RU2483081C2 - Полипептидный комплекс, содержащий непептидильный полимер, обладающий тремя функциональными концами - Google Patents

Полипептидный комплекс, содержащий непептидильный полимер, обладающий тремя функциональными концами Download PDF

Info

Publication number
RU2483081C2
RU2483081C2 RU2011102446/10A RU2011102446A RU2483081C2 RU 2483081 C2 RU2483081 C2 RU 2483081C2 RU 2011102446/10 A RU2011102446/10 A RU 2011102446/10A RU 2011102446 A RU2011102446 A RU 2011102446A RU 2483081 C2 RU2483081 C2 RU 2483081C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
immunoglobulin
domain
protein complex
protein
physiologically active
Prior art date
Application number
RU2011102446/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2011102446A (ru
Inventor
Дае Хае СОНГ
Дзае Хи ШИН
Ми Дзи ЛИ
Сунг Хи ХОНГ
Се Чанг КВОН
Гван Сун ЛИ
Original Assignee
Ханми Сайенс Ко.,Лтд.,Kr
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41570742&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2483081(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ханми Сайенс Ко.,Лтд.,Kr filed Critical Ханми Сайенс Ко.,Лтд.,Kr
Publication of RU2011102446A publication Critical patent/RU2011102446A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2483081C2 publication Critical patent/RU2483081C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии. Представлен белковый комплекс с улучшенными активностью длительного действия и биостабильностью, содержащий физиологически активный полипептид, Fc-домен иммуноглобулина и непептидильный полимер, обладающий тремя функциональными концами. Раскрыт способ получения белкового комплекса, состоящего из физиологически активного полипептида, Fc-домена иммуноглобулина и непептидильного полимера, обладающего тремя функциональными концами. Представлена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество указанного белкового комплекса, обладающая улучшенной устойчивостью in-vivo физиологически активного полипептида. Изобретение позволяет получить белковый комплекс с улучшенными активностью длительного действия и биостабильностью. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 9 пр.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к белковому комплексу физиологически активного полипептида с димерным белком, обеспечивающему длительно действующую активность. Более конкретно, настоящее изобретение относится к белковому комплексу, в котором физиологически активный полипептид и димерный белок связаны с непептидильным полимером, обладающим тремя функциональными концами (3 плечами), посредством соответствующей ковалентной связи, и к способу его получения.
Уровень техники
Из-за низкой стабильности полипептиды, как правило, подвержены денатурации и деградации протеазами и теряют свою активность. С другой стороны, пептиды являются относительно небольшими по размеру, так что они легко выделяются через почки.
Чтобы поддерживать их желательный уровень концентраций в крови и титры, таким образом, белковые лекарственные средства, содержащие полипептиды или пептиды в качестве активных ингредиентов, необходимо вводить часто. Однако, поскольку белковые лекарственные средства существуют, по большей части, в форме, подходящей для инъекций, для поддержания соответствующих уровней в крови физиологически активных полипептидов или пептидов необходимы частые инъекции, вызывающие значительную боль у пациента. Чтобы преодолеть эти проблемы, предприняты попытки обеспечения максимальных лечебных эффектов посредством увеличения стабильности белковых лекарственных средств в крови и посредством поддержания высоких уровней лекарственного средства в крови в течение длительного периода времени. Необходимо, чтобы эти средства для долговечности белковых лекарственных средств не только увеличивали стабильность белковых лекарственных средств и поддерживали достаточные титры самих лекарственных средств, но также не вызывали иммунных ответов у пациентов.
Общепринятым образом высокорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль (PEG), химически прививают на поверхность белков с целью стабилизации белков, предотвращая контактирование протеаз с белками и супрессируя потерю пептидов малого размера в почках. Привитый к специфическому участку или к множеству различных участков белков PEG является применимым для стабилизации и предотвращения гидролиза белков без создания заслуживающих внимания побочных эффектов. Кроме того, привитый PEG увеличивает молекулярную массу белков, таким образом ограничивая потерю белков в почках и поддерживая физиологическую активность белков.
Например, в WO 2006/076471 описано применение натрийуретического пептида B-типа (BNP) в лечении застойной сердечной недостаточности. BNP связывается с рецептором A натрийуретического пептида (NPR-A) для запуска синтеза cGMP, таким образом уменьшая артериальное кровяное давление. Описано, что при пегилировании BNP продлевается его физиологическая активность на длительный период времени. В патенте США № 6924264 описано также увеличение периода активности эксендина-4 посредством прививки PEG на остаток лизина.
Чтобы увеличить его физиологическую активность, лекарственный полипептид присоединяют к обоим концам PEG для формирования бис-конъюгата (Патент США № 5738846). С другой стороны, два различных лекарственных белка присоединяют к соответствующим концам PEG для формирования белкового комплекса, обладающего двумя различными видами физиологической активности (WO 92/16221). Однако не обнаружено значимости этих белковых лекарственных средств в отношении поддержания активности.
Опубликовано также, что увеличена стабильность слитого белка, в котором G-CSF и альбумин человека присоединены к одному PEG (Kinstler et al. Pharmaceutical Research 12(12): 1883-1888, 1995). Однако обнаружено, что у модифицированного лекарственного средства со структурой G-CSF-PEG-альбумин время удержания увеличено только приблизительно в четыре раза по сравнению с природными лекарственными средствами отдельно, и время полужизни в сыворотке только слабо увеличено. Таким образом, модифицированное лекарственное средство не применяют на практике в качестве долговечного средства.
При соединении с PEG пептиды становятся настолько стабильными, чтобы продлить свою персистенцию in vivo. Однако при придании высокой молекулярной массы PEG делает титр физиологически активного пептида значительно низким и уменьшает реакционную способность по отношению к пептидам, приводя к низкому выходу.
Альтернативно, для увеличения стабильности физиологически активных белков in vivo прибегают к генной рекомбинации. Ген, кодирующий белок, высокостабильный в крови, связывают с геном, кодирующим интересующий физиологически активный белок, с последующей трансформацией клеток животных, которые затем культивируют для продукции слитого белка.
Например, слитый белок, в котором альбумин или его фрагмент, известный как наиболее эффективный для стабилизации белков к настоящему времени, слит с физиологически активным интересующим белком (WO 93/15199 и 93/15200, публикация EP № 413622). А также у слитого белка из интерферона альфа и альбумина, продуцируемого в Human Genome Sciences (торговое наименование: Альбуферон) увеличено время полужизни в сыворотке от 5 часов до 93 часов, но он страдает критическим недостатком уменьшения биологической активности до менее чем 5% активности наивного интерферона (Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303(2): 540-548, 2002).
Что касается пептидов, их модификации упомянуты в WO 02/46227, где описано, что GLP-1, эксендин-4 и их аналоги сливают с человеческим сывороточным альбумином или фрагментами иммуноглобулина (Fc) с использованием способов генетической рекомбинации, и в Патенте США № 6756480, где описаны слитые белки из паратиреоидного гормона (PTH) или его аналогов и фрагментов иммуноглобулина (Fc). Этими способами можно преодолевать низкий выход пегилирования и неспецифичность, но они обладают теми недостатками, что время полужизни в сыворотке не является значительно увеличенным, и в некоторых случаях приводят к низким титрам. Различные пептидные линкеры используют для максимального увеличения времени полужизни в сыворотке, но они обладают высокой способностью вызывать иммунные ответы. При введении пептид, обладающий дисульфидной связью, такой как BNP, с высокой вероятностью индуцирует неправильное сворачивание и таким образом его трудно применять.
Известно также, что другие различные слитые белки получают присоединением Fc-домена иммуноглобулина к интерферону (Публикация патента Кореи № 2003-9464), рецептору интерлейкина-4, рецептору интерлейкина-7 или рецептору эритропоэтина (Патент Кореи № 249572) посредством генетической рекомбинации. В Патентной публикации PCT № WO 01/03737 описан слитый белок, в котором цитокин или фактор роста присоединен посредством олигопептидного линкера к Fc-фрагменту иммуноглобулина. В патенте США № 5116964 описан LHR (гликопротеин поверхности клеток лимфоцитов) или белок CD4, который сливают с N- или C-концом Fc-домена иммуноглобулина с использованием способа генетической рекомбинации. А также в Патенте США № 5349053 описан слитый белок, в котором IL-2 присоединен к Fc-домену иммуноглобулина. Описано множество других слитых с Fc белков, сконструированных с использованием способов генетической рекомбинации, примеры которых включают в себя слитый белок из Fc-домена иммуноглобулина с интерфероном-бета или его производное (Патентная публикация PCT № WO 00/23472), Fc-домена иммуноглобулина с рецептором IL-5 (Патент США № 5712121), Fc-домена иммуноглобулина G4 с интерфероном альфа (Патент США № 5723125) и Fc-домена иммуноглобулина G2 с белком CD4 (Патент США № 6451313). С другой стороны, в Патенте США № 5605690 объяснено применение модифицированного Fc-домена иммуноглобулина для продукции слитых белков. Например, Fc иммуноглобулина с аминокислотными остатками, модифицированными, в частности, до участков связывания комплемента или до участков связывания рецептора, используют для получения слитого белка TNFR-Fc IgG1 с использованием способа генетической рекомбинации. Другие слитые белки с модифицированным Fc-доменом иммуноглобулина, полученные с использованием способов генетической рекомбинации, описаны в Патентах США № 6277375, 6410008 и 6444792.
Иммуноглобулины функционируют как антитела, вызывая антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимую цитотоксичность (CDC), и опубликовано, что цепи сахара, присутствующие в Fc-домене иммуноглобулина, играют важную роль в ADCC и CDC (Burton D., Molec. Immun. 22, 161-206, 1985). Известно, что иммуноглобулины сами по себе, свободные от цепей сахаров, обладают сходством по времени полужизни в сыворотке с иммуноглобулинами, обладающими цепями сахаров, но обладают 10-1000-кратным уменьшением силы связывания комплемента и силы связывания рецептора (Waldmann H., Eur. J. Immunol. 23, 403-411, 1993; Morrison S., J. Immunol. 143, 2595-2601, 1989).
В Патенте США № 6660843 описано слияние Fc-домена с интересующим пептидом посредством линкера и продукция слитого белка в E. coli с использованием способа генной рекомбинации. В случае использования для получения комплексов линкер позволяет отбор участков конъюгации между двумя интересующими белками и их ориентацию и позволяет получение комплексов в форме гомогенных или гетерогенных мономеров, димеров или мультимеров. Кроме того, при использовании этого способа можно получать комплексы с более низкой стоимостью, чем при использовании клеток млекопитающих. Кроме того, можно получать комплексы в свободных от цепей сахаров формах. Однако из-за одновременной продукции интересующего белка и Fc-домена иммуноглобулина в E. coli этот способ сложно применять к белку-мишени, когда природная форма белка-мишени обладает цепью сахаров. Принимая преимущества телец включения, этот способ сильно подвержен индукции неправильного сворачивания. В слитых с Fc белках, полученных с использованием способов генетической рекомбинации, слияние возможно только в конкретных участках, то есть на N- или C-конце Fc-домена иммуноглобулина. Слитые с Fc белки экспрессируются только в формах гомогенных димеров, но не в мономерных формах. Кроме того, слияние возможно только между гликозилированными белками или между агликозилированными белками, но невозможно между гликозилированными белками и агликозилированными белками. Если оно присутствует, аминокислотная последовательность, вновь сформированная в результате слияния, может индуцировать иммунный ответ. Более того, линкер может являться чувствительным к ферментативной деградации.
При разработке слитых белков с использованием Fc-доменов иммуноглобулинов нигде в предшествующих публикациях не предпринимали попыток получить комплексы белков-мишеней с природным Fc человека посредством сшивающего агента. Fc-домены иммуноглобулинов можно получать в клетках млекопитающих или E. coli с использованием способов генетической рекомбинации, но нигде в предшествующих публикациях не предпринимали попыток получить только природные Fc-домены иммуноглобулинов, свободные от белков-мишеней, с высоким выходом и переводить их в долговечные формы. Кроме того, не предпринимали попыток получить комплексы рекомбинантного Fc иммуноглобулина с белками-мишенями посредством сшивающих агентов.
Как таковые, множество различных способов осуществляли для конъюгации физиологически активных полипептидов с полимерами. В общепринятых способах можно улучшать стабильность полипептидов, но со значительным уменьшением активности или можно улучшать активность независимо от стабильности. Таким образом, все еще существует необходимость способа для увеличения стабильности белковых лекарственных средств с минимальным уменьшением индуцированной модификацией активности.
В этом контексте авторы настоящего изобретения разработали белковый комплекс с высокой активностью, время полужизни в сыворотке которого улучшено посредством присоединения иммуноглобулина и физиологически активного полипептида соответственно к противоположным концам непептидильного линкера, как описано в Патентах Кореи № 10-0725315 и 10-0775343, полное содержание которых приведено в качестве ссылки.
Белковый комплекс, в котором иммуноглобулин и физиологически активный полипептид соответственно присоединены к противоположным концам непептидильного линкера, общепринятым образом получают присоединением непептидильного полимера предпочтительно к физиологически активному полипептиду и затем к Fc-домену иммуноглобулина. Однако этот общепринятый способ приводит к множеству нежелательных загрязнений, кроме того, приводит к потере большого количества физиологически активного полипептида. То есть общепринятый способ является экономически невыгодным при его промышленном применении, и полученный комплекс необходимо очищать до некоторой степени сложным способом. В случае когда физиологически активный полипептид присутствует в форме димера, он образует форму мостика с непептидильным полимером на обоих концах, так что он не может образовывать комплекс с Fc иммуноглобулина или может образовывать комплекс, но с очень низким выходом. С другой стороны, когда Fc-домен иммуноглобулина сначала присоединяют к непептидильному полимеру, также возникают сходные проблемы. Поскольку Fc иммуноглобулина представляет собой гомодимер с двумя N-концами в близком соседстве друг с другом, соответствующие связи формируются между двумя N-концами Fc иммуноглобулина и противоположными концами непептидильного полимера с образованием формы мостика, так что не остается функциональных концов для реакции с физиологически активным полипептидом. Соответственно, выход продукции значительно уменьшается.
Описание изобретения
Техническая проблема
Приведшие к настоящему изобретению интенсивные и тщательные исследования белковых комплексов, проводимые авторами настоящего изобретения, имеющие целью преодоление проблем, встречающихся в предшествующей области техники, привели к обнаружению того, что применение непептидильного полимера с 3 плечами в качестве линкера для получения белкового комплекса, состоящего из димерного белка и физиологически активного полипептида, предотвращает потери физиологически активного полипептида со значительным увеличением выхода продукции, позволяет очистку комплекса простым способом и придает структурную стабильность белковому комплексу с удлинением времени полужизни в сыворотке при сохранении в то же самое время его биологической активности.
Решение проблемы
Таким образом, целью настоящего изобретения является предоставление белкового комплекса, в котором физиологически активный полипептид, непептидильный полимер с 3 плечами и димерный белок связаны ковалентной связью, и способа его получения.
Другой целью настоящего изобретения является предоставление средства для продления долговечности белкового лекарственного средства, содержащего белковый комплекс, продлевающего время полужизни в сыворотке физиологически активного полипептида при сохранении его биологической активности.
Полезные эффекты изобретения
Обладая структурой, в которой физиологически активный полипептид и димерный белок присоединены к непептидильному полимеру с 3 плечами посредством ковалентных связей, белковый комплекс по настоящему изобретению может поддерживать высокую концентрацию активного полипептида в крови в течение длительного периода времени, оказывая стабильные лечебные эффекты.
Кроме того, способ получения белкового комплекса в соответствии с настоящим изобретением может значительно уменьшать количество физиологически активного полипептида, необходимого по общепринятому способу с использованием непептидильного полимера с 2 плечами и по сравнению с общепринятым способом пользуется преимуществом включения более простых способов очистки и значительного увеличения выхода продукции. В частности, персистирующие белковые комплексы с димерными, физиологически активными полипептидами предпочтительно получали с использованием способа по настоящему изобретению.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показано репрезентативное изображение белкового комплекса с использованием непептидильного полимера, обладающего тремя функциональными концами (3 плечами).
На фиг. 2 показана эффективность in vivo комплекса Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотида(N) на графиках (HM11760B: комплекс Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотида(N), Сандостатин-LAR: состав с замедленным высвобождением октреотида).
На фиг. 3 показана эффективность in vivo комплекса Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-FSH(N) (HM12160A: комплекс Fc иммуноглобулина-PEG с 2 плечами-FSH(N), HM12160B: комплекс Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-FSH(N)).
Наилучший способ осуществления изобретения
В соответствии с его аспектами настоящее изобретение относится к белковому комплексу, в котором физиологически активный полипептид и димерный белок ковалентно присоединены к непептидильному полимеру с 3 плечами.
Как применяют в настоящем документе, термин «белковый комплекс» или «комплекс» предназначен для обозначения структуры, состоящей из по меньшей мере одного физиологически активного полипептида, по меньшей мере одного непептидильного полимера с 3 плечами и по меньшей мере одного димерного белка, с соединением между ними посредством ковалентных связей. Чтобы отличать от «комплекса», термин «конъюгат» применяют в настоящем документе для обозначения структуры, в которой только пары физиологически активного полипептида, непептидильного полимера и димерного белка соединены между собой посредством ковалентной связи.
Белковый комплекс по настоящему изобретению представляет собой белковое лекарственное средство, модифицированное для увеличения его персистенции in vivo и минимального уменьшения его биологической активности. Настоящее изобретение относится к применению непептидильного полимера с 3 плечами для соединения посредством него физиологически активного полипептида и димерного белка для образования белкового комплекса, таким образом позволяя применение способа получения, посредством которого можно предотвращать потери физиологически активного полипептида, и белковый комплекс может быть настолько структурно стабильным, чтобы его можно было легко очищать.
Как применяют в настоящем документе, термин «димерный белок» обозначает белок с двумя N-концами. Предпочтительным является Fc-домен иммуноглобулина, который можно использовать в качестве носителя. Физиологически активные гомодимеры или гетеродимеры также включены в объем димерного белка.
Fc-домен иммуноглобулина является достаточно стабильным для использования в качестве носителя для лекарственного средства, поскольку он является биологически разлагаемым полипептидом, подвергающимся метаболизму in vivo. Кроме того, благодаря относительно небольшой молекулярной массе Fc-домен иммуноглобулина обладает преимуществами по сравнению с полными молекулами иммуноглобулина в отношении выделения, очистки и выхода комплекса. Кроме того, поскольку он является свободным от Fab, который очень отличается по аминокислотной последовательности между антителами, Fc сильно способствует гомогенности комплекса и, как ожидают, снижает индукцию антигенности.
Термин «Fc-домен иммуноглобулина», как применяют в настоящем документе, предназначен для обозначения константного домена 2 тяжелой цепи (CH2) и константного домена 3 тяжелой цепи (CH3), которые свободны от вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, константного домена 1 тяжелой цепи (CH1) и константного домена 1 легкой цепи (CL1) и могут содержать шарнирную область. Fc-домен иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой удлиненный Fc домен, дополнительно содержащий частичный или полный константный домен 1 тяжелой цепи (CH1) и/или константный домен 1 легкой цепи (CL1) и свободный от вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, если он обеспечивает эффект, по существу такой же или более сильный по сравнению с эффектом природной формы. Альтернативно, Fc домен может представлять собой укороченную форму CH2 и/или CH3 с отсутствием значительной части соответствующей аминокислотной последовательности. Для обобщения, Fc-домен иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой 1) CH1 домен, CH2 домен, CH3 домен и CH4 домен, 2) CH1 домен и CH2 домен, 3) CH1 домен и CH3 домен, 4) CH2 домен и CH3 домен, 5) комбинацию одного или нескольких доменов и шарнирной области иммуноглобулина (или части шарнира) или 6) димер, состоящий из каждого из константного домена легкой цепи и константного домена легкой цепи.
Кроме того, термин «Fc-домен иммуноглобулина», как применяют в настоящем документе, предназначен, чтобы включать не только природные аминокислотные последовательности, но также их мутанты. Мутант аминокислотной последовательности означает аминокислотную последовательность, отличающуюся от природной последовательности делецией, вставкой, неконсервативной или консервативной заменой одного или нескольких аминокислотных остатков или их сочетаниями. Например, аминокислотные остатки в положениях 214-238, 297-299, 318-322 или 327-331 Fc IgG, известные как играющие важную роль в связывании антитела, можно модифицировать так, чтобы использовать в качестве подходящих участков связывания. Кроме того, возможны различные мутанты, например, с отсутствием остатка, формирующего дисульфидную связь, или нескольких N-концевых аминокислот природного Fc, или с дополнительным остатком метионина на N-конце природного Fc. Кроме того, эффекторные функции можно прекращать удалением связывающего комплемент мотива, например связывающего C1q мотива, или мотива ADCC (антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичности). Можно сделать ссылку на WO 97/34631 и WO 96/32478 относительно получения мутантов аминокислотной последовательности Fc-доменов иммуноглобулинов.
Замены аминокислот, не изменяющие активность природных белков или пептидов, в целом известны в данной области (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее типичные замены происходят между Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly. При необходимости, аминокислоты можно подвергать модификации, такой как фосфорилирование, сульфатирование, акрилирование, гликозилирование, метилирование, фарнезилирование, ацетилирование, амидирование и т.д.
Вышеописанные мутанты Fc, предпочтительно, представляют собой функциональные эквиваленты их природных форм, таким образом являются сходными по биологической активности с улучшением стабильности структуры по отношению к нагреванию и pH.
Fc-домен может представлять собой природную форму, выделенную из человека и других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, или может являться рекомбинантным или производным из них, полученным из трансформированных клеток животных или микроорганизмов. В первом случае тотальный иммуноглобулин выделяют из людей или животных с последующей обработкой протеазой. При обработке папаином тотальный иммуноглобулин разделяют на Fab и Fc. Пепсин расщепляет тотальный иммуноглобулин на pF'c и F(ab)2. От этих фрагментов Fc или pF'c можно отделить с использованием эксклюзионной хроматографии. Предпочтительным является рекомбинантный Fc-домен иммуноглобулина, полученный из Fc-домена человека в микроорганизмах.
Fc-домен иммуноглобулина, применимый по настоящему изобретению, может обладать цепью сахаров, по длине меньшей, равной или более длинной, чем в природном Fc-домене, или может не иметь цепей сахаров. Добавление, уменьшение или удаление цепи сахаров Fc иммуноглобулина можно осуществлять с использованием общепринятого способа, такого как химический способ, ферментативный способ или способ генетической рекомбинации с использованием микроорганизма. Дегликозилированный Fc-домен иммуноглобулина обладает значительно уменьшенной силой связывания комплемента (C1q) и обладает малой или не обладает антителозависимой опосредуемой клетками цитотоксичностью или комплементзависимой цитотоксичностью и таким образом не индуцирует ненужных иммунных ответов. В этом контексте дегликозилированные или агликозилированные Fc-домены иммуноглобулинов предпочтительно соответствуют функционированию в качестве носителей лекарственного средства.
Как применяют в настоящем документе, термин «дегликозилирование» относится к ферментативному удалению цепи сахаров из природного Fc. Термин «агликозилирование» относится к отсутствию цепей сахаров в Fc-домене из-за его продукции в эукариотах и предпочтительно в E. coli.
Fc-домен иммуноглобулина может происходить из животных, включая человека, коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, при предпочтительности человеческого происхождения. Кроме того, Fc-домен иммуноглобулина, применимый по настоящему изобретению, можно получать из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM и их комбинаций или их гибридов. Предпочтительно, его получают из IgG или IgM, которые являются более распространенными, чем другие типы иммуноглобулинов, и наиболее предпочтительно из IgG, который, как известно, продлевает время полужизни в сыворотке связывающих лиганд белков.
Кроме того, Fc-домен иммуноглобулина может существовать в форме димеров или мультимеров (комбинаций Fc иммуноглобулина), каждый из которых содержит гликозилированные иммуноглобулины, состоящие из доменов одного и того же происхождения.
Термин «комбинация», как применяют в настоящем документе, означает, что полипептиды, кодирующие одноцепочечные Fc-фрагменты иммуноглобулина одного и того же происхождения, присоединены к одноцепочечному полипептиду другого происхождения для формирования димера или мультимера. То есть димер или мультимер можно получать комбинацией двух или более фрагментов, выбранных из Fc-фрагментов Fc IgG, Fc IgA, Fc IgM, Fc IgD и Fc IgE.
Термин «гибрид», как применяют в настоящем документе, означает, что последовательности, кодирующие два или более Fc-фрагментов иммуноглобулинов различного происхождения, присутствуют в одноцепочечном Fc-фрагменте иммуноглобулина. По настоящему изобретению возможны различные гибридные формы. Например, Fc-домен состоит из от одного до четырех различных доменов, выбранных из CH1, CH2, CH3 и CH4 Fc IgG, Fc IgM, Fc IgA, Fc IgE и Fc IgD, и может содержать шарнирную область.
IgG также далее разделяют на подклассы IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и их комбинации или гибриды предусмотрены по настоящему изобретению. Предпочтительным является Fc-домен IgG2 или IgG4 с наибольшим предпочтением Fc-домена IgG4, свободного от эффекторных функций, таких как комплементзависимая цитотоксичность (CDC).
Соответственно, агликозилированный Fc-домен IgG4 человека является наиболее предпочтительным носителем лекарственного средства. Fc-домен человеческого происхождения является преимущественным по сравнению с Fc-доменом не относящегося к человеку происхождения, поскольку последний может действовать как антиген в организме, индуцируя продукцию антител против него.
Настоящее изобретение относится к присоединению белкового лекарственного средства к димерному белку посредством непептидильного полимера.
По настоящему изобретению непептидильный полимер обозначает биосовместимый полимер, состоящий из двух или более повторяющихся единиц, присоединенных друг к другу посредством ковалентной связи, отличной от пептидной связи.
Общепринятые пептидильные линкеры, используемые в слитых белках, полученных посредством слияния в рамке считывания, страдают недостатком простого расщепления in vivo протеазами, что приводит к невозможности обеспечения времени полужизни в сыворотке активного лекарственного средства, настолько долгого, какое ожидают, когда носитель остается интактным. В отличие от этого полимер по настоящему изобретению является устойчивым к ферментативной деградации, поддерживая время полужизни в сыворотке лекарственного средства настолько долгим, как это обеспечивается, когда носитель остается интактным. До тех пор пока он действует, как упомянуто выше, то есть является устойчивым к протеазам in vivo, любой полимер можно использовать по настоящему изобретению без применения к нему ограничений. Молекулярная масса непептидильного полимера, применимого по настоящему изобретению, лежит в диапазоне от 1 до 100 кДа и предпочтительно от 1 до 20 кДа. Непептидильный полимер по настоящему изобретению, который конъюгируют с Fc-доменом иммуноглобулина, может представлять собой полимер или комбинацию различных полимеров.
Примеры непептидильного полимера, применимого по настоящему изобретению, включают в себя такие биоразлагаемые полимеры, как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, сополимер этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированный полиол, поливиниловый спирт, полисахарид, декстран, поливинилэтиловый эфир, такие биоразлагаемые полимеры, как PLA (полимолочная кислота) и PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислот), липополимеры, хитины, гиалуроновая кислота и их комбинации с предпочтением полиэтиленгликоля. Кроме того, их производные, которые известны в данной области или которые можно легко получить с использованием общепринятого способа, включены в объем настоящего изобретения.
Непептидильные полимеры, применяемые по настоящему изобретению, обладают функциональными группами, с которыми может связываться Fc-домен иммуноглобулина и белковое лекарственное средство.
В отличие от предшествующих способов получения белкового комплекса с использованием непептидильного полимера, обладающего двумя функциональными концами (2 плечами) (Патент Кореи № 10-0725315), настоящее изобретение относится к непептидильному полимеру с 3 плечами. В отличие от общепринятого непептидильного полимера, который обладает одним функциональным концом и ответвлениями от коровой молекулы, непептидильный полимер, применимый по настоящему изобретению, обладает тремя функциональными концами, из которых два отвечают за формирование ковалентных связей с димерным белком, в то время как оставшийся один ковалентно присоединен к физиологически активному полипептиду.
Более подробно, поскольку Fc иммуноглобулина представляет собой гомодимер с двумя N-концами в близком соседстве друг с другом, соответствующие связи формируются между двумя N-концами Fc иммуноглобулина и противоположными концами непептидильного полимера. Таким образом, когда непептидильный полимер с 2 плечами сначала формирует ковалентные связи с Fc-доменом иммуноглобулина, не остается функциональных концов, которые могут вступать в реакцию с физиологически активным полипептидом, что приводит к значительному уменьшению выхода продукции. Таким образом проводят реакцию физиологически активного полипептида до непептидильного полимера с 2 плечами с Fc-доменом иммуноглобулина. Однако, когда предварительно проводят реакцию с физиологически активным полипептидом, образуется множество нежелательных примесей, таким образом приводя к потере физиологически активного полипептида. В отличие от этого является возможным проводить реакцию непептидильного полимера с 3 плечами с Fc-доменом иммуноглобулина до реакции с физиологически активным полипептидом, поскольку два из трех его функциональных концов отвечают за два N-конца Fc иммуноглобулина, в то время как оставшийся его функциональный конец может нацеливаться на физиологически активный полипептид. Таким образом можно получать белковый комплекс с высоким выходом. На практике обнаружили, что выход продукции увеличивается в два-девять раз по сравнению с применением непептидильных полимеров с 2 плечами.
Три концевых функциональных группы непептидильного полимера могут связываться с N-концом свободными остатками лизина, гистидина или цистеина Fc-домена иммуноглобулина и физиологически активного полипептида.
Предпочтительно, три концевые функциональные группы непептидильных полимеров выбирают из альдегидных групп, пропиональдегидных групп, бутилальдегидных групп, малеинимидных групп и сукцинимидных производных. Примеры сукцинимидных производных, применимых по настоящему изобретению, включают в себя сукцинимидилпропионат, гидроксисукцинимидил, сукцинимидилкарбоксиметил и сукцинимидилкарбонат. Предпочтительными являются альдегидные группы. При присутствии на трех концах непептидильного полимера реакционноспособные альдегидные группы могут минимизировать неспецифические реакции и являются эффективными для формирования связей между физиологически активным полипептидом и димерным белком. Кроме того, конечный продукт, образованный посредством восстановительного алкилирования с помощью альдегида, является намного более стабильным, чем продукт, образованный с помощью амидных связей. Как правило, альдегидные функциональные группы избирательно реагируют с N-концами при низком pH, в то время как формируют ковалентную связь с остатком лизина при высоком pH, например pH 9,0. Три концевые функциональные группы непептидильного полимера могут являться одинаковыми или отличающимися друг от друга.
В соответствии с настоящим изобретением конъюгат димерного белка с непептидильным полимером присоединяют к физиологически активному полипептиду с формированием белкового комплекса.
В настоящем документе термин «физиологически активный полипептид», «физиологически активный белок», «активный белок», «активный полипептид» или «белковое лекарственное средство» обозначает полипептид, пептид или белок, обладающие некоторой антагонистической активностью против физиологического события in vivo, и эти термины можно использовать взаимозаменяемо.
Физиологически активные полипептиды, применимые в белковом комплексе по настоящему изобретению, можно проиллюстрировать примерами гормонов, цитокинов, интерлейкинов, связывающих интерлейкин белков, ферментов, антител, факторов роста, факторов транскрипции, факторов крови, вакцин, структурных белков, белков-лигандов, рецепторов, антигенов поверхности клеток, антагонистов рецепторов и их производных или аналогов.
Конкретные примеры физиологически активных полипептидов, применимых по настоящему изобретению, включают в себя человеческие гормоны роста, высвобождающие гормон роста гормоны, высвобождающие гормон роста пептиды, интерфероны и рецепторы интерферона (например, интерферон-α, -β и -γ, растворимые рецепторы интерферона типа I), колониестимулирующие факторы, глюкагоноподобные пептиды (GLP-1 и т.д.), пептиды эксендина-4, ANP, BNP, CNP, DNP, связанные с G-белком рецепторы, интерлейкины (например, интерлейкин-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30) и рецепторы интерлейкина (например, рецептор IL-1, рецептор IL-4 и т.д.), ферменты (например, глюкоцереброзидаза, идуронат-2-сульфатаза, α-галактозидаза-A, α-L-идуронидаза, бутирилхолинэстераза, хитиназа, глутаматдекарбоксилаза, имиглюцераза, липаза, уриказа, ацетилгидролаза фактора активации тромбоцитов, нейтральная эндопептидаза, миелопероксидаза и т.д.), связывающие интерлейкины и цитокины белки (например, IL-18bp, связывающий TNF белок и т.д.), факторы активации макрофагов, пептиды макрофагов, факторы B-клеток, факторы T-клеток, белок A, ингибиторы аллергии, гликопротеины некроза клеток, иммунотоксины, лимфотоксины, фактор некроза опухоли, супрессоры опухолей, трансформирующий фактор роста, антитрипсин альфа-1, альбумин, α-лактальбумин, аполипопротеин-E, эритропоэтин, гликозилированный эритропоэтин, ангиопоэтины, гемоглобин, тромбин, активирующие рецепторы тромбина пептиды, тромбомодулин, фактор крови VII, VIIa, VIII, IX и XIII, активаторы плазминогена, связывающие фибрин пептиды, урокиназа, стрептокиназа, гирудин, белок C, C-реактивный белок, ингибитор ренина, ингибитор коллагеназы, супероксиддисмутаза, лептин, тромбоцитарный фактор роста, эпителиальный фактор роста, эпидермальный фактор роста, ангиостатин, ангиотензин, фактор роста кости, стимулирующий рост костей белок, кальцитонин, инсулин, соматостатин, октреотид (агонист соматостатина), атриопептин, индуцирующий образование хряща фактор, элкатонин, фактор активации соединительной ткани, ингибитор пути тканевого фактора, фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, гормон, высвобождающий лютеинизирующий гормон, факторы роста нервной ткани (например, фактор роста нервной ткани, цилиарный нейротрофический фактор, фактор аксогенеза-1, глюкагонподобные пептиды (GLP-1), пептиды эксендина-4, натрийуретический пептид головного мозга, глиальный нейротрофический фактор, нетрин, ингибиторующий фактор нейтрофилов, нейртурин и т.д.), паратиреоидный гормон, релаксин, секретин, соматомедин, инсулинподобный фактор роста, адренокортикальный гормон, глюкагон, холицистокинин, панкреатический полипептид, высвобождающий гастрин пептид, высвобождающий кортикотропин фактор, тиреоидстимулирующий гормон, аутотаксин, лактоферрин, миостатин, рецепторы (например, TNFR(P75), TNFR(P55), рецептор IL-1, рецептор VEGF, рецептор фактора активации В-клеток и т.д.), антагонисты рецепторов (например, IL1-Ra и т.д.), антигены поверхности клеток (например, CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 и т.д.), моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, scFv, Fab, Fab' F(ab')2 и Fd) и антигены полученных из вирусов вакцин. Предпочтительно, физиологически активный полипептид выбирают из человеческих гормонов роста, интерферона-альфа, интерферона-бета, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, эритропоэтина, эксендина-4, имидазолацетила пептида эксендина-4 (агониста эксендина-4), кальцитонина, октреотида (агониста соматостатина), BNP и Fab'.
Является неблагоприятным, что эти белковые лекарственные средства не могут сохранять свою биологическую активность in vivo в течение длительного времени, поскольку они сильно подвержены денатурации или легко деградируют под действием протеаз. Однако у комплекса по настоящему изобретению, в котором димерный белок и полипептид конъюгированы посредством непептидильного полимера, увеличены как структурная стабильность, так и время полувыведения лекарственного средства. Уменьшение биологической активности полипептида из-за конъюгации с димерным белком является очень незначительным по сравнению с получаемым в общепринятых комплексах. Таким образом, комплекс полипептида и Fc-домена иммуноглобулина в соответствии с настоящим изобретением характеризуется обладанием значительно улучшенной биодоступностью по сравнению с биодоступностью общепринятых полипептидных лекарственных средств.
В соответствии с другим его аспектом настоящее изобретение относится к способу получения белкового комплекса, в котором димерный белок конъюгируют с физиологически активным полипептидом посредством непептидильного полимера с 3 плечами, включающему в себя: (1) ковалентное присоединение двух плечей непептидильного полимера с 3 плечами к противоположным N-концевым аминогруппам димерного белка с формированием конъюгата, (2) выделение из реакционной смеси со стадии (1) конъюгата, в котором димерный белок ковалентно присоединен по своим N-концам к непептидильному полимеру, и (3) ковалентное присоединение физиологически активного полипептида к одному свободному плечу непептидильного полимера выделенного конъюгата.
В предпочтительном варианте осуществления димерный белок со стадии (1) представляет собой Fc-домен иммуноглобулина. В другом предпочтительном варианте осуществления три плеча непептидильного полимера со стадии (1) обладают соответствующими альдегидными функциональными группами на своих концах. Более предпочтительно, непептидильный полимер присоединяют к N-концевой аминогруппе физиологически активного полипептида при pH 6,0.
На стадии (1) проводят реакцию димерного белка с непептидильным полимером в молярном соотношении от 1:2 до 1:5. На стадии (3) молярное соотношение конъюгата, выделенного на стадии (2): физиологически активного полипептида предпочтительно лежит в диапазоне от 1:0,5 до 1:0,05.
Реакции на стадиях (1) и (3) зависят от трех концевых групп непептидильного полимера. При необходимости реакции можно проводить в присутствии восстанавливающего средства. Предпочтительные примеры восстанавливающего средства включают в себя цианоборогидрид натрия (NaCNBH3), борогидрид натрия, борат диметиламина и борат пиридина.
Соединения Fc-домена иммуноглобулина и физиологически активного полипептида достигают не посредством слияния на основе генетической рекомбинации, а посредством ковалентной связи.
В соответствии с его дополнительным аспектом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белковый комплекс по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, обладающей улучшенной устойчивостью in-vivo физиологически активного полипептида.
Посредством подходящего способа фармацевтическую композицию по настоящему изобретению необходимо вводить в интересующую ткань или орган. До тех пор пока он обеспечивает доставку к ткани-мишени, любой способ можно использовать для введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Например, введение можно осуществлять посредством внутрибрюшинного, внутривенного, внутримышечного, подкожного, чрескожного, перорального, местного, интраназального, внутрилегочного и ректального способов, но не ограничиваясь ими. Предпочтительно, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в пригодной для инъекции форме. Кроме того, фармацевтическую композицию можно вводить с помощью устройства, посредством которого активное вещество доставляют в клетки-мишени.
Фармацевтическая композиция на основе комплекса по настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Для применения в качестве фармацевтически приемлемого носителя в пероральных лекарственных формах выбирают связующее вещество, смазывающее вещество, дезинтергратор, наполнитель, солюбилизатор, диспергирующее средство, стабилизатор, суспендирующее вещество, краситель и/или фрагмент. Если фармацевтическая композиция по настоящему изобретению составлена для инъекций, можно использовать буфер, консервант, обезболивающее средство, солюбилизатор, изотоническое средство и стабилизатор, отдельно или в комбинации. Для местного применения можно использовать наполнитель, смазывающее вещество и консервант. Для применения на практике фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно составлять в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем в различных лекарственных формах. Для лекарственных форм, например, ее можно составлять в форме таблеток, лепешек, капсул, эликсира, суспензий, сиропов, облаток и т.д. Что касается препаратов для инъекций, они могут существовать в форме ампул с однократной дозой или множественными дозами. Другие доступные формы включают в себя растворы, суспензии, пилюли, порошки, капсулы и средства с замедленным высвобождением. Примеры носителей, наполнителей и разбавителей, применимых в составе, включают в себя лактозу, d-лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, аморфную целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло. Кроме того, применимыми являются наполнитель, средство против агломерации, смазывающее вещество, ароматизирующее средство, эмульгатор и консервант.
Фармацевтически эффективное количество белкового комплекса по настоящему изобретению меняется в зависимости от вида заболеваний, подлежащих лечению, способа и частоты введения, возраста, пола и массы пациента и тяжести заболевания, так же как от вида физиологически активных полипептидов. Превосходство белкового комплекса в персистенции и титре in vivo делает возможным уменьшение дозы и частоты введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
Как описано в Патентах Кореи № 10-0725315 и 10-0775343, представлен белковый комплекс, в котором константный домен иммуноглобулина и физиологически активный полипептид соответственно присоединены к противоположным концам непептидильного полимера. Этот белковый комплекс получен соединением непептидильного полимера с физиологически активным полипептидом для формирования конъюгата и затем с Fc иммуноглобулина. Способ получения является неблагоприятным в том, что физиологически активный полипептид теряется в большом количестве во время получения. В отличие от этого применение непептидильного полимера с 3 плечами для получения белкового комплекса может, как ожидают, уменьшать потери физиологически активного полипептида. Кроме того, белковый комплекс можно выделять с использованием простого способа очистки.
Лучшее понимание настоящего изобретения можно получить посредством следующих примеров, которые приведены с целью иллюстрации, но которые не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение.
Осуществление изобретения
ПРИМЕР 1: Получение комплекса Fc иммуноглобулина - PEG с 3 плечами - Октреотид(N)
Для пегилирования Fc иммуноглобулина по его N-концу проводили реакцию 10 мг/мл Fc иммуноглобулина в молярном соотношении 1:2 с 5K PropionALD(3) PEG (PEG с тремя пропиональдегидными группами, NOF, Japan) при 4°C в течение 4,5 час. Реакцию проводили в буфере 100 мМ фосфате калия, pH 6,0, в присутствии 20 мМ SCB (NaCNBH3) в качестве восстанавливающего средства. С использованием SOURCE Q (XK 16 мл, GE Healthcare) монопегилированный Fc иммуноглобулина очищали от реакционной смеси. Затем проводили реакцию октреотида в молярном соотношении 1:2 с конъюгатом Fc иммуноглобулина-5K PEG при 4°C в течение 20 час с тотальной концентрацией белка, доведенной до 25 мг/мл. Эту реакцию связывания проводили в 100 мМ фосфате калия, pH 6,0, в присутствии восстанавливающего средства 20 мМ SCB. Реакционную смесь для связывания очищали на колонке для очистки SP HP. При использовании буфера 10 мМ фосфата натрия (pH 5,4) в качестве буфера для связывания конъюгат Fc иммуноглобулина-5K PEG, не подвергшийся реакции связывания, не связывался с колонкой SP HP (XK 16 мл, GE Healthcare), но отделялся пропусканием через колонку, в то время как иммуноглобулин-PEG-Октреотид (HM11760B) слабо связывался с колонкой и затем его элюировали градиентом соли 1M NaCl.
Колонка: SP HP (XK 16 мл, GE Healthcare)
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Градиент: A 0 → 20% 60 мин B (A: 10 мМ Na-P pH 5,4, B: A + 1M NaCl)
ПРИМЕР 2: Получение комплекса Fc иммуноглобулина - PEG с 3 плечами - кальцитонина(N)
Реакцию иммуноглобулина-Fc по его N-концам с 5K PropionALD(3) PEG проводили таким же способом, как в примере 1, после чего только монопегилированный Fc иммуноглобулина очищали и связывали с кальцитонином. При этом проводили реакцию кальцитонина в молярном соотношении 1:2 с конъюгатом Fc иммуноглобулина-5K PEG при 4°C в течение 20 час с тотальной концентрацией белка, доведенной до 25 мг/мл. Для использования в качестве среды в этой реакции связывания буфер 100 мМ фосфат калия, pH 6,0, дополняли восстанавливающим средством 20 мМ SCB (NaCNBH3). Реакционную смесь для связывания очищали на колонке для очистки SP HP. Сначала колонку SP HP (XK 16 мл, GE Healthcare) использовали для удаления конъюгата Fc иммуноглобулина-5K PEG, который оставался не связанным с кальцитонином. При использовании буфера 10 мМ фосфата натрия (pH 5,4) в качестве буфера для связывания конъюгат Fc иммуноглобулина-5K PEG, не подвергшийся реакции связывания, не связывался с колонкой SP HP (XK 16 мл, GE Healthcare), но отделялся пропусканием через колонку, в то время как иммуноглобулин-PEG-кальцитонин слабо связывался с колонкой и затем его элюировали градиентом соли 1M NaCl.
Колонка: SP HP (XK 16 мл, GE Healthcare)
Скорость потока: 2,0 мл/мин
Градиент: A 0 → 20% 60 мин B (A: 10 мМ Na-P, pH 5,4, B: A + 1M NaCl)
ПРИМЕР 3: Сравнение выхода продукции и простоты способа очистки для комплекса PEG с 3 плечами (ПРИМЕР 1 и 2) и комплекса PEG с 2 плечами
Выход продукции для комплекса PEG с 3 плечами и комплекса PEG с 2 плечами сравнивали с использованием комплекса Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотида(N) и комплекса Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Кальцитонина(N), полученных в Примерах 1 и 2 соответственно (таблица 1).
Комплекс PEG с 2 плечами в качестве контрольной группы получали присоединением октреотида или кальцитонина в качестве физиологически активного полипептида к области Fc иммуноглобулина посредством PEG с 2 плечами (PEG с двумя пропиональдегидными группами, IDB, South Korea) в качестве линкера. В частности, PEG с 2 плечами соединяли с октреотидом или кальцитонином и затем с Fc-доменом иммуноглобулина посредством ковалентной связи (KR10-0725315).
Таблица 1
Активный фармацевтический ингредиент (API) Форма PEG Выход продукции (на основании API)
Октреотид с 2 плечами 9%
с 3 плечами 33%
Кальцитонин с 2 плечами 18%
с 3 плечами 30%
Способы очистки комплекса из реакционной смеси анализировали по простоте и размеру первичной колонки, и результаты обобщены в таблице 2.
Таблица 2
API Форма PEG Способ очистки Размер первичной колонки
Октреотид с 2 плечами Source Q -> Source ISO 5
с 3 плечами SP HP 1
Кальцитонин с 2 плечами Source Q -> Source ISO 4
с 3 плечами SP HP 1
При использовании комплекса PEG с 2 плечами все Fc иммуноглобулина, оставшиеся неприсоединенными, связывались с колонкой, так что отделялись от Fc иммуноглобулина-PEG с 2 плечами-октреотида или Fc иммуноглобулина-PEG с 2 плечами-кальцитонина. В отличие от этого при использовании комплекса PEG с 3 плечами, разделения между конъюгатом Fc иммуноглобулина-5K PEG, оставшимся неприсоединенным к физиологически активному полипептиду, и Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотидом или Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Кальцитонином достигали таким способом, что конъюгат Fc иммуноглобулина-5K PEG удаляли пропусканием через колонку, в то время как Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотид или Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Кальцитонин связывался с колонкой. Таким образом, не только способ очистки уменьшали от двух стадий до одной, но также размер колонки уменьшали до 1/5.
ПРИМЕР 4: Получение комплекса Fc иммуноглобулина -PEG с 3 плечами-FSH(N)
Реакцию иммуноглобулина-Fc по его N-концам с 5K PropionALD(3) PEG проводили таким же способом, как в примере 1, после чего только монопегилированный Fc иммуноглобулина очищали и связывали с FSH. При этом проводили реакцию FSH в молярном соотношении 1:15 с конъюгатом Fc иммуноглобулина-5K PEG при 4°C в течение 20 час с тотальной концентрацией белка, доведенной до 40 мг/мл. Для использования в качестве среды в этой реакции связывания буфер 100 мМ фосфат калия, pH 6,0, дополняли восстанавливающим средством 20 мМ SCB. Реакционную смесь для связывания очищали посредством двух колонок для очистки. Сначала колонку Blue HP (Hitrap 5 мл, GE Healthcare) использовали для удаления конъюгата Fc иммуноглобулина-5K PEG, который оставался не связанным с FSH. Затем мультиполимеры, в которых конъюгат двух или более Fc иммуноглобулина-5K PEG присоединен к FSH, удаляли посредством Resource Iso (1 мл, GE Healthcare) на основе гидрофобности.
Колонка: Blue HP (Hitrap 5 мл, GE Healthcare)
Скорость потока: 3,0 мл/мин
Градиент: A 0 → 100% 20 мин B
A: 50 мМ Gly-NaOH + 0,2M KCl
B: 50 мМ Gly-NaOH + 2,5M KCl
Колонка: Resource ISO (1 мл, GE Healthcare)
A 0 → 100% 90 мин B (A: 20 мМ трис pH 7,5, B: A + 1,3 М A.S)
ПРИМЕР 5: Получение комплекса Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Инсулина(N)
Для пегилирования Fc иммуноглобулина по его N-концу проводили реакцию 10 мг/мл Fc иммуноглобулина в молярном соотношении 1:2 с 5K PEG PropionALD(3) PEG (PEG с тремя пропиональдегидными группами, NOF, Japan) при 4°C в течение 4,5 час. Реакцию проводили в буфере 100 мМ фосфате калия, pH 6,0, в присутствии 20 мМ SCB (NaCNBH3) в качестве восстанавливающего средства. С использованием SOURCE Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare) монопегилированный Fc иммуноглобулина очищали от реакционной смеси. Затем проводили реакцию инсулина в молярном соотношении 1:4 с конъюгатом Fc иммуноглобулина-5K PEG при 4°C в течение 19,5 час. Для использования в качестве среды в этой реакции связывания буфер 100 мМ фосфат калия, pH 6,0, дополняли восстанавливающим средством 20 мМ SCB. Реакционную смесь для связывания очищали посредством двух колонок для очистки. Сначала колонку SOURCE Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare) использовали для удаления конъюгата Fc иммуноглобулина-5K PEG, который оставался не связанным с инсулином. Градиент соли 1 M NaCl в 20 мМ трис (pH 7,5) позволял элюировать конъюгат Fc иммуноглобулина-5K PEG первым из-за относительно слабой силы связывания со следующей непосредственно за этим элюцией Fc иммуноглобулина-PEG-Инсулина. Во время этой первичной очистки конъюгат Fc иммуноглобулина-5K PEG удаляли, но мультиполимеры Fc-5K PEG и инсулина полностью не отделялись. Вторичную очистку таким образом проводили на основе разницы молекулярной массы между комплексом и мультиполимером с использованием колонки Сефакрил S-300 (GE Healthcare). В то же время составляли комплекс Fc иммуноглобулина-PEG-Инсулина. Сначала элюировали высокомолекулярные мультиполимеры Fc иммуноглобулина-5K PEG и инсулина, затем комплекс Fc иммуноглобулина-PEG-Инсулина.
Колонка: Source Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare)
Скорость потока: 8,0 мл/мин
Градиент: A 0 → 25% 100 мин B (A: 20 мМ трис pH 7,5, B: A + 1M NaCl)
Колонка: Сефакрил S-300 (HiPrep 120 мл, GE Healthcare)
Скорость потока: 0,6 мл/мин
ПРИМЕР 6: Сравнение выхода продукции для комплекса PEG с 3 плечами (ПРИМЕРЫ 4 и 5) и комплекса PEG с 2 плечами
Выход продукции для комплекса PEG с 3 плечами и комплекса PEG с 2 плечами сравнивали с использованием комплекса Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-FSH(N)
и комплекса Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Инсулина(N), полученных в Примерах 4 и 5 соответственно (таблица 3).
При использовании общепринятого способа получения с использованием PEG с 2 плечами димерные физиологически активные полипептиды, такие как FSH (Mw. приблизительно 40000 Да) и инсулин (Mw. 5807), занимали оба конца непептидильного полимера, так что полимер не мог формировать ковалентную связь с Fc-доменом иммуноглобулина, обеспечивающим персистенцию in vivo. Этот феномен являлся более выраженным для димерного физиологически активного полипептида малой молекулярной массы, такого как инсулин.
Соответственно, персистирующие белковые комплексы с димерными физиологически активными полипептидами предпочтительно получали с использованием PEG с 3 плечами.
Различия в выходе продукции для FSH и инсулина по способу получения с использованием PEG с 2 плечами и PEG с 3 плечами обобщены в таблице 3.
Таблица 3
Активный фармацевтический ингредиент (API) Форма PEG Выход продукции (на основании API)
FSH PEG с 2 плечами 10%
PEG с 3 плечами 32%
Инсулин PEG с 2 плечами 3%
PEG с 3 плечами 27%
ПРИМЕР 7: Получение комплекса Fc иммуноглобулина -PEG-FacVIIa(N)
Для пегилирования Fc иммуноглобулина по его N-концу проводили реакцию 6 мг/мл Fc иммуноглобулина в молярном соотношении 1:2 с 5K PropionALD(3) PEG (PEG с тремя пропиональдегидными группами, NOF, Japan) при 4°C в течение 4,5 час. Реакцию проводили в буфере фосфате калия 100 мМ, pH 6,0, в присутствии 20 мМ SCB (NaCNBH3) в качестве восстанавливающего средства. С использованием SOURCE Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare) монопегилированный Fc иммуноглобулина очищали от реакционной смеси. Затем проводили реакцию FVIIa в молярном соотношении 1:9 с конъюгатом Fc иммуноглобулина-5K PEG при 4°C в течение 18 час с тотальной концентрацией белка, доведенной до 20 мг/мл. Для использования в качестве среды в этой реакции связывания буфер 100 мМ фосфат калия, pH 6,0, дополняли восстанавливающим средством 20 мМ SCB. Реакционную смесь для связывания очищали посредством двух колонок для очистки. Сначала колонку SOURCE Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare) использовали для удаления конъюгата Fc иммуноглобулина-5K PEG, который оставался не связанным с FVIIa. Градиент соли 1 M NaCl в 20 мМ трис (pH 7,5) позволял элюировать конъюгат Fc иммуноглобулина-5K PEG первым из-за относительно слабой силы связывания со следующей непосредственно за этим элюцией Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-FVIIa. После этого проводили вторичную очистку для отделения Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-FVIIa от примесей мультимеров FVIIa с использованием колонки RESOURCE ISO (GE Healthcare). Сначала элюировали Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-FVIIa, затем примеси мультимеров FVIIa.
Колонка: Source Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare)
Скорость потока: 4 мл/мин
Градиент: A 0 → 7% 1 мин B, 7% 37% 80 мин B (A: 20 мМ трис, pH 7,5, B: A + 1M NaCl)
Колонка: RESOURCE ISO (предварительно набитая, 1 мл, GE Healthcare)
Скорость потока: 2 мл/мин
Градиент: B 100 0% 60 мин A (A: 20 мМ трис, pH 7,5, B: A + 1,6M (NH4)2SO4)
Таблица 4
Активный фармацевтический ингредиент (API) Форма PEG Выход продукции (на основании API)
FacVIIa PEG с 2 плечами Не получен
PEG с 3 плечами Приблизительно выше 3%
ПРИМЕР 8: Анализ in-vivo комплекса Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотида(N)
Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотид(N) анализировали, чтобы установить эффекты на массу тела и уровень IGF-1 у крыс SD при его подкожном введении. Октреотид является сильным ингибитором гормона роста и его в основном применяют для лечения акромегалии. Он коммерчески доступен в Novatis в двух формах: Сандостатин вариант короткого действия и Сандостатин-LAR вариант длительного действия. В настоящее время акромегалия представляет собой синдром, приводящий к сверхпродукции гормона роста человека (hGH). В тестах октреотида in-vivo у крыс, которым его подкожно вводили, мониторировали массу тела и уровень IGF-1 для оценки его эффектов на ингибирование секреции GH. Подобным образом Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотид(N) анализировали in vivo по изменениям массы тела и уровня IGF-1 у крыс. Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотид(N) вводили в однократных дозах 0,5, 1,0, и 2,0 мг/кг, в то время как Сандостатин-LAR в качестве контроля вводили в однократных дозах 1,0 и 2,0 мг/кг, после чего у крыс мониторировали массу тела и уровень IGF-1 в течение двух недель. Оба тестируемых вещества вводили подкожно.
По сравнению с группой с введением носителя в группах с Сандостатином-LAR наблюдали уменьшение массы тела приблизительно на 3,7% при введении в дозе 1,0 мг/кг и приблизительно на 8,9% при введении в дозе 2,0 мг/кг. С другой стороны, в группах с Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотида(N) масса тела уменьшалась приблизительно на 44,3% при введении 0,5 мг/кг, приблизительно на 40,1% при введении 1,0 мг/кг и приблизительно на 55,1% при введении 2,0 мг/кг.
Для количественного анализа изменений IGF-1 у крыс использовали набор для ELISA IGF-1 крысы. По сравнению с носителем наблюдали уменьшение уровня IGF-1 в крови приблизительно на 15% с 1,0 мг/кг Сандостатина и приблизительно на 11% с 2,0 мг/кг Сандостатина на основании AUC уровня IGF-1 в крови. С другой стороны, в группах с Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотида(N) уровень IGF-1 в крови уменьшался приблизительно на 23% при дозе 0,5 мг/кг, приблизительно на 18% при дозе 1,0 мг/кг и приблизительно на 25% при дозе 2,0 мг/кг [фиг. 2].
Данные теста in-vivo показывают, что Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-Октреотид(N) является более сильным по активности, чем Сандостатин-LAR, состав с замедленным высвобождением октреотида.
ПРИМЕР 9: Анализ in-vivo комплекса Fc иммуноглобулин-PEG с 3 плечами-FSH(N)
Анализ in-vivo Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-FSH(N) проводили согласно способу Steelman-Pohley (Endocrinology 53, 504-616). Неполовозрелых самок крыс SD (в возрасте 21 суток) применяли для анализа in vivo Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-FSH(N). Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-FSH(N) вводили в однократных дозах 0,018, 0,075 и 0,3 мкг/крысу, в то время как Фоллитроп, коммерчески доступную природную форму FSH, использовали в качестве контроля в дозах 4, 2 и 1 МЕ/крысу один раз в сутки в течение трех суток. Носитель и тестируемые вещества вводили в сочетании с hCG (хорионический гонадотропин человека) при 13,3 МЕ/крысу. Каждое тестируемое вещество вводили подкожно в количестве 0,25 мл/кг. Через 72 часа после первого введения тестируемых веществ животных подвергали эвтаназии и овариэктомии. Удаленные таким образом яичники взвешивали.
Как изображено на фиг. 3, для Fc иммуноглобулина-PEG с 3 плечами-FSH(N) показали активность in vivo зависимым от дозы образом, такую же как для Fc иммуноглобулина-PEG с 2 плечами-FSH(N).

Claims (24)

1. Белковый комплекс с улучшенными активностью длительного действия и биостабильностью, содержащий физиологически активный полипептид, Fc-домен иммуноглобулина и непептидильный полимер, обладающий тремя функциональными концами, где Fc-домен иммуноглобулина представляет собой гомодимер с двумя N-концами, где два функциональных конца непептидильного полимера ковалентно связаны с N-концами Fc-домена иммуноглобулина, а его третий функциональный конец ковалентно связан с физиологически активным полипептидом, и где непептидильный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, липополимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций.
2. Белковый комплекс по п.1, где Fc-домен иммуноглобулина является агликолированным.
3. Белковый комплекс по п.1, где Fc-домен иммуноглобулина состоит из 1-4 различных доменов, выбранных из CH1, CH2, CH3 и CH4.
4. Белковый комплекс по п.3, где Fc-домен иммуноглобулина дополнительно содержит шарнирную область.
5. Белковый комплекс по п.1, где Fc-домен иммуноглобулина выбран из группы, состоящей из Fc-доменов IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, и их комбинаций и гибридов.
6. Белковый комплекс по п.5, где Fc-домен иммуноглобулина выбран из группы, состоящей из Fc-доменов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, и их комбинаций и гибридов.
7. Белковый комплекс по п.5, где Fc-домен иммуноглобулина присутствует в форме димеров или мультимеров (комбинаций Fc иммуноглобулина), каждый из которых содержит гликозилированные иммуноглобулины, состоящие из доменов одинакового происхождения.
8. Белковый комплекс по п.5, где Fc-домен иммуноглобулина представляет собой Fc-домен IgG4.
9. Белковый комплекс по п.8, где Fc-домен иммуноглобулина представляет собой человеческий агликозилированный Fc-домен IgG4.
10. Белковый комплекс по п.1, где непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
11. Белковый комплекс по п.1, где непептидильный полимер обладает концевой функциональной группой, выбранной из альдегидных групп, пропиональдегидных групп, бутилальдегидных групп, малеинимидных групп и сукцинимидных производных.
12. Белковый комплекс по п.11, где непептидильный полимер обладает тремя функциональными альдегидными группами на своих соответствующих концах.
13. Белковый комплекс по п.1, где три функциональных конца непептидильного полимера связаны с N-концевыми функциональными группами Fc-домена иммуноглобулина и физиологически активного полипептида, где указанные N-концевые функциональные группы выбраны из группы, состоящей из остатков лизина, гистидина, цистеина и их комбинаций.
14. Белковый комплекс по п.1, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из гормонов, цитокинов, интерлейкинов, связывающих интерлейкин белков, ферментов, антител, факторов роста, факторов транскрипции, факторов крови, вакцин, структурных белков, белков-лигандов, рецепторов, антигенов поверхности клеток, антагонистов рецепторов и их производных или аналогов.
15. Белковый комплекс по п.14, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из человеческих гормонов роста, высвобождающих гормон роста гормонов, высвобождающих гормон роста пептидов, интерферонов и рецепторов интерферона, колониестимулирующих факторов, глюкагоноподобных пептидов, пептидов эксендина-4, ANP, BNP, CNP, DNP, связанных с G белком рецепторов, интерлейкинов и рецепторов интерлейкина, ферментов, связывающих интерлейкины белков, связывающих цитокины белков, факторов активации макрофагов, пептидов макрофагов, факторов В-клеток, факторов Т-клеток, белка А, ингибиторов аллергии, гликопротеинов некроза клеток, иммунотоксинов, лимофтоксинов, фактора некроза опухоли, супрессоров опухолей, трансформирующего фактора роста, антитрипсина альфа-1, альбумина, α-лактальбумина, аполипопротеина-Е, эритропоэтина, высокогликозилированного эритропоэтина, ангиопоэтинов, гемоглобина, тромбина, активирующих рецепторы тромбина пептидов, тромбомодулина, фактора крови VII, VIIa, VIII, IX и XIII, активаторов плазминогена, связывающих фибрин пептидов, урокиназы, стрептокиназы, гирудина, белка С, С-реактивного белка, ингибитора ренина, ингибитора коллагеназы, супероксиддисмутазы, лептина, тромбоцитарного фактора роста, эпителиального фактора роста, эпидермального фактора роста, ангиостатина, ангиотензина, фактора роста кости, стимулирующего рост костей белка, кальцитонина, инсулина, соматостатина, октреотида (агониста соматостатина), атриопептина, индуцирующего образование хряща фактора, элкатонина, фактора активации соединительной ткани, ингибитора пути тканевого фактора, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон, факторов роста нервной ткани, паратиреоидного гормона, релаксина, секретина, соматомедина, инсулинподобного фактора роста, адренокортикального гормона, глюкагона, холицистокинина, панкреатического полипептида, высвобождающего гастрин пептида, высвобождающего кортикотропин фактора, тиреоидстимулирующего гормона, аутотаксина, лактоферрина, миостатина, рецепторов, антагонистов рецепторов, антигенов поверхности клеток, антигенов полученных из вирусов вакцин, моноклональных антител, поликлональных антител, фрагментов антител.
16. Белковый комплекс по п.15, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из человеческих гормонов роста, интерферона-альфа, интерферона-бета, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, эритропоэтина, эксендина-4, имидазолацетила пептида эксендина-4 (агониста эксендина-4), кальцитонина, октреотида (агониста соматостатина), BNP и Fab'-фрагмента.
17. Способ получения белкового комплекса, состоящего из физиологически активного полипептида, Fc-домена иммуноглобулина и непептидильного полимера, обладающего тремя функциональными концами, включающий:
(1) ковалентное присоединение двух функциональных концов непептидильного полимера к противоположным N-концевым аминогруппам Fc-домена иммуноглобулина с образованием конъюгата,
(2) выделение из реакционной смеси со стадии (1) конъюгата, в котором два функциональных конца непептидильного полимера ковалентно связаны с N-концами Fc-домена иммуноглобулина, и
(3) ковалентное присоединение физиологически активного полипептида к одному свободному функциональному концу непептидильного полимера выделенного конъюгата с получением, таким образом, комплекса, в котором физиологически активный полипептид и Fc-домен иммуноглобулина ковалентно связаны с непептидильным полимером, обладающим тремя функциональными концами,
где Fc-домен иммуноглобулина представляет собой гомодимер с двумя N-концами, и где непептидильный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахарида, декстрана, поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, липополимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинаций.
18. Способ по п.17, где непептидильный полимер обладает тремя функциональными альдегидными группами на своих соответствующих концах.
19. Способ по п.17, где на стадии (1) проводят реакцию Fc-домена иммуноглобулина с непептидильным полимером в молярном соотношении от 1:2 до 1:5.
20. Способ по п.17, где на стадии (3) проводят реакцию конъюгата с физиологически активным полипептидом в молярном соотношении от 1:0,5 до 1:0,05.
21. Способ по п.17, где реакции на обеих стадиях (1) и (3) проводят в присутствии восстанавливающего средства.
22. Способ по п.21, где восстанавливающее средство выбрано из группы, состоящей из цианоборогидрида натрия (NaCNBH3), борогидрида натрия, бората диметиламина и бората пиридина.
23. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество белкового комплекса по п.1 и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель, обладающая улучшенной устойчивостью in-vivo физиологически активного полипептида.
24. Белковый комплекс с улучшенными активностью длительного действия и биостабильностью, содержащий физиологически активный полипептид, Fc-домен иммуноглобулина и непептидильный полимер, обладающий тремя функциональными концами, полученный с использованием способа по п.17.
RU2011102446/10A 2008-07-23 2009-07-23 Полипептидный комплекс, содержащий непептидильный полимер, обладающий тремя функциональными концами RU2483081C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20080071766 2008-07-23
KR10-2008-0071766 2008-07-23
PCT/KR2009/004114 WO2010011096A2 (en) 2008-07-23 2009-07-23 A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2011102446A RU2011102446A (ru) 2012-08-27
RU2483081C2 true RU2483081C2 (ru) 2013-05-27

Family

ID=41570742

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2011102446/10A RU2483081C2 (ru) 2008-07-23 2009-07-23 Полипептидный комплекс, содержащий непептидильный полимер, обладающий тремя функциональными концами

Country Status (22)

Country Link
US (3) US9636420B2 (ru)
EP (1) EP2300501B1 (ru)
JP (1) JP5563572B2 (ru)
KR (1) KR101200659B1 (ru)
CN (1) CN102112493B (ru)
AR (2) AR072596A1 (ru)
AU (1) AU2009274738B2 (ru)
BR (1) BRPI0916326A2 (ru)
CA (1) CA2731546C (ru)
CL (1) CL2011000079A1 (ru)
ES (1) ES2523043T3 (ru)
HK (1) HK1154023A1 (ru)
IL (1) IL210466A (ru)
MX (1) MX2011000861A (ru)
MY (1) MY151184A (ru)
NZ (1) NZ590358A (ru)
PE (1) PE20110221A1 (ru)
RU (1) RU2483081C2 (ru)
TW (1) TWI388570B (ru)
UA (1) UA101670C2 (ru)
WO (1) WO2010011096A2 (ru)
ZA (1) ZA201100157B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2747291C1 (ru) * 2017-09-15 2021-05-04 Беийинг Вйт Био Ко., Лтд. Длительно действующий рекомбинантный свиной гибридный белок FSH, способ его приготовления и его применение

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2887039T3 (es) 2004-04-21 2021-12-21 Alexion Pharma Inc Conjugados para administración ósea y procedimiento de uso de estos para dirigir proteínas al hueso
JP5563572B2 (ja) * 2008-07-23 2014-07-30 ハンミ サイエンス カンパニー リミテッド 三末端官能基を有する非ペプチド性重合体を用いた生理活性ポリペプチド薬物結合体
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR081755A1 (es) * 2010-04-02 2012-10-17 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de la hormona estimuladora de los foliculos donde se usa un fragmento de inmunoglobulina, metodo de preparacion y metodo para tratar a un sujeto que sufre un trastorno reproductivo
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
BR112012028326A2 (pt) 2010-05-06 2017-03-21 Novartis Ag anticorpo multivalente isolado, anticorpos biparatópicos isolados, ácido nucleico, vetor, composição farmacêutica, método de obtenção dos referidos anticorpos, bem como uso do dos mesmos
US9428583B2 (en) 2010-05-06 2016-08-30 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein-related protein 6 (LRP6) multivalent antibodies
KR20120002129A (ko) * 2010-06-30 2012-01-05 한미홀딩스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 제７인자（Ｆａｃｔｏｒ Ⅶａ）약물 결합체
KR101337797B1 (ko) * 2010-07-14 2013-12-06 한미사이언스 주식회사 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제
KR101303388B1 (ko) 2010-10-26 2013-09-03 한미사이언스 주식회사 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제
US9676871B2 (en) 2010-11-05 2017-06-13 Pfizer Inc. Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
CA2823066A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
UA113626C2 (xx) 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
WO2013003641A2 (en) 2011-06-28 2013-01-03 Inhibrx Llc Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
CA2840944A1 (en) * 2011-07-08 2013-01-17 Bayer Intellectual Property Gmbh Fusion proteins releasing relaxin and uses thereof
JP6284478B2 (ja) * 2011-09-05 2018-02-28 ハンミ サイエンス カンパニー リミテッド インターフェロンアルファ結合体を含む癌治療用医薬組成物
TW201323442A (zh) 2011-11-04 2013-06-16 Novartis Ag 低密度脂蛋白相關蛋白６（ｌｒｐ６）－半衰期延長構築體
KR20130049671A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) * 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
KR101665009B1 (ko) * 2012-03-09 2016-10-11 한미사이언스 주식회사 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2013148871A1 (en) * 2012-03-28 2013-10-03 Amylin Pharmaceuticals, Llc Engineered polypeptides
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
TWI647240B (zh) * 2013-03-05 2019-01-11 韓美藥品股份有限公司 生理活性多肽複合物高產率製備之改良製程
KR101479937B1 (ko) * 2013-05-24 2015-01-12 주식회사 에스에프에이 글라스와 마스크의 정렬장치
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
AR096891A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
WO2015015448A2 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Rinat Neuroscience Corp. Engineered polypeptide conjugates
WO2015152618A1 (ko) * 2014-03-31 2015-10-08 한미약품 주식회사 면역글로불린 fc 단편 결합을 이용한 단백질 및 펩타이드의 용해도를 개선시키는 방법
US11602525B2 (en) 2014-04-25 2023-03-14 Rinat Neuroscience Corp. Antibody-drug conjugates with high drug loading
US10822596B2 (en) 2014-07-11 2020-11-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating craniosynostosis
WO2016090251A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Treating seizure with recombinant alkaline phosphatase
EP3250227A2 (en) 2015-01-28 2017-12-06 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
AR105616A1 (es) 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
US11208452B2 (en) 2015-06-02 2021-12-28 Novo Nordisk A/S Insulins with polar recombinant extensions
WO2017018742A1 (en) 2015-07-24 2017-02-02 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method of preparing physiologically active polypeptide conjugate
MX2018002121A (es) 2015-08-17 2018-06-18 Alexion Pharma Inc Elaboracion de fosfatasas alcalinas.
JP7222710B2 (ja) * 2015-09-24 2023-02-15 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 免疫グロブリン断片の特定位置を連結部位として用いたタンパク質結合体
TW201718629A (zh) * 2015-09-25 2017-06-01 韓美藥品股份有限公司 包含多個生理多肽及免疫球蛋白Ｆｃ區之蛋白質接合物
US11229686B2 (en) 2015-09-28 2022-01-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Reduced frequency dosage regimens for tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP)-enzyme replacement therapy of hypophosphatasia
MA43348A (fr) * 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
JP2018533571A (ja) 2015-10-30 2018-11-15 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 患者の頭蓋縫合早期癒合症を治療するための方法
EP3426286A4 (en) 2016-03-08 2019-12-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING HYPOPHOSPHATASE IN CHILDREN
EP3436020A4 (en) 2016-04-01 2019-12-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING HYPOPHOSPHATASIE IN TEENS AND ADULTS
JP2019513711A (ja) 2016-04-01 2019-05-30 アレクシオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アルカリホスファターゼによって筋力低下を治療すること
US10988744B2 (en) 2016-06-06 2021-04-27 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method of producing alkaline phosphatase
US11116821B2 (en) 2016-08-18 2021-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
EP3600383A4 (en) 2017-03-31 2020-10-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. METHODS FOR TREATMENT OF HYPOPHOSPHATASIA (HPP) IN ADULTS AND ADOLESCENTS
CN110505885A (zh) 2017-04-05 2019-11-26 诺和诺德股份有限公司 寡聚体延伸的胰岛素-Fc缀合物
EP3672986A1 (en) 2017-08-22 2020-07-01 Sanabio, LLC Soluble interferon receptors and uses thereof
KR101974305B1 (ko) * 2018-02-14 2019-04-30 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
WO2019190752A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of glycoproteins
US11267858B2 (en) * 2019-05-31 2022-03-08 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment using G-CSF protein complex
WO2022166720A1 (zh) * 2021-02-05 2022-08-11 华南理工大学 基于血清白蛋白的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070041967A1 (en) * 2003-11-13 2007-02-22 Jung Sung Y Igg fc fragment for a drug carrier and method for the preparation thereof

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
ES2120949T4 (es) 1990-06-28 2011-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh 50% Proteinas de fusión con porciones de inmunoglobulinas, su preparación y empleo.
JP3670276B2 (ja) 1991-02-08 2005-07-13 プロゲニクス・ファーマスーティカルズ、インコーポレイテッド ＣＤ４― ガンマ・２キメラ及びＣＤ４ ― ＩｇＧ２・キメラ
JP3693671B2 (ja) 1991-03-15 2005-09-07 アムゲン インコーポレーテッド ポリペプチドのｐｅｇ化
EP0596011A1 (en) * 1991-07-19 1994-05-11 Hybritech Incorporated Trifunctional compounds having specificity for multi-drug resistant cells
EP0533006A1 (en) 1991-09-18 1993-03-24 F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft Chimaeric interleukin 5-receptor/immunoglobulin polypeptides
US5399671A (en) 1992-11-18 1995-03-21 Kluger; Ronald Specifically crosslinked hemoglobin with free functionality
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US6410008B1 (en) 1994-12-12 2002-06-25 Beth Israel Hospital Association Chimeric IL-10 proteins and uses thereof
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
TW555765B (en) * 1996-07-09 2003-10-01 Amgen Inc Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
PL200586B1 (pl) 1998-10-16 2009-01-30 Biogen Idec Inc Polipeptydy zawierające mutanty interferonu-beta-1a, kodujące je cząsteczki kwasów nukleinowych, komórki gospodarza transformowane tymi cząsteczkami, sposób wytwarzania polipeptydów, zawierające je kompozycje farmaceutyczne i zastosowania polipeptydów
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6924264B1 (en) 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
JP4944324B2 (ja) 1999-07-13 2012-05-30 ボルダー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド 免疫グロブリン融合タンパク質
US6756480B2 (en) * 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
IL155812A0 (en) 2000-12-07 2003-12-23 Lilly Co Eli Glp-1 fusion proteins
WO2003049684A2 (en) * 2001-12-07 2003-06-19 Centocor, Inc. Pseudo-antibody constructs
US20040023848A1 (en) * 2002-02-27 2004-02-05 Thomas Boehm Compositions for the treatment, prevention, and diagnosis of gastrointestinal and other infections
EP1569690B1 (en) 2002-12-13 2011-07-27 Mitra Medical Technology AB Antilymphoma targeting agents with effector and affinity functions linked by a trifunctional reagent
MX2007002441A (es) * 2004-08-31 2007-05-04 Pharmacia & Upjohn Co Llc Conjugados de hormona del crecimiento humana y polietilenglicol ramificado con glicerol, proceso para su preparacion y metodos de uso de los mismos.
ES2434035T3 (es) * 2004-12-27 2013-12-13 Baxter International Inc. Conjugados de polímero-factor von Willebrand
US20080207505A1 (en) 2005-01-12 2008-08-28 James Kenneth D Bna Conjugates and Methods of Use
US7833979B2 (en) 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
AU2006280587B2 (en) * 2005-08-16 2011-02-24 Hanmi Science Co., Ltd. A method for the mass production of immunoglobulin Fc region deleted initial methionine residues
DK2963011T3 (en) 2005-11-23 2018-08-06 Ventana Med Syst Inc MOLECULAR CONJUGATE
CN101448525A (zh) * 2006-05-12 2009-06-03 东亚制药株式会社 聚乙二醇-干扰素α缀合物
RU2009114154A (ru) * 2006-09-15 2010-10-20 Энзон Фармасьютикалз, Инк. (Us) Полимерные пролекарства с направленной доставкой, содержащие полифункциональные линкеры
JP2008169195A (ja) * 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
JP2010520855A (ja) * 2007-01-31 2010-06-17 アフィーマックス・インコーポレイテッド 修飾基をポリペプチドおよびその他の高分子に結合するための窒素ベースのリンカー
JP5563572B2 (ja) * 2008-07-23 2014-07-30 ハンミ サイエンス カンパニー リミテッド 三末端官能基を有する非ペプチド性重合体を用いた生理活性ポリペプチド薬物結合体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070041967A1 (en) * 2003-11-13 2007-02-22 Jung Sung Y Igg fc fragment for a drug carrier and method for the preparation thereof
RU2352583C2 (ru) * 2003-11-13 2009-04-20 Ханми Фарм. Инд. Ко., Лтд. ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ Fc-ОБЛАСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНА В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЯ
RU2356909C2 (ru) * 2003-11-13 2009-05-27 Ханми Фарм. Инд. Ко., Лтд. Белковый комплекс, полученный с использованием фрагмента иммуноглобулина, и способ получения такого комплекса

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUGUETTE A. et al., Monospecific bivalent scFv-SH: Effects of linker length and location of an engineered cysteine on production, antigen binding activity and free SH accessibility, Journal of Immunological Methods, 2006, v. 310, p.p.100-116. *
HUGUETTE A. et al., Monospecific bivalent scFv-SH: Effects of linker length and location of an engineered cysteine on production, antigen binding activity and free SH accessibility, Journal of Immunological Methods, 2006, v. 310, p.p.100-116. TON N.C. et al. Phase I Evaluation of CDP791, a PEGylated Di-Fab' Conjugate that Binds Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2, Clin Cancer Res, 2007, v.13, p.7113-71118. *
TON N.C. et al. Phase I Evaluation of CDP791, a PEGylated Di-Fab' Conjugate that Binds Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2, Clin Cancer Res, 2007, v.13, p.7113-71118. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2747291C1 (ru) * 2017-09-15 2021-05-04 Беийинг Вйт Био Ко., Лтд. Длительно действующий рекомбинантный свиной гибридный белок FSH, способ его приготовления и его применение

Also Published As

Publication number Publication date
KR101200659B1 (ko) 2012-11-12
BRPI0916326A2 (pt) 2020-08-25
TWI388570B (zh) 2013-03-11
JP2011529046A (ja) 2011-12-01
US10071171B2 (en) 2018-09-11
WO2010011096A2 (en) 2010-01-28
UA101670C2 (ru) 2013-04-25
CN102112493B (zh) 2015-04-01
AR109513A2 (es) 2018-12-19
ZA201100157B (en) 2011-10-26
MY151184A (en) 2014-04-30
US11040110B2 (en) 2021-06-22
US20180360983A1 (en) 2018-12-20
US20160051696A1 (en) 2016-02-25
RU2011102446A (ru) 2012-08-27
WO2010011096A3 (en) 2010-05-27
AR072596A1 (es) 2010-09-08
CA2731546A1 (en) 2010-01-28
AU2009274738A1 (en) 2010-01-28
CL2011000079A1 (es) 2011-04-29
EP2300501B1 (en) 2014-08-20
JP5563572B2 (ja) 2014-07-30
HK1154023A1 (en) 2012-04-13
KR20100010919A (ko) 2010-02-02
CN102112493A (zh) 2011-06-29
US20110200623A1 (en) 2011-08-18
TW201004649A (en) 2010-02-01
EP2300501A4 (en) 2012-02-01
NZ590358A (en) 2012-04-27
AU2009274738B2 (en) 2012-12-13
US9636420B2 (en) 2017-05-02
PE20110221A1 (es) 2011-04-06
CA2731546C (en) 2013-11-19
IL210466A (en) 2013-08-29
MX2011000861A (es) 2011-06-21
ES2523043T3 (es) 2014-11-20
EP2300501A2 (en) 2011-03-30
IL210466A0 (en) 2011-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2483081C2 (ru) Полипептидный комплекс, содержащий непептидильный полимер, обладающий тремя функциональными концами
US20190083579A1 (en) Composition for treating diabetes comprising long-acting insulin conjugate and long-acting insulinotropic peptide conjugate
KR101382593B1 (ko) 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR20200018526A (ko) 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린 약물 결합체
KR102231217B1 (ko) 면역글로불린 단편의 특정 위치를 연결 부위로 이용한 단백질 결합체
EP3578204A1 (en) Conjugate of bioactive material having enhanced sustainability and use thereof
AU2013228144B2 (en) An improved process for preparation of physiologically active polypeptide complex
KR20210015996A (ko) 면역반응이 약화된 결합체
RU2773823C2 (ru) Конъюгат физиологически активного вещества длительного действия и его применение
KR20170100936A (ko) G 단백질 연결 수용체 폴리펩타이드 리간드의 지속형 결합체 및 이의 제조방법