DE69233480T2 - CD4-gamma2- und CD4-IgG2-Chimären - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • In dieser Anmeldung wird durch Arabische Ziffern in Klammern auf verschiedene Veröffentlichungen verwiesen. Die vollständigen Belegstellen für diese Veröffentlichungen sind am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen zu finden. Die Offenbarungen dieser Veröffentlichungen sind in ihrer Gesamtheit hierdurch unter Bezugnahme in dieser Anmeldung eingeschlossen, um den Stand der Technik, wie er den Fachleuten bekannt ist, bis zum Zeitpunkt der hierin beschriebenen und beanspruchten Erfindung ausführlicher zu beschreiben.
  • Der Lebenszyklus von tierischen Viren ist durch eine Reihe von Ereignissen gekennzeichnet, die für die produktive Infektion der Wirtszelle erforderlich sind. Der erste Schritt im Vermehrungszyklus ist die Anlagerung des Virus an die Zelloberfläche, welche durch die spezifische Wechselwirkung des Virusanheftungsproteins (VAP) mit Rezeptoren auf der Oberfläche der Zielzelle vermittelt wird. Das Expressionsmuster dieser Rezeptoren ist größtenteils für den Wirtsbereich und die tropischen Eigenschaften von Viren verantwortlich. Die Wechselwirkung des VAP's mit Zellrezeptoren spielt daher bei der Infektion und der Pathogenese von Viruserkrankungen eine entscheidende Rolle und stellt ein wichtiges Gebiet für die zielgerichtete Entwicklung von antiviralen Therapeutika dar.
  • Zellrezeptoren können aus allen Komponenten von Membranen bestehen, einschließlich Proteinen, Kohlenhydraten und Lipiden. Die Identifizierung der Moleküle, welche die Anlagerung von Viren an die Oberfläche der Zielzelle vermitteln, ist in einigen Fällen durchgeführt worden. Das am umfassendsten charakterisierte virale Rezeptorprotein ist CD4 (T4)(1). CD4 ist ein nicht polymorphes Zelloberflächen-Glycoprotein, das vorwiegend auf der Oberfläche von Helfer-T-Lymphocyten und Zellen der Monocyten/Makrophagen-Abstammungslinie exprimiert wird. CD4 ist mit Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse II-Molekülen auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen assoziiert, um wirksame zelluläre Immunantwort- Interaktionen zu vermitteln. Beim Menschen ist CD4 auch das Ziel einer Wechselwirkung mit dem menschlichen Immunschwächevirus (HIV).
  • HIV infiziert vorwiegend Helfer-T-Lymphocyten und Monocyten/Makrophagen, d.h. Zellen, die CD4 auf der Oberfläche exprimieren, was zu einem allmählichen Verlust der Immunfunktion führt, woraus die Entwicklung des menschlichen erworbenen Immunschwäche-Syndroms (AIDS) resultiert. Die erste Phase des HIV-Vermehrungszyklus beinhaltet eine Wechselwirkung mit hoher Affinität zwischen dem äußeren HIV-Hüllglycoprotein gp120 und dem oberflächlichen CD4 (Kd etwa 4 × 10–9 M)(2). Mehrere Beweisführungen veranschaulichen die Erfordernis dieser Wechselwirkung für die Virusinfektiosität. In vitro ist die Einschleusung einer funktionellen cDNA, die CD4 codiert, in menschliche Zellen, die kein CD4 exprimieren, ausreichend, um sonst resistente Zellen für eine HIV-Infektion anfällig zu machen (3). In vivo scheint die Virusinfektion auf Zellen begrenzt zu sein, die CD4 exprimieren. Nach der Bindung von HIV-gp120 an CD4 auf der Zelloberfläche verschmelzen die Membranen des Virus und der Zielzelle, wodurch das Viruscapsid in das Cytoplasma der Zielzelle eingeschleust wird.
  • Die Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen HIV-gp120 und CD4 ist durch die Isolierung von cDNA-Clonen, die beide Moleküle codieren, erleichtert worden (4, 5). CD4 ist ein nicht polymorphes, auf bestimmte Abstammungslinien begrenztes Zelloberflächen-Glycoprotein, das ein Vertreter der Immunglobulingen-Superfamilie ist. Es sind hohe Expressionsraten für sowohl das CD4 vollständiger Länge als auch für verkürzte lösliche Varianten von CD4 (sCD4) in stabilen Expressionssystemen beschrieben worden. Die Verfügbarkeit großer Mengen an gereinigtem sCD4 hat eine detaillierte Einsicht in die Struktur dieses komplexen Glycoproteins ermöglicht. Reifes CD4 weist eine relative Molekülmasse (Mr) von 55 Kilodaltons auf und besteht aus einer aminoterminalen extrazellulären Domäne von 372 Aminosäuren, die vier Immunglobulin-ähnliche Regionen in Tandemanordnung, bezeichnet als V1–V4, gefolgt von einer Transmembrandomäne von 23 Aminosäuren und einem cytoplasmatischen Segment von 38 Aminosäuren, enthält. Die aminoterminale Immunglobulin-ähnliche Domäne V1 weist eine Homologie von 32% mit den variablen Domänen der leichten kappa-Kette auf. Drei der vier Immunglobulin-ähnlichen Domänen enthalten eine Disulfidbrücke (V1, V2 und V4), und es werden beide N-gebundenen Glycosylierungsstellen in dem carboxyterminalen Teil des Moleküls benutzt (4, 6).
  • Experimente unter Verwendung von verkürzten sCD4-Proteinen zeigen, daß die Determinanten einer Bindung mit hoher Affinität an HIV-gp120 innerhalb der aminoterminalen Immunglobulin-ähnlichen Domäne V1 liegen (7–9). Die Mutationsanalyse von V1 hat eine abgrenzbare gp120-Bindungsstelle (Reste 38–52 des reifen CD4-Proteins) definiert, die eine Region umfaßt, welche strukturell zu der zweiten komplementaritätsbestimmenden Region (CDR2) von Immunglobulinen homolog ist (9). Die Herstellung von großen Mengen an V1V2 hat eine Strukturanalyse der zwei aminoterminalen Immunglobulin-ähnlichen Domänen ermöglicht. Die bei einer Auflösung von 2,3 Ångström ermittelte Struktur zeigt, daß das Molekül zwei eng miteinander verbundene Domänen, enthaltend die Immunglobulin-Falte, aufweist, die durch einen zusammenhängenden beta-Strang verknüpft sind. Die mutmaßlichen Bindungsstellen für monoclonale Antikörper, Klasse II-MHC-Moleküle und HIV-gp120 (bestimmt mittels Mutationsanalyse), stimmen mit der Moleküloberfläche überein (10, 11).
  • Eine lösliche Variante des vollständigen extrazellulären Segments von CD4 (V1–V4, bezeichnet als sCD4) ist beschrieben worden und scheint ein möglicher therapeutischer Ansatz für die Behandlung einer HIV-Infektion zu sein. In vitro-Experimente zeigen, daß: 1) sCD4 durch die Bindung an HIV-gp120 und die Hemmung der Virusanlagerung und der nachfolgenden Infektion von menschlichen Zellen als ein "molekularer Köder" wirksam ist; 2) sCD4 das virale Hüllglycoprotein gp120 von der Virusoberfläche "ablöst"; und 3) sCD4 die interzelluläre Ausbreitung des Virus von HIV-infizierten Zellen in nichtinfizierte Zellen durch die Hemmung der virus- vermittelten Zellfusion blockiert (1, 13).
  • Zusätzlich zu in vitro-Ergebnissen sind Experimente mit sCD4 bei Rhesusaffen, die mit dem Affen-Immunschwächevirus (SIV) infiziert wurden, beschrieben worden. Diese Studien zeigten, daß die Verabreichung von 2 mg (intramuskulär) sCD4 während 28 Tagen an SIV-infizierte Rhesusaffen die Möglichkeit verringerte, das Virus aus Lymphocyten des peripheren Bluts und dem Knochenmark zu isolieren. Außerdem normalisierte sich die Vermehrung von Granulocyten-Makrophagen- und Erythrocyten-Vorläuferkolonien im Knochenmark. Diese Daten legen nahe, daß die Verabreichung von sCD4 an SIV-infizierte Rhesusaffen eine Verringerung des Virusreservoirs zur Folge hat.
  • Klinische Prüfungen der Phase I an Menschen zeigten, daß mit der Verabreichung von sCD4 in Dosen von so hoch wie 30 mg/Tag keine wesentliche Toxizität oder Immunogenität verbunden ist. Pharmakokinetische Studien zeigten, daß die Serumhalbwertszeit von sCD4 45 Minuten nach der intravenösen Verabreichung, 9,4 Stunden nach der intramuskulären Verabreichung der Dosis und 10,3 Stunden nach der subkutanen Verabreichung des Arzneistoffs beträgt (14, 15). Vorläufige antivirale Studien waren im Hinblick auf die CD4-Zellzahl und die HIV-Antigen-Spiegel nicht schlüssig. Da die maximal tolerierte Dosis nicht erreicht wurde, kann die antivirale Wirkung von sCD4 unterschätzt worden sein, besonders im Hinblick auf neuere Daten, die Unterschiede bezüglich der sCD4-Konzentrationen betreffen, die erforderlich sind, um Laborstämme von HIV-1 im Vergleich zu primären Virusisolaten zu hemmen (16).
  • Obwohl diese klinischen in vitro-Studien an Primaten und Menschen mit sCD4 ermutigende Ergebnisse erbracht haben, weisen sie auch mehrere bestimmte Begrenzungen auf. Erstens ist die gemessene Serumhalbwertszeit von sCD4 relativ kurz. Zweitens ist sCD4 im Hinblick auf die gp120-Bindung monovalent, im Gegensatz zu CD4 auf der Zelloberfläche und gp120 auf der Virusoberfläche, die multivalent sind. Drittens ist sCD4 für HIV-infizierte Zellen nicht cytotoxisch. Viertens kann sCD4 in einem wesentlichen Maße die Plazenta nicht passieren. Daher sind chimäre CD4-Moleküle beschrieben worden, die von der Immunglobulin-ähnlichen Natur von CD4 und mehreren vorteilhaften Eigenschaften der Immunglobuline selbst profitieren (d.h. CD4-Immunglobulin-Fusionen).
  • Immunglobuline oder Antikörper sind die durch B-Lymphocyten erzeugten Antigen-bindenden Moleküle, welche die humorale Immunantwort ausmachen. Die Grundeinheit eines Immunglobulinmoleküls besteht aus zwei identischen schweren Ketten und zwei identischen leichten Ketten. Der Aminoterminus jeder Kette enthält eine Region mit einer variablen Aminosäuresequenz (variable Region). Die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten treten in Wechselwirkung miteinander, um zwei Antigen-Bindungsstellen zu bilden. Der Carboxyterminus jeder Kette enthält eine Region mit einer konstanten Aminosäuresequenz (konstante Region). Die leichte Kette enthält eine einzige konstante Domäne, während die konstante Domäne der schweren Kette in vier separate Domänen (CH1, Gelenkregion, CH2 und CH3) unterteilt ist. Die schweren Ketten der Immunglobulinmoleküle unterteilen sich in mehrere Typen, einschließlich mu (M), delta (D), gamma (G), alpha (A) und epsilon (E). Die leichten Ketten der Immunglobulinmoleküle umfassen zwei Typen, entweder kappa oder lambda. Innerhalb der einzelnen Typen der schweren und leichten Ketten gibt es Subtypen, die sich bezüglich der Effektorfunktion unterscheiden. Ein zusammengelagertes Immunglobulinmolekül leitet seine Bezeichnung von dem Typ der schweren Kette, die es besitzt, ab.
  • Durch die Entwicklung von monoclonalen Antikörpern wurde die inhärente Heterogenität von Antikörpern, die aus dem Serum von Tieren oder Menschen erhalten werden, umgangen. Jedoch sind die meisten monoclonalen Antikörper aus Zellen abgeleitet, die von der Maus stammen, und daher bei der Verabreichung an Menschen immunogen. Jüngste Entwicklungen, welche die Techniken der Molekulargenetik mit der Technik der Erzeugung von monoclonalen Antikörpern kombinieren, führten zur Herstellung von "humanisierten" chimären Antikörpern in vitro. In diesen chimären Antikörpern sind die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten eines menschlichen Immunglobulins durch spezifische variable Domänen der leichten und schweren Kette aus einem murinen monoclonalen Antikörper ersetzt (17–19). Das Ergebnis dieser genetischen Manipulation ist ein Molekül mit einer Spezifität für ein bestimmtes Antigen und den Eigenschaften von menschlichen Immunglobulinen.
  • Sequenz- und Strukturanalysen von CD4 zeigen, daß die vier extrazellulären Domänen Immunglobulin-ähnlich sind. Da der Fc-Teil von Immunglobulinen die Abbaurate der Moleküle reguliert (Serumhalbwertszeit im Bereich von 14 bis 21 Tagen) und verschiedene Effektorfunktionen bereitstellt, beschreiben mehrere Berichte den Austausch von variablen und konstanten Domänen von Immunglobulinen durch die Immunglobulin-ähnlichen Domänen von CD4 (21–24).
  • Fusionsproteine aus CD4 und der schweren IgG1-Kette, die chimäre Dimere der schweren gamma1-Kette ergeben, sind beschrieben worden (21). Diese Moleküle enthalten zusätzlich zu den Gelenkregion-, CH2- und CH3-Domänen auch die CH1-Domäne der schweren gamma1-Kette. Jedoch ist die Zusammenlagerung und Sekretion der schweren Kette aus Säugerzellen weniger effektiv, falls die CH1-Domäne in Abwesenheit der leichten Ketten exprimiert wird (25). Später wurde ein Fusionsprotein aus CD4 und der schweren IgG1-Kette beschrieben, worin die CH1-Domäne und die ersten fünf Aminosäuren der Gelenkregion fehlten und das in hohen Raten sezerniert wurde (22). Diese Fusionsproteine behalten verschiedene Effektorfunktionen von Immunglobulinmolekülen bei, wie die Fc-Rezeptor-Bindung, die Antikörper-abhängige zellvermittelte Cytotoxizität (ADCC) gegenüber HIV-1-infizierten Zellen und den Plazentatransfer mit Hilfe eines Fc-Rezeptor-abhängigen Mechanismus (22). Fusionsproteine aus CD4 und der schweren IgM-Kette sind auch beschrieben worden (26). Außerdem sind CD4-IgG1-Fusionsproteine beschrieben worden, worin die V1V2-Domänen von CD4 mit den CH1-, Gelenkregion-, CH2- und CH3-Domänen einer schweren gamma1-Kette fusioniert sind und worin die V1V2-Domänen von CD4 mit der konstanten Domäne einer leichten kappa-Kette fusioniert sind (29).
  • Fusionsproteine, die CD4 mit Toxinen verknüpfen, sind auch konstruiert und auf ihre Fähigkeit, HIV-infizierte Zellen abzutöten, untersucht worden. In einer Studie wurde sCD4 an die deglycosylierte A-Kette von Ricin, welche Ribosomen inaktiviert, gekoppelt, wodurch die Proteinsynthese gehemmt und die Zelle abtötet wird (27). Es wurde berichtet, daß dieses Fusionsprotein spezifisch Zellen lysiert, die mit fünf verschiedenen Isolaten von HIV infiziert wurden, aber für nichtinfizierte Zellen nicht toxisch war. In einer anderen Studie wurden die V1V2-Domänen von CD4 an die Domänen II und III von Pseudomonas-Exotoxin A gekoppelt (28). Es wurde berichtet, daß dieses Fusionsprotein spezifisch bindet und die Proteinsynthese in Zellen hemmt, die das HIV-Hüllglycoprotein gp120 exprimieren (25).
  • Es ist ausreichend bewiesen, daß menschliche Monocyten und Makrophagen (M/M), die CD4 auf der Oberfläche exprimieren, durch HIV infiziert werden können und als ein Infektionsreservoir und ein Vehikel für die Virusausbreitung dienen (29). Außerdem enthalten menschliche M/M auch Fc-Rezeptoren, die für die Bindung an spezifische IgG-Moleküle über ihren Fc-Teil verantwortlich sind (vgl. Tabelle 1). Der eine hohe Affinität aufweisende Fc-Rezeptor (FcRI) bindet monomeres IgG und komplexiertes IgG (Antigen plus Antikörper). Die Rangfolge der Affinität von FcRI für IgG-Isotypen ist: IgG1 = IgG3 > IgG4; es interagiert nicht mit IgG2. Der eine geringe Affinität aufweisende Fc-Rezeptor (FcRII) bindet monomeres IgG mit einer geringeren Affinität als IgG in einer komplexierten Form. Die Rangfolge der Affinität ist derart, daß die IgG1- und IgG3-Bindung stärker ist als die an IgG2 oder IgG4 (30).
    Figure 00070001
    (Tabelle gekürzt aus Gergely J. und Sarmay G., FASEB J. 4 (1990), 3275.)
  • Aufgrund der jüngsten Beweise, daß Seren von HIV+-Patienten einen niedrigen Titer von Antikörpern aufweisen, die das HIV-Hüllglycoprotein erkennen, ist beobachtet worden, daß die Infektion von M/M durch anti-HIV-Antikörper mit einem niedrigen Titer verschlimmert wird, vermutlich durch die Vernetzung von HIV und dem Fc-Rezeptor (31). Eine Verschlimmerung der Infektion von Makrophagen durch das Dengue-Fieber-Virus, Gelbfieber-Virus und Sindbis-Virus ist in vitro sowie in Rhesusaffen hinreichend dokumentiert (32). Es ist gezeigt worden, daß eine solche Verschlimmerung in Anwesenheit von subneutralisierenden Antikörpern gegen diese Viren erfolgt, welche dazu dienen, die Viren zu opsonisieren und sie an die FcRs (oder Komplement-Rezeptoren) auf der Oberfläche der Zelle zu binden. Im Falle von HIV dient diese Vernetzung dazu, HIV auf der Oberfläche der M/M zu konzentrieren, worauf das Virus dann in der Lage ist, CD4 für den Eintritt in die Zelle zu benutzen, da sCD4 fähig ist, die Verschlimmerung zu hemmen, welche bei den Antikörpern in einem niedrigen Titer beobachtet wird (31).
  • Vor kurzem haben Byrn et al. (22) ein CD4-IgG-Chimär des IgG1-Isotyps erzeugt, um die Plasmahalbwertszeit von sCD4 zu erhöhen, sowie um Effektorfunktionen auf das chimäre Molekül zu übertragen. Daher besitzt dieses Molekül die Fähigkeit, an Fc-Rezeptoren zu binden, die sich auf der Oberfläche der M/M befinden, und verursacht möglicherweise eine Verschlimmerung der Infektion dieser Zelltypen. Da die Verschlimmerung der Infektion dieser Zelltypen ein ernstzunehmender Gesichtspunkt bei der Entwicklung von neuen Therapeutika ist, war das Ziel der Erfinder, für die Konstruktion eines CD4-IgG-Moleküls den IgG2-Typ zu verwenden, der eine stark verminderte Fähigkeit besitzt, an M/M-Fc-Rezeptoren zu binden (30). Außerdem scheinen menschliche IgG2-Antikörper keine wesentliche allotypische Variation zu zeigen, während menschliche IgG1-Antikörper allotypische Variationen enthalten (33). Um mögliche immunogene Antworten auf rekombinante Moleküle, enthaltend Immunglobulin-Domänen, zu vermeiden, haben die Erfinder daher ein Molekül ausgewählt, das am wenigsten polymorph ist und eine verminderte Fähigkeit besitzt, HIV auf der Oberfläche des Makrophagen zu konzentrieren.
  • Zweitens können ähnliche Beobachtungen einer Verschlimmerung der Infektion von ungeborenen Babys auch für CD4-IgG1-Immunadhäsionen, die an Schwangere verabreicht wurden, gezeigt werden. Zum Beispiel ist es hinreichend dokumentiert, daß die Plazenta-Syncytiotrophoblast-Plasmamembran Fc-Rezeptoren enthält (30). Da der mütterliche-fötale Transport von Immunglobulin vorwiegend auf die IgG-Klasse begrenzt ist, nimmt man an, daß eine passive Immunität durch den spezifischen Transport über die Plazenta mit Hilfe eines bestimmten Fc-Rezeptor-Transcytose-Mechanismus erreicht werden kann. Weiterhin scheint es, daß die Fc-Rezeptoren auf der Plazenta-Syncytiotrophoblast-Membran insofern selektiv sind, als Immunglobuline des IgG1-Typs eine etwa 10-20-fach höhere Bindungsaffinität für den Rezeptor aufweisen. In der Tat weisen von allen IgG-Subtypen IgG1 und IgG3 die höchste Affinität für den Rezeptoren auf, gefolgt von IgG4 und schließlich IgG2 (30). Diese Ergebnisse stimmen mit denen überein, die aus der Clonierung des FcR aus einer menschlichen Plazenta erhalten wurden, welche zeigen, daß der Rezeptor eine große Ähnlichkeit mit dem FcRII-Typ hat, der auf M/M zu finden ist. Obwohl man argumentieren könnte, daß der transplazentale Transport von Immunglobulin für den Fötus im Uterus vorteilhaft sein kann, könnte auch argumentiert werden, daß ein bestimmtes mütterliches Immunglobulin, das gegen ein bestimmtes Pathogen (wie HIV) hervorgerufen wurde, den Transport über die Plazenta mit Hilfe eines Fc-abhängigen Mechanismus erleichtern könnte, um die Infektion des Föten zu verschlimmern; ähnlich dem Mechanismus, der sich entwickelt hat, um IgA über das Epithel mit Hilfe des Poly-Ig-Rezeptors zu transportieren (34). Folglich können spezifische CD4-IgG1-Fusionsproteine, für die gezeigt worden ist, daß sie die Plazenta passieren und sich im fötalen Blut anreichern (22), für den Föten insofern schädlich sein, als sie für das HIV einen neuen Mechanismus bereitstellen, die plazentale Schranke zu passieren.
  • Die Erfinder haben nun entdeckt, daß ein spezifisches chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer gegenüber solchen CD4-schwere IgG1-Kette-Homodimeren, die vor mehr als einem Jahr beschrieben worden sind, Vorteile bereitstellen. Genauer haben die Erfinder ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer konstruiert, das die V1V2-Domänen von CD4 enthält und das intrazellulär effizient zusammengelagert wird und durch Säugerzellen als ein Homodimer effizient sezerniert wird, was eine hohe Ausbeute und Reinigung aus dem Medium von Zellen, die dieses chimäre Homodimer der schweren Kette exprimieren, ermöglicht. Für die Konstruktion dieses Homodimeren verwendeten die Erfinder die gesamten Gelenkregion-, CH2- und CH3-Domänen aus einer menschlichen schweren gamma2-Kette, wobei ein chimäres Molekül erhalten wird, das die konstanten Domänen eines menschlichen IgG2-Moleküls enthält, welche für die Dimerisierung und eine effiziente Sekretion verantwortlich sind. Dies steht im Gegensatz zu den durch Capon und Gregory (20) beschriebenen Dimeren der schweren Kette, welche die CH1-Domäne in das CD4-schwere IgG1-Kette-Dimer einbeziehen, woraus eine unzureichende Sekretion und Gewinnung des rekombinanten Moleküls aus dem Zellkulturmedium resultiert. Die Erfindern haben auch die gesamte Gelenkregion-Domäne der schweren gamma2-Kette in das erfindungsgemäße chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer einbezogen, um eine wirksame Dimerisierung vorzusehen, da die in dieser Domäne enthaltenen Cysteinreste für die Bildung der Disulfidbrücken mit der zweiten Kette des Homodimeren verantwortlich sind, wodurch die zwei Ketten in der richtigen räumlichen Ausrichtung positioniert werden und die Bildung der Antigen-Kombinationsstelle erleichtert wird.
  • Durch die Einbeziehung der gesamten Gelenkregion-Domäne haben die Erfinder außerdem die segmentäre Flexibilität der Dimeren der schweren Kette bei behalten, wodurch die Modulation einer biologischen Funktion wie der Komplementaktivierung und der Fc-Rezeptor-Bindung ermöglicht wird (29).
  • Da IgG2-Immunglobuline eine stark verminderte Fähigkeit besitzen, an Fc-Rezeptoren auf Monocyten, Makrophagen und Plazentamembranen zu binden, resultiert die Konstruktion eines chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren und eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren in chimären Proteinen mit vielen Vorteilen, die chimäre CD4-schwere gamma1-Kette-Homodimere oder chimäre CD4-IgG1-Heterotetramere nicht aufweisen (20, 23, 24, 26). Außerdem ist menschliches IgG2 wesentlich weniger polymorph als andere IgG-Typen, und daher ist es weniger wahrscheinlich, daß es bei der Verabreichung an Menschen immunogen ist. Dies steht im Gegensatz zu menschlichem IgG1, das viele Allotypen enthält und für das eine höhere Wahrscheinlichkeit besteht, daß es bei der Verabreichung an Menschen immunogen ist.
  • Zusätzlich zu den chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren haben die Erfinder auch CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküle konstruiert, welche die V1V2-Domänen von CD4 fusioniert mit den CH1-, Gelenkregion-, CH2- und CH3-Domänen der menschlichen schweren gamma2-Kette enthalten. Diese Moleküle codieren ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer und ermöglichen, wenn in Anwesenheit von chimären CD4-leichte kappa-Kette-Molekülen, enthaltend die V1- und V2-Domänen von CD4, fusioniert mit der gesamten konstanten Domäne der menschlichen leichten kappa-Ketten (oder leichten lambda-Ketten), coexprimiert, die Herstellung des Heterotetrameren. Dieses Heterotetramer umfaßt zwei chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküle und zwei chimäre CD4-leichte kappa-Kette-Moleküle. Die Herstellung der schweren Ketten, die die CH1-Domäne enthalten, ermöglicht eine wirksame Zusammenlagerung mit den chimären CD4-leichte kappa-Kette-Molekülen, woraus die effiziente Sekretion eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren resultiert. Diese chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren besitzen erhöhte Serumhalbwertszeiten und eine erhöhte Affinität für HIV im Vergleich zu Dimeren der schweren Kette.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Erfindung stellt einen Expressionsvektor bereit, der die schweren Ketten eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren codiert. Schließlich stellt diese Erfindung einen Expressionsvektor bereit, der die leichten Ketten eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren codiert.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1:
    A) Domänenstruktur eines chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Gens; B) Proteinstruktur eines chimären CD4-gamma2-Homodimeren aus der schweren Kette. Die darunter gezeigte Sequenz ist der Ein-Buchstaben-Aminosäurecode der Verbindungsstelle zwischen CD4 (Phe 179) und der Gelenkregion der menschlichen schweren gamma2-Kette. Es ist anzumerken, daß die Gelenkregion einer schweren gamma2-Kette vier Cysteine enthält (vgl. Text zur Erläuterung). Abkürzungen: L = Leader (Signal)-Sequenz des menschlichen CD4; V1V2 = aminoterminale variable ähnliche Domäne des menschlichen CD4; H = Gelenkregion der menschlichen schweren gamma2-Kette; CH2 und CH3 = zweite und dritte konstante Region der menschlichen schweren gamma2-Kette.
  • 2:
    A) Domänenstruktur der chimären Gene, welche für die Expression des chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren verwendet werden. Oben: chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Gen; unten = chimäres CD4-leichte kappa-Kette-Gen. B) Proteinstruktur des chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren. Abkürzungen: CH1-CH2-CH3 = erste, zweite und dritte konstante Region der menschlichen schweren gamma2-Kette; c-kappa = konstante Region der menschlichen leichten kappa-Kette.
  • 3:
    DNA-Sequenz und vorhergesagte Proteinsequenz eines chimären CD4-gamma2-Homodimeren aus der schweren Kette (eine Kette). Die Zahlen am Ende jeder Linie geben die Nucleotidpositionen an. Die Zahlen oberhalb jeder Linie geben die Aminosäurepositionen an (angegeben im Ein-Buchstaben-Code). Die Proteindomänen sind oberhalb der Sequenzen durch Pfeile angegeben.
  • 4:
    DNA-Sequenz und vorhergesagte Proteinsequenz eines chimären CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküls des chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren. Die Zahlen am Ende jeder Linie geben die Nucleotidpositionen an. Die Zahlen oberhalb jeder Linie geben die Aminosäurepositionen an (angegeben im Ein-Buchstaben-Code). Die Proteindomänen sind oberhalb der Sequenzen durch Pfeile angegeben.
  • 5:
    DNA-Sequenz und vorhergesagte Proteinsequenz eines chimären CD4-leichte kappa-Kette-Moleküls des chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren. Die Zahlen am Ende jeder Linie geben die Nucleotidpositionen an. Die Zahlen oberhalb jeder Linie geben die Aminosäurepositionen an (angegeben im Ein-Buchstaben-Code). Die Proteindomänen sind oberhalb der Sequenzen durch Pfeile angegeben.
  • 6:
    Sekretion eines chimären CD4-gamma2-Homodimeren aus der schweren Kette aus transfizierten Zellen. Cos-M5-Zellen wurden scheintransfiziert sowie mit der Säugerexpressionsvektor-DNA, die chimäre CD4-schwere gamma1-Kette-Moleküle codiert, oder mit CD4-IgG2-pcDNA1 transfiziert. Bei 48–72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit 35S-Methionin radioaktiv markiert. Radioaktiv markiertes Medium wurde mit Protein A-Sepharose-Kügelchen gefällt. Die gefällten Proteine wurden durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen analysiert und mittels Fluorographie sichtbar gemacht. Bahn M: Medium von scheintransfizierten Zellen; Bahn 1: Medium von Zellen, die mit der Säugerexpressionsvektor-DNA der chimären CD4-schwere gamma1-Kette-Moleküle transfiziert wurden; Bahn 2: Medium von Zellen, die mit der CD4-IgG2-pcDNA1-DNA transfiziert wurden.
  • 7:
    Fällung von HIV-1-gp120 mit dem chimären CD4-gamma2-Homodimer aus der schweren Kette. Cos-M5-Zellen wurden scheintransfiziert sowie mit der Säugerexpressionsvektor-DNA, die chimäre CD4-schwere gamma1-Kette-Moleküle codiert, oder mit CD4-IgG2-pcDNA1 transfiziert. Bei 48–72 Stunden nach der Transfektion wurden unmarkierte Aliquots des Mediums mit einem Aliquot von 35S-Methionin markiertem gp120 inkubiert. Die Komplexe wurden mit Protein A-Sepharose-Kügelchen gefällt. Die Präzipitate wurden dann durch eine SDS-PAGE, gefolgt durch eine Fluorographie, analysiert. Bahn M: Medium von scheintransfizierten Zellen; Bahn 1: Medium von Zellen, die mit der Säugerexpressionsvektor-DNA der chimären CD4-schwere gamma1-Kette-Moleküle transfiziert wurden; Bahn 2: Medium von Zellen, die mit der CD4-IgG2-pcDNA1-DNA transfiziert wurden.
  • 8:
    Reinigung eines chimären CD4-gamma2-Homodimeren aus der schweren Kette aus einem durch CHO-Zellen konditionierten Medium. Stabile CHO-Zellen, die das chimäre CD4-schwere gamma1-Kette-Homodimer oder das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer konstitutiv sezernieren, wurden in Rollerflaschen gezüchtet. Das konditionierte Medium wurde über eine Protein A-Sepharose-Säule geleitet, und das gebundene Material wurde aus der Säule eluiert. Die Peakfraktionen wurden durch eine SDS-PAGE, gefolgt durch eine Silberfärbung, identifiziert und vereinigt. Die gereinigten Proteine wurden dann durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, gefolgt durch eine Silberfärbung, analysiert. Bahn 1: chimäres CD4-gamma1-Homodimer aus der schweren Kette; Bahn 2: chimäres CD4-gamma2-Homodimer aus der schweren Kette.
  • 9:
    Hemmung der HIV-Bindung an CEM-Zellen durch auf CD4 basierende Moleküle. Lösliches CD4 (sCD4), teilweise gereinigtes CD4-gamma1 oder teilweise gereinigtes CD4-gamma2 wurden auf eine Hemmung der Virusbindung an CD4-positive Zellen getestet. Das gebundene Virus wurde durch indirekte Immunfluoreszenz und Cytofluorographie nachgewiesen. Die Ergebnisse sind als prozentuale Hemmung im Vergleich zu der Konzentration des Hemmstoffs angegeben.
  • 10:
    Hemmung einer HIV-Infektion von CD4-positiven Zellen durch auf CD4 basierende Moleküle. sCD4, teilweise gereinigtes CD4-gamma1 oder teilweise gereinigtes CD4-gamma2 wurden mit einem HIV-1-Impfmaterial (100 TCID50) inkubiert, und die Gemische wurden zu PHA-stimulierten Lymphocyten zugegeben und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und in Mikrokulturen (1 × 105 Zellen/Kultur; 10 Kulturen pro Verdünnung) plattiert und 8 und 12 Tage später durch Nachweis eines HIV-Antigens in den Kulturüberständen auf eine reproduktive Virusreplikation überprüft. Die Ergebnisse sind als positive Kulturen in Prozent bei einer bestimmten Konzentration des Hemmstoffs angegeben.
  • 11:
    Reinigung eines chimären CD4-gamma2-Homodimeren aus der schweren Kette. Stabile CHO-Zellen, die das chimäre CD4-gamma2-Homodimer aus der schweren Kette konstitutiv sezernieren, wurden in Rollerflaschen gezüchtet. Das konditionierte Medium wurde über eine Protein A-Sepharose-Säule geleitet, und das gebundene Material wurde aus der Säule eluiert (vgl. 8). Die Peakfraktionen wurden dann vereinigt und über eine S-Sepharose-Säule geleitet. Nach gründlichem Waschen wurde das chimäre CD4-gamma2-Homodimer aus der schweren Kette mit 50 mM BES, pH 7,0, 500 mM NaCl eluiert. Die Peakfraktionen wurden durch eine SDS-PAGE, gefolgt durch eine Silberfärbung, identifiziert, vereinigt und konzentriert. Das vereinigte, konzentrierte chimäre CD4-gamma2-Homodimer aus der schweren Kette wurde dann auf eine Sephacryl S-300HR-Säule aufgetragen, die vorher äquilibriert worden war und mit PBS eluiert wurde. Die Peakfraktion, welche dem gereinigten chimären CD4-gamma2-Homodimer aus der schweren Kette entspricht, wurde durch eine SDS-PAGE, gefolgt durch eine Silberfärbung, identifiziert. Die Peakfraktionen wurden dann vereinigt und konzentriert. Das gereinigte Protein wurde dann durch eine SDS-PAGE unter nichtreduzierenden und reduzierenden Bedingungen, gefolgt durch eine Silberfärbung, analysiert. Bahn 1: etwa 1,5 μg Protein, aufgetrennt unter nichtreduzierenden Bedingungen; Bahn 2: etwa 1,5 μg Protein, aufgetrennt unter reduzierenden Bedingungen.
  • 12:
    Sekretion eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren aus stabil transfizierten Zellen. CHO-Zellen, die sowohl chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküle als auch chimäre CD4-leichte kappa-Kette-Moleküle stabil exprimieren, wurden mit 35S-Methionin und Cystein radioaktiv markiert. Radiomarkiertes Medium wurde mit Protein A-Sepharose-Kügelchen gefällt. (A) Die gefällten Proteine wurden durch eine SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen analysiert und mittels Fluorographie sichtbar gemacht. Bahn 1: Medium von nichttransfizierten CHO-Zellen; Bahn 2: Medium von Zellen, die sowohl die chimären CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküle als auch die chimären CD4-leichte kappa-Kette-Moleküle stabil exprimieren. (B) Eine Probe, die mit der in Bahn 2 aus (A) aufgetrennten Probe identisch ist, wurde auf einer SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Die Bahn wurde aus diesem SDS-PAGE-Gel ausgeschnitten, und die Proteine wurden durch Inkubation des Gelteils für 45 Minuten bei 4°C in Äquilibrierungspuffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,3% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin) reduziert. Nach Inkubation des Gelteils unter reduzierenden Bedingungen wurden die in dem Gel enthaltenen Proteine durch eine SDS-PAGE analysiert und mittels Fluorographie sichtbar gemacht.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Fünf Expressionsvektoren und zwei Plasmide, bezeichnet als CD4-IgG2-Rf, CD4-IgG1-Rf, CD4-IgG1HC-pRcCMV, CD4-IgG2HC-pRcCMV, CD4-kLC-pRcCMV, CD4-IgG1-pcDNA1 bzw. CD4-IgG2-pcDNA, sind bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, 20852 unter den ATCC-Hinterlegungsnummern 40949, 40950, 75192, 75193, 75194, 40951 bzw. 40952 hinterlegt worden. Diese Hinterlegungen erfolgten gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke eines Patentverfahrens (Budapester Vertrag).
  • Die Anmeldung offenbart einen Expressionsvektor, bezeichnet als CD4-IgG2-pcDNA1 (ATCC-Nr. 40951), der ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer codiert, sowie ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer, das durch diesen Expressionsvektor oder einen anderen Expressionsvektor, der die gleiche darin inserierte codierende DNA-Region aufweist, codiert wird. Genauer stellt die Erfindung Expressionsvektoren bereit, bezeichnet als CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75193) und CD4-kLC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75194), die ein chimäres CD4-schwere IgG2-Kette-Molekül und ein chimäres CD4-leichte kappa-Kette-Molekül codieren. Die Erfindung stellt weiterhin ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer bereit, das durch diese Expressionsvektoren oder einen anderen Expressionsvektor, der die gleiche darin inserierte codierende DNA-Region aufweist, codiert wird.
  • Im Einklang mit der Erfindung können zahlreiche Vektorsysteme für die Expression verwendet werden. Zum Beispiel verwendet eine Klasse von Vektoren DNA-Elemente, die aus tierischen Viren wie dem Rinderpapillomvirus, Polyomavirus, Adenovirus, Vacciniavirus, Baculovirus, den Retroviren (RSV, MMTV oder MOMLV) oder dem SV40-Virus stammen. Zusätzlich können Zellen, welche die DNA in ihre Chromosomen stabil integriert haben, durch das Einschleusen eines oder mehrerer Marker, welche die Selektion von transfizierten Wirtszellen ermöglichen, selektiert werden. Der Marker kann eine Prototrophie für einen auxotrophen Wirt, eine Biozidresistenz, z.B. Antibiotika, oder eine Resistenz gegen Schwermetalle wie Kupfer oder dergleichen bereitstellen. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Sequenzen verknüpft sein oder durch Cotransformation in die gleiche Zelle eingeschleust werden. Für eine optimale mRNA-Synthese können auch zusätzliche Elemente erforderlich sein. Diese Elemente können Spleißsignale sowie Transkriptionspromotoren, Enhancer und Terminationssignale einschließen. Die cDNA-Expressionsvektoren, die solche Elemente beinhalten, schließen die durch Okayama (37) beschriebenen ein.
  • Folglich offenbart die Anmeldung ein Verfahren zur Herstellung eines chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren. Dieses Verfahren umfaßt:
    • a) Transfizieren einer Säugerzelle mit einem Expressionsvektor zur Herstellung des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren;
    • b) Züchten der erhaltenen transfizierten Säugerzelle unter Bedingungen, so daß das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer hergestellt wird; und
    • c) Gewinnen des auf diese Weise hergestellten chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren der schweren Kette.
  • Nachdem der Vektor oder die DNA-Sequenz, enthaltend die Konstrukte, für die Expression hergestellt worden ist, können die Expressionsvektoren in eine geeignete Säugerwirtszelle transfiziert oder eingeschleust werden. Verschiedene Techniken wie die Protoplastenfusion, Calciumphosphatpräzipitation, Elektroporation oder andere herkömmliche Techniken können angewendet werden. Im Falle der Protoplastenfusion werden die Zellen in einem Medium gezüchtet und auf die geeignete Aktivität durchmustert. Die Expression des Gens oder der Gene resultiert in der Herstellung des Fusionsproteins, das einer Kette des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren entspricht. Dieses Fusionsprotein kann dann behandelt werden, um das chimäre Homodimer der schweren Kette zu bilden.
  • Die Verfahren und Bedingungen für die Züchtung der erhaltenen transfizierten Zellen und für die Gewinnung des chimären Homodimeren der schweren Kette sind den Fachleuten hinreichend bekannt und können abhängig von dem spezifischen Expressionsvektor und der verwendeten Säugerwirtszelle variiert oder optimiert werden.
  • Die bevorzugten Wirtszellen für die Expression der chimären Homodimeren der schweren Kette sind Säugerzelllinien, einschließlich zum Beispiel die Affen-Nierenzellen-CV1-Linie, die mit SV40 transformiert ist (COS-7); die menschliche embryonale Nierenzelllinie 293; Nierenzellen von Hamsterjungen (BHK); DHFR-Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO); Affen-Nierenzellen (CV1); Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO-76); menschliche Zervixkarzinomzellen (HeLa); Nierenzellen des Hundes (MDCK); menschliche Lungenzellen (W138); menschliche Leberzellen (Hep G2); Brusttumorzellen der Maus (MMT 060562); eine Mauszelllinie (C127); und Myelomzelllinien.
  • Die Anmeldung offenbart ferner ein Verfahren zur Hemmung der HIV-Infektion einer CD4+-Zelle, umfassend die Behandlung der CD4+-Zelle mit dem chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer in einer wirksamen Menge, um die Infektion der Zelle zu hemmen.
  • Die Anmeldung offenbart weiterhin ein Verfahren zur Verhinderung, daß sich ein Individuum mit HIV infiziert, umfassend die Verabreichung an das Individuum des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren in einer wirksamen Menge, um zu verhindern, daß sich das Individuum mit HIV infiziert.
  • Obwohl die Anmeldung die Verabreichung des chimären Homodimeren der schweren Kette an verschiedene Individuen offenbart, sind AIDS-Patienten von besonderem Interesse. Verfahren zur Verabreichung des Homodimeren sind weiterhin auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt, und schließen zum Beispiel die subkutane, intramuskuläre und intravaskuläre Injektion, allein oder in Kombination mit anderen Mitteln wie AZT oder DDI ein.
  • Ferner wird ein Verfahren zur Behandlung eines Individuums, das mit HIV infiziert ist, bereitgestellt, um die Ausbreitung einer HIV-Infektion zu blockieren, umfassend die Verabreichung an das Individuum einer wirksamen Menge des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren, um die Ausbreitung einer HIV-Infektion zu blockieren.
  • Zum Beispiel kann das Homodimer an Patienten mit einer HIV-Infektion in einer Dosierung verabreicht werden, die in der Lage ist, eine Konzentration von mehr als etwa 100 ng des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren/ml Plasma aufrechtzuerhalten. Für Varianten des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren mit unterschiedlichen Molekulargewichten werden etwa 2 Picomole des löslichen Rezeptors pro ml Plasma verabreicht, wobei die Menge zum Beispiel ausreichend ist, um eine stöchiometrische Äquivalenz zwischen dem nativen (membrangebundenen) und löslichen Rezeptor zu etablieren. Typischerweise beträgt die Dosierung des löslichen CD4 etwa 100 μg/kg Patientengewicht/Tag.
  • Das vorstehende Verfahren kann angewendet werden, um die Verhinderung der Ausbreitung des HIV-Virus innerhalb des Körpers eines HIV-infizierten Patienten zu unterstützen. Außerdem kann das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer als eine prophylaktische Maßnahme verabreicht werden, um das Blut eines Individuums für die Ausbreitung des HIV-Virus weniger anfällig zu machen. Eine solche prophylaktische Verabreichung schließt die Verabreichung sowohl vor einem HIV-Kontakt als auch kurz danach oder beides ein.
  • Ferner wird ein Arzneimittel bereitgestellt, welches das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer in einer wirksamen Menge, um die HIV-Infektion einer CD4+-Zelle zu hemmen, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  • Pharmazeutisch verträgliche Träger sind auf dem Fachgebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, hinreichend bekannt und schließen, aber sind nicht begrenzt auf, 0,01–0,1 M und vorzugsweise 0,05 M Phosphatpuffer oder 0,8%ige Kochsalzlösung ein. Weiterhin können solche pharmazeutisch verträglichen Träger wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen sein. Beispiele nichtwäßriger Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Wäßrige Träger schließen Wasser, alkoholische/wäßrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen einschließlich Kochsalzlösung und gepufferte Medien ein. Parenterale Vehikel schließen Natriumchloridlösung, Ringer-Dextroselösung, Dextrose und Natriumchlorid, lactathaltige Ringerlösung oder nichtflüchtige Öle ein. Intravenöse Vehikel schließen Flüssigkeits- und Nährstoffergänzungsmittel, Elektrolytergänzungsmittel wie solche auf der Basis von Ringer-Dextroselösung und dergleichen ein. Konservierungsmittel und andere Zusätze können auch vorhanden sein, wie zum Beispiel antimikrobielle Mittel, Antioxidantien, Chelatbildner, Edelgase und dergleichen (38).
  • Die Anmeldung stellt ferner eine Zusammensetzung von Stoffen bereit, die ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer und ein damit verknüpftes Toxin umfaßt.
  • Einige Beispiele für Toxine sind die deglycosylierte A-Kette von Ricin, Domäne II oder III von Pseudomonas-Exotoxin A, das Diphtherie-Toxin oder ein Nichtpeptidyl-Cytotoxin. Diese Toxine können mittels herkömmlicher in vitro-Proteinvernetzungsmittel gebunden werden (39–41). Außerdem können die Toxine durch rekombinante Synthese in Form eines Fusionsproteins gebunden werden (vgl. zum Beispiel US-Patent 4,765,382).
  • Die Anmeldung stellt auch ein Diagnosemittel bereit, das ein chimäres CD4-schwere IgG2-Kette-Homodimer und einen damit verknüpften nachweisbaren Marker umfaßt. Durch die Verwendung eines Moleküls, welches an das HIV-Virus bindet und zusätzlich einen verknüpften nachweisbaren Marker aufweist, kann man Zellen identifizieren, die mit HIV infiziert sind. Beispiele herkömmlicher nachweisbarer Marker schließen Radioisotope wie I125, Chromophore und Fluorophore ein.
  • Auf diese Weise kann das chimäre Homodimer der schweren Kette in einem Test auf eine HIV- oder SIV-Virusinfektion in einer biologischen Probe durch das Inkontaktbringen einer Probe, die von einem Tier stammt, das im Verdacht steht, eine HIV- oder SIV-Infektion aufzuweisen, mit dem erfindungsgemäßen Homodimer und dem Nachweis, ob ein Komplex mit gp120 gebildet wird, entweder allein oder auf der Oberfläche einer HIV-infizierten Zelle, verwendet werden. Zu diesem Zweck kann das Homodimer mit einem nachweisbaren Marker markiert werden oder kann unmarkiert sein und wird dann mit einem anderen Reagens nachgewiesen, das nachweisbar markiert ist und spezifisch gegen das Homodimer oder gegen einen Komplex zwischen dem Homodimer und gp120 gerichtet ist.
  • Zum Beispiel kann eine biologische Probe mit Nitrocellulose oder einem anderen festen Träger, der in der Lage ist, Zellen, Zellpartikel oder lösliches Protein zu immobilisieren, behandelt werden. Der Träger kann dann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, gefolgt durch die Behandlung mit dem chimären Homodimer der schweren Kette, das nachweisbar markiert sein kann. Der Festphasenträger kann dann ein zweites Mal mit Puffer gewaschen werden, um ungebundenes Fusionsprotein zu entfernen, und das markierte Homodimer kann dann nachgewiesen werden.
  • Bei der Durchführung des Tests können die folgenden Schritte verwendet werden:
    • a) Inkontaktbringen einer Probe, die im Verdacht steht, gp120 zu enthalten, mit einem festen Träger, um eine Immobilisierung von gp120 zu bewirken, oder mit Zellen, die gp120 auf ihrer Oberfläche exprimieren;
    • b) Inkontaktbringen des festen Trägers mit dem nachweisbar markierten chimären Homodimer der schweren Kette;
    • c) Inkubieren des nachweisbar markierten Homodimeren mit dem Träger während eines ausreichenden Zeitraums, um die Bindung des Homodimeren an das immobilisierte gp120 oder an die Zelle, die gp120 auf ihrer Oberfläche exprimiert, zu ermöglichen;
    • d) Trennen des Festphasenträgers von dem in Schritt c) erhaltenen Inkubationsgemisch; und
    • e) Nachweisen des gebundenen markierten Homodimeren und dadurch Nachweisen von gp120.
  • Ein solches Verfahren kann entweder als ein qualitativer oder als ein quantitativer Test unter Anwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt sind, aufgebaut sein.
  • In einer anderen Ausführungsform kann der Komplex zwischen dem markierten Homodimer und gp120 durch Inkontaktbringen des Komplexes mit einem immobilisierten Antikörper oder einem Protein, das für ein Immunglobulin spezifisch ist, oder z.B. Protein A, Protein G oder anti-IgG-Antikörpern von dem Reaktionsgemisch getrennt werden. Solche anti-Immunglobulin-Antikörper können monoclonal oder polyclonal sein. Der feste Träger kann dann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, um einen immobilisierten gp120 markiertes Homodimer-Antikörper-Komplex zu erhalten. Der Marker auf dem Homodimer kann dann nachgewiesen werden, um endogenes gp120 zu messen und dadurch die Anwesenheit von HIV nachzuweisen.
  • Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zum Nachweis einer HIV- oder SIV-Virusinfektion in einer Probe, umfassend:
    • a) Inkontaktbringen einer Probe, die im Verdacht steht, gp120 zu enthalten, mit einem hierin offenbarten chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren und dem Fc-Teil einer Immunglobulinkette; und
    • b) Nachweisen, ob ein Komplex gebildet wird.
  • Die Anmeldung stellt auch Verfahren zum Nachweis von gp120 in einer Probe bereit, umfassend:
    • a) Inkontaktbringen eines Gemisches, welches durch das Inkontaktbringen einer Probe, die im Verdacht steht, gp120 zu enthalten, mit einem erfindungsgemäßen Homodimeren und dem Fc-Teil einer Immunglobulinkette erhalten wird, mit einem Fc-Bindungsmolekül wie einem Antikörper, Protein A oder Protein G, das auf einem Festphasenträger immobilisiert ist und für das Homodimer spezifisch ist, um einen immobilisierten gp120-Homodimer-Antikörper-Komplex zu erhalten;
    • b) Waschen des in Schritt (a) erhaltenen Festphasenträgers, um das ungebundene Homodimer zu entfernen; und
    • c) Nachweisen des Homodimeren.
  • Natürlich können die spezifischen Konzentrationen des unmarkierten oder nachweisbar markierten Homodimeren und von gp120, die Temperatur und die Inkubationszeit sowie andere Testbedingungen abhängig von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Konzentration von gp120 in der Probe, der Art der Probe und dergleichen, variiert werden. Fachleute sind ohne weiteres in der Lage, operative und optimale Testbedingungen für jede Bestimmung zu ermitteln.
  • Ebenfalls bereitgestellt wird ein enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA), um lösliches CD4 (sCD4) oder chimäre CD4-Proteine nachzuweisen und zu quantifizieren. Bei der Durchführung des Tests umfaßt das Verfahren:
    • a) Inkontaktbringen einer Probe, die sCD4 enthält, mit einem festen Träger, um lösliches sCD4 zu immobilisieren;
    • b) Inkontaktbringen des festen Trägers mit dem nachweisbar markierten monoclonalen Antikörper OKT4a allein oder mit einer Probe, die sCD4 oder chimäre CD4-Proteine und OKT4a enthält;
    • c) Inkubieren des Mediums, das den nachweisbar markierten OKT4a enthält, während eines ausreichenden Zeitraums, um die Bindung an das immobilisierte sCD4 zu ermöglichen;
    • d) Trennen des Festphasenträgers von dem Inkubationsgemisch aus Schritt (c);
    • e) Nachweisen des gebundenen OKT4a und dadurch Quantifizieren der in der Probe enthaltenen Menge an CD4.
  • Die Erfindung stellt einen Expressionsvektor bereit, der die schweren Ketten eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren codiert und als CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75193) bezeichnet wird. Die Erfindung stellt auch ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer bereit, dessen schweren Ketten durch diesen Expressionsvektor oder einen anderen Vektor, der die gleiche codierende Sequenz enthält, codiert werden.
  • Zusätzlich stellt die Erfindung einen Expressionsvektor bereit, der die leichten Ketten eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren codiert und als CD4-kLC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75194) bezeichnet wird. Schließlich stellt die Erfindung ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer bereit, dessen leichten Ketten durch den CD4-kLC-pRcCMV-Expressionsvektor oder einen anderen Vektor, der die gleiche codierende Sequenz enthält, codiert werden.
  • Ferner stellt die Erfindung ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer bereit, dessen schweren und leichten Ketten durch die vorstehend erwähnten Expressionsvektoren codiert werden.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines solchen chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren bereit, wobei das Verfahren umfaßt:
    • a) Cotransfizieren einer Säugerzelle mit dem Expressionsvektor zur Herstellung der leichten Ketten eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren und mit einem Expressionsvektor, der eine leichte Kette codiert;
    • b) Züchten der erhaltenen cotransfizierten Säugerzelle unter Bedingungen, so daß das chimäre CD4-IgG2-Heterotetramer hergestellt wird; und
    • c) Gewinnen des so hergestellten chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren.
  • Verfahren zur Cotransfektion von Säugerzellen sind auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt und schließen die vorstehend besprochenen ein. In ähnlicher Weise sind Expressionsvektoren, die leichte Ketten codieren, auf dem Fachgebiet hinreichend bekannt.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren bereit, umfassend:
    • a) Cotransfizieren einer Säugerzelle mit dem Expressionsvektor zur Herstellung der leichten Ketten eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren und mit einem Expressionsvektor, der eine schwere Kette von IgG1 codiert;
    • b) Züchten der erhaltenen cotransfizierten Säugerzelle unter Bedingungen, so daß ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer hergestellt wird; und
    • c) Gewinnen des so hergestellten chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren bereit, umfassend:
    • a) Cotransfizieren einer Säugerzelle mit dem Expressionsvektor zur Herstellung der schweren Ketten eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren und mit einem Expressionsvektor zur Herstellung der leichten Ketten eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren;
    • b) Züchten der erhaltenen cotransfizierten Säugerzelle unter Bedingungen, so daß das chimäre CD4-IgG2-Heterotetramer hergestellt wird; und
    • c) Gewinnen des so hergestellten chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren.
  • Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Hemmung der HIV-Infektion einer CD4+-Zelle ein, umfassend das Behandeln der CD4+-Zelle mit entweder einem chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren, dessen schwere Ketten durch den als CD4-IgG2HC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; einem chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren, dessen leichte Ketten durch den als CD4-kLC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; oder einem chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren, dessen schwere und leichte Ketten durch beide der vorstehenden Expressionsvektoren codiert werden, in einer wirksamen Menge, um die Infektion der Zelle zu hemmen.
  • Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, das verhindert, daß sich ein Individuum mit HIV infiziert. Dieses Verfahren umfaßt das Verabreichen an das Individuum von entweder einem chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren, dessen schwere Ketten durch den als CD4-IgG2HC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; einem chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren, dessen leichte Ketten durch den als CD4-kLC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; oder einem chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren, dessen schwere und leichte Ketten durch die vorstehenden Expressionsvektoren codiert werden, in einer wirksamen Menge, um zu verhindern, daß sich das Individuum mit HIV infiziert.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung eines mit HIV infizierten Individuums bereit, um die Ausbreitung einer HIV-Infektion zu blockieren. Dieses Verfahren umfaßt das Verabreichen an das Individuum von entweder einem chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren, dessen schwere Ketten durch den als CD4-IgG2HC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; einem chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren, dessen leichte Ketten durch den als CD4-kLC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; oder einem chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren, dessen schwere und leichte Ketten durch die vorstehenden Expressionsvektoren codiert werden, in einer wirksamen Menge, um die Ausbreitung einer HIV-Infektion zum Beispiel innerhalb des Individuums oder des Körpers eines AIDS-Patienten zu blockieren.
  • Die Erfindung stellt auch ein Arzneimittel bereit, das entweder ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer, dessen schwere Ketten durch den als CD4-IgG2HC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer, dessen leichte Ketten durch den als CD4-kLC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; oder ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer, dessen schwere und leichte Ketten durch die vorstehend beschriebenen Expressionsvektoren codiert werden, in einer wirksamen Menge, um die HIV-Infektion einer CD4+-Zelle zu hemmen, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  • Durch die Erfindung wird ferner eine Zusammensetzung von Stoffen bereitgestellt, die entweder ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer, dessen schwere Ketten durch den als CD4-IgG2HC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer, dessen leichte Ketten durch den als CD4-kLC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; oder ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer, dessen schwere und leichte Ketten durch die vorstehend beschriebenen Expressionsvektoren codiert werden, und ein damit verknüpftes Toxin umfaßt.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Toxin die deglycosylierte A-Kette von Ricin, Domäne II oder III von Pseudomonas-Exotoxin A, das Diphtherie-Toxin oder ein Nichtpeptidyl-Cytotoxin.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Diagnosemittel bereit, das entweder ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer, dessen schwere Ketten durch den als CD4-IgG2HC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer, dessen leichte Ketten durch den als CD4-kLC-pRcCMV bezeichneten Expressionsvektor codiert werden; oder ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer, dessen schwere und leichte Ketten durch diese Expressionsvektoren codiert werden, und einen damit verknüpften nachweisbaren Marker umfaßt. Beispiele für geeignete nachweisbare Marker sind Radioisotope, Chromophore oder Fluorophore.
  • Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erleichtern, wird auf Maniatis et al. (42) verweisen, worin bestimmte häufig vorkommende Verfahren und/oder Begriffe am besten beschrieben sind.
  • Diese Erfindung wird in dem nachstehenden Abschnitt Versuchseinzelheiten veranschaulicht. Dieser Abschnitt wird angegeben, um die Erfindung verständlicher zu machen, aber soll die Erfindung, so wie in den nachfolgenden Ansprüchen dargelegt ist, in keiner Weise begrenzen oder als eine Begrenzung davon gedeutet werden.
  • Versuchseinzelheiten
  • A. Materialien und Methoden
  • 1. Konstruktion eines chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Gens, das ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer codiert
  • Die menschliche CD4-cDNA wurde aus dem Plasmid pSP6T4 (4) als ein EcoRI/StuI-Restriktionsfragment ausgeschnitten. Das 0,70 Kilobasen große Fragment wurde isoliert und in dem mit EcoRI/SmaI geschnittenen Vektor M13mp18 cloniert. Dieses Vektor-Zwischenprodukt (M13mp18(CD4)) wurde dann isoliert, mit PstI linearisiert, gereinigt und mit Bakterieller Alkalischer Phosphatase (BAP) behandelt. Das 2,0 Kb große PstI/PstI-Fragment aus dem Plasmid pBr-gamma2, welches das Gen für die schwere Kette von menschlichem gamma2 enthält (36) (enthaltend die Gelenkregion-, CH2- und CH3-Exons), wurde isoliert und in den mit BAP behandelten M13mp18/CD4-Vektor cloniert. Die erhaltenen Rekombinanten wurden dann auf die richtige Orientierung des PstI-Fragments (im Hinblick auf die CD4-Sequenz) durchmustert, um einen Vektor zu erhalten, der CD4 (EcoRI/StuI) – gamma2 (PstI/PstI) in einer Tandemanordnung enthält. Um ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Gen zu erhalten, wurde eine Oligonucleotid vermittelte ortsspezifische Mutagenese durchgeführt, um die DNA-Sequenzen von CD4 und der schweren gamma2-Kette aneinanderzulagern, wobei die CD4-Sequenz im Leseraster mit dem Exon für die Gelenkregion ligiert wurde. Das erhaltene chimäre DNA-Molekül codiert ein Protein, das die V1V2-Domänen von CD4, gefolgt durch die Gelenkregion-, CH2- und CH3-Domänen der schweren gamma2-Kette, enthält (1A). Die Mutagenese wurde an einem DNA-Einzelstrang durchgeführt, der aus einem rekombinanten Phagen aus transformierten TG1-Zellen (Amersham) isoliert wurde. Kurz zusammengefaßt wurde eine Matrizen-DNA an ein 34-mer-Oligonucleotid (5'-GACACAACATTTGCGCTCGAAAGCTAGCACCACG-3') angelagert, das Sequenzen enthält, welche das letzte Codon, das Phe (179) aus V1V2 von CD4 codiert, mit dem ersten Codon der Gelenkregion für IgG2 (codierend Glu) verknüpfen (1A und 3). Nach der Synthese des Sekundärstrangs wurde der DNA-Doppelstrang in kompetente TG1-Zellen transformiert. Isolierte Plaques wurden dann in frischen TG1-Zellen vermehrt, und der DNA-Einzelstrang wurde für eine DNA-Sequenzierung gereinigt. Alle Mutationen wurden durch eine Didesoxy-Sequenzierung unter Verwendung des Sequenase-Systems (USB) überprüft und bestätigt. Plaques, die das chimäre Gen mit der richtigen Sequenz enthielten, wurden anschließend in TG1-Zellen vermehrt, und aus diesen Zellen wurde die Rf-DNA (bezeichnet als CD4-IgG2-Rf) isoliert.
  • 2. Konstruktion eines Säugerexpressionsvektors, der ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer codiert
  • Das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Gen wurde aus der rekombinanten Rf-DNA isoliert, gefolgt durch eine Rf-Linearisierung mit EcoRI. Die EcoRI-Stellen in der linearisierten DNA wurden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt. Die mit glatten Enden versehene DNA wurde dann über Nacht bei 15°C mit der T4-DNA-Ligase mit einem 100-fachen molaren Überschuß von HindIII-Linkern ligiert. Nach einer Hitzeinaktivierung der T4-DNA-Ligase während 15 Minuten bei 70°C wurde die mit HindIII-Linkern versehene DNA mit HinIII ausgiebig geschnitten, um ein Fragment freizusetzen, welches das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Gen enthält. Dieses HinIII-Fragment wurde dann gereinigt und mit dem Expressionsvektor pcDNA-1 (Invitrogen) ligiert, der vorher mit HinIII gespalten und mit BAP behandelt worden war. Das erhaltene Plasmid wurde dann in MC1061/P3-Zellen transformiert. Die Plasmid-DNA wurde aus rekombinanten Clonen isoliert, und die Überprüfung der Anwesenheit der HinIII-Insertion und der Orientierung der Insertion im Hinblick auf den Cytomegalievirus (CMV)-Promotor in dem Plasmid erfolgte mittels Restriktionsenzymanalyse. Das erhaltene Säuger expressionsplasmid, das ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer codiert, wird als CD4-IgG2-pcDNA1 bezeichnet.
  • 3. Expression von CD4-IgG2-pcDNA1 in Säugerzellen
  • a. Vorübergehende Expression
  • CosM5-Zellen, gezüchtet in DMEM, enthaltend 10% fötales Kälberserum, wurden bei 75% Konfluenz aufgeteilt. Am folgenden Tag wurden die Zellen für 16–20 Stunden durch die herkömmliche CaPO4-Präzipitationstechnik mit 10 μg CsCl-gereinigter CD4-IgG2-pcDNA1-Plasmid-DNA transfiziert. Nach der Transfektion wurde zu den Zellen frisches Medium zugegeben. Die Analyse der Produkte, die 48–72 Stunden nach der Transfektion synthetisiert wurden, wurde mittels radioaktiver Markierung von Transfektanten mit 35S-Methionin während 12–18 Stunden, gefolgt durch eine Fällung der Medien und Zelllysate unter Verwendung von anti-CD4-Antikörpern oder durch Inkubation mit Protein A-Sepharose-Kügelchen allein, gefolgt durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen, durchgeführt (6). Zusätzlich wurde 48–72 Stunden nach der Transfektion eine Analyse der Medien und Zelllysate durch herkömmliche Western-Blot-Verfahren durchgeführt.
  • b. Stabile Expression
  • Dhfr-Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) wurden mit 20 μg CsCl gereinigter DNA in einem molaren Verhältnis von 1000:1 von CD4-IgG2-pcDNA1:p410 (p410 ist ein Expressionsplasmid, welches das dhfr-Gen enthält) transfiziert, obgleich andere Verhältnisse auch verwendet werden können. Ungefähr 3–5 Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in Selektionsmedium (nucleosidfreies alpha-MEM, enthaltend 10% dialysiertes fötales Kälberserum) überführt. Etwa 10–15 Tage nach der Selektion wurden einzelne Zellclone ausgewählt und durch mehrere Durchmusterungstechniken wie ELISA und Fällung mit Protein A-Sepharose-Kügelchen, gefolgt durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen, auf eine stabile Expression des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren untersucht. Clone, die die größten Mengen exprimierten, wurden aufeinanderfolgenden Runden einer Amplifikation der neu eingeschleusten DNA-Sequenzen bei ansteigenden Konzentrationen von Methotrexat unterzogen.
  • Auf diese Weise wurden stabile CHO-Zelllinien erzeugt, die zwischen 10–100 μg/ml des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren sezernierten.
  • 4. Reinigung eines chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren aus CHO konditioniertem Medium
  • Das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer wurde mittels Protein A-Sephanose-Säulenchromatographie in einem einzigem Schritt gereinigt. CHO-Zellen, die das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer sezernierten, wurden in Rollerflaschen in einem Medium, das alpha-MEM mit 10% IgG-freiem fötalem Kälberserum enthielt, bis zu einer hohen Dichte gezüchtet. Das konditionierte Medium wurde gesammelt, durch Zentrifugation geklärt und mit PBS, mit oder ohne Detergens (d.h. Tween), in diesem Puffer und den nachfolgenden Puffern 1:1 verdünnt. Das verdünnte Medium wurde dann auf eine 5 ml-Protein A-Sepharose-Fast Flow-Säule, die mit PBS vorher äquilibriert worden war, in einer Durchflußrate von 60 ml/Stunde aufgetragen. Nach gründlichem Waschen wurde das spezifisch gebundene Material mit 100 mM Glycin/HCl, pH 3,5, direkt in ein Aliquot von 1 M Tris-HCl, pH 8,0, eluiert, um die eluierten Fraktionen sofort zu neutralisieren. Die Fraktionen wurden dann durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen, gefolgt durch eine Silberfärbung, analysiert und vereinigt (8).
  • Die vereinigten Fraktionen wurden dann auf eine 10 ml-S-Sepharose Fast Flow-Säule, die mit 50 mM BES, pH 7,0, vorher äquilibriert worden war, in einer Durchflußrate von 120 ml/h aufgetragen. Nach dem Auftragen der Probe wurde ein Elutionsstufengradient (bestehend aus den folgenden vier Schritten: 5 Säulenvolumina von 50 mM BES, pH 7,0; 4 Säulenvolumina von 50 mM BES, pH 7,0, 100 mM NaCl; 6 Säulenvolumina von 50 mM BES, pH 7,0, 225 mM NaCl; gefolgt durch 8 Säulenvolumina von 50 mM BES, pH 7,0, 500 mM NaCl) für die spezifische Elution des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren verwendet. Das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer wurde in 50 mM BES, pH 7,0, 500 mM NaCl, aus der Säule eluiert. Die Peakfraktionen wurden anschließend vereinigt und konzentriert, um eine Proteinendkonzentration von mindestens 1 mg/ml zu erhalten. Die vereinigten und konzentrierten Fraktionen wurden dann auf eine 120 ml-Sephacryl S-300HR-Säule, die mit PBS vorher äquilibriert worden war, in einer Durchflußrate von 8 ml/h aufgetragen. Die Fraktion des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren wurde speziell in PBS eluiert und auf mindestens 1 mg/ml konzentriert.
  • 5. Nachweis der Bindung eines chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren an das HIV-Hüllglycoprotein gp120
  • CosM5-Transfektanten, die das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer exprimieren, wurden für 72 Stunden in DMEM, enthaltend 10% IgG-freies fötales Kälberserum, inkubiert. Das unmarkierte Medium wurde dann gesammelt und dazu verwendet, mit 35S-Methionin radiomarkiertes HIV-gp120 zu fällen. Nach Inkubation des das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer enthaltenden Mediums, das 35S-Methionin markiertes gp120 enthält, wurden die Komplexe an Protein A-Sepharose adsorbiert. Die Protein A-Sepharose-Komplexe wurden durch Zentrifugation gewonnen, und die Präzipitate wurden durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, gefolgt durch eine Fluorographie, analysiert (7). Alternativ wurden auch Aliquots eines gereinigten chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren aus CHO-Zellen verwendet, um 35S-radiomarkiertes gp120 mit Hilfe des gleichen Verfahrens zu fällen.
  • 6. Bestimmung der Plasmahalbwertszeit und des Plazentatransfers eines chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren
  • Die Bestimmung der Plasmahalbwertszeit und des Plazentatransfers wird durch gut eingeführte Techniken ausgeführt. Kurz zusammengefaßt wird Kaninchen oder Affen ein gereinigtes chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer intravenös oder intramuskulär injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion werden Plasmaproben entnommen, und die Menge des in dem Serum vorhandenen chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren wird durch einen ELISA gemessen. Außerdem wird auch trächtigen Affen ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer entweder IV oder IM injiziert und dessen Konzentration im Nabelschnurblut und im Serum des neugeborenen Affens bestimmt. Die Bestimmung und der Vergleich der Menge des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren im Serum der Mutter sowie im Nabelschnurblut und im Serum des Neugeborenen geben die relative Transportrate dieser Moleküle über die Plazenta an.
  • 7. Bestimmung der FcR-Bindung und Makrophagen-Infektiosität eines chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren
  • Die Bestimmung der FcR-Bindung und Makrophagen-Infektiosität eines chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren wird durch gut eingeführte Techniken ausgeführt. Für diese Studien werden U937-Zellen (eine menschliche Monocyten-Zelllinie, die FcRI und FcRII exprimiert), gereinigte Monocyten/Makrophagen-Populationen aus menschlichem peripherem Blut und HeLa-Zellen, die rekombinante menschliche FcRs konstitutiv exprimieren, verwendet. Ferner sind im Handel monoclonale Antikörper erhältlich, die für FcRI und FcRII spezifisch sind. Kurz zusammengefaßt wird ein radiomarkiertes monomeres oder aggregiertes chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer mit den vorstehenden Zellen und geeigneten Kontrollzellen bei 4°C während verschiedener Zeiträume inkubiert. Am Ende jeder Inkubation werden die Zellen solubilisiert, und die zellassoziierte Radioaktivität wird bestimmt, um die an jeden Zelltyp spezifisch gebundene Menge des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren festzustellen. Als Kontrolle wird ein radiomarkiertes monomeres oder aggregiertes normales menschliches IgG2 verwendet, um das Ausmaß einer spezifischen Antikörperbindung zu bestimmen. Außerdem wird durch eine Kompetition der radiomarkierten Komponente mit einem unmarkierten monomeren oder aggregierten normalen menschlichen IgG2 oder mit monoclonalen Antikörpern gegen FcRI oder FcRII die Bindungseffizienz und -spezifität eines chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren für jeden Zelltyp ermittelt.
  • Um festzustellen, ob das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer eine Verschlimmerung der HIV-Infektion von Monocyten/Makrophagen vermittelt, wird HIV-1 mit Medium allein oder mit entweder einem monomeren oder aggregierten chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren in mehreren Verdünnungen inkubiert. Als Kontrolle wird Serum von normalen Individuen und HIV-infizierten Individuen verwendet (31). Nach Inkubation für eine Stunde bei 4°C wird das "opsonisierte" Virus zu den im vorherigen Absatz beschriebenen Zelltypen zugegeben. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wird das Medium geerntet und auf eine virale reverse Transkriptaseaktivität untersucht, um das Ausmaß der Virusinfektion zu bestimmen. Als Kontrolle wird sCD4, OKT4a oder Leu3a während der Infektion der Zellen eingeschlossen. Zusätzlich werden verschiedene Verdünnun gen des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren und geeignete Kontrollen zuerst mit den Zellen bei 4°C inkubiert, um eine Bindung zu ermöglichen. Anschließend wird HIV zugegeben, und eine Infektion wird durch eine virale reverse Transkriptaseaktivität festgestellt.
  • 8. HIV-Bindungstest
  • Die Bindung von HIV wurde durchgeführt, wie bereits beschrieben wurde (43, 44). Kurz zusammengefaßt wurden konzentrierte HIV-1-Präparationen mit verschiedenen Verdünnungen von sCD4, CD4-gamma1 oder CD4-gamma2 während 30 Minuten inkubiert und anschließend zu 5 × 105 CEM-Zellen zugegeben. Das gebundene Virus wurde durch indirekte Immunfluoreszenz und Cytofluorographie, wie bereits beschrieben (44), nachgewiesen.
  • 9. Neutralisierungstest
  • Der Mikrokultur-Test auf eine produktive Virusreplikation wurde durchgeführt, wie bereits beschrieben wurde (43, 45). Kurz zusammengefaßt wurden Verdünnungen von sCD4, CD4-gamma1 oder CD4-gamma2 während 30 Minuten mit 100 TCID50 HIV-1 bei Raumtemperatur inkubiert. Die Gemische wurden zu PHA-stimulierten Lymphocyten zugegeben und bei 37°C über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und in Mikrokulturen bei 1 × 105 Zellen/Kultur plattiert, und 10 Kulturen pro Verdünnung wurden 8 und 12 Tage später durch Nachweis eines HIV-Antigens in den Kulturüberständen auf eine produktive Virusreplikation überprüft.
  • B. Konstruktion eines chimären CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküls und eines chimären CD4-leichte kappa-Kette-Moleküls für die Expression eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren
  • 1. Einführung
  • Diese Erfindung beschreibt ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Gen, codierend ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer, das aus transformierten Säugerzellen wirksam sezerniert wird. Dieses chimäre Molekül wurde derart konstruiert, daß es Sequenzen aus der schweren Kette des menschlichen IgG2 enthält, die eine effiziente Zusammenlagerung und Sekretion des Homodimeren ermöglichen. Die CH1-Region der schweren Ketten von IgG ist für das intrazelluläre Zurückhalten der Moleküle der schweren Kette und für die Bildung von Heterotetrameren mit leichten Ketten verantwortlich (25). Um chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimere wirksam herzustellen, fehlt dem vorstehend beschriebenen chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Gen spezifisch die CH1-Domäne. Das erhaltene Homodimer enthält zwei CD4-V1V2-Einheiten und besitzt daher das Potential, im Hinblick auf eine gp120-Bindung bivalent zu sein und eine erhöhte Affinität für HIV verglichen mit sCD4 aufzuweisen.
  • Zusätzlich beschreibt diese Erfindung die Konstruktion von chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren, die zwei schwere Ketten und zwei leichte Ketten enthalten. Das erhaltene Heterotetramer, das zwei oder vier CD4-V1V2-Einheiten enthält, besitzt das Potential, im Hinblick auf eine gp120-Bindung tetravalent zu sein und eine erhöhte Affinität für HIV verglichen mit sCD4 aufzuweisen. Das chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Gen, das verwendet wird, um ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer herzustellen, enthält die gesamte konstante Region der schweren Kette einschließlich der CH1-Domäne. Die Einbeziehung der CH1-Domäne ermöglicht eine wirksame intrazelluläre Zusammenlagerung mit den leichten Ketten, wodurch ein Potential für sezernierte, durch Disulfidbrücken verknüpfte Heterotetramere bereitgestellt wird. Sowohl das chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Gen als auch das chimäre CD4-leichte kappa-Kette-Gen enthält die V1V2-Domänen von CD4. Versuche, chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküle oder chimäre CD4-leichte kappa-Kette-Moleküle zu exprimieren (entweder allein oder in Kombination miteinander), welche nur die V1-Domäne von CD4 enthalten, waren erfolglos.
  • 2. Konstruktion eines Expressionsvektors für das chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Molekül und eines Expressionsvektors für das chimäre CD4-leichte kappa-Kette-Molekül für die Herstellung von chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren
  • a. Konstruktion eines Säugerexpressionsvektors für das chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Molekül
  • Die menschliche CD4-cDNA-Sequenz wird aus dem Plasmid pSP6T4 (4) als ein EcoRI/StuI-Restriktionsfragment ausgeschnitten. Das 0,70 Kilobasen große Fragment wird isoliert und in den mit EcoRI/SmaI geschnittenen Vektor M13mp18 cloniert. Der erhaltene Vektor (M13mp18(CD4)) wird dann isoliert und mit BamHI geschnitten. Die BamHI-Stellen des M13mp18(CD4)-Vektors werden mit dem Klenow- Fragment von DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen. Nach einer Hitzeinaktivierung der Polymerase für 15 Minuten bei 65°C wird der linearisierte M13mp18(CD4)-Vektor dann mit PstI geschnitten und gereinigt.
  • Um ein Fragment auszuschneiden, das das CH1-Exon des Gens der schweren Kette des menschlichen gamma2 enthält, wird das Plasmid pBr-gamma2 (36) mit SacII geschnitten, und die SacII-Stellen werden dann unter Verwendung der T4-DNA-Polymerase mit glatten Enden versehen. Nach einer Hitzeinaktivierung der Polymerase wird das Fragment dann mit PstI geschnitten. Das erhaltene SacII (mit glatten Enden versehen)-PstI-Fragment, welches das CH1-Exon enthält, wird dann gereinigt und mit dem im vorherigen Absatz beschriebenen M13mp18(CD4)-Vektor ligiert. Nach der Transformation von kompetenten TG1-Zellen werden die erhaltenen Rekombinanten mittels Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit von sowohl CD4- als auch CH1-Sequenzen durchmustert, die CD4 (EcoRI/StuI) – CH1 (SacII (mit glatten Enden versehen)-PstI) in einer Tandemanordnung enthalten. Anschließend wird eine Oligonucleotid gerichtete ortsspezifische Mutagenese durchgeführt, um die CD4- und CH1-Sequenzen im Leseraster aneinanderzulagern. Das erhaltene chimäre DNA-Molekül enthält die V1V2-Domänen von CD4 fusioniert mit der CH1-Domäne der schweren Kette von gamma2. Die Mutagenese wird an einem DNA-Einzelstrang durchgeführt, der aus einem rekombinanten Phagen aus transformierten TG1-Zellen (Amersham) isoliert wurde. Die Matrizen-DNA wird an ein 33-mer-Oligonucleotid (5'-GGGCCCTTGGTGGAGGCGAAAGCTAGCACCACG-3') angelagert, das Sequenzen enthält, die das letzte Codon, das Phe (179) aus V1V2 von CD4 codiert, mit dem ersten Codon der CH1-Domäne für die schwere Kette von gamma2 (codierend Ala) verknüpft. Nach der Synthese des Sekundärstrangs wird der DNA-Doppelstrang in kompetente TG1-Zellen transformiert. Isolierte Plaques werden dann in frischen TG1-Zellen vermehrt, und der DNA-Einzelstrang wird für eine DNA-Sequenzierung gereinigt. Alle Mutationen werden durch eine Didesoxy-Sequenzierung unter Verwendung des Sequenase-Systems (USB) bestätigt. Plaques, welche die chimären Gene mit der richtigen Sequenz enthalten, wie mittels Restriktionsanalyse bestimmt wurde, werden dann in TG1-Zellen vermehrt, und aus diesen Zellen wird die Rf-DNA isoliert.
  • Die Rf-DNA von dem chimären CD4-CH1-Gen wird dann durch Spalten mit PstI linearisiert. Der mit PstI linearisierte Vektor wird dann mit BAP behandelt und mit dem PstI-PstI-DNA-Fragment des Plasmids pBr-gamma2, das die Gelenkregion-, CH2- und CH3-Exons des Gens der schweren Kette des menschlichen gamma2 enthält, ligiert. Die richtige Orientierung des PstI-PstI-Fragments im Hinblick auf das chimäre CD4-CH1-Fragment wird dann mittels Restriktionsanalyse überprüft. Das erhaltene chimäre Gen codiert ein Protein, das die V1V2-Domänen von CD4, gefolgt durch die CH1-, Gelenkregion-, CH2- und CH3-Regionen der schweren Kette von gamma2, enthält (2A, 2B und 4).
  • Das chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-DNA-Molekül wird aus der rekombinanten Rf-DNA isoliert, gefolgt durch die Rf-Linearisierung mit EcoRI. Die EcoRI-Stellen in der linearisierten DNA werden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt. Die mit glatten Enden versehene DNA wird dann über Nacht bei 15°C unter Verwendung der T4-DNA-Ligase mit einem 100-fachen molaren Überschuß von HinIII-Linkern ligiert. Nach einer Hitzeinaktivierung der T4-DNA-Ligase für 15 Minuten bei 70°C wird die mit HinIII-Linkern versehene DNA mit HinIII ausgiebig geschnitten, um ein Fragment freizusetzen, welches das chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Gen enthält. Dieses HinIII-Fragment wird dann gereinigt und mit dem Expressionsvektor pcDNA-1 (Invitrogen) ligiert, der vorher mit HinIII geschnitten und mit BAP behandelt wurde. Das erhaltene Plasmid wird dann in MC1061/P3-Zellen transformiert. Die Plasmid-DNA wird aus rekombinanten Clonen isoliert, und die Bestätigung der Anwesenheit der HinIII-Insertion und der Orientierung der Insertion im Hinblick auf den Cytomegalievirus (CMV)-Promotor in dem Plasmid erfolgt mittels Restriktionsanalyse. Das erhaltene Säugerexpressionsplasmid, das ein chimäres CD4-schwere IgG2-Kette-Molekül codiert, wird als CD4-IgG2HC-pRcCMV bezeichnet.
  • b. Konstruktion eines Säugerexpressionsvektors für das chimäre CD4-leichte kappa-Kette-Molekül
  • Die konstante Region der menschlichen leichten kappa-Kette wird aus dem Plasmid pCNkappa-leicht als ein MseI-Fragment ausgeschnitten. Das gereinigte MseI-Fragment wird unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I mit glatten Enden versehen. Anschließend wird M13mp18-Rf mit HincII linearisiert, und das mit glatten Enden versehene MseI-Fragment der leichten Kette Kappa wird mit M13mp18 an der mit glatten Enden versehenen HincII-Stelle in den Vektor ligiert. Nach der Transformation von TG1-Zellen werden die Rekombinanten mittels Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit der Insertion und die richtige Orientierung innerhalb des Vektors überprüft. Rf wird aus infizierten TG1-Zellen gereinigt und mit EcoRI und SmaI geschnitten. Der gereinigte Vektor, der die konstante Region der leichten kappa-Kette enthält, wird dann mit dem EcoRI/StuI-Fragment der vorstehend beschriebenen menschlichen CD4-cDNA ligiert. Die erhaltenen Rekombinanten werden dann auf die Anwesenheit und Orientierung beider Insertionen, die CD4 (EcoRI/StuI) – Ckappa (MseI (mit glatten Enden versehen)/MseI (mit glatten Enden versehen) in Tandemanordnung enthalten, überprüft, und die einzelsträngige DNA wird für eine Oligonucleotid gerichtete ortsspezifische Mutagenese gereinigt. Die Matrizen-DNA wird an ein 33-mer-Oligonucleotid (5'-GATGGTGCAGCCACAGTGAAAGCTAGCACCACG-3') angelagert, das Sequenzen enthält, die das letzte Codon, das Phe (179) aus V1V2 von CD4 codiert, mit dem ersten Codon der konstanten Domäne der leichten kappa-Kette (codierend Thr) verknüpft. Nach der Synthese des Sekundärstrangs wird der DNA-Doppelstrang in kompetente TG1-Zellen transformiert, und isolierte Plaques werden dann in frischen TG1-Zellen für eine DNA-Sequenzierung vermehrt. Die Anwesenheit der Mutation wird mittels Didesoxy-Sequenzierung bestätigt. Plaques, die chimäre Gene mit der richtigen Sequenz enthalten, werden dann in TG1-Zellen vermehrt, und aus diesen Zellen wird die Rf-DNA isoliert. Das erhaltene DNA-Molekül codiert ein Protein, das die V1V2-Domänen von CD4, gefolgt durch die konstante Region der leichten kappa-Kette, codiert (2A, 2B und 5).
  • Das chimäre CD4-leichte kappa-Kette-DNA-Molekül wird aus der rekombinanten Rf-DNA isoliert, gefolgt durch eine Rf-Linearisierung mit EcoRI. Die EcoRI-Stellen in der linearisierten DNA werden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt. Die mit glatten Enden versehene DNA wird dann über Nacht bei 15°C unter Verwendung der T4-DNA-Ligase mit einem 100-fachen molaren Überschuß von HinIII-Linkern ligiert. Nach einer Hitzeinaktivierung der T4-DNA-Ligase für 15 Minuten bei 70°C wird die mit HinIII-Linkern versehene DNA mit HinIII ausgiebig geschnitten, um ein Fragment freizusetzen, welches das chimäre CD4-leichte kappa-Kette-Gen enthält. Dieses HinIII-Fragment wird dann gereinigt und mit dem Expressionsvektor pcDNA-1 (Invitrogen) ligiert, der vorher mit HinIII geschnitten und mit BAP behandelt wurde. Das erhaltene Plasmid wird dann in MC1061/P3-Zellen transformiert. Die Plasmid-DNA wird aus rekombinanten Clonen isoliert, und die Überprüfung der Anwesenheit der HindIII-Insertion und der Orientierung der Insertion im Hinblick auf den Cytomegalievirus (CMV)-Promotor in dem Plasmid erfolgt mittels Restriktionsenzymanalyse. Das erhaltene Säugerexpressionsplasmid, das ein chimäres CD4-leichte kappa-Kette-Molekül codiert, wird als CD4-kLC-pRcCMV bezeichnet.
  • 3. Coexpression von CD4-IgG2HC-pRcCMV und CD4-kLC-pRcCMV in Säugerzellen zur Herstellung eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren
  • a. Vorübergehende Expression
  • CosM5-Zellen, gezüchtet in DMEM, enthaltend 10% fötales Kälberserum, werden bei 75% Konfluenz aufgeteilt. Am folgenden Tag werden die Zellen durch die herkömmliche CaPO4-Präzipitationstechnik für 16–20 Stunden mit 5 μg CsCl gereinigter CD4-IgG2HC-pRcCMV-DNA und 5 μg CsCl gereinigter CD4-kLC-pRcCMV-DNA transfiziert. Nach der Transfektion wird frisches Medium zu den Zellen zugegeben. Die Analyse der Produkte, die 48–72 Stunden nach der Transfektion synthetisiert werden, erfolgt durch radioaktive Markierung von Transfektanten mit 35S-Methionin während 12–18 Stunden, gefolgt durch Fällung der Medien und Zelllysate unter Verwendung von anti-CD4-Antikörpern oder durch Inkubation mit Protein A-Sepharose-Kügelchen allein, gefolgt durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen. Zusätzlich wurde 48–72 Stunden nach der Transfektion eine Analyse der Medien und Zelllysate durch herkömmliche Western-Blot-Verfahren durchgeführt.
  • b. Stabile Expression
  • Dhfr-Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) werden mit 20 μg CsCl gereinigter DNA in einem Verhältnis von 1000:1000:1 von CD4-IgG2HC-pRcCMV:CD4-kLC-pRcCMV:p410 (p410 ist ein Expressionsplasmid, welches das dhfr-Gen enthält) transfiziert, obgleich andere Verhältnisse auch verwendet werden können. Ungefähr 3–5 Tage nach der Transfektion werden die Zellen in Selektionsmedium (nucleosidfreies alpha-MEM, enthaltend 10% dialysiertes fötales Kälberserum) überführt. Etwa 10–15 Tage nach der Selektion werden einzelne Zellclone ausgewählt. Die Clone werden dann durch mehrere Durchmusterungstechniken wie ELISA und Fällung mit Protein A-Sepharose-Kügelchen, gefolgt durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen, auf eine stabile Expression von chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren untersucht. Clone, die die größten, Mengen exprimieren, werden aufeinanderfolgenden Runden einer Amplifikation der neu eingeschleusten DNA-Sequenzen bei ansteigenden Konzentrationen von Methotrexat unterzogen. Auf diese Weise werden stabile CHO-Zelllinien erzeugt, die große Mengen des chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren sezernieren.
  • 4. Reinigung von chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren aus CHO konditioniertem Medium
  • Die chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren werden mittels Protein A-Sepharose-Säulenchromatographie gereinigt. CHO-Zellen, die chimäre CD4-IgG2-Heterotetramere sezernieren, werden in Rollerflaschen in einem Medium, das alpha-MEM mit 10% IgG-freiem fötalem Kälberserum enthält, bis zu einer hohen Dichte gezüchtet. Das konditionierte Medium wird gesammelt, durch Zentrifugation geklärt und mit PBS mit/ohne Detergens (d.h. Tween) in diesem Puffer und nachfolgenden Puffern 1:1 verdünnt. Das verdünnte Medium wird dann auf eine 5 ml-Protein A-Sepharose-Fast Flow-Säule, die mit PBS vorher äquilibriert wurde, in einer Durchflußrate von 60 ml/Stunde aufgetragen. Nach gründlichem Waschen wird das gebundene Material mit 100 mM Glycin/HCl, pH 3,5, direkt in ein Aliquot von 1 M Tris-HCl, pH 8,0, eluiert, um die eluierten Fraktionen sofort zu neutralisieren. Die Fraktionen werden dann durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen, gefolgt durch eine Silberfärbung, analysiert und vereinigt (8).
  • 5. Nachweis der Bindung eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren an das Hüllglycoprotein gp120
  • CosM5-Transfektanten, die chimäre CD4-IgG2-Heterotetramere exprimieren, werden während 72 Stunden in DMEM, enthaltend 10% IgG-freies fötales Kälberserum, inkubiert. Anschließend wird das unmarkierte Medium gesammelt und dazu verwendet, mit 35S-Methionin radioaktiv markiertes HIV-gp120 zu fällen. Nach Inkubation des das chimäre CD4-IgG2-Heterotetramer enthaltenden Mediums mit dem 35S-Methionin markierten gp120 werden die Komplexe an Protein A-Sepharose adsorbiert. Die Protein A-Sepharose-Komplexe werden durch Zentrifugation gewon nen, und die Präzipitate werden durch eine SDS-PAGE, gefolgt durch eine Fluorographie, analysiert. Alternativ werden auch Aliquots von gereinigten chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren aus CHO-Zellen verwendet, um 35S-radiomarkiertes gp120 durch das gleiche Verfahren zu fällen.
  • 6. Bestimmung der Plasmahalbwertszeit und des Plazentatransfers eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren
  • Die Bestimmung der Plasmahalbwertszeit und des Plazentatransfers erfolgt durch gut eingeführte Techniken. Kurz zusammengefaßt wird Kaninchen oder Affen ein gereinigtes chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer intravenös oder intramuskulär injiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion werden Plasmaproben entnommen, und die Menge des in dem Serum vorhandenen chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren wird durch einen ELISA gemessen. Außerdem wird auch trächtigen Affen ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer entweder IV oder IM injiziert, und dessen Konzentration wird im Nabelschnurblut und im Serum des neugeborenen Affens bestimmt. Die Bestimmung und der Vergleich der Menge des chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren im Serum der Mutter sowie im Nabelschnurblut und im Serum des Neugeborenen geben die relative Transportrate dieser Moleküle über die Plazenta an.
  • 7. Bestimmung der FcR-Bindung und Makrophagen-Infektiosität eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren
  • Die Bestimmung der FcR-Bindung und Makrophagen-Infektiosität eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren erfolgt durch gut eingeführte Techniken. Für diese Studien werden U937-Zellen (eine menschliche Monocyten-Zelllinie, die FcRI und FcRII exprimiert), gereinigte Monocyten/Makrophagen-Populationen aus menschlichem peripherem Blut und HeLa-Zellen, die rekombinante menschliche FcRs konstitutiv exprimieren, verwendet. Ferner sind im Handel monoclonale Antikörper erhältlich, die für FcRI und FcRII spezifisch sind. Kurz zusammengefaßt wird ein radiomarkiertes monomeres oder aggregiertes chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer mit den vorstehenden Zellen und geeigneten Kontrollzellen bei 4°C während verschiedener Zeiträume inkubiert. Am Ende jeder Inkubation werden die Zellen solubilisiert, und die zellassoziierte Radioaktivität wird bestimmt, um die an jeden Zelltyp spezifisch gebundene Menge des chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren zu ermitteln. Als Kontrolle wird radiomarkiertes monomeres oder aggregiertes normales menschliches IgG2 verwendet, um das Ausmaß einer spezifischen Antikörperbindung zu bestimmen. Außerdem wird durch die Kompetition der radiomarkierten Komponente mit einem unmarkierten monomeren oder aggregierten normalen menschlichen IgG2 oder monoclonalen Antikörpern gegen FcRI oder FcRII die Bindungseffizienz und -spezifität eines chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren für jeden Zelltyp ermittelt.
  • Um festzustellen, ob das chimäre CD4-IgG2-Heterotetramer eine Verschlimmerung der HIV-Infektion von Monocyten/Makrophagen vermittelt, wird HIV-1 mit Medium allein oder entweder mit einem monomeren oder aggregierten chimären CD4-IgG2-Heterotetramer in mehreren Verdünnungen inkubiert. Als Kontrolle wird Serum von normalen Individuen und HIV-infizierten Individuen verwendet (31). Nach Inkubation für eine Stunde bei 4°C wird das "opsonisierte" Virus zu den im vorherigen Absatz beschriebenen Zelltypen zugegeben. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wird das Medium geerntet und auf eine virale reverse Transkriptaseaktivität untersucht, um das Ausmaß einer Virusinfektion zu bestimmen. Als Kontrolle wird sCD4, OKT4a oder Leu3a während der Infektion der Zellen eingeschlossen. Zusätzlich werden verschiedene Verdünnungen des chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren und geeignete Kontrollen zuerst mit den Zellen bei 4°C inkubiert, um eine Bindung zu ermöglichen. Anschließend wird HIV zugegeben, und eine Infektion wird durch eine virale reverse Transkriptaseaktivität festgestellt.
  • B. Ergebnisse
  • Ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Gen, das ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer codiert, wurde durch Ligieren des Leader-V1-V2-Segments der menschlichen CD4-cDNA (4) mit dem Gelenkregion-Exon des menschlichen Gens der schweren Kette von gamma2 (30) erzeugt (1A). Das erhaltene rekombinante DNA-Molekül (bezeichnet als CD4-IgG2-Rf) codiert die Signalsequenz und zwei aminoterminale Immunglobulin-ähnliche Domänen des CD4-Proteins (die ersten 179 Aminosäuren des reifen CD4), gefolgt durch die Gelenkregion (15 Aminosäuren), die CH2-Region (110 Aminosäuren) und die CH3-Region (107 Aminosäuren) des Proteins der schweren Kette von gamma2 (3). Dieses rekombinante DNA-Molekül enthält auch zwei Introns, die innerhalb des Gens der schweren Kette von gamma2 liegen, und zwar zwischen den H- und CH2-Domänen und zwischen den CH2- und CH3-Domänen. Dieses chimäre CD4-gamma2-Gen wurde derart konstruiert, daß es ein chimäres CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer codiert, dem spezifisch die CH1-Domäne der schweren Kette von gamma2 fehlt. Eine Expression der CH1-Domäne ohne die leichten Ketten verhindert eine effiziente Sekretion der schweren Kette aus Säugerzellen (25).
  • In dem chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer enthält die Gelenkregion einer Kette vier Cysteinreste, welche die Möglichkeit für vier Disulfidbrücken zwischen den Ketten vorsehen (1B). In ähnlicher Weise enthält das natürlich vorkommende menschliche IgG2 vier Disulfidbrückenbindungen zwischen den schweren Ketten von gamma2.
  • Das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Gen wurde in den Säugerexpressionsvektor pcDNA1 subcloniert. Dieser Vektor enthält die folgenden DNA-Elemente: den sehr frühen Promotor und Enhancer aus dem Cytomegalievirus (CMV), die die Transkription des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Gens regulieren; eine SV40-Polyadenylierungssequenz; und einen SV40-Replikationsursprung, der die Replikation des ♦ Plasmids in hoher Kopienzahl in CosM5-Zellen ermöglicht. Der erhaltene Säugerexpressionsvektor des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Moleküls (bezeichnet als CD4-IgG2-pcDNA1) wurde in CosM5-Zellen transformiert, welche dann 48–72 Stunden nach der Transfektion mit 35S-Methionin radioaktiv markiert wurden. Das radiomarkierte Medium wurde durch Fällung mit Protein A-Sepharose-Kügelchen und einer SDS-PAGE, gefolgt durch eine Fluorographie, analysiert (6). Unter reduzierenden Bedingungen wird ein Protein ausgefällt, das bei einer relativen Molekülmasse (Mr) von etwa 47 Kilodalton wandert. Wenn das gefällte Material in einer SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen aufgetrennt wurde, wird ein Protein beobachtet, das bei einer Mr von etwa 94 Kilodalton wandert, was zeigt, daß sich die chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Moleküle zusammenlagern und als Homodimere sezerniert werden. Diese Ergebnisse zeigen ferner, daß die sezernierten chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren eine intakte Immunglobulin-Fc-Domäne enthalten, da sie Protein A binden. Eine weitere Charakterisierung durch eine Western-Blot-Analyse der Proteine, welche 48–72 Stunden nach der Transfektion in das Medium sezerniert wurden, wurde unter Verwendung eines polyclonalen Kaninchen-Antiserums, das gegen gereinigtes lösliches menschliches CD4 hervorgerufen wurde, durchgeführt. Ähnlich wie bei den durch Fällung erhaltenen Ergebnissen wanderte der größte Teil des immunreaktiven Proteins bei einer Mr von etwa 47 Kilodaltons, wenn das Medium auf einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und anschließend durch einen Western-Transfer auf Nitrocellulose übertragen wurde. Unter nichtreduzierenden Bedingungen wanderte der größte Teil des immunreaktiven Proteins bei einer Mr von etwa 94 Kilodaltons. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Molekül hergestellt und als ein Homodimer mit dem vorhergesagten Molekulargewicht sezerniert wird.
  • Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß der Fc-Teil des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren, der durch die konstanten Regionen des Gens der schweren Kette von gamma2 codiert wird, Protein A bindet und daher funktionell aktiv ist. Um zu bestimmen, ob der CD4-Teil funktionell intakt ist, wurden chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimere auf ihre Fähigkeit untersucht, an das äußere HIV-Hüllglycoprotein gp120 zu binden (7). Unmarkiertes Medium von CosM5-Zellen, die mit CD4-IgG2-pcDNA1-DNA transfiziert worden waren, wurde mit 35S-Methionin markiertem gp120 inkubiert. Komplexe zwischen dem chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren und gp120 wurden durch Inkubation mit Protein A-Sepharose-Kügelchen gefällt, und die Präzipitate wurden durch eine SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, gefolgt durch eine Fluorographie, analysiert. Diese Ergebnisse zeigen, daß das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer das HIV-gp120 wirksam erkennt und mit hoher Affinität bindet. Diese Beobachtungen zusammengenommen mit den im vorherigen Absatz beschriebenen Ergebnissen zeigen, daß das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer funktionell aktive Regionen von sowohl CD4 als auch der schweren Kette von gamma2 enthält.
  • Um große Mengen der chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren stabil herzustellen, wurde der CD4-IgG2-pcDNA1-Vektor mit dem Plasmid p410 (codierend das Enzym Dihydrofolatreduktase (dhfr)) in dhfr-Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) cotransfiziert. Ungefähr zwei Wochen nach der Transfektion wurden einzelne Clone, die in nucleosidfreiem alpha-MEM und 10% dialysiertem fötalem Kälberserum gezüchtet wurden (und daher dhfr+ sind), isoliert und durch Fällung und einen ELISA auf eine Coexpression von chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren untersucht. Die Zelllinien mit der höchsten Produktionsrate wurden identifiziert und stufenweise ansteigenden Konzentrationen von Methotrexat ausgesetzt, das die Selektion auf eine Amplifikation der neu eingeschleusten DNA-Sequenzen bewirkt. Eine CHO-Zelllinie, welche 10 μg/ml des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren exprimiert, wurde für die stabile konstitutive Herstellung in Rollerflaschen verwendet. Die Zellen wurden in alpha-MEM, enthaltend 10% IgG-freies fötales Kälberserum, bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden dann jeden zweiten Tag versorgt, und ein zwei Tage altes konditioniertes Medium wurde für die Reinigung des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren verwendet. Das konditionierte Medium wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) 1:1 verdünnt und auf eine 5 ml-Protein A-Sepharose-Fast Flow-Säule (Pharmacia) in einer Durchflußrate von 60 ml/Stunde aufgetragen. Die Säule wurde dann mit 10 Säulenvolumina von PBS gewaschen, und das gebundene Material wurde mit 100 mM Glycin, pH 3,5, eluiert. Das eluierte Material wurde direkt in 50 μl 1 M Tris-HCl, pH 8,0, gesammelt, um das Elutionsmittel zu neutralisieren. Fraktionen mit einer OD280 von größer als 0,1 wurden durch eine SDS-PAGE, gefolgt durch eine Silberfärbung oder Western-Blot-Analyse, analysiert, und die Peakfraktionen wurden vereinigt. Aus der Protein A-Sepharose-Säule wurde speziell eine einzelne Bande eluiert, die eine Mr aufwies, welche der des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren entspricht (8). Eine Western-Blot-Analyse bestätigt, daß das eluierte Protein mit einem polyclonalen Antiserum, das gegen lösliches menschliches CD4 hervorgerufen wurde, immunreaktiv ist. Außerdem behält das gereinigte Protein die Fähigkeit bei, mit hoher Affinität an 35S-Methionin markiertes gp120 zu binden. Diese Ergebnisse veranschaulichen die stabile Herstellung der chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren in einer hohen Rate in Säugerzellen und die Reinigung eines chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren, welches seine biologische Funktion beibehält.
  • Das teilweise gereinigte CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer, das gereinigt wurde, wie in 8 beschrieben ist, war in der Verhinderung einer HIV-Bindung an CD4-Zellen (9) und der Neutralisierung der Infektiösität eines feststehenden HIV-Impfmaterials (10) wirksam. In dem letzteren Test waren etwa 10–25 μg/ml CD4-gamma2 sowie sCD4 erforderlich, um 50% der Kulturen vor einer Infektion durch HIV zu schützen.
  • Die weitere Reinigung eines CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren wurde mittels Ionenaustauschchromatographie erreicht. Die Peakfraktion aus der Protein A-Sepharose-Säule wurde auf eine 10 ml-S-Sepharose-Fast Flow-Säule, die mit 50 mM BES, pH 7,0, vorher äquilibriert worden war, in einer Durchflußrate von 120 ml/h aufgetragen. Nach dem Auftragen der Probe wurde die Säule mit 50 mM BES, pH 7,0, bei einer ansteigenden Salzkonzentration (vgl. Materialien und Methoden) gründlich gewaschen. Das CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer wurde spezifisch aus der Säule in 50 mM BES, pH 7,0, enthaltend 500 mM NaCl, eluiert. Nach der Ionenaustauschchromatographie stellten die Erfinder unerwartet fest, daß die Peakfraktionen, die das chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer enthalten, noch immer unrein waren. Daher wurden die Peakfraktionen aus der S-Sepharose-Säule vereinigt, konzentriert und auf eine 120 ml-Sephacryl S-300HR-Säule, die mit PBS vorher äquilibriert worden war, in einer Durchflußrate von 8 ml pro Stunde aufgetragen. Die Peakfraktionen des gereinigten CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren wurden durch eine SDS-PAGE und eine Silberfärbung unter nichtreduzierenden Bedingungen analysiert, und die gereinigten Fraktionen wurden vereinigt und durch eine SDS-PAGE, gefolgt durch eine Silberfärbung, unter nichtreduzierenden Bedingungen (11, Bahn 1) oder reduzierenden Bedingungen (11, Bahn 2) analysiert. Wenn das gereinigte chimäre CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimer auf einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen getrennt wurde, wurde eine Doppelbande beobachtet, die anscheinend auf Unterschiede bei der Glycosylierung des chimären CD4-schwere gamma2-Kette-Homodimeren zurückzuführen ist (Daten nicht gezeigt).
  • Ein chimäres CD4-schwere IgG2HC-Kette-Gen, das ein chimäres CD4-schwere IgG2-Kette-Molekül codiert, wurde durch Ligieren des Leader-V1-V2-Segments der menschlichen CD4-cDNA mit dem CH1-Exon des Gens der schweren Kette des menschlichen IgG2 erzeugt (2A). Zusätzlich wurde ein chimäres CD4-leichte kappa-Kette-Gen, das ein chimäres CD4-leichte kappa-Kette-Molekül codiert, durch Ligieren des Leader-V1-V2-Segments der menschlichen CD4-cDNA mit der konstanten Region des Gens der leichten kappa-Kette erzeugt (2A). Diese chimären CD4-schwere IgG2-Kette-Gene und chimären CD4-leichte kappa- Kette-Gene wurden derart konstruiert, daß sie ein chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer codieren, in dem das CD4-schwere IgG2-Kette-Molekül eine CH1-Domäne für eine wirksame Zusammenlagerung mit den leichten kappa-Ketten enthält.
  • Sowohl das chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Gen als auch das chimäre CD4-leichte kappa-Kette-Gen wurden in die Säugerexpressionsvektoren pRcCMV oder pPPI-2 subcloniert. Beide Vektoren enthalten den sehr frühen Promotor und Enhancer des Cytomegalievirus, welche die Transkription der chimären Gene regulieren. In dem Vektor pRcCMV wird eine zweite Transkriptionskassette, die den Promotor und Enhancer von RSV enthält, dazu verwendet, die Transkription des Neomycin-Resistenzgens zu regulieren. In pPPI-2 reguliert eine zweite Transkriptionskassette, die den β-Globin-Promotor enthält, die Transkription des dhfr-Gens (vgl. vorstehend). Um große Mengen des chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren stabil herzustellen, wurden der Expressionsvektor des chimären CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküls und der Expressionsvektor des chimären CD4-leichte kappa-Kette-Moleküls gleichzeitig transfiziert (typischerweise wurde das in pRcCMV clonierte chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Gen verwendet, und das in pPPI-2 clonierte chimäre CD4-leichte kappa-Kette-Gen wurde in einem Verhältnis von 1:1 verwendet). Etwa zwei Wochen nach der Transfektion wurden einzelne Clone, die in nucleosidfreiem alpha-MEM, enthaltend 1 mg/ml G418 und 10% dialysiertes fötales Kälberserum, gezüchtet wurden, isoliert und durch Immunpräzipitation und einen ELISA auf eine Coexpression von sowohl chimären CD4-schwere IgG2-Kette-Molekülen als auch chimären CD4-leichte kappa-Kette-Molekülen untersucht. 12 zeigt einen Clon, der auf eine Expression von sowohl chimären CD4-schwere IgG2-Kette-Molekülen als auch chimären CD4-leichte kappa-Kette-Molekülen selektiert und untersucht wurde. Die CHO-Zelllinie oder die nichttransfizierte CHO-Stammzelllinie wurden mit 35S-Methionin und 35S-Cystein für 16 Stunden radioaktiv markiert. Das radiomarkierte Medium wurde durch Fällung mit Protein A-Sepharose-Kügelchen und einer SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen, gefolgt durch eine Fluorographie, analysiert (12A). Unter nichtreduzierenden Bedingungen wurden zwei Proteine ausgefällt, die bei relativen Molekülmassen von etwa 140 Kilodaltons und 210 Kilodaltons wandern. Wenn das gefällte Material bei einer SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen aufgetrennt wurde, wurden zwei Proteine beobachtet, die bei relativen Molekülmassen von 69 Kilodaltons und 35 Kilodaltons wandern, was mit den vorhergesagten relativen Molekülmassen der chimären CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküle bzw. der chimären CD4-leichte kappa-Kette-Moleküle vereinbar ist (Daten nicht gezeigt). Eine weitere Charakterisierung hat gezeigt, daß das Protein, welches bei einer SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen bei 210 Kilodaltons wandert, sowohl die chimären CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküle als auch die chimären CD4-leichte kappa-Kette-Moleküle enthält, welche kovalent assoziiert sind, während das Protein, das bei einer SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen bei 140 Kilodaltons wandert, nur die chimären CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküle enthält (12B). Diese Ergebnisse sind vereinbar mit dem vorhergesagten Molekulargewicht für das Protein mit 210 Kilodaltons, das zwei chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküle und zwei chimäre CD4-leichte kappa-Kette-Moleküle enthält, die unter Bildung eines Moleküls mit der Struktur H2L2 (H = schwere Kette, L = leichte Kette) kovalent assoziiert sind. Außerdem ist das bei einer SDS-PAGE unter nichtreduzierenden Bedingungen zu beobachtende Protein mit 140 Kilodaltons mit dem vorhergesagten Molekulargewicht eines chimären CD4-IgG2-Homodimeren mit der Struktur H2 vereinbar. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß eine CHO-Zelllinie, die sowohl chimäre CD4-schwere IgG2-Kette-Moleküle als auch chimäre CD4-leichte kappa-Kette-Moleküle exprimiert, in der Lage ist, chimäre CD4-IgG2-Heterotetramere effizient zusammenzulagern und zu sezernieren.
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Claims (27)

  1. Gereinigtes chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer, das in der Lage ist, das HIV-1-Virus eines HIV-1-infizierten Individuums zu neutralisieren, das zwei schwere und zwei leichte Ketten umfasst, wobei die schweren Ketten die Aminosäuresequenz haben, die in 4 dargestellt ist, oder durch einen Expressionsvektor codiert werden, der mit CD-4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75193) bezeichnet ist, und wobei die leichten Ketten die Aminosäuresequenz haben, die in 5 dargestellt ist, oder durch den Expressionsvektor codiert werden, der mit CD4-kLC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75194) bezeichnet ist.
  2. Gereinigtes chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer nach Anspruch 1, wobei die schweren Ketten die Aminosäuresequenz haben, die in 4 dargestellt ist, und die leichten Ketten die Aminosäuresequenz haben, die in 5 dargestellt ist.
  3. Gereinigtes chimäres CD4-IgG2-Heterotetramer nach Anspruch 1, wobei die schweren Ketten durch den Expressionsvektor codiert werden, der mit CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75193) bezeichnet ist, und die leichten Ketten durch den Expressionsvektor codiert werden, der mit CD4-kLC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75194) bezeichnet ist.
  4. Zusammensetzung, umfassend das gereinigte chimäre CD4-IgG2-Heterotetramer nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in einer wirksamen Menge, um das HIV-1-Virus eines HIV-1-infizierten Individuums zu neutralisieren, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  5. Zusammensetzung, umfassend das gereinigte chimäre CD4-IgG2-Heterotetramer nach einem der Ansprüche 1 bis 3, verknüpft mit einem Toxin, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Toxin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der deglycosylierten A-Kette von Ricin, Domäne II von Pseudomonas-Exotoxin A, Domäne III von Pseudomonas-Exotoxin A und Diphterietoxin.
  7. Diagnosemittel, umfassend das gereinigte chimäre CD4-IgG2-Heterotetramer nach Anspruch 1, verknüpft mit einem nachweisbaren Marker.
  8. Diagnosemittel nach Anspruch 7, wobei der nachweisbare Marker ein Radioisotop, ein Chromophor order ein Fluorophor ist.
  9. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren, das in der Lage ist, das HIV-1-Virus eines HIV-infizierten Individuums zu neutralisieren, das umfasst: (a) Cotransfizieren einer Säugerzelle mit (A) einem Expressionsvektor, der die in 4 dargestellte Aminosäuresequenz codiert, oder einem Expressionsvektor, der mit CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75193) bezeichnet ist, und (B) einem Expressionsvektor, der die in 5 dargestellte Aminosäuresequenz codiert, oder einem Expressionsvektor, der mit CD4-kLC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75194) bezeichnet ist; (b) Züchten der daraus resultierenden cotransfizierten Säugerzelle unter Bedingungen und in einem Medium, so dass das chimäre Heterotetramer in das Medium sezeniert wird; und (c) Gewinnen und Reinigen des sezernierten chimären CD4-IgG2-Heterotetramers, um so das gereinigte chimäre CD4-IgG2-Heterotetramer herzustellen, wobei das Heterotramer in der Lage ist, das HIV-1-Virus eines HIV-1-infizierten Individuums zu neutralisieren.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Vektor mit CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75193) bezeichnet ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Vektor mit CD4-kLC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75194) bezeichnet ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Vektor die in 4 dargestellte Aminosäuresequenz codiert.
  13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Vektor die in 5 dargestellte Aminosäuresequenz codiert.
  14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Säugerzelle eine COS-Zelle, eine CHO-Zelle oder eine Myelomzelle ist.
  15. In vitro-Verfahren zur Hemmung der Infektion einer CD4+-Zelle durch ein menschliches Immunschwächevirus, das umfasst: Inkontaktbringen des menschlichen Immunschwächevirus mit einer Menge eines chimären CD4-IgG2-Hetertetrameren nach Anspruch 1, die wirksam ist, um einen Komplex mit dem menschlichen Immunschwächevirus in Anwesenheit der CD4+-Zelle zu bilden, so dass dadurch die Infektion der CD4+-Zelle durch das Virus gehemmt wird.
  16. Verwendung eines Heterotetrameren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6 für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Verhinderung, dass CD4+-Zellen eines Individuums mit menschlichem Immunschwächevirus infiziert werden.
  17. Verwendung eines Heterotetrameren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6 für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines Individuums, bei dem CD4+-Zellen mit menschlichem Immunschwächevirus infiziert sind.
  18. Transformierte Wirtszelle, die mindestens zwei Vektoren umfasst, wobei ein Vektor DNA umfasst, die die schweren Ketten des chimären CD4-IgG2-Heterotetrameren codiert, und ein Vektor DNA umfasst, die die leichten Ketten des chimären CD4-IgG2-Heterotetramen codiert, wobei die schweren Ketten die in 4 dargestellte Aminosäuresequenz haben oder durch einen Expressionsvektor codiert werden, der mit CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75193) bezeichnet ist, und die leichten Ketten die in 5 dargestellte Aminosäuresequenz haben oder durch einen Expressionsvektor codiert werden, der mit CD4-kLC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75194) bezeichnet ist.
  19. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei die Zelle eine Säugerzelle ist.
  20. Tranformierte Säugerwirtszelle nach Anspruch 19, wobei die Zelle eine COS-Zelle, eine CHO-Zelle oder eine Myelomzelle ist.
  21. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei die Zelle das CD4-IgG2 chimäre Heterotetramer sezerniert.
  22. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei der Vektor, der die schweren Ketten codiert, mit CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75193) bezeichnet ist.
  23. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei der Vektor, der die leichten Ketten codiert, mit CD4-kLC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75194) bezeichnet ist.
  24. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei der Vektor, der die schweren Ketten codiert, mit CD4-Ig2HC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75193) bezeichnet ist, und der Vector, der die leichten Ketten codiert, mit CD4-kLC-pRcCMV (ATCC-Nr. 75194) bezeichnet ist.
  25. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei die DNA, die die schweren Ketten codiert, die in 4 dargestellte Aminosäuresequenz codiert.
  26. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 18, wobei die DNA, die die leichten Ketten codiert, die in 5 dargestellte Aminosäuresequenz codiert.
  27. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, umfassend das Kombinieren des gereinigten chimären CD4-IgG2-Heterotetramers nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gegebenenfalls mit einem Toxin verknüpft, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
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