TW201323442A - 低密度脂蛋白相關蛋白６（ｌｒｐ６）－半衰期延長構築體 - Google Patents

低密度脂蛋白相關蛋白６（ｌｒｐ６）－半衰期延長構築體 Download PDF

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Abstract

本發明係關於結合至LRP6受體之LRP6構築體。LRP6構築體包含至少一個LRP6結合部分及半衰期延長分子，使得LRP6構築體在不增強Wnt信號之情況下抑制Wnt信號傳導路徑。LRP6構築體亦具有增長之半衰期以為治療效益提供更多時間。

Description

低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)-半衰期延長構築體
本發明係關於一種結合至LRP6受體之LRP6構築體。LRP6構築體包含至少一個LRP6結合部分及半衰期延長分子，使得LRP6構築體在不增強Wnt信號之情況下抑制Wnt信號傳導路徑。LRP6構築體亦具有增長之半衰期以為治療效益提供更多時間。
相關申請案
本申請案主張2011年11月4日申請之美國臨時申請案第61/555,848號之優先權，其內容以全文引用之方式併入本文中。
Wnt/β-索烴素路徑(Wnt/β-catenin pathway)經由調變β-索烴素之蛋白質穩定性而調節發育期間之多種生物過程及組織內穩定。該路徑亦與許多人類癌症有關(參見Clevers等人，(2006)Cell 127：469-480；及Logan等人，(2004)Annu.Rev Cell Dev.Biol 20：781-810)。
Wnt信號經由兩種不同的受體類型(蛇形受體捲曲蛋白(Frizzled)及單次跨膜蛋白LRP5或LRP6)跨質膜轉導。Wnt蛋白質促進捲曲蛋白-LRP5/6信號傳導複合物之裝配，且利用GSK3及酪蛋白激酶I誘導細胞質PPPSPxS基元之磷酸化。經磷酸化之LRP5/6結合至軸蛋白(Axin)且使β-索烴素降解複合物不活化。經穩定之β-索烴素進入核，結合至TCF家族轉錄因子，且開始轉錄。
LRP5/6之較大細胞外域含有四個YWTD型β-螺旋槳區，該等β-螺旋槳區各自後接EGF樣域及LDLR域。各螺旋槳區含有六個YWTD基元，該等基元形成六葉狀β-螺旋槳結構。生物化學研究表明Wnt蛋白質與捲曲蛋白及LRP6兩者以物理方式相互作用，且誘導捲曲蛋白-LRP6信號傳導複合物之形成(Semenov等人，(2001)Curr.Biol 11,951-961；Tamai等人(2000)Nature 407,530-535)。除Wnt蛋白質以外，LRP5/6之較大細胞外域結合至多種分泌型Wnt調節劑，包括Wnt拮抗劑、DKK1及硬化蛋白(Sclerostin；SOST)及Wnt促效劑R-脊椎蛋白(R-Spondin)。
儘管LRP6之抗體已經鑑別，但經IgG形式化之分子之治療性質可受到若干因素限制，該等因素包括因標靶組織(諸如腫瘤)之較大尺寸及不良血管形成所致之有限組織穿透(Schmidt及Wittrup,(2009)Mol.Cancer Ther.8,2861-71)。此外，對於腫瘤學用途而言，免疫抑制性腫瘤微環境可抑制Fc介導之效應功能(Dougan及Dranoff,2009,Curr Protocol Immunol第20章：第20.11單元)。因此，需要新型蛋白質治療形式。然而，小於50 kDa至60 kDa之重組蛋白質之治療功效可受到因例如腎臟清除作用及內皮細胞之內飲作用所致之較短血清半衰期的限制。
因此，需要新型LRP6抗體形式及方法來延長此等抗體形式之血清半衰期，以便能夠產生有效治療。具體而言，需要抑制Wnt信號傳導路徑、尤其治療人類癌症之新型LRP6抗體形式。
本發明提供新穎LRP6構築體，其在不增強Wnt信號之情況下抑制Wnt信號傳導且展示增長之半衰期。特定言之，本發明提供LRP6結合物，其包含至少一個LRP6結合部分及至少一個半衰期延長劑，使得LRP6構築體結合至LRP6，且在不明顯增強Wnt信號之情況下抑制Wnt信號傳導，且具有增長之半衰期(例如至少約5小時、至少10小時、至少15小時、至少20小時、至少25小時、至少30小時、至少35小時、至少40小時或40小時以上)。
因此，在一個態樣中，本發明係關於一種經分離之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其包含結合至LRP6之第一及第二LRP6結合部分以及半衰期延長分子，其中半衰期延長分子係選自由PEG、Fc及HSA組成之群，其中第一及第二LRP6結合部分連接至半衰期延長劑之N端及C端，其中LRP6構築體抑制典型Wnt信號轉導路徑；且其中LRP6構築體展示在未經阻斷之LRP6結合蛋白存在下不明顯增強Wnt信號。在一個實施例中，LRP6結合部分係選自由以下組成之群：抗體、雙特異性單鏈Fv((scFv')2)分子、單域抗體、雙功能抗體、三功能抗體、激素、Fab片段、F(ab')2分子、scFab片段及串聯scFv(taFv)片段。在一個實施例中，LRP6結合部分為單鏈Fv分子(scFv)。在一個實施例中，LRP6構築體結合至LRP6之一個以上螺旋槳區，其中螺旋槳區係選自由螺旋槳1及螺旋槳3組成之群。在一個實施例中，第一LRP6結合部分連接至半衰期延長劑之N端 且結合至LRP6之螺旋槳1區，且第二LRP6結合部分連接至半衰期延長劑之C端且結合至LRP6之螺旋槳3區。在另一實施例中，第一LRP6結合部分連接至半衰期延長劑之C端且結合至LRP6之螺旋槳1區，且第二LRP6結合部分連接至半衰期延長劑之N端且結合至LRP6之螺旋槳3區。在一個實施例中，LRP6結合蛋白為選自由Wnt 1、Wnt 3及Wnt 3a組成之群的Wnt結合蛋白。在一個實施例中，LRP6結合部分經由連接子連接至半衰期延長劑之N端及C端，該連接子選自由以下組成之群：Fc連接子、鉸鏈連接子、Gly-Ser連接子、Ala連接子及KTHT連接子。在另一實施例中，LRP6結合部分藉由直接融合至半衰期延長劑而連接至半衰期延長劑之N端及C端。在一個實施例中，如由Wnt配位體誘導之磷酸化分析所評估，LRP6構築體抑制LRP6之磷酸化。在一個實施例中，LRP6構築體具有以下功能活性：耗乏細胞群體、抑制或減少細胞群體之增殖、抑制或減少來自細胞群體之發炎介體之分泌、抑制或減少來自細胞群體之細胞質顆粒之分泌，其中該細胞群體係選自由腫瘤細胞及Wnt依賴性細胞組成之群。在一個實施例中，與不具有半衰期延長劑之LRP6結合部分相比，LRP6構築體展示約5小時之增長之半衰期。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其包含結合至LRP6之第一及第二LRP6單鏈Fv分子(scFv)以及人血清白蛋白，其中第一及第二scFv分子連接至人血清白蛋白之N端及C端，其中 LRP6構築體抑制典型Wnt信號轉導路徑，且其中LRP6構築體展示在LRP6結合蛋白存在下不明顯增強Wnt信號。在一個實施例中，第一LRP6 scFv連接至人血清白蛋白之N端且結合至LRP6之螺旋槳1區，且第二LRP6 scFv連接至人血清白蛋白之C端且結合至LRP6之螺旋槳3區。在另一實施例中，第一LRP6 scFv連接至人血清白蛋白之C端且結合至LRP6之螺旋槳1區，且第二LRP6 scFv連接至人血清白蛋白之N端且結合至LRP6之螺旋槳3區。在一個實施例中，LRP6結合蛋白為選自由Wnt 1、Wnt 3及Wnt 3a組成之群的Wnt結合蛋白。在一個實施例中，第一及第二LRP6 scFv經由附接連接子間接連接至人血清白蛋白之N端及C端，該附接連接子選自由以下組成之群：Fc連接子、鉸鏈連接子、Gly-Ser連接子、Ala連接子及KTHT連接子。在另一實施例中，第一及第二LRP6 scFv藉由直接融合至人血清白蛋白而直接連接至人血清白蛋白之N端及C端。在一個實施例中，人血清白蛋白係選自由以下組成之群：突變人血清白蛋白、人血清白蛋白之片段。在一個實施例中，突變人血清白蛋白包含突變C34S及N503Q。在一個實施例中，人血清白蛋白之片段包含至少一個選自由以下組成之群的人血清白蛋白之域：DI、DII、DIII及DIV。在一個實施例中，scFv片段包含至少一個胺基酸突變，與未突變之scFv片段相比，該至少一個胺基酸突變改良scFv之穩定性，其中胺基酸突變係選自圖32至圖35。在一個實施例中，scFv片段結合至LRP6之螺旋槳1區且包含至少一個胺基酸突 變，與未突變之scFv片段相比，該至少一個胺基酸突變改良scFv之穩定性，其中胺基酸突變係選自由I34M及S49A組成之群。在另一實施例中，scFv片段結合至LRP6之螺旋槳3區且包含至少一個胺基酸突變，與未突變之scFv片段相比，該至少一個胺基酸突變改良scFv之穩定性，其中胺基酸突變為M100F。在另一實施例中，scFv片段結合至LRP6之螺旋槳1區且包含至少一個胺基酸突變，與未突變之scFv片段相比，該至少一個胺基酸突變改良scFv之穩定性，其中胺基酸突變係選自由I34M及S49A組成之群；且scFv片段結合至LRP6之螺旋槳3區且包含至少一個胺基酸突變，與未突變之scFv片段相比，該至少一個胺基酸突變改良scFv之穩定性，其中胺基酸突變為M100F。在一個實施例中，如由Wnt配位體誘導之磷酸化分析所評估，LRP6構築體抑制LRP6之磷酸化。在另一實施例中，LRP6構築體具有以下功能活性：耗乏細胞群體、抑制或減少細胞群體之增殖、抑制或減少來自細胞群體之發炎介體之分泌、抑制或減少來自細胞群體之細胞質顆粒之分泌，其中該細胞群體係選自由腫瘤細胞及Wnt依賴性細胞組成之群。在一個實施例中，與不具有半衰期延長劑之LRP6結合部分相比，LRP6構築體展示約5小時之增長之半衰期。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其包含SEQ ID NO：293或包含與SEQ ID NO：293至少95%序列一致性之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離之低密度脂蛋 白相關蛋白6(LRP6)構築體，其包含SEQ ID NO：295或包含與SEQ ID NO：295至少95%序列一致性之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明係關於一種核酸，其包含編碼低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)之核苷酸序列。
在另一態樣中，本發明係關於一種核酸，其包含編碼低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體之核苷酸序列，該低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體包含SEQ ID NO：293或包含與SEQ ID NO：293至少98%序列一致性之核苷酸序列。
在另一態樣中，本發明係關於一種核酸，其包含編碼低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體之核苷酸序列，該低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體包含SEQ ID NO：295或包含與SEQ ID NO：295至少98%序列一致性之核苷酸序列。
在另一態樣中，本發明係關於一種載體，其包含編碼LRP6構築體之核酸。
在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明係關於一種製備如技術方案1之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體之方法，該方法包含：(a)提供結合至LRP6靶受體之第一結合部位之第一單鏈Fv分子；(b)提供結合至LRP6靶受體之第二結合部位之第二單鏈Fv分子；及(c)使第一scFv及第二scFv直接或間接 連接至半衰期延長分子，其中LRP6構築體抑制典型Wnt信號轉導路徑，且其中LRP6構築體展示在LRP6結合蛋白存在下不明顯增強Wnt信號。
在另一態樣中，本發明係關於一種使用低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體治療由典型Wnt信號傳導路徑介導之疾病的方法。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療癌症之方法，該方法包含選擇患有LRP6表現性癌症之個體，向有需要之個體投與有效量之包含低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體的組合物。在一個實施例中，個體為人類。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療癌症之方法，該方法包含選擇患有LRP6表現性癌症之個體，向有需要之個體投與有效量之包含如前述技術方案中任一項之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體的組合物，其中癌症係選自由以下組成之群：乳癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、肝癌胃癌、前列腺癌、急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌及黑色素瘤。
在另一態樣中，本發明係關於如前述技術方案中任一項之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體之用途，其用於製造供治療癌症用之藥物，該癌症選自由以下組成之群：乳癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、肝癌胃癌、前列腺癌、急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌及黑色素瘤。
在另一態樣中，本發明係關於一種低密度脂蛋白相關蛋 白6(LRP6)構築體LRP6，其用作藥物。在另一態樣中，本發明係關於一種低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其具有SEQ ID NO：293，適用於治療由典型Wnt信號傳導路徑介導之癌症。在另一態樣中，本發明係關於一種低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其具有SEQ ID NO：295，適用於治療由典型Wnt信號傳導路徑介導之癌症。在另一態樣中，本發明係關於一種低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其具有SEQ ID NO：293，用作藥物。在另一態樣中，本發明係關於一種低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其具有SEQ ID NO：295，用作藥物。
定義
為使本發明可更容易地理解，首先定義某些術語。在整個實施方式中闡述其他定義。
術語「LRP6」係指如寄存編號NP002327中定義之人類低密度脂蛋白相關蛋白6。
如本文所用之片語「LRP6構築體」係指包含至少一個LRP6結合部分及至少一個半衰期延長分子之分子。LRP6結合部分可為結合至LRP6之至少一個區(諸如LRP6之螺旋槳區)之任何分子。LRP6構築體結合至LRP6且在不增強Wnt信號之情況下抑制Wnt信號傳導路徑。此外，與單獨LRP6結合部分相比，LRP6構築體展示增長之活體外及活體內半衰期(例如增長至少5小時、至少10小時、至少15小時、至少20小時、至少25小時、至少30小時、至少35小 時、至少40小時或40小時以上)。
術語「LRP6結合部分」係指特異性結合至LRP6標靶抗原決定基、抗原、配位體或受體之任何分子。LRP6結合部分包括(但不限於)抗體(例如單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類化抗體及嵌合抗體)、抗體片段(例如Fab片段、Fab'2、scFv抗體、SMIP、域抗體、雙功能抗體、微型抗體、scFv-Fc、親和體、奈米抗體及域抗體)、受體、配位體、適體及具有已知結合搭配物之其他分子。
如本文所用之術語「抗體」係指與LRP6抗原決定基相互作用(例如藉由結合、位阻、穩定化/去穩定化、空間分佈)且抑制信號轉導之完整抗體。天然產生之「抗體」為包含經二硫鍵相互連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的醣蛋白。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域(CH1、CH2及CH3)。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域(CL)。VH及VL區可進一步再分成穿插有較保守區(稱為構架區(FR))之高變區(稱為互補決定區(CDR))。各VH及VL由自胺基端至羧基端按以下順序排列之三個CDR及四個FR組成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白結合至宿主組織或因子，包括免疫系統之多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(C1q)。
舉例而言，抗體可為人類抗體、人類化抗體、雙特異性 抗體、嵌合抗體或具有抗體樣性質之蛋白質骨架(諸如纖維結合蛋白或錨蛋白重複序列)。抗體可具有以下同型中之任一者：IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)、IgM、IgA(例如IgA1、IgA2及IgAsec)、IgD或IgE。
輕鏈及重鏈均分成結構及功能同源之區。術語「恆定」及「可變」就其功能使用。就此而言，應理解輕鏈(VL)及重鏈(VH)部分之可變域決定抗原識別及特異性。另一方面，輕鏈(CL)及重鏈(CH1、CH2或CH3)之恆定域賦予重要生物學性質，諸如分泌、介胎盤移動性、Fc受體結合、補體結合及其類似性質。按照慣例，恆定區域之編號隨著其逐漸遠離抗體之抗原結合部位或胺基端而增大。N端為可變區且C端為恆定區；CH3及CL域實際上分別包含重鏈及輕鏈之羧基端。
如本文所用之術語「抗體片段」係指保留與LRP6抗原決定基特異性特異性相互作用(例如藉由結合、位阻、穩定化/去穩定化、空間分佈)之能力且抑制信號轉導之抗體的一或多個片段。抗體之抗原決定基結合功能可利用全長抗體之片段進行。涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」內之結合片段的實例包括(但不限於)：(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，一種在鉸鏈區處包含由二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其由VH及CH1域組成；(iv)scFab，其由VL、VH、CL及CH1域組成；(v)dAb，其包括VH及VL域；(vi)dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546 (1989))，其由VH域組成；(vii)dAb，其由VH或VL域組成；(viii)經分離之互補決定區(CDR)；及(ix)兩個或兩個以上經分離之CDR之組合，其可視情況利用合成連接子連接。此等抗體片段係使用熟習此項技術者已知之習知技術獲得，且以與完整抗體相同之方式針對效用對片段進行篩檢。抗體片段可藉由重組DNA技術或藉由完整免疫球蛋白之酶促或化學裂解進行製造。
如本文所用之術語「scFv」係指VL及VH使用重組方法或利用合成連接子連接在一起，使得其能夠被製成單個蛋白質鏈，其中VL及VH區成對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人，Science 242：423-426(1988)及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：5879-5883(1988))。
術語「半衰期延長分子」係指賦予所連接之分子另一功能性之生物學或化學實體。在一特定實施例中，半衰期延長劑為多肽(例如人血清白蛋白(HSA))或化學實體(例如聚乙二醇(PEG))，其增長LRP6結合部分之半衰期。如由本文揭示之分析所測定，半衰期延長分子可使LRP6結合部分之半衰期增長至少約5小時、至少10小時、至少15小時、至少20小時、至少25小時、至少30小時、至少35小時、至少40小時或40小時以上。
如本文所用之片語「Wnt信號傳導路徑」係指典型Wnt路徑，其中分泌型蛋白質配位體之Wnt家族之成員結合LRP與捲曲蛋白(FZD)之受體複合物，允許β-索烴素易位至 核中，與LEF/TCF轉錄因子相互作用，且活化靶基因表現。如本文所述，Wnt信號傳導路徑可使用Wnt報導體基因分析或Wnt引導之信號傳導(例如LRP6磷酸化、β-索烴素穩定化及核易位、細胞增殖/存活)之其他量測進行量測。
片語「Wnt 1信號傳導路徑」係指藉由LRP6與Wnt1配位體及Wnt1結合性配位體類(諸如Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt9a、Wnt10a或Wnt10b)相互作用而活化之典型Wnt路徑。
片語「Wnt 3信號傳導路徑」係指藉由LRP6與Wnt3或Wnt3a配位體相互作用而活化之典型Wnt路徑。
如本文所用之片語「經分離之LRP6構築體」係指實質上不含具有不同抗原特異性之其他LRP6構築體之LRP6構築體(例如，特異性結合LRP6之經分離之LRP6構築體實質上不含特異性結合除LRP6以外之抗原的構築體)。此外，經分離之LRP6構築體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物。然而，特異性結合LRP6之經分離之LRP6構築體可具有對其他抗原(諸如來自其他物種之LRP6分子)之交叉反應性。如本文所用之片語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指具有實質上相同胺基酸序列或來源於相同遺傳來源之多肽，包括抗體、抗體片段、雙特異性抗體等。此術語亦包括單分子組分之抗體分子之製備物。單株抗體組分展示對於特定抗原決定基之單一結合特異性及親和力。
如本文所用之片語「人類抗體」包括具有構架區及CDR區均來源於人類來源之序列之可變區的抗體。此外，若抗 體含有恆定區，則恆定區亦來源於該等人類序列，例如人類生殖系序列、或突變型人類生殖系序列或含有來源於人類構架序列分析之共同構架序列之抗體，例如Knappik等人(2000.J.Mol Biol 296,57-86)中所述。可使用熟知編號方案定義免疫球蛋白可變域(例如CDR)之結構及位置，該等編號方案例如為Kabat編號方案、Chothia編號方案或Kabat與Chothia之組合(參見例如Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services(1991).Kabat等人編；Al Lazikani等人，(1997)J.Mol.Bio.273：927948)；Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公開案第91-3242號U.S.Department of Health and Human Services；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883；及Al-Lazikani等人，(1997)J.Mol.Biol.273：927-948)。
人類抗體及人類抗體片段可能包括不由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或特定位點突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入之突變，或保守性取代，以促進穩定性或製造)。然而，如本文所用之術語「人類抗體」及「人類抗體片段」不欲包括來源於其他哺乳動物物種(諸如小鼠)之生殖系的CDR序列已接枝於人類構架序列上之抗體。
如本文中所用之片語「重組人類抗體」包括所有經由重組方式製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如自人類 免疫球蛋白基因之轉殖基因或轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備之融合瘤分離之抗體，自經轉型以表現人類抗體之宿主細胞(例如由轉染瘤)分離之抗體，自重組組合人類抗體文庫分離之抗體，及經由涉及剪接所有或一部分人類免疫球蛋白基因序列至其他DNA序列之任何其他方式而製備、表現、產生或分離之抗體。該等重組人類抗體具有構架區及CDR區來源於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，該等重組人類抗體可經受活體外突變誘發(或當使用人類Ig序列之動物轉殖基因時，則為活體內體細胞突變誘發)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為如下序列，當源自人類生殖系VH及VL序列且與人類生殖系VH及VL序列相關時，其可能不活體內天然存在於人類抗體生殖系所有組成部分內。
如本文所用之術語「附接連接子」係指由單獨或組合使用之胺基酸(諸如丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸殘基)組成之肽連接子，以使至少一個LRP6結合部分(例如scFv)連接至半衰期延長劑。在一個實施例中，連接子為Gly/Ser連接子且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Ser)2，亦即(Gly2Ser)n，其中n為等於或大於1之正整數。舉例而言，n=1，n=2，n=3，n=4，n=5及n=6，n=7，n=8，n=9及n=10。在一個實施例中，連接子包括(但不限於)(Gly4 Ser)4或(Gly4 Ser)3。在另一實施例中，連接子Glu及Lys殘基穿插於Gly-Ser連接子內以達成較佳溶解度。在另一實施例中，連接子包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)之多個重複序列。在另一 實施例中，連接子包括(Gly3Ser)+(Gly4Ser)+(GlySer)之組合及倍數。在另一實施例中，Ser可經Ala置換，例如(Gly4Ala)或(Gly3Ala)。在另一實施例中，連接子包含Gly、Ser及Pro之任何組合。在另一實施例中，連接子包含基元(GluAlaAlaAlaLys)n，其中n為等於或大於1之正整數。在另一實施例中，連接子為包含胺基酸序列Ala-Ala-Xn之Ala連接子，其中X可為任何胺基酸(例如Ala、Gly、Ser、Glu或Val)且n為1至20之整數。在另一實施例中，不使用附接連接子來使至少一個LRP6結合部分(例如scFv)連接至半衰期延長劑。
如本文所用之術語「域內連接子」係指由單獨或組合使用之胺基酸(諸如丙胺酸、甘胺酸及絲胺酸殘基)組成之肽連接子，以使多個LRP6結合部分連接在一起。在一個實施例中，連接子為Gly/Ser連接子且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Ser)2，亦即(Gly2Ser)n，其中n為等於或大於1之正整數。舉例而言，n=1，n=2，n=3，n=4，n=5及n=6，n=7，n=8，n=9及n=10。在一個實施例中，連接子包括(但不限於)(Gly4 Ser)4或(Gly4 Ser)3。在另一實施例中，連接子Glu及Lys殘基穿插於Gly-Ser連接子內以達成較佳溶解度。在另一實施例中，連接子包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)之多個重複序列。在另一實施例中，連接子包括(Gly3Ser)+(Gly4Ser)+(GlySer)之組合及倍數。在另一實施例中，Ser可經Ala置換，例如(Gly4Ala)或(Gly3Ala)。在另一實施例中，連接子包含Gly、Ser及Pro之任何組合。在 另一實施例中，連接子包含基元(GluAlaAlaAlaLys)n，其中n為等於或大於1之正整數。在另一實施例中，連接子為包含胺基酸序列Ala-Ala-Xn之Ala連接子，其中X可為任何胺基酸(例如Ala、Gly、Ser、Glu或Val)且n為1至20之整數。
如本文所用之術語「結合部位」包含LRP6靶受體上LRP6結合部分所選擇性結合之區域。舉例而言，LRP6上之結合部位包括β-螺旋槳1結合域、β-螺旋槳2結合域、β-螺旋槳3結合域及β-螺旋槳4結合域。
如本文所用之術語「抗原決定基」係指能夠以較高親和力結合至免疫球蛋白之任何決定子。抗原決定基為由LRP6結合部分(例如scFv)結合之LRP6受體之區域。包括抗原決定基之給定多肽(例如LRP6)之區域可使用此項技術中熟知之許多抗原決定基定位技術進行鑑別。參見例如Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris編，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey中之Epitope Mapping Protocols。舉例而言，藉由在固體支撐物上同時合成大量肽(該等肽對應於蛋白分子之部分)，且當該等肽仍附接至支撐物時使該等肽與抗體反應，可測定線性抗原決定基。該等技術為此項技術中已知且描述於以下中：美國專利第4,708,871號；Geysen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：3998-4002；Geysen等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：78-182；Geysen等人，(1986)Mol.Immunol.23：709-715。類似地，藉由測定胺基酸之空間構 形，諸如藉由例如x射線晶體分析法及二維核磁共振，易於鑑別構形抗原決定基。參見例如上述Epitope Mapping Protocol。使用標準抗原性及親水性曲線，諸如使用例如可購自Oxford Molecular Group之Omiga 1.0版軟體程式計算之曲線，亦可鑑別蛋白質之抗原區域。此電腦程式採用Hopp/Woods方法(Hopp等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：3824-3828)用於測定抗原性概況；及Kyte-Doolittle技術(Kyte等人，(1982)J.Mol.Biol.157：105-132)用於親水性曲線。
術語兩個實體之間的「特異性結合」意謂具有以下平衡常數(KA)(kon/koff)之結合：至少102 M-1、至少5×102 M-1、至少103 M-1、至少5×103 M-1、至少104 M-1至少5×104 M-1、至少105 M-1、至少5×105 M-1、至少106 M-1、至少5×106 M-1、至少107 M-1、至少5×107 M-1、至少108 M-1、至少5×108 M-1、至少109 M-1、至少5×109 M-1、至少1010 M-1、至少5×1010 M-1、至少1011 M-1、至少5×1011 M-1、至少1012 M-1、至少5×1012 M-1、至少1013 M-1、至少5×1013 M-1、至少1014 M-1、至少5×1014 M-1、至少1015 M-1或至少5×1015 M-1。
片語「特異性(或選擇性)結合」係指LRP6結合部分與其同源抗原(例如人類LRP6)之間的結合反應，該結合反應為異源蛋白質及其他生物製品群體中存在同源抗原之決定因數。除上述平衡常數(KA)以外，LRP6結合部分通常亦具有以下解離速率常數(KD)(koff/kon)：小於5×10-2 M、小於10-2 M、小於5×10-3 M、小於10-3 M、小於5×10-4 M、小於10-4 M、小於5×10-5 M、小於10-5 M、小於5×10-6 M、小於10-6 M、小於5×10-7 M、小於10-7 M、小於5×10-8 M、小於10-8 M、小於5×10-9 M、小於10-9 M、小於5×10-10 M、小於10-10 M、小於5×10-11 M、小於10-11 M、小於5×10-12 M、小於10-12 M、小於5×10-13 M、小於10-13 M、小於5×10-14 M、小於10-14 M、小於5×10-15 M或小於10-15 M或10-15 M以下；且以比其與非特異性抗原結合之親和力大至少兩倍之親和力結合至LRP6。在一個實施例中，如使用本文中所述之方法或熟習此項技術者已知之方法(例如BIAcore分析、ELISA、FACS、SET)(Biacore International AB,Uppsala,Sweden)所評估，LRP6結合部分具有以下解離常數(Kd)：小於3000 pM、小於2500 pM、小於2000 pM、小於1500 pM、小於1000 pM、小於750 pM、小於500 pM、小於250 pM、小於200 pM、小於150 pM、小於100 pM、小於75 pM、小於10 pM、小於1 pM。
如本文所用之術語「Kassoc」或「Ka」係指特定LRP6結合部分-抗原相互作用之結合速率，而如本文所用之術語「Kdis」或「Kd」係指特定LRP6結合部分-抗原相互作用之解離速率。如本文所用之術語「KD」係指解離常數，其由Kd與Ka之比率(亦即Kd/Ka)獲得且表示為莫耳濃度(M)。LRP6結合部分(諸如LRP6抗體或其片段)之KD值可使用此項技術中充分確立之方法進行測定。測定抗體之KD之方法為藉由使用表面電漿子共振或使用生物感測器系統(諸如Biacore®系統)。
如本文所用之術語「親和力(affinity)」係指在單個抗原位點處LRP6結合部分與抗原之間相互作用的強度。在各抗原位點內，抗體「臂」之可變區經由較弱非共價力與抗原在多個位點處相互作用；相互作用愈大，親和力愈強。
如本文所用之術語「親合力(avidity)」係指LRP6結合部分-LRP6抗原複合物之總體穩定性或強度之資訊量豐富的量度。其受三個主要因素控制：抗體抗原決定基親和力；抗原與抗體二者之價數；及相互作用部分之結構配置。最終此等因素定義抗體之特異性，亦即特定抗體與正確抗原之抗原決定基結合之可能性。
如本文所用之片語「抑制」係指LRP6構築體與LRP6結合且減小、降低典型Wnt信號傳導之生物活性，例如在Wnt報導體基因分析或磷酸化LRP6分析中減小、降低LRP6誘導之信號傳導活性。分析之實例更詳細地描述於下文實例中。在一些實施例中，如在Wnt報導體基因分析中所量測，LRP6構築體以10 nM或10 nM以下、1 nM或1 nM以下或100 pM或100 pM以下、10 pM、1 pM、0.5 pM、0.1 pM之IC50減小、降低或抑制LRP6誘導之活性。在一些實施例中，LRP6構築體之活性可藉由使用SET、ELISA、FACS、史卡查(Scatchard)以10 nM或10 nM以下、1 nM或1 nM以下、0.5 pM或100 pM或100 pM以下之IC50結合至LRP6來進行量測。
如本文所用之術語「Wnt 1」係指Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt9a、Wnt10a或Wnt10b。
如本文所用之術語「Wnt 3a」係指Wnt3a及Wnt3。
如本文所用之術語「增強」係指使Wnt信號在Wnt配位體存在下在抗體片段轉變成全長IgG LRP6抗體後活化及增強之方法。舉例而言，在不存在Wnt配位體(例如Wnt 3)之情況下，Wnt 1 Fab結合至LRP6受體之螺旋槳1區且阻斷Wnt 1路徑。在存在Wnt配位體(例如Wnt 3)之情況下，Wnt 1 Fab經由Wnt 1路徑阻斷信號傳導，但信號活化可經由Wnt 3路徑發生，藉此產生信號。然而，在存在Wnt配位體(例如Wnt 3)之情況下，當Wnt 1 Fab轉變成全長Wnt 1 IgG時，Wnt 1 IgG結合至兩個LRP6受體之螺旋槳1區且阻斷Wnt 1路徑；信號活化經由Wnt 3路徑發生且亦得以增強。雖然未要求提供作用理論，但一種可能的機制為IgG藉由結合至各LRP6受體之螺旋槳1區而使兩個或兩個以上LRP6受體叢集在一起，該LRP6受體在Wnt 3配位體存在下經由Wnt 3路徑產生較強信號。LRP6受體之二聚化促進Wnt信號傳導，或許經由增強涉及LRP6在內之各種相互作用之親合力。
以結合LRP6受體之螺旋槳3區且阻斷Wnt 3路徑之Wnt 3Fab獲得相反結果。在Wnt 1配位體存在下，Wnt 3 Fab阻斷Wnt 3路徑，但活化Wnt 1路徑以產生信號。當Wnt 3 Fab轉變成全長Wnt 3 IgG時，Wnt 3 IgG結合至兩個LRP6受體之螺旋槳3區，且在Wnt 1配位體存在下經由Wnt 1路徑抑制信號傳導。
術語「不明顯增強」或「避免增強」係指與結合至相同 抗原決定基之對照抗體或其片段相比，Wnt信號並未活化或增強。不明顯增強可為比對照抗體或其片段少至少10%，比對照抗體或其片段少至少20%、至少30%，至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%。
如本文所用之術語「叢集」係指使LRP6受體聚集或歸類在一起且增強Wnt信號傳導之任何蛋白質。該等蛋白質之實例包括(但不限於)Wnt 1配位體、Wnt 3a配位體及Wnt 3配位體。此等蛋白質可引起多聚化，例如兩個內源性LRP6受體之二聚化。此二聚化可引起因LRP6(其在Wnt配位體存在下可增強Wnt信號)之增強之相互作用所致之增強的親合力。
片語「經保守修飾之變異體」適用於胺基酸及核酸序列。相對於特定核酸序列，經保守修飾之變異體係指編碼相同或基本上相同之胺基酸序列之核酸或其中核酸並不編碼胺基酸序列成基本上相同之序列。由於遺傳密碼子之簡併，大量功能上相同之核酸編碼任何所給定之蛋白質。舉例而言，密碼子GCA、GCC、GCG及GCU均編碼胺基酸丙胺酸。因此，在丙胺酸由密碼子指定之各位置上，密碼子可在不改變經編碼之多肽的情況下變成所描述之相應密碼子的任一者。該等核酸變異為「寂靜變異(silent variation)」，其為一種經保守修飾之變異。本文中編碼多肽之各核酸序列亦描述核酸之各種可能之寂靜變異。熟習此項技術者將認識到核酸中之各密碼子(除通常為甲硫胺 酸之唯一密碼子之AUG及通常為色胺酸之唯一密碼子之TGG之外)可經修飾以得到功能上相同之分子。因此，編碼多肽之核酸之各寂靜變異隱含於各所述序列中。
對於多肽序列而言，「經保守修飾之變異體」包括對多肽序列之個別取代、缺失或添加而導致以化學上相似胺基酸取代胺基酸。提供功能上相似胺基酸之保守性取代表為在此項技術中所熟知。該等經保守修飾之變異體為除了以下各者以外之變異體且並不排除以下各者：多晶型變異體、種間同系物及等位基因。以下八個群組含有彼此為保守性取代之胺基酸：1)丙胺酸(A)、甘胺酸(G)；2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)；3)天冬醯胺(N)、麩醯胺酸(Q)；4)精胺酸(R)、離胺酸(K)；5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V)；6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)；7)絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)；及8)半胱胺酸(C)、甲硫胺酸(M)(參見例如Creighton,Proteins(1984))。在一些實施例中，術語「保守序列修飾」用於指代胺基酸修飾，該等修飾不會明顯影響或改變含有該胺基酸序列之抗體的結合特徵。
術語「交叉阻斷(cross-block)」、「交叉阻斷之(cross-blocked)」及「交叉阻斷性(cross-blocking)」在本文中可互換使用，意謂LRP6結合部分(例如抗體或片段)在標準競爭性結合分析中干擾其他抗體對LRP6之結合的能力。可利用標準競爭結合分析對LRP6結合部分能夠干擾另一結合部分對LRP6之結合的能力或程度(且因此其是否可稱為 交叉阻斷)進行測定。一個適合之分析包括使用Biacore技術(例如藉由使用BIAcore 3000儀器(Biacore,Uppsala,Sweden))，其可使用表面電漿子共振技術量測相互作用之程度。另一種量測交叉阻斷之分析使用基於ELISA之方法。
如本文所用之術語「最優化」係指核苷酸序列已利用在生產細胞或生物體(通常為真核細胞，例如畢赤酵母(Pichia)細胞、木黴(Trichoderma)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞)中較佳之密碼子進行改變以編碼胺基酸序列。經最優化之核苷酸序列經工程化以完全或儘可能多地保留最初由起始核苷酸序列(其亦稱為「親本」序列)編碼之胺基酸序列。
評估抗體對多個物種之抗原之結合能力的標準分析為此項技術中已知，包括例如ELISA、西方墨點法(western blot)及RIA。此等標準分析亦適用於LRP6構築體且詳細描述於實例中。亦可利用此項技術中已知之標準分析，諸如利用Biacore分析或FACS相對親和力(史卡查)，來評估LRP6構築體之結合動力學(例如結合親和力)。評估LRP6構築體對LRP6之功能性質之作用的分析(例如受體結合分析，調節Wnt路徑)進一步詳細描述於實例中。
因此，如根據此項技術中已知及本文中所述之方法測定，「抑制」一或多種此等LRP6功能性質(例如生物化學、免疫化學、細胞、生理學或其他生物學活性或其類似功能性質)之LRP6構築體應理解為與以下有關：特定活性相對 於在不存在LRP6構築體之情況下所見之該特定活性在統計學上顯著降低。抑制LRP6活性之LRP6構築體使所量測之參數在統計學上顯著降低至少10%、至少50%、80%或90%，且在某些實施例中，LRP6構築體可抑制大於95%、98%或99%之LRP6功能活性。
片語「一致百分比」或「一致性百分比」在兩個或兩個以上核酸或多肽序列之情形下係指相同之兩個或兩個以上序列或子序列。當如使用下列序列比較演算法中之一者或由手動對準及肉眼檢查所量測在比較時窗或經指明區上比較及對準最大一致性時，若兩個序列具有相同胺基酸殘基或核苷酸之所規定百分比(亦即在所規定區上或當未規定時則在整個序列上具有60%一致性，視情況65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%一致性)，則兩個序列為「實質上一致」。一致性視情況存在於長度為至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)之區上、或更佳存在於長度為100至500或1000個或1000個以上核苷酸(或20、50、200個或200個以上胺基酸)之區域上。
為進行序列比較，通常一個序列充當比較測試序列之參考序列。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入電腦，必要時，指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數或者可指定替代性參數。隨後，序列比較演算法基於程式參數計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。
如本文所用之「比較時窗」包括參考鄰近位置數目選自 由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150組成之群中的任一者之區段，其中在最佳對準兩個序列之後序列可與具有相同鄰近位置數目之參考序列相比較。序列對準用於比較之方法為此項技術中所熟知。可例如利用Smith及Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源演算法、利用Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443之同源對準演算法、利用Pearson及Lipman,(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444之相似法搜索、利用此等演算法(Wisconsin Genetics軟體套件，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)之電腦化實施或利用手動對準及肉眼檢查(參見例如Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology)，進行用於比較之最佳序列對準。
適用於測定序列一致性百分比及序列相似性之演算法之兩個實例為BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別描述於Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402及Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。此演算法包括首先藉由識別查詢序列中長度W之短字來鑑別較高得分序列對(HSP)，該等查詢序列中長度W之短字在與資料庫序列中相同長度之字對準時匹配或滿足某個正值的閾值分數T。T稱為鄰近字分數閾值(Altschul等人，前述)。此 等初始鄰近字採樣數充當啟始搜索之種子以發現含有其之較長HSP。該等字採樣數沿各序列雙向延伸直至累積對準分數可增加。對於核苷酸序列而言，使用參數M(一對匹配殘基之獎勵分數；始終>0)及N(錯配殘基之處罰分數；始終<0)計算累積分數。對於胺基酸序列而言，使用計分矩陣計算累積分數。各方向之字採樣數之延伸可在下列情況下中止：累積對準分數由其所達成之最大值減少量X；歸因於一或多個負得分殘基對準之累積，累積分數變成零或零以下；或達到任一序列之末端。BLAST演算法參數W、T及X測定對準之敏感性及速度。BLASTN程式(對於核苷酸序列)使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=-4及比較兩股作為預設值。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用字長為3、及期望值(E)為10，且BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff及Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)對準(B)為50、期望值(E)為10、M=5、N=-4及比較兩股作為預設值。
BLAST演算法亦進行兩個序列之間相似性之統計分析(參見例如Karlin及Altschul,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST演算法提供之一個相似性量度為最小和概率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間會偶然發生匹配的概率指標。舉例而言，若測試核酸與參考核酸之比較中最小和概率小於約0.2，更佳小於約0.01，且最佳小於約0.001，則認為核酸與參考序列相似。
兩個胺基酸序列之間的一致性百分比亦可使用已併入 ALIGN程式(2.0版)中之E.Meyers及W.Miller之演算法(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17,(1988))，使用PAM120權重殘基表(weight residue table)，12之空隙長度處罰及4之空隙處罰來測定。此外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用已併入GCG軟體套件(可在www.gcg.com獲得)中之GAP程式中的Needleman及Wunsch(J.Mol,Biol.48：444-453,(1970))演算法，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及空隙權重16、14、12、10、8、6或4及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。
除以上所指示之序列一致性百分比以外，兩個核酸序列或多肽為實質上一致之另一指征為如下所述由第一核酸所編碼之多肽與針對由第二核酸所編碼之多肽產生之抗體具有免疫交叉反應性。因此，舉例而言，多肽與第二多肽在兩個肽之不同之處僅在於保守性取代時通常實質上一致。兩個核酸序列為實質上一致之另一指征為如下所述兩個分子或其補體在嚴格條件下彼此雜交。兩個核酸序列為實質上一致之另一指征為可使用相同引子來擴增序列。
片語「核酸」在本文中可與術語「聚核苷酸」互換使用且係指呈單股或雙股形式之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非另有指示，否則特定核酸序列亦隱含地包涵其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)及互補序列以及經明確指明之序列。特定言之，如以下詳述，簡併密碼子取代可藉由產生一或多個所選(或所有)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代之序列來達 成(Batzer等人，(1991)Nucleic Acid Res.19：5081；Ohtsuka等人，(1985)J.Biol.Chem.260：2605-2608；及Rossolini et al.,(1994)Mol.Cell.Probes 8：91-98)。
片語「可操作地連接」係指兩個或兩個以上聚核苷酸(例如DNA)區段之間的功能關係。其通常係指轉錄調節序列與經轉錄之序列的功能關係。舉例而言，若啟動子或強化子序列於適當宿主細胞或其他表現系統中刺激或調節編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子序列可操作地連接於該編碼序列。一般而言，可操作地連接於經轉錄之序列之啟動子轉錄調節序列物理上鄰接該經轉錄之序列，亦即其為順式作用。然而，某些轉錄調節序列(諸如強化子)不必物理上鄰接或緊密接近編碼序列，其增強該編碼序列之轉錄。
術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指代胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基為相應天然產生之胺基酸之人造化學模擬物的胺基酸聚合物，以及適用於天然產生之胺基酸聚合物及非天然產生之胺基酸聚合物。除非另有指示，否則特定多肽序列亦隱含地包涵其經保守修飾之變異體。
術語「個體」包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、羊、狗、牛、雞、兩棲動物及爬行動物。除有所指示之時，術語「患者」或「個體」在本文中可交換使用。
術語「抗癌劑」意謂可用於治療細胞增生性病症(諸如癌症)之任何藥劑，包括細胞毒性劑、化學治療劑、放射線療法及放射線治療劑、靶向抗癌劑及免疫治療劑。
術語「腫瘤」係指贅生性細胞生長及增殖(無論惡性抑或良性)，及所有癌變前及癌性細胞及組織。
術語「抗腫瘤活性」意謂降低腫瘤細胞增殖速率、生存力或轉移活性。展示抗腫瘤活性之一種可能的方式為在治療期間出現之異常細胞之生長速率或腫瘤尺寸穩定性或減小方面展示降低。該活性可使用認可之活體外或活體內腫瘤模型進行評估，該等模型包括(但不限於)異種移植物模型、同種異體移植模型、MMTV模型及此項技術中已知之研究抗腫瘤活性之其他已知模型。
術語「惡性疾病」係指非良性腫瘤或癌症。如本文所用，術語「癌症」包括惡性疾病，其特徵在於失調或無控之細胞生長。例示性癌症包括：癌瘤、肉瘤、白血病及淋巴瘤。術語「癌症」包括原發性惡性腫瘤(例如細胞不遷移至個體體內除原始腫瘤部位以外之部位的惡性腫瘤)及繼發性惡性腫瘤(例如由癌轉移產生之惡性腫瘤，腫瘤細胞遷移至不同於原始腫瘤部位之繼發性部位)。
在以下章節及分章中進一步詳細描述各種態樣。
LRP6及Wnt信號傳導路徑
本發明係關於LRP6構築體及其用途。LRP6構築體包含至少一個LRP6結合部分及至少一個半衰期延長分子。此等LRP6構築體結合至LRP6受體上之至少一個結合部位， 且在不增強Wnt信號之情況下抑制Wnt信號傳導，且在與典型Wnt信號傳導有關之疾病(例如癌症)方面給予幫助。
Wnt信號傳導路徑在胚胎發育及出生後組織維持方面很重要。此藉由對控制細胞生長、運動及細胞存活之時間及空間調節之特定的一組基因進行引導而達成(綜述於Barker及Clevers(2006)Nature Rev.5：997中)。此路徑之適當調節對於維持組織內穩定很重要。此路徑之慢性活化促進無控細胞生長及存活，且可因此推動細胞增生性疾病(諸如癌症)之發展。或者，此路徑之異常抑制可引起許多疾病病況，例如骨量損失及其他骨疾病。Wnt蛋白質藉由與捲曲蛋白受體及兩種細胞表面受體之一相互作用而引發下游信號傳導，該等細胞表面受體為低密度脂蛋白受體(LDLR)相關蛋白(LRP)之成員：LRP5及LRP6(綜述於He等人，(2004)Development 31：1663-1677中)。
LRP6之細胞外域包含三個基礎域：1)YWTD(酪胺酸、色胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸)型β-螺旋槳區；2)EGF(表皮生長因子)樣域；及3)LDLR A型(LA)域。
LRP6之YWTD型β-螺旋槳區含有六個YWTD重複序列，該等重複序列各自具有43至50個胺基酸殘基且形成六葉狀β-螺旋槳結構。在LRP6中，存在四個YWTD型β-螺旋槳區，其各自後接EGF樣域，該EGF樣域包含具有保守型半胱胺酸殘基之約40個胺基酸殘基，該EGF樣域又後接三個LA域。(Springer等人，(1998)J.Mol.Biol.283：837-862；Jeon等人(2001)Nat.Struct.Biol.8：499-504)。β-螺旋 槳-EGF樣域可結合細胞外配位體。LRP6之細胞外域由胺基酸殘基19至1246定義且在胺基酸殘基43至324、352至627、654至929及957至1250處含有四個β-螺旋槳域，該等β-螺旋槳域分別對應於β-螺旋槳區1、2、3及4。螺旋槳域1-2包括胺基酸19至629，且螺旋槳域3-4包括胺基酸631至1246。
使用基於噬菌體之淘選，LRP6抗體已經鑑別可抑制或增強Wnt信號傳導，如實例中所示。已鑑別兩個種類之LRP6拮抗性抗體。一個種類之抗體特異性抑制由Wnt1表示之Wnt蛋白質，而第二種類特異性抑制由Wnt3a表示之Wnt蛋白質。抗原決定基定位實驗指示Wnt1特異性及Wnt3a特異性LRP6抗體分別結合至LRP6之第一螺旋槳及第三螺旋槳，表明Wnt1及Wnt3a蛋白質結合至LRP6之不同螺旋槳(參見國際第PCT/EP2008/064821號(2008年10月31日申請)、第PCT/EP2011/057200號(2011年5月6日申請)及第PCT/EP2011/057202號(2011年5月6日申請)，其內容以全文引用之方式併入本文中)。LRP6之螺旋槳3域之另一表徵鑑別此域中擔負與抗體相互作用之殘基。螺旋槳3之YWTD-EGF區內之抗體結合部位使用氫-氘交換(HDx)質譜分析(MS)鑑別，且對應於螺旋槳3域之葉片1與6之間的凹面。
以上經鑑別之LRP6抗體或其片段已用於產生本發明之LRP6構築體。
LRP6結合部分
兩個種類之抗LRP6抗體先前已經描述(2011年5月6日申 請之PCT/EP2011/057200及2011年5月6日申請之PCT/EP2011/057202，其內容以全文引用之方式併入本文中)：一個種類結合至第一螺旋槳區且抑制Wnt1類特異性信號傳導，且第二種類結合至第三螺旋槳區且抑制Wnt3類特異性信號傳導。
1.抗體
在一個實施例中，LRP6構築體藉由使用連接至半衰期延長劑之至少一個抗體進行製造，使得LRP6構築體結合至LRP6，且在不增強Wnt信號之情況下抑制Wnt信號傳導，且展示活體外及活體內增長之半衰期。
抗體包括IgG、IgA、IgM、IgD及IgE同型。如本文所用之抗體或其抗體片段含有結合至存在於靶細胞之外部上或內部中之靶蛋白、醣蛋白或抗原決定基的一或多個互補決定區(CDR)或結合肽。
特異性結合至LRP6蛋白質(例如人類及/或食蟹獼猴(cynomologus)LRP6)之抗體展示於前述表1中，且包含VH域，該VH域具有SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62之胺基酸序列；及VL域，該VL域具有SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：61之胺基酸序列。特異性結合LRP6蛋白質(例如人類及/或食蟹獼猴LRP6)之其他抗體包含VH域，該VH域具有SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130及SEQ ID NO：138之胺基酸序列；及VL域，該VL域具有SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：127及SEQ ID NO：129之胺基酸序列。
其他抗體包括已突變但CDR區與表1中描述之序列中所述之CDR區具有至少60%、70%、80%、90%、95%或98%一致性的胺基酸。在一些實施例中，其包括突變胺基酸序列，其中在與表1中描述之序列中所述之CDR區相比時，在CDR區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已突變，同時仍然維持其對原始抗體之抗原決定基之特異性。
本發明亦提供編碼特異性結合至LRP6蛋白質(例如人類及/或食蟹獼猴LRP6)之抗體之VH、VL、全長重鏈及全長輕鏈的核酸序列。該等核酸序列可經最優化以在哺乳動物細胞中表現(例如，表1用於β-螺旋槳1抗體之MOR08168、MOR08545及MOR06706，及用於β-螺旋槳3抗體之MOR06475、MOR08193及MOR08473)。該等核酸序列可另外用於製造LRP6構築體。
LRP抗體結合至不同LRP6 β-螺旋槳區。螺旋槳1抗體結合至β-螺旋槳1域且阻斷螺旋槳1依賴性Wnt，諸如Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt9、Wnt10A、Wnt10B。螺旋槳3抗體結合至β-螺旋槳3域且阻斷螺旋槳3依賴性Wnt，諸如Wnt3a及Wnt3。
其他抗體包括胺基酸或編碼胺基酸之核酸已突變但具有與表1中描述之序列至少60%、70%、80%、90%、95%或98%一致性的抗體。在一些實施例中，其包括突變胺基酸序列，其中在與表1中描述之序列中所述之可變區相比時，在可變區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已突變，同時保留實質上相同的治療活性。
此等抗體各自可結合至LRP6，VH、VL、全長輕鏈及全長重鏈序列(胺基酸序列及編碼胺基酸序列之核苷酸序列)可「經混合及匹配」以產生其他LRP6抗體。該等「經混合及匹配」之LRP6抗體可使用此項技術中已知之結合分析(例如ELISA，及描述於實例部分中之其他分析)進行測試。在此等經混合及匹配之抗體之情況下，來自特定VH/VL對之VH序列應經結構上類似之VH序列置換。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長重鏈序列應經結構上類似之全長重鏈序列置換。同樣，來自特定VH/VL對之VL序列應經結構上類似之VL序列置換。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈對之全長輕鏈序列應經結構上類似之全長輕鏈序列置換。因此，在一個態樣中，本發明提供一種經分離之單株抗體或其片段，其具有：重鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62；及輕鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：61；重鏈，其選自由以下組成之群：SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130及SEQ ID NO：138；及輕鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：81及SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO： 129及SEQ ID NO：137；其中抗體特異性結合至LRP6(例如人類及/或食蟹獼猴LRP6)。
包含重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3(或其組合)之結合至LRP6之β螺旋槳1域之LRP6抗體描述於表1中。抗體之VH CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：47中。抗體之VH CDR2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：48中。抗體之VH CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：49中。抗體之VL CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：50中。抗體之VL CDR2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：51中。抗體之VL CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：52中。CDR區使用Kabat系統描繪(Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883；及Al-Lazikani等人，(1997)J.Mol.Biol.273,927-948)。
包含重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3(或其組合)之結合至LRP6之β螺旋槳3域之LRP6抗體描述於表1中。抗體之VH CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：93及SEQ ID NO：115中。抗體之VH CDR2之胺基酸序 列展示於SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：116中。抗體之VH CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：95及SEQ ID NO：117中。抗體之VL CDR1之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：96及SEQ ID NO：118中。抗體之VL CDR2之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：97及SEQ ID NO：119中。抗體之VL CDR3之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：120中。已知此等抗體各自可結合至LRP6且抗原結合特異性主要由CDR1、CDR2及CDR3區提供，VH CDR1、CDR2及CDR3序列及VL CDR1、CDR2及CDR3序列可「經混合及匹配」(亦即來自不同抗體之CDR可經混合及匹配，不過各抗體必須含有VH CDR1、CDR2及CDR3以及VL CDR1、CDR2及CDR3以產生其他LRP6結合分子)。該等「經混合及匹配」之LRP6抗體可使用此項技術中已知之結合分析及描述於實例中之結合分析(例如ELISA)進行測試。當VH CDR序列經混合及匹配時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之CDR序列置換。同樣，當VL CDR序列經混合及匹配時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應經結構上類似之CDR序列置換。對一般技術者應易於顯而易見，新穎VH及VL序列可藉由以與本文中針對本發明之單株抗體所示之CDR序列結構上類似的序列取代一或多個VH及/或VL CDR區序列而產生。
因此，本發明提供一種經分離之LRP6 β-螺旋槳1單株抗 體或其片段，其包含：重鏈可變區CDR1，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：47；重鏈可變區CDR2，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：22及SEQ ID NO：48；重鏈可變區CDR3，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：49；輕鏈可變區CDR1，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：24及SEQ ID NO：50；輕鏈可變區CDR2，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：51；及輕鏈可變區CDR3，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：26及SEQ ID NO：52；其中抗體結合LRP6。
因此，本發明提供一種經分離之LRP6 β-螺旋槳3單株抗體或其片段，其包含：重鏈可變區CDR1，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：93及SEQ ID NO：115；重鏈可變區CDR2，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：94及SEQ ID NO：116；重鏈可變區CDR3，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：95及SEQ ID NO：117；輕鏈可變區CDR1，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：96及SEQ ID NO：118；輕鏈可變區CDR2，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：97及SEQ ID NO：119；及輕鏈可變區CDR3，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：98及SEQ ID NO：120；其中抗體結合LRP6。
在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：2之重鏈可變區CDR2、SEQ ID NO：3之重鏈可變區CDR3、SEQ ID NO：4之輕鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：5之輕鏈可變區CDR2及SEQ ID NO：6之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：21之重鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：22之重鏈可變區CDR2、SEQ ID NO：23之重鏈可變區CDR3、SEQ ID NO：24之輕鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：25之輕鏈可變區CDR2及SEQ ID NO：26之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：47之重鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：48之重鏈可變區CDR2、SEQ ID NO：49之重鏈可變區CDR3、SEQ ID NO：50之輕鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：51之輕鏈可變區CDR2及SEQ ID NO：52之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：69之重鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：70之重鏈可變區CDR2、SEQ ID NO：71之重鏈可變區CDR3、SEQ ID NO：72之輕鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：73之輕鏈可變區CDR2及SEQ ID NO：74之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：93之重鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：94之重鏈可變區CDR2、SEQ ID NO：95之重鏈可變區CDR3、SEQ ID NO：96之輕鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：97之輕鏈可變區CDR2及SEQ ID NO：98之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：115之重鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：116之重鏈可變區CDR2、SEQ ID NO：117之重鏈可變區CDR3、SEQ ID NO：118之輕鏈可變區CDR1、SEQ ID NO：119之輕鏈可變區CDR2及SEQ ID NO：120之輕鏈可變區CDR3。
在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：14之VH及SEQ ID NO：13之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：34之VH及SEQ ID NO：33之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：35之VH及SEQ ID NO：36之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：43之VH及SEQ ID NO：44之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：60之VH及SEQ ID NO：59之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：62之VH及SEQ ID NO：61之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：82之VH及SEQ ID NO：81之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：90之VH及SEQ ID NO：89之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：106之VH及SEQ ID NO：105之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包 含SEQ ID NO：108之VH及SEQ ID NO：107之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：128之VH及SEQ ID NO：127之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：130之VH及SEQ ID NO：129之VL。在一特定實施例中，結合至LRP6之抗體包含SEQ ID NO：138之VH及SEQ ID NO：137之VL。
在一個實施例中，LRP6抗體為拮抗劑抗體。在一個實施例中，LRP6抗體為促效劑抗體。在某些實施例中，結合至LRP6之抗體為描述於表1中之抗體。
如本文所用，若人類抗體之可變區或全長鏈係獲自使用人類生殖系免疫球蛋白基因之系統，則該抗體包含作為特定生殖系序列之「產物」或「來源於」特定生殖系序列的重鏈或輕鏈可變區或全長重鏈或輕鏈。該等系統包括以相關抗原來使帶有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫，或以相關抗原來篩檢在噬菌體上呈現之人類免疫球蛋白基因庫。因而，作為人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體可藉由將該人類抗體之胺基酸序列與人類生殖系免疫球蛋白之胺基酸序列相比較，及選擇序列最接近(亦即最大一致性%)該人類抗體之序列的人類生殖系免疫球蛋白序列來鑑別。作為特定人類生殖系免疫球蛋白序列之「產物」或「來源於」特定人類生殖系免疫球蛋白序列之人類抗體與該生殖系序列相比可含有胺基酸差異，此係歸因於例如天然產生之體細胞突變或定點突變之意向引入。然而，在 VH或VL構架區中，所選人類抗體之胺基酸序列通常與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有在與其他物種之生殖系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類生殖系序列)相比時將人類抗體識別為屬於人類的胺基酸殘基。在某些情況下，人類抗體之胺基酸序列可與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少60%、70%、80%、90%或至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。通常，重組人類抗體與由人類生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相比在VH或VL構架區中將呈現不超過10個胺基酸差異。在某些情況下，人類抗體與由生殖系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列相比可呈現不超過5個，或甚至不超過4、3、2或1個胺基酸差異。
同源抗體
本發明範疇內亦包括包含與表1中所述序列同源之胺基酸序列的抗體或其片段，其中同源抗體結合至LRP6蛋白質(例如人類及/或食蟹獼猴LRP6)，且保留表1中所述該等抗體之所需功能性質。
舉例而言，一種經分離之單株抗體(或其片段)，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%或至少98%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：62；輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%或 至少98%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：61；其中抗體結合至LRP6(例如人類及/或食蟹獼猴LRP6)之β-螺旋槳1，且抑制β-螺旋槳1依賴性Wnt蛋白質之信號傳導活性。如本文所述，信號傳導活性可在Wnt報導體基因分析或Wnt引導之信號傳導(例如LRP6磷酸化、β-索烴素穩定化及核易位、細胞增殖/存活)之其他量測中進行量測。在一特定實例中，當使用條件培養基或使用經轉染之細胞時，該等抗體在Wnt1分析中具有小於10 nM之EC50值。
另一實例為一種經分離之單株抗體(或其片段)，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%或至少98%或至少98%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：130及SEQ ID NO：138；輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%或至少98%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129及SEQ ID NO：137；其中抗體結合至LRP6(例如人類及/或食蟹獼猴LRP6)之β-螺旋槳3，且抑制β-螺旋槳3依賴性Wnt蛋白質之信號傳導活性。如本文所述，信號傳導活性可在Wnt報導體基因分析或Wnt引導之信號傳導(例如LRP6 磷酸化、β-索烴素穩定化及核易位、細胞增殖/存活)之其他量測中進行量測。在一特定實例中，當使用條件培養基或使用經轉染之細胞時，該等抗體在Wnt3a分析中具有小於10 nM之EC50值。
在其他實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可與表1中所述序列50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。在其他實施例中，VH及/或VL胺基酸序列可一致，除了在不超過1、2、3、4或5個胺基酸位置中之胺基酸取代。藉由分別編碼SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：33及SEQ ID NO：59之核酸分子的突變誘發(例如定點突變誘發或PCR介導之突變誘發)，隨後使用本文中所述之功能分析測試經編碼經改變之抗體所保留之功能，可獲得具有具備與表1中所述該等螺旋槳1抗體之VH及VL區較高(亦即80%或80%以上)一致性之VH及VL區的抗體。
藉由分別編碼SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：105及SEQ ID NO：127之核酸分子的突變誘發(例如定點突變誘發或PCR介導之突變誘發)，隨後使用本文中所述之功能分析測試經編碼經改變之抗體所保留之功能，可獲得具有具備與表1中所述該等螺旋槳3抗體之VH及VL區較高(亦即80%或80%以上)一致性之VH及VL區的抗體。
在其他實施例中，重鏈及/或輕鏈核苷酸序列之可變區可與上述序列60%、70%、80%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%一致。此等同源抗體或其片段可用於產生LRP6構築體。
具有保守修飾之抗體
範疇內亦包括具有保守修飾之抗體。抗體具有包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中一或多個此等CDR序列具有指定胺基酸序列或其保守修飾，其中具有保守修飾之抗體或其片段特異性結合至LRP6，且藉由抑制Wnt信號傳導路徑來抑制LRP6活性，該Wnt信號傳導路徑可在Wnt報導體基因分析或Wnt引導之信號傳導(例如LRP6磷酸化、β-索烴素穩定化及核易位、細胞增殖/存活)之其他量測中進行量測。具有保守修飾之此等抗體或其片段可用於產生本發明之LRP6構築體。
結合至相同抗原決定基之抗體
如表1中所述之LRP6抗體般結合至相同抗原決定基之抗體亦在範疇內。因此，另外的抗體可基於其在本文所揭示之LRP6結合分析中與其他抗體交叉競爭(例如以在統計學上顯著方式競爭性抑制其他抗體之結合)之能力進行鑑別。測試抗體抑制本發明抗體結合至LRP6蛋白質(例如人類及/或食蟹獼猴LRP6)之能力展示測試抗體可與結合至LRP6之該抗體競爭；根據非限制性理論，該抗體可如與其競爭之抗體般結合至LRP6蛋白質上相同或相關(例如結構上類似或空間上接近)抗原決定基。在一實施例中，如本發明抗體般結合至LRP6上相同抗原決定基之抗體為人 類單株抗體。該等人類單株抗體可如本文所述進行製備及分離。結合至相同抗原決定基之此等抗體或其片段可用於產生本發明之LRP6構築體。
2.抗體片段
在一個實施例中，LRP6構築體藉由使用連接至半衰期延長劑之至少一個抗體片段進行製造，使得LRP6構築體結合至LRP6，且在不增強Wnt信號之情況下抑制Wnt信號傳導，且展示活體外及活體內增長之半衰期。抗體之抗體片段應保留特異性結合至靶抗原之能力。抗體片段包括單獨可變重鏈、可變輕鏈、Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc及scFab。片段可藉由完整免疫球蛋白之酶促或化學分離進行製造。舉例而言，F(ab')2片段可藉由使用標準方法(諸如Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Pubs.,N.Y.(1988)中所述之標準方法)用胃蛋白酶在pH 3.0至pH 3.5下蛋白水解消化而自IgG分子獲得。Fab片段可藉由有限還原而自F(ab')2片段獲得，或藉由在還原劑存在下用番木瓜蛋白酶消化而自完整抗體獲得。片段亦可利用重組DNA技術製造。編碼所選片段之核酸之區段藉由用限制酶消化全長編碼序列或藉由重新合成(de novo synthesis)進行製造。片段通常以噬菌體外套融合蛋白質之形式表現。此表現方式宜於抗體之親和力強化。
scFv
「單鏈抗體」(scFv)為抗體片段，其由包含連接至VH域之VL域之單條多肽鏈組成，其中VL域及VH域成對形成單 價分子。單鏈抗體可根據此項技術中已知之方法進行製備(參見例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。在一個實施例中，LRP6構築體使用scFv作為LRP6結合部分藉由連接至少一個半衰期延長劑而製造。用於製造scFv之VH及VL域可來源於相同或不同抗體且連接在一起。scFv包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR。
用於產生scFv及突變scFv之方法展示於2011年5月6日申請之PCT/EP2011/057200及2011年5月6日申請之PCT/EP2011/057202中，其內容以全文引用之方式併入本文中。scFv之熱穩定性之結果描述於圖32至圖35中。
scFv可沿許多不同取向連接至半衰期延長劑。在一個實施例中，至少一個scFv連接至半衰期延長劑之C端。在另一實施例中，至少一個scFv連接至半衰期延長劑之N端。在另一實施例中，至少一個scFv連接至半衰期延長劑之N端及C端。
連接子
scFv分子可藉由使用連接子將VH及VL區連接在一起來製造。scFv分子包含具有最優化長度及/或胺基酸組成之scFv連接子(例如Ser-Gly連接子)。已知連接子長度可大大影響scFv之可變區如何摺疊及相互作用。實際上，若使用較短連接子(例如在5至10個胺基酸之間；在5至20個胺基酸之間)，則防止鏈內摺疊，且需要鏈間摺疊以使兩個可 變區在一起形成功能抗原決定基結合部位。關於連接子取向及尺寸之實例參見例如Hollinger等人1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448；美國專利申請公開案第2005/0100543號、第2005/0175606號、第2007/0014794號；及PCT公開案第WO 2006/020258號及第WO 2007/024715號，其以引用之方式併入本文中。
scFv可在其VL與VH區之間包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75個或75個以上胺基酸殘基之連接子序列。連接子序列可包含任何天然產生之胺基酸。在一些實施例中，胺基酸甘胺酸及絲胺酸構成連接子序列內之胺基酸。在另一實施例中，連接子區取向包含甘胺酸重複序列(Gly4Ser)n組，其中n為等於或大於1之正整數。
在一個實施例中，連接子包括(但不限於)(Gly4 Ser)4或(Gly4 Ser)3。在另一實施例中，連接子Glu及Lys殘基可穿插於Gly-Ser連接子內以達成較佳溶解度。在另一實施例中，連接子包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)之多個重複序列。在另一實施例中，連接子包括(Gly3Ser)+(Gly4Ser)+(GlySer)之組合及倍數。在另一實施例中，Ser可經Ala置換，例如(Gly4Ala)或(Gly3Ala)。在另一實施例中，連接子包含基元(GluAlaAlaAlaLys)n，其中n為等於或大於1之正整數。
scFv連接子可具有不同長度。在一個實施例中，scFv連 接子長度為約5至約50個胺基酸。在另一實施例中，scFv連接子長度為約10至約40個胺基酸。在另一實施例中，scFv連接子長度為約15至約30個胺基酸。在另一實施例中，scFv連接子長度為約15至約20個胺基酸。連接子長度之變化可保留或增強活性，在活性研究中產生優異功效。可使用此項技術中已知之技術將scFv連接子引入多肽序列中。舉例而言，可使用PCR突變誘發。修飾可由DNA序列分析證實。質體DNA可用於使宿主細胞轉型以達成所製造之多肽之穩定製造。
在一個實施例中，scFv分子包含scFv連接子，該scFv連接子具有插入於VH域與VL域之間的(Gly4Ser)3或(Gly4Ser)4之胺基酸序列，其中VH及VL域利用二硫鍵連接。
scFv分子可另外包含至少一個二硫鍵，該二硫鍵連接VL域中之胺基酸與VH域中之胺基酸。半胱胺酸殘基為必需的以提供二硫鍵。二硫鍵可包括於scFv分子中。編碼VH及VL域之基因之修飾可使用此項技術中已知之技術(例如定點變突誘發)來實現。
穩定性及突變
scFv分子之穩定性可參考習知對照scFv分子或全長抗體之生物物理學性質(例如熱穩定性)進行評估。在一個實施例中，LRP6構築體在所述分析中具有比對照結合分子(例如習知scFv分子)高約0.1℃、約0.25℃、約0.5℃、約0.75℃、約1℃、約1.25℃、約1.5℃、約1.75℃、約2℃、約2.5℃、約3℃、約3.5℃、約4℃、約4.5℃、約5℃、約 5.5℃、約6℃、約6.5℃、約7℃、約7.5℃、約8℃、約8.5℃、約9℃、約9.5℃、約10℃、約11℃、約12℃、約13℃、約14℃或約15℃之熱穩定性。
scFv之改良之熱穩定性隨後賦予整個LRP6構築體。與習知抗體相比，scFv之熱穩定性可提高至少約2℃或3℃。在一個實施例中，與習知抗體相比，scFv具有提高1℃之熱穩定性。在另一實施例中，與習知抗體相比，scFv具有提高2℃之熱穩定性。在另一實施例中，與習知抗體相比，scFv具有提高4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃之熱穩定性。可例如在本文所揭示之scFv分子與來自scFv VH及VL所源自之抗體的scFv分子或Fab片段之間進行比較。熱穩定性可使用此項技術中已知之方法進行量測。舉例而言，在一個實施例中，可量測Tm。量測Tm之方法及測定蛋白穩定性之其他方法更詳細地描述於下文中。
scFv中之突變改變scFv之穩定性，且與不具有scFv中之突變之LRP6構築體相比，提高scFv及包含該突變之scFv之LRP6構築體的總體穩定性。scFv之突變可如實例中所示產生。如實例中所述，使用諸如Tm、變性溫度及聚集溫度之量測值，相對於未突變之scFv，比較突變之scFv之穩定性。突變scFv之結合能力可使用諸如ELISA之分析進行測定。
在一個實施例中，scFv包含至少一個突變，以使突變之scFv賦予LRP6構築體改良之穩定性。在另一實施例中， scFv包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個突變，以使突變之scFv賦予LRP6構築體改良之穩定性。在另一實施例中，scFv包含突變之組合，以使突變之scFv賦予LRP6構築體改良之穩定性。
評估蛋白穩定性之方法
為了評估LRP6構築體之穩定性，使用方法及下文所述之方法預測多域蛋白質之最小域以及整個多域蛋白質之穩定性。該等方法允許測定多個熱展開轉變，其中最不穩定域首先展開或限制共同展開之多域單元(亦即展現單個展開轉變之多域蛋白質)之總體穩定性閾值。最不穩定域可以許多其他方式鑑別。可進行突變誘發以探測限制總體穩定性之域。另外，多域蛋白質之耐蛋白酶性可經由DSC或其他光譜學方法在最不穩定之域已知固有展開之條件下進行(Fontana等人，(1997)Fold.Des.,2：R17-26；Dimasi等人(2009)J.Mol.Biol.393：672-692)。一旦最不穩定域經鑑別，即可將編碼此域(或其部分)之序列用作該等方法中之測試序列。
a)熱穩定性
組合物之熱穩定性可使用此項技術中已知之許多非限制性生物物理學或生物化學技術進行分析。在某些實施例中，熱穩定性利用分析光譜學進行評估。
一種例示性分析光譜學方法為差示掃描熱量測定(DSC)。DSC採用對與大部分蛋白質或蛋白域展開同時發生之熱吸收敏感的熱量計(參見例如Sanchez-Ruiz等人， Biochemistry,27：1648-52,1988)。為了測定蛋白質之熱穩定性，將蛋白質樣品插入熱量計內，且提昇溫度直至Fab或scFv展開為止。蛋白質展開之溫度為總體蛋白穩定性之指示。
另一例示性分析型光譜學方法為圓二色性(CD)光譜法。CD光譜測定法量測組合物隨漸增之溫度而變之光學活性。圓二色性(CD)光譜法量測因結構不對稱而產生之左旋偏振光相對於右旋偏振光之吸收差異。無序或展開之結構產生與有序或摺疊結構之CD光譜極不相同的CD光譜。CD光譜反映蛋白質對漸增之溫度之變性作用的敏感性，且因此為蛋白質熱穩定性之指示(參見van Mierlo及Steemsma,J.Biotechnol.,79(3)：281-98,2000)。
用於量測熱穩定性之另一例示性分析型光譜學方法為螢光發射光譜法(參見van Mierlo及Steemsma，前述)。用於量測熱穩定性之另一例示性分析型光譜學方法為核磁共振(NMR)光譜法(參見例如van Mierlo及Steemsma，前述)。
組合物之熱穩定性可以生物化學方式量測。用於評估熱穩定性之例示性生物化學方法為熱攻擊分析(thermal challenge assay)。在「熱攻擊分析」中，組合物經歷持續設定時間之一系列高溫。舉例而言，在一個實施例中，測試scFv分子或包含scFv分子之分子經歷例如持續1至1.5小時之一系列漸增之溫度。蛋白質之活性隨後利用相關生物化學分析進行分析。舉例而言，若蛋白質為結合蛋白(例如scFv或含有scFv之多肽)，則結合蛋白之結合活性可利用 功能性ELISA或定量性ELISA進行測定。
該分析可使用大腸桿菌(E.coli)及高通量篩檢以高通量形式及實例中揭示之形式進行。scFv變異體之文庫可使用此項技術中已知之方法建立。scFv表現可經誘導，scFv可經歷熱攻擊。可針對結合分析經攻擊之測試樣品，該等穩定之scFv可按比例增高且進一步表徵。
熱穩定性藉由使用以上技術中之任一者(例如分析型光譜學技術)量測組合物之熔融溫度(Tm)來評估。熔融溫度為熱轉變曲線之中點下之溫度，其中組合物之50%分子呈摺疊狀態(參見例如Dimasi等人.(2009)J.Mol Biol.393：672-692)。在一個實施例中，scFv之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一個實施例中，IgG之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、 79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一個實施例中，多價抗體之Tm值為約40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。
熱穩定性亦藉由使用分析型量熱技術(例如DSC)量測組合物之比熱或熱容量(Cp)來評估。組合物之比熱為1 mol水之溫度提昇1℃所需之能量(例如以千卡/莫耳為單位)。較大Cp為變性或失活蛋白質組合物之標誌。組合物熱容量之變化(△Cp)藉由測定組合物在其熱轉變前後之比熱進行量測。熱穩定性亦可藉由量測或測定熱力學穩定性之其他參數來評估，該等參數包括展開之吉布斯自由能(Gibbs free energy)(△G)、展開之焓(△H)或展開之熵(△S)。一或多種上述生物化學分析(例如熱攻擊分析)用於測定50%組合物保留其活性(例如結合活性)時之溫度(亦即TC值)。
此外，與未突變之scFv相比，scFv之突變改變scFv之熱穩定性。當突變之scFv併入LRP6構築體中時，突變之scFv 賦予整個LRP6構築體熱穩定性。在一個實施例中，scFv包含賦予scFv熱穩定性之單個突變。在另一實施例中，scFv包含賦予scFv熱穩定性之多個突變。在一個實施例中，scFv中之多個突變對scFv之熱穩定性具有累加效應。
b)聚集%
組合物之穩定性可藉由量測其聚集傾向來測定。聚集可利用許多非限制性生物化學或生物物理學技術進行量測。舉例而言，組合物之聚集可使用層析(例如尺寸排阻層析法(SEC))進行評估。SEC基於尺寸分離分子。管柱經聚合凝膠之半固體珠粒填充，該等珠粒將允許離子及小分子而非大分子進入其內部。當將蛋白質組合物施加至管柱頂部時，緊密摺疊之蛋白質(亦即非聚集蛋白質)經由可供較大蛋白質聚集體利用之較大體積溶劑分佈。因此，較大聚集體經由管柱較快速移動，且混合物可以此方式分離或分級分離成其組分。各溶離份可在其自凝膠溶離時分別定量(例如藉由光散射)。因此，藉由將溶離份之濃度與施加至凝膠之蛋白質之總濃度比較，可測定組合物之聚集%。穩定組合物以基本上單一溶離份之形式自管柱溶離，且在溶離概況或層析圖中以基本上單峰之形式呈現。
c)結合親和力
組合物之穩定性可藉由測定其標靶結合親和力來評估。用於測定結合親和力之多種方法為此項技術中已知。一種用於測定結合親和力之例示性方法採用表面電漿子共振。表面電漿子共振為光學現象，其藉由例如使用BIAcore系 統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden及Piscataway N.J.)，偵測生物感測器基質內蛋白質濃度之變化，而允許分析實時生物特異性相互作用。關於進一步描述，參見Jonsson,U.等人(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson,U.,i(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson,B.等人(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；及Johnnson,B.等人(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
其他抗體片段
其他抗體片段，諸如Fab、scFab，亦可用於產生LRP6構築體。單鏈抗體亦可用於LRP6構築體，諸如「疏芽(disbud)」，其由兩條鏈組成，各鏈包含與利用短肽連接子連接之同一多肽鏈上之輕鏈可變區連接之重鏈可變區，其中同一鏈上之該兩個區並不彼此成對，而是與另一鏈上之互補域成對以形成雙特異性分子。製備雙功能抗體之方法為此項技術中已知(參見例如Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448及Poljak等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。
域抗體(dAb)可用於LRP6構築體，其為抗體之小功能結合片段，對應於抗體之重鏈或輕鏈之可變區。域抗體較好地表現於細菌、酵母及哺乳動物細胞系統中。域抗體及其製造方法之更多細節為此項技術中已知(參見例如美國專利第6,291,158號、第6,582,915號、第6,593,081號、第6,172,197號、第6,696,245號；歐洲專利0368684及0616640；WO 05/035572、WO 04/101790、WO 04/081026、 WO 04/058821、WO 04/003019及WO 03/002609)。奈米抗體來源於抗體之重鏈。
奈米抗體通常包含單個可變域及兩個恆定域(CH2及CH3)，且保留原始抗體之抗原結合能力。奈米抗體可藉由此項技術中已知之方法進行製備(參見例如美國專利第6,765,087號、美國專利第6,838,254號、WO 06/079372)。單抗體由IgG4抗體之一條輕鏈及一條重鏈組成。單抗體可藉由移除IgG4抗體之鉸鏈區來製備。單抗體及其製備方法之更多細節可見於WO 2007/059782。
半衰期延長分子
本發明提供LRP6結合物，其包含至少一個LRP6結合部分及至少一個半衰期延長分子，使得LRP6構築體結合至LRP6，且在不增強Wnt信號之情況下抑制Wnt信號傳導，且展示活體外及活體內增長之半衰期。半衰期延長分子延長LRP6構築體在抑制Wnt信號路徑中之治療作用。因此，LRP6構築體具有諸如以下之所需性質：至少5小時、至少10小時、至少15小時、至少20小時、至少25小時、至少30小時、至少35小時、至少40小時或40小時以上之增長之活體內半衰期。可採用數種方法來改良重組蛋白質之血清半衰期，該等方法包括聚乙二醇化、糖基化、融合至抗體Fc域、人血清白蛋白(HSA)、聚唾液酸(PSA)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合配位體及碳水化合物保護物(carbohydrate shield)；藉由遺傳融合至結合至血清蛋白(例如HSA)、IgG、FcRn、Fc及運鐵蛋白之蛋白質；藉由 偶合(以遺傳方式或以化學方式)至結合至血清蛋白之其他LRP6結合部分，諸如奈米抗體、Fab、DARPin、高親和性多聚體(avimer)、親和體及抗運載蛋白(anticalin)；或藉由併入奈米載體、緩釋調配物或醫療裝置中。
(i)人血清白蛋白
在一個實施例中，本發明提供LRP6構築體，其包含連接至人血清白蛋白(HSA)之至少兩個LRP6結合部分。HSA(一種具有585個胺基酸之呈其成熟形式之蛋白質)為造成相當大比例之血清滲透壓之原因，且亦充當內源性及外源性配位體之載體。白蛋白作為載體分子之作用及其惰性本質為用作活體內多肽之載體及輸送體之所需性質。WO 93/15199、WO 93/15200及EP 413 622中已提出白蛋白用作作為多種蛋白質之載體之白蛋白融合蛋白質的組分。亦已提出HSA之N端片段用於融合至多肽(EP 399 666)。因此，藉由以遺傳方式或以化學方式使抗體或其片段融合或結合至白蛋白，可穩定或延長存放期，及/或活體外及/或活體內在溶解狀態中保留分子活性持續延長之時間。
白蛋白融合至另一蛋白質可藉由遺傳操作達成，以使針對HSA編碼之DNA或其片段連接至針對蛋白質編碼之DNA。適合之宿主隨後以經融合之核苷酸序列轉型或轉染，以便配置在適合之質體上來表現融合多肽。表現可活體外由例如原核生物或真核細胞實現，或活體內例如由轉殖基因生物體實現。與HSA融合體有關之其他方法可見於例如WO 2001077137及WO 200306007中，其以引用之方式 併入本文中。在一特定實施例中，融合蛋白質之表現在哺乳動物細胞株(例如CHO細胞株)中進行。
在一個實施例中，HSA為具有SEQ ID NO：209之野生型HSA。
dahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl(SEQ ID NO：209)。
在另一實施例中，HSA為具有SEQ ID NO：210之突變HSA。
Dahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqspfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefqaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl(SEQ ID NO：210)。
相對於野生型HSA，突變之HSA具有兩個胺基酸取代(亦即「C34S」及「N503Q」取代，如SEQ ID NO：210中所述)。此突變之HSA含有兩個胺基酸取代(亦即絲胺酸取代胺基酸殘基34處之半胱胺酸(「C34S」)及麩醯胺酸取代胺基酸殘基503處之天冬醯胺(「N503Q」))。位置34處之半胱胺酸殘基(亦即C34)可突變成除半胱胺酸以外之任何胺基酸殘基(例如絲胺酸、蘇胺酸或丙胺酸)。同樣，位置503處之天冬醯胺殘基(亦即N503)可突變成除天冬醯胺以外之 任何胺基酸殘基(例如麩醯胺酸、絲胺酸、組胺酸或丙胺酸)。特定言之，絲胺酸對胺基酸殘基34處之半胱胺酸之取代引起HSA之氧化減少及蛋白質非均質性。在野生型HSA中，胺基酸殘基503處之天冬醯胺對脫胺作用敏感，可能引起藥理學半衰期縮短。麩醯胺酸對胺基酸殘基503處之天冬醯胺之取代在投與哺乳動物(例如人類)或其細胞、組織或器官時可引起HSA之藥理學半衰期增長，且相應地引起包括HSA之LRP6構築體之藥理學半衰期增長。
本發明另外提供一種LRP6結合物，其使用截斷之野生型HSA多肽形成，在有或無附接連接子之情況下連接至LRP6結合部分。缺乏全長野生型HSA胺基酸序列(亦即SEQ ID NO：209)之1、2、3、4、5、10、15、20、50、100、200個或200個以上胺基酸之野生型HSA多肽可連接至本文中所述之任何LRP6結合部分。截斷可出現在HSA之一端或兩端，或可包括內部殘基之缺失。一個以上胺基酸殘基之截斷無需為線性的(亦即連續的)。野生型HSA之實例包括與一或多個附接連接子或LRP6結合部分結合之野生型HSA，其具有HSA之域I(SEQ ID NO：209之「DI」殘基1至197)、HSA之域II(SEQ ID NO：209之「DII」殘基189至385)或HSA之域III(SEQ ID NO：209之「DIII」殘基381至585)中之一或多者或其組合(例如HSA之域I及域II、域I及域III、以及域II及域III)。LRP6結合物之血清清除率可藉由測試含有截斷之野生型HSA之結合物來最優化。
半衰期延長劑(例如HSA)可(但不必)藉由HSA中胺基酸 殘基之特定位點化學修飾進行修飾。HSA之正確摺疊之三級結構展示蛋白質外表面上之某些胺基酸殘基。化學反應性胺基酸殘基(例如半胱胺酸)可取代此等表面暴露之殘基以允許其他藥劑之特定位點結合。
或者或此外，半衰期延長劑(例如HSA)可視情況藉由自HSA序列添加或移除天冬醯胺、絲胺酸或蘇胺酸殘基來修飾，以改變此等胺基酸殘基之糖基化。添加至HSA中之糖基化位點可為表面暴露的。引入HSA中之糖基或其他碳水化合物部分可直接結合至診斷劑、治療劑或細胞毒性劑。
半衰期延長劑(例如HSA)之表面暴露之胺基酸殘基可經半胱胺酸殘基取代以允許診斷劑、治療劑或細胞毒性劑之化學結合。暴露於HSA(當摺疊成其天然三級結構時)之表面上之半胱胺酸殘基允許診斷劑、治療劑或細胞毒性劑特異性結合至硫醇反應性基團(諸如順丁烯二醯亞胺或鹵乙醯基)。與蛋白質中任何其他胺基酸官能基(諸如離胺酸殘基之胺基或N端胺基)相比，半胱胺酸殘基之硫醇官能基對順丁烯二醯亞胺基之親核反應性高約1000倍。碘乙醯基及順丁烯二醯亞胺試劑中之硫醇特異性官能基可與胺基反應，但需要較高pH值(>9.0)及較長反應時間(Garman,1997,Non-Radioactive Labelling：A Practical Approach,Academic Press,London)。蛋白質中游離硫醇之量可使用標準埃爾曼氏分析(Ellman's assay)進行估算。在一些情況下，需要用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或硒醇之試劑還原二硫鍵(Singh等人，Anal.Biochem.304：147-156(2002))，以產生反應性 游離硫醇。
半胱胺酸取代之位點可藉由分析HSA之表面可接近性來鑑別。表面可接近性可表示為可由溶劑分子(例如水)接觸之表面積(例如平方埃)。水佔據之空間近似為具有1.4埃半徑之球體。用於計算蛋白質之各胺基酸之表面可接近性之軟體可免費獲得或可獲許可。舉例而言，晶體學程式之CCP4套件，其採用演算法以已知X射線晶體分析得出之座標計算蛋白質之各胺基酸的表面可接近性(「The CCP4 Suite：Programs for Protein Crystallography」Acta.Cryst.D50：760-763(1994)；www.ccp4.ac.uk/dist/html/INDEX.html)。溶劑可接近性亦可使用自Swiss Institute of Bioinformatics下載之免費軟體DeepView Swiss PDB Viewer進行評估。半胱胺酸在表面暴露位點處之取代允許反應性半胱胺酸結合至連接至診斷劑或治療劑之硫醇反應性基團。糖基化
此外，改變之血清清除率可藉由使糖基化位點工程化至半衰期延長劑(例如HSA)中來達成。在某些實施例中，HSA可經糖基化。多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X表示除脯胺酸以外之任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中此等三肽序列中之任一者之存在產生潛在糖基化位點。O連接型糖基化係指糖N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者連接至羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，不過亦可使用 5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
藉由改變胺基酸序列，方便地實現HSA之糖基化位點之添加或缺失，以產生上述三肽序列中之一或多者(用於N連接型糖基化位點)。藉由對HSA之序列之一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基之添加、缺失或取代(用於O連接型糖基化位點)，亦可作出改變。HSA上之所得碳水化合物結構亦可用於細胞毒性劑、免疫調節劑或細胞生長抑制劑之特定位點結合。
半衰期延長分子(諸如HSA)可藉由直接或間接與LRP6結合部分(例如scFv)連接而併入LRP6結合物中。術語「直接」連接係指LRP6結合部分緊密結合至半衰期延長劑，以使LRP6結合部分與半衰期延長劑之間不存在間隙。術語「間接」連接係指LRP6結合部分並非緊密結合至半衰期延長劑，而是經由LRP6結合部分與半衰期延長分子之間的胺基酸「附接連接子」結合至半衰期延長劑。胺基附接連接子之實例包括(但不限於)完全包含以下各者之連接子：甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、白胺酸或纈胺酸殘基連接子或此等殘基之任何組合。此等胺基酸附接連接子之長度可為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或20個以上胺基酸，且提供LRP6結合部分與半衰期延長劑之間的可撓性繫栓(tether)。胺基酸附接連接子可連接(例如以共價方式(例如肽鍵)、以離子方式、或疏水性結合、或經由高親和力蛋白-蛋白結合相互作用(例如生物素及抗生物素蛋白 (avidin))至半衰期延長劑(諸如HSA或突變之HSA)之C端或N端。
(ii)Fc融合體
本發明提供LRP6構築體，其包含至少一個LRP6結合部分及至少一個半衰期延長分子，該半衰期延長分子為Fc分子。天然抗體分子由兩個相同重鏈及兩個相同輕鏈組成。重鏈恆定區包括CH1、鉸鏈區、CH2及CH3。番木瓜蛋白酶消化抗體，產生兩個片段，Fab及Fc。Fc片段由CH2、CH3及一部分鉸鏈區組成。已認識到Fc區為維持IgG類抗體之血清半衰期之關鍵(Ward及Ghetie,Ther.Immunol.2：77-94(1995))。研究已發現IgG抗體之血清半衰期藉由Fc結合至新生Fc受體(FcRn)來介導。FcRn為雜二聚體，其由跨膜α鏈及可溶性β鏈(β2-微球蛋白)組成。分子生物學技術之進展已允許製備具有多個功能域之新穎嵌合多狀。最常見之該等嵌合多肽為免疫球蛋白(Ig)融合蛋白質。此等蛋白質由融合至無關蛋白質或蛋白質片段之抗體(通常為小鼠或人類抗體)之Fc區組成。
如本文所用之術語「Fc」係指包含抗體之恆定域之CH3、CH2及至少一部分鉸鏈區的多肽。Fc區視情況可包括某些抗體種類中存在之CH4域。Fc可包含抗體之恆定域之全部鉸鏈區。在一個實施例中，本發明包含抗體之Fc及CH1區。在一個實施例中，本發明包含抗體之Fc及CH3區。在另一實施例中，本發明包含來自抗體恆定域之Fc、CH1區及Cκ/λ區。例示性修飾包括一或多個域中之一或多 個胺基酸之添加、缺失或取代。可包括該等變化以最優化效應功能、半衰期等。
包含Fc作為半衰期延長劑之LRP6結合物可利用標準重組DNA技術或利用蛋白質合成技術(例如藉由使用肽合成儀)進行製造。舉例而言，編碼Fc融合蛋白質之核酸分子可利用習知技術(包括自動DNA合成儀)進行合成。或者，可使用在兩個連續基因片段之間產生互補突出物之錨定引子進行基因片段之PCR擴增，該兩個連續基因片段隨後可退火且再擴增以產生嵌合基因序列(參見例如「Current Protocols in Molecular Biology」,Ausubel等人編，John Wiley & Sons,(1992))。此外，編碼生物活性分子之核酸可選殖至含有Fc域或其片段之表現載體中，以使生物活性分子同框連接至恆定域或其片段。
用於將多肽融合或結合至抗體之恆定區之方法展示於實例部分中且為此項技術中已知。參見例如美國專利第5,336,603號、第5,622,929號、第5,359,046號、第5,349,053號、第5,447,851號、第5,723,125號、第5,783,181號、第5,908,626號、第5,844,095號及第5,112,946號；歐洲專利公開案EP 0 307 434、EP 0 367 166、EP 0 394 827；PCT公開案WO 91/06570、WO 96/04388、WO 96/22024、WO 97/34631及WO 99/04813；Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Traunecker等人，Nature 331：84-86(1988)；Zheng等人，J.Immunol.154：5590-5600(1995)； 及Vil等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341(1992)；WO 98/23289；WO 97/34631；美國專利第6,277,375號；WO 93/15199；WO 93/15200；WO 01/77137；及EP 413,622，其各自以全文引用之方式併入本文中。包含經修飾之Fc作為半衰期延長劑之LRP6構築體亦在本發明之範疇內。
(iii)聚乙二醇化
在另一實施例中，LRP6構築體包含至少一個半衰期延長分子，該半衰期延長分子為聚乙二醇(PEG)。為了延長活體內LRP6結合物之血清循環，經由PEG對LRP6結合部分之N端或C端之特定位點結合，或經由存在於離胺酸殘基上之ε-胺基，LRP6結合部分可在有或無附接連接子之情況下連接至惰性聚合物分子(諸如高分子量PEG)。為了聚乙二醇化，LRP6結合部分通常在一或多個PEG基團會附接至LRP6結合部分之條件下與聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)反應。聚乙二醇化可藉由與反應性PEG分子(或類似之反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之任何形式的PEG，諸如單(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。可使用引起極小生物活性損失之線性或分支聚合物衍生作用。可利用SDS-PAGE及質譜分析密切監測結合程度以確保PEG分子適當結合至LRP6結合部分，產生LRP6結合物。可藉由尺寸排阻或藉由離子交換層析自LRP6結合物 中分離未反應之PEG。可使用熟習此項技術者熟知之方法(例如藉由本文中所述之免疫分析)來測試LRP6結合物之結合活性以及活體內功效。用於聚乙二醇化蛋白質之方法為此項技術中已知(參見例如Nishimura等人之EP 0 154 316及Ishikawa等人之EP 0 401 384)。
其他經修改之聚乙二醇化技術包括重組化學正交引導之工程技術(ReCODE PEG)，其經由包括tRNA合成酶及tRNA之重組系統將化學指定之側鏈併入生物合成蛋白質中。此技術能夠在大腸桿菌、酵母及哺乳動物細胞中將大於30個新胺基酸併入生物合成蛋白質中。tRNA將非天然胺基酸併入琥珀密碼子(amber codon)所定位之任何位置，使琥珀由終止密碼子轉變成信號併有化學上指定之胺基酸之密碼子。
重組聚乙二醇化技術(rPEG)亦可用於血清半衰期延長。此技術涉及將300至600個胺基酸非結構化蛋白質尾部以遺傳方式融合至LRP6結合部分。因為該非結構化蛋白質鏈之表觀分子量比其實際分子量大約15倍，所以將大大增長LRP6結合部分之血清半衰期。與需要化學結合及再純化之傳統聚乙二醇化相反，該製造製程大大簡化且產物為均質的。
(iv)PSA
在另一實施例中，LRP6構築體包含至少一個半衰期延長分子，該半衰期延長分子為聚唾液酸(PSA)。聚唾液酸化為另一種技術，其使用天然聚合物PSA來延長有效壽命 且改良治療性肽及蛋白質之穩定性。PSA為唾液酸(一種糖)之聚合物。當用於蛋白質及治療性肽藥物傳遞時，聚唾液酸對結合提供保護性微環境。由此增長LRP6結合物在循環中之有效壽命且防止其被免疫系統識別。PSA聚合物天然可見於人體中。其被進化超過數百萬年之某些細菌用於包裹其壁。此等天然聚唾液酸化之細菌因而能夠藉助於分子擬態來阻撓身體之防禦系統。PSA，自然終極隱形技術，可易於以較大量及預定物理特徵自該等細菌製造。細菌PSA完全非免疫原性，即使當偶合至蛋白質時亦然，因為其在化學上與人體中之PSA相同。
(v)羥乙基澱粉化
在另一實施例中，LRP6構築體包含至少一個半衰期延長分子，該半衰期延長分子為羥乙基澱粉(「HES」)。HES衍生物連接至LRP6結合部分之用法可產生具有延長之半衰期之LRP6結合物。HES為來源於糯玉米澱粉之經改質之天然聚合物且可由身體之酶代謝。通常投與HES溶液以替代不足之血容量且改良血液之流變性。LRP6結合部分之羥乙基澱粉化藉由增強分子之穩定性以及藉由減少腎臟清除作用而實現循環半衰期之延長，產生增強之生物活性。藉由改變不同參數，諸如HES之分子量，可定製多種HESLRP6結合物。
LRP6構築體
本發明提供LRP6結合物，其包含至少一個LRP6結合部分及至少一個半衰期延長分子，使得LRP6構築體結合至 LRP6，且在不顯著增強Wnt信號之情況下抑制Wnt信號傳導，且展示活體外及活體內增長之半衰期。半衰期延長分子延長LRP6構築體在抑制Wnt信號路徑中之治療作用。因此，LRP6構築體具有諸如至少5小時之增長之活體內半衰期的所需性質。本發明係基於LRP6構築體具有抑制螺旋槳1(例如Wnt1)及螺旋槳3(例如Wnt3)配位體介導之信號傳導且避免增強Wnt信號之能力的發現。LRP6構築體之LRP6結合部分經設計以結合至不同的LRP6 β-螺旋槳區。LRP6構築體之至少一個LRP6結合部分包含結合至β-螺旋槳1域之螺旋槳1抗體或其片段，且阻斷螺旋槳1依賴性Wnt(諸如Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt9、Wnt10A、Wnt10B)以抑制Wnt 1信號轉導路徑；且LRP6構築體之至少一個LRP6結合部分包含結合至β-螺旋槳3域之螺旋槳3抗體或其片段，且阻斷螺旋槳3依賴性Wnt(諸如Wnt3a及Wnt3)以抑制Wnt3信號轉導路徑。除LRP6構築體之多重結合效應以外，LRP6構築體之半衰期亦因半衰期延長分子而增長。半衰期增長至少約5小時、至少10小時、至少15小時、至少20小時、至少25小時、至少30小時、至少35小時、至少40小時或40小時以上、至少10小時、至少15小時、至少20小時、至少25小時、至少30小時、至少35小時、至少40小時或40小時以上。
LRP6結合部分包括(但不限於)抗體(例如單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類化抗體及嵌合抗體)、抗體片段(例如scFv、scFab、Fab片段、Fab'2、SMIP、域抗體、雙 功能抗體、微型抗體、scFv-Fc、親和體、奈米抗體及域抗體)、受體、配位體、適體及具有已知結合搭配物之其他分子。在一個實施例中，LRP6構築體使用至少兩個scFv作為LRP6結合部分來產生。在一個實施例中，LRP6構築體使用至少一個Fab作為LRP6結合部分來產生。在一個實施例中，LRP6構築體使用至少一個scFab作為LRP6結合部分來產生。在一個實施例中，LRP6構築體使用LRP6結合部分之任何組合來產生。LRP6構築體之代表性實例展示於表2中。
LRP6構築體提供優於傳統抗體之益處，例如擴增標靶之所有組成部分、具有新穎結合特異性、增強之效能及無信號增強作用。單個LRP6構築體可結合至同一細胞上之單個LRP6靶受體上之多個螺旋槳區，且抑制Wnt信號傳導。在一個實施例中，LRP6構築體結合至選自由以下組成之群的β-螺旋槳區之任何組合：螺旋槳1(P1)、螺旋槳2(P2)、螺旋槳3(P3)及螺旋槳4(P4)。在一個實施例中，LRP6構築體結合至LRP6之螺旋槳1及螺旋槳3域。因此，單個LRP6構築體藉由結合至多個β-螺旋槳區而具有增強之作用效能，且抑制由各域介導之Wnt信號傳導。舉例而言，單個LRP6構築體藉由分別結合至螺旋槳1及螺旋槳3域兩者而抑制螺旋槳1及螺旋槳3介導之Wnt信號傳導，同時避免增強Wnt信號。
LRP6構築體可同時結合LRP6受體之多個結合部位。LRP6構築體之LRP6結合部分可結合LRP6受體之至少1、2、3、4、5、6、7、8個或8個以上結合部位。LRP6構築體可包含對同一LRP6受體上之不同抗原決定基(例如LRP6受體之β-螺旋槳1域或β-螺旋槳3域)具有特異性之一或多個LRP6結合部分。或者，LRP6構築體可包含對不同靶受體(例如LRP6及非LRP6之受體，諸如Erb、cmet、IGFR1、平滑受體(Smoothened)及刻痕受體(Notch receptor))上之抗原決定基具有特異性之LRP6結合部分。
在一個實施例中，兩個或兩個以上相同LRP6結合部分(亦即具有相同結構及結合親和力之部分)連接至半衰期延 長劑，一或多個(例如呈串聯形式)各自在半衰期延長劑(例如HSA)之胺基端及羧基端處，得到結合部分對其靶抗原之改良之親合力(例如scFv(P1)-scFv(P1)-HSA；scFv(P3)-scFv(P3)-HSA；HSA-scFv(P1)-scFv(P3))。或者，對兩個或兩個以上相同或不同靶分子具有結合親和力之兩個或兩個以上不同LRP6結合部分(例如Fab、scFv)(例如scFv(P1)-HSA-Fab(P3)、scFv(P3)-HSA-Fab(P1)、Fab(P1)-HSA-scFv(P3)、Fab(P3)-HSA-scFv(P1))、或對同一靶分子上兩個或兩個以上不同抗原決定基具有結合親和力之Fab或scFv可連接至半衰期延長劑(例如scFv(P3)-HSA-scFv(P1)、scFv(P1)-HSA-scFv(P3)、Fab(P1)-HSA-Fab(P3)、Fab(P3)-HSA-Fab(P1)、scFv(P1)-scFv(P3)-HSA、scFv(P3)-scFv(P1)-HSA)Fab(P1)-Fab(P3)-HSA、Fab(P3)-Fab(P1)-HSA)，以允許多個標靶抗原或抗原決定基被LRP6結合物結合。在另一實施例中，不同物種之LRP6結合部分亦可連接至LRP6結合物以在LRP6上給予例如兩種或兩種以上不同的結合特異性或促效/拮抗生物學性質。
在一個實施例中，LRP6構築體包含結合至LRP6受體之螺旋槳1區之scFv、半衰期延長分子(例如HSA)及結合至LRP6受體之螺旋槳3區之scFv。該構築體稱為「801」且具有scFv(P1)-HSA-scFv(P3)之構築體序列。
在一個實施例中，LRP6構築體包含結合至LRP6受體之螺旋槳3區之scFv、半衰期延長分子(例如HSA)及結合至LRP6受體之螺旋槳1區之scFv。該構築體稱為「802」且具 有scFv(P3)-HSA-scFv(P1)之構築體序列。
在另一實施例中，LRP6構築體包含結合至LRP6受體之螺旋槳1區之Fab、半衰期延長分子(例如HSA)及結合至LRP6受體之螺旋槳3區之Fab。該構築體稱為Fab(P1)-HSA-Fab(P3)。
在另一實施例中，LRP6構築體包含結合至LRP6受體之螺旋槳1區之scFv、半衰期延長分子(例如HSA)及結合至LRP6受體之螺旋槳3區之Fab。該構築體稱為scFv(P1)-HSA-Fab(P3)。
在另一實施例中，LRP6構築體包含結合至LRP6受體之螺旋槳1區之Fab、半衰期延長分子(例如PEG)及結合至LRP6受體之螺旋槳3區之Fab。該構築體稱為Fab(P1)-PEG-Fab(P3)。
在另一實施例中，LRP6構築體包含結合至LRP6受體之螺旋槳1區之scFv、半衰期延長分子(例如Fc)及結合至LRP6受體之螺旋槳3區之scFv。該構築體稱為scFv(P1)-Fc-scFv(P3)。
LRP6構築體取向
LRP6構築體使用至少一個LRP6結合部分(例如scFv及Fab)沿任何取向產生，只要所得LRP6構築體保留功能活性(例如抑制Wnt信號傳導)及延長之半衰期即可。應理解，可向半衰期延長劑之C端及/或N端中添加任何數目之LRP6結合部分，只要所得LRP6構築體保留功能活性(例如抑制Wnt信號傳導)即可。在一實施例中，1、2、3個或3個以上 LRP6結合部分連接至半衰期延長劑之C端。在其他實施例中，1、2、3個或3個以上LRP6結合部分連接至半衰期延長劑之N端。在其他實施例中，1、2、3個或3個以上LRP6結合部分連接至半衰期延長劑之N端及C端。舉例而言，LRP6構築體可包含連接至半衰期延長劑之C端及/或N端之相同類型之一個以上LRP6結合部分，例如scFv-半衰期延長劑-scFv。或者，LRP6構築體可包含連接至半衰期延長劑之C端及/或N端之不同類型之一個以上LRP6結合部分，例如scFv-半衰期延長劑-Fab。
可產生具有任何數目排列之LRP6結合部分及半衰期延長劑之LRP6構築體。在一個實施例中，半衰期延長劑為HSA。在另一實施例中，半衰期延長劑為Fc。在另一實施例中，半衰期延長劑為PEG。此等LRP6構築體可使用文中描述之方法及分析針對功能性進行測試。
LRP6結合物可藉由多種功能分析進行表徵。舉例而言，其可藉由以下表徵：其在如本文所述之Wnt基因分析中藉由抑制典型Wnt信號傳導而抑制生物活性之能力、其對LRP6蛋白質(例如人類及/或食蟹獼猴LRP6)之親和力、抗原決定基結合性、其對蛋白水解之耐受性及其阻斷Wnt路徑之能力。此外，藉由在Wnt配位體存在下增強Wnt信號之能力表徵LRP6結合物。多種方法可用於量測LRP6介導之Wnt信號傳導。舉例而言，Wnt信號傳導路徑可藉由以下方式監測：(i)量測β-索烴素之豐度及定位；及(ii)量測LRP6或其他下游Wnt信號傳導蛋白質(例如DVL)之磷酸 化；及iii)量測特定基因特徵或基因標靶(例如c-myc、Cyclin-D、Axin2)。
LRP6結合物-結合物
LRP6結合物可偶合至診斷劑或可偵測劑以產生LRP6結合物-結合物。該等LRP6結合物可適用於作為臨床測試程序之一部分(諸如測定特定療法之功效)監測或預測疾病或病症之發作、發展、進展及/或嚴重程度。該診斷及偵測可藉由使LRP6結合物偶合至可偵測物質來實現，該等可偵測物質包括(但不限於)：多種酶，諸如(但不限於)辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如(但不限於)抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生物素蛋白/生物素；螢光物質，諸如(但不限於)繖酮(umbelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光物質，諸如(但不限於)魯米諾(luminol)；生物發光物質，諸如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母素(aequorin)；放射性物質，諸如(但不限於)碘(131I、125I、123I及121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In及111In)、鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin；及使用多種正電子發射斷層攝影法之正電子發射金屬以及非放射性順磁性金屬離 子。
本發明另外涵蓋偶合至治療性部分之LRP6結合物之用途，該治療性部分諸如為細胞毒素(例如細胞抑制劑或殺細胞劑)、治療劑或放射性金屬離子(例如α發射體)。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害之任何藥劑。
LRP6結合物可偶合至放射性同位素以產生細胞毒性放射性藥物，亦稱為放射免疫結合物。可與抗體結合以達成診斷性或治療性用途之放射性同位素之實例包括(但不限於)碘131、銦111、釔90及鑥177。用於製備放射免疫結合物之方法建立於此項技術中。放射免疫結合物之實例可購得，包括ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)及BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，且類似方法可用於製備放射免疫結合物。在某些實施例中，巨環螯合劑為1,4,7,10-四氮環十二烷-N,N',N",N'''-四乙酸(DOTA)，其可經由連接子分子連接至LRP6結合物。該等連接子分子通常為此項技術中已知，且描述於以下中：Denardo等人，(1998)Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等人，(1999)Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；及Zimmerman等人，(1999)Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，其各自以全文引用之方式併入。
LRP6結合物製造
LRP6構築體可以重組方式製造。舉例而言，編碼LRP6結合部分及半衰期延長分子之核苷酸序列可表現(例如在質體、病毒載體中或以轉殖基因方式)於細菌(例如大腸桿菌)、昆蟲、酵母或哺乳動物細胞(例如CHO細胞)、或哺乳 動物組織、器官或生物體(例如轉殖基因齧齒動物、有蹄類動物(例如山羊)或非人類靈長類動物)中。在LRP6構築體表現於宿主細胞、組織或器官中之後，熟練技術人員可使用標準蛋白質純化方法(例如FPLC或親和層析法)來分離及純化LRP6構築體。
或者，LRP6構築體可以合成方式製造。舉例而言，LRP6構築體可藉由肽合成技術中一般確立之技術(諸如固相方法)進行製備。固相合成涉及向連接至不溶性支撐物或基質(諸如聚苯乙烯)之生長肽鏈中逐步添加胺基酸殘基。肽之C端殘基首先錨定至市售支撐物，其中該殘基之胺基經N保護劑(諸如第三丁氧羰基(tBoc)或茀基甲氧基羰基(FMOC))保護。用適合之脫保護劑(諸如在tBOC之情況下之TFA或針對FMOC之哌啶)移除胺基保護基，且用偶合劑(諸如雙環碳化二亞胺(DCC))添加下一個胺基酸殘基(呈N保護之形式)。在形成肽鍵後，自支撐物中洗去試劑。添加最終殘基之後，用適合之試劑(諸如三氟乙酸(TFA)或氟化氫(HF))自支撐物裂解試劑。必要時，LRP6構築體可以1、2、3個或3個以上區段之形式製造，該等區段隨後可經連接以形成完整LRP6構築體。
預防及治療用途
本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之LRP6結合物來治療與LRP6 Wnt信號傳導路徑有關之疾病或病症的方法。在一特定實施例中，本發明提供一種藉由向有需要之個體投與有效量之LRP6結合物來治療或預防癌症(例如 乳癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌及黑色素瘤)的方法。在一些實施例中，本發明提供藉由向有需要之個體投與有效量之LRP6結合物來治療或預防與Wnt信號傳導路徑有關之癌症的方法。
在一個實施例中，本發明提供治療與Wnt信號傳導路徑有關之癌症的方法，該等癌症包括(但不限於)乳癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝癌胃癌、前列腺癌、急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌及黑色素瘤。
LRP6結合物亦可用於治療或預防與異常或缺損Wnt信號傳導有關之其他病症，該等病症包括(但不限於)骨質疏鬆症、骨關節炎、多囊性腎病、糖尿病、精神分裂症、血管病、心臟病、非致癌性增生性疾病、纖維化及神經退化性疾病(諸如阿茲海默氏症(Alzheimer's disease))。Wnt信號傳導路徑在組織修復及再生中起關鍵作用。使細胞對Wnt信號傳導敏感之藥劑可用於針對許多病況(諸如骨疾病、黏膜炎、急性及慢性腎損傷及其他病況)促進組織再生。
適用於與LRP6結合物組合治療之藥劑包括能夠調節典型Wnt信號傳導路徑活性之此項技術中已知的標準護理藥劑(例如PI3激酶劑)。
醫藥組合物
LRP6結合物可在放射線療法或手術之前、同時或之後投與。舉例而言，罹患增生性病症(例如乳癌)之患者可在 靶向放射線療法或手術介入(例如乳房瘤切除術或乳房切除術)同時在癌性組織部位處接受單獨或與如本文所述之其他治療劑、細胞毒性劑或細胞毒性劑組合的LRP6結合物。適於與LRP6結合物組合使用之放射線療法包括近距離療法(brachy therapy)及靶向術中放射線療法(TARGIT)。
本文提供之醫藥組合物含有治療或診斷有效量之LRP6結合物，該LRP6結合物包括一或多個LRP6結合部分(例如抗體或抗體片段)。活性成分LRP6結合物(以一或多個LRP6結合部分製備)可經調配以用於多種藥物傳遞系統。一或多種生理學上可接受之賦形劑或載劑亦可包括於組合物中用於適當調配。適用於本發明之適合之調配物可見於Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA，第17版.(1985)中。關於用於藥物傳遞之方法之簡評，參見Langer Science 249：1527-1533(1990)。
醫藥組合物意欲用於非經腸、經鼻內、局部、經口或局部投藥，諸如藉由經皮方式，用於預防性及/或治療性治療。醫藥組合物通常非經腸(例如藉由靜脈內、肌肉內或皮下注射)、或藉由經口攝取、或藉由局部施用投與。因此，用於非經腸投藥之組合物可包括溶解或懸浮於可接受之載劑中的LRP6結合物，該可接受之載劑較佳為水性載劑，例如水、緩衝水、鹽水、PBS及其類似物。組合物視需要可含有醫藥學上可接受之助劑物質以接近生理條件，該等助劑物質諸如為pH值調節劑及緩衝劑、張力調節劑、 濕潤劑、清潔劑及其類似物。本發明亦提供用於經口傳遞之組合物，其可含有惰性成分，諸如用於調配錠劑、膠囊之黏合劑或填充劑及其類似物。此外，本發明提供用於局部投藥之組合物，其可含有惰性成分，諸如用於調配乳膏、軟膏之溶劑或乳化劑及其類似物。
此等組合物可藉由習知殺菌技術殺菌，或可經無菌過濾。所得水溶液可經包裝以按現狀使用或經凍乾，該凍乾製劑係在投藥之前與無菌水性載劑組合。製劑之pH值通常將在3與11之間，更佳在5與9之間或在6與8之間，且最佳在7與8之間，諸如為7至7.5。舉例而言，呈固體形式之所得組合物可以各自含有定量之LRP6結合物之多個單次劑量單元形式包裝於錠劑或膠囊的密封包裝中。呈固體形式之組合物亦可包裝於容器中以用於可變量，諸如包裝於為可局部施用之乳膏或軟膏設計的可壓縮管中。
含有有效量之LRP6結合物之組合物可投與哺乳動物(例如人類)用於預防性及/或治療性治療。在預防性應用中，含有LRP6結合物之組合物投與易於出現疾病或病況(例如癌症)或處於出現疾病或病況(例如癌症)風險之中的患者。該量定義為「預防性有效劑量」。在此用途中，精確量又視患者之健康狀態而定，但通常在以下範圍內：每劑約0.5 mg至約400 mg LRP6結合物(例如每劑10 mg、50 mg、100 mg、200 mg、300 mg或400 mg或400 mg以上)及每劑約0.1 μg至約300 mg一或多種免疫調節劑(例如每劑10 μg、30 μg、50 μg、0.1 mg、10 mg、50 mg、100 mg或200 mg)。LRP6結合物之劑量可每小時、每日、每週、每月或每年一或多次(例如每小時、每日、每週、每月或每年2、4、5、6、7、8、9、10、11或12次)預防性地投與患者。較通常，投與每週單次劑量之LRP6結合物。
在治療應用中，向已罹患疾病或病況(例如癌症、自體免疫疾病、心血管疾病、骨病、眼科病)之哺乳動物(例如人類)投與一定量的LRP6結合物劑量，該量足以治癒或至少部分停滯或減輕該疾病或病況之一或多種症狀及其併發症。足以實現此目的之量定義為「治療有效劑量」。有效用於此用途之量可視疾病或病況之嚴重程度及患者之一般狀態而定，但通常在每劑約0.5 mg至約400 mg LRP6結合物之範圍內(例如每劑10 mg、50 mg、100 mg、200 mg、300 mg或400 mg或400 mg以上)。LRP6結合物劑量可每小時、每日、每週、每月或每年一或多次(例如每小時、每日、每週、每月或每年2、4、5、6、7、8、9、10、11或12次)治療性地投與患者。較通常，投與每週單次劑量之LRP6結合物。
在若干實施例中，患者可接受在以下範圍內之LRP6結合物：每週一或多次(例如每週2、3、4、5、6或7次或7次以上)每劑約0.5 mg至約400 mg，較佳每週一或多次每劑約5 mg至約300 mg，且甚至更佳每週一或多次每劑約5 mg至約200 mg。患者亦可接受在約50 mg至約800 mg範圍內之雙週一次劑量之LRP6結合物或在約50 mg至約1,200 mg範圍內之每月一次劑量之LRP6結合物。
在其他實施例中，LRP6結合物以下列典型劑量範圍投與患者：每週約0.5 mg至每週約2000 mg、每週約1.0 mg至每週約1000 mg、每週約5 mg至每週約500 mg、每週約10 mg至每週約100 mg、每週約20 mg至每週約80 mg、每週約100 mg至每週約300 mg或每週約100 mg至每週約200 mg。在另一態樣中，對70 kg患者之投藥劑量可在以下範圍內：例如約1 μg至約5000 mg、約2 μg至約4500 mg、約3 μg至約4000 mg、約4 μg至約3,500 mg、約5 μg至約3000 mg、約6 μg至約2500 mg、約7 μg至約2000 mg、約μg至約1900 mg、約9 μg至約1,800 mg、約10 μg至約1,700 mg、約15 μg至約1,600 mg、約20 μg至約1,575 mg、約30 μg至約1,550 mg、約40 μg至約1,500 mg、約50 μg至約1,475 mg、約100 μg至約1,450 mg、約200 μg至約1,425 mg、約300 μg至約1,000 mg、約400 μg至約975 mg、約500 μg至約650 mg、約0.5 mg至約625 mg、約1 mg至約600 mg、約1.25 mg至約575 mg、約1.5 mg至約550 mg、約2.0 mg至約525 mg、約2.5 mg至約500 mg、約3.0 mg至約475 mg、約3.5 mg至約450 mg、約4.0 mg至約425 mg、約4.5 mg至約400 mg、約5 mg至約375 mg、約10 mg至約350 mg、約20 mg至約325 mg、約30 mg至約300 mg、約40 mg至約275 mg、約50 mg至約250 mg、約100 mg至約225 mg、約90 mg至約200 mg、約80 mg至約175 mg、約70 mg至約150 mg或約60 mg至約125 mg本文提供之HSA連接子結合物。給藥方案可經調整以提供最佳治療反應。在另一態樣中， LRP6結合物可以下列範圍投與：每隔一天約0.5 mg至每隔一天約500 mg，較佳每隔一天約5 mg至每隔一天約75 mg，更佳每隔一天約10 mg至每隔一天約50 mg，且甚至更佳每隔一天20 mg至每隔一天約40 mg。LRP6結合物亦可以下列範圍投與：每週三次約0.5 mg至每週三次約100 mg，較佳每週三次約5 mg至每週三次約75 mg，更佳每週三次約10 mg至每週三次約50 mg，且甚至更佳每週三次約20 mg至每週三次約40 mg。
在本發明方法之非限制性實施例中，LRP6結合物連續投與哺乳動物(例如人類)1、2、3或4小時；一天1、2、3或4次；每隔一天或每三天、四天、五天或六天；一週1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；兩週一次；一月1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30次；兩月一次；每六個月1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次；一年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次或半年一次。LRP6結合物可在治療方案期間以不同頻率投與。在其他實施例中，LRP6結合物可以相同頻率或以不同頻率投與患者。
達成所需治療效果所需之一或多種診斷劑或治療劑及LRP6結合物之量視許多因素而定，該等因素諸如為所選特定診斷劑或治療劑、投藥模式及接受者之臨床狀況。熟練技術人員將能確定一或多種診斷劑或治療劑及LRP6結 合物之適當劑量以達成所需結果。
包含有效量之LRP6結合物之組合物之單次或多次投藥可以由治療醫師選擇之劑量及模式進行。劑量及投藥時程可基於哺乳動物(例如人類)之疾病或病況之嚴重程度來確定及調節，該嚴重程度可在整個治療期間根據由臨床醫師通常實施之方法或本文中所述之方法進行監測。
LRP6結合物可直接或與此項技術中已知之任何醫藥學上可接受之載劑或鹽組合投與哺乳動物個體(諸如人類)。醫藥學上可接受之鹽可包括製藥工業中常用之無毒性酸加成鹽或金屬錯合物。酸加成鹽之實例包括有機酸，諸如乙酸、乳酸、雙羥萘酸、順丁烯二酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、丁二酸、苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸或其類似物；聚合酸，諸如鞣酸、羧甲基纖維素或其類似物；及無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸或其類似物。金屬錯合物包括鋅、鐵及其類似物。一種例示性醫藥學上可接受之載劑為生理鹽水。其他生理上可接受之載體及其調配物為熟習此項技術者已知且描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences，(第18版)，A.Gennaro編，1990,Mack Publishing Company,Easton,PA.Diagnostic and Therapeutic Applications中。
LRP6結合物可用於人類之診斷及治療應用，包括例如診斷或治療增生性疾病(例如癌症，諸如黑色素瘤、透明細胞肉瘤及腎癌)及自體免疫疾病(例如多發性硬化症、類 風濕性關節炎及葡萄膜炎)。人類增生性及自體免疫疾病之以下論述意欲提供熟練習藝人士關於LRP6結合物可如何應用於診斷及治療應用中之一般瞭解，且不欲限制本發明之範疇。
已充分描述之本發明藉由具有說明性且不欲進一步限制之以下實例及申請專利範圍進一步說明。
實例 實例1：產生抗LRP6單及雙互補位血清白蛋白融合體
此實例描述單特異性及雙互補位抗LRP6抗體之製造及表徵，該等抗體被設計為抗LRP6 Fab與血清白蛋白之融合體用於單特異性形式，以及抗LRP6 Fab及抗LRP6 scFv或scFab與血清白蛋白之融合體用於雙互補位形式。除與野生型小鼠血清白蛋白(MSA)之融合體以外，亦製備MSA或人血清白蛋白(HSA)中之游離半胱胺酸突變成絲胺酸(MSA(C：S)或HSA(C：S))之融合體。單特異性變異體藉由使MSA、MSA(C：S)或HSA(C：S)C端添加至抗LRP6 Fab而設計。雙互補位變異體藉由使抗LRP6 scFv或抗LRP6 scFab(在CL與VH之間具有6×Gly4Ser連接子之Fab)C端添加至抗LRP6 Fab MSA或抗LRP6 Fab MSA(C：S)/HSA(C：S)主鏈而設計。
(a)材料及方法
(i)融合至血清白蛋白之單特異性抗LRP6 Fab之產生
抗LRP6_MOR08168 Fab-MSA
自載體pMORPHx9-FH-MOR08168擴增MOR08168-VH， 且PCR產物經由NruI/BlpI選殖至載體pRS5a-MOR06706-MSA中(引物1：gctacgtcgcgattctggaaggcgtgcactgtcaggtgcaattggtggaaagc(SEQ ID NO：301)，引物2：gctacggctagctgagctaaccgtcaccag(SEQ ID NO：302))。所得載體稱作pRS5a-MOR08168-MSA。
自載體pMORPHx9-FH-MOR08168擴增MOR08168-VL，且PCR產物經由AgeI/HindIII選殖至載體pRS5a-hlambda-MOR06706中(引物3：gctacgaccggtgatatcgaactgacccagccg(SEQ ID NO：303)，引物4：gctacgaagcttcgtgccgccgccaaac(SEQ ID NO：304))。所得載體稱作pRS5a-hlambda-MOR08168。
抗LRP6_MOR08168 Fab-MSA(C：S)
MSA基因內之取代C58S藉由QuickChange定點變突誘發(Agilent)引入載體pRS5a-MSA-MOR08168中(引物5：cagtacctgcagaagtccagctacgacgagcac(SEQ ID NO：305)，引物6：gtgctcgtcgtagctggacttctgcaggtactg(SEQ ID NO：306))。
藉由PCR，隨後經由AgeI/AscI將PCR產物選殖至載體pRS5a-MSA-MOR0168_C58S中，而引入MSA基因內之取代C603S(引物7：ggcccacaagagcgagatcgccc(SEQ ID NO：307)，引物8：gcggccgcccggcgcgcctcatcagtgatggtgatgatggtgggccagggcgtccttggaccgggtcaccaggttggg(SEQ ID NO：308))。最後，基因最優化之MOR08168-VH自Geneart載體0924690_8168sc-fvCH1mut_cys擴增且經由MfeI/BlpI選殖至載體pRS5a-MSA-MOR08168_C58S_C603S中，所得載體 稱作pRS5a-MSA-MORO8168opt_C58S_C603S(引物9：tgtcaggtgcaattggtcgagtctggcggaggactg(SEQ ID NO：309)，引物10：ccttggtgctggctgagctg(SEQ ID NO：310))。基因最優化之MOR08168-VL自Geneart載體0924690_8168sc-fvCH1mut_cys擴增且經由AgeI/HindIII選殖至載體pRS5a-hlambda中。所得載體稱作pRS5a-hlambda-MOR08168opt(引物11：gcttccggacaccaccggtgacatcgagctgacccagcc(SEQ ID NO：311)，引物12：cagcacggtaagcttggtgcctccgccgaacaccag(SEQ ID NO：312))。
抗LRP6_MOR08168 Fab-HSA(C：S)
針對HSA-C：S編碼之DNA片段自載體pRS5aHSAcys中分離，且經由NheI/AscI選殖至pRS5a-MSA-MOR08168opt_C58S_C603S中。所得載體稱作pRS5a-MOR08168opt_HSA_C至S。如針對抗LRP6_MOR08168 Fab-MSA(C：S)所述，產生MOR08168-LC(pRS5a-hlambda-MOR08168opt)。
抗LRP6_MOR08545 Fab-MSA
針對MOR08545-VH編碼之基因最優化之DNA片段經由NruI/NheI自Geneart載體0814746_MOR08545_重鏈-乳腺中分離且選殖至載體pRS5a-h-IgG1(MV)-MSA中，所得載體稱作pRS5a-MSA-MOR08545。針對MOR08545-VL編碼之基因最優化之DNA片段經由AgeI/NarI自Geneart載體0814747_MOR08545_輕鏈_乳腺中分離且選殖至載體pRS5a-h-λ中，所得載體稱作pRS5a-h-λ-MOR08545。
抗LRP6_MOR06707 Fab-MSA
針對MOR06707-VH編碼之基因最優化之DNA片段經由NruI/NheI自Geneart載體0814748_MOR06707_重鏈_乳腺中分離且選殖至pRS5a-MSA-MOR08545中，所得載體稱作pRS5a-MSA-MOR06707。針對MOR06707-VL編碼之基因最優化之DNA片段經由AgeI/NarI自Geneart載體0814749_MOR06707_輕鏈_乳腺中分離且選殖至pRS5a-h-λ中，所得載體稱作pRS5a-h-λ-MOR06707。
抗LRP6_MOR06706 Fab-MSA
自載體pMORPHx9-FH-MOR06706擴增MORO6706-VH，且PCR產物經由NruI/NheI選殖至載體pRS5a(MV)-hIgG1-MSA-6707-SalI中(引物27：gctacgtcgcgattctggaaggcgtgcactgtcaggtgcaattggtggaaagc(SEQ ID NO：313)，引物28：gctacggctagctgagctaaccgtcaccag(SEQ ID NO：314))。所得載體稱作pRS5a-hIgG1-MOR06706-SalI-MSA。藉由QuickChange定點變突誘發(Agilent)移除載體pRS5a-hlambda-MOR06707中起始密碼子上游之HindIII位點(引物29：ggtccaactgcacggtagctttctagagccg(SEQ ID NO：315)，引物30：cggctctagaaagctaccgtgcagttggacc(SEQ ID NO：316))。在第二突變誘發步驟中，在載體pRS5a-hlambda-MOR06707-w/o-HindIII中在針對VL及CL編碼之序列區之間整合HindIII位點(引物31：gcggaacaaagcttaccgtgctgggcc(SEQ ID NO：317)，引物32：ggcccagcacggtaagctttgttccgc(SEQ ID NO：318))。自載體pMORPHx9-FH-MOR06706擴 增MOR06706-VL，且PCR產物經由AgeI/HindIII選殖至突變之載體pRS5a-hlambda-MOR06707中(引物33：gctacgaccggtgatatcgaactgacccagccg(SEQ ID NO：319)，引物34：gctacgaagcttcgtgccgccgccaaac(SEQ ID NO：320))。所得載體稱作pRS5a-hlambda-MOR06706。
抗LRP6 MOR06475 Fab-MSA
MOR06475 Fab使用載體pRS5a以VH前導序列融合至MSA之N端。在MOR06475與MSA之間存在鉸鏈連接子。鉸鏈連接子序列為DKTHT。所得載體稱作pRS5a-MSA-MOR6475501。蛋白質表現於293T懸浮細胞中且藉由KappaSelect純化。
抗LRP6 MOR06475 scFv-MSA
MOR06475 scFv使用載體pRS5a以VH前導序列沿LH取向融合至MSA之N端。在MOR06475 scFv與MSA之間存在(Gly4Ser)2連接子。在MSA之C端處存在His標記用於純化目的。所得載體稱作pRS5a-scFv6475-MSA 507。蛋白質表現於293T懸浮細胞中且藉由來自Qiagen之NTi樹脂純化。
(ii)基於與血清白蛋白之融合體之雙互補位抗LRP6構築體之產生
抗LRP6_MOR08168 Fab-MSA(C：S)MOR06475 scFv
BstEII限制性位點藉由QuickChange定點變突誘發(Agilent)引入載體pRS5a-MOR08168opt-HSA-C至S中，引物13：ggccagggcacacttgtgaccgtcagctc(SEQ ID NO：321)，引物14：gagctgacggtcacaagtgtgccctggcc(SEQ ID NO：322)。 所得載體稱作pRS5a-MOR08168opt-MSA-C58S-C603S_1BsteII_位點。自載體pRS5a-MOR06475-scFv擴增MOR06475 scFv，且PCR產物經由BstEII/XbaI選殖至載體pRS5a-MOR08168opt-MSA-C58S-C603S_1BsteII_位點中(引物15：ggccccaacctggtgacccggtccaaggacgccctggccggcggctccggcggaagcgatatcgtgctgacacagagccc(SEQ ID NO：323)，引物16：gtttaaacgggccctctagagcggccgcccggcgcgcctcagctggacactgtcaccagggttc(SEQ ID NO：324))。所得載體稱作pRS5a-MOR08168opt-MSA-C至S-6475scFv。如針對抗LRP6_MOR08168 Fab-MSA(C：S)所述，產生MOR08168-LC(pRS5a-hlambda-MOR08168opt)。
抗LRP6_MOR08168 Fab-HSA(C：S)MOR06475 scFv
AfeI限制性位點藉由QuickChange定點變突誘發(Agilent)引入載體pRS5a-MOR08168opt-HSA-C58S_C603S中，引物17：gcggccagtcaggcagcgcttggtttgtgatg(SEQ ID NO：325)，引物18：catcacaaaccaagcgctgcctgactggccgc(SEQ ID NO：326)。所得載體稱作pRS5a-MOR08168opt-HSA-C至S_AfeI。自載體pRS5a-hIgG1LALA-MOR08168opt-6475scFv擴增MOR06475-scFv，且PCR產物經由AfeI/XbaI選殖至pRS5a-MOR08168opt-HSA-C至S_AfeI中(引物19：caggcagcgcttggtttgggcggctccggcggaagcgatatcg(SEQ ID NO：327)，引物20：gggtttaaacgggccctctagagc(SEQ ID NO：328))。所得載體稱作pRS5a-MOR08168opt-HSA-C至S-6475-scFv。如針對抗LRP6_MOR08168 Fab-MSA(C：S)所 述，產生MOR08168-LC(pRS5a-hlambda-MOR08168opt)。
抗LRP6_MOR08168 Fab-HSA(C：S)MOR06475 scFab
自載體pRS5a-hkappa-linker-hIgG1LALA-MOR06475擴增MOR06475 scFab(針對在CL與VH之間具有6×Gly4Ser連接子之完整IgG1LALA編碼)，且PCR產物經由AfeI/XbaI選殖至載體pRS5a-MOR08168opt-HSA-C至S_AfeI中(引物21：caggcagcgcttggtttgggcggctccggcggaagcgatatcgtgctgacccagagcc(SEQ ID NO：329)，引物22：gccctctagagcggccgcccggcgcgcctcatcagcagctcttgggctccactctcttg(SEQ ID NO：330))。所得載體稱作pRS5a-MOR08168opt-HSA-C至S-6475-scFab。如針對抗LRP6_MOR08168 Fab-MSA(C：S)所述，產生MOR08168-LC(pRS5a-hlambda-MOR08168opt)。
(iii)單特異性及雙互補位抗LRP6 Fab MSA/MSA(C：S)/HSA(C：S)融合體之短暫表現
在BioWave20中以下列條件將3 L至4 L HEK293細胞在V3培養基(批號D07668B)中培養至2×106個活細胞/毫升之密度：搖晃10 rpm；角度7°；充氣25公升/小時，25% O2，6% CO2。在V3培養基中用1 L至2 L DNA：PEI-MIX短暫性轉染細胞(質體：5 mgHC+5 mg LC+20 mg PEI)。轉染6小時後，向培養物中添加5 L儲料培養基(Novartis；批號09-021)。隨後，細胞以下列條件進一步培養：搖晃24 rpm；角度：7°；充氣25公升/小時，25% O2，0%至6% CO2。轉染7至10天後，使用0.2 μm Fresenius過濾器掃流過濾，移除細胞。之後，使用來自Fresenius之10 kDa截止 過濾器掃流過濾，使無細胞物質濃縮至1.75 L。濃縮物經由stericup過濾器(0.22 μm)無菌過濾。在4℃下儲存無菌上清液。
所有所述抗LRP6 Fab融合變異體均以與如上所述方式類似之方式進行表現。
(iv)單特異性及雙互補位抗LRP6 Fab MSA/MSA(C：S)/HSA(C：S)融合體之純化
使用具有10 ml CaptureSelect Fab λ親和性基質(BAC #0849.10)之新鮮消毒(0.5 M NaOH/30%異丙醇)之XK16/20管柱，在冷卻箱中在4℃下在ÄKTA 100 explorer Air層析系統上進行純化。除裝載1 ml/min以外，所有流動速率均為2 ml/min。以10 CV PBS(由10×製得，Gibco)平衡管柱，隨後經濃縮及無菌過濾之醱酵上清液(約1 l)以1.0 ml/min裝載。用10 CV PBS洗滌管柱。隨後，以5 CV 100 mM甘胺酸/HCl緩衝液(pH 3.0)溶離Fab融合體。溶離液以3 ml溶離份之形式收集於含有0.3 ml 1 M Tris/HCl(pH 9.0)之管中。將池無菌過濾(Millipore Steriflip，0.22 μm)，在Lambda 35 Spectrometer(Perkin Elmer)中量測OD 280 nm，且基於序列資料計算蛋白質濃度。針對聚集(SEC-MALS)及純度(SDS-PAGE、LAL及MS)分別測試池，且基於結果，僅進一步使用中心池。在第二純化步驟中，將來自第一純化之池裝載至新鮮消毒(0.5 M NaOH/30%異丙醇)之HiLoad 26/60-Superdex200管柱(GE-Healthcare)中，用PBS以1 ml/min進行運作，溶離液以4 ml溶離份之形式收集且如針 對第一純化步驟所述進行分析。
所有所述雙互補位抗LRP6 Fab融合變異體均以與如上所述方式類似之方式進行純化。
(v)與多角度光散射偵測器偶聯之尺寸排阻層析(SEC-MALS)
在連接至三角度光散射偵測器(miniDAWN Treos,Wyatt Technology,Santa Barbara,CA,USA)之Agilent 1200 HPLC系統(Agilent Technologies)上進行SEC-MALS量測。使用值為0.186 ml/g之特定折光指數增值(dn/dc)，用示差折射器(Optilab rEX,Wyatt Technology)在線追蹤樣品之濃度(Wen等人，1996 Anal Biochem.240：155-66)。在Superdex 200 10/300 GL管柱(GE Healthcare)上注射50 μl體積之樣品。記錄資料且使用ASTRA V軟體(Wyatt Technology)處理。為了測定偵測器延遲體積及MALS偵測器之標準化係數，使用BSA樣品(Sigma，目錄號A8531)作為參考。既不應用削峰亦不應用譜帶增寬修正。
實例2：雙互補位LRP6抗體半分子之產生
此實例描述雙互補位抗LRP6 IgG1 LALA抗體半分子之製造及表徵。抗體半分子使用鉸鏈突變(半胱胺酸至甘胺酸或絲胺酸)之組合進行工程化，以防止二硫鍵形成及CH3突變(F405T及Y407D)破壞非共價鍵。雙互補位變異體藉由使抗LRP6 scFv C端融合至抗LRP6抗體半分子來設計。亦製造具有額外CH2及CH3(F405T，Y407D)域之變異體。
(a)材料及方法
(i)雙互補位LRP6抗體半分子之產生
抗LRP6_MOR08168 hIgG1LALA(突變鉸鏈F：T；Y：D)MOR06475 scFv
MOR08168opt-hIgG1LALA之鉸鏈區內之兩個半胱胺酸在載體pRS5a-hIgG1LALA-MORO8168opt-6475scFv中藉由QuickChange定點變突誘發(Agilent)取代成甘胺酸(引物23：caagacccacaccggcccccccggcccagccccagaggc(SEQ ID NO：331)，引物24：gcctctggggctgggccgggggggccggtgtgggtcttg(SEQ ID NO：332))。此外，藉由QuickChange定點變突誘發(Agilent)，將取代F至T及Y至D引入載體pRS5a-hIgG1LALA-MOR08168opt-6475scFv_突變_鉸鏈之CH3域中，引物25：gcgacggcagcttcaccctggacagcaagctgacc(SEQ ID NO：333)，引物26：ggtcagcttgctgtccagggtgaagctgccgtcgc(SEQ ID NO：334)。所得載體稱作pRS5a-hIgG1LALA-MOR08168opt-6475scFv_突變-鉸鏈_F至T_Y至D。如針對前述實例中之抗LRP6_MOR08168 Fab-MSA(C：S)所述，產生MOR08168-LC(pRS5a-hlambda-MOR08168opt)。
抗LRP6_MOR08168 hIgG1LALA 2(CH2_CH3)(突變鉸鏈F：T；Y：D)MOR06475 scFv
針對hIgG1LALA(突變鉸鏈F：T；Y：D)之整個CH2/3域編碼之經基因最優化之DNA片段自DNA2.0載體49692_CLONED中分離，且經由AfeI/BamHI選殖至載體pRS5a-hIgG1LALA-MOR08168opt-6475scFv_突變-鉸鏈_F至T_Y至D中。所得載體稱作pRS5a-hIgG1LALA- MOR08168opt-2xCH2/3-6475scFv_突變-鉸鏈_F至T_Y至D。如針對前述實例中之抗LRP6_MOR08168 Fab-MSA(C：S)所述，產生MOR08168-LC(pRS5a-hlambda-MOR08168opt)。
(ii)雙互補位抗LRP6抗體半分子之短暫表現
如以上實例1中所述進行短暫表現。
(iii)雙互補位抗LRP6抗體半分子之純化
抗LRP6_MOR08168 hIgG1LALA(突變鉸鏈F：T；Y：D)MOR06475 scFv
使用5 ml HiTrap蛋白質G管柱(GE-Healthcare)，在冷卻箱中在4℃下在ÄKTA 100 explorer Air層析系統上進行雙互補位抗體半分子之純化。除裝載1 ml/min以外，所有流動速率均為3 ml/min。以10 CV PBS(由10×製得，Gibco)平衡管柱，隨後經濃縮及無菌過濾之醱酵上清液(約1 L)以1.0 ml/min裝載。用10 CV PBS洗滌管柱。隨後，以100 mM甘胺酸/HCl緩衝液(pH 4.5)至100 mM甘胺酸/HCl緩衝液(pH 2.5)(12 CV)進而6 CV 100 mM甘胺酸/HCl緩衝液(pH 2.0)之梯度溶離抗體半分子。合併對應於所偵測之峰之溶離份(1 ml)，且藉由添加10體積%之1 M Tris/HCl(pH 9.0)來中和。將池無菌過濾(Millipore Steriflip，0.22 μm)，在Lambda 35 Spectrometer(Perkin Elmer)中量測OD 280 nm，且基於序列資料計算蛋白質濃度。針對聚集(SEC-MALS)及純度(SDS-PAGE、LAL及MS)分別測試池，且基於結果，僅進一步使用中心池。
抗LRP6_MOR08168 hIgG1LALA 2(CH2_CH3)(突變鉸鏈 F：T；Y：D)MOR06475 scFv
使用5 ml HiTrap MabSelect Sure管柱(GE-Healthcare)，在冷卻箱中在4℃下在ÄKTA 100 explorer Air層析系統上進行雙互補位抗體半分子之純化。所有流動速率均為5 ml/min。以5 CV PBS(由10×製得，Gibco)平衡管柱，隨後經濃縮及無菌過濾之醱酵上清液(約1 l)以5.0 ml/min裝載。依序用5 CV PBS以及5 CV 50 mM檸檬酸鹽、90 mM NaCl(pH 5.5)洗滌管柱。隨後，抗體半分子用5 CV 50 mM檸檬酸鹽、90 mM NaCl(pH 3.0)以4 ml溶離份之形式溶離。合併對應於所偵測之峰之溶離份，且藉由添加1 M NaOH中和至pH 6至pH 7。將池無菌過濾(Millipore Steriflip，0.22 μm)，在Lambda 35 Spectrometer(Perkin Elmer)中量測OD 280 nm，且基於序列資料計算蛋白質濃度。針對聚集(SEC-MALS)及純度(SDS-PAGE、LAL及MS)分別測試池，且基於結果，僅進一步使用中心池。
(iv)與多角度光散射偵測器偶聯之尺寸排阻層析(SEC-MALS)
如本申請案之實例1進行SEC-MALS。
實例3：抗LRP6單及雙互補位血清白蛋白融合體及雙互補位LRP6抗體半分子之表現、純化及表徵
所有經血清白蛋白融合之構築體均成功地經表現及純化。經純化之產物藉由SDS-PAGE檢查且展示對應於其預期尺寸之條帶。利用質譜分析(MS)之進一步驗證展示抗LRP6 MOR08168 Fab-HSA(C：S)MOR06475-scFv、抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA(C：S)MOR06475-scFv、抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA、抗LRP6 MOR08168 Fab-HSA(C：S)及抗LRP6 MOR06706-MSA對應於其預期質量(分別為140207 Da、139611 Da、113851 Da、113594 Da及113931 Da)，但具有在N端處之焦麩胺酸。來自抗LRP6 MOR08168 Fab-HSA(C：S)MOR06475-scFab之輕鏈亦對應於其預期質量(22837 Da)，且重鏈利用胰蛋白酶肽質量指紋(MALDI-TOF及MALDI-TOF/TOF)進行驗證。如由SEC MALS所測定，所有抗LRP6單及雙互補位血清白蛋白融合體之聚集均小於6%。
雙互補位抗LRP6 IgG1抗體半分子亦較好地以單體形式表現。利用SDS-PAGE偵測對應於其預期尺寸之條帶。利用MS之進一步驗證展示MOR08168-hIgG1LALA(突變鉸鏈F：T；Y：D)MOR06475-scFv及MOR08168-hIgG1LALA 2(CH2_CH3)(突變鉸鏈F：T；Y：D)MOR06475-scFv對應於其預期質量(分別為98536 Da及123301 Da)，但具有在N端處之焦麩胺酸以及糖基化。如由SEC MALS所測定，兩個變異體之聚集均小於6%。
質譜分析：
利用質譜分析來分析針對此工作產生之所有分子以檢查其完整性及純度。應用標準QC方法，其由完整分子之LC-MS分析組成，且在樣品之下列處理之後利用至少一次LC-MS分析：(i)去糖基化；(ii)還原；(iii)還原及去糖基化；(iv)還原及羧基醯胺甲基化。
在抗LRP6 MOR08168 Fab-HSA(C：S)MOR06475-scFab之情況下，必需利用胰蛋白酶肽定位來確認重鏈之一致性。
LC-MS儀器：
在直接偶聯至質譜儀之Waters Acquity UPLC系統上進行液相層析(LC)。溶劑A：2% CH3CN/H2O 0.1%甲酸，及溶劑B：CH3CN 0.1%甲酸。以下列梯度在MassPrep柱體(0.4 mL/min，Waters)上分離完整樣品(4 μg)：在5分鐘內0% B至90% B。以下列梯度以0.1 μL/min之流動速率在POROS 10 R1管柱(150×1 mm，Morey)上分離經處理之樣品(4 μg)：在0.5分鐘內0% B至22% B，隨後在10分鐘內達至44% B，隨後在1分鐘內達至90% B，在90% B下保持2分鐘，隨後回至0% B。
在120℃之源溫、250℃之去溶劑化溫度、40 V之樣品錐設置下，以正性V模式操作電噴霧電離飛行時間(ESI_TOF)質譜儀(Waters Q_TOF Premier質譜儀)，且將伴以0.05秒內掃描延遲之0.95 Hz掃描速率用於在整個分析中獲取資料。在完整及經處理之樣品量測中，將毛細管電壓設為1.5 kV及2.8 kV，且分別以1000至6000及600至2000之m/z範圍獲取質譜。解旋ESI-TOF光譜後進行評估。
樣品處理：
(i)去糖基化：
將25 μg經凍乾之人類IgG溶解於含有0.4 M NH4HCO3之5 μL 8 M脲中。隨後依序添加37 μL 50 mM NH4HCO3(pH 8.3)、5 μL反應緩衝液G7及1.6 μL PNGaseF(New England Biolabs,Ipswich,MA)，且將混合物在37℃下培育70分鐘。
(ii)還原：
25 μg經凍乾之人類IgG在溶解於5 μL 8 M脲/0.4 M NH4HCO3(pH 8.3)中之後用1.2 μL 1 M DTT還原(在50℃下在氮氣下持續30分鐘)，隨後添加5 μL 50 mM NH4HCO3(pH 8.3)。
(iii)還原/去糖基化
25 μg經凍乾之人類IgG在溶解於5 μL 8 M脲/0.4 M NH4HCO3及5 μL 50 mM NH4HCO3(pH 8.3)中之後用1.2 μL 1 M DTT還原。在50℃下培育30分鐘後，依序添加5 μL反應緩衝液G7及32 μL 50 mM NH4HCO3(pH 8.3)以及1.6 μL PNGaseF(New England Biolabs,Ipswich,MA)，且將混合物在37℃下培育70分鐘。
(iii)還原/羧基醯胺甲基化
將100 μg經凍乾之人類IgG溶解於80 μL 8 M脲/g 0.4 M NH4HCO3(pH 8.3)中，隨後在添加2.3 μL 1 M DTT之後，將混合物放在氮氣下且在50℃下培育30分鐘。溶液隨後冷卻至室溫，添加6.5 μL 1 M碘乙醯胺，且在室溫下在黑暗中將混合物培育30分鐘。藉由添加10%甲酸達到pH 3至pH 4來停止反應。
MALDI-MSMS分析：
將經羧基醯胺甲基化之樣品(iv)注射於HPLC上用於各鏈之脫鹽及收集。收集約4.4 μg HC，且在SpeedVac上乾燥。 在經羧基醯胺甲基化之HC溶解(5 μl 8 M脲0.4 M NH4HCO3+40 μl 0.4 M NH4HCO3+1 μl 1 M Tris(pH 10))之後，添加1 μl胰蛋白酶(1 μg/μl，Promega)且在37℃下靜置培育隔夜。藉由添加10%甲酸達到pH 3至pH 4來停止反應。
所獲得之消化物之等分試樣(2 μL)藉由ZipTipC18(Waters)純化，且以乙腈/0.1% TFA H2O(50/50)在具有2 μl基質HCCA之MALDI靶上直接溶離。分別以正性反射器及LIFT模式獲取MALDI-TOF MS及MSMS(Autoflex III,Bruker)光譜。藉由針對自用序列資料庫MASCOT搜索，進行資料評估。
實例4：抗LRP6單及雙互補位血清白蛋白融合體及雙互補位LRP6抗體半分子在Wnt報導體基因分析中之活體外活性之評估
在Wnt1及Wnt3a響應性螢光素酶報導體基因分析中測試抗LRP6單及雙互補位血清白蛋白融合體及雙互補位LRP6抗體半分子抑制Wnt信號傳導之能力。如下文所述，用Wnt3a條件培養基、藉由Wnt 1或Wnt3a表現質體之共轉染或藉由與Wnt1或Wnt3a過度表現細胞共培養來刺激細胞。
(i)使用條件培養基之Wnt3a報導體基因分析
將3×104個HEK293-STF細胞/孔接種至96孔組織培養盤中，且在37℃/5% CO2下在100 μL培養基中將細胞培育隔夜。
翌日，各種抗LRP6構築體稀釋液在PBS中製備成20×溶 液。自96孔組織培養盤中移出20微升/孔之上清液，且替換為5微升/孔抗LRP6構築體稀釋液及15 μL條件培養基。
在37℃/5% CO2下培育16至24小時後，添加100 μL BrightGlo螢光素酶試劑(Promega)，且將盤培育10分鐘。使用Perkin Elmer Envision或Molecular Devices Spectramax M3/M5盤讀取器測定發光。
(ii)使用經短暫轉染之細胞之Wnt1/Wnt3a報導體基因分析
將3×104個HEK293T/17細胞/孔接種至96孔組織培養盤(Costar #3903)中，且在37℃/5% CO2下在100 μL培養基中培育細胞。12至16小時後，用Wnt表現質體(1奈克/孔)、pTA-Luc-10xSTF(螢火蟲螢光素酶構築體)(50奈克/孔)及phRL-SV40(海腎螢光素酶構築體)(0.5奈克/孔)轉染細胞。
製備含有上列質體及0.2 μL FuGene6/孔(Roche)之轉染預混物(10微升/孔)。轉染預混物在室溫下培育15分鐘且隨後分配至孔中。盤在室溫下以400 rpm搖晃2分鐘，且隨後在37℃/5% CO2下培育4小時。4小時轉染培育後，抗體在培養基中稀釋成20×溶液，且添加至經轉染之細胞中(5微升/孔)。
24小時後，添加75微升/孔DualGlo螢光素酶試劑(Promega)，且將盤搖晃10分鐘以達成細胞溶解，隨後如上所述讀出螢火蟲螢光素酶活性。讀出發光後，添加75微升/孔DualGlo停止及發光試劑(Promega)，且再量測發光以測定海腎螢光素酶活性。為了分析，計算螢火蟲螢光素酶活性與海腎螢光素酶活性之間的比率。針對抗LRP6構築 體之IC50測定，使用GraphPad Prism分析相對螢光素酶值。
(iii)Wnt1/Wnt3a共培養報導體基因分析
使用Wnt1或其他Wnt配位體過度表現細胞(例如CHO-K1或L-細胞)與穩定STF報導體細胞株(HEK293、NIH/3T3、TM3、PA1、MDA-MB435、MDA-MB231)之共培養，亦可進行類似分析。簡言之，將4×104個STF報導體細胞以30微升/孔塗於96孔TC盤(Costar #3903)中。以30微升/孔添加2×104個穩定Wnt配位體表現細胞。最後，每孔添加30 μl 3×抗體稀釋液。盤在37℃/5%CO2下培育40至48小時，且藉由以下方式測定螢光素酶信號：每孔添加90 μl BrightGlo螢光素酶試劑(Promega)，在室溫下在適度振盪之情況下培育10分鐘，且用適合之盤讀取器(例如Molecular Devices SpectramaxM3或M5)量測發光信號。以與無抗體對照(100% Wnt誘導)之比率之形式量測活性百分比。
結果
單價血清白蛋白融合分子抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA、抗LRP6 MOR08168 Fab-HSA(C：S)、抗LRP6 MOR08545 Fab-MSA、抗LRP6 MOR06706 Fab-MSA、抗LRP6 MOR06475 Fab-MSA及抗LRP6 MOR06475 scFv-MSA之活性展示於圖1中。MOR08168、MOR08545及MOR06706來源之分子為Wnt1刺激之報導體基因活性而非Wnt3a刺激之報導體基因活性的強力抑制劑，而 MOR06475來源之MSA融合構築體為Wnt3a驅動之信號傳導而非Wnt1驅動之信號傳導的強力抑制劑。
抗LRP6雙互補位血清白蛋白融合體及雙互補位LRP6抗體半分子之活性總結於圖2中。資料展示該等構築體能夠抑制Wnt1及Wnt3a驅動之信號傳導。
實例5：活體內抗LRP6血清白蛋白構築體之藥物動力學及藥效學性質之評估
在非腫瘤負載小鼠以及此項技術認可之稱為MMTV-Wnt1之經遺傳工程化之小鼠模型中，進一步活體內表徵數種抗LRP6 Fab與血清白蛋白構築體之藥物動力學(PK)及藥效學(PD)性質。來源於MMTV-Wnt1轉殖基因小鼠之乳腺腫瘤為Wnt1依賴性：舉例而言，使用經四環素調節之系統關閉Wnt1表現(Gunther等人，(2003),Genes Dev.17,488-501)或使用Fz8CRDFc阻斷Wnt(DeAlmeida等人，(2007)Cancer Research 67,5371-5379)，活體內抑制腫瘤生長。
為了在非腫瘤負載小鼠中測定抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA之PK性質，裸小鼠以單次劑量5 mg/kg之抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA靜脈內給藥。藉由質譜分析測定在輸注完成後多個時間點(分別為2小時、8小時、24小時、72小時、120小時、168小時、240小時及336小時)下MSA構築體之血清濃度，且結果展示於圖3中。質譜分析測定抗體及抗體樣變異體血清濃度之用法係基於描述於US2007/088258中之詳情，其以引用之方式併入本文中。藉由添加鹽酸至67 mM之最終濃度，將樣本pH值調節至 3.5±0.25。隨後添加胃蛋白酶，達至2微克胃蛋白酶/微升血清之最終濃度，且將盤加蓋，短暫離心且渦旋。在烘箱中在37℃下進行2小時消化。
在胃蛋白酶消化完成後，樣本以2 M脲/1%脫氧膽酸鈉(DOC)/10 mM DTT/50 mM碳酸氫銨(pH 7.8)稀釋5×，且將盤渦旋。盤在58℃下在烘箱中培育2小時以促進DTT對二硫鍵之還原。將IAA添加至20 mM之最終濃度，且將盤在環境溫度下在黑暗中培育1小時以使游離半胱胺酸殘基羧基醯胺甲基化。添加0.75微克豬/微升血清。將盤加蓋，短暫離心且渦旋。樣本在37℃下在烘箱中消化隔夜。翌日添加甲酸至1%(v/v)之最終濃度以終止消化。
在真空歧管中使用Oasis MCX 96孔30 μm、30 mg盤(Waters Corp.)藉由固相萃取(SPE)淨化消化物。在稍許修改之情況下遵循製造商推薦之方案。簡言之，依序用1.0 mL甲醇及1.0 mL HPLC級水預洗Oasis MCX孔。裝載樣本，且隨後依序用2×1 mL 1%乙酸及2×1 mL甲醇洗滌。隨後，使用1 mL 5%氫氧化銨/(50%甲醇、45%乙醇)溶離至96孔2 mL收集盤中。樣本蒸發至乾燥且儲存在-50℃下。在HPLC-MS/MS分析之前，在1%三氟乙酸中新鮮復原消化物。
將2.5 μL血清等效物注射至Agilent 1100毛細管HPLC上。在以SRM模式操作之Quantum Vantage(Thermo-Fisher)上進行MS/MS分析。藉由以下方式測定濃度值：將標準化為內標肽之代表抗LRP6分子之單肽之峰面積比與藉由將 抗LRP6分子連續稀釋至相應基質中而產生的標準曲線進行比較。
亦評估抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA對MMTV-Wnt1腫瘤中Wnt信號傳導之作用。在此等研究中，MMTV-Wnt1腫瘤以單次劑量5 mg/kg之抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA靜脈內(IV)給藥，且經14天之時間分析抗體之血清濃度以及β-索烴素靶基因Axin2之mRNA表現。結果展示於圖4中。抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA之終末半衰期為約17小時。此外，在抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA於血清中之含量降低時回收之腫瘤中觀察到Axin2 mRNA表現顯著降低。用抗LRP6 MOR06706-MSA及抗LRP6 MOR06706 Fab進行類似研究。與以抗LRP6 MOR08168 Fab及MSA融合體獲得之資料一致，MOR06706 Fab之終末半衰期為約2.7小時。與此相比，伴侶MSA融合體之半衰期為約17小時。此外，與抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA相似，在投與抗LRP6 MOR06706 Fab-MSA之後，觀察到Axin2 mRNA之時間及濃度依賴性變化(圖5)。
總而言之，此等結果提示融合至MSA可增長抗LRP6 Fab分子之血清半衰期。資料進一步展示Wnt1類特異性血清白蛋白構築體可在MMTV-Wnt1異種移植物中抑制Wnt信號傳導，且此抑制與血清濃度相關。
實例6：抗LRP6血清白蛋白構築體在MMTV-Wnt1同種異體移植模型中之活體內抗腫瘤功效之評估
除PK-PD研究以外，亦在以上實例5中所述之MMTV- Wnt1模型中測定抗LRP6血清白蛋白構築體之功效。在此等研究中，MMTV-Wnt1腫瘤片段經皮下(SC)植入雌性裸小鼠中。植入19天後，用媒劑IgG(4 mg/kg，IV，每週一次(qw))或LRP6-螺旋槳1 8168-Fab-MSA(6 mg/kg，IV，每週三次(3qw))處理攜帶MMTV-Wnt1腫瘤之小鼠(n=8，平均179 mm3；範圍：92 mm3至380 mm3)，且每週兩次對腫瘤測徑。LRP6-螺旋槳1 8168-Fab-MSA展示抗腫瘤活性(90%消退，p<0.05)且結果展示於圖6中。
實例7：聚乙二醇化8545方法及活體外表徵
(i)抗LRP6_MOR08545 Fab構築體之產生
在pMORPHx9-FH-MOR08545上用引物對(引物35：ccgttgcgccgactgaggcctgctgataagcatgcgtagg(SEQ ID NO：335)，引物36：cctacgcatgcttatcagcaggcctcagtcggcgcaacgg(SEQ ID NO：336))進行突變誘發，以便產生pMORPHx9-FH-MOR08545-2cys。隨後用引物對(引物38：cactggctggtttcgctaccg(SEQ ID NO：337)；引物39：cgggtggctccaatggtgatggtgatggtggaattcttatcagcagcttttcggttccacttttttatc(SEQ ID NO：338))自載體pMORPHx9-FH-MOR08545-2cys擴增MOR08545-VH及VL，且PCR產物以EcoRI/XbaI限制酶消化且連接至以相同酶消化之載體pFAB-ExpCol中。所得構築體稱為pFAB-ExpCol/MOR08545-2Cys。
(ii)抗LRP6 MOR08545 Fab之微生物表現
將質體pFAB-ExpCol/MOR08545-2Cys轉型至大腸桿菌BL21(DE3)細胞中。在220 rpm、30℃、pH 7.0±0.1下，在 以2×YT培養基+0.1%葡萄糖裝填之100 L生物反應器中培養經轉型之大腸桿菌細胞。在0.8之OD550下，細胞以IPTG誘導且藉由在再培育8小時之後離心收穫。將100 g濕細胞集結粒部分再懸浮於800 mL溶解緩衝液(100 mM TrisHCl，10 mM EDTA，pH 7.5)中，且在55℃、400 rpm下進行溶解16小時。添加600 U Benzonase及5 mL MgCl2×6H2O(1 M)且在室溫下再攪拌1小時後，周質提取物藉由離心(1小時，11000 g，4℃)收集，經合併及清除之提取物使用來自Fresenius之10 kDa截止過濾器藉由掃流過濾濃縮至2 L。
(iii)抗LRP6 MOR08545 Fab之純化
使用新鮮消毒之XK26/20蛋白質A瓊脂糖凝膠FF管柱，在冷卻箱中在4℃下在ÄKTA-3D層析系統上進行純化。除加載1 ml/min以外，所有流動速率均為2 ml/min。以10 CV PBS平衡管柱，隨後經濃縮及無菌過濾之周質提取物(約2 L)以1.0 ml/min裝載。將管柱洗滌2次，一次用含有0.5 M精胺酸之10 CV PBS且一次僅用10 CV PBS。
隨後，用5 CV 50 mM檸檬酸鹽(pH 3.0)、140 mM NaCl溶離Fab。收集溶離液，且立即用1 M Tris(pH 9.0至pH 10)中和至pH 7.0。池經無菌過濾(Millipore Steriflip，0.22 μm)，用NanoDrop分光光度計量測OD 280 nm，且基於序列資料計算蛋白質濃度。針對聚集(SEC-MALS)、純度(SDS-PAGE及MS)及低內毒素(LAL測試)測試池。基於此等結果，僅進一步使用中心池。
(iv)抗LRP6 MOR08545 Fab之聚乙二醇化
在Zeba管柱上進行緩衝液交換，達至100 mM K-磷酸鹽，2 mM EDTA，pH 7.5。為了還原鏈間二硫化物，用40 mM TCEP處理Fab，隨後在室溫下適度振盪30分鐘。使用Zeba管柱及如上所述之相同條件重複TCEP移除。為了聚乙二醇化，向經還原之Fab中添加20倍莫耳過量之SUNBRIGHT-ME-200MA(NOF Corporation Japan)，隨後在室溫下振盪隔夜。樣品以1：4之比率與40 mM CH3COOH混合。使用緩衝液A(25 mM CH3COOH，pH 4.5)及緩衝液B(75 mM CH3COOH，150 mM，pH 8.0)之步長梯度，在TSK-凝膠SP-5PW陽離子交換上分離聚乙二醇化加合物，且進一步測試具有附接至鏈間半胱胺酸之兩個20 kd PEG之Fab溶離份。
(v)抗LRP6 MOR08545 Fab-2×PEG20之活性
使用如實例4中所述之經Wnt1刺激及經Wnt3a刺激之報導體基因分析來評估抗LRP6 MOR08545 2c-Fab-2×PEG20之活體外活性。當與親本MOR08545 Fab、MOR08545 Fab-MSA(參見實例4，圖1)及MOR08545-2c-Fab相比時，抗LRP6 MOR08545 2c-Fab-2×PEG20在經Wnt1刺激及經Wnt3a刺激之分析中均具有類似效能(圖7)，表明PEG部分之添加並不明顯改變MOR08545抑制Wnt信號傳導之能力。
使用如實例4中所述之經Wnt1刺激及經Wnt3a刺激之報導體基因分析來評估抗LRP6 MOR08545 2c-Fab-2×PEG20 之活體外活性。當與親本MOR08545 Fab、MOR08545 Fab-MSA(參見實例4，圖1)及MOR08545-2c-Fab相比時，抗LRP6 MOR08545 2c-Fab-2×PEG20在經Wnt1刺激及經Wnt3a刺激之分析中均具有類似效能(圖7)，表明PEG部分之添加並不明顯改變MOR08545抑制Wnt信號傳導之能力。
實例8：雙特異性HSA融合蛋白質之產生。
材料及方法
構築體
scFv6475 VH及VL序列係來自抗LRP6 MOR08168 IgG1LALA MOR06475 scFv(SEQ ID NO：166)。scFv6475沿VL-(Gly4Ser)4-VH取向以各種前導序列選殖至pNAT43載體中，以實現其對表現之作用的測試。同樣，scFv8168 VH及VL序列係來自抗LRP6 MOR08168hIgG1LALA6475 scFv。scFv8168沿VH-(Gly4Ser)4-VL取向以pelB前導序列選殖至pNAT43載體中。向C端中添加TEV切割位點及His標記以用於純化。
針對HSA融合雙互補位構築體，將scFv8168融合至人血清白蛋白(HSA；SEQ ID NO：210)之N端，而將scFv6475融合至HSA之C端，以產生融合構築體801(SEQ ID NO：265)，如圖8中所示。scFv8168與HSA之間的連接子為AAS，而HSA與6475之間的連接子為AAAL。將兩點突變C34S及N503Q引入HSA中，以分別使氧化及脫胺之風險降至最低。此外，使scFv8168及scFv6475沿相對取向融合至 HSA以產生802(SEQ ID NO：269)，如圖8及圖9中所示。引入針對scFv8168之兩個有益突變(VH：S34M及S49A)及針對scFv6475之一個突變(VH：M100F)，以產生穩定型801T(T用於三重突變型)及802T(T用於三重突變型)。此等突變先前描述於國際第PCT/EP2011/057200號(2011年5月6日申請)及第PCT/EP2011/057202號(2011年5月6日申請)中，其以全文引用之方式併入本文中。
其他HSA融合雙互補位構築體以相應連接子及標記或在缺乏該等之情況下根據圖9構築。為了測定最佳形式，測試多種連接子：GS連接子(803T(SEQ ID NO：273)及804T(SEQ ID NO：275))、來自人類IgG1之上鉸鏈之KTHT(808T，SEQ ID NO：283)、無連接子(802T(SEQ ID：281)、801TF(SEQ ID NO：293)及802TF(SEQ ID NO：295))。此外，構築且評估經優化之scFv8168及scFv6475串聯連接之分子(812T，SEQ ID NO：285)及HSA定位於C端之分子(812T-HSA；SEQ ID NO：287)。亦產生單模組突變8168scFv-HSA(809T；SEQ ID NO：289)及突變6475scFv-HSA(810T；SEQ ID NO：291)分子。
在哺乳動物細胞中產生蛋白質且用Ni-NTA純化
構築體短暫表現於50 ml 293T懸浮細胞中。簡言之，PEI以1：3與50 μg DNA混合以達成最佳轉染效率。細胞以1.4×106個/毫升用於轉染。在250 ml濾紙燒瓶中在CO2箱中80 rpm振盪培育6天後，收集經轉染之細胞。將上清液濃縮至約1 ml以達成最佳蛋白質回收。藉由MagneHis套組根 據來自製造商之說明書手動純化蛋白質。經純化之蛋白質在更換緩衝液之情況下在PBS中透析隔夜。蛋白質樣品在透析之前或之後用於DSF分析。
非標記HSA融合分子之純化
將如上所述轉染之293T細胞以1500 g旋轉30分鐘。上清液通過0.8/0.2 μm Pall過濾器頂部單元過濾且在50 mM HEPES緩衝液(pH 7.5)中1：4稀釋。GE Q瓊脂糖凝膠快流珠粒(Sepharose Fast Flow bead)在使用之前依序於50 mM HEPES緩衝液、HEPES/1 M NaCl緩衝液及HEPES緩衝液中洗滌。向經稀釋之上清液中添加10 ml珠粒。混合物在旋轉下在4℃下培育2小時。將結合溶液與延長劑一起轉移至Bio-Rad 2.5×10 cm玻璃管柱中，且用25 ml 50 mM HEPES緩衝液洗滌。蛋白質使用溶離緩衝液(1 M NaCl，50 mM HEPES)以10 ml溶離份之形式溶離。溶離份使用GE Vivaspin 20 PES 5 kDa MWCO管柱濃縮至25 mg/mL，且隨後使用10 ml注射環裝載至HiLoad Superdex 200 26/60 SEC管柱上。管柱在4℃下用Gibco達爾伯克氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco's phosphate buffered saline)作為移動相以4 ml/min運作。收集5 ml溶離份且基於純度合併。
藉由差示掃描熱量測定(DSC)評估構築體
如上所述在哺乳動物293T細胞中表現以及純化後，將400 μl下列樣品注入MicroCal VP-毛細管DSC系統中以用於表徵其熱穩定性：13.88 μM 801、9.34 μM 801T、15.04 μM 802及9.75 μM 802T。隨後用由MicroCal提供之DSC分
析程式在Origin中分析DSC概況。
結果及討論
HSA融合分子之構築及最優化
使用穩定性經改良之scFv8168及scFc6475，設計及構築大量HSA融合構築體以用於結合活性以及穩定性之最優化。scFv8168中存在兩個突變(VH：S34M及S49A)且scFv6475中存在一個突變(VH：M100F)，因此，此等融合分子針對三重突變型稱為T。如圖10中所示，構築體中存在三個模組。在801T及803T中，作為模組1之scFv8168(VH：S34M及S49A)位於HSA(模組2)之N端，而作為模組3之scFv6475(VH：M100F)位於HSA之C端。對於802T及808T而言，scFv 6475(VH：M100F)位於HSA之N端，而scFv8168(VH：S34M及S49A)位於HSA之C端。scFv6475(VH：M100F)及scFv8168(VH：S34M及S49A)在812T中串聯融合，或在812T-HSA中後接HSA。
模組1與模組2之間的連接子稱為連接子1，且連接子2係指模組2與模組3之間的連接子。在801T及802T中，連接子1為AAS，連接子2為AAAL。在803T及804T中，連接子1為Gly4SerGlySer且連接子2為3×Gly4Ser。在808T中，鉸鏈連接子KTHT用於兩個連接子。801TF及802TF中不存在連接子，且802T無連接子。809包含經由4×Gly4Ser連接子連接之scFv8168及HSA。同樣，810包含經由4×Gly4Ser連接子連接之scFv6475及HSA。
HSA融合分子之表現及無標記純化
經His標記之HSA融合體以及未經標記之融合分子之表現在100 mg/L至200 mg/L範圍內。不同連接子修飾似乎並不影響在哺乳動物細胞中之表現(資料未展示)。如圖10中所示，未經標記之HSA融合分子之純化穩固，得到每公升約70毫克至80毫克之經純化之蛋白質。分子質量藉由LC-MS檢查，且分子量與預測之分子量一致(資料未展示)。
HSA分子之熱穩定性及聚集概況
比較801、802及其突變對應物之DSF及DSC分佈，將DSF中69℃下或DSC中71℃至72℃下之峰歸為來自HSA之峰。此資料與吾人內部資料(未展示)及HSA之Tm之文獻量測值(Michnik等人，2006,J Thermal Analysis Calorimetry,84(1)113-117)一致。DSC及DSF資料大部分類似，提示利用不同方法之量測的一致性(圖11)。三重突變型801T及802T展示相對於野生型對應物之顯著Tm改良，其中對於溫度勻變期間之第一熔點而言，801T相對於801增高7℃至9℃，且802T相對於802增高12℃至13℃。如圖12及圖13中所示，在三重突變型之情況下，完整融合分子之Tm變得較窄，提示融合分子之三種不同組分間之Tm較統一。
其中例外為812T，各種HSA融合分子之Tm在62℃至66℃範圍內(圖14)。一般而言，在scFv6475在HSA之N端且scFv8168在HSA之C端之取向情況下，Tm傾向於較高，如802T、804T、808T中所示，其中觀察到Tm分別為66℃、65.5℃及66℃。對於相對取向而言，如由801T及803T例示，所記錄之Tm分別為62℃及63℃。
利用分析型SEC評估聚集傾向。如圖15A中所示，當在4℃下儲存兩週時，802T之單體溶離份為98%，而對於801T而言單體溶離份為93%。在一次凍融後，802T之單體溶離份僅略微下降至97%，而對於801T而言，單體溶離份下降至91%(圖15B)。在多次凍融(至多4次)之後，802T之單體溶離份保持在99%(n=1)。一般而言，在多次凍融循環之後在若干HSA融合分子上觀察到聚集之極小變化，指示此等分子通常就聚集傾向而言為穩定蛋白質(參圖16)。亦令人感興趣的注意到，與如上所述之Tm中之趨勢一致，802T及804T與其同屬分子801T及803T相比均展示較少聚集。
在約2 mg/mL之濃度下，802TF之單體溶離份記錄為97.7%，且801TF為96.6%。當濃縮至約5 mg/mL時，802TF記錄為95.6%，且801TF為90.8%。結果與由濃度引起之聚集之一般趨勢一致。
實例9：利用ELISA評估HSA融合分子之結合活性
材料及方法
利用ELISA量測各種融合蛋白質(參見圖9)針對LRP6蛋白質之結合EC50。一般而言，在4℃下用2.5 μg/ml LRP6抗原(詳情參見下文)塗佈Maxisorp盤隔夜。盤用50 μl 2% BSA阻斷1小時，且用洗液(具有0.05%(v/v)Tween-20之PBS)洗滌五次。樣品相應地以1% BSA稀釋。將盤在室溫下培育1小時，且洗滌3次。藉由添加在1% BSA中1：2000稀釋之50 μl pentaHis-HRP(Qiagen材料號1014992)，在室溫下培育1小時且洗滌3次，來進行偵測。添加50 μl受質試劑 A加B(R&D Systems)，隨後視顏色而定培育5至20分鐘。藉由添加25 μl停止溶液來停止反應，隨後在450 nm下使用Biotek EL808盤讀取器讀取吸光度。
為了以均一方式量測融合分子之結合，所有分子均經生物素標記以由抗生蛋白鏈菌素-HRP偵測。將單特異性HSA融合分子(scFv8168-HSA(809)及scFv6475-HSA(810))用作對照。總體而言，使用三種抗原：LRP6螺旋槳域1-2(PD1/2，寄存編號NP002327之胺基酸殘基19至629)、LRP6螺旋槳域3-4(PD3/4，寄存編號NP002327之胺基酸殘基631至1246)及LRP6螺旋槳域1-4-Fc(PD1-4，LRP6-Fc；R&D Systems，目錄號：1505-LR)。
競爭ELISA
為了測定雙互補位構築體結合LRP6之多個域之能力，進行競爭ELISA。舉例而言，為了測定結合至LRP6螺旋槳域1-2(PD1/2)是否妨礙結合至其他LRP6螺旋槳域，在4℃下用5 μg/ml PD1/2塗佈Maxisorp盤隔夜。盤用50 μl 2% B SA阻斷1小時，且用洗液(具有0.05%(v/v)Tween-20之PBS)洗滌5次。含2 nM經生物素標記之HSA融合分子802T之1% BSA與緩衝液或在溶解狀態中之100 nM不同抗原(PD1/2、PD3/4或LRP6-Fc)混合。將混合物在室溫下培育30分鐘，隨後添加至分析盤中。將盤在室溫下再培育1小時，隨後用含有0.05%(v/v)Tween-20之PBS洗滌3次。如下進行偵測：添加在1% BSA中1：200稀釋之50 μl抗生蛋白鏈菌素-HRP(R&D Systems，目錄號890803)，且將盤在室溫 下培育1小時，隨後用含有0.05%(v/v)Tween-20之PBS洗滌3次。添加50 μl受質試劑A加B(R&D Systems，目錄號DY999)，隨後視顏色而定培育5至20分鐘。藉由添加25 μl停止溶液(R&D Systems，目錄號DY994)來停止反應，隨後在450 nm下使用Biotek EL808盤讀取器讀取吸光度。
將scFv8168或scFv6475用作對照。使用經LRP6 PD3/4及LRP6螺旋槳域1-4-Fc(PD1-4，LRP6-Fc；R&D Systems，目錄號：1505-LR)塗佈之分析盤進行類似競爭ELISA。
結果及討論
利用ELISA之結合評估
評估數種HSA融合分子(詳情參見圖9)之ELISA結合，且資料展示於圖17中。如圖17A及圖17B中所示，8168-HSA(809)以0.54 nM之EC50結合PD1/2，當結合至PD3/4時遠較弱(EC50：>75 nM)。相比之下，scFv 6475-HSA(810)以0.46 nM之EC50結合至PD3/4，且以大於158 nM之EC50結合至PD1/2。由此指示scFv8168及scFv6475分別差別地結合至LRP6 PD1/2及PD3/4。亦比較各種融合分子對LRP6-Fc之結合，且結果展示於圖17C中。此外，測試812T-HSA之ELISA結合，且如圖17D中所示，結合EC50估算值似乎與802T之估算值相似。此外，亦評估802TF對人類LRP6之結合，且結果呈現於圖17E中。在利用ELISA評估時，802TF亦展示對小鼠及食蟹獼猴LRP6之類似結合。
競爭ELISA
為了測定雙互補位分子是否可結合標靶且佔據LRP6完 整分子中之兩個不同的互補位，進行競爭ELISA分析。首先，針對抗原PD1/2或抗原PD3/4評估結合及競爭。如圖18A中所示，將PD1/2或PD3/4塗佈於盤表面上。隨後，2 nM 802T與在100 nM下之PD1/2、PD3/4或LRP6-Fc在溶解狀態下混合，且隨後塗覆至孔中。結果顯示呈溶解狀態之PD1/2可競爭802T對塗佈於表面上之PD1/2之結合，而PD3/4不能。相比之下，可溶性PD3/4可與802T競爭對結合PD3/4之盤而非結合PD1/2之盤的結合結合。正如所料，呈溶解狀態之LRP6 PD1-4(圖18A中之LRP6)可與802T競爭對塗佈於表面上之PD1/2及PD3/4抗原的結合。
進行其他實驗，其中LRP6-Fc之LRP6 PD1-4(R&D Systems，目錄號：1505-LR)固定化於ELISA盤上(圖18B)。在此等研究中，呈溶解狀態之100 nM PD1/2或PD3/4均不能與802T充分競爭結合經固定化之LRP6。然而，呈溶解狀態之LRP6能夠競爭結合。此等結果表明802T結合至LRP6上可能同時佔據兩個互補位。
實例10：在Wnt配位體驅動之報導體基因分析中評估HSA融合分子之活體外功能活性
使用與以上實例4中所述相同的方法，評估圖9中所述之HSA融合分子抑制經Wnt1刺激及經Wnt3a刺激之報導體基因的活性的能力。
使用經短暫性轉染之細胞形式測試801、801T、802及802T，且發現所有各者均為Wnt1及Wnt3a介導之信號傳導的強力抑制劑(圖19A)。亦使用此分析形式評估其他分子 (圖19B及圖19C)，且所產生之資料展示連接子之變化及存在/不存在His標記並不影響抗LRP6 HSA融合分子之效能。當使用共培養形式測試各種抗LRP6 HSA融合分子時獲得類似資料(未展示)。發現812T(其中2個scFv部分串聯融合)及812T-HSA(其中2個scFv部分串聯融合，隨後融合至HSA)之效能與802T之效能相似(圖19D)。此等結果與報導於實例9中之結合ELISA資料一致，且表明抗LRP6 scFv可沿數個取向且在HSA融合體處於不同位置之情況下保留效能。亦產生缺乏His標記及任何連接子之801T及802T之型式，當於報導體基因分析中測試時，發現801TF與802T效能相似，且觀察到802TF效能增強(圖19E)。
除HEK293細胞以外，在MDA-MB435黑色素瘤細胞中測定801T及802T抑制Wnt1及Wnt3a誘導之Wnt信號傳導之活性。在此等研究中，在共培養形式中用Wnt1及Wnt3a刺激經STF報導體穩定轉染之MDA-MB435細胞。將STF報導體之慢病毒(Lentivirus)包裝於HEK293T細胞中，且將病毒上清液用於感染MDA-MB435細胞。經穩定選擇之純系之池用於如以上實例4中所述之報導體基因共培養分析。除HEK293細胞以外，801T及802T在MDA-MB435細胞中均為Wnt信號傳導之強力抑制劑(圖20)。此資料另外表明抗LRP6 HSA融合分子抑制Wnt信號傳導之能力不限於HEK293細胞，且此等分子具有在廣泛範圍環境中抑制Wnt信號傳導之潛能。
實例11：活體內抗LRP6血清白蛋白構築體之藥物動力學 及藥效學性質之評估
在負載MMTV-Wnt1腫瘤之小鼠及非腫瘤負載大鼠中評估數種抗LRP6 HSA構築體之藥物動力學(PK)及藥效學(PD)性質。(DeAlmeida等人，(2007)Cancer Res.67,5371-5379)；Ettenberg等人，(2010)Proc.Nat.Acad.Sci.107,15473-15478；國際第PCT/EP2008/064821號(2008年10月31日申請)、第PCT/EP2011/057200號(2011年5月6日申請)及PCT/EP2011/057202(2011年5月6日申請)，其內容以引用之方式併入本文中)。
為了測定802T、802T無連接子及802T無his標記之PK性質，負載MMTV-Wnt1腫瘤之裸小鼠以單次劑量5 mg/kg上述分子靜脈內給藥。使用實例5中所述方法在輸注完成後之多個時間點(分別為0.5小時、2小時、8小時、24小時及48小時)下藉由質譜分析測定HSA構築體之血清濃度，且結果展示於圖21A中。所有分子之PK性質類似，且半衰期為約14小時。此外，在7小時、24小時及48小時之時間點下採集樣本以用於Wnt信號傳導抑制之分析。在此等樣本中，分析β-索烴素靶基因Axin2之mRNA表現之含量，且結果展示於圖21B中。與以上實例5中所述之抗LRP6 Fab MSA構築體及其他抗LRP6靶向劑獲得之資料一致，觀察到Axin2 mRNA表現降低，其幅度視抗LRP6 HSA分子之血清濃度而定(Ettenberg等人，(2010)Proc.Nat.Acad.Sci.107,15473-15478；國際第PCT/EP2008/064821號(2008年10月31日申請)、第PCT/EP2011/057200號(2011年5月6日申 請)及PCT/EP2011/057202(2011年5月6日申請)，其內容以全文引用之方式併入本文中)。與PK資料一致，所有3種分子(802T、802T無連接子及802T無his標記)在Axin2 mRNA含量方面展現類似變化(圖21B)。
為了評估801T、802T及802T無his標記之PK性質，未處理之史泊格多利大鼠(Sprague-Dawley rat)以單次劑量5 mg/kg上述分子靜脈內給藥。如實例5中所述在輸注完成後之多個時間點(分別為1小時、6小時、24小時、48小時、72小時、96小時及192小時)下藉由質譜分析測定HSA構築體之血清濃度，且802T之結果展示於圖22中。應注意96小時及192小時之時間點未報導值，因為其低於分析探測限。
亦評估802TF在負載MMTV-Wnt1腫瘤之裸小鼠中之PK性質。在此等研究中，負載MMTV-Wnt1腫瘤之裸小鼠以單次劑量6 mg/kg或24 mg/kg之802TF靜脈內給藥，且使用實例5中所述方法在輸注完成後之多個時間點(分別為1小時、2小時、8小時、24小時、48小時及72小時)下藉由質譜分析測定血清濃度。發現終末半衰期在6 mg/kg給藥後之18小時至24 mg/kg給藥後之24小時的範圍內。
實例12：在MMTV-Wnt1同種異體移植模型中評估抗LRP6血清白蛋白構築體之活體內抗腫瘤功效
在MMTV-Wnt1同種異體移植模型中評估抗LRP6螺旋槳1+3 scFv6475(VH：M95F)-HSA-scFv8168(VH：S34M及S49A)802T之抗腫瘤活性。MMTV-Wnt1腫瘤片段經皮下 (SC)植入雌性裸小鼠中。植入23天後，用媒劑(PBS，靜脈內(IV)，每週一次(qw))或LRP6-螺旋槳1+3 802T(2 mg/kg、4 mg/kg、6 mg/kg及8 mg/kg，iv，每週三次(3qw))處理攜帶MMTV-Wnt1腫瘤之小鼠(n=5，平均185 mm3；範圍：115 mm3至265 mm3)，且每週兩次對腫瘤測徑(圖23A)。802T展示劑量依賴性抗腫瘤活性，在8 mg/kg 3qw下達至10%之T/C(相對於媒劑p<0.05)。此外，在研究結束時評估各種劑量之802T對MMTV-Wnt1腫瘤中之Wnt信號傳導的作用。最後一次給藥7小時後收集腫瘤，且評估β-索烴素靶基因Axin2之mRNA表現。如圖23B中所示，與抗腫瘤作用一致，觀察到Axin2 mRNA表現降低。
在其他研究中，在MMTV-Wnt1同種異體移植模型中評估802T相對於抗LRP6 MOR08168-Fab-MSA之抗腫瘤活性。MMTV-Wnt1腫瘤片段經皮下(SC)植入雌性裸小鼠中。植入23天後，用媒劑(PBS，靜脈內(IV)，每週一次(qw))、802T(6 mg/kg、12 mg/kg及24 mg/kg，IV，每週三次(3qw))及LRP6螺旋槳1 8168-Fab-MSA(6 mg/kg，IV，3qw)處理攜帶MMTV-Wnt1腫瘤之小鼠(n=6，平均236 mm3；範圍：124 mm3至402 mm3)，且每週兩次對腫瘤測徑(圖24A)。802T展示劑量依賴性抗腫瘤活性，當以6 mg/kg 3qw給藥時，達至8%之T/C，且當分別以12 mg/kg及24 mg/kg 3qw給藥時，44%及98%消退(相對於媒劑兩者均p<0.05)。以6 mg/kg 3qw給藥之LRP6-螺旋槳1 8168-Fab-MSA引起94%消退(相對於媒劑p<0.05)。如上所述，在研 究結束時評估各種劑量之802T及抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA對MMTV-Wnt1腫瘤中之Wnt信號傳導之作用。最後一次給藥7小時後收集腫瘤，且評估β-索烴素靶基因Axin2之mRNA表現。如圖24B中所示，與分子之抗腫瘤作用一致，觀察到Axin2 mRNA表現降低。
在MMTV-Wnt1同種異體移植模型中評估802TF之抗腫瘤活性。MMTV-Wnt1腫瘤片段經皮下(SC)植入雌性裸小鼠中。植入26天後，用媒劑(PBS，靜脈內(IV)，每週一次(qw))、802TF(以6 mg/kg、12 mg/kg及24 mg/kg，IV，每週三次(3qw))及抗LRP6 MOR08168-Fab-MSA(6 mg/kg，IV，3qw)處理攜帶MMTV-Wnt1腫瘤之小鼠(n=6，平均204 mm3；範圍：127 mm3至384 mm3)，且每週兩次對腫瘤測徑(圖24C)。802TF展示劑量依賴性抗腫瘤活性，當以12 mg/kg或24 mg/kg 3qw給藥時在第35天達到約45%消退(相對於媒劑p<0.05)。如上所述，在研究結束時評估各種劑量之802TF及抗LRP6 MOR08168 Fab-MSA對MMTV-Wnt1腫瘤中之Wnt信號傳導的作用。最後一次給藥3小時及7小時後收集腫瘤，且評估β-索烴素靶基因Axin2之mRNA表現。
實例13：基於抗LRP6雙互補位Fc之融合分子之產生及結合性質
除HSA融合體以外，亦產生基於Fc之雙互補位分子。在此等分子中，將scFv8168或scfv6475之熱穩定性增強之突變體融合至CH2之N端或CH3之C端以製造scFv-Fc-scFv融合體，如圖25及圖26中所示，分別產生911T(SEQ ID NO： 297)及912T(SEQ ID NO：299)。
使用先前描述於本專利之實例8中之方法，製造、純化及表徵分子。使該等分子充分表現，且凝膠純度展示於圖27中。此外，利用分析型SEC評估911T及912T，且資料分別呈現於圖28及圖29中。由DSF得出，911T之Tm為53.5℃，60℃，且912T之Tm為52.5℃及62℃。
使用與本專利之實例10中所述相同的方法藉由ELISA測定911T及912T之結合EC50。結果呈現於圖30中：911T對LRP6-Fc(R&D Systems，目錄號：1505-LR)之結合EC50為0.084 nM，且912T之EC50為0.113 nM。此等均低於在0.276 nM下之802T之EC50，可能反映Fc融合分子之四價性。
實例14：評估基於抗LRP6雙互補位Fc之融合分子之活體外功能活性
使用與以上實例4中所述相同的方法，評估圖25中所述之基於抗LRP6雙互補位Fc之融合分子抑制經Wnt1刺激及經Wnt3a刺激之報導體基因的活性的能力。
使用經短暫性轉染之細胞形式測試911T及912T，且發現所有各者均為Wnt1及Wnt3a介導之信號傳導的強力抑制劑(圖31)。此外，發現所有分子均至少如802T般強力，表明抗LRP6 scFv部分可在融合至多個半衰期延長蛋白質時保留其效能。
圖1A至圖1E為展示抗LRP6小鼠血清白蛋白融合分子在 短暫表現Wnt1或Wnt3a配位體之HEK293 STF細胞(基因報導體分析)中之活性的圖式。資料展示抗LRP6 MSA融合分子阻斷Wnt1或Wnt3a信號傳導；圖2展示抗LRP6雙特異性血清白蛋白融合體及雙特異性LRP6抗體半分子在STF報導體基因分析中抑制Wnt1及Wnt3a刺激之信號傳導的效能；圖3為展示非腫瘤負載裸小鼠中5 mg/kg單次IV劑量之結合至β-螺旋槳1區之LRP6小鼠血清白蛋白融合分子的圖式；圖4為展示負載MMTV-Wnt1腫瘤之小鼠中5 mg/kg結合至β-螺旋槳1區之LRP6小鼠血清白蛋白融合分子的血清濃度及對Axin2 mRNA之作用的圖式；圖5為展示負載MMTV-Wnt1腫瘤之小鼠中5 mg/kg結合至β-螺旋槳1區之LRP6小鼠血清白蛋白融合分子的血清濃度及對Axin2 mRNA之作用的圖式；圖6為展示螺旋槳1抗LRP6 Fab MSA融合蛋白質在MMTV-Wnt1模型中引起活體內腫瘤消退之圖式；圖7為展示抗LRP6 Fab、小鼠血清白蛋白結合之抗LRP分子及聚乙二醇化之抗LRP分子在短暫表現Wnt1或Wnt3a配位體之HEK293 STF細胞(基因報導體分析)中的活性的圖式；圖8為抗LRP6 scFv及HSA融合分子之示意圖；圖9展示數種抗LRP6融合分子；圖10A至圖10C為展示經純化之雙特異性HSA融合分子之 SDS-PAGE凝膠之相片；圖11展示基於HSA融合體之雙互補位分子之熱穩定性量測值；圖12A及12B為展示各分子之Tm之DSF實驗的圖式。Tm由峰值中點指示。來自非突變分子之曲線經強調；圖13A及13B為展示各分子之Tm之DSC實驗的圖式；圖14展示如由DSF測定之基於HSA融合體之雙互補位分子之熱穩定性；圖15A至圖15B為展示來自分析型SEC之801T及802T之溶離概況的圖式；圖16展示在多次凍融(FT)之後由分析型SEC測定之基於抗LRP6 HSA融合體之雙互補位分子的聚集；圖17A至圖17E為展示如由ELISA測定之抗LRP6 scFv融合分子對LRP6之結合的圖式；圖18A至圖18B為展示由競爭ELISA測定之抗LRP6 scFv融合分子與可溶性LRP6蛋白質競爭結合至結合LRP蛋白質之盤之能力的圖式；圖19；(A、C至E)為展示抗LRP6融合分子在經Wnt1刺激及經Wnt3a刺激之HEK293 Wnt報導體基因分析中之活性的圖式；(B)為概述抗LRP6融合分子之效能的表；圖20為展示抗LRP6融合分子在經Wnt1刺激及經Wnt3a刺激之MDA-MB435 Wnt報導體基因分析中之活性的圖式；圖21(A)為展示負載MMTV-Wnt1腫瘤之小鼠中5 mg/kg單次IV劑量之結合至β-螺旋槳1區之抗LRP6人血清白蛋白融 合分子的圖式。(B)為展示負載MMTV-Wnt1腫瘤之小鼠中5 mg/kg結合至β-螺旋槳1區之抗LRP6人血清白蛋白融合分子對Axin2 mRNA之作用的圖式；圖22為展示未處理大鼠中5 mg/kg單次IV劑量之結合至β-螺旋槳1區之抗LRP6人血清白蛋白融合分子的圖式；圖23(A)為展示螺旋槳1抗LRP6 Fab人血清白蛋白融合蛋白質在活體內腫瘤MMTV-Wnt1模型中引起抗腫瘤作用之圖式；(B)為展示在研究結束時在各種治療之後對MMTV-Wnt1腫瘤Axin2 mRNA表現之作用的直方圖；圖24(A)為展示螺旋槳1抗LRP6 Fab人血清白蛋白融合蛋白質在活體內腫瘤MMTV-Wnt1模型中引起消退之圖式；(B)為展示在研究結束時在各種治療之後對MMTV-Wnt1腫瘤Axin2 mRNA表現之作用的直方圖；(C)為展示802TF在活體內腫瘤MMTV-Wnt1模型中引起劑量依賴性抗腫瘤活性之圖式；圖25展示數種抗LRP6 Fc融合分子；圖26為抗LRP6 Fc融合分子之示意圖；圖27為展示經純化之抗LRP6雙特異性Fc融合分子之SDS-PAGE凝膠的相片；圖28為展示來自分析型SEC之911T之溶離概況的圖式；圖29為展示來自分析型SEC之912T之溶離概況的圖式；圖30為展示如由ELISA測定之抗LRP6 scFv融合分子對LRP6之結合之圖式；圖31為展示抗LRP6融合分子在經Wnt1刺激及經Wnt3a刺 激之HEK293 Wnt報導體基因分析中之活性的圖式；圖32為展示MOR06475 scFv中之單突變對Tm之作用的表。
圖33為展示MOR08168 scfv中之單突變對Tm之作用的表；圖34為展示在細菌及哺乳動物系統中所表現之物質中MOR08168 scFv中之雙突變對Tm之作用的表；及圖35為概述野生型及單/雙突變型之MOR06475及MOR08168 scFv在ELISA、Proteon親和力及STF報導體基因分析中之結合及功能活性的表。
<110> 瑞士商諾華公司
<120> 低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)-半衰期延長構築體
<130> PAT054821
<140> 101140860
<141> 2012-11-02
<150> 61/555,848
<151> 2011-11-04
<160> 336
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
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<210> 2
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Claims (34)

  1. 一種經分離之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其包含結合至LRP6之第一及第二LRP6單鏈Fv分子(scFv)以及人血清白蛋白，其中該等第一及第二scFv分子連接至該人血清白蛋白之N端及C端，其中該LRP6構築體抑制典型Wnt信號轉導路徑，且其中該LRP6構築體展示在LRP6結合蛋白存在下不明顯增強Wnt信號。
  2. 如請求項1之經分離之構築體，其中該第一LRP6 scFv連接至該人血清白蛋白之N端且結合至LRP6之螺旋槳1區，且該第二LRP6 scFv連接至該人血清白蛋白之C端且結合至LRP6之螺旋槳3區。
  3. 如請求項1之經分離之構築體，其中該第一LRP6 scFv連接至該人血清白蛋白之C端且結合至LRP6之螺旋槳1區，且該第二LRP6 scFv連接至該人血清白蛋白之N端且結合至LRP6之螺旋槳3區。
  4. 如請求項1之經分離之構築體，其中該LRP6結合蛋白為選自由Wnt 1、Wnt 3及Wnt 3a組成之群的Wnt結合蛋白。
  5. 如請求項1之經分離之構築體，其中該等第一及第二LRP6 scFv經由附接連接子間接連接至該人血清白蛋白之N端及C端，該附接連接子選自由以下組成之群：Fc連接子、鉸鏈連接子、Gly-Ser連接子、Ala連接子及KTHT連接子。
  6. 如請求項1之經分離之構築體，其中該等第一及第二 LRP6 scFv藉由直接融合至該人血清白蛋白而直接連接至該人血清白蛋白之N端及C端。
  7. 如請求項1之經分離之構築體，其中該人血清白蛋白係選自由以下組成之群：突變人血清白蛋白或人血清白蛋白之片段。
  8. 如請求項7之經分離之構築體，其中該突變人血清白蛋白包含突變C34S及N503Q。
  9. 如請求項7之經分離之構築體，其中該人血清白蛋白之片段包含至少一個選自由以下組成之群的人血清白蛋白之域：DI、DII、DIII及DIV。
  10. 如請求項1之經分離之構築體，其中該scFv片段包含至少一個胺基酸突變，與未突變之scFv片段相比，該至少一個胺基酸突變改良該scFv之穩定性，其中該胺基酸突變係選自圖32至圖35。
  11. 如請求項10之經分離之構築體，其中該scFv片段結合至LRP6之螺旋槳1區且包含至少一個胺基酸突變，與未突變之scFv片段相比，該至少一個胺基酸突變改良該scFv之穩定性，其中該胺基酸突變係選自由S34M及S49A組成之群。
  12. 如請求項10之經分離之構築體，其中該scFv片段結合至LRP6之螺旋槳3區且包含至少一個胺基酸突變，與未突變之scFv片段相比，該至少一個胺基酸突變改良該scFv之穩定性，其中該胺基酸突變為M95F。
  13. 如請求項10之經分離之構築體，其中該scFv片段結合至 LRP6之螺旋槳1區且包含至少一個胺基酸突變，與未突變之scFv片段相比，該至少一個胺基酸突變改良該scFv之穩定性，其中該胺基酸突變係選自由S34M及S49A組成之群；且scFv片段結合至LRP6之螺旋槳3區且包含至少一個胺基酸突變，與未突變之scFv片段相比，該至少一個胺基酸突變改良該scFv之穩定性，其中該胺基酸突變為M95F。
  14. 如請求項1之經分離之構築體，其中如由Wnt配位體誘導之磷酸化分析所評估，該構築體抑制LRP6之磷酸化。
  15. 如請求項1之經分離之構築體，其中該構築體具有以下功能活性：耗乏細胞群體、抑制或減少細胞群體之增殖、抑制或減少來自細胞群體之發炎介體之分泌、抑制或減少來自細胞群體之細胞質顆粒之分泌，其中該細胞群體係選自由腫瘤細胞及Wnt依賴性細胞組成之群，如由選自由以下組成之群的分析測定。
  16. 如請求項1之經分離之構築體，其中與不具有半衰期延長劑之該LRP6結合部分相比，該構築體展示約5小時之增長之半衰期。
  17. 一種經分離之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其包含SEQ ID NO：293或包含與SEQ ID NO：293至少95%序列一致性之胺基酸序列。
  18. 一種經分離之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其包含SEQ ID NO：295或包含與SEQ ID NO：295至少95%序列一致性之胺基酸序列。
  19. 一種核酸，其包含編碼如請求項1之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體之核苷酸序列。
  20. 一種核酸，其包含編碼低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體之核苷酸序列，該低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體包含SEQ ID NO：293或包含與SEQ ID NO：293至少98%序列一致性之核苷酸序列。
  21. 一種核酸，其包含編碼低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體之核苷酸序列，該低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體包含SEQ ID NO：295或包含與SEQ ID NO：295至少98%序列一致性之核苷酸序列。
  22. 一種載體，其包含如請求項19至21中任一項之核酸。
  23. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至18中任一項之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體及醫藥學上可接受之載劑。
  24. 一種製備如請求項1之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體之方法，該方法包含：(a)提供結合至LRP6靶受體之第一結合部位之第一單鏈Fv分子；(b)提供結合至LRP6靶受體之第二結合部位之第二單鏈Fv分子；及(c)使該第一scFv及該第二scFv直接或間接連接至半衰期延長分子，其中該LRP6構築體抑制典型Wnt信號轉導路徑，且其中該LRP6構築體展示在LRP6結合蛋白存在下不明顯增強Wnt信號。
  25. 一種如請求項1至18中任一項之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體之用途，其用於製造供治療由典型Wnt信 號傳導路徑介導之疾病用之藥物。
  26. 一種如請求項1至18中任一項之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體之用途，其用於製造供治療患有LRP6表現性癌症之患者之癌症用的藥物。
  27. 如請求項26之用途，其中該個體為人類。
  28. 如請求項26之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、肝癌胃癌、前列腺癌、急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌及黑色素瘤。
  29. 一種如請求項1至18中任一項之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體之用途，其用於製造供治療癌症用之藥物，該癌症選自由以下組成之群：乳癌、肺癌、多發性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、肝癌胃癌、前列腺癌、急性骨髓白血病、慢性骨髓白血病、骨肉瘤、鱗狀細胞癌及黑色素瘤。
  30. 如請求項1至18中任一項之低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體LRP6，其用作藥物。
  31. 一種低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其具有SEQ ID NO：293，適用於治療由典型Wnt信號傳導路徑介導之癌症。
  32. 一種低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其具有SEQ ID NO：295，適用於治療由典型Wnt信號傳導路徑介導之癌症。
  33. 一種低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其具有SEQ ID NO：293，用作藥物。
  34. 一種低密度脂蛋白相關蛋白6(LRP6)構築體，其具有SEQ ID NO：295，用作藥物。
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008320823B2 (en) 2007-11-02 2013-01-17 Novartis Ag Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6)
JP5677972B2 (ja) * 2008-11-18 2015-02-25 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
CA2798432A1 (en) 2010-05-06 2011-11-10 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein -related protein 6 (lrp6) antibodies
JP2013527761A (ja) 2010-05-06 2013-07-04 ノバルティス アーゲー 治療的低密度リポタンパク質関連タンパク質６（ｌｒｐ６）多価抗体の組成物および使用方法
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
HUE058896T2 (hu) 2010-10-01 2022-09-28 Modernatx Inc N1-metil-pszeudo-uracilt tartalmazó ribonukleinsavak és azok felhasználásai
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RU2648950C2 (ru) 2011-10-03 2018-04-02 Модерна Терапьютикс, Инк. Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение
EP3290442A1 (en) 2011-11-04 2018-03-07 Novartis AG Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) half-life extender constructs
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
AU2013243951A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
EP2888279A1 (en) * 2012-08-22 2015-07-01 Glaxo Group Limited Anti lrp6 antibodies
EP2922554B1 (en) 2012-11-26 2022-02-23 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EA201690675A1 (ru) 2013-10-03 2016-08-31 Модерна Терапьютикс, Инк. Полинуклеотиды, кодирующие рецептор липопротеинов низкой плотности
CN103524628B (zh) * 2013-10-15 2015-01-07 张喜田 重组灵芝免疫调节蛋白与人血清白蛋白融合蛋白及其制备方法与应用
US11185583B2 (en) * 2014-02-11 2021-11-30 Albany Medical College Multi-functional mucosal vaccine platform
US10744207B2 (en) * 2014-05-02 2020-08-18 Acepodia, Inc. Biological complexes and methods for using same
JP6796059B2 (ja) 2014-09-12 2020-12-02 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー Ｗｎｔシグナリングアゴニスト分子
HUE051777T2 (hu) 2015-12-04 2021-03-29 Boehringer Ingelheim Int Tumorsejtekben WNT-jelátvitelt antagonizáló biparatópos polipeptidek
WO2018035046A1 (en) 2016-08-15 2018-02-22 President And Fellows Of Harvard College Treating infections using idsd from proteus mirabilis
CN107029211A (zh) * 2017-05-05 2017-08-11 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种用于治疗心衰保护心脏功能的药物
EP3630816B1 (en) 2017-05-31 2024-03-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
CN111699003B (zh) 2017-12-19 2024-05-03 瑟罗泽恩奥普瑞汀公司 抗lrp5/6抗体和使用方法
US11773171B2 (en) 2017-12-19 2023-10-03 Surrozen Operating, Inc. WNT surrogate molecules and uses thereof
CN111655729B (zh) 2017-12-19 2023-10-20 瑟罗泽恩奥普瑞汀公司 抗卷曲蛋白抗体和使用方法
WO2023044348A1 (en) * 2021-09-14 2023-03-23 Surrozen Operating, Inc. Modulation of wnt signalling in pulmonary disorders

Family Cites Families (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4708871A (en) 1983-03-08 1987-11-24 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2 Inc Geänderte antikörper.
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
DE3813023A1 (de) 1988-04-19 1989-11-16 Behringwerke Ag Monoklonaler antikoerper gegen pseudomonas aeruginosa, seine herstellung und verwendung
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
EP0394827A1 (en) 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5242813A (en) 1990-10-12 1993-09-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Mouse monoclonal antibodies specific for normal primate tissue, malignant human cultural cell lines human tumors
CA2074825C (en) 1990-12-14 2005-04-12 Daniel J. Capon Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
DK0616640T3 (da) 1991-12-02 2004-12-20 Medical Res Council Fremstilling af anti-selv antistoffer fra repertoirer af antistofsegmenter og fremvist på fag
PT1696031E (pt) 1991-12-02 2010-06-25 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1993016178A2 (en) 1992-02-12 1993-08-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Sequences characteristic of human gene transcription product
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
AU6445894A (en) 1993-03-19 1994-10-11 Duke University Method of treatment of tumors with an antibody binding to tenascin
US6838254B1 (en) 1993-04-29 2005-01-04 Conopco, Inc. Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
EP0770135A1 (en) 1994-07-29 1997-05-02 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
EP1323346B1 (en) 1995-01-17 2006-06-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
WO1997034631A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
DE69837542T2 (de) 1997-04-15 2008-01-31 Merck & Co, Inc. Ldl-rezeptor
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6770461B1 (en) 1998-10-23 2004-08-03 Genome Therapeutics Corporation High bone mass gene of 11q13.3
US6780609B1 (en) 1998-10-23 2004-08-24 Genome Therapeutics Corporation High bone mass gene of 1.1q13.3
WO2000008181A2 (en) 1998-08-07 2000-02-17 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Chp polypeptide, a ligand of pak65
GB9824632D0 (en) 1998-11-10 1999-01-06 Celltech Therapeutics Ltd Biological compounds
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
CA2359145A1 (en) 1999-01-20 2000-07-27 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Exocytosis pathway proteins and methods of use
AU3391200A (en) 1999-03-04 2000-09-21 Corixa Corporation Compositions and methods for breast cancer therapy and diagnosis
US7534866B2 (en) 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
EP1130094A3 (en) 1999-07-08 2001-11-21 Helix Research Institute Primers for synthesizing full length cDNA clones and their use
US20030138804A1 (en) 2000-02-03 2003-07-24 Boyle Bryan J. Methods and materials relating to novel C-type lectin receptor-like polypeptides and polynucleotides
CA2405709A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
US7514594B2 (en) 2001-05-11 2009-04-07 Wyeth Transgenic animal model of bone mass modulation
BR0209563A (pt) 2001-05-11 2004-12-07 Genome Theraupeutics Corp ácido nucleico, polipeptìdeo, vetor, célula, anticorpo, métodos de diagnosticar um fenótipo e um paciente como expressando um ácido nucleico e de identificar agentes que modulam a atividade de um ácido nucleico e de uma proteìna e lrp5, lrp6, ou hbm e compostos que modulam a interação de dkk com o caminho de sinalização wnt, composição para modular a massa óssea e/ou os nìveis de lipìdeo em um paciente, animal transgênico, embrião e modelo de animal, e, agente
US20040038860A1 (en) 2002-05-17 2004-02-26 Allen Kristina M. Reagents and methods for modulating dkk-mediated interactions
BR0209836A (pt) 2001-05-17 2004-12-07 Genome Therapeutics Corp Método para regular a atividade de lrp5, lrp6 ou hbm em um paciente, e do caminho dkk-wnt em um paciente, para modular a massa óssea e os nìveis de lipìdeo em um paciente, para diagnosticar a massa óssea alta ou baixa e/ou os nìveis de lipìdeos altos ou baixos em um paciente, para triar um composto que modula a interação de dkk com lrp5, lrp6, hbm ou um fragmento de ligação de dkk de lrp5, lrp6 ou hbm, e de dkk com uma proteìna que interage com a dkk, composição, composição farmacêutica, métodos para identificar compostos que modulem as interações da dkk e lrp5/lrp6/hbm, e para identificar parceiros de ligação para uma proteìna de dkk, ácido nucléico que codifica um aptâmero peptìdico da proteìna que interage com dkk, vetor, método para detectar uma atividade moduladora de um composto, animal transgênico, método para identificar compostos potenciais que modulem a atividade da dkk, aptâmero peptìdico, anticorpo ou fragmento de anticorpo, e, métodos para identificar proteìnas que interagem com a dkk modulando a interação da dkk com o caminho de sinalização wnt, para identificar compostos que modulem a interação da dkk com o caminho de sinalização wnt, para testar compostos que modulam a atividade mediada pela dkk em um mamìfero, e para triar compostos ou composições que modulam a interação da dkk e uma proteìna que interage com a dkk
DK1399484T3 (da) 2001-06-28 2010-11-08 Domantis Ltd Dobbelt-specifik ligand og anvendelse af denne
WO2004081026A2 (en) 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Polypeptides
ITMI20011483A1 (it) 2001-07-11 2003-01-11 Res & Innovation Soc Coop A R Uso di composti come antagonisti funzionali ai recettori centrali deicannabinoidi
US20060051851A1 (en) 2001-09-13 2006-03-09 Sara Kaminaka Novel selenocysteine-containing protein
US20030194708A1 (en) 2002-04-10 2003-10-16 Minke Binnerts Human homolog of crossveinless materials and methods
EP2366718A3 (en) 2002-06-28 2012-05-02 Domantis Limited Ligand
JP2006519763A (ja) 2002-11-08 2006-08-31 アブリンクス エン．ヴェー． 治療用ポリペプチドの投与法およびそのためのポリペプチド
EP1578801A2 (en) 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
WO2004101790A1 (en) 2003-05-14 2004-11-25 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
US20050084494A1 (en) 2003-05-21 2005-04-21 Darwin Prockop Inhibitors of Dkk-1
AU2004255216B2 (en) 2003-07-01 2010-08-19 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
US8637506B2 (en) 2003-09-22 2014-01-28 Enzo Biochem, Inc. Compositions and methods for bone formation and remodeling
US9046537B2 (en) 2003-09-22 2015-06-02 Enzo Biochem, Inc. Method for treating inflammation by administering a compound which binds LDL-receptor-related protein (LRP) ligand binding domain
US8461155B2 (en) * 2003-09-22 2013-06-11 University Of Connecticut Sclerostin and the inhibition of WNT signaling and bone formation
US20080227734A1 (en) 2003-11-24 2008-09-18 Gunnar Westin Mutant Lrp5/6 Wnt-Signaling Receptors in Cancer Diagnosis, Prognosis, and Treatment
US20060094046A1 (en) 2004-02-11 2006-05-04 Arie Abo Compositions and methods relating to angiogenesis and tumorigenesis
US20060127919A1 (en) 2004-02-25 2006-06-15 Arie Abo Compositions and methods relating to cell adhesion molecule L1
CN100376599C (zh) 2004-04-01 2008-03-26 北京安波特基因工程技术有限公司 基因工程重组抗cea抗cd3抗cd28线性单链三特异抗体
EP1753880A4 (en) 2004-05-14 2010-07-14 Univ California METHODS OF TREATING CANCER USING ANTI-WNT2 MONOCLONAL ANTIBODIES AND SHORT INTERFERING RNA
EP1786918A4 (en) 2004-07-17 2009-02-11 Imclone Systems Inc NEW BISPECIFIC ANTIBODY TETRAVALENT
ES2414460T3 (es) 2004-08-04 2013-07-19 Amgen Inc. Anticuerpos para Dkk-1
JP2008520583A (ja) 2004-11-15 2008-06-19 マウント シナイ スクール オブ メディスン オブ ニューヨーク ユニバーシティー Ｗｎｔ自己分泌シグナル伝達を改変するための組成物および方法
CA2595682A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
WO2006089114A2 (en) 2005-02-17 2006-08-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for treating an anthrax toxin mediated condition
BRPI0615026A8 (pt) 2005-08-19 2018-03-06 Abbott Lab imunoglobulina de domínio variável duplo e seus usos
US7811251B2 (en) 2005-10-13 2010-10-12 Tyco Healthcare Group Lp Trocar anchor
JP5525729B2 (ja) 2005-11-28 2014-06-18 ゲンマブ エー／エス 組換え一価抗体およびその作製方法
US20070248628A1 (en) 2005-12-06 2007-10-25 Keller Lorraine H Immunogens in cancer stem cells
JP5374359B2 (ja) 2006-03-17 2013-12-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 安定化されたポリペプチド化合物
WO2007136778A2 (en) 2006-05-19 2007-11-29 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Fusion proteins, uses thereof and processes for producing same
US7622267B2 (en) 2006-05-30 2009-11-24 Van Andel Research Institute Low-density lipoprotein receptor 6 (LRP6) as a mammary stem cell marker and related methods
WO2008013934A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Cell Signaling Technology, Inc. Tyrosine phosphorylation sites
US7847067B2 (en) 2006-08-28 2010-12-07 ARCA Biopharma Antibodies to NTB-A
AU2008245425A1 (en) 2007-04-30 2008-11-06 Washington University Methods and compositions for the treatment of cancer
EP2069784A4 (en) 2007-05-18 2009-11-18 Medimmune Llc IL-33 IN INFLAMMATORY DISEASE
US20090176654A1 (en) 2007-08-10 2009-07-09 Protelix, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
US20090130105A1 (en) 2007-08-28 2009-05-21 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
US20090155255A1 (en) 2007-09-27 2009-06-18 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
TWI489993B (zh) 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
WO2009051957A2 (en) 2007-10-16 2009-04-23 Nuvelo, Inc. Antibodies to irem-1
EP2211903A4 (en) 2007-10-17 2011-07-06 Nuvelo Inc CLL-1 ANTIBODY
AU2008320823B2 (en) 2007-11-02 2013-01-17 Novartis Ag Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6)
CA2705292C (en) 2007-11-13 2016-06-21 Teva Biopharmaceuticals Usa, Inc. Humanized antibodies against tl1a
CA2705923A1 (en) 2007-11-16 2009-05-22 Nuvelo, Inc. Antibodies to lrp6
EP2080812A1 (en) 2008-01-18 2009-07-22 Transmedi SA Compositions and methods of detecting post-stop peptides
CA2721093A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
US8716243B2 (en) 2008-05-28 2014-05-06 St. Jude Childen's Research Hospital Methods of effecting Wnt signaling through Dkk structural analysis
EP2304439A4 (en) 2008-05-29 2012-07-04 Nuclea Biotechnologies Llc ANTI-phospho-AKT ANTIBODY
CA2731546C (en) 2008-07-23 2013-11-19 Hanmi Holdings Co., Ltd. A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends
JP5677972B2 (ja) 2008-11-18 2015-02-25 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
JP5693475B2 (ja) 2009-03-04 2015-04-01 ペイタント・ソリューションズ・インコーポレイテッドＰｅｙｔａｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ， Ｉｎｃ． 羊膜組織を含む材料で修飾されたステント及び対応する方法
AU2010228990A1 (en) 2009-03-24 2011-10-27 Teva Biopharmaceuticals Usa, Inc. Humanized antibodies against LIGHT and uses thereof
JP5841046B2 (ja) 2009-04-08 2016-01-06 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 制御された血清中薬物動態を有するヒトタンパク質スキャフォールド
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
BR112012004777A2 (pt) 2009-09-03 2019-09-24 Genentech Inc métodos para tratar diagnósticar e monitorar artrite reumatoide
UY32920A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Boehringer Ingelheim Int Moleculas de unión biespecíficas para la terapia anti-angiogénesis
WO2011047180A1 (en) 2009-10-14 2011-04-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents targeting igf-1r and erbb3 signalling and uses thereof
WO2011084714A2 (en) 2009-12-17 2011-07-14 Biogen Idec Ma Inc. STABILIZED ANTI-TNF-ALPHA scFv MOLECULES OR ANTI-TWEAK scFv MOLECULES AND USES THEREOF
CN102985441B (zh) 2010-02-19 2015-04-22 俄克拉何马大学董事会 抑制Wnt信号传导途径的单克隆抗体及其制备方法和用途
WO2011106707A2 (en) 2010-02-26 2011-09-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to dr3
EP2550295A1 (en) 2010-03-24 2013-01-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-lrp6 antibodies
CA2798432A1 (en) * 2010-05-06 2011-11-10 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein -related protein 6 (lrp6) antibodies
JP2013527761A (ja) * 2010-05-06 2013-07-04 ノバルティス アーゲー 治療的低密度リポタンパク質関連タンパク質６（ｌｒｐ６）多価抗体の組成物および使用方法
CA2812785A1 (en) 2010-10-20 2012-04-26 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating the wnt pathway
EP2648753A4 (en) 2010-12-10 2015-06-24 Merrimack Pharmaceuticals Inc ASSAY AND ADMINISTRATION OF BISPECIFIC SCFV CONJUGATES
BR122017005075B1 (pt) 2011-06-23 2022-09-20 Ablynx N.V Técnicas para prever, detectar e reduzir interferência de proteína não especifica em ensaios envolvendo domínios variáveis únicos de imunoglobulina
EP3290442A1 (en) 2011-11-04 2018-03-07 Novartis AG Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) half-life extender constructs

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