DE69913325T2

DE69913325T2 - Nephrin Gen und Protein

Info

Publication number: DE69913325T2
Application number: DE1999613325
Authority: DE
Inventors: Karl Tryggvason; Marjo Kestila; Ulla Lenkkeri; Minna Männikkö
Original assignee: Biostratum Inc
Current assignee: Biostratum Inc
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1999-03-16
Publication date: 2004-11-18
Anticipated expiration: 2019-03-17
Also published as: AU3087799A; CA2323091A1; AU761601B2; CA2323091C; JP2002506883A; WO1999047562A1; DE69913325D1; EP1064306A1; US7105291B2; ATE255595T1; JP4368061B2; US20020004589A1; EP1064306B1; US20070009952A1; US6207811B1; ES2213357T3; US7799529B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Das kongenitale nephrotische Syndrom des finnischen Typs (CNF, NPHS1, MIM 256300) ist eine autosomal rezessive Störung und eine eigene Einheit unter den kongenitalen nephrotischen Syndromen. Es ist durch eine massive Proteinurie im fötalen Stadium und eine Nephrose bei der Geburt gekennzeichnet. Wesentlich ist, NPHS1 scheint einzig die Nieren zu betreffen und stellt deshalb ein einzigartigen Model für Untersuchungen an der glomerulären Filtrationsschranke bereit.
Die primäre Schranke für die Plasmaultrafiltration in den renalen Glomeruli umfasst drei Schichten; ein Endothel mit Poren, eine 300–350 nm dicke glomeruläre Basalmembran (GBM) und Schlitzporen, dass heißt Diaphragmas, die zwischen den Fußfortsätzen der Epithelialzellen lokalisiert sind. Diese Schranke ist ein hoch entwickeltes größenselektives molekulares Sieb, dessen molekulare Funktionsmechanismen immer noch weitgehend ungeklärt sind. Es wird angenommen, dass die GBM, ein eng quervernetztes Geflecht aus Typ IV Kollagen, Laminin, Nidogen und Proteoglykanen, Poren enthält, die die Penetration von großen Molekülen und Zellen beschränkt, und zusätzlich ist die Hypothese aufgestellt worden, dass anionische Heparansulfat-Proteoglykanverbindungen zu einer elektrischen Schranke für Makromoleküle beitragen (Kasinath und Kanwar, 1993). Der glomeruläre Filter ist von einer großen Anzahl erworbener und vererbter Erkrankungen betroffen, die zu einem umfangreichen Durchsickern von Plasmaalbumin und größeren Proteinen führen, was ein nephrotisches Syndrom und eine Renalerkrankung im Endstadium zur Folge hat. Ein Verständnis für die molekularen Mechanismen des glomerulären Filtrationsverfahrens und seiner Pathologie ist von grundlegender Wichtigkeit für die klinische Medizin, was wiederum neuartige Entwicklungen für die Diagnose und die Behandlung von Komplikationen in primären und sekundären Nierenerkrankungen erleichtern kann. Genetische Erkrankungen mit Defekten in der Filtrationsschranke als Hauptsymptome können als Modelle zu Bereitstellung eines solchen Wissens dienen.
Die kongenitalen nephrotischen Syndrome (NPHS) bilden eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die durch eine massive Proteinurie bei oder kurz nach der Geburt gekennzeichnet ist (Rapola et al., 1992). Das nephrotische Syndrom kann primär, erworben oder ein Teil von anderen Syndromen sein. Das kongenitale nephrotische Syndrom des finnischen Typs (CNF, NPHS1) ist eine eigene Einheit unter den NPHS. Es ist eine autosomal rezessive Störung mit einem Auftreten bei 1 : 10000 Geburten in Finnland, beträchtlich weniger aber in anderen Ländern (Norio, 1966; Huttunen, 1976). Diese Erkrankung manifestiert sich bereits im fötalen Stadium mit einer schweren Proteinurie in utero, die frühe Läsionen der glomerulären Filtrationsschranke demonstriert. Die Pathogenese von NPHS1 ist undurchsichtig geblieben. Es gibt keine pathognomonisch pathologischen Merkmale, der typischste histologische Befund von NPHS1-Nieren ist die Dilation der proximalen Tubuli (Huttunen et al., 1980). Auch sind die Nieren groß und es wurde herausgefunden, dass sie eine größere Menge an Nephronen enthielten als altersentsprechende Kontrollen (Tryggvason und Kouvalainen, 1975). Eine Elektronenmikroskopie offenbart keine abormalen Merkmale der GBM selbst, obwohl es einen Verlust an Fußfortsätzen der glomerulären Epithelialzellen gibt, ein Befund, der für nephrotische Syndrome jeder Ursache charakteristisch ist. Die Analysen von GBM-Proteinen wie dem Kollagen Typ IV, dem Laminin und dem Heparansulfat-Proteoglykan haben keine abormalen Befunde beim NPHS1 offenbart (zum Beispiel siehe Ljungberg et al., 1993, Kestilä et al., 1994a). NPHS1 ist eine progressive Erkrankung, die gewöhnlich während der ersten zwei Lebensjahren zum Tod führt, und die einzige lebensrettende Behandlung ist eine Nierentransplantation (Holmberg et al., 1995). Wichtig ist, die meisten transplantierten Patienten haben so weit keine extrarenalen Komplikationen entwickelt, was nahe legt, dass das mutierte Genprodukt hoch spezifisch für die Nierenentwicklung und/oder die glomeruläre Filtrationsfunktion ist. Über 20% der Patienten jedoch haben posttransplantationale Nephrosen entwickelt, deren Ursache unbekannt ist (Laine et al., 1993; Holmberg et al., 1995).
Auf Grund seiner hohen Spezifität für den glomerulären Filtrationsprozess stellt NPHS1 eine einzigartige Modelerkrankung für Untersuchungen an dieser wichtigen Nierenfunktion bereit. Da es kein überzeugendes Kandidatengen für dieser Erkrankung gab, haben wir einen Ansatz mit Positional Cloning in unseren Versuchen, das CNF-Gen zu identifizieren, verwendet und das Gen zu einer 150 kb Region auf dem Chromosom 19q13.1 lokalisiert (Kestilä et al., 1994b; Männikkö et al., 1995). Wir haben ein neuartiges Gen in der kritischen Region identifiziert und gezeigt, dass es beim NPHS1 mutiert ist. Das Genprodukt ist ein neuartiges Transmembranprotein, das im humanen Embryo einen hohen Expressionslevel in den renalen Glomeruli aufweist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges Protein Nephrin und das Gen, welches für dieses Protein kodiert, bereit. Die vorliegende Erfindung umfasst eine neuartige DNA-Nukleinsäuresequenz, die die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 ist, welche für das Nephrinprotein kodiert. Die vorliegende Erfindung umfasst auch das Protein, für welches die kodierenden Regionen der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 kodieren und welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 hat. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung auch das reife Nephrinprotein, bei welchem das Signalpeptid abgeschnitten worden ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren, die Reagenzien und Kits zum Screenen von Individuen auf die Präsenz eines mutierten Nephringens zur Diagnose, zum pränatalen oder zum postnatalen Screening auf eine Suszeptibilität für eine glomeruläre Nephrose oder eine Basalmembranerkrankung. Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung das Screenen auf das kongenitale nephrotische Syndrom des finnischen Typs (NPHS1) vor.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Reagenzien und Kits für die therapeutische Behandlung von Basalmembranerkrankungen bereit, die mit einem defekten endogenen Nephringenprodukt assoziiert sind. Folglich sieht die vorliegende Erfindung die therapeutische Behandlung unter Verwendung des Nephrinproteins vor und insbesondere unter Verwendung von Protein, das mittels rekombinanter DNA-Verfahren hergestellt wurde. Zusätzlich sieht die vorliegende Erfindung eine Gentherapie unter Verwendung therapeutischer Nukleinsäurekonstrukte vor, die das Nephringen oder im Wesentlichen dazu ähnliche Sequenzen enthalten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird besser mit Blick auf die anliegenden Zeichnungen verstanden werden, worin:
1 eine Zeichnung ist, die eine physikalische Karte des NPHS1-Lokus auf 19q13.1 und die genomische Organisation des NPHS1-Gens zeigt. 1A ist eine physikalische Karte der 920 kb Region zwischen den Markern D19S208 und D195224. 1B ist ein Diagramm der überlappenden Cosmidklone, die die kritische 150 kb Region überspannen, die das NPHS1-Gen enthält. Die Lokation der polymorphen Marker ist durch Pfeile angezeigt. 1C ist ein Diagramm, dass die Lokation von fünf Genen, NPHS1, APLP1, A, B und C, zeigt, die in dieser Untersuchung charakterisiert und auf Mutationen durchsucht wurden. 1D ist eine Zeichnung, die eine schematische Struktur des NPHS1-Gens zeigt;
2 eine Northernblotanalyse der Nephrinexpression (dem NPHS1-Genprodukt) mit mRNA von humanen embryonischen und adulten Geweben zeigt. Die Northernblotfilter, die 2 μg humane poly(A)-RNA von vier fötalen und acht adulten Geweben (Clontech) enthielten, wurden mit einer 1371 bp Nephrin cDNA-Sonde hybridisiert (Exons 1–10), die mittels RT-PCR von fötaler Nieren Poly(A)-RNA gemacht wurde. 2A zeigt die deutliche Expression, die nur mit fötaler Nieren-RNA (Pfeil) beobachtet werden kann. 2B zeigt die Resultate unter Verwendung von RNA aus adulten Geweben, und ein starkes Signal wird nur in einer 4,3 kb Bande mit Nieren-RNA (Pfeil) beobachtet. Die anderen Gewebe weisen, wenn überhaupt positive, nur unbedeutende Signale auf. Die untersuchten Gewebe sind oben über dem Filter gekennzeichnet und die molekularen Größenmarker (kb) sind an den Seiten der Filter gezeigt;
3 ein Diagramm einer Mutationsanalyse des NPHS1-Gens ist. Links: (A) Stammbaum einer NPHS1-Familie mit einem betroffenen Kind, das eine 2 bp Deletion im Exon 2 hat. Die Sequenzen der Deletionsstelle sind für den Patienten (homozygot), einen Elter (heterozygot) und ein gesundes Geschwister gezeigt. Rechts: (B) Stammbaum einer NPHS1-Familie mit einem betroffenen Kind, das eine Nonsensemutation im Exon 26 hat. Die Sequenzen der mutierten Region sind für den Patienten (homozygot), einen Elter (heterozygot) und ein gesundes Geschwister gezeigt;
4 ein Diagramm einer nukleotidabgeleiteten Aminosäuresequenz des Nephrins (dem NPHS1 Genprodukt) und der vorhergesagten Domänenstruktur ist. 4A ist die vorhergesagte N-terminale 22 Reste lange Signalsequenz. Die Schnittstelle ist mit einem Pfeil markiert. Eine vermeintliche Transmembrandomäne (die die Reste 1059–1086 überspannt) ist fettgedruckt und unterstrichen dargestellt. Der vermeintliche extrazelluläre Teil des Proteins enthält acht Ig-ähliche Module (eingerahmt) und ein Fibronektin Typ III-ähliches Modul angrenzend an die Transmembrandomäne (mit einer fetten Linie eingerahmt, Reste 941–1025). Die Cysteinreste sind durch schwarze Punkte angezeigt und die zehn vermeintlichen N-Glykosylierungsstellen in dem extrazellulären Teil des Proteins sind unterstrichen. 4B zeigt die vorhergesagte Domänenstruktur des normalen Nephrins und die vorhergesagten Auswirkungen der zwei Mutationen (Fin-major und Finminor), die in dieser Studie identifiziert wurden. Die Ig-ählichen Module sind als Teilkreise dargestellt und das Fibronektin Typ III-ähliche Motiv als ein Sechseck. Die Transmembrandomäne ist als ein schwarzes Rechteck dargestellt, das in einem Membranlipidbilayer lokalisiert ist. Die Lokationen von zwei freien Cysteinresten sind durch Linien mit einem schwarzen Punkt am Ende angezeigt. Die Fin-major Mutation würde zu der Produktion eines Teils des Signalpeptides führen und einer kurzen Nonsensessequenz. Die Finminor Mutation würde zu einem Nephrinmolekül führen, dem ein Teil der cytosolischen Domäne fehlt; und
5 die Ergebnisse der Nephrin-mRNA-Expression in humaner embryonischer Niere durch in situ Hybridisierung zeigt. 5A zeigt eine starke Expression in den Glomeruli durch den ganzen renalen Cortex hindurch und wenig, wenn überhaupt irgendeine, spezifische Expression wurde in anderen Strukturen beobachtet. (4 × Objektivvergrößerung). 5B ist eine Ansicht mit stärkerer Vergrößerung, die eine starke Expression in der Peripherie individueller Glomeruli (gerade Pfeile) offenbart, wahrscheinlich hauptsächlich in den Epithelialzellen. Es wurde keine Expression in der Bowmanschen Kapsel (gekrümmte Pfeile), den proximalen Tubuli (offene Pfeile) oder den Endothelialzellen der Gefäßwände beobachtet. (20× Objektivvergrößerung).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das kongenitale nephrotische des Finnischen Typs (CNF, NPHS1, MIM 256300) ist eine autosomal rezessive Störung, und eine eigene Einheit unter den kongenitalen nephrotischen Syndromen. Es ist durch eine massive Proteinurie im fötalen Stadium und durch eine Nephrose bei der Geburt gekennzeichnet. Wesentlich ist, NPHS1 scheint einzig die Nieren zu betreffen und stellt deshalb ein einzigartigen Model für Studien an der glomerulären Filtrationsschranke bereit.
Das NPHS1-Gen ist auf dem Chromosom 19q13.1 lokalisiert worden und in der vorliegenden Studie wurde das Kopplungsungleichgewicht verwendet, um die kritische Region auf 150 Kilobasen, die sequenziert wurden, einzugrenzen. Es wurden wenigstens 10 neuartige Gene in dieser Region identifiziert, wobei eines für ein amyloidvorläuferähnliches Protein kodiert. Fünf dieser Gene, von denen alle etwas Expression in der Niere aufzeigten, wurden analysiert, indem alle ihre 63 Exons in NPHS1-Patienten sequenziert wurden. Zwei Mutationen, eine 2 bp Deletion im Exon 2 und ein einzelner Basenaustausch im Exon 26, die beide zu einem verfrühten Stopcodon führen, wurden in einem neuartigen 29 Exon Gen gefunden. Die Mutationen wurden entweder als homozygote oder compound-heterozygote Mutationen in 44 von 49 Patienten gefunden, wobei 4 Patienten, die 2 bp Deletion in einem Allel hatten und die andere potenzielle Mutation noch unbekannt ist. Es wurden bei keiner der Kontrollen gefunden, dass sie homozygot oder compound-heterozygot für die Mutation war. Das Genprodukt, das mit Nephrin bezeichnet wurde, ist ein 1241 Reste langes vermeintliches Transmembranprotein der Immunglobulinfamilie von Zelladhäsionsmolekülen, für welches durch Northern- und in situ Hybridisierung gezeigt wurde, dass es spezifisch für den Nierenglomerulus ist. Diese Ergebnisse demonstrieren eine entscheidende Rolle für Nephrin in der Entwicklung oder Funktion der Filtrationsschranke der Niere.
Die Erfindung wird durch die Betrachtung der folgenden Beispiele, die zur Illustration und nicht zur Einschränkung gedacht sind, besser verstanden werden.
Beispiel 1
Methoden und Verfahren
Sequenzierung der Cosmidklone
Über die Isolation von Cosmidklonen, die die Region zwischen D19S208 und D19S608 überspannen, ist früher berichtet worden (Olsen et al., 1996). Die DNA der Cosmidklone F19541, R33502, F15549, R28051, F19399, R31158 und R31874 wurde mechanisch durch Zerstäubung geschert, und es wurden Fragmente von 1000–2000 bp isoliert und in den M13-Pagen subkloniert, bevor eine Randomsequenzierung unter Verwendung von ABI 377 automatisierten Sequenzierern durchgeführt wurde.
Analyse der Sequenz
Um neue Mikrosatellitenmarker zu entwickeln, wurden Repeatregionen auf der Sequenz gesucht und für drei davon (D19S1173, D19S1175, D19S1176) herausgefunden, dass sie polymorph sind. Homologievergleiche wurden unter Verwendung der BLASTX- und BLASTN-Programme (Altschul et al., 1990) durchgeführt. Vor der BALSTN-Analyse wurde die Nukleotidsequenz gefiltert, wobei CENSOR (Jurka et al., 1996) verwendet wurde, um Repeatregionen wie Alu-Sequenzen auszublenden. Eine Exonvorhersage wurde unter Verwendung der Programme GRAIL II (Uberbacher und Mural, 1991), GENSCAN (Burge und Karlin, 1997), FGENEH und HEXON (Solovyeh et al., 1994) gemacht, und die Vorhersage der Proteinstruktur unter Verwendung von BLASTN (Altschul et al., 1990) und dem EXPASY Molekularbiologieserver (Appel et al., 1994). Die Mutationssuche wurde durch den Vergleich der Patientensequenzen mit der normalen genomischen Sequenz unter Verwendung des FASTA-Programms aus dem GCG-Packet (Genetics Computer Group, 1996) durchgeführt.
Isolation der cDNAs
cDNAs wurden durch PCR mit poly(A)-RNA aus verschiedenen Geweben unter Verwendung von Primern gebildet, die auf Exonsequenzen basierten. Die PCR-Fragmente wurden sequenziert und für das Screenen von cDNA-Bibliotheken verwendet. Die Marathon ready cDNA-Kits (Clontech Laboratories) wurden auch verwendet, um die 5'- und 3'-Extremitäten der cDNAs zu charakterisieren. Der Vergleich der cDNA und der genomischen Sequenzen wurde gemacht, um die Größen der Introns festzulegen, sowie es Intronsequenzen an der Akzeptor- und Donor-Splicestelle gab.
Southern- und Northernblots und in situ Hybridisierungsanalysen
Für Southernanalysen wurden Proben, die 10 μg genomische DNA enthielten, mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und auf 1% Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt, auf Nylonmembranen transferiert und mit cDNA-Sonden hybridisiert. In Nothernanalysen mit mehreren Geweben wurden die Poly(A)-RNAs von 8 adulten und 4 fötalen Geweben untersucht (Clontech). Die Hybridisierung wurde in ExpressHyp-Puffer bei 65°C gemacht, wobei ein cDNA-Klon, der die Exons 1–10 enthielt, verwendet wurde.
Für die in situ Hybridisierung wurde ein Fragment des NPHS1 cDNA-Klons (der dem Exon 10 entspricht) mit Digoxigenin markiert (Boehringer Mannheim), mittels alkalischer Hydrolyse in Fragmente von etwa 150 Basenpaaren geschnitten und dann als Sonde verwendet. Es wurden 7 μm Gewebeschnitte von 23 Wochen humaner embryonischer Niere mit 0,2 M HCl, 0,1 M Triethanolaminpuffer, pH 8,0, der 0,25% (v/v) Essigsäureanhydrid und 100 μg/ml Proteinase K enthielt, behandelt. Die Schnitte wurden mit der Sonde bei 62°C für 16 h hybridisiert. Nach dem Spülen in 50% Formamid und Standard-Natriumcitrat, wurde die Sonde immunologisch mit einem Antikörper gegen Digoxigenin detektiert, der mit dem alkalischen Phosphatenzym konjugiert war (Boehringer Mannheim). Die Farbe wurde mit NBT und BCIP entwickelt.
Mutationsanalyse
In dieser Untersuchung analysierten wir 49 finnische NPHS1-Patienten, deren Eltern und eine Gesamtheit von 54 gesunden Geschwistern. Die Diagnose für NPHS1 basiert auf einer schweren Proteinurie, einer großen Plazenta (> 25% des Geburtsgewichts), einem nephrotischen Syndrom während der ersten Lebenswochen und dem Ausschluß anderer Typen kongenitaler nephrotischer Syndrome (Koskimies 1990). Zusätzlich wurden 83 Proben von Kontrollindividuen analysiert.
Das NPHS1-Gen wurde mittels PCR-Amlifikation und der Sequenzierung aller Exonregionen von genomischer DNA analysiert. Die Sequenzen der Primer für das Exon 2 waren 5'-GAGAAAGCCAGACAGACGCAG-3' (5'-UTR) und 5'-AGCTTCCGCTGGTGGCT-3' (Intron 2) und die Sequenzen für die Primer für das Exon 26 waren 5'-CTCGGGGAGACCCACCC-3' (Intron 23) und 5'-CCTGATGCTAACGGCAGGGC-3' (Intron 26). Die PCR-Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 25 μl durchgeführt, die 20 ng Vorlagen-DNA, 1 × AmpliTaq-Puffer (Perkin-Elme), 0,2 mM von jedem Nukleotid, 50 ng von jedem Primer und 0,5 U AmpliTaq Gold DNA-Polymerase enthielten. Die Reaktionen wurde für 30 Cyclen mit einer Denaturierung bei 95°C für 1 min, einer Anlagerung bei 60°C für 1 min und einer Extension bei 72°C für 1 min durchgeführt. In dem ersten Cyclus wurde die Denaturierung für 12 min durchgeführt und die Extension im letzten Cyclus dauerte 8 min. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1,5% Agarosegel aufgetrennt, ausgeschnitten und mit dem QiaexII System (Qiagen) aufgereinigt. Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde sequenziert, wobei spezifische Primer, die die dRhodamine dye-terminator Chemie einsetzten, und ein ABI377 automatisierter Sequenzierer (Perkin-Elme) verwendet wurden.
Wenn auf die NPHS1 Fin-major Mutation von Eltern, Geschwistern und Kontrollen gescreened wurde, wurde ein 100 bp PCR-Produkt amplifiziert, das die Exon 2 Deletionsstelle enthielt, wobei ein radioaktiv endmarkierter Primer verwendet wurde, und auf 6% Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt. Auf die zweite NPHS1 Fin-minor Mutation konnte unter Verwendung einer neuen Restriktionsschnittstelle für DdeI gescreent werden. Das 140 bp amplifizierte PCR-Produkt wurde mit DdeI verdaut und die Produkte (140 bp oder 90 bp + 50 bp) wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1% SeaKem agarose – 3% NuSieve agarose).
Im Allgemeinen sind die Methoden und Verfahren zur Durchführung molekularbiologischer und biochemischer Techniken im Stand der Technik bekannt und können in den erhältlichen Texten uns Referenzen gefunden werden, wie zum Beispiel Sambrok et al., (1989) Molecular Cloning: a laboratoy manual, 2. Auflage, (Cold Spring Habour Laboratory Press, Cold Spring Habour, NY); Short Protocols in Molecular Biology, 2. Auflage (herausgegeben von Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 1992); Davis et al., (1986) Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, New York); Gene Expression Technology (herausgegeben von Davis Goeddel, Academic Press, San Diego, CA, 1991).
Beispiel 2
Charakterisierung der Gene an dem CNF-Lokus
Im Anschluß an die Lokalisierung des NPHS1-Gens auf 19q13.1 wurden überlappende Cosmidklone von dem Intervall von Interesse zwischen den Markern D19S208 und D19S224 isoliert (Männikkö et al., 1995; Olsen et al., 1996). Basierend auf dem signifikanten Kopplungsungleichgewicht, das mit D19S608 und D19S610 beobachtet worden ist, sowie den neuen Mikrosatellitenmarkern D19S1173, D19S1175 und D19S1176, die in dieser Untersuchung identifiziert wurden, wurde das NPHS1-Gen zwischen D19S1175 und D19S608, in der nahen Umgebung von D19S1176 und D19S610, feinkartiert. Southernhybridisierungsanalysen von NPHS1 Patienten-DNA mit genomischen Klonen offenbarten keine Variationen, was nahe legte, dass die NPHS1-Mutationen keine größeren genomischen Reanangements repräsentieren. Die 150 bp kritische Region wurde in ihrer Gesamtheit sequenziert und die Sequenz nach potentiellen Kandidatengenen abgesucht, wobei Exonvorhersageprogramme und die Datenbankähnlichkeitsdurchsuchungen (data base similarity searches) verwendet wurden. Basierend auf diesen Analysen wurde für die kritische Region abgeschätzt, dass sie über 100 potentielle Exons enthält. Die Ähnlichkeitsdurchsuchungen (similarity searches) offenbarten ein zuvor bekanntes Gen, dass heißt APLP1, das für ein amyloidvorläufer-ähnliches Protein (Lenkkeri et al., im Druck) und acht bestimmte exprimierte Sequenz Tags (ESTs) kodiert. Zusammen weisen diese Analysen auf die Anwesenheit von wenigstens zehn neuartigen Genen in der kritischen Region hin.
1 illustriert eine physikalische Karte des NPHS1-Lokus auf 19q13.1 und die genomische Organisation des NPHS1-Gens. 1A: Physikalische Karte der 920 kb Region zwischen D19S208 und D19S224. 1B: Überlappende Cosmidklone, die die kritische 150 kb Region überspannen, die das NPHS1- Gen enthält. Die Lokation der polymorphen Marker ist mit Pfeilen angezeigt. Die Lokation der polymorphen Marker ist durch Pfeile angezeigt. 1C: Lokation von fünf Genen, NPHS1, APLP1, A, B, und C, die in dieser Untersuchung charakterisiert wurden und die auf Mutationen hin durchsucht wurden. 1D: Schematische Struktur des NPHS1-Gens.
Unter Verwendung von Grail und Genscan Exonvorhersageprogrammen und den Sequenzen von cDNAs wurden die Exon/Intronstrukturen von fünf von den Genen, NPHS1 (1), APLP1, A, B, und C (nicht gezeigt), bestimmt. Obwohl das Fliessgleichgewicht der Transkriptionslevel variierte, offenbarten Northernblotanalysen eine Expression von allen Genen in der Niere und, mit Ausnahme von NPHS1, auch in anderen Geweben. Deshalb konnte keines von ihnen als das NPHS1-Gen ausgeschlossen werden und alle wurden einer Mutationsanalyse unterworfen.
Beispiel 3
Identifikation des NPHS1-Gens
Haplotypanalysen des NPHS1-Chromosoms haben zwei Hauptklassen von finnischen Patienten offenbart (Männikkö et al., 1995; diese Untersuchung). Die erste Klasse, die die Haplotypen 1-1-1-6-g-2-8-9 und 1-1-1-6-g-6-4-2 enthält (Marker D19S1173, D19S1175, D19S1176, D195610, RFLP des Gens B, D19S608, D19S224 beziehungsweise D19S220), ist die häufigste Klasse, die in 78% der finnischen NPHS1-Chromosomen gefunden wird. Die zweite Haplotypklasse, 3-5-3-6-a-8-10-x, wird in 13% der Fälle gefunden. Die verbleibenden 9% der beobachteten Haplotypen weisen völlig unterschiedliche Allelkombinationen auf, und es wurde angenommen, dass sie andere Mutationen repräsentieren. Die zwei Haupthaplotypklassen könnten dieselbe Mutation repräsentieren, weil sie beide das Allel 6 von D19S610 teilen. Die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren jedoch, dass sie zwei verschiedene Mutationen repräsentieren.
Da Sothernhybridisierungsanalysen keine größeren Genrearrangements aufdeckten, wurden Mutationen mittels einer direkten Sequenzierung der PCR-amplifizierten Exonregionen von, wenn nötig, allen Genen dieser Region gesucht.
Das 17 Exon APLP1-Gen, das distal zu D19S610 lokalisiert ist, wies keine Variationen zwischen den Patienten und den Kontrollen auf und wurde als das NPHS1-Gen ausgeschlossen (Lenkkeri et al., im Druck). Auch die neuartigen Gene A, B und C, die die Exons 9, 5 und beziehungsweise 3 enthalten, hatten keine Sequenzvarianten, die mit NPHS1 segregierten und konnten genauso als die NPHS1-Gene ausgeschlossen werden (Daten nicht gezeigt). Von einem vierten neuartigen Gen (NPHS1), das proximal zu D195610 lokalisiert ist und das ein Transkript von etwa 4,3 kb kodiert, wurde gezeigt, dass es in humanen embryonischen und adulten Nieren stark exprimiert wird, und über dem Hintergrund in anderen Geweben wurden keine klaren Signale beobachtet (2).
2 illustriert die Ergebnisse einer Northernanalyse der Nephrinexpression mit mRNA von humanen embryonischen und adulten Geweben. Die Nothernfilter, die 2 μg humane poly(A)-RNA von vier fötalen und acht adulten Geweben enthielten (Clontech), wurden mit einem 1371 bp NephrincDNA-Sonde (Exons 1–10) hybridisiert, die mittels RT-PCR von fötaler Nieren poly(A)-RNA hergestellt wurde. In 2A kann nur mit fötaler Nieren-RNA (Pfeil) eine deutliche Expression erkannt werden. In 2B kann unter Verwendung von RNA aus adulten Geweben ein starkes Signal nur in einer 4,3 kb Bande mit Nieren-RNA (Pfeil) beobachtet werden, die anderen Gewebe wiesen nur nicht-signifikante, wenn überhaupt irgendwelche, positiven Signale auf. Die untersuchten Gewebe sind über dem Filter angegeben und die molekularen Größenmarker (kb) sind an der Seite der Filter gezeigt.
Deshalb war dieses Gen ein starker Kandidat für NPHS1. Es wurde eine fulllength cDNA für das Transkript konstruiert, wobei fötale poly(A) mRNA (Clontech) verwendet wurden, und es wurden PCR-Primer basierend auf der vorhergesagten Exonstruktur hergestellt. Es wurde herausgefunden, dass das Gen eine Größe von 26 kb hat und 29 Exons enthält (1).
Die Exonsequenzierungsanalysen offenbarten in über 90% der NPHS1-Chromosomen die Anwesenheit von zwei Hauptmutationen (3). 3 illustriert die Mutationsanalyse des NPHS1-Gens. Links: (A) Stammbaum einer NPHS1-Familie mit einem betroffenen Kind, das eine 2 pb Deletion im Exon 2 hat. Die Sequenzen der Deletionsstelle sind für den Patienten (homozygot), einen Elter (heterozygot) und ein gesundes Geschwister gezeigt. Rechts: (B) Stammbaum einer NPHS1-Familie mit einem betroffenen Kind, das eine Nonsensemutation im Exon 26 hat. Die Sequenzen der mutierten Region sind für den Patienten (homozygot), einen Elter (heterozygot) und ein gesundes Geschwister gezeigt.
Die erste Mutation, eine 2 pb Deletion im Exon 2, verursacht eine Leserasterverschiebung, die zur Bildung eines Stopcodons innerhalb des Exons führt. Diese Mutation wurde in allen NPHS1-Chromosomen mit dem Haplotyp 1-1-1-6-g-2-8-9 und 1-1-1-6-g-6-4-2 gefunden (eine Gesamtheit von 76 Chromosomen). Eines von 83 Kontrollindividuen war für die Fin-major Mutation heterozygot. Die zweite Sequenzvariante, die in dem NPHS1-Gen gefunden wurde, war eine Nonsensemutation von GCA → TGA im Exon 26, die in Patienten mit dem Haplotyp 3-5-3-6-a-8-10-x (13 Chromosomen) und in drei Patienten mit unterschiedlichen Haplotyen vorlag. Keiner der Eltern, gesunden Geschwister oder Kontrollen (eine Gesamtheit von 230 Individuen) war für die zwei Mutationen, die hier identifiziert wurden, homozygot oder compound-heterozygot. Da das in dieser Untersuchung klonierte Gen dasjenige ist, das in das erbliche nephrotische Syndrom involviert ist, bezeichnen wir es als das NPHS1-Gen.
Von den 49 untersuchten NPHS1-Patienten waren 32 homozygot für die 2 pb Deletion im Exon 2 (Fin-major), vier waren homozygot für die Nonsensemutation im Exon 26 (Fin-minor) und acht waren compoundheterozygot. Vier Patienten hatten die Fin-major Mutation auf einem Allel, die andere potentielle Mutation ist immer noch unbekannt. Ein Patient hatte weder die eine noch die andere Mutation.
Beispiel 4
Charakterisierung des NPHS1-Genprodukts
Die cDNA-vorhergasagte Aminosäuresequenz des NPHS1-Proteins (Nephrin) ist 1241 Reste lang (4), mit einer berechneten Molekularmasse von 134742 ohne die posttranslationalen Modifikationen.
4 zeigt die nukleotidabgeleitete Aminosäuresequenz von Nephrin und die vorhergesagte Domänenstruktur (das NPHS1 Genprodukt). 4A illustriert die vorhergesagte N-terminale Signalsequenz von 22 Resten, die Schnittstelle ist mit einem Pfeil markiert. Eine mutmaßliche Transmembrandomäne (Reste 1059–1086) ist fett gedruckt und unterstrichen gezeigt. Der mutmaßliche extrazelluläre Teil des Proteins enthält acht Ig-ähnliche Module (umrahmt) und ein Fibronektin Typ III-ähnliches Modul angrenzend an die Transmembrandomäne (mit einer fetten Linie umrahmt). Die Cysteinreste sind durch schwarze Punkte angezeigt und die zehn mutmaßlichen N-Glycosylierungsstellen in dem extrazellulären Teil des Proteins sind unterstrichen. 4B illustriert die vorhergesagte Domänenstruktur des normalen Nephrins (des NPHS1-Genprodukts) und die vorhergesagten Effekte der zwei Mutationen (Fin-major und Fin-minor), die in dieser Untersuchung identifiziert wurden. Die Ig-ähnlichen Module sind als Teilkreise und das Fibronektin Typ III-ähnliche Motif als ein Sechseck abgebildet. Die Transmembrandomäne ist als ein schwarzes Rechteck gezeigt, das in einem Membranlipidbilayer lokalisiert ist. Die Lokationen von drei freien Cysteinenresten sind durch Linien mit einem schwarzen Punkt am Ende angezeigt. Die major NPHS1-Mutation würde zur Produktion eines sekretierten Proteins führen, das nur einen Teil des ersten Ig-ähnlichen Moduls enthält. Die Fin-minor Mutation würde zu einem Nephrinmolekül führen, dem ein Teil der cytosolischen Domäne fehlt.
Mehrere Programme für Ähnlichkeitsvergleiche und Proteinstrukturvorhersagen sagten vorher, dass das NPHS1-Protein ein Transmembranprotein der Immunglobulinsuperfamilie sein würde. Es gibt ein vorläufiges 22 Reste langes N-terminales Signalpeptid, eine extrazelluläre Domäne, die acht immunglobulinähnliche Domänen enthält, ein Fibronectin Typ III Domänen-ähnliches Modul, gefolgt von einer einzelnen mutmaßlichen transmembrandomäneähnlichen Sequenz und einem cytosolischen C-terminalen Ende. Anstelle der Anwesenheit von bekannten strukturellen Modulen (4) war die Sequenzidentität mit den entsprechenden Proteindomänen in der Datenbank relativ gering. Der vorläufige extrazelluläre Anteil des Proteins enthält zehn NXS oder NXT Consensustriplets für die N-Glycosylierung. Darüber hinaus gibt es sieben SG-Duplet, die potenzielle Anlagerungsstellen für Heparinsulfat sind.
Die Nothernhybridisierungsanalyse, die mit poly(A)-mRNA von vier humanen embryonischen und acht adulten Geweben durchgeführt wurde, enthüllte einen hohen Fliessgleichgewichtslevel des NPHS1-Gentranskripts in der Niere, nicht merklich aber in anderen Geweben (2). Eine in situ-Hybridisierung, die mit einer Nierenprobe eines 23 Wochen alten humanen Embryos durchgeführt wurde, enthüllte intensive Expressionssignale in den Glomeruli (5A). Mit einer stärkeren Vergrößerung (5B) konnten die Signale in der Peripherie von reifen und sich entwickelnden Glomeruli erkannt werden, während die zentralen mesangialen Regionen negativ waren. Es ist offensichtlich, dass die positiven Zellen epitheliale Podocyten sind. Es wurden mit der antisense Kontollsonde keine spezifischen Signale erhalten.
5 illustriert die Expression der Nephrin-mRNA in humaner embryonische Niere mittels in situ-Hybridisierung. 5A zeigt eine starke Expression in den Glomeruli durch den ganzen renalen Cortex hindurch, und wenig, wenn überhaupt irgendeine, spezifische Expression wird in anderen Strukturen beobachtet. (4 × Objektivvergrößerung). 5B: Eine stärkere Vergrößerung offenbart eine starke Expression in der Peripherie individueller Glomeruli (grade Pfeile) und wahrscheinlich hauptsächlich in den Epithelialzellen. Es wird keine Expression in der Bowmanschen Kapsel (gekrümmte Pfeile), den proximalen Tubuli (offene Pfeile) oder den Endothelialellen der Gefäßwände beobachtet. (20 × Objektivvergrößerung).
Beispiel 5
Das NPHS1-Gen und sein Genprodukt Nephrin
Mehrere in der vorliegenden Untersuchung erhaltene Beweislinien zeigen, dass wir das Gen positionell kloniert haben, das im kongenitalen nephrotischen Syndrom des finnischen Typs betroffen ist. Erstens wurde das defekte Gen in der kritischen 150 kb Region auf dem Chromosom 19q13.1 lokalisiert, zu welcher das Gen unter Verwendung der Kopplungsungleichgewichtsanalysen lokalisiert worden war (Kestilä et al., 1994b; Mannikkö et al., 1995; Kestilä et al. Manuskript). Zweitens wurde von den zweien in dieser Untersuchung identifizierten Mutationen gezeigt, dass sie in 44 von 49 untersuchten finnischen Patienten vorhanden waren, entweder als homozygote oder als compound-heterozygote Mutationen. Vier der verbleibenden Patienten hatten die Majormutation in einem Allel, die Mutation in dem anderen Allel ist bis jetzt nicht identifiziert worden. Ein Patient, der keine der beiden Mutationen hatte, hat einen einzigartigen Haplotyp und trägt deshalb wahrscheinlich eine andere Mutation. Drittens wurden in den 230 Kontroll-DNAs keine Individuen gefunden, die homozygot oder compound-heterozygot für die Mutationen waren. Außerdem war die starke und praktisch renalglomerulispezifische Expression des Gens ein indirekter Beweis, was eine Verwicklung des Genprodukts in die glomeruläre Entwicklung oder Funktion andeutet,.
Identifikation des NPHS1-Gens
Die vorliegende Identifikation des NPHS1-Gens demonstriert die Stärke der Kopplungsungleichgewichtsanalyse und der direkten DNA-Sequenzierung im Positional Cloning (positionelles Klonieren) von Krankheitsgenen, die kleine Mutationen enthalten. Hier wurde die Kopplungsungleichgewichtskartierung (Hästbacka et al., 1994), die, wenn sie mit DNA von Individuen einer homogenen Population wie der isolierten finnischen Population (da la Chapelle, 1993) angewendet wird, verwendet, um das NPHS1-Gen in einem genomischen 150 kb Segment zu lokalisieren. Um die Gene zu finden, die in dieser Region lokalisiert sind, wurde das gesamte Segment als erstes sequenziert und unter Verwendung einer Kombination aus Exonvorhersageprogrammen und Homologievergleichsanalysen konnten wir bemerkenswert akkurate Genstrukturen konstruieren, die von cDNAs verifiziert wurden. Diese cDNAs konnten entweder unter Verwendung von EST-Klonen oder unter Verwendung der vorhergesagten Exonsequenzen isoliert werden, um cDNAs mittels PCR von mRNA zu konstruieren. Auf diese Weise konnten wir schnell 11 Gene innerhalb des 150 kb NPHS1- enthaltenden genomischen Segments identifizieren. Da keines der Gene ein offensichtlicher Kandidat für NPHS1 war und keine größeren Genrearrangements wie Deletionen, Insertionen oder Inversionen in den Patienten-DNAs gefunden wurden, musste die Suche nach kleinen Mutationen, wenn nötig in allen 11 Genen, initiiert werden. Nachdem die Exon- und cDNA-Sequenzen der Gene bestimmt worden waren, wären Methoden wie SSCP und DGGE, welche häufig zur Identifikation kleiner Mutationen verwendet werden, mögliche Alternativen gewesen. Unsere Erfahrung aus der Suche nach kleinen Mutationen beim Alport Syndrom (Barker et al., 1990; Tryggvason, 1996) legte jedoch nahe, dass diese Verfahren häufig Falschnegative erzielen können. Zum Beispiel haben SSCP-Analysen in einer recht großen Patientenpopulation nur eine Mutationsdetektionsrate von 35–50% offenbart (Kawai et al., 1996, Knebelmann et al., 1996, Renieri et al., 1996), während unsere direkte Sequenzierung der PCR-amplifizierten Exonregionen eine Detektion über 80% erzielte. Wir entschieden deshalb die direkte Sequenzierung der Exonregionen zu verwenden, um die NPHS1-Mutationen zu finden. Obwohl wir zahlreiche Exons von mehreren Genen zu sequenzieren hatten, führte dies relativ bald zu der Identifikation von zwei kleinen Mutationen in einem Gen. Wir folgerten, dass das Sequenzieren von sogar einer großen Kandidatengenregion und die direkte Sequenzierung ihrer Gene ein attraktives und vor allem ein verlässliches Verfahren für die Suche nach kleinen Mutationen beim Positional Cloning ist, insbesondere wenn erwartet werden kann, dass nur ein paar Mutationen vorhanden sind.
Genetik von NPHS1
Die entscheidenden Komponenten beim erfolgreichen Positional Cloning des NPHS1-Gens waren die kleinen isolierten Populationen, die guten klinischen Unterlagen und das gleichberechtigte, qualitativ hochwertige Gesundheitssystem, die es ermöglichten, verlässlich Proben von Familien zu sammeln. Eine typische Situation bei Populationsisolaten ist, dass beinahe 100% der Fälle durch dieselbe Mutation verursacht werden, und dieses Phänomen kann bereits bei der Haplotypanalyse erkannt werden. Beobachtete Veränderungen in dem Gründerhaplotyp, die durch historische Rekombinationen verursacht wurden, können verwendet werden, um die kritische chromosomale Region auf ein kurzes genomisches Segment einzuschränken. Folglich machten Unterschiede in dem major NPHS1-Haplotyp 1-1-1-6-g-2-8-9 eine beträchtliche Einengung des Intervalls möglich, was zur Isolation des NPHS1-Gens führte. Die major NPHS1-Mutation verursacht nur 78% der Fälle im Gegensatz zu vielen anderen „finnischen Erkrankungen" mit einer Prävalenz von 95–98% der major Erkrankungsalle (zum Beispiel Ikonen et al., 1991). Jedoch die zwei Haupt-NPHS1-Mutationen, die in dieser Untersuchung charakterisiert wurden, repräsentieren zusammen 94% der finnischen Fälle.
Das kongenitale nephrotische Syndrom des finnischen Typs ist in der finnischen Population angereichert, weltweit können aber mehrere Fälle gefunden werden. Eine beachtliche Immigration von Finnland nach Minnesota hat ebenso die Verbreitung von NPHS1 nach den USA verursacht (Norio 1966; Mahan et al., 1984). Außerdem sind mehrere CNF-Fälle in verschiedenen europäischen Ländern diagnostiziert worden, und Kopplungsstudien haben eine Beziehung der analysierten Familien zu demselben Lokus auf Chromosom 19 unterstützt (Fuchshuber et al., 1996).
Die Identifikation des NPHS1-Gens und der krankheitsverursachenden Mutationen haben eine unmittelbare klinische Signifikanz, da sie die Entwicklung einer exakten DNA-basierten Diagnose für NPHS1 und ein Screening nach den Trägern ermöglichen. Dies ist besonders wichtig, da wir kürzlich demonstriert haben, dass das in Finnland breit angewendete Screeningverfahren für NPHS1, basierend auf der Messung der Alpha-Fetoproteinlevel im Fruchtwasser, zu falschpositiven Ergebnissen und folglich zu Abtreibungen von gesunden NPHS1-Trägern führen kann (Männikö et al., 1997).
Nephrin – ein glomerulusspezifischer Zelladhäsionsrezeptor
Auf Grund der starken Assoziation der Expression und der Pathologie mit den Glomeruli, dem proximalen Teil des Nephrons, haben wir das NPHS1-Genprodukt Nephrin genannt. Die Rolle von Nephrin bleibt unbekannt, es ist aber wahrscheinlich, dass es ein Adhäsionsrezeptor und ein Signalprotein ist, da seine Domänenstruktur der Domänenstruktur einer großen Gruppe von Zelladhäsionsrezeptoren ähnelt, die zur Immunglobulinsuperfamilie gehören (Brümmendott und Rathjen, 1994).
Die Ig-ähnlichen Domänen von Nephrin sind alle vom Typ C2, der besonders in Proteinen gefunden wird, die an Zell-Zell- oder Zell-Matrixinteraktionen teilhaben. Zwischen der sechsten und der siebten Ig-ähnlichen Domäne ist ein Platzhalter (Spacer) von etwa 130 Resten, der ein ungepaartes Cystein enthält, und es gibt ein weiteres ungepaartes Cystein in der Fibronektin Typ III-ähnlichen Domäne. Ihre SH-Gruppen könnten in die Bildung von cis-Homo/Heterodimeren involviert sein, an Thioether- oder Thioesterbindungen mit unbekannten Stukturen teilhaben oder sie könten innerhalb der Domänen begraben sein, wie es von Brümmendott und Rathjen vorgeschlagen wurde (1994).
Datenbankdurchsuchungen offenbarten, dass die cytosolische Domäne, die neun Tyrosinreste des Nephrins enthält, keine signifikante Homologie mit anderen bekannten Proteinen hat. Die Sequenzmotive jedoch, die die Thyrosine umgeben, legen nahe, dass die Thyrosine 1176, 1192 und 1217 während der Ligandenbindung des Nephrins phosphoryliert werden könnten (siehe Songyang et al., 1993). In diesem Fall könnten Bindungsstellen für die SH2-Domänen der Kinasen der Scr-Familie, der Abl-Kinase und einem Adaptorprotein Nck geschaffen werden (die Thyrosine 1176 und 1192 sind von dem Motif DEV und das Thyrosin 1217 von dem Motiv DQV gefolgt). Die entscheidende Rolle für die intrazelluläre Domäne von Nephrin wird durch die Tatsache unterstrichen, dass die finnische Minormutation, die zum Verlust von 132 von 155 Resten führt, zu einem völlig zertstörten NPHS1 führt.
Von der Pathogenese des NPHS1 wurde angenommen, dass sie primär oder sekundär die hoch anionischen Glycosaminoglykane mit einbezieht, da berichtet wird, dass der Gehalt von solchen Molekülen, von denen angenommen wird, dass sie für den glomerulären Filtrationsprozess wichtig sind, in der GBM bei der Proteinurie verringert ist (Kasinath und Kanwar, 1993). Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass Nephrin ein Proteoglykan ist, da es mehrere SG-Konsensusstellen für Heparansufatseitenketten hat, einschließlich das Triplet-SGD, welches die Hauptbefestigunssequenz für die drei großen Heparansulfatseitenketten in dem Basalmembranproteoglykan Perlecan ist (Noonan et al., 1991; Kallunki und Tryggvason, 1992; Dolan et al., 1997). So weit jedoch ist von keinen Ig-ähnlichen Rezeptoren berichtet worden, die Glycosaminoglykane enthalten.
Wie funktioniert Nephrin und was ist seine Rolle bei der glomerulären Funktion? Eine breite Mehrheit ähnlicher Rezeptoren interagiert mit anderen Membranproteinen auf eine homo- oder heterophilen Weise. Jedoch von einigen dieser Rezeptoren ist gezeigt worden, dass sie mit Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM für Englisch: extracellular matrix) interagieren. Zum Beispiel das myelinassoziierte Glycoprotein MAG, dessen extrazelluläre Domäne fünf Ig-ähnliche Domänen enthält, interagiert mit verschiedenen Typen von Kollagen und Glycosaminoglykanen (Fahrig et al., 1987). Darüber hinaus ist sowohl von dem axonalen Glycoprotein F11 (Englisch: axonal glycoprotein F11) als auch dem colorectalem Karzinom deletierten (DCC für Englisch: deleted in colorectal cancer) Protein gezeigt worden, dass sie an Tenaskine beziehungsweise Netrine binden (Zisch et al., 1992; Pesheva et al., 1993; Keino-Masu, 1996). Da es möglich ist, dass Nephrin entweder ein anderes Membranprotein oder ein Protein der ECM, welche in diesem Fall die GBM wäre, bindet, wird es wichtig sein, Nephrin mittels Immunelektronenmitkroskopie zu lokalisieren, bevor mit der Suche nach einem spezifischen Liganden begonnen wird.
Was auch immer seine Funktion ist, die in situ Hybridisierungsanalyse deutet stark an, dass Nephrin in den glomerulären Epithelialzellen hergestellt wird, die die Fußfortsätze bilden, die teilweise die Außenseite der glomerulären Kapillaren bedecken. Die ultimative Filtrationsschranke für Plasmamakromoleküle ist in dem Diaphragma lokalisiert, dass die Schlitzporen zwischen den Fußfortsätzen bedeckt. Beim NPHS1 und bei nephrotischen Syndromen mit anderer Ursache ist die Fusion der Fußfortsätze ein genereller Befund, und die Struktur oder Funktion der Schlitzporen ist irgendwie mit einer Proteinurie als Ergebnis betroffen. Es wird vorgeschlagen, dass das Plasmamembranprotein Nephrin wichtig für die Aufrechterhaltung der Integrität von den Fußfortsätzen der glomerulären Epithelialzellen ist oder dass es für deren Verankerung an den Komponenten der GBM entscheidend ist.
Schlussfolgerungen
Die Identifikation des NPHS1-Gens wird eine unmittelbare Anwendungen für die Diagnose der Erkrankung finden. Untersuchen an dem Genprodukt Nephrin, einem mutmaßlichen Zelladhäsions- und Signalingrezeptor, können auch einen Schlüssel für ein neues, fundamentales Verständnis der molekularen Mechanismen der glomerulären Filtration bereitstellen, die trotz jahrzehntelanger Forschung kaum verstanden sind. Da eine abormale Funktion der Filtrationsbarriere eine der Hauptkomplikationen bei vielen klinisch wichtigen Nierenerkrankungen wie der diabetischen Nephropathie, den nephrotischen Syndromen und Glomerulonephritiden ist, hat die vorliegende Arbeit wahrscheinlich eine generellere Auswirkung auf die klinische Nephrologie. Unmittelbare Fragen beziehen sich auf die Expression und Lokation des Proteins während der Entwicklung, was die Erzeugung von Antikörpern und Nukleotidsonden für Untersuchungen in tierischen und Zellkultursystemen verlangen würde.
Genetisches Screenen auf eine Basalmembranerkrankungen
Mit der Identifikation und Charakterisierung von Nephrin als eine entscheidende Komponente bei der Basalmembranerkrankung assoziiert mit einer glomerulären Nephropathie, ist es nun möglich Individuuen sowohl präals auch postnatal auf die Suszeptibilität für eine Basalmembranerkrankung zu screenen, indem das mutierte Nephringen oder -protein detektiert wird. Eine solche Information wird für Ärzte für eine Zukunftsdiagnose bei den Erkrankungsbedingungen der gescreenten Individuen und für die Planung von präventiven Maßnahmen für das zukünftige In-Schach-Halten der Erkrankung nützlich sein. Eine solche Information wird für die Diagnose der derzeitig aktiven Erkrankungsbedingungen nützlich sein. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Diagnose der derzeitig aktiven Erkrankungsbedingungen wie sie sich auf eine Erkrankung der Basalmembran beziehen, indem das mutierte Nephringen oder -protein detektiert wird. Die Entdeckung des Nephringens stellt ein Mittel zur Detektion der Präsenz des Nephringens in Individuen und für die Determination der Präsenz von irgendwelchen Mutationen in dem besagten Gen bereit. Solch ein Mittel zur Detektion umfasst Nukleinsäuren, die die gesamte Nephringensequenz oder Fragmente davon haben, welche spezifisch mit dem besagten Nephringen oder mRNA-Transkripten des besagten Nephringens unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Ein zusätzliches Mittel zur Detektion des Nephringens und von Mutationen darin umfasst spezifische aneinander angrenzende (Englisch: contigous) Fragmente des besagten Gens und die komplementäre Gensequenz, die für die Verwendung als Primer zur Amplifikation der Gensequenz, auf die abgezielt wird, kombiniert werden können. Die besagten Mittel zur Detektion von Mutationen in einem Nephringen können auch die direkte Hybridisierung des normalen Gens mit dem Zielgen und die anschließende Detektion der erfolgreichen Hybridisierung umfassen. In allen Fällen kann das Zielgen amplifizierte oder nicht-amplifizierte DNA oder RNA, die aus dem zu testenden Individuum isoliert wurde, sein.
Antikörperscreening von Geweben und Proben
Dadurch, dass man die Gensequenz hat, liegt es im Bereich des Fachmanns die existierenden molekularbiologischen und biochemischen Techniken zu verwenden, um einen Expressionsvektor zu konstruieren und zu verwenden, der ein rekombinantes Nephrinprotein oder Fusionsprotein produziert, dieses Protein aufzureinigen und Antikörper, die spezifisch mit Nephrin regieren, herzustellen. Die Expression von Proteinen in bakteriellen, Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen ist im Stand der Technik bekannt. Es ist im Stand der Technik bekannt, wie Expressionsvektoren zu konstruieren und zu verwenden sind, in welchen das exprimierte Gen zwei oder mehrere Introns enthält. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern ist im Stand der Technik gut bekannt, und die Verwendung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern zur immunhistochemischen Detektion von Protein in Gewebeproben ist eine Routineanwendung. Es ist eine große Vielfalt an detektierbaren Markierungen zur Verwendung in immunhistochemischen Färbungen und Immunnassays zur Proteindetektion in Proben wie homogenisiertem Gewebe, Blut, Serum, Urin oder anderen Körperflüssigkeiten, erhältlich.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird in der Lage sein diese Lehren gemäß der vorliegenden Erfindung ohne weiteres anzuwenden, um geeignete Nachweise und Detektionsschemata für die Praktizierung der Screeningverfahren zu designen, die von der vorliegenden Erfindung beabsichtigt sind.
Gentherapie
Angesichts der Lehre gemäß der vorliegenden Erfindung wird es möglich sein die Mängel im Nephringen oder -protein mittels Gentherapie oder mittels einer Therapie, die rekombinantes Protein verwendet, zu addressieren. Die Verfahren für die Adminstration der Protein- oder Gentherapie sind im Stand der Technik bekannt.
GenBank Accession Numbers
Die Accession Numbers für die charakterisierten Cosmidklone sind: F19541 = U95090, R33502 = AC002133, R28051 = AD000864, F19399 = AD000833, R31158 = AD000827, R31874 = AD000823. Die Accession für die Nephrin-cDNA-Sequenz ist AF035835.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird in der Lage sein die Lehren der vorliegenden Erfindung ohne weiteres anzuwenden, um geeignete Nukleinsäuresequenzen zu designen und zu konstruieren, die funktionelle Äquivaltente zu den hier offen gelegten sein werden. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird wissen, dass es viele allelische Varianten der offenbarten Nukleinsäuresequenzen geben kann, die dennoch für ein Nephrinprotein mit einer äquivalenten Funktion kodieren werden. Die Lehren der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Entdeckung von Mutationen in dem Nephringen und dem modifizierten Protein, welches darin kodiert wrid.
Beispiel 7
Screenen auf Therapeutika bestehend aus kleinen Molekülen
Mit der Identifikation und Charakterisierung von Nephrin als eine entscheidende Komponente in der Nierenpathologie und Proteinurie und folglich die Verwicklung in viele Nierenerkrankungen, ist es nun möglich auf Therapeutika, die bestehend aus kleinen Molekülen bestehen, zu screenen, wobei Nephrin und das Nephringen verwendet werden. Das Screenen auf solche Therapeutika kann durch sequenzielles selektives Screenen auf die Aktivität von Molekülen, die spezifisch an Nephrin hybridisieren oder welche spezifisch die Expression des Nephringens bewirken, bewerkstelligt werden. Ein selektives Screening kann an Pools aus Verbindungen, die kleine Moleküle sind, welche mittels standartkombinatorischer Chemie erzeugt werden, an bekannten Molekülen oder in Kombination mit einer Computermodelierung der Nephrinproteinstruktur und rationellem Medikamentendesign durchgeführt werden. Solche Verfahren und Techniken sind im Stand der Technik bekannt.
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Anhang Sequenzauflistung

Claims

Isolierte Nukleinsäure, die die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 hat.
Expressionsvektor, der die Nukleinsäure nach Anspruch 1 enthält.
Expressionsvektor nach Anspruch 2, wobei die besagte Nukleinsäure wenigstens ein Intron enthält.
Isoliertes Protein, das von der Nukleinsäure nach Anspruch 1 kodiert wird.
Isoliertes Protein nach Anspruch 4, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 hat.
Verfahren zum Detektieren einer Suszeptibilität für das kongenitale nephrotische Syndrom oder zum Detektieren der Präsenz eines existierenden kongenitalen nephrotischen Syndroms, umfassend die Detektion einer Mutation in dem Nephringen nach Anspruch 1, in einer Probe, die von einem Individuum erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 6, das das Detektieren einer Mutation in dem Nephrinprotein nach Anspruch 4 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, das das Detektieren der Präsenz oder Absenz von dem Nephrinprotein nach Anspruch 4 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das besagte kongenitale nephrotische Syndrom speziell eines der kongenitalen nephrotischen Syndrome des finnischen Typs ist.
Kit zum Screenen von Individuen auf eine Suszeptibilität für das kongenitale nephrotische Syndrom oder auf die Präsenz eines kongenitalen nephrotischen Syndroms, der wenigstens eine Nukleinsäuresonde enthält, die spezifisch die Nukleinsäure nach Anspruch 1 detektiert.
Verwendung eines Proteins nach Anspruch 4 in der Präparation eines Medikaments zu Behandlung von einem Individuum mit kongenitalem nephrotischem Syndrom.
Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts, das eine exprimierbare Nukleinsäure nach Anspruch 1 in der Präparation eines Medikaments zur Behandlung von einem Individuum mit kongenitalem nephrotischem Syndrom umfasst.
Polyklonales Antiserum, das spezifische Antikörper für das Nephrinprotein enthält und das hergestellt wird, indem ein Tier mit einer ausreichenden Menge von dem Protein nach Anspruch 5 immunisiert wird, um eine Immunantwort zu stimulieren.
Nephinspezifischer monoklonaler Antikörper, der hergestellt wird, indem ein Nager mit einer ausreichenden Menge von dem Protein nach Anspruch 5 immunisiert wird, um eine Immunantwort zu stimulieren, indem Milzzellen von dem besagten Nager geerntet werden, indem die besagten Milzzellen mit einem geeigneten Hybridomapartner hybridisiert werden und indem die resultierenden Hybridomazellen auf den spezifischen besagten monoklonalen Antikörper gescreened werden.
Chimerer Antikörper, der die variablen Domänen des Antikörpers nach Anspruch 14 umfasst, die funktionell mit den konstanten Domänen des humanen Antikörpers verbunden sind.
Kit zum Screenen von Individuen auf eine Suszeptibilität für das kongenitale nephrotische Syndrom oder auf die Präsenz eines kongenitalen nephrotischen Syndroms, der wenigstens einen Antikörper enthält, der spezifisch für das Nephrin nach Anspruch 4 ist.
Verfahren zum Identifizieren eines kleines Moleküls, das für die Behandlung von Proteinurie, die mit einer Nierenerkrankung assoziiert ist, therapeutisch wirkt, umfassend das Screenen von Kandidatenmolekülen auf die spezifische Bindung an das Nephrinprotein nach Anspruch 4.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die besagte spezifische Bindung eine Veränderung in der Nephrinbioaktivität bewirkt.
Verwendung der Nukleinsäure nach Anspruch 1 und/oder des Proteins nach Anspruch 4 in der Medizin.
Pharmazeutische Komposition, die die Nukleinsäure nach Anspruch 1 und/oder das Protein nach Anspruch 4 und einen pharmazeutischen Exzipienten umfasst.