JPH05507854A - ＣＤ４― ガンマ・２キメラ及びＣＤ４ ― ＩｇＧ２・キメラ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 本出願を通して、種々の刊行物が括弧内のアラビア数字で参照される。これら全 ての刊行物は、請求の範囲の直前の明細書末尾に列挙しである。これらの刊行物 の開示は、その全体が、ここに記載され権利請求される本発明の日に、当業者に 知られた技術の状態をより完全に記述するために参考として本出願に取り込まれ る。

動物ウィルスのライフサイクルは、宿主細胞の多量の感染に必要とされる一連の 現象によって特徴付けられる。複製サイクルの最初のステップは細胞表面へのウ ィルスの付着であり、この付着は、標的細胞表面の受容体に対するウィルスの付 着タンパク（ＶＡＰ）の特異的な相互作用によって媒介される。ウィルスの宿主 レンジ及び属性は、主にこれら受容体の発現パターンによるものである。ＶＡＰ とその細胞受容体との相互作用は、ウィルス性疾患の感染および病理に重要な役 割を演じ、また抗ウイルス治療剤の開発を目的とした重要な領域を提供する。

細胞受容体は、タンパク、糖鎖および脂質を含む膜の全ての成分を具備し得る。

標的細胞表面へのウィルスの付着を媒介する分子の同定は、数例しか行われてい ない。最も広範に特性が明らかにされたウィルス受容体タンパクは、ＣＤ４（Ｔ ４）である（１）。ＣＤ４は、主にヘルパーＴリンパ球および単球／マクロファ ージ系列の細胞表面に発現する非多形性の細胞表面糖タンパクである。ＣＤ４は 、抗原提示細胞表面の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラス■分子と共 働して、効率的な細胞性の免疫応答相互作用を媒介する。

ＣＤ４はまた、人間においてはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）との相互作用の 標的になる。

ＨＩＶは表面にＣＤ４を発現している細胞、主にヘルパーＴリンパ球および単球 ／マクロファージに感染し、免疫機能を徐々に喪失させ、ヒト後天的免疫不全症 候群（ＡＩＤＳ）の発病をもたらす。ＨＩＶ複製サイクルの初期相には、ＨＩＶ の外部エンベロープ糖タンパクｇｐ１２０と、表面ＣＤ４（Ｋｄは略４ｘｌＱ− ９）との間の親和性の高い相互作用が含まれる（２）。幾つかの系統についての 証拠は、ウィルスの感染性に関するこの必要性を示している。イン・ビトロにお いては、ＨＩＶに対して耐性である細胞をＨＩＶ感受性にするためには、ＣＤ４ を発現しないヒト細胞内に、ＣＤ４を発現する機能的ｃＤＮＡを導入すれば充分 である（３）。イン・ビボにおいて、ウィルス感染はＣＤ４を発現している細胞 に限定されるように思える。細胞表面のＣＤ４に対するＨＩＶｇ　ｐ　１２１１ の結合に続いて、ウィルス膜および標的細胞膜が融合し、ウィルスキャプシドは 標的細胞の細胞質内に導入される。

ＨＩＶのｇ　ｐ　１２０及びＣＤ４の間の相互作用に関する特性の解明は、両分 子をコードするｃＤＮＡクローンの単離によって容易になっている。ＣＤ４は非 多形性で且つ系列限定の細胞表面糖タンパクであり、これは免疫グロブリン遺伝 子スーパーファミリーの一員である。完全な長さのＣＤ４、並びに切断された不 完全な可溶性ＣＤ４変種（ｓＣＤ４）の両者についての高レベルの発現が、安定 した発現系に記述されている。多量の精製５ＣＤ４が入手可能になったことによ り、この複雑な糖タンパクの構造に関する詳細な理解が可能になっている。成熟 ＣＤ４は５５キロドルトンの相対分子量（Ｍｒ）を有しており、Ｖ　１−Ｖ４と 称される四つのタンデム免疫グロブリン様領域を含んだアミノ末端の３７２アミ ノ酸細胞外ドメインと、これに続＜２３アミノ酸のトランスメンブランドメイン 及び３８アミノ酸の細胞質セグメントとからなっている。

アミノ末端免疫グロブリン様ドメインＶ１は、カッパ軽鎖可変領域との間で３２ ％の相同性を有している。四つの免疫グロブリン様ドメインのうちの三つ（Ｖｌ 、Ｖ２およびＶ４）はジスルフィド結合を含んでおり、該分子のカルボキシ末端 部分におけるＮ−結合されたグリコジル化部位が利用される（４．６）。

切断された不完全な５ＣＤ４を用いた実験により、ＨＩＶ・ｇ　ｐ　１２０に対 する高い親和性を決定する領域は、アミノ末端免疫グロブリン様ドメインＶｌ内 にあることが示された（７−９）。ｖｌの変異分析によって、免疫グロブリンの 第二相補性決定領域（ＣＤＲ２）との構造的相同性を有する領域を具備した、分 離されたｇ　ｐ　１２０結合部位（成熟ＣＤ４タンパクの残基３８−５２）が定 義された（９）。Ｖｌ、Ｖ２が大量に製造されることによって、この二つのアミ ノ末端免疫グロブリン様領域の構造的分析が可能になっている。２．３オングス トロームの解像度で決定された構造によって、該分子は、連続的なベータ鎖で結 合された免疫グロブリン折り畳み構造を含んだ、二つの密接に関連したドメイン を有することが明らかになった。モノクローナル抗体、クラスＩＩＭＨＣ分子お よびＨＩＶ−ｇｐ１２０　（変異分析によって決定されたもの）のための推定さ れる結合部位は、分子表面に存在する（１０゜１１）。

ＣＤ４細胞外セグメントの全体の可溶性変種（Ｖ　１−Ｖ４、ｓ　ＣＤ４）が記 述されており、これはＨＩＶ感染の治療に対する可能な治療上のアプローチであ ると思われる（１２）。

イン・ビボの実験によって次のことが示される：１＞５ＣＤ４は、ＨＩＶ−ｇｐ １２０への結合によって「分子的誘因物」として作用し、ウィルス付着およびこ れに続くヒト細胞の感染を阻害する；２）ｓＣＤ４は、ウィルス表面からウィル スエンベロープ糖タンパクｇ　ｐ　１２０を「剥ぎ取るに３）ｓｃＤ４４；Ｌウ ィルスに媒介された細胞融合を阻害することによって、細胞間でのウィルスの広 がり、即ちＨＩＶ感染細胞から非感染細胞へのウィルスの広がりを阻止する（１ ．１３）。

イン・ビトロでの結果に加え、シミアン免疫不全ウィルス（Ｓ　Ｉ　Ｖ）に感染 したアカゲザルにおいて５ＣＤ４を用いた実験が記載されている。これらの研究 によって、ＳＩＶに感染したアカゲザルに２ミリグラムの５ＣＤ４を２８日間投 与（筋肉内）すると、抹消血液リンパ球および骨髄からウィルスを単離する能力 か減少することが示された。加えて、骨髄中の顆粒球−マクロファージおよび赤 血球前駆細胞コロニーの増殖は正常レベルに戻った。これらのデータは、ＳＩｖ 感染感染アカ用ザルする５ＣＤ４の投与が、ウィルス貯蔵庫の縮小を導びくこと を示唆している。

ヒト臨床試験のフェーズＩによって、３０ｍｇ／日の高い投与量で投与した場合 にも、５ＣＤ４は顕著な毒性または免疫原性を伴わないことが示された。薬物動 態学的研究によって、５ＣＤ４の血清半減期は静脈投与によれば４５分、筋肉内 投与後では９．４時間、薬物が皮下に投与された後ではｌ０１３時間であること が明らかになった（１４．１５）。ＣＤ４細胞のカウント及びＨＩＶ抗原のレベ ルに関して、予備的な抗ウイルス的研究では結論が出ていない。最大耐容量に達 しないため５ＣＤ４の抗ウイルス効果は過少評価されており、特に、主要なウィ ルス単離に比較して、ＨＩＶ−１の実験室株を阻害するのに必要な５ＣＤ４濃度 の相違に関する最近のデータにおいてはそうである（１６）。

５ＣＤ４を用いたこれらイン・ビトロ及び霊長類での研究、並びにヒト臨床研究 では勇気づけられる積極的な結果が得られたが、これらは又、幾つかの制約をも 規定している。第一に、測定された５ＣＤ４の血清半減期が相対的に短い。第二 に、細胞表面ＣＤ４およびウィルス表面ｇ　ｐ　１２ｉ）が多価であるのとは対 称的に、５ＣＤ４はｇ　１）　１２０結合に関して一価である。第三に、５ＣＤ ４はＨＩＶ感染細胞に対して細胞障害性ではない。第四に、５ＣＤ４は胎盤を有 意に通過し得ない。

従って、ＣＤ４の免疫グロブリン様特性の利点および免疫グロブリン自体の有利 な性質を併有したキメラＣＤ４分子（即ち、ＣＤ４−免疫グロブリン・融合）が 記載されている。

免疫グロブリン又は抗体はＢリンパ球によって製造される抗原結合性分子であり 、これは液性免疫応答を包含する。免疫グロブリン分子の基本的なユニットは、 二つの同じ重鎮および二つの同じ軽鎖からなる。夫々の鎖のアミノ末端は、アミ ノ酸配列が可変の領域（可変領域）を含んでいる。重鎮および軽鎖の可変領域は 相互作用して、二つの抗原結合部位を形成する。夫々の鎖のカルボキシ末端は、 アミノ酸配列が一定である領域（定常領域）を含んでいる。軽鎖は単一の定常領 域を含んでいるのに対して、重鎮の定常ドメインは四つの分離したドメインに分 けられる（ＣＨＩ、ヒンジ、ＣＨ２゜及びＣＨ３）。免疫グロブリン分子の重鎮 には、ミュー（Ｍ）、デルタ（Ｄ）、ガンマ（Ｇ）、アルファ（Ａ）及びニブシ ロン（Ｅ）を含む幾つかのタイプが存在する。免疫グロブリン分子の軽鎖には、 カッパ又はラムダの二つのタイプが存在する。重鎮および軽鎖の個々のタイプに は、エフェクター機能において異なり得るサブタイプが存在する。組み立てられ た免疫グロブリン分子は、それが具備する重鎮のタイプに由来した名前が付され る。

モノクローナル抗体の発展によって、動物またはヒトの血清から得られる抗体の 固有の不均一性の問題が解消されてきている。しかしながら、殆どのモノクロー ナル抗体はマウス起源の細胞に由来しており、従って、ヒトニ投与されるときに は免疫原性を有する。より最近では、分子遺伝学とモノクローナル抗体技術との 組み合わせによって、「ヒト化された」キメラ抗体のイン・ビボでの製造が開発 されている。これらのキメラ抗体においては、ヒト免疫グロブリンにおける重鎮 および軽鎖の可変ドメインが、ネズミモノクローナル抗体に由来する重鎮および 軽鎖の特異的な可変ドメインで置き換えられる（１７−１９）。この遺伝子操作 の結果、特定の抗原に対する特異性およびヒト免疫グロブリンの特性をもった分 子が得られる。

ＣＤ４の配列解析および構造解析によって、前記臼つの細胞外ドメインは免疫グ ロブリン様であることが示された。免疫グロブリンのＦｃ部分は該分子の異化速 度を制御しく１４〜２１日の血清半減期）、また種々のエフェクター機能を提供 するから、幾つかの報告は、免疫グロブリンの可変領域および定常領域をＣＤ４ の免疫グロブリン様ドメインで置き換えることを記載している（２１−２４）。

キメラガンマド重鎖二量体をもたらすＣＤ４−ＩｇＧ１・重鎖融合タンパクが記 載されている（２１）。これらの分子は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン に加えて、ガンマ１重鎖ＣＨＩドメインを含んでいる。しかしながら、軽鎖の不 存在下でＣＨＩドメインが発現すされると、Ｋ重鎖の組み立て及び哺乳動物細胞 からの分泌は効率が低い（２５）。

その後、ＣＨＩドメイン及びヒンジ領域の最初の５アミノ酸を欠いたＣＤ４−Ｉ ｇＧ１φ重鎖融合タンパクは、高レベルで分泌されることが記載された（２２） 。これら融合タンパクは、Ｆｃ受容体結合、ＨＩＢ−１感染細胞に対する抗体依 存性細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）　、及びＦｃ受容体依存性の機構を介した 胎盤通過のような、免疫グロブリン分子の種々のエフェクター機能を保持してい る。ＣＤ４−Ｉ　ｇＭ・重鎮融合タンパクもまた記載されている（２６）。加え て、ＣＤ４のＶｌ、Ｖ２ドメインがガンマ１重鎖のＣＨＬヒンジ、ＣＨ２および ＣＨ３ドメインに融合されたＣＤ４−ＩｇＧ１・融合タンパク、及びＣＤ４のＶ ｌ、Ｖ２ドメインがカッパ軽鎖の定常領域に融合されたＣＤ４−１ｇＧ１・融合 タンパクが記載されている（２９）。

また、ＣＤ４を毒素に結合した融合タンパクが構築され、そのＨＩＶ感染細胞を 殺す能力が試験されている。一つの研究においては、５ＣＤ４が、リポソームを 不活性化してタンパク合成を阻害し、細胞を殺すリシンの脱グリコジル化された Ａ鎖に結合された（２７）。この融合タンパクは、ＨＩＶの五つの異なった単離 体で感染された細胞を特異的に溶解するが、非感染細胞に対しては無毒である。

別の研究においては、ＣＤ４のＶｌ、Ｖ２ドメインがシュードモナスエキソトキ シンＡのドメイン■および■に結合された（２８）。この融合タンパクは、ＨＩ Ｖエンベロープ糖タンパクｇｐ！２０を発現する細胞に特異的に結合し、該細胞 内でのタンパク合成を阻害する（２５）。

ヒト単球およびマクロファージ（Ｍ／Ｍ）はＣＤ４を発現し、ＨＩＶに感染し得 、感染の貯蔵庫およびウィルス播種担体として働くことが確立されている（２９ ）。更に、ヒトＭ／ＭはＦｃ受容体をも含んでおり、このＦｃ受容体は、Ｍ／Ｍ が特定のＩｇＧ分子のＦｃ部分を介して該１ｇＧ分子に結合する原因である（表 １参照）。親和性の高いＦｃ受容体（ＦｃＲＩ）は、単量体ＩｇＧおよび複合体 ＩｇＧ（抗原プラス抗体）に結合する。ＦｃＲＩのＩｇＧアイソタイプに対する 親和性の序列は、ＩｇＧ１＝ＩｇＧ３＞１ｇＧ４＞であり、またＩ　ｇＧ２とは 相互作用しない。親和性の低いＦｃ受容体（ＦｃＲｆｆ）は、複合体の形のＩｇ Ｇ寄りも低い親和性で単量体１ｇＧに結合する。親和性の序列についていえば、 ＩｇＧ１及び１ｇＧ３の結合はＩ　ｇＧ２及び１ｇＧ４のそれよりも大きい（３ ０）。

Ｆ　ｃ　ＲＩ　７２．０００　高い　単球　１ｇＧ１．１ｇＧ３＞ＦｃＲＵ　４ ０．０（１１）　低い　単球　１ｇＧ１．１ｇＧ３＞血小板　１ｇＧ２．１ｇＧ ４ 好中球 Ｆ　ｃ　ｍ　５０−７０．０００　低い　好中球　１ｇＧ１．１ｇＧ３（Ｇｅｒ ｇｅ１７１．　ａｎｄ　Ｓａｒｍａ７　Ｇ、　（１９９０）　ＦＡＳＥＢ　１． ４：３２７５から抜粋した表） ＨＩＶ＋患者の血清がＨＩＶエンベロープ糖タンパクヲ認識する低力価の抗体を 含むという最近のデモンストレーションのために、Ｍ／Ｍの感染が低力価の抗Ｈ ＩＶ抗体によって、恐らくはＨＩＶおよびＦｃ受容体の交差結合により増大され ることが観察されている（３１）。イン・ビトロ並びにアヵゲザルにおいて、デ ングル熱ウィルス、黄熱ウィルス及びシンドビスウイルスによりマクロファージ の感染が増大することが良（記録されている（３２）。このような増大は、これ らウィルスに対する準無力化抗体の存在下で生じることが示されており、該抗体 は該ウィルスのオンソニン化作用を有し、又これを細胞表面のＦｃＲ５（または 相補的受容体）に結合する。ＨＩＶの場合、この交差結合はＭ／Ｍの表面にＨＩ Ｖを濃縮するように作用する。５ＣＤ４は低力価抗体で見られる増大を阻害する ことができるから、Ｍ／Ｍ表面に濃縮されたウィルスは、次に細胞内への侵入の ためにＣＤ４を利用することができる（３１）。

最近、バイルン等（２２）は５ＣＤ４の血漿半減期を増大させるため、並びにキ メラ分子にエフェクター機能を与えるために、ＩｇＧ１アイソタイプのＣＤ４− ＩｇＧ・キメラ抗体を製造した。従って、該分子はＭ／Ｍ表面に存在するＦｃ受 容体に結合する能力を有し、これら細胞タイプの感染を潜在的に増大させる。こ れら細胞タイプの感染の増大は、新規治療剤の開発においては考慮すべき重大な 問題であるがら、ＣＤ４−ＩｇＧ分子を設計する我々の目的は、Ｍ／Ｍ−Ｆｃ受 容体に結合する能力が大幅に減少したＩ　ｇＧ２タイプを用いることである。更 に、ヒトＩｇＧ１抗体はアロタイプ変種を含むのに対して、ヒトＩ　ｇＧ２抗体 は顕著なアロタイプ変種を含まないように思える（３３）。従って、免疫グロブ リンドメインを含む組換分子に対する可能な免疫応答を回避するために、我々は 多形性が最も少なく、且つマクロファージ表面にＨＩＶを濃縮する能力が低下し た分子を選択した。

第二に、妊婦に対するＣＤ４−ＩｇＧ１の投与についても、胎児感染の増大が同 様に観察されることが示され得る。例えば、胎盤の合胞体栄養細胞層の形質膜に Ｆｃ受容体が含まれることが記述されている（３０）。母体−胎児の間の免疫グ ロブリンの輸送は主にＩｇＧクラスに限定されるので、受動免疫は、特異的なＦ ｃ受容体の細胞透過機構を介した胎盤を横切る特異的輸送によって達成され得る と考えられる。更に、胎盤合胞体層の膜上に存在するＦｃ受容体は、前記ＩｇＧ １タイプの免疫グロブリンが該受容体に対する略１０〜２０倍高い結合親和性を 有する点において選択的であるように思える。

事実、全てのＩｇＧサブタイプの中で、ＩｇＧ１及び３は該受容体に対して最も 高い親和性を有し、ＩｇＧ４がこれに続き、最後がＩ　ｇＧ２である（３０）。

これらの結果は、ヒト胎盤からのＦｃＲのクローニングで得られた結果、即ち該 受容体がＭ／Ｍ上に見られるＦｃＲＩＩタイプに非常に似ていることを示す結果 と一致する。胎盤を通過する免疫グロブリンの輸送は子宮内の胎児にとって有益 であり得るとの議論は可能であるが、特定の病原（ＨＩ　Ｖのような）に提示さ れた母体の特定の免疫グロブリンは、ポリＩｇ受容体を介した上皮（ｅｐｉｔｈ ｅｌｉａ）を横切るＩｇＡの輸送に発展する機構と同様、Ｆｃ依存機構を介した 胎盤を横切る輸送を容易にして胎児の感染を増大し得るとの議論もまた可能であ る（３４）。従って、胎盤を通過して胎児血清中に濃縮することが示されている 特定のＣＤ４−ＩｇＧ１・融合タンパク（２２）は、ＨＩＶに胎盤障壁を横切る 新しい機構をを提供することにより、胎児にとって有害となり得る。

今回、我々は特定のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ポモニ量体が、１年以上前に 記述されたＣＤ４−ＩｇＧ１・重鎖ポモニ量体に比して利点を提供することを発 見した。特に、我々はＣＤ４のＶＩＶ２ドメインを含むＣＤ４−ガンマ２・キメ ラ重鎖ホモニ量体を構築した。このキメラ重鎖ポモニ量体は、哺乳動物細胞内で 効率的に組み立てられ、哺乳動物細胞から効率的に分泌されて、このキメラ重鎖 ホモニ量体を発現する細胞の培地から効率での回収および精製を可能とする。

このホモニ量体を構築するために、我々はヒトガンマ２・重鎮からの全体のヒン ジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３領域を用いた。これは二量体化および効率的な分泌 の原因であるヒト・ＩｇＧ２分子の定常ドメインを含むキメラ分子をもたらす。

これは、カプロンおよびグレゴリ−（２ｏ）によって記述された、ＣＤ４−１ｇ Ｇ１・重鎖二量体中にＣＨＩを含み、組換分子の分泌および細胞培養からの回収 性が乏しい重鎖二量体とは対照的である。我々はまた、効率的な二量体化を提供 するために、本発明のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体中にガンマ２・ 重鎮の全体のヒンジドメインを含ませた。

何故なら、このドメイン中に含まれるシスティン残基は、ポモニ量体の第二鎖に 対してジスルヒド結合を形成し、二つの鎖を正しい空間的配置に位置付けて抗原 結合部位の形成を容易にする原因だからである。

更に、全体のヒンジドメインを含ませることによって、我々は重鎖二量体の切片 のフレキシビリティ−を維持し、補体活性化およびＦｃ受容体結合のような生物 学的機能の調節を（２９）可能とした。

Ｉ　ｇＧ２免疫グロブリンは単球、マクロファージ及び胎盤膜上のＦｃ受容体に 結合する極めて減少された能力を有するから、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホ モニ量体およびＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の構築によって、ＣＤ４ −ガンマドキクラ重鎖ホモニ量体およびＣＤ４−ＩｇＧトキメラヘテロ四量体に はない多くの利点を有するキメラタンパクがもたらされる（２０．２３，２４． ２６）。、更に、他のＩｇＧタイプに比較すると、ヒトＩ　ｇＧ２は顕著に多形 性が少なく、従ってヒトに投与されたときの免疫原性は小さくなる。これは、多 くのアロタイプを含んでおり、従ってヒトに投与されたときに免疫原性となる可 能性が高いヒト１ｇＧ１とは対照的である。

ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体に加えて、我々はヒトガンマ２・重鎖 のＣＨＩ、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合されたＣＤ４のＶＩＶ２ ドメインを含んだ、ＣＤ４−ＩｇＧ２・重鎖を構築した。これらの分子はＣＤ４ −　Ｉ　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体をコードし、またヒト・カツバ軽鎖（又は ラムダ軽鎖）の全体の定常ドメインに融合されたＣＤ４のＶｌ及びＶ２ドメイン を含むＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖の存在下で同時発現されると、前記へテロ四 量体の製造を可能にする。このへテロ四量体は、二つのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメ ラ重鎖及び二つのＣＤ４−カッパ命キメラ軽鎖を具備する。ＣＨＩドメインを含 む重鎮の製造は、ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖との効率的な会合または共働を可 能とし、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の効率的な分泌をもたらす。こ れらＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体は、重鎖二量体に比較して、増大し た血清半減期およびＨＩＶに対する増大したアビディティーを有する。

〔発明の概要〕

本発明は、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体をコードする発現ベクター を提供する。本発明はまた、ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体の重鎮を コードする発現ベクターを提供する。最後に、本発明はＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キ メラヘテロ四量体の軽鎖をコードする発現ベクターを提供する。

〔図面の簡単な説明〕

図１：Ａ）ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子のドメイン構造；Ｂ）ＣＤ４− ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体のタンパク構造。下に示した配列は、ＣＤ４　 （Ｐｔｕ１７６）とヒトガンマ２・重鎮のヒンジ領域との間の連結部の１文字ア ミノ酸コードである。なお、ガンマ２・重鎖のヒンジ領域は四つのシスティン（ テキストの考察を参照）を含んでいる。略語：ＬはヒトＣＤ４のリーダー（シグ ナル）配列；ＶＩＶ２はヒ）ＣＤ４のアミノ末端可変様ドメイン：Ｈはヒトガン マ２・重鎖のヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３はヒトガンマ２参重鎖の第二およ び第三定常領域。

図２　：　Ａ）ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体の発現に用いられるキ メラ遺伝子のドメイン構造。上部はＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子；下部 はＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子。Ｂ）ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラヘテロ 四量体のタンパク構造。略語：　ＣＨＩ−ＣＨ２−ＣＨ３はヒト・カッパ軽鎖の 第一、第二及び第三定常領域；Ｃ−カッパはヒト・カッパ軽鎖の定常領域。

図３：ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体（−末鎖）のＤＮＡ配列および 予想タンパク配列。夫々の行の末尾の番号はヌクレオチド位置を示す。夫々の行 の上の番号は、（１文字コードで与えられる）アミノ酸位置を示す。タンパクド メインは配列の上に矢印で示される。

図４　：　ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２−キメラヘテロ四量体におけるＣＤ４−ＩｇＧ２ ・キメラ重鎖のＤＮＡ配列および予想タンパク配列。夫々の行の末尾の番号は、 ヌクレオチド位置を示す。

夫々の行の上の数字夫々の行の上の番号は、（１文字コードで与えられる）アミ ノ酸位置を示す。タンパクドメインは配列の上に矢印で示される。

図５　：　ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体におけるＣＤ４−カッパ・ キメラ軽鎖のＤＮＡ配列および予想タンパク配列。夫々の行の末尾の番号は、ヌ クレオチド位置を示す。

夫々の行の上の数字夫々の行の上の番号は、（１文字コードで与えられる）アミ ノ酸位置を示す。タンパクドメインは配列の上に矢印で示される。

図６：形質移入された細胞からのＣＤ４−ガンマ２Ｑキメラ重鎖ホモニ量体の分 泌。Ｃ０３−Ｍ５細胞が偽って形質移入され、またはＣＤ４−ガンマドキメラ重 鎖哺乳動物発現ベクターＤＮＡを形質移入され、或いはＣＤ４−１ｇＧ２−ｐ　 ｃ　ＤＮＡ　１を形質移入された。形質移入後４８−７２時間の時点で、該細胞 が３５８−メチオニンで放射能ラベルされた。放射能ラベルされた培地が、プロ ティンＡ・セファロースビーズで沈殿された。沈殿されたタンパクは、還元性条 件または非還元性条件の下に５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、フルオログラ フィーによって可視化された。レーンＭは偽りの形質導入された細胞からの培地 ；レーン１はＣＤ４−ガンマドキメラ重鎖哺乳動物発現ベクターＤＮＡを形質移 入された細胞からの培地；レーン２はＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２−ｐｃＤＮＡｌを形質 移入された細胞からの培地。

図７　：　ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を用いたＨＩＶ−１・ｇ　 ｐ１２０の沈殿。Ｇｏｓ−Ｍ５細胞が偽って形質移入され、またはＣＤ４−ガン マドキメラ重鎖哺乳動物発現ベクターＤＮＡを形質移入され、或いはＣＤ４−１ 　ｇＧ２−ｐｃＤＮＡｌを形質移入された。形質移入後４８−７２時間の時点で 、培地のラベルされていないアリコートが３５８−メチオニンでラベルされたｇ 　ｐ１２０のアリコートと共にインキュベートされた。この複合体は、プロティ ンＡΦセファロースビーズで沈殿された。次いで、沈殿物は５Ｄ５−ＰＡＧＥに よって分析され、続いてフルオログラフィーにかけられた。

レーンＭは偽りの形質導入された細胞からの培地；レーン１はＣＤ４−ガンマド キメラ重鎖哺乳動物発現ベクターＤＮＡを形質移入された細胞からの培地；レー ン２はＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡｌを形質移入された細胞からの培地。

図８　：　ＣＨＯ細胞馴らし培地から得たＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ 量体の精製。ＣＤ４−ガンマドキメラ重鎖ホモニ量体またはＣＤ４−ガンマ２・ キメラ重鎖ホモニ量体を本質的に分泌する安定なＣＨＯ細胞が、ローラボトル内 で増殖された。馴らし培地がプロティンＡ−セファロースカラムに通され、結合 物質がカラムから溶出された。ピーク画分が５ＤＳ−ＰＡＧＥによって同定され 、続いて銀染色およびプールされた。次いで、精製されたタンパクが還元性条件 下の５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、続いて銀染色された。レーン１は、Ｃ Ｄ４−ガンマ１φキメラ重鎖ホモニ量体；レーン２は、ＣＤ４〜ガンマ２・キメ ラ重鎖ホモニ量体。

図９　：　ＣＤ４系分子による、ＨＩＶのＣＥＭ細胞への結合ノ阻害。ＣＤ４陽 性細胞へのウィルスへの結合の阻害ニついて、可溶性ＣＤ４　（ｓＣＤ４）　、 部分的に精製されたＣＤ４−ガンマ１、または部分的に精製されたＣＤ４−ガン マ２が試験された。間接的免疫蛍光分析およびサイトフルオログラフィーによっ て、結合したウィルスが検出された。結果は、阻害剤の濃度に対するパーセント 阻害として表わされた。

図１０：ＣＤ４系分子による、ＣＤ４陽性細胞のＨＩＶ感染の阻害。ｓ　ＣＤ　 ４　、部分的に精製されたＣＤ４−ガンマ１または部分的に精製されたＣＤ４− ガンマ２が、ＨＩＶ−１播種（１００ＴＣＩ　Ｄ５ｏ）と共にインキュベートさ れ、該混合物に対してＰＨＡ刺激されたリンパ球が添加され、３７℃で一晩イン キユベートされた。該細胞を洗浄し、微小培養器内にブレーティングしくＩ　Ｘ 　１０５細胞／培養；稀釈当たり１０カルチヤー）、８日後および１２日後に培 養上清中のＨＩＶ抗原を検出することによって、ウィルスの複製をモニターした 。結果は、阻害剤の所定濃度におけるパーセント陽性培養として表現した。

図１１　＋　ＣＤ４−ガンマ２争キメラ重鎖ホモニ量体の精製。

ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を本質的に分泌する安定なＣＨＯ細胞 が、ローラボトル内で増殖された。馴らし培地がプロティンＡ−セファロースカ ラムに通され、結合物質がカラムから溶出された（図８参照）。ピーク画分がプ ールされ、Ｓ−セファロースカラムに通された。広範に洗浄した後、５０ｍＭ　 ＢＥＳ　ｐＨ７，０，５００ｍＭ　ＮａＣ１を用いてＣＤ４−ガンマ２・キメラ 重鎖ホモニ量体が溶出された。ピーク画分が５ＤＳ−ＰＡＧＥによって同定され 、続いて銀染色され、プールされて濃縮された。プールされて濃縮されたＣＤ４ −ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体は、ＰＢＳで予め平衡化されたセファクリル Ｓ　−３００ＨＲカラムに掛けられ、ＰＢＳで溶出された。精製されたＣＤ４− ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体に対応するピーク画分は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及 びこれに続く銀染色によって同定された。次いで、ピーク画分はプールされ、濃 縮された。精製されたタンパクは、次いで非還元性条件および還元性条件下での ５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、続いて銀染色された。レーン１は、非還元 性条件下で行った略１．５μｇタンパク；レーン２は、還元性条件下で行った略 １，５μｇタンパク。

図１２：安定に形質移入された細胞からの、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四 量体の分泌。ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖 を安定に発現するＣＨＯ細胞が、３５Ｓ−メチオニン及びシスティンで放射能ラ ベルされた。放射能ラベルされた培地は、プロティンＡ−セファロース・ビーズ で沈殿された。（Ａ）沈殿されたタンパクは、非還元性条件下での５ＣＤ−ＰＡ ＧＥによって分析され、フルオログラフィーによって可視化された。レーン１は 、非形質移入ＣＨＯ細胞からの培地；レーン２は、ＣＤ４−１ｇＧ２φキメラ重 鎖およびＣＤ４−カッパーキメラ軽鎖を安定に発現する細胞からの培地。（Ｂ） Ａのレーン２で分析されたのと同じサンプルが、非還元性条件下での５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥで分析された。この５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルからのレーンが切り取られ、該 ゲル切片は、平衡化緩衝液（６２，５ｄ　Ｔｒｉｓ肛＋ｐｉ６．ｇ、２．３％Ｓ ＤＳ　５％β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）中において４℃で ４５分間インキュベートすることにより遺児された。このゲル切片を還元性条件 下でインキュベートした後、該ゲル内に含まれるタンパクを５ＤＳ−ＰＡＧＥに より分析し、フルオログラフィーによって可視化した。

〔発明の詳細な記述〕

ＣＤ４−１ｇＧ２−Ｒｆ、ＣＤ４−ＩｇＧ１−Ｒｆ、ＣＤ４−１　ｇＧＩＨｃ− ｐＲｃＣＭＶ、ＣＤ４−１　ｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ、ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲ ｃＣＭＶ、ＣＤ４−ＩｇＧ１−ｐｃＤＮＡｌ、及びＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２−ｐｃＤ ＮＡと命名された五つの発現ベクター及び二つのプラスミドの夫々、ＡＴＣＣ受 付番号第４０９４９号、第４０９５０　、第７５１９２号、第７５１９３号、第 ７５１９４号、第４０９５１号、第４０９５２号の下に、ＵＳＡ、　２０８５２ メリーランド、ロックウィルのアメリカン・タイプΦカルチャー会コレクション に寄託されている。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に 関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定に従って行われた。

特に、本発明はＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体をコードする、ＣＤ４ −ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡｌ　（ＡＴＣＣ第４０９５１号）と命名された発現ベク ターを提供する。加えて、本発明はこの発現ベクター、或いは同ＤＮＡコード領 域を挿入された他の何れかの発現ベクターによってコードされる、ＣＤ４−ガン マ２・キメラ重鎖ホモニ量体を提供する。特に、本発明はまた、ＣＤ４−Ｉ　ｇ Ｇ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖をコードする、ＣＤ４−Ｉ ｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ　（ＡＴＣＣ第７５２９３号）及びＣＤ４−ｋＬＣ− ｐＲｃｃＭＶ　（ＡＴＣＣ第７５１９４号）と命名された発現ベクターを提供す る。加えて、本発明はこれらの発現ベクター、或いは同ＤＮＡコード領域を挿入 された他の何れかの発現ベクターによってコードされる、ＣＤ４−１　ｇＧ２・ キメラヘテロ四量体を提供する。

本発明に従えば、発現のための多くのベクター系が用いられ得る。例えば、成る クラスのベクターでは、ウシ・パピローマウィルス、ポリオーマウィルス、アデ ノウィルス、ワクチンウィルス、バキュロウィルス、レトロウィルス（ＲＳ　Ｖ 。

ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）　、又はＳＶ４０ウィルスのような動物ウィルスか ら誘導されたＤＮＡ要素が利用される。加えて、形質移入されたホスト細胞の選 別を可能にする一以上のマカーを導入することによって、該ＤＮＡをクロモソー ム中に安定に組み込んだ細胞が選択され得る。このマーカーは、原栄養株を栄養 要求性宿主にしたり、生物致死耐性（抗生物質耐性）や銅等の重金属に対する耐 性を与え得る。選別可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接に結 合され得、或いは同時形質転換によって同じ細胞内に導入され得る。ｍＲＮＡの 最適合成のために、追加の要素もまた必要とされ得る。これらの要素にはスプラ イス信号、並びに転写プロモータ、エンハンサ−及び停止信号が含まれる。この ような要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターには、オカヤマによって記載され たものが含まれる（３７）。

こうして、本発明は更に、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の製造方法 を提供する。この方法は、下記の２）〜Ｃ）を具備する。

８）哺乳動物細胞に、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を産生ずるため の発現ベクターで形質移入すること；ｂ）上記で得られた形質転換哺乳動物細胞 を、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体が産生される条件の下で培養する こと；及び Ｃ）こうして産生されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を回収するこ と。

発現のための構造を含むＤＮＡベクター又はＤＮＡ配列が製造されると、この発 現ベクターは適切な哺乳動物宿主細胞に形質転換され、または該細胞内に導入さ れる。プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション又 は他の従来技術のような種々の技術が用いられ得る。プロトプラスト融合におい ては、細胞が培地中で増殖され、適切な活性についてスクリーニングされる。当 該遺伝子の発現によって、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の一つの鎖 に対応する融合タンパクの産生がもたらされる。この融合タンパクは、次いでキ メラ重鎖ホモ二量体を形成するように処理される。

更に、得られた形質転換細胞を培養する方法、並びにこうして産生されたキメラ 重鎖ホモ二量体を回収するための方法は当業者に周知であり、使用される個々の 発現ベクター及び哺乳動物宿主細胞に基づいて変形または最適化され得る。

権利請求される発明に従えば、本発明のキメラ重鎖ホモ二量体を発現させるため の好ましい宿主細胞は哺乳動物セルラインであり、例えば、ＳＶ４０　（ＣＯ８ −７）によって形質転換されたサル腎Ｃ■１ライン；ヒト胚体腎ライン２９３； 新生ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；チャイニーズノ＼ムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ （ＣＨＯ）；サル腎細胞（ＣＶＩ）；アルリカ緑サル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６） ；ヒト頚部腫瘍細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；ヒト肺細胞（Ｗ　 １３８）　；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；７ウス乳癌（ＭＭＴＯ６０５６２）　 ；マウス・セルライン（Ｃ１２７）およびミエローマ赤セルラインが含まれる。

本発明は更に、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ感染を阻止する方法を提供する。この方法 は、ＣＤ４＋細胞を、該細胞の感染を阻止するのに有効な量のＣＤ４−ガンマ２ ・キメラ重鎖ホモ二量体で処理することを具備する。

加えて、本発明は対象をＨＩＶによる感染から防ぐ方法を提供する。この方法は 、対象に対して、該対象をＨＩＶによる感染から防止するために有効な量のＣＤ ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を投与することを具備する。

本発明は種々の対象に対するキメラ重鎖ホモ二量体の投与を包含するが、興味の 対象は特にＡＩＤＳ患者である。更に、該ホモ二量体を投与する方法は当該技術 分野において周知であり、例示のみを目的として列記すれば、これを単独または ＡＺＴもしくはＤＤＩと組み合わせた形での、皮下注射、筋肉内注射および静脈 内注射が挙げられる。

更に、ＨＩＶ感染の広がりを阻止するように、ＨＩＶに感染した対象を治療する 方法が提供される。この方法は、対象に対して、ＨＩＶ感染の広がりを阻止する ために有効な量のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を投与することを具 備する。

例えば、該ホモニ量体は、血漿１ｍｌ当たり約１００　ｎｇのＣＤ４−ガンマ２ ・キメラ重鎖ホモ二量体の濃度を維持できる投与量で、ＨＩＶ感染を有する患者 に対して投与され得る。異なった分子量を有するＣＤ４−ガンマ２φキメラ重鎖 ホモニ量体の変種については、血漿１ｍｌ当たり約２ピコモルの可溶性受容体、 例えば、天然の可溶性受容体（膜に結合したもの）との化学量論的等量を達成す るのに充分な量が投与される。

典型的には、可溶性ＣＤ４の投与量は、１日当たり、約１００μｇ／ｋｇ患者体 重である。

上記の方法は、ＨＩＶ感染患者の体内におけるＨＩＶウィルスの広がり防止を補 助する。加えて、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体は、ＨＩＶの広がり に対する患者血液の感受性を低下させる予防的手段として投与され得る。このよ うな予防的投与には、ＨＩＶ接触の前、該接触後の短期間またはその両方での投 与が含まれる。

更に、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ感染を阻止するのに有効な量の本発明によるＣＤ４ −ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体と、薬剤的に許容可能な担体とを含有する薬 剤組成物が提供される。

薬剤的に許容され得る担体は、本発明が関係する技術の分野において周知であり 、同等限定されるものではないが、その中には０．０１−０．１Ｍ、好ましくは ０．０５Ｍのリン酸緩衝液、または０．８％生理食塩水溶液が含まれる。加えて 、このような薬剤的に許容され得る担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液お よびエマルジョンであり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリ エチレングリコール、オリーブ油のような植物油、並びにオレイン酸エチルのよ うな注射可能な有機エステルである。水性担体には、整理食塩水および緩衝媒質 を含む水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョン又は懸濁液が含まれる。非 経腸的担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖液、ブドウ糖及び塩 化ナトリウム、乳酸リンゲル液、又は固定化オイル（ｆｉｘｒｄ　ｏｉｌ）が含 まれる。

静脈内担体には、液体の栄養補液、リンゲルのブドウ糖液をベースとするような 電解質補液、その他が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活 性ガス等のような保存剤および他の添加剤も存在せしめ得る（３８）。

本発明は更に、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体と、これに結合した毒 素とを含有する組成物を提供する。

毒素の幾つかの例としては、リシンの脱グリコジル化されたＡ鎖、ジフテリア毒 素、又は非ペプチジル細胞毒がある。

これらの毒素は、従来のイン・ビトロでのタンパク架橋剤を用いて結合され得る 。加えて、該毒素は組換合成によって、融合タンパクとして結合され得る（例え ば、米国特許第４．７６５、３８２号を参照のこと）。

本発明はまた、ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラ重鎖ホモニ量体と、これに結合され た検出マーカーとを含有した診断試薬を提供する。ＨＩＶウィルスに結合するこ とに加え、検出マーカーが結合されている分子を用いることによって、ＨＩＶ感 染細胞を同定することができる。従来の検出マーカーの例には、　Ｉのような放 射性アイソトープ、発色団、および蛍光基が含まれる。

こうして、本発明のキメラ重鎖ホモニ量体は、ＨＩＶまたはＳＩＶ感染が疑われ る動物から採取したサンプルを本発明のホモニ量体と接触させ、単独またはＨＩ Ｖ感染細胞表面のｐｇ１２０と複合体を形成するか否かを検出することによって 、生物学的サンプルにおけるＨＩＶまたはＳＩＶウィルス感染を試験するために 用いられ得る。この目的のために、本発明のホモニ量体は、検出マーカーでラベ ルされ又はラベルされずに、該ホモニ量体またはこれとｇ　ｐ　１２０との複合 体に特異的に向けられる検出可能にラベルされた別の試薬で検出される。

例えば、生物学的サンプルは、細胞、細胞粒子または可溶性タンパクを固相化で きるニトロセルロース又は他の固相支持体で処理され得る。該支持体は、次いで 適切な緩衝液で洗浄され、続いて検出可能にラベルされ得るキメラ重鎖ホモニ量 体で処理され得る。次に、固相支持体は緩衝液で二回目の洗浄が行なわれて未結 合の融合タンパクが除去され、ラベルされたホモニ量体が検出される。

この試験を行うに際しては、次のステップが採用される。

ａ）　ｇ　Ｉ）　１２０を含有することが疑われるサンプルを固相支持体に接触 させ、ｇ　ｐ１２０または表面にｇ　ｐ　１２（ｌを発現する細胞の固相化を行 なうこと； ｂ）前記固相支持体を、検出可能にラベルされた本発明のキメラ重鎖ホモニ量体 と接触させること；Ｃ）前記検出可能にラベルされたホモニ量体を、該ホモニ量 体が前記固相化されたｇ　Ｉ）　１２０又はｇ　ｐ　１２０を表面に発現した細 胞に結合するのに充分な時間だけ、前記支持体と共にインキュベートすること； ｄ）ステップＣ）で得られたインキュベーション混合物から、該固相支持体を分 離すること；および ｅ）結合されたラベル化ホモニ量体を検出し、これによってｇ　ｐ　１２０を検 出すること； このような方法は、当該技術分野で周知の方法を用いて、定性試験または定量試 験としてフォーマット化される。

或いは、ラベルされたホモニ量体ｇ　ｐ１２０複合体は、該複合体を、例えば免 疫グロブリン、プロティンＡ１プロテインＧまたは抗ＩｇＧ抗体に特異的な固相 化された抗体またはタンパクと接触させることにより、反応混合物から分離され 得る。このような抗免疫グロブリン抗体は、モノクローナル抗体であってもポリ クローナル抗体であってもよい。次いで、固相化されたｇ　ｐ１２０−ラベル化 ホモニ量体／抗体の複合体を得るために、固相支持体は適切な緩衝液で洗浄され 得る。ホモニ量体上のラベルが検出されて内因性ｇ　ｐ　１２０が測定され、こ れによってＨＩＶの存在が検出される。

本発明の一つの態様において、サンプル中におけるＨＩＶまたはＳＩＶウィルス 感染の検出方法は、次のａ）およびｂ）を具備する。

りｇｐ１２０の含有が疑われるサンプルを、本発明に従うＣＤ４−ガンマ２・キ メラ重鎖ホモニ量体および免疫グロブリンのＦｃ部分と接触させることと； ｂ）複合体が形成されたか否かを検出すること。

本発明はまた、下記のａ）〜Ｃ）を具備したサンプル中におけるｇ　ｐ１２０の 検出方法を提供する。

ａ）　ｇ　ｐ　１２０の含有が疑われるサンプルを本発明のホモニ量体および免 疫グロブリン鎖のＦｃ部分と接触させることにより得られた混合物を、前記ホモ ニ量体に特異的で且っ固相支持体に固相化された抗体、プロティンＡまたはプロ ティンＧのようなＦｃ結合性分子と接触させて、ｇ　ｐ　１２０−ホモニ量体固 相化抗体の複合体を得ること； ｂ）ステップ２）で得られた該固相支持体を洗浄し、未結合のホモニ量体を除去 すること；および Ｃ）このホモニ量体を検出すること。

勿論、未ラベル又は検出可能にラベルされたホモニ量体およびｇ　ｐ　１２０の 特定の濃度、温度、インキュベーション時間、並びに他の試験条件は、サンプル 中のｇ　ｐ　１２０の濃度およびサンプルの性質等を含む種々の因子に応じて変 化し得る。当業者は、夫々の測定のための操作条件および最適試験条件を容易に 決定することができる。

また、可溶性ＣＤ４　（ｓＣＤ４）またはＣＤ４キメラタンパクを検出し、定量 するための酵素結合免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）が提供される。この試験を行う 際、そのプロセスは次のり〜ｅ）を具備する。

ａ）可溶性５ＣＤ４を固相化するために、５ＣＤ４を含むサンプルを固相支持体 と接触させること；ｂ）前記固相支持体を、検出可能にラベルされたｔツクロー ナル抗体０ＫＴ４ａ単独と接触させるか、またはｓ　ＣＤ４若しくはＣＤ４キメ ラタンパクを含むサンプルおよび０ＫＧ４ａと接触させること； Ｃ）前記検出可能にラベルされた０ＫＧ４ａを含む培地を、固相化された５ＣＤ ４に結合させるために充分な時間だけインキュベートすること； ｄ）ステップＣ）におけるインキュベーション混合物から、前記固相支持体を分 離することと、 ｅ）結合された０ＫＴ４ａを検出し、これによってサンプル中に含まれるＣＤ４ の量を定量すること。

本発明は更に、ＣＤ４−　Ｉ　ｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ　（ＡＴＣＣ第７５１ ９３号）と命名された、ＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体の重鎮をコフド する発現ベクターを提供する。

本発明は又、その重鎮が上記発現ベクター若しくはこれと同じコーディング配列 を含む他のベクターによってコードされるＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量 体を提供する。

加えて、ＣＤ４−ＫＬＣ−ｐＲｃｃＭＶ　（ＡＴＣＣ第７５１９、４号）と命名 された、ＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体の軽鎖をコードする発現ベクタ ーを提供する。本発明は最後に、ソノ軽鎖が上記ＣＤ４−ＫＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ 発現ベクター若しくはこれと同じコーディング配列を含む他のベクターによって コードされるＣＤ４−１　ｇＧ２−キメラヘテロ四量体を提供する。

更に本発明は、その重鎮および軽鎖の両者が上記の発現ベクターによってコード される、ＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体を提供する。

本発明は更に、このようなＣＤ４−１ｇＧ２−キメラヘテロ四量体の製造方法を 提供する。この方法は、次のａ）〜Ｃ）を具備する。

ａ）ＣＤ４−１ｇＧ２−キメラヘテロ四量体の軽鎖を産生ずるための発現ベクタ ーと、軽鎖をコードする発現ベクターとを、哺乳動物細胞に同時形質移入するこ と；ｂ）こうして同時形質移入されだ哺乳動物細胞を、ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キ メラヘテロ四量体が産生きれるような条件下で培養すること；および Ｃ）こうして産生されたＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２−キメラヘテロ四量体を回収するこ と。

哺乳動物細胞に同時形質移入する方法は当該技術において周知であり、これまで に議論されたものが含まれる。同様に、軽鎖をコードする発現ベクターは当該技 術分野において周知である。

加えて、本発明は次のａ）〜Ｃ）を具備した、ＣＤ４−　Ｉ　ｇＧ２・キメラヘ テロ四量体の製造方法を提供する。

ａ）ＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体の軽鎖を産生ずるための発現ベクタ ーと、重鎮をコードする発現ベクターとを、哺乳動物細胞に同時形質移入するこ と：ｂ）こうして同時形質移入された哺乳動物細胞を、ＣＤ４−１ｇＧ２・キメ ラヘテロ四量体が産生されるような条件下で培養すること；および Ｃ）こうして産生されたＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体を回収すること 。

更に、本発明は下記り〜Ｃ）を具備した、ＣＤ４−１　ｇＧ２・キメラヘテロ四 量体の製造方法を提供する。

ａ）ＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体の重鎮を産生ずるための発現ベクタ ーと、ＣＤ４−ＩｇＧ２＠キメラヘテロ四量体の軽鎖を産生ずるための発現ベク ターとを、哺乳動物細胞に同時形質移入すること； ｂ）こうして同時形質移入された哺乳動物細胞を、ＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘ テロ四量体が産生されるような条件下で培養すること；および Ｃ）こうして産生されたＣＤ４−　Ｉ　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体を回収する こと。

本発明は又、ＣＤ十細胞のＨＩＶ感染を阻止する方法を提供する。この方法は、 その重鎖がＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターに よってコードされるＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体、その軽鎖がＣＤ４ −ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４ −Ｉ　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体、またはその重鎮および軽鎖の両者が上記の 発現ベクターによってコードされるＣＤ４−１　ｇＧ２Φキメラへテロ四量体の 何れかを用い、ＣＤ４＋細胞の感染を阻止するのに有効な量の上記ＣＤ４−１ｇ Ｇ２・キメラヘテロ四量体で、該ＣＤ４＋細胞を処理することを具備する。

本発明は更に、対象がＨＩＶで感染されるのを防止する方法を提供する。この方 法は、その重鎖がＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベク ターによってコードされるＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体、その軽鎖が ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされる ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体、またはその重鎮および軽鎖の両者が 上記の発現ベクターによってコードされるＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量 体の何れかを、対象がＨＩＶで感染されるのを防止するのに有効な量で、対象に 対して投与することを具備する。

本発明はまた、ＨＩＶで感染された対象を、ＨＩＶ感染の広がりを阻止するよう に治療する方法を提供する。この方法は、その重鎖がＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２ＨＣ− ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−１　ｇＧ ２・キメラヘテロ四量体、その軽鎖がＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名され た発現ベクターによってコードされるＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体、 またはその重鎮および軽鎖の両者が上記の発現ベクターによってコードされるＣ Ｄ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体の何れかを、対象またはＡＩＤＳ患者の体 内におけるＨＩＶ感染の広がりを阻止するのに有効な量で、対象に対して投与す ることを具備する。

また、本発明は薬剤組成物を提供する。該組成物は、ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ感染 を阻止するのに有効な量のＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体であって、そ の重鎮がＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによ ってコードされるＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体、その軽鎖がＣＤ４− ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４− １ｇＧ２やキメラへテロ四量体、またはその重鎮および軽鎖の両者が上記の発現 ベクターによってコードされるＣＤ４−１　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体の何れ かと、薬剤的に許容され得る担体とを含有する。

本発明によれば、更に、その重鎖がＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命 名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四 量体、その軽鎖がＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによ ってコードされるＣＤ４−１ｇＧ２−キメラヘテロ四量体、またはその重鎮およ び軽鎖の両者が上記の発現ベクターによってコードされるＣＤ４−１ｇＧ２・キ メラヘテロ四量体の何れかと、これに結合された毒素とを含有する組成物が提供 される。

本発明の一つの態様において、該毒素は脱グリコジル化されたりシンのＡ鎖、シ ュードモナスエキソトキシンＡのドメン■もしくは■、または非ペプチジル化細 胞毒である。

本発明は更に診断試薬を提供する。この診断試薬は、その重鎖がＣＤ４−Ｉ　ｇ Ｇ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクター１こよってコードされるＣＤ ４−ＩｇＧ２争キメラヘクラ四量体、ソノ軽鎖がＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ と命名された発現ベクターによってコードされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテ ロ四量体、またはその重鎮および軽鎖の両者が上記の発現ベクターによってコー ドされるＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の何れかと、これに結合された 検出マーカーとを含有する。

以下に示す例の理解を容易にするために、頻繁に出てくる一定の方法および／ま たは用語はマニアティス等（４２）に最も良く説明されている。

以下の実験の詳細のセクションにおいて、本発明が例示される。これらのセクシ ョンは本発明の理解を助けるために提示されるものであって、後述の請求の範囲 に記載される発明を限定することを意図したものではなく、また如何なる意味で もそのように解釈されてはならない。

〔実験の詳細〕

プラスミドｐＳＰ６Ｔ４　（４）からＥｃｏＲ１／５ｔｕｌ制限酵素断片として ヒトＣＤ４ｃＤＮＡを切り出した。０゜７０キロベ一ス断片を単離し、ＥｃｏＲ １／Ｓｍａｌで消化されたＭ１３ｍｐ１８にクローン化した。その後この中間ベ クター（Ｍ１３ｍｐ　１８　（ＣＤ４））を単離し、Ｐｓｔｌでリニア化し、精 製し、細菌性アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）で処理した。ヒトガンマ２Φ 重鎖遺伝子を含むプラスミドルＢｒガンマ２からの２．ＯＫｂ　Ｐｓｔｌ／Ｐｓ ｔｌ断片（３６）（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３エキソンを含む）を単離し、ＢＡ Ｐ処理したＭ１３ｍｐ１８／ＣＤ４ベクターにクローン化した。得られた組み換 え体をその後Ｐｓｔｌ断片の正方向に対して（ＣＤ４配列に関して）スクリーニ ングし、縦列にＣＤ４　（ＥｃｏＲ１／５ｔｕｌ）−ガン？２　（Ｐｓｔｌ／Ｐ ｓｔｌ）を含むベクターを得た。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子を得るた めに、オリゴヌクレオチドに媒介された部位指向性突然変異誘発（ｏｌｉｇｏｎ ｕｃｌｅｏ目ｄｅ−ｍｅｄｉａｊｅｄ　ｓ目ｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｊａｇ ｅｎｅｓｉｓ）を遂行して、ＣＤ４及びガンマ２・重鎖ＤＮＡ配列を並べて、フ レームのＣＤ４配列をヒンジエキソンにつなげた。得られたキメラＤＮＡ分子は ＣＤ４のＶＩＶ２領域及びそれに続くガンマ２・重鎮のヒンジＣＨ２及びＣＨ３ 領域を含む蛋白質をコードする（図ＩＡ）。突然変異誘発は、形質転換したＴＧ Ｉ細胞からの組み換えファージから単離された１本鎖ＤＮＡ　（アマジャム）で 遂行された。簡単には、鋳型ＤＮＡを、ｃＤ４のｖｌＶ２のＰｈｅ　（１７９） をコードする最終コドンをＩ　ｇＧ２に対するヒンジの最初のコドン（Ｇ　１　 ｕをコードする）に接続する配列を含む３４ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５−− ＧＡＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣＧＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧ−３ ”）でアニーリングした（図ＩＡ及び図３）。第二の鎖合成の後、２本鎖ＤＮＡ をコンピテントＴＧ１細胞に形質転換した。単離したプラークをその後新鮮なＴ ＧＩ細胞で増殖させ、ＤＮＡの塩基配列を決定するために１本鎖ＤＮＡを精製し た。すべての変異をシークエナーゼシステム（ＵＳＢ）を用いてジデオキシ法に より立証及び確認した。正しい配列を有するキメラ遺伝子を含むプラークをその 後ＴＧ１細胞で増殖させ、この細胞からＲｆ　ＤＮＡ　（ＣＤ４−１　ｇＧ２− Ｒｆと称する）を単離した。

２、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体をコードする萌乳類発現ベクター 作成 ＥＣ０ＲＩを用いたリニア化に続いて、組み換えＲｆＤＮＡからＣＤ４−ガンマ ２・キメラ重鎖遺伝子を単離した。リニア化されたＤＮＡのＥｃｏＲ１部位をＤ ＮＡ、ポリメラーゼ■のフレノウフラグメントを用いてうめた。平坦な末端を有 するＤＮＡをその後Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で一晩、１００倍モル過 剰のＨｉｎｄＩＩＩリンカ−につなげた。

７０℃、１５分間で７４ＤＮＡリガーゼを熱不活性化した後、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　 Ｉリンカ−ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで広範囲に消化し、ＣＤ４−ガンマ２・キメ ラ重鎖遺伝子を含む断片を遊離した。その後このＨｉｎｄＩＩＩ断片を精製し、 予めＨｉｎｄｌＩＩで消化され、ＢＡＰ処理された発現ベクターｐｃＤＮＡ−１ （インビトローゲン）につなげた。得られたプラスミドをその後ＭＣ１０６１／ Ｐ３細胞に形質転換した。

プラスミドＤＮＡを組み換えクローンから単離し、ＨｉｎｄＩＩＩ挿入部の存在 及びプラスミド中のサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターに関する挿入 部の方向を制限酵素分析により確かめた。得られたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重 鎖ホモニ量体をコードする哺乳動物発現プラスミドはＣＤ４Ｉ　ｇＧ２−ｐｃＤ ＮＡｌと称する。

３、哺乳動物細胞における ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２−ｐｃＤＮＡｌの発現ａ、一時的な発現 １０％牛脂児血清を含有するＤＭＥＭ中で増殖したＣｏ５Ｍ５細胞を７５％コン フレンドになるように分割した。次の日、標準的なＣａＰＯ（４）沈降法により 、この細胞にＣｓＣ１で精製されたプラスミドＣＤ４１　ｇＧ２−ｐ　ｃＤＮＡ ｌ・ＤＮＡｌ０μｇを１６〜２０時間でトランスフェクションした。

トランスフェクションの後、この細胞に新鮮な培地を添加した。トランスフェク ション後４８〜７２時間後に合成された生成物の分析を、トランスフェクシント の３５Ｓ−メチオニンによる１２〜１８時間の放射能ラベル及びそれに続く抗Ｃ Ｄ４抗体を用いた培地及び細胞溶解産物の沈降、或いはプロテインＡ−セファロ ースビーズのみを用いたインキュベーション及びそれに続く還元或いは非還元状 態での５ＤＳ−ＰＡＧＥにより遂行した（図６）。更に、培地及び細胞溶解産物 の分析をトランスフェクション後４８〜７２時間後に、標準的なウェスタンブロ ッティング手順により遂行した。

ｂ、安定な発現 Ｄｈｆｒ−チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に、ＣｓＣ１で精製され たＤＮＡ２０μｇを、ＣＤ４　Ｉ　ｇＧ２−ｐｃＤＮＡｌ　：　ｐ４１０　（ｐ ４１０はｄｈｆｒ遺伝子を含む発現プラスミドである）　１０００：１のモル比 でトランスフェクションした。しかし他の比率も用いることができる。トランス フェクション後約３〜５日後に、細胞を選択培地（１０％透析牛脂児血清を含む 無ヌクレオシドアルファＭＥＭ）にまいた。セレクション後約１０〜１５日後に 、個々の細胞クローンを採取し、ＥＬＩＺＡ、プロティンＡ−セファロースビー ズを用いた沈降及びそれに続く還元或いは非還元状態での５ＤＳ−ＰＡＧＥ等の いくつかのスクリーニング技術を用いてＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量 体の安定な発現を分析した。高レベルで発現したクローンを、メソトレキセート の濃度を増加させた中で増やし、新しく導入されたＤＮＡ配列を連続的に繰り返 し増幅させた。このように、１０〜１００μｇ／ｍｌのＣＤ４−ガンマ２−キメ ラ重鎖ホモニ量体を分泌する安定なＣＨＯ細胞株が樹立された。

ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を、プロティンＡ−セファロースカラ ムクロマトグラフィーを用いて１工程で精製した。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重 鎖ホモニ量体を分泌するＣＨＯ細胞を、ｌＯ％無１ｇＧ牛脂児血清アルファＭＥ Ｍが入っているローラーボトル中で高密度になるまで増殖させた。馴らし培地を 回収し、遠心により分離し、この及び次の緩衝液中に界面活性剤（すなわちＴｗ ｅｅｎ）を含む、或いは含まないＰＢＳで１：１希釈した。その後、希釈した培 地を、６０ｍ１／時間の流速で、予めＰＢＳで平衡にしたプロティンＡ−セファ ロースツアーストフロラの５ｍｌカラムにかけた。広範囲な洗浄の後、特異的に 結合した材料を、直ぐに溶出フラクションを中和するために、１００ｍＭ　グリ シン／ＭＣＩ　（ｐＨ３，５）を用いてＩＭＴｒｉｓ、ＨＣｌ　（ｐＨ８，０） のアリコートに直接溶出した。その後フラクションを還元及び非還元状態での５ ＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続く銀染色により分析し、プールした（図８）。

その後プールしたフラクションを、１２０ｍ１／時間の流速で、予め５０ｍＭ　 ＢＥＳ　（ｐＨ７，０）で平衡にしたＳ−セファロースツアーストフロラの１０ ｍ１カラムにかけた。

サンプルをのせた後、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を特異的に溶出 させるために、１工程溶出勾配（ａ　５ｔｅｐｅｌｕｔｉｏｎ　ｇｒｚｄｉｅｎ ｌ　）　（以下の４工程からなる：５５カラム積の５０ｍＭ　ＢＥＳ　（ｐＨ７ ，０）　、４力ラム体積の５０ｍＭ　ＢＥＳ　（ｐＨ７，０）　、１００ｍＭ　 ＮａＣ１，６力ラム体積の５０ｍＭ　ＢＥＳ　（ｐＨ７，０）　、２２５ｍＭＮ ａＣ１、及びそれに続く８力ラム体積の５０ｍＭ　ＢＥＳ（ｐＨ７，０）　、５ ００ｍＭ　ＮａＣ１）を使用した。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を 、５０ｍＭ　ＢＥＳ（ｐＨ７，０）　、５００ｍＭ　ＮａＣ１でカラムから溶出 させた。その後ピークフラクションをプールし、濃縮して、最終的に蛋白質の濃 度を少なくとも１ｍｇ／ｍｌにした。プールし、濃縮されたフラクションをその 後、８ｍｌ／時間の流速で、予めＰＢＳで平衡にしたセファクリル　Ｓ−３００ ＨＲの１２０　ｍ　１カラムにかけた。ＣＤ４−ガンマ２Φキメラ重鎖ホモニ量 体のフラクションをＰＢＳ中に特異的に溶出させ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌに濃 縮した。

５、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体のＨＩＶエンベロープ糖タンパク ｇｐ　１２０に対する結合の例証 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を発現しているＣ　ｏ　ｓ　Ｍ　５　 トランスフェクシントを、１０％無ＩｇＧ牛脂児血清を含むＤＭＥＭ中で７２時 間インキュベートした。その後ラベルされていない培地を回収し、３５Ｓ−メチ オニン−放射能ラベルＨＩＶ　ｇｐ１２０を沈降させるために用いた。

３５Ｓ−メチオニン−ラベルＨＩＶ　ｇｐ１２０を含むＣＤ４−ガンマ２・キメ ラ重鎖ホモニ量体含有培地をインキュベーションした後、複合体をプロティンＡ −セファロースに吸着させた。プロティンＡ−セファロース複合体を遠心により 回収し、沈降物を還元状態の５ＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続くフルオログラフィー により分析した（図７）。また、ＣＨＯ細胞から精製されたＣＤ４−ガンマ２・ キメラ重鎖ホモニ量体のアリコートも、同様の手順で３５８−放射能ラベル　ｇ ｐ１２０を沈降させるために用いた。

血漿半減期及び胎盤移入の例証を、すでに確立されている技術により遂行する。

簡単には、ウサギ又はサルに、精製されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ 量体を静脈内或いは筋肉内注射する。注射後種々の時点において、血漿サンプル を採取し、血清中に存在するＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体の量をＥ ＬＩＺＡにより測定する。更に妊娠したサルにもＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖 ホモニ量体をＩＶ又はＩＭ注射し、新生サルのさい帯面及び血清中の濃度を測定 する。新生サルのさい帯面及び血清中に加えて、母親の血清中のＣＤ４−ガンマ ２働キメラ重鎖ホモニ量体の量の測定及び比較は、これら分子の胎盤を通した移 入比率を示す。

ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体のＦｃＲ結合及びマクロファージ感染 性の測定はすでに確立されている技術を用いて行う。これらの研究に対して、ヒ ト末梢血からの単球／マクロファージ群から精製されたＵ９３７細胞（ＦｃＲＩ 及びＦｃＲＩ　Ｉを発現しているヒト単球細胞株）及びヒト組み換えＦｃＲ５を 本質的に発現するヘラ細胞が用いられる。

更にＦｃＲＩ及びＦｃＲＩ　ｒに特異的なモノクローナル抗体は商業的に入手可 能である。簡単には、放射能標識された単量体の或いは凝集したＣＤ４−ガンマ ２・キメラ重鎖ホモニ量体を上記細胞及び適当なコントロール細胞と共に４℃で 種々の時間でインキュベートする。各インキュベーションの終りに、細胞を溶解 し、細胞に結合している放射能活性を測定し、各細胞型に特異的に結合するＣＤ ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体の量を立証する。コントロールとして、特 異的な抗体の結合のレベルを測定するために、放射能標識された正常の単量体の 或いは凝集した正常ヒトＩ　ｇＧ２を用いる。

更に、放射能標識された成分と、標識されていない単量体のまたは凝集した正常 ヒトＩ　ｇＧ２、或いはＦｃＲＩ及びＦｃＲ１１に対するモノクローナル抗体と の競合は、各細胞型に対するＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体の結合効 率及び特異性を立証する。

ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体が単球／マクロファージのＨＩＶ感染 の増強を媒介するか否かを確認するために、ＨＩＶ−１を培地のみと共に、或い はいくつかの希釈された単量体の或いは凝集したＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖 ホモニ量体のいずれかと共にインキュベートする。コントロールとして、正常な 個人及びＨＩＶ感染した個人からの血清を用いる（３１）。１時間、４℃のイン キュベーションの後、前パラグラフに記載された細胞型にオプソニン化ウィルス を添加する。感染浸種々の時点において、培地を回収し、ウィルス逆転写活性を アッセイしてウィルス感染の程度を測定する。コントロールとして、細胞の感染 の間に、５ＣＤ４．０ＫＴ４ａ、又はＬｅｕ３ａを含ませる。更にＣＤ４−ガン マ２・キメラ重鎖ホモニ量体及び適当なコントロールの種々の希釈液を、結合が 可能になるように４℃で細胞と共にまずインキュベートする。その後ＨＩＶを添 加し、ウィルス逆転写活性により感染アッセイを行う。

８、ＨＩＶ結合アッセイ ＨＩＶの結合は、前記の通り遂行された（４３．４４）。

簡単には、濃縮されたＨＩＶ−１調製液を５ＣＤ４、ＣＤ４−ガンマ２、又はＣ Ｄ４−ガンマ２の種々の希釈液と共に３０分間インキュベートし、その後５×１ ０５のＣＥＭ細胞に添加する。結合したウィルスを、前述の間接蛍光抗体法及び サイトフルオログラフィーによって検出した（４４）。

９、中和アッセイ 増殖性ウィルス複製のマイクロカルチャーアッセイは前述の通りであった（４３ ．４５）。簡単には、５ＣＤ４、ＣＤ４−ガンマ２、又はＣＤ４−ガンマ２の希 釈液を、１００ＴＣＩ　Ｄ５ｏＨＩ　Ｖ−１と共に室温で３０分間インキュベー トした。この混合液をＰＨＡ−刺激性リンパ球に添加し、３７℃で一晩インキユ ベートした。その後に細胞を洗浄し、１×１０５／カルチヤーでマイクロカルチ ャープレートにまいた。

そして希釈当たり１０カルチヤーについて、８日及び１２日後の培養上清中のＨ ＩＶ抗原を検出することによって増殖性ウィルス複製をモニタリングした。

Ｂ、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の発現のためのＣＤ４−ＩｇＧ２・ キメラ重鎖及びＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖の作成 本発明は、形質転換した哺乳動物の細胞から効率よく分泌されるＣＤ４−ガンマ ２・キメラ重鎖ホモニ量体をコードするＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子に 関する。このキメラ分子は、効果的なホモニ量体の組立て及び分泌を可能とする 、ヒトＩ　ｇＧ２・重鎮からの配列を含むように設計されている。ＩｇＧ重鎖の ＣＨＩ領域は、細胞内に重鎮分子を保持させ、軽鎖とへテロ四量体を形成させる （２５）。効率よ＜ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を生産するために 、前記ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子は特異的にＣＨ１領域を欠いている 。得られたホモニ量体は２つのＣＤ４ＶＩＶ２成分を含み、従って、ｇｐ１２０ 結合に関して二価となる可能性を有し、また５ＣＤ４と比較してＨＩＶに対して 増強されたアビディティーを有する。

更に、本発明は２つの重鎮及び２つの軽鎖を含むＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラヘ テロ四量体の作成に関する。得られたヘテロ四量体は、２つ或いは４つのＣＤ４ ＶＩＶ２成分を含み、ｇｐ１２０結合に関して四価となる可能性を有している。

また、５ＣＤ４と比較してＨＩＶに対して増強されたアビディティーを有する。

ＣＤ４−１　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体を生産するために用いられるＣＤ４− １　ｇＧ２・キメラ重鎖遺伝子は完全な重鎮定常部を含み、またＣＨＩ領域も含 む。ＣＨ１領域を含むと、軽鎖との効率のよい細胞内相互作用を促進し、ジスル フィド結合したヘテロ四量体の分泌を可能にする。ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重 鎖遺伝子及びＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子は共にＣＤ４のＶＩＶ２領域を 含む。

ＣＤ４のＶ１領域のみを含むＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラ重鎖遺伝子またはＣＤ ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子を（何れか一方または両者を組み合わせて）発現 させる試みは失敗であヒトＣＤ４ｃＤＮＡ配列をプラスミドｐａＳＰ６Ｔ４（４ ）からＥｃｏＲ１／５ｔｕｌ制限酵素断片として切り出す。０゜７０キロベ一ス 断片を単離し、ＥｃｏＲ１／Ｓｍａｌで消化されたＭ１３ｍｐ１８にクローン化 する。その後得ら、れたベクター（Ｍ１３ｍｐ　１８　（ＣＤ４））を単離し、 ＢａｍＨｌで消化する。Ｍ１３ｍｐ１８　（ＣＤ４））のＢａｍＨ１部位をＤＮ Ａポリメラーシーのフレノウフラグメントで平坦な末端とする。ポリメラーゼを ６５℃１５分間で熱不活性化した後、リニア化したＭｌ　３ｍｐ　１８　（ＣＤ ４）ベクターをＰｓｔｌで消化し、精製する。

ヒトガンマ２・重鎮遺伝子のＣＨＩエキソンを含む断片を切り出すために、プラ スミドルＢｒガンマ２　（３６）を５ａｃＩＩで消化し、５ａｃＩＩ部位をその 後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平坦にする。ポリメラーゼを熱不活性化した 後、この断片をＰｓｔｌで消化する。得られたＣＨＩエキソンを含む５ａａｌｌ （平坦）−Ｐｓｔｌ断片をその後精製し、前パラグラフで記載したＭ１３ｍｐ１ ８　（ＣＤ４）ベクターにつなげる。コンピテントＴＧＩ細胞の形質転換の後、 得られた組み換え体を、縦列にＣＤ４　（ＥｃｏＲ１／５ｔｕｌ）−ＣＨＩ　（ Ｓａｃ　Ｉ　Ｉ　（平坦）／Ｐｓｔｌ）を含むＣＤ４及びＣＨＩの両配列の存在 について制限酵素分析を用いてスクリーニングする。その後オリゴヌクレオチド に媒介された部位指向性突然変異誘発を遂行して、フレーム中にＣＤ４及びＣＨ Ｉ配列を並べる。得られたキメラＤＮＡ分子はガンマ２・重鎖のＣＨＩ領域に融 合されたＣＤ４のＶＩＶ２領域を含む。突然変異誘発は、形質転換したＴＧＩ細 胞からの組み換えファージから単離された１本鎖ＤＮＡ　（アマジャム）で遂行 される。鋳型ＤＮＡを、ＣＤ４のＶＩＶ２のＰｈｅ　（１７９）をコードする最 終コドンをガンマ２・重鎖に対するＣＨ１領域の最初のコドン（Ａｌａをコード する）に接続する配列を含む３３ｍａｒオリゴヌクレオチド（５−−ＧＧＧＣＣ ＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧ−３′）でアニー リングする。第二の鎖合成の後、２本鎖ＤＮＡをコンピテントＴＧ１細胞に形質 転換する。単離したプラークを新鮮なＴＧＩ細胞で増殖させ、ＤＮＡの塩基配列 を決定するために１本鎖ＤＮＡを精製する。すべての変異をシークエナーゼシス テム（ＵＳＢ）を用いたジデオキシ法により確認する。制限酵素分析によって決 定された正しい配列を有するキメラ遺伝子を含むプラークをその後ＴＧＩ細胞で 増殖させ、この細胞からＲｆＤＮＡを単離する。

ＣＤ４−ＣＨＩ・キメラ遺伝子からのＲｆＤＮＡをその後Ｐｓｔｌによる消化に よってリニア化する。Ｐｓｔｌでリニア化されたベクターをその後ＢＰＡ処理し 、ヒトガンマ２・重鎮遺伝子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３エキソンを含むプラス ミドルＢｒガンマ２のＰｓｔｌ−ＰｓｔｌＤＮＡ断片につなげる。その後キメラ ＣＤ４−ＣＨＩ断片に関するＰｓｔｌ−Ｐｓｔｌ断片の正しい方向を制限酵素分 析によって立証する。得られたキメラ遺伝子はＣＤ４のＶＩＶ２領域及びそれに 続くガンマ２φ重鎖のＣＨｌ、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む蛋白質をコ ードする（図２Ａ、２Ｂ及び４）。

ＥｃｏＲｌを用いたＲｆのリニア化に続いて、組み換えＲｆＤＮＡからＣＤ４− ＩｇＧ２・キメラ重鎖ＤＮＡ分子を単離する。リニア化されたＤＮＡのＥｃｏＲ １部位をＤＮＡポリメラーシーのフレノウフラグメントで埋める。平坦な末端を 有するＤＮＡをその後Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で一晩、１００倍モル 過剰のＨｉｎｄｌｌＩリンカ−につなげる。７０℃、１５分間で７４ＤＮＡ’Ｊ ガーゼを熱不活性化した後、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉリンカ−ＤＮＡをＨｉｎｄＩ　 Ｉ　Ｉにより広範囲に消化し、ＣＤ４−ＩｇＧ２−キメラ重鎖遺伝子を含む断片 を遊離する。このＨｉｎｄＩＩＩ断片をその後精製し、予めＨｉｎｄＩＩＩで消 化され、ＢＡＰ処理された発現ベクターｐｃＤＮＡ−１（インビトローゲン）に つなげる。

得られたプラスミドをその後ＭＣ１０６１／Ｐ３細胞に形質転換する。プラスミ ドＤＮＡを組み換えクローンから単離し、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ挿入部の存在及び プラスミド中のサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターに関する挿入部の 方向を制限酵素分析により確かめる。得られたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖を コードする哺乳動物発現プラスミドはＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２ＣＨ−ｐＲｃ　ＣＭＶ と称する。

ヒトカッパー軽鎖の定常部を、プラスミドルＣＮカッパ軽鎖からＭｓｅｌ断片と して切り出す。精製されたＭ　ｓ　ｅ　１断片をその後ＤＮＡポリメラーゼ１の フレノウフラグメントを用いて平坦な末端とする。その後Ｍ１３ｍｐ１８Ｒｆを ＨｉｎｃｌＩを用いてリニア化し、平坦な末端を有するＭ　ｓ　ｅ　１力ツパー 軽鎖断片をベクターの平坦な末端のＨｉｎｃＩＩ部位につなげる。ＴＧ１細胞の 形質転換の後、この組み換え体を、制限酵素分析によって、ベクター中の挿入部 の存在及び正しい方向について確認する。感染したＴＧ１細胞からＲｆを精製し 、ＥｃｏＲｌ及びＳｍａ　１を用いて消化する。カッパー軽鎖定常部を含む精製 されたベクターをその後前記ヒトＣＤ４ｃＤＮＡのＥｃｏＲ１／５ｔｕｌ断片に つなげる。得られた組み換え体を、縦列にＣＤ４　（ＥｃｏＲ１／５ｔｕｌ）− Ｃカッパ（Ｍｓｅｌ（平坦）／Ｍｓｅｌ（平坦））を含む挿入部の存在及び方向 について確認し、オリゴヌクレオチドに媒介された部位指向性突然変異誘発を行 うために１本鎖ＤＮＡを精製する。

鋳型ＤＮＡを、ＣＤ４のＶＩＶ２のＰｈｅ　（１７９）をコードする最終コドン をカッパー軽鎖定常部の最初のコドン（ｔｈｒをコードする）に接続する配列を 含む３３ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５＝−ＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧ ＴＧＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧ−３−）でアニーリングする。第二の鎖合 成の後、２本鎖ＤＮＡをコンピテントＴＧ１細胞に形質転換し、単離したプラー クをＤＮＡの塩基配列を決定するために新鮮なＴＧ１細胞で増殖させる。変異の 存在をジデオキシ法で確認する。正しい配列を有するキメラ遺伝子を含むプラー クをその後ＴＧ１細胞で増殖させ、この細胞からＲｆＤＮＡを単離する。得られ たＤＮＡ分子はＣＤ４のＶＩＶ２領域及びそれに続くカッパー軽鎖の定常部を含 む蛋白質をコードする（図２Ａ、２Ｂ及び５）。

ＥｃｏＲｌによるリニア化の後、ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖ＤＮＡ分子を組み 換えＲｆＤＮＡから精製する。リニア化されたＤＮＡのＥｃｏＲ１部位をＤＮＡ ポリメラーシーのフレノウフラグメントで埋める。平坦な末端を有するＤＮＡを その後Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で一晩、１００倍モル過剰のＨｉｎｄ ＩＩＩリンカ−につなげる。７０℃、１５分間でＴ４ＤＮＡリガーゼを熱不活性 化した後、ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−ＤＮＡをＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉにより広範囲に 消化し、ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子を含む断片を遊離する。このＨｉｎ ｄＩＩＩ断片をその後精製し、予めＨｉｎｄＩＩＩて消化され、ＢＡＰ処理され た発現ベクターｐｃＤＮＡ−１（インビトローゲン）につなげる。得られたプラ スミドをその後ＭＣ１０６１／Ｐ３細胞に形質転換する。ブラスミドＤＮＡを組 み換えクローンから単離し、ＨｉｎｄｌＩＩ挿入部の存在及びプラスミド中のサ イトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターに関する挿入部の方向を制限酵素分 析により確かめる。得られたＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖をコードする哺乳動物 発現プラスミドをＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと称する。

３、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を生産するための哺乳動物細胞にお けるＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２ＨＣＤＲｃＣＭＶ及びＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶの ｌＯ％牛脂児血清を含有するＤＭＥＭ中で増殖したＣｏ５Ｍ５細胞を７５％コン フレンドになるように分割する。次の日、標準的なＣａＰＯ（４）沈降法により 、この細胞にＣｓＣ１で精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃｃＭＶ　ＤＮ Ａ５μｇ及びＣｓＣ１で精製されたＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶプラスミドＤ ＮＡ５μｇを１６〜２０時間でトランスフェクションする。トランスフェクショ ンの後、この細胞に新鮮な培地を添加する。トランスフェクション後４８〜７２ 時間後に合成された生成物の分析を、トランスフェクシントの３５８−メチオニ ンによる１２〜１８時間の放射能ラベル及びそれに続く抗ＣＤ４抗体を用いた培 地及び細胞溶解産物の沈降、或いはプロティンＡ−セファロースビーズのみを用 いたインキュベーション及びそれに続く還元或いは非還元状態での５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにより遂行する。更に、培地及び細胞溶解産物の分析をトランスフェクショ ン後４８〜７２時間後に、標準的なウェスタンブロッティング手順により遂行す る。

ｂ、安定な発現 Ｄｈｆｒ−チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に、ＣｓＣ１で精製され たＤＮＡ２０μｇを、ＣＤ４−１ｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ：　ＣＤ４−ｋＬＣ −ｐＲｃＣＭＶ　：ｐ４１０　（ｐ４１０はｄｈｆｒ遺伝子を含む発現プラスミ ドである）＝１０００　：　１０００　：　１の比でトランスフェクションする 。しかし他の比率も用いることができる。トランスフェクション後約３〜５日後 に、細胞を選択培地（１０％透析牛脂児血清を含む無ヌクレオシドアルファＭＥ Ｍ）にまく。

セレクション後約１０〜１５日後に、個々の細胞クローンを採取する。このクロ ーンを、その後、ＥＬＩＺＡ、プロティンＡ−セファロースビーズを用いた沈降 及びそれに続く還元或いは非還元状態での５ＤＳ−ＰＡＧＥ等のいくつかのスク リーニング技術を用いてＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量体の安定な発現に ついて分析する。高レベルで発現したクローンを、メソトレキセートの濃度を増 加させた中で増やし、新しく導入されたＤＮＡ配列を連続的に繰り返し増幅させ る。

このように、高レベルのＣＤ４−ＩｇＧ２−キメラヘテロ四量体を分泌する安定 なＣＨＯ細胞株が樹立される。

ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を、プロティンＡ−セファロースカラム クロマトグラフィーを用いてで精製する。ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量 体を分泌するＣＨＯ細胞を、１０％無ＩｇＧ牛脂児血清アルファＭＥＭが入って いるローラーボトル中で高密度になるまで増殖させる。馴らし培地を回収し、遠 心により分離し、この及び次の緩衝液中に界面活性剤（すなわち７　ｗ　６　ｅ 　ｎ　）を含む、或いは含まないＰＢＳで１：１希釈する。その後、希釈した培 地を、６０ｍ１／時間の流速で、予めＰＢＳで平衡にしたプロティンＡ−セファ ロースツアーストフロラの５ｍｌカラムにかける。

広範囲な洗浄の後、結合した材料を、直ぐに溶出フラクションを中和するために 、１００ｍＭ　グリシン／ＨＣＩ（ｐＨ３，５）を用いてＬＭ　Ｔｒｉｓ、ＨＣ Ｉ　（ｐＨ８，０）のアリコートに直接溶出する。その後フラクションを還元及 び非還元状態での５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続く銀染色により分析し、プール する（図８）。

５、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体のエンベロープ糖タンパクｇｐ１２ ０に対する結合の例証ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を発現しているＣ ｏ５Ｍ５）ランスフエクタントを、１０％無ＩｇＧ牛脂児血清を含むＤＭＥＭ中 で７２時間インキュベートする。その後ラベルされていない培地を回収し、３５ Ｓ−メチオニンで放射能ラベルされたＨＩＶ−ｇｐ１２０を沈降させるために用 いる。３５Ｓ−メチオニンでラベルされたＨＩＶ−ｇｐ１２０を含むＣＤ４−Ｉ ｇＧ２・キメラヘテロ四量体含有培地をインキュベーションした後、複合体をプ ロティンＡ−セファロースに吸着させる。プロティンＡ−セファロース複合体を 遠心により回収し、沈降物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続くフルオログラフィー により分析する。また、ＣＨＯ細胞から精製されたＣＤ４−　Ｉ　ｇＧ２・キメ ラヘテロ四量体のアリコートも、同様の手順で３５８−放射能ラベルされたｇｐ １２０を沈降させるために用いる。

血漿半減期及び胎盤移入の例証を、すでに確立されている技術により遂行する。

簡単には、ウサギ又はサルに、精製されたＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロ四量 体を静脈内或いは筋肉内注射する。注射浸種々の時点において、血漿サンプルを 採取し、血清中に存在するＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の量をＥＬＩ ＺＡにより測定する。更に妊娠したサルにもＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四 量体をＩＶ又は１Ｍ注射し、新生サルのさい帯面及び血清中の濃度を測定する。

新生サルのさい帯面及び血清中に加えて、母親の血清中のＣＤ４−ＩｇＧ２−キ メラヘテロ四量体の量の測定及び比較は、これらの分子の胎盤を通した移入比率 を示す。

ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体のＦｃＲ結合及びマクロファージ感染 性の測定はすでに確立されている技術を用いて行う。これらの研究に対して、ヒ ト末梢血からの単球／マクロファージ群から精製されたＵ９３７細胞（ＦｃＲＩ 及びＦｃＲＩＩを発現しているヒト単球細胞株）及びヒト組み換えＦｃＲ５を本 質的に発現するヘラ細胞が用いられる。

更にＦｃＲＩ及びＦｃＲＩＩに特異的なモノクローナル抗体は商業的に入手可能 である。簡単には、放射能標識された単量体の或いは凝集したＣＤ４−ＩｇＧ２ ・キメラヘテロ四量体を上記細胞及び適当なコントロール細胞と共に４℃で種々 の時間でインキュベートする。各インキュベーションの終りに、細胞を溶解し、 細胞に結合している放射能活性を測定し、各細胞型に特異的に結合するＣＤ４− Ｉ　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体の量を立証する。コントロールとして、特異的 な抗体の結合のレベルを測定するために、放射能標識された正常の単量体の或い は凝集した正常ヒトＩｇＧ２を用いる。更に、放射能標識された成分と、標識さ れていない単量体のまたは凝集した正常ヒトＩ　ｇＧ２、或いはＦｃＲＩ及びＦ ｃＲＩ　Ｉに対するモノクローナル抗体との競合は、各細胞型に対するＣＤ４− ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の結合効率及び特異性を立証する。

ＣＤ４−　Ｉ　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体が単球／マクロファージのＨＩＶ感 染の増強を媒介するか否かを確認するために、ＨＩＶ−１を培地のみと共に、或 いはいくつかの希釈された単量体の或いは凝集したＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘ テロ四量体の何れかと共にインキュベートする。コントロールとして、正常な個 人及びＨＩＶ感染した個人からの血清を用いる（３１）。１時間、４℃のインキ ュベーションの後、前バラグラフに記載された細胞型にオンソニン化ウィルスを 添加する。感染浸種々の時点において、培地を回収し、ウィルス逆転写活性をア ッセイしてウィルス感染の程度を測定する。

コントロールとして、細胞の感染の間に、５ＣＤ４．０ＫＴ４ａ、又はＬｅｕ３ ａを含ませる。更にＣＤ４−ＩｇＧ２−キメラヘテロ四量体及び適当なコントロ ールの種々の希釈液を、結合が可能になるように４℃で細胞と共にまずインキュ ベートする。その後ＨＩＶを添加し、ウィルス逆転写活性により感染アッセイを 行う。

Ｂ、結果 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体をコードするＣＤ４〜ガンマ２・キメ ラ重鎖遺伝子は、ヒトＣＤ４ｃＤＮＡ（４）のリーダー・ＶＩＶ２セグメントを ヒトガンマ２・重鎮遺伝子（３０）のヒンジエキソンに結合させることにより生 成した（図ＩＡ）。得られた組換えＤＮＡ分子（ＣＤ４−１ｇＧ２−Ｒｆと称す る）は、シグナル配列およびＣＤ４タンパクの２つのアミノ末端免疫グロブリン 様ドメイン（成熟ＣＤ４の最初の１７９アミノ酸）、次いでガンマ２・重鎮タン パクのヒンジ（１５アミノ酸）、ＣＨ２（１１０アミノ酸）、およびＣＨ３（１ ０７アミノ酸）領域（図３）をコードする。

この組換えＤＮＡ分子は、ガンマ２・重鎮遺伝子内（ＨおよびＣＨ２ドメインの 間、およびＣＨ２およびＣＨ３の間）に存在する２つのイントロンをも有してい る。このＣＤ４−ガンマ２・キメラ遺伝子は、ガンマ２・重鎖のＣＨＩドメイン を特異的に欠いているＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体をコードするよ うに設計されている。軽鎖を伴わないＣＨ１ドメインの発現は、哺乳動物細胞か らの効率的な重鎮分泌を提供する（２５）。

ＣＤ４−ガンマ２＃キメラ重鎖ホモニ量体において、１本の鎖のヒンジ領域は、 ４か所の鏡開ジスルフィド結合の可能性を提供する４つのシスティン残基を有し ている（図ＩＢ）。

同様に、天然のヒトＩ　ｇＧ２は、ガンマ２・重鎮の間に４つの鏡開ジスルフィ ド結合を有している。

ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖は、哺乳動物発現ベクターｐ　ｃ　ＤＮＡ　ｌ内 にサブクローンされた。このベクターは以下のＤＮＡ要素を有している：　ＣＤ ４−ガンマ２Φキメラ３ｍｍ遺伝子の転写を推進するサイトメガロウィルス（Ｃ ＭＶ）　直接初期プロモーターおよびエンヘンサー；ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジ ョン配列；およびＣｏ５Ｍ５細胞においてこのプラスミドを高いコピー数で複製 することを可能にする複製のＳＶ４０オリジン。得られたＣＤ４−ガンマ２・重 鎖哺乳動物発現ベクター（ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡｌと称する）はＣｏ　 ｓ　Ｍ　５細胞に形質導入され、この細胞を形質導入の４８−７２時間後に３５ ８メチオニンで放射性標識した。放射性標識した培地を、プロティンＡ−セファ ロースビーズを用いる沈降、および５ＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで蛍光光度法により 分析した（図６）。還元条件下において約４７キロダルトンの相対分子質量（Ｍ ｒ）で移動するタンパク質が沈殿する。

沈殿した物質を非還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた場合には、Ｍｒ約９４ キロダルトンで移動するタンパク質が観察された。これは、ＣＤ４−ガンマ２・ キメラ重鎖が組み立てられ、ホモニ量体として分泌されていることを示している 。

加えて、これらの結果は、分泌されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体 がプロティンＡと結合することから、それらが損なわれていない免疫グロブリン Ｆｃドメインを有していることを示している。さらに、精製可溶ヒトＣＤ４に対 するウサギ・ポリクローナル抗血清を用いて、形質導入後４８−７２時間に培地 内に分泌されたタンパク質のウェスタンプロット分析による特徴付けを行なった 。沈殿により得られた結果と同様に、還元条件下で培地を５ＤＳ−ＰＡＧＥにか け、次いでニトロセルロースにウェスタン移動させた場合には、主要な免疫反応 性タンパク質はＭｒ約４７キロダルトンで移動する。非還元条件下においては、 主な免疫反応性タンパク質はＭｒ約９４キロダルトンで移動する。まとめると、 これらは、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖が予期された分子量のホモニ量体とし て産生され、分泌されていることを示している。

上記結果は、ガンマ２・重鎮の定常領域によってコードされるＣＤ４−ガンマ２ ・キメラ重鎖ホモニ量体のＦｃタンパク質がプロティンＡと結合し、したがって 機能的に活性であることを示している。ＣＤ４部分が果たして機能的に完全であ るかを決定するために、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を、それらの ＨＩＶ外部外部エンベロー少糖タンパクｐ１２０への結合能力について検定した （図７）。ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２−ｐｃＤＮＡｌ　・ＤＮＡを形質導入したＣｏ　 ｓＭ５細胞からの非標識培地を３５８メチオニン標識ｇｐ１２０と共にインキュ ベートした。プロティンＡ−セファロースビーズと共にインキュベートすること によりＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体／　ｇ　ｐ　１２０複合体を沈 殿させ、この沈殿物を還元条件下における５ＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで蛍光光度法 により分析した。これらの結果は、ＣＤ４−ガンマ２Φキメラ重鎖ホモニ量体が 、ＨＩ　Ｖ　ｇ　ｐ　１２０を効率よく認識し、高い親和力で結合することを示 している。上段に記述した結果とまとめると、これらの観察は、ＣＤ４−ガンマ ２・キメラ重鎖ホモニ量体がＣＤ４およびガンマ２・重鎖の機能的に活性な領域 を有していることを示している。

大量のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を安定に製造するために、ＣＤ ４−１　ｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１ベクターを（酵素ジヒドロフオレート・レダクタ ーゼ（ｄｈｆｒ）をコードする）プラスミドｐ４１０と共にｄｈｆｒ−キナーゼ ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に形質導入した。形質導入の約２週間後、ヌク レオシド非含有αＭＥＭおよび１０％透析仔ウシ血清（したがって、ｄｈｆｒ＋ ）中に増殖した個々のクローンを単離し、沈殿およびＥＬＩＳＡによりＣＤ４− ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体の共発現について分析した。

最大産生細胞系を同定し、濃度が段階的に増加するメトトレキセートを作用させ た。これは、新規に導入されたＤＮＡ配列の増加を選択する。ＣＤ４−ガンマ２ ・キメラ重鎖ホモニ量体１０μｇ／ｍＮを発現するＣＨＯ細胞系を、ローラーボ トル内での安定な組織だった産生に用いた。この細胞を、１０％ＩｇＧ非含有仔 ウシ血清を含むａＭＥＭ中において増殖させ、合流させた。次いで、これらの細 胞に毎日栄養を補給し、２日経た馴らし培地をＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホ モニ量体の精製に用いた。馴らし培地をリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で １：１に希釈し、プロティンＡ−セファロースψファースト・フロー（ファルマ シア）の５ｍ、Ｑカラムに流速６０ミリリットル／時で流した。その後、このカ ラムを１０カラム容積のＰＢＳで洗浄し、結合物質を１００ｍＭグリシン、ｐＨ ３，５で溶出させた。溶出した物質は５０ｕ、Ｑの１Ｍトリス・Ｈ（１！、ｐＨ ８，０に直接集め、溶離液（ｅｌｕａΩ１）を中和した。ＯＤ　（２８０）が０ ．１より大きい分画を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで銀染色またはウェスタン・プ ロット分析により分析し、ピーク分画をプールした。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ 重鎖ホモニ量体に相当するＭｒを有する単独のバンドがプロティンＡ−セファロ ースカラムから特異的に溶出された（図８）。溶出したタンパク質は、可溶ヒト ＣＤ４に対するポリクローナル抗血清に免疫反応性を有することがウェスタン・ プロット分析により確認された。加えて、精製タンパク質は、３５Ｓメチオニン 標識ｇｐ１２０と高い親和力で結合する能力を保持している。これらの結果は、 哺乳動物細胞におけるＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体の安定で高レベ ルの産生、および生物学的な機能を保持するＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ ニ量体の精製を示している。

図８に示される方法で部分的に精製されたＣＤ４−ガンマ２・重鎖ホモニ量体は 、ＣＤ４細胞に結合するＨＩＶの妨害（図９）および固定ＨＩＶ接種物の感染力 の中和（図１０）に有効である。この後の検定においては、５０％の培養物への ＨＩＶの感染を妨げるために、５ＣＤ４の他に約１０−２５μｇ／ｍｌのＣＤ４ −ガンマ２が必要であった。

イオン交換クロマトグラフィを用いることにより、ＣＤ４−ガンマ２・重鎖ホモ ニ量体のさらなる精製を達成した。プロティンＡ−セファロースカラムからのピ ーク分画を、５０ｍＭ　ＢＥＳ、ｐＨ７，０で予め平衡にした１０ｍ、１ＪＳ− セファロース・ファースト・フローカラムに流速１２０ｍ、ｌ？／時で流した。

試料を流した後、カラムを塩濃度が増加する５０ｍＭ　ＢＥＳ１ｐＨ７，０で広 範に洗浄した（材料および方法を参照）。ＣＤ４−ガンマ２・重鎖ホモニ量体は 、カラムから、５００ｍＭ　ＮａＣ１を含有する５０ｍＭ　ＢＥＳ。

ｐＨ７，０中に特異的に溶出した。イオン交換クロマトグラフィの後、我々は、 予期せぬことに、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を含有するピーク分 画がいまだ不純であることを見出した。したがって、Ｓ−セファ０−ス力ラムか らのピーク分画をプールし、濃縮して、予めＰＢＳで平衡にした１２０ｍＮセフ ァクリル（Ｓ！ｐｈａｃｒ７１　）　Ｓ−３００ＨＲカラムに流速毎時８ｍｌで 流した。精製ＣＤ４−ガンマ２・重鎖ホモニ量体のピーク分画を、非還元条件下 における５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により分析し、かつ精製した分画をプー ルして非還元条件下（図１１、レーン１）、もし、くは還元条件下（図１１、レ ーン２）において５ＤＳ−ＰＡＧＥ、続く銀染色により分析した。精製ＣＤ４− ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた場合 には、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体のグリコジル化の違いによるも のと思われる二重バンドが観察された（データは示さす）。

ＣＤ４−　Ｉ　ｇＧ２・キメラ重鎖をコードするＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣキメラ重 鎖遺伝子は、ヒトＣＤ４ｃＤＮＡのリーダー・ｖ１ｖ２セグメントをヒトＩ　ｇ Ｇ２重鎖遺伝子のＣＨＩエキソンに結合させることにより生成した（図２Ａ）。

加えて、ＣＤ４−カッパ軽鎖をコードするＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子が 、ヒトＣＤ４ｃＤＮＡのリーダー・ｖｌ・Ｖ２セグメントをカッパ軽鎖遺伝子の 定常ドメインに結合させることにより生成した（図２Ａ）。これらのＣＤ４−１ 　ｇＧ２Φキメラ重鎖遺伝子およびＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラ軽鎖遺伝子は、 ＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・重鎖がカッパ軽鎖に効率よく結合するＣＨＩを含有するＣ Ｄ４−１　ｇＧ２・キメラヘテロ四量体をコードするように設計されている。

ＣＤ４−工ｇＧ２１１キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子の両 者は、哺乳動物発現ベクターｐＲｃＣＭＶもしくはｐｐｐ　Ｉ−２にサブクロー ンされる。いずれのベクターも、サイトメガロウィルス直接初期プロモーターお よびキメラ遺伝子の転写を推進するエンヘンサーを有する。ベクターｐＲｃＣＭ Ｖにおいては、Ｒ３Ｖプロモーターおよびエンヘンサーを有する第２の転写カセ ットが耐ネオマイシン遺伝子の転写の指令に用いられる。ｐｐｐ　Ｉ−２におい ては、β−グロビンプロモーターを含有する第２の転写カセットがｄｈｆｒ遺伝 子の転写を指令する（前記参照）。大量のＣＤ４−１ｇＧ２・キメラヘテロテト ロマーを安定に製造するために、ＣＤ４−　Ｉ　ｇＧ２・キメラ重鎖発現ベクタ ーおよびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖発現ベクターを同時に形質導入した（典型 的には、ｐ　Ｒｃ　ＣＭＶ内でクローンしたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖遺伝 子およびｐｐｐｌ−２内でクローンしたＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子を１ ：１の割合で用いた）。形質導入の約２週間後、１ｍｇ／ｍＤ　Ｇ４１８および １０％透析仔ウシ血清を含有するヌクレオシド非含有ａＭＥＭ中で増殖した個々 のクローンを単離し、免疫沈降およびＥＬ　Ｉ　ＳＡによりＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２ 争キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖両者の共発現を解析した。図１ ２は、選択され、ＣＤ４−１　ｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメ ラ軽鎖両者の発現について解析された１つのクローンを示す。ＣＨＯ細胞系もし くは形質導入されていないＣＨＯ親細胞系を３５８メチオニンおよび３５Ｓシス テインで１６時間放射性標識した。放射性標識した培地を、プロティンＡ−セフ ァロースビーズを用いる沈殿および非還元条件下における５ＤＳ−ＰＡＧＥ、次 いで蛍光光度法により分析した（図１２Ａ）。非還元条件下において相対分子質 量約１４０キロダルトンおよび２１０キロダルトンで移動する２種のタンパク質 が沈殿する。沈殿した物質を非還元条件下における５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた場 合には、相対分子質量６９キロダルトンおよび３５キロダルトンで移動する２種 のタンパク質が観察された。これは、それぞれＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラ重鎖 およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖の予期された相対分子質量に一致する（デー タは示された）。非還元条件下における５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で１４０キロダルト ンで移動するタンパク質がＣＤ４−Ｉ　ｇＧ２・キメラ重鎖のみを有するのに対 して、非還元条件下における５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で２１０キロダルトンで移動す るタンパク質は共有結合で結合するＣＤ４−１ｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４ −カッパ・キメラ軽鎖の両者を含有するというさらなる特徴付けが示されている （図１２Ｂ）。これらのデータは、共有結合で結合してＨ２Ｌ２　（Ｈ＝重鎮、 Ｌ＝軽鎖）構造を有する分子を形成する、２つのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖 および２つのＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖を有する２１０キロダルトン・タンノ ＜り質の予期された分子量に一致する。さらに、非還元条件下における５ＤＳ− ＰＡＧＥ上に見出される１４０キロダルトン・タンパク質は、構造Ｈ２を有する ＣＤ４−１ｇＧ２・キメラホモニ量体の予期された分子量に一致する。まとめる と、これらの結果は、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キ メラ軽鎖の両者を発現するＣＨＯ細胞系が、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四 量体を効率よく組み立てかつ分泌することが可能であることを示している。

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ＳｃＬ、８１，６４１５１−６８５５゜２０、　Ｃａｐｏｎ、　Ｄ、Ｊ＋、　ａ ｎｄ　Ｇｒ＠ｇ口ｒｙ、　Ｔ、Ｊ、、　（１９Ｂ９）　ＰＣＴＷ０８９１０２９ ２２゜ ２１−　’　Ｃａｐｏｎ、　Ｄ、Ｊ、、　ａｔ、　ａｌ、（１９８９）　Ｎａｔ ｕｒｅ　］）７．　５２５−５３１゜２２、　Ｂｙｒｎ、　ＲｏＡ、、　ａｔ、 　ａｌ、（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ　３４４．６６７−６７ｏ。

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コ１．　コ３５゜ ココ、　Ｋａｂａｔ、Ｅ、、ａｔ　ａｌ、（１９＋１７１　ｉｎ：　５ｅｑｕｅ ｎｃ＠ｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔａｉｎｓｏｆ　工ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　工ｎｔ ＠ｒａｓｔ、４ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ。

コ４．　ｔＪｎｄ＠ｒｄｏｖｎ、ＢＪ、、ｉｎ：ＦｃＲａｃａｐｔｏｒｓａｎｄ ｔｈｅＡｅｔｉｏｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、工５Ｂ）Ｊ　ｌ−５５５８１− ０１６−０，ｐｐ、　７４−９３゜コｓ、　Ｂｕｒｔｏｎ、Ｄ、、　（１９１１ ５）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　工！Ｉ１ｍｕｎｏｌｏｇｙ　２２．　１６１−１６ 、　０ｉ、Ｖ、丁＋ｙ　ａｎｄ　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ、Ｌ、、（１９８６）　 Ｂｉｏｔａｅｈｎｏｌｏｇｙ４、　２１４−２２コニ コア、　０にａｙａｍａ、Ｈ，、Ｍｏ１．　Ｃａ１．　Ｂｉｏｌ、、コニ２８０ 　（１９８３）。

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４１、　Ｇｈｏｔｉｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒａｓ、４８二２６１０ 　（１９８８）。

４２、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、ａｔ、ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ、Ｖｏｌ、　ｌ−３゜（１９９０）。

４コニ　Ｋａｎｎ＠ｄｙ、Ｍ、Ｓ、、ａｔ　ａｌ−（１９９１）　ＡよりＳ　Ｒ ａｓ、ａｎｄ　ＨｕｍａｎＲａｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　７．　９７５−９８１４ ４、　ＭｅＤｏｕｇａｌ、Ｊ、Ｓ、、ａｔ　ａｍ、（１９８６）　、ｒ、工ｍｍ ｕｎｏｌ　１：１７，２９３７−２９４４゜ ４５、　ＭｃＤｏｕｇａｌ、Ｊ−５，、ａｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｊ、工！ Ｉ１ｍｕｎ口Ｉ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　７６゜１７１−１８３゜ Ｆｉｇｕｒｅ　１Ａ ヒト１９Ｇ２ゲノム Ｆｉｇｕｒｅ　１Ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　２Ａ Ｆｉｇｕｒｅ　２Ｂ 蚤　２墓讐口旨　０ゴ　−？　？　×ヨ← ＣＪ　Ｕ　Ｕ 〇 一←　ロＣ５喰Ｑ　〉←　＝ぺ　−Ｕ　ｏ。

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ラヘテロ四量体の軽鎖をコードする発現ベクターを提供す／

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１（ＡＴＣＣ第４０９５２号）と命名された 、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードする発現ベクター。
2. ２．請求の範囲第１項に記載の発現ベクターによってコードされる、ＣＤ４−ガ ンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体。
3. ３．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の製造方法であって、 ａ）哺乳動物細胞に、請求の範囲第１項に記載の発現ベクターで形質移入するこ とと； ｂ）上記で得られた形質転換哺乳動物細胞を、キメラ重鎖ホモ二量体が産生され る条件の下で培養することと；ｃ）こうして産生された前記キメラ重鎖ホモ二量 体を回収することとを具備する方法。
4. ４．前記哺乳動物細胞がＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞またはミエローマ細胞である請 求の範囲第３項に記載の方法。
5. ５．ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ感染を阻止する方法であって、ＣＤ４＋細胞を、該細 胞の感染を阻止するのに有効な量の、請求の範囲第２項に記載のＣＤ４−ガンマ ２・キメラ重鎖ホモ二量体で処理することを具備する方法。
6. ６．対象をＨＩＶによる感染から防ぐ方法であって、対象に対して、該対象をＨ ＩＶによる感染から防止するために有効な量の、請求の範囲第２項に記載のＣＤ ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を投与することを具備する方法。
7. ７．ＨＩＶ感染の広がりを阻止するように、ＨＩＶに感染した対象を治療する方 法であって、該対象に対して、ＨＩＶ感染の広がりを阻止するために有効な量の 、請求の範囲第２項に記載のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を投与す ることを具備する方法。
8. ８．ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ感染を阻止するのに有効な量の、請求の範囲第２項に 記載のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体と、薬剤的に許容可能な担体と を含有する薬剤組成物。
9. ９．請求の範囲第２項に記載のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体と、こ れに結合した毒素とを含有する組成物。
10. １０．請求の範囲第９項に記載の組成物であって、前記毒素がリシンの脱グリコ シル化されたＡ鎖またはジフテリア毒素である組成物。
11. １１．請求の範囲第２項に記載のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体と、 これに結合された検出マーカーとを含有する診断試薬。
12. １２．前記検出マーカーが放射性アイソトープ、発色団または蛍光基である請求 の範囲第１１項に記載の診断試薬。
13. １３．ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ第７５１９３号）と命名 された、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の重鎖をコードする発現ベクタ ー。
14. １４．ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ第７５１９４号）と命名された 、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の軽鎖をコードする発現ベクター。
15. １５．その重鎖が請求の範囲第１３項に記載の発現ベクターによってコードされ る、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体。
16. １６．その軽鎖が請求の範囲第１４項に記載の発現ベクターによってコードされ る、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体。
17. １７．その重鎖および軽鎖が、請求の範囲第１３項および第１４項に記載の発現 ベクターによって夫々コードされる、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体。
18. １８．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の製造方法であって、 ａ）請求の範囲第１３項に記載の発現ベクターと、軽鎖をコードする発現ベクタ ーとを、哺乳動物細胞に同時形質移入することと； ｂ）こうして同時形質移入された哺乳動物細胞を、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘ テロ四量体が産生されるような条件下で培養することと； ｃ）こうして産生されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を回収すること とを具備した方法。
19. １９．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の製造方法であって、 ａ）請求の範囲第１４項に記載の発現ベクターと、ＩｇＧ２重鎖をコードする発 現ベクターとを、哺乳動物細胞に同時形質移入することと； ｂ）こうして同時形質移入された哺乳動物細胞を、前記キメラヘテロ四量体が産 生されるような条件下で培養することと； ｃ）こうして産生された前記キメラヘテロ四量体を回収することとを具備した方 法。
20. ２０．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の製造方法であって、 ａ）請求の範囲第１３項および第１４項に記載の発現ベクターを、哺乳動物細胞 に同時形質移入することと；ｂ）こうして同時形質移入された哺乳動物細胞を、 前記キメラヘテロ四量体が産生されるような条件下で培養することと； ｃ）こうして産生された前記キメラヘテロ四量体を回収することとを具備した方 法。
21. ２１．請求の範囲第１８項、第１９項または第２０項に記載の方法であって、前 記哺乳動物細胞がＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞またはミエローマ細胞である方法。
22. ２２．ＣＤ＋細胞のＨＩＶ感染を阻止する方法であって、ＣＤ４＋細胞を、該細 胞の感染を阻止するのに有効な量の請求の範囲第１５項、第１６項または第１７ 項に記載のキメラヘテロ四量体で処理することを具備する方法。
23. ２３．対象がＨＩＶで感染されるのを防止する方法であって、対象に対して、対 象がＨＩＶで感染されるのを防止するのに有効な量の請求の範囲第１５項、第１ ６項または第１７項に記載のＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を投与する ことを具備する方法。
24. ２４．ＨＩＶで感染された対象を、ＨＩＶ感染の広がりを阻止するように治療す る方法であって、請求の範囲第１５項、第１６項または第１７項に記載のＣＤ４ −ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を、ＨＩＶ感染の広がりを阻止するのに有効な 量で、対象に対して投与することを具備する方法。
25. ２５．ＣＤ４＋細胞のＨＩＶ感染を阻止するのに有効な量の、請求の範囲第１５ 項、第１６項または第１７項に記載のＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体と 、薬剤的に許容され得る担体とを含有する薬剤組成物。
26. ２６．請求の範囲第１５項、第１６項または第１７項に記載のＣＤ４−ＩｇＧ２ ・キメラヘテロ四量体と、これに結合された毒素とを含有する組成物。
27. ２７．請求の範囲第２６項に記載の組成物であって、前記毒素がリシンの脱グリ コシル化されたＡ鎖、シュードモナスエキソトキシンＡのドメインＩＩもしくは ＩＩＩ、またはジフテリア毒素である組成物。
28. ２８．請求の範囲第１５項、第１６項または第１７項に記載のＣＤ４−ＩｇＧ２ ・キメラヘテロ四量体と、これに結合された検出マーカーとを含有する診断試薬 。
29. ２９．請求の範囲第２８項の診断試薬であって、前記検出マーカーが放射性アイ ソトープ、発色団または蛍光基である診断試薬。