DE69626132T3

DE69626132T3 - Regulierung von essgewohnheiten

Info

Publication number: DE69626132T3
Application number: DE69626132T
Authority: DE
Inventors: Eleftheria Maratos-Flier
Original assignee: Joslin Diabetes Center Inc
Current assignee: Joslin Diabetes Center Inc
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2016-06-06
Also published as: US5849708A; DE69626132T2; WO1996039162A1; EP0871463A4; AU6041896A; DE69626132D1; EP0871463B2; AU721624B2; EP0871463A1; EP0871463B1; ATE232106T1; CA2223153A1; US20040242487A1; JPH11507517A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft MCH, MCH-Agonisten und -Antagonisten, und ihre Verwendung zur Regulation des Essverhaltens.
Obwohl unser Verständnis von Nagetierfettleibigkeit durch die molekulare Analyse von Mausmodellen für die Fettleibigkeit wie z. B. der ob/ob-Maus, Agouti-Maus und der für braunes Fettgewebe defizienten Maus erheblich zugenommen hat, ist der Mechanismus, durch den verschiedene molekulare Defekte zu einem veränderten Essverhalten führen, zu großen Teilen unbekannt geblieben. Im Allgemeinen sind die molekularen Ursachen für Hyperphagie und Fettleibigkeit sowohl in Mensch als auch in Tieren kaum verstanden (Brav (1989) Am. J. Clin. Nutr. 891-902). Vor kurzem wurden zwei mit Fettleibigkeit in Zusammenhang stehende Gene durch Positionsklonierung identifiziert (Zhang et al. (1994) Nature 372:425-432).
Von Neurotransmittern und Neuropeptiden ist bekannt, dass sie das Fressverhalten beeinflussen. Die Neurotransmitter Serotonin und Norepinephrin (NE) sind beteiligt an der Regulation des Appetits, wobei Serotonin-Agonisten Appetit hemmen, während NE-Agonisten das Essen induzieren. Es wurde auch über abnormale Reaktionen auf den Neurotransmitter GABA berichtet (Tsuji et al. (1991) Brain Research 48-54). Zusätzlich wurde eine Reihe von Neuropeptiden mit der Regulation der Futteraufnahme in Verbindung gebracht. Neuropeptid Y (NPY) ahmt die Wirkung von NE im Zentralen Nervensystem nach. Injektion von NPY induziert Fressverhalten in gesättigten Ratten (Stanley et al. (1989) Physiol and Behav. 46: 173-177) und die Mengen der NPY und Präpro-NPY-mRNA können in fettleibigen Nagetieren verändert sein, aber die Ergebnisse, die von verschiedenen Forschungsgruppen berichtet wurden, sind nicht konsistent. Erhöhte NPY-Spiegel wurden im Hypothalamus von Wistar-Ratten mit Essens-induzierter Fettleibigkeit beobachtet, obwohl die mRNA-Mengen unverändert waren (Wilding et al. (1992) J. Endocrinol. 132-299-404). In Zucker-Ratten wurde von NPY-erhöhten Spiegeln von hypothalamischer NPY- und Präpro-NPY-mRNA berichtet (Sanacor et al. (1990) Endocrinology 127: 730-736; Pesonen et al. (1992) 255-260; und Williams et al. (1991) Clinical Science 80: 419-426). Im selben Modell fanden andere Forscher die NPY-Spiegel im Basalstadium unverändert, aber erhöht bei Futtereinschränkungen (Williams et al. (1991) Clinical Science 80: 419-426). In ob/ob-Mäusen sind die hypothalamischen NPY-Konzentrationen unverändert, aber die Futterbeschränkung aktiviert NPY-Genexpression (Wilding et al. (1993) Endocrinology 132: 1939-1943). Eine Reihe anderer Peptide beinhaltend Galanin, Beta-Endorphin, Dynorphin bewirken die Stimulation der Futteraufnahme in gesättigten Ratten, wenn sie in den paraventriculären Nukleus oder den ventromedianen Nukleus injiziert werden. Faktoren, die aus dem Gastrointestinal-Trakt kommen, können auch bedeutend für die Regulation des Appetits sein. Z. B. hemmen Cholecystokinin und Bombesin die Futteraufnahme, wenn sie in Ratten injiziert werden (Baile et al. (1986) Physiol Reviews 66: 172-234 und Morley (1987) Endocrinol Rev. 8: 256-87).
Die Gegenwart von Melanozyten-konzentrierendem Hormon (MCH), einem zyklischen Peptid, im Fisch-Hypothalamus wurde vor mehr als einem Jahrzehnt beschrieben. Die Rolle von MCH im Teleosten-Fisch scheint die Regulation der Farbveränderung zu sein; MCH induziert die Melanophoren-Aggregation und MCH induziert die Melanophoren-Dispersion (Nahon et al. (1993) Ann. NY Acad. Sci. 680: 111-129). 1985 wurde immunoreaktives MCH auch im Nagetierhirn nachgewiesen (Skofitsch et al. (1985) Brain Res. Bull. 15: 635-639), und seine subzelluläre Lokalisation in Ratten und Menschen wurde wenige Jahre später beschrieben (Naito et al. (1988) Cell Tissue Res. 253: 291-295 und Bresson et al. (1987) CR Soc Biol. 181: 376-382). In Säugetieren ist die MCH-Genexpression auf der ventralen Seite der Zona Incerta und im lateralen Hypothalamus lokalisiert (Breton et al. (1993) Molecular and Cellular Neurosciences 4: 271-284). Das Gen kodiert für ein MCH-Peptid sowie ein dreizehn Aminosäuren-Peptid, das von Hypothalamus-Zellen in Kultur prozessiert und freigesetzt wird (Parkes et al. (1992) Endocrinology 131: 1826-1831). MCXH-Perikarya erstrecken sich durch das gesamte Säugetierhirn, und es ist wahrscheinlich, dass MCH an integrativen Prozessen beteiligt ist, die mit komplexem Verhalten einhergehen (Skofitch et al. (1985) Brain Res. Bull. 15: 635-(Zhang et al. (1994) Nature 372: 425-432).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung von MCH oder eines Agonisten davon, zur Zubereitung eines Medikamentes für ein Verfahren zur Förderung des Essensappetits oder der Zunahme oder Beibehaltung von Gewicht bei einem Individuum, umfassend die Verabreichung einer effektiven Menge an MCH oder eines Agonisten davon an das Individuum, worin der Agonist ein Peptid-Analog von MCH ist.
Die vorliegende Erfindung liefert auch die Verwendung von Antagonisten von MCH zur Zubereitung eines Medikaments für ein Verfahren zur Hemmung des Essensappetits oder der Gewichtszunahme in einem Individuum, umfassend die Verabreichung einer effektiven Menge eines Antagonisten von MCH an das genannte Individuum, worin der Antagonist ein Peptid-Analog von MCH ist, das einen MCH-Rezeptor bindet.
In einem verwandten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Auswertung einer Behandlung bezüglich ihrer Wirkung auf das Essverhalten, umfassend: Verabreichen der Behandlung einem Untersuchungssystem, welches auf Melanozyten beruht, in einer Zellkultur-Präparation; um zu bestimmen, ob eine Änderung im System erfolgt; und Verabreichung der Behandlung einem zweiten Untersuchungssystem und Bestimmung der Wirkung der Behandlung auf einen Parameter, der sich auf Essverhalten oder Gewichtszunahme oder -abnahme im zweiten System bezieht, worin die Behandlung ein Peptid-Analog von MCH ist.
Die vorliegende Erfindung liefert auch:
Ein Verfahren zur Auswertung einer Behandlung bezüglich ihrer Wirkung auf das Essverhalten, umfassend: Bereitstellen einer Zell- oder Zellkultur-Präparation, bei der ein Reporter-Gen mit der Promotorregion von MCH verknüpft ist; Verabreichung der Behandlung; und Bestimmung, ob eine Wirkung auf die Expression des Reporter-Gens vorliegt; ein Verfahren zur Auswertung einer Behandlung bezüglich ihrer Wirkung auf Essverhalten, Appetit oder Beibehalten des Gewichts, umfassend: Bereitstellen einer Zell- oder Zellkulturpräparation, Verabreichen der Behandlung einer Zell- oder Zellkultur-Präparation; sowie Bestimmung, ob eine Wirkung auf die MCH-RNA oder MCH-Protein-Spiegel vorliegt.
EINZELHEITEN DER ERFINDUNG
Im Allgemeinen stellt die Erfindung Medikamente zur Verfügung zur Verwendung in einem Verfahren zur Förderung des Essens, des Appetits, oder der Zunahme oder Beibehaltung von Gewicht in einem Individuum, beinhaltend: Verabreichen einer effektiven Menge an MCH oder eines Agonisten davon an das Individuum. Der Verweis hierin auf MCH-Agonisten bezeichnet Peptid-Analoge von MCH mit agonistischer Aktivität. Ebenso bezeichnet der Verweis auf MCH-Antagonisten Peptid-Analoge von MCH mit antagonistischer Aktivität, die einen MCH-Rezeptor binden.
In bevorzugten Ausführungsformen: das Individuum ist ein Säugetier, z. B. ein Mensch; das Individuum ist untergewichtig oder zeigt ein Essverhalten, das geringer als normal ist; das Individuum leidet an einer Störung des Immunsystems, z. B. Aids, oder ist HIV-positiv; das Individuum leidet an Anorexia nervosa oder einer Nierenkrankheit, z. B. einer chronischen Nierenkrankheit oder einer Nierenkrankheit, die eine Dialyse erfordert; das Individuum bekommt eine Behandlung verabreicht oder hat oder wird eine Behandlung verabreicht bekommen, die zu einem verringertem Appetit oder Essverhalten oder zu einem Gewichtsverlust führt, z. B. Chemotherapie, Bestrahlungstherapie oder Dialyse.
In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die beanspruchte Verwendung weiterhin die Diagnose, dass ein Individuum dem Risiko ausgesetzt ist für eine Funktionsstörung oder ungewollte Beschwerden, die mit dem MCH-Stoffwechsel zusammenhängen; eine mit dem Essen, Appetit oder Gewicht zusammenhängende Funktionsstörung; ein Essverhalten, das geringer als normal ist; Auszehrung oder Untergewicht.
In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die beanspruchte Verwendung weiterhin die Wiederholung der Verabreichung von MCH oder einem Agonisten davon.
In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die beanspruchte Verwendung weiterhin die Verabreichung des Medikaments während einer Behandlung, die zu einem verringerten Essverhalten oder zu einem Gewichtsverlust führt, z. B. Chemotherapie, Bestrahlungstherapie oder Dialyse. Die Behandlung kann vor, nach oder während der MCH- oder MCH-Agonist oder Teilstück-Verabreichung verabreicht werden.
In bevorzugten Ausführungsformen: das Individuum ist ein nicht-menschliches Tier, z. B. ein nicht-menschliches Säugetier, z. B. ein nicht-menschlicher Primat, ein Hund, oder ein Nagetier, Z. B. eine Ratte oder eine Maus; das Individuum ist kein Fisch. Das Individuum kann in Bezug auf die Gene, die das Gewicht oder das Essverhalten regulieren, wildtypisch sein, oder das Subjekt kann eine oder mehrere genetische Veränderungen tragen, die Auswirkungen auf das Gewicht oder das Essverhalten haben. Zum Beispiel kann das Individuum eine Mutation in dem ob-, dem MCH- oder dem ob-Rezeptor-Gen tragen. Das Individuum kann ein transgenes Tier sein, z. B. ein Transgen, das das ob-Transgen, das MCH-Transgen, oder das ob-Rezeptor-Transgen auf eine falsche Weise exprimiert. Dem Individuum kann auch das braune Fettgewebe fehlen. Zum Beispiel kann eine "knockout"-Maus für braunes Fettgewebe durch die Fusion des Diphtheria-Toxins mit einem Promotor, der spezifisch für braunes Fettgewebe ist, hergestellt werden.
Die Verabreichung von MCH oder einem MCH-Agonisten kann begonnen werden: wenn der Empfänger beginnt, Anzeichen von ungenügendem Essen, Appetitsverlust oder Gewichtsverlust zu zeigen, Z. B. bei einer Gewichtsabnahme von mehr als 10, 20 oder 30% des Körpergewichtes oder wenn das Individuum mehr als 10, 20 oder 30% unter dem normalen Körpergewicht liegt; wenn ein Appetitverlust diagnostiziert wird; zu Beginn einer Behandlung, die das Essen, den Appetit oder die Gewichtszunahme oder -beibehaltung hemmt, oder wenn die Behandlung beginnt ihre Wirkung auszuüben; oder allgemein, wenn es erforderlich ist, die Gesundheit oder geeignete Gewichtslevels aufrechtzuerhalten.
Der Zeitraum, in dem das Agens verabreicht wird (oder der Zeitraum, in dem klinisch effektive Spiegel in dem Individuum aufrechterhalten werden), kann langfristig sein, z. B. für sechs Monate oder mehr, oder ein Jahr oder mehr, oder kurzfristig, z. B. für weniger als ein Jahr, bevorzugt sechs Monate oder weniger, insbesondere bevorzugt ein Monat oder weniger, und am meisten bevorzugt zwei Wochen oder weniger.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Medikamente zur Verfügung für ein Verfahren zur Hemmung des Essens, zur Hemmung des Appetits, oder zur Förderung des Gewichtsverlustes in einem Individuum, beinhaltend: Verabreichung einer effektiven Menge eines Antagonisten von MCH an ein Individuum.
In bevorzugten Ausführungsformen: das Individuum ist ein Säugetier, z. B. ein Mensch; das Individuum ist übergewichtig oder zeigt zwanghaftes oder anderes ungewolltes Essverhalten; dem Individuum wurde oder wird eine Behandlung verabreicht werden, die zu einem erhöhten Essverhalten führt, z. B. Steroidtherapie.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das Medikament benutzt zur Diagnose, dass ein Individuum einem Risiko ausgesetzt ist von: einer Funktionsstörung oder ungewollten Beschwerde, die mit dem MCH-Stoffwechsel zusammenhängt; einer mit dem Essen oder dem Gewicht zusammenhängenden Funktionsstörung; einem zwanghaften oder anderweitig ungewollten Essverhalten, Fettleibigkeit; oder anderen Funktionsstörungen, die mit dem Essen oder dem Gewicht zu tun haben.
In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die beanspruchte Verwendung weiterhin die wiederholte Verabreichung eines MCH-Antagonisten.
In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die beanspruchte Verwendung weiter die Verabreichung des Medikaments während einer Behandlung, die zu einem erhöhten Essverhalten oder zu einer Gewichtszunahme führt, Z. B. der Steroidtherapie. Die Behandlung kann vor, nach oder während dem MCH-Antagonisten verabreicht werden.
In bevorzugten Ausführungsformen: das Individuum ist ein nicht-menschliches Tier, z. B. ein nicht-menschliches Säugetier, Z. B. ein nicht-menschlicher Primat, ein Hund, oder ein Nagetier, z. B. eine Ratte oder eine Maus; das Individuum ist kein Fisch. Das Individuum kann in Bezug auf die Gene, die das Gewicht oder das Essverhalten regulieren, wildtypisch sein, oder das Individuum kann eine oder mehrere genetische Veränderungen tragen, die das Gewicht oder das Essverhalten beeinflussen. Z. B. kann das Individuum eine Mutation im ob-Gen, im MCH-Gen oder dem ob-Rezeptorgen tragen. Das Individuum kann ein transgenes Tier sein, z. B. ein Transgen, das das ob-Transgen, das MCH-Transgen, oder das ob-Rezeptortransgen auf eine falsche Weise exprimiert. Dem Individuum kann auch das braune Fettgewebe fehlen. Zum Beispiel kann eine Knockout-Maus für das braune Fettgewebe hergestellt werden durch die Fusion des Diphteria-Toxins mit einem Promotor, der für braunes Fettgewebe spezifisch ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Antagonist ein Peptid-Analog von MCH, das mindestens 50, 60, 70, 80, oder 90% Homologie mit MCH besitzt.
Die Verabreichung eines MCH-Antagonisten kann begonnen werden: wenn der Empfänger Zeichen von ungewolltem Essverhalten oder Gewichtszunahme zeigt, Z. B. wenn das Körpergewicht um mehr als 10, 20, oder 30% zunimmt oder wenn das Individuum das normale Körpergewicht um mehr als 10, 20, oder 30% übertrifft; wenn eine Zunahme an Appetit diagnostiziert wird; zu Beginn einer Behandlung, die das Essen, den Appetit oder die Gewichtszunahme oder -beibehaltung fördert, oder wenn die Behandlung beginnt ihre Wirkung auszuüben; oder im Allgemeinen, wenn es gewünscht wird, die Gesundheit oder akzeptable Gewichtslevels aufrechtzuerhalten.
Der Zeitraum, in dem das Agens verabreicht wird (oder der Zeitraum, in dem klinisch effektive Levels im Individuum aufrecht erhalten werden) kann langfristig sein, z. B. für sechs oder mehr Monate, oder ein Jahr oder mehr, oder kurzfristig, Z. B. für weniger als ein Jahr, bevorzugt sechs Monate oder weniger, insbesondere bevorzugt ein Monat oder weniger, und am meisten bevorzugt zwei Wochen oder weniger.
Der Erfinder hat herausgefunden, dass MCH Essverhalten induziert. Die Erfindung beinhaltet eine Anzahl von Verfahren zur Auswertung von Behandlungen oder Agentien bezüglich MCH-Agonist- oder -Antagonist-Aktivität. Manche Verfahren benutzen in vitro-Assays, manche benutzen Zellen und wieder andere benutzen Tiere. Die hierin erwähnten Verfahren können einzeln oder in Kombination verwendet werden, um Agentien in Bezug auf ihre Aktivität als MCH-Agonist oder -Antagonist auszuwerten. Z. B. können relativ schnelle in vitro- oder zellbasierte Assays als erstes Screening-Verfahren benutzt werden und ein Tier-Assay als Sekundär-Screen benutzt werden.
Die Behandlung kann jegliche Behandlung sein, die die gewünschte Wirkung zeigt, aber die Verabreichung von Agentien, z. B. von Wirkstoffen oder Chemikalien, ist bevorzugt. Bevorzugt ist die Behandlung eine andere als ein chirurgischer Eingriff, wie z. B. die Erzeugung von chirurgischen Läsionen, wie z. B. elektrolytischen Läsionen, eine andere als eine ventromediale hypothalamische Läsion, z. B. eine elektrolytisch erzeugte ventromediale hypothalamische Läsion. Das Agens, das ausgewertet wird, kann z. B. ein Polysaccharid, eine Nukleinsäure, ein Fett, Polypeptid oder ein Peptid-Mimetikum sein. Aminosäure-basierte Agentien können die gleiche Sequenzhomologie haben wie MCH oder können, was die Sequenzhomologie betrifft, unverwandt sein. Z. B. kann das Agens 50, 60, 70, 80, 90 oder 95% Homologie mit MCH besitzen. Das Agens kann ein lineares oder zyklisches Peptid sein.
Entsprechend stellt die Erfindung in einem anderen Aspekt ein Verfahren zur Auswertung einer Behandlung dar, Z. B. die Verabreichung eines Agens, bezüglich seiner Wirkung auf Essverhalten, Appetit oder die Aufrechterhaltung des Gewichts. Das Verfahren beinhaltet: Verabreichung der Behandlung einem Melanozyten-basierten System, z. B. einem oder mehreren Frosch- oder Eidechsenhaut-, Fischschuppen-, oder Fischhaut-Assays, die hier beschrieben sind, und Bestimmung, ob eine Veränderung im System vorliegt und (optional) Verabreichung der Behandlung einem zweiten Testsystem und Bestimmung der Wirkung der Behandlung auf einen Parameter, der mit Essverhalten, Appetit oder Gewichtszunahme oder -verlust zusammenhängt, im zweiten System. Die Behandlung ist ein Peptid-Analog von MCH. Das zweite System kann dasselbe oder ein anderes als das erste sein. In bevorzugten Ausführungsformen ist das zweite System ein zell-basierter Assay, z. B. ein Assay, der benutzt: eine Fischzelle; eine Reptilienzelle; eine Amphibienzelle; eine Säugetierzelle; eine Nagetierzelle, z. B. eine Maus- oder Rattenzelle; eine Primatenzeile; oder eine menschliche Zelle. In bevorzugten Ausführungsformen: die Zelle ist eine neuronale Zelle, z. B. eine GH3-Zelle, eine PC12-Zelle, oder eine Zelle aus einer primären Hypothalamus-Kultur. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das zweite System ein Tier-basiertes System, z. B. wird die Behandlung einem Tier verabreicht und die Wirkung auf einen Parameter, der mit dem Essverhalten zusammenhängt, z. B. das Essverhalten selbst, wird ausgewertet.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Auswertung einer Behandlung dar, z. B. der Verabreichung eines Agens, bezüglich auf seines Effekts auf Essverhalten, Appetit oder Beibehalten des Gewichts. Die Methode beinhaltet: Bereitstellen einer Zelle (einer Tier-, Pflanzen- oder Bakterienzelle) oder Zellkultur-Präparation, bei der ein Reporter-Gen mit der Promotor-Region von MCH verknüpft ist; Verabreichung der Behandlung; und Bestimmung, ob eine Wirkung auf die Reporter-Gen-Expression vorliegt. Eine Wirkung auf die Reporter-Gen-Expression ist ein Hinweis auf eine Wirkung auf Essverhalten, Appetit oder das Beibehalten des Gewichts. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle: eine Fischzelle; eine Reptilienzelle; eine Amphibienzelle; eine Säugetierzelle; eine Nagetierzelle, Z. B. eine Maus- oder Rattenzelle; eine Primatenzelle oder eine menschliche Zelle. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neuronale Zelle, z. B. eine GH3-Zelle, eine PC12-Zelle, oder eine Zelle aus einer primären Hypothalmus-Kultur.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Auswertung einer Behandlung dar, z. B. die Verabreichung eines Agens, bezüglich seines Effekts auf Essverhalten, Appetit oder das Beibehalten des Gewichts. Das Verfahren beinhaltet: Bereitstellen einer Zelle oder Zellkultur-Präparation; Verabreichung der Behandlung sowie Bestimmung, ob eine Wirkung auf die MCH-RNA oder MCH-Proteinlevels in der Zelle oder Zellkultur-Präparation vorliegt. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle: eine Fischzelle; eine Reptilienzelle; eine Amphibienzelle; eine Säugerzelle; eine Nagetierzelle, z. B. Maus- oder Rattenzelle; eine Primatenzelle oder eine menschliche Zelle. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neuronale Zelle, Z. B. eine GH3-Zelle, eine PC12-Zelle, oder eine Zelle aus einer primären Hypothalamus-Kultur.
In einem verwandten Aspekt gibt es eine Methode zur Auswertung einer Behandlung, z. B. die Verabreichung eines Agens bezüglich seiner Wirkung auf das Essverhalten, den Appetit oder das Beibehalten des Gewichts. Das Verfahren beinhaltet: Bereitstellung eines Tier-Individuums; Verabreichung der Behandlung; sowie Bestimmung, ob ein Effekt auf die MCH-RNA oder -Proteinlevels im Tier vorliegt. Die Behandlung kann jede Behandlung sein, die in der gewünschten Wirkung resultiert, aber die Verabreichung von Agentien, z. B. Wirkstoffen oder Chemikalien, ist bevorzugt. Bevorzugt ist die Behandlung ein anderer als ein chirurgischer Eingriff, wie z. B. die Erzeugung von chirurgischen Läsionen, wie z. B. elektrolytischen Läsionen, z. B. eine andere als eine hypothalamische Läsion, Z. B. eine elektrolytisch erzeugte ventromediale hypothalamische Läsion.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Tier ein Säugetier, Z. B. ein Nagetier, z. B. eine Ratte oder eine Maus, ein Hund, oder ein nicht-menschlicher Primat. In anderen Ausführungsformen ist das Tier keine Ratte oder Maus. In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Behandlung die Verabreichung des Agens und: das Agens ist kein Antikörper; das Agens ist kein Antikörper, der gegen das Lachs-MCH gerichtet ist; das Agens ist kein Antikörper aus Kaninchen; das Agens ist kein polyklonaler-Antikörper aus Kaninchen, z. B. kein polyklonaler-anti-Fisch-MCH-Antikörper aus Kaninchen; das Agens ist kein Volllängen-Antikörper, Z. B. ist es ein Fragment eines Antikörpers, Z. B. ein Fragment, das fähig ist, MCH zu binden; das MCH-Polypeptid liegt nicht in Form einer unbehandelten Gehirn-Präparation oder eines Gehirn-Schnittes vor; das MCH ist im Wesentlichen frei von mindestens einem Protein, mit dem es normalerweise auftritt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen: das Agens ist ein monoklonaler Antikörper; das Agens ist ein rekombinanter oder humanisierter Antikörper.
In einem anderen Aspekt gibt es ein Verfahren zur Auswertung eines Agens, z. B. eines Polypeptids oder Peptid-Mimetikum, bezüglich seiner Wirkung auf Essverhalten, Appetit oder Beibehalten des Gewichts. Das Verfahren beinhaltet: Verabreichung des Agens an ein Tier, z. B. ein Säugetier, z. B. ein Nagetier, Z. B. eine Ratte; und Bestimmen, ob eine Wirkung auf einen Parameter, der mit dem Essverhalten zusammenhängt, vorliegt. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Agens MCH, oder ein Agonist oder Antagonist davon.
Z. B. ist der Agonist oder Antagonist ein Peptidanalog von MCH, das 40, 50, 60, 70, 80 oder 90% Homologie mit dem nativen MCH besitzt, oder es ist ein Polypeptid, das MCH oder einen natürlich vorkommenden Liganden von MCH bindet, z. B. ein MCH-Rezeptor, z. B. MC3-R. Das Agens kann ein lineares oder zyklisches Polypeptid sein.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verbindung nicht Wasser oder NaCl.
In bevorzugten Ausführungsformen: das Agens ist kein Antikörper; das Agens ist kein Antikörper, der gegen Lachs-MCH gerichtet ist; das Agens ist kein Antikörper aus Kaninchen; das Agens ist kein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, z. B. kein polyklonaler-anti-Fisch-MCH-Antikörper Kaninchen; das Agens ist kein Volllängen-Antikörper, z. B. ist es ein Fragment eines Antikörpers, z. B. ein Fragment, das MCH binden kann; das MCH-Polypeptid liegt nicht in Form einer unbehandelten Gehirn-Präparation oder eines Gehirn-Schnittes vor; das MCH ist im Wesentlichen frei von mindestens einem Protein, mit dem es natürlicherweise vorkommt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen: das Agens ist ein monoklonaler Antikörper; das Agens ist ein rekombinanter oder humanisierter Antikörper. In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Auswertung eines Agens bezüglich seiner Fähigkeit, ein MCH-Polypeptid zu binden, dar. Das Verfahren beinhaltet: das Agens mit dem MCH-Polypeptid oder einer aufgereinigten Präparation davon in Kontakt zu bringen; und Auswertung der Fähigkeit der Verbindung einen Komplex mit dem MCH-Polypeptid zu bilden. Dieses Verfahren kann in vitro oder in vivo, z. B. in einem Two-Hybrid Interaction Trap Assay durchgeführt werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Agens kein Antikörper, der gegen das Lachs-MCH gerichtet ist; das Agens ist kein Kaninchen-Antikörper; das Agens ist kein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, z. B. kein polyklonaler-anti-Fisch-MCH-Antikörper aus Kaninchen; das Agens ist kein Volllängen-Antikörper, z. B. ist es ein Fragment eines Antikörpers, Z. B. ein Fragment, das MCH binden kann; das MCH-Polypeptid liegt nicht in Form einer unbehandelten Gehirn-Präparation oder eines Gehirn-Schnittes vor; das MCH ist im Wesentlichen frei von mindestens einem Protein, mit dem es natürlicherweise auftritt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen: das Agens ist ein monoklonaler Antikörper; das Agens ist ein rekombinanter oder humanisierter Antikörper.
In einem anderen Aspekt gibt es ein Verfahren zur Auswertung eines Agens, Z. B. eines Fragments eines MCH-Peptids, bezüglich seiner Fähigkeiten, einen natürlich vorkommenden Liganden von MCH, z. B. einen MCH-Rezeptor, z. B. MC3-R zu binden oder ihn zu verändern. Verändern beinhaltet, Z. B. sterische Veränderung der Rezeptors, oder Veränderung der Bindungseigenschaften des Rezeptors für ein MCH-Polypeptid oder für einen anderen Liganden. Das Verfahren beinhaltet: das Agens mit dem MCH-Liganden in Kontakt zu bringen; und Auswertung der Fähigkeit des Agens bezüglich seiner Fähigkeit, einen Komplex mit dem MCH-Liganden zu bilden, z. B. der Fähigkeit des Agens, die MCH-Peptid/MCH- Ligand-Interaktion zu hemmen oder den Rezeptor zu verändern. Dieses Verfahren kann in vitro oder in vivo angewendet werden, z. B. in einem Two-Hybrid Interaction Trap Assay. In bevorzugten Ausführungsformen: der Rezeptor ist nicht Maus-MC3-R; das Agens ist ein Peptidanalog zu MCH, das 40, 50, 60, 70, 80, 90% oder mehr Homologie mit MCH besitzt; das Agens ist ein lineares oder zyklisches Polypeptid.
In einem weiteren Aspekt gibt es ein Verfahren zur Auswertung eines Agens, z. B. bezüglich seiner Fähigkeit, die Interaktion eines MCH-Peptids mit einem zweiten Polypeptid, z. B. einen natürlicherweise vorkommenden Liganden von MCH, z. B. einen MCH-Rezeptors, Z. B. MC3-R zu modulieren. Das Verfahren schließ ein die Schritte (i) Vereinigen eines zweiten Polypeptids (oder bevorzugt einer aufgereinigten Präparation davon), eines MCH-Polypeptids (oder bevorzugt einer aufgereinigten Präparation davon), und des Agens, z. B. unter Bedingungen, unter denen in Abwesenheit des Agens das zweite Polypeptid und das MCH-Polypeptid miteinander interagieren können, z. B. um einen Komplex zu bilden; und (ii) Nachweisen der Interaktion, z. B. durch Nachweisen der Bildung (oder Auflösung) eines Komplexes, der das zweite Polypeptid und das MCH-Peptid beinhaltet. Eine Veränderung, z. B. eine Abnahme oder Zunahme, in der Bildung des Komplexes in der Gegenwart des Agens (relativ zu dem, was in der Abwesenheit des Agens beobachtet wird) ist ein Anzeichen für eine Modulierung, Z. B. eine Hemmung oder Förderung der Interaktion zwischen dem zweiten Polypeptid und dem MCH-Peptid. In bevorzugten Ausführungsformen: das zweite Polypeptid und das MCH-Peptid werden in einem zellfreien System kombiniert und mit dem Agens in Kontakt gebracht; das zellfreie System ist ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus einem Zelllysat und einem rekonstituierten Proteingemisch; das MCH-Peptid und das zweite Polypeptid werden gleichzeitig in einer Zelle exprimiert, und die Zelle wird mit dem Agens in Kontakt gebracht, z. B. beinhaltet das Verfahren einen Interaction Trap Assay (z. B. einen Two-Hybrid Assay). In bevorzugten Ausführungsformen: der Rezeptor ist nicht Maus MC3-R; das Agens ist ein Peptid-Analog, das 40, 50, 60, 70, 80, 90% oder mehr Homologie mit MCH besitzt; das Agens ist ein lineares oder zyklisches Polypeptid.
In bevorzugten Ausführungsformen: das Agens ist kein Antikörper gegen Lachs-MCH; das Agens ist kein Antikörper aus Kaninchen; das Agens ist kein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, z. B. kein polyklonaler-anti-Fisch-MCH-Antikörper aus Kaninchen; das Agens ist. kein Volllängen-Antikörper, z. B. ist es ein Fragment eines Antikörpers, z. B. ein Fragment, das fähig ist, MCH zu binden; das MCH-Polypeptid liegt nicht in Form einer unbehandelten Gehirn-Präparation oder eines Gehirn-Schnittes vor; das MCH ist im Wesentlichen frei von mindestens einem Protein, mit dem es natürlicherweise vorkommt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen: das Agens ist ein monoklonaler Antikörper; das Agens ist ein rekombinanter oder humanisierter Antikörper.
In wieder einem anderen Aspekt gibt es ein Zweiphasen-Verfahren (z. B. ein Verfahren mit einer in vitro- und einer in vivo-Phase) für die Auswertung eines Agens, z. B. bezüglich seiner Fähigkeit, die Interaktion eines MCH-Peptids mit einem natürlich vorkommenden Liganden von MCH, z. B. einem MCH-Rezeptor, z. B. MC3-R zu modulieren, z. B. zu hemmen oder zu fördern. Das Verfahren beinhaltet die Schritte (i) und (ii) des Verfahrens, das unmittelbar zuvor beschrieben ist imd in vivo durchgeführt wird und beinhaltet weiterhin: (iii) Bestimmung, ob das Agens die Interaktion in vitro moduliert, und wenn dem so ist: (iv) Verabreichung des Agens an eine Zelle oder ein Tier; und (v) Auswertung des in vivo-Effekts, Z. B. Hemmung, des Agens auf eine Interaktion eines MCH-Peptids mit einem zweiten Polypeptid, z. B. durch die Wirkung auf das Essverhalten.
In einem anderen Aspekt gibt es ein Zweiphasen-Verfahren (z. B. ein Verfahren mit einer primären in vitro- und einer sekundären in vivo-Phase) zur Auswertung der Behandlung. Das Verfahren kann zur Auswertung der Behandlung bezüglich der Fähigkeit zur Modulation, z. B. der Hemmung oder Förderung, eines MCH-vermittelten Phänomens, z. B. eines Aspekts des Essverhaltens, Appetits oder der Beibehaltung des Gewichts genutzt werden, oder um ein Testagens bezüglich seiner Verwendung als therapeutisches Agens auszuwerten. Das Verfahren beinhaltet: (i) eine in vitro-Phase, in der das Testagens mit der Zelle oder einem zellfreien System, in der ein Reporter-Gen funktionell mit der MCH-regulatorischen Sequenz verknüpft ist, in Kontakt gebracht wird und Nachweis der Modulation der Reporter-Gen-Expression und (ii) wenn das Testagens die Expression moduliert, Verabreichen der Testverbindung an ein Tier, und Auswertung der in vivo-Effekte der Verbindung bezüglich eines Aspekts des Essverhaltens, z. B. das Level der MCH-Expression.
In einem anderen Aspekt gibt es ein Verfahren zur Auswertung eines Agens bezüglich seiner Fähigkeit, eine Nukleinsäure zu binden, die für die MCH-regulatorische Sequenz kodiert. Das Verfahren beinhaltet: das Agens mit der Nukleinsäure in Kontakt bringen; und Auswertung der Fähigkeit der Verbindung, einen Komplex mit der Nukleinsäure zu bilden.
In einem anderen Aspekt gibt es ein Verfahren zur Auswertung einer Wirkung einer Behandlung, z. B. einer Behandlung einer Funktionsstörung, die durch ungewolltes Essverhalten charakterisiert ist oder von Unter- oder Übergewicht. Das Verfahren verwendet eine Testzelle oder einen Testorganismus, der ein MCH-Gen falsch exprimiert. Das Verfahren beinhaltet: Verabreichen der Behandlung einer Testzelle oder einem Testorganismus, z. B. einer Kulturzelle, oder einem Säugetier, und Auswertung der Wirkung der Behandlung auf einen Aspekt des MCH-Stoffwechsels. Eine Auswirkung auf einen Aspekt des MCH-Stoffwechsels weist auf eine Wirkung der Behandlung hin. In bevorzugten Ausführungsformen: Die Wirkung auf einen Aspekt des MCH-Stoffwechsels ist ein eine Änderung im Essverhalten oder Gewicht, eine Änderung im MCH mRNA-Level oder eine Änderung in den MCH-Protein-Levels.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle: eine Fischzelle; eine Reptilienzelle; eine Amphibienzelle; eine Säugerzelle; eine Nagetierzelle, z. B. eine Maus- oder Rattenzelle; eine Primatenzelle; oder eine menschliche Zelle. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neuronale Zelle, z. B. eine GH3-Zelle, eine PC12-Zelle, oder eine Zelle aus einer primären Hypothalmus-Kultur.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Behandlung die Verabreichung eines Agens und: das Agens ist kein Antikörper, der gegen Lachs-MCH gerichtet ist; das Agens ist kein Antikörper aus Kaninchen; das Agens ist kein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, z. B. kein polyklonaler-anti-Fisch-MCH-Antikörper aus Kaninchen; das Agens ist kein Volllängen-Antikörper, z. B. ist es ein Fragment eines Antikörpers, z. B. ein Fragment, das MCH binden kann. Das MCH-Polypeptid liegt nicht in Form einer unbehandelten Gehirn-Präparation oder eines Gehirn-Schnittes vor; das MCH ist im Wesentlichen frei von mindestens einem Protein, mit dem es natürlicherweise vorkommt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen: das Agens ist ein monoklonaler Antikörper; das Agens ist ein rekombinanter oder humanisierter Antikörper.
In einem anderen Aspekt gibt es ein Verfahren zur Auswertung einer Wirkung einer Behandlung, z. B. einer Behandlung einer Funktionsstörung, die durch ungewolltes Ess verhalten charakterisiert ist oder durch Unter- oder Übergewicht. Das Verfahren benutzt eine MCH-transgene Testzelle oder einen MCH-transgenen Testorganismus. Das Verfahren beinhaltet: Verabreichung der Behandlung an eine Testzelle oder -Organismus, z. B. eine Kulturzelle, oder ein Säugetier, und Auswertung der Wirkung der Behandlung auf einen Aspekt des MCH-Stoffwechsels. Eine Wirkung auf einen Aspekt des MCH-Stoffwechsels weist auf eine Wirkung der Behandlung hin. In bevorzugten Ausführungsformen: die Wirkung auf einen Aspekt des MCH-Stoffwechsels ist eine Veränderung im Essverhalten oder Gewicht, eine Veränderung der MCH mRNA-Levels, eine Veränderung in den MCH-Protein-Levels. Die Testzelle oder der Organismus kann wildtypisch sein oder mutant an einem oder mehreren Loci, die nicht für MCH kodieren, sondern für, z. B. ob oder den ob-Rezeptor. Dem Individuum kann auch braunes Fettgewebe fehlen. Zum Beispiel kann eine "knockout"-Maus für braunes Fettgewebe hergestellt werden, indem das Diphtheria-Toxin mit einem Promotor, der spezifisch für braunes Fettgewebe ist, fusioniert wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle: eine Fischzelle; eine Reptilienzelle; eine Amphibienzelle; eine Säugerzelle; eine Nagetierzelle, z. B. eine Maus- oder Rattenzelle; eine Primatenzelle; oder eine menschliche Zelle. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neuronale Zelle, z. B. eine GH3-Zelle, eine PC12-Zelle, oder eine Zelle aus einer primären Hypothalamus-Kultur.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Behandlung die Verabreichung eines Agens und: das Agens ist kein Antikörper, der gegen Lachs-MCH gerichtet ist; das Agens ist kein Antikörper aus Kaninchen; das Agens ist kein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, z. B. kein polyklonaler-anti-Fisch-MCH-Antiköper aus Kaninchen; das Agens ist kein Volllängen-Antikörper, z. B. ist es ein Fragment eines Antikörpers, Z. B. ein Fragment, das MCH binden kann; das MCH-Polypeptid liegt nicht in Form einer unbehandelten Gehirn-Präparation oder eines Gehirn-Schnittes vor; das MCH ist im Wesentlichen frei von mindestens einem Protein, mit dem es natürlicherweise vorkommt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen: das Agens ist ein monoklonaler Antikörper; das Agens ist ein rekombinanter oder humanisierter Antikörper.
In einem anderen Aspekt gibt es ein Verfahren zur Auswertung einer Wirkung einer Behandlung, z. B. einer Behandlung einer Funktionsstörung, die durch ungewolltes Essverhalten charakterisiert ist oder Unter- oder Übergewicht. Das Verfahren verwendet eine Testzelle oder einen Organismus, der ein Wildtyp-MCH-Gen exprimiert. Das Verfahren beinhaltet: Verabreichen der Behandlung einer Testzelle oder einem Organismus, z. B. einer Kulturzelle, oder einem Säugetier, und Auswertung der Wirkung der Behandlung auf einen Aspekt des MCH-Stoffwechsels. Eine Wirkung auf einen Aspekt des MCH-Stoffwechsels weist auf eine Wirkung der Behandlung hin. In bevorzugten Ausführungsformen: die Wirkung auf einen Aspekt des MCH-Stoffwechsels ist eine Veränderung im Essverhalten oder Gewicht, eine Veränderung in den MCH mRNA-Levels, eine Veränderung in den MCH-Protein-Levels. Die Testzelle oder der Organismus kann wildtypisch oder mutiert an einem oder mehreren Loci, die nicht für MCH kodieren, sein, z. B. für ob oder den ob-Rezeptor. Dem Individuum kann auch das braune Fettgewebe fehlen. Zum Beispiel kann eine "knockout"-Maus für braunes Fettgewebe hergestellt werden durch die Fusion von Diphtheria-Toxin mit einem Promotor, der spezifisch für braunes Fettgewebe ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle: eine Fischzelle; eine Reptilienzelle; eine Amphibienzelle; eine Säugerzelle; eine Nagetierzelle, z. B. eine Maus- oder Rattenzelle; eine Primatenzelle; oder eine menschliche Zelle. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine neuronale Zelle, z. B. eine GH3-Zelle, eine PC12-Zelle, oder eine Zelle aus einer primären Hypothalamus-Kultur.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die Behandlung die Verabreichung eines Agens und: das Agens ist kein Antikörper, der gegen Lachs-MCH gerichtet ist; das Agens ist kein Antikörper aus Kaninchen; das Agens ist kein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, Z. B. kein polyklonaler-anti-Fisch-MCH-Antikörper aus Kaninchen; das Agens ist kein Volllängen-Antikörper, Z. B. ist es ein Fragment eines Antikörpers, z. B. ein Fragment, das MCH binden kamen; das MCH-Polypeptid liegt nicht in Form einer unbehandelten Gehirn-Präparation oder eines Gehirn-Schnittes vor; das MCH ist im Wesentlichen frei von mindestens einem Protein, mit dem es natürlicherweise vorkommt. In anderen bevorzugten Ausführungsformen: das Agens ist ein monoklonaler Antikörper; das Agens ist ein rekombinanter oder humanisierter Antikörper.
In einem anderen Aspekt gibt es ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Säugerindividuum, Z. B. ein Primat, z. B. ein Mensch, ein erhöhtes Risiko für eine mit MCH zusammenhängende Funktionsstörung besitzt, eine mit Gewicht zusammenhängende Funktionsstörung oder eine Ess- oder Appetit-Störung. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren benutzt, um auszuwerten, ob das Individuum ein erhöhtes Risiko für eine genetisch bedingte Funktionsstörung besitzt. Essstörungen beinhalten, z. B. eine Funktionsstörung, die durch ungewolltes Essverhalten charakterisiert ist. Das Verfahren schließt ein das Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit einer Mutation des MCH-Gens in einem Gewebe des Individuums. In bevorzugten Ausführungsformen: Nachweisen einer Mutation beinhaltet das Feststellen der Existenz von mindestens: einer Deletion von mindestens einem oder mehreren Nukleotiden aus dem MCH-Gen; eine Insertion von einem oder mehreren Nukleotiden in das Gen, eine Punktmutation, z. B. den Austausch von einem oder mehreren Nukleotiden des Gens, ein chromosomales Rearrangement des Gens, z. B. eine Translokation, Inversion oder Deletion.
Zum Beispiel kann der Nachweis der genetischen Schädigung beinhalten: (i) Bereitstellen einer Sonde/eines Primers beinhaltend ein Oligonukleotid, das eine Nukleotidsequenz enthält, die an eine sense- oder antisense-Sequenz des MCH-Gens oder natürlich vorkommende Mutanten davon oder an die 5'- oder 3'-flankierenden Sequenzen, die natürlicherweise mit dem MCH-Gen assoziiert sind, hybridisiert; (ii) die Sonde/den Primer den Nukleinsäuren des Gewebes aussetzen; und (iii) Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit der genetischen Schädigung durch Hybridisierung der Sonde/des Primers an die Nukleinsäure.
Zirkulierende weiße Blutkörperchen können als Quelle für genomische DNA in den hier beschriebenen diagnostischen Verfahren dienen. Verfahren des Standes der Technik, z. B. die Single-Strand-Conformation-Polymorphism (SSCP)-Methode, können zum Nachweis von Schädigungen oder Polymorphismen verwendet werden. Die hier verwendeten diagnostischen Verfahren können benutzt werden, um übergewichtige Individuen, z. B. fettleibige oder krankhaft fettleibige Individuen auf MCH-Gen-Schädigungen oder Polymorphismen zu untersuchen.
In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren weiterhin die Bestimmung, ob ein Individuum übergewichtig, fettleibig oder krankhaft fettleibig ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Individuum übergewichtig, fettleibig oder krankhaft fettleibig.
In einem anderen Aspekt gibt es ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Saugetier-Individuum, z. B. ein Primat, z. B. ein Mensch, ein erhöhtes Risiko für eine mit MCH zusammenhängende Funktionsstörung, eine mit dem Gewicht zusammenhängende Funktionsstörung, oder eine Essstörung hat. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren verwendet, um auszuwerten, ob ein Individuum ein erhöhtes Risiko für eine genetisch bedingte Funktionsstörung hat. Das Verfahren beinhaltet den Nachweis von nicht-Wildtyp-Levels von MCH-RNA oder -Proteinen in einem Gewebe des Individuums. In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren weiterhin die Bestimmung, ob ein Individuum übergewichtig, fettleibig oder krankhaft fettleibig ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Individuum übergewichtig, fettleibig oder krankhaft fettleibig.
In einem anderen Aspekt gibt es ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Säugetier-Individuum, Z. B. ein Primat, z. B. ein Mensch, ein erhöhtes Risiko für eine mit MCH zusammenhängende Funktionsstörung, eine mit dem Gewicht zusammenhängende Funktionsstörung, oder eine Essstörung hat. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Verfahren verwendet, um auszuwerten, ob das Individuum ein erhöhtes Risiko für eine genetisch bedingte Funktionsstörung hat. Das Verfahren beinhaltet den Nachweis der Fehl-Expression eines Gens, das für ein MCH-Gen kodiert, in einem Gewebe des Individuums. In bevorzugten Ausführungsformen: Nachweis der Fehl-Expression beinhaltet die Feststellung der Existenz von mindestens einem: einer Veränderung in dem Level des mRNA-Transkripts des Gens; das Vorkommen eines nicht-Wildtyp-Splicing-Musters eines mRNA-Transkripts des Gens; und/oder ein nicht-Wildtyp-Level des Proteins. In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren weiterhin die Bestimmung, ob ein Individuum übergewichtig, fettleibig oder krankhaft fettleibig ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Individuum übergewichtig, fettleibig oder krankhaft fettleibig.
In einem anderen Aspekt gibt es ein Verfahren zur Herstellung eines MCH-Polypeptids, z. B. eines MCH-Polypeptids, das eine nicht-Wildtyp-Aktivität besitzt, z. B. ein Antagonist, Agonist oder Superagonist eines natürlich vorkommenden MCH. Das Verfahren beinhaltet: Änderung der Sequenz oder Ringstruktur eines MCH-Peptids, bevorzugt eines Säugetier-, z. B. eines menschlichen oder Ratten-Peptids, oder eines Peptids, das nicht ein Fisch-, Amphibien- oder Reptilien-Peptid ist, und das Testen des veränderten Peptids bezüglich der gewünschten Aktivität, z. B. durch Verabreichung des Peptids an ein Tier und Bestimmung der Wirkung auf die MCH RNA- oder Protein-Levels, das Essverhalten oder das Gewicht.
In einem anderen Aspekt gibt es eine Zelle oder eine aufgereinigte Zell-Präparation, die ein MCH-Transgen beinhalten oder die ein MCH-Gen fehlexprimieren. Die Zell-Präparation kann aus humanen oder nicht humanen Zellen bestehen, z. B. Nagetierzellen, z. B. Maus- oder Rattenzellen, Kaninchenzellen, oder Schweinezellen. In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zelle oder die Zellen ein MCH-Transgen, z. B. eine heterologe Form des MCH-Gens, Z. B. ein Gen, das vom menschlichen Gen abgeleitet ist (im Falle einer nicht-menschlichen Zelle). In anderen bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Zelle oder die Zellen ein Gen, das ein MCH-Gen, z. B. ein endogenes MCH-Gen, fehlexprimiert. In bevorzugten Ausführungsformen ist MCH über- oder unterexprimiert. Solche Zellen können als Modell für das Studium von Funktionsstörungen dienen, die mit mutierten oder missexprimierten MCH-Allelen zusammenhängen oder zum Wirkstoff-Screening benutzt werden.
In einem anderen Aspekt gibt es ein für MCH transgenes nicht-humanes Tier, z. B. ein Nagetier, Z. B. eine Maus oder eine Ratte, ein Kaninchen oder ein Schwein. In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet (und bevorzugt exprimiert) das transgene Tier eine heterologe Form des MCH-Gens, z. B. ein Gen, das vom menschlichen Gen abgeleitet ist. In anderen bevorzugten Ausführungsformen besitzt das Tier ein MCH-Gen, Z. B. ein endogenes MCH-Gen, das fehlexprimiert ist, z. B. ein "knockout" oder ein überexprimiertes MCH-Gen. Solch ein transgenes Tier kann als Modell für das Studium von Funktionsstörungen, die mit mutierten oder fehlexprimierten MCH-Allelen zusammenhängen, oder für das Wirkstoff-Screening benutzt werden.
Zum Beispiel gibt es ein Verfahren zur Auswertung der Wirkung der Expression oder Fehlexpression eines MCH-Gens auf einem Parameter, der mit dem Essverhalten zusammenhängt. Das Verfahren beinhaltet: Bereitstellen eines transgenen Tieres, das ein MCH-Transgen besitzt; das Tier mit einem Agens, Z. B. einem Analog von MCH in Kontakt bringen; und Auswertung der Wirkung des Transgens auf den Parameter (z. B. durch Vergleich der Werte des Parameters in einem transgenen Tier mit dem Wert für eine Kontrolle, Z. B. ein Wildtyp-Tier).
Die Durchführung der vorliegenden Erfindung wird, sofern nicht anders beschrieben, konventionelle Techniken der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, Transgenbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA, und Immunologie verwenden, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Solche Techniken sind in der Literatur beschrieben, siehe z. B. Molecular Cloning A Laborstory Manual, 2. Auflage, hrsg. von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laborstory Press: 1989); DNA Cloning, Bd. I und II (D.N. Glover Hrsg., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait Hrsg., 1984); Mullis et al. US-Patent No. 4,683,195 ; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins Hrsg. 1984); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins Hrsg. 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); die Abhandlung Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller und M.P. Calos Hrsg., 1987, Cold Spring Harbor Laborstory); Methods in Enzymology, Bd. 154 und 155 (Wu et al., Hrsg.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer und Walker, Hrsg., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Bd. I-IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell, Hrsg., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden durch die folgende detaillierte Beschreibung und durch die Ansprüche ersichtlich werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Zeichnungen werden kurz beschrieben.
Zeichnungen:
1 ist ein Balkendiagramm, das die MCH-Levels in gefütterten gegenüber gefasteten Mausen (nach 24 h des Fastens) der folgenden Gentypen darstellt: C57BL/6J (Wildtyp), ob/+, und ob/ob.
2 ist ein Diagramm, das die Verdopplung der Kcal darstellt, die innerhalb einer Stunde in Ratten, die mit 5 μg MCH intraventrikulär injiziert wurden, verbraucht wurden.
Definitionen
MCH-Antagonisten, im hier benutzten Sinne, bezeichnen Agenzien, die in einer Hemmung des Fressverhaltens resultieren, und welche Peptid-Analoge von MCH sind, welche einen MCH-Rezeptor binden. MCH-Agonist, im hier benutzten Sinne, bezeichnet Peptid-Analoge von MCH mit agonistischer Aktivität.
Fehlexpression in dem hier benutzten Sinne bezeichnet ein nicht-wildtypisches Muster der Genexpression. Es beinhaltet: Expression auf nicht-wildtypischen Levels, d.h. Über- oder Unterexpression; Expressionsmuster, das von dem des Wildtyps abweicht in Bezug auf die Zeit oder das Stadium, in dem das Gen exprimiert wird, z. B. erhöhte oder verringerte Expression (verglichen mit dem Wildtyp) in einem bestimmten Entwicklungszeitraum oder Abschnitt; ein Expressionsmuster, das vom Wildtyp abweicht durch niedrigere Expression (verglichen mit dem Wildtyp) in einem bestimmten Zelltyp oder Gewebetyp; ein Expressionsmuster, das abweicht vom Wildtyp in Bezug auf die Splicing-Größe, Aminosäuresequenz, post-translationale Modifikation oder biologische Aktivität des exprimierten Polypeptids; ein Expressionsmuster, das abweicht vom Wildtyp in Bezug auf den Effekt eines Umwelt-Stimulus oder extrazellulären Stimulus auf die Expression des Gens, z. B. ein Muster erhöhter oder verringerter Expression (verglichen mit dem Wildtyp) bei Anstieg oder Abnahme der Stimulationsstärke.
Eine im Wesentlichen reine Nukleinsäure, z. B. eine im Wesentlichen reine DNA, ist eine Nukleinsäure, die entweder nicht unmittelbar anschließend ist an eine der beiden kodierenden Sequenzen, an die es normalerweise unmittelbar anschließt (d.h. eine am 5'-Ende und eine am 3'-Ende) in dem natürlich vorkommenden Genom des Organismus, aus dem die Nukleinsäure gewonnen wurde, oder die im Wesentlichen frei von einer Nukleinsäuresequenz ist, mit der sie in dem Organismus auftritt, aus dem die Nukleinsäure stammt. Der Begriff schließt ein, z. B., eine rekombinante DNA, die in einen Vektor eingebaut ist, z. B. in ein autonom replizierendes Plasmid oder Virus, oder in die genomische DNA eines Prokaryonten oder Eukaryonten, oder die als ein separates Molekül (z. B. eine eDNA oder ein genomisches DNA-Fragment, das durch PCR oder Restriktionsendonuklease-Behandlung entstanden ist) existiert, unabhängig von anderen DNA-Sequenzen. Im wesentlichen reine DNA beinhaltet auch eine rekombinante DNA, die Teil eines Hybrid-Gens ist, das für zusätzliche MCH-Sequenzen kodiert.
Eine aufgereinigte Präparation oder eine im Wesentlichen reine Präparation eines Polypeptids in dem hier benutzten Sinne bezeichnet ein Polypeptid, das von anderen Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren, mit denen es natürlicherweise vorkommt, abgetrennt wurde. Bevorzugt ist das Polypeptid auch getrennt von den Substanzen, z. B. Antikörpern oder Gelmatrix, z. B. Polyacrylamid, die zur Aufreinigung benutzt wurden. Bevorzugt macht das Polypeptid mindestens 10, 20, 50, 70, 80 oder 95% Trockengewicht der aufgereinigten Präparation aus. Bevorzugt enthält die Präparation: genügend Polypeptid, um die Proteinsequenzierung zu erlauben; mindestens 1, 10 oder 100 μg des Polypeptids; mindestens 1, 10 oder 100 mg des Polypeptids.
Herstellung von MCH-Peptidanalogen
Synthetisches MCH und seine Analoge können erzeugt werden, um Agonisten und Antagonisten zu identifizieren, und um die strukturellen Voraussetzungen für MCH-Agonist oder -Antagonist-Aktivität zu bestimmen. MCH kann auf verschiedene Arten modifiziert werden, z. B. durch Kürzung entweder der Amino- oder der Carboxy-Terminalen-Region oder von beiden, Kontraktion des Cystein-überbrückten Rings, Bildung von azyklischen Analogen oder Modifikation oder Austausch einer Aminosäure, z. B. eines Restes innerhalb, oder außerhalb, des Rings.
Synthetisches MCH und seine Analoge können durch eine oder mehrere hier beschriebene Assay-Methoden untersucht werden.
Allgemein verwenden die Synthese-Schemata die Merrifield-Festphasen-Synthese, gefolgt von Zyklisierung und Aufreinigung wie beschrieben, z. B., in Lebl et al. (1988) J. Med. Chem. 31: 949-954, hier beigelegt als Referenz. Kurz gefasst kann chloromethyliertes Harz als Hilfsmittel benutzt werden, um die erste Aminosäure an einem automatischen Synthetisierer, z. B. einem DuPont 2200, einzuführen. Die intakten Peptide werden vom Harz abgespalten und gewaschen. Nach der Extraktion aus dem Waschpuffer werden die Peptide lyophilisiert. Das lyophilisierte Protein wird in entgastem Wasser gelöst. Zyklisierung wird erreicht durch tropfenweise Zugabe von Kaliumferricyanid (K₃Fe(CN)₆). Die Aufreinigung kann durch Säulenchromatographie an Sephadex G-25, Carboxymethyl-Cellulose und durch Reverse-Phase-HPLC erfolgen.
Alternativ können verkürzte MCH-Analoge dadurch präpariert werden, dass natürliches oder synthetisches MCH der Wirkung von Enzymen ausgesetzt wird. Natürliches MCH kann aus Hirnanhangdrüsen durch Aceton-Extraktion isoliert werden und auf einer HPLC-Säule aufgereinigt werden wie beschrieben in Kawauchi et al. (1988) Adv. in Pigment Cell Res. 517-530, hier beigelegt als Referenz. Z. B. kann MCH_1-14, eine Carboxy-terminale Verkürzung, dadurch aus MCH gebildet werden, dass MCH der Carboxypeptidase Y ausgesetzt wird.
Azylische Analoge können dadurch gebildet werden, dass die Cys⁵-Cys¹⁴-Brücke durch pseudoisosterische Einheiten ersetzt wird. Entweder L-Serin, ein polarer Austausch, oder L-α-Aminobutyrat, ein nicht-polarer Austausch, können verwendet werden. Die Peptide, mit einem geeigneten Austausch, können durch Festphasen-Synthese gebildet werden wie oben und in Matsunaga et al., Life Sci. (1992) 51:679-685, hier beigelegt als Referenz beschrieben.
Die Modifikation von Aminosäuren innerhalb des Rings wird durchgeführt mit einem Reagens, das für jeden Rest spezifisch ist. Modifikationen können erreicht werden entweder durch Austausch mit einer unterschiedlichen Aminosäure oder durch Veränderung der bereits existierenden Aminosäure. Z. B. kann der Tyrosin-Rest an Position 11 durch das Hinzufügen einer NO₂-Gruppe modifiziert werden, indem MCH einer Lösung von 10% Nitromethan-95% Ethanol ausgesetzt wird. Siehe, z. B. Kawauchi et al. (1988) Adv. in Pigment Cell Res. 517-530, hier beigefügt als Referenz.
Assay für MCH-Agonisten und -Antagonisten-Aktivität
Frosch-/Eidechsen-Melanozyten-Assay
Die Aktivität von Verbindungen, z. B. MCH und verwandten Analogen, z. B. MCH-Agonisten oder -Antagonisten, kann bestimmt werden durch einen in vitro Assay, der die Haut von Fröschen (R. pipiens) und Eidechsen (A. carolinensis) verwendet (siehe z. B. Castrucci et al. (1989) Gen. Corp. Endocrinol. 73:157-163, und Hruby et al. (1987) J. Med. Chem. 30:2126-2130, hier beigefügt als Referenz). Diese Assays basieren auf der Menge des Lichts, die von der Oberfläche der Haute in vitro reflektiert wird. In diesen Assays wandern Melanin-Granulae (Melanosomen) innerhalb der Melanozyten in Antwort auf MCH nach außen in die dendritischen Fortsätze der Pigmentzellen. Diese zentrifugale Granula-Translokation führt zu einer Verdunkelung der Haut. Die Veränderungen im Reflexionsgrad werden im Reflexionsmessgerät gemessen und üblicherweise als Prozentveränderung gegenüber den Ausgangswerten (Zeitpunkt Null) ausgedrückt. Ein Anstieg im Reflexionsgrad deutet Hautaufhellung an, während eine Abnahme im Reflexionsgrad eine Hautverdunkelung anzeigt. Das Entfernen von MCH (d.h. durch Spülen mit Ringer-Lösung) aus dem Inkubatinosmedium führt üblicherweise zu einer perinuklearen Aggregation von Melanosomen, die zu einer Aufhellung der Haute zurück zu den Ausgangswerten führt.
Kurz gesagt, wurden Frösche oder Eidechsen durch Enthauptung getötet und die Bein- und Oberschenkelhäute entfernt und lebensfähig in einem Bad von physiologischer Kochsalzlösung (Ringer) gehalten. Die Häute können über PVC-Ringe gespannt werden und die Ausgangs-Lichtreflexion im Reflexionsmessgerät bestimmt werden. Zum Beispiel können die Haute für die Messung der antagonistischen Aktivität für eine Stunde in verschiedenen Konzentrationen des potentiellen Antagonisten vorinkubiert werden. Nach diesem Zeitraum wird eine bekannte Konzentration von MCH zugegeben und seine Aktivität im selben Assay bestimmt. Dadurch können Dosis-Wirkungskurven für jeden möglichen MCH-Agonisten oder -Antagonisten und seine relative Wirksamkeit, verglichen mit MCH, bestimmt werden.
Fischschuppen-Melanozyten-Assay
Die Aktivität von Verbindungen, z. B. MCH und verwandten Analogen, z. B. Agonisten oder Antagonisten, kann auch in verschiedenen Melanozyten-Assays, die auf Fischschuppen beruhen, ausgewertet werden. In diesem Assay werden Fischschuppen benutzt, um die Wirkung von MCH-verwandten Verbindungen sichtbar zu machen. Die Schuppen einer Vielzahl von Fischen, wie z. B. dem Weißkehlbuntbarsch (Oreochromis mossambicus), können verwendet werden. Siehe z. B. Hogben und Slome (1931) Proc. R. Soc. B108:10-53, hier beigelegt als Referenz.
In Kürze, die Schuppen wurden in einer Lösung inkubiert, die das Melanin verteilt, was die Verdunkelung der Schuppen bewirkt. Eine Probe mit unbekannter MCH-Aktivität wird zugegeben. Wenn eine MCH-ähnliche Aktivität vorliegt, wird das Melanin konzentriert, was die Aufhellung der Schuppen bewirkt. Alternativ können die Schuppen auch in einer Kombination von MCH und mutmaßlichen Antagonisten inkubiert werden, um die Stärke des Antagonisten auszuwerten. Die Schuppen werden visuell unter dem Mikroskop ausgewertet. Siehe z. B. Kawauchi et al., Nature, 305:321-323 (1983), hier beigelegt als Referenz.
Teleostenhaut-Melanozyten-Bioassays
Ein wiederum anderes Verfahren verwendet den Teleostenfisch Synbranchus marmoratus, um die Melanosomen-aggregierende Aktivität von MCH, MCH-Analogen oder einer Probe mit unbekannter MCH-Aktivität auszuwerten. In diesem Assay ist der ruhende (unstimulierte) Zustand der Melanophoren durch verteilte Melanosomen charakterisiert, d. h. die Haut ist verdunkelt. Deshalb ist der Assay besonders geeignet für die Untersuchung von Melanosomen-aggregierenden Agentien wie MCH. Dieser Assay kann durchgeführt werden wie im Wesentlichen offenbart in Casstucci et al., Gen. Corp. Endocrin., 66:374-380 (1987), hier beigefügt als Referenz.
In Kürze, die Fischhäute werden in Stücke von etwa 2,5 mal 2,5 cm geschnitten, zwischen zwei Ringe (entweder aus PVC oder Metall) gebracht und für eine Stunde in einer geeigneten Pufferlösung equilibriert, bevorzugt Tyrodes oder Ringers. Im ruhenden (unstimulierten) Zustand sind die Häute verdunkelt. MCH wird ins Bad zugegeben und mit den Fischhäuten für 60 Minuten inkubiert. Die Veränderungen in der Hautfarbe wurden durch ein Reflexionsmessgerät gemessen. MCH wird die Aufhellung der Haute verursachen und zu höheren Reflektionswerten führen.
In vivo Melanozyten-Bioassay
Die MCH-ähnliche Aktivität von Analogen oder Proben kann auch in einem intakten Organismus ausgewertet werden. Wenn eine Regenbogenforelle einem schwarzen Hintergrund ausgesetzt wird, verdunkeln sich ihre Schuppen. Intraperitoneale Injektionen von MCH, seinem Analog, oder einer Probe mit unbekannter MCH-Aktivität in die verdunkelte Forelle wird zu einer Aufhellung der Schuppen führen, wenn MCH-ähnliche Aktivität vorliegt. Der Effekt setzt schnell ein und hält für mehrere Stunden an, wenn MCH-ähnliche Aktivität vorliegt. Dieser Assay kann durchgeführt werden wie im Wesentlichen offenbart in Kawauchi et al. Adv. in Pigment Cell Res., 517-530 (1988).
Radioimmuno-Assay und Immunhistochemie: Verfahren zur Bestimmung der Stärke der MCH-Bindung an ein Substrat
Die MCH-Konzentration in einem Individuum oder einer Gewebeprobe kann durch einen Radioimmuno-Assay bestimmt werden. Die Probe, die eine unbekannte MCH-Konzentration enthält, wird mit einem Standard mit bekannter Konzentration verglichen. Wenn eine Probe eine steigende Menge MCH enthält, wird relativ zum radioaktiv markierten MCH mehr unmarkiertes MCH für die Bindung zum Anti-MCH-Antikörper zur Verfügung stehen, was dazu führt, dass weniger radioaktiv markiertes MCH an den Anti-MCH-Antikörper bindet. Dies kann benutzt werden, um die Bindung von MCH oder einem Analog davon an ein Substrat z. B. in Anwesenheit oder Abwesenheit einer anderen Verbindung, z. B. einem mutmaßlichen Antagonisten, zu bestimmen.
Im Allgemeinen wird eine Probe vom Individuum genommen und Proteinproben hergestellt. Kaninchen-Anti-MCH kann als primärer Antikörper dienen und wird mit der Proteinprobe inkubiert, zu der radioaktiv markiertes MCH gegeben worden war. Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper wird dann zugegeben, um die Präzipitation des MCH-Kaninchen-Antikörper-Komplexes zu bewerkstelligen. Nach einer Inkubationsperiode wird die Probe zentrifugiert und das resultierende Pellet wird gezählt. Je mehr MCH in der Probe vorhanden ist, desto weniger Radioaktivität wird in dem resultierenden Pellet gefunden werden. Dieser Assay kann durchgeführt werden wie im Wesentlichen offenbart in Zamir et al., supra.
Die Lokalisation von MCH kann durch Fluoreszenz-Immunhistochemie erreicht werden. Zum Beispiel können 20 μM dicke Schnitte von Rattenhirnen hergestellt und auf Objektträger gebracht werden. Diese Schnitte werden mit einem Kaninchen-Anti-MCH-Antikörper oder einem gleichwertigen Antikörper inkubiert. Die Schnitte werden gewaschen, um überschüssigen Antikörper zu entfernen. Eine Inkubation mit einem fluoreszenz-markierten Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper erlaubt die Lokalisation von MCH-ähnlichem Material. Die Fluoreszenz kann im Fluoreszenz-Mikroskop nachgewiesen werden. Dieser Assay kann durchgeführt werden wie im Wesentlichen offenbart in Zamir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1528-1531 (1986).
Synaptosomen-Bindung
Die Fähigkeit einer Verbindung, an einen natürlich vorkommenden MCH-Rezeptor zu binden, z. B. die Fähigkeit von Analogen, mit MCH zu konkurrieren, kann bestimmt werden, indem radioaktiv markiertes MCH in Bindungsassays benutzt wird. Ein kompetitiver Antagonist kann verhindern, dass MCH mit seinem Rezeptor interagiert, wodurch weniger Radioaktivität gebunden wird. Ein hoch tritiiertes MCH wurde synthetisiert und ist verfügbar für Ganzzell-Bindungsstudien, siehe z. B. Drozdz und Eberle, J. Receptor & Signal Transduction Res. 15(1-4):487-502 (1995), hier beigefügt als Referenz. Verfahren zum Jodieren von MCH wurden ebenfalls entwickelt, siehe dazu z. B. Drozdz und Eberle, 23rd European Peptide Symphosium, Braga, Portugal (1994).
Im Allgemeinen wird zur Präparation von Membranen und Synaptosomen die Gewebeprobe von Interesse homogenisiert, oder mit Enzymen für ganze Zellen verdaut. Ganze Zellen, Membranen oder Synaptosomen können durch Zentrifugation isoliert werden. Z. B. können Membranen präpariert werden, indem die Gewebeprobe homogenisiert wird und die sich bildende Lösung zentrifugiert wird. Der Überstand wird gesammelt und zentrifugiert. Das Pellet wird resuspendiert und durch eine Kanüle mit kleinem Durchmesser gedrückt. Das unbehandelte Membranpellet wird in einem geeigneten Bindungspuffer resuspendiert. Die Membranen werden einer konstanten Konzentration von radioaktiv markiertem MCH und variierenden Konzentrationen des Analogs von Interesse ausgesetzt. Ungebundenes ³H-MCH wird von gebundenem ³H-MCH getrennt durch eine schnelle Filtration durch Fiberglasfilter. Die Filter werden gewaschen und gezählt. Siehe z. B. Drozdz und Eberle, J. Receptor & Signal Transduction Res. 15(1-4):487-502 (1995).
HEK-293-Assay
Wie hier diskutiert, können heterologe humane Nieren HEK-293-Zellen, die stabil mit einem Plasmid, das den MC3-Rezeptor trägt, transfiziert wurden, benutzt werden, um MCH- Aktivität zu messen. Es ist nicht geklärt, ob die MCH-Interaktion mit dem MC3-R-Rezeptor direkt oder indirekt ist, aber die Anwendung von MCH führt zu einem Ansteigen der Bindung von ACTH an den MC3-R-Rezeptor. "Scatchered"-Analyse legt einen Anstieg an ACTH-Bindungsstellen nahe, so dass der Effekt von MCH die Induktion einer sterischen Veränderung im Rezeptor sein könnte. Das Aussetzen von Zellen gegenüber 10^–7 Molar-MCH für 20 Minuten oder über Nacht führt zu einem Anstieg an ACTH-Bindung von 15-100%.
In vivo Nagetier-Gehirnassay
Wie hier diskutiert, können Nagetiere, z. B. Ratten, benutzt werden, um die MCH-Aktivität in vivo zu bestimmen. Ein Teflonkatheter kann in den dritten Ventrikel einer Ratte eingesetzt und befestigt werden. MCH oder seine Analoge, z. B. Agonisten oder Antagonisten, können über den Katheter in verschiedenen Konzentrationen eingebracht werden und ihr Effekt auf das Essverhalten bestimmt werden.
Identifizierung von Genen, die bevorzugt im ob/ob-Hypothalamus exprimiert werden durch PCR-Display
PCR-Display wurde verwendet, um die differentielle Expression von Neuropeptiden nachzuweisen, die für die Regulation des Appetits im Hypothalamus von fettleibigen Nagetieren bedeutend sein könnten. PCR-Display erlaubt das Screening bezüglich differentieller Genexpression mit relativ kleinen Mengen (100 μg) mRNA (Lian und Pardee, 1992, Science 257:967-971). Das PCR-Display wurde durchgeführt wie folgt. Männliche C57b16J ob/ob, ob/+-heterozygote, und nicht betroffene C57b16J Mause wurden im Alter von 7 Wochen von Jackson Laborstories (Bar Harbor, Maine) bezogen. Die Mause wurden nach der Ankunft mindestens 4 Tage ungestört gelassen, damit sie sich vom Versand erholen konnten.
Die gefütterten Mause wurden am Morgen getötet, nachdem sie mit einer IP-Injektion von 200 mg/kg Natriumamytal betäubt worden waren. In kleinen Experimenten wurde das Futter für die beschriebenen Zeitintervalle entzogen. Die Mause wurden enthauptet, die Hirne wurden entfernt, und die Hypothalami identifiziert, herausgeschnitten und sofort in RNAzol extrahiert (Cinna/Biotex Laborstories, Houston, Texas). Zehn Hypothalami, die etwa 100 mg wogen, wurden gesammelt und dann mit einem Handhomogenisator homogenisiert. Aliquots der Gesamt-RNA wurden mit DNAase I behandelt (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), um jegliche Spuren von DNA zu entfernen. Die RNA wurde in neun Teile aufgeteilt, und eine cDNA wurde mit Hilfe der MMTV reversen Transkriptase (Superscript RNAaseH, Gibco BRL, Gaithersburg, MD), und einem von neun verankerten Primern (siehe unten) synthetisiert. Die dadurch erhaltene cDNA wurde im PCR-Display verwendet.
Zwölf mögliche Downstream-Primer mit der Sequenz T₁₂XY (wobei X und Y ein beliebiges Nukleotid sind), die als Ankerprimer bezeichnet wurden, wurden mit etwa 50 willkürlichen Upstream-Primern verwendet, die als willkürliche Primer für den PCR-Display bezeichnet wurden. Die willkürlichen Upstream-Primer enthielten nicht mehr als 50% GC und besaßen keine interne Homologie zueinander. Durch die Verwendung dieser 600 Primerpaare war es möglich, die Expressionsstärke von etwa 30.000 mRNAs abzuschätzen (jedes Primerpaar ergab etwa 50 cDNA-Banden). In der vorliegenden Studie wurden 180 Primerpaare, die aus jeweils einem von neun Ankerprimern und 20 willkürlichen Primern bestanden, verwendet, um die mRNA-Expression im Hypothalamus von fettleibigen gegenüber nicht-fettleibigen Tieren zu untersuchen. cDNA, die durch die Reverse-Transkriptase-Reaktion gebildet wurde, wurde mit Hilfe der Amplitaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT) amplifiziert. Die Reaktionen wurden in Gegenwart von ³⁵S-ATP (NEN, Boston, MA) durchgeführt, und die Produkte wurden über ein Sequenzgel aufgetrennt. Die getrockneten Gele wurden für 24 bis 48 Stunden an einen Kodak X-OMAT AR-Film angelegt (Eastman Kodak, Rochester, NY). Nach dem Entwickeln des Films wurden die DNA-Fragmente von ob/ob- und ob/+-Hypothalamus verglichen.
Analyse von ob/ob-exprimierten Genen
In der PCR-Display-Reaktion schienen 52 DNA-Banden differentiell exprimiert zu sein. 35 dieser 52 Banden wurden mit Hilfe einer Northern Blot-Analyse mit Riboproben ausgewertet. Von diesen Banden konnte in 9 Fällen kein Signal nachgewiesen werden und kein Expressionsunterschied wurde für 20 Banden beobachtet. So wurden Expressionsunterschiede nur für 6 Banden von etwa 9.000 getesteten cDNAs bestätigt (oder etwa 0,7%). Von diesen passten zwei zu Einträgen in der Genbank: eines war Melanin-konzentrierendes Hormon (MCH), und das andere das Mausonkogen, fau. Eine dritte Bande hatte Homologie zu einem DNA-bindenden Faktor und drei zusätzliche Banden waren differentiell exprimiert, besaßen aber keine bekannte Homologie. Obwohl der Unterschied in der MCH-Expression im differentiellen Display absolut schien, d.h. es wurde kein Signal in ob/+-Mausen gegenüber dem starken Signal in ob/ob-Mäusen nachgewiesen, zeigte die Abschätzung der MCH-Expression mit einem Ribonuclease Protection Assay, dass der Unterschied zwischen gefütterten ob/ob- und ob/+-Mäusen ein relativ geringer 50 bis 80%iger Anstieg in den ob/ob-Tieren war.
Differentiell exprimierte Banden wurden identifiziert wie folgt. Die Banden, die entweder nur im ob/ob- oder nur im ob/+-Hypothalamus vorkamen, wurden aus dem getrockneten Gel ausgeschnitten und extrahiert, indem sie in 100 μl TB-Puffer gekocht und mit Ethanol in Gegenwart von Muskel-Glycogen (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) präzipitiert wurden. Die DNA wurde unter den selben PCR-Bedingungen mit dem ursprünglichen Primerset weiter vervielfacht, um eine bestimmte Bande zu bilden. Die Reaktionsprodukte wurden über ein 1%-Agarose-Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten, eluiert und in das pCR-Plasmid ligiert (InVitrogen, San Diego, CA).
Die in den pCR-Vektor inserierten Banden wurden mit Hilfe des Dideoxysequenzierungsverfahrens sequenziert, um sowohl die Sequenz als auch die Orientierung zu bestimmen. Abhängig von der Orientierung wurden der T4- oder der T7-Promotor benutzt, um eine Riboprobe herzustellen. Die Riboproben wurden benutzt, um Northern Blots zu testen, die 20 μg/RNA Spur von ob/ob- oder ob/+-Hypothalamus enthielten. Die Northern Blots wurden entweder gegen einen Kodak X-OMAT Film exponiert, oder mit dem Molecular Dynamics PhosphoImager analysiert.
MCH-Expression
Um den Expressionsunterschied von MCH in schlanken gegenüber fettleibigen Mausen weiter zu untersuchen, und um die Möglichkeit zu untersuchen, dass die Unterschiede abhängig vom Ernährungszustand waren, wurden Kontroll-C57B16J-Mäuse, C57B16J-ob/+-Heterozygote und C57B16J-ob/ob-Tiere sowohl im gefütterten Zustand als auch nach 24 Stunden des Fastens verglichen. 1 zeigt quantitative Daten, die aus hypothalamischen mRNA-Blots von gefütterten und gefasteten (fasted) Mausen erhalten wurden, die mit einer MCH-Probe getestet wurden. Die MCH-Expression steigt um 233% an in gefütterten ob/ob-Mäusen, verglichen mit schlanken Mäusen ohne das ob-Gen. Schlanke Heterozygote Mause liegen zwischen den beiden anderen Mausen und die MCH-mRNA ist um 156% erhöht gegenüber den Kontroll-Levels. Das Fasten für 24 Stunden erhöht die MCH-Expression in allen drei Gruppen von Mausen. Die Expression in Kontrollmäusen war um 233% erhöht, verglichen mit den gefasteten Tieren. Das relative Verhältnis der MCH mRNA-Levels in Kontroll-, ob/+- und ob/ob-Mäusen blieb das gleiche, aber die Gesamtmenge der MCH-mRNA verdoppelte sich für jede Gruppe.
Die Levels der NPY-mRNA wurden als "Kontroll"-Neuropeptid bestimmt. Im gefütterten Zustand war die NPY-Expression in ob/ob-Mausen etwas höher (161%) verglichen entweder mit den Kontroll-Homozygoten oder den ob/+-Mäusen. Die Levels der NPY-mRNA stiegen mit dem Fasten an, und die NPY-Expression war doppelt so hoch in gefasteten ob/ob-Mausen verglichen mit den gefütterten ob/ob-Mausen (gefastete Kontrollen 172% der gefütterten Kontroll-Mäuse).
Die Veränderungen in der MCH-Expression über die Zeit wurden auch in gefasteten C57B16J schlanken Tieren untersucht. Ein Anstieg der MCH-Expression wurde sechs Stunden nach Beginn des Fastens nachgewiesen und wuchs während 24 Stunden weiter an.
Weil andere Forscher extra-hypothalamische Expression beobachtet hatten, wurden Northern Blots, mit 30 μg RNA beladen und mit einer Riboprobe hybridisiert, benutzt, um eine Reihe von Organen auf ihre MCH-Expression zu untersuchen. Es konnte kein MCH-Signal außerhalb des Hypothalamus nachgewiesen werden.
Verabreichung von MCH in vivo
Um die Bedeutung von MCH als Appetit-Regulator weiter zu untersuchen, wurde ein Teflonkatheter in den dritten Ventrikel der Ratte eingebracht und befestigt, gefolgt von einer intraventrikulären Injektion von 5 μg MCH in 5 μl Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung. Kontrolltiere erhielten nur Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung. Die Verabreichung von MCH erhöhte das Fressverhalten, wodurch mehr als die doppelte Menge an Kcal in einer Stunde aufgenommen wurden (2).
Strukturelle Erfordernisse für MCH-Aktivität
Ein beträchtlicher Arbeitsaufwand wurde unternommen, um die strukturellen Erfordernisse für MCH-ähnliche Aktivität in Melanozyten-Assay-System mit Hilfe von Analogen des Lachs-MCH-Peptids zu bestimmen. Analoge, die sich aus dieser Arbeit ergaben, können auf ihre MCH-ähnliche Aktivität getestet werden, indem Verfahren der Erfindung benutzt werden, z. B. in vivo-Ratten-Assay oder in vitro-HEK-293-Rezeptorbindungs-Assay, oder neue MCH-Analoge, Z. B. humane MCH-Analoge, die auf dem Wissen des Standes der Technik über die strukturellen Erfordernisse beruhen, können synthetisiert werden und auf ihre Aktivität in einem der hier beschriebenen in vivo- oder in vitro-Assays getestet werden. Zahlreiche Forscher haben N-terminale und C-terminale Fragmentanaloge des Lachs-MCH synthetisiert und diese auf MCH-Aktivität in Teleosten-Haut-Bioassay und Frosch- und Eidechsen-Bioassays, die hier beschrieben wurden, getestet (siehe z. B. Matsunaga et al. (1989) Peptides 10:349-354; Hardley et al. (1987) Life Sci. 40:1139-1145). Diese Studien schlussfolgerten, dass die minimale Sequenz, die benötigt wird, um eine ähnlich starke Wirkung wie das native MCH hervorzurufen, MCH(5-15) ist, eine Struktur, der die Reste 1-4 vom N-terminalen Ende und die Reste 16-17 vom C-terminalen Ende des Peptids fehlen. Das Entfernen von Trp¹⁵, wodurch ein Fragment MCH(5-14) gebildet wird, führt zu einem Analog, das 100 bis 300 Mal weniger aktiv ist als das native MCH, was darauf hindeutet, dass Trp an Position 15 wichtig für die Aufrechterhaltung der vollen (gleich starken) Agonisten-Aktivität von MCH ist und dass der Indol-Ring des Trp-Restes wichtig sein könnte, damit MCH in seine Rezeptortasche passt, wodurch die Bindung ermöglicht wird. Weil Fragmentanaloge, die N-terminal verkürzt sind, z. B. die, denen die Reste 1-4 fehlen, äquipotent zu nativem MCH sind, scheinen diese für die MCH-Aktivität nicht benötigt zu werden. Das selbe wurde für die Reste 16-17 am C-terminalen Ende des Peptids geschlussfolgert. Weiterhin haben andere Forscher MCH-Analoge mit kontrahierter Ringstruktur synthetisiert und diese auf ihre Aktivität in Teleosten-Fischhaut-Bioassays getestet (siehe Z. B. Lebl et al. (1988) J. Med. Chem. 31:949-945; Lebl et al. (1989) Life Sci. 44:451-457; Matsunaga et al. (1989) Peptides 10:349-354). Die folgenden Ringkontraktionsanaloge (die eine Disulfidbrücke beibehalten) wurden synthetisiert: [Ala⁵, Cys¹⁰]MCH, [Ala⁵, Cys⁸]MCH, [Ala⁵, Cys⁷]MCH, [Ala⁵, Cys¹⁰]MCH_5-17, [Ala⁵, Cys⁸]MCH_5-17, [Ala⁵, Cys⁷]MCH_5-17, [Cys¹⁰]MCH_10-17, [Cys⁸]MCH_8-17, und [Cys⁷]MCH_7-17. Die Studien mit diesen Analogen schlussfolgerten, dass die Disulfidbrücke zwischen den Positionen 5 und 14 essentiell für die MCH-ähnliche Aktivität ist, da Ringkontraktionen die MCH-ähnliche Aktivität eliminierten oder größtenteils reduzierten. Es scheint, dass die Struktur mit 10 Einheiten und einem Ring, MCH(5-14), sehr wichtig für die optimale Aktivierung ist. Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass zwei Analoge, [Ala⁵, Cys⁸]MCH_5-17 und [Cys¹⁰]MCH_10-17 vollwertige Agonisten sind, wenn auch mit stark reduzierter Aktivität, was darauf hindeutet, dass die kürzeste Sequenz mit MCH-ähnlicher Aktivität die Einheiten 10-14 umfasst (Val-Tyr-Arg-Pro-Cys) (SEQ ID No: 1), wobei die Reste an den Positionen 11-14 (Tyr-Arg-Pro-Cys) (SEQ ID No: 2) möglicherweise entscheidend für die Weitergabe der Botschaft sind. Zusätzlich wurden azyklische Analoge synthetisiert und auf ihre MCH-Aktivität in Teleosten-Fischhaut-Bioassays getestet (siehe z. B. Kawauchi und Kawazoe (1988) Advances in Pigment Cell Res. 517-527; Matsunaga et al. (1992) Life Sci. 51: 679-685). Diese Analoge wurden derart konstruiert, dass sie vom nativen MCH nur in der Polarität der Seitenkettengruppe an den Positionen 5 und 14 abweichen. In einem Analog wurde das polare L-Serin für ein Cystein an den Positionen 5 und 14 eingesetzt (L-Ser^5,14 MCH), während für das andere Analog das nicht-polare L-α-Aminobutyrat (Abu) an den selben Positionen eingesetzt wurde (Abu^5,14 MCH). Ein anderes azyklisches Analog wurde hergestellt durch die Reduktion der Disulfidbrücke, gefolgt von der Carboxymethylierung von Cystein-Einheiten an den Positionen 5 und 14 (CAM-Cys^5,14 MCH). Alle diese Analoge zeigen keine MCH-ähnliche Aktivität, was darauf hinweist, dass die Disulfidbrücke notwendig ist, um die richtige Konformation und die topographischen Eigenschaften von MCH für die Rezeptorbindung und die Transmembransignaltransduktion aufrechtzuerhalten. Es wurden auch MCH-Derivate mit modifizierten Einheiten synthetisiert und auf ihre Aktivität in einem Fischschuppen-Assay getestet (siehe z. B. Kawauchi und Kawazoe (1988) Advances in Pigment Cell Res. 517-527). Die folgenden Derivate wurden synthetisiert und auf ihre Aktivität getestet: NPS-Trp¹⁵MCH, DHCH-Arg^4,9,12MCH, NO₂-Tyr¹¹MCH und S-O-Met^3,6MCH. Die Modifikationen der Aminosäurereste außerhalb der Ringstruktur hatten keinen Effekt auf die MCH-Aktivität, während die Modifikation von Resten innerhalb des Rings, z. B. DHCH-Arg^4,9,12MCH, NO₂-Tyr¹¹MCH und S-O-Met^3,6MCH zu Analogen mit einer stark reduzierten MCH-Aktivität führte. Diese Ergebnisse unterstützen die Einschätzung, dass die MCH-Aktivität von dem zyklischen Segment (MCH5-14) des Peptids ausgeht.
Die Melanozyten-basierten Assays sagen vorher, dass Peptide mit der folgenden Struktur nützlich als Agonisten der MCH-Aktivität sein können:
R¹-R²-R³-R⁴-R⁵-R⁶-R⁷-R⁸-R⁹-R¹⁰-R¹¹-R¹²-R¹³-R¹⁴-R¹⁵-R¹⁶-R¹⁷-R¹⁸-R¹⁹ (SEQ ID NO: 3),
wobei:
R¹ ist Asp, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, oder deletiert;
R² ist Phe, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, oder deletiert;
R³ ist Asp, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, oder deletiert;
R⁴ ist Met oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, Thr oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, oder deletiert;
R⁵ ist Leu, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, Met oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, oder deletiert;
R⁶ ist Arg, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, deletiert, oder Cys;
R⁷ ist Cys, oder eine beliebige Aminosäure;
R⁸ ist Met, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, oder Cys;
R⁹ ist Leu oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, oder Val oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle;
R¹⁰ ist Gly, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle;
R¹¹ ist Arg oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle;
R¹² ist Val, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle;
R¹³ ist Tyr, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle;
R¹⁴ ist Arg, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle;
R¹⁵ ist Pro, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, oder Cys;
R¹⁶ ist Cys, oder eine beliebige Aminosäure;
R¹⁷ ist Trp, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, ein Analog von Trp, z. B. NPS-Trp, eine Aminosäure mit einer aromatischen Seitengruppe, oder Cys;
R¹⁸ ist Gln, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, Glu oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, Trp, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, ein Analog von Trp, Z. B. NPS-Trp, eine Aminosäure mit einer aromatischen Seitengruppe, oder deletiert;
R¹⁹ ist Val, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, oder deletiert;
vorausgesetzt dass: Wenn R⁶ Cys ist, dann ist R¹⁵ Cys, die Disulfidbrücke bildet sich zwischen diesen beiden, und R⁷, R⁸, R¹⁶ und R¹⁷ sind nicht Cys; wenn R⁷ Cys ist, dann ist R¹⁶ Cys, die Disulfidbrücke bildet sich zwischen diesen beiden, und R⁶, R⁸, R¹⁵ und R¹⁷ sind nicht Cys; wenn R⁸ Cys ist, dann ist R¹⁷ Cys, die Disulfidbrücke bildet sich zwischen diesen beiden, R⁶, R⁷, R¹⁵ und R¹⁶ sind nicht Cys, und R¹⁸ ist Trp oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, ein Analog von Trp, z. B. NPS-Trp, oder eine Aminosäure mit einer aromatischen Seitengruppe.
In bevorzugten Ausführungsformen: R¹² ist Val, R¹³ ist Tyr, R¹⁴ ist Arg, R¹⁵ ist Pro, R¹⁶ ist Cys und R¹⁷ ist Trp; der Agonist hat eine Disulfidbrücke zwischen den Resten R⁷ und R¹⁶; der Disulfidring beinhaltet zehn Aminosäuren; dem Agonisten fehlen irgendein oder alle Reste zwischen R¹ und R⁶; dem Agonisten fehlen einer oder beide Reste zwischen R¹⁸ und R¹⁹; der Agonist hat mindestens 70, 80, oder 90% Homologie mit humanem, Ratten- oder Lachs-MCH; im Agonisten liegen 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Reste innerhalb des Rings modifiziert oder substituiert mit einer konservierender Aminosäure, wie in der hier bereitgestellten Tabelle vor.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Agonist: MCH(2-19), MCH(3-19), MCH(4-19), MCH(5-19), MCH(6-19), MCH(7-19), MCH(1-18), MCH(2-18), MCH(3-18), MCH(4-18), MCH(5-18), MCH(6-18), MCH(7-18), MCH(1-17), MCH(2-17), MCH(3-17), MCH(4-17), MCH(5-17), MCH(6-17), MCH(7-17) und NPS-Trp¹⁷MCH. Die Melanozyten-basierten Assays sagen voraus, dass die Peptide mit der folgenden Struktur nützlich als Antagonisten für MCH-Aktivität sein können:
R¹-R²-R³-R⁴-R⁵-R⁶-R⁷-R⁸-R⁹-R¹⁰-R¹ ¹-R¹²-R¹³-R¹⁴-R¹⁵-R¹⁶-R¹⁷-R¹⁸-R¹⁹, wobei:
R¹ ist Asp, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, oder deletiert;
R² ist Phe, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, oder deletiert;
R³ ist Asp, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, oder deletiert;
R⁴ ist Met oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, Thr oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, oder deletiert;
R⁵ ist Leu, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, Met oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, oder deletiert;
R⁶ ist Arg, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, eine beliebige D-Aminosäure, deletiert, oder Cys;
R⁷ ist Cys, oder eine beliebige Aminosäure;
R⁸ ist Met, ein konservierender Aminosäureaustausch von der hier bereitgestellten Tabelle, oder Cys;
R⁹ ist Leu oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, oder Val oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle;
R¹⁰ ist Gly, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle;
R¹¹ ist Arg oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle;
R¹² ist eine beliebige Aminosäure außer Val, oder ein anderer nicht-konservierender Aminosäureersatz;
R¹³ ist eine beliebige Aminosäure außer Tyr, oder ein anderer nicht-konservierender Aminosäureersatz;
R¹⁴ ist eine beliebige Aminosäure außer Arg, oder ein anderer nicht-konservierender Aminosäureaustausch;
R¹⁵ ist jede Aminosäure außer Pro, ein anderer nicht-konservierender Aminosäureersatz oder Cys;
R¹⁶ ist Cys, oder eine beliebige andere Aminosäure;
R¹⁷ ist Trp, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, ein Analog von Trp, z. B. NPS-Trp, eine Aminosäure mit einer aromatischen Seitengruppe, jede Aminosäure außer Trp, ein anderer nicht-konservierender Aminosäureersatz, eine Aminosäure ohne eine aromatische Seitengruppe, deletiert, oder Cys;
R¹⁸ ist Gin, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, Glu oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, Trp, oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, ein Analog von Trp, Z. B. NPS-Trp, eine Aminosäure mit einer aromatischen Seitengruppe, eine beliebige Aminosäure außer Trp, ein anderer nicht-konservierender Aminosäureersatz, eine Aminosäure ohne eine aromatischen Seitengruppe, oder deletiert;
R¹⁹ ist Val, ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, oder deletiert;
vorausgesetzt, dass: wenn R⁶ Cys ist, dann ist R¹⁵ Cys, die Disulfidbrücke bildet sich zwischen diesen beiden, und R⁷, R⁸, R¹⁶ und R¹⁷ sind nicht Cys; wenn R⁷ Cys ist, dann ist R¹⁶ Cys, die Disulfidbrücke bildet sich zwischen diesen beiden, und R⁶, R⁸, R¹⁵ und R¹⁷ sind nicht Cys; wenn R⁸ Cys ist, dann ist R¹⁷ Cys, die Disulfidbrücke bildet sich zwischen diesen beiden, R⁶, R⁷, R¹⁵ und R¹⁶ sind nicht Cys, und R¹⁸ ist Trp oder ein konservierender Aminosäureaustausch aus der hier bereitgestellten Tabelle, ein Analog von Trp, z. B. NPS-Trp, eine Aminosäure mit einer aromatischen Seitengruppe, eine beliebige Aminosäure außer Trp, ein anderer nicht-konservierter Aminosäureersatz, eine Aminosäure ohne eine aromatische Seitengruppe, oder deletiert.
In bevorzugten Ausführungsformen:
R¹² ist eine beliebige Aminosäure außer Val, oder ein anderer als ein konservierter Aminosäureersatz;
R¹³ ist jegliche Aminosäure außer Tyr, oder ein anderer als ein konservierter Aminosäureersatz;
R¹⁴ ist eine beliebige Aminosäure außer Arg, oder ein anderer als ein konservierter Aminosäureersatz;
R¹⁵ ist eine beliebige Aminosäure außer Pro oder ein anderer als ein konservierter Aminosäureersatz;
R¹⁶ ist Cys;
R¹⁷ ist eine beliebige Aminosäure außer Trp, ein anderer als ein konservierter Aminosäureersatz, eine Aminosäure ohne eine aromatische Seitengruppe, oder deletiert.
In bevorzugten Ausführungsformen: Der Antagonist hat eine Disulfidbrücke zwischen den Einheiten R⁷ und R¹⁶; der Disulfidring schließt zehn Aminosäuren ein; der Antagonist ist deletiert für beliebige oder alle Reste zwischen R¹ und R⁶; der Antagonist ist deletiert für einen oder beide Reste zwischen R¹⁸ und R¹⁹; der Antagonist besitzt mindestens 70, 80 oder 90% Homologie mit humanem, Ratte- oder Lachs-MCH; im Antagonist liegen 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Einheiten innerhalb des Rings modifiziert oder ausgetauscht gegen eine nicht konservierte Aminosäure vor.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Antagonist: MCH(1-16), MCH(2-16), MCH(3-16), MCH(4-16), MCH(5-16), MCH(6-16), MCH(7-16), DHCH-Arg^6,11,14MCH, und NO₂-Tyr¹³MCH.
Transgene Tiere
Genetische Techniken, die die Expression von Transgenen erlauben, die in vivo durch stellenspezifische genetische Manipulation reguliert sind, sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel stehen genetische Systeme zur Verfügung, die die regulierte Expression einer Rekombinase erlauben, die die genetische Rekombination einer Zielsequenz katalysiert. Der Begriff „Zielsequenz", wie er hier benutzt wird, bezeichnet eine Nukleotidsequenz, die durch eine Rekombinase genetisch rekombiniert wird. Die Zielsequenz ist flankiert von Rekombinase-Erkennungssequenzen und wird in Zellen, die die Rekombinase-Aktivität exprimieren, im Allgemeinen entweder ausgeschnitten oder invertiert. Die von Rekombinase katalysierten Rekombinationsereignisse können in einer Weise entworfen werden, dass die Rekombination der Zielsequenz entweder in der Aktivierung oder in der Repression der Expression des MCH-Polypeptids des Individuums resultiert. Zum Beispiel kann man die Expression des Gens aktivieren durch das Ausschneiden einer Zielsequenz, die mit der Expression des rekombinanten MCH-Gens interferiert, wie z. B. eine, die für ein antagonistisches Homolog kodiert. Diese Interferenz mit der Expression des Proteins kann das Ergebnis einer Vielzahl von Mechanismen sein, z. B. der räumlichen Trennung des MCH-Gens vom Promotor-Element oder ein internes Stop-Kodon.
Zudem kann ein Transgen hergestellt werden, in dem die kodierende Sequenz des Gens von Rekombinase-Erkennungssequenzen flankiert ist und das zunächst in Zellen in einer 3' zu 5' Orientierung in Bezug auf das Promotor-Element transfiziert wird. In solch einem Falle wird die Inversion der Zielsequenz das betroffene Gen so reorientieren, dass das 5'-Ende der kodierenden Sequenz in einer Orientierung in Bezug auf das Promotor-Element vorliegt, die die Promotor-getriebene transkriptionelle Aktivierung erlaubt. Siehe z. B. Beschreibungen des cre/loxP Rekombinasesystems des Bakteriophagen P1 (Lakso et al. (1992) PNAS 89:6232-6236; Orban et al. (1992) PNAS 89:6861-6865) oder das FLP Rekombinase-System aus Saccharomyces cerevisieae (O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355; WO 92/15694 ). Die genetische Rekombination der Zielsequenz ist abhängig von der Expression der Cre-Rekombinase. Die Expression der Rekombinase kann durch Promotor-Elemente reguliert werden, die einer regulatorischen Kontrolle unterliegen, z. B. gewebespezifisch, entwicklungsstadienspezifisch, induzierbar oder reprimierbar durch extern zugegebene Agenzien. Diese regulierte Kontrolle führt zur genetischen Rekombination der Zielsequenz nur in den Zellen, in denen die Rekombinase-Expression durch das Promotor-Element vermittelt wird. Deshalb kann die Expression des rekombinanten MCH durch die Kontrolle der Rekombinase-Expression reguliert werden. Ähnliche konditionale Transgene können bereitgestellt werden durch die Verwendung von prokaryontischen Promotorsequenzen, die es erfordern, dass gleichzeitig prokaryontische Proteine exprimiert werden, um die Expression des Transgens zu ermöglichen. Beispiele für Promototren und die korrespondierenden transaktivierenden prokaryontischen Proteine sind im US-Patent Nr. 4,833,080 gegeben.
Zudem kann die Expression der konditionalen Transgene durch Gentherapie-ähnliche Methoden induziert werden, wobei ein Gen, das für ein transaktivierendes Protein, z. B. eine Rekombinase oder ein prokaryotisches Protein, kodiert, in das Gewebe eingebracht wird und bewirkt wird, dass es exprimiert wird, z. B. in einer Zelltyp-spezifischen Weise. Durch diese Methode könnte das MCH-Transgen bis zum Erwachsenenstadium stillgelegt bleiben, bevor es durch die Einführung eines Transaktivators "eingeschaltet" wird.
Gentherapie
Die Genkonstrukte der Erfindung können auch als Teil eines Gentherapieprotokolls benutzt werden, um Nukleinsäuren, die entweder für eine agonistische oder eine antagonistische Form eines MCH-Peptids kodieren, einzubringen. Ein Merkmal der Erfindung sind Expressionsvektoren für die in vivo-Transfektion und Expression eines MCH-Peptids in speziellen Zelltypen, um die Funktion des MCH-Peptids wiederherzustellen oder alternativ seiner Funktion entgegenzuwirken in einer Zelle, in der das Peptid fehlexprimiert ist. Die Expressionskonstrukte für MCH-Peptide können in jedem biologisch wirksamen Träger verabreicht werden, z. B. jeder Formulierung oder Verbindung, die fähig ist, das MCH-Gen in vivo in Zellen wirksam einzubringen. Die Ansätze beinhalten die Insertion des Gens von Interesse in virale Vektoren beinhaltend rekombinante Retroviren, Adenvirus, Adeno-assoziierten Virus, und Herpes simplex-Virus-1, oder rekombinante bakterielle oder eurkaryontische Plasmide. Virale Vektoren transfizieren Zellen direkt; Plasmid-DNA kann mit Hilfe von, Z. B. kationischen Liposomen (Lipofektin), oder derivatisierten (z. B. Antikörper-konjugierten), Polylysin-Konjugaten, Gramacidin S, künstlichen viralen Hüllproteinen oder anderen solchen intrazellulären Trägern eingebracht werden, ebenso wie durch direkte Injektion des Genkonstrukts oder CaPO₄-Präzipitation, die in vivo durchgeführt wird.
Ein bevorzugter Ansatz für die in vivo-Einführung einer Nukleinsäure in eine Zelle ist die Verwendung eines viralen Vektors, der eine Nukleinsäure enthält, Z. B. eine cDNA, die für ein MCH-Polypeptid kodiert. Infektion von Zellen mit einem viralen Vektor hat den Vorteil, dass ein großer Prozentsatz der Zielzellen die Nukleinsäure aufnehmen kann. Zusätzlich werden Moleküle, die innerhalb des viralen Vektors kodiert werden, z. B. durch eine cDNA, die im viralen Vektor enthalten ist, effizient in den Zellen exprimiert, die die virale Vektor-Nukleinsäure aufgenommen haben.
Retrovirale Vektoren und Adeno-assoziierte Virusvektoren können als rekombinantes Gentransfersystem für den Transfer von exogenen Genen in vivo verwendet werden, speziell in Menschen hinein. Diese Vektoren sorgen für die effiziente Lieferung der Gene in die Zellen, und die transferierten Nukleinsäuren werden stabil in die chromosomale DNA des Wirtes integriert. Die Entwicklung von spezialisierten Zelllinien (als "Verpackungszellen" bezeichnet), die nur replikationsdefiziente Retroviren bilden, hat den Nutzen der Retroviren für die Gentherapie vergrößert, und defiziente Retroviren sind bezüglich ihres Einsatzes für Gentherapiezwecke charakterisiert (für eine Übersicht siehe Miller, A.D. (1990) Blond 76:271). Ein replikationsdefizienter Retrovirus kann in Virionen verpackt werden, die verwendet werden, um eine Zielzelle mit Hilfe eines Helfervirus durch Standardtechniken zu infizieren. Protokolle für die Produktion rekombinanter Retroviren und für die Infektion von Zellen in vitro oder in vivo mit solchen Viren sind zu finden in Current Protocols in Molecular Biology, Ausuber, F.M. et al. (Herausgeber) Greene Publishing Associates, (1989), Abschnitte 9.10-9.14 und anderen Standard-Laborhandbüchern. Beispiele für geeignete Retroviren schließen ein: pLJ, pZIP, pWE und pEM, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele für geeignete Virus-Verpackungslinien, um sowohl ecotrope als auch amphotrope retrovirale Systeme herzustellen, schließen ein: ψCrip, ψCre, ψ2 und ψAm. Die Retroviren wurden benutzt, um eine Vielzahl von Genen in viele verschiedene Zelltypen, einschließlich Epithelzellen, in vitro und/oder in vivo einzubringen (siehe z. B. Eglitis et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos und Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3014-3018; Armentann et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; US-Patent Nr. 4,868,116 ; US-PatentNr. 4,980,286 ; WO 89/07136 ; WO 89/02468 ; WO 89/05345 ; und WO 92/07573 ).
Ein anderes virales Genlieferungssystem, das für die vorliegende Erfindung von Nutzen ist, verwendet Vektoren, die von Adenviren abgeleitet sind. Das Genom eines Adenvirus kann derartig manipuliert werden, dass es für ein Genprodukt von Interesse kodiert und dieses exprimiert, aber inaktiviert ist in Bezug auf seine Fähigkeit in einem normalen lytischen viralen Lebenszyklus zu replizieren. Siehe zum Beispiel Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252-431-434; und Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155. Geeignete adenovirale Vektoren sind von der Adenoviruslinie Ad-Typ 5 d1324 oder anderen Adenoviruslinien (z. B. Ad2, Ad3, Ad7 usw.) abgeleitet und dem Fachmann bekannt. Rekombinante Adenoviren können unter manchen Bedingungen vorteilhaft sein, weil sie nicht fähig sind, sich nicht teilende Zellen zu infizieren und können verwendet werden, um eine große Vielzahl von Zelltypen zu infizieren, einschließlich Epithelzellen (Rosenfeld et al. (1992) supra). Weiterhin ist der Viruspartikel relativ stabil und der Aufreinigung und Konzentration zugänglich, und, wie oben beschrieben, kann er modifiziert werden, um das Spektrum der Infektiösität zu beeinflussen. Zusätzlich wird die eingebrachte adenovirale DNA (und die fremde DNA, die darin enthalten ist) nicht in das Genom der Wirtszelle integriert, sondern bleibt episomal, wodurch mögliche Probleme vermieden werden, die als Ergebnis der Insertionsmutagenese auftreten können, wenn die eingebrachte DNA (z. B. retrovirale DNA) in das Wirtsgenom integriert wird. Zusätzlich ist die Tragekapazität des adenoviralen Genoms für fremde DNA groß (bis zu 8 Kilobasen) verglichen mit anderen Genlieferungsvektoren (Berkner et al. supra; Haj-Ahmand und Graham (1986) J. Virol. 57:267).
Ein wiederum anderes virales Vektorsystem, das nützlich ist für die Einfuhr des MCH-Gens ist das Adeno-assoziierte Virus (AAV). Adeno-assoziertes Virus ist ein natürlich vorkommendes defektes Virus, das ein anderes Virus, wie ein Adenvirus oder ein Herpesvirus als Helfervirus für die effiziente Replikation und einen produktiven Lebenszyklus benötigt. (Für eine Übersicht siehe Muzyczka et al. Cum. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158:97-129). Es ist auch eine der wenigen Viren, die ihre DNA in sich nicht teilende Zellen integrieren, und zeigt eine hohe Häufigkeit von stabiler Integration (siehe zum Beispiel Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; und McLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973). Vektoren, die so wenig wie 300 Basenpaare von AAV enthalten, können verpackt und integriert werden. Die Menge an exogener DNA ist auf etwa 4,5 Kilobasen beschränkt. Ein AAV-Vektor, wie er in Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 beschrieben ist, kann benutzt werden, um DNA in Zellen einzuführen. Eine Vielzahl von Nukleinsäuren wurden in verschiedene Zelltypen unter Benutzung von AAV-Vektoren eingeführt (siehe zum Beispiel Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mal. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619; und Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790).
Zusätzlich zu viralen Transfermethoden wie den oben beschriebenen, können auch nicht-virale Verfahren verwendet werden, um die Expression eines MCH-Peptids im Gewebe eines Tieres zu bewirken. Die meisten nicht-viralen Methoden des Gentransfers verwenden Mechanismen, die von Säugetierzellen normalerweise für die Aufnahme und den intrazellulären Transport von Makromolekülen benutzt werden. In bevorzugten Ausführungsformen beruhen die nicht-viralen Geneinfuhrsysteme der vorliegenden Erfindung auf endozytischen Wegen für die Aufnahme des MCH-Gens durch die Zielzelle. Beispielhafte Geneinfuhrsysteme dieser Art schließen ein: von Liposomen abgeleitete Systeme, Polylysinkonjugate, und künstliche virale Hüllen.
In einer repräsentativen Ausführungsform kann ein Gen, das für ein MCH-Polypeptid kodiert, in Liposomen eingeschlossen werden, die positive Ladungen auf ihrer Oberfläche tragen (zum Beispiel Lipofektine) und (optional) die mit Antikörpern gegen Zelloberflächen-Antigene des Zielgewebes markiert sind (Mizuno et al. (1992) No Shinkei Geka 20:547-551; WO 91/06309 ; JP-A-1047381 ; und EP-A-43075 ).
In klinischen Rahmen können die Geneinfuhrsysteme für das therapeutische MCH-Gen durch eine Anzahl von Methoden in den Patienten eingeführt werden, von denen jede im Stand der Technik bekannt ist. Zum Beispiel kann eine pharmazeutische Präparation eines Geneinfuhrsystems systemisch eingebracht werden, zum Beispiel durch intravenöse Injektion, und spezifische Übertragung des Proteins in die Zielzellen findet hauptsächlich durch die Spezifität der Transfektion, die durch das Geneinfuhrvehikel, Zelltyp oder gewebespezifische Expression aufgrund der transkriptionellen regulatorischen Sequenzen, die die Expression des Reportergens kontrollieren, oder Kombinationen davon statt. In anderen Ausführungsformen ist die Ausgangs-Einfuhr des rekombinanten Gens dadurch eingeschränkt, dass die Einfuhr in das Tier räumlich relativ beschränkt ist. Zum Beispiel kann das Geneinfuhrvehikel durch einen Katheter eingebracht werden (siehe US-Patent 5,328,470 ) oder stereotaktische Injektion (z. B. Chen et al. (1994) PNAS 91:3054-3057).
Die pharmazeutische Präparation des Gentherapiekonstruktes kann im Wesentlichen aus dem Geneinfuhrsystem in einem geeigneten Verdünnungsmittel bestehen oder kann eine langsam freisetzende Matrix umfassen, in die das Geneinfuhrvehikel eingebettet ist. Alternativ kann die pharmazeutische Präparation eine oder mehrere Zellen, die das Geneinfuhrsystem produzieren, umfassen, wenn das vollständige Geneinfuhrsystem, z. B. retrovirale Vektore, von rekombinanten Zellen hergestellt werden kann.
Antisense-Therapie
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung der isolierten Nukleinsäure in der "Antisense"-Therapie. Der Begriff "Antisense"-Therapie, wie er hier benutzt wird, bezeichnet die Verabreichung oder in situ-Bildung von Oligonukleotiden oder ihren Derivaten, die spezifisch unter zellulären Bedingungen mit der zellulären mRNA und/oder genomischen DNA, die für MCH kodieren hybridisieren (z. B. binden), um die Expression des kodierten Proteins zu hemmen, z. B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation. Die Bildung kann durch konventionelle Basenpaarkomplementarität erfolgen, oder, z. B. im Falle der Bindung an DNA-Duplexe, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Im Allgemeinen bezeichnet "Antisense"-Therapie eine Anzahl von Techniken, die allgemein im Stand der Technik angewendet werden und beinhaltet jede Therapie, die auf der spezifischen Bindung an Oligonukleotidsequenzen beruht.
Ein Antisense-Konstrukt der vorliegenden Erfindung kann z. B. als ein Expressionsplasmid eingeführt werden, das nach Transkription in der Zelle RNA produziert, die komplementär zu mindestens einem einzigartigen Abschnitt der zellulären mRNA ist, die für ein MCH kodiert. Alternativ ist das Antisense-Konstrukt eine Oligonukleotidsonde, die ex vivo gebildet wird und die nach Einfuhr in die Zelle die Hemmung der Expression vermittelt durch Hybridisierung mit der mRNA und/oder der genomischen Sequenz eines MCH-Gens. Solche Oligonukleotidsonden sind bevorzugt modifizierte Oligonukleotide, die resistent gegen endogene Nukleasen, z. B. Exonukleasen und/oder Endonukleasen, sind und daher in vivo stabil sind. Beispielhafte Nukleinsäuremoleküle zur Verwendung als Antisense-Oligonukleotide sind Phosphoramidat-, Phosphorothioat- und Methylphosphonatanaloge der DNA (siehe auch US-Patente 5,176,996 ; 5,264,564 ; und 5,256,775 ). Zusätzlich sind allgemeine Ansätze für die Bildung von Oligomeren, die in der Antisense-Therapie nützlich sind, in einem Übersichtsartikel von z. B. Van der Krol et al. (1988) Biotechniques 6:958-976; und Stein et al. (1988) Cancer Res. 48:2659-2668 beschrieben.
Entsprechend sind modifizierte Oligomere der Erfindung nützlich in therapeutischen, diagnostischen und Forschungszusammenhängen. In therapeutischen Anwendungen werden die Oligomere in einer Weise benutzt, die für die Antisense-Therapie in Allgemeinen geeignet ist. Für eine solche Therapie können die Oligomere der Erfindung für eine Reihe von Verabreichungsformen formuliert werden, einschließlich der systemischen und der topischen oder lokalisierten Verabreichung. Für die systemische Verabreichung wird die Injektion bevorzugt, einschließlich der intramuskulären, intravenösen, intraperitonealen und subkutanen Injektion. Für die Injektion können die Oligomere der Erfindung in wässrigen Lösungen formuliert werden, bevorzugt in physiologisch kompatiblen Puffer wie der Hank-Lösung oder der Ringer-Lösung. Zusätzlich können die Oligomere in fester Form formuliert werden und unmittelbar vor der Verwendung aufgelöst oder suspendiert. Lyophilisierte Formen sind auch in der Erfindung eingeschlossen.
Die Verbindungen können oral verabreicht werden, oder auf transmukosalem oder transdermalem Wege. Zur transmukosalen oder transdermalen Verabreichung werden in der Formulierung Penetrantien benutzt, die geeignet sind, die Barriere zu überwinden. Solche Penetrantien sind im Stand der Technik bekannt, und schließen z. B. ein: für die transmukosale Verabreichung Gallensalze und Fusidinsäurederivate und Detergenzien. Die transmukosale Verabreichung kann durch Nasensprays oder mit Hilfe von Zäpfchen erfolgen. Für die orale Verabreichung werden die Oligomere in konventionellen oralen Verabreichungsformen wie Kapseln, Tabletten oder Säften formuliert. Für die topische Verabreichung werden die Oligomere der Erfindung in Salben, Balsamen, Gelen oder Cremes formuliert, wie im Stand der Technik bekannt.
Zusätzlich zur Verwendung in der Therapie können die Oligomere der Erfindung auch als diagnostische Reagenzien verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit der Ziel-DNA- oder RNA-Sequenzen nachzuweisen, an die sie spezifisch binden.
Herstellung von Peptid-Analogen
Der Erfinder hat herausgefunden, dass MCH das Essverhalten reguliert. Weil die Struktur von MCH bekannt ist, kann ein Fachmann die MCH-Struktur verändern, z. B. durch die Herstellung von Fragmenten oder Analogen, und die neu hergestellten Strukturen auf ihre Aktivität zu testen. Beispiele für Verfahren aus dem Stand der Technik, die die Herstellung und den Test der Fragmente und Analoge erlauben, werden hier diskutiert. Diese oder analoge Verfahren können verwendet werden, um Fragmente und Analoge von MCH herzustellen und zu screenen, die an einen natürlich vorkommenden Liganden von MCH, z. B. einen MCH-Rezeptor, z. B. MC3-R binden. Ebenso können sie benutzt werden, um Fragmente und Analoge herzustellen, die MCH binden.
Herstellung von Fragmenten
Fragmente eines Proteins können auf unterschiedliche Weise produziert werden, z. B. rekombinant, durch proteolytischen Verdau, oder durch chemische Synthese. Interne oder terminale Fragmente eines Polypeptids können gebildet werden durch das Entfernen eines oder mehrerer Nukleotide von einem Ende (für ein terminales Fragment) oder von beiden Enden (für ein internes Fragment) einer Nukleinsäure, die für das Polypeptid kodiert. Die Expression der mutagenisierten DNA produziert Polypeptidfragmente. Der Verdau mit Endonukleasen, die Nukleotide vom Ende abspalten, kann DNAs produzieren, die für eine Reihe von Fragmenten kodieren. DNAs, die für Fragmente eines Proteins kodieren, können auch durch willkürliches Scheren, Restriktionsverdau oder eine Kombination der oben diskutierten Verfahren hergestellt werden.
Fragmente können auch chemisch synthetisiert werden durch Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, wie etwa konventionelle Merrifield Festphasen-f-Moc oder t-Boc-Chemie. Zum Beispiel können Peptide der vorliegenden Erfindung willkürlich eingeteilt werden in Fragmente der gewünschten Länge ohne Überlappung der Fragmente oder eingeteilt werden in überlappende Fragmente der gewünschten Länge.
Herstellung veränderter DNA und Peptidsequenzen: willkürliche Verfahren Varianten der Aminosäuresequenz eines Proteins können hergestellt werden durch willkürliche Mutagenese der DNA, die für ein Protein oder eine bestimmte Domäne oder Region eines Proteins kodiert. Brauchbare Verfahren schließen ein: PCR-Mutagenese und Sättigungsmutagenese. Eine Sammlung von willkürlichen Varianten der Aminosäuresequenz kann auch gebildet werden durch die Synthese eines Satzes degenerierter Oligonukleotidsequenzen (Verfahren für das Screening von Proteinen in einer Sammlung von Varianten sind woanders in dieser Beschreibung beschrieben).
PCR-Mutagenese
In der PCR-Mutagenese wird eine reduzierte Genauigkeit der Taq-Polymerase benutzt, um willkürliche Mutationen in ein kloniertes DNA-Fragment einzuführen (Leung et al., 1989, Technique 1:11-15). Dies ist eine sehr effiziente und relativ schnelle Methode, um willkürliche Mutationen einzuführen. Die DNA-Region, die mutagenisiert werden soll, wird durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert unter Bedingungen, die die Genauigkeit der DNA-Synthese durch die Taq-DNA-Polymerase reduzieren, z. B. durch Verwendung eines dGTP/dATP-Verhältnisses von fünf und durch die Zugabe von Mn²⁺ zur PCR-Reaktion. Der Pool der amplifizierten DNA-Fragmente wird in geeignete Klonierungsvektoren inseriert, um Sammlungen von willkürlichen Mutanten herzustellen.
Sättigungsmutagenese
Die Sättigungsmutagenese erlaubt die rasche Einführung einer hohen Anzahl von Einzelbasenaustäuschen in klonierte DNA-Fragmente (Mayers et al., 1985, Science 229:242). Diese Technik beinhaltet die Herstellung von Mutationen, z. B. durch chemische Behandlung oder Bestrahlung von Einzelstrang-DNA in vitro, und die Synthese eines komplementären DNA-Stranges. Die Mutationshäufigkeit kann moduliert werden durch die Modulation der Intensität der Behandlung, und im Wesentlichen können alle möglichen Basenaustäusche erhalten werden. Da diese Prozedur keine genetische Selektion von Mutanten-Fragmenten beinhaltet, können sowohl neutrale Austausche als auch welche, die die Funktion ändern, erhalten werden. Die Verteilung der Punktmutationen ist nicht einseitig gegenüber konservierten Sequenzelementen.
Degenerierte Oligonukleotide
Eine Bibliothek von Homologen kann auch hergestellt werden durch einen Satz von degenerierten Oligonukleotidsequenzen. Chemische Synthese von degenerierten Sequenzen kann in einem automatischen DNA-Synthetisierer durchgeführt werden und die synthetischen Gene dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Synthese von degenerierten Oligonukleotiden ist im Stand der Technik bekannt (siehe z. B. Narang, SA (1983), Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, Herausgeber AG Walton, Amsterdam: Elsevier S.273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477. Solche Techniken wurden für die gesteuerte Evolution anderer Proteine verwendet (siehe z. B. Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87:6378-6382; und die US-Patente Nrn. 5,223,409 , 5,198,346 und 5,096,815 ).
Herstellung veränderter DNA- und Peptidsequenzen: Verfahren zur gerichteten Mutagenese
Nicht-willkürliche oder gerichtete Mutagenese-Techniken können verwendet werden, um spezifische Sequenzen oder Mutationen in spezifischen Regionen bereitzustellen. Diese Techniken können benutzt werden, um Varianten zu bilden, die einschließen, z. B. Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Resten einer bekannten Aminosäuresequenz eines Proteins. Die Mutationsstellen können individuell oder seriell modifiziert werden, z. B. durch (1) Austausch zuerst mit konservierten Aminosäuren und anschließend mit einer radikaleren Auswahl abhängig von den erreichten Ergebnissen, (2) Deletion des Zielrestes, oder (3) Insertion von Resten der gleichen oder einer unterschiedlichen Klasse angrenzend an die geortete Stelle, oder Kombinationen der Möglichkeiten 1-3.
Alanin-Scanning-Mutagenese
Alanin-Scanning-Mutagenese ist ein nützliches Verfahren zur Identifizierung bestimmter Reste oder Regionen eines gewünschten Proteins, die bevorzugte Stellen oder Domänen für die Mutagenese sind, Cunningham und Wells (Science 244:1081-1085, 1989). Beim Alanin-Scanning wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert (z. B. geladene Reste wie Arg, Asp, His, Lys, und Glu) und ersetzt durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (am meisten bevorzugt Alanin oder Polyalanin). Der Austausch einer Amino saure kann die Interaktion von Aminosäuren mit der umgebenden wässrigen Umgebung innerhalb oder außerhalb der Zelle beeinflussen. Diese Domänen, die funktionelle Empfindlichkeit gegenüber den Austauschen zeigen, werden dann weiter untersucht durch das Einbringen weiterer oder anderer Varianten an oder für die Stellen des Austausches. So muss die Art der Mutation per se nicht vorbestimmt werden, während die Stelle für das Einsetzen einer Aminosäuresequenzvariation vorbestimmt ist. Zum Beispiel kann, zur Optimierung der Leistung eine Mutation an einer bestimmten Stelle, Alanin-Scanning oder willkürliche Mutagenese durchgeführt werden an dem Zielkodon oder der Zielregion und die exprimierten gewünschten Varianten der Protein-Untereinheiten werden für die optimale Kombination der gewünschten Aktivität gescreent.
Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese
Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese ist ein nützliches Verfahren, um Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten der DNA herzustellen, siehe z. B. Adelman et al. (DNA 2:183, 1983). In Kürze, die gewünschte DNA wird durch Hybridisierung eines Oligonukleotids, das für eine Mutation kodiert, mit einer DNA-Vorlage verändert, wobei die Vorlage eine einzelsträngige Form eines Plasmids oder Bakteriophagen ist, die die unveränderte oder native DNA-Sequenz des gewünschten Proteins enthält. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase benutzt, um den gesamten zweiten komplementären Strang de Vorlage zu synthetisieren und so den Oligonukleotidprimer einbauen, und wird für die ausgewählte Veränderung in der gewünschten Protein-DNA kodieren. Im Allgemeinen werden Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 25 Nukleotiden benutzt. Ein optimales Oligonukleotid wird zwischen 12 bis 15 Nukleotiden besitzen, die komplett komplementär zur Vorlage sind auf beide Seiten des/der Nukleotide(n), das/die für die Mutation kodiert/kodieren. Dies gewährleistet, dass das Oligonukleotid richtig an das einzelsträngige DNA-Vorlagen-Molekül hybridisiert. Die Oligonukleotiden werden leicht synthetisiert unter der Verwendung von Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, wie z. B. beschrieben bei Crea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765 [1978]).
Kassetten-Mutagenese
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Varianten, die Kassetten-Mutagenese, basiert auf einer Technik, die von Wells et al. beschrieben wurde (Gene, 34:315[1985]). Das Ausgangsmaterialist ein Plasmid (oder ein anderer Vektor), der die zu mutierende DNA für die Protein-Untereinheit enthält. Das/Die zu mutierende(n) Kodon(s) in der DNA für die Protein-Untereinheit werden identifiziert. Es muss eine einzigartige Restriktion-Endonukleasestelle an beiden Seiten der identifizierten Mutationsstelle(n) vorliegen. Wenn solche Restriktionsstellen nicht vorhanden sind, können sie mit Hilfe der oben beschriebenen Oligonukleotidvermittelte Mutagenese-Methode an geeigneten Stellen in der gewünschten DNA für die Proteinuntereinheit eingeführt werden. Nachdem die Restriktionsstellen in das Plasmid eingeführt wurden, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonukleotid, das für die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen kodiert, aber die gewünschten Mutationen enthält, wird mit Hilfe von Standardmethoden synthetisiert. Die beiden Stränge werden unabhängig voneinander synthetisiert und dann mit Hilfe von Standardtechniken miteinander hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonukleotid wird als Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so entworfen, dass sie 3'- und 5'-Enden hat, die mit den Enden des linearisierten Plasmids vergleichbar sind, so dass sie direkt mit dem Plasmid ligiert werden können. Dieses Plasmid enthält nun die mutierte DNA-Sequenz für die gewünschte Proteinuntereinheit.
Kombinatorische Mutagenese
Um Mutanten herzustellen, kann auch die kombinatorische Mutagenese benutzt werden (Ladner et al., WO 88/06630 ). In diesem Verfahren werden die Aminosäuresequenzen für eine Gruppe von Homologen oder anderen verwandten Proteinen aneinander ausgerichtet, bevorzugt um die höchstmögliche Homologie zu fördern. Alle die Aminosäuren, die an einer bestimmten Position der ausgerichteten Sequenzen auftauchen, können ausgewählt werden, um einen degenerierten Satz von kombinatorischen Sequenzen herzustellen. Die bunt gemischte Bibliothek von Varianten wird gebildet durch kombinatorische Mutagenese auf dem Nukleinsäurelevel und wird kodiert durch eine bunt gemischte Bibliothek von Genen. Z. B. kann ein Gemisch von synthetischen Oligonukleotiden enzymatisch in Gensequenzen ligiert werden, so dass der degenerierte Satz möglicher Sequenzen als individuelle Peptide exprimierbar ist, oder alternativ als ein Satz längerer Fusionsproteine, die einen Satz von degenerierten Sequenzen enthalten.
Primäre Hochdurchsatz-Verfahren zum Screening von Bibliotheken von Peptidfragmenten oder Homologen
Im Stand der Technik sind verschiedene Techniken bekannt, um hergestellte mutante Genprodukte zu screenen. Die Techniken für das Screenen großer Gensammlungen beinhalten häufig das Klonieren der Gensammlung in replizierbare Expressionsvektoren, das Transformieren geeigneter Zellen mit der resultierenden Bibliothek von Vektoren, und Expression der Gene unter Bedingungen, in denen der Nachweis einer gewünschten Aktivität, z. B. in diesem Fall Bindung von MCH oder eines natürlich vorkommenden Liganden von MCH, z. B. einem MCH-Rezeptor, z. B. MC3-R, die relativ leichte Isolation des Vektors ermöglicht, der für das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wird. Jede der unten beschriebenen Techniken ist verwendbar für die Hochdurchsatz-Analyse zum Screenen einer großen Anzahl von z. B. durch willkürliche Mutagenese-Techniken gebildeten Sequenzen.
Two-Hybrid-Systeme
Two-Hybrid-Assays (wie die anderen Screening-Verfahren, die hier beschrieben werden) können verwendet werden, um Fragmente oder Analoge eines MCH-Polypeptids zu identifizieren, die an natürlich vorkommende Liganden von MCH, z. B. einen MCH-Rezeptor, z. B. MC3-R, binden. Diese können Agonisten, Superagonisten und Antagonisten einschließen. (Der MCH-Ligand wird als "Bait"-Protein benutzt und die Sammlung von Varianten wird als "Fisch-Fusions-Proteine" exprimiert.) In analoger Weise kann ein Two-Hybrid-Assay (wie die anderen hier beschriebenen Screening-Methoden) benutzt werden, um Fragmente und Analoge zu finden, die MCH binden.
Display-Bibliotheken
In einem Ansatz von Screening-Assays werden die Kandidaten-Peptide auf der Oberfläche einer Zelle oder eines viralen Partikels präsentiert und die Fähigkeit von bestimmten Zellen oder viralen Partikeln, ein geeignetes Rezeptor-Protein durch das präsentierte Produkt zu binden, wird in einem "Panning-Assay" nachgewiesen. Z. B. kann die Genbank in das Gen für ein Oberflächenmembran-Protein einer Bakterienzelle kloniert werden, und das resultierende Fusionsprotein durch das "Panning" nachgewiesen werden (Ladner et al., WO 88/06630 ; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1371; und Goward et al. (1992) TIBS 18:136-140). In einer ähnlichen Weise kann ein nachweisbar markierter Ligand benutzt werden, um potentiell funktionale Peptid-Homologe zu markieren. Fluoreszenz-markierte Liganden, z. B. Rezeptoren, können benutzt werden, um ein Homolog nachzuweisen, das die Ligandenbindende Aktivität beibehält. Die Verwendung von Fluoreszenz-markierten Liganden erlaubt die visuelle Untersuchung von Zellen und die Unterscheidung in einem Fluoreszenzmikroskop oder, wenn es die Morphologie der Zelle erlaubt, die Trennung durch einen Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer.
Eine Genbank kann als ein Fusionsprotein auf der Oberfläche eines viralen Partikels exprimiert werden. Zum Beispiel können im filamentösen Phagensystem fremde Peptidsequenzen auf der Oberfläche eines infektiösen Phagen exprimiert werden, wodurch zwei beträchtliche Vorteile erreicht werden. Erstens, da dieser Phage mit einer Konzentration von mehr als 10¹³ Phagen pro Milliliter auf Affinitätsmatrices aufgebracht werden kann, kann eine große Zahl von Phagen gleichzeitig gescreent werden. Zweitens, da jeder infektiöse Phage ein Genprodukt auf seiner Oberfläche präsentiert, kann der Phage durch eine weitere Infektionsrunde amplifiziert werden, wenn ein bestimmter Phage mit einer geringen Ausbeute von der Affinitätsmatrix abgelöst werden kann. Die Gruppe von fast identischen E. coli filamentösen Phagen M13, fd., und fl werden am häufigsten in Phagen-Display-Bibliotheken benutzt. Um Fusionsproteine zu bilden, können entweder die Hüllproteine gIII oder gVIII des Phagen benutzt werden, ohne die endgültige Verpackung des viralen Partikels zu stören. Fremde Epitope können am NH₂-terminalen Ende von gIII exprimiert werden und Phagen, die solche Epitope tragen, können aus einem großen Überschuss von Phagen, denen dieses Epitop fehlt, wiedergewonnen werden (Ladner et al., WO 90/02909 ; Garrard et al., WO 92/09690 ; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 16007-16010; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; und Barbas et al. (1992) PNAS 89: 4457-4461).
Ein verbreiteter Ansatz verwendet den Maltose-Rezeptor von E. coli (das Protein der äußeren Membran, LamB) als einen Peptid-Fusionspartner (Charbit et al. (1986) EMBO 5, 3029-3037). Oligonukleotide wurden in Plasmide inseriert, die für das LamB-Gen kodieren, um Peptide zu bilden, die an eine der extrazellulären Schleifen des Proteins fusioniert sind. Diese Peptide stehen zur Bindung von Liganden, z. B. Antikörpern, zur Verfügung und können eine Immunantwort auslösen, wenn die Zellen an Tiere verabreicht werden. Andere Zelloberflächen-Proteine, z. B. OmpA (Schorr et al. (1991) Vaccines 91, Seiten 387-392), PhoE (Agterberg et al. (1990) Gene 88, 37-45), und PAL (Fuchs et al. (1991) Bio/rech 9, 1369-1372) ebenso wie große bakterielle Oberflächenstrukturen haben als Mittel zum Präsentieren von Peptiden gedient. Peptide können an Pilin fusioniert sein, ein Protein, das polymerisiert, um den Pilus zu bilden – eine Verbindung zum interbakteriellen Austausch von genetischer Information (Thiry et al. (1989) Appl. Environ. Microbiol. 55, 984-993). Aufgrund seiner Rolle in der Interaktion mit anderen Zellen stellt der Pilus ein nützliches Hilfsmittel für die Präsentation von Peptiden gegenüber der extrazellulären Umgebung dar. Eine andere große Oberflächenstruktur, die zum Präsentieren der Peptide verwendet wird, ist das bakterielle Bewegungsorgan, das Flagellum. Fusion von Peptiden an die Protein-Untereinheit Flagellin bietet eine dichte Anordnung von vielen Peptidkopien auf den Wirtszellen (Kuwajima et al. (1988) Bio/rech. 6, 1080-1083). Oberflächenproteine anderer bakterieller Spezies haben auch als Peptid-Fusionspartner gedient. Beispiele schließen ein das Staphylococcus Protein A und die Protease IgA der äußeren Membran von Neisseria (Hansson et al. (1992) J. Bacteriol. 174, 4239-4245 und Klauser et al. (1990) EMBO J. 9, 1991-1999).
In den oben beschriebenen filamentösen Phagen-Systemen und dem LamB-System entsteht die physikalische Verbindung zwischen dem Peptid und der für es kodierenden DNA durch das Enthaltensein der DNA innerhalb des Partikels (Zelle oder Phage), der das Peptid auf seiner Oberfläche trägt. Das Einfangen des Peptids fängt den Partikel und die DNA darin. Ein alternatives Schema verwendet das DNA-bindende Protein LacI, um eine Verbindung zwischen Peptid und DNA zu schaffen (Cull et al. (1992) PNAS USA 89: 1865-1869). Dieses System verwendet ein Plasmid, das das LacI-Gen mit einer Oligonukleotid-Klonierungsstelle an seinem 3'-Ende enthält. Unter der kontrollierten Induktion durch Arabinose wird ein LacI-Peptid-Fusionsprotein gebildet. Dieses Fusionsprotein behält die natürliche Fähigkeit von LacI bei, an eine kurze DNA-Sequenz, die als LacO-Operator (LacO) bekannt ist, zu binden. Durch Einbringen von zwei Kopien von LacO in das Expressionsplasmid bindet die LacI-Peptid-Fusion eng an das Plasmid, das für es kodiert hat. Weil die Plasmide in jeder Zelle nur eine einzige Oligonukleotidsequenz enthalten, und jede Zelle nur eine einzige Peptidsequenz exprimiert, assoziieren die Peptide spezifisch und stabil mit der DNA-Sequenz, die ihre Synthese gesteuert hat. Die Zellen der Sammlung werden milde lysiert und die Peptid-DNA-Komplexe einer Matrix des immobilisierten Rezeptors ausgesetzt, um die Komplexe wiederzugewinnen, die aktive Peptide enthalten. Die assoziierte Plasmid-DNA wird dann zur Amplifikation und DNA-Sequenzierung wieder in Zellen eingeführt, um die Identität der Peptid-Liganden zu bestimmen. Als ein Beweis für die praktische Verwendbarkeit des Verfahrens wurde eine große willkürliche Bibliothek von Dodeca-Peptiden hergestellt und an einem monoklonalen Antikörper gegen das Opioid-Peptid Dynorphin B selektioniert. Eine Reihe von Peptiden wurde wiedergewonnen, alle miteinander verwandt durch eine Konsensussequenz, die zu einem Abschnitt von sechs Aminosäuren von Dynorphin B korrespondiert (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89-1869).
Dieses Schema, das gelegentlich als Peptide-auf-Plasmiden bezeichnet wird, unterscheidet sich in zwei wichtigen Aspekten von den Phagen-Display-Verfahren. Erstens werden die Peptide an den C-Terminus des Fusionsproteins angehängt, was dazu führt, dass die Mitglieder der Sammlung als Peptide mit freiem Carboxy-Terminus präsentiert werden. Beide Hüllproteine des filamentösen Phagen, pIII und pVIII, sind durch ihre C-Termini an den Phagen verankert und die Guest-Peptide befinden sich in den sich nach außen erstreckenden N-terminalen Domänen. In manchen experimentellen Entwürfen werden die durch die Phagen präsentierten Peptide direkt am Amino-Terminus des Fusionsproteins präsentiert (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378-6382). Ein zweiter Unterschied ist der Satz von biologischen Vorlieben, die die Population von Peptiden, die tatsächlich in den Sammlungen vorhanden sind, beeinflussen. Die LacI-Fusionsmoleküle sind auf das Zytoplasma der Wirtszellen beschränkt. Die Phagen-Hüllfusionen werden während der Translation kurz dem Zytoplasma ausgesetzt, werden dann aber rasch durch die innere Membran in das periplasmatische Kompartiment sezerniert, und bleiben durch ihre C-terminalen hydrophoben Domänen in der Membran verankert, während die N-Termini, die die Peptide enthalten, sich in das Periplasma erstrecken, während sie auf den Einbau in die Phagen-Partikel warten. Die Peptide in den LacI- und Phagen-Sammlungen können sich signifikant unterscheiden durch ihre Exposition gegenüber verschiedenen proteolytischen Aktivitäten. Die Phagen-Hüllproteine benötigen den Transport urch die innere Membran und die Prozessierung durch Signalpeptidasen als eine Voraussetzung für ihren Einbau in die Phagen. Bestimmte Peptide üben eine zerstörerische Wirkung auf diese Prozesse aus und sind in den Bibliotheken unterrepräsentiert (Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37 (9):1233-1251). Diese speziellen Vorlieben sind kein Faktor im LacI-Display-System.
Die Anzahl kleiner Peptide, die in rekombinanten willkürlichen Bibliotheken zur Verfügung stehen, ist enorm. Bibliotheken mit 10⁷ bis 10⁹ unabhängigen Klonen werden routinemäßig präpariert. Bibliotheken mit einer Größe von 10¹¹ Rekombinanten wurden auch gebildet, aber diese Größe erreicht die praktische Grenze für Klonbanken. Diese Beschränkung der Bibliotheksgröße findet statt bei der Transformation der DNA, die die willkürlichen Segmente enthält, in die Wirtsbakterienzellen. Um diese Beschränkung zu umgehen, wurde vor Kurzem ein in vitro System entwickelt, das auf der Präsentation wachsender Peptide in Polysomkomplexen beruht. Dieses Display-Bibliotheken-Verfahren hat das Potential, Bibliotheken zu bilden, die 3-6 Größenordnungen größer sind als die momentan verfügbaren Phagen-/Phagemid- oder Plasmidbanken. Weiterhin wird der Aufbau von Bibliotheken, die Expression der Peptide und das Screening in einem gänzlich zellfreien Format durchgeführt.
In einer Anwendung dieses Verfahrens (Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37(9):1233-1251) wurde eine molekulare DNA-Bank, die für 10¹² Dekapeptide kodiert, gebildet und die Bank in einem E. coli S30 in vitro gekoppelten Transkriptions-/Translationssystem exprimiert. Die Bedingungen wurden so gewählt, dass die Ribosomen auf der mRNA festgehalten wurden, was die Anhäufung einer erheblichen Menge von RNA in Polysomen ermöglicht und den Erhalt von Komplexen mit mitwachsenden Peptiden, die immer noch mit ihrer kodierenden DNA verbunden sind. Die Polysomen sind ausreichend robust, um an immobilisierten Rezeptoren affinitätsgereinigt zu werden, im großen und ganzen auf dieselbe Art und Weise, wie die konventionelleren rekombinanten Peptid-Display-Bibliotheken. RNA aus den gebundenen Komplexen wird wiedergewonnen, in cDNA umgewandelt und durch PCR amplifiziert, um eine Vorlage für die nächste Runde von Synthese und Screening zu produzieren. Die Polysomen-Display-Methode kann mit dem Phagen-Display-System gekoppelt werden. Nach mehreren Runden des Screenings wird die cDNA von dem angereichterten Pool der Polysomen in einen Phagemid-Vektor kloniert. Dieser Vektor dient sowohl als Peptid-Expressionsvektor, der die Peptide, die mit den Hüllproteinen fusioniert sind, präsentiert und als DNA-Sequenzierungsvektor für die Peptid-Identifikation. Durch Expression der Polysomen-abgeleiteten Peptide auf den Phagen kann man entweder die Affinitäts-Selektionsprozedur in diesem Format weiterführen oder die Peptide auf individuellen Klonen hinsichtlich ihrer Bindungsaktivität in einem Phagen ELISA untersuchen oder hinsichtlich ihrer Bindungsspezifität in einem Abschluss-Phagen ELISA (Barret et al. (1992) Anal. Biochem 204, 357-364). Um die Sequenzen der aktiven Peptide zu identifizieren, sequenziert man die DNA, die von dem Phagemidwirt produziert wird.
Sekundär-Screens
Den oben beschriebenen Hoch-Durchsatz-Assays können Sekundär-Screens folgen, um weitere biologische Aktivitäten zu identifizieren, die z. B. einem Fachmann erlauben werden, zwischen Agonisten und Antagonisten zu unterscheiden. Die Art des verwendeten Sekundär-Screens hängt von der gewünschten Aktivität ab, die getestet werden soll (manche der Assays, die spezifische MCH-Aktivität testen, wurden bereits oben beschrieben). Z. B. kann ein Assay entwickelt werden, in dem die Fähigkeit, die Interaktion zwischen einem Protein von Interesse und seinem zugehörigen Liganden zu hemmen, benutzt werden kann, um Antagonisten aus einer Gruppe von Peptidfragmenten zu identifizieren, die durch einen der oben beschriebenen Primär-Screens isoliert wurden.
Daher sind Methoden für die Herstellung von Fragmenten und Analogen und für den Test auf ihre Aktivität im Stand der Technik bekannt. Wenn einmal die Kernsequenz von Interesse identifiziert ist, ist es Routine für einen Fachmann, die Analoge und Fragmente zu erhalten.
Peptid-Mimetika
Die Erfindung stellt auch die Reduktion der proteinbindenden Domäne des MCH-Peptids bereit, um Mimetika zu bilden, z. B. Peptide oder Nicht-Peptid-Agentien, die in der Lage sind, die Bindung, in diesem Fall, eines MCH an einen natürlich vorkommenden Liganden von MCH, z. B. einen MCH-Rezeptor, z. B. MC3-R zu unterbinden. Die kritischen Einheiten des MCH-Peptids, die an der molekularen Erkennung des MCH-Liganden beteiligt sind, können bestimmt werden und benutzt werden, um MCH-abgeleitete Peptid-Mimetika zu bilden, die kompetitiv oder nicht-kompetitiv die Bindung von MCH an einen MCH-Liganden hemmen (siehe z. B., "Peptide inhibitors of human papillomavirus Protein binding to retinoblastoma gene Protein" europäische Patentanmeldungen EP-412,762 A und EP-B31,080 A ). Durch die Verwendung von z. B. Scanning-Mutagenese, um die Aminosäureeinheiten für ein bestimmtes MCH-Peptid zu identifizieren, die an der Bindung des MCH-Liganden beteiligt sind, können Peptid-Mimetika-Verbindungen, z. B. Diazepin- oder Isoquinolin-Derivate, gebildet werden, die diese Reste bezüglich der Bindung an einen MCH-Liganden nachahmen, und die daher die Bindung von MCH an den Liganden hemmen und dadurch mit der Funktion von MCH interferieren. Z. B. können nicht-hydrolisierbare Peptid-Analoge solcher Reste gebildet werden unter der Verwendung von Benzodiazepin (z. B. siehe Freidinger et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall Hrsg., ESCOM Verleger: Leiden, Niederlande, 1988), Azepin (z. B. siehe Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall Hrsg., ESCOM Verleger: Leiden, Niederlande, 1988), substituierte Gamma-Laktamringe (Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall Hrsg., ESCOM Verleger: Leiden, Niederlande, 1988), Ketomethylen-Pseudopeptide (Ewenson et al. (1986) J. Med. Chem. 29:295; und Ewenson et al. in Peptides: Structure and Funktion (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), β-Wende-Dipeptidkerne (Nagai et al. (1985) Tetrahedron Lett 26:647; und Sato et al. (1986) J. Chem. Soc. Perkin Trans 1:1231), und β-Aminoalkohole (Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419; und Dann et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134:71).
Verabreichung
Die Verbindungen der Erfindung können so formuliert werden, dass sie in vivo eine geeignete Verteilung gewährleisten. Z. B. schließt die Blut-Hirn-Schranke viele hoch-hydrophile Verbindungen aus. Um zu gewährleisten, dass die therapeutischen Verbindungen der Erfindung die Blut-Hirn-Schranke überwinden können, können sie z. B. in Liposomen formuliert werden. Für Verfahren zur Herstellung von Liposomen, siehe z. B. US-Patente 4,522,811 ; 5,374,548 ; und 5,399,331 . Die Liposomen können umfassen einen oder mehrere Teile, die selektiv in spezifische Zellen oder Organe transportiert werden ("zielende Anteile"), wodurch ein gezielter Wirkstofftransport vermittelt wird (siehe Z. B. V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Beispielhafte zielende Anteile beinhalten Folat oder Biotin (siehe z. B. US-Patent 5,416,016 an Low et al.); Mannoside (Umezawa et al. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); Antikörper (P.G. Bloeman et al. (1995) FERS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); Oberflächenfaktor-Protein-A-Rezeptor (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); gp120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); siehe auch K. Keinanen; M.L. Laukanen (1994) FERS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die therapeutischen Verbindungen der Erfindung in Liposomen formuliert; in einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthalten die Liposomen einen zielenden Anteil.
Um die therapeutischen Verbindungen anders als durch parenterale Verabreichung zu verabreichen, kann es notwendig sein, die Verbindung zu umhüllen mit, oder die Verbindung zu verabreichen zusammen mit einem Material, das seine Inaktivierung verhindert. Z. B. kann die therapeutische Verbindung einem Individuum verabreicht werden in einem geeigneten Träger, z. B. Liposomen, oder einem Verdünnungsmittel. Pharmazeutisch akzeptierbare Verdünnungsmittel beinhalten Kochsalz- und wässrige Pufferlösungen. Liposomen beinhalten Wasser-in-Öl-in-Wasser CGF-Emulsionen ebenso wie konventionelle Liposomen (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
Die therapeutische Verbindung kann auch parenteral, intraperitoneal, intraspinal, oder intrazerebral verabreicht werden. Dispersionen können in Glycerol, flüssigen Polyethylenglykolen, und Gemischen davon und in Ölen präpariert werden. Unter üblichen Lager- und Verwendungsbedingungen können diese Präparationen ein Konservierungsmittel enthalten, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die injizierbare Verwendung geeignet sind, beinhalten sterile wässrige Lösungen (sofern wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver für die außerplanmäßige Zubereitung von steril injizierbaren Lössugen oder Dispersionen. In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein und so flüssig sein, dass sie leicht auf eine Spritze aufgezogen werden kann. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und muss konserviert werden gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen. Die Trägersubstanz kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, das enthält, z. B., Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerol, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und ähnliches), geeignete Gemische daraus und Pflanzenöle. Die geeignete Fließfähigkeit kann aufrechterhalten werden, z. B. durch die Verwendung eines Überzugs, wie etwa. Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle der Dispersion und durch die Verwendung von Oberflächenfaktoren.
Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann erreicht werden durch verschiedene antibakterielle und Antipilz-Agentien, z. B. Parabene, Chlorobutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal, und ähnliche. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein, isotonische Agentien in die Zusammensetzung einzuschließen, z. B. Zucker, Natriumchlorid, oder Polyalkohole wie Mannitol und Sorbitol. Verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzung kann erreicht werden durch Einschließen eines Agens in die Zusammensetzung, das die Absorption verzögert, z. B. Aluminiummonostearat oder Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen können präpariert werden durch den Einbau der therapeutischen Verbindung in der geforderten Menge in einem geeigneten Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination von Inhaltsstoffen, die oben aufgezählt wurden, gefolgt von einer Sterilfiltration, wenn benötigt. Im Allgemeinen werden Dispersionen gebildet durch den Einbau der therapeutischen Verbindung in ein steriles Vehikel, das ein Grund-Dispersionsmedium und die benötigten anderen Inhaltsstoffe aus den oben aufgezählten enthält. Im Falle von sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsmethoden Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen, die als Ergebnis ein Pulver mit dem aktiven Inhaltsstoff (d. h. der therapeutischen Verbindung) plus jeden zusätzlichen gewünschten Inhaltsstoff aus einer vorher steril filtrierten Lösung davon enthalten.
Geeignete Dosen können durch Verfahren aus dem Stand der Technik bestimmt werden, aber sie können in der Größenordnung von 0,001-100 mg/kg oder 0,1-10 mg/kg Körpergewicht liegen.
ANDERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Analoge können sich vom natürlich vorkommenden MCH in der Aminosäuresequenz oder in anderer Weise, die nicht die Sequenz betreffen, oder beide unterscheiden. Nicht-Sequenz-Modifikationen beinhalten die in vivo oder in vitro chemische Derivatisierung von MCH. Nicht-Sequenz-Modifikationen beinhalten Veränderungen in der Acetylierung, Methylierung, Phosporylierung, Carboxylierung, oder Glycosylierung.

Bevorzugte Analoge beinhalten MCH, deren Sequenzen sich von der Wildtyp-Sequenz durch einen oder mehrere konservative Aminosäure-Austäusche oder durch einen oder mehrere nicht-konservative Aminosäure-Austäusche, -Deletionen oder -Insertionen unterscheiden, die die biologische Aktivität von MCH nicht beeinträchtigen. Konservative Austausche schließen typischerweise den Austausch von einer Aminosäure gegen eine andere mit ähnlichen Eigenschaften ein, z. B. Austausch innerhalb der folgenden Gruppen: Valin, Glycin; Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Asparaginsäure, Glutaminsäure; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin. Andere konservative Austäusche können aus der unten aufgeführten Tabelle entnommen werden. Tabelle 1 Konservative Aminosäure-Austäusche

Für Aminosäure	Code	Ersetze durch eine beliebige von
Alanin	A	D-Ala, Gly, beta-Ala, L-Cys, D-Cys
Arginin	R	D-Arg, Lys, D-Lys, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-Met, D-Ile, Orn, D-Orn
Asparagin	N	D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Asparaginsäure	D	D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gin, D-Gln
Cystein	C	D-Cys, S-Me-Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Glutamin	Q	D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Glutaminsäure	E	D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gin, D-Gln
Glycin	G	Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, β-Ala, Acp
Isoleucin	I	D-Ile, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Leucin	L	D-Leu, Val, D-Val, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Lysin	K	D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Methionin	M	D-Met, S-Me-Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
Phenylalanin	F	D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans-3,4, oder 5-Phenylprolin, cis-3,4, oder 5-Phenylprolin
Prolin	P	D-Pro, L-1-Thioazolidin-4-Karbonsäure, D- oder L-1-Oxazolidin-4-Karbonsäure
Serin	S	D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(0), D-Met(0), L-Cys, D-Cys
Threonin	T	D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(0), D-Met(0), Val, D-Val
Tyrosin	Y	D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Valin	V	D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met

Andere Analoge innerhalb der Erfindung sind solche mit Modifikationen, die die Peptidstabilität erhöhen; solche Analoge können z. B. enthalten, eine oder mehrere nicht-Peptid-Bindungen (die die Peptid-Bindungen ersetzen) in der Peptidsequenz. Auch beinhaltet sind: Analoge, die Reste enthalten, die nicht die natürlich vorkommenden L-Aminosäuren sind, z. B. D-Aminosäuren oder nicht-natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäuren, Z. B. (β- oder γ-Aminosäuren; und zyklische Analoge.
Um ein MCH-Polypeptid zu erhalten, kann die für MCH kodierende DNA in einen Expressionsvektor eingeführt werden, der Vektor in eine Zelle eingeführt werden, die für die Expression des gewünschten Proteins geeignet ist, und das Peptid kann wiedergewonnen und aufgereinigt werden durch Methoden aus dem Stand der Technik. Antikörper gegen die Peptide und Proteine können hergestellt werden durch die Immunisierung eines Tieres, z. B. eines Kaninchens oder einer Maus, und Rückgewinnung der Anti-MCH-Antikörper durch Methoden aus dem Stand der Technik.
Andere Ausführungsformen sind innerhalb der folgenden Ansprüche ausgeführt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung von MCH oder eines Agonisten davon, in der Zubereitung eines Medikaments für ein Verfahren zur Förderung des Essensappetits oder der Zunahme oder Beibehaltung von Gewicht bei einem Individuum, umfassend die Verabreichung einer effektiven Menge an MCH oder eines Agonisten davon an das Individuum, wobei der Agonist ein Peptid-Analog von MCH ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Individuum untergewichtig ist oder ein Essverhalten zeigt, das geringer als normal ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Individuum an Anorexia nervosa leidet.
Verwendung nach Anspruch 1, worin dem Individuum eine Behandlung, die ein verringertes Essverhalten nach sich zieht, momentan verabreicht wird oder verabreicht worden ist.
Verwendung nach Anspruch 1, weiterhin umfassend das Diagnostizieren bei dem Individuum, das Risiko für ein Essverhalten, welches geringer als normal ist, für Auszehrung oder für eine Essstörung zu haben.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Individuum ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin dem Individuum eine zweite Dosis von MCH oder einem Agonisten davon verabreicht wird, wobei der Agonist ein Peptid-Analog von MCH ist.
Verwendung eines Antagonisten von MCH in der Zubereitung eines Medikamentes für ein Verfahren zur Hemmung des Essensappetits oder der Zunahme von Gewicht bei einem Individuum, umfassend die Verabreichung einer effektiven Menge eines Anta gonisten von MCH an das Individuum, worin der Antagonist ein Peptid-Analog von MCH ist, das einen MCH-Rezeptor bindet.
Verwendung nach Anspruch 8, worin das Individuum übergewichtig ist oder ein zwanghaftes Essverhalten zeigt.
Verwendung nach Anspruch 8, weiterhin umfassend das Diagnostizieren bei dem Individuum, das Risiko für jeweils entweder zwanghaftes Essverhalten, Fettleibigkeit oder Essstörung zu haben.
Verwendung nach Anspruch 8, worin das Individuum ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 8, worin dem Individuum eine zweite Dosis eines Antagonisten von MCH verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 8, worin der Antagonist ein Peptid-Analog von MCH ist, welches mindestens 70% Homologie zu MCH besitzt.
Verfahren zur Auswertung einer Behandlung bezüglich ihrer Wirkung auf das Essverhalten umfassend: Verabreichung der Behandlung einem Untersuchungssystem, welches auf Melanozyten beruht, in einer Zellkultur-Präparation; Bestimmung, ob eine Veränderung im System erfolgt; und Verabreichung der Behandlung einem zweiten Untersuchungssystem und Bestimmung der Wirkung der Behandlung auf einen Parameter, der sich auf Essverhalten oder Gewichtszunahme oder -abnahme im zweiten System bezieht, wobei die Behandlung ein Peptid-Analog von MCH ist.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Behandlung ein Polypeptid, welches mindestens 50% Homologie zu MCH besitzt, ist.
Verfahren zur Auswertung einer Behandlung bezüglich ihrer Wirkung auf das Essverhalten, umfassend: Bereitstellen einer Zell- oder Zellkultur-Präparation, bei der ein Reporter-Gen mit der Promotor-Region von MCH verknüpft ist; Verabreichung der Behandlung; sowie Bestimmung, ob eine Wirkung auf die Expression des Reporter-Gens vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die Behandlung in der Verabreichung eines Agens besteht, und das Agens jeweils entweder ein Polysaccharid, eine Nukleinsäure, ein Fett, Polypeptid oder ein Peptid-Mimetikum ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Agens ein Polypeptid, welches mindestens 50% Homologie zu MCH besitzt, ist.
Verfahren zur Auswertung einer Behandlung bezüglich ihrer Wirkung auf Essverhalten, Appetit oder Beibehalten des Gewichtes, umfassend: Bereitstellen einer Zell- oder Zellkultur-Präparation; Verabreichung der Behandlung einer Zell- oder Zellkultur-Präparation; sowie Bestimmung, ob eine Wirkung auf die MCH-RNS- oder MCH-Protein-Spiegel vorliegt.