DE69837542T2

DE69837542T2 - Ldl-rezeptor

Info

Publication number: DE69837542T2
Application number: DE69837542T
Authority: DE
Inventors: John Andrew Coton TODD; John Wilfred Lansdale HESS; Charles Thomas Houston CASKEY; Roger David Cox; David Lansdale GERHOLD; Holly Telford HAMMOND; Patricia Lansdale HEY; Yoshihiko Kawaguchi; Tony Raymond Merriman; Michael Lee Houston METZKER; Yusuke Osaka NAKAGAWA; Michael Sean Lansdale PHILLIPS; Rebecca Christina Twells
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-15
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2018-04-16
Also published as: ES2285767T3; CA2286313A1; ATE359367T1; CA2286313C; DE69837542D1; AU7061498A; WO1998046743A1; AU733722B2; EP0988379B1; EP0988379A1; JP4271735B2; JP2002501376A; US6545137B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Polypeptide, Oligonukleotid-Sonden und -Primer, Verfahren zur Diagnose oder Prognose und andere Verfahren in Zusammenhang mit und auf Grundlage der Identifizierung eines Gens, welches als Mitglied der LDL-Rezeptorfamilie charakterisiert ist und für welches es Hinweise gibt, dass einige Allele mit einer Suszeptibilität (Anfälligkeit) für insulinabhängigen Diabetes mellitus ("IDDM"), auch bekannt als Typ 1-Diabetes, assoziiert sind.
Spezieller basiert die vorliegende Erfindung auf der Klonierung und Charakterisierung eines Gens, welches die Erfinder der vorliegenden Erfindung auf der Grundlage der charakteristischen Eigenschaften des codierten Polypeptids, welche hier zum ersten Mal offenbart werden und es als Mitglied der LDL-Rezeptorfamilie identifizieren, als "LDL-Rezeptor-verwandtes Protein-5 (LRP5)" (früher "LRP-3"), bezeichnet haben. Ferner sind hier experimentelle Befunde eingeschlossen, welche darauf hinweisen, dass LRP5 das IDDM-Suszeptibilitätsgen IDDM4 ist.
Hintergrund der Erfindung
Diabetes, die Regulationsstörung der Glucose-Homöostase, betrifft etwa 6% der allgemeinen Bevölkerung. Die schwerwiegendste Form, Typ 1-Diabetes, welche bis zu 0,4% der Bevölkerung mit europäischer Abstammung betrifft, wird durch eine Autoimmunzerstörung der insulinproduzierenden β-Zellen des Pankreas mit einem hauptsächlichen Ausbruchalter von 12 Jahren verursacht. Die β-Zell-Zerstörung ist irreversibel und trotz Insulinersatz mittels Injektion leiden Patienten unter früher Sterblichkeit, Nierenversagen und Blindheit (Bach, 1994; Tisch und McDevitt, 1996). Das Hauptziel der genetischen Forschung ist deshalb die Identifizierung der Gene, welche für Typ 1-Diabetes prädisponieren, und die Verwendung dieser Information zum Verständnis von Krankheitsmechanismen und zur Voraussage und Verhinderung der vollständigen Zerstörung von β-Zellen und der Erkrankung.
Die Art und Weise der Vererbung von Typ 1-Diabetes folgt keinem einfachen Mendel-Muster und die Konkordanz des Suszeptibilitäts-Genotyps und des Auftretens der Krankheit ist viel geringer als 100%, wie belegt durch die 30–70%ige Konkordanz von identischen Zwillingen (Matsuda und Kuzuya, 1994; Kyvik et al., 1995). Diabetes wird durch eine Anzahl von Genen oder Polygenen verursacht, die zusammenwirken, was es besonders schwierig macht, individuelle Gene zu identifizieren und zu isolieren.
Der Haupt-IDDM-Locus wird von dem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf dem Chromosom 6p21 codiert (IDDM1). Der Grad der familiären Häufung an diesem Locus ist λs = 2,5, wobei λs = P-Erwartungswert [gemeinsame Null-Allele an dem abstammungsidentischen ("identical-by-descent"; IBD) Locus]/P-Beobachtungswert [gemeinsame Null-Allele IBD] (Risch, 1987; Todd, 1994), mit einem zweiten Locus auf dem Chromosom 11p15, IDDM2, dem Insulin-Minisatelliten, λs = 1,25 (Bell et al., 1984; Thomson et al., 1989; Owerbach et al., 1990; Julier et al., 1991; Bain et al., 1992; Spielman et al., 1993; Davies et al., 1994; Gennett et al., 1995). Diese Loci wurden ursprünglich durch kleine Fallkontroll-Assoziationsstudien, basierend auf ihrem Status als funktionelle Kandidaten, festgestellt, welche später durch weitere Fallkontroll-, Assoziations- und Kopplungsstudien bestätigt wurden.
Diese beiden Loci können jedoch nicht für die gesamte beobachtete Häufung der Erkrankung in Familien verantwortlich sein (λs = 15), welche aus dem Verhältnis des Risikos für Patientengeschwister und der Populationsprävalenz (6%/0,40) abgeschätzt wird (Risch, 1990). Wir initiierten eine positionelle Klonierungsstrategie in der Hoffnung, die anderen Loci zu identifizieren, welche eine Suszeptibilität (Anfälligkeit) für Typ 1-Diabetes verursachen, unter Nutzung der Tatsache, dass Marker, die mit einem Krankheitsgen gekoppelt sind, einen Überschuss von gemeinsamen Allelen, identisch durch Abstammung, bei betroffenen Geschwisterpaaren zeigen werden (Penrose, 1953; Risch, 1990; Holmans, 1993).
Die anfängliche genom-übergreifende Suche nach Kopplung unter Verwendung von 289 Mikrosatellitenmarkern in 96 UK-Geschwisterpaar-Familien offenbarte den Nachweis der Kopplung mit zusätzlichen 18 Loci (Davies et al., 1994). Eine Bestätigung der Kopplung mit zwei dieser Loci wurde durch Analyse zweier zusätzlicher Familiengruppen (102 UK-Familien und 84 USA-Familien) erhalten, IDDM4 auf dem Chromosom 11q13 (MLS 1,3; P = 0,003 bei FGF3) und IDDM5 auf dem Chromosom 6q (MLS 1,8 bei ESR). Bei IDDM4 wurde die signifikanteste Kopplung in der Untergruppe von Familien erhalten, die 1 oder 0 Allele IBD bei HLA gemeinsam hatten, (MLS = 2,8; P = 0,001; λs = 1,2) (Davies et al., 1994). Diese Kopplung wurde auch von Hashimoto et al. (1994) unter Verwendung von 251 betroffenen Geschwisterpaaren erhalten, wobei P = 0,0008 bei allen Geschwisterpaaren erhalten wurde. Die Kombination dieser Resultate mit 596 Familien ergibt einen substantiellen Beleg für IDDM4 (P = 1,5 × 10^–6) (Todd und Farrall, 1996; Luo et al., 1996).
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung offenbaren nunmehr zum ersten Mal ein Gen, das für ein neues Mitglied der LDL-Rezeptorfamilie codiert, welches sie als "LRP5" (früher "LRP-3") bezeichnen. Ferner weisen Indizien darauf hin, dass das Gen den Locus für IDDM-Suszeptibilität IDDM4 repräsentiert, dessen Identifizierung und Isolierung einen großen wissenschaftlichen Durchbruch darstellt.
Im Laufe der letzten 10 Jahre wurden viele Gene für Einzelgen- oder Monogen-Erkrankungen, welche in der Population relativ selten sind, durch Kopplungsanalyse in Familien positioniert und in einer ausreichend kleinen Region lokalisiert, um die Identifizierung des Gens zu erlauben. Die spätere Sublokalisierung und Feinkartierung kann bei seltenen Einzelgen-Erkrankungen durchgeführt werden, da Rekombinationen innerhalb von Familien die Grenzen des minimalen Intervalls zweifelsfrei definieren. Im Gegensatz dazu fällt bei häufigen Erkrankungen wie Diabetes oder Asthma die Anwesenheit der Krankheitsmutation nicht immer mit der Entwicklung der Krankheit zusammen; Krankheitssuszeptibilitätsmutationen bei üblichen Erkrankungen stellen ein Risiko zur Entwicklung der Erkrankung dar und dieses Risiko ist gewöhnlich viel niedriger als 100%. Somit können Suszeptibilitätsgene bei üblichen Erkrankungen nicht unter Verwendung von Rekombinationsereignissen innerhalb von Familien lokalisiert werden, wenn nicht zehntausende von Familien für die Feinkartierung des Locus zur Verfügung stehen. Nachdem Sammlungen dieser Größe unpraktisch sind, ziehen Forscher die Anwendung der Assoziationskartierung in Betracht, welche auf historischen Rekombinationsereignissen während der Geschichte der Bevölkerung, aus der die Familien stammen, beruht.
Assoziationskartierung wurde in über einem Dutzend Beispiele seltener Einzelgen-Merkmale verwendet und insbesondere in genetisch isolierten Populationen wie Finnland, um Krankheitsmutationen zu feinkartieren. Nichtsdestoweniger unterscheidet sich die Assoziationskartierung grundsätzlich von einer direkten Kopplungskartierung, da, obwohl der Assoziationsgrad zwischen zwei Markern oder einem Marker und einer Krankheitsmutation proportional zur physikalischen Distanz entlang des Chromosoms ist, diese Beziehung unvorhersagbar sein kann, da sie von den Allelhäufigkeiten der Marker, der Geschichte der Population und dem Alter und der Anzahl von Mutationen am Krankheitslocus abhängt. Für seltene, hochpenetrante Einzelgen-Erkrankungen gibt es gewöhnlich genau ein Founder-Chromosom in der untersuchten Population, was es relativ einfach macht, ein Intervall zu lokalisieren, das kleiner ist als dasjenige, welches durch Standardrekombinationsereignisse innerhalb lebender Familien definiert werden kann. Die Auflösung dieses Verfahrens bei monogenen Erkrankungen, bei denen es nur ein hauptsächliches Founder-Chromosom gibt, ist sicher geringer als 2 cM und in bestimmten Beispielen geht die Auflösung herunter bis 100 kb DNA (Hastbacka et al. (1994), Cell 78: 1–20).
Bei häufigen Erkrankungen wie Typ 1-Diabetes, welche durch eine Anzahl von Genen oder Polygenen verursacht werden die zusammenwirken, kann die Populationshäufigkeit des Krankheitsallels sehr hoch sein, möglicherweise 50% übersteigen, und es gibt wahrscheinlich mehrere Founder-Chromosomen, welche alle ein Risiko verleihen, und nicht eine 100%ige Sicherheit der Krankheitsentwicklung. Nachdem die Assoziationskartierung von unvorhersehbaren Parametern abhängt und nachdem die Founder-Cchromosomen mehrere sein und in der allgemeinen Bevölkerung häufig auftreten werden, ist die Aufgabe der Feinkartierung von Polygenen derzeit etwas kontrovers und viele bezweifeln die Durchführbarkeit eines systematischen genetischen Ansatzes unter Verwendung einer Kombination von Kopplungs- und Assoziationskartierung überhaupt. Kürzlich haben Risch und Marskandis einen gewissen mathematischen Hintergrund hinsichtlich der Durchführbarkeit von Assoziationskartierung bei komplexen Erkrankungen zur Verfügung gestellt (Science 273: 1516–1517, 1996), jedoch berücksichtigten sie nicht die Auswirkung von mehreren Founder-Chromosomen.
Als Folge dieser Unsicherheiten sind extrem große Anzahlen diabetischer Familien für die Genotypenbestimmung erforderlich, mit einer großen Anzahl Marker über eine spezifische Region, die eine Kopplungsungleichgewichtskurve ergeben, welche mehrere Peaks aufweisen kann. Die Frage ist, welcher Peak identifiziert die ätiologische Mutation und auf welche Weise können wir dies bestätigen? Unseres Wissens sind die Kopplungsungleichgewichtskurven und Haplotyp-Assoziationskarten, die in den 3, 4, 19 und 20 gezeigt sind, die ersten ihrer Art für irgendeine komplexe polygene Erkrankung für irgendeinen Locus. Kurven dieser Art wurden noch nicht in der Literatur publiziert, sogar für den wohletablierten IDDM1/MHC-Locus. Diesbezüglich ist die hier beschriebene Arbeit vollkommen neu und ein wegbereitender Schritt der Forschung zur Genetik von Polygenen.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 illustriert eine annähernde Lokalisierung von IDDM4 auf dem Chromosom 11q13. Eine Mehrpunkt-Kopplungskarte maximaler Wahrscheinlichkeit von IBD in einer Subgruppe von HLA 1:0-Besitzern in 150 Familien, MLS von 2.3 bei FGF3 und D11S1883 (λs = 1,19), wurde erhalten (Davies et al. (1994), Nature 371: 130–136).
2 zeigt eine physikalische Karte der Region D11S987 – Galanin auf dem Chromosom 11q13. Das Intervall wurde in Pacs, Bacs und Cosmide kloniert und unter Verwendung eines Spektrums von Restriktionsenzymen restriktionskartiert, um die physikalische Distanz zwischen jedem Marker zu bestimmen.
3 zeigt eine Einpunkt-Kopplungsungleichgewichtskurve bei der IDDM4-Region. 1289 Familien wurden mittels TDT analysiert, mit einem Peak bei H0570POLYA, P = 0,001. x-Achse: physikalische Distanz in kb; y-Achse: statistischer TDT-Chi²-Wert (tdf).
4 zeigt eine Dreipunkt-Kopplungsungleichgewichtsrollkurve bei IDDM4, mit 1289 Familien aus vier verschiedenen Populationen (UK, USA, Sardinien und Norwegen). Zur Minimierung der Effekte einer Variation in der Allelfrequenz bei jedem Polymorphismus wurden die TDT-Daten mit drei konsekutiven Markern erhalten und ausgedrückt als Mittelwert der drei. x-Achse: physikalische Distanz in kb; y-Achse: statistischer TDT-Chi²-Wert.
5(a) zeigt die DNA-Sequenz der LRP5-Isoform 1-cDNA.
5(b) zeigt die DNA-Sequenz des längsten offenen Leserahmens, der in der LRP5-cDNA vorliegt.
5(c) Aminosäuresequenztranslation (im einbuchstabigen Standardcode) des offenen Leserahmens in 5(b).
5(d) Motive der LRP5-Isoform 1, codiert von dem offenen Leserahmen, der in 5(b) enthalten ist. Symbole: Die unterstrichenen Reste 1–24 enthalten ein Signal für Proteinexport und Spaltung,
zeigt die Position einer Intron/Exon-Grenze an, * zeigt eine mutmaßliche N-verknüpfte Glycosylierungsstelle in dem angenommenen extrazellulären Anteil des Rezeptors an. Die EGF-Bindungsmotive sind hellgrau schattiert, die LDL-Rezeptorligandenmotive sind in einem dunkleren Grau schattiert. Die Spacer-Regionen sind durch die unterstrichenen vier Aminosäuren mit hoher Ähnlichkeit zu dem YWTD-Motiv angezeigt. Eine mutmaßliche transmembran-überspannende Domäne ist mit einer dicken Linie unterstrichen. Schattierte Bereiche in der zytoplasmatischen Domäne (1409 bis zum Ende) könnten an der Endozytose beteiligt sein.
5(e) Aminosäuresequenz des reifen LRP5-Proteins.
5(f) zeigt den Vergleich der Nukleotidsequenz der ersten 432 Nukleotide des 5'-Endes der Human-Isoform 1-cDNA-Sequenz (5(a)) auf der oberen Linie mit den ersten 493 Nukleotiden des 5'-Endes der Maus-Lrp5-cDNA-Sequenz (16(a)) auf der unteren Linie.
Der Vergleich wurde mit Hilfe des GCG-Algorithmus GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI) durchgeführt.
5(g) zeigt den Vergleich der ersten 550 Aminosäuren der humanen LRP5-Isoform 1 mit den ersten 533 Aminosäuren von Maus-Lrp5 unter Verwendung des GCG-Algorithmus GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI).
6(a) zeigt die Aminosäuresequenz von LRP5-Motiven. Ein Vergleich wurde unter Verwendung des Programms "Crossmatch" (erhalten von Dr. Phil Green, University of Washington) zwischen den Motiven, die in LRP1 vorliegen, und der LRP5-Aminosäuresequenz durchgeführt. Die beste Übereinstimmung für jedes LRP5-Motiv ist gezeigt. Für jedes Motiv ist die oberste Zeile die LRP5-Isoform 1-Aminosäuresequenz, die mittlere Zeile stellt Aminosäuren dar, die in den beiden Motiven identisch sind, die untere Zeile ist die Aminosäuresequenz des LRP1-Motivs mit der besten Übereinstimmung. Von besonderer Bedeutung sind die konservierten Cystein (C)-Reste, welche die Grenze sowohl der EGF-Vorläufer- als auch LDL-Rezeptorligandenbindungsmotive darstellen.
6(b) illustriert die Motivorganisation des LDL-Rezeptors und von LRP5. Das LDL-Rezeptorligandenbindungsmotiv wird durch die hellgrauen Boxen dargestellt, die EGF-ähnlichen Motive werden durch die dunkelgrauen Boxen dargestellt. Die YWTD-Spacer-Motive werden durch die vertikalen Linien angezeigt. Die mutmaßlichen Transmembrandomänen werden durch die schwarze Box dargestellt.
7 zeigt die LRP5-Genstruktur. Die DNA-Sequenz zusammenhängender Abschnitte genomischer DNA wird durch die dicken Linien dargestellt und entspricht dem angegebenen Maßstab. Die Position der Marker D11S1917(UT5620), H0570POLYA, L3001CA, D11S1337 und D11S970 ist angezeigt. Die Exons sind durch die kleinen schwarzen Boxen mit ihrer numerischen oder alphabetischen Bezeichnung darunter angezeigt, die Größe der Exons ist nicht maßstabsgetreu.
8 illustriert verschiedene LRP5-Gen-Isoformen. Alternativ gespleisste 5'-Enden des LRP5-Gens sind mit der Isoform-Nummer für jede alternativ gespleisste Form angezeigt. Der hellgraue Pfeil bezeichnet den Translationsstart, der in Exon 6 in der Isoform 1 auftritt, stromaufwärts von Exon 1 in der Isoform 3 auftreten kann, und in Exon B in den Isoformen 2, 4, 5 und 6 auftritt. Die 22 Kern-Exons (A bis V) werden durch die Box dargestellt.
9 ist eine SNP-Karte von Contig 57. Polymorphismen wurden durch den Vergleich der DNA-Sequenz von BAC 14-1-15 mit den Cosmiden EO 864 und BO 7185 identifiziert. Die entsprechende Tabelle 6 zeigt ein PCR-Amplikon, welches die Stelle des Polymorphismus einschließt, die Art des Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP), dessen Lokalisierung und die geänderte Restriktionsstelle, falls vorhanden. Die Linie repräsentiert die zusammenhängende genomische DNA mit der relativen Lage der Polymorphismen und der Amplikons, welche zu deren Nachweis verwendet wurden. Die großen dünnen Dreiecke stellen die Stelle mutmaßlicher Exons dar. Der Marker H0570POLYA ist angezeigt.
10 ist eine SNP-Karte von Contig 58. Polymorphismen wurden durch den Vergleich der DNA-Sequenz von BAC 14-1-15 mit dem Cosmid BO 7185 identifiziert. Die entsprechende Tabelle 6 zeigt ein PCR-Amplikon, welches die Stelle des Polymorphismus, die Art des Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP), dessen Lage und die geänderte Restriktionsstelle, falls vorhanden, einschließt. Die Linie repräsentiert die zusammenhängende genomische DNA mit der relativen Lage der Polymorphismen und der Amplikons, welche zu deren Nachweis verwendet wurden. Das große dünne Dreieck am äußersten Ende der Linie repräsentiert das Exon A von LRP5.
11(a) zeigt die DNA-Sequenz der Isoform 2-cDNA.
11(b) zeigt den längsten offenen Leserahmen der Isoform 2 (auch Isoform 4, 5, 6).
11(c) zeigt die Aminosäuresequenz der Isoform 2 (auch Isoform 4, 5, 6), codiert von dem offenen Leserahmen von 12(b).
12(a) zeigt die DNA-Sequenz der Isoform 3-cDNA.
12(b) zeigt eine Sequenz, die durch GRAIL erhalten wurde, und eine mutmaßliche Verlängerung der Isoform 3.
12(c) zeigt einen mutmaßlichen offenen Leserahmen für die Isoform 3.
12(d) zeigt die Aminosäuresequenz der Isoform 3.
12(e) zeigt die durch GRAIL vorausgesagte Promotorsequenz für die Isoform 3.
13 zeigt die DNA-Sequenz der Isoform 4-cDNA, welche einen offenen Leserahmen enthält, der für die Isoform 2 codiert (11(b)).
14 zeigt die DNA-Sequenz der cDNA-Isoform 5, welche einen offenen Leserahmen enthält, der für die Isoform 2 codiert (11(b)).
15 zeigt die DNA-Sequenz der Isoform 6, welche einen offenen Leserahmen enthält, der für die Isoform 2 codiert (11(b)).
15(b) zeigt die durch GRAIL vorausgesagte Promotorsequenz, die mit der Isoform 6 assoziiert ist.
16(a) zeigt die DNA-Sequenz eines Abschnitts der Maus-Lrp5-cDNA.
16(b) zeigt die DNA-Sequenz der 5'-Verlängerung des Mausklons.
16(c) zeigt die DNA-Sequenz eines Abschnitts des offenen Leserahmens von Maus-Lrp5.
16(d) zeigt die Aminosäuresequenz des offenen Leserahmens, der für einen Abschnitt von Maus-Lrp5 codiert.
17(a) zeigt die DNA-Sequenz der Exons A bis V.
17(b) zeigt die Aminosäuresequenz, die von einem in 17(a) enthaltenen offenen Leserahmen codiert wird.
18(a) zeigt die Nukleotidsequenz der Volllängen-Maus-Lrp5-cDNA.
18(b) zeigt die Nukleotidsequenz für den längsten offenen Leserahmen, der in der Maus-Lrp5-cDNA vorliegt.
18(c) zeigt die Aminosäuresequenztranslation (im einbuchstabigen Code) des offenen Leserahmens in 18(b).
18(d) zeigt eine Zuordnung der Aminosäuresequenz des Human-LRP5-Proteins und des Maus-Lrp5-Protein-Programms unter Verwendung des GCG-Algorithmus GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI).
18(e) zeigt eine Zuordnung der Aminosäuresequenz des reifen Human-LRP5-Proteins mit dem reifen Maus-LRP5-Programm unter Verwendung des GCG-Algorithmus GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI).
19 zeigt eine schematische Darstellung von Haplotypen in der IDDM4-Region. Drei unterschiedliche Haplotypen sind gezeigt. Der Haplotyp A schützt gegen IDDM, während die Haplotypen B und C suszeptibel/nicht-schützend für IDDM sind.
20 zeigt eine schematische Darstellung von Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP)-Haplotypen in der IDDM4-Region. Der Haplotyp A ist schützend, wohingegen die Haplotypen B, C, D und E suszeptibel/nicht-schützend sind. Eine minimale Region von 25 kb, welche für die vier suszeptiblen Haplotypen gemäß Abstammung identisch ist (Identical By Descent"; IBD), ist angezeigt. Die SNP-Bezeichnungen, z.B. 57-3, sind wie in Tabelle 6 und in 9 und 10 beschrieben.
LRP5-Genstruktur
Das identifizierte Gen enthält 22 Exons, bezeichnet als A–V, welche für den größten Teil des reifen LRP5-Proteins codieren. Die 22 Exons machen 4961 Nukleotide des LRP5-Gen- Transkripts aus (5(a)) und befinden sich in etwa 110 kb genomischer DNA. Die genomische DNA, welche diese Exons enthält, beginnt stromabwärts des genetischen Markers L3001CA und umfasst die genetischen Marker D11S1337, 141ca5 und D11S970 (7). Mehrere verschiedene 5'-Enden des LRP5-Transkripts wurden identifiziert. Von besonderem Interesse ist die Isoform 1 mit einem 5'-Ende, das für eine Signalpeptidsequenz für Proteinexport (sekretorisches Leaderpeptid) über die Plasmamembran codiert. Wie im folgenden erörtert, enthält das LRP5-Protein wahrscheinlich eine große extrazelluläre Domäne, deshalb würde erwartet werden, dass dieses Protein eine Signalsequenz aufweist. Das Exon, welches für die Signalsequenz codiert, bezeichnet als Exon 6, liegt in der Nähe des genetischen Markers H0570POLYA. Dieses Exon befindet sich 35 kb stromaufwärts von Exon A und verlängert somit die genomische DNA, welche das LRP5-Gen umfasst, auf mindestens 160 kb.
Mehrere zusätzliche Isoformen des LRP5-Gens, welche die Folge von alternativem Spleissen des 5'-Endes sind, wurden mittels PCR identifiziert (8). Die funktionelle Relevanz dieser zusätzlichen Isoformen ist nicht klar. Zwei dieser LRP5-Transkripte enthalten Exon 1, welches sich stromaufwärts des genetischen Markers D11S1917(UT5620) befindet und das LRP5-Gen auf etwa 180 kb genomischer DNA verlängert. Das als Isoform 3 bezeichnete Transkript besteht aus dem Exon 1, direkt an Exon A gespleisst. Der Leserahmen ist am 5'-Ende offen und somit gibt es ein Potential für zusätzlich codierende Information, die sich in Exons stromaufwärts von Exon 1 befindet. Alternativ ergibt eine zentromere Verlängerung von Exon 1, um den gesamten offenen Leserahmen einzuschließen, der mit dieser Region assoziiert ist, den offenen Leserahmen für die Isoform 3.
Das zweite Transkript, welches Exon 1 enthält, enthält auch das Exon 5, welches sich in der Nähe des genetischen Markers H0570POLYA befindet. Der offene Leserahmen für diese Isoform, Isoform 2, beginnt in Exon B und codiert somit für ein verkürztes LRP5-Protein, dem jegliches vorausgesagtes sekretorisches Leaderpeptid in den ersten 100 Aminosäuren fehlt. Es gibt drei zusätzliche Transkripte, jeweils mit einem offenen Leserahmen, der in Exon B beginnt, und mit 5'-Enden in der Nähe des genetischen Markers L3001CA.
Expressionsprofil von LRP5
Eine Northernblot-Analyse zeigt an, dass das hauptsächliche mRNA-Transkript für das LRP5-Gen etwa 5 bis 5,5 kb aufweist und am stärksten in der Leber, dem Pankreas, der Prostata und Plazenta exprimiert wird. Expression wird auch im Skelettmuskel, der Niere, Milz, dem Thymus, den Eierstöcken, der Lunge, dem Dünndarm und Dickdarm nachge wiesen. Nebenbanden, sowohl größer als auch kleiner als 5 kb, werden nachgewiesen und könnten alternative Spleissereignisse oder verwandte Familienmitglieder repräsentieren.
LRP5 ist ein Mitglied der LDL-Rezeptorfamilie
Das in dem IDDM4-Locus identifizierte Gen, Irp5, ist ein Mitglied der LDL-Rezeptorfamilie. Diese Familie von Proteinen weist mehrere charakteristische Unterscheidungsmerkmale auf, eine große extrazelluläre Domäne, die cystein-reiche Motive enthält, welche an der Ligandenbindung beteiligt sind, eine einzelne transmembran-überspannende Domäne und ein "NPXY"-Internalisierungsmotiv (Krieger und Herz (1994), Ann. Rev. Biochem. 63: 601–637). Die funktionelle Rolle der Mitglieder dieser Familie ist die Clearance ihrer Liganden durch den Mechanismus der rezeptor-vermittelten Endozytose. Dies wird illustriert durch das am besten charakterisierte Mitglied der Familie, den LDL-Rezeptor, der für die Clearance von LDL-Cholesterin aus dem Plasma verantwortlich ist (Goldstein et al. (1985), Ann. Rev. Cell Biol. 1: 1–39).
LRP5 ist am engsten verwandt mit dem LDL-Rezeptor-verwandten Protein (LRP), welches auch als der Alpha 2-Makroglobulin-Rezeptor bekannt ist. Die Translation des offenen Leserahmens (ORF) der Isoform 1 ergibt das LRP5-Protein. Ein Vergleich des LRP5-Proteins mit Human-LRP1 unter Verwendung des Algorithmus GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI) offenbart eine Gesamtaminosäureähnlichkeit von 55% und 34% Identität mit der Region des Human-LRP1-Proteins von den Aminosäuren 1236 bis 2934. Die DNA dieses ORF ist zu 45% identisch mit LRP1-codierender DNA, wie durch GAP gezeigt. Ein etwas geringeres, aber signifikantes Niveau an Ähnlichkeit wird bei dem Megalin-Rezeptor beobachtet, auch bezeichnet als LRP2 und gp330 (Saito et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9725–9729), sowie dem Drosophila-Vitellogenin-Rezeptor (Schonboum et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 1485–1489). Ähnlichkeit wird auch bei anderen Mitgliedern der LDL-Rezeptorfamilie beobachtet, einschließlich des LDL-Rezeptors (Suedhof et al. (1985), Science 228: 815–822) und des VLDL-Rezeptors (Oka et al. (1994), Genomics 20: 298–300). Aufgrund der Anwesenheit von EGF-ähnlichen Motiven in LRP5 wird auch eine Ähnlichkeit mit dem EGF-Vorläufer und Nidogen-Vorläufer beobachtet, welche keine Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie sind.
Eigenschaften und Motive von LRP5
Der N-terminale Abschnitt von LRP5 hat wahrscheinlich das Potential für eine Signalsequenz-Spaltungsstelle. Signalsequenzen werden häufig in Proteinen gefunden, die über die Plasmamembran exportiert werden (von Heijne (1994), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 23: 167–192). Darüber hinaus enthalten andere Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie eine Signalsequenz für den Proteinexport.
Die Anwesenheit einer Signalsequenz-Spaltungsstelle wurde zunächst festgestellt durch einen Vergleich der Human-LRP5- mit einer Maus-cDNA-Sequenz, die wir erhielten. Die ursprüngliche partielle Maus-cDNA-Sequenz, die wir erhielten, 1711 Nukleotide (16(a)), ist über einem etwa 1500 Nukleotide langen Abschnitt zu 87% identisch mit der Human-LRP5-cDNA und ist somit wahrscheinlich das Maus-Orthologe (Lrp5) des Human-LRP5. Der klonierte Abschnitt der Maus-cDNA enthält einen offenen Leserahmen (16(c)), codierend für 533 Aminosäuren. Das Initiationscodon hat Konsensus-Nukleotide für eine effiziente Translation sowohl an den –3 (Purin)-Positionen als auch den +4 (G-Nukleotid)-Positionen (Kozak, M., 1996, Mammalian Genome 7: 563–574). Ein 500-Aminosäuren-Abschnitt des Maus-Lrp5 (5(g) und 16(d)) ist zu 96% identisch mit Human-LRP5, welches ferner die Hypothese stützt, dass dieses das Maus-Orthologe von LRP5 ist.
Signifikanterweise weisen die ersten 200 Nukleotide der Maus-cDNA sehr wenig Ähnlichkeit mit den 5'-Verlängerungen auf, die in den im Folgenden erörterten Isoformen 2–6 vorliegen. Im Gegensatz dazu ist diese Sequenz zu 75% identisch mit der humanen Sequenz für Exon 6, welche das 5'-Ende der Isoform 1 umfasst. Somit repräsentiert die Isoform 1, welche für ein Signalpeptid für den Proteinexport codiert, wahrscheinlich die biologisch wichtigste Form von LRP5.
Es ist von Bedeutung, dass die offenen Leserahmen für sowohl Human-LRP5 als auch Maus-Lrp5 für ein Peptid codieren, welches das Potential hat, als eukaryotische Signalsequenz für den Proteinexport zu fungieren (von Heijne, 1994, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 23: 167–192). Der höchste Wert für die Signalsequenz, wie bestimmt unter Verwendung des "SigCleave"-Programms in dem GCG-Analyse-Paket (Genetics Computer Group, Madison, WI), generiert ein reifes Peptid, beginnend an Rest 25 von Human-LRP5 und Rest 29 von Maus-Lrp5 (5(d und g)). Zusätzliche Stellen, welche verwendet werden können, produzieren reife Peptide im Human-LRP5, beginnend an den Aminosäureresten 22, 23, 23, 26, 27, 28, 30 oder 32. Zusätzliche Spaltstellen in dem Maus-Lrp5 resultieren in reifen Peptiden, beginnend an Aminosäurerest 31, 32, 33 oder 38 (5(g)). Das reife Human-LRP5-Protein ist in 5(e) gezeigt.
Den anderen alternativen Isoformen von LRP5 fehlt eine Signalsequenz in der Nähe des N-Terminus des codierten Proteins. Die funktionelle Relevanz dieser zusätzlichen Isoformen ist nicht bekannt, es gibt jedoch mehrere exportierte Proteine, denen eine Signalsequenz fehlt und die durch einen von einem Signalpeptid unabhängigen Mechanismus transportiert werden (Higgins, C. F. (1992), Ann. Rev. Cell Biol. 8: 67–113). Somit ist es möglich, dass die mutmaßliche extrazelluläre Domäne dieser Isoformen über die Plasmamembran transloziert wird.
Die extrazelluläre Domäne von Mitgliedern der LDL-Rezeptorfamilie enthält mehrere Motive, die 6 Cysteinreste innerhalb eines Bereichs von etwa 40 Aminosäuren enthalten (Krieger und Herz (1994), Ann. Rev. Biochem. 63: 601–637). Mehrere Klassen dieser cystein-reichen Motive wurden definiert, basierend auf der Beabstandung der Cysteinreste und der Art anderer konservierter Aminosäuren innerhalb des Motivs. Das LDL-Rezeptorligandenbindungsmotiv (Klasse A) unterscheidet sich durch einen Cluster saurer Reste im C-terminalen Abschnitt des Motivs, welcher eine hoch konservierte SDE-Sequenz einschließt. Die Bedeutung dieser sauren Region bei der Ligandenbindung wurde durch Mutagenesestudien demonstriert (Russell et al. (1989), J. Biol. Chem. 264: 21682–21688). Drei LDL-Rezeptorligandenbindungsmotive werden in dem LRP5-Protein gefunden (6(a)). Dem EGF-ähnlichen Motiv (Klasse B) fehlt der Cluster von sauren Resten, die in dem LDL-Rezeptorligandenbindungsmotiv vorliegen. Darüber hinaus unterscheidet sich die Beabstandung der Cysteinreste in den EGF-ähnlichen Motiven relativ zum LDL-Rezeptorligandenbindungsmotiv. Das LRP5-Protein enthält vier EGF-Vorläufer (B.2)-Motive, welche die Eigenschaft eines NGGCS-Motivs aufweisen, zwischen dem ersten und zweiten Cysteinrest (6(a)).
Die Größe der Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie und die Anzahl der cystein-reichen Repeats in der extrazellulären Domäne variiert in großem Umfang. LRP1 ist ein großes Protein von 4544 Aminosäuren und enthält 31 LDL-Rezeptorligandenbindungsmotive (Klasse A) und 22 EGF-ähnliche Motive (Klasse B) (Herz et al., (1988), EMBO 7: 4119–4127). Ähnlich ist der Megalin-Rezeptor, LRP2, ein Protein von 4660 Aminosäuren und besteht aus 36 LDL-Rezeptorligandenbindungsmotiven und 17 EGF-ähnlichen Motiven (Saito et al. (1994), PNAS 91: 9725–9729). Im Gegensatz dazu ist der LDL-Rezeptor ein relativ kleines Protein von 879 Aminosäuren, welches 7 LDL-Ligandenbindungsmotive und drei EGF-ähnliche Motive enthält. Die vorausgesagte Größe des reifen LRP5-Proteins, 1591 Aminosäuren, liegt zwischen LRP1 und dem LDL-Rezeptor. Wie oben angegeben, enthält das LRP5-Protein vier EGF-ähnliche Motive und drei LDL-Ligandenbindungsmotive. Es wurde postuliert, dass die mehrfachen Motiveinheiten, insbesondere in LRP1 und LRP2 ersichtlich, für die Fähigkeit dieser Proteine zur Bindung mehrerer Lipoproteine und Proteinliganden verantwortlich sind (Krieger und Herz (1994), Ann. Rev. Biochem. 63: 601–637).
Die Anordnung der LDL-Rezeptorligandenbindungsmotive und der EGF-ähnlichen Motive relativ zueinander ist ähnlich in sowohl dem LDL-Rezeptor, LRP1 und LRP2. In jedem dieser Proteine sind mehrere LDL-Ligandenbindungsmotive zusammen gruppiert und gefolgt von mindestens einem EGF-ähnlichen Motiv (Herz et al. (1988), EMBO 7: 4119–4127). Im Gegensatz dazu geht in dem LRP5-Protein ein EGF-ähnliches Motiv der Gruppe von drei LDL-Ligandenbindungsmotiven voraus (6(b)). Eine zusätzliche Eigenschaft, die für LRP5 einzigartig ist, besteht darin, dass die LDL-Ligandenbindungsmotive in LRP5 von der mutmaßlichen Transmembrandomäne gefolgt werden. Die unterschiedliche Anordnung der Motive kann LRP5 als Mitglied einer neuen Subfamilie innerhalb der LDL-Rezeptor-verwandten Proteinfamilie definieren.
LRP5 hat ein Signalpeptid für den Proteinexport am N-Terminus des Proteins. Die Signalpeptidspaltung ergibt ein reifes LRP5-Protein, welches mit einer EGF-Vorläufer-Spacerdomäne von den Aminosäuren 31–297 (die Aminosäurerest-Nrn. basieren auf dem LRP5-Vorläufer) beginnt. Die EGF-Vorläufer-Spacerdomäne ist aus fünf etwa 50 Aminosäuren langen Repeats aufgebaut, die jeweils das charakteristische Sequenzmotiv Tyr-Trp-Thr-Asp (YWTD) enthalten. Es gibt drei zusätzliche Spacerdomänen von den Aminosäuren 339–602, 643–903 und 944–1214. Jeder Spacerdomäne folgt ein EGF-Repeat von den Aminosäuren 297–338 (egf1), 603–642 (egf2), 904–943 (egf3) und 1215–1255 (egf4). Die EGF-Repeats enthalten sechs konservierte Cysteinreste und sind von der Klasse B.2, welche ein Asn-Gly-Gly-Cys (NGGC)-Motiv als Merkmal aufweist (Herz et al. (1988), EMBO J. 7: 4119–27) (6(a)). Eine einzelne Einheit, definiert als eine EGF-Vorläufer-Spacerdomäne und ein EGF-Repeat, ist viermal in LRP5 wiederholt. Das letzte EGF-Repeat befindet sich neben drei aufeinanderfolgenden LDLR-Repeats von den Aminosäuren 1257–1295 (ldlr1), 1296–1333 (ldlr2) und 1334–1372 (ldlr3). Die LDLR-Repeats weisen die konservierten Cysteinreste sowie das Motiv Ser-Asp-Glu (SDE) als charakteristisches Merkmal auf (6(a)). Es gibt 13 Aminosäuren, welche die LDLR-Repeats von der mutmaßlichen transmembran-überspannenden Domäne von 23 Aminosäuren von 1386–1408 trennen. Die mutmaßliche extrazelluläre Domäne von LRP5 hat 6 potentielle Stellen für eine N-verknüpfte Glycosylierung an den Aminosäureresten 93, 138, 446, 499, 705 und 878 (5(d)).
Die intrazelluläre Domäne von LRP5 umfasst 207 Aminosäuren, welches länger ist als die meisten Mitglieder der Familie, jedoch von ähnlicher Größe wie LRP2 (Saito et al. (1994), PNAS 91: 9725–9729). Sie zeigt keine Ähnlichkeit mit der LDL-Rezeptorfamilie, noch ist sie irgendwelchen anderen bekannten Proteinen ähnlich. Die zytoplasmatische Domäne von LRP5 umfasst 16% Prolin- und 15% Serinreste (5(d)). Die meisten Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie enthalten ein konserviertes NPXY-Motiv in der zytoplasmatischen Domäne, von dem postuliert wurde, dass es an der Endozytose durch "Coated pits" beteiligt ist (Chen et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 3116–3123). Mutagenese-Studien haben gezeigt, dass der kritische Rest für die Erkennung durch Komponenten des endozytischen Prozesses der Tyrosinrest ist (Davis et al. (1987), Cell 45: 15–24). Ein Ersatz des Tyrosinrests durch Phenylalanin oder Tryptophan wird toleriert, somit scheint die minimale Anforderung für diesen Rest zu sein, dass er eine aromatische Aminosäure ist (Davis et al. (1987), Cell 45: 15–24). Strukturstudien haben gezeigt, dass die kritische Funktion der NP-Reste die Bereitstellung einer Beta-Kehre ist, die den aromatischen Rest präsentiert (Bansal und Gierasch (1991), Cell 67: 1195–1201).
Obwohl die zytoplasmatische Domäne von LRP5 kein NPXY-Motiv enthält, gibt es mehrere aromatische Reste in der zytoplasmatischen LRP5-Domäne, die in mutmaßlichen Kehrenregionen liegen (5(d)) und somit an der Erleichterung der Endozytose beteiligt sein können. Insbesondere hat Tyrosin 1473, welches in dem Sequenzmotiv VPLY auftritt, das Prolin und Tyrosin in der richtigen Position in Bezug auf das Konsensus-Motiv. Obwohl das NPXY-Motiv mit der Endozytose in mehreren Proteinen in Verbindung gebracht wurde, ist es kein absolutes Erfordernis, da es Proteine gibt, denen das NPXY-Motiv fehlt, z.B. der Transferrin-Rezeptor, der eine Endozytose durch "Coated pits" erfährt (Chen et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 3116–3123). In jedem Fall erwarten wir, dass die Hauptfunktion dieses Proteins die rezeptor-vermittelte Endozytose seines Liganden sein wird.
Potentielle Rollen von LRP5
Das Vermögen von Mitgliedern der LDL-Rezeptorfamilie zur Bindung an mehrere Liganden legt nahe, dass LRP5 eine Funktion bei der Bindung eines oder mehrerer Liganden haben könnte. Darüber hinaus würde in einer analogen Weise wie bei anderen Mitgliedern der Familie der LRP5-Rezeptorligand-Komplex nach der Bindung eine Endozytose erfahren, was zu einer Clearance des Liganden aus dem extrazellulären Milieu führt. Die Natur des LRP5-Liganden kann ein Lipid, ein Protein, ein Proteinkomplex oder ein Lipoprotein sein und kann eine Vielfalt von Funktionen aufweisen. Obwohl die physiologische Funktion des am engsten verwandten Mitglieds der LDL-Rezeptorfamilie, LRP1, unsicher ist, weist es eine Reihe biochemischer Aktivitäten auf. LRP1 bindet an Alpha-2-Makroglobulin. Alpha-2-Makroglobulin ist ein Plasmakomplex, der einen "Köder"-Liganden für eine Vielfalt von Proteinasen, wie z.B. Trypsin, Chymotrypsin, pankreatische Elastase und Plasma-Kallikrein, enthält (Jensen (1989), J. Biol. Chem. 20: 11539–11542). Nachdem die Proteinase an das "Köder"-Alpha-2-Makroglobulin gebunden und es enzymatisch gespalten hat, erfährt es eine Konformationsänderung und "fängt" die Proteinase ein. Der Proteinase:Alpha-2-Makroglobulin-Komplex wird schnell durch LRP der Clearance zugeführt. Dieser Mechanismus fängt Proteinasen ab, welche das Potential zur Vermittlung einer Vielfalt biologischer Funktionen, wie z.B. Antigenprozessierung und Proteinasesekretion, aufweisen (Strickland et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 17401–17404). Die Bedeutung dieser Funktion wird belegt durch den pränatalen Tod von Lrp1-"knockout"-Mäusen (Zee et al. (1994), Genomics 23: 256–259).
Die Antigenpräsentation ist eine kritische Komponente in der Entwicklung von IDDM, wie belegt durch die essentielle Rolle von MHC-Haplotypen bei der Verleihung von Krankheitsanfälligkeit (Tisch und McDivitt (1996), Cell 85: 291–297). Analog zu LRP1 könnte LRP5 eine Rolle bei der Antigenpräsentation spielen, in welchem Falle Polymorphismen innerhalb dieses Gens die Entwicklung einer Autoimmunität bei dem Typ 1-Diabetes-Patienten beeinflussen könnten.
Der Alpha-2-Makroglobulin-Komplex bindet auch Cytokine und Wachstumsfaktoren, wie z.B. Interleukin-1-Beta, Interleukin 2, Interleukin 6, transformierender Wachstumsfaktor Beta und Fibroblastenwachstumsfaktor (Moestrup und Gliemann (1991), J. Biol. Chem. 266: 14011–14017). Somit hat der Alpha-2-Makroglobulin-Rezeptor das Potential, eine Rolle bei der Clearance von Cytokinen und Wachstumsfaktoren zu spielen. Die Rolle von Cytokinen bei der Vermittlung von Immunreaktionen und Entzündungsreaktionen ist wohl etabliert. Beispielsweise ist das Interleukin-2-Gen ein aussichtsreiches Kandidatengen für den Idd3-Locus bei der nicht-obesen diabetischen Maus, ein Tiermodell für Typ 1-Diabetes (Denny et al. (1977), Diabetes 46: 695–700). Wenn LRP5 Alpha-2-Makroglobulin oder verwandte Komplexe bindet, könnte es dann eine Rolle bei der Immunreaktion durch Vermittlung der Cytokin-Clearance spielen. Beispielsweise könnte das LRP5, welches im Pankreas, dem Zielgewebe von IDDM, exprimiert wird, eine Rolle bei der Clearance von Cytokinen aus dem entzündlichen Infiltrat (Insulitis), das bei der Krankheit gebildet wird, spielen. Ein Polymorphismus in LRP5, welcher das Vermögen von LRP5 für die Clearance von Cytokinen verringert, könnte die Anfälligkeit eines Individuums zur Entwicklung von IDDM erhöhen. Ferner könnte ein Individuum mit einem Polymorphismus, welcher das Vermögen von LRP5 zur Clearance von Cytokinen erhöht, vor der Entwicklung von IDDM geschützt werden. Umgekehrt wirken bestimmte Cytokine anderen Cytokinen entgegen und somit könnte die Entfernung bestimmter vorteilhafter Cytokine durch LRP5 eine Krankheitsanfälligkeit verleihen und somit könnte ein Polymorphismus, welcher LRP5-Aktivität reduziert, einen Schutz vor Entwicklung der Krankheit bieten.
Es wurde gezeigt, dass Zunahmen freier Fettsäuren (FFA) die Insulinsekretion in Tieren verringern (Boden et al. (1997), Diabetes 46: 3–10). Darüber hinaus wurde ApoE, welches ein Ligand für den LDL-Rezeptor ist, mit einer antioxidativen Aktivität assoziiert (Miyata und Smith (1996), Nature Genet. 14: 55–61) und die oxidative Schädigung ist ein zentraler pathogener Mechanismus bei der Pankreas-β-Zell-Zerstörung in Typ 1-Diabetes (Bac (1994), Endocrin. Rev. 15: 516–542). Somit könnten Veränderungen im Vermögen von LRP5, an ApoE und verwandte Lipoproteine zu binden, die Anfälligkeit für eine oxidative Schädigung in Pancreas-β-Zellen beeinflussen. Eine Transfektion von Formen von LRP5 in β-Zellen könnte die Resistenz von β-Zellen gegenüber einer Schädigung durch das Immunsystem bei Autoimmunität und Transplantation erleichtern.
Ein pharmakologisches Gebilde, bezeichnet als lipolyse-stimulierter Rezeptor (LSR), welcher Chylomicron-Überreste in Gegenwart von FFA bindet und der Endozytose zuführt, wurde beschrieben (Mann et al. (1995), Biochemistry 34: 10421–10431). Eine mögliche Rolle für das LRP5-Genprodukt besteht darin, dass es für diese Aktivität verantwortlich ist.
Ein weiteres Mitglied der LRP-Familie ist LRP2, auch bekannt als Megalin und gp330; dieses Protein wurde mit Heymann-Nephritis, einer Autoimmunerkrankung der Niere bei Ratten, in Verbindung gebracht (Saito et al. (1994), PNAS 91: 9725–9729). Heymann-Nephritis ist ein Modell von Glomerulonephritis und ist gekennzeichnet durch die Entwicklung von Autoantikörpern gegen das Alpha-2-Makroglobulin-Rezeptor-assoziierte Protein, auch bekannt als Heymann-Nephritis-Antigen. Das Heymann-Nephritis-Antigen bindet an LRP2 (Strickland et al. (1991), J. Biol. Chem. 266: 13364–13369). LRP2 könnte durch Clearance dieses pathogenen Proteins eine Rolle bei dieser Erkrankung spielen. In analoger Weise könnte die Funktion von LRP5 darin bestehen, Proteine, gegen welche der IDDM-Patient Autoantikörper gebildet hat, im Pankreas binden und einer Clearance zuführen. Alternativ könnte LRP5 selbst ein Autoantigen bei dem IDDM-Patienten sein.
LRP1 wurde als Rezeptor für bestimmte bakterielle Toxine (Krieger und Herz (1994), Ann. Rev. Biochem. 63: 601–637) und das Human-Rhinovirus (Hofer et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 1839–1842) identifiziert. Es ist möglich, dass eine virale Infektion die Suszeptibilität eines Individuums für IDDM verändert (Epstein (1994), N. Eng. J. Med. 331: 1428–1436). Wenn bestimmte Viren LRP5 als Eintrittsmodus in die Zelle verwenden, könnten die Polymorphismen in LRP5 dann die Suszeptibilität des Individuums für Typ 1-Diabetes verändern.
Veränderungen in LRP5 könnten an der Pathogenese anderer Erkrankungen beteiligt sein. LRP1 bindet Lipoproteine, wie z.B. apoE und C-Apolipoproteine. Die Clearance von Lipoproteinen, wie z.B. apoE und apoE, durch den LDL-Rezeptor ist dessen primäre Rolle, Mutationen im LDL-Rezeptor führen zu Hypercholesterinämie (Chen et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 3116–3123). Deswegen könnten Mutationen in LRP5, welche das Vermögen des Proteins zum Abfangen von Lipoproteinen verringern, eine Erhöhung des Cholesterins verursachen. Variationen in LRP5 könnten die Entwicklung von makrovaskulären Komplikationen bei Diabetikern, der Haupttodesursache, prädisponieren. Bei Typ 2-Diabetikern ist die Pankreas-Pathologie durch die Ablagerung von Amyloid gekennzeichnet. Amyloid-Ablagerung könnte die Pankreas-β-Zellfunktion verringern. LRP5 könnte beim Metabolismus von Inselzell-Amyloid eine Rolle spielen und die Anfälligkeit gegenüber Typ 2-Diabetes sowie Typ 1-Diabetes beeinflussen. Die Rolle von ApoE bei Alzheimer-Erkrankung zeigt, dass Proteine wie LRP1 und möglicherweise LRP5 das Potential aufweisen, zur Pathogenese dieser Erkrankung beizutragen.
Polymorphismen in Genen, die an der Entwicklung von Osteoporose-Pseudogliom-Syndrom beteiligt sind, wurden auf einer 3-cM-Region des Chromosoms 11 kartiert, welche das für LRP5 codierende Gen einschließt (Gong et al. (1996), Am. J. Hum. Genet. 59: 146–151). Der pathogene Mechanismus dieser Erkrankung ist unbekannt, es wird jedoch angenommen, dass er eine regulatorische Rolle beinhaltet, Patienten damit weisen ein aberrantes Gefäßwachstum in der Vitero-Retina auf. Die potentielle Rolle von LRP5 bei der Clearance von Fibroblastenwachstumsfaktor, einem Vermittler von Angiogenese, und die chromosomale Lage des Gens legen nahe, dass es eine Rolle bei dieser Erkrankung spielen könnte. Diese postulierte Funktion könnte auch mit der Entwicklung von Retinopathie bei Diabetes verbunden sein.
Polymorphismen im LRP5-Gen
Die Exons des LRP5-Gens werden hinsichtlich Polymorphismen gescannt. Es gibt mehrere Polymorphismen, welche eine Aminosäure in LRP5 verändern, die bei IDDM-Patienten identifiziert wurden (Tabelle 5). Von besonderem Interesse ist ein C-zu-T-Übergang, welcher ein Ala-Codon zu Val ändert, in einem der drei konservierten LDL-Rezeptorligandenbindungsmotive. Neben diesem oben beschriebenen Polymorphismus wurde ein C-zu-T-Übergang in dem Codon für Asn⁷⁰⁹ beobachtet (ohne Auswirkung auf die codierte Aminosäure) und drei Polymorphismen wurden in Intronsequenzen, welche die Exons flankieren, beobachtet. Ein zusätzlicher Satz von Polymorphismen wurde identifiziert durch den Vergleich experimentell erhaltener cDNA-Sequenzen mit der genomischen DNA-Sequenz (Tabelle 5). Einige dieser Polymorphismen werden in einer großen Anzahl von IDDM-Patienten und Kontrollindividuen analysiert werden, um deren Assoziation mit IDDM zu bestimmen.
Eine Reihe von (etwa 30) Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) wurden in den genomischen DNA-Sequenzen von überlappenden BAC- und Cosmid-Klonen in der Umgebung des genetischen Markers Poly A identifiziert. Die zusammenhängenden genomischen Sequenzen, welche diese Polymorphismen enthalten, wurden als Contig 57 (9), welches die Exons 1 und 5 zusammen mit den genetischen Markern Poly A und D11S1917(UT5620) enthält, und Contig 58 (10), welches den genetischen Marker L3001ca und einen Teil des Exons A enthält, bezeichnet.
Zusätzliche experimentelle Befunde
Eine Region von Identität durch Abstammung (IBD), assoziiert mit Typ 1-Diabetes, wurde in dem 5'-Anteil des LRP5-Gens identifiziert. Durch Kombination von Daten aus SNPs und Mikrosatelliten-Markern identifizierten wir eine Region als identisch durch Abstammung in suszeptiblen Haplotypen, wobei die minimale Region aus 25 kb besteht, welche die mutmaßlichen regulatorischen Regionen von LRP5 und das erste Exon enthält. Dies stützt die genetischen Befunde, dass LRP5 ein Diabetes-Risikogen ist. Deshalb könnten Therapien, welche LRP5 beeinflussen, bei der Verhütung und Behandlung von Typ 1-Diabetes von Nutzen sein.
Eine Überexpression von LRP5 in Mäusen liefert Hinweise, dass LRP5 den Lipoproteinmetabolismus beeinflusst. Statistisch signifikante Belege für die Modulation von Triglyceriden durch LRP5 wurden erhalten. Somit könnten Therapien, welche LRP5 beeinflussen, bei der Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung und Krankheitszuständen, bei denen die Serumtriglyceride erhöht sind, von Nutzen sein.
Es wurden überzeugende Belege dafür erhalten, dass LRP5 Serumcholesterin verringert, wenn es sich oberhalb des normalen Niveaus befindet. Es gibt auch Belege für das Vermögen von LRP5, mit Lipoproteinpartikeln mit sehr geringer Dichte zu Wechselwirken und deren Niveaus im Serum zu verringern. Deshalb könnten Therapien, welche LRP5 beeinflussen, bei der Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung und Krankheitszuständen, bei denen die Serumcholesterinspiegel erhöht sind, von Nutzen sein.
Biochemische Studien zeigten an, dass LRP5 die Kapazität für eine Funktion bei der Aufnahme von Lipoproteinpartikeln niedriger Dichte (LDL) aufweist. Somit könnten Therapien, welche LRP5 beeinflussen, bei der Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung, worin die LDL-Spiegel erhöht sind, von Nutzen sein.
Eine Überexpression von LRP5 in Mäusen lieferte statistisch signifikante Belege für eine Verringerung der alkalischen Phosphatase im Serum. Eine Verringerung der alkalischen Phosphatase im Serum stimmt damit überein, dass LRP5 eine Rolle bei der Modulation der Immunreaktion spielt. Dies liefert Belege für die Teilnahme von LRP5 an der Pathogenese von Typ 1-Diabetes. Deshalb könnten Therapien, welche LRP5 beeinflussen, zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen von Nutzen sein.
Die zelluläre Lokalisation von LRP5 weist darauf hin, dass es in einem speziellen Subtyp, den phagozytischen Makrophagen, von reifen Gewebe-Makrophagen exprimiert wird. Befunde aus der Literatur weisen darauf hin, dass diese Klasse von Makrophagen an einer Autoimmunerkrankung beteiligt ist, was eine Rolle für LRP5 bei einer Autoimmunerkrankung und Typ 1-Diabetes stützt. Somit könnten Therapien, welche LRP5 beeinflussen, zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen von Nutzen sein.
Volllängen-cDNAs für sowohl Human- als auch Maus-LRP5 wurden erhalten. Gegen LRP5 gerichtete Antikörper wurden entwickelt. Diese Reagenzien bieten Werkzeuge zur weiteren Analyse der biologischen Funktion von LRP5.
Unabhängig von der tatsächlichen Wirkungsweise und Beteiligung bei IDDM und anderen Erkrankungen von LRP5, etabliert und stützt die hier beschriebene experimentelle Arbeit die praktischen Anwendungen, welche als Aspekte und Ausführungen der vorliegenden Erfindung offenbart sind.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, welches eine Nukleotidsequenz aufweist, die für ein Polypeptid codiert, welches die in 5(c), 5(d) oder 5(e) gezeigte Aminosäuresequenz einschließt. Die Aminosäuresequenz von 5(c) schließt diejenige von 5(e) und eine Signalsequenz ein.
Die codierende Sequenz kann die in 5(a) oder 5(b) eingeschlossen gezeigte sein oder kann eine Mutante, Variante, ein Derivat oder Allel der gezeigten Sequenz sein. Die Sequenz kann sich von der gezeigten durch eine Veränderung unterscheiden, die eines oder mehrere von einer Addition, Insertion, Deletion und Substitution von einer oder mehreren Nukleotide der gezeigten Sequenz ist. Änderungen einer Nukleotidsequenz können zu einer Aminosäureänderung auf der Proteinebene führen oder nicht, wie durch den genetischen Code bestimmt.
Somit kann Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung eine Sequenz einschließen, die sich von der in 5(a) oder 5(b) gezeigten Sequenz unterscheidet, jedoch für ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz codiert. Die in 5(c) gezeigte Aminosäuresequenz besteht aus 1615 Resten.
Andererseits kann das codierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfassen, die durch einen oder mehrere Aminosäurerest(e) von der in 5(c) gezeigten Aminosäuresequenz differiert. Nukleinsäure, codierend für ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenzmutante, -variante, ein Derivat oder Allel der in 5(c) gezeigten Sequenz ist, wird ferner durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt. Solche Polypeptide werden im folgenden erörtert. Nukleinsäure, welche für ein solches Polypeptid codiert, kann auf der Ebene der Nukleotidsequenz und/oder der codierten Aminosäuren mehr als etwa 60% Homologie mit der in 5(a) gezeigten codierenden Sequenz und/oder der in 5(c) gezeigten Aminosäuresequenz, mehr als etwa 70% Homologie, mehr als etwa 80% Homologie, mehr als etwa 90% Homologie oder mehr als etwa 95% Homologie aufweisen. Aminosäure-"Homologie" ist zu verstehen als Ähnlichkeit (gemäß den etablierten Prinzipien der Aminosäureähnlichkeit, wie z.B. bestimmt unter Verwendung des Algorithmus GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI) oder Identität. GAP verwendet den Algorithmus von Needleman und Wunsch zur Zuordnung von zwei vollständigen Sequenzen, welcher die Anzahl der Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl der Lücken minimiert. Im Allgemeinen werden die Standardparameter verwendet, mit einem Lückenbildungsmalus = 12 und einem Lückenverlängerungsmalus = 4. Die Verwendung eines der Begriffe "Homologie" und "homolog" hier impliziert nicht irgendeine notwendige evolutionäre Beziehung zwischen verglichenen Sequenzen, beispielsweise in Übereinstimmung mit der Standardverwendung von Begriffen wie "homologe Rekombination", welche lediglich erfordert, dass zwei Nukleotidsequenzen ausreichend ähnlich sind, um unter den geeigneten Bedingungen zu rekombinieren. Eine weitere Erörterung von Polypeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung, welche von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung codiert werden können, ist im Folgenden zu finden.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf Nukleinsäure, welche mit einer oder mehreren der hier offenbarten spezifischen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Geeignete Bedingungen umfassen, beispielsweise für den Nachweis von Sequenzen, die zu etwa 80–90% identisch sind, wie z.B. Nachweis von Maus-LRP5 mit einer humanen Sonde oder umgekehrt, Hybridisierung über Nacht bei 42°C in 0,25 M Na₂HPO₄, pH 7,2, 6,5% SDS, 10% Dextransulfat und einen letzten Waschschritt bei 55°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS. Für den Nachweis von Sequenzen, die zu mehr als etwa 90% identisch sind, umfassen geeignete Bedingungen eine Hybridisierung über Nacht bei 65°C in 0,25 M Na₂HPO₄, pH 7,2, 6,5% SDS, 10% Dextransulfat und einen letzten Waschschritt bei 60°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS.
Die codierende Sequenz kann innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls eingeschlossen sein, das die in 5(a) (Isoform 1) oder 5(b) gezeigte Sequenz aufweist, und für das vollständige Polypeptid der Isoform 1 codieren (5(c)).
Ebenfalls beschrieben ist ein Nukleinsäuremolekül, codierend für ein Polypeptid, welches die in 17(b) gezeigte Aminosäuresequenz einschließt. Diese Sequenz bildet einen wesentlichen Teil der in 5(e) gezeigten Aminosäuresequenz. Nukleinsäure, codierend für ein Polypeptid, welches die in 17(b) gezeigte Aminosäuresequenz einschließt, kann die in 17(b) gezeigte codierende Sequenz einschließen oder ein Allel, eine Variante, Mutante oder ein Derivat davon, in ähnlichen Begriffen wie oben und im Folgenden für andere Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung erörtert.
Gemäß verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung werden auch verschiedene Isoformen des LRP5-Polypeptids und -Gens bereitgestellt. Das Gen von 5 ist als Isoform 1 bekannt. Von der vorliegenden Erfindung umfasst ist ein Nukleinsäuremolekül, welches eine Nukleotidsequenz aufweist, die für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz eines in 11(c) gezeigten Polypeptids (Isoform 2) einschließt. Die codierende Sequenz kann die in 11(b) gezeigte sein (die in einem Molekül eingeschlossen sein kann, welches die in 11(a) gezeigte Sequenz (Isoform 2) oder die in 12(a) (Isoform 3) gezeigte Sequenz aufweist), oder die in 13 (Isoform 4), 14 (Isoform 5) und 15 (Isoform 6) gezeigte Sequenz.
Weitere Nukleinsäuremoleküle gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die Nukleotidsequenz irgendeiner von 5(a), 12(b), 12(e), 15(b), 16(a) und 16(b) und Nukleinsäure, codierend für die Aminosäuresequenzen, die von 5(a), 11(b), 12(c) oder 16(c) codiert werden, zusammen mit Mutanten, Allelen, Varianten und Derivaten dieser Sequenzen. Ferner eingeschlossen sind Nukleinsäuremoleküle, welche für die Aminosäuresequenz von 18(c) codieren, insbesondere einschließlich der in 18(b) gezeigten codierenden Sequenz.
Spezielle hier beschriebene Allele haben Sequenzen mit einer in Tabelle 5 oder Tabelle 6 angegebenen Variation. Eine oder mehrere davon kann mit Anfälligkeit für IDDM oder eine andere Erkrankung assoziiert sein. Änderungen in einer Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, welche mit IDDM oder einer anderen Erkrankung assoziiert sind, können gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sein. Implikationen für das Screening, z.B. für diagnostische oder prognostische Zwecke, sind im Folgenden erörtert.
Im Allgemeinen wird Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung als Isolat bereitgestellt, in isolierter und/oder gereinigter Form oder frei oder im Wesentlichen frei von Material mit dem sie natürlicherweise assoziiert ist, wie z.B. frei oder im Wesentlichen frei von Nukleinsäure, welche das Gen im humanen Genom flankiert, möglicherweise mit Ausnahme einer oder mehrerer regulatorischer Sequenz(en) für die Expression. Nukleinsäure kann ganz oder teilweise synthetisch sein und kann genomische DNA, cDNA oder RNA einschließen. Die hier gezeigte codierende Sequenz ist eine DNA-Sequenz. Wenn Nukleinsäure gemäß der Erfindung RNA einschließt, sollte eine Bezugnahme auf die Sequenz so verstanden werden, dass sie eine Bezugnahme auf das RNA-Äquivalent, mit U als Ersatz für T, einschließt.
Nukleinsäure kann als Teil eines replizierbaren Vektors bereitgestellt werden und von der vorliegenden Erfindung werden auch ein Vektor, umfassend Nukleinsäure wie oben ausgeführt, insbesondere irgendein Expressionsvektor, von dem das codierte Polypeptid unter geeigneten Bedingungen exprimiert werden kann, und eine Wirtszelle, die irgendeinen solchen Vektor oder irgendeine solche Nukleinsäure enthält, bereitgestellt. Ein Expressionsvektor in diesem Kontext ist ein Nukleinsäuremolekül, welches Nukleinsäure, die für ein Polypeptid von Interesse codiert, und geeignete regulatorische Sequenzen für die Expression des Polypeptids in einem in vitro-Expressionssystem, z.B. Retikulozytenlysat, oder in vivo, z.B. in eukaryotischen Zellen wie COS- oder CHO-Zellen oder in prokaryotischen Zellen wie E. coli, einschließt. Dies wird unten näher erörtert.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellte Nukleinsäuresequenz ist von Nutzen zur Identifizierung von interessierender Nukleinsäure (und welche gemäß der vorliegenden Erfindung sein kann) in einer Testprobe. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren für den Erhalt von Nukleinsäure von Interesse bereit, wobei das Verfahren die Hybridisierung einer Sonde mit der Sequenz, die in irgendeiner von 5(a), 11(a), 11(b), 12(a), 12(b), 12(c), 12(e), 13, 14, 15, 15(b), 16(a), 16(b) und 16(c) gezeigt ist, oder einer komplementären Sequenz mit einer Zielnukleinsäure umfasst. Der Hybridisierung folgt gewöhnlich eine Feststellung erfolgreicher Hybridisierung und eine Isolierung von Nukleinsäure, welche mit der Sonde hybridisiert hat, welches einen oder mehrere Schritt(e) von PCR beinhalten kann. Es wird gewöhnlich nicht erforderlich sein, eine Sonde mit der vollständigen Sequenz, die in irgendeiner dieser Figuren gezeigt ist, zu verwenden. Kürzere Fragmente, gewöhnlich Fragmente mit einer Sequenz, die für die konservierten Motive codiert (5(c, d) und 6(a)), können verwendet werden.
Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung ist erhältlich unter Verwendung einer(s) oder mehrerer Oligonukleotid-Sonde(n) oder -Primer, welche so gestaltet sind, dass sie mit einem oder mehreren Fragment(en) der in irgendeiner der Figuren gezeigten Nukleinsäuresequenz hybridisieren, insbesondere Fragmenten mit einer relativ seltenen Sequenz, basierend auf der Codonverwendung oder statistischer Analyse. Ein Primer, der zur Hybridisierung mit einem Fragment der in irgendeiner der Figuren gezeigten Nukleinsäuresequenz gestaltet ist, kann in Verbindung mit einem oder mehreren Oligonukleotid(en) verwendet werden, welche(s) gestaltet ist/sind, um mit einer Sequenz in einem Klonierungsvektor, in den Zielnukleinsäure kloniert wurde, zu hybridisieren, oder in einer sog. "RACE" („Rapid Amplification of cDNA-ends"), worin cDNA's in einer Bank mit einem Oligonukleotid-Linker ligiert werden und eine PCR unter Verwendung eines Primers, der mit einer gezeigten Sequenz hybridisiert, und eines Primers, der mit dem Oligonukleotid-Linker hybridisiert, durchgeführt wird.
Solche Oligonukleotid-Sonden oder -Primer sowie die Volllängen-Sequenz (und Mutanten, Allele, Varianten und Derivate) sind auch von Nutzen beim Screenen einer Testprobe, die Nukleinsäure enthält, hinsichtlich der Anwesenheit von Allelen, Mutanten und Varianten, mit diagnostischen und/oder prognostischen Implikationen wie detaillierter im Folgenden erörtert.
Nukleinsäure, die aus einer Zelle oder mehreren Zellen (z.B. Human) isoliert und/oder gereinigt wurde, oder eine Nukleinsäure-Bank, abgeleitet von Nukleinsäure, die aus Zellen isoliert und/oder gereinigt wurde (z.B. einte cDNA-Bank, abgeleitet aus mRNA, die aus den Zellen isoliert wurde), kann unter Bedingungen für selektive Hybridisierung sondiert und/oder einer spezifischen Nukleinsäureamplifizierungsreaktion, wie z.B. der Polymerasekettenreaktion (PCR) (beispielsweise im Überblick dargestellt in "PCR protocols: A Guide to Methods and Applications", Hrsg. Innis et al., 1990, Academic Press, New York, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987), Ehrlich (Hrsg.), PCR technology, Stockton Press, NY, 1989, und Ehrlich et al., Science, 252: 1643–1650 (1991)), unterworfen werden. PCR umfasst Schritte der Denaturierung von Matrizen-Nukleinsäure (falls doppelsträngig), Verschmelzung von Primern mit Target und Polymerisation. Die sondierte Nukleinsäure oder als Matrize in der Amplifizierungsreaktion verwendete Nukleinsäure kann genomische DNA, cDNA oder RNA sein. Andere spezifische Nukleinsäureamplifizierungstechniken umfassen Strangverdrängungsaktivierung, das QB-Replicase-System, die Reparaturkettenreaktion, die Ligasekettenreaktion und ligations-aktivierte Transkription. Aus Gründen der Bequemlichkeit und aufgrund seiner allgemeinen Bevorzugung wird der Begriff PCR hier in Kontexten verwendet, in denen andere Nukleinsäureamplifizierungstechniken von Fachleuten eingesetzt werden können. Soweit es der Kontext nicht anders verlangt, sollte der Verweis auf PCR die Verwendung jeder geeigneten Nukleinsäureamplifizierungsreaktion umfassen, die im Stand der Technik verfügbar ist.
Im Kontext der Klonierung kann es erforderlich sein, dass ein oder mehrere Genfragment(e) ligiert wird/werden, um eine codierende Sequenz voller Länge zu erzeugen. Auch kann, wenn ein codierendes Nukleinsäuremolekül voller Länge nicht erhalten wurde, ein kleineres Molekül, das einen Teil des vollständigen Moleküls repräsentiert, verwendet werden, um Volllängen-Klone zu erhalten. Inserts können aus partiellen cDNA-Klonen präpariert und zum Screenen von cDNA-Banken verwendet werden. Die isolierten Volllängen-Klone können in Expressionsvektoren subkloniert werden und durch Transfektion in geeignete Wirtszellen, z.B. mit einem Reporterplasmid, einem Assay hinsichtlich Aktivität unterworfen werden.
Ein Verfahren kann die Hybridisierung von einer Sonde oder mehreren (z.B. zwei) Sonden oder Primern mit Zielnukleinsäure umfassen. Wenn die Nukleinsäure doppelsträngige DNA ist, wird der Hybridisierung im allgemeinen eine Denaturierung vorangehen, um einzel strängige DNA zu bilden. Die Hybridisierung kann Teil einer PCR-Prozedur sein oder Teil einer Sonderungsprozedur, die keine PCR beinhaltet. Eine Beispielsprozedur wäre eine Kombination von PCR und Hybridisierung bei niedriger Stringenz. Ein Screeningverfahren, ausgewählt aus den vielen, die Fachleuten zur Verfügung stehen, wird dazu verwendet, erfolgreiche Hybridisierungsereignisse und isolierte hybridisierte Nukleinsäure zu identifizieren.
Die Bindung einer Sonde an eine Zielnukleinsäure (z.B. DNA) kann unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken, die Fachleuten zur Verfügung stehen, gemessen werden. Beispielsweise können Sonden radioaktiv, fluoreszent oder enzymatisch markiert sein. Andere Verfahren, die keine Markierung einer Sonde einsetzen, umfassen die Untersuchung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen, Amplifizierung unter Verwendung von PCR, RNase-Spaltung und allel-spezifische Oligonukleotid-Sondierung. Die Sondierung kann unter Anwendung der standardmäßigen Southernblot-Technik durchgeführt werden. Beispielsweise kann DNA aus Zellen extrahiert und mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut werden. Die Restriktionsfragmente können dann mittels Elektrophorese auf einem Agarosegel aufgetrennt werden, vor Denaturierung und Überführung auf einen Nitrocellulosefilter. Markierte Sonde kann mit den DNA-Fragmenten auf dem Filter hybridisiert und die Bindung bestimmt werden. DNA zur Sondierung kann aus RNA-Präparationen aus Zellen präpariert werden.
Einleitende Experimente können durchgeführt werden, indem unter Bedingungen niedriger Stringenz verschiedene Sonden mit Southernblots von DNA, verdaut mit Restriktionsenzymen, hybridisiert werden. Geeignete Bedingungen würden erzielt werden, wenn eine große Anzahl hybridisierender Fragmente erhalten wird, während die Hintergrund-Hybridisierung niedrig ist. Unter Verwendung dieser Bedingungen können Nukleinsäure-Banken, z.B. cDNA-Banken, die für die exprimierten Sequenzen repräsentativ sind, durchsucht werden. Fachleute auf dem Gebiet sind unter Berücksichtigung von Faktoren wie Oligonukleotid-Länge und Basenzusammensetzung, Temperatur etc., unschwer in der Lage, geeignete Bedingungen gewünschter Stringenz für eine selektive Hybridisierung einzusetzen. Auf Grundlage der Aminosäuresequenzinformation können unter Berücksichtigung der Degeneration der genetischen Codes und, wo angemessen, der Codonverwendung des Organismus, aus dem die Kandidatennukleinsäure stammt, Oligonukleotid-Sonden oder Primer konstruiert werden. Ein Oligonukleotid zur Verwendung bei der Nukleinsäureamplifizierung kann etwa 10 oder weniger Codons (z.B. 6, 7 oder 8) aufweisen, d.h. etwa 30 oder weniger Nukleotide Länge (z.B. 18, 21 oder 24). Im Allgemeinen haben spezifische Primer eine Länge von 14 Nukleotiden aufwärts, müssen jedoch nicht mehr als 18–20 haben. Fachleute auf dem Gebiet sind wohl versiert bei der Gestaltung von Primern zur Verwendung in Prozessen wie PCR. Verschiedene Techniken zur Synthese von Oligonukleotid-Primern sind im Stand der Technik wohl bekannt, einschließlich Phosphotriester- und Phosphodieester-Syntheseverfahren.
Bevorzugte Aminosäuresequenzen, die zur Verwendung bei der Konstruktion von Sonden oder PCR-Primern geeignet sind, können konservierte Sequenzen (vollständig, substantiell oder teilweise), codierend für die die in LRP5 vorliegenden Motive (5(d)), einschließen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Oligonukleotid- oder Polynukleotid-Fragment der in irgendeiner der hier vorliegenden Figuren, die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung bereitstellen, gezeigten Nukleotidsequenz oder einer komplementären Sequenz bereit, insbesondere zur Verwendung in einem Verfahren zum Erhalt und/oder zum Screenen von Nukleinsäure. Einige bevorzugte Oligonukleotide haben eine Sequenz, die in Tabelle 2, Tabelle 4, Tabelle 7, Tabelle 8 oder Tabelle 9 gezeigt ist, oder eine Sequenz, welche sich von irgendeiner der gezeigten Sequenzen durch die Addition, Substitution, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Nukleotid(en) unterscheidet, jedoch vorzugsweise ohne Verlust des Vermögens, selektiv mit Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung zu hybridisieren, d.h., wobei der Ähnlichkeitsgrad des Oligonukleotids oder Polynukleotids mit einer der gegebenen Sequenzen ausreichend hoch ist.
Fragmente und andere Oligonukleotide können als Primer oder Sonden wie erörtert verwendet werden, können jedoch auch generiert werden (z.B. mittels PCR) in Verfahren, welche die Feststellung der Anwesenheit einer Sequenz, die Suszeptibilität (Anfälligkeit) für IDDM oder eine andere Krankheit anzeigt, in einer Testprobe betreffen.
Verfahren, welche die Verwendung von Nukleinsäure in diagnostischen und/oder prognostischen Kontexten umfassen, beispielsweise bei der Bestimmung der Suszeptibilität für IDDM oder eine andere Erkrankung, und andere Verfahren, welche die Feststellung der Anwesenheit von Sequenzen, die Suzeptibilität für IDDM oder eine andere Krankheit anzeigen, betreffen, werden im Folgenden erörtert.
Weitere Ausführungsformen von hier beschriebenen Oligonukleotiden sind Antisense-Oligonukleotidsequenzen auf Grundlage der hier beschriebenen Nukleinsäuresequenzen. Antisense-Oligonukleotide können so gestaltet sein, dass sie mit der komplementären Sequenz von Nukleinsäure, Prä-mRNA oder reifer mRNA hybridisieren, die Bildung eines Polypeptids stören, das von einer gegebenen DNA-Sequenz codiert wird (z.B. entweder natives Polypeptid oder eine Mutantenform davon), so dass dessen Expression verringert oder vollkommen verhindert wird. Antisense-Techniken können zur gezielten Beinflussung einer Codierungssequenz, einer Kontrollsequenz eines Gens, z.B. der 5'-flankierenden Sequenz, verwendet werden, wodurch die Antisense-Oligonukleotide Kontrollsequenzen stören können. Antisense-Oligonukleotide können DNA oder RNA sein und können etwa 14–23 Nukleotide, vorzugsweise etwa 15–18 Nukleotide, aufweisen. Die Konstruktion von Antisense-Sequenzen und deren Verwendung ist beschrieben in Peyman und Ulman, Chemical Reviews, 90: 543–584 (1990), und Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 329–376 (1992).
Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Verfahren der Gentherapie eingesetzt werden, beispielsweise zur Behandlung von Individuen mit dem Ziel IDDM oder eine andere Erkrankung zu verhindern oder zu heilen (ganz oder vollständig). Dies kann ein oder mehrere Symptom(e) der Erkrankung lindern. Dies wird im Folgenden erörtert.
Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, wie z.B. eine Volllängen-Codierungssequenz oder ein(e) Oligonukleotid-Sonde oder -Primer, kann als Teil eines Kits bereitgestellt werden, wie z.B. in einem geeigneten Behälter, z.B. ein Gefäß, in dem der Inhalt von der äußeren Umgebung geschützt ist. Der Kit kann Instruktionen zur Verwendung der Nukleinsäure, beispielsweise bei einer PCR und/oder einem Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Nukleinsäure von Interesse in einer Testprobe, beinhalten. Ein Kit, bei dem die Nukleinsäure zur Verwendung bei der PCR vorgesehen ist, kann ein oder mehrere andere(s) Reagenz(ien) einschließen, das bzw. die für die Reaktion erforderlich ist/sind, wie z.B. Polymerase, Nukleoside, Pufferlösung etc. Die Nukleinsäure kann markiert sein. Ein Kit zur Verwendung bei der Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Nukleinsäure von Interesse kann einen oder mehrere Artikel und/oder Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens einschließen, wie z.B. ein Mittel zur Bereitstellung der Testprobe selbst, beispielsweise ein Bausch zur Entfernung von Zellen aus der Mundhöhle oder eine Spritze zur Entnahme einer Blutprobe (solche Komponenten sind im allgemeinen steril).
Ebenfalls beschrieben wird hier ein Nukleinsäuremolekül, das für einen LRP5-Gen-Promotor codiert.
Somit wird hier ein Nukleinsäuremolekül einschließlich eines Promotors beschrieben, wobei der Promotor die in 12(e) oder 15(b) gezeigte Nukleotidsequenz einschließt. Der Promotor kann ein oder mehrere Fragment(e) der in 12(e) oder 15(b) gezeigten Sequenz einschließen, welche(s) ausreicht/en, um die Genexpression zu fördern. Der Promotor kann eine Sequenz von Nukleotiden 5' zu dem LRP5-Gen in dem humanen Chromosom oder eine äquivalente Sequenz in einer anderen Spezies, wie z.B. der Maus, umfassen oder im Wesentlichen daraus bestehen.
Irgendeine der hier in den Figuren offenbarten Sequenzen kann dazu verwendet werden, eine Sonde zur Verwendung bei der Identifizierung und Isolierung eines Promotors aus einer genomischen Bank, enthaltend ein genomisches LRP5-Gen, zu konstruieren und Bedingungen für eine solche Sondierung sind im Stand der Technik wohl bekannt und werden hier an anderer Stelle erörtert. Zur Auffindung minimaler Elemente oder Motive, welche für Gewebe- und/oder Entwicklungsregulation erforderlich sind, können Restriktionsenzyme oder Nukleasen verwendet werden, um ein Nukleinsäuremolekül zu verdauen, gefolgt von einem geeigneten Assay (beispielsweise unter Verwendung eines Reporterenzyms wie Luciferase), um die erforderliche Sequenz zu bestimmen. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Nukleinsäureisolat mit der minimalen Nukleotidsequenz, gezeigt in 12(e) oder 15(b), welche für die Promotoraktivität erforderlich ist, bereit.
Wie festgestellt, kann der Promotor ein oder mehrere Sequenzmotiv(e) oder Element(e) umfassen, das/die eine entwicklungs- und/oder gewebespezifische regulatorische Kontrolle der Expression bietet/bieten. Andere regulatorische Sequenzen können eingeschlossen sein, beispielsweise wie identifiziert durch Mutations- oder Verdauungs-Assay in einem geeigneten Expressionssystem oder durch Sequenzvergleich mit verfügbarer Information, z.B. unter Verwendung eines Computers zur Durchsuchung von Online-Datenbanken.
"Promotor" bedeutet eine Sequenz von Nukleotiden, von der eine Transkription von DNA initiiert werden kann, die funktionsfähig stromabwärts (d.h. in 3'-Richtung des Sense-Stranges von doppelsträngiger DNA) verknüpft ist.
"Funktionsfähig verknüpft" bedeutet verbunden als Teil desselben Nukleinsäuremoleküls, in geeigneter Weise positioniert und orientiert für die Transkription, die von dem Promotor initiiert werden soll. DNA, die funktionsfähig mit einem Promotor verknüpft ist, befindet sich "unter der transkriptionalen Initiationsregulation" des Promotors.
Somit kann ein Promotor eine Nukleotidsequenz aufweisen, welche ein Allel, eine Mutante, Variante oder ein Derivat, durch Nukleotid-Addition, -Insertion, -Substitution oder -Deletion einer Promotorsequenz wie hier bereitgestellt, darstellt. Bevorzugte Niveaus von Sequenzhomologie mit einer vorgegebenen Sequenz können analog zu denjenigen sein, welche oben für codierende Nukleinsäure und Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung angegeben sind. Eine systematische oder statistische Mutagenese von Nukleinsäure, um eine Veränderung der Nukleotidsequenz zu generieren, kann unter Verwendung irgendeiner Fachleuten bekannten Technik durchgeführt werden. Eine oder mehrere Veränderung(en) einer Promotorsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Promotoraktivität erhöhen oder verringern oder die Größe der Wirkung einer Substanz, welche zur Modulation der Promotoraktivität in der Lage ist, erhöhen oder verringern.
"Promotoraktivität" wird zur Beschreibung des Vermögens zur Initiierung von Transkription verwendet. Das Niveau der Promotoraktivität ist quantitativ bestimmbar, beispielsweise durch Ermittlung der Menge an mRNA, welche durch Transkription von dem Promotor gebildet wird, oder durch Ermittlung der Menge an Proteinprodukt, welche durch Translation der durch Transkription von dem Promotor gebildeten mRNA gebildet wird. Die Menge an einer spezifischen mRNA, die in einem Expressionssystem vorhanden ist, kann beispielsweise unter Verwendung spezifischer Oligonukleotide bestimmt werden, welche in der Lage sind, mit der mRNA zu hybridisieren, und welche markiert sind oder in einer spezifischen Amplifizierungsreaktion, wie z.B. der Polymerasekettenreaktion, verwendet werden können. Die Verwendung eines Reportergens erleichtert die Bestimmung der Promotoraktivität durch Bezugnahme auf die Proteinproduktion.
Ebenfalls beschrieben ist ein Nukleinsäurekonstrukt, umfassend eine LRP5-Promotorregion oder ein Fragment, eine Mutante, ein Allel, Derivat oder eine Variante davon, welche(s) in der Lage ist, die Transkription zu fördern, in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem heterologen Gen, z.B. einer codierenden Sequenz. Ein "heterologes" oder "exogenes" Gen ist im Allgemeinen keine modifizierte Form von LRP5. Im Allgemeinen kann das Gen in mRNA transkribiert werden, welche in ein Peptid- oder Polypeptid-Produkt translatiert werden kann, das nach der Expression nachgewiesen und vorzugsweise quantitativ bestimmt werden kann. Ein Gen, dessen codiertes Produkt nach der Expression nachgewiesen werden kann, wird als "Reportergen", d.h. ein Gen, welches die Promotoraktivität "berichtet", bezeichnet.
Das Reportergen codiert vorzugsweise für ein Enzym, das eine Reaktion katalysiert, welche ein nachweisbares Signal produziert, vorzugsweise ein visuell nachweisbares Signal, z.B. ein gefärbtes Produkt. Viele Beispiele sind bekannt, einschließlich β-Galactosidase und Luciferase. β-Galactosidase-Aktivität kann durch Bildung einer blauen Farbe auf Substrat nachgewiesen werden, wobei der Assay mit dem Auge oder unter Verwendung eines Spektrophotometers zur Messung der Extinktion stattfinden kann. Fluoreszenz, beispielsweise die als Folge von Luciferase-Aktivität gebildete, kann unter Verwendung eines Spektrophotometers quantitativ bestimmt werden. Radioaktive Assays können verwendet werden, beispielsweise unter Verwendung von Chloramphenicolacetyltransferase, welche auch in nicht-radioaktiven Assays eingesetzt werden kann. Die Anwesenheit und/oder Menge von Genprodukt, welches das Ergebnis der Expression von dem Reportergen ist, kann unter Verwendung eines Moleküls, welches zur Bindung des Produkts in der Lage ist, beispielsweise eines Antikörpers oder Fragments davon, bestimmt werden. Das bindende Molekül kann direkt oder indirekt unter Verwendung irgendeiner Standardtechnik markiert werden.
Fachleute auf dem Gebiet kennen eine Vielzahl möglicher Reportergene und Assay-Techniken, welche zur Bestimmung von Genaktivität eingesetzt werden können. Irgendein geeigneter Reporter/Assay kann verwendet werden.
Nukleinsäure-Konstrukte, umfassend einen Promotor (wie hier offenbart) und ein heterologes Gen (Reporter), können beim Screenen hinsichtlich einer Substanz, die zur Modulierung der Aktivität des Promotors in der Lage ist, eingesetzt werden. Für therapeutische Zwecke, z.B. zur Behandlung von IDDM oder einer anderen Erkrankung, kann eine Substanz gesucht werden, welche zur Hochregulation der Expression des Promotors in der Lage ist. Ein Verfahren zum Screenen hinsichtlich des Vermögens einer Substanz zur Modulation der Aktivität eines Promotors kann das Kontaktieren eines Expressionssystems, wie z.B. einer Wirtszelle, die ein Nukleinsäurekonstrukt wie hier offenbart enthält, mit einer Test- oder Kandidatensubstanz und Bestimmung der Expression des heterologen Gens umfassen.
Das Expressionsniveau in Gegenwart der Testsubstanz kann mit dem Expressionsniveau in Abwesenheit der Testsubstanz verglichen werden. Ein Unterschied in der Expression in Anwesenheit der Testsubstanz zeigt das Vermögen der Substanz zur Modulation der Genexpression an. Eine Erhöhung in der Expression des heterologen Gens im Vergleich zur Expression eines anderen Gens, das nicht mit einem Promotor wie hier offenbart verknüpft ist, zeigt die Spezifität der Substanz für die Modulation des Promotors an.
Ein Promotor-Konstrukt kann in eine Zelllinie unter Verwendung irgendeiner Technik, die bereits beschrieben wurde, eingeführt werden, um eine stabile Zelllinie, welche das Reporterkonstrukt in das Genom integriert enthält, herzustellen. Die Zellen können gezüchtet und mit Testverbindungen für variierende Zeiten inkubiert werden. Die Zellen können in 96-Mulden-Platten gezüchtet werden, um die Analyse einer großen Anzahl von Verbindungen zu erleichtern. Die Zellen können dann gewaschen und die Reportergen-Expression kann analysiert werden. Für einige Reporter, wie z.B. Luciferase, werden die Zellen lysiert und dann analysiert werden.
Nach der Identifizierung einer Substanz, welche Promotoraktivität moduliert oder beeinflusst, kann die Substanz weiter untersucht werden. Ferner kann sie hergestellt werden und/oder bei der Präparation, beispielsweise Herstellung oder Formulierung einer Zusammensetzung, wie z.B. einem Medikament, einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einem Arzneiwirkstoff, verwendet werden. Diese können Individuen verabreicht werden.
Somit ist es möglich, unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls als Modulator von Promotoraktivität gemäß der vorliegenden Offenbarung nicht nur eine Substanz zu identifizieren, sondern auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Medikament, einen Arzneiwirkstoff oder eine Zusammensetzung herzustellen, die eine solche Substanz enthält, ein Verfahren, welches die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten umfasst, z.B. zur Erhöhung der LRP5-Expression beispielsweise bei der Behandlung (welche eine präventive Behandlung einschließen kann) von IDDM oder einer anderen Erkrankung, die Verwendung einer solchen Substanz bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die Verabreichung, beispielsweise zur Erhöhung der LRP5-Expression, beispielsweise bei der Behandlung von IDDM oder einer anderen Erkrankung, und ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend das Mischen einer solchen Substanz mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Vehikel oder Träger und gegebenenfalls anderen Bestandteilen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Polypeptid bereit, welches die in 5(c) gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, welches in isolierter und/oder gereinigter Form vorliegen kann, frei oder im Wesentlichen frei von Material mit dem es natürlicherweise assoziiert ist, wie z.B. anderen Polypeptiden oder anderen humanen Polypeptiden als denjenigen, für die in 5(c) die Aminosäuresequenz gezeigt ist, oder (falls beispielsweise durch Expression in einer prokaryotischen Zelle hergestellt) dem die native Glycosylierung fehlt, z.B. unglycosyliert ist. Weitere Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung haben eine Aminosäuresequenz, welche aus der Sequenz ausgewählt ist, die in dem in 11(c) gezeigten Polypeptid, dem in 12(d) gezeigten Polypetid und dem in 16(d) gezeigten partiellen Polypeptid gezeigt ist.
Polypeptide, welche Aminosäuresequenzvarianten, Allele, Derivate oder Mutanten sind, sind ebenfalls beschrieben. Ein Polypeptid, welches eine Variante, ein Allel, Derivat oder eine Mutante ist, kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, die sich von der hier in einer Figur angegebenen durch eines oder mehrere von Addition, Substitution, Deletion und Insertion von einer oder mehrer Aminosäuren unterscheidet. Bevorzugte solche Polypeptide haben LRP5-Funktion, d.h. eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: immunologische Kreuzreaktivität mit einem Antikörper, der reaktiv gegenüber dem Polypeptid ist, für welches die Sequenz hier in einer Figur angegeben ist; ein gemeinsames Epitop mit dem Polypeptid, für welches die Aminosäuresequenz hier in einer Figur gezeigt ist (wie beispielsweise bestimmt durch immunologische Kreuzreaktion zwischen den beiden Polypeptiden); eine biologische Aktivität, welche durch einen Antikörper inhibiert wird, der gegen das Polypeptid induziert wurde, dessen Sequenz hier in einer Figur gezeigt ist; Vermögen zur Verringerung von Serumtriglyceriden; Vermögen zur Verringerung von Serumcholesterin; Vermögen zur Wechselwirkung mit und/oder zur Verringerung von Serumspiegeln von Lipoproteinpartikeln sehr niedriger Dichte, Vermögen zur Beeinflussung der Spiegel von alkalischer Phosphatase im Serum. Die Veränderung der Sequenz kann die Natur und/oder das Niveau der Aktivität und/oder die Stabilität des LRP5-Proteins verändern.
Ein Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenzvariante, ein Allel, Derivat oder eine Mutante der hier in einer Figur gezeigten Aminosäuresequenz ist, kann eine Aminosäuresequenz umfassen, die mehr als etwa 35% Sequenzidentität mit der gezeigten Sequenz, mehr als etwa 40%, mehr als etwa 50%, mehr als etwa 60%, mehr als etwa 70%, mehr als etwa 80%, mehr als etwa 90% oder mehr als etwa 95% aufweist. Die Sequenz kann mehr als etwa 60% Ähnlichkeit, mehr als etwa 70% Ähnlichkeit, mehr als etwa 80% Ähnlichkeit oder mehr als etwa 90% Ähnlichkeit mit der Aminosäuresequenz aufweisen, die in der relevanten Figur gezeigt ist. Aminosäureähnlichkeit ist im Allgemeinen definiert unter Bezugnahme auf den Algorithmus GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI) wie oben festgestellt oder das TBLASTN-Programm von Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403–410. Ähnlichkeit erlaubt eine "konservative Variation", d.h. Substitution eines hydrophoben Rests, wie z.B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, durch einen anderen oder die Substitution eines polaren Rests durch einen anderen, wie z.B. Lysin durch Arginin, Asparaginsäure durch Glutaminsäure oder Asparagin durch Glutamin. Spezielle Amino säuresequenzvarianten können sich von der hier in einer Figur gezeigten durch Insertion, Addition, Substitution oder Deletion von 1 Aminosäure, 2, 3, 4, 5–10, 10–20, 20–30, 30–50, 50–100, 100–150 oder mehr als 150 Aminosäuren unterscheiden.
Ein Sequenzvergleich kann über die volle Länge der hier gezeigten relevanten Sequenz erfolgen oder bevorzugter über eine zusammenhängende Sequenz von etwa oder mehr als etwa 20, 25, 30, 33, 40, 50, 67, 133, 167, 200, 233, 267, 300, 333, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 oder mehr Aminosäuren oder Nukleotid-Tripletts, verglichen mit der relevanten Aminosäuresequenz oder Nukleotidsequenz, wie es der Fall sein mag.
Ferner beschrieben sind aktive Abschnitte, Fragmente, Derivate und funktionelle Mimetika der Polypeptide der Erfindung. Ein "aktiver Abschnitt" eines Polypeptids bedeutet ein Peptid, welches weniger als das Polypeptid voller Länge ist, jedoch eine biologische Aktivität behält, wie z.B. eine biologische Aktivität, welche aus der Bindung an einen Liganden oder Beteiligung an Endozytose ausgewählt ist. Somit kann ein aktiver Abschnitt des LRP5-Polypeptids beispielsweise in einer Ausführungsform die Transmembrandomäne und den Abschnitt des zytoplasmatischen Endes, der an der Endozytose beteiligt ist, beinhalten. Ein solches aktives Fragment kann als Teil eines Fusionsproteins, beispielsweise unter Einschluss eines bindenden Abschnitts für einen anderen Liganden, eingeschlossen sein. In verschiedenen Ausführungsformen können Kombinationen von LDL- und EGF-Motiven in einem Molekül eingeschlossen sein, um dem Molekül unterschiedliche Bindungsspezifitäten zu verleihen.
Fragmente der LRP5-Polypeptidsequenz können antigene Determinanten oder Epitope einschließen, welche zur Bildung von Antikörpern gegen einen Abschnitt der Aminosäuresequenz von Nutzen sind. Alanin-Scans werden üblicher Weise eingesetzt, um Peptidmotive innerhalb von Polypeptiden aufzufinden und zu verfeinern; dies beinhaltet den systematischen Ersatz eines jeden Rests nacheinander durch die Aminosäure Alanin, gefolgt von der Ermittlung einer biologischen Aktivität.
Bevorzugte Fragmente von LRP5 umfassen diejenigen mit irgendeiner der folgenden Aminosäuresequenzen:
SYFHLFPPPPSPCTDSS
VDGRQNIKRAKDDGT
EVLFTTGLIRPVALVVDN
IQGHLDFVMDILVFHS,
welche beispielsweise zur Induktion oder Isolierung von Antikörpern eingesetzt werden können. Varianten- und Derivat-Peptide, Peptide, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche sich von einer dieser Sequenzen durch die Addition, Insertion, Deletion oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäure(n) unterscheidet, sind ebenfalls hier beschrieben, im Allgemeinen mit der Maßgabe, dass das Varianten- oder Derivat-Peptid von einem Antikörper oder einem anderen spezifischen Bindungselement gebunden wird, welches eines der Peptide bindet, deren Sequenz gezeigt ist. Ein Peptid, das eine Variante oder ein Derivat eines der gezeigten Peptide ist, kann mit dem gezeigten Peptid um die Bindung an ein spezifisches Bindungselement, wie z.B. ein Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon, konkurrieren.
Ein "Derivat" eines Polypeptids oder Fragments davon kann ein Polypeptid einschließen, welches durch Variation der Aminosäuresequenz des Proteins, z.B. durch Manipulation der Nukleinsäure, welche für das Protein codiert, oder durch Veränderung des Proteins selbst modifiziert wurde. Solche Derivate der natürlichen Aminosäuresequenz können eines oder mehrere von Insertion, Addition, Deletion oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäure(n) beinhalten, welche stattfinden können, ohne die qualitative Natur der biologischen Aktivität des Wildtyp-Polypeptids wesentlich zu ändern. Ebenfalls beschrieben sind funktionelle Mimetika aktiver Fragmente der bereitgestellten LRP5-Polypeptide (einschließlich Allele, Mutanten, Derivate und Varianten). Der Begriff "funktionelles Mimetikum" bedeutet eine Substanz, welche keinen aktiven Abschnitt der relevanten Aminosäuresequenz beinhalten mag und wahrscheinlich nicht einmal ein Peptid ist, welche jedoch in qualitativer Hinsicht die biologische Aktivität von natürlichem LRP5-Polypeptid behält. Die Konstruktion und das Screenen von Kandidaten-Mimetika werden detailliert im Folgenden beschrieben.
Sequenzen von Aminosäuresequenzvarianten, welche repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind, sind in Tabelle 5 und Tabelle 6 gezeigt. Das Screenen hinsichtlich der Anwesenheit einer oder mehrerer davon in einer Testprobe hat diagnostischen und/oder prognostischen Nutzen, beispielsweise bei der Bestimmung der Anfälligkeit für IDDM oder eine andere Erkrankung, wie im Folgenden erörtert.
Andere Fragmente der Polypeptide, für die hier Sequenzinformation bereitgestellt wird, werden beschrieben, die beispielsweise funktionellen Domänen entsprechen. Eine solche funktionelle Domäne ist die mutmaßliche extrazelluläre Domäne, so dass ein Polypeptidfragment der vorliegenden Erfindung die extrazelluläre Domäne des Polypeptids ein schließen kann, dessen Aminosäuresequenz in 5(e) oder 5(c) gezeigt ist. Diese reicht bis Aminosäure 1385 der Vorläufersequenz von 5(c). Eine weitere nützliche LRP5-Domäne ist die zytoplasmatische Domäne, 207 Aminosäuren, gezeigt in 5(d). Dies kann zur gezielten Beinflussung von Proteinen, um dem endozytotischen Weg zu folgen, verwendet werden.
Ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann isoliert und/oder gereinigt (beispielsweise unter Verwendung eines Antikörpers) sein, beispielsweise nach Herstellung mittels Expression von codierender Nukleinsäure (siehe unten). Somit kann ein Polypeptid frei oder im Wesentlichen frei von Verunreinigungen, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist (falls es ein natürlich vorkommendes Polypeptid ist), bereitgestellt werden. Ein Polypeptid kann frei oder im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden bereitgestellt werden. Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung können vollständig oder teilweise durch chemische Synthese hergestellt werden. Das isolierte und/oder gereinigte Polypeptid kann bei der Formulierung einer Zusammensetzung verwendet werden, die mindestens eine zusätzliche Komponente einschließen kann, beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, ein annehmbares Vehikel oder einen annehmbaren Träger einschließt. Eine Zusammensetzung, die ein Polypeptid gemäß der Erfindung einschließt, kann bei der prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung wie im Folgenden erörtert eingesetzt werden.
Ein Polypeptid, Peptidfragment, Allel, eine Mutante, ein Derivat oder eine Variante wie hier beschrieben kann als Immunogen oder auf andere Weise für den Erhalt spezifischer Antikörper eingesetzt werden. Antikörper sind von Nutzen bei der Reinigung und anderen Manipulation von Polypeptiden und Peptiden, beim diagnostischen Screening und für therapeutische Zwecke. Dies wird im Folgenden näher erörtert.
Ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann zum Screenen hinsichtlich von Molekülen eingesetzt werden, welche dessen Aktivität oder Funktion beeinflussen oder modulieren, beispielsweise Bindung an einen Liganden, Beteiligung an der Endozytose, Bewegung von einem intrazellulären Kompartiment zu der Zelloberfläche, Bewegung von der Zelloberfläche zu einem intrazellulären Kompartiment. Solche Moleküle können mit dem ligandenbindenden Abschnitt von LRP5, dem zytoplasmatischen Abschnitt von LRP5 oder mit einem oder mehreren Hilfsmolekülen, die beispielsweise an der Bewegung von Vesikeln, die LRP5 enthalten, zu und von der Zelloberfläche beteiligt sind, Wechselwirken und können in einem therapeutischen (potentiell einschließlich prophylaktischen) Kontext von Nutzen sein.
Es ist wohlbekannt, dass die pharmazeutische Forschung, die zur Identifizierung eines neuen Arzneiwirkstoffes führt, das Screening einer großen Anzahl von Kandidatensubstanzen, sowohl bevor als auch nachdem eine Leitverbindung gefunden wurde, beinhalten kann. Dies ist ein Faktor, welcher die pharmazeutische Forschung sehr kostspielig und zeitraubend macht. Mittel zur Erleichterung des Screeningprozesses können beträchtliche kommerzielle Bedeutung und Nützlichkeit aufweisen. Solche Mittel zum Screenen hinsichtlich Substanzen, die potentiell bei der Behandlung oder Verhütung von IDDM oder einer anderen Erkrankung von Nutzen sind, werden durch Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Substanzen, die als Modulatoren des Polypeptids identifiziert wurden, repräsentieren einen Fortschritt im Kampf gegen IDDM und andere Erkrankungen, da sie die Grundlage für die Entwicklung und Untersuchung von Therapeutika für die Verwendung in vivo bereitstellen. Ferner können sie in Anbetracht der funktionellen Indikationen für LRP5, die hier an anderer Stelle erörtert werden, in irgendeinem von einer Reihe von Krankheitszuständen, einschließlich Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Glomerulonephritis, Erkrankungen und Störungen, welche die Störung der Endozytose und/oder Antigenpräsentation beinhalten, Erkrankungen und Störungen, welche die Cytokin-Clearance und/oder Entzündung betreffen, viraler Infektion, Kontaminierung mit dem Toxin eines pathogenen Bakteriums, Erhöhung freier Fettsäuren oder Hypercholesterinämie, Typ 2-Diabetes, Osteoporose und Alzheimer-Erkrankung, von Nutzen sein. Wie an anderer Stelle festgestellt, können LRP5, Fragmente davon und Nukleinsäure gemäß der Erfindung auch zur Bekämpfung irgendeiner dieser Erkrankungen und Störungen von Nutzen sein.
Ein Verfahren zum Screenen hinsichtlich einer Substanz, welche die Aktivität eines Polypeptids moduliert, kann das Kontaktieren einer oder mehrerer Testsubstanz(en) mit dem Polypeptid in einem geeigneten Reaktionsmedium, Testen der Aktivität des behandelten Polypeptids und Vergleich der Aktivität mit der Aktivität des Polypeptids in einem vergleichbaren Reaktionsmedium, das nicht mit der Testsubstanz oder den Testsubstanzen behandelt wurde, beinhalten. Ein Unterschied in der Aktivität zwischen den behandelten und unbehandelten Polypeptiden zeigt eine modulierende Wirkung der relevanten Testsubstanz oder der Substanzen an.
Die Kombinationsbank-Technologie (Schultz, J. S. (1996), Biotechnol. Prog. 12: 729–743) bietet einen effektiven Weg, um eine potentiell riesige Anzahl verschiedener Substanzen hinsichtlich des Vermögens zur Modulation der Aktivität eines Polypeptids zu testen. Vor oder auch mit dem Screening hinsichtlich der Modulation von Aktivität können Testsubstanzen hinsichtlich des Vermögens zur Wechselwirkung mit dem Polypeptid gescreent werden, beispielsweise in einem Hefe-Zweihybrid-System (welches erfordert, dass sowohl das Polypeptid als auch die Testsubstanz in Hefe von codierender Nukleinsäure exprimiert werden können). Dies kann als ein grober Screen vor dem Testen einer Substanz hinsichtlich des tatsächlichen Vermögens zur Modulation der Aktivität des Polypeptids eingesetzt werden.
Nach der Identifizierung einer Substanz, welche Polypeptidaktivität moduliert oder beeinflusst, kann die Substanz weiter untersucht werden. Ferner kann sie hergestellt werden und/oder bei der Präparation, beispielsweise Herstellung oder Formulierung, einer Zusammensetzung, wie z.B. eines Medikaments, einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Arzneiwirkstoffs, verwendet werden. Diese können Individuen verabreicht werden.
Somit beschreibt die vorliegende Patentbeschreibung in verschiedenen Aspekten nicht nur eine Substanz, die als Modulator von Polypeptidaktivität identifiziert wurde, gemäß der vorliegenden Offenbarung, sondern auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, ein Medikament, einen Arzneiwirkstoff oder eine andere Zusammensetzung, die eine solche Substanz umfasst, ein Verfahren, das dier Verabreichung einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten umfasst, beispielsweise zur Behandlung (welche eine präventive Behandlung einschließt) von IDDM oder einer anderen Erkrankung, die Verwendung einer solchen Substanz zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Verabreichung, beispielsweise zur Behandlung von IDDM oder einer anderen Erkrankung, und ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend das Mischen einer solchen Substanz mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Vehikel oder Träger und gegebenenfalls anderen Bestandteilen.
Eine Substanz, die als Modulator von Polypeptid- oder Promotorfunktion identifiziert wurde, kann die Natur eines Peptids oder Nicht-Peptids haben. "Kleine Moleküle", die keine Peptide sind, sind oft für viele pharmazeutische Anwendungen in vivo bevorzugt. Dementsprechend kann ein Mimetikum oder Nachahmer der Substanz (insbesondere, falls es sich um ein Peptid handelt) für die pharmazeutische Verwendung entwickelt werden. Die Entwicklung von Mimetika für eine bekannte pharmazeutisch aktive Verbindung ist ein bekannter Ansatz zur Entwicklung von Pharmazeutika, die auf einer "Leit"-Verbindung basieren. Dies könnte wünschenswert sein, wenn die aktive Verbindung schwierig oder teuer zu synthetisieren ist, oder wenn sie für eine spezielle Verabreichungsmethode ungeeignet ist, z.B. sind Peptide nicht gut als Wirkstoffe für orale Zusammensetzungen geeignet, da sie dazu neigen, von Proteasen im Verdauungstrakt schnell abgebaut zu werden. Die Konstruktion, Synthese und das Testen von Mimetika kann eingesetzt werden, um das zufällige Screenen einer großen Anzahl von Molekülen hinsichtlich einer Zieleigenschaft zu vermeiden.
Es gibt mehrere Schritte, die gewöhnlich bei der Konstruktion eines Mimetikums anhand einer Verbindung mit einer gegebenen Zieleigenschaft durchgeführt werden. Zuerst werden die speziellen Abschnitte der Verbindung bestimmt, welche kritisch und/oder bei der Feststellung der Zieleigenschaft von Bedeutung sind. Im Falle eines Peptids kann dies erfolgen durch systematische Variation der Aminosäurereste in dem Peptid, z.B. durch Substitution eines jeden Rests nacheinander. Diese Teile oder Reste, welche den aktiven Bereich der Verbindung ausmachen, sind als deren "Pharmakophor" bekannt.
Nachdem das Pharmakophor gefunden wurde, wird dessen Struktur gemäß seinen physikalischen Eigenschaften, beispielsweise Stereochemie, Bindung, Größe und/oder Ladung, unter Verwendung von Daten aus einem Spektrum von Quellen, beispielsweise spektroskopische Techniken, Röntgenbeugungsdaten und NMR, modelliert. Computeranalyse, Ähnlichkeitskartierung (welche eher die Ladung und/oder das Volumen eines Pharmakophors modelliert, als die Bindung zwischen Atomen) und andere Techniken können bei diesem Modellierungsprozess verwendet werden.
In einer Variante dieses Ansatzes wird die dreidimensionale Struktur des Liganden und seines Bindungspartners modelliert. Dies kann besonders nützlich sein, wenn der Ligand und/oder der Bindungspartner die Konformation bei der Bindung ändern, welches dem Modell erlaubt, dies bei der Gestaltung des Mimetikums zu berücksichtigen.
Ein Matrizenmolekül wird dann ausgewählt, auf das chemische Gruppen gepfropft werden können, welche das Pharmakophor nachbilden. Das Matrizenmolekül und die darauf gepfropften chemischen Gruppen können günstiger Weise so gewählt werden, dass das Mimetikum leicht zu synthetisieren ist, wahrscheinlich pharmakologisch annehmbar ist und nicht in vivo abgebaut wird, während die biologische Aktivität der Leitverbindung erhalten bleibt. Das Mimetikum oder die Mimetika, das/die mit diesem Ansatz gefunden wird/werden, kann/können dann gescreent werden, um festzustellen, ob es/sie die Zieleigenschaft aufweist bzw. aufweisen oder bis zu welchem Grad es/sie diese aufweist/aufweisen. Eine weitere Optimierung oder Modifizierung kann dann durchgeführt werden, um zu einem oder mehreren endgültigen Mimetikum/a für in vivo-Tests oder klinische Tests zu gelangen.
Ein bequemer Weg zur Herstellung eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Expression von dafür codierender Nukleinsäure durch Einsatz der Nukleinsäure in einem Expressionssystem. Demgemäß beschreibt die vorliegende Offenbarung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids (wie offenbart), wobei das Verfahren die Expression von Nukleinsäure, die für das Polypeptid codiert (gewöhnlich Nukleinsäure gemäß der Erfindung), einschließt. Dies kann günstig erzielt werden durch Züchtung einer Wirtszelle, die einen solchen Vektor enthält, in Kultur unter geeigneten Bedingungen, welche die Expression des Polypeptids veranlassen oder erlauben. Polypeptide können auch in in vitro-Systemen, wie z.B. Retikulozytenlysat, exprimiert werden.
Systeme zur Klonierung und Expression eines Polypeptids in einer Vielfalt verschiedener Wirtszellen sind wohl bekannt. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, eukaryotische Zellen wie Säuger- und Hefezellen, und Baculovirus-Systeme. Säugerzelllinien, die im Stand der Technik zur Expression eines heterologen Polypeptids zur Verfügung stehen, umfassen Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters, HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen, COS-Zellen und viele andere. Ein üblicher bevorzugter bakterieller Wirt ist E. coli. Geeignete Vektoren können ausgewählt oder konstruiert werden, die geeignete regulatorische Sequenzen enthalten, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancersequenzen, Markergene und andere Sequenzen, je nach Eignung. Vektoren können Plasmide sein, viral, beispielsweise ein Phage oder Phagemid, je nach Eignung. Für weitere Details siehe beispielsweise Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. Auflage, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Viele bekannte Techniken und Protokolle zur Manipulation von Nukleinsäure, beispielsweise bei der Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression und Analyse von Proteinen sind detailliert in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, 1992, beschrieben.
Somit ist ebenfalls eine Wirtszelle beschrieben, die Nukleinsäure wie hier offenbart enthält. Die Nukleinsäure der Erfindung kann in das Genom (z.B. Chromosom) der Wirtszelle integriert werden. Integration kann durch Einschluss von Sequenzen, welche die Rekombination mit dem Genom fördern, gemäß Standardtechniken gefördert werden. Die Nukleinsäure kann auf einem extrachromosomalen Vektor innerhalb der Zelle vorliegen.
Ebenfalls offenbart ist ein Verfahren, welches die Einführung der Nukleinsäure in eine Wirtszelle einschließt. Die Einführung, welche (insbesondere für in vitro-Einführung) im Allgemeinen ohne Einschränkung als "Transformation" bezeichnet werden kann, kann jegliche verfügbare Technik einsetzen. Für eukaryotische Zellen können geeignete Techniken Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, lipsosomen-vermittelte Transfektion und Transduktion unter Verwendung eines Retrovirus oder eines anderen Virus, beispielsweise Vaccinia oder, für Insektenzellen, Baculovirus, einschließen. Für bakterielle Zellen können geeignete Techniken Calciumchlorid-Transformation, Elektroporation und Transfektion unter Verwendung eines Bakteriophagen einschließen.
Markergene, wie z.B. Antibiotikaresistenz- oder -sensitivitätsgene, können zur Identifizierung von Klonen eingesetzt werden, die Nukleinsäure von Interesse enthalten, wie im Stand der Technik wohlbekannt.
Der Einführung kann die Veranlassung oder die Gestattung der Expression von der Nukleinsäure folgen, beispielsweise durch Kultivierung von Wirtszellen (welche Zellen einschließen können, die tatsächlich transformiert wurden, obwohl die Zellen wahrscheinlicher Abkömmlinge der transformierten Zellen sein werden) unter Bedingungen zur Expression des Gens, so dass das codierte Polypeptid hergestellt wird. Wenn das Polypeptid gekoppelt an ein geeignetes Signalleaderpeptid exprimiert wird, kann es von der Zelle in das Kulturmedium sekretiert werden. Nach der Herstellung durch Expression kann ein Polypeptid aus der Wirtszelle und/oder dem Kulturmedium, je nach Fall, isoliert und/oder gereinigt werden und anschließend gewünschtenfalls zur Formulierung einer Zusammensetzung eingesetzt werden, welche eine oder mehrere zusätzliche Komponenten einschließen kann, wie z.B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Exzipienten, Vehikel oder Träger (z.B. siehe unten) einschließt.
Die Einführung von Nukleinsäure kann in vivo auf dem Weg der Gentherapie erfolgen, wie im Folgenden erörtert. Eine Wirtszelle, die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, beispielsweise als Folge der Einführung der Nukleinsäure in die Zelle oder in einen Vorfahren der Zelle, und/oder der genetischen Änderung der Sequenz, welche für die Zelle oder den Vorfahren endogen ist (welche Einführung oder Änderung in vivo oder ex vivo stattfinden kann), kann in einem Organismus (z.B. im Soma) enthalten sein, welcher ein Tier ist, insbesondere ein Säuger, welcher menschlich oder nicht-menschlich sein kann, z.B. Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Maus oder ein anderer Nager, Katze, Hund, Schwein, Schaf, Ziege, Rind oder Pferd, oder welcher ein Vogel ist, beispielsweise ein Huhn.
Genetisch modifizierte oder transgene Tiere oder Vögel, umfassend eine solche Zelle, werden ebenfalls als weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
Somit ist es möglich, ein nicht-humanes Tier mit einem humanen LRP5-Transgen innerhalb seines Genoms herzustellen. Das Transgen kann die Sequenz irgendeiner der hier identifizierten Isoformen oder einer Mutante, eines Derivats, eines Allels oder einer Variante davon wie offenbart aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform ersetzt die heterologe humane LRP5-Sequenz die endogene tierische Sequenz. In anderen bevorzugten Ausführungsformen werden eine oder mehrere Kopie(n) der humanen LRP5-Sequenz dem tierischen Genom hinzugefügt.
Vorzugsweise ist das Tier ein Nager und am meisten bevorzugt eine Maus oder Ratte.
Dies kann ein therapeutisches Ziel haben. (Gentherapie wird im Folgenden erörtert.) Die Anwesenheit einer Mutante, eines Allels oder einer Variantensequenz innerhalb von Zellen eines Organismus, insbesondere anstelle einer homologen endogenen Sequenz, kann dem Organismus erlauben, als Modell beim Testen und/oder Untersuchen der Rolle des LRP5-Gens oder von Substanzen, welche die Aktivität des codierten Polypeptids und/oder des Promotors in vitro modulieren oder anderweitig als von therapeutischem Potential angegeben sind, verwendet zu werden.
Ein Tiermodell für LRP5-Defizienz kann unter Verwendung von Standardtechniken zur Einführung von Mutationen in eine tierische Keimbahn konstruiert werden. In einem Beispiel dieses Ansatzes kann unter Verwendung einer Maus ein Vektor, der eine Insertionsmutation in dem LRP5-Gen trägt, in embryonale Stammzellen transfiziert werden. Ein selektierbarer Marker, beispielsweise ein Antibiotikaresistenzgen, wie z.B. neoR, kann eingeschlossen sein, um die Selektion von Klonen, in denen das Mutantengen das endogene Wildtyp-Homologe ersetzt hat, zu erleichtern. Solche Klone können auch mittels Southernblot-Hybridisierung identifiziert oder weiter untersucht werden. Die Klone können dann expandiert und Zellen in Mausembryos im Blastozystenstadium injiziert werden. Mäuse, in denen die injizierten Zellen zur Entwicklung der Maus beigetragen haben, können durch Southernblots identifiziert werden. Diese chimären Mäuse können dann gezüchtet werden, um Mäuse zu erzeugen, welche eine Kopie der Mutation in der Keimbahn tragen. Diese heterozygoten Mutantentiere können dann gezüchtet werden, um Mäuse zu erzeugen, die Mutationen im Gen homozygot tragen. Die Mäuse mit einer heterozygoten Mutation in dem LRP5-Gen können ein geeignetes Modell für menschliche Individuen mit einer Kopie des mutierten Gens in der Keimbahn sein, welche ein Risiko zur Entwicklung von IDDM oder einer anderen Erkrankung tragen.
Tiermodelle können auch von Nutzen sein für irgendwelche der verschiedenen Krankheiten, die hier an anderer Stelle erörtert werden.
Anstatt oder neben der Verwendung für die Produktion eines Polypeptids das von einem Transgen codiert wird, können Wirtszellen als Nukleinsäure-"Fabrik" zur Replikation der Nukleinsäure von Interesse, um große Mengen davon herzustellen, verwendet werden. Mehrere Kopien von Nukleinsäure von Interesse können innerhalb einer Zelle hergestellt werden, wenn sie an ein amplifizierbares Gen, wie z.B. Dihydrofolatreduktase (DHFR), gekoppelt ist, wie wohlbekannt ist. Wirtszellen, die mit Nukleinsäure von Interesse transformiert sind oder von Wirtszellen abstammen, in die Nukleinsäure eingeführt wurde, können unter geeigneten Bedingungen, z.B. in einem Fermenter, kultiviert, aus der Kultur genommen und einer Aufarbeitung unterworfen werden, um die Nukleinsäure zu reinigen. Nach der Reinigung kann die Nukleinsäure oder ein oder mehrere Fragment(e) davon wie gewünscht verwendet werden, beispielsweise in einem diagnostischen oder prognostischen Assay, wie hier an anderer Stelle erörtert.
Die Bereitstellung der neuen LRP5-Polypeptid-Isoformen und Mutanten, Allele, Varianten und Derivate ermöglicht zum ersten Mal die Produktion von Antikörpern, welche zur spezifischen Bindung dieser Moleküle in der Lage sind.
Dementsprechend stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung einen Antikörper bereit, der in der Lage ist, spezifisch an das Polypeptid zu binden, dessen Sequenz hier in einer Figur angegeben ist. Ein solcher Antikörper kann spezifisch indem Sinne sein, dass er zwischen dem Polypeptid unterscheiden kann, das er zu binden vermag, und anderen humanen Polypeptiden, für die er keine oder im Wesentlichen keine Bindungsaffinität (z.B. eine Bindungsaffinität von etwa 1000fach weniger) aufweist. Spezifische Antikörper binden an ein Epitop auf dem Molekül, welches auf anderen Molekülen entweder nicht vorliegt oder nicht zugänglich ist. Antikörper der vorliegenden Erfindung können für das Wildtyp-Polypeptid spezifisch sein. Antikörper sind auch von Nutzen bei der Reinigung des Polypeptids oder der Polypeptide, an das oder die sie binden, z.B. nach Produktion durch rekombinante Expression von codierender Nukleinsäure.
Bevorzugte Antikörper gemäß der Erfindung sind isoliert in dem Sinne, dass sie frei von Kontaminationen wie Antikörper sind, die an andere Polypeptide binden können, und/oder frei von Serumkomponenten. Monoklonale Antikörper sind für einige Zwecke bevorzugt, obwohl polyklonale Antikörper vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst werden.
Antikörper können durch Anwendung von Standardtechniken auf dem Gebiet erhalten werden. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern umfassen die Immunisierung eines Säugers (z.B. Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Ziege, Schaf oder Affe) mit dem Protein oder einem Fragment davon. Antikörper können aus immunisierten Tieren unter Verwendung irgendeines von einer Vielfalt von im Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten und gescreent werden, vorzugsweise unter Verwendung der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen von Interesse. Beispielsweise können Westernblot-Techniken oder Immunpräzipitation eingesetzt werden (Armitage et al., 1992, Nature 357: 80–82). Die Isolierung von Antikörpern und/oder antikörper-produzierenden Zellen aus einem Tier kann von einem Schritt der Tötung des Tieres begleitet sein.
Als Alternative oder Ergänzung zur Immunisierung eines Säugers mit einem Peptid kann ein für ein Protein spezifischer Antikörper aus einer rekombinant hergestellten Bank von exprimierten variablen Immunglobulin-Domänen, beispielsweise unter Verwendung von Lambda-Bakteriophagen oder filamentösen Bakteriophagen, welche funktionelle Immunglobulin-Bindungsdomänen auf ihren Oberflächen präsentieren, siehe beispielsweise WO92/01047 , erhalten werden. Die Bank kann nativ sein, d.h. erstellt aus Sequenzen, welche aus einem Organismus erhalten wurden, der nicht mit irgendeinem der Proteine (oder Fragmente) immunisiert wurde, oder kann unter Verwendung von Sequenzen erstellt worden sein, die aus einem Organismus erhalten wurde, der dem Antigen von Interesse ausgesetzt wurde.
Geeignete Peptide zur Verwendung bei der Immunisierung eines Tiers und/oder Isolierung von Anti-LRP5-Antikörper umfassen irgendeine der folgenden Aminosäuresequenzen:
SYFHLFPPPPSPCTDSS
VDGRQNIKRAKDDGT
EVLFTTGLIRPVALVVDN
IQGHLDFVMDILVFHS.
Antikörper wie hier beschrieben, können auf einer Reihe von Wegen modifiziert werden. In der Tat sollte der Begriff "Antikörper" so verstanden werden, dass er jede bindende Substanz umfasst, welche eine bindende Domäne mit der erforderlichen Spezifität aufweist. Somit umfasst dieser Begriff Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, einschließlich synthetischer Moleküle und Moleküle, deren Gestalt diejenige eines Antikörpers nachahmt und es ihnen ermöglicht, an ein Antigen oder Epitop zu binden.
Beispielhafte Antikörperfragmente, welche zur Bindung eines Antigens oder eines anderen Bindungspartners in der Lage sind, sind das Fab-Fragment, bestehend aus den Domänen VL, VH, CI und CH1; das Fd-Fragment, bestehend aus den VH- und CH1-Domänen; das Fv-Fragment, bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines einzigen Arms eines Antikörpers; das dAb-Fragment, welches aus einer VH-Domäne besteht; isolierte CDR-Bereiche und F(ab')2-Fragmente, ein bivalentes Fragment, umfassend zwei Fab-Fragmente, die über eine Disulfidbrücke an der Gelenkregion verknüpft sind. Einkettige Fv-Fragmente sind ebenfalls eingeschlossen.
Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung produziert, kann einer genetischen Mutation oder anderen Veränderungen unterworfen werden. Es versteht sich ferner für Fachleute auf dem Gebiet, dass ein monoklonaler Antikörper den Techniken rekombinanter DNA-Technologie unterworfen werden kann, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle herzustellen, welche die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers behalten. Solche Techniken können die Einführung von DNA, codierend für die variable Region eines Immunglobulins oder die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) eines Antikörpers, in die konstanten Regionen oder konstanten Regionen plus Gerüstregionen eines unterschiedlichen Immunglobulins beinhalten. Siehe beispielsweise EP184187A , GB2188638A oder EP-A-0239400 . Die Klonierung und Expression chimärer Antikörper wird in EP-A-0120694 und EP-A-0125023 beschrieben.
Hybridome, welche zur Produktion von Antikörper mit gewünschten Bindungseigenschaften in der Lage sind, werden vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst, ebenso wie Wirtszellen, eukaryotische oder prokaryotische, die Nukleinsäure, codierend für Antikörper (einschließlich Antikörperfragmente), enthalten und zur deren Expression in der Lage sind. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Produktion der Antikörper bereit, einschließlich der Züchtung einer Zelle, die zur Produktion des Antikörpers unter Bedingungen, unter denen der Antikörper produziert und vorzugsweise sekretiert wird, in der Lage ist.
Die Reaktivitäten von Antikörpern gegenüber einer Probe können mit irgendeinem geeigneten Mittel bestimmt werden. Die Markierung mit individuellen Reportermolekülen ist eine Möglichkeit. Die Reportermoleküle können direkt oder indirekt nachweisbare und vorzugsweise messbare Signale erzeugen. Die Verknüpfung von Reportermolekülen kann direkt oder indirekt, kovalent, z.B. über eine Peptidbindung, oder nicht-kovalent erfolgen. Die Verknüpfung über eine Peptidbindung kann das Ergebnis der rekombinanten Expression einer Genfusion, codierend für Antikörper und Reportermolekül, sein.
Eine bevorzugte Art und Weise ist die kovalente Verknüpfung eines jeden Antikörpers mit einem individuellen Fluorochrom, Phosphor- oder Laserfarbstoff mit spektral isolierten Absorptions- oder Emissionscharakteristiken. Geeignete Fluorochrome umfassen Fluroescein, Rhodamin, Phycoerythrin und Texas Rot. Geeignete chromogene Farbstoffe umfassen Diaminobenzidin.
Andere Reportermoleküle umfassen makromolekulare kolloidale Partikel oder teilchenförmiges Material, wie z.B. Latexperlen, die gefärbt, magnetisch oder paramagnetisch sind, und biologisch oder chemisch aktive Agenzien, welche direkt oder indirekt nachweisbare Signale veranlassen können, die visuell beobachtet, elektronisch nachgewiesen oder auf andere Weise aufgezeichnet werden können. Diese Moleküle können Enzyme sein, welche Reaktionen katalysieren, die z.B. Farben entwickeln oder verändern oder Veränderungen elektrischer Eigenschaften verursachen. Sie können molekular anregbar sein, so dass elektronische Übergänge zwischen Energiezuständen zu charakteristischen Spektralabsorptionen oder -emissionen führen. Sie können chemische Gebilde umfassen, die in Verbindung mit Biosensoren verwendet werden. Biotin/Avidin oder Biotin/Streptavidin und Nachweissysteme mit alkalischer Phosphatase können eingesetzt werden.
Die Art und Weise der Bindung ist kein Merkmal der vorliegenden Erfindung und Fachleute auf dem Gebiet sind in der Lage, eine geeignete Art und Weise entsprechend ihrer Bevorzugung und allgemeinen Kenntnis auszuwählen. Spezielle Ausführungsformen von Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Antikörper, welche in der Lage sind, spezifisch, z.B. mit einer Affinität von mindestens 10^–7 M, an eines der folgenden Peptide zu binden, und/oder spezifisch daran binden:
SYFHLFPPPPSPCTDSS
VDGRQNIKRAKDDGT
EVLFTTGLIRPVALVVDN
IQGHLDFVMDILVFHS.
Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können zum Screenen hinsichtlich der Anwesenheit eines Polypeptids, beispielsweise in einer Testprobe, die Zellen oder Zelllysat wie erörtert enthält, verwendet werden und können bei der Reinigung und/oder Isolierung eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung, beispielsweise nach der Produktion des Polypeptids durch Expression von dafür codierender Nukleinsäure, verwendet werden. Antikörper können die Aktivität des Polypeptids, an das sie binden, modulieren und so, wenn das Polypeptid eine nachteilige Wirkung bei einem Individuum aufweist, in einem therapeutischen Kontext (welcher eine Prophylaxe einschließt) von Nutzen sein.
Ein Antikörper kann in einem Kit bereitgestellt werden, welcher Instruktionen zur Verwendung des Antikörpers einschließen kann, z.B. zur Bestimmung der Anwesenheit einer speziellen Substanz in einer Testprobe. Ein oder mehrere andere Reagenz(ien) kann/können eingeschlossen sein, wie z.B. Markierungsmoleküle, Pufferlösungen, Elutionsmittel etc. Reagenzien können in Behältern, welche diese von der äußeren Umgebung schützen, wie z.B. einem versiegelten Gefäß, bereitgestellt werden.
Die Identifizierung des LRP5-Gens und Indikationen seiner Assoziation mit IDDM und anderen Erkrankungen ebnet den Weg für Aspekte der vorliegenden Erfindung, um die Verwendung von Materialien und Verfahren, wie z.B. oben erörtert und offenbart, zur Etablierung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Variantenform des Gens, insbesondere eines Allels oder einer Variante, die spezifisch mit IDDM oder einer anderen Erkrankung assoziiert ist, in einer Testprobe bereitzustellen. Dies kann zur Diagnose einer Veranlagung eines Individuums zu IDDM oder einer anderen Erkrankung sein. Es kann zur Diagnose des IDDM eines Patienten mit der Krankheit als mit dem IDDM4-Gen assoziiert dienen.
Dies erlaubt die Planung einer geeigneten therapeutischen und/oder prophylaktischen Behandlung, welche eine Anpassung der Behandlung durch gezielte Auswahl derjenigen, die am wahrscheinlichsten davon profitieren, erlaubt.
Eine Variantenform des Gens kann eine oder mehrere Insertionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Additionen von einem oder mehreren Nukleotiden im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz (wie z.B. in Tabelle 5 oder Tabelle 6 gezeigt), welche die Genfunktion zerstören können oder nicht, enthalten. Unterschiede auf der Nukleinsäureebene werden nicht notwendiger Weise durch einen Unterschied in der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids reflektiert. Jedoch mag eine Mutation oder ein anderer Unterschied in einem Gen in einer Rahmenverschiebung oder einem Stoppcodon resultieren, welche(s) die Natur des gebildeten Polypeptids (falls überhaupt gebildet) schwerwiegend verändern könnte, oder in einer Punktmutation oder umfangreichen Mutationsveränderung des codierten Polypeptids, einschließlich Insertion, Deletion, Substitution und/oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren oder Regionen in dem Polypeptid. Eine Mutation in einer Promotorsequenz oder einer anderen regulatorischen Region könnte die Expression von dem Gen verhindern oder verringern oder die Prozessierung oder Stabilität des mRNA-Transkripts beeinflussen. Beispielsweise könnte eine Sequenzänderung alternatives Spleissen der mRNA beeinflussen. Wie erörtert, werden verschiedene LRP5-Isoformen, die das Ergebnis alternativen Spleissens sind, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt.
Es gibt verschiedene Verfahren, die Anwesenheit oder Abwesenheit einer speziellen Nukleinsäuresequenz, wie z.B. der in irgendeiner Figur hier gezeigten Sequenz oder einer Mutante, Variante oder einem Allel davon, z.B. einschließlich einer Änderung, die in Tabelle 5 oder 6 gezeigt ist, in einer Testprobe zu bestimmen.
Tests können mit Präparationen durchgeführt werden, die genomische DNA, cDNA und/oder mRNA enthalten. Der Test von cDNA oder mRNA hat den Vorteil, dass die Komplexität der Nukleinsäure durch die Abwesenheit von Intronsequenzen verringert ist, jedoch den möglichen Nachteil, dass zusätzliche Zeit und Mühe erforderlich ist, um die Präparationen herzustellen. RNA ist aufgrund des weit verbreiteten Vorkommens von RNasen schwieriger zu manipulieren als DNA. Nukleinsäure in einer Testprobe kann sequenziert werden und die Sequenz mit der hier in irgendeiner der Figuren gezeigten Sequenz verglichen werden, um festzustellen, ob ein Unterschied vorliegt oder nicht. Falls ja, kann der Unterschied mit bekannten Suszeptibilitäts-Allelen (z.B. wie gezeigt in Tabelle 5 oder Tabelle 6) verglichen werden, um festzustellen, ob die Testnukleinsäure eine oder mehrere der angegebenen Variationen enthält, oder der Unterschied kann hinsichtlich einer Assoziation mit IDDM oder einer anderen Erkrankung untersucht werden.
Nachdem es im allgemeinen nicht zeit- oder arbeitseffizient sein wird, die gesamte Nukleinsäure in einer Testprobe oder sogar das gesamte LRP5-Gen zu sequenzieren, kann eine spezifische Amplifizierungsreaktion, wie z.B. PCR unter Verwendung von einem oder mehreren Primerpaar(en) eingesetzt werden, um die Region von Interesse in der Nukleinsäure zu amplifizieren, beispielsweise das LRP5-Gen oder eine spezielle Region, in der Polymorphismen auftreten, die mit Suszeptibilität für IDDM oder eine andere Krankheit assoziiert sind. Die amplifizierte Nukleinsäure kann dann wie oben sequenziert werden und/oder auf irgendeine andere Weise getestet werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines speziellen Merkmals festzustellen. Nukleinsäure für Tests kann aus Nukleinsäure, die aus Zellen entnommen wurde, oder in einer Bank unter Verwendung einer Vielfalt von Techniken, wie z.B. Restriktionsenzymverdauung und Elektrophorese präpariert werden.
Nukleinsäure kann mit Hilfe einer varianten- oder allel-spezifischen Sonde gescreent werden. Eine solche Sonde korrespondiert in der Sequenz mit einer Region des LRP5-Gens oder seinem Komplement, enthaltend eine Sequenzänderung, die bekanntermaßen mit Suszeptibilität (Anfälligkeit) für IDDM oder eine andere Erkrankung assoziiert ist. Unter geeignet stringenten Bedingungen ist die spezifische Hybridisierung einer solchen Sonde mit Testnukleinsäure ein Indiz für die Anwesenheit der Sequenzänderung in der Testnukleinsäure. Zum Zwecke eines effizienten Screenings kann mehr als eine Sonde bei der gleichen Testprobe verwendet werden.
Allel- oder varianten-spezifische Oligonukleotide können gleichermaßen in einer PCR eingesetzt werden, um spezifisch bestimmte Sequenzen zu amplifizieren, wenn sie in einer Testprobe vorliegen. Die Ermittlung, ob eine PCR-Bande eine Genvariante enthält, kann auf einer Reihe von Wegen durchgeführt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist. Das PCR-Produkt kann beispielsweise in einer Weise behandelt werden, welche es einem ermöglicht, den Polymorphismus auf einem denaturierenden Polyacrylamid-DNA-Sequenzierungsgel darzustellen, mit spezifischen Banden, welche mit den auszuwählenden Genvarianten verknüpft sind.
Eine SSCP-Heteroduplex-Analyse kann zum Screenen von DNA-Fragmenten hinsichtlich Sequenzvarianten/Mutationen eingesetzt werden. Sie beinhaltet im Allgemeinen die Amplifizierung von radioaktiv markierten 100-300-bp-Fragmenten des Gens, Verdünnung dieser Produkte und Denaturierung bei 95°C. Die Fragmente werden schnell auf Eis gekühlt, so dass die DNA in einzelsträngiger Form verbleibt. Diese einzelsträngigen Fragmente werden über acrylamid-basierte Gele laufen gelassen. Unterschiede in der Sequenzzusammensetzung werden die einzelsträngigen Moleküle dazu veranlassen, unterschiedliche Konformationen in dieser Gelmatrix einzunehmen, was somit ihre Mobilität von Wildtyp-Fragmenten verschieden macht und den Nachweis von Mutationen in den zu analysierenden Fragmenten bezüglich eines Kontrollfragments nach Exposition des Gels gegenüber einem Röntgenfilm erlaubt. Fragmente mit geänderter/n Mobilität/Konformationen können direkt aus dem Gel ausgeschnitten und direkt hinsichtlich einer Mutation sequenziert werden.
Die Sequenzierung eines PCR-Produkts kann eine Fällung mit Isopropanol, Resuspension und Sequenzierung mit Hilfe eines TaqFS+-Fabstoffterminator-Sequenzierungskits beinhalten. Verlängerungsprodukte können mit einem ABI 377 DNA-Sequenzierer elektrophoresiert und unter Verwendung von Sequence Navigator Software analysiert werden.
Ein weiterer möglicher Screening-Ansatz verwendet einen PTT-Assay, bei dem Fragmente mit Primern amplifiziert werden, welche die Konsensus-Kozak-Initiationssequenzen und einen T7-RNA-Polymerase-Promotor enthalten. Diese zusätzlichen Sequenzen sind in den 5'-Primer inkorporiert, so dass sie sich im Leserahmen mit der nativen codierenden Sequenz des analysierten Fragments befinden. Diese PCR-Produkte werden in ein gekoppeltes Transkriptions/Translations-System eingeführt. Diese Reaktion erlaubt die Produktion von RNA von dem Fragment und die Translation dieser RNA in ein Proteinfragment. PCR-Produkte von Kontrollen bilden ein Proteinprodukt einer Wildtyp-Größe, bezogen auf die Größe des analysierten Fragments. Wenn das analysierte PCR-Produkt eine Leserahmenverschiebung oder eine Nonsense-Mutation aufweist, wird der Assay ein verkürztes Proteinprodukt im Vergleich zu den Kontrollen ergeben. Die Größe des verkürzten Produkts steht in Bezug zur Position der Mutation und die relative Region des Gens von diesem Patienten kann sequenziert werden, um die verkürzende Mutation zu identifizieren.
Eine Alternative zu oder Ergänzung der Suche hinsichtlich der Anwesenheit von Variantensequenzen in einer Testprobe ist die Suche nach der Anwesenheit der normalen Sequenz, z.B. unter Verwendung einer/eines geeigneten spezifischen Oligonukleotid-Sonde oder -Primers. Die Verwendung von Oligonukleotid-Sonden und -Primer wurden detaillierter oben erörtert.
Allel- oder varianten-spezifische Oligonukleotid-Sonden oder -Primer gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können aus den in Tabelle 4, Tabelle 7 oder Tabelle 8 gezeigten ausgewählt werden.
Ansätze, welche auf der Hybridisierung zwischen einer Sonde und Testnukleinsäure und anschließendem Nachweis einer Fehlpaarung beruhen, können eingesetzt werden. Unter geeigneten Bedingungen (Temperatur, pH etc.) wird eine Oligonukleotid-Sonde mit einer Sequenz hybridisieren, welche nicht vollständig komplementär ist. Der Grad an Basenpaarung zwischen den beiden Molekülen wird ausreichen, dass sie trotz einer Fehlpaarung verschmelzen. Verschiedene Ansätze sind im Stand der Technik wohlbekannt, um die Anwesenheit einer Fehlpaarung zwischen zwei verschmelzenden Nukleinsäuremolekülen nachzuweisen.
Beispielsweise spaltet RNase A an der Stelle einer Fehlpaarung. Die Spaltung kann durch Elektrophorese von Testnukleinsäure, mit der die relevante Sonde oder Sonde verschmolzen ist, und der Suche nach kleineren Molekülen (d.h. Moleküle mit höherer elektrophoretischer Mobilität) als das Sonde/Test-Hybrid vollständiger Länge nachgewiesen werden.
Somit kann eine Oligonukleotid-Sonde, welche die Sequenz einer Region des normalen LRP5-Gens (entweder Sense- oder Antisense-Strang) aufweist, worin Mutationen, die mit IDDM- oder einer anderen Krankheitsanfälligkeit assoziiert sind, bekanntermaßen auftreten (siehe z.B. Tabelle 5 und Tabelle 6), mit Testnukleinsäure verschmolzen werden und die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Fehlpaarung bestimmt werden. Der Nachweis der Anwesenheit einer Fehlpaarung kann die Anwesenheit einer Mutation, die mit Anfälligkeit für IDDM oder eine andere Erkrankung assoziiert ist, anzeigen. Andererseits kann eine Oligonukleotid-Sonde, welche die Sequenz einer Region des Gens aufweist, die eine mit IDDM- oder einer anderen Krankheitsanfälligkeit assoziierte Mutation einschließt, mit Testnukleinsäure verschmolzen und die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Fehlpaarung bestimmt werden. Die Anwesenheit einer Fehlpaarung kann anzeigen, dass die Nukleinsäure in der Testprobe die normale Sequenz aufweist (die Abwesenheit einer Fehlpaarung zeigt an, dass die Testnukleinsäure die Mutation aufweist). In jedem Fall kann eine Reihe von Sonden für verschiedene Regionen des Gens eingesetzt werden.
Die Anwesenheit von Unterschieden in der Sequenz von Nukleinsäuremolekülen kann mittels Restriktonsenzymverdau nachgewiesen werden, wie z.B. bei einem Verfahren des DNA-Fingerprints, wobei die gebildeten Restriktionsmuster, wenn ein oder mehrere Restriktionsenzym(e) zum Spalten einer Nukleinsäureprobe verwendet wird/werden, mit dem erhaltenen Muster verglichen werden, wenn eine Probe, die das normale Gen, das hier in einer Figur gezeigt ist, oder eine Variante oder ein Allel, wie z.B. enthaltend eine Änderung, die in Tabelle 5 oder Tabelle 6 gezeigt ist, enthält, mit dem gleichen Enzym oder den gleichen Enzymen verdaut wird.
Die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Läsion in einem Promotor oder einer anderen regulatorischen Sequenz kann auch ermittelt werden durch Bestimmung des Ausmaßes an mRNA-Produktion durch Transkription oder des Ausmaßes der Polypeptidproduktion durch Translation von der mRNA. Die Bestimmung von Promotoraktivität wurde oben erörtert.
Eine Testprobe von Nukleinsäure kann bereitgestellt werden, indem beispielsweise Nukleinsäure aus Zellen oder biologischen Geweben oder Flüssigkeiten, Urin, Speichel, Kot, einem Mundhöhlenabstrich, einer Biopsie oder vorzugsweise Blut extrahiert wird oder für pränatale Tests aus dem Amnion, der Plazenta oder dem Fötus selbst.
Es gibt verschiedene Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit eines speziellen Polypeptids in einer Testprobe, wie z.B. des Polypeptids mit der Aminosäuresequenz, die hier in irgendeiner Figur gezeigt ist, oder einer Aminosäuresequenz-Mutante, -Variante oder einem Allel davon.
Eine Probe kann hinsichtlich der Anwesenheit eines Bindungspartners für ein spezifisches Bindungselement, wie z.B. eines Antikörpers (oder einer Mischung von Antikörpern), spezifisch hinsichtlich einer oder mehreren speziellen Varianten des hier in einer Figur gezeigten Polypeptids, getestet werden. Eine Probe kann hinsichtlich der Anwesenheit eines Bindungspartners für ein spezifisches Bindungselement, wie z.B. eines Antikörpers (oder einer Mischung von Antikörpern), der/die für das hier in einer Figur gezeigte Polypeptid spezifisch ist, getestet werden. In solchen Fällen kann die Probe getestet werden, indem sie mit einem spezifischen Bindungselement, wie z.B. einem Antikörper, unter geeigneten Bedingungen für die spezifische Bindung in Kontakt gebracht wird, bevor die Bindung bestimmt wird, beispielsweise unter Verwendung eines Reportersystems wie erörtert. Wenn eine Gruppe von Antikörper verwendet wird, können verschiedene Reportermarkierungen für jeden Antikörper eingesetzt werden, so dass die Bindung eines jeden bestimmt werden kann.
Ein spezifisches Bindungselement, wie z.B. ein Antikörper, kann eingesetzt werden, um dessen Bindungspartner-Polypeptid aus einer Testprobe zu isolieren und/oder zu reinigen, um eine Sequenzanalyse und/oder biochemische Analyse des zu bestimmenden Polypeptids zu erlauben, um festzustellen, ob es die Sequenz und/oder die Eigenschaften des Polypeptids aufweist, dessen Sequenz hier offenbart ist, oder ob es eine Mutanten- oder Variantenform ist. Die Aminosäuresequenz wird mit Hilfe automatischer Sequenziermaschinen routinemäßig im Stand der Technik bestimmt.
Eine Testprobe, die ein oder mehrere Polypeptid(e) enthält, kann beispielsweise als rohe oder partiell gereinigte Zell-Präparation oder Zelllysat-Präparation bereitgestellt werden, z.B. unter Verwendung von Geweben oder Zellen, wie z.B. aus Speichel, Kot oder vorzugsweise Blut, oder für pränatale Tests aus dem Amnion, der Plazenta oder dem Fötus selbst.
Ob es sich um ein(en) Polypeptid, Antikörper, Peptid, Nukleinsäuremolekül, kleines Molekül oder eine andere pharmazeutisch nützliche Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung handelt, die einem Individuum verabreicht werden soll, die Verabreichung geschieht vorzugsweise in einer "prophylaktisch wirksamen Menge" oder einer "therapeutisch wirksamen Menge" (je nach Fall, obwohl die Prophylaxe als Therapie betrachtet werden kann), welche ausreichend ist, um für das Individuum von Nutzen zu sein. Die tatsächlich verabreichte Menge und die Geschwindigkeit und der Zeitverlauf der Verabreichung werden von der Art und der Schwere des zu behandelnden Zustands abhängen. Eine Festlegung der Behandlung, z.B. Entscheidungen über die Dosierung etc., liegt innerhalb der Verantwortlichkeit von Allgemeinärzten und anderen Ärzten.
Eine Zusammensetzung kann alleine oder in Kombination mit anderen Behandlungen verabreicht werden, entweder simultan oder sequentiell, in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Zustand.
Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung und zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können neben dem aktiven Bestandteil einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere Materialien, die Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, einschließen. Solche Materialien sollten nicht-toxisch sein und die Wirksamkeit des aktiven Bestandteils nicht beeinträchtigen. Die genaue Natur des Trägers oder anderen Materials wird von der Verabreichungsroute abhängen, welche oral sein kann oder mittels Injektion, z.B. kutan, subkutan oder intravenös.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können in Form einer Tablette, Kapsel, eines Pulvers oder einer Flüssigkeit vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger, wie z.B. Gelatine, oder ein Adjuvans einschließen. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen im allgemeinen einen flüssigen Träger, wie z.B. Wasser, Paraffinöl, tierische oder pflanzliche Öle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische Salzlösung, Dextrose oder eine andere Saccharidlösung oder Glycole, wie z.B. Ethylenglycol, Propylenglycol oder Polyethylenglycol, können eingeschlossen sein.
Für die intravenöse, kutane oder subkutane Injektion oder Injektion an der betroffenen Stelle wird der aktive Bestandteil in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vorliegen, die pyrogen-frei ist und einen geeigneten pH-Wert, eine geeignete Isotonität und Stabilität aufweist. Fachleute auf dem Gebiet sind unschwer in der Lage, geeignete Lösungen herzustellen unter Verwendung von beispielsweise isotonen Vehikeln wie Natriumchlorid-Injektion, Ringer-Injektion oder Laktat-Ringer-Injektion. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidantien und/oder andere Additive können erforderlichenfalls eingeschlossen sein.
Therapien mit zielgerichteter Abgabe können dazu verwendet werden, um das aktive Agens durch die Verwendung von zielgerichteten Systemen, wie z.B. Antikörper oder zellspezifische Liganden, spezifischer an bestimmte Zelltypen abzugeben. Die zielgerichtete Abgabe kann aus einer Vielfalt von Gründen wünschenswert sein; wenn beispielsweise das Agens unannehmbar toxisch ist oder ansonsten eine zu hohe Dosis erfordern würde oder wenn es ansonsten nicht in der Lage wäre, in die Zielzellen zu gelangen.
Statt der direkten Verabreichung eines Agens kann es in Zielzellen durch Expression von einem codierenden Gen, das in die Zellen eingeführt wurde, z.B. in einem viralen Vektor (siehe unten), gebildet werden. Der Vektor kann gezielt zu den zu behandelnden speziellen Zellen gebracht werden oder er kann regulatorische Elemente enthalten, welche mehr oder weniger selektiv von den Zielzellen aktiviert werden. Virale Vektoren können unter Verwendung spezifischer Bindungsmoleküle, wie z.B. ein Zucker, Glycolipid oder ein Protein, z.B. ein Antikörper oder bindendes Fragment davon, zielspezifisch gemacht werden. Nukleinsäure kann mit Hilfe der Verknüpfung mit einem Proteinliganden (z.B. einem Antikörper oder bindenden Fragment davon) über Polylysin zielspezifisch gemacht werden, wobei der Ligand spezifisch für einen Rezeptor ist, der auf der Oberfläche der Zielzellen vorliegt.
Ein Agens kann in einer Vorläuferform verabreicht werden, um durch ein Aktivierungsmittel, das in den zu behandelnden Zellen gebildet wird oder gezielt dorthin gebracht wird, in eine aktive Form überführt werden. Diese Art von Ansatz ist manchmal als ADEPT oder VDEPT bekannt; der erstere beinhaltet die gezielte Abgabe des Aktivierungsmittels an die Zellen durch Konjugation mit einem zellspezifischen Antikörper, während der letztere die Bildung des Aktivierungsmittels, z.B. eines Enzyms, in einem Vektor durch Expression von codierender DNA in einem viralen Vektor beinhaltet (siehe beispielsweise EP-A-415731 und WO 90/07936 ).
Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, die beispielsweise für das authentische biologisch aktive LRP5-Polypeptid oder ein funktionelles Fragment davon codiert, kann in einem Verfahren der Gentherapie eingesetzt werden, um einen Patienten zu behandeln, der nicht in der Lage ist, das aktive Polypeptid zu synthetisieren, oder nicht in der Lage ist, es auf dem normalen Niveau zu synthetisieren, und dadurch die Wirkung bereitzustellen, welche von dem Wildtyp bereitgestellt wird, mit dem Ziel der Behandlung und/oder Verhinderung von einem oder mehreren Symptom(en) von IDDM und/oder einer oder mehreren anderen Erkrankung(en).
Vektoren, wie z.B. virale Vektoren, wurden dazu verwendet, um Gene in eine breite Vielfalt von verschiedenen Zielzellen einzuführen. Typischerweise werden die Vektoren den Zielzellen ausgesetzt, so dass die Transfektion in einem ausreichenden Anteil der Zellen stattfinden kann, um eine brauchbare therapeutische oder prophylaktische Wirkung aufgrund der Expression des gewünschten Polypeptids bereitzustellen. Die transfizierte Nukleinsäure kann permanent in das Genom einer jeden der Zielzellen inkorporiert werden, wodurch eine lang anhaltende Wirkung bereitgestellt wird, oder alternativ kann die Behandlung periodisch wiederholt werden müssen.
Eine Vielfalt von Vektoren, sowohl virale Vektoren als auch Plasmidvektoren, sind im Stand der Technik bekannt, siehe z.B. US-Patent Nr. 5,252,479 und WO 93/07282 . Insbesondere wurde eine Reihe von Viren als Gentransfer-Vektoren verwendet, einschließlich Adenovirus, Papovaviren, wie z.B. SV40, Vacciniavirus, Herpesviren, einschließlich HSV und EBV, und Retroviren, einschließlich Gibbon-Leukämie-Virus, Rous-Sarkom-Virus, Venezuela-Pferdeenzephalitis-Virus, Moloney-Maus-Leukämie-Virus und Maus-Mammatumor-Virus. Viele Gentherapie-Protokolle im Stand der Technik wurden unter Verwendung von entschärften Maus-Retroviren durchgeführt.
Entschärfte Virusvektoren werden in Helferzelllinien gebildet, in denen Gene, die für die Bildung infektiöser viraler Partikel erforderlich sind, exprimiert werden. Helferzelllinien fehlt gewöhnlich eine Sequenz, welche von dem Mechanismus erkannt wird, der das virale Genom verpackt, und bilden Virionen, die keine Nukleinsäure enthalten. Ein viraler Vektor, der ein intaktes Verpackungssignal zusammen mit dem Gen oder einer anderen Sequenz, das/die abgegeben werden soll (z.B. codierend für das LRP5-Polypeptid oder ein Fragment davon), enthält, wird in den Helferzellen zu infektiösen Virionen-Partikeln verpackt, welche dann für den Gentransport verwendet werden können.
Andere bekannte Verfahren zur Einführung von Nukleinsäure in Zellen umfassen Elektroporation, Calciumphosphat-Copräzipitation, mechanische Techniken wie Mikroinjektion, liposomen-vermittelter Transfer und direkte DNA-Aufnahme und rezeptor-vermittelter DNA- Transfer. Liposomen können RNA, DNA und Virionen für die Abgabe an Zellen verkapseln. In Abhängigkeit von Faktoren wie pH-Wert, Ionenstärke und Anwesenheit zweiwertiger Kationen kann die Zusammensetzung von Liposomen für die gezielte Abgabe an spezielle Zellen oder Gewebe maßgeschneidert werden. Liposomen umfassen Phospholipide und können Lipide und Steroide einschließen und die Zusammensetzung einer jeden solchen Komponente kann verändert werden. Die zielgerichtete Abgabe von Liposomen kann auch unter Verwendung eines spezifischen Bindungspaarmitglieds, wie z.B. eines Antikörpers oder bindenden Fragments davon, eines Zuckers oder eines Glycolipids, erreicht werden.
Das Ziel der Gentherapie unter Verwendung von Nukleinsäure, welche für das Polypeptid oder einen aktiven Abschnitt davon codiert, ist die Erhöhung der Menge des Expressionsprodukts der Nukleinsäure in Zellen, in denen das Niveau des Wildtyp-Polypeptids fehlt oder es nur in verringerten Niveaus vorliegt. Eine solche Behandlung kann therapeutisch oder prophylaktisch sein, insbesondere bei der Behandlung von Individuen, von welchen durch Screening oder Tests bekannt ist, dass sie ein IDDM₄-Suszeptibilitätsallel aufweisen und somit eine Veranlagung für die Krankheit.
Ähnliche Techniken können für die Antisense-Regulation der Genexpression eingesetzt werden, z.B. durch gezielte Abgabe eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls an Zellen, in denen eine Mutantenform des Gens exprimiert wird, wobei das Ziel darin besteht, die Produktion des Mutantengenprodukts zu verringern. Andere Ansätze, um Gene spezifisch herunterzuregulieren, sind wohlbekannt, einschließlich der Verwendung von Ribozymen, welche zur Spaltung spezifischer Nukleinsäuresequenzen konstruiert sind. Ribozyme sind Nukleinsäuremoleküle, tatsächlich RNA, welche spezifisch einzelsträngige RNA, wie z.B. mRNA, bei definierten Sequenzen spalten, und deren Spezifität kann manipuliert werden. "Hammerkopf"-Ribozyme können bevorzugt sein, da sie Basensequenzen von etwa 11–18 Basen Länge erkennen und somit eine größere Spezifität haben als Ribozyme des Tetrahymena-Typs, welche Sequenzen von etwa vier Basen Länge erkennen, obwohl der letztere Typ von Ribozymen unter bestimmten Umständen nützlich ist. Referenzen hinsichtlich der Verwendung von Ribozymen umfassen Marschall et al., Cellular and Molecular Neurobiology, 1994, 14(5): 523; Hasselhoff, Nature 334: 585 (1988); und Cech, J. Amer. Med. Assn., 260: 3030 (1988).
Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die Begleitzeichnungen, die bereits oben beschrieben wurden, und Versuchsbeispiele beispielhaft und nicht beschränkend illustriert werden. Weitere Aspekte und Ausführungsformen werden für Fachleute von durchschnittlichem Können ersichtlich sein.
BEISPIEL 1
Klonierung von LRP5
Wie oben festgestellt, wurde die Bestätigung der Kopplung mit 2 der 18 potentiellen Loci für eine IDDM-Veranlagung durch Analyse von zwei Familiengruppen (102 UK-Familien und 84 USA-Familien), IDDM4 auf Chromosom 11q13 (MLS 1,3; P = 0,01 bei FGF3) und IDDM5 auf Chromosom 6q (MLS 1,8; P = 0,003 bei ESR), erreicht. Bei IDDM4 wurde die signifikanteste Kopplung in der Untergruppe von Familien erhalten, die 1 oder 0 Allele IBD bei HLA teilten (MLS = 2,8; P = 0,0002; Is = 1,2) (Davies et al., 1994). Diese Kopplung wurde auch von Hashimoto et al. (1994) unter Verwendung von 251 betroffenen Geschwisterpaaren beobachtet, wobei P = 0,0008 in allen Geschwisterpaaren erhalten wurde. Die Kombination dieser Ergebnisse, mit 596 Familien, ergab einen wesentlichen Beleg für IDDM4 (P = 1,5 × 10^–6) (Todd und Farrall, 1996; Luo et al., 1996).
Eine Mehrpunkt-Analyse mit anderen Markern in der FGF3-Region ergab einen MLS-Wert von 2,3 bei FGF3 und D11S1883 (Is = 1,19) und grenzte das Intervall auf eine 27-cM-Region, flankiert von den Markern D11S903 und D11S527 (1), ein.
Eine Mehrpunkt-Kopplungsanalyse kann das Gen nicht auf eine kleine Region lokalisieren, wenn nicht mehrere tausend Multiplex-Familien zur Verfügung stehen. Stattdessen wurde eine Assoziationskartierung für seltene Einzelgen-Erkrankungen angewandt, die das Intervall, welches das Krankheitsgen enthält, auf weniger als 2 cM oder 2 M Basen eingrenzen kann. Trotzdem ist dieses Verfahren in hohem Maße unvorhersehbar und wurde bisher nicht dazu verwendet, ein Polygen für eine übliche Krankheit zu lokalisieren. Assoziationskartierung wurde verwendet, um das IDDM2/INS-Polygen zu lokalisieren, dies beruhte jedoch auf der Auswahl eines funktionellen Kandidaten-Polymorphismus/Gens und war auf eine sehr kleine Region (< 30 kb) beschränkt. Kopplungsungleichgewichts („linkage disequilibrium"; LD)- oder Assoziationsstudien wurden durchgeführt, um die IDDM4-Region auf weniger als 2 cM einzugrenzen. In der Theorie wird die Assoziation eines speziellen Allels, das sehr nahe an der Founder-Mutation liegt, in Populationen nachgewiesen, die von dem Founder abstammen. Der Übertragungsungleichgewichtstest („transmission disequilibrium test", TDT; Spielman et al., 1993) misst die Assoziation durch Ermittlung der Abweichung von 50% bei Übertragung von Allelen aus einem Markerlocus von Eltern auf betroffene Kinder. Der Nachweis der Assoziation hängt davon ab, dass die Herkunft einer jeden untersuchten Population so homogen wie möglich ist, um die Möglichkeit zu verringern, dass mehrere Founder-Chromosomen vorliegen, welche das Auflösungsvermögen zum Nachweis der Assoziation verringern. Diese Parameter sind in hohem Maße unvoraussagbar.
Bei der Analyse von Markern, welche das IDDM4-Kopplungsintervall überspannen, wurde ein Kopplungsungleichgewicht (LD) bei D11S1917(UT5620) in 554 Familien nachgewiesen, P = 0,01. Eine physikalische Karte dieser Region, umfassend etwa 500 kb, wurde unter Konstruktion eines Pac-, Bac- und Cosmid-Contigs (2) erreicht. Die Region wurde physikalisch kartiert durch Hybridisierung von Markern mit restriktionsenzym-verdauten Klonen, die durch Agarose aufgetrennt und einem Southernblot unterworfen worden waren.
Weitere Mikrosatelliten (sowohl veröffentlichte als auch die aus den Klonen durch Mikrosatelliten-Freisetzung isolierte) wurden innerhalb von 1289 Familien aus vier verschiedenen Populationen (UK, USA, Sardinien und Norwegen) analysiert. Ein LD-Graph wurde erstellt mit einem Peak bei H0570POLYA, P = 0,001, flankiert von den Markern D11S987 und 18018AC (3). Der bei einem polymorphen Marker nachgewiesene LD-Wert wird durch die Allelhäufigkeit beeinflusst und davon, ob die Mutation, die eine Suszeptibilität gegenüber Diabetes Typ 1 verursacht, auf einem Chromosom aufgetreten war, bei dem das Allel in LD dasselbe Allel ist wie auf schützenden oder neutralen Chromosomen. In dem Fall, dass der analysierte Marker dasselbe Allel in LD bei sowohl suszeptiblen als auch schützenden Genotypen aufweist, werden sie bei Einzelpunkt-Analyse ohne Nachweis bleiben, da sie in der Wirkung einander neutralisieren und wenig oder keine Belege für LD mit dem Krankheitslocus zeigen. Die mangelnde Vorhersehbarkeit des daraus resultierenden Verfahrens wurde bereits oben festgestellt.
Zur Maximierung der Information, die mit jedem Marker erhalten wurde, wurde eine Dreipunkt-LD-Rollkurve mit den IDDM4-Markern generiert (4). In diesem Fall wurde die prozentuale Übertragung (% T) von einem Marker und dessen beiden unmittelbar flankierenden Markern berechnet und ein Mittelwert von ihnen gebildet, um die Auswirkungen schwankender Allelhäufigkeit zu minimieren. Dies ergab ebenfalls einen Peak bei H0570POLYA, mit P = 0,04, und zeigt an, dass die IDDM4-Mutation wahrscheinlicher in dem Intervall E0864CA – D11S1337 liegt (75 kb).
Durch die Identifizierung dieses 75-kb-Intervalls, welches eine Assoziation mit Typ 1-Diabetes zeigt, wurden krankheits-assoziierte Haplotypen identifiziert. Diese stammen von den ursprünglichen Founder-Chromosomen, auf denen die Diabetes-Mutation oder die Mutationen von IDDM4 auftrat(en). Zur Identifizierung der Mutation, welche Suszeptibilität gegenüber Typ 1-Diabetes verursacht, wurde eine verfeinerte Kopplungsungleichgewichtskurve, basierend auf Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) und Haplotypen, konstruiert. SNPs werden identifiziert durch die Sequenzierung von Individuen mit speziellen Haplotypen, welche aufgrund der Mikrosatelliten-Analyse identifiziert wurden: Homozygot suszeptibel für Typ 1-Diabetes, homozygot schützend gegen Typ 1-Diabetes und Kontrollen. Einer dieser SNPs kann die ätiologische Mutation (DDM4 sein oder kann sich in einem sehr starken Kopplungsungleichgewicht mit dem primären Krankheitslocus befinden und somit bei einem Peak der verfeinerten Kurve liegen. Eine Kreuzübereinstimmungs-Analyse reduziert weiter die Anzahl der Kandidaten-SNPs, wie gezeigt durch die Lokalisierung der IDDM2-Mutation mit diesem Verfahren (Bennett et al., 1995; Gennett und Todd, 1996). Dies erfordert die Identifizierung unterschiedlicher Haplotypen oder Founder-Chromosomen, welche eine unterschiedliche Anordnung von Allelen von den hauptsächlichen suszeptiblen oder schützenden Haplotypen aufweisen, so dass die Assoziation oder Übertragung von Kandidaten-SNP-Allelen vor verschiedenen Haplotyp-Hintergründen getestet werden kann. Die Kandidatenmutationen können hinsichtlich Wirkungen auf die Genfunktion oder Genregulation untersucht werden.
In verschiedenen Populationen können verschiedene IDDM4-Mutationen im selben Gen aufgetreten sein. Wir sequenzierten mehrere mutmaßliche mit einem Founder-Chromosom oder einer Krankheit assoziierte Haplotypen von mehreren nicht verwandten Individuen aus verschiedenen Populationen, um Kandidatenmutationen für IDDM4 zu identifizieren, und welche im selben Gen gehäuft auftreten.
Zur Durchführung einer umfangreichen Suche hinsichtlich DNA-Mutationen oder Polymorphismen wurde die gesamte Region und flankierende Regionen der assoziierten Region sequenziert (die 75-kb-Kernregion und 125 kb flankierender DNA). Die DNA-Sequenz trägt ebenfalls zur Genidentifizierung bei und ist komplementär zu anderen Verfahren der Genidentifizierung, wie z.B. cDNA-Selektion oder Genidentifizierung durch DNA-Sequenzierung und vergleichende Analyse homologer genomischer Maus-DNA.
In der Hoffnung auf Identifizierung potentieller codierender Sequenzen innerhalb dieser Region wurden verschiedene Strategien angewandt: Sequenzierung, Computervoraussage mutmaßlicher Exons und Promotoren und cDNA-Selektion, um die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung aller Gene innerhalb dieses Intervalls zu erhöhen.
Konstruktion von Banken zur "Shotgun"-Sequenzierung
DNA wurde aus entweder Cosmiden, BACs ("Bacterial Artificial Chromosomes") oder PACs ("P1 Artificial Chromosomes") präpariert. Zellen, die den Vektor enthielten, wurden auf Luria-Bertani (LB)-Agarplatten, ergänzt mit dem geeigneten Antibiotikum, ausgestrichen. Eine Einzelkolonie wurde dazu verwendet, um 200 ml LB-Medium, ergänzt mit dem geeigneten Antibiotikum, anzuimpfen, und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und Plasmid-DNA wurde hergestellt gemäß dem Tip500 Maxi-Plasmid/Cosmid-Reinigungsprotokoll von QIAGEN (Chatsworth, CA) mit den folgenden Modifikationen: die Zellen von 100 ml Kultur wurden für jede Tip500-Säule eingesetzt, wobei die NaCl-Konzentration des Elutionspuffers von 1,25 M auf 1,7 M erhöht und der Elutionspuffer auf 65°C erwärmt wurde.
Gereinigte BAC- und PAC-DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease NotI verdaut und dann einer Pulsfeld-Gelelektrophorese unter Verwendung eines BioRad CHEF-Mapper-Systems (Richmond, CA) unterworfen. Die verdaute DNA wurde über Nacht in einem 1%igen Agarosegel mit niedriger Schmelztemperatur (BioRad, Richmond, CA) elektrophoresiert, welches mit 0,5 × Tris-Borat-EDTA (10 × Stammlösung; Fisher, Pittsburg, PA) hergestellt worden war. Die CHEF-Mapper-Autoalgorithmus-Standardeinstellungen wurden für Umschaltzeiten und Spannungen verwendet. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidiumbromid (Sigma, St. Louis, MO) angefärbt und mit einem Ultraviolett-Transilluminator sichtbar gemacht. Die Insertbande(n) wurde(n) aus dem Gel ausgeschnitten. Die DNA wurde aus dem Gelstück durch Verdauung mit Beta-Agarase (New England Biolabs, Beverly, MA) nach den Instruktionen des Herstellers isoliert. Die Lösung, welche die DNA und verdaute Agarose enthielt, wurde auf 50 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl₂ und 25% Glycerin in einem Volumen von 2 ml gebracht und in einen AERO-MIST-Zerstäuber (CIS-US, Redford, MA) eingebracht. Der Zerstäuber wurde mit einer Stickstoffgasquelle verbunden und die DNA wurde 30 Sekunden lang einer zufälligen Scherung mit 10 psi unterworfen. Die gescherte DNA wurde ethanolgefällt und in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) resuspendiert. Die Enden wurden durch Behandlung durch MungBean Nuclease (Promega, Madison, WI) bei 30°C für 30 Minuten glattendig gemacht, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Behandlung mit T4-DNA-Polymerase (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) in Multicore Puffer (Promega, Madison, WI) in Gegenwart von 40 μM dNTPs bei 16°C. Zur Erleichterung der Subklonierung der DNA-Fragmente wurden BstXI-Adapter (Invitrogen, Carlsbad, CA) mit den Fragmenten bei 14°C über Nacht mit T4-DNA-Ligase (Promega, Madison, WI) ligiert. Adapter und DNA-Fragmente von weniger als 500 bp wurden durch Säulenchromatographie unter Verwendung einer cDNA-Klassifizierungssäule (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) nach den vom Hersteller bereitgestellten Instruktionen entfernt. Fraktionen, die DNA von mehr als 1 kb enthielten, wurden vereinigt und durch Ethanolpräzipitation konzentriert. Die DNA-Fragmente, die BstXI-Adapter enthielten, wurden in die BstXI-Stellen von pSHOT II ligiert, welches durch Subklonierung der BstXI-Stellen aus pcDNA II (Invitrogen, Carlsbad, CA) in die BssHII-Stellen von pBlueScript (Stratagene, La Jolla, CA) konstruiert worden war. pSHOT II wurde durch Verdauung mit der Restriktionsendonuklease BstXI präpariert und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Die gelgereinigte Vektor-DNA wurde aus der Agarose extrahiert, indem das Prep-A-Gene-Protokoll (BioRad, Richmond, CA) befolgt wurde. Um eine Ligierung des Vektors mit sich selbst zu verringern, wurde der verdaute Vektor mit Kalbsdarm-Phosphatase (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) behandelt. Ligierungsreaktionen der DNA-Fragmente mit dem Klonierungsvektor wurden in ultrakompetente XL-2 Blue-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA) transformiert und diese auf LB-Agar-Platten ausplattiert, die mit 100 μg/ml Ampicillin ergänzt waren. Individuelle Kolonien wurden auf eine 96-Mulden-Platte gepickt, die 100 μl/Mulde LB-Bouillon, ergänzt mit Ampicillin, enthielt und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Etwa 25 μl von 80%igem sterilem Glycerin wurden jeder Mulde zugegeben und die Kulturen wurden bei –80°C gelagert.
Herstellung von Plasmid-DNA
Glycerin-Stammlösungen wurden zur Animpfung von 5 ml LB-Bouillon, ergänzt mit 100 μl/ml Ampicillin, entweder manuell oder unter Verwendung eines Tecan Genesis RSP 150-Roboters (Tecan AG, Hombrechtikon, Schweiz), der zur Beimpfung von 96 Röhrchen, enthaltend 5 ml Bouillon von den 96 Mulden, programmiert war, verwendet. Die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C unter Schütteln, um für Belüftung zu sorgen, gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation pelletiert, der Überstand wurde dekantiert und das Zellpellet bei –20°C gelagert. Plasmid-DNA wurde mit einem QIAGEN Bio Robot 9600 (QIAGEN, Chatsworth, CA) nach dem Qiawell Ultra-Protokoll präpariert. Zum Testen der Häufigkeit und Größe von Inserts wurde Plasmid-DNA mit der Restriktionsendonuklease PvuII verdaut. Die Größe der Restriktionsendonukleaseprodukte wurde durch Agarosegelelektrophorese überprüft, wobei die mittlere Insertgröße 1 bis 2 kb betrug.
DNA-Sequenz-Analyse von "Shotgun"-Klonen
Eine DNA-Sequenzanalyse wurde unter Verwendung des ABI PRISM^TM-Farbstoffterminatorzyklus-Schnellsequenzierungsreaktionskits mit AmpliTaq-DNA-Polymerase FS (Perkin Elmer, Norwalk, CT) durchgeführt. Eine DNA-Sequenzanalyse wurde mit M13-Vorwärts- und -Rückwärtsprimern durchgeführt. Nach der Amplifizierung in einem Perkin-Elmer 9600 wurden die Verlängerungsprodukte gereinigt und auf einem automatischen ABI PRISM 377-Sequenzierer (Perkin Elmer, Norwalk, CT) analysiert. Etwa 12 bis 15 Sequenzierungsreaktionen wurden pro kb zu untersuchender DNA durchgeführt, z.B. 1500 Reaktionen würden für ein PAC-Insert von 100 kb durchgeführt werden.
Assemblierung von DNA-Sequenzen
Phred/Phrap wurde für die Assemblierung von DNA-Sequenzen verwendet. Dieses Programm wurde von Dr. Phil Green entwickelt und von der University of Washington (Seattle, WA) lizensiert. Phred/Phrap besteht aus den folgenden Programmen: Phred für Basensuche, Phrap für Sequenzassemblierung, Crossmatch für Sequenzvergleiche, Consed und Phrapview für die Sichtbarmachung von Daten und Repeatmasker für das Screenen repetitiver Sequenzen. Vektor- und E. coli-DNA-Sequenzen wurden durch Crossmatch identifiziert und aus dem DNA-Sequenz-Assemblierungsprozess entfernt. Die DNA-Sequenz-Assemblierung erfolgte auf einem SUN Enterprise 4000 Server, auf dem ein Solaris 2.51 Betriebssystem lief (Sun Microsystems Inc., Mountain View, CA), unter Verwendung von Standard-Phrap-Parametern. Die Sequenz-Assemblierungen wurde weiter mittels Consed und Phrapview analysiert.
Bioinformatik-Analyse assemblierter DNA-Sequenzen
Als sich die assemblierten DNA-Sequenzen einer fünf- bis sechsfachen Abdeckung der Region von Interesse näherten, wurden die Exon- und Promotor-Voraussagefähigkeiten des Programms GRAIL (ApoCom, Oak Ridge) dazu verwendet, um die Genidentifizierung zu erleichtern. ApoCom GRAIL ist eine kommerzielle Version der vom Department of Energy entwickelten GRAIL Gene Characterization Software, lizensiert an ApoCom Inc., von Lockheed Martin Energy Research Corporation und ApoCom Client Tool für Genomics (ACTG) TM.
Mit den DNA-Sequenzen in verschiedenen Stadien der Assemblierung wurden die DNA-Sequenzen in der GenBank-Datenbank (Subjekt) unter Verwendung des BLAST-Algorithmus (S. F. Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215, 403–410) mit Standardparametern abgefragt. Wenn große zusammenhängende Sequenzen von DNA untersucht wurden, wurden repetitive Elemente nach der Identifizierung durch Crossmatch mit einer Datenbank von repetitiven Säugerelementen maskiert. Nach der BLAST-Analyse wurden die Ergebnisse mit einem Parser-Programm, geschrieben von Dr. Guochun Xie (Merck Research Lab), zusammengestellt. Der Parser lieferte die folgende Information aus der Datenbank für jede DNA-Sequenz mit einer Ähnlichkeit mit einem P-Wert von mehr als 10^–6; die kommentierte Bezeichnung der Sequenz, die Datenbank, aus der sie erhalten wurde, die Länge und prozentuale Identität des Ähnlichkeitsbereichs und die Lage der Ähnlichkeit bei sowohl der Abfrage als auch dem Subjekt.
Die BLAST-Analyse identifizierte einen hohen Grad an Ähnlichkeiten (90–100% Identität) über eine Länge von mehr als 100 bp zwischen DNA-Sequenzen, die wir erhielten, und einer Anzahl von humanen EST-Sequenzen, die in der Datenbank vorlagen. Diese humanen EST-Sequenzen häuften sich in Gruppen, welche durch die Zugangsnummern R73322, E50627, F07016 repräsentiert werden. Im allgemeinen wird angenommen, dass jeder EST-Cluster ein Einzelgen repräsentiert. Die DNA-Sequenzen in dem R73322-Cluster von 424 Nukleotiden hatten einen niedrigeren, jedoch signifikanten Grad an DNA-Sequenzähnlichkeit mit dem Gen, welches für das LDL-Rezeptor-verwandte Protein codiert (GenBank-Zugangsnummer X13916), und mehreren anderen Mitgliedern der LDL-Rezeptorfamilie. Deshalb wurde geschlossen, dass die Sequenzen, die hohe Ähnlichkeit mit EST R73322 aufwiesen, von einem Mitglied der LDL-Rezeptorfamilie codiert wurden.
Mitglieder eines jeden EST-Clusters wurden unter Verwendung des Programms Sequencher (Perkin Elmer, Norwalk, CT) assembliert. Zur Erhöhung der Genauigkeit der EST-Sequenzdaten, die aus der Datenbank extrahiert worden waren, wurden relevante Chromatographiespurdaten aus den genomischen DNA-Sequenzen, erhalten mittels "Shotgun"-Sequenzierung, in die Assemblierung eingeschlossen. Die korrigierten EST-Sequenzen wurden erneut mittels BLAST und BLASTX analysiert. Für den EST-Cluster 3, repräsentiert durch die Zugangsnummer R50627, offenbarte eine Analyse der überarbeiteten EST-Assemblierung, dass dieser Cluster Mitgliedern der LDL-Rezeptorfamilie ähnlich war. Dieses Ergebnis legte die Möglichkeit nahe, dass die beiden EST-Cluster Komponenten desselben Gens waren.
Experimentell erhaltene cDNA-Sequenzen wurden unter Verwendung des Programms Sequencher (Perkin Elmer, Norwalk, CT) assembliert. Genomische DNA-Sequenzen und cDNA-Sequenzen wurden unter Verwendung des Programms Crossmatch verglichen, welches einen schnellen und sensitiven Nachweis der Lage von Exons erlaubte. Die Identifizierung von Intron/Exon-Grenzen erfolgte dann durch manuellen Vergleich der genomischen und cDNA-Sequenzen unter Verwendung des Programms GeneWorks (Intelligenetics Inc., Campbell, CA).
Northernblot-Analyse
Die Primer 256F und 622R (Tabelle 2) wurden dazu verwendet, um ein PCR-Produkt von 366 bp von einer Fötusgehirn-cDNA-Bank zu amplifizieren. Dieses Produkt wurde auf einem Agarosegel gereinigt, die DNA extrahiert und subkloniert in pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Die 366-bp-Sonde wurde durch statistisches Primen mit dem Amersham Rediprime-Kit (Arlington Heights, IL) in Gegenwart von 50–100 μCi von 3000 Ci/mmol [Alpha-³²P]dCTP (Dupont/NEN, Boston, MA) markiert. Nicht inkorporierte Nukleotide wurden mit einer ProbeQuant-G-50-Schleudersäule (Pharmacia/Biotech, Piscataway, NJ) entfernt. Die radioaktiv markierte Sonde in einer Konzentration von mehr als 1 × 10⁶ CpM/ml in Schnellhybridisierungspuffer (Clontech, Palo Alto, CA) wurde über Nacht bei 65°C mit humanem Mehrfachgewebe Northern's I und II (Clontech, Palo Alto, CA) inkubiert. Die Blots wurden gewaschen durch zwei 15minütige Inkubationen in 2 × SSC, 0,1% SDS (hergestellt aus Stammlösungen von 20 × SSC und 20% SDS, Fisher, Pittsburg, PA) bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei 15minütigen Inkubationen in 1 × SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur und zwei 30minütigen Inkubationen in 0,1 × SSC, 0,1% SDS, bei 60°C. Eine Autoradiographie der Blots erfolgte, um die Banden sichtbar zu machen, die spezifisch mit der radioaktiv markierten Sonde hybridisierten.
Die Sonde hybridisierte mit einem mRNA-Transkript von etwa 5–5,5 kb, das am stärksten in der Plazenta, Leber, dem Pankreas und der Prostata exprimiert wird. Es wird auf mittlerem Niveau in der Lunge, dem Skelettmuskel, der Niere, Milz, dem Thymus, Eierstock, Dünndarm und Dickdarm exprimiert. Die Message wird auf einem niedrigen Niveau im Gehirn, in den Hoden und Leukozyten exprimiert. In Geweben, in denen das Transkript stark exprimiert wird, z.B. Leber und Pankreas, werden zusätzliche Banden von 7 kb und 1,3 kb beobachtet.
Isolierung von Volllängen-cDNAs
PCR-basierte Techniken wurden dazu verwendet, Regionen zu verlängern, die ESTs sehr ähnlich waren, und Regionen, die durch Exon-Voraussage-Software (GRAIL) identifiziert worden waren. Die eine verwendete Technik ist eine Variation von RACE ("Rapid Amplification of cDNA Ends"), bezeichnet als RCCA ("Reduced Complexity cDNA-Analysis"), ähnliche Prozeduren werden von Munroe et al. (1995), PNAS, 92: 2209–2213, und Wilfinger et al. (1997), BioTechniques, 22: 481–486, berichtet. Diese Technik beruht auf einer PCR-Matrize, die ein Pool von etwa 20.000 cDNA-Klonen ist, dies reduziert die Komplexität der Matrize und erhöht die Wahrscheinlichkeit, längere PCR-Verlängerungen zu erhalten. Eine zweite Technik, die zur Verlängerung von cDNAs verwendet wurde, war eine PCR zwischen Regionen, von denen anhand der genomischen Sequenz festgestellt wurde, dass sie das Potential aufwiesen, Abschnitte eines Gens zu sein, z.B. Sequenzen, die ESTs sehr ähnlich waren, oder Sequenzen, die mittels GRAIL identifiziert worden waren. Diese PCR-Reaktionen erfolgten mit cDNA, hergestellt von etwa 5 μg mRNA (Clontech, Palo Alto, CA) mit dem SuperScript^TM-Choice-System (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD). Die Synthese des ersten cDNA-Stranges wurde unter Verwendung von 1 μg Oligo(dT)_12-18-Primer und 25 ng statistischer Hexamere pro Reaktion geprimt. Die Synthese des zweiten cDNA-Stranges erfolgte nach den Anweisungen des Herstellers.
Identifizierung zusätzlicher Exons, die mit dem EST-Cluster 1 verwandt waren
Wir scannten 96 Mulden einer Human-Fötusgehirn-Plasmidbank, 20.000 Klone pro Mulde, durch Amplifizierung eines 366-bp-PCR-Produkts unter Verwendung der Primer 256F und 622R. Die Reaktionsmischung bestand aus 4 μl Plasmid-DNA (0,2 ng/ml), 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 10% Sucrose, 2,5 mM MgCl₂, 0,1% Tetrazin, 200 mM dNTP's, 100 ng eines jeden Primers und 0,1 μl Taq Gold (Perkin-Elmer, Norwalk, CT). Ein Gesamtreaktionsvolumen von 11 μl wurde bei 95°C 12 Minuten lang inkubiert, gefolgt von 32 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden. Etwa 20 Mulden wurden mittels PCR-Analyse befunden, das korrekte 366-bp-Fragment zu enthalten. 5'- und 3'-RACE wurde anschließend bei mehreren der positiven Mulden, welche die Plasmid-cDNA-Bank enthielten, unter Verwendung eines vektor-spezifischen Primers und eines genspezifischen Primers durchgeführt. Die vektor-spezifischen Primer, PBS 543R und PBS 873F, wurden beide in Kombination mit den gen-spezifischen Primern 117F und 518R verwendet, da die Orientierung des Inserts nicht bekannt war. Die PCR-Amplifizierungsbedingungen bestanden aus 1 × TaKaRa-Puffer LA, 2,5 mM MgCl₂, 500 mM dNTPs, 0,2 μl von TaKaRa LA Taq-Polymerase (PanVera, Madison, WI), 100 ng eines jeden Primers und 5 μl der Plasmidbank mit 0,2 ng/ml. In einem Gesamtreaktionsvolumen von 20 ml waren die Bedingungen der thermischen Zyklen wie folgt: 92°C für 30 Sekunden, gefolgt von 32 Zyklen von 92°C für 30 Sekunden, 1 Minute bei 60°C und 10 Minuten bei 68°C. Nach der ersten PCR-Amplifizierung wurde eine verschachtelte oder halbverschachtelte PCR-Reaktion unter Verwendung der verschachtelten Vektorprimer PBS 578R und PBS 838F und verschiedener gen-spezifischer Primer (256F, 343F, 623R und 657R) durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden von den nicht-inkorporierten dNTPs und Primern unter Verwendung von QIAquick-PCR-Reinigungs-Schleudersäulen von QIAGEN unter Anwendung von Standardprotokollen abgetrennt und in 30 μl Wasser resuspendiert. Die Amplifizierungsbedingungen für die verschachtelte und halbverschachtelte PCR waren die gleichen wie bei der ursprünglichen PCR-Amplifizierung, mit der Ausnahme, dass 3 μl des gereinigten PCR- Fragments als Matrize verwendet wurden und die Zyklisierungsbedingungen nur 20 Zyklen umfassten. Die aus dieser PCR-Amplifizierung erhaltenen Produkte wurden auf 1%igen Agarosegelen analysiert, ausgeschnittene Fragmente wurden mittels QIAGEN QIAquick-Schleudersäulen gereinigt und unter Verwendung von ABI-Farbstoffterminator-Sequenzierungskits sequenziert. Die Produkte wurden mit ABI 377-Sequenzierern nach Standardprotokollen analysiert.
Verbindung der EST-Cluster 1–3
Wie oben erörtert, ist es möglich, dass jeder EST-Cluster ein Einzelgen repräsentiert, alternativ können die EST-Cluster Abschnitte desselben Gens sein. Zur Unterscheidung zwischen diesen beiden Möglichkeiten wurden Primer konstruiert für die beiden anderen EST-Cluster in der Region, welche von den EST-Zugangsnummern F07016 (Cluster 2, enthaltend 272 Nukleotide) und R50627 (Cluster 3, enthaltend 1177 Nukleotide) repräsentiert werden. Primer vom Cluster 1 (117F und 499F) wurden mit einem Primer vom EST-Cluster 3 (4034R) in einer PCR-Reaktion gepaart. Eine 50-μl-Reaktion wurde unter Verwendung der TaKaRa-LA-Taq-Polymerase (PanVera, Madison, WI) in dem vom Hersteller bereitgestellten Reaktionspuffer unter Zugabe von 0,32 mM dNTPs, Primern und etwa 30 ng Lymphknoten-cDNA durchgeführt. PCR-Produkte wurden für 35 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 4 Minuten amplifiziert. Die Produkte wurden auf einem 1%igen Agarosegel elektrophoresiert und Banden von 2,5 bis 3 kb wurden ausgeschnitten, in pCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) subkloniert und Plasmid-DNA wurde für die DNA-Sequenzanalyse präpariert.
Die oben beschriebene Primärreaktion, generiert mit einem Primer im EST-Cluster 1 (638F) und EST-Cluster 3 (4173R), wurde als Matrize für eine Reaktion mit einem Primer vom EST-Cluster 1 (638F) und vom EST-Cluster 2 (3556R) verwendet. Diese halbverschachtelte PCR-Reaktion wurde mit TaKaRa-LA-Taq-Polymerase durchgeführt wie im vorherigen Absatz beschrieben. Ein Produkt von etwa 2 kb wurde erzeugt und für die DNA-Sequenzanalyse subkloniert. Die Assemblierung der DNA-Sequenzergebnisse dieser PCR-Produkte zeigte an, dass die EST-Cluster 1 bis 3 Teil desselben Gens waren und etablierte deren Orientierung relativ zueinander in dem von diesem Gen produzierten mRNA-Transkript.
PCR-Reaktionen wurden auch zwischen den EST-Clustern 2 und 3 durchgeführt. Eine Amplifizierung von Leber-cDNA unter Verwendung von TaKaRa-LA-Taq-Polymerase (PanVera, Madison, WI) mit den Primern 2519F, 3011F oder 3154F (EST-Cluster 2) in Kombination mit 5061 R (EST-Cluster 3) erfolgte für 35 Zyklen von 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 60 Sekunden und 72°C für 3 Minuten. Die PCR-Produkte wurden gelgereinigt, subkloniert und die DNA-Sequenz wurde bestimmt. Die DNA-Sequenzanalyse der Enden aller dieser PCR-Produkte ergab den größten Teil der cDNA-Sequenz, um jedoch die vollständige DNA-Sequenz von beiden Strängen bereitzustellen, wurden Oligonukleotid-Primer konstruiert und für die DNA-Sequenzierung verwendet (5(a)).
Verlängerung des 5'-Endes
Eine RCCA-Analyse wurde eingesetzt, um durch Verwendung der internen gen-spezifischen Primer wie zuvor beschrieben eine Anzahl von Klonen zu erhalten, die am 5'-Ende verlängert waren. Mehrere klonale Verlängerungen wurden isoliert, jedoch brachen die meisten analysierten Klone innerhalb des Exons A ab. Ein Klon reichte jenseits des 5'-Endes von Exon A, jedoch war die Sequenz zusammenhängend mit genomischer DNA. Nachdem eine Reihe von Befunden eine Intron/Exon-Grenze am 5'-Ende von Exon A anzeigt, schien es wahrscheinlich, dass diese Verlängerung das Ergebnis einer unprozessierten Intronsequenz ist. Ein zweiter Klon h10 reichte jenseits dieses Punkts, wich jedoch von der genomischen DNA-Sequenz ab. Es wurde geschlossen, dass dieser einen chimären Klon darstellte, der in der ursprünglichen Fötusgehirn-cDNA-Bank vorlag.
Identifizierung des 5'-Endes der Isoform 1
Wie oben beschrieben, ergaben Ergebnisse aus RCCA-Experimenten eine Anzahl unabhängiger Klone, die am 5'-Ende von Exon A endeten. Dies legte nahe, dass das humane LRP5-Gen eine Region enthält, welche die reverse Transkriptase schwer transkribieren kann. Zur Umgehung dieses Problems entschieden wir uns dafür, das Maus-Orthologe von LRP5 zu isolieren, da subtile Unterschiede im DNA-Sequenzgehalt das Vermögen eines Enzyms zur Transkribierung einer Region verändern können. Zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit für die Isolierung des 5'-Abschnitts des Mausgens wurde eine humane Sonde von 366 Nukleotiden, oben beschrieben und von den Exons A und B abgeleitet, verwendet.
Eine cDNA-Bank wurde aus Mausleber-mRNA, erhalten von Clontech (Palo Alto, CA), konstruiert. cDNA wurde hergestellt unter Verwendung des SuperScript Choice-Systems (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) nach den Instruktionen des Herstellers. Phosphorylierte BstXI-Adapter (Invitrogen, San Diego, CA) wurden mit etwa 2 μg Mausleber-cDNA ligiert. Die Ligierungsmischung wurde verdünnt und auf einer cDNA-Klassifizierungssäule (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) größenfraktioniert. Tropfen von der Säule wurden gesammelt und das von der Säule eluierte Volumen bestimmt wie für die Konstruktion von "Shutgun"-Banken beschrieben. Die größenfraktionierte cDNA mit den BstXI-Linkern wurde in den oben beschriebenen Vektor pSHOT II ligiert, mit der Restriktionsendonuklease BstXI gespalten, gelgereinigt und mit Kalbsdarm-Phosphatase (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) dephosphoryliert. Die Ligierungsmischung, die etwa 10–20 ng cDNA und etwa 100 ng Vektor enthielt, wurde über Nacht bei 14°C inkubiert. Mit der Ligierungsmischung wurden ultrakompetente XL-2-Blue-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA) transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf 20 Colony/Plaque-Screen-Filter (Dupont/NEN, Boston, MA) von 133 mm in einer Dichte von etwa 30.000 Kolonien pro Platte auf Luria Broth-Agarplatten, die mit 100 μg/ml Ampicillin (Sigma, St. Louis, MO) ergänzt waren, ausgebreitet. Die Kolonien wurden über Nacht wachsen gelassen und dann auf zwei Filterduplikate replika-plattiert. Die Replika-Filter wurden mehrere Stunden lang bei 37°C gezüchtet, bis die Kolonien sichtbar waren, und für die in situ-Hybridisierung von Kolonien nach etablierten Verfahren (Maniatis, Fritsch und Sambrook, 1982) behandelt. Ein Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA) wurde zur Vernetzung der DNA mit dem Filter verwendet. Die Filter wurden über Nacht mit mehr als 1.000.000 CpM/ml Sonde in 1 × Hybridisierungspuffer (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), enthaltend 50% Formamid bei 42°C, hybridisiert. Die Sonde wurde von einem PCR-Produkt generiert, das von der Human-LRP5-cDNA unter Verwendung der Primer 512F und 878R erhalten worden war. Diese Sonde wurde mit dem Amersham Rediprime Kit (Arlington Heights, IL) in Gegenwart von 50–100 μCi von 3000 Ci/mmol [Alpha-³²P]dCTP (Dupont/NEN, Boston, MA) statistisch Primer-markiert und unter Verwendung einer ProbeQuant G-50-Schleudersäule (Pharmacia/Biotech, Piscataway, NJ) gereinigt. Die Filter wurden mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C gewaschen. Nach der Autoradiographie wurden individuelle Regionen, enthaltend hybridisierungs-positive Kolonien, von dem Masterfilter ausgeschnitten und in 0,5 ml Luria Broth plus 20% Glycerin platziert. Jedes Positiv wurde mit einer Dichte von etwa 50–200 Kolonien pro 100-mm-Platte erneut ausplattiert und mittels Hybridisierung wie oben beschrieben gescreent. Einzelkolonien wurden isoliert und Plasmid-DNA für die DNA-Sequenzanalyse präpariert.
Drei Klone wurden aus der Maus-cDNA-Bank isoliert, die assemblierte Sequenz der Klone (16(a)), hatte einen hohen Grad an Ähnlichkeit (87% Identität über einen Abschnitt von etwa 1700 Nukleotiden) mit dem humanen LRP5-Gen und repräsentiert somit wahrscheinlich das Maus-Orthologe von LRP5. Die 500 Aminosäuren des Abschnitts des Maus-LRP5 ( 16(d)), den wir zuerst erhielten, sind zu 96% identisch mit Human-LRP5. Signifikanterweise hatten zwei dieser Klone eine Sequenz, die sich 5' der Exon A entsprechenden Region befand; Klon 19a enthielt zusätzliche 200 bp und Klon 9a enthielt zusätzliche 180 bp ( 16(b)). Die zusätzlichen 200 bp enthalten einen offenen Leserahmen, der bei bp 112 beginnt (16(c)). Das Initiationscodon hat Konsensus-Nukleotide für eine effiziente Translationsinitiation an sowohl den –3(Purin)- als auch +4(G-Nukleotid)-Positionen (Kozak, M., 1996, Mammalian Genome 7: 563–574). Dieser offene Leserahmen codiert für ein Peptid mit dem Potential, als eukaryotische Signalsequenz für den Proteinexport zu fungieren (von Heijne, 1994, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 23: 167–192). Die höchste Bewertung für die Signalsequenz, wie bestimmt durch Verwendung des SigCleave-Programms in dem GCG-Analysepaket (Genetics Computer Group, Madison, WI), generiert ein reifes Peptid, das bei Rest 29 der Isoform 1 beginnt. Zusätzliche Stellen, welche verwendet werden können, produzieren reife Peptide, die bei Aminosäurerest 31 (die erste Aminosäure, die von Exon A codiert wird) oder den Aminosäureresten 32, 33 oder 38 beginnen.
Molekulare Klonierung der Volllängen-Maus-Lrp3-cDNA
Die Maus-cDNA-Klone, welche durch Nukleinsäurehybridisierung isoliert wurden, enthalten 1,7 kb des 5'-Endes der Lrp3-cDNA (16(a)). Dies macht etwa ein Drittel der Volllängen-cDNA im Vergleich zur Human-cDNA-Sequenz aus. Der Rest der Maus-Lrp3-cDNA wurde unter Verwendung von PCR zur Amplifizierung von Produkten von Mausleber-cDNA isoliert. PCR-Primer, Tabelle 9, wurden auf Grundlage von DNA-Sequenzen konstruiert, die durch die grobe Sequenzdurchmusterung („Skimming") der genomischen Mausklone, BACs 53-d-8 und 131-p-15, welche das Maus-Lrp3-Gen enthalten, identifiziert worden waren. BAC 53-d-8 wurde durch FISH-Analyse auf dem Mauschromosom 19 kartiert, welches synten mit 11q13 ist. Eine Sequenzdurchsuchung dieser Klone identifizierte DNA-Sequenzen, welche dem codierenden Bereich von Human-LRP5 sowie der 3'-untranslatierten Region entsprachen. Diese Strategie führte zur Bestimmung einer Maus-cDNA-Sequenz von 5059 Nukleotiden (18(a)), welche einen offenen Leserahmen von 4842 Nukleotiden (18(b)) enthält, der für ein Protein von 1614 Aminosäuren (18(c)) codiert. Das mutmaßliche ATG befindet sich in einem Sequenzkontext, der für die Translationsinitiation günstig ist (Kozak, M., 1996, Mammalian Genome 7: 563–574).
Vergleich von Human- und Maus-LRP5
Die cDNA-Sequenzen von Human- und Maus-LRP5 zeigen 87% Identität. Der offene Leserahmen der Human-LRP5-cDNA codiert für ein Protein von 1615 Aminosäuren, das zu 94% identisch mit dem 1614-Aminosäureprotein ist, welches von Maus-Lrp3 codiert wird (18(d)). Der Längenunterschied ist auf eine einzige Aminosäuredeletion in der Maus-Lrp3-Signalpeptidsequenz zurückzuführen. Die Signalpeptidsequenz ist nicht hoch konserviert, mit weniger als 50% Identität zwischen Mensch und Maus. Die Position der mutmaßlichen Signalsequenz-Spaltungsstelle befindet sich bei Aminosäurerest 25 beim Menschen und Aminosäure 29 bei der Maus. Die Spaltung an diesen Stellen würde zu reifen Human- und Mausproteinen von 1591 bzw. 1586 Aminosäuren führen, welche zu 95% identisch sind (18(e)). Der hohe Grad von Gesamtsequenzähnlichkeit ist ein starkes Argument dafür, dass die identifizierten Sequenzen Orthologe des LRP5-Gens sind. Diese Hypothese wird weiter gestützt durch die Ergebnisse von genomischen Southern-Experimenten (Daten nicht gezeigt).
Identifizierung eines Human-Signalpeptid-Exons für die Isoform 1
Das humane Exon, welches für ein Signalpeptid codiert, wurde aus Leber-cDNA mittels PCR isoliert. Der Vorwärtsprimer 1F (Tabelle 9) wurde in Kombination mit einem der folgenden reversen Primer: 218R, 265R, 318R und 361R, in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von Taq Gold-Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) verwendet und mit entweder 3, 5 oder 7% DMSO ergänzt. Produkte wurden für 40 Zyklen von 30 Sek. bei 95°C, 30 Sek. 58°C und 1 Mm. 72°C amplifiziert. Die Produkte wurden auf einem Agarosegel analysiert und einige der Reaktionen, die Banden der vorhergesagten Größe enthielten, wurden für die DNA-Sequenzanalyse und Subklonierung in pCR2.1 (Invitrogen, San Diego, CA) ausgewählt.
Die abgeleitete DNA-Sequenz von 139 Nukleotiden stromaufwärts von Exon 2 (auch bekannt als Exon A) enthält ein ATG, das sich in einem Kontext für effiziente Translationsinitiation befindet: ein Adenin (A)-Rest an der Position –3 und ein Guanin (G)-Rest an der Position +4 (Kozak, M., 1996, Mammalian Genome 7: 563–574). Der offene Leserahmen für dieses ATG setzt sich 4854 Nukleotide fort (5(b)), welche für ein Polypeptid von 1615 Aminosäuren (5(c)) codieren.
Die Sequenz, welche dem Initiator-ATG-Codon folgt, codiert für ein Peptid mit dem Potential, als Signal für Proteinexport zu fungieren. Der höchste Wert für die Signalsequenz (15.3), der von dem "SigCleave"-Programm in dem GCG-Analysepaket (Genetics Computer Group, Madison, WI) angezeigt wird, ergibt ein reifes Polypeptid, das am Aminosäurerest 25 beginnt (5(d, e)). Zusätzliche mutmaßliche Spaltstellen, welche dazu verwendet werden können, ein reifes LRP5-Protein zu erzeugen, werden für die Reste 23, 24, 26, 27, 28, 30 und 32 (die erste Aminosäure, die von Exon A codiert wird) vorausgesagt.
Bestimmung der genomischen DNA-Sequenz, welche das Signalpeptid-Exon enthält und flankiert
Die Region, welche die genomische DNA-Sequenz enthielt, die mit der für ein Signalpeptid codierenden cDNA-Sequenz identisch war, befand sich in einer Lücke zwischen zwei Folgen von zusammenhängender genomischer DNA-Sequenz, die als Contig 57 und 58 bekannt sind. Zur Schließung dieser Lücke wurden vier Klone aus der "Shotgun"-Bank gewählt, welche gemäß Analyse mit dem Programm Phrapview, lizensiert von Dr. Phil Green von der University of Washington (Seattle, WA), als diese Lücke überspannend bestimmt wurden. Eine direkte DNA-Sequenzierung dieser Klone war erfolglos, d.h. der hohe GC-Gehalt verringerte signifikant die Effizienz der zyklischen Sequenzierung. Zur Umgehung dieses Problems wurden PCR-Produkte durch Inkorporation von 7-Deaza-dGTP (Pharmacia, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) generiert. Die Bedingungen für diese Reaktionen bestanden aus einer Modifizierung des Klentaq Advantage-GC-Polymerase-Kits (Clontech, Palo Alto, CA). Das Standardreaktionsprotokoll wurde durch Ergänzung der Reaktionsmischung mit 200 μM 7-Deaza-dGTP modifiziert. Die Inserts wurden mit Vorwärts- und Rückwärts-M13-Primern für 32 Zyklen von 30 Sek. bei 92°C, 1 Min. bei 60°C und 5 Min. bei 68°C amplifiziert. Produkte wurden mit Hilfe des Qiaquick-Gelextraktionskits (Qiagen Inc., Santa Clarita, CA) gelgereinigt und wie zuvor beschrieben sequenziert. Die Assemblierung der resultierenden Sequenzen schloss die Lücke und generierte eine zusammenhängende Sequenz von etwa 78.000 bp genomischer DNA.
Verlängerung der Isoformen 2 und 3
Das Software-Paket GRAIL (oben) sagt Exons und Promotorsequenzen von genomischer DNA-Sequenz voraus. Eine mittels GRAIL identifizierte Region ist ein Exon, das ursprünglich als G1 bezeichnet wurde und später Exon 1 genannt wurde, das sich etwa 55 kb stromaufwärts des Beginns von Exon A befindet (12(c)). Drei Primer mit der Bezeichnung G1 1f bis 3f wurden auf Grundlage dieser Sequenz konstruiert. Dieses Exon war von besonderem Interesse, da GRAIL auch einen Promotor unmittelbar stromaufwärts der Exonsequenz voraussagte (12(e)). Ferner codierte einer der offenen Leserahmen in G1 für ein Peptid, welches die charakteristischen Eigenschaften einer eukaryotischen Signalsequenz aufwies.
Zur Feststellung, ob das vorausgesagte G1-Exon Teil des LRP5-Gens war, wurde eine PCR mit reverser Transkriptase (RT) durchgeführt unter Verwendung des Taqara-RNA-PCR-Kits (Panvera, Madison, WI). Humanleber-mRNA (50 ng) wurde als Matrize für eine 10-μl-Reaktion mit reverser Transkriptase verwendet. Die Reaktion mit reverser Transkriptase unter Verwendung eines der LRP5-spezifischen Primer (622R, 361 R oder 318R) wurde 30 Min. lang bei 60°C inkubiert, gefolgt von 5 Min. bei 99°C, und dann wurde die Probe auf Eis gestellt. Einer der Vorwärtsprimer, Tabelle 2 (G1 1f, 2f oder 3f), wurde zusammen mit den Reagenzien für eine PCR-Amplifizierung zugegeben und die Reaktion wurde für 30 Zyklen von 30 Sek. bei 94°C, 30 Sek. bei 60°C und 2 Min. bei 72°C amplifiziert. Diese primäre PCR-Reaktion wurde dann 1:2 in Wasser verdünnt und 1 μl der Reaktion wurde in einer zweiten 20-μl-Reaktion unter Verwendung ineinander geschachtelter Primer verwendet. Die Reaktionsbedingungen für den zweiten Durchgang der Amplifizierung waren 30 Zyklen von 94°C für 30 Sek., 60°C für 30 Sek. und 72°C für 2 Min. Die Produkte wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt und ausgeschnitten. Die gereinigten Produkte wurden in pCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) subkloniert, Plasmid-DNA wurde präpariert und die DNA-Sequenz wurde bestimmt.
Die DNA-Sequenz dieser Produkte zeigte an, dass G1 (Exon 1) auf mindestens einem Teil der LRP5-Transkripte vorhanden war. Zwei verschiedene Isoformen wurden identifiziert. Die erste, Isoform 2 (11(a)), die in diesem Experiment identifiziert wurde, besteht aus Exon 1, gefolgt von einem Exon, dem wir die Bezeichnung Exon 5 gaben. Diese Spleissvariante hat einen offenen Leserahmen, der bei Nukleotid 402 von Exon B beginnt (11(a)), das Initiator-Methionin an dieser Stelle entspricht nicht den Konsensus-Sequenzen für die Translationsinitiation (Kozak, M. (1996), Mammalian Genome 7: 563–574). Ein zweites potentielles Initiator-Methionin befindet sich bei Nukleotid 453, dieses Codon liegt in einem Kontext für eine effiziente Initiation der Translationsinitiation (Kozak, M. (1996), Mammalian Genome 7: 563–574). Der längste potentielle offene Leserahmen für die Isoform 2 ( 11(c)) codiert für eine Spleissvariante, die eine eukaryotische Signalsequenz bei Aminosäure 153 enthält. Dem reifen Peptid, das von dieser Spleissvariante erzeugt wird, würden die ersten fünf Spacerdomänen fehlen und ein Teil des ersten EGF-ähnlichen Motivs.
Die zweite Isoform (Isoform 3) besteht aus Exon 1, gefolgt von Exon A (12(a)). Es ist nicht bekannt, ob das Exon 1 das erste Exon der Isoform 2 ist. Jedoch legt die Position eines durch GRAIL vorausgesagten Promotors stromaufwärts von G1 die Möglichkeit nahe, dass Exon 1 das erste Exon ist. Ferner gibt es einen offenen Leserahmen, der sich über die 5'-Intron/Exon-Grenze erstreckt, die von GRAIL postuliert wird (12(b)). Deshalb untersuchten wir die Möglichkeit, diesen verlängerten offenen Leserahmen in das LRP5-Transkript zu inkorporieren. Der resultierende offene Leserahmen (12(c)) codiert für ein Protein von 1639 Aminosäuren (12(d)). Das Initiator-Methionin-Codon enthält keines der Konsensus-Nukleotide, welche für eine effiziente Translation für wichtig gehalten werden (Kozak, M., 1996, Mammalian Genome 7: 563–574). Ferner enthält das vorausgesagte Protein keine vorausgesagte eukaryotische Signalsequenz innerhalb der ersten 100 Aminosäuren. Alternativ könnte es zusätzliche Exons stromaufwärts von Exon 1 geben, welche das Initiator-Methionin-Codon und/oder eine potentielle Signalsequenz bereitstellen.
RACE-Verlängerung des 5' Endes von Irp5: Isoformen 4 und 5
RACE ist ein etabliertes Protokoll für die Analyse von cDNA-Enden. Diese Prozedur wurde unter Verwendung der Marathon-RACE-Matrize, bezogen von Clontech (Palo Alto, CA), durchgeführt. Sie erfolgte gemäß den Instruktionen unter Verwendung der Clontech-"Marathon"-cDNA aus Fötusgehirn- und Brustgeweben. Zwei "ineinander geschachtelte" PCR-Amplifizierungen wurden unter Verwendung der ELONGASE^TM-long-PCR-Enzymmischung und Puffer von Gibco/BRL (Gaithersburg, MD) durchgeführt.
Marathon-Primer

AP1: CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC
AP2: ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC

Bei dem ersten PCR-Durchgang wurden 2 μl Marathon-Plazenta-cDNA-Matrize und jeweils 10 pmol der Primer 1217 und AP1 verwendet. Die zyklische thermische Reaktionsführung war: 94°C 30 Sek., 68°C 6 Mm., 5 Zyklen; 94°C 30 Sek., 64°C 30 Sek., 68°C 4 Mm, 5 Zyklen; 94°C 30 Sek., 62°C 30 Sek., 68°C 4 Mm., 30 Zyklen. 1 μl einer 1/20-Verdünnung dieser Reaktion wurde einer zweiten PCR-Reaktion als DNA-Matrize zugegeben. Diese PCR-Reaktion unterschied sich auch von der ersten PCR-Reaktion darin, dass ineinander geschachtelte Primer L120 und AP2 verwendet wurden. Zwei Produkte von etwa 1600 bp und 300 bp wurden beobachtet und in pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Die DNA-Sequenz dieser Klone zeigte an, dass sie durch Spleissen von Sequenzen an Exon A generiert wurden. Das größere 1,6-kb-Fragment (13) identifizierte eine Region von etwa 4365 Nukleotiden stromaufwärts von Exon A und schien mit genomischer DNA für 1555 Basenpaare kontinuierlich zu sein. Die Sequenz, welche mit dem 300-bp-Fragment identifiziert wurde, befand sich etwa 5648 Nukleotide stromaufwärts von Exon A (14). Diese Sequenz hatte Ähnlichkeit mit Alu-Repeats. Die mit dem 300-bp-Fragment identifizierte Region befand sich innerhalb der Region, welche mit dem 1,6-kb-Fragment identifiziert wurde. Der offene Leserahmen für diese Isoformen, bezeichnet als 4 und 5, ist derselbe wie für die Isoform 2 beschrieben (11(b)).
Verlängerung der Isoform 6
GRAIL (oben)-Analyse wurde dazu verwendet, um potentielle Promotorregionen für das Gen vorauszusagen. Primer wurden für die Isoform 6-Promotorsequenz (15(b)) konstruiert, welche durch GRAIL definiert worden war und sich etwa 4 kb zentromer von Exon A befindet. Diese Region wurde als GRAIL-Promotor 1 (Gp-1) bezeichnet.
Der PCR-Primer Gp 1f (Tabelle 2) wurde in einer PCR-Reaktion mit den Primern 574r und 599r unter Verwendung der Polymerase Taq Gold in dem Reaktionspuffer eingesetzt, der vom Hersteller (Perkin Elmer, Norwalk, CT) zur Verfügung gestellt worden war. Die Reaktionsbedingungen waren 12 Min. bei 95°C, gefolgt von 35 Zyklen von 95°C für 30 Sek., 60°C für 30 Sek. und 72°C für 1 Mm. 30 Sek., mit etwa 10 ng Leber-cDNA pro 20-μl-Reaktion. Die Primärreaktionen wurden 20fach in Wasser verdünnt und ein zweiter PCR-Durchgang unter Verwendung von Primer Gp 1f in Kombination mit etweder 474r oder 521r wurde durchgeführt. Die Produkte wurden auf einem 2%igen Agarosegel analysiert und Banden von etwa 220 bis 400 bp wurden in pCR 2.1 subkloniert (Invitrogen, Carlsbad, CA) und mittels DNA-Sequenzanalyse analysiert. Der offene Leserahmen, der in der Isoform 4 vorliegt, ist der gleiche wie für die Isoform 2 oben beschrieben (11(b)).
Mikrosatelliten-Freisetzung
Eine "Vectorette"-Bank wurde aus jedem Klon hergestellt durch Spalten eines jeden Klons und Ligierung mit einem speziellen "Bubble"-Linker (Munroe, D. J. (1994), Genomics 19: 506). Eine PCR wurde zwischen einem Primer (Not 1-A), der für den Linker spezifisch war, und einem Repeat-Motiv (AC) 11N (wobei N nicht A ist) bei einer Verschmelzungstemperatur von 65°C durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden gelgereinigt und unter Verwendung des ABI PRISM-Farbstoffterminatorzyklus-Sequenzierungskits wie bereits beschrieben sequenziert. Von dieser Sequenz wurde ein Primer konstruiert, welcher bei einer PCR mit dem Not 1-A-Primer eingesetzt wurde. Dieser wurde ebenfalls sequenziert und ein zweiter PCR-Primer so konstruiert (Tabelle 8), dass beide Primer das Repeat-Motiv flankierten, und diese für die Genotypenbestimmung verwendet.
Mutations-Scanning
Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) wurden bei Typ 1-Diabetes-Patienten unter Verwendung eines Sequenzierungsscanning-Ansatzes identifiziert (Tabelle 5).
Primer wurden konstruiert, um spezifisch genomische Fragmente von etwa 500 bis 800 bp Länge, die spezielle Regionen von Interesse enthielten (d.h. Regionen, welche LRP5-Exons, vorher identifizierte SNPs oder mit GRAIL vorausgesagte Exons enthielten), zu amplifizieren. Zur Erleichterung der Fluoreszenzfarbstoff-Primersequenzierung wurden Vorwärts- und Rückwärts-Primerpaare mit Sequenzen am Ende versehen, welche dem M13-Universalprimer (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3') bzw. einem modifizierten M13-Rückwärtsprimer (5'-GCTATGACCATGATTACGCC-3') entsprachen. PCR-Produkte, die unter Verwendung der oben genannten Primersets gebildet worden waren, wurden in 50-μl-Reaktionen amplifiziert, die aus Perkin-Elmer 10 × PCR-Puffer, 200 mM dNTPs, 0,5 μl Taq Gold (Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA), 50 ng Patienten-DNA und 20 pmol/ml von Vorwärts- und Rückwärts-Primern bestanden. Die Zyklisierungsbedingungen waren 95°C für 12 Min., 35 Zyklen von 95°C für 30 Sek., 57°C für 30 Sek. und 68°C für 2 Min., gefolgt von einer Verlängerung von 72°C für 6 Min. und einem Halt bei 4°C.
Die Bedingungen wurden so optimiert, dass nur einzelne DNA-Fragmente mit dieser Reaktion hergestellt wurden, Die PCR-Produkte wurden dann für die Sequenzierung unter Verwendung von QiaQuick-Streifen oder QiaQuick-96-Mulden-Platten auf dem Quiagen-Roboter (Qiagen Inc., Santa Clarita, CA) gereinigt. Dieser Reinigungsschritt entfernt die nicht inkorporierten Primer und Nukleotide.
Eine direkte "BODIPY"-Farbstoffprimerzyklus-Sequenzierung war das verwendete Verfahren zur Analyse der PCR-Produkte (Metzker et al. (1996), Science 271: 1420–1422). Ein Tecan-Roboter (Tecan, Research Triangle Park, NC) führte die Sequenzierungsreaktionen unter Anwendung von Standard-Farbstoffprimer-Sequenzierungsprotokollen (ABI Dye Primer Cycle Sequencing with AmpliTaq DNA Polymerase FS, Perkin-Elmer Corp., Foster City, CA) durch. Die Reaktionen wurden unter Anwendung der folgenden Zyklisierungsbedingungen mit einem DNA-Engine-Thermocycler (M. J. Research Inc., Watertown, MA) durchgeführt: 15 Zyklen von 95°C für 4 Sek., 55°C für 10 Sek. und 70°C für 60 Sek., gefolgt von 15 Zyklen von 95°C für 4 Sek. und 70°C für 60 Sek. Nach der Zyklisierung wurden die Proben vereinigt, präzipitiert und getrocknet. Die Proben wurden in 3 μl Auftragspuffer resuspendiert und 2 ml wurden auf einem automatischen ABI 377-DNA-Sequenzierer laufengelassen.
Nachdem SNPs identifiziert worden waren, wurden Scanning-Techniken eingesetzt, um deren Informationskapazität als Marker zur Unterstützung der Feststellung einer Assoziation des Gens mit einer Krankheit bei den Typ 1-Diabetes-Familien festzustellen. Wir verwendeten Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLPs), um SNPs zu ermitteln, welche eine Restriktionsendonukleasestelle verändern. Ferner verwendeten wir eine forcierte RFLP-PCR (Li und Hood (1995), Genomics 26: 199–206; Haliassos et al. (1989), Nuc. Acids Res. 17: 3608) und ARMS (Gibbs et al. (1989), Nuc. Acids Res. 17: 2437–2448; Wu et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 2757–2760), um SNPs zu ermitteln, welche keine Restriktionsendonukleasestelle verändern. Wir versuchten auch, größere Regionen des Locus durch die Entwicklung fluoreszenz-basierter Assays mit Cleavase (CFLP) (Life Technologies, Gaithersburg, MD) und Resolvase (Avitech Diagnostics, Malvern, PA) zu scannen.
Haplotyp-Analyse bei IDDM4
Haplotypen-Kartierung (oder "Identität-nach-Abstammung"-Kartierung) wurde in Verbindung mit Assoziationskartierung verwendet, um Regionen von Identität-durch-Abstammung (IBD) in Founder-Populationen zu identifizieren, wo (einige) betroffene Individuen in einer Founder-Population nicht nur die Mutation gemeinsam haben, sondern auch einen ziemlich großen genomischen Haplotyp (somit ein identisches DNA-Stück), welcher den Krankheitslocus umgibt. Rekombinante Haplotypen können dazu verwendet werden, die Region einzugrenzen, welche die Mutation enthält. Diese Verfahren wurden dazu verwendet, um die Gene der rezessiven Erkrankungen: Wilson-Krankheit, Gatten-Krankheit, Hirschsprung-Krankheit und erbliche Hämochromatose (Tanzi, R., et al. (1993), Nature Genet. 5: 344–350; The International Gatten Disease Consortium (1995), Cell 82: 949–957; Puffenberger, E., et al. (1994), Hum. Mol. Genet. 3: 1217–1225, und Feder, J., et al. (1996), Nature Genet. 13: 399–408) zu kartieren. Gleichermaßen identifizierte bei Typ 1-Diabetes eine vergleichende MHC-Haplotypenkartierung für IDDM1 zwischen bestimmten Kaukasiern und Haplotypen afrikanischen Ursprungs sowohl HLA-DQA1 als auch HLA-DQB1 als Suszeptibilitätsloci für diese Erkrankung (Todd, J., et al. (1989), Nature 338: 587–589, und Todd, J., et al. (1987), Nature 329: 599–604).
Auf dem Chromosom 11q13 wurde eine Haplotyp-Analyse in Verbindung mit einer Assoziationsanalyse durchgeführt, um Regionen von IBD zwischen Haplotypen zu identifizieren, welche öfter als erwartet übertragen werden und somit ein suszeptibles Allel am ätiologischen Locus enthalten; im Gegensatz dazu werden schützende Haplotypen weniger oft als erwartet übertragen werden und enthalten ein unterschiedliches (schützendes) Allel am ätiologischen Locus. Belege für eine Abweichung von der erwarteten Übertragung von Allelen wurde mit den beiden polymorphen Markern D11S1917 und H0570POLYA gezeigt. Bei 2042 Typ 1-Diabetes-Familien aus dem Vereinigten Königreich, den USA, Norwegen, Sardinien, Rumänien, Finnland, Italien und Dänemark war die Übertragung des D11S1917-H0570POLYA-Haplotyps 3-2 auf betroffene Nachkommen negativ (46%), mit einem 2 × 2- Test der Heterogenität zwischen betroffenen und nicht-betroffenen Übertragungen ergab sich chi² = 23, df = 1, p < 1,5 × 10^-6, was gute Belege liefert, dass dies ein schützender Haplotyp ist. Im Gegensatz dazu wurde der 2-3-Haplotyp mehr auf betroffene als nicht betroffene Nachkommen übertragen (% T = 51,3; 2 × 2 Kontingenztest; chi² = 5,5, df = 1, p < 0,02), was anzeigt, dass dies ein suszeptibles (oder möglicherweise neutrales) Chromosom war. Ein weiterer Haplotyp, der selten ist, wurde identifiziert, welcher suszeptibel für Typ 1-Diabetes zu sein scheint (D11S1917-H0570POLYA, 3-3,% T betroffen = 62,4, 2 × 2 Kontingenztest, Betroffene vs. Nicht-Betroffene; chi² = 6,7, df = 1, p < 0,009). Deswegen ergab eine Analyse der Assoziation in dieser Region Belege für einen Haplotyp, der ein schützendes Allel gegen Typ 1-Diabetes enthält, da es im Vergleich zu den nicht betroffenen Nachkommen signifikant weniger auf die betroffenen Nachkommen übertragen wird, und Belege für zwei nicht-schützende Haplotypen, welche eine neutrale oder suszeptible Wirkung auf Typ 1-Diabetes haben.
Die Erweiterung dieser Haplotyp-Analyse, um die 14 flankierenden Mikrosatellitenmarker 255ca5, D11S987, 255ca6, 255ca3, D11S1296, E0864CA, TAA, L3001CA, D11S1337, 14LCA5, D11S4178, D11S970, 14LCA1, 18018 sowie die Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) 58-1, Exon E (intronisch, 8 bp 3' von Exon 6) und Exon R (Ala¹³³⁰, Exon 18) (19) einzuschließen, offenbarte hoch konservierte Haplotypen innerhalb dieses Intervalls bei den diabetischen Individuen. Ein deutlich schützender Haplotyp (A) wurde identifiziert (umfassend den 3-2-Haplotyp bei D11S1917-H0570POLYA) sowie ein deutlich suszeptibler Haplotyp (B) (umfassend den 2-3-Haplotyp bei D11S1917-H0570POLYA). Der suszeptible Haplotyp ist IBD mit dem schützenden Haplotyp 3' des Markers D11S1337, was anzeigt, dass die ätiologische Variante, die eine Rolle bei Typ 1-Diabetes spielt, nicht in der identischen Region liegt, und sie 5' von Exon E des LRP5-Gens lokalisiert. Diese Region, welche IBD bei den schützenden und suszeptiblen Haplotypen ist, verhindert die Durchführung einer Assoziationsanalyse, da keine Abweichung der Übertragung auf betroffene Nachkommen nachgewiesen werden würde. Der seltene suszeptible Haplotyp (C), 3-3 bei D11S1917-H0570POLYA, kann ebenfalls identifiziert werden. Eine Haplotyp-Analyse mit den zusätzlichen Markern in der Region offenbart, dass dieser seltene suszeptible Haplotyp identisch ist mit dem suszeptiblen Haplotyp zwischen UT5620 und 14L15CA, was die ätiologische Variante möglicherweise zwischen UT5620 und Exon E lokalisiert, welches etwa 100 kb ausmacht. Deshalb können die suszeptiblen und seltenen suszeptiblen Haplotypen ein Allel (oder separate Allele) tragen, welche(s) eine suszeptible Wirkung für Typ 1-Diabetes verleiht/en, wohingegen der schützende Haplotyp ein schützendes Allel gegen IDDM enthält.
Die 5'-Region des LRP5-Gens liegt innerhalb dieses Intervalls und umfasst die 5'-regulatorischen Regionen des LRP5-Gens und der Exons 1 bis 6.
Eine Analyse der italienischen und sardischen Haplotypen offenbarte zwei zusätzliche suszeptible Haplotypen. Bei D11S1917-H0570POLYA in den italienischen Familien war der Haplotyp 1-3, 63% T, 2 × 2 Betroffene vs. Nicht-Betroffene, p = 0,03 (Haplotyp D). Bei H0570POLYA-L3001 in den sardischen Familien war der Haplotyp 1-2, 58% T, 2 × 2 Betroffene vs. Nicht-Betroffene, p = 0,05 (Haplotyp E).
Proben, welche die obigen fünf Haplotypen enthielten, wurden mit SNPs von der IDDM4-Region genotypisiert, um Regionen von IBD zu untersuchen (Figur B). Diese SNPs bestätigten die Region von IBD bei den suszeptiblen Haplotypen B und C zwischen UT5620 und 14L15CA. Es wurde auch die Region von IBD bei den schützenden und suszeptiblen Haplotypen A und B 3' des Markers D11S1337 bestätigt, was diese Region davon ausschließt, die ätiologische Variante zu enthalten. Die SNP-Analyse offenbarte auch eine potentielle IBD-Region zwischen UT5620 und TAA bei den suszeptiblen Haplotypen B, C, D und E, welche sich von dem schützenden Haplotyp A unterscheidet (eine 25-kb-Region). Der Marker H0570POLYA liegt innerhalb dieses Intervalls und ist beim Haplotyp E im Vergleich zu den anderen suszeptiblen Haplotypen nicht identisch; möglicherweise ist dies auf eine Mutation an diesem Polymorphismus zurückzuführen oder es zeigt eine Grenze innerhalb dieser Region, und die ätiologische Variante ist entweder 5' oder 3' dieses Markers. Eine weitere Analyse zusätzlicher SNPs innerhalb dieses Intervalls wird erforderlich sein.
Deshalb identifizierte eine Haplotypen-Kartierung innerhalb der IDDM4-Region eine Region von IBD bei den suszeptiblen Haplotypen B und C von 100 kb in der 5'-Region des LRP5-Gens. Eine SNP-Haplotypen-Kartierung grenzte dies möglicherweise weiter ein auf ein 25-kb-Intervall, umfassend die 5'-Region von LRP5, welche mögliche regulatorische Sequenzen für dieses Gen einschließt, einen mutmaßlichen Promotor und Regionen von Homologie mit der syntenen Maus-Region (Tabelle 12) sowie Exon 1 von LRP5.
Konstruktion von Adenovirus-Vektoren, die LRP5 enthalten
Das Volllängen-Human-LRP5-Gen wurde in den Adenovirus-Transfervektor pde1E1sp1A-CMV-bGHPA, enthaltend den "Immediate early"-Promotor des Human-Cytomegalovirus und das Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignal, kloniert, um pdehlrp3 zu bilden. Dieser Vektor wurde zur Konstruktion eines Adenovirus verwendet, welcher das LRP5-Gen in die E1-Region des Virus in Richtung des 5'-ITR inseriert enthält. Um eine cDNA dieser Länge aufzunehmen, wurde die E3-Region vollständig aus dem Virus deletiert, wie für pBHG10 (Bett et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8802–8806) beschrieben. Eine identische Strategie wurde zur Konstruktion eines Adenovirus-Vektors verwendet, der das Volllängen-Maus-Lrp5-Gen enthält.
Eine lösliche Version von Maus-Lrp5 wurde konstruiert, worin ein His-Tag und ein translationales Stopcodon die mutmaßliche transmembran-überspannende Domäne ersetzte (Primer in Tabelle 9 aufgelistet). Dies sollte zur Sekretion der extrazellulären Domäne von Lrp5 führen und die biochemische Charakterisierung der mutmaßlichen ligandenbindenden Domäne von Lrp5 erleichtern. Gleichermaßen kann eine lösliche Version von Human-LRP5 unter Verwendung der in Tabelle 9 gezeigten Primer konstruiert werden. Die extrazelluläre Domäne reicht bis Aminosäure 1385 der (unreifen) Vorläufer-Proteinsequenz.
Identifizierung von LRP5-Liganden
LRP5 demonstriert das Vermögen zur Bindung und Aufnahme von LDL (siehe unten), diese Aktivität befindet sich jedoch nicht auf einem hohen Niveau. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass LRP5 das Vermögen zur Bindung eines zusätzlichen Liganden oder zusätzlicher Liganden besitzt. Zur Identifizierung von LRP5-Liganden wird die extrazelluläre Domäne, bestehend aus den ersten 1399 Aminosäuren von Human-LRP5, oder die entsprechende Region von Maus-Lrp5 gereinigt werden. Eine Anzahl von Expressionssystemen kann eingesetzt werden, einschließlich plasmid-basierter Systeme in Drosophila-S2-Zellen, Hefe und E. coli und Systeme auf viraler Basis in Säugerzellen und SF9-Insektenzellen. Ein Histidin-Tag wird dazu verwendet werden, um LRP5 auf einer Nickel-Säule (Novagen, Madison, WI) zu reinigen. Eine Vielfalt von Harzen kann bei der Säulenchromatographie eingesetzt werden, um lösliches LRP5 weiter anzureichern. LRP5 wird an einem festen Träger, z.B. eine Nickel-Säule, gebunden werden. Lösungen, die Liganden aus Serumfraktionen, Urinfraktionen oder Fraktionen aus Gewebeextrakten enthalten, werden über der LRP5-Säule fraktioniert werden. LRP5, komplexiert mit gebundenem Liganden, wird von der Nickel-Säule mit Imidizol eluiert werden. Die Art des/der Liganden, der/die an LRP5 gebunden hat/haben, wird durch Gelelektrophorese, Aminosäuresequenz, Aminosäurezusammensetzung, Gaschromatographie und Massenspektrophotometrie bestimmt werden.
Die Bindung von gereinigtem LRP5 an einen BiaCore 2000-Chip (BiaCore, Uppsala, Schweden) wird dazu verwendet werden, um festzustellen, ob Liganden, die an LRP5 binden, in Testlösungen vorliegen. Nachdem Liganden für LRP5 identifiziert sind, wird der LRP5-Chip zur Charakterisierung der Kinetik der LRP5-Ligandenwechselwirkung verwendet werden.
Adenovirus-Vektoren, enthaltend lösliche Versionen von LRP5, werden zur Infizierung von Tieren verwendet werden, die Isolierung von Liganden/LRP5-Komplexen aus Serum oder Leberextrakten wird durch die Verwendung eines Histidin-Tags und gegen diesen Teil von LRP5 gerichtete Antikörper erleichtert werden.
Behandlung von Tieren mit LRP5-Virus
Ein breites Spektrum an Spezies kann mit Adenovirus-Vektoren behandelt werden, die ein Transgen tragen. Mäuse sind die bevorzugten Spezies zur Durchführung von Experimenten, aufgrund der Verfügbarkeit einer Anzahl genetisch veränderter Stämme von Mäusen, d.h. "Knockout"-Mäuse, transgene Mäuse und Inzuchtmäuse. Jedoch können größere Tiere, z.B. Ratten oder Kaninchen, geeignetenfalls verwendet werden. Ein bevorzugtes Tiermodell zum Testen des Vermögens von LRP5 zur Modifizierung der Entwicklung von Typ 1-Diabetes ist die nicht-obese diabetische Maus (NOD). Bevorzugte Tiermodelle zur Untersuchung einer potentiellen Rolle für LRP5 im Lipoprotein-Metabolismus sind Mäuse, bei denen Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie unterbrochen wurden, z.B. der LDL-Rezeptor (LDLR), oder bei denen Gene, die am Lipoprotein-Metabolismus beteiligt sind, z.B. Apo-E, unterbrochen wurden.
Adenoviren werden verabreicht, indem etwa 1 × 10⁹ Plaque-bildende Einheiten in die Schwanzvene einer Maus injiziert werden. Auf Grundlage von früheren Studien führt diese Form der Behandlung zur Infektion von Hepatozyten mit einer relativ hohen Häufigkeit. Drei verschiedene Adenovirus-Behandlungen wurden vorbereitet, 1) Adenovirus, das kein Insert enthält (negative Kontrolle), 2) Adenovirus, enthaltend Human-LDLR (positive Kontrolle), oder 3) Adenovirus, enthaltend Human-LRP5. Jedes dieser Viren wurden dazu eingesetzt, um fünf C57-Wildtyp- und fünf C57-LDLR-"Knockout"-Mäuse zu infizieren. Eine Blutentnahme vor der Behandlung, 8 Tage vor der Injektion des Virus, wurde dazu verwendet, um die Serumchemie-Werte vor der Behandlung zu untersuchen. Den Tieren wurde Virus injiziert. Am Tag fünf nach der Verabreichung des Virus wurde eine zweite (Behandlungs-) Blutentnahme vorgenommen und die Tiere für die Gewinnung von Serum für die Lipoprotein-Fraktion euthanasiert. Darüber hinaus wurden Gewebe für die in situ-Analyse, Immunhistochemie und Histopathologie gewonnen.
Während des Experiments wurden die Tiere in einem Hell/Dunkel-Standardzyklus gehalten und erhielten eine regelmäßige Futterdiät. Die Tiere wurden vor der Serumgewinnung hungern gelassen. Bei bestimmten Versuchsbedingungen kann es wünschenswert sein, den Tieren eine Diät mit hohem Fett zu geben.
Klinische Serumchemie-Standardassays wurden durchgeführt, um zu bestimmen: Serumtriglyceride, Gesamtcholesterin, alkalische Phosphatase, Aspartataminotransferase, Alaninaminotransferase, Harnstoff-Stickstoff und Kreatinin. Eine Hämatologie wurde durchgeführt, um die Niveaus von zirkulierenden Leukozyten, Neutrophilen, den Prozentsatz an Lymphozyten, Monozyten und Eosinophilen, Erythrozyten, Blutblättchen, Hämoglobin und den Hämatokrit-Prozentwert zu untersuchen.
Serumlipoproteine wurden unter Verwendung einer Superose 6 FPLC-Klassifizierungssäule und kleineren Modifizierungen des von Gerdes et al. (Clin. Chim. Acta 205: 1–9 (1992)) beschriebenen Verfahrens in Größenklassen fraktioniert, wobei der signifikanteste Unterschied von dem Gerdes-Verfahren darin lag, dass nur eine Säule verwendet wurde. Säulenfraktionen wurden gewonnen und hinsichtlich Cholesterin und Triglyceriden analysiert. Die "Fläche unter der Kurve" wurde für jede Lipoprotein-Klasse berechnet. Die ungefähren Peakfraktionen, welche jeder der durch Dichte definierten Klassen entsprachen, sind: Fraktion 24 für VLDL, Fraktion 36 für LDL und Fraktion 51 für HDL.
LRP5-Überexpression beeinflusst die Serumtriglyceride und Lipoproteine
Eine statistische Analyse der Serumchemie-Daten zeigte an, dass im Vergleich zum Kontrollvirus eine 30%ige Abnahme, p-Wert = 0,025, der Triglyceridspiegel in Tieren vorlag, die mit LRP5-enthaltendem Virus behandelt worden waren (Tabelle 10). Diese Abnahme der Triglyceride geschah auf einem ähnlichen Niveau sowohl bei Wildtyp- als auch KO-Mäusen. Im Vergleich dazu verringerte das LDLR-Virus die Serumtriglyceride etwa um 55% im Vergleich zum Kontrollvirus. Dieses Ergebnis zeigt an, dass LRP5 das Potential zur Modulierung der Serumtriglyceridspiegel aufweist.
Das Serumlipoprotein-Profil zeigte an, dass die VLDL-Partikelklasse bei Wildtyp-Mäusen, die mit LRP5-Virus behandelt worden waren, verringert war. Obwohl die Anzahl der analysierten Proben nicht ausreichend für statistische Analysen war, steht dieses Ergebnis in Einklang mit der beobachteten Abnahme der Serumtriglyceride. Diese Ergebnisse legen nahe, dass LRP5 das Potential zur Bindung und Internalisierung von lipidreichen Partikeln hat, was die Abnahme an Serumtriglyceriden und VLDL-Partikeln veranlasst. Deshalb könnte eine Behand lung mit LRP5 oder mit therapeutischen Mitteln, welche die Expression von LRP5 oder die biologische Aktivität von LRP5 erhöhen, von Nutzen sein, um bei Patienten mit Krankheiten, welche die Triglyceridniveaus erhöhen, wie z.B. Typ 2-Diabetes und Adipositas, lipidreiche Partikel und Triglyceride herabzusetzen.
Obwohl nicht statistisch signifikant, gab es einen beobachteten Trend hinsichtlich einer Verringerung der Serumcholesterinspiegel als Folge der LRP5-Behandlung (28%, p = 0,073) bei Mäusen mit einem hohen Serumcholesterinspiegel (etwa 220 mg/dl) aufgrund einer Unterbrechung (Knockout) des LDL-Rezeptors (Tabelle 10). Ein gegenteiliger Trend, dass die LRP5-Behandlung Serumcholesterin erhöhte (30%, p = 0,08), wurde nicht bei Wildtyp-Mäusen beobachtet, die ein relativ niedriges Niveau an Serumcholesterin (etwa 70 mg/dl) aufweisen. Die kleinen Behandlungsgruppen, n = 4, in diesen Datensätzen beschränken die Interpretation dieser Ergebnisse und weisen darauf hin, dass weitere Experimente erforderlich sind. Nichtsdestoweniger legen diese Ergebnisse nahe, dass bei einem Zustand von erhöhtem Cholesterin eine Erhöhung der LRP5-Aktivität die Serumcholesterinspiegel verringern könnte. Somit könnte eine Behandlung mit LRP5 oder mit therapeutischen Agenzien, welche entweder die Expression von LRP5 oder die biologische Aktivität von LRP5 erhöhen, bei der Verringerung von Cholesterin in Patienten mit Hypercholesterinämie von Nutzen sein.
LRP5-Überexpression könnte die Serumspiegel von alkalischer Phosphatase beeinflussen
Die Serumspiegel von alkalischer Phosphatase können als Folge einer Obstruktion des Gallentrakts dramatisch erhöht sein, z.B. 20fache Erhöhung (Jaffe, M. S., und McVan, B., 1997, Davis's laboratory and diagnostic test handbook, Pub. F. A. Davis Philadelphia, PA). Jedoch können niedrigere Spiegel, bis zu einer dreifachen Erhöhung der alkalischen Phosphatase, das Ergebnis der entzündlichen Reaktion sein, welche als Antwort auf ein infektiöses Agens, z.B. Adenovirus, in der Leber stattfindet. Bei Tieren, die mit einem Kontrollvirus behandelt worden waren, gab es eine etwa zweifache Erhöhung der Spiegel alkalischer Phosphatase. Im Gegensatz dazu gab es nur eine leichte Erhöhung der Spiegel alkalischer Phosphatase bei Tieren, die mit dem LRP5-Virus behandelt worden waren. Im Vergleich zur Kontrolle war der Spiegel alkalischer Phosphatase um 49% in den LRP5-behandelten Tieren verringert, p-Wert = 0,001 (Tabelle 10).
Die Erhöhung der Niveaus alkalischer Phosphatase könnte eine Folge des Infektionsniveaus mit dem Adenovirus sein, deshalb könnte eine mögliche Erklärung für die Abnahme bei den mit dem LRP5-Virus behandelten Tieren einfach darin bestehen, dass es weniger Virus in dieser Behandlungsgruppe gab. Ein Indikator des Niveaus der Virusinfektion ist das Auftreten der Leberenzyme Aspartataminotransferase und Alaninaminotransferase im Serum. Diese Enzyme werden normalerweise im Zytoplasma von Zellen gefunden und sind im Serum erhöht, wenn eine Zellschädigung eintritt (Jaffe, M. S., und McVan, B., 1997, Davis's laboratory and diagnostic test handbook, Pub. F. A. Davis, Philadelphia, PA). Deshalb dienen diese Enzyme als Marker für das Toxizitätsniveau, welches eine Folge der adenoviralen Infektion ist. Diese Enzyme liegen vor der Infektion und in Tieren, welche das Virus nicht erhalten haben, in einem normal niedrigen Niveau vor. Es ist von Bedeutung, dass die Niveaus an Aspartataminotransferase und Alaninaminotransferase in den Tieren, denen das LRP5-Virus gegeben wurde, höher sind, was anzeigt, dass diese Tiere mehr zelluläre Schädigung und somit eine umfangreichere Infektion aufweisen als die Tiere, denen das Kontrollvirus gegeben wurde (Tabelle 11). Deshalb ist es unwahrscheinlich, dass das verringerte Niveau von alkalischer Phosphatase einfach darauf zurückzuführen ist, dass weniger LRP5-Virus verabreicht wurde. Eine zweite mögliche Erklärung ist, dass LRP5 die Art der Entzündungsreaktion modifiziert, die das Ergebnis der Adenovirus-Infektion ist. Eine mögliche Rolle für LRP5 bei der Modulation der Entzündungsreaktion steht in Einklang mit den genetischen Daten, welche anzeigen, dass dieses Gen mit einem Risiko zur Entwicklung von Typ 1-Diabetes assoziiert ist. Chronische Insulitis oder Entzündung ist ein Vorläufer des klinischen Ausbruchs von Typ 1-Diabetes, deshalb könnte eine LRP5-Behandlung oder Behandlung mit therapeutischen Mitteln, welche die Transkription von LRP5 erhöhen, bei der Verhütung von Typ 1-Diabetes von Nutzen sein. Typ 1-Diabetes ist eine Autoimmunerkrankung, deshalb könnte eine Behandlung mit LRP5 oder mit therapeutischen Mitteln, welche jeweils die Expression von LRP5 oder die biologische Aktivität von LRP5 erhöhen, bei der Behandlung anderer Autoimmunerkrankungen von Nutzen sein.
Expression von LRP5 in Zelllinien
Eine Überexpression von LRP5 unter der Kontrolle eines heterologen Promotors kann entweder durch Infektion mit einem Adenovirus, das LRP5 enthält, oder durch Transfektion mit einem Plasmidvektor, der LRP5 enthält, erreicht werden. Die Transfektion mit einem Plasmidvektor kann zu entweder transienter oder stabiler Expression des Transgens führen.
Endogene LDL-Rezeptoren verringern das Vermögen zum Nachweis der Aufnahme von LDL durch andere Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie. Zur Untersuchung der Lipoprotein-Aufnahme in Abwesenheit des LDL-Rezeptors wurden primäre Zelllinien aus humanen Patienten mit familiärer Hypercholesterinämie (FH) verwendet. Diesen FH-Zelllinien fehlt jeglicher endogener LDL-Rezeptor. FH-Fibroblasten wurden mit einer MOI von 500 plaquebildenden Einheiten pro Zelle 24 h lang bei 37°C infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen mit 40 μg/ml ²⁵I-LDL bei 37°C inkubiert. Nach 4 h wurden die Zellen gewaschen und die Aufnahme von LDL gemessen. Eine mäßige (etwa 60%ige) Erhöhung im Niveau der LDL-Aufnahme wurde beobachtet. Im Vergleich dazu führte die Infektion von FH-Zellen mit einem Adenovirus, das den LDL-Rezeptor enthielt, zu einer 20fachen Erhöhung der LDL-Aufnahme (p < 0,0001, n = 3). Zur Feststellung, ob dieses mäßige Niveau an Aktivität, das durch LRP5 vermittelt wurde, statistisch signifikant war, wurden 24 individuelle Mulden mit LRP5-Virus infiziert und analysiert. Eine statistische Analyse dieses Experiments zeigte, dass die Zunahme der LDL-Aufnahme hoch signifikant war, p < 0,0001. Deshalb kann LRP5 die LDL-Aufnahme vermitteln. Jedoch scheint es auf Grundlage des mäßigen Aktivitätsniveaus in Bezug auf den LDL-Rezeptor nicht so, dass die primäre Aktivität von LRP5 die Vermittlung der LDL-Aufnahme ist.
Es gibt zusätzliche weitere Zelllinien, denen entweder der LDL-Rezeptor oder andere Mitglieder der LDL-Rezeptorfamilie fehlen. Der PEA-13-Zelllinie (ATCC 2216-CRL) fehlt der LRP1-Rezeptor. Mutanten-CHO-Zellen, denen der LDL-Rezeptor fehlt, wurden von Kingsley und Krieger (Proceedings National Academy Sciences USA (1984), 81: 5454) beschrieben. Diese Zelllinie, bekannt als ldlA₇, ist besonders nützlich zur Schaffung stabiler transfizierter Zelllinien, die rekombinantes LRP5 exprimieren.
Anti-LRP5-Antikörper
Westernblot-Analyse
Antiseren, hergestellt in Kaninchen, die mit den Human-LRP5-MAP-Peptiden
SYFHLFPPPPSPCTDSS
VDGRQNIKRAKDDGT
EVLFTTGLIRPVALVVDN
IQGHLDFVMDILVFHS
immunisiert worden waren, wurden mittels Westernblot-Analyse untersucht.
COS-Zellen wurden mit einem Adenovirus infiziert, das Human-LRP5-cDNA enthielt. Drei Tage nach der Infektion wurden die Zellen geerntet durch Abschaben in phosphatgepufferte Salzlösung (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), welche die Proteaseinhibitoren PMSF (100 μg/ml), Aprotinin (2 μg/ml) und Pepstatin A (1 μg/ml) enthielt. Die Zellen wurden durch eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit pelletiert, in phosphatgepufferter Salzlösung, die Proteaseinhibitoren enthielt, resuspendiert und mittels Dounce-Homogenisierung lysiert. Die Kerne wurden durch eine Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit, 1000 UpM für fünf Minuten in einem Beckman J-9-Rotor, entfernt. Der Überstand wurde gewonnen und mit hoher Geschwindigkeit, 100.000 × g für 3 h, zentrifugiert, um die Membranen zu pelletieren. Die Membranen wurden in SDS-Probenpuffer (Novex, San Diego, CA) resuspendiert.
Membranproteine wurden durch Elektrophorese auf einem 10%igen Tris-Glycin-Acrylamidgel (Novex, San Diego, CA) fraktioniert. Die fraktionierten Proteine wurden auf PVDF-Papier (Novex, San Diego, CA) nach den Instruktionen des Herstellers überführt. Eine Standard-Westernblot-Analyse wurde auf der Membran durchgeführt, wobei der primäre Antikörper eine 1:200-Verdünnung von rohen Antiseren war und der sekundäre Antikörper eine 1:3000-Verdünnung von Antikaninchen-IgG-HRP-Konjugat (Amersham, Arlington Heights, IL). ECL-Reagenzien (Amersham, Arlington Heights, IL) wurden dazu verwendet, um Proteine sichtbar zu machen, die von den in den Seren vorliegenden Antikörpern erkannt wurden.
Eine Bande von etwa 170–180 kD wurde durch Seren von einem Kaninchen, das mit dem Peptid SYFHLFPPPPSPCTDSS immunisiert worden war, nachgewiesen. Diese Bande wurde nur in den Zellen nachgewiesen, die mit dem Adenovirus infiziert waren, welches Human-LRP5 enthielt, und lagen nicht in Zellen vor, die mit einem Kontrollvirus infiziert waren. Ferner wurde der Nachweis dieser 170-kD-Bande blockiert durch Voradsorption einer 1:500-Verdünnung der Seren mit 0,1 μg/ml des Peptids SYFHLFPPPPSPCTDSS, jedoch nicht mit 0,1 μg/ml des Peptids VDGRQNIKRAKDDGT. Deshalb ist diese Proteinbande von etwa 170 kD, die mit dem gegen das Peptid SYFHLFPPPPSPCTDSS gerichteten Antikörper nachgewiesen wurde, humanes LRP5. Die vorausgesagte Größe des reifen Human-LRP5-Proteins beträgt 176 kD.
Das Antiserum von einem Kaninchen, das mit dem Peptid SYFHLFPPPPSPCTDSS immunisiert worden war, wurde mit einer Affigel 10-Säule (BioRad, Hercules, CA), an die das MAP-Peptid SYFHLFPPPPSPCTDSS kovalent angebunden war, affinitätsgereinigt. Dies führt zu Antiseren mit einer größeren Spezifität für LRP5.
Das Antiserum aus einem Kaninchen, das mit dem Peptid IQGHLDFVMDILVFHS immunisiert wurde, ist in der Lage, eine Bande von etwa 170 kD nachzuweisen, die in Zellen vorliegt, welche mit einem LRP5-enthaltenden Virus infiziert wurden, nicht jedoch in Zellen, die mit einem Kontrollvirus infiziert wurden. Dieser Antikörper erkennt ein Peptid, das in der mutmaßlichen extrazellulären Domäne von LRP5 vorliegt, und wird somit beim Nachweis der löslichen Version von LRP5 von Nutzen sein. Jedoch wird bei Verwendung dieses Antiserums im Vergleich zu dem aus dem Kaninchen, welches mit dem Peptid SYFHLFPPPPSPCTDSS immunisiert wurde, ein größerer Hintergrund beobachtet.
LRP5 wird in Gewebe-Makrophagen exprimiert
Das rohe und affinitätsgereinigte Antiserum gegen das LRP5-Peptid SYFHLFPPPPSPCTDSS wurde für Immunzytochemie-Studien in Humanleber verwendet. Der Antikörper erkannte Gewebe-Makrophagen, bezeichnet als Kupfer-Zellen in der Leber, welche eine positive Anfärbung für LRP5 und positive für den Marker RFD7 (Harlan Bioproducts, Indianapolis, IN), welcher reife Gewebe-Phagozyten erkennt, und negative für einen MHC-Klasse II-Marker RFD1 (Harlan Bioproducts, Indianapolis, IN) ergaben. Dieses Färbungsmuster (RFD1–, RFD7+) identifiziert eine Subpopulation von Makrophagen, die Effektor-Phagozyten. Diese Klasse von Makrophagen wurde in Zusammenhang mit dem Krankheitsfortschritt in einem Modell von Autoimmunerkrankung gebracht, experimenteller Autoimmun-Neuritis (Jung, S., et al., 1993, J. Neurol. Sci. 119: 195–202). Die Expression in phagozytischen Gewebe-Makrophagen stützt eine Rolle für LRP5 bei der Modulation der entzündlichen Komponente in der Immunreaktion. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der postulierten Rolle, auf Basis der Unterschiede, die in den Niveaus alkalischer Phosphatase in mit LRP5-Virus behandelten Tieren beobachtet wurden, und den genetischen Daten, welche darauf hinweisen, dass LRP5 ein Diabetes-Risikogen ist.
Bestimmung zusätzlich konservierter Regionen des LRP5-Gens
Eine Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung von "Shotgun"-Banken, hergestellt aus den Maus-BAC-Klonen 131-p-15 und 53-d-8, wurde zur Identifizierung von Regionen des LRP5-Gens, die bei Maus und Mensch konserviert sind, eingesetzt. Zur Identifizierung dieser Regionen wurde die genomische Maus-DNA, entweder nicht-assemblierte Sequenzen oder assemblierte Contigs, mit einer Assemblierung von genomischer Human-DNA verglichen. Der Vergleich erfolgte unter Verwendung des BLAST-Algorithmus mit einem Ausschluss von 80%. Diese Analyse führte zur Identifizierung einer Mehrheit der Exons des LRP5-Gens und identifizierte eine Anzahl von Bereichen konservierter Sequenzen an anderen Positionen in dem Gen (Tabelle 12).
Es gibt zwischen Mensch und Maus konservierte Sequenzen, die 4,3 kb und 168 bp stromaufwärts des mutmaßlichen ATG lokalisiert sind. Diese Sequenzen könnten 5'-untranslatierte Sequenzen des mRNA-Transkripts oder Promotorelemente repräsentieren.
Innerhalb des mutmaßlichen ersten Introns von 36 kb gibt es 12 Bereiche, die einen Grad an DNA-Sequenzkonservierung aufweisen. Einige dieser Regionen, z.B. 41707–41903, sind ziemlich umfangreich und haben einen hohen Grad der Sequenzkonservierung, ähnlich dem für die Exons des LRP5-Gens beobachteten. Nachdem diese Regionen nicht transkribiert zu werden scheinen, ist es wahrscheinlich, dass diese konservierten Regionen eine Rolle bei der Regulation entweder der Transkription des LRP5-Gens oder der Prozessierung des LRP5-mRNA-Transkripts spielen. Unabhängig von der exakten Natur ihrer Rolle repräsentieren diese neu identifizierten Regionen Gebiete, wo ein Sequenzpolymorphismus die biologische Aktivität von LRP5 beeinflussen könnte.
Der BAC-Klon 131-p-15, welcher die beiden ersten Exons von LRP5 enthält, wurde eingehend sequenziert, d.h. etwa 6fache Abdeckung. Der BAC-Klon 53-d-8 enthält Sequenzen von Exon D bis Exon V, jedoch war das Niveau des Sequenzabdeckung dieser Klone nur etwa einfach (Skim-Sequenzierung). Die Skim-Sequenzierung des Maus-BAC 53-d-8 führte zum Nachweis von 76% der Exons, jedoch war in einigen Fällen nur ein Teil eines Exons in den Maussequenzdaten vorhanden. Zusätzlich zu den Exons gab es drei Bereiche in den BAC-53-d-8-Sequenzen, welche einen Grad an Sequenzkonservierung mit den humanen Sequenzen aufwiesen (Tabelle 12). Alle diese befanden sich in dem großen 20-kb-Intron zwischen den Exons D und E. Diese Sequenzen könnten Regionen repräsentieren, welche für die Prozessierung dieses großen Introns von Bedeutung sind, und somit könnten Polymorphismen in diesen Sequenzen das Expressionsniveau von LRP5 beeinflussen.
Bestimmung der relativen Haufigkeit von alternativ gespleissten LRP5-mRNA-Transkripten
Mehrere Techniken können eingesetzt werden, um die relative Häufigkeit der verschiedenen alternativ gespleissten Isoformen von LRP5 festzustellen.
Eine Northernblot-Analyse von Sonden, abgeleitet von spezifischen Transkripten, wird zur Durchmusterung von Geweben hinsichtlich der Häufigkeit eines speziellen Transkripts verwendet. Sensitivere Techniken, wie z.B. RNase-Schutz-Assays, werden eingesetzt werden. Reagenzien aus im Handel erhältlichen Kits (Ambion, Inc., Austin, TX) werden zur Herstellung von Sonden verwendet. Die relative Häufigkeit eines Transkripts, das mit einer Sonde hybridisiert, die mit [Alpha]³²P-UTP radioaktiv markiert ist, wird durch native und denaturierende Acrylamidgele (Novex Inc., San Diego, CA) analysiert. Primerverlängerungs-Assays werden nach etablierten Verfahren (Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Press, NY) unter Verwendung von reversen Primern, die vom 5'-Abschnitt des Transkripts stammen, durchgeführt.
Isolierung anderer Spezies-Homologe des LRP5-Gens
Das LRP5-Gen von verschiedenen Spezies, z.B. Ratte, Hund, wird isoliert durch Screenen einer cDNA-Bank mit Abschnitten des Gens, welche von cDNA der Spezies von Interesse unter Verwendung von PCR-Primern, die anhand der humanen LRP5-Sequenz konstruiert worden waren, erhalten wurden. Eine degenerierte PCR wird durchgeführt mittels Konstruktion von Primern von 17–20 Nukleotiden mit 32-128facher Degeneration durch Auswahl von Regionen, welche für Aminosäuren codieren, die eine geringe Codondegeneration aufweisen, z.B. Met und Trp. Bei der Selektion dieser Primer werden Regionen bevorzugt, die in dem Protein konserviert sind, z.B. die in 6(b) gezeigten Motive. PCR-Produkte werden mittels DNA-Sequenzanalyse analysiert, um deren Ähnlichkeit mit Human-LRP5 zu bestätigen. Das korrekte Produkt wird zum Screenen von cDNA-Banken durch Kolonie- oder Plaque-Hybridisierung mit hoher Stringenz verwendet. Alternativ werden Sonden, die direkt von dem Human-LRP5-Gen abgeleitet sind, dazu verwendet, um die cDNA-Sequenz von LRP5 aus verschiedenen Spezies durch Hybridisierung mit verringerter Stringenz zu isolieren. Eine cDNA-Bank wird erstellt wie oben beschrieben.
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Tabelle 1
Haplotyp-Analyse bei D11S1917(UT5620) – H0570POLYA, innerhalb von 2582 Familien aus dem Vereinigten Königreich, den USA, Norwegen und Sardinien. Suszeptible, schützende und neutrale Allele wurden bei jedem Polymorphismus identifiziert und die Übertragung rekombinanter Haplotypen auf diabetische Nachkommen wurde berechnet (t = Transmission (Übertragung), nt = keine Transmission (Nichtübertragung). Eine signifikante Übertragung des Haplotyps 332-104 wurde nachgewiesen (P = 0,005), sowie eine signifikante Nichtübertragung des Haplotyps 328-103 (P = 0,03).

D11S1917 H0570POLYA t nt P

(UT5620)

328 104 539 474

Schützend 332 103 427 521 0,002

Suszeptibel 332 104 60 33 0,005

Schützend 328 103 16 31 0,03
Tabelle 2 PCR-Primer für den Erhalt von LRP5-cDNA

Primer, die innerhalb von LRP5-cDNA lokalisiert sind: Die Primer sind nummeriert, beginnend bei Nukleotid 1 in 5(a)

Tabelle 3 Intron-Exon-Organisierung von Human-LRP5

Tabelle 4, Seite 1 von 6

Tabelle 5

LRP5-Exon-SNPs
Exon	Polymorphismus	Aminosäureänderung	Lage
Exon E	G zu A	intronisch	10 bp 3' von Exon E
Exon E	C zu T	keine	Phe³³¹, Exon E
Exon F	G zu A	intronisch	50 bp 5' von Exon F
Exon G	C zu T	keine	Phe⁵¹⁸, Exon G
Exon I	C zu T	keine	Asn⁷⁰⁹, Exon I
Exon P	C zu T	intronisch	82 bp 5' von Exon P
Exon N	C zu T	keine	Asp¹⁰⁶⁸, Exon N
Exon N	A zu G	keine	Val¹⁰⁸⁸, Exon N
Exon Q	C zu T	Ala¹²⁹⁹ zu Val	Ala¹²⁹⁹, Exon Q
Exon U	T zu C	Val¹⁴⁹⁴ zu Ala	Val¹⁴⁹⁴, Exon U

Tabelle 6 im IDDM4-Locus identifizierte SNPs

Liste von PCR-Fragmenten und verfügbaren RFLP-Stellen für die Analyse:
PCR-Produkt	SNP	Lage	Enzym
Contig 57
57-11	alt	13363	kein
57-11	a/g	13484	BstXI
57-2	a/g	14490	kein
57-2	a/g	14885	kein
57-3	c/g	18776	MaeII
57-3	t/c	18901	MspI
57-3	a/g	19313	AflII
57-4	22T/25T	20800	kein
57-5	g/a	23713	MspI

Contig 58
58-15	c/t	3015	kein
58-14	g/c	3897	PflMI
58-13	c/g	5574	EcoNI
58-12	t/g	6051	kein
58-11	a/g	8168	kein
58-10	a/g	8797	kein
58-9	g/t	9445	kein
58-9	c/t	9718	kein
58-8	Insert T	10926	PstI
58-7	t/a	11449	BstXI
58-7	t/c	11468	kein
58-6	t/c	11878	kein
58-6	g/a	12057	kein
58-6	a/g	12180	HgaI
58-5	c/t	14073	kein
58-4	a/g	15044	MaeII
58-4	t/c	15354	kein
58-3	Insert G	16325	kein
58-2	g/a	17662	kein
58-1	g/t	18439	BglII

Tabelle 7
Tabelle 8

Durch Mikrosatelliten-Freisetzung konstruierte Primer für die Genotypenbestimmung und Restriktionskartierung der IDDM4-Region auf dem Chromosom 11q13. Die anderen verwendeten Primer sind veröffentlicht und befinden sich auch in der Genom-Ddatenbank.

255CA3F	GCCGAGAATTGTCATCTTAACT
255CA3R	GGATTGAAAGCTGCAAACTACA
255CA5F	GGAGCCACCACATCCAGTTA
255CA5R	TGGAGGGATTGCTTGAGG
255CA6F	AGGTGTACACCACCATGCCT
255CA6R	TGGTGCCAATTATTGCTGC
14LCA5F	AGATCTTATACACATGTGCGCG
14LCA5R	AGGTGACATCACTTACAGCGG
L15CA1F	ATTACCCAGGCATGGTGC
L15CA1R	CAGGCACTTCTTCCAGGTCT
18018ACF	AGGGTTACACTGGAGTTTGC
18018ACR	AAACCTTCAATGTGTTCATTAAAAC
E0864CAF	TCAACTTTATTGGGGGTTTA
E0864CAR	AAGGTAAAAGTCCAAAATGG
H0570POLYAF	GGACAGTCAGTTATTGAAATG
H0560POLYAR	TTTCCTCTCTGGGAGTCTCT

E0864CA wurde von dem Cosmid E0864 erhalten.
H0570POLYA wurde von dem Cosmid H0570 erhalten.
255CA5, 255CA3 und 255CA6 wurden von dem PAC255_m_19 erhalten.
14LCA5 und L15CA1 wurden von dem BAC 14_1_15 erhalten.
18018AC wurde von dem PAC 18_o_18 erhalten.
Tabelle 9 PCR-Primer für den Erhalt von LRP-3-cDNA

A) Primer, die innerhalb der Human-LRP-3-cDNA lokalisiert sind:
Die Primer sind nummeriert, beginnend bei Nukleotid 1 in 5(a)

B) Maus-Lrp-3-cDNA-Primer
Die Primer sind nummeriert, beginnend bei Nukleotid 1 in 18(a)

B) Maus-Lrp-3-cDNA-Primer
Die Primer sind nummeriert, beginnend bei Nukleotid 1 in 18(a).

Tabelle 10 Zusammenfassung des Serumchemie-Vergleichs von LRP3-Behandlung gegenüber Kontrolle

Variable	Maus-Typ	Behandlung (% Diff. ± SE)	p-Wert (Behandlung)
Triglyceride	WI + KO	–30 ± 14	0,025
alkalische Phosphatase #	WT + KO	–49 ± 15	0,001
Gesamtcholesterin Gesamtcholesterin	nur KO nur WT	–28 ± 15 30 ± 13	0,073 0,080
AST#	WT + KO	8 ± 66	0,912
ALT#	WT + KO	–34 ± 51	0,431
BUN	WT + KO	–19 ± 15	0,195
# statistisch signifikant höhere Grundlinienwerte für die Kontrollen

Tabelle 11 Zusammenfassung für Blutchemie-Variablen, gepoolt von "Knockout"- und Wildtyp-Mäusen

Variable	Behandlungsgruppe	Tiertyp	n	Grundlinie (Mittelwert ± % CV)	Nach Behandlung (Mittelwert ± % CV)	Ände-Rung	Prozentuale Änderung (95% Cl)	p-Wert (% chg)
Trigly (mg/dl)	Kontrolle	gepoolt	10	86 ± 13%	186 ± 35%	100	115% (61, 189)	< 0,001
Trigly (mg/dl)	LDL	gepoolt	9	92 ± 31%	81 ± 55%	–12	–13% (–35, 17)	0,321
Trigly (mg/dl)	LRP3	gepoolt	8	99 ± 24%	128 ± 36%	29	30% (–10, 86)	0,133
Alkphos (E/l)	Kontrolle	gepoolt	10	190 ± 19%	374 ± 30%	184	97% (68, 130)	< 0,001
Alkphos (E/l)	LDL	gepoolt	9	162 ± 12%	193 ± 29%	31	19% (–1,43)	0,061
Alkphos (E/l)	LRP3	gepoolt	8	154 ± 13%	146 ± 35%	–8	–5% (–24, 19)	0,604
GesChol (mg/dl)	Kontrolle	gepoolt	10	116 ± 69%	176 ± 86%	60	51% (21, 89)	0,002
GesChol (mg/dl)	LDL	gepoolt	9	124 ± 58%	87 ± 68%	–37	–30% (–41, –17)	0,001
GesChol (mg/dl)	LRP3	gepoolt	8	127 ± 62%	166 ± 57%	39	30% (9, 56)	0,009
AST (E/l)	Kontrolle	gepoolt	9	41 ± 22%	821 ± 69%	780	1894% (1142, 3101)	< 0,001
AST (E/l)	LDL	gepoolt	8	41 ± 25%	362 ± 61%	320	772% (369, 1520)	< 0,001
AST (E/l)	LRP3	gepoolt	8	33 ± 21%	989 ± 129%	955	2888% (953, 8380)	< 0,001
ALT (E/l)	Kontrolle	gepoolt	10	33 ± 15%	624 ± 59%	591	1798% (1203, 2665)	< 0,001
ALT (E/l)	LDL	gepoolt	8	32 ± 36%	331 ± 42%	299	938% (447, 1872)	< 0,001
ALT (E/l)	LRP3	gepoolt	8	25 ± 35%	^{1020 ± 157%}	994	3944% (861, 16921)	< 0,001
BUN (E/l)	Kontrolle	gepoolt	8	29 ± 12%	23 ± 11%	–5	–19% (–29, 7)	0,008
BUN (E/l)	LDL	gepoolt	9	28 ± 19%	25 ± 14%	–3	–12% (–22, 1)	0,062
BUN (E/l)	LRP3	gepoolt	8	28 ± 12%	19 ± 41%	–9	–31% (–53, 2)	0,058
Die angegebenen Mittelwerte sind geometrische Mittelwerte. Der p-Wert stammt von einem zweiseitigen gepaarten t-Test.

Tabelle 12 Regionen von Sequenzähnlichkeit zwischen Human- und Maus-LRP3

Lage in der Humansequenz	Nukleotidlänge	Prozentuale Identität	BLAST-Wert	Exon-Bezeichnung

Contig 31
20235–20271	37	86	140
24410–24432	23	86	88
24464–24667	204	82	168,223	6
24904–24995	52	82	179
25489–25596	108	81	360
26027–26078	52	80	170
26192–26261	70	84	251
26385–26486	102	87	393
28952–28993	42	85	156
41707–41903	197	90	823
42827–42898	66	81	222
43468–43585	117	85	316
50188–50333	146	86	550
54455–54494	40	80	128
54718–54750	33	87	129
59713–60123	411	87	1587	A
78536–78680	145	80	473	D
87496–87548	53	88	211
87598–87717	120	84	429
90772–90819	48	85	177
99457–99795	339	83	1182	E
103094–103281	188	83	661	F
116659–116954	296	81	985	G
119754–120089	336	83	1167	H

Contig 30
8920–9256	337	89	1026	K
11238–11353	116	84	*418	L
18394–18648	255	80	825	M
20020–20224	205	84	746	N
20926–21153	228	83	807	O
20955–25155	201	82	672	P
29126–19288	163	74	*437	Q
33874–34033	160	85	*593	S
35205–35340	136	86	509	T
41911–41911	55	80	*176	U
44629–44681	53	73	*249	V

SEQUENZVERZEICHNIS

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend für ein Polypeptid, welches die in 5(e) gezeigte Aminosäuresequenz einschließt.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die in 5(c) gezeigte Aminosäuresequenz einschließt.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, welches die in 5(a) gezeigte codierende Sequenz einschließt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend für ein LRP5, welches die Aminosäuresequenz von 5(e) einschließt, wobei die Nukleinsäure unter stringenten Bedingungen mit der in 5(a) gezeigten Nukleinsäuresequenz hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen eine Hybridisierung über Nacht bei 42°C in 0,25 M Na₂HPO₄, pH 7,2, 6,5% SDS, 10% Dextransulfat, und Waschen bei 55°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS umfassen.
Nukleinsäuremolekül, codierend für ein Polypeptid, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz eines Polypeptids einschließt, die aus den in 11(c), 12(d) und 18(c) gezeigten ausgewählt ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, welches eine codierende Sequenz einschließt, die aus den in 11(b), 12(c), 13, 14, 15(a) und 18(b) gezeigten Nukleotidsequenzen ausgewählt ist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 6, wobei die codierende Sequenz die in 11(b) gezeigte ist, eingeschlossen in einem Molekül, welches die in 11(a) gezeigte Sequenz aufweist.
Isoliertes Polypeptid, welches die in 5(e) gezeigte Aminosäuresequenz einschließt.
Polypeptid nach Anspruch 8, welches die in 5(c) gezeigte Aminosäuresequenz einschließt.
Polypeptid nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz eines Polypeptids einschließt, die aus den in 11(c), 12(d) und 18(c) gezeigten ausgewählt ist.
Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 9 oder 10, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus: SYFHLFPPPPSPCTDSS, VDGRQNIKRAKDDGT, EVLFTTGLIRPVVDN und IQGHLDFVMDILVFHS.
Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 9 oder 10, welches die Aminosäuresequenz der extrazellulären LRP5-Domäne von Aminosäurerest 25 bis 1385 der in 5(d) gezeigten Aminosäuresequenz einschließt.
Fragment eines Polypeptids nach Anspruch 9 oder 10, welches die Aminosäuresequenz der zytoplasmatischen LRP5-Domäne von Aminosäurerest 1409 bis 1615 der in 5(d) gezeigten Aminosäuresequenz einschließt.
Rekombinantes Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 10, welches die Expression des Polypeptids von codierender Nukleinsäure einschließt.
Rekombinantes Verfahren nach Anspruch 14, welches ferner das Isolieren und/oder Reinigen des Polypeptids einschließt.
Rekombinantes Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, welches ferner das Formulieren des Polypeptids zu einer Zusammensetzung, welche mindestens eine zusätzliche Komponente einschließt, einschließt.
Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 10 und einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff.
Verfahren zur Herstellung eines Fragments nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 13, welches die Expression des Fragments von codierender Nukleinsäure einschließt.
Verfahren nach Anspruch 18, welches ferner das Isolieren und/oder Reinigen des Fragments einschließt.
Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, welches ferner das Formulieren des Fragments zu einer Zusammensetzung, welche mindestens eine zusätzliche Komponente einschließt, einschließt.
Zusammensetzung, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 und einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff.
Isolierter Antikörper, welcher für ein Polypeptid nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 10 spezifisch ist.
Isolierter Antikörper nach Anspruch 22, welcher an eine Aminosäuresequenz bindet, die ausgewählt ist aus: SYFHLFPPPPSPCTDSS, VDGRQNIKRAKDDGT, EVLFTTGLIRPVALWDN und IQGHLDFVMDILVFHS.
Zusammensetzung, die einen Antikörper nach Anspruch 22 oder Anspruch 23 und einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff umfasst.