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Hintergrund
der Erfindung
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Das
kongenitale nephrotische Syndrom des finnischen Typs (CNF, NPHS1,
MIM 256300) ist eine autosomal rezessive Störung und eine eigene Einheit
unter den kongenitalen nephrotischen Syndromen. Es ist durch eine
massive Proteinurie im fötalen
Stadium und eine Nephrose bei der Geburt gekennzeichnet. Wesentlich
ist, NPHS1 scheint einzig die Nieren zu betreffen und stellt deshalb
ein einzigartigen Model für
Untersuchungen an der glomerulären
Filtrationsschranke bereit.
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Die
primäre
Schranke für
die Plasmaultrafiltration in den renalen Glomeruli umfasst drei
Schichten; ein Endothel mit Poren, eine 300–350 nm dicke glomeruläre Basalmembran
(GBM) und Schlitzporen, dass heißt Diaphragmas, die zwischen
den Fußfortsätzen der
Epithelialzellen lokalisiert sind. Diese Schranke ist ein hoch entwickeltes
größenselektives
molekulares Sieb, dessen molekulare Funktionsmechanismen immer noch weitgehend
ungeklärt
sind. Es wird angenommen, dass die GBM, ein eng quervernetztes Geflecht
aus Typ IV Kollagen, Laminin, Nidogen und Proteoglykanen, Poren
enthält,
die die Penetration von großen
Molekülen
und Zellen beschränkt,
und zusätzlich
ist die Hypothese aufgestellt worden, dass anionische Heparansulfat-Proteoglykanverbindungen
zu einer elektrischen Schranke für
Makromoleküle
beitragen (Kasinath und Kanwar, 1993). Der glomeruläre Filter
ist von einer großen
Anzahl erworbener und vererbter Erkrankungen betroffen, die zu einem
umfangreichen Durchsickern von Plasmaalbumin und größeren Proteinen
führen,
was ein nephrotisches Syndrom und eine Renalerkrankung im Endstadium
zur Folge hat. Ein Verständnis
für die
molekularen Mechanismen des glomerulären Filtrationsverfahrens und
seiner Pathologie ist von grundlegender Wichtigkeit für die klinische
Medizin, was wiederum neuartige Entwicklungen für die Diagnose und die Behandlung
von Komplikationen in primären
und sekundären
Nierenerkrankungen erleichtern kann. Genetische Erkrankungen mit
Defekten in der Filtrationsschranke als Hauptsymptome können als
Modelle zu Bereitstellung eines solchen Wissens dienen.
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Die
kongenitalen nephrotischen Syndrome (NPHS) bilden eine heterogene
Gruppe von Erkrankungen, die durch eine massive Proteinurie bei
oder kurz nach der Geburt gekennzeichnet ist (Rapola et al., 1992).
Das nephrotische Syndrom kann primär, erworben oder ein Teil von
anderen Syndromen sein. Das kongenitale nephrotische Syndrom des
finnischen Typs (CNF, NPHS1) ist eine eigene Einheit unter den NPHS.
Es ist eine autosomal rezessive Störung mit einem Auftreten bei
1 : 10000 Geburten in Finnland, beträchtlich weniger aber in anderen
Ländern
(Norio, 1966; Huttunen, 1976). Diese Erkrankung manifestiert sich
bereits im fötalen
Stadium mit einer schweren Proteinurie in utero, die frühe Läsionen der
glomerulären
Filtrationsschranke demonstriert. Die Pathogenese von NPHS1 ist
undurchsichtig geblieben. Es gibt keine pathognomonisch pathologischen
Merkmale, der typischste histologische Befund von NPHS1-Nieren ist
die Dilation der proximalen Tubuli (Huttunen et al., 1980). Auch
sind die Nieren groß und
es wurde herausgefunden, dass sie eine größere Menge an Nephronen enthielten
als altersentsprechende Kontrollen (Tryggvason und Kouvalainen,
1975). Eine Elektronenmikroskopie offenbart keine abormalen Merkmale
der GBM selbst, obwohl es einen Verlust an Fußfortsätzen der glomerulären Epithelialzellen
gibt, ein Befund, der für
nephrotische Syndrome jeder Ursache charakteristisch ist. Die Analysen
von GBM-Proteinen wie dem Kollagen Typ IV, dem Laminin und dem Heparansulfat-Proteoglykan
haben keine abormalen Befunde beim NPHS1 offenbart (zum Beispiel
siehe Ljungberg et al., 1993, Kestilä et al., 1994a). NPHS1 ist
eine progressive Erkrankung, die gewöhnlich während der ersten zwei Lebensjahren
zum Tod führt,
und die einzige lebensrettende Behandlung ist eine Nierentransplantation (Holmberg
et al., 1995). Wichtig ist, die meisten transplantierten Patienten
haben so weit keine extrarenalen Komplikationen entwickelt, was
nahe legt, dass das mutierte Genprodukt hoch spezifisch für die Nierenentwicklung
und/oder die glomeruläre
Filtrationsfunktion ist. Über
20% der Patienten jedoch haben posttransplantationale Nephrosen
entwickelt, deren Ursache unbekannt ist (Laine et al., 1993; Holmberg
et al., 1995).
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Auf
Grund seiner hohen Spezifität
für den
glomerulären
Filtrationsprozess stellt NPHS1 eine einzigartige Modelerkrankung
für Untersuchungen
an dieser wichtigen Nierenfunktion bereit. Da es kein überzeugendes
Kandidatengen für
dieser Erkrankung gab, haben wir einen Ansatz mit Positional Cloning
in unseren Versuchen, das CNF-Gen zu identifizieren, verwendet und
das Gen zu einer 150 kb Region auf dem Chromosom 19q13.1 lokalisiert
(Kestilä et
al., 1994b; Männikkö et al.,
1995). Wir haben ein neuartiges Gen in der kritischen Region identifiziert
und gezeigt, dass es beim NPHS1 mutiert ist. Das Genprodukt ist
ein neuartiges Transmembranprotein, das im humanen Embryo einen
hohen Expressionslevel in den renalen Glomeruli aufweist.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges Protein Nephrin und
das Gen, welches für
dieses Protein kodiert, bereit. Die vorliegende Erfindung umfasst
eine neuartige DNA-Nukleinsäuresequenz,
die die Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NO: 1 ist, welche für
das Nephrinprotein kodiert. Die vorliegende Erfindung umfasst auch
das Protein, für
welches die kodierenden Regionen der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodieren
und welches die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2 hat. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung
auch das reife Nephrinprotein, bei welchem das Signalpeptid abgeschnitten
worden ist.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren, die Reagenzien und
Kits zum Screenen von Individuen auf die Präsenz eines mutierten Nephringens
zur Diagnose, zum pränatalen
oder zum postnatalen Screening auf eine Suszeptibilität für eine glomeruläre Nephrose
oder eine Basalmembranerkrankung. Insbesondere sieht die vorliegende
Erfindung das Screenen auf das kongenitale nephrotische Syndrom
des finnischen Typs (NPHS1) vor.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Reagenzien und Kits für die therapeutische
Behandlung von Basalmembranerkrankungen bereit, die mit einem defekten
endogenen Nephringenprodukt assoziiert sind. Folglich sieht die
vorliegende Erfindung die therapeutische Behandlung unter Verwendung
des Nephrinproteins vor und insbesondere unter Verwendung von Protein,
das mittels rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt wurde. Zusätzlich sieht
die vorliegende Erfindung eine Gentherapie unter Verwendung therapeutischer Nukleinsäurekonstrukte
vor, die das Nephringen oder im Wesentlichen dazu ähnliche
Sequenzen enthalten.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die
Erfindung wird besser mit Blick auf die anliegenden Zeichnungen
verstanden werden, worin:
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1 eine Zeichnung ist, die
eine physikalische Karte des NPHS1-Lokus auf 19q13.1 und die genomische
Organisation des NPHS1-Gens zeigt. 1A ist
eine physikalische Karte der 920 kb Region zwischen den Markern
D19S208 und D195224. 1B ist
ein Diagramm der überlappenden
Cosmidklone, die die kritische 150 kb Region überspannen, die das NPHS1-Gen enthält. Die
Lokation der polymorphen Marker ist durch Pfeile angezeigt. 1C ist ein Diagramm, dass
die Lokation von fünf
Genen, NPHS1, APLP1, A, B und C, zeigt, die in dieser Untersuchung
charakterisiert und auf Mutationen durchsucht wurden. 1D ist eine Zeichnung, die
eine schematische Struktur des NPHS1-Gens zeigt;
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2 eine Northernblotanalyse
der Nephrinexpression (dem NPHS1-Genprodukt)
mit mRNA von humanen embryonischen und adulten Geweben zeigt. Die
Northernblotfilter, die 2 μg
humane poly(A)-RNA von vier fötalen
und acht adulten Geweben (Clontech) enthielten, wurden mit einer
1371 bp Nephrin cDNA-Sonde hybridisiert (Exons 1–10), die mittels RT-PCR von
fötaler
Nieren Poly(A)-RNA gemacht wurde. 2A zeigt die
deutliche Expression, die nur mit fötaler Nieren-RNA (Pfeil) beobachtet
werden kann. 2B zeigt
die Resultate unter Verwendung von RNA aus adulten Geweben, und
ein starkes Signal wird nur in einer 4,3 kb Bande mit Nieren-RNA (Pfeil) beobachtet.
Die anderen Gewebe weisen, wenn überhaupt
positive, nur unbedeutende Signale auf. Die untersuchten Gewebe
sind oben über
dem Filter gekennzeichnet und die molekularen Größenmarker (kb) sind an den
Seiten der Filter gezeigt;
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3 ein Diagramm einer Mutationsanalyse
des NPHS1-Gens ist. Links: (A) Stammbaum einer NPHS1-Familie mit
einem betroffenen Kind, das eine 2 bp Deletion im Exon 2 hat. Die
Sequenzen der Deletionsstelle sind für den Patienten (homozygot),
einen Elter (heterozygot) und ein gesundes Geschwister gezeigt. Rechts:
(B) Stammbaum einer NPHS1-Familie mit einem betroffenen Kind, das
eine Nonsensemutation im Exon 26 hat. Die Sequenzen der mutierten
Region sind für
den Patienten (homozygot), einen Elter (heterozygot) und ein gesundes
Geschwister gezeigt;
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4 ein Diagramm einer nukleotidabgeleiteten
Aminosäuresequenz
des Nephrins (dem NPHS1 Genprodukt) und der vorhergesagten Domänenstruktur
ist. 4A ist die vorhergesagte
N-terminale 22 Reste lange Signalsequenz. Die Schnittstelle ist
mit einem Pfeil markiert. Eine vermeintliche Transmembrandomäne (die
die Reste 1059–1086 überspannt)
ist fettgedruckt und unterstrichen dargestellt. Der vermeintliche
extrazelluläre
Teil des Proteins enthält
acht Ig-ähliche
Module (eingerahmt) und ein Fibronektin Typ III-ähliches Modul angrenzend an
die Transmembrandomäne
(mit einer fetten Linie eingerahmt, Reste 941–1025). Die Cysteinreste sind
durch schwarze Punkte angezeigt und die zehn vermeintlichen N-Glykosylierungsstellen
in dem extrazellulären
Teil des Proteins sind unterstrichen. 4B zeigt
die vorhergesagte Domänenstruktur
des normalen Nephrins und die vorhergesagten Auswirkungen der zwei
Mutationen (Fin-major und Finminor), die in dieser Studie identifiziert
wurden. Die Ig-ählichen
Module sind als Teilkreise dargestellt und das Fibronektin Typ III-ähliche Motiv
als ein Sechseck. Die Transmembrandomäne ist als ein schwarzes Rechteck
dargestellt, das in einem Membranlipidbilayer lokalisiert ist. Die
Lokationen von zwei freien Cysteinresten sind durch Linien mit einem
schwarzen Punkt am Ende angezeigt. Die Fin-major Mutation würde zu der
Produktion eines Teils des Signalpeptides führen und einer kurzen Nonsensessequenz.
Die Finminor Mutation würde
zu einem Nephrinmolekül
führen,
dem ein Teil der cytosolischen Domäne fehlt; und
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5 die Ergebnisse der Nephrin-mRNA-Expression
in humaner embryonischer Niere durch in situ Hybridisierung zeigt. 5A zeigt eine starke Expression
in den Glomeruli durch den ganzen renalen Cortex hindurch und wenig,
wenn überhaupt
irgendeine, spezifische Expression wurde in anderen Strukturen beobachtet.
(4 × Objektivvergrößerung). 5B ist eine Ansicht mit
stärkerer
Vergrößerung,
die eine starke Expression in der Peripherie individueller Glomeruli
(gerade Pfeile) offenbart, wahrscheinlich hauptsächlich in den Epithelialzellen.
Es wurde keine Expression in der Bowmanschen Kapsel (gekrümmte Pfeile),
den proximalen Tubuli (offene Pfeile) oder den Endothelialzellen
der Gefäßwände beobachtet.
(20× Objektivvergrößerung).
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Das
kongenitale nephrotische des Finnischen Typs (CNF, NPHS1, MIM 256300)
ist eine autosomal rezessive Störung,
und eine eigene Einheit unter den kongenitalen nephrotischen Syndromen.
Es ist durch eine massive Proteinurie im fötalen Stadium und durch eine
Nephrose bei der Geburt gekennzeichnet. Wesentlich ist, NPHS1 scheint
einzig die Nieren zu betreffen und stellt deshalb ein einzigartigen
Model für
Studien an der glomerulären
Filtrationsschranke bereit.
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Das
NPHS1-Gen ist auf dem Chromosom 19q13.1 lokalisiert worden und in
der vorliegenden Studie wurde das Kopplungsungleichgewicht verwendet,
um die kritische Region auf 150 Kilobasen, die sequenziert wurden,
einzugrenzen. Es wurden wenigstens 10 neuartige Gene in dieser Region
identifiziert, wobei eines für ein
amyloidvorläuferähnliches
Protein kodiert. Fünf
dieser Gene, von denen alle etwas Expression in der Niere aufzeigten,
wurden analysiert, indem alle ihre 63 Exons in NPHS1-Patienten sequenziert
wurden. Zwei Mutationen, eine 2 bp Deletion im Exon 2 und ein einzelner
Basenaustausch im Exon 26, die beide zu einem verfrühten Stopcodon
führen,
wurden in einem neuartigen 29 Exon Gen gefunden. Die Mutationen
wurden entweder als homozygote oder compound-heterozygote Mutationen
in 44 von 49 Patienten gefunden, wobei 4 Patienten, die 2 bp Deletion
in einem Allel hatten und die andere potenzielle Mutation noch unbekannt
ist. Es wurden bei keiner der Kontrollen gefunden, dass sie homozygot
oder compound-heterozygot für
die Mutation war. Das Genprodukt, das mit Nephrin bezeichnet wurde,
ist ein 1241 Reste langes vermeintliches Transmembranprotein der
Immunglobulinfamilie von Zelladhäsionsmolekülen, für welches
durch Northern- und in situ Hybridisierung gezeigt wurde, dass es
spezifisch für
den Nierenglomerulus ist. Diese Ergebnisse demonstrieren eine entscheidende
Rolle für
Nephrin in der Entwicklung oder Funktion der Filtrationsschranke
der Niere.
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Die
Erfindung wird durch die Betrachtung der folgenden Beispiele, die
zur Illustration und nicht zur Einschränkung gedacht sind, besser
verstanden werden.
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Beispiel 1
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Methoden und Verfahren
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Sequenzierung der Cosmidklone
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Über die
Isolation von Cosmidklonen, die die Region zwischen D19S208 und
D19S608 überspannen, ist
früher
berichtet worden (Olsen et al., 1996). Die DNA der Cosmidklone F19541,
R33502, F15549, R28051, F19399, R31158 und R31874 wurde mechanisch
durch Zerstäubung
geschert, und es wurden Fragmente von 1000–2000 bp isoliert und in den
M13-Pagen subkloniert, bevor eine Randomsequenzierung unter Verwendung
von ABI 377 automatisierten Sequenzierern durchgeführt wurde.
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Analyse der
Sequenz
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Um
neue Mikrosatellitenmarker zu entwickeln, wurden Repeatregionen
auf der Sequenz gesucht und für
drei davon (D19S1173, D19S1175, D19S1176) herausgefunden, dass sie
polymorph sind. Homologievergleiche wurden unter Verwendung der
BLASTX- und BLASTN-Programme (Altschul et al., 1990) durchgeführt. Vor
der BALSTN-Analyse wurde die Nukleotidsequenz gefiltert, wobei CENSOR
(Jurka et al., 1996) verwendet wurde, um Repeatregionen wie Alu-Sequenzen
auszublenden. Eine Exonvorhersage wurde unter Verwendung der Programme
GRAIL II (Uberbacher und Mural, 1991), GENSCAN (Burge und Karlin,
1997), FGENEH und HEXON (Solovyeh et al., 1994) gemacht, und die
Vorhersage der Proteinstruktur unter Verwendung von BLASTN (Altschul
et al., 1990) und dem EXPASY Molekularbiologieserver (Appel et al.,
1994). Die Mutationssuche wurde durch den Vergleich der Patientensequenzen
mit der normalen genomischen Sequenz unter Verwendung des FASTA-Programms
aus dem GCG-Packet (Genetics Computer Group, 1996) durchgeführt.
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Isolation
der cDNAs
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cDNAs
wurden durch PCR mit poly(A)-RNA aus verschiedenen Geweben unter
Verwendung von Primern gebildet, die auf Exonsequenzen basierten.
Die PCR-Fragmente wurden sequenziert und für das Screenen von cDNA-Bibliotheken verwendet.
Die Marathon ready cDNA-Kits (Clontech Laboratories) wurden auch verwendet,
um die 5'- und 3'-Extremitäten der
cDNAs zu charakterisieren. Der Vergleich der cDNA und der genomischen
Sequenzen wurde gemacht, um die Größen der Introns festzulegen,
sowie es Intronsequenzen an der Akzeptor- und Donor-Splicestelle
gab.
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Southern-
und Northernblots und in situ Hybridisierungsanalysen
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Für Southernanalysen
wurden Proben, die 10 μg
genomische DNA enthielten, mit verschiedenen Restriktionsenzymen
verdaut und auf 1% Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt, auf
Nylonmembranen transferiert und mit cDNA-Sonden hybridisiert. In
Nothernanalysen mit mehreren Geweben wurden die Poly(A)-RNAs von
8 adulten und 4 fötalen
Geweben untersucht (Clontech). Die Hybridisierung wurde in ExpressHyp-Puffer
bei 65°C
gemacht, wobei ein cDNA-Klon, der die Exons 1–10 enthielt, verwendet wurde.
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Für die in
situ Hybridisierung wurde ein Fragment des NPHS1 cDNA-Klons (der
dem Exon 10 entspricht) mit Digoxigenin markiert (Boehringer Mannheim),
mittels alkalischer Hydrolyse in Fragmente von etwa 150 Basenpaaren
geschnitten und dann als Sonde verwendet. Es wurden 7 μm Gewebeschnitte
von 23 Wochen humaner embryonischer Niere mit 0,2 M HCl, 0,1 M Triethanolaminpuffer,
pH 8,0, der 0,25% (v/v) Essigsäureanhydrid
und 100 μg/ml
Proteinase K enthielt, behandelt. Die Schnitte wurden mit der Sonde
bei 62°C für 16 h hybridisiert.
Nach dem Spülen
in 50% Formamid und Standard-Natriumcitrat, wurde die Sonde immunologisch
mit einem Antikörper
gegen Digoxigenin detektiert, der mit dem alkalischen Phosphatenzym
konjugiert war (Boehringer Mannheim). Die Farbe wurde mit NBT und
BCIP entwickelt.
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Mutationsanalyse
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In
dieser Untersuchung analysierten wir 49 finnische NPHS1-Patienten,
deren Eltern und eine Gesamtheit von 54 gesunden Geschwistern. Die
Diagnose für
NPHS1 basiert auf einer schweren Proteinurie, einer großen Plazenta
(> 25% des Geburtsgewichts),
einem nephrotischen Syndrom während
der ersten Lebenswochen und dem Ausschluß anderer Typen kongenitaler
nephrotischer Syndrome (Koskimies 1990). Zusätzlich wurden 83 Proben von
Kontrollindividuen analysiert.
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Das
NPHS1-Gen wurde mittels PCR-Amlifikation und der Sequenzierung aller
Exonregionen von genomischer DNA analysiert. Die Sequenzen der Primer
für das
Exon 2 waren 5'-GAGAAAGCCAGACAGACGCAG-3' (5'-UTR) und 5'-AGCTTCCGCTGGTGGCT-3' (Intron 2) und die Sequenzen für die Primer
für das
Exon 26 waren 5'-CTCGGGGAGACCCACCC-3' (Intron 23) und
5'-CCTGATGCTAACGGCAGGGC-3' (Intron 26). Die
PCR-Reaktionen wurden
in einem Gesamtvolumen von 25 μl
durchgeführt,
die 20 ng Vorlagen-DNA, 1 × AmpliTaq-Puffer
(Perkin-Elme), 0,2 mM von jedem Nukleotid, 50 ng von jedem Primer
und 0,5 U AmpliTaq Gold DNA-Polymerase
enthielten. Die Reaktionen wurde für 30 Cyclen mit einer Denaturierung
bei 95°C
für 1 min, einer
Anlagerung bei 60°C
für 1 min
und einer Extension bei 72°C
für 1 min
durchgeführt.
In dem ersten Cyclus wurde die Denaturierung für 12 min durchgeführt und
die Extension im letzten Cyclus dauerte 8 min. Die PCR-Produkte
wurden auf einem 1,5% Agarosegel aufgetrennt, ausgeschnitten und
mit dem QiaexII System (Qiagen) aufgereinigt. Das aufgereinigte
PCR-Produkt wurde sequenziert, wobei spezifische Primer, die die dRhodamine
dye-terminator Chemie einsetzten, und ein ABI377 automatisierter
Sequenzierer (Perkin-Elme) verwendet wurden.
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Wenn
auf die NPHS1 Fin-major Mutation von Eltern, Geschwistern und Kontrollen
gescreened wurde, wurde ein 100 bp PCR-Produkt amplifiziert, das
die Exon 2 Deletionsstelle enthielt, wobei ein radioaktiv endmarkierter
Primer verwendet wurde, und auf 6% Polyacrylamidgelen elektrophoretisch
aufgetrennt. Auf die zweite NPHS1 Fin-minor Mutation konnte unter
Verwendung einer neuen Restriktionsschnittstelle für DdeI gescreent
werden. Das 140 bp amplifizierte PCR-Produkt wurde mit DdeI verdaut
und die Produkte (140 bp oder 90 bp + 50 bp) wurden auf einem Agarosegel
aufgetrennt (1% SeaKem agarose – 3%
NuSieve agarose).
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Im
Allgemeinen sind die Methoden und Verfahren zur Durchführung molekularbiologischer
und biochemischer Techniken im Stand der Technik bekannt und können in
den erhältlichen
Texten uns Referenzen gefunden werden, wie zum Beispiel Sambrok
et al., (1989) Molecular Cloning: a laboratoy manual, 2. Auflage, (Cold
Spring Habour Laboratory Press, Cold Spring Habour, NY); Short Protocols
in Molecular Biology, 2. Auflage (herausgegeben von Ausubel et al.,
John Wiley & Sons,
New York, 1992); Davis et al., (1986) Basic Methods in Molecular
Biology (Elsevier, New York); Gene Expression Technology (herausgegeben
von Davis Goeddel, Academic Press, San Diego, CA, 1991).
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Beispiel 2
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Charakterisierung
der Gene an dem CNF-Lokus
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Im
Anschluß an
die Lokalisierung des NPHS1-Gens auf 19q13.1 wurden überlappende
Cosmidklone von dem Intervall von Interesse zwischen den Markern
D19S208 und D19S224 isoliert (Männikkö et al.,
1995; Olsen et al., 1996). Basierend auf dem signifikanten Kopplungsungleichgewicht,
das mit D19S608 und D19S610 beobachtet worden ist, sowie den neuen
Mikrosatellitenmarkern D19S1173, D19S1175 und D19S1176, die in dieser
Untersuchung identifiziert wurden, wurde das NPHS1-Gen zwischen
D19S1175 und D19S608, in der nahen Umgebung von D19S1176 und D19S610,
feinkartiert. Southernhybridisierungsanalysen von NPHS1 Patienten-DNA
mit genomischen Klonen offenbarten keine Variationen, was nahe legte,
dass die NPHS1-Mutationen keine größeren genomischen Reanangements
repräsentieren.
Die 150 bp kritische Region wurde in ihrer Gesamtheit sequenziert
und die Sequenz nach potentiellen Kandidatengenen abgesucht, wobei
Exonvorhersageprogramme und die Datenbankähnlichkeitsdurchsuchungen (data
base similarity searches) verwendet wurden. Basierend auf diesen
Analysen wurde für
die kritische Region abgeschätzt,
dass sie über
100 potentielle Exons enthält.
Die Ähnlichkeitsdurchsuchungen
(similarity searches) offenbarten ein zuvor bekanntes Gen, dass
heißt
APLP1, das für
ein amyloidvorläufer-ähnliches
Protein (Lenkkeri et al., im Druck) und acht bestimmte exprimierte
Sequenz Tags (ESTs) kodiert. Zusammen weisen diese Analysen auf die
Anwesenheit von wenigstens zehn neuartigen Genen in der kritischen
Region hin.
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1 illustriert eine physikalische
Karte des NPHS1-Lokus auf 19q13.1 und die genomische Organisation
des NPHS1-Gens. 1A:
Physikalische Karte der 920 kb Region zwischen D19S208 und D19S224. 1B: Überlappende Cosmidklone, die
die kritische 150 kb Region überspannen,
die das NPHS1- Gen
enthält.
Die Lokation der polymorphen Marker ist mit Pfeilen angezeigt. Die
Lokation der polymorphen Marker ist durch Pfeile angezeigt. 1C: Lokation von fünf Genen,
NPHS1, APLP1, A, B, und C, die in dieser Untersuchung charakterisiert
wurden und die auf Mutationen hin durchsucht wurden. 1D: Schematische Struktur des
NPHS1-Gens.
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Unter
Verwendung von Grail und Genscan Exonvorhersageprogrammen und den
Sequenzen von cDNAs wurden die Exon/Intronstrukturen von fünf von den
Genen, NPHS1 (1), APLP1,
A, B, und C (nicht gezeigt), bestimmt. Obwohl das Fliessgleichgewicht
der Transkriptionslevel variierte, offenbarten Northernblotanalysen
eine Expression von allen Genen in der Niere und, mit Ausnahme von
NPHS1, auch in anderen Geweben. Deshalb konnte keines von ihnen
als das NPHS1-Gen ausgeschlossen werden und alle wurden einer Mutationsanalyse
unterworfen.
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Beispiel 3
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Identifikation
des NPHS1-Gens
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Haplotypanalysen
des NPHS1-Chromosoms haben zwei Hauptklassen von finnischen Patienten
offenbart (Männikkö et al.,
1995; diese Untersuchung). Die erste Klasse, die die Haplotypen
1-1-1-6-g-2-8-9 und 1-1-1-6-g-6-4-2 enthält (Marker D19S1173, D19S1175,
D19S1176, D195610, RFLP des Gens B, D19S608, D19S224 beziehungsweise
D19S220), ist die häufigste
Klasse, die in 78% der finnischen NPHS1-Chromosomen gefunden wird.
Die zweite Haplotypklasse, 3-5-3-6-a-8-10-x, wird in 13% der Fälle gefunden.
Die verbleibenden 9% der beobachteten Haplotypen weisen völlig unterschiedliche
Allelkombinationen auf, und es wurde angenommen, dass sie andere
Mutationen repräsentieren.
Die zwei Haupthaplotypklassen könnten
dieselbe Mutation repräsentieren,
weil sie beide das Allel 6 von D19S610 teilen. Die vorliegenden
Ergebnisse demonstrieren jedoch, dass sie zwei verschiedene Mutationen
repräsentieren.
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Da
Sothernhybridisierungsanalysen keine größeren Genrearrangements aufdeckten,
wurden Mutationen mittels einer direkten Sequenzierung der PCR-amplifizierten
Exonregionen von, wenn nötig,
allen Genen dieser Region gesucht.
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Das
17 Exon APLP1-Gen, das distal zu D19S610 lokalisiert ist, wies keine
Variationen zwischen den Patienten und den Kontrollen auf und wurde
als das NPHS1-Gen ausgeschlossen (Lenkkeri et al., im Druck). Auch
die neuartigen Gene A, B und C, die die Exons 9, 5 und beziehungsweise
3 enthalten, hatten keine Sequenzvarianten, die mit NPHS1 segregierten
und konnten genauso als die NPHS1-Gene ausgeschlossen werden (Daten
nicht gezeigt). Von einem vierten neuartigen Gen (NPHS1), das proximal
zu D195610 lokalisiert ist und das ein Transkript von etwa 4,3 kb
kodiert, wurde gezeigt, dass es in humanen embryonischen und adulten Nieren
stark exprimiert wird, und über
dem Hintergrund in anderen Geweben wurden keine klaren Signale beobachtet
(2).
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2 illustriert die Ergebnisse
einer Northernanalyse der Nephrinexpression mit mRNA von humanen embryonischen
und adulten Geweben. Die Nothernfilter, die 2 μg humane poly(A)-RNA von vier
fötalen
und acht adulten Geweben enthielten (Clontech), wurden mit einem
1371 bp NephrincDNA-Sonde (Exons 1–10) hybridisiert, die mittels
RT-PCR von fötaler
Nieren poly(A)-RNA hergestellt wurde. In 2A kann nur mit fötaler Nieren-RNA (Pfeil) eine
deutliche Expression erkannt werden. In 2B kann unter Verwendung von RNA aus
adulten Geweben ein starkes Signal nur in einer 4,3 kb Bande mit
Nieren-RNA (Pfeil) beobachtet werden, die anderen Gewebe wiesen
nur nicht-signifikante, wenn überhaupt
irgendwelche, positiven Signale auf. Die untersuchten Gewebe sind über dem
Filter angegeben und die molekularen Größenmarker (kb) sind an der
Seite der Filter gezeigt.
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Deshalb
war dieses Gen ein starker Kandidat für NPHS1. Es wurde eine fulllength
cDNA für
das Transkript konstruiert, wobei fötale poly(A) mRNA (Clontech)
verwendet wurden, und es wurden PCR-Primer basierend auf der vorhergesagten
Exonstruktur hergestellt. Es wurde herausgefunden, dass das Gen
eine Größe von 26
kb hat und 29 Exons enthält
(1).
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Die
Exonsequenzierungsanalysen offenbarten in über 90% der NPHS1-Chromosomen die Anwesenheit
von zwei Hauptmutationen (3). 3 illustriert die Mutationsanalyse
des NPHS1-Gens. Links: (A) Stammbaum einer NPHS1-Familie mit einem
betroffenen Kind, das eine 2 pb Deletion im Exon 2 hat. Die Sequenzen
der Deletionsstelle sind für
den Patienten (homozygot), einen Elter (heterozygot) und ein gesundes Geschwister
gezeigt. Rechts: (B) Stammbaum einer NPHS1-Familie mit einem betroffenen
Kind, das eine Nonsensemutation im Exon 26 hat. Die Sequenzen der
mutierten Region sind für
den Patienten (homozygot), einen Elter (heterozygot) und ein gesundes
Geschwister gezeigt.
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Die
erste Mutation, eine 2 pb Deletion im Exon 2, verursacht eine Leserasterverschiebung,
die zur Bildung eines Stopcodons innerhalb des Exons führt. Diese
Mutation wurde in allen NPHS1-Chromosomen mit dem Haplotyp 1-1-1-6-g-2-8-9
und 1-1-1-6-g-6-4-2 gefunden (eine Gesamtheit von 76 Chromosomen).
Eines von 83 Kontrollindividuen war für die Fin-major Mutation heterozygot.
Die zweite Sequenzvariante, die in dem NPHS1-Gen gefunden wurde,
war eine Nonsensemutation von GCA → TGA im Exon 26, die in Patienten
mit dem Haplotyp 3-5-3-6-a-8-10-x (13 Chromosomen) und in drei Patienten
mit unterschiedlichen Haplotyen vorlag. Keiner der Eltern, gesunden
Geschwister oder Kontrollen (eine Gesamtheit von 230 Individuen)
war für die
zwei Mutationen, die hier identifiziert wurden, homozygot oder compound-heterozygot.
Da das in dieser Untersuchung klonierte Gen dasjenige ist, das in
das erbliche nephrotische Syndrom involviert ist, bezeichnen wir es
als das NPHS1-Gen.
-
Von
den 49 untersuchten NPHS1-Patienten waren 32 homozygot für die 2
pb Deletion im Exon 2 (Fin-major), vier waren homozygot für die Nonsensemutation
im Exon 26 (Fin-minor) und acht waren compoundheterozygot. Vier
Patienten hatten die Fin-major Mutation auf einem Allel, die andere
potentielle Mutation ist immer noch unbekannt. Ein Patient hatte
weder die eine noch die andere Mutation.
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Beispiel 4
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Charakterisierung
des NPHS1-Genprodukts
-
Die
cDNA-vorhergasagte Aminosäuresequenz
des NPHS1-Proteins (Nephrin) ist 1241 Reste lang (4), mit einer berechneten Molekularmasse
von 134742 ohne die posttranslationalen Modifikationen.
-
4 zeigt die nukleotidabgeleitete
Aminosäuresequenz
von Nephrin und die vorhergesagte Domänenstruktur (das NPHS1 Genprodukt). 4A illustriert die vorhergesagte
N-terminale Signalsequenz von 22 Resten, die Schnittstelle ist mit
einem Pfeil markiert. Eine mutmaßliche Transmembrandomäne (Reste 1059–1086) ist
fett gedruckt und unterstrichen gezeigt. Der mutmaßliche extrazelluläre Teil
des Proteins enthält
acht Ig-ähnliche
Module (umrahmt) und ein Fibronektin Typ III-ähnliches Modul angrenzend an
die Transmembrandomäne
(mit einer fetten Linie umrahmt). Die Cysteinreste sind durch schwarze
Punkte angezeigt und die zehn mutmaßlichen N-Glycosylierungsstellen
in dem extrazellulären
Teil des Proteins sind unterstrichen. 4B illustriert
die vorhergesagte Domänenstruktur
des normalen Nephrins (des NPHS1-Genprodukts) und die vorhergesagten
Effekte der zwei Mutationen (Fin-major und Fin-minor), die in dieser
Untersuchung identifiziert wurden. Die Ig-ähnlichen Module sind als Teilkreise
und das Fibronektin Typ III-ähnliche
Motif als ein Sechseck abgebildet. Die Transmembrandomäne ist als
ein schwarzes Rechteck gezeigt, das in einem Membranlipidbilayer
lokalisiert ist. Die Lokationen von drei freien Cysteinenresten
sind durch Linien mit einem schwarzen Punkt am Ende angezeigt. Die
major NPHS1-Mutation würde
zur Produktion eines sekretierten Proteins führen, das nur einen Teil des
ersten Ig-ähnlichen
Moduls enthält.
Die Fin-minor Mutation würde
zu einem Nephrinmolekül
führen,
dem ein Teil der cytosolischen Domäne fehlt.
-
Mehrere
Programme für Ähnlichkeitsvergleiche
und Proteinstrukturvorhersagen sagten vorher, dass das NPHS1-Protein
ein Transmembranprotein der Immunglobulinsuperfamilie sein würde. Es
gibt ein vorläufiges
22 Reste langes N-terminales Signalpeptid, eine extrazelluläre Domäne, die
acht immunglobulinähnliche Domänen enthält, ein
Fibronectin Typ III Domänen-ähnliches
Modul, gefolgt von einer einzelnen mutmaßlichen transmembrandomäneähnlichen
Sequenz und einem cytosolischen C-terminalen Ende. Anstelle der Anwesenheit
von bekannten strukturellen Modulen (4)
war die Sequenzidentität
mit den entsprechenden Proteindomänen in der Datenbank relativ
gering. Der vorläufige
extrazelluläre
Anteil des Proteins enthält
zehn NXS oder NXT Consensustriplets für die N-Glycosylierung. Darüber hinaus gibt es sieben SG-Duplet,
die potenzielle Anlagerungsstellen für Heparinsulfat sind.
-
Die
Nothernhybridisierungsanalyse, die mit poly(A)-mRNA von vier humanen
embryonischen und acht adulten Geweben durchgeführt wurde, enthüllte einen
hohen Fliessgleichgewichtslevel des NPHS1-Gentranskripts in der
Niere, nicht merklich aber in anderen Geweben (2). Eine in situ-Hybridisierung, die
mit einer Nierenprobe eines 23 Wochen alten humanen Embryos durchgeführt wurde,
enthüllte
intensive Expressionssignale in den Glomeruli (5A). Mit einer stärkeren Vergrößerung (5B) konnten die Signale
in der Peripherie von reifen und sich entwickelnden Glomeruli erkannt
werden, während
die zentralen mesangialen Regionen negativ waren. Es ist offensichtlich,
dass die positiven Zellen epitheliale Podocyten sind. Es wurden
mit der antisense Kontollsonde keine spezifischen Signale erhalten.
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5 illustriert die Expression
der Nephrin-mRNA in humaner embryonische Niere mittels in situ-Hybridisierung. 5A zeigt eine starke Expression
in den Glomeruli durch den ganzen renalen Cortex hindurch, und wenig,
wenn überhaupt
irgendeine, spezifische Expression wird in anderen Strukturen beobachtet.
(4 × Objektivvergrößerung). 5B: Eine stärkere Vergrößerung offenbart
eine starke Expression in der Peripherie individueller Glomeruli
(grade Pfeile) und wahrscheinlich hauptsächlich in den Epithelialzellen.
Es wird keine Expression in der Bowmanschen Kapsel (gekrümmte Pfeile),
den proximalen Tubuli (offene Pfeile) oder den Endothelialellen
der Gefäßwände beobachtet.
(20 × Objektivvergrößerung).
-
Beispiel 5
-
Das NPHS1-Gen
und sein Genprodukt Nephrin
-
Mehrere
in der vorliegenden Untersuchung erhaltene Beweislinien zeigen,
dass wir das Gen positionell kloniert haben, das im kongenitalen
nephrotischen Syndrom des finnischen Typs betroffen ist. Erstens
wurde das defekte Gen in der kritischen 150 kb Region auf dem Chromosom
19q13.1 lokalisiert, zu welcher das Gen unter Verwendung der Kopplungsungleichgewichtsanalysen
lokalisiert worden war (Kestilä et
al., 1994b; Mannikkö et
al., 1995; Kestilä et
al. Manuskript). Zweitens wurde von den zweien in dieser Untersuchung
identifizierten Mutationen gezeigt, dass sie in 44 von 49 untersuchten
finnischen Patienten vorhanden waren, entweder als homozygote oder
als compound-heterozygote Mutationen. Vier der verbleibenden Patienten
hatten die Majormutation in einem Allel, die Mutation in dem anderen
Allel ist bis jetzt nicht identifiziert worden. Ein Patient, der
keine der beiden Mutationen hatte, hat einen einzigartigen Haplotyp
und trägt
deshalb wahrscheinlich eine andere Mutation. Drittens wurden in
den 230 Kontroll-DNAs
keine Individuen gefunden, die homozygot oder compound-heterozygot
für die
Mutationen waren. Außerdem
war die starke und praktisch renalglomerulispezifische Expression
des Gens ein indirekter Beweis, was eine Verwicklung des Genprodukts
in die glomeruläre
Entwicklung oder Funktion andeutet,.
-
Identifikation
des NPHS1-Gens
-
Die
vorliegende Identifikation des NPHS1-Gens demonstriert die Stärke der
Kopplungsungleichgewichtsanalyse und der direkten DNA-Sequenzierung
im Positional Cloning (positionelles Klonieren) von Krankheitsgenen,
die kleine Mutationen enthalten. Hier wurde die Kopplungsungleichgewichtskartierung
(Hästbacka et
al., 1994), die, wenn sie mit DNA von Individuen einer homogenen
Population wie der isolierten finnischen Population (da la Chapelle,
1993) angewendet wird, verwendet, um das NPHS1-Gen in einem genomischen 150
kb Segment zu lokalisieren. Um die Gene zu finden, die in dieser
Region lokalisiert sind, wurde das gesamte Segment als erstes sequenziert
und unter Verwendung einer Kombination aus Exonvorhersageprogrammen
und Homologievergleichsanalysen konnten wir bemerkenswert akkurate
Genstrukturen konstruieren, die von cDNAs verifiziert wurden. Diese
cDNAs konnten entweder unter Verwendung von EST-Klonen oder unter
Verwendung der vorhergesagten Exonsequenzen isoliert werden, um
cDNAs mittels PCR von mRNA zu konstruieren. Auf diese Weise konnten
wir schnell 11 Gene innerhalb des 150 kb NPHS1- enthaltenden genomischen Segments identifizieren.
Da keines der Gene ein offensichtlicher Kandidat für NPHS1
war und keine größeren Genrearrangements
wie Deletionen, Insertionen oder Inversionen in den Patienten-DNAs gefunden
wurden, musste die Suche nach kleinen Mutationen, wenn nötig in allen
11 Genen, initiiert werden. Nachdem die Exon- und cDNA-Sequenzen
der Gene bestimmt worden waren, wären Methoden wie SSCP und DGGE,
welche häufig
zur Identifikation kleiner Mutationen verwendet werden, mögliche Alternativen
gewesen. Unsere Erfahrung aus der Suche nach kleinen Mutationen
beim Alport Syndrom (Barker et al., 1990; Tryggvason, 1996) legte
jedoch nahe, dass diese Verfahren häufig Falschnegative erzielen
können.
Zum Beispiel haben SSCP-Analysen
in einer recht großen
Patientenpopulation nur eine Mutationsdetektionsrate von 35–50% offenbart
(Kawai et al., 1996, Knebelmann et al., 1996, Renieri et al., 1996),
während
unsere direkte Sequenzierung der PCR-amplifizierten Exonregionen
eine Detektion über
80% erzielte. Wir entschieden deshalb die direkte Sequenzierung
der Exonregionen zu verwenden, um die NPHS1-Mutationen zu finden.
Obwohl wir zahlreiche Exons von mehreren Genen zu sequenzieren hatten,
führte
dies relativ bald zu der Identifikation von zwei kleinen Mutationen
in einem Gen. Wir folgerten, dass das Sequenzieren von sogar einer
großen
Kandidatengenregion und die direkte Sequenzierung ihrer Gene ein
attraktives und vor allem ein verlässliches Verfahren für die Suche
nach kleinen Mutationen beim Positional Cloning ist, insbesondere
wenn erwartet werden kann, dass nur ein paar Mutationen vorhanden
sind.
-
Genetik von NPHS1
-
Die
entscheidenden Komponenten beim erfolgreichen Positional Cloning
des NPHS1-Gens waren die kleinen isolierten Populationen, die guten
klinischen Unterlagen und das gleichberechtigte, qualitativ hochwertige
Gesundheitssystem, die es ermöglichten,
verlässlich
Proben von Familien zu sammeln. Eine typische Situation bei Populationsisolaten
ist, dass beinahe 100% der Fälle
durch dieselbe Mutation verursacht werden, und dieses Phänomen kann
bereits bei der Haplotypanalyse erkannt werden. Beobachtete Veränderungen
in dem Gründerhaplotyp,
die durch historische Rekombinationen verursacht wurden, können verwendet
werden, um die kritische chromosomale Region auf ein kurzes genomisches
Segment einzuschränken.
Folglich machten Unterschiede in dem major NPHS1-Haplotyp 1-1-1-6-g-2-8-9 eine beträchtliche
Einengung des Intervalls möglich,
was zur Isolation des NPHS1-Gens führte. Die major NPHS1-Mutation
verursacht nur 78% der Fälle im
Gegensatz zu vielen anderen „finnischen
Erkrankungen" mit
einer Prävalenz
von 95–98%
der major Erkrankungsalle (zum Beispiel Ikonen et al., 1991). Jedoch
die zwei Haupt-NPHS1-Mutationen,
die in dieser Untersuchung charakterisiert wurden, repräsentieren
zusammen 94% der finnischen Fälle.
-
Das
kongenitale nephrotische Syndrom des finnischen Typs ist in der
finnischen Population angereichert, weltweit können aber mehrere Fälle gefunden
werden. Eine beachtliche Immigration von Finnland nach Minnesota
hat ebenso die Verbreitung von NPHS1 nach den USA verursacht (Norio
1966; Mahan et al., 1984). Außerdem
sind mehrere CNF-Fälle
in verschiedenen europäischen
Ländern
diagnostiziert worden, und Kopplungsstudien haben eine Beziehung
der analysierten Familien zu demselben Lokus auf Chromosom 19 unterstützt (Fuchshuber
et al., 1996).
-
Die
Identifikation des NPHS1-Gens und der krankheitsverursachenden Mutationen
haben eine unmittelbare klinische Signifikanz, da sie die Entwicklung
einer exakten DNA-basierten Diagnose für NPHS1 und ein Screening nach
den Trägern
ermöglichen.
Dies ist besonders wichtig, da wir kürzlich demonstriert haben,
dass das in Finnland breit angewendete Screeningverfahren für NPHS1,
basierend auf der Messung der Alpha-Fetoproteinlevel im Fruchtwasser, zu
falschpositiven Ergebnissen und folglich zu Abtreibungen von gesunden NPHS1-Trägern führen kann
(Männikö et al.,
1997).
-
Nephrin – ein glomerulusspezifischer
Zelladhäsionsrezeptor
-
Auf
Grund der starken Assoziation der Expression und der Pathologie
mit den Glomeruli, dem proximalen Teil des Nephrons, haben wir das
NPHS1-Genprodukt
Nephrin genannt. Die Rolle von Nephrin bleibt unbekannt, es ist
aber wahrscheinlich, dass es ein Adhäsionsrezeptor und ein Signalprotein
ist, da seine Domänenstruktur
der Domänenstruktur
einer großen
Gruppe von Zelladhäsionsrezeptoren ähnelt, die
zur Immunglobulinsuperfamilie gehören (Brümmendott und Rathjen, 1994).
-
Die
Ig-ähnlichen
Domänen
von Nephrin sind alle vom Typ C2, der besonders in Proteinen gefunden wird,
die an Zell-Zell- oder Zell-Matrixinteraktionen teilhaben. Zwischen
der sechsten und der siebten Ig-ähnlichen
Domäne
ist ein Platzhalter (Spacer) von etwa 130 Resten, der ein ungepaartes
Cystein enthält,
und es gibt ein weiteres ungepaartes Cystein in der Fibronektin
Typ III-ähnlichen
Domäne.
Ihre SH-Gruppen könnten in
die Bildung von cis-Homo/Heterodimeren
involviert sein, an Thioether- oder Thioesterbindungen mit unbekannten
Stukturen teilhaben oder sie könten
innerhalb der Domänen
begraben sein, wie es von Brümmendott und
Rathjen vorgeschlagen wurde (1994).
-
Datenbankdurchsuchungen
offenbarten, dass die cytosolische Domäne, die neun Tyrosinreste des Nephrins
enthält,
keine signifikante Homologie mit anderen bekannten Proteinen hat.
Die Sequenzmotive jedoch, die die Thyrosine umgeben, legen nahe,
dass die Thyrosine 1176, 1192 und 1217 während der Ligandenbindung des
Nephrins phosphoryliert werden könnten
(siehe Songyang et al., 1993). In diesem Fall könnten Bindungsstellen für die SH2-Domänen der
Kinasen der Scr-Familie, der Abl-Kinase und einem Adaptorprotein
Nck geschaffen werden (die Thyrosine 1176 und 1192 sind von dem
Motif DEV und das Thyrosin 1217 von dem Motiv DQV gefolgt). Die
entscheidende Rolle für
die intrazelluläre
Domäne
von Nephrin wird durch die Tatsache unterstrichen, dass die finnische
Minormutation, die zum Verlust von 132 von 155 Resten führt, zu
einem völlig
zertstörten
NPHS1 führt.
-
Von
der Pathogenese des NPHS1 wurde angenommen, dass sie primär oder sekundär die hoch
anionischen Glycosaminoglykane mit einbezieht, da berichtet wird,
dass der Gehalt von solchen Molekülen, von denen angenommen wird,
dass sie für
den glomerulären
Filtrationsprozess wichtig sind, in der GBM bei der Proteinurie
verringert ist (Kasinath und Kanwar, 1993). Es kann nicht ausgeschlossen
werden, dass Nephrin ein Proteoglykan ist, da es mehrere SG-Konsensusstellen
für Heparansufatseitenketten
hat, einschließlich
das Triplet-SGD, welches die Hauptbefestigunssequenz für die drei
großen
Heparansulfatseitenketten in dem Basalmembranproteoglykan Perlecan
ist (Noonan et al., 1991; Kallunki und Tryggvason, 1992; Dolan et
al., 1997). So weit jedoch ist von keinen Ig-ähnlichen Rezeptoren berichtet
worden, die Glycosaminoglykane enthalten.
-
Wie
funktioniert Nephrin und was ist seine Rolle bei der glomerulären Funktion?
Eine breite Mehrheit ähnlicher
Rezeptoren interagiert mit anderen Membranproteinen auf eine homo-
oder heterophilen Weise. Jedoch von einigen dieser Rezeptoren ist
gezeigt worden, dass sie mit Proteinen der extrazellulären Matrix
(ECM für
Englisch: extracellular matrix) interagieren. Zum Beispiel das myelinassoziierte
Glycoprotein MAG, dessen extrazelluläre Domäne fünf Ig-ähnliche Domänen enthält, interagiert mit verschiedenen Typen
von Kollagen und Glycosaminoglykanen (Fahrig et al., 1987). Darüber hinaus
ist sowohl von dem axonalen Glycoprotein F11 (Englisch: axonal glycoprotein
F11) als auch dem colorectalem Karzinom deletierten (DCC für Englisch:
deleted in colorectal cancer) Protein gezeigt worden, dass sie an
Tenaskine beziehungsweise Netrine binden (Zisch et al., 1992; Pesheva
et al., 1993; Keino-Masu, 1996). Da es möglich ist, dass Nephrin entweder
ein anderes Membranprotein oder ein Protein der ECM, welche in diesem
Fall die GBM wäre,
bindet, wird es wichtig sein, Nephrin mittels Immunelektronenmitkroskopie
zu lokalisieren, bevor mit der Suche nach einem spezifischen Liganden
begonnen wird.
-
Was
auch immer seine Funktion ist, die in situ Hybridisierungsanalyse
deutet stark an, dass Nephrin in den glomerulären Epithelialzellen hergestellt
wird, die die Fußfortsätze bilden,
die teilweise die Außenseite der
glomerulären
Kapillaren bedecken. Die ultimative Filtrationsschranke für Plasmamakromoleküle ist in
dem Diaphragma lokalisiert, dass die Schlitzporen zwischen den Fußfortsätzen bedeckt.
Beim NPHS1 und bei nephrotischen Syndromen mit anderer Ursache ist
die Fusion der Fußfortsätze ein
genereller Befund, und die Struktur oder Funktion der Schlitzporen
ist irgendwie mit einer Proteinurie als Ergebnis betroffen. Es wird
vorgeschlagen, dass das Plasmamembranprotein Nephrin wichtig für die Aufrechterhaltung
der Integrität
von den Fußfortsätzen der
glomerulären
Epithelialzellen ist oder dass es für deren Verankerung an den
Komponenten der GBM entscheidend ist.
-
Schlussfolgerungen
-
Die
Identifikation des NPHS1-Gens wird eine unmittelbare Anwendungen
für die
Diagnose der Erkrankung finden. Untersuchen an dem Genprodukt Nephrin,
einem mutmaßlichen
Zelladhäsions-
und Signalingrezeptor, können
auch einen Schlüssel
für ein
neues, fundamentales Verständnis
der molekularen Mechanismen der glomerulären Filtration bereitstellen,
die trotz jahrzehntelanger Forschung kaum verstanden sind. Da eine abormale
Funktion der Filtrationsbarriere eine der Hauptkomplikationen bei
vielen klinisch wichtigen Nierenerkrankungen wie der diabetischen
Nephropathie, den nephrotischen Syndromen und Glomerulonephritiden
ist, hat die vorliegende Arbeit wahrscheinlich eine generellere
Auswirkung auf die klinische Nephrologie. Unmittelbare Fragen beziehen
sich auf die Expression und Lokation des Proteins während der
Entwicklung, was die Erzeugung von Antikörpern und Nukleotidsonden für Untersuchungen
in tierischen und Zellkultursystemen verlangen würde.
-
Genetisches
Screenen auf eine Basalmembranerkrankungen
-
Mit
der Identifikation und Charakterisierung von Nephrin als eine entscheidende
Komponente bei der Basalmembranerkrankung assoziiert mit einer glomerulären Nephropathie,
ist es nun möglich
Individuuen sowohl präals
auch postnatal auf die Suszeptibilität für eine Basalmembranerkrankung
zu screenen, indem das mutierte Nephringen oder -protein detektiert
wird. Eine solche Information wird für Ärzte für eine Zukunftsdiagnose bei
den Erkrankungsbedingungen der gescreenten Individuen und für die Planung
von präventiven Maßnahmen
für das
zukünftige
In-Schach-Halten der Erkrankung nützlich sein. Eine solche Information
wird für
die Diagnose der derzeitig aktiven Erkrankungsbedingungen nützlich sein.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht
die Diagnose der derzeitig aktiven Erkrankungsbedingungen wie sie
sich auf eine Erkrankung der Basalmembran beziehen, indem das mutierte
Nephringen oder -protein detektiert wird. Die Entdeckung des Nephringens
stellt ein Mittel zur Detektion der Präsenz des Nephringens in Individuen
und für
die Determination der Präsenz
von irgendwelchen Mutationen in dem besagten Gen bereit. Solch ein
Mittel zur Detektion umfasst Nukleinsäuren, die die gesamte Nephringensequenz
oder Fragmente davon haben, welche spezifisch mit dem besagten Nephringen
oder mRNA-Transkripten des besagten Nephringens unter stringenten
Bedingungen hybridisieren. Ein zusätzliches Mittel zur Detektion
des Nephringens und von Mutationen darin umfasst spezifische aneinander
angrenzende (Englisch: contigous) Fragmente des besagten Gens und
die komplementäre Gensequenz,
die für
die Verwendung als Primer zur Amplifikation der Gensequenz, auf
die abgezielt wird, kombiniert werden können. Die besagten Mittel zur
Detektion von Mutationen in einem Nephringen können auch die direkte Hybridisierung
des normalen Gens mit dem Zielgen und die anschließende Detektion
der erfolgreichen Hybridisierung umfassen. In allen Fällen kann
das Zielgen amplifizierte oder nicht-amplifizierte DNA oder RNA,
die aus dem zu testenden Individuum isoliert wurde, sein.
-
Antikörperscreening
von Geweben und Proben
-
Dadurch,
dass man die Gensequenz hat, liegt es im Bereich des Fachmanns die
existierenden molekularbiologischen und biochemischen Techniken
zu verwenden, um einen Expressionsvektor zu konstruieren und zu
verwenden, der ein rekombinantes Nephrinprotein oder Fusionsprotein
produziert, dieses Protein aufzureinigen und Antikörper, die
spezifisch mit Nephrin regieren, herzustellen. Die Expression von
Proteinen in bakteriellen, Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen ist im Stand
der Technik bekannt. Es ist im Stand der Technik bekannt, wie Expressionsvektoren
zu konstruieren und zu verwenden sind, in welchen das exprimierte
Gen zwei oder mehrere Introns enthält. Die Herstellung von monoklonalen
Antikörpern
ist im Stand der Technik gut bekannt, und die Verwendung von polyklonalen
oder monoklonalen Antikörpern
zur immunhistochemischen Detektion von Protein in Gewebeproben ist
eine Routineanwendung. Es ist eine große Vielfalt an detektierbaren
Markierungen zur Verwendung in immunhistochemischen Färbungen
und Immunnassays zur Proteindetektion in Proben wie homogenisiertem
Gewebe, Blut, Serum, Urin oder anderen Körperflüssigkeiten, erhältlich.
-
Ein
Fachmann auf diesem Gebiet wird in der Lage sein diese Lehren gemäß der vorliegenden
Erfindung ohne weiteres anzuwenden, um geeignete Nachweise und Detektionsschemata
für die
Praktizierung der Screeningverfahren zu designen, die von der vorliegenden
Erfindung beabsichtigt sind.
-
Gentherapie
-
Angesichts
der Lehre gemäß der vorliegenden
Erfindung wird es möglich
sein die Mängel
im Nephringen oder -protein mittels Gentherapie oder mittels einer
Therapie, die rekombinantes Protein verwendet, zu addressieren.
Die Verfahren für
die Adminstration der Protein- oder Gentherapie sind im Stand der
Technik bekannt.
-
GenBank Accession
Numbers
-
Die
Accession Numbers für
die charakterisierten Cosmidklone sind: F19541 = U95090, R33502
= AC002133, R28051 = AD000864, F19399 = AD000833, R31158 = AD000827,
R31874 = AD000823. Die Accession für die Nephrin-cDNA-Sequenz ist
AF035835.
-
Ein
Fachmann auf diesem Gebiet wird in der Lage sein die Lehren der
vorliegenden Erfindung ohne weiteres anzuwenden, um geeignete Nukleinsäuresequenzen
zu designen und zu konstruieren, die funktionelle Äquivaltente
zu den hier offen gelegten sein werden. Ein Fachmann auf diesem
Gebiet wird wissen, dass es viele allelische Varianten der offenbarten Nukleinsäuresequenzen
geben kann, die dennoch für
ein Nephrinprotein mit einer äquivalenten
Funktion kodieren werden. Die Lehren der vorliegenden Erfindung
ermöglichen die
Entdeckung von Mutationen in dem Nephringen und dem modifizierten
Protein, welches darin kodiert wrid.
-
Beispiel 7
-
Screenen auf
Therapeutika bestehend aus kleinen Molekülen
-
Mit
der Identifikation und Charakterisierung von Nephrin als eine entscheidende
Komponente in der Nierenpathologie und Proteinurie und folglich
die Verwicklung in viele Nierenerkrankungen, ist es nun möglich auf
Therapeutika, die bestehend aus kleinen Molekülen bestehen, zu screenen,
wobei Nephrin und das Nephringen verwendet werden. Das Screenen
auf solche Therapeutika kann durch sequenzielles selektives Screenen
auf die Aktivität
von Molekülen,
die spezifisch an Nephrin hybridisieren oder welche spezifisch die Expression
des Nephringens bewirken, bewerkstelligt werden. Ein selektives
Screening kann an Pools aus Verbindungen, die kleine Moleküle sind,
welche mittels standartkombinatorischer Chemie erzeugt werden, an bekannten
Molekülen
oder in Kombination mit einer Computermodelierung der Nephrinproteinstruktur
und rationellem Medikamentendesign durchgeführt werden. Solche Verfahren
und Techniken sind im Stand der Technik bekannt.
-
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