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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft im Allgemeinen den von-Willebrand-Faktor (vWF)
des Hundes und genauer ein vWF codierendes Gen sowie einen genetischen
Defekt, der die von-Willebrand-Erkrankung des Hundes verursacht. BIOLOGISCHE
HINTERLEGUNGEN
| SEQUENZ | ZUGANGSNUMMER |
| von-Willebrand-Faktor
des Hundes | |
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Sowohl
bei Hunden als auch bei Menschen ist die von-Willebrand-Erkrankung
(vWD) eine Bluterkrankheit von unterschiedlichem Schweregrad, welche
die Folge eines quantitativen oder qualitativen Defekts im von-Willebrand-Faktor
(vWF) ist (Ginsburg, D. et al., Blood 79: 2507-2519 (1992); Ruggeri,
Z.M., et al., FASEB J 7: 308-316 (1993); Dodds, W.J., Mod Vet Pract
681-686 (1984); Johnson, G.S. et al., JAVMA 176: 1261-1263 (1988),
Brooks, M., Probl In Vet Med 4: 636-646 (1992)). Dieser Gerinnungsfaktor
hat zwei bekannte Funktionen, die Stabilisierung von Faktor VIII
(hämophiler
Faktor A) im Blut und die Hilfe bei der Anheftung von Blutplättchen an
das Subendothel, welche ihnen die effektivere Aufrechterhaltung
der Hämostase
ermöglicht. Wenn
der Faktor fehlt oder defekt ist, kann der Patient, ob Mensch oder
Hund, schwer bluten.
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Die
Erkrankung ist die häufigste
erbliche Bluterkrankheit in beiden Arten und ist genetisch und klinisch heterogen.
Drei klinische Typen, genannt 1, 2, und 3 (früher I, II und III; vgl. Sadler,
J.E. et al., Blood 84: 676-679 (1994) bzgl. der Änderungen in der Nomenklatur),
wurden beschrieben. Typ I-vWD wird dominant, unvollständig penetrant
vererbt. Die Blutung scheint eher auf einen verminderten vWF-Spiegel
als auf einen qualitativen Unterschied zurückzuführen sein. Obwohl dies die
häufigste
Form von vWD in den meisten Säugern ist
und ernsthafte Blutungsstörungen
verursachen kann, ist sie im Allgemeinen weniger schwer als die
beiden anderen Typen. Zusätzlich
kann ein relativ preisgünstiges
Vasopressin-Analogon (DDAVP) helfen, die Symptome zu lindern (Kraus,
K.H. et al., Vet Surg 18: 103-109 (1989)).
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Bei
Typ 2-vWD haben die Patienten im Wesentlichen normale vWF-Spiegel,
der Faktor ist aber, wie durch spezialisierte Testverfahren bestimmt
wurde, abnormal (Ruggeri, Z.M., et al., FASEB J 7: 308-316 (1993);
Brooks, M., Probl In Vet Med 4: 636-646 (1992)). Dieser Typ wird
auch dominant vererbt und wurde nur selten bei Hunden beschrieben
(Turrentine, M.A., et al., Vet Clin North Am Small Anim Pract 18:
275 (1988)).
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Typ
3-vWD ist die schwerste Form der Erkrankung. Sie wird als autosomales
rezessives Merkmal vererbt und betroffene Individuen haben keinen
nachweisbaren vWF in ihrem Blut. Bei schweren Anfällen von
Blutungen werden Transfusionen von Blut oder Kryopräzipitat
benötigt,
um den fehlenden vWF zu liefern. Heterozygote Träger haben moderat verminderte
Faktorkonzentrationen, scheinen im Allgemeinen aber eine normale
Hämostase
zu haben.
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Schottische
Terrier haben Typ 3-vWD (Dodds, W.J., Mod Vet Pract 681-686 (1984);
Johnson, G.S. et al., JAVMA 176: 1261-1263 (1988)). Homozygote haben
keinen nachweisbaren vWF und eine schwere Bluterkrankheit. Heterozygote
haben reduzierte Spiegel des Faktors und sind klinisch normal (Brooks,
M. et al., JAVMA 200: 1123-1127 (1992)). Die Prävalenz von vWD unter Scottischen
Terriern einschließlich
sowohl Heterozygoten als auch Homozygoten wurde verschiedentlich
auf 27-31 % geschätzt
(Stokol, T. et al., Res. Vet. Sci. 59: 152-155 (1995); Brooks, M.,
Proc. 9fh ACVIM Forum 89-91 (1991)).
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Derzeit
wird der Nachweis von betroffenen und Schottischen Terrierhunden
und solchen, die Träger sind,
durch vWF-Antigentests (Benson, R.E. et al., Am J Vet Res 44: 399-403
(1983); Stokol, T. et al., Res. Vet. Sci. 59: 152-155 (1995) oder
durch Koagulationstests durchgeführt
(Rosborough, T.K. et al., J. Lab. Clin. Med. 96: 47-56 (1980); Read,
M.S. et al., J. Lab. Clin. Med. 101: 74-82 (1983)). Diese Verfahren
liefern variable Ergebnisse, da die auf Protein basierenden Tests
durch solche Dinge wie Probennahme, Probenhandhabung, Menstruation,
Schwangerschaft, Impfung, Alter und Schilddrüsenunterfunktion beeinflusst
werden (Strauss, H.S. et al., New Eng J Med 269: 1251-1252 (1963);
Bloom, A.L., Mayo Clin Proc 66: 743-751 (1991); Stirling, Y et al.,
Thromb Haemostasis 52: 176-182 (1984); Mansell, P.D. et al., Br.
Vef. J. 148: 329-337 (1992); Avgeris, S. et al., JAVMA 196: 921-924
(1990); Panciera, D.P. et al., JAVMA 205: 1550-1553 (1994). Daher
kann zum Beispiel ein Hund, dessen Testergebnis an einem Tag innerhalb
des normalen Bereichs liegt, an einem anderen Tag ein Testergebnis
innerhalb des Trägerbereichs
haben. Es ist daher für
Züchter
schwierig diese Information zu verwenden.
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Es
wäre daher
wünschenswert,
eine Nucleinsäuresequenz
bereitzustellen, die den vWF des Hundes codiert. Es wäre ebenfalls
wünschenswert,
den genetischen Defekt bereitzustellen, der für vWD des Hundes verantwortlich
ist. Es wäre
weiterhin wünschenswert,
die Aminosäuresequenz
von vWF des Hundes zu erhalten. Es wäre auch wünschenswert, ein Verfahren
zum Nachweis von Trägern
des defekten vWF-Gens
basierend auf der Nucleinsäuresequenz
des normalen und des defekten vWF-Gens bereitzustellen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine neue gereinigte und isolierte,
den vWF des Hundes codierende Nucleinsäuresequenz bereit. Eine Nucleinsäuresequenz,
enthaltend die Mutation, welche vWD bei Schottischen Terriern verursacht,
eine einzelne Basendeletion in Exon 4, wird ebenfalls bereitgestellt.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen
können
in Verfahren zum Nachweis von Trägern
der Mutation, die vWD verursacht, verwendet werden. Solche Verfahren
können
von Züchtern
verwendet werden, um die Häufigkeit
des krankheitsverursachenden Allels und die Häufigkeit der Erkrankung zu
vermindern. Zusätzlich
kann die hier bereitgestellte Nucleinsäuresequenz von vWF des Hundes
verwendet werden, um den genetischen Defekt zu bestimmen, der vWD
in anderen Züchtungen
sowie in anderen Arten verursacht.
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Zusätzliche
Ziele, Vorteile und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden
durch die nachstehende Beschreibung in Verbindung mit den begeleitenden
Abbildungen deutlich.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ABBILDUNGEN
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Die
verschiedenen Vorteile der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann
durch Lesen der folgenden Beschreibung und durch Bezugnahme auf
die nachstehenden Abbildungen deutlich, in denen:
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Die 1A–1C die
Nucleinsäuresequenz
des erfindungsgemäßen von-Willebrand-Faktor
des Hundes ist;
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Die 2A–2C ein
Vergleich der Präpro-von-Willebrand-Faktor
Aminosäuresequenzen
ist;
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3 Nucleotid-Sequenzierungsleitern
für den
Mutationsbereich der von-Willebrand-Erkrankung
für normale
(freie) Träger-
und betroffene Schottische Terrier bereitstellt, wobei die Sequenzen
direkt aus PCR-Produkten aus genomischen DNAs in Exon 4 erhalten
werden;
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4 die
Ergebnisse eines erfindungsgemäßen Verfahrens
darstellt, welches verwendet wird, um die vWD-Mutation des Schottischen
Terriers nachzuweisen; und
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5 einen
Schottischen Terrier-Stammbaum zeigt, welcher wiederum die Segregation
der mutierten und normalen vWF-Allele deutlich macht.
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GENAUE BESCHREIBUNG DER
BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
den von-Willebrand-Faktor (vWF) des Hundes codierende cDNA wurde
sequenziert und seine Sequenz wird in den 1A–1C und
SEQ ID NO: 1 gezeigt. Die der cDNA des vWF des Hundes entsprechende
Aminosäuresequenz
wurde anschließend
abgeleitet und wird in den 2A–2C und
SEQ ID NO:2 gezeigt. Die Mutation des normalen vWF-Gens, welches
die von-Willebrand-Erkrankung
(vWD) verursacht, eine Deletion bei Codon 85 des normalen Gens,
welche eine Verschiebung des Leserasters zur Folge hat, wird ebenfalls
bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen
können
in Verfahren zum Nachweis von homozygoten und heterozygoten Trägern des
defekten vWF-Gens
verwendet werden.
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In
einem bevorzugten Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins des
von-Willebrand-Allels
in Hunden werden zuerst durch verhältnismäßig nicht-invasive Verfahren
DNA-Proben genommen, d.h. DNA-Proben werden durch minimale Penetration
in Körpergewebe
von den zu testenden Tieren erhalten. Übliche nicht-invasive Gewebeentnahmeverfahren
können
verwendet werden und umfassen die Entnahme von Mundzellen durch
Wangenabstriche und Entnahme von Blutproben. Nach der Isolierung
von DNA mittels Standardverfahren wird mit der DNA unter Verwendung
von zuvor entworfenen Primern, die Restriktionsenzym-Schnittstellen
auf jenen DNA-Proben, die das defekte Gen tragen, eine PCR durchgeführt. Die
Behandlung der amplifizierten DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen
wie BsiEI erlaubt es einem daher, das Vorhandensein des defekten
Allels zu analysieren. Ein Fachmann wird erkennen, dass dieses Verfahren
nicht nur auf Schottische Terrier, sondern auch auf andere Rassen
wie Shetland Schafhunde und Holländische
Kooiker angewendet werden kann.
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Insgesamt
stellt die vorliegende Erfindung Züchtern einen genauen, aussagekräftigen Test
zur Verfügung,
wodurch das unerwünschte
vWD-Gen aus den Zuchtlinien eliminiert werden kann. Die gegenwärtigen, von
den Züchtern
verwendeten Tests basieren auf Protein und, wie zuvor bemerkt, besteht
die primäre
Schwierigkeit mit diesem Typ von Test in der Variabilität der Ergebnisse
durch eine Vielzahl von Faktoren. Das letztendliche Ergebnis einer
solchen Variabilität
ist, dass eine übermäßige Anzahl
von Tieren in eine unsichere Gruppierung fallen, wodurch Träger und
nicht-Träger
nicht zuverlässig
unterschieden werden können.
Die vorliegende Erfindung umgeht die inhärenten Limitationen der Tests
auf Basis von Protein durch Nachweis der genetischen Mutation, die
vWD verursacht. Wie im Spezifischen Beispiel 1 beschrieben wird,
stellen die erfindungsgemäßen Verfahren
einen genauen Test zur Unterscheidung von nicht-Trägern, homozygoten
Trägern und
heterozygoten Trägern
des defekten vWF-Gens bereit.
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Es
wird anerkannt werden, dass die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen
verwendet werden können,
um DNA-Mutationen auch in anderen Züchtungen nachzuweisen, da die
erfindungsgemäße vWF-cDNA
zur vWF-cDNA innerhalb
der Hundearten im Wesentlichen homolog ist. Zusätzlich kann die hier vorgestellte
vWF-Sequenz des Hundes potenziell in Kombination mit der etablierten
menschlichen Sequenz (Genbank Zugangs-Nr. X04385, Bonthron, D. et
al., Nucleic Acids Res. 14: 7125-7128 (1986); Mancuso, D.J. et al.,
Biochemistry 30: 253-269 (1989); Meyer, D. et al., Throm Haemostasis
70: 99-104 (1993)) verwendet werden, um die Sequenzierung des vWF-Gens
und der genetischen Defekte, die vWD verursachen, in anderen Säugerarten,
z. B. unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Arten-übergreifenden
PCR-Verfahren, zu erleichtern.
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Es
liegt ebenso innerhalb der Erwägungen
dieser Erfindung, dass die isolierten und gereinigten erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen
in einen geeigneten rekombinanten Expressionsvektor, z. B. viral oder
Plasmid, eingebaut wird, der in der Lage ist, eine geeignete Wirtszelle,
entweder eukaryontisch (z. B. Säuger)
oder prokaryontisch (z. B. E. coli), zu transformieren. Eine solche
DNA kann wechselnde Nucleinsäureformen,
wie cDNA, gDNA und durch teilweise oder vollständige chemische Synthese hergestellte
DNA beinhalten. Die DNA kann auch von zusätzlichen regulatorischen Elementen
wie Promotoren, Operatoren und Regulatoren, die notwendig sind und/oder
die Expression des vWF-Genprodukts verstärken können, begleitet werden. Auf
diesem Wege können
Zellen zur Überexpression
des vWF-Gens induziert werden, wodurch die gewünschten Mengen des vWF-Zielproteins
hergestellt werden. Es wird weiterhin in Betracht gezogen, dass die
erfindungsgemäße vWF-Polypeptidsequenz
des Hundes genutzt werden kann, um vWF des Hundes unter Verwendung
von synthetischen Standardverfahren herzustellen. Ein Fachmann wird
auch feststellen, dass das durch das erfindungsgemäße defekte
vWF-Gen codierte defekte Protein auch von Nutzen zur Erstellung
eines komplementären
diagnostischen Tests auf vWD des Hundes sein kann, der weitere Daten
bei der Feststellung der Anwesenheit des defekten Allels liefern
kann. Daher wird die Herstellung des defekten vWF-Polypeptids, entweder
durch Expression in transformierten Wirtszellen, wie es vorstehend
für das
aktive vWF-Polypeptid beschrieben wird, oder durch chemische Synthese,
ebenfalls durch die vorliegende Erfindung erwogen.
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Der
Begriff „Gen" im hier verwendeten
Zusammenhang bedeutet eine Nucleinsäure, welche ein Proteinprodukt
codiert. Der Begriff „Nucleinsäure" bezieht sich auf
eine lineare Anordnung von Nucleotiden und Nucleosiden wie genomische
DNA, cDNA und DNA, hergestellt durch teilweise oder vollständige chemische Synthese
aus Nucleotiden. Der Begriff „codierend" bedeutet, dass die
Nucleinsäure
transkribiert und in das gewünschte
Polypeptid translatiert werden kann. „Polypeptid" bezieht sich auf
Aminosäuresequenzen,
welche sowohl Proteine in voller Länge als auch Fragmente davon
umfassen. „Mutation" im hier verwendeten
Zusammenhang umfasst jegliche Änderung
einer Nucleinsäuresequenz
einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf Deletionen, Substitutionen und Additionen.
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Im
hier verwendeten Zusammenhang bedeutet der Begriff „fähig zur
Hybridisierung unter hochstringenten Bedingungen" das Anlagern eines Strangs komplementärer DNA
an die interessierende DNA unter hochstringenten Bedingungen. Ähnlich bezieht
sich „fähig zur
Hybridisierung unter Bedingungen geringer Stringenz" auf das Anlagern
eines Strangs komplementärer
DNA an die interessierende DNA unter Bedingungen geringer Stringenz.
In der vorliegenden Erfindung würde
die Hybridisierung unter Bedingungen mit entweder hoher oder geringer
Stringenz die Hybridisierung einer Nucleinsäuresequenz (z. B. einer zu
SEQ ID NO: 1 oder einem Teil davon komplementären Sequenz) mit einer zweiten
Zielnucleinsäuresequenz
beinhalten. „Bedingungen
hoher Stringenz" für den Anlagerungsprozess
können
zum Beispiel hohe Temperaturen und/oder einen niedrigen Salzgehalt
beinhalten, welche nachteilig für
die Wasserstoff-Bindungskontakte
zwischen fehlgepaarten Basenpaaren sind. „Bedingungen geringer Stringenz" würden eine
niedrigere Temperatur und/oder eine höhere Salzkonzentration beinhalten
als jene der hochstringenten Bedingungen. Solche Bedingungen erlauben
es zwei DNA-Strängen
sich aneinander zu lagern, wenn weitgehende, wenn auch nicht annähernd vollständige Komplementarität zwischen
den beiden Strängen
besteht, wie es zwischen DNA-Strängen,
die dasselbe Protein codieren, sich aber aufgrund der Degeneriertheit
des genetischen Codes unterscheiden, der Fall ist. Bedingungen von
einer geeigneten Stringenz, welche die DNA-Hybridisierung fördern, zum Beispiel
6X SSC bei etwa 45°C,
gefolgt von einem Waschschritt mit 2X SSC bei 50°C sind dem Fachmann bekannt
oder finden sich in Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons,
NY (1989), 6.3.1-6.3.6. Zum Beispiel kann eine Salzkonzentration
im Waschschritt ausgewählt
werden aus einer geringen Stringenz von etwa 2X SSC bei 50°C bis zu
einer hohen Stringenz von etwa 0,2X SSC bei 50°C. Zusätzlich kann die Temperatur
im Waschschritt von einer geringen Stringenz bei Raumtemperatur,
etwa 22°C,
bis zu Bedingungen hoher Stringenz bei etwa 65°C erhöht werden. Andere Stringenzparameter
werden beschrieben in Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
NY, (1982) auf den Seiten 387-389; vgl. auch Sambrook J. et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Band 2,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, NY auf den Seiten
8.46-8.47 (1989).
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SPEZIFISCHES BEISPIEL
1
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Materialien und Methoden
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Isolierung
von RNA. Die Quelle der RNA war ein Uterus eines von vWD betroffenen
Schottischen Terriers (Spiegel des Faktors < 0,1 % und ein klinischer Bluter),
der wegen einer Infektion operativ entfernt wurde. Milzgewebe wurde
von einem von vWD betroffenen Doberman Pinscher erhalten, der durch
eine dilatierte Cardiomyopathie (Spiegel des Faktors 7% und ein
klinischer Bluter) starb. Die Gesamt-RNA wurde aus den Geweben unter
Verwendung von Trizol (Life Technologies, Gaithersburg, MD) extrahiert.
Die Intaktheit der RNA wurde durch Agarosegelelektrophorese untersucht.
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Entwicklung
der PCR-Primer-Sätze.
Die Primer wurden passend zu einigen Bereichen des Gens entworfen,
von denen Sequenzen von zwei Arten verfügbar waren (Lavergne, J.M.
et al., Biochem Biophys Res Commun 194: 1019-1024 (1993); Bakhshi,
M.R. et al., Biochem Biophys Acta 1132: 325-328 (1992)). Diese Primer
wurden unter Verwendung der Regeln zur artübergreifenden Amplifikation
entwickelt (Venta et al., „Genes-Specific
Universal Mammalian Sequence-Tagged Sites: Application To The Canine
Genome" Biochem. Genet.
(1996) im Druck). Die meisten der Primer mussten für andere
Bereiche des Gens unter alleiniger Verwendung der menschlichen Sequenz
entworfen werden (Mancuso, D.J. et al., Biochemistry 30: 253-269 (1991)).
Gute Amplifizierungsbedingungen wurden unter Verwendung der genomischen
DNA von Mensch und Hund bestimmt.
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Reverse
Transkriptase-PCR. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Zufalls-Primern
transkribiert (Bergenhem, N.C.H. et al., PNAS (USA) 89: 8789-8802
(1992)): Die cDNA wurde unter Verwendung der Primer-Sätze amplifiziert,
von denen gezeigt wurde, dass sie mit der genomischen DNA des Hundes
funktionieren.
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DNA-Sequenzanalyse.
Amplifizierungsprodukte der vorhergesagten Größen wurden aus den Agarosegelen
durch Adsorption an Silikagelpartikel unter Verwendung des Verfahrens
des Herstellers (Qiagen, Chatsworth, CA) isoliert. Die Sequenzen
wurden unter Verwendung von 32P-5'-endmarkierten Primern
und einem Zyklus-Sequenzierungs-Kit (United States Biochemical Corp.,
Cleveland, OH) bestimmt. Die Sequenzen der nicht-translatierten
5'- und 3'-Bereiche wurden
nach Amplifizierung unter Verwendung des MarathonTM RACE-Kits
(Clontech, Palo Alto, CA) bestimmt. Die Sequenzen wurden unter Verwendung
des Eugene Software-Analysepakets
(Lark Technologies, Houston, TX) gegeneinander ausgerichtet. Die
Sequenz von Intron 4 des Hundes wurde aus der mittels PCR amplifizierten
genomischen DNA bestimmt.
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Entwicklung
eines diagnostischen Tests. PCR-Mutagenese wurde verwendet, um BsiEI-
und Sau96I-Restriktionsenzym-Schnittstellen für den Test für diagnostische
und Kontrollzwecke zu schaffen. Amplifizierungsbedingungen für den Test
sind: 94°C,
1 min, 61 °C,
1 min und 72°C,
1 min, für
50 Zyklen unter Verwendung der Wangenabstrich-DNA (Richards, B.
et al., Human Molecular Genetics 2: 159-163 (1992)).
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Populationsstudie.
Von 87 Schottischen Terriern aus 16 Nachkommen wurde DNA gesammelt.
Die DNA wurde entweder aus Blut unter Verwendung von Standardverfahren
(Sambrook, J. et al., Cold Harbor Spring Lab, Cold Harbor Spring
NY zweite Ausgabe (1989)) oder durch Wangenabstrichproben (Richards,
B. et al., Human Molecular Genetics 2: 159-163 (1992)) isoliert.
Der genetische Status jedes Tieres in der Studie wurde unter Verwendung
des vorstehend beschriebenen BsiEI-Tests bestimmt.
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Ergebnisse
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Vergleich
der Sequenzen des Menschen und des Hundes. Die Ausrichtung der Präpro-von-Willebrand-Faktor-Aminosäuresequenzen
von Mensch und Hund wird in den 2A–2C dargestellt.
Die Stelle der vWD-Mutation des Schottischen Terriers wird durch "*" angezeigt. Potenzielle N-Glycosylierungsstellen werden
in Fettdruck dargestellt. Die bekannten und postulierten Integrin-Bindestellen
sind eingerahmt. Die Zahl der Aminosäuren wird auf der rechten Seite
der Abbildung angezeigt. Die menschliche Sequenz ist von der Genbank-Zugangsnummer
X04385 (Bonthron, D. et al., Nucleic Acids Res. 14: 7125-7128 (1986))
abgeleitet.
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Insgesamt
wird eine Sequenzidentität
von 85,1 % zwischen den Präpro-vWF-Sequenzen gesehen. Die
Pro-Region ist etwas weniger konserviert als das reife Protein (81,4%
vs. 87,5%). Es wurden keine anderen nennenswerten prozentualen Sequenzidentitätsunterschiede
in anderen Regionen des Gens oder zwischen den bekannten innerhalb
des Gens enthaltenen Wiederholungsbereichen gesehen (Daten nicht
gezeigt). 14 potenzielle N-verknüpfte
Glycosylierungsstellen sind in der Sequenz des Hundes vorhanden,
von denen alle den ähnlichen
Stellen, die innerhalb der menschlichen Sequenz enthalten sind,
entsprechen. Die beiden in der menschlichen vWF-Proteinsequenz identifizierten
Integrin-Bindestellen (Lankhof, H. et al., Blood 86: 1035-1042 (1995))
sind auch in der Sequenz des Hundes konserviert (2A–2C).
Die nicht-translatierten 5'-
und 3'-Regionen
sind in größerem Maße divergiert
als die codierende Region (Daten nicht gezeigt), vergleichbar zu
denen, die zwischen den Sequenzen des Menschen und des Rindes, abgeleitet
für die
5'-flankierende
Region gefunden werden (Janel, N. et al., Gene 167: 291-295 (1995)).
Zusätzliche
Einblicke in die Struktur und Funktion des von-Willebrand-Faktors können durch Vergleich der vollständigen menschlichen
Sequenz (Mancuso, D.J. et al., Biochemistry 30: 253-269 (1989);
Meyer, D. et al., Throm Haemostasis 70: 99-104 (1993)) und der hier
berichteten vollständigen
Sequenz des Hundes erhalten werden.
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Die
Sequenz des größten Teils
von Exon 28 wurde bestimmt (Mancuso, D.J. et al., Thromb Haemost 69:
980 (1993); Porter, C.A. et al., Mol Phylogenet Evol 5: 89-101 (1996)). Alle
drei Sequenzen sind in vollständiger Übereinstimmung,
obwohl zwei stille Varianten in anderen Züchtungen gefunden wurden (Tabelle
1, Exon 28). Teilsequenzen der Exons 40 und 41 (cDNA-Nucleotid-Nummer
6923 bis 7155, ab dem Initiationscodon) wurden auch als Teil der
Entwicklung eines polymorphen einfachen genetischen Tandem-Wiederholungsmarkers
(Shibuya, H. et al., Anim Genet 24: 122 (1994)) bestimmt. Es gibt
einen einzigen Nucleotidsequenz-Unterschied
zwischen dieser Sequenz („T") und der erfindungsgemäßen Sequenz
(„C") bei Nucleotidposition 6928.
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vWD-Mutation
des Schottischen Terriers. 3 zeigt
Nucleotidsequenzierungsleitern für
die Mutationsregion der von-Willebrand-Erkrankung für normale (freie), Träger- und
betroffene Schottische Terrier. Die Sequenzen wurden direkt aus
den PCR-Produkten, abgeleitet von genomischen DNAs in Exon 4, erhalten.
Die Pfeilspitzen zeigen die Lage des C-Nucleotids, welches im die
Krankheit verursachenden Allel deletiert ist. Man beachte, dass
in der Leiter des Trägers
jede Base oberhalb des Mutationspunktes eine Duplett-Erscheinung hat,
wie es für
Deletionsmutationen vorhergesagt wird. Die für diese Tiere berichteten Spiegel
des Faktors waren: Normale 54%, Träger 34%, Betroffene <0,1 %.
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Als
Folge der Deletion führt
eine Mutation mit Verschiebung des Leserasters bei Codon 88 zu einem neuen
Stoppcodon 103 Basen stromabwärts.
Das daraus entstehende stark verkürzte Protein von 119 Aminosäuren schließt keine
Region des reifen von-Willebrand-Faktors ein. Die Identität der Base
im normalen Allel wurde bei einem nicht betroffenen Hund bestimmt.
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Entwicklung
eines diagnostischen Tests. Ein PCR-Primer wurde entworfen, um eine
BsiEI-Stelle im mutierten Allel, nicht jedoch im normalen Allel
zu schaffen (4). Die Stelle des deletierten
Nucleotids wird durch einen Stern angezeigt. Die geänderten
Nucleotide in jedem Primer sind unterstrichen. Das normale und das
mutierte Allel können
auch unter Verwendung von Sau96I unterschieden werden. Die natürlich vorkommenden
Sau96I-Stellen werden doppelt unterstrichen dargestellt. Die hochkonservierten
Donor- und Akzeptor-Dinucleotid-Spleißsequenzen werden in Fettdruck
dargestellt.
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Um
sicherzustellen, dass das Restriktionsenzym die amplifizierte DNA
vollständig
geschnitten hat, wurde eine Restriktionsstelle als interne Kontrolle,
die den beiden Allelen gemeinsam ist, in den nicht-diagnostischen
Primer eingebaut. Der Test wurde durch die Spaltung der DNA aus
Tieren, die betroffene, obligate Träger oder normal waren (basierend
auf hohen Spiegeln des Faktors [größer als 100% des Normalwertes],
erhalten aus üblicherweise
in Anspruch genommenen Testlabors und uns durch die Inhaber berichtet,
und auch unter Verwendung von Züchtungen,
in denen Typ 3-vWD nicht beobachtet wurde), verifiziert. Die erwarteten Ergebnisse
wurden erhalten (z. B. 5). Bei fünf von vWD betroffenen Tieren
aus einer Kolonie, ausgehend von Schottischen Terriern (Brinkhous,
K.M. et al., Ann. New York Acad. Sci. 370: 191-203 (1981)) wurde
auch gezeigt, dass sie für
diese Mutation homozygot sind. Ein zusätzliches, nicht betroffenes
Tier aus derselben Kolonie wurde als frei befunden.
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Es
wäre immer
noch möglich,
die Ergebnisse des Tests falsch zu interpretieren, wenn die Spaltung
mit dem Restriktionsenzym nicht vollständig wäre und wenn die Spaltungsraten
der Kontrollstellen und der diagnostischen Stellen stark unterschiedlich
wären.
Die Spaltungsraten für
die beiden BsiEI-Stellen wurden daher durch teilweise Spaltung der
PCR-Produkte und Lauf durch eine Kapillar-Elektrophorese untersucht. Es wurde festgestellt,
dass die Raten beinahe gleich waren (die diagnostische Stelle wurde
zu 12% schneller geschnitten als die Kontrollstelle).
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Der
Mutageneseprimer wurde auch so entworfen, dass eine Sau96I-Stelle
im normalen Allel, nicht jedoch im mutierten Allel eingeführt wurde.
Dies ist das umgekehrte Verhältnis
im Vergleich zum BsiEI-abhängigen
Test, im Bezug darauf, welches Allel geschnitten wird. Natürliche interne
Sau96I-Stellen dienen als Kontrollstellen für die Spaltung (gezeigt in 4).
Der Test unter Verwendung dieses Enzyms lieferte identische genotypische
Ergebnisse im Vergleich zu BsiEI für alle untersuchten Tiere (Daten
nicht gezeigt).
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Eine
mögliche
Mutatinon im Gen des Doberman Pinschers. Die vollständige Sequenz
des Schottischen Terriers wurde mit der vollständigen Sequenz des Doberman
Pinschers verglichen. Einige Nucleotid-Unterschiede wurden gefunden
und mit den Nucleotiden verglichen, die sich an derselben Stelle
in der menschlichen Sequenz finden, wie in der nachstehenden Tabelle
1 gezeigt wird. Die meisten dieser Veränderungen waren still. Von
drei Aminosäureveränderungen
ist jedoch eine vergleichsweise nicht-konservativ (F905L) und es
wird vorgeschlagen, dass es die Mutation ist, die vWD beim Doberman
Pinscher verursacht. Andere Daten legen stark nahe, dass der Nucleotidaustausch
am Ende von Exon 43 die Aktivierung einer kryptischen Spleiß-Stelle
verursacht, welche die Menge der normal prozessierten mRNA vermindert,
was mit einer damit einhergehenden Verringerung der produzierten
Menge an vWF einhergeht.
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Mendelsche
Vererbung. Ein Test, der häufig
verwendet wird, um die richtige Identifizierung eines mutierten
Allels zu verifizieren, ist seine Vererbung nach dem Mendelschen
Gesetz der Segregation. Drei Stammbäume wurden untersucht, in denen
die normalen und mutierten Allele, wie in
5 gezeigt,
segregierten. Exon vier des vWF-Gens wurde ausgehend von genomischer
DNA mittels PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden auf die Anwesenheit
der normalen und mutierten vWF-Allele durch Agarosegelelektrophorese
nach Spaltung mit BsiEI (vgl.
5) untersucht.
Die betroffenen Tiere sind homozygot für das mutierte Allel (229 Bp,
Spuren 3 und 5). Die anderen Tiere in dieses Stammbaums sind Heterozygote
(251 und 229 Bp, Spuren 1, 2, 4 und 6) einschließlich der obligaten Trägereltern. Tabelle
1 – Unterschiede
zwischen Protein- und Nucleotidsequenzen des von-Willebrand-Faktors
von Scottischem Terrier und Doberman im Vergleich zu den Sequenzen
des Menschen
- 1 Position des
Aminosäurerestes
- 2 Nicht-translatierter Bereich
- 3 Nucleotidposition
- 4 Nicht anwendbar
- 5 Leserastermutation
- Eingerahmte Reste zeigen Aminosäureunterschiede zwischen Züchtungen
- *Für
diese Stelle wurde in einigen Züchtungen
gezeigt, dass sie polymorph ist
- Das reife vWF-Protein beginnt in Exon 18
-
Die
Allele, typisiert sowohl durch den BsiEI- als auch durch den Sau96I-Test,
zeigten keine Unstimmigkeiten mit der Mendelschen Vererbung. Einer
dieser Stammbäume
schloss zwei betroffene Tiere, zwei phänotypisch normale Zwillinge, und
die obligaten Trägereltern
ein. Die beiden Eltern wurden durch den Test als heterozygot, die
beiden betroffenen Tiere als homozygot für das mutierte Allel und die
normalen Zwillinge als Heterozygote identifiziert.
-
Populationsstudie
bezüglich
der Mutation. Wangenabstriche oder Blutproben wurden von 87 Tieren gesammelt,
um das Auftreten der Träger
in der Population der Schottischen Terrier in den Vereinigten Staaten zu
bestimmen. Obwohl wir versuchten, die Stichproben so zufällig wie
möglich
zu nehmen, stellte sich heraus, dass diese Hunde von 16 Stammbäumen abstammten,
von denen einige weiter entfernt miteinander verbunden waren. Dies
geht auf eine Misklassifikation basierend auf der Besitzerschaft
zurück
(im Gegensatz zu einer phänotypischen
Misklassifikation). In diesen 87 Tieren wurden vier Betroffene und
15 Trägertiere
identifiziert.
-
Diskussion
-
Diese
Ergebnisse begründen,
dass die einzelne Basendeletion, die in Exon vier des vWF-Gens gefunden
wird, vWD in der Züchtung
von Schottischen Terriern verursacht. Das Protein, das von dem mutierten
Allel gebildet wird, ist extrem kurz und schließt keinen Teil des reifen vWF-Proteins
ein. Vier Schottische Terrier, von denen bekannt war, dass sie von
der Krankheit betroffen sind, sind homozygot für die Mutation. Fünf andere Hunde
aus gemischten Züchtungen
stammten von Schottischen Terriern ab und sind, betroffen von vWD,
auch homozygot für
die Mutation. Keine normalen Tiere sind homozygot für die Mutation.
Nicht betroffene obligate Träger
sind immer heterozygot für
die Mutation.
-
Die
Genhäufigkeit,
bestimmt durch die Populationsstudie, scheint um die 0,13 zu liegen,
was zu einer Heterozygoten-Häufigkeit
von etwa 23% und einer erwarteten Häufigkeit betroffener Tiere
von etwa 2% führt. Obwohl
der Stichprobenumfang relativ klein und etwas verschoben ist, sind
die Daten in allgemeiner Übereinstimmung
mit den Studien auf Basis des Proteins (Stokol, T. et al., Res Vet
Sci 59: 152-155 (1995); Brooks, M., Probl In Vet Med 4: 636-646
(1992)), dahingehend, dass die Allelhäufigkeit entscheidend ist.
-
Alle
bis dahin gesammelten Daten weisen darauf hin, dass diese Mutation
für im
Wesentlichen alle von-Willebrand-Krankheitsfälle in Schottischen Terriern
verantwortlich ist. Dieses Ergebnis ist in Übereinstimmung mit den Ergebnissen,
welche, definiert auf molekularer Ebene, für andere genetische Krankheiten
in verschiedenen Haustieren gefunden werden (Shuster, D.E. et al.,
PNAS (USA) 89: 9225-9229 (1992); Rudolph, J.A. et al., Nat Genet
2: 144-147 (1992); O'Brien,
P.J. et al., JAVMA 203: 842-851 (1993)). Eine wahrscheinliche Erklärung kann
im ausgeprägten
Gründer-Effekt
gefunden werden, der in Haustieren, verglichen mit den meisten Populationen
von Menschen und wilden Tieren, auftritt.
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Veröffentlichte
Daten unter Verwendung der Faktortests auf Basis des Proteins haben
gezeigt, dass zumindest in einigen Fällen obligate Träger einen
Faktorspiegel haben, der zu einer Diagnose „frei" von dem Krankheitsallel führen würde. Zum
Beispiel hatte in einer Studie ein obligater Träger einen Faktorspiegel von 78%
(Johnson, G.S. et al., JAVMA 176: 1261-1263 (1980)). In einer anderen
Studie hatten zumindest einige der obligaten Träger Faktorspiegel von 65% oder
mehr (Brinkhous, K.M. et al., Ann. New York Acad. Sci. 370: 191-203
(1981)). Zusätzlich
kann die Anzahl der Tiere, die in einen zweifelhaften Bereich fallen,
beträchtlich sein.
In einer Studie fielen 19% der Schottischen Terrier in diesen Bereich
(50-65% des normalen vWF-Antigenspiegels) (Stokol, T. et al., Res
Vet Sci 59: 152-155 (1995)). Daher sollte, obwohl die Tests auf
Basis des Proteins nützlich
waren, die Sicherheit des hier beschriebenen, auf DNA basierenden
Tests die Notwendigkeit der wiederholten Testung und die Variabilität, die mit
den auf Protein basierenden Tests einhergeht, verringern.
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Die
Mutation liegt im Prä-vWF-Anteil
des Moleküls.
Dieser Teil des Moleküls
wird vor der Ausschleusung des reifen Proteins in das Plasma prozessiert.
Dieser Prä-Anteil
des Proteins ist wichtig für
die Zusammenlagerung des reifen vWF-Proteins (Verwiej, L, et al., EMBO J
6: 2885-2890 (1987); Wise, R.J. et al., Cell 52: 229-236 (1988)).
Mit dieser zu einer Verschiebung des Leserasters führenden
vWD-Mutation des
Schottischen Terriers wird weder dieser Prä-Anteil noch irgendein Teil
des reifen Faktors jemals hergestellt, was in Übereinstimmung mit der Tatsache
ist, dass kein Faktor jemals im Blut der betroffenen Hunde nachgewiesen wurde.
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Die
Bestimmung der vollständigen
vWF-cDNA des Hundes wird auch einen Einfluss auf die Entwicklung
von Tests auf Träger
für andere
Rassen und andere Arten haben. Gegenwärtig ist bekannt, dass Shetland Schafhunde
und Holländische
Kooiker eine signifikante Menge an Typ-3-vWD aufweisen (Brooks,
M. et al., JAVMA 200: 1123-1127 (1992); Slappendel, R.J., Vet-Q
17: S21-S22 (1995)). Typ-3-vWD wurde gelegentlich auch in anderen
Rassen beobachtet (z. B. Johnson, G.S. et al., JAVMA 176: 1261-1263
(1980)). Alle Typ-3-vWD-Mutationen, die bislang beim Menschen beschrieben
wurden, wurden innerhalb des vWF-Gens selbst gefunden. Die Verfügbarkeit
der Sequenz des Hundes wird es einfacher machen, die Mutationen
in diesen Rassen zu finden. Zusätzlich
wurden zumindest einige Typ-1-Mutationen
innerhalb des vWF-Gens des Menschen gefunden und daher können Typ-11-Mutationen
auch bei Rassen, die von dieser Form der Krankheit betroffen sind,
innerhalb des vWF-Gens gefunden werden. Die Verfügbarkeit zweier divergierender vWF-cDNA-Sequenzen
des Säugers
wird es auch viel leichter machen, unter Verwendung von artübergreifenden
PCR-Verfahren das Gen von anderen Säugerarten zu sequenzieren (z.
B. Venta et al., Biochem. Genet. (1996) im Druck).
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Der
hier beschriebene Test auf den Nachweis der Mutation in Schottischen
Terriern kann mit geringen Mengen an DNA von einem beliebigen Gewebe
durchgeführt
werden. Die Gewebe, deren Gewinn am wenigsten invasiv ist, sind
Blut- und Mundzellen. Da es am bequemsten ist, wird als Quelle der
DNA ein Wangenabstrich bevorzugt.
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Die
vorstehende Diskussion offenbart und beschreibt nur beispielhaft
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung. Ein Fachmann wird leicht aus einer solchen
Diskussion und von den begleitenden Abbildungen erkennen, dass verschiedene
Veränderungen,
Modifikationen und Variationen vorgenommen werden können.
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