KR20100010919A - 세 말단 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 이용한 생리활성 폴리펩타이드 약물 결합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생리활성 폴리펩타이드, 세 개의 반응기 말단을 가진(3-arm) 비펩타이드성 중합체 및 이량체 단백질이 상호 공유결합에 의해 연결된 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 단백질 결합체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질결합체는 생리활성 폴리펩타이드 및 펩타이드의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되어 다양한 생리활성 폴리펩타이드 약물의 지속형 제형 개발에 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 종래 단백질 결합체 제조시, 낮은 제조수율 및 원료 생리활성 폴리펩타이드의 유실 등의 문제점을 개선하여 효율적으로 이용할 수 있는 제조방법으로, 정제가 용이하다는 장점을 가진다.
이량체 단백질, 생리활성 폴리펩타이드, 세 개의 반응기 말단을 가지는 비펩타이드성 중합체, 공유결합

Description

세 말단 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 이용한 생리활성 폴리펩타이드 약물 결합체 {A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends}
본 발명은 이량체 단백질을 이용한 생리활성 폴리펩타이드의 지속형 단백질 결합체에 관한 발명으로서, 구체적으로 생리활성 폴리펩타이드, 세 말단 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체 및 이량체 단백질 영역이 상호 공유결합에 의해 연결되어 있어 생리활성 지속성 및 안정성이 향상된 단백질결합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 체내 단백질 가수 분해 효소에 의해 분해되어 그 활성을 잃으며, 펩타이드는 상대적으로 크기가 작아 신장을 통해 쉽게 제거되기 때문에 약리 성분으로 폴리펩타이드 및 펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 생리활성 폴리펩타이드 및 펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사하게 되는데, 이는 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
단백질을 안정화시키고 단백질 가수분해효소와의 접촉을 방지하며 크기가 작은 펩타이드의 신장 소실을 억제하기 위해 종래에는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 용해도가 높은 고분자 물질을 펩타이드 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어왔다. PEG는 목적 단백질의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 용해도를 높임으로써 단백질을 안정화시키고, 단백질의 가수분해를 방지하는데 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는다. 또한 펩타이드의 분자량을 증가시켜 신장에 의한 소실을 억제하고 생리 활성을 지속시킨다.
예를 들어, WO 2006/076471에서는 NPR-A에 결합하여 cGMP의 생산을 활성화하여 동맥 내 혈압을 감소시킴으로써 울혈성 심부전증(Congestive heart failure) 치료제로 사용되는 B형 나트륨 배설 증가 펩타이드(B-type natriuretic peptide, BNP)에 PEG를 결합하여 생리 활성을 지속시키는 것에 대해 기술하고 있으며, US 6,924,264에서는 엑센딘-4의 라이신 잔기에 PEG를 결합시켜 생체 내 지속 시간을 증가시키는 방법을 기술하고 있다.
생리활성 폴리펩타이드의 경우 PEG의 양쪽 말단에 동일한 단백질 약물을 결 합시킨 이중체를 만들어 활성 증가를 꾀하거나(미국특허 제5,738,846호), 서로 다른 종류의 단백질 약물을 PEG의 양쪽 말단에 결합시켜 동시에 2가지 활성을 나타내는 단백질(국제출원공개 제WO 92/16221호)도 개발되었지만, 이들은 단백질 약물의 활성을 지속시키는 면에서는 뚜렷한 효과를 보이지 못하였다.
또한 킨스틀러 등은 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)와 인간 알부민을 PEG에 결합시킨 융합단백질이 증가된 안정성을 보인다고 보고하였다(Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12(12): 1883-1888, 1995). 그러나 G-CSF-PEG-알부민 구조를 갖는 상기 문헌의 변형된 약물은 체내 잔류시간이 천연형 약물을 단독 투여한 경우에 비해 약 4배 증가하는데 불과하고, 혈중반감기 증가가 미미하여 단백질 약물의 효과적인 지속성제제로서 실용화되지 못하고 있다.
이러한 PEG를 펩타이드에 결합시키는 방법은, 단백질의 안정성을 높여 생체내 지속시간을 연장 할 수 있는 반면, PEG의 분자량이 증가할수록 생리활성 단백질의 역가가 현저히 낮아지고 단백질과의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
생리활성 단백질의 생체내 안정성을 높이는 또 다른 방법으로서, 유전자 재조합에 의해 혈중 안정성이 높은 단백질 유전자와 생리활성 단백질 유전자를 연결한 후, 상기 재조합 유전자로 형질전환된 동물세포 등을 배양하여 융합단백질을 생산하는 방법이 개발되어 있다.
예를 들면, 현재까지 단백질의 안정성 증가에 가장 효과가 높은 것으로 알려져 있는 알부민 또는 그 단편을 유전자 재조합에 의해 목적하는 생리활성 단백질에 결합시켜 생산한 융합단백질이 보고 되었다(국제공개출원 제93/15199호 및 제93/15200호, 유럽공개특허 제413,622호). 또한, 휴먼 게놈 사이언스(Human GenomeScience)사가 효모에서 생산한 인터페론 알파와 알부민의 융합단백질로 개발한 알부페론(제품명: Albuferon™)은 원숭이에서 인터페론의 반감기를 5시간에서 93시간으로 증가시켰지만, 변형되지 않은 인터페론에 비해 생체 활성도가 5% 미만으로 현저히 감소하는 문제가 있었다(Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther . 303(2): 540-548, 2002).
펩타이드의 경우, WO 02/46227에서는 재조합 유전자 기술을 이용한 GLP-1, 엑센딘-4 및 그 유사체와 인간 혈청 알부민 또는 면역 글로불린 단편(Fc)과의 융합단백질에 대해 기술하고 있으며, US 6,756,480에서는 부갑상선 호르몬(PTH) 및 그 유사체와 면역 글로불린 단편(Fc)과의 융합단백질에 대해 기술하고 있다. 이러한 방법은 낮은 페길화(pegylation) 수율 문제와 비특이성을 극복할 수 있는 반면에, 혈중반감기 증가효과가 예상보다 획기적이지 못하고 경우에 따라서는 역가가 낮은 문제점을 지니고 있다. 혈중반감기 증가효과를 극대화하기 위하여 다양한 종류의 펩타이드 링커가 사용되기도 하지만 면역 반응을 유발할 수 있는 가능성이 있다. 또한 BNP와 같이 디설파이드 결합(disulfide bond)을 가지고 있는 펩타이드를 이용할 경우 미스폴딩(misfolding)의 확률이 높아 적용이 어렵다는 문제점이 있다.
또한 유전자 재조합 방법에 의한 인터페론(대한민국 특허공개 제2003-9464호), 인터루킨-4 수용체, 인터루킨-7 수용체 또는 적혈구 생성인자 수용체(대한민국 특허등록 제249572호)를 면역글로불린의 Fc 영역과 융합된 형태로 포유 동물에서 발현시키는 것이 알려져 있으며, 국제특허공개 제01/03737호에서는 사이토카인 또는 성장인자를 올리고펩타이드 링커(linker)를 통해 면역글로불린의 Fc 단편에 결합시킨 융합단백질이 개시되어 있다. 또한, 미국특허 제5,116,964호는 LHR(lymphocyte cell surface glycoprotein) 또는 CD4 단백질을 면역글로불린 Fc 영역의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 유전자 재조합 방법에 의해 융합시킨 단백질을 개시하고 있고, 미국특허 제5,349,053호는 IL-2를 면역글로불린 Fc 영역에 융합시킨 융합단백질을 개시하고 있다. 그 외에도, 유전자 재조합에 의해 제조된 Fc 융합단백질의 예로서 인터페론-베타 또는 그의 유도체와 면역글로불린 Fc 영역의 융합 단백질(국제특허공개 제 WO 00/23472호), IL-5 수용체와 면역글로불린 Fc 영역의 융합 단백질(미국특허 제5,712,121호), 인터페론 알파와 면역 글로불린 G4의 Fc 영역의 융합 단백질(미국특허 제5,723,125호) 및 CD4 단백질과 면역글로불린 G2의 Fc 영역의 융합 단백질(미국특허 제6,451,313호)이 개시되었다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역의 아미노산을 변형시킨 미국특허 제5,605,690호에는 면역글로불린 Fc 영역에서 특히 보체 결합부위나 수용체 결합부위의 아미노산을 변형시킨 Fc를 이용하여 유전자 재조합 방법에 의해 제조된 TNFR-IgG1 Fc 융합단백질을 개시되어 있고, 이와 같이 변형된 면역글로불린의 Fc영역을 이용한 유전자 재조합 방식의 융합단백질의 제조방법은 미국특허 제6,277,375호, 제6,410,008호 및 제6,444,792호 에도 개시되어 있다.
면역글로불린은 항체-의존성 세포독성(antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC) 효과와 같은 항체로서의 기능을 가지고 있으며, 면역글로불린 Fc 영역에 존재하는 당쇄는 ADCC 및 CDC 효과에 중요한 역할을 한다고 보고되었다(Burton D., Molec. Immun. 22, 161-206,1985). 당쇄가 없는 경우에는 면역글로불린 자체의 혈중반감기는 당쇄가 있는 면역글로불린과 비슷하지만, 보체 결합력 및 수용체 결합력은 10 내지 1000배 감소한다고 알려져 있다(Waldmann H., Eur. J. Immunol. 23, 403-411, 1993;Morrison S., J. Immunol. 143, 2595-2601, 1989).
한편, 미국특허 제6,660,843호는 면역글로불린 Fc 영역과 목적단백질을 링커를 사용하여 융합시킨 결합체를 대장균에서 유전자 재조합 방법으로 생산하는 방법을 개시하고 있다. 링커를 사용한 결합체의 제조는 결합부위 및 결합되는 두 단백질의 방향성을 선택하여 조절할 수 있고 단량체, 이량체 또는 다량체 제조가 가능하며, 동종 또는 이종 형태 모두 제조할 수 있다는 장점이 있다. 또한 상기 방법은 포유동물세포를 이용하는 방법보다 저렴한 비용으로 생산이 가능하며, 당쇄가 제거된 형태로 결합체를 얻을 수 있다. 그러나 목적단백질과 면역글로불린 Fc 영역을 대장균에서 동시에 생산하기 때문에 천연형에 당쇄가 있는 목적단백질에는 적용하기 어려울 뿐만 아니라, 봉입체(inclusion body)를 이용하기 때문에 오중 첩(misfolding) 확률이 매우 높다는 문제점이 있다. 이러한 유전자 재조합 방법에 의해 생산된 Fc 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역의 특정부위 즉, 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서만 단백질 융합이 가능하고 동종이량체의 형태로만 발현되어 단량체의 형태로는 생산이 불가능하며, 당쇄화 단백질간 또는 비당쇄화 단백질간의 융합만이 가능하기 때문에 당쇄화 단백질과 비당쇄화 단백질의 융합은 불가능하다는 문제점이 있다. 또한, 융합에 의해 새로 생긴 아미노산 서열로 인하여 면역반응이 유발될 수 있을 뿐만 아니라 링커부위에 대한 단백질 가수분해효소의 민감성이 증가될 수 있다.
면역글로불린 Fc 영역을 이용한 융합단백질의 개발에 있어서, 천연형 인체 유래 Fc 및 교차결합제를 사용하여 목적 단백질과의 결합체를 얻고자 하는 시도는 아직까지 보고된 바 없다. 또한 면역글로불린 Fc 영역은 포유동물세포 또는 대장균을 이용한 재조합 방법에 의해 생산이 가능하지만, 목적단백질을 포함하지 않은 천연형 면역글로불린 Fc 영역만을 대장균으로부터 높은 수율로 대량생산하여 지속형 제형에 사용한 예는 현재까지 보고된 바 없다. 뿐만 아니라, 이러한 재조합 방법에 의해 생산된 대장균 유래 면역글로불린 Fc 영역을 사용하여 교차결합제를 매개로 목적단백질과의 결합체를 생산한 시도도 아직까지 보고된 바 없다.
이처럼 생리활성 폴리펩타이드에 고분자를 결합시키는 다양한 방법이 시도되어 왔지만, 기존의 방법들은 폴리펩타이드의 안정성을 높이면 활성이 현저히 감소 하거나, 안정성과는 무관하게 활성만을 증가시키는 것이어서, 변형에 의한 단백질 약물의 활성 감소를 최소화하고 안정성 향상을 동시에 달성하는 방법의 개발이 여전히 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 증가된 혈중 반감기와 높은 활성을 갖는 단백질 약물을 제공하고자, 비펩타이드성 링커의 양 말단에 면역글로불린 및 생리활성 폴리펩타이드를 각각 결합시킨 단백질 결합체를 개발하였으며, 이에 관하여 출원하여 등록 받은 바 있다(대한민국 등록 특허 제10-0725315호 및 10-0775343호). 이러한 본 발명자의 상기 특허 문헌들은 모두 본원 발명의 참고 문헌으로 포함된다.
종래의 비펩타이드성 중합체의 양 말단에 면역글로불린 및 생리활성 폴리펩타이드가 결합된 결합체의 경우 그 제조방법에 있어서 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 중합체를 먼저 결합시킨 후 그에 따라 제조된 산물에 면역글로불린 Fc 영역을 결합시키는 방식에 의해서 제조하여야 했다. 그러나, 이에 의할 경우 원하지 않는 불순물이 많이 생성되며 이로 인하여 원료인 생리활성 폴리펩타이드가 그 제조과정에서 다량 유실되어 공업적인 생산 시에 비경제적이며, 제조된 결합체를 다소 복잡한 방법에 의해 정제하여야 한다는 단점을 가지고 있다. 또한 생리활성 폴리펩타이드가 이량체인 경우, 양 말단 비펩타이드성 중합체와 bridge form을 형성하여 면역글로불린 Fc와 결합체를 제조할 수 없거나 매우 낮은 제조수율로 제조되는 문제가 있다. 한편, 양 말단 비펩타이드성 중합체와 면역글로불린 Fc영역을 먼저 결합시키는 방식에 의해 제조하는 경우, 면역글로불린 Fc는 호모 다이머 형태로 2개의 N-말단을 가지며 또한 2개의 N-말단이 매우 근접해 있기 때문에, 2개의 N-말단에 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 결합하여 면역글로불린 Fc영역이 bridge form을 형성하게 되고 결국 더 이상 생리활성 폴리펩타이드와 반응할 작용기 말단이 없어 제조수율이 현저히 떨어지는 단점을 갖고 있다.
이러한 배경 하에서 본 발명자들은 효율적인 생산이 가능하며 간이한 정제방법에 의해서도 고순도로 정제가 가능한, 반감기 및 생리활성이 탁월한 단백질 결합체에 대해 지속적인 연구를 하였으며, 그 결과, 이량체 단백질 및 생리활성 폴리펩타이드가 3개의 결합부위를 가진 비펩타이드성 중합체로 연결된 단백질 결합체의 경우 종래 제조방법이 갖는 문제점들의 개선이 가능하여 생리활성 폴리펩타이드의 유실을 획기적으로 방지할 수 있으며 현저한 수율로 단백질 결합체를 제조하며, 간이한 정제방법을 사용하여도 정제가 가능하고 단백질 결합체에 구조적 안정성을 증가시킴을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생리활성 폴리펩타이드, 세 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체 및 이량체 단백질이 상호 공유결합에 의해 연결된 단백질 결합체 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생리활성 폴리펩타이드의 생체 내 활성을 유지하면서 혈중 반감기가 연장된 상기 단백질 결합체를 포함하는 지속성 단백질 약물 제제를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 생리활성 폴리펩타이드 및 이량체 단백질이 세 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 통해 상호 공유결합에 의해 연결되어 있는 단백질 결합체에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서, 단백질 결합체(complex)" 또는 "결합체"라 함은 하나 이상의 생리활성 폴리펩타이드, 세 말단에 반응기를 갖는 하나 이상의 비펩타이드성 중합체 및 하나 이상의 이량체 단백질을 포함하고, 이들 구성요소가 공유결합으로 상호 연결되어 있는 것을 가리킨다. 또한 상기 "결합체"와 구별하기 위하여, 생리활성 폴리펩타이드, 비펩타이드성 중합체 및 이량체 단백질에서 선택된 2 종류의 물질 분자만이 공유결합으로 연결된 구조물은 "연결체(conjugate)"로 표시한다.
본 발명의 단백질 결합체는 단백질 약물의 생리활성 감소를 최소화하고 생체내 지속성을 최대한 증진시키기 위한 단백질약물의 변형체이며, 본 발명에서는 특히 생리활성 폴리펩타이드의 제조시 유실을 최소화하고, 간이방법에 의해서도 정제가 가능한 안정한 구조의 단백질 결합체의 제조방법이 적용될 수 있도록 세 말단이 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 이용하여 생리활성 폴리펩타이드와 이량체 단백질을 결합시킴을 특징으로 한다.
이량체 단백질은 N-말단이 두 개인 단백질을 의미하며, 바람직하게는 캐리어로 사용하는 면역글로불린 Fc영역이며, 동종이량체와 이종이량체로 존재하는 생리활성 물질을 포함한다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서 "면역글로불린 Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영 역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge)부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수 도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1)CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6)중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 및 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질 전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, "비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 하이브리드(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 당쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체(면역글로불린 Fc의 조합)일 수 있다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 하이브리드도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 단백질 약물은 이량체 단백질과 비펩타이드성 중합체로 연결됨을 특징으로 한다.
본 발명에서 비펩타이드성 중합체는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합 성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다. 또한 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합할 수 있는 반응기를 가진다.
본 발명에서는, 기존에 사용되던 양 말단 반응기를 가진 비펩타이드성 중합체를 이용한 단백질 결합체 제조 방법(한국등록특허 제10-0725315호)에 기재된 바와는 달리 세 말단 반응기를 가진 비펩타이드성 중합체를 도입하였다. 본 발명에서 사용된 비펩타이성 중합체는 기존에 흔히 사용되어 온 반응기 말단이 하나이고 핵분자를 중심으로 브랜치 모양을 띠는 비펩타이성 중합체와는 차별되며, 세 개의 반응기 말단 중 두 개는 이량체 단백질에 나머지 하나는 생리활성 폴리펩타이드에 상호 공유결합함을 그 특징으로 한다.
구체적으로, 면역글로불린 Fc는 호모 다이머 형태로 2개의 N-말단을 가지며 또한 2개의 N-말단이 매우 근접해 있기 때문에 양 말단 반응기를 가진 비펩타이드성 중합체를 이용하여 면역글로불린 Fc영역에 먼저 공유결합시킬 경우, 2개의 N-말단에 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 결합하여 더이상 생리활성 폴리펩타이드와 결합할 확률이 매우 낮아 제조 수율이 현저히 낮았기 때문에 생리활성 폴리펩타이드를 먼저 결합하는 방법에 의해 제조하는 방법을 사용하고 있었다. 또한 생리활성 폴리펩타이드를 먼저 결합시키는 경우, 원하지 않는 불순물이 많이 생성되며 이로 인하여 생리활성 폴리펩타이드가 유실 되는 중요한 단점이 있었다. 그러 나, 세 말단 반응기를 가진 비펩타이드성 중합체의 사용으로 세 말단 중 두 말단이 면역 글로불린 Fc의 2개의 N-말단과 공유결합을 하게 되고 그 후 비펩타이드성 중합체의 한 잔여 말단이 생리활성 폴리펩타이드와 결합하게 되어 높은 수율로 제조할 수 있게 되었고, 구체적인 실시예로서 2 ~ 9배의 제조수율 향상을 확인할 수 있었다.
또한 바람직하게는 비펩타이드성 중합체의 세 말단 반응기는 각각 면역글로불린 Fc 영역과 생리활성 폴리펩타이드의 N- 말단, 라이신 잔기, 히스티딘 잔기 또는 시스테인 잔기의 유리 반응기에 결합될 수 있다.
상기 비 펩타이드성 중합체의 세 말단 반응기는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 하이드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 알데히드 그룹이다. 상기 비펩타이드성 중합체가 세 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 세 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 이량체 단백질과 각각 결합하는데 효과적이며, 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 아미노 말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다. 또한 상기 비펩타이드성 중합체의 세 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 이량체 단백질과 비펩타이드성 중합체의 연결체는 생리활성 폴리펩타이드에 결합되어 단백질 결합체를 형성하게 된다.
본 발명에서, 생리활성 폴리펩타이드, 생리활성 단백질, 활성 단백질, 활성 폴리펩타이드 또는 단백질 약물이란 생체 내에서 생리적 현상에 길항작용을 나타내는 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단백질을 의미하는 용어로서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질 결합체에 적용될 수 있는 생리활성 폴리펩타이드로는 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질, 수용체, 세포표면항원 또는 수용체 길항물질과 같은 다양한 생리활성 폴리펩타이드, 이들의 유도체 및 유사체들을 예시할 수 있다.
구체적으로, 생리활성 폴리펩타이드는 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류와 인터페론 수용체류(예: 인터페 론-α, -β 및 -γ, 수용성 타입 I 인터페론 수용체 등), 콜로니 자극인자, 글루카곤-유사 펩타이드류(GLP-1등), 엑센딘-4 펩타이드류, ANP, BNP, CNP, DNP, 지프로테인 관련 수용체(Gprotein-coupled receptor), 인터루킨류(예:인터루킨-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30 등)와 인터루킨 수용체류(예: IL-1 수용체, IL-4 수용체 등), 효소류(예: 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 이두로네이트-2-설파 타아제(iduronate-2-sulfatase), α-갈락토시다제-A(α-galactosidase-A), α-L-이두로니다제, 부티릴콜린에스터라제(butyrylcholinesterase), 키티나아제(chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제(glutamate decarboxylase), 이미글루세라제(imiglucerase), 리파제(lipase), 유리카제(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤라제(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티다아제(neutralendopeptidase), 마이엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase) 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예: IL-18bp, TNF-결합 단백질 등), 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴(angiopoeitin)류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드(thrombin receptor activating peptide), 트롬보모듈린(thrombomodulin), 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘(hirudin), 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴(angiostatin), 안지오텐신(angiotensin), 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 소마토스타틴, 옥트레오타이드(소마토스타틴 아고니스트), 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌(elcatonin), 결합조직 활성인자, 조직인자경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor), 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경성장인자류(예: 신경 성장인자(Nerve growth factor), 모양체 신경영양성인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스인자-1 (axogenesis factor-1), Glucagon-like-pepetide 류(GLP-1), 엑센딘-4 펩타이드류, 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriureticpeptide), 신경아세포 유래 신경인자(glial deri ved neurotrophic factor), 네트린(netrin), 향신경성 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경인자, 뉴르투린(neurturin) 등), 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신(autotaxin), 락토페린(lactoferrin), 미오스타틴(myostatin), 수용체류(예: TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포 활성인자 수용체 등), 수용체 길항물질(예: IL1-Ra 등), 세포표면항원 (예: CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 등), 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류 (예: scFv, Fab, Fab, F(ab)2 및 Fd), 바 이러스 유래 백신 항원 등 다양한 종류를 포함한다. 바람직하게는 인간성장 호르몬, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 과립구 콜로니 자극인자, 적혈구 생성인자, 엑센딘-4, 이미다졸 아세틸 엑센딘-4 펩타이드(엑센딘-4 아고니스트), 칼시토닌, 옥트레오타이드(소마토스타틴 아고니스트), BNP 또는 Fab' 항체 단편을 생리활성 폴리펩타이드로 하는 경우이다.
이러한 단백질 약물은 쉽게 변성되거나 생체내에 존재하는 단백질 분해효소에 의해 잘 분해되는 등의 이유로 장시간에 걸쳐 생리학적 활성을 지속할 수 없는 단점이 있다. 그러나 본 발명의 이량체 단백질과 폴리펩타이드를 결합시킨 결합체의 경우, 약물의 구조적 안정성이 증가하고 분해 반감기가 증가하게 된다. 이때 이량체 단백질의 결합에 의한 폴리펩타이드의 생리학적 활성의 감소는 기타 공지된 다른 폴리펩타이드 약물 제제에 비해 아주 경미하다 할 것이다. 그러므로 기존의 폴리펩타이드 약물의 생체내 이용률에 비해 본 발명의 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역의 결합체는 생체내 이용률이 현저히 증가하였음을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, (1) 세 말단의 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체의 두 말단 반응기에 이량체 단백질의 양 N-말단 아미노기에 공유결합으로 연결시키는 단계; (2) (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단에 비펩타이드성 중합체가 공유 결합된 이량체 단백질을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및 (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드를 공유 결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 세 군데 말단이 각각 이량체 단백질 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다.
바람직하게 (1)의 이량체 단백질이 면역글로불린 Fc영역인 경우이다. 또한 바람직하게 (1)의 비펩타이드성 중합체의 세 말단은 알데히드 반응기를 가지며, 더욱 바람직하게는 (1)의 비펩타이드성 중합체 및 생리활성 폴리펩타이드의 N-말단 아미노기는 pH 6.0 에서 연결된다.
한편, 단계(1)의 이량체 단백질과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰비가 1:2 내지 1:5인 것이 바람직하며, 단계(3)의 단계(2)에서 수득된 이량체 단백질을 포함하는 연결체 : 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰비가 1: 0.5 내지 1: 0.05 인 것이 바람직하다.
단계(1) 및 단계(3)의 반응은, 반응에 참가하는 비펩타이드성 중합체의 세 말단 반응기의 종류를 고려하여 필요에 따라 환원제의 존재 하에 수행될 수 있다. 바람직한 환원제로는 나트륨시아노보로하이드라이드(NaCNBH3), 수소화붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염 및 피리딘 붕산염 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역과 단백질의 결합은 종래의 재조합적 인 방법에 의한 융합이 아닌 공유결합인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 단백질 결합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 생체내 지속성이 증가된 생리 활성 폴리펩타이드의 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입되는 것으로, 상기 약제학적 조성물의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여가 가능하나 이에 제한되지는 않으며 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 결합체를 포함한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함 할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 산제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다. 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 사용될 수 있다. 제제는 또한 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 단백질 결합제은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성 성분인 생리활성 폴리펩타이드의 종류에 따라 치료용량이 결정된다. 본 발명의 단백질 결합제는 생체내 지속성 및 역가가 매우 우수하므로, 본 발명의 단백질 결합체를 포함하는 약제학적 조성물은 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
대한민국 등록 특허 제10-0725315호 및 10-0775343호 등에 의해 공지되어 있는 바와 같이, 종래에는 비펩타이드성 중합체를 통해 면역글로불린 불변 영역과 생리활성 폴리펩타이드가 비펩타이드성 중합체의 양 말단에 연결된 단백질 결합체만이 존재하였으며, 이러한 단백질 결합체는 생리활성 폴리펩타이드를 비펩타이드성 중합체와 먼저 결합시킨 후에 그 과정에서 제조된 생리활성 폴리펩타이드-비펩타이 드성 연결체(conjugate)와 면역글로불린 Fc를 결합시키는 제조방법을 사용할 수 있었으며 이러한 제조방법에 의해 제조하는 경우 그 과정에서 생리활성 폴리펩타이드가 제조 과정 중 다량으로 유실되는 단점이 있었다. 그러나, 본 발명에 따른 단백질 결합체의 경우 세 말단의 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 단백질 결합체를 제조하는 경우, 다량의 생리활성 폴리펩타이드의 유실을 획기적으로 줄일 수 있으며, 추후 매우 간이한 정제법을 통해 제조된 단백질 결합체를 제조할 수 있게 되었다.
본 발명의 단백질 결합체는 세 개의 반응기 말단을 가진(3-arm) 비펩타이드성 중합체를 사용하여 생리활성 폴리펩타이드와 이량체 단백질을 상호 공유결합에 의해 연결시킨 것으로, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 지속적으로 유지하여 약효를 안정적으로 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질 결합체 제조방법은 기존 양 말단 반응기를 가진 비펩타이드성 중합체 이용시, 원료 생리활성 폴리펩타이드의 불필요한 소비량을 획기적으로 줄일 수 있으며 보다 간이한 정제법을 도입할 수 있다는 장점을 지니며, 종래에 비해 현저히 향상된 제조 수율로 단백질 결합체를 제조할 수 있다. 특히, 이량체 생리활성 폴리펩타이드의 경우 지속성 단백질 결합체를 제조하기 위하여 반드시 세 말단 비펩타이드성 중합체를 이용한 본원의 제조방법이 필수적이라고 할 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Octreotide(N) 결합체 제조
5K PropionALD(3) PEG(프로피온알데히드기를 3개 가지고 있는 PEG, NOF, 일본)를 면역글로불린 Fc의 N-말단에 페길화시키기 위하여 면역글로불린 Fc 와 PEG의 몰비를 1 : 2, 면역글로불린 Fc 농도를 10mg/ml로 하여 4℃에서 4.5hrs 반응하였다. 이 때 반응은 pH 6.0 인 100mM 농도의 Potassium phosphate 완충액 내에서 이루어졌으며, 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 SOURCE Q(XK 16ml, GE Healthcare)를 통하여 Mono-pegylated 면역글로불린 Fc를 정제하였다. 그 후 Octreotide와 면역글로불린 Fc-5K PEG 몰비를 1 : 2, 전체단백질농도를 25mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM Potassium phosphate pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. Coupling 반응액은 SP HP 정제 컬럼으로 정제된다. SP HP(XK 16ml,GE Healthcare)에 10mM Sodium phosphate(pH5.4) 완충액을 이용하여 Coupling 반응에 참여하지 않은 면역글로불린 Fc-5K는 컬럼에 붙이지 않고 Loading through로 분리하고, 면역글로불린-PEG-Octreotide(HM11760B)는 컬럼에 약하게 붙여 1M Nacl을 이용하여 salt gradient로 용출시킨다.
Column : SP HP(XK16ml, GE Healthcare)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →20% 60분 B (A: 10mM Na-P pH5.4, B: A + 1M NaCl )
실시예 2. 면역글로불린 Fc -3 arm PEG - Calcitonin (N) 결합체 제조
실시예 1.의 방법을 이용하여 5K PropionALD(3) PEG를 면역글로불린-Fc의 N-term과 반응시킨 후 Mono-pegylated 면역글로불린 Fc만을 정제하여 Calcitonin과 Coupling시켰다. Calcitonin과 면역글로불린 Fc-5K PEG몰비를 1 : 2, 전체단백질농도를 25mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM Potassium phosphate pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. Coupling 반응액은 SP HP정제 컬럼으로 정제된다. 먼저 Coupling 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로불린 Fc-5K　PEG를 제거하기 위하여 SP HP(XK 16ml, GE Healthcare)이용하였다. 10mM Sodium phosphate(pH5.4) 완충액을 이용하여 Coupling 반응에 참여하지 않은 면역글로불린 Fc-5K　PEG는 컬럼에 붙이지 않고 Loading through로 분리하고, 면역글로불린-PEG-Calcitonin은 컬럼에 약하게 붙여 1M Nacl을 이용하여 salt gradient로 용출시킨다.
Column : SP HP(XK16ml, GE Healthcare)
유속 : 2.0ml/분
구배 : A 0 →20% 60분 B (A: 10mM Na-P pH5.4, B: A + 1M NaCl )
실시예 3. 3 arm PEG 결합체( 실시예 1 및 2)와 2 arm PEG 결합체와의 제조 수율 및 정제 간이성 비교
실시예 1 및 2에서 제조한 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Octreotide(N) 결합체 및 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Calcitonin(N) 결합체를 이용하여 3 arm PEG 결합체와 2 arm PEG 결합체의 제조 수율을 비교하였다 (표 1).
2 arm PEG 결합체, 즉 대조군으로서 Octreotide 및 calcitonin을 각각 생리활성 폴리펩타이드로 하여, 2 arm PEG (프로피온알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG, IDB, 한국)를 링커로 하여 면역글로불린 Fc 영역과 공유결합시켜 2 arm PEG 결합체를 제조하였다. 보다 구체적으로는 2 arm PEG에 Octreotide 또는 calcitonin을 결합시킨 후, 면역글로불린 Fc 영역을 결합시켰다. (KR0725315)
약리 활성 물질(API) PEG 형태 제조 수율( API 기준)
Octreotide 2 arm 9%
3 arm 33%
Calcitonin 2 arm 18%
3 arm 30%
추가로, 상기 결합체 제조 방법으로 얻어진 coupling 반응액내의 결합체를 정제하는 공정의 간이성 및 일차컬럼의 크기를 비교하여 본 결과는 다음과 같다.
API PEG 형태 결합체 정제 공정 일차 컬럼 크기
Octreotide 2 arm Source Q -> Source ISO 5
3 arm SP HP 1
Calcitonin 2 arm Souce Q -> Source ISO 4
3 arm SP HP 1
2 arm PEG를 이용한 결합체의 경우, 기존에 반응에 참여하지 않은 면역글로불린 Fc와 면역글로불린 Fc-2 arm PEG-Octreotide 또는 면역글로불린 Fc-2 arm PEG-Calcitonin 를 정제하기 위해 반응에 참여하지 않은 면역글로불린 Fc를 모두 컬럼에 붙여 정제를 하였으나, 3 arm PEG를 이용한 결합체의 경우 반응에 참여하지 않은 면역글로불린 Fc-5K PEG 연결체와 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Octreotide 또는 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Calcitonin 를 분리 정제하기 위해, 반응에 참여하지 않은 면역글로불린 Fc-PEG 연결체를 loading through로 제거한 후 단백질 결합체만을 컬럼에 붙여 정제하기 때문에 정제과정을 2 단계에서 1 단계로 줄일 뿐 아니라, 불필요하게 커져야 했던 컬럼크기를 1/5수준으로 줄일 수 있었다.
실시예 4. 면역글로불린 Fc -3 arm PEG - FSH (N) 결합체 제조
실시예 1 의 방법을 이용하여 5K PropionALD(3) PEG를 면역글로불린-Fc의 N-term과 반응시킨 후 Mono-pegylated 면역글로불린 Fc만을 정제하여 FSH과 Coupling시켰다. FSH와 면역글로불린 Fc-5K PEG몰비를 1 : 15, 전체단백질농도를 40mg/ml로 하여 4℃에서 20시간 반응하였다. 반응액은 100mM Potassium phosphate pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. Coupling 반응액은 두 개의 정제 컬럼을 거쳐 정제된다. 먼저 Coupling 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로불린 Fc-5K PEG를 제거하기 위하여 Blue HP(Hitrap 5ml, GE Healthcare)이용하였다. 이후 Resource Iso (1ml, GE Healthcare)을 이용하여 FSH에 면역글로불린Fc-5K PEG가 두 개 이상 붙은 다중합체 불순물을 Hydrophobicity를 이용하여 제거한다.
Column : Blue HP(Hitrap5ml, GE Healthcare)
유속 : 3.0ml/분
구배 : A 0 →100% 20분 B
A : 50mM Gly-NaOH + 0.2M KCl
B : 50mM Gly-NaOH + 2.5M KCl
Column : Resource ISO (1ml, GE Healthcare)
A 0 →100% 90분 B (A: 20mM Tis pH7.5, B: A + 1.3M A.S )
실시예 5. 면역글로불린 Fc -3 arm PEG - Insulin (N) 결합체 제조
5K PropionALD(3) PEG(프로피온알데히드기를 3개 가지고 있는 PEG, NOF, 일본)를 면역글로불린 Fc의 N-말단에 페길화시키기 위하여 면역글로불린 Fc 와 PEG의 몰비를 1 : 2, 면역글로불린 Fc 농도를 10mg/ml로 하여 4℃에서 4.5hrs 반응하였다. 이 때 반응은 pH 6.0 인 100mM 농도의 Potassium phosphate 완충액 내에서 이루어졌으며, 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 SOURCE Q(LRC25 85ml, GE Healthcare)를 통하여 Mono-pegylated 면역글로불린 Fc를 정제하였다. 그 후 Insulin과 면역글로불린 Fc-5K PEG몰비를 1 : 4, 전체단백질농도를 20mg/ml로 하여 4℃에서 19.5시간 반응하였다. 반응액은 100mM Potassium phosphate pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. Coupling 반응액은 두 개의 정제 컬럼을 거쳐 정제된다. 먼저 Coupling 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로불린 Fc-5K를 제거하기 위하여 SOURCE Q(LRC25 85ml,GE Healthcare)를 이용하였다. 20mM Tris(pH7.5)에서 1M NaCl을 사용하여 Salt gradient를 주면 상대적으로 결합력이 약한 면역글로불린 Fc-5K PEG가 먼저 용출되고 바로 뒤이어 면역글로불린 Fc-PEG-Insulin 이 용출된다. 일차 정제를 통하여 면역글로불린 Fc-5K 가 제거되지만 면역그로불린 Fc-5K PEG와 Insulin 다중합체 불순물은 완전히 분리되지 않는다. 따라서 두 물질의 분자량 차이를 이용하여 Sephacryl S-300 (GE Healthcare) column으로 이차 정제를 하였으며, 이와 동시에 면역글로불린 Fc-PEG-Insulin 결합체를 제형화하였다. 분자량이 큰 면역그로불린 Fc-5K PEG 와 Insulin의 다중합체가 먼저 용출되고 그 뒤로 면역글로블리 Fc-PEG-Insulin 결합체가 용출된다.
Column : Source Q (LRC25 85ml, GE Healthcare)
유속 : 8.0ml/분
구배 : A 0 →25% 100분 B (A: 20mM Tis pH7.5, B: A + 1M NaCl )
Column : Sephacryl S-300 (HiPrep 120ml, GE Healthcare)
유속 : 0.6ml/분
실시예 6. 3 arm PEG 결합체( 실시예 4 및 5)와 2 arm PEG 결합체와의 제조 수율 비교
실시예 4 및 5에서 제조한 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-FSH(N) 결합체 및 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Insulin(N) 결합체를 이용하여 3 arm PEG 결합체와 2 arm PEG 결합체의 제조 수율을 비교하였다 (표 3).
FSH(Mw. ~40,000Da) 와 Insulin(Mw. 5,807)과 같이 생리활성 폴리펩타이드가 이량체인 경우, 종래의 2 arm PEG를 이용한 제조방법으로 제조 시, 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 생리활성 폴리펩타이드와 모두 결합하게 되어 지속성을 부여하는 면역글로불린 Fc영역과 공유결합을 할 수 없게 된다. 이러한 현상은 Insulin과 같은, 분자량이 작은 이량체 생리활성 폴리펩타이드에서 더욱 두드러지게 나타난다.
따라서 이량체 생리활성 폴리펩타이드를 이용한 지속성 단백질 결합체 제조의 경우, 3 arm PEG를 이용한 제조방법이 반드시 요구된다.
FSH 및 Insulin의 경우, 2 arm PEG 와 3 arm PEG를 사용한 제조 수율의 차이는 다음과 같다.
약리 활성 물질(API) PEG 형태 제조 수율(API 기준)
FSH 2 arm PEG 10%
3 arm PEG 32%
Insulin 2 arm PEG 3%
3 arm PEG 27%
실시예 7. 면역글로불린 Fc - PEG - FacVIIa (N) 결합체 제조
5K PropionALD(3) PEG(프로피온알데히드기를 3개 가지고 있는 PEG, NOF, 일본)를 면역글로불린 Fc의 N-말단에 페길화시키기 위하여 면역글로불린 Fc 와 PEG의 몰비를 1 : 2, 면역글로불린 Fc 농도를 6 mg/ml로 하여 4℃에서 4.5hrs 반응하였다. 이 때 반응은 pH 6.0 인 100mM 농도의 Potassium phosphate 완충액 내에서 이루어졌으며, 환원제인 20mM SCB (NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 SOURCE Q(LRC25 85ml, GE Healthcare)를 통하여 Mono-pegylated 면역글로불린 Fc를 정제하였다. 그 후 FVIIa과 면역글로불린 Fc-5K PEG 몰비를 1 : 9, 전체단백질농도를 20mg/ml로 하여 4℃에서 18시간 반응하였다. 반응액은 100mM Potassium phosphate pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다. Coupling 반응액은 두 개의 정제 컬럼을 거쳐 정제된다. 먼저 Coupling 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로불린 Fc-5K PEG를 제거하기 위하여 SOURCE Q (LRC25 85ml, GE Healthcare)를 이용하였다. 20mM Tris(pH7.5)에서 1M NaCl을 사용하여 Salt gradient를 주면 상대적으로 결합력이 약한 면역글로불린 Fc-5K 가 먼저 용출되고 전도도 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-FVIIa이 용출된다. 이후 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-FVIIa와 FVIIa 다량체 불순물 제거를 위해 RESOURCE ISO (GE Healthcare) column으로 이차 정제를 하였다. 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-FVIIa가 먼저 용출되고 그 뒤로 FVIIa 다량체 불순물이 용출된다.
Column : Source Q (LRC25 85ml, GE Healthcare)
유속 : 4 ml/분
구배 : A 0 →7% 1분 B, 7%→37% 80분 B (A: 20mM Tris pH7.5, B: A + 1M NaCl )
Column : RESOURCE ISO (Pre-packed 1ml, GE Healthcare)
유속 : 2 ml/분
구배 : B 100 →0% 60분 A (A: 20mM Tris pH7.5, B: A + 1.6M (NH4)2SO4)
약리 활성 물질( API ) PEG 형태 제조 수율( API 기준)
FacVIIa 2 arm PEG 제조 불가
3 arm PEG 약 3% 이상
실시예 8. 면역글로불린 Fc -3 arm PEG - Octreotide (N) 결합체 in - vivo 효력시험
면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Octreotide(N)를 SD 랫드에 피하 투여하여 시험동물의 체중변화와 시험동물에서의 시험물질에 의한 IGF-1 변화를 측정하였다. Octreotide는 말단비대증(acromegaly)을 적응증으로 두고 있으며 속효성 제품인 Sandostatin과 지속형제제인 Sandostatin-LAR(Novatis)로 시판되고 있다. 말단비대증은 hGH의 과분비에 의하여 성장억제가 저해되는 현상이다. Octreotide의 in vivo 시험으로 랫드 GH의 분비 저하로 체중증가 억제 및 GH 감소로 인한 랫드의 IGF-1 변화를 측정하는 시험이 이용되고 있으며 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Octreotide(N)의 효능도 랫드의 체중변화 및 IGF-1 변화를 측정하는 시험으로 진행되었다. 시험물질은 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Octreotide(N)를 0.5, 1.0, 2.0mg/kg 용량으로 단회투여하고 대조물질로 Sandostatin-LAR을 1.0, 2.0mg/kg으로 단회 투여하여 2주 동안의 변화를 측정하였다. 두 시험물질 모두 피하투여로 진행되었다.
시험결과 vehicle 투여군에 비하여 Sandostatin-LAR 1.0mg/kg 투여군은 약 3.7% 의 체중 감소를 보였으며 Sandostatin-LAR 2.0mg/kg 투여군은 약 8.9%의 체중감소를 보였다. 이에 비하여 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Octreotide(N)의 0.5mg/kg 투여군은 약 44.3%가 감소하였으며 1.0mg/kg 투여군은 약 40.1%, 2.0mg/kg 투여군은 55.1%의 체중감소를 보였다.
랫트의 IGF-1 변화는 랫드 IGF-1 ELISA kit를 이용하여 정량하였으며 혈중 IGF-1 level의 AUC를 기준으로 vehicle 대비 Sandostatin 1.0mg/kg 투여군은 약 15%, 2.0mg/kg 투여군은 약 11% 감소하였다. 이에 비하여 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Octreotide(N) 투여군은 0.5mg/kg 투여군이 약 23%, 1.0mg/kg 투여군이 약 18%, 2.0mg/kg 투여군이 약 25% 감소하는 것을 확인할 수 있었다[도2].
위 시험결과로 볼 때 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Octreotide(N)가 Sandostatin 지속형 제제인 Sandostatin-LAR에 비하여 높은 in vivo 효력을 가짐을 알 수 있다.
실시예 9. 면역글로불린 Fc -3- arm PEG - FSH (N) 결합체 in - vivo 효력시험
면역글로불린 Fc-3 arm PEG-FSH(N) 의 in vivo 효력 측정은 Steelman and Pohley 시험법 (Endocrinology 53, 504-616)에 따라 진행되었다. 세부적으로, 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-FSH(N) 의 in vivo 효력 측정을 위해 미성숙 암컷 SD 랫드 (21 days old)가 사용되었다. 시험물질은 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-FSH(N) 를 0.018, 0.075, 0.3 ug/rat 용량으로 단회투여하였고 대조물질로 천연형 시판품인 Follitrope를 4, 2, 1 IU/rat 용량으로 3일 동안 매일 투여하였다. Vehicle 투여군과 시험 물질 투여군 모두 13.3 U/rat 용량의 hcG (human chorionic gonadotropin)을 병용투여하였다. 각 시험 물질은 모두 0.25 mL/kg 투여 액량으로 피하투여 되었다. 시험 물질 최초 투여 후 72시간 후에, 시험 동물들을 안락사 시키고 난소를 적출하여 각 시험 동물에서 난소무게를 측정하였다.
[도3]에 의하면, 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-FSH(N) 는 농도 의존성을 보이며 면역글로불린 Fc-2 arm PEG-FSH(N) 와 동일한 효력을 보이는 것을 알 수 있다.
도 1은 이량체 단백질을 이용한 생리활성 폴리펩타이드 약물 결합체 대표도이다.
도 2는 면역글로불린 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Octreotide(N)결합체의 in vivo efficacy를 측정한 결과이다 (HM11760B는 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-Octreotide(N) 결합체, Sandostatin-LAR은 Sandostatin-LAR 임).
도 3은 면역글로불린 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-FSH(N) 결합체의 in vivo efficacy를 측정한 결과이다 (HM12160A는 면역글로불린 Fc-2 arm PEG-FSH(N) 결합체, HM12160B는 면역글로불린 Fc-3 arm PEG-FSH(N) 결합체).

Claims (27)

  1. 생리활성 폴리펩타이드 및 이량체 단백질이 반응기 말단이 세 개인 비펩타이드성 중합체를 통해 각각 공유결합으로 연결된 단백질 결합체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 이량체 단백질이 면역글로불린 Fc 영역인 것인 단백질 결합체.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화된 것인 단백질 결합체.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 단백질 결합체.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 단백질 결합체.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합(combination) 및 이들의 하이브리드(hybrid)의 Fc 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 이들의 조합(combination) 및 이들의 하이브리드의 Fc영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 당쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체(면역글로불린 Fc의 조합)인 단백질 결합체.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 단백질 결합체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 단백질 결합체.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리락트산, 폴 리락틱-글리콜산, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 단백질 결합체.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체의 반응기가 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 세 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 단백질 결합체.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체의 세 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역과 생리활성 폴리펩타이드의 N-말단, 라이신 잔기, 히스티딘 잔기 및 시스테인 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되는 반응기에 결합되어 있는 단백질 결합체.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 호르몬, 사이토카인, 인터루킨, 인터루킨 결합 단백질, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백 신, 구조단백질, 리간드 단백질, 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질, 이들의 유도체 및 유사체들로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체.
  17. 제16항에 있어서, 생리활성 폴리펩타이드가 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자류, 글루카콘-유사 펩타이드류, 엑센딘-4 펩타이드류, ANP, BNP, CNP, DNP, 지프로테인 관련 수용체 (Gprotein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터루킨 수용체류, 효소류, 인터루킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트 렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 소마토스타틴, 옥트레오타이드(소마토스타틴 아고니스트), 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자 류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질 결합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드가 인간 성장 호르몬, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 과립구 콜로니자극인자, 적혈구 생성인자, 엑센딘-4, 이미다졸 아세틸 엑센딘-4 펩타이드(엑센딘-4 아고니스트), 칼시토닌, 옥트레오타이드(소마토스타틴 아고니스트), BNP 및 Fab' 항체 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 단백질 결합체.
  19. (1) 세 말단의 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체의 세 말단 반응기 중 두 말단 반응기를 이량체 단백질의 N-말단 아미노기에 공유결합으로 연결하는 단계;
    (2) (1)에서 제조된 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체와 연결된 이량체 단백질을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 생리활성 폴리펩타이드를 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는, 생리활성 폴리펩타이드 및 이량체 단백질이 반응기 말단이 세 개인 비펩타이드성 중합체를 통해 각각 연결된 단 백질 결합체의 제조방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 이량체 단백질이 면역글로불린 Fc영역임을 특징으로 하는 단백질 결합체의 제조방법.
  21. 제 19항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체가 세말단에 알데히드 반응기를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 결합체의 제조방법.
  22. 제 19항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 이량체 단백질과 비펩타이드성 중합체의 반응 몰비가 1:2 내지 1:5인 단백질 결합체의 제조방법.
  23. 제 19항에 있어서, 상기 단계 (3)의 단계 (2)에서 수득된 이량체 단백질을 포함하는 연결체 : 생리활성 폴리펩타이드의 반응 몰비가 1:0.5 내지 1:0.05인 단백질 결합체의 제조방법.
  24. 제 19항에 있어서, 상기 단계 (1) 및 단계 (3)의 반응이 환원제의 존재하에서 수행되는 단백질 결합체의 제조방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 환원제가 나트륨 시아노 보로하이드라이 드(NaCNBH3), 수소화 붕소나트륨, 디메틸아민 붕산염 및 피리딘 붕산염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 결합체의 제조방법.
  26. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항의 단백질 결합체 또는 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  27. 제 19항 내지 제25항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 생성된 단백질 결합체.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101479937B1 (ko) * 2013-05-24 2015-01-12 주식회사 에스에프에이 글라스와 마스크의 정렬장치
WO2017052321A1 (ko) * 2015-09-25 2017-03-30 한미약품 주식회사 다수의 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는, 단백질 결합체
KR20180019634A (ko) * 2018-02-14 2018-02-26 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
US11168109B2 (en) 2012-03-08 2021-11-09 Hanmi Science Co., Ltd. Process for preparation of physiologically active polypeptide complex
US11434271B2 (en) 2011-11-04 2022-09-06 Hanmi Science Co., Ltd. Method for preparing physiologically active polypeptide complex

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL1759001T3 (pl) 2004-04-21 2011-09-30 Alexion Pharma Inc Koniugaty dostarczane do kości i sposób ich zastosowania do nakierowywania białek do kości
UA101670C2 (ru) 2008-07-23 2013-04-25 Ханми Сайенс Ко., Лтд. Полипептидный комплекс, содержащий непептидильный полимер, который имеет три функциональных конца
AR081066A1 (es) * 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US9981017B2 (en) 2010-04-02 2018-05-29 Hanmi Science Co., Ltd. Insulin conjugate using an immunoglobulin fragment
AR081755A1 (es) * 2010-04-02 2012-10-17 Hanmi Holdings Co Ltd Formulacion de accion prolongada de la hormona estimuladora de los foliculos donde se usa un fragmento de inmunoglobulina, metodo de preparacion y metodo para tratar a un sujeto que sufre un trastorno reproductivo
EA201291181A1 (ru) 2010-05-06 2013-05-30 Новартис Аг Композиции и способы применения терапевтических поливалентных антител против белка, родственного рецептору липопротеинов низкой плотности 6 (lrp6)
ES2659406T3 (es) 2010-05-06 2018-03-15 Novartis Ag Composiciones y procedimientos de uso para anticuerpos terapéuticos contra la proteína 6 relacionada con las lipoproteínas de baja densidad (LRP6)
KR20120002129A (ko) * 2010-06-30 2012-01-05 한미홀딩스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 제７인자（Ｆａｃｔｏｒ Ⅶａ）약물 결합체
KR101337797B1 (ko) 2010-07-14 2013-12-06 한미사이언스 주식회사 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제
KR101303388B1 (ko) * 2010-10-26 2013-09-03 한미사이언스 주식회사 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제
CA2930801C (en) * 2010-11-05 2019-05-28 Rinat Neuroscience Corporation Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
WO2012088608A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Enobia Canada Limited Partnership Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
UA113626C2 (xx) 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
PT2726092T (pt) 2011-06-28 2019-10-08 Lp Inhibrx Polipéptidos de fusão serpina e métodos para a sua utilização
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
BR112014000474A2 (pt) * 2011-07-08 2017-02-21 Bayer Ip Gmbh proteínas de fusão libertadoras de relaxina e suas utilizações
WO2013036032A1 (en) * 2011-09-05 2013-03-14 Hanmi Science Co., Ltd. A pharmaceutical composition for treating cancer, comprising interferon alpha conjugate
EP2773669B1 (en) 2011-11-04 2018-03-28 Novartis AG Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) - half life extender constructs
KR101665009B1 (ko) * 2012-03-09 2016-10-11 한미사이언스 주식회사 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2013148871A1 (en) * 2012-03-28 2013-10-03 Amylin Pharmaceuticals, Llc Engineered polypeptides
US10052366B2 (en) 2012-05-21 2018-08-21 Alexion Pharmaceuticsl, Inc. Compositions comprising alkaline phosphatase and/or natriuretic peptide and methods of use thereof
CN110590903A (zh) * 2013-03-05 2019-12-20 韩美药品株式会社 高产率制备生理活性多肽复合物的改进方法
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
AR096891A1 (es) 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
EP3027224B1 (en) 2013-07-31 2020-06-03 Rinat Neuroscience Corp. Engineered polypeptide conjugates using transglutaminase
CA2944138C (en) * 2014-03-31 2023-06-20 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method for improving solubility of protein and peptide by using immunoglobulin fc fragment linkage
CA2946488C (en) 2014-04-25 2021-11-09 Rinat Neuroscience Corp. Antibody-drug conjugates with high drug loading
WO2016007873A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating craniosynostosis
KR20240045379A (ko) 2014-12-05 2024-04-05 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 재조합 알칼리성 포스파타제를 이용한 발작 치료
AU2016211447B2 (en) 2015-01-28 2021-09-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating a subject with an alkaline phosphatase deficiency
AR105616A1 (es) 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
JP6983075B2 (ja) 2015-06-02 2021-12-17 ノヴォ ノルディスク アー／エス 極性の組換え延長部を有するインスリン
US11123436B2 (en) 2015-07-24 2021-09-21 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Method of preparing physiologically active polypeptide conjugate
WO2017031114A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of alkaline phosphatases
WO2017052329A1 (en) * 2015-09-24 2017-03-30 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Protein complex by use of a specific site of an immunoglobulin fragment for linkage
US11229686B2 (en) 2015-09-28 2022-01-25 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Reduced frequency dosage regimens for tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP)-enzyme replacement therapy of hypophosphatasia
MA43348A (fr) 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
WO2017074466A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating craniosynostosis in a patient
WO2017155569A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in children
KR20220162816A (ko) 2016-04-01 2022-12-08 알렉시온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 알칼리성 포스파타아제로 근육 약화의 치료
US10898549B2 (en) 2016-04-01 2021-01-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia in adolescents and adults
WO2017214130A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Metal impact on manufacturing of alkaline phosphatases
WO2018035420A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating tracheobronchomalacia
US11224637B2 (en) 2017-03-31 2022-01-18 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypophosphatasia (HPP) in adults and adolescents
WO2018185131A2 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Novo Nordisk A/S Oligomer extended insulin-fc conjugates
WO2019040674A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Sanabio, Llc SOLUBLE INTERFERON RECEPTORS AND USES THEREOF
CN107540748B (zh) * 2017-09-15 2020-07-14 北京伟杰信生物科技有限公司 长效重组猪fsh融合蛋白及其制备方法与应用
EP3773684A1 (en) 2018-03-30 2021-02-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing of glycoproteins
US11267858B2 (en) * 2019-05-31 2022-03-08 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment using G-CSF protein complex
CN114478800B (zh) * 2021-02-05 2022-10-11 华南理工大学 基于血清白蛋白的融合蛋白、纳米组装体及其制备方法和应用

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
ES2251009T3 (es) 1990-06-28 2006-04-16 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Proteinas de fusion con partes de inmunoglobulinas, su preparacion y uso.
WO1992013947A1 (en) 1991-02-08 1992-08-20 Progenics Pharmaceuticals, Inc. CD4-GAMMA2 AND CD4-IgG2 CHIMERAS
SG47099A1 (en) 1991-03-15 1998-03-20 Amgen Boulder Inc Pegylation of polypeptides
WO1993002105A1 (en) * 1991-07-19 1993-02-04 Hybritech Incorporated Trifunctional compounds having specificity for multi-drug resistant cells
EP0533006A1 (en) 1991-09-18 1993-03-24 F.Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft Chimaeric interleukin 5-receptor/immunoglobulin polypeptides
US5399671A (en) 1992-11-18 1995-03-21 Kluger; Ronald Specifically crosslinked hemoglobin with free functionality
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US6410008B1 (en) 1994-12-12 2002-06-25 Beth Israel Hospital Association Chimeric IL-10 proteins and uses thereof
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
TW555765B (en) * 1996-07-09 2003-10-01 Amgen Inc Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
AU766190B2 (en) 1998-10-16 2003-10-09 Biogen Idec Ma Inc. Interferon-beta fusion proteins and uses
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6924264B1 (en) 1999-04-30 2005-08-02 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Modified exendins and exendin agonists
ES2317843T3 (es) 1999-07-13 2009-05-01 Bolder Biotechnology, Inc. Proteinas de fusion de eritropoyetina-inmunoglobulina.
US6756480B2 (en) * 2000-04-27 2004-06-29 Amgen Inc. Modulators of receptors for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related protein
WO2002046227A2 (en) 2000-12-07 2002-06-13 Eli Lilly And Company Glp-1 fusion proteins
AU2002357072A1 (en) * 2001-12-07 2003-06-23 Centocor, Inc. Pseudo-antibody constructs
US20040023848A1 (en) * 2002-02-27 2004-02-05 Thomas Boehm Compositions for the treatment, prevention, and diagnosis of gastrointestinal and other infections
EP1569690B1 (en) 2002-12-13 2011-07-27 Mitra Medical Technology AB Antilymphoma targeting agents with effector and affinity functions linked by a trifunctional reagent
KR100775343B1 (ko) * 2003-11-13 2007-11-08 한미약품 주식회사 면역글로불린 Ｆｃ 영역을 캐리어로 포함하는 약제학적조성물
EP1789092A2 (en) * 2004-08-31 2007-05-30 Pharmacia & Upjohn Company LLC Glycerol branched polyethylene glycol human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
US7884075B2 (en) * 2004-12-27 2011-02-08 Baxter International Inc. Polymer-factor VIII-von Willebrand factor-conjugates
WO2006076471A2 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
US7833979B2 (en) * 2005-04-22 2010-11-16 Amgen Inc. Toxin peptide therapeutic agents
AU2006280587B2 (en) * 2005-08-16 2011-02-24 Hanmi Science Co., Ltd. A method for the mass production of immunoglobulin Fc region deleted initial methionine residues
ES2804129T3 (es) 2005-11-23 2021-02-03 Ventana Med Syst Inc Conjugado anticuerpo-enzima
JP2009536963A (ja) * 2006-05-12 2009-10-22 ドン・ア・ファーム・カンパニー・リミテッド ポリエチレングリコール−インターフェロンα結合体
KR20090057383A (ko) * 2006-09-15 2009-06-05 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 다기능성 링커를 포함하는 표적화된 고분자 전구약물
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
US8106154B2 (en) * 2007-01-31 2012-01-31 Affymax, Inc. Nitrogen-based linkers for attaching modifying groups to polypeptides and other macromolecules
UA101670C2 (ru) * 2008-07-23 2013-04-25 Ханми Сайенс Ко., Лтд. Полипептидный комплекс, содержащий непептидильный полимер, который имеет три функциональных конца

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11434271B2 (en) 2011-11-04 2022-09-06 Hanmi Science Co., Ltd. Method for preparing physiologically active polypeptide complex
US11168109B2 (en) 2012-03-08 2021-11-09 Hanmi Science Co., Ltd. Process for preparation of physiologically active polypeptide complex
KR101479937B1 (ko) * 2013-05-24 2015-01-12 주식회사 에스에프에이 글라스와 마스크의 정렬장치
WO2017052321A1 (ko) * 2015-09-25 2017-03-30 한미약품 주식회사 다수의 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는, 단백질 결합체
KR20180019634A (ko) * 2018-02-14 2018-02-26 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법

Also Published As

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