NL8500961A - Cdna-codering voor de humane von willebrand-factor, plasmiden met een dergelijke cdna-codering respektievelijk fragmenten ervan, alsmede micro-organismen, welke dergelijke plasmiden bevatten. - Google Patents

Description

* 3T.0. 32992 cDNA-codering voor de humane von Willebrand-factor, plasmiden met een dergelijke cDNA-codering respektievelijk fragmenten ervan, alsmede micro-organismen, welke dergelijke plasmiden bevatten.

5 Het glycoproteine complex-Factor VIII-von Willebrand factor (FVIII-vWF) speelt een hoofdrol in de haemostasis. Het complex bestaat uit twee componenten, welke op basis van hun biologische en immunologische eigenschappen kunnen worden onderscheiden. Deze componenten zijn de procoagulant-proteine-Factor VIII-C, welke verbonden is met het pro-10 coagulant-antigeen (C:Ag), en het von Willebrand factor proteïne (vWF), dat verbonden is met het Factor VlII-gerelateerde antigeen (vWF:Ag) (Hoyer, L.W. (1981) Blood 58, 1-13). Het FVIII-vWF-complex is in plasma als een reeks multimeren met een relatieve massa van (0,8 - 20) x 10^ Dalton aanwezig. De subunit van vWF is een glycoproteine met een mole-15 cuulgewicht van 225.000 Dalton, dat gesynthesiseerd wordt in vasculaire endotheelcellen (en megakaryocyten) als precursor-proteine van ongeveer 260.000 Dalton. Het precursor-proteine wordt klaarblijkelijk omgevormd tot het gerede vWF-proteine tijdens secretie in het lumen. Vereniging van de.gerede subunit in grote geaggregeerde vormen is een voorwaarde 20 voor de biologische functie ervan, namelijk het hechten van bloedplaat-jes aan het subendotheel na vasculaire beschadigingen. Bovendien wordt vWF beschouwd als het dragerproteine voor de procoagulant-activiteit en moduleert klaarblijkelijk de omzetting ervan.

Het aan de uitvinding ten grondslag liggende onderzoek is in hoofd-25 zaak gericht op het vaststellen van de structuur van het vWF-proteine, d.w.z. het vaststellen van de DNA-codering ervan, alsook het microbieel produceren van het vWF-proteine. Bij dit onderzoek is uitgegaan van een moleculair biologische benadering, waarbij vWF-cDNA-clonen werden bereid.

30 Voor het uitvoeren van de aan de uitvinding ten grondslag liggende onderzoekingen is gebruik gemaakt van de onderstaande materialen en methoden.

DNA-analyse:

Bij de uitvinding werd gebruik gemaakt van plasmide-DNA-isolerin- 35 gen, analyse van door restrictie-enzymen verkregen DNA-fragmenten op agarose of polyacrylamide-gels, "Southern blotting" en radiolabelling van DNA-fragmenten door "nick translation", zoals beschreven door Maniatis, T. c.s., (1982), Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Het bepalen van de DNA-volgorde werd uitge-40 voerd met behulp van de dideoxy-keten-terminatieprocedure volgens w Λ y Π j V v v v £/ ** 9

Sanger, F. c.s., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467.

> 2 r *

Celculturen:

Endotheelcellen werden geïsoleerd uit veneuze bloedvaten van mense-5 lijke navelstrengen volgens de methode van Jaffe c.s. (1973) J. Clin. Invest. 52, 2745-2756, met de in Willems c.s., (1982) Exp. Cell. Res. 139, 191-197 vermelde modificaties. De cellen werden als endotheelcellen geïdentificeerd vanwege hun typische morfologische eigenschappen. De cellen werden gecultiveerd in plastic flessen, welke met humaan fibro-10 nectine waren bekleed. Het cultuurmedium bestond uit gelijke volumina RPMI 1640 en medium 199, aangevuld met 20% v/v humaan serum (groep van 24 gezonde donors), 2mM glutamine, penicilline (100 eenheden/ml), strep-tomycine (100 microgram/ml) en amphotericine B (5 microgram/ml). De cellen, welke voor RNA-isolatie werden gebruikt, werden aan drie of vier 15 passages onderworpen en bereikten vöör het oogsten een samenvloeiing. Na trypsinisatie werden de cellen met 10 mM natriumfosfaat (pH: 7,4), 0,14 M NaCl gewassen en tot de toepassing ervan in vloeibare stikstof ingevroren.

20 Isolering van endotheel polyA* RNA:

Het totale RNA werd bereid uit ongeveer 2 x 10^ gekweekte humane endotheelcellen, welke afkomstig waren van bloedvaten van navelstrengen met behulp van de "hot phenol" procedure volgens Warner c.s. (1966), J. Mol. Biol. 19, 349-361 met de onderstaande modificaties. De lysis van de 25 cellen werd uitgevoerd bij aanwezigheid van 10 mM vanadyl ribonucleosi-decomplex voor het voorkomen van RNA-degradatie. Voorts werd verontreinigend DNA verwijderd door selectieve precipitatie van RNA in 3,3 M LiCl gedurende 30 min. bij 0°C. Het totale RNA-preparaat werd door centrifugeren gedurende 15 min. bij 20.000 g en 4°C gewonnen, waarna het preci-30 pitaat drie maal met 70% v/v ethanol werd gewassen. Het RNA werd in 10 mM tris-HCl (pH: 7,5), 1 mM EDTA, 0,2% natriumdodecylsulfaat en 0,4 M NaCl gesolubiliseerd. Het polyA+ RNA werd na twee cycli van adsorptie aan en elutie uit oligo (dT)-cellulose geïsoleerd. De opbrengst aan polyA+ RNA uit 2 x 10$ endotheelcellen bedroeg ongeveer 300 micro-35 gram.

Grootte-fractionering van het polyA+ rna:

Het polyA+ rna werd naar grootte gefraktioneerd met behulp van preparatieve ureum-agarosegel electroforese volgens de methode van Rosen 40 c.s.,(1975, Biochemistry 14, 69-78) met de onderstaande modificaties.

.<o, t-·» Ά A Λ Λ J

ij 5 U *J 9 ^ 1 3·\.

• 1,5 g laagsmeltend agarose in 40 ml steriel water werd 10 min. in een autoclaaf behandeld en tot 45eC afgekoeld. Hieraan werd 60 ml van een buffer van dezelfde temperatuur toegevoegd onder verkrijging van een eindconcentratie van 25 mM citroenzuur (pH: 3,8), 6 M ureum. De RNA-mon-5 sters werden 1 minuut op 100°C verhit, snel in ijs gekoeld, ingesteld op 25 mM citroenzuur (pH: 3,8), 6 M ureum en gedurende 20' bij 37°C gelncu-beerd. De electroforese werd gedurende 16 uren (40 mA) bij 4°C in 25 mM citroenzuur (pH: 3,8) uitgevoerd. Na de electroforese werd de gel in repen gesneden en werden de RNA-fracties volgens Wieslander, L. (1979) 10 Anal. Biochem. 98, 305-309 geëxtraheerd.

Volgens een andere methode werd het polyA+ RNA naar grootte ge-fraktioneerd door centrifugeren onder toepassing van lineaire denature-rende-sucrosegradiënten. Hierbij werden 5-32% sucrosegradiënten in 0.1 M Tris-HCl (pH: 7,5), 1 mM EDTA, 0,2% natriumdodecylsulfaat en 50% v/v 15 formamide bereid. RNA-monsters in dezelfde buffer werden 2 min. op 55eC verwarmd en in ijs afgekoeld voor het opbrengen op de gradiënten. Het centrifugeren werd in een SW41 rotor gedurende 15 uren bij 15eC en 85,000 x g uitgevoerd.

20 Micro-injectie van RNA in Xenopus laevis oocyten:

De micro-injectie van RNA in Xenopus laevis oocyten werd nagenoeg volgens de methode van Gurdon c.s. (1971, J. Mol. Biol. 233, 177-181) uitgevoerd. Hierbij werd 25 nl geïnjecteerd van of het totale endotheel polyA**· RNA, het naar grootte gefractioneerde endotheel polyA+ RNA, 25 het tabaksmosaic virus (TMV) RNA of het kalf-alfa-cristalline RNA. Alle RNA-preparaten werden voor injectie op 1 mg/ml ingesteld. De micro-geïn-jecteerde oocyten werden 30 uren bij 19°C in een gemodificeerd Barth's medium geïncubeerd. Vervolgens werden groepen van 10 onbeschadigde oocyten in 0,25 ml 10 mM Tris-HCl (pH: 9,0), 50 mM NaCl gehomogeniseerd en 30 gedurende 30 min. in een microfuge gecentrifugeerd. De lipiden werden van de bovenstaande vloeistof door middel van twee achtereenvolgende extracties met een gelijk volume aan diethylether verwijderd. De aanwezigheid van vWF-achtige polypeptiden werd met een immunoradiometrische proef bepaald.

35

De immunoradiometrische proef (IRMA) voor de detectie van vWF-achtige produkten:

Een IgG-preparaat van het murine monoclonale anti-humane vWF CLB-RAg20 werd aan Sepharose CL-4B gekoppeld. 0,25 ml extracten van 10 oocy-40 ten, geïnjecteerd met dezelfde RNA-fractie en bereid op de bovenbeschre- 8500951 i * 4 ven wijze, werden "end-over-end" gedurende 20 uren bij kamertemperatuur met een overmaat aan Sepharose-gebonden antilichamen in een buffer van 0,5 M Tris-HCl (pH: 7,5), 0,15 M NaCl, 3% w/v bovineserum albumine en 0,05% v/v Tween-20 geïncubeerd. Na de incubatie werden de Sepharose 5 beads gedurende 2 min. bij 3000 g gecentrifugeerd en vier maal met 2 ml 50 mM Tris-HCl (pH: 7,5), 0,15 M NaCl, 0,3% bovineserum albumine, 0,05% Tween-20 gewassen. Vervolgens werd 0,4 ml van een mengsel van zes verschillende murine monoclonale anti-humane vWF IgG's (CLB-RAg 20, CLB-RAg 23, CLB-RAg 35, CLB-RAg 38, CLB-RAg 56, CLB-RAg 58), welke radiolabelled 10 zijn met 125]· (2 x 10^ cpm) toegevoegd. De "end-over-end"-incubatie werd 20 uren bij kamertemperatuur in 50 mM Tris-HCl (pH: 7,5), 0,15 M NaCl, 3% bovineserum albumine, 0,1% w/v gelatine, 0,6% w/v humane IgG, 0,05% Tween-20 uitgevoerd. Na deze incubatie werden de Sepharose beads gecentrifugeerd en op de bovenbeschreven wijze gewassen. Vervol-15 gens werd gebonden 12f>I-gelabelled monoclonaal anti-vWF geteld. De methode maakt een kwantitatieve terugwinning van vWF-achtige produkten mogelijk aangezien toediening van een standaardhoeveelheid gezuiverd vWF aan gehomogeniseerde niet-gelnjecteerde oocyten een volledig terugwinnen van vWF-verwant antigeen te zien gaf.

20 cDNA synthese en bacteriële transformatie:

De cDNA-synthese onder toepassing van ongefractioneerd endotheel polyA+ RNA als substraat werd in hoofdzaak uitgevoerd volgens de methode van Gubler c.s., (1983, Gene 25, 263-269). Het cDNA werd naar 25 grootte gefractioneerd onder toepassing van Sepharose CL-4B chromatogra-fie waarbij fracties met minder dan 600 bp (baseparen) werden afgedankt. Normaliter levert 600 ng polyA+ RNA ongeveer 200 ng naar grootte gefractioneerd, dubbelstrengs "C-tailed" cDNA op dat "geannealed" werd met een tweevoudige molaire overmaat "G-tailed" Pstl-gesplitst pUC9 (Viera 30 en Messing, (1982, Gene 19, 259-268). De transformatie van de stam E. coli DH1 ree A werd volgens de hoge efficiëntieprocedure van Hanahan, D. (1983), J. Mol. Biol. 166(4), 557-580 uitgevoerd wat resulteerde in ongeveer 1000 transformanten per ng C-tailed cDNA en een transformatiefre-quentie van 2 x 10^ per microgram van een standaard supercoiled 35 pBR322-preparaat. Dienovereenkomstig werd een pUC9-bibliotheek van 60.000 onafhankelijke kolonies geconstrueerd, waarvan ongeveer 90% plas-miden met cDNA-inserties met een lengte van meer dan 600 baseparen bevatten.

40 8500361 — s

Screening on expression van vWF-achtige produkten in E. coll:

De cDNA-bibliotheek, met plasmide pUC9 as vector, werd uitgeplaat op 18 nitrocellulosefilters (diameter 13 cm; porie-diameter 0,1pm) en gelegd op L-broth agar petri-schalen, waarin 100 microgram/ml ampicilli-5 ne. Elk filter droeg ongeveer 3000 kolonies. Na replica-plating werden de duplicaatfliters gedurende 20 min. aan een met chloroformdamp verzadigde atmosfeer blootgesteld (Helfman c.s., (1983), Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 80, 31-35). Daarna werd elk filter afzonderlijk gedurende 16 uren bij kamertemperatuur in 20 ml 50 mM Tris-HCl (pH: 7,5), 0,15 M 10 NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1% Tween-20, 1 microgram/ml pancrease DNaseï en 40 microgram/ml lysozyme onder zacht roeren gelncubeerd. Vervolgens werden de filters in 50 mM Tris-HCl (pH: 7,5), 0,15 M NaCl (TS), gespoeld, zorgvuldig met tissuepapier gepoetst en opnieuw in TS gespoeld. Vervolgens werden de filters 1 uur bij kamertemperatuur in TS-bevattend 0,5% 15 Tween-20 gelncubeerd, gevolgd door een 10 min. durende spoelbehandeling in TS met 0,1% Tween-20. De incubatie van gefixeerde bacteriële antige-nen met het eerste antilichaampreparaat bedroeg 1 uur bij kamertemperatuur onder toepassing van een 1:500 verdunning in TS, 0,1% Tween-20 van konijn anti-humaan vWF IgG, dat 2 uren bij 4°C gepreabsorbeerd was met 20 een gekookt extract van E. coli DH1 bacteriën. Na de antigeen-anti- lichaam-reactie werden de filters vijf maal in TS, 0,1% Tween-20 gewassen en vervolgens 1 uur bij kamertemperatuur met het tweede antilichaampreparaat gelncubeerd onder toepassing van een 1:1000 verdunning van een paard anti-konijn IgG, geconjugeerd aan mierikswortel-peroxydase. Ten-25 slotte werden de filters vijf maal met TS, 0,1% Tween-20 gewassen en gevolgd door een enkele wastrap in TS, 0,5% Tween-20. Vervolgens werd getest in de "enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)".

Het in situ immuno-kleuren van plasma-protelnen: 30 Een natriumdodecylsulfaat (SDS)-agarose-electroforese voor de ana lyse van grote plasmaproteïne-complexen werd uitgevoerd in 2,5% agarose dat 0,14 M glycine, 30 mM tris (pH: 8,6),en 0,1% w/v SDS bevatte. De bovenlaag van de gel bestond uit 1% agarose in 0,1 M Tris-HCl (pH: 6,8), 0,1% SDS. Plasmamonsters van normale personen en van een patiënt met een 35 ernstige homozygote vorm van von Wiliebrand-ziekte werden 15 min. bij 37eC onder niet reducerende omstandigheden in 0,1 M Tris-HCl (pH: 6,9), 2% SDS en 10% v/v glycerol gelncubeerd. Na electroforese werden de proteïnen 1 uur in 10% v/v azijnzuur, 25% v/v propanol-2 gefixeerd. Daarna werd de gel 1 uur met verscheidene hoeveelheden gedestilleerd water ge-40 spoeld. Vervolgens werd de gel ten minste 1 uur bij kamertemperatuur in 85 0 0-V3 1 ί ; 6 9 50 mM Tris- HC1 (pH: 7,5), 0,15 M NaCl, 3% bovineserum albumine, 0,1% gelatine, 0,6% humane IgG, 0,05% Tween-20, 0,02% w/v natriumazide geln-cubeerd en daarna 16 uren bij kamertemperatuur met 1 microgram/ml van het murine anti-humane vWF IgG CLB-RAg 41 gelncubeerd. Deze incubatie 5 werd door een uitgebreide wasbehandeling van de gel gedurende 1 uur in 0,5 M NaCl en vervolgens gedurende 8 uren in TS gevolgd. Antigeen-anti-lichaam-complexen werden na incubatie gedurende 16 uren bij kamertemperatuur met *25i_gelabelde geit anti-muis IgG gedetecteerd, waarna de gel op de bovenbeschreven wijze aan een uitgebreide wasbehandeling 10 werd onderworpen. Tenslotte werd de gel gedroogd en werd autoradiografie toegepast.

"Immunoblotting" van bacterlële eiwitten:

De analyse met behulp van "immunoblotting" van bacteriële proteïnen 15 werd uitgevoerd na SDS-polyacrylamidegel-electroforese volgens Laemmli, U.K. (1970), Nature 277, 280-285 en de overdracht van proteïnen van de gel naar nitrocellulosemembraanfilters vond in hoofdzaak volgens de door Towbin c.s., (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354) beschreven methode plaats.

20 De bacteriële extracten werden als volgt bereid. 25 ml Cultures van de stam E. coli DH1, welke recombinant-plasmiden bevatten, werden gecultiveerd in L-cultuurvloeistof, die voorzien was van 25 microgram/ml am-picilline tot een dichtheid van 5 x 10^ cellen per ml. De cellen werden door centrifugeren geoogst, in 0,5 ml 10 mM Tris-HCl (pH: 7,5), 1 mM 25 EDTA, 0,1 M NaCl, 0,1 mM PMSF gesuspendeerd en door sonicatie opengebroken. De extracten werden bij 6000 g gedurende 20 min. bij kamertemperatuur gecentrifugeerd en de bovenstaande vloeistoffen werden ingesteld op 0,1 M β-mercaptoethanol, 2% SDS en vervolgens 5 min. gekookt. Het proteïne werd gedurende 15 min. bij kamertemperatuur door toevoegen van 10 30 volumina aceton neergeslagen. Het precipitaat werd door centrifugeren gedurende 10 min. bij 20.000 g geoogst. Tenslotte werd het precipitaat in 0,5 ml 625 mM Tris-HCl (pH: 6,8), 2% SDS, 5% v/v (5-mercaptoethanol, 5% v/v glycerol, 0,001% w/v broomfenolblauw gesolubiliseerd, gedurende 5 min. op 100°C verhit en direkt op de gel gebracht (25 microliter per 35 sleuf). De op nitrocellulosefliters overgebrachte polypeptiden werden met een 1:400 verdunning van een affiniteitsgezuiverd konijn polyclonaal anti-humaan vWF IgG gelncubeerd. De immunocomplexen werden met ^I-gelabelled schaap anti-konijn IgG (2 x 10^ cpm) gedetecteerd. Voor het afzonderlijk testen van een enkel bacterieel extract op 40 de aanwezigheid van een vWF-achtig produkt met verschillende murine mo- 8 5 0 0 υ ts *é / ^ |ί '1 % noclonale antihumane vWF IgG’s (1-microgram/ml) werden "blots" van een preparatleve SDS-polyacrylamidegel (sleufwijdte 13 cm) toegepast. Deze blots werden op een apparaat gebracht, welke de blot, loodrecht op de protelnebanden, in 21 secties verdeelt. Een goed kontakt tussen de vlek 5 en het apparaat (incubator) maakt een afzonderlijke incubatie van 21 verschillende antisera met potentiële antigenen zonder lekken mogelijk.

Hierbij werd ^25]-_ge2ateixe(j geit anti-muis IgG toegepast voor het detecteren van de immunocomplexen. De incubatie, het "blokkeren" van de filters en het wassen werd op dezelfde wijze uitgevoerd als beschreven 10 voor de in de bovenstaande paragraaf beschreven kolonie-selectie met dien verstande, dat voor deze blots 0,2% gelatine aan alle buffers was toegevoegd. Na het wassen werd autoradiografie toegepast.

RNA-analyse: 15 De RNA-preparaten werden aan electroforese op een 0,8% agarosegel in 2,2 M formaldehyde onderworpen (Lehrach c.s., (1977) Biochemistry 16, (21), 4743-4751). Het RNA werd op nitrocellulosevellen overgebracht volgens de methode van Maniatis c.s., (1982) Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory) gehybridiseerd.

20

Materialen;

De bij de uitvinding toegepaste immunoreagentia waren hetzij afkomstig van het Centraal Laboratorium van de Bloedtransfusiedienst van het Nederlandse Rode Kruis of van de firma Dakopatts (Denemarken).

25 Ultrapure laagsmeltend agarose was afkomstig van Bethesda Research

Laboratories Inc. (Ü.S.A.) en het oligo d(T) en oligo d(T)-cellulose waren van Collaborative Research. "Super" reverse transcriptase werd verkregen van de Anglia Biotechnology (U.K.), terwijl de restrictie endo-nucleasen afkomstig waren van de New England Biolabs (U.S.A.) en over-30 eenkomstig de instrukties van de fabrikant werden toegepast.

(alfa-^P) dCTP was afkomstig van het Radiochemical Centre (Amersham, U.K.). De cultuurmedia RPMI 1640 en 199 zijn afkomstig van Gibco (Ü.K.). De monodonale antilichamen werden uit ascites door absorptie aan een proteine A-Sepharosekolom (Pharmacia) (Sweden) gezui-35 verd. Het ^·25ι_χβ^βχχβη van polyclonale IgG werd met behulp van de chlooramine-T-methode uitgevoerd, terwijl de monodonale IgG-preparaten onder toepassen van iodogeen-reactie werden gelabelled.

De uitvinding wordt met meer bijzonderheden in het onderstaande toegelicht.

40 8e a r (\ 0 V O “* - 8

Identificatie van vWF mRNA in endotheelcellen:

Zoals in het bovenstaande is vermeld is het aan de uitvinding ten grondslag liggende onderzoek gericht op het vaststellen van de structuur van humane endotheelprotelnen, welke een rol spelen hij hemostase en 5 thrombose. Hierbij is onderzoek verricht betreffende de chromosomale structuur van de genen en in het bijzonder van de coderende segmenten. Derhalve zijn cDNA-clonen geconstrueerd welke de genetische informatie van vWF cDNA bevatten.

Het substraat voor deze cDNA clonen, namelijk vWF mRNA, werd in en-10 dotheelcellen geïdentificeerd. PolyA+ RNA-preparaten bleken intact vWF mRNA te bevatten vanwege het teweegbrengen van een specifieke translatie van micro-gelnjecteerd RNA in Xenopus laevis oocyten. Deze translatie-produkten, d.w.z. vWF-achtige proteïnen werden met behulp van een immu-noradiometrische bepaling (IRMA) (Veerman c.s., (1983) Thromb. Res. 33, 15 89-93) gedetecteerd. Extracten van oocyten werden met monoclonale anti- lichamen (CLB-RAg 20 anti-vWF IgG) die aan Sepharose beads waren gekoppeld, gelncubeerd en vervolgens met een mengsel van zes verschillende monoclonale antilichamen (anti-vWF IgG's), welke met zijn ge- labelled, aangetoond. De hoeveelheid Sepharose-gebonden 125χ 20 indicatief voor de hoeveelheid vWF-achtige proteïnen, die door micro-ge-Injecteerde oocyten zijn gesynthetiseerd. Een analyse werd uitgevoerd onder toepassing van zowel totaal polyA+ RNA als naar grootte gefrac-tioneerd polyA"1* RNA, dat gewonnen werd uit ureum-agarosegels na elec-troforese. De gegevens worden in fig. 1 vermeld.

25 Een belangrijke hoeveelheid Sepharose-gebonden 125i_gexabe]_ led materiaal werd gedetecteerd onder toepassing van oocyten welke geïnjecteerd waren met totaal polyA+ RNA uit endotheelcellen of met mRNA-fracties met een lengte welke aanzienlijk groter was dan de marker 28S ribosomale subeenheid. Deze resultaten geven aan, dat polyA+ RNA-pre-30 paraten intact vWF mRNA bevatten.

Ofschoon de resolutie van ureum-agarosegel electroforese voor het scheiden van heterogene RNA preparaten aanzienlijk is, wordt deze methode onbetrouwbaar geacht voor een preciese lengtebepaling van RNA (Lehrach c.s., (1977) Biochemistry 16, (21) 4743-4751). Derhalve werd 35 het bovenbeschreven experiment herhaald met polyA+ RNA, dat naar grootte gefractioneerd was door sucrose/formamide-centrifugatie, gevolgd door micro-injectie in oocyten. Hierbij werden in hoofdzaak dezelfde resultaten verkregen als voor naar grootte gefractioneerd polyA+ rna bij ureum-agarosegel-electroforese. PolyA+ RNA met een lengte van 7500-40 10.000 nucleotiden veroorzaakten een toename voor wat betreft het binden 8500961 Ύ**· f 9 Η van 125i_geiabelled monoclonaal anti-vWF IgG aan Sepharose beads.

Uit het bovenstaande kan worden afgeleid, dat vWF mRNA tussen 7500 en 10.000 nucleotiden bevat. Dit komt overeen met het gegeven, dat het precursor proteïne voor de vWF subeenheid een molecuulgewicht van onge-5 veer 260.000 dalton bezit (Wagner c.s., (1983) J. Biol. Chem. 258 (4) 2065-2067). 15% Van het molecuulgewicht van dit glycoprotelne komt voor rekening van carbohydraatresten (Sodetz c.s., J. Biol. Chem. 254, (1979), 10754-10760. Op grond hiervan kan worden gesteld dat het coderende gebied ten minste 6000 nucleotiden omvat.

10

Constructie en isolatie van vWF cDNA-clonen;

De beschikbaarheid van goed gekarakteriseerde polyclonale en mono-clonale anti-vWF antilichamen (Stel c.s., (1984), Blood 63, 1408- 1415) was aanleiding voor het toepassen van een techniek voor het selecteren 15 van bacteriekolonies, welke gebaseerd was op de expressie van antigene determinanten als keuzestrategie (Helfman c.s., (1983), Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 80, 31-35). Er werd een humaan endotheel cDNA-bibliotheek geconstrueerd onder toepassing van E. coli als gastheer en het plasraide pUC9 als vector (Viera, J. en Messing, J. (1982) Gene 19, 259- 268. Het 20 plasmide pUC9 bevatte de lac-promotor, de translationele initiatiesigna-len en 5 N-terminale aminozuren van β-galactosidase, het eerste gen van het lac operon, gevolgd door meerdere unieke cloneringsplaatsen (bijvoorbeeld PstI). Dit plasmide werd met PstI gedigereerd, voorzien van G-residuen en gebruikt als vector voor een cDNA expressie-bibliotheek.

25 De synthese van dubbelstrengs cDNA onder toepassing van totaal en dotheel polyA* RNA werd in hoofdzaak uitgevoerd volgens de methode van Gubler c.s., (1983), Gene 25, 263-269. cDNA met een lengte van meer dan ongeveer 600 baseparen werd door Sepharose CL-4B chromatografie geïsoleerd en via gebruikelijke methoden (Maniatis, T., c.s., (1980), Molecu-30 lar Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory) in de vector ingebracht. De transformatie van E. coli stam DH1 leverde 60.000 kolonies op waarvan ten minste 90% voorzien was van recombinantplasmi-den.

De expressie-bibliotheek werd geselecteerd op bacteriële synthese 35 van vWE-achtige proteïnen. Na lysis van de kolonies werden de bacteriële proteïnen gelncubeerd met een konijn polyclonaal anti-humaan vWF IgG-preparaat en vervolgens met schaap anti-konijn IgG geconjugeerd met mierikswortel peroxidase. Deze "enzym-linked immunosorbent assay" (ELISA) leverde acht kolonies op, welke positief waren op duplicaatfilters. Een 40 voorbeeld hiervan wordt in fig. 2 weergegeven. Het opnieuw uitplaten van 8500251 10 de gezuiverde kolonies, gevolgd door herselecteren leverde eveneens positieve signalen op. Bovendien gaf herselecteren met een affiniteits gezuiverd konijn polyclonaal anti-humaan vWF IgG-preparaat, verkregen uit een ander serum identieke resultaten. In dit verband wordt naar vo-5 ren gebracht, dat twee kolonies een sterke reactie te zien gaven bij de ELISA, twee kolonies een middelmatig signaal gaven terwijl de resterende vier kolonies zwak reageerden bij de ELISA.

Een analyse van het plasmide DNA van deze acht immuno-reactieve clonen gaf aan, dat de lengte van de DNA-inserties liep van 750 tot 1415 10 bp. Clonen, welke zwak reageerden bij het selecteren bleken identiek te zijn op basis van restrictie endonuclease analyse. De cDNA-inserties van deze clonen bevatten allen ongeveer 1415 bp. Daarentegen bevatten de overblijvende clonen plasmide DNA met inserties, welke duidelijk verschillend in lengte waren, namelijk 750, 780, 830 en 1210 bp. Deze plas-15 miden zullen in het onderstaande worden aangeduid als pvWF750, pvWF780 enz..

"Southern blot analysis" werd toegepast voor het aantonen van de nucleotide-volgorde-homologie tussen deze acht plasmidepreparaten. Als "probes" werden PstI cDNA-fragmenten van het plasmide pvWFl210 toege-20 past, dat is opgebouwd uit de vector pUC9 en drie continue Pstl-fragmen-ten van 180, 260 en 770 bp. Voorafgaand DNA-volgordeonderzoek toonde aan, dat de 180 bp- en de 770 bp-fragmenten G-C uiteinden aan ëin zijde bezaten, wat aangeeft, dat het 260 bp-fragment door deze fragmenten is ingesloten. Een voorbeeld van de resultaten van de hybridizatie-experi-25 menten wordt in fig. 3 weergegeven.

Duidelijk is dat alle pvWF DNA-preparaten inserties met overlappende nucleotide-reeksen bevatten.

De vWF-achtige proteïnen, gesynthetiseerd door clonen met een der inserties pvWF750, pvWF780, pvWF830 en pvWF1210 werden verder gekarakte-30 riseerd door "Western blotting" onder toepassing van zowel polyclonale-als monoclonale anti-vWF IgG. Hiermee is het mogelijk een korrelatie te leggen tussen de grootte van de bacteriële vWF-achtige polypeptiden met de codeercapaciteit van de cDNA-inserties. Bovendien levert de vorming van specifieke immuuncomplexen tussen een discreet bacterieel antigeen 35 en (a) monoclonaal anti-humaan vWF:Ag IgG aanvullend bewijs voor de autenticiteit van plasmiden met vWF cDNA.

Voor dat doel werden bacteriële extracten door SDS-polyacrylamide-gels geleid, overgebracht op nitrocellulosepapier en met konijn-polyclo-nale anti-humane vWF IgG's of afzonderlijk met verschillende murine 40 monoclonale anti-humane vWF IgG's geïncubeerd. Vervolgens werden de 3 b ö j i! ^ . ' TT 1 i 4 immuuncomplexen gedetecteerd en wel met respectievelijk 125i_geia_ belled schaap anti-konijn IgG en geit anti-muis IgG. De resultaten hiervan worden in fig. 4 weergegeven en de relevante data worden in Tabel A samengevat. Een vergelijking van de potentiële codeercapaciteit van de 5 cDNA inserties met de werkelijk gecodeerde bacteriële proteïnen levert op, dat de lengte van de inserties van pvWF780, pvWF830 en pvWF1210 de lengte van de codeerregionen overschrijden. Het is echter denkbaar, dat deze clonen die vWF-achtige proteïnen tot expressie brengen ten minste een deel van het 31-onvertaalde gebied van het vWF mRNA bevatten. In 10 deze gevallen bevat het onvertaalde gebied 200 tot 240 bp.

DNA-reeksanalyse van het cDNA-insertie van pvWF1210 toont aan dat het G-C uiteinde, verkregen door terminal transferase, niet gevolgd wordt door een continu A-T-uiteinde, dat afkomstig is van de polyA-tail van vWF mRNA. Echter het gebied, dat aansluit op het G-C-uiteinde, is 15 rijk aan A-T, zodat het waarschijnlijk is, dat de oligo(dT)-primed cDNA synthese in dat gebied wordt geïnitieerd.

Benadrukt wordt, dat bij het "immunoblotting-onderzoek" nagenoeg identieke resultaten worden verkregen voor een polyclonaal anti-humaan vWF IgG en monoclonaal anti-humaan vWF IgG CLB-RAg 41. In dit verband is 20 het belangrijk de eigenschappen van dit monoclonale antilichaam IgG-pre-paraat verder vast te stellen. Verscheidene essentiële kenmerken van een panel van monoclonale anti-humane vWF:Ag antilichamen, waaronder CLB-RAg 41, is door Stel, H.V. c.s., (1984), Blood 63, 1408-1415 beschreven.

Deze omvatten het binden aan gezuiverd FVIII-vWF, aan FVIII-vWF aanwezig 25 in normaal plasma en haemophilie A-plasma, het ontbreken van binding aan plasma van patiënten met de ziekte van von Willebrand en inhibitie van mIndium-gelabelde bloedplaatjes aan het subendotheel. Bovendien zijn er proeven uitgevoerd of monoclonaal CLB-RAg 41 toepasbaar was voor het aantonen van specifieke verschillen tussen normaal plasma en plasma 30 van een patiënt met een ernstig homozygote von Willebrand-ziekte. Het in situ "immunostaining" experiment wordt in fig. 5 weergegeven.

Duidelijk is dat de immuuncomplexen met normaal plasma worden waargenomen. Multimere vormen van FVIII-vWF laten een karakteristiek patroon zien (Hoyer, L.W. (1981), Blood 58, 1-13). Er konden geen interacties 35 van monoclonaal CLB-RAg 41 worden gedetecteerd met plasma van een patiënt met een ernstige von Willebrand-ziekte. Hieruit volgt, dat monoclonaal vWF CLB-RAg 41 specifiek het natuurlijke FVIII-vWF en bacteriële antigenen, welke door de plasmiden pvWF780 en pvWF1210 zijn gecodeerd, bindt. Derhalve bezitten deze polypeptiden van verschillende bron het-40 zelfde epitoop en zijn waarschijnlijk identiek. Uit de resultaten kan

*50ögiH

12 derhalve worden afgeleid, dat een deel van het humane vWF-gen is gedoneerd .

Voorts zijn in het kader van de uitvinding proeven uitgevoerd voor het vinden van andere pvWF-plasmiden voor het samenstellen van een plas-5 mide met een volledig vWF cDNA. Dienovereenkomstig is de humaan endo-theel cDNA-bibliotheek van 60.000 onafhankelijke kolonies met een 770 bp Pstl-fragment van pvWFl210 als "probe" geselecteerd voor het voorkomen van "non-expressie" clonen. Hierbij werden veertig kolonies gedetecteerd, waaronder de eerder gevonden acht immunoreactieve clonen. Aange-10 nomen wordt, dat deze 32 nieuwe clonen vWF cDNA-inserties zullen bevatten, die hetzij niet juist georiënteerd zijn ten aanzien van de lac promotor hetzij niet het korrekte afleesframe van de N-terminale aminozuren van β- galactosidase bezitten. Restrictie endonuclease analyse van plasmide DNA-preparaten van deze "non-expressie" clonen gaf aan, dat een 15 van deze plasmiden een cDNA-insertie met een lengte van ongeveer 2150 bp bezat. "Southern blot analysis" gaf aan, dat de insertie uit vWF cDNA bestond. In het onderstaande wordt aangegeven, dat de lengte van deze insertie overeenkomt met ongeveer 25% van vWF mRNA.

Voor het bepalen van de lengte van het vWF mRNA werden zowel totaal 20 polyA+ RNA als polyA+ RNA-preparaten van endotheelcellen aan elec- troforese op denaturerende agarosegels onderworpen en op nitrocellulose-filters overgebracht. Vervolgens werd hybridisatie uitgevoerd met het "nick-translated" 770 bp PstI cDNA-fragment van plasmide pvWF1210. De resultaten worden weergegeven in fig. 6, uit welke figuur blijkt, dat 25 een mRNA species van ongeveer 9000 nucleotiden aan de vWF cDNA-probe hy-bridiseert. De lengte van dit mRNA is in overeenstemming met het geschatte codeersegment van ongeveer 6000 nucleotiden, wat vereist is voor het coderen van het precursor glycoprotelne van 260.000 dalton.

Een deel van de DNA-volgorde van de cDNA-insertie van het plasmide 30 pvWF1210 is bepaald onder toepassing van de dideoxytrifosfaat keten-ter-minatiemethode volgens Sanger, F. c.s.,(1977) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 74, 5463-5467. Hiertoe werd het 260 bp PstI cDNA-fragment van pvWFl210 gesubcloneerd in Ml3mp9 DNA in beide oriëntaties waarna de DNA-volgorde van beide strengen werd opgehelderd. De gegevens worden in fig. 35 7 weergegeven. Zoals vermeld wordt het 260 bp PstI cDNA-fragment geflan keerd door PstI cDNA-fragmenten van respectievelijk 770 bp en 180 bp.

Uit restrictie-enzym-kartering bleek, dat het 770 bp-fragment stroomopwaarts en het 180 bp-fragment stroomafwaarts van het aangrenzende 260 bp-fragment is gelegen. Op grond hiervan kan tevens worden geconsta-40 teerd, wat de oriëntatie van het 260 bp PstI vWF cDNA-fragment ten op- 8 5 ö 0 9 o 'i j_3 "^Pfs.....; 'f zichte van het 770 bp en het 180 bp fragment is. Een inspectie van mogelijke aflees-frames leverde de volgende kenmerken op. Twee aflees-frames bevatten verscheidene nonsense codons welke hoofdzakelijk aanwezig zijn nabij het 5'-einde van het 260 bp vWF cDNAfragment. Het resterende af-5 lees—frame bevat een stopcodon (TGAj 253— 255), wat aanwezig is nabij het 3’-einde van dit fragment. De gegevens betreffende de grootte van het bacteriële vWF-achtige proteïne, gecodeerd door het plasmide pvWF-1210 (tabel A), geeft aan, dat dit afleesframe korrekt is voor het vWF-protelne. Het tot expressie gebrachte vWFachtige proteine van plasmide 10 pvWF1210 heeft een molecuulgewicht van 37.000 dalton, wat overeenkomt met een codeergebied van ongeveer 1000 nucleotiden. Klaarblijkelijk is het stroomopwaarts gelocaliseerde 770 bp PstI cDNA vWF fragment niet voldoende om dit proteïne te coderen. Nagenoeg de totale codeercapaci-teit van het aangrenzende 260 bp PstI vWF cDNA-fragment dient te worden 15 vertaald om een proteïne met een molecuulgewicht van 37.000 dalton te synthetiseren. Deze interpretatie plaatst het stopcodon van het vWF-gen in de nabijheid van het 3'- einde van het 260 bp PstI vWF cDNA-fragment. Samengevat kan worden gesteld, dat hiermee het cDNA is gecloned, welke het carboxy-terminal-uiteinde van het humane vWF-protelne codeert.

20

De uitvinding wordt in het onderstaande in meer bijzonderheden aan de hand van de constructie en isolering van cDNA-clonen welke een deel van de humane vWF-subeenheid van de factor VIIÏ-von Willebrand-factor-complex coderen, geïllustreerd. De beschikbaarheid van goed gekarakteri-25 seerde polyclonale en monoclonale anti-vWF-antilichamen levert de mogelijkheid op antigene determinanten in E. coli cellen te selecteren. Uit verscheidene bewijsmethoden blijkt, dat deze overlappende cDNA-inserties overeenkomen met codeergebieden voor het vWF-protelne, namelijk: 1) De tot expressie gebrachte proteïnen worden door twee onafhankelij- 30 ke polyclonale anti-vWF-antilichaampreparaten herkend, waarvan éen preparaat affiniteits gezuiverd was op een kolom met covalent gebonden faktor VIII-von Willebrand-factor.

2) Goed gekarakteriseerd monoclonaal anti-vWF IgG (CLB-SAg 41) reageerde met de tot expressie gebrachte vWF-achtige polypeptiden van 35 een aantal irnmunoreactieve clonen, wat aangeeft, dat antigene de terminant (en), aanwezig in deze bacteriële produkten en natuurlijk vWF identiek zijn.

3) De cDNA-bevattende plasmiden hybridiseren specifiek met een endo-theel mRNA met een lengte van ongeveer 9000 nucleotiden. De lengte 40 van dit mRNA is voldoende om dit glycoprotelne met een molecuulge- 9K0 * o 5 1 V. V W V j ~ * v* 14 wicht van 260.000 dalton te coderen.

In het bovenstaande is aangetoond, dat het gebruik van monoclonale antilichamen een snelle en gemakkelijke weg verschaffen om de aanwezig-5 heid van een vreemd gen-segment, opgenomen in bacteriën te bevestigen of te identificeren.

De in deze octrooiaanvrage beschreven procedure geeft een alternatief voor de hybride-geselecteerde translatie of hybride-geremde translatie van mRNA. Voor deze technieken is een grote hoeveelheid mRNA no-10 dig, welke eis bijzonder bezwaarlijk is wanneer een beperkt aantal cellen, zoals humane endotheelcellen, de mRNA-bron vormen. Voorts is de in vitro- translatie van zeer lange hybride-geselecteerde mRNA’s in reticu-locyt- lysaten vaak inefficiënt. Echter wordt in dit verband naar voren gebracht, dat zowel polyclonale als monoclonale antilichaam-preparaten, 15 welke in dergelijke proeven worden toegepast, een voldoende affiniteit dienen te bezitten om 0,1-1 ng antigeen, gesynthetiseerd in een bacte-rie-kolonie aan te tonen. Bovendien kunnen "valse" positieve kolonies worden verwacht wanneer polyclonale antisera tegen onzuivere antigenen worden gebruikt. Dergelijke clonen zijn echter niet bij het onderzoek, 20 wat aan de onderhavige uitvinding ten grondslag ligt, gedetecteerd, wat de betrouwbaarheid van de bij de uitvinding toegepaste methode benadrukt. Voor het bereiken van een optimale specificiteit en gevoeligheid van deze selectie-methode zijn verscheidene parameters beproefd, d.w.z. verdunningen van het antiserum, pre-absorptie met een bacterieel lysaat 25 van de plasmide-vrije stam en combinaties met zowel 125χ_ proteïne A of paard anti-konijn IgG, geconjugeerd met mierikswortel-peroxidase.

De uiteindelijk toegepaste selectie-methode aangaande de synthese van bacteriële vWF-achtige polypeptiden is gevoelig (0,1 ng op nitrocellulo-sefilters) en bezit een geringe achtergrond met E. coli lysaat. Een ver-30 gelijking van het signaal, dat geproduceerd wordt door de twee sterke expressie-clonen, namelijk pvWE780 of pvWF1210, met een standaardserie van puntsgewijs aangebracht natuurlijk vWF liet zien, dat het kolonie-signaal overeenkomt met ongeveer 2 ng vWF-achtig proteïne. Uit deze gegevens kan worden berekend, dat ongeveer 6 x 10^ vWF-achtige moleculen 35 per bacterie zijn gesynthetiseerd. Meer in het bijzonder konden vier clonen slechts in een "colony-assay” en niet door "immunoblotting” worden gedetecteerd. Mogelijkerwijjs is in deze gevallen het vWF-achtige bacteriële produkt instabiel.

Resumerend is bij het in het kader van de uitvinding uitgevoerde 40 onderzoek vastgesteld, dat het vWF mRNA ongeveer 9000 nucleotiden om- Q S f; Λ Λ tf vj q ü U y y u i ''""flllPiv"' f

15 ' '........""J

spant. Het codeergebied voor een glycoprotelne van 260.000 dalton met 15% carbohydraatresiduën bedraagt ongeveer 6000 bp. Op grond hiervan is aangenomen dat vWF mRNA een uitgebreid 3' onvertaald gebied bezit. Met het oog op de vaak te wensen overlatende "first strand synthesis” door 5 reverse transcriptase, geprogrammeerd door oligo (dT)-primed lange mRNA’s en de op antilichamen gebaseerde selectiemethode, welke codogene gebieden selecteert, is het mogelijk dat bij voorkeur clonen worden gedetecteerd met cDNA, geïnitieerd nabij het vWF-stopcodon in plaats van op de polyA- tail. De hierin beschreven pvWF plasmiden bevatten geen A-T 10 uiteinde aangrenzend op de G-C-verbindingssegment. Echter dit gebied is rijk aan A-T wat het waarschijnlijk maakt, dat oligo (dT)-primed synthese ook in dit gebied van vWF mRNA wordt geïnitieerd.

Het "screenen" van de cDNA-bibliotheek met het volledig codogene 770 bp PstI cDNA fragment van pvWFl210 gaf 40 hybridiserende kolonies te 15 zien waaronder de acht immunoreactieve kolonies.

Onder toepassing van een codogene probe stellen de pvWF plasmidebe-vattende clonen slechts 0,07% van de gehele endotheel cDNA-bibliotheek voor, dit ondanks het feit dat cDNA met minder dan 600 bp is afgedankt.

In Thromb. Haemost. (1983) 50(4), 835-837 is geschat, dat het vWF mRNA-20 niveau in totaal endotheel polyA+ RNA ongeveer 1,58% is. Dit resultaat zou aangeven, dat vanwege de selectiemethode vele potentiële pvWF clonen worden gemist en ondersteunt impliciet de stelling, dat vWF mRNA een zeer lang 3’-onvertaald gebied bezit.

Gebaseerd op de gegevens van de restrictie endonuclease analyse van 25 pvWF-plasmiden, de "Southern blotting" van gedigereerde pvWF-plasmiden, gehybridiseerd met PstI cDNA-fragmenten van pvWFl210 en van het karakteriseren van enkele tot expressie gebrachte vWF-achtige proteïnen in bacteriën kan de structuur van pvWF-plasmiden worden afgeleid (zie fig. 8).

Zoals vermeld zijn voor de 770 bp en 180 bp Pst cDNA-fragmenten van het 30 pvWFl210 het 5' resp. 3' einde van het 260 bp Pstl-fragment aanwezig.

Voorts kan uit de gegevens aangaande de grootte van de expressieproduk-ten (tabel A) worden afgeleid, dat het vereiste codeergebied 540 bp (pvW780), 630 bp (pvWF830), 740 bp (pvWF750) en 1010 bp (pvWF1210) is.

Wanneer deze gegevens worden gecombineerd is het translatiestopcodon van 35 het vWF cDNA nabij de samenvoeging van het 260 bp en 180 bp Pstl-fragment van de plasmiden pvWF830 en pvWFl210 aanwezig. Uit DNA-volgordeana-lyse van het 260 bp-fragment wordt dit bevestigd.

Met betrekking tot de bijgaande figuren volgt de onderstaande toe-40 lichting: S Λ Λ 0 6 1 <9 v w * ν', 16 \ *

Fig. 1:

Identificatie van het vWF mRNA.

Endotheel polyA+ RNA (150 microgram) werd aan een electroforese op een preparatieve 1,5% ureum-agarosegel onderworpen. De gel werd in 5 repen verdeeld onder verkrijging van 25 fracties. Het RNA werd op de reeds eerder beschreven wijze geïsoleerd. Totaal polyA+ RNA en RNA-fracties welke een lagere migratie-snelheid hadden dan de 18S ribosomaal RNA marker werden in Xenopus laevis oocyten geïnjecteerd. Als controle oocyten werden oocyten toegepast, welke geïnjecteerd werden met kalf a-10 cristalline RNA (α-crys) of met tabaksmosaic-virus (TMV) RNA. Homogena-ten van geïnjecteerde oocyten werden beproefd voor wat betreft de syn-these van vWF-achtige produkten onder toepassing van "imraunoradiometric assay (IRMA)" zoals eerder is toegelicht. De pijlen in het rechter deel van de figuur geven de plaatsen aan van ribosomaal RNA in een parallele 15 baan.

Fig. 2;

De immunologische detectie van een vWF cDNA-cloon.

Kolonies op duplicaatfilters werden gescreened met konijn-anti-hu-mane vWF IgG, gevolgd door incubatie met paard-anti-konijn IgG geconju-20 geerd met mierikswortel peroxidase waarna reacties in de "enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)" werden getest. Een gedetailleerde beschrijving van deze methode is in het bovenstaande weergegeven. De positieve kolonie op de duplicaatfilters (aangegeven met een pijl) bevatte een plasmide met een 1210 bp cDNA insertie. De kruisjes op de filters marke-25 ren de oriëntatie.

Fig. 3; "Southern blotting" van pUC9-vWF cDNA, geïsoleerd uit immunoreac-tieve kolonies.

Plasmide DNA werd geïsoleerd uit 8 immunoreactieve kolonies volgens 30 standaardmethoden en de lengte van de cDNA-inserties werd door analyse met verschillende restrictie-enzym-omzettingen bepaald. Aangezien geen van de cDNA-inserties BamHI of HindlII-plaatsen bevatten (terwijl deze plaatsen in pUC9 de Pstl-insertieplaatsen flankeren) is met een dubbele omzetting met deze enzymen een direkte meting van de lengte van het 35 cDNA-insertie mogelijk. In deze figuur werden de pvWF-plasmide DNA’s omgezet met PstI, onderworpen aan electroforese op een agarosegel en overgebracht op nitrocellulose. De blot werd gehybridiseerd met 32p_ge_ labelled 770 bp PstI cPNA-fragment van het plasmide pvWF1210. De banen 1 t/m 8 stellen pvWF830, pvWF1415a, pvWFl415b, pvWF1415c, pvWF780, pvWF-40 1415d, pvWF750 en pvWFl210 voor.

9500961 * 17

Fig. 4; "Immunoblotting" van proteine-extracten van vWF cDNA-bevattende bacteriën met polyclonale- en monoclonale anti-vWF-antilichamen.

Proteine-extracten werden na bereiding onderworpen aan electrofore-5 se op een 13% SDS-polyacrylamidegel en overgebracht op nitrocellulose-vellen zoals in het bovenstaande reeds uitvoerig is beschreven.

A. Incubatie van de blot met konijn polyclonaal anti-humaan vWF IgG (affiniteits gezuiverd op een Factor VIII-von Willebrand factor kolom) gevolgd door Incubatie met -*-^5];_gexabexie<j schaap anti- 10 konijn IgG. Extracten werden bereid uit stam E. coli DH1 met pUC9- afgeleide plasmiden. Banen 1 t/m 6: vector pUC9 zonder insertie; pvWF1415a; pvWF830; pvWF750; pvWF780; pvWFl210.

B. Incubatie van de blot met murine monoclonale anti-humane vWF IgG's. Proteine-extracten van de twee sterke expressleclonen, welke 3f 15 pvWF1210 3f pvWF780 bevatten, werden aan electroforese op een pre- paratieve 13% SDS-polyacrylamidegel onderworpen en op nitrocellulose overgebracht. Secties van de blots, loodrecht op de "protelne-banden" werden met een panel van verschillende monoclonale anti-vWF IgG's gelncubeerd en vervolgens met 125i_geiat,ene(j geit-20 anti-muis IgG. De essentiële delen van deze blots worden in deze figuur weergegeven. De banen 1, 2 en 3 bevatten proteine-extracten van E. coli DH1 met pvWF1210 en de banen 4, 5 en 6 bevatten proteine-extracten van E. coli DH1 met pvWF780. Proteïnen In baan 1 en 4 met gelncubeerd monoclonaal anti-vWF CLB-RAg 41 IgG, in baan 2 en 5 25 met monoclonaal anti-vWF CLB-RAg 42 IgG, in baan 3 en 6 met mono clonaal anti-vWF CLB-RAg 35 IgG.

Fig. 5;

Het in situ "immunostaining" van Factor VIII-von Willebrand-fac- tor.

30 Plasma-monsters werden bij 37eC met SDS bij een eindconcentratie van 2% voorbehandeld en aan een electroforese in een 2,5% agarosegel met 0,1% SDS onderworpen. Na fixering werd de gel met murine monoclonaal anti-humaan vWF CLB-RAg 41 IgG gelncubeerd. Immunocomplexen werden met geit-anti-muis IgG gedetecteerd. Baan 1: 10 micro-35 liter plasma van een normaal individu. Baan 2: 10 microliter plasma van een patiënt met een ernstig von Willebrand-ziekte. Incubatie van plasma met uitsluitend geit-anti-muis IgG gaf géén immunostaining.

Fig. 6:

Grootte-bepaling van het vWF mRNA.

40 Preparaten van totaal humaan endotheel RNA, totaal humaan Melanoma Q " ^ Π ^ ti ·ί 0 ~ -J 3 | v 4 18

Bowes RNA en van endotheel polyA+ RNA werden met formamide en formaldehyde behandeld, aan electroforese op een 0,8% agarose-formaldehydegel onderworpen en op nitrocellulose overgebracht.

A. De RNA blot werd met het ^^P-gelabelled 770 bp PstI cDNA-frag- 5 ment van pvWF1210 gehybridlseerd.

Baan 1: 10 microgram totaal humaan endotheel RNA.

Baan 2: 1 microgram humaan endotheel polyA* RNA.

Baan 3: 10 microgram totaal Melanoma Bowes RNA.

B. De RNA blot werd gehybridlseerd met een ^^P-gelabelled 1280 bp 10 cDNA-probe, die afgeleid was van een humaan weefsel-type plasmino- geen-activator (t-PA) cDNA van volledige lengte als controle voor de intaktheid van het endotheel- en Melanoma Bowes RNA-preparaat. Baan 1: 10 microgram totaal humaan endotheel RNA.

Baan 2: 10 microgram totaal Melanoma Bowes RNA.

15 Fig. 7:

Nucleotide-volgorde van het 260 bp PstI cDNA-fragment van pvWF1210. Het 260 bp PstI vWF cDNA-fragment werd in beide oriëntaties in de faag Ml3mp9 RF DNA gesubcloond. De volledige nucleotide-volgorde in beide oriëntaties werden volgens de methode van Sanger, c.s. (1977) (Proc. 20 Natl. Acad. Sci.USA74, 5463-5467) bepaald. In deze figuur is de nucleotide-volgorde van de codogene streng weergegeven en zijn de te voorspellen aminozuren aangegeven. De weergegeven nucleotide-volgorde stelt klaarblijkelijk het C-terminale-codogene gedeelte van het vWF-gen voor met inbegrip van het echte TGA-translatie-stopcodon. De onderstreepte 25 aminozuurvolgorde bevat een potentieel asparagine-gebonden glycosyle-ringsplaats.

Fig. 8:

Schematische voorstelling van de structuur van vWF cDNA-inserties. De bovenste lijn stelt vWF mRNA voor met een lengte van ongeveer 30 9000 nucleotiden. Het TGA-stopcodon wordt aangegeven met een zwarte punt. De lengte van het 3’-onvertaald gebied is niet precies bekend. De lijnen beneden vWF mRNA stellen vWF cDNA-clonen voor. De tot expressie gebrachte vWF-achtige proteïnen van de immunoreactieve clonen met pvWF-1210, pvWF780, pvWF830 en pvWF750 worden door golflijnen beneden het 35 corresponderende coderende gedeelte van vWF cDNA aangegeven.

De pijlen in deze figuur geven de Pstl-restrictie-plaatsen aan.

40 8500031 > 19 t

O

TABEL A

Plasmide cDNA insertie MW van verkre- Lengte codo- Lengte onver-5 lengte gen vWF-achtig gene volg- taalde volgorde proteïne orde PVWF750 750 bp 27.000 Dalton 740 bp 10 bp PVWF780 780 bp 20.000 Dalton 540 bp 240 bp 10 PVWF830 830 bp 23.000 Dalton 630 bp 200 bp PVWF1210 1210 bp 37.000 Dalton 1010 bp 200 bp

Samenvatting van de gegevens aangaande cDNA-lengtebepalingen van de 15 immunoreactieve bacteriën en de MW-bepaling van de tot uitdrukking gebrachte vWF-achtige proteïnen. De lengte van de cDNA's, welke vereist zijn voor het coderen van een proteïne met dat specifieke molecuulge-wicht wordt vergeleken met de lengte van het overeenkomstige cDNA-inser-tie.

20 Een monster van het bovenbeschreven recombinant DNA plasmide pvWF1210 is op maart 1985, onder nummer bij het Centraal- bureau voor Schimmelcultures te Baarn gedeponeerd. Dit plasmide kan middels standaard laboratoriumtechnieken (b.v. D. Hanahan (1983) Journal of Molecular Biology, 166, biz. 557-580) in Escherichia Coli-bacteriMn wor-25 den ingebracht.

3500331

Claims (10)

1. DNA-fragment, dat in een recombinant DNA-plasmide of in een bac-teriophaag kan worden ingebracht, met het kenmerk, dat het DNA-fragment 5 ten minste gedeeltelijk overeenkomt met het gen, dat voor de biologische aktiviteit van de humane von Willebrand-factor codeert.

2. DNA-fragment volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat dit DNA-fragment de in fig. 7 weergegeven nucleotiden-volgorde bezit.

3. Recombinant DNA-plasmide, met het kenmerk, dat het daarin aange-10 brachte DNA-fragment ten minste gedeeltelijk overeenkomt met het gen, dat voor de von Willebrand-factor codeert.

4. Recombinant DNA-plasmide, met het kenmerk, dat het plasmide pUC9 bevat.

5. Recombinant DNA-plasmide volgens conclusie 3 of 4, met het ken-15 merk, dat het ingebrachte DNA-fragment de in fig.7 weergegeven nucleotiden-volgorde bezit.

6. Microorganisme, dierlijke cel of humane cel met een recombinant DNA-plasmide, met het kenmerk, dat het recombinant DNA-plasmide overeenkomt met een der in conclusies 3-5 vermelde piasmiden.

7. Microorganisme met een recombinant DNA-plasmide volgens conclu sie 6, met het kenmerk, dat het microorganisme Escherichia coli is.

8. Microorganisme met een recombinant DNA-plasmide volgens conclusie 6 of 7, met het kenmerk, dat het microorganisme de stam E. coli DH1 is.

9. Werkwijze voor het bereiden van proteïnen door het cultiveren van een microorganisme met een recombinant DNA-plasmide, met het kenmerk, dat men een der in de conclusies 6-8 gedefinieerde microorganismen cultiveert.

10. Proteïne, verkregen overeenkomstig de werkwijze volgens conclu-30 sie 9. *** 5500961