JPH02295487A - キメラモノクローナル抗体の産生のための発現系 - Google Patents
キメラモノクローナル抗体の産生のための発現系Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
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- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、キメラモノクローナル抗体の産生方法を提供
する発現系に関する。発現系はベクターを含み、前記ベ
クターはヒト免疫グロブリンの重鎮および／または重鎮
の全体のゲノムヒト定常領域を含有し、モしてヒト以外
の抗体ガ可変領域の挿入のために適合することができる
。発現ベクターは、全体のヒト定常領域および全体のヒ
ト以外の可変領域を含み、前記可変領域は、通常免疫グ
ロブリンゲノムＤＮＡに関連する組織特異的プロモータ
ーおよび／またはエンハンサー領域を欠く。
する発現系に関する。発現系はベクターを含み、前記ベ
クターはヒト免疫グロブリンの重鎮および／または重鎮
の全体のゲノムヒト定常領域を含有し、モしてヒト以外
の抗体ガ可変領域の挿入のために適合することができる
。発現ベクターは、全体のヒト定常領域および全体のヒ
ト以外の可変領域を含み、前記可変領域は、通常免疫グ
ロブリンゲノムＤＮＡに関連する組織特異的プロモータ
ーおよび／またはエンハンサー領域を欠く。
さらに、この発現系は、突然変異誘発によりｃＤＮＡの
可変領域中に制限酵素認識部位をつくることを必要とし
ない。発現ベクターを含有しそして免疫グロブリンを産
生ずる宿主細胞は、リンパ球または非リンパ球の細胞系
を含むことができる。
可変領域中に制限酵素認識部位をつくることを必要とし
ない。発現ベクターを含有しそして免疫グロブリンを産
生ずる宿主細胞は、リンパ球または非リンパ球の細胞系
を含むことができる。
インターリューキンー２受容体および腫瘍壊死因子に対
するモノクローナル抗体は、この系により産土すること
ができるキメラモノクローナルの例である。
するモノクローナル抗体は、この系により産土すること
ができるキメラモノクローナルの例である。
抗体は、関連して機能的分子を産生する、重鎮およびｕ
５Ｊ４のポリベプチドから成る。重鎮および重鎮の両者
は、可変領域および定常領域と表示する２つの領域を含
有する。重鎮および重鎮の可変領域は特異的抗原に結合
する。重鎮および重鎮の定常領域は抗原に結合に参加し
ないが、重鎮の定常領域は特異的エフェクターの機能に
より生理学的役割を有する。キメラ抗体の産土において
、ヒト抗体の重鎮および重鎮の定常領域は、ヒト以外の
抗体の可変領域を結合して、ヒト以外の抗体の所望の結
合機能を達成すると同時に、ヒト以外の定常領域に対す
る免疫応答の可能性を減少する。
５Ｊ４のポリベプチドから成る。重鎮および重鎮の両者
は、可変領域および定常領域と表示する２つの領域を含
有する。重鎮および重鎮の可変領域は特異的抗原に結合
する。重鎮および重鎮の定常領域は抗原に結合に参加し
ないが、重鎮の定常領域は特異的エフェクターの機能に
より生理学的役割を有する。キメラ抗体の産土において
、ヒト抗体の重鎮および重鎮の定常領域は、ヒト以外の
抗体の可変領域を結合して、ヒト以外の抗体の所望の結
合機能を達成すると同時に、ヒト以外の定常領域に対す
る免疫応答の可能性を減少する。
ヒトエフエクターの機能は、また、保存される。
先行技術の方法はヒト定常領域およびヒト以外の可変領
域を有するキメラ抗体を提供したが、今日まで知られて
いる先行技術の方法は、可変領域の突然変異誘発なしに
可変領域の挿入に適合できるか、あるいは組織特異的プ
ロモーターを欠く発現ベクターをを提供しない。さらに
、このベクターは、通常ゲノムＤＮＡに関連するエンハ
ンサー領域を欠く可変領域の遺伝子のサブクローニング
および発現を可能とする。
域を有するキメラ抗体を提供したが、今日まで知られて
いる先行技術の方法は、可変領域の突然変異誘発なしに
可変領域の挿入に適合できるか、あるいは組織特異的プ
ロモーターを欠く発現ベクターをを提供しない。さらに
、このベクターは、通常ゲノムＤＮＡに関連するエンハ
ンサー領域を欠く可変領域の遺伝子のサブクローニング
および発現を可能とする。
Ｗ０８６／０１５３３（Ｃｅｌｌｔｅｃ Ｌｉｍｉｔ
ｅｄ）は、組み換え技術を使用するキメラ抗体の産生の
方法を記載されている。ここにおいて、用語「キメラ抗
体」は、他のタンパク質の少なくとも一部に取り付けら
れた免疫グロブリン分子（夏ｇ）の少なくとも抗原結合
タンパク質からなるタンパク質を記載するとして定義さ
れている。
ｅｄ）は、組み換え技術を使用するキメラ抗体の産生の
方法を記載されている。ここにおいて、用語「キメラ抗
体」は、他のタンパク質の少なくとも一部に取り付けら
れた免疫グロブリン分子（夏ｇ）の少なくとも抗原結合
タンパク質からなるタンパク質を記載するとして定義さ
れている。
この例において、定常領域および可変領域は、ゲノムＤ
ＮＡに関連する組織特異的プロモーターおよびエンハン
サーを含む。これらの組織特異的領域は、発現ベクター
の使用を宿主細胞としてリンパ球に制限する。
ＮＡに関連する組織特異的プロモーターおよびエンハン
サーを含む。これらの組織特異的領域は、発現ベクター
の使用を宿主細胞としてリンパ球に制限する。
ＥＰＯ Ｏ １２５ ０２３ （Ｇｅｎｅｎｔｅ
ｃｈ）は、バクテリア細胞中で組み換えＤＮＡ技術を使
用して、免疫グロブリンを産土することを記載しており
、モしてキメラ免疫グロブリンの構成を提案している。
ｃｈ）は、バクテリア細胞中で組み換えＤＮＡ技術を使
用して、免疫グロブリンを産土することを記載しており
、モしてキメラ免疫グロブリンの構成を提案している。
ＷＯ８６／０１５３３におけるセルテク（Ｃｅ １ １
ｔ ｅｃｈ）は、ジエネンテク（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ
）が鎖の分泌および所望のキメラ免疫グロブリン中のア
センブリーを生じなかったと信じた。鎖の分泌および所
望のキメラ免疫グロブリン中のアセンブリーについての
説明は、原核細胞が啼乳動物が分泌したタンパク質を正
確に処理することができないことである。
ｔ ｅｃｈ）は、ジエネンテク（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ
）が鎖の分泌および所望のキメラ免疫グロブリン中のア
センブリーを生じなかったと信じた。鎖の分泌および所
望のキメラ免疫グロブリン中のアセンブリーについての
説明は、原核細胞が啼乳動物が分泌したタンパク質を正
確に処理することができないことである。
リウ（Ｌ ｉ ｕ）ら、ブロシーデインダス・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、Ｖｏｌ．８４、ｐ
ｐ３４３９−３４４３ （Ｍａｙ１９８７）は、ＤＮＡ
のトランスフェクションによりリンパ様細胞中に導入さ
れたｃＤＮＡを使用する、キメラマウスーヒト抗体を記
載している。
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、Ｖｏｌ．８４、ｐ
ｐ３４３９−３４４３ （Ｍａｙ１９８７）は、ＤＮＡ
のトランスフェクションによりリンパ様細胞中に導入さ
れたｃＤＮＡを使用する、キメラマウスーヒト抗体を記
載している。
ｃＤＮＡを分離し、そして制限酵素の認識部位はｃＤＮ
Ａ構造中にＶ／Ｃ接合において生体外突然変異誘発によ
りつくられた。この方法は、ヌクレオチド配列が可変領
域の各々について知られていること、および可変領域の
各々を突然変異誘発により変更することを必要とした。
Ａ構造中にＶ／Ｃ接合において生体外突然変異誘発によ
りつくられた。この方法は、ヌクレオチド配列が可変領
域の各々について知られていること、および可変領域の
各々を突然変異誘発により変更することを必要とした。
米国特許第４，０８５，７０７号（Ｗａｌｄｍａｎｎ）
は、インターリューキン−２受容体に接合されているか
、あるいは接合されていないモノクローナル抗体を使用
して、悪性および自己免疫の疾患を処置しそして異型移
植の拒絶を防止する方法を記載している。異種ネズミモ
ノクロ−ナル抗体は、Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスの腹水
から調製され、モしてＤＥＡＥクロマトグラ７イーによ
り精製される。この特許は、静脈内に投与した抗Ｔａｃ
モノクローナル抗体を使用して（処置Ａ）；リシン毒素
Ａ鎖またはシュードモナス毒素に結合した抗Ｔａｃモノ
クローナル抗体を使用して（処置Ｂ）：そしてビスマス
−２１２またはイットリウム−９０放射性核種ｎｉ結合
した抗Ｔａｃモノクローナル抗体を使用して（処１１ｃ
） 、ＨＴＬＶ−Ｉ関連大人白血病（ＡＴＬ）をもつ患
者の処理を詳しく記載している。
は、インターリューキン−２受容体に接合されているか
、あるいは接合されていないモノクローナル抗体を使用
して、悪性および自己免疫の疾患を処置しそして異型移
植の拒絶を防止する方法を記載している。異種ネズミモ
ノクロ−ナル抗体は、Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスの腹水
から調製され、モしてＤＥＡＥクロマトグラ７イーによ
り精製される。この特許は、静脈内に投与した抗Ｔａｃ
モノクローナル抗体を使用して（処置Ａ）；リシン毒素
Ａ鎖またはシュードモナス毒素に結合した抗Ｔａｃモノ
クローナル抗体を使用して（処置Ｂ）：そしてビスマス
−２１２またはイットリウム−９０放射性核種ｎｉ結合
した抗Ｔａｃモノクローナル抗体を使用して（処１１ｃ
） 、ＨＴＬＶ−Ｉ関連大人白血病（ＡＴＬ）をもつ患
者の処理を詳しく記載している。
米国特許第４，５４５．９８５号（Ｐａｔａｎら）は、
化学的治療において使用するための、表皮増殖因子、ト
ランス７エリン受容体モノクローナル抗体およびインタ
ーリューキンー２受容体モノクローナル抗体（抗Ｔａ
ｃ）とシュードノマス外毒素との免疫毒素（ｉｍｍｕｎ
ｏｔｏｘｉｎ）接合体を記載しかつ特許請求している。
化学的治療において使用するための、表皮増殖因子、ト
ランス７エリン受容体モノクローナル抗体およびインタ
ーリューキンー２受容体モノクローナル抗体（抗Ｔａ
ｃ）とシュードノマス外毒素との免疫毒素（ｉｍｍｕｎ
ｏｔｏｘｉｎ）接合体を記載しかつ特許請求している。
インターリュ−キン−２受容体に対するネズミモノクロ
ーナル抗体の調製物は、ウチャマら、ジャーナル・オブ
・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）、ｌ２６：１１
３９３ （１９８１）に記載されているようにして調製
された。
ーナル抗体の調製物は、ウチャマら、ジャーナル・オブ
・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）、ｌ２６：１１
３９３ （１９８１）に記載されているようにして調製
された。
英国特許出願２１８８９４１号（Ｄｉａｍａｎｓｔｅｉ
ｎおよびＯｓａｗａ）（Ｂａｙｅｒ）は、インターリュ
ーキンー２受容体の認識する少なくとも２つのモノクロ
ーナル抗体の組成物を記載しかつ特許請求しており、こ
の組成物は超免疫症候群の病気の剋置のためのインター
リューキンー２依存性リンパ球増殖を抑制することがで
きる。この出願は２つのハイブリドーマＡＨＴ−５ ４
およびＡＨＴ−１０７（それぞれ、ＮＴＣＣ，Ｎｏ．８
６０４ １８０ １および８６０４１８０２で受託され
ている）からのネズミモノクローナル抗体の調製および
特性決定を記載しており、これらはインターリューキン
ー２受容体の異なる部位（エビトープ）を認識する。こ
の出願は、また、モノクローナル抗体のＡＨＴ−５４お
よびＡＨＴ− １ ０７の組み合わせが、インターリュ
ーキンー２依存性リンパ球増殖のより大きい抑制を生ず
ることを開示している。重鎮および重鎮のヒト定常領域
大きいネズミ可変領域を有するインターリューキン２受
容体に対するアンバーが提案されているが、このような
抗体を発生するための実験は実施されなかった。
ｎおよびＯｓａｗａ）（Ｂａｙｅｒ）は、インターリュ
ーキンー２受容体の認識する少なくとも２つのモノクロ
ーナル抗体の組成物を記載しかつ特許請求しており、こ
の組成物は超免疫症候群の病気の剋置のためのインター
リューキンー２依存性リンパ球増殖を抑制することがで
きる。この出願は２つのハイブリドーマＡＨＴ−５ ４
およびＡＨＴ−１０７（それぞれ、ＮＴＣＣ，Ｎｏ．８
６０４ １８０ １および８６０４１８０２で受託され
ている）からのネズミモノクローナル抗体の調製および
特性決定を記載しており、これらはインターリューキン
ー２受容体の異なる部位（エビトープ）を認識する。こ
の出願は、また、モノクローナル抗体のＡＨＴ−５４お
よびＡＨＴ− １ ０７の組み合わせが、インターリュ
ーキンー２依存性リンパ球増殖のより大きい抑制を生ず
ることを開示している。重鎮および重鎮のヒト定常領域
大きいネズミ可変領域を有するインターリューキン２受
容体に対するアンバーが提案されているが、このような
抗体を発生するための実験は実施されなかった。
欧州特許出願第２３５８０５号（Ｊａｎｏｓｓｙ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ Ｈｏｓｐ
ｉｔａｌ ｉｎ Ｌｏｎｄｏｎ）は、腎臓移植を行
った患者への免疫抑制治療のための、Ｔ細胞表面抗原に
対する複数のモノクローナル抗体の組成物を記載しかつ
特許請求している。この発明の主張されている利点は、
細胞の表面抗原上の異なるエビトーブを認識するモノク
ローナル抗体の使用である。Ｔ細胞表面抗原に対するキ
メラモノクローナル抗体は開示されているが、再び、こ
れらの効能を詳しく立証する実験は存在しない。キメラ
モノクローナル抗体の記載は、ヒト定常領域およびネズ
ミ可変領域を有する仮定のモノクローナル抗体に限定さ
れている。
ｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ Ｈｏｓｐ
ｉｔａｌ ｉｎ Ｌｏｎｄｏｎ）は、腎臓移植を行
った患者への免疫抑制治療のための、Ｔ細胞表面抗原に
対する複数のモノクローナル抗体の組成物を記載しかつ
特許請求している。この発明の主張されている利点は、
細胞の表面抗原上の異なるエビトーブを認識するモノク
ローナル抗体の使用である。Ｔ細胞表面抗原に対するキ
メラモノクローナル抗体は開示されているが、再び、こ
れらの効能を詳しく立証する実験は存在しない。キメラ
モノクローナル抗体の記載は、ヒト定常領域およびネズ
ミ可変領域を有する仮定のモノクローナル抗体に限定さ
れている。
欧州特許出願第２１７９９２号（Ｓｔｒｏｍｏｆ Ｂ
ｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｈｏｓｐｉｔａ１）は、な
かでも、異型移植の拒絶を処置するためのＴ−リンパ球
に対するインターリューキン＝２の結合を抑制するため
の、インターリューキン−２受容体に対するモノクロー
ナル抗体を開示しかつ特許請求している。インターリュ
ーキン−２受容体に対して特異的である、ネズミモノク
ローナル抗体Ｍ７／２ ０は、従属栄養体の心臓異型移
植の実施後に、マウスに投与された。
ｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｈｏｓｐｉｔａ１）は、な
かでも、異型移植の拒絶を処置するためのＴ−リンパ球
に対するインターリューキン＝２の結合を抑制するため
の、インターリューキン−２受容体に対するモノクロー
ナル抗体を開示しかつ特許請求している。インターリュ
ーキン−２受容体に対して特異的である、ネズミモノク
ローナル抗体Ｍ７／２ ０は、従属栄養体の心臓異型移
植の実施後に、マウスに投与された。
モノクローナル抗体を使用してインターリューキンー２
受容体を結合してＴ細胞の増殖を抑制する方法は詳細に
記載されたが、これはキメラモノクローナル抗体の場合
ではない。
受容体を結合してＴ細胞の増殖を抑制する方法は詳細に
記載されたが、これはキメラモノクローナル抗体の場合
ではない。
活性化されたＴ−リンパ球は多くの望ましくない免疫応
答において主要な役割を有する。抗インターリューキン
−２受容体の抗体の治療は、他の標準の治療、例えば、
薬物または放射線を越えた利点を有する。なぜなら、イ
ンターリューキン２受容体の抗体は、免疫応答に活動的
に参加するＴ細胞に選択的に結合しかつそれらのＴ細胞
の陳去を促進するが、残りのＴ細胞または他の組織に影
響を及ぼさないからである。上の英国特許出願２１８８
９４１号は、ネズミモノクローナル抗体を使用してして
上の所望の結果を達成した。適当な特異性のヒトモノク
ローナル抗体の産生が困難であるために、ネズミモノク
ローナル抗体は利用された。マウス抗体はヒト免疫系に
より異質タンパク質であると見られるので、マウス抗体
は反作用する抗体を発生し、これらの抗体はそれらの有
効性を破壊し、そしてまたアレルギー性副作用を引き起
こすことがある。キメラモノクローナル抗体の他の重要
な利点は、血清半減期の増加である。
答において主要な役割を有する。抗インターリューキン
−２受容体の抗体の治療は、他の標準の治療、例えば、
薬物または放射線を越えた利点を有する。なぜなら、イ
ンターリューキン２受容体の抗体は、免疫応答に活動的
に参加するＴ細胞に選択的に結合しかつそれらのＴ細胞
の陳去を促進するが、残りのＴ細胞または他の組織に影
響を及ぼさないからである。上の英国特許出願２１８８
９４１号は、ネズミモノクローナル抗体を使用してして
上の所望の結果を達成した。適当な特異性のヒトモノク
ローナル抗体の産生が困難であるために、ネズミモノク
ローナル抗体は利用された。マウス抗体はヒト免疫系に
より異質タンパク質であると見られるので、マウス抗体
は反作用する抗体を発生し、これらの抗体はそれらの有
効性を破壊し、そしてまたアレルギー性副作用を引き起
こすことがある。キメラモノクローナル抗体の他の重要
な利点は、血清半減期の増加である。
ネズミモノクローナルＩ ｇＧ− １モノクローナル抗
体は、２１〜２３日の血清半減期を有する。
体は、２１〜２３日の血清半減期を有する。
抗インターリューキンー２受容体抗体に対する反作用の
免疫応答の可能性を減少するために、インターリューキ
ン−２受容体抗体を、本発明の発現系により開示される
ように、マウス：ヒトキメラをつくることによってヒト
化する。ヒト重鎮および重鎮の定常領域をそれぞれのマ
ウスの定常領域と置換することによって、ヒトにおいて
マウスモノクローナル抗体を使用するとき関連する抗原
の問題は大きく減少されるであろう。
免疫応答の可能性を減少するために、インターリューキ
ン−２受容体抗体を、本発明の発現系により開示される
ように、マウス：ヒトキメラをつくることによってヒト
化する。ヒト重鎮および重鎮の定常領域をそれぞれのマ
ウスの定常領域と置換することによって、ヒトにおいて
マウスモノクローナル抗体を使用するとき関連する抗原
の問題は大きく減少されるであろう。
米国特許第４．６０３，１０６号（（６ｒａｍ１ら）（
Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖ．）は、規定され
た仲介体に対する抗体を開示および特許請求している。
Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖ．）は、規定され
た仲介体に対する抗体を開示および特許請求している。
ｔｒｍ＠瘍壊死因子（ＴＮＦ）はこの特許において使用
されていないが、特性決定された仲介体はＴＮＦである
と信じられる。この特許は、仲介体に対する抗体は、ハ
イプリドーマの使用を含む既知の技術により、例えば、
融合したマウス牌細胞および骨髄腫細胞を利用して産生
ずることができることを指摘している。この特許におい
てキメラモノクローナル抗体は言及されていない。
されていないが、特性決定された仲介体はＴＮＦである
と信じられる。この特許は、仲介体に対する抗体は、ハ
イプリドーマの使用を含む既知の技術により、例えば、
融合したマウス牌細胞および骨髄腫細胞を利用して産生
ずることができることを指摘している。この特許におい
てキメラモノクローナル抗体は言及されていない。
キメラモノクローナル抗体を産土する発現系が提供され
る。この発現系は、ヒト免疫グロプリンの重鎮および／
または重鎮の一定領域からなる発現ベクターを含み、前
記発現ベクターは、突然変異誘発なしで、ヒト以外の抗
体の可変領域の挿入のために適合することができ、こう
して生ずる発現ベクターは、全体のヒト定常領域および
全体のヒト以外の可変領域を含み、前記可変領域は、通
常免疫グロブリンゲノムＤＮＡに関連する組織特異的プ
ロモーターおよび／またはエンハンサー領域を欠く。
る。この発現系は、ヒト免疫グロプリンの重鎮および／
または重鎮の一定領域からなる発現ベクターを含み、前
記発現ベクターは、突然変異誘発なしで、ヒト以外の抗
体の可変領域の挿入のために適合することができ、こう
して生ずる発現ベクターは、全体のヒト定常領域および
全体のヒト以外の可変領域を含み、前記可変領域は、通
常免疫グロブリンゲノムＤＮＡに関連する組織特異的プ
ロモーターおよび／またはエンハンサー領域を欠く。
発現ベクターは、ヒト定常領域の上流にプロモーターを
さらに含み、前記プロモーターは、前記ベクターに対し
ておよび前記可変領域に対して独特である、少なくとも
１つの制限部位を含有するポリリン力一により、前記定
常領域に結合している。このようなポリリンカーの例は
、複数の制限部位を提供する、ｍ１３ＭＰ７ポリリン力
一である。多数のクローニング部位（ｍｃｓ）を含有す
る他のポリリンカーは、同一機能を提供することができ
ると認められる。
さらに含み、前記プロモーターは、前記ベクターに対し
ておよび前記可変領域に対して独特である、少なくとも
１つの制限部位を含有するポリリン力一により、前記定
常領域に結合している。このようなポリリンカーの例は
、複数の制限部位を提供する、ｍ１３ＭＰ７ポリリン力
一である。多数のクローニング部位（ｍｃｓ）を含有す
る他のポリリンカーは、同一機能を提供することができ
ると認められる。
発現系は、可変領域の挿入のために適合でき、挿入すべ
き前記可変領域は合成オリゴヌクレオチドのリンカーを
含み、こうして前記可変領域および前記り冫カーがプロ
モーターおよび一定領域の間に挿入されるとき、生ずる
ベクターはインフレームで融合した全体の定常領域およ
び全体のヒト以外の可変領域を含み、前記可変領域は通
常ゲノムＤＮＡに関連する組織特異的領域を欠く。
き前記可変領域は合成オリゴヌクレオチドのリンカーを
含み、こうして前記可変領域および前記り冫カーがプロ
モーターおよび一定領域の間に挿入されるとき、生ずる
ベクターはインフレームで融合した全体の定常領域およ
び全体のヒト以外の可変領域を含み、前記可変領域は通
常ゲノムＤＮＡに関連する組織特異的領域を欠く。
発現系は、ヒト定常領域中に挿入された制限部位さらに
を含み、前記制限部位は前記ヒト定常領域および前記可
変領域を含む前記ベクターに対して独特である。このよ
うな制限部位の例はＣｌａＩである。他の制限部位は同
一機能を提供することができると認められる。
を含み、前記制限部位は前記ヒト定常領域および前記可
変領域を含む前記ベクターに対して独特である。このよ
うな制限部位の例はＣｌａＩである。他の制限部位は同
一機能を提供することができると認められる。
独特制隈部位を含有するヒト定常領域、およびポリリン
カー、例えば、ｍｃｓを含有するｍ１３ＭＰ７ポリリン
カーにより分離されたプロモーターとアセンブリングさ
れたベクターは、キメラモノクローナル抗体の産生のた
めの一般的ベクターを提供する。前述のカセットを含む
ベクターは、通常ゲノムＤＮＡに関連する組織特異的調
節要素を欠く、クローニングされたヒト以外の可変領域
をプロモーターと定常領域との間に、可変領域中に制限
酵素認識部位を挿入しないで、挿入することを可能とす
る。発現系は、可変領域中に制限酵素認識部位を挿入し
ないで、通常ゲノムＤＮＡに関連する組織特異的プロモ
ーターおよび／またはエンハンサーを欠く可変領域をク
ローニングおよび挿入する方法を提供する。こうして、
この一般的ベクターは、免疫グロブリンの産土のために
リンパ球および非リンパ球の宿主細胞中のトランスフエ
クションに適当であるという利点を有する。
カー、例えば、ｍｃｓを含有するｍ１３ＭＰ７ポリリン
カーにより分離されたプロモーターとアセンブリングさ
れたベクターは、キメラモノクローナル抗体の産生のた
めの一般的ベクターを提供する。前述のカセットを含む
ベクターは、通常ゲノムＤＮＡに関連する組織特異的調
節要素を欠く、クローニングされたヒト以外の可変領域
をプロモーターと定常領域との間に、可変領域中に制限
酵素認識部位を挿入しないで、挿入することを可能とす
る。発現系は、可変領域中に制限酵素認識部位を挿入し
ないで、通常ゲノムＤＮＡに関連する組織特異的プロモ
ーターおよび／またはエンハンサーを欠く可変領域をク
ローニングおよび挿入する方法を提供する。こうして、
この一般的ベクターは、免疫グロブリンの産土のために
リンパ球および非リンパ球の宿主細胞中のトランスフエ
クションに適当であるという利点を有する。
この系は、クローニングのための普通の組み換え技術を
使用するクローニングされた可変領域の挿入を可能とす
る。それは、また、ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用し
て分離されたヌクレオチド配列の挿入のだめの発現ベク
ターを提供する。
使用するクローニングされた可変領域の挿入を可能とす
る。それは、また、ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用し
て分離されたヌクレオチド配列の挿入のだめの発現ベク
ターを提供する。
本発明の目的は、可変領域の突然変異誘発なしに、ヒト
以外の可変領域の挿入を可能とする、般的発現系を提供
することである。
以外の可変領域の挿入を可能とする、般的発現系を提供
することである。
本発明の他の目的は、ＤＮＡのトランスフエクンヨンに
よりリンパ球および非リンパ球の細胞中に導入すること
ができる発現ベクターを提供することである。
よりリンパ球および非リンパ球の細胞中に導入すること
ができる発現ベクターを提供することである。
英国特許出願２１８８９４１号に記載されているような
ＡＨＴ５４およびＡＨＴ Ｉ Ｏ ７と表示する不ズミ
ハイブリドーマを使用して、ヒト以外の可変領域を得た
。
ＡＨＴ５４およびＡＨＴ Ｉ Ｏ ７と表示する不ズミ
ハイブリドーマを使用して、ヒト以外の可変領域を得た
。
本発明において使用するための異種プロモーターの非制
限的実施例は、次のものを包含する：（１）マウスおよ
びヒトの金属チオ不イン、（２）ラウス肉腫、モロニー
（Ｍｏｌｏｎｅｙ）白血病、七ロ二一肉腫および他のレ
トロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、 （３）ＳＶ４０およびポリ才マウイルスの早期および後
期のプロモーター （４）ヒトサイトメガロウイルスの直ぐ早期の７口モー
ター （５）アデノウイルスの主要な後期のプロモーター （６）上のプロモーター（１）〜（５）からのエンハン
サー要素およびコアプロモーター要素の組み合わせ、 （７）免疫グロブリン、遺伝子エンハンサーおよび制御
要素と前述のプロモーターのプロモーター要素との組み
合わせ。
限的実施例は、次のものを包含する：（１）マウスおよ
びヒトの金属チオ不イン、（２）ラウス肉腫、モロニー
（Ｍｏｌｏｎｅｙ）白血病、七ロ二一肉腫および他のレ
トロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、 （３）ＳＶ４０およびポリ才マウイルスの早期および後
期のプロモーター （４）ヒトサイトメガロウイルスの直ぐ早期の７口モー
ター （５）アデノウイルスの主要な後期のプロモーター （６）上のプロモーター（１）〜（５）からのエンハン
サー要素およびコアプロモーター要素の組み合わせ、 （７）免疫グロブリン、遺伝子エンハンサーおよび制御
要素と前述のプロモーターのプロモーター要素との組み
合わせ。
本発明において使用するための細胞系の非制限的例は、
ヒト、誓歯類、サルおよび他の啼乳動物種から誘導され
た次の永久の細胞系を包含する：ヒト：ＨｅＬａ，２９
３骨髄腫、 蔭歯類：マウス：ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｃｌ２７、ＭＯＰ
，骨髄腫、 ハムスター： ＣＨＯ，ＢＨＫ１ ラット：骨釦［ラット２、 サル： ＣＶ− １、ＣＯＳ，ＶＥＲＯ。
ヒト、誓歯類、サルおよび他の啼乳動物種から誘導され
た次の永久の細胞系を包含する：ヒト：ＨｅＬａ，２９
３骨髄腫、 蔭歯類：マウス：ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｃｌ２７、ＭＯＰ
，骨髄腫、 ハムスター： ＣＨＯ，ＢＨＫ１ ラット：骨釦［ラット２、 サル： ＣＶ− １、ＣＯＳ，ＶＥＲＯ。
ｍＲＮＡの分離
１０’の細胞を含有する懸濁液を、１５００ｒｐｍにお
いて１５分間遠心することによって沈澱させた。１０′
のＡＨＴ Ｉ Ｏ ７を含有する細胞の沈澱に、３０ｍ
ＱのＬＳＴ緩衝液（すべての緩衝液のリストは下に記載
する）および２ｍＱのバナディ・リボヌクレオシド・コ
ンプレックス（Ｖａｎａｄｙ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅ
ｏｓｉｄｅ Ｃｏｐｌｅｘ） （Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，マリイランド州カイサースバーグ）を添加し、そし
て細胞を穏やかに再懸濁し、細胞を氷上に保持した。再
懸濁した細胞を５０ｍ＋２の管に移した。１２ｍｌ２の
４×ＴＮＬＢ緩衝液を添加し、種やかにｌＯ回転倒させ
た。再懸濁液を２５０Ｏｒｐｍにおいて５分間遠心した
。上澄み液を２５０ｍｆｆのふたをもつ遠心びんに移し
た。４ｍＱのｌＯ％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）を上澄み液に添加し、モして体墳をＡＣＥ緩衝液で８
０ｍｆ２にする。８０ｍ＋２のＡＣＥ／フェノールを添
加し、そして室温において５分間激しく震盪した。５０
００ｒｐｍで１０分間遠心した。水性相を除去し、そし
て新鮮な２５０ｒｒｌのびんに移した。ＲＮＡを２体積
の−２０°Ｃの無水エタノールで沈澱させ、そしてｌ／
１０体積の水性１モルのＮａＣ ｌを添加した。ＲＮＡ
を一夜−２０゜Ｃにおいて沈澱させた。ＲＮＡを７００
Ｑｒｐｍで４℃において４０分間遠心により沈降させた
。沈澱を７０％のエタノールで洗浄し、そして４°Ｃに
おいて１５分間７０００ｒｐｍで遠心した。沈澱を乾燥
した（凍結乾燥）。合計のＲＮＡをｄＨ．ｏ中に含有す
る沈澱を再懸濁させた。
いて１５分間遠心することによって沈澱させた。１０′
のＡＨＴ Ｉ Ｏ ７を含有する細胞の沈澱に、３０ｍ
ＱのＬＳＴ緩衝液（すべての緩衝液のリストは下に記載
する）および２ｍＱのバナディ・リボヌクレオシド・コ
ンプレックス（Ｖａｎａｄｙ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅ
ｏｓｉｄｅ Ｃｏｐｌｅｘ） （Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，マリイランド州カイサースバーグ）を添加し、そし
て細胞を穏やかに再懸濁し、細胞を氷上に保持した。再
懸濁した細胞を５０ｍ＋２の管に移した。１２ｍｌ２の
４×ＴＮＬＢ緩衝液を添加し、種やかにｌＯ回転倒させ
た。再懸濁液を２５０Ｏｒｐｍにおいて５分間遠心した
。上澄み液を２５０ｍｆｆのふたをもつ遠心びんに移し
た。４ｍＱのｌＯ％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）を上澄み液に添加し、モして体墳をＡＣＥ緩衝液で８
０ｍｆ２にする。８０ｍ＋２のＡＣＥ／フェノールを添
加し、そして室温において５分間激しく震盪した。５０
００ｒｐｍで１０分間遠心した。水性相を除去し、そし
て新鮮な２５０ｒｒｌのびんに移した。ＲＮＡを２体積
の−２０°Ｃの無水エタノールで沈澱させ、そしてｌ／
１０体積の水性１モルのＮａＣ ｌを添加した。ＲＮＡ
を一夜−２０゜Ｃにおいて沈澱させた。ＲＮＡを７００
Ｑｒｐｍで４℃において４０分間遠心により沈降させた
。沈澱を７０％のエタノールで洗浄し、そして４°Ｃに
おいて１５分間７０００ｒｐｍで遠心した。沈澱を乾燥
した（凍結乾燥）。合計のＲＮＡをｄＨ．ｏ中に含有す
る沈澱を再懸濁させた。
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）ら、に記載されているプロトコルに従いオリゴ（ｄ
Ｔ）一セルロースクロマトグラ７イーにより分離する。
ｓ）ら、に記載されているプロトコルに従いオリゴ（ｄ
Ｔ）一セルロースクロマトグラ７イーにより分離する。
ｃＤＮＡの合成およびラムダＧＴＩＯライブラリーの構
成 二本鎖ｃＤＮＡを、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＲｅｓｅａｃｈＬａｂｏｒｉ
ｅｓ）（ＢＲＬ，マリイランド州ガイサーバーグ）のｃ
ＤＮＡ合成系（カタログＮＯ．８２６７ＳＡ）を使用し
て合成した。６％のポリアクリルアミドゲルの分画によ
り二本鎖ｃＤＮＡを大きさで選択した。５００ｂｐ以上
のＤＮＡを含有するゲル断片を切除する。０．ＩＸＴＢ
Ｅ緩衝液中の１４０ボルトにおいて２時間ゲルからＤＮ
Ａを電気溶離する。等しい体積のフェノール／クロロホ
ルムｌＸ、および等しい体積のクロロホルムｌ×を添加
し、そして２．５体積の１００％エタノールおよび０．
１体積の３モルの酢酸ナトリウムの添加により沈澱させ
、そして−２０００において一夜インキユベーションし
た。ＤＮＡを遠心により沈澱させ、７０％のエタノール
で洗浄し、そして凍結乾燥する。二本鎖ｃＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩアダプターに次のようにして結合する：アダプタ
ーの上の鎖のヌクレオチド配列は、５’ ＣＴＣＧＡＧ
ＡＧＡＡＣＧＴＡＴＧ３’であり、 アダプターの下の鎖のヌクレオチド配列は、５’ ＡＡ
ＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＴＣＧＡＧ３’ である。
成 二本鎖ｃＤＮＡを、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＲｅｓｅａｃｈＬａｂｏｒｉ
ｅｓ）（ＢＲＬ，マリイランド州ガイサーバーグ）のｃ
ＤＮＡ合成系（カタログＮＯ．８２６７ＳＡ）を使用し
て合成した。６％のポリアクリルアミドゲルの分画によ
り二本鎖ｃＤＮＡを大きさで選択した。５００ｂｐ以上
のＤＮＡを含有するゲル断片を切除する。０．ＩＸＴＢ
Ｅ緩衝液中の１４０ボルトにおいて２時間ゲルからＤＮ
Ａを電気溶離する。等しい体積のフェノール／クロロホ
ルムｌＸ、および等しい体積のクロロホルムｌ×を添加
し、そして２．５体積の１００％エタノールおよび０．
１体積の３モルの酢酸ナトリウムの添加により沈澱させ
、そして−２０００において一夜インキユベーションし
た。ＤＮＡを遠心により沈澱させ、７０％のエタノール
で洗浄し、そして凍結乾燥する。二本鎖ｃＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩアダプターに次のようにして結合する：アダプタ
ーの上の鎖のヌクレオチド配列は、５’ ＣＴＣＧＡＧ
ＡＧＡＡＣＧＴＡＴＧ３’であり、 アダプターの下の鎖のヌクレオチド配列は、５’ ＡＡ
ＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＣＴＣＴＣＴＣＧＡＧ３’ である。
アダプターをｃＤＮＡへ結合する前に、上の鎖のアダプ
ターをマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らに記載されて
いるプロトコルに従いキナーゼ処理する。
ターをマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らに記載されて
いるプロトコルに従いキナーゼ処理する。
遊離リンカーからの二本鎖ｃＤＮＡの精製は、次のとお
りである二６％のポリアクリルアミドゲルを通す全体の
結合反応を分画し、そして５００ｂｐより大きいＤＮＡ
を含有するゲル断片を分離する。次いで、前述したよう
に、ＤＮＡをゲルスライスから電気溶離し、フェノール
／クロロホルム、エタノール沈澱させ、遠心し、そして
凍結乾燥する。
りである二６％のポリアクリルアミドゲルを通す全体の
結合反応を分画し、そして５００ｂｐより大きいＤＮＡ
を含有するゲル断片を分離する。次いで、前述したよう
に、ＤＮＡをゲルスライスから電気溶離し、フェノール
／クロロホルム、エタノール沈澱させ、遠心し、そして
凍結乾燥する。
ＥｃｏＲＩアダプターを含有する二本鎖ｃＤＮＡを、製
造業者により提供されるプロトコルに従い、ラムダＧＴ
ＩＯアーム（Ｓｔｒｔａｇｅｎｅ，カリ７オルニア州ラ
ジョラ）に結合する。
造業者により提供されるプロトコルに従い、ラムダＧＴ
ＩＯアーム（Ｓｔｒｔａｇｅｎｅ，カリ７オルニア州ラ
ジョラ）に結合する。
ｃＤＮＡライブラリーの包装、力価決定および平板培養
は、ラムダ（，ＴＩＯアームの製造業者（Ｓｔｒｔａｇ
ｅｎｅ）により供給される手順に従い実施する。
は、ラムダ（，ＴＩＯアームの製造業者（Ｓｔｒｔａｇ
ｅｎｅ）により供給される手順に従い実施する。
ＡＨＴｌ０７！ｉ，ＩＩＩを再発現するクローンは、次
のようにして分離した：ＡＨＴｌ０７ ｃＤＮＡライ
ブラリーを、発表されたマウスＩｇＧ−１の一定領域の
ヌクレオチド配列に対して相補的である作った、３つの
合成オリゴヌクレオチドのプローブでスクリーニングし
た。グローブのヌクレオチド配列は、次のとおりである
： グローブ＃ｌ： ５’ ＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＧ３’プロー
ブ＃２： ５’ ＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴ３′ ブローブ＃３： ５″ＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＣ３′ 高い厳格さにおいてグローブにハイブリダイゼーション
したクローンを、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ消
化によりさらに分析した。最長のインサートを有するク
ローンをプラーク精製し、そしてそれらのインサートを
ジデオキシ配列決定のためにバタテリオファージＭｌ３
中にスクリーニングした。コンピューターに助けられた
分析を使用して、可変領域のアミノ酸配列をクローンの
ヌクレオチド配列から誘導した。精製したＡＨ７１０７
重鎮タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。精製
した抗体と同一のＮ末端アミノ酸配列を有する完全な長
さのＡＨＴ Ｉ ０ ７重鎮タンパク質をエンコードす
ることがコンピューター分析により予測されたクローン
を、サザン分析によりさらに特性決定した。第１因は、
ＡＨＴ １ ０ ７重鎮の可変領域のヌクレオチド配列
およびアーミノ酸配列を示す。
のようにして分離した：ＡＨＴｌ０７ ｃＤＮＡライ
ブラリーを、発表されたマウスＩｇＧ−１の一定領域の
ヌクレオチド配列に対して相補的である作った、３つの
合成オリゴヌクレオチドのプローブでスクリーニングし
た。グローブのヌクレオチド配列は、次のとおりである
： グローブ＃ｌ： ５’ ＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＧ３’プロー
ブ＃２： ５’ ＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＴ３′ ブローブ＃３： ５″ＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＣ３′ 高い厳格さにおいてグローブにハイブリダイゼーション
したクローンを、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ消
化によりさらに分析した。最長のインサートを有するク
ローンをプラーク精製し、そしてそれらのインサートを
ジデオキシ配列決定のためにバタテリオファージＭｌ３
中にスクリーニングした。コンピューターに助けられた
分析を使用して、可変領域のアミノ酸配列をクローンの
ヌクレオチド配列から誘導した。精製したＡＨ７１０７
重鎮タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。精製
した抗体と同一のＮ末端アミノ酸配列を有する完全な長
さのＡＨＴ Ｉ ０ ７重鎮タンパク質をエンコードす
ることがコンピューター分析により予測されたクローン
を、サザン分析によりさらに特性決定した。第１因は、
ＡＨＴ １ ０ ７重鎮の可変領域のヌクレオチド配列
およびアーミノ酸配列を示す。
５′末端においてプライミングするＩ；めの同義性オリ
ゴマーのヌクレオチド配列は、次のとおりである： ＡＣＧＴＴＣ；ＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣＡＧ（；ＴＣ
ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡ Ａ ＴＡ Ｇ 丁Ｔ ハイライトの（肉太）のヌクレオチドは、処理した重鎮
の最初の５つのアミノ酸に相当する。上に線を引いたヌ
クレオチドは、キメラの配列決定および構成のために適
当なベクター中にスクリーニングするために使用した、
ＥｃｏＲＩおよびＢａＩ１の制限部位に相当する。３′
末端においてプライミングするためのオリゴマーのヌク
レオチド配列は、次のとおりである： ＴＡＣＴＡＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣＧ
ＴＴＴＴＧＧＣハイライトの（肉太）のヌクレオチドは
、マウスＩｇＧ−１の定常領域の最初の５つのアミノ酸
に相当する。上に線を引いたヌクレオチドは、キメラの
配列決定および構成のために適当なベクター中にスクリ
ーニングするために使用した、Ｈｉｎｄｌｌｌの制限部
位に相当する。
ゴマーのヌクレオチド配列は、次のとおりである： ＡＣＧＴＴＣ；ＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＣＣＡＧ（；ＴＣ
ＣＡＧＣＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡ Ａ ＴＡ Ｇ 丁Ｔ ハイライトの（肉太）のヌクレオチドは、処理した重鎮
の最初の５つのアミノ酸に相当する。上に線を引いたヌ
クレオチドは、キメラの配列決定および構成のために適
当なベクター中にスクリーニングするために使用した、
ＥｃｏＲＩおよびＢａＩ１の制限部位に相当する。３′
末端においてプライミングするためのオリゴマーのヌク
レオチド配列は、次のとおりである： ＴＡＣＴＡＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣＧ
ＴＴＴＴＧＧＣハイライトの（肉太）のヌクレオチドは
、マウスＩｇＧ−１の定常領域の最初の５つのアミノ酸
に相当する。上に線を引いたヌクレオチドは、キメラの
配列決定および構成のために適当なベクター中にスクリ
ーニングするために使用した、Ｈｉｎｄｌｌｌの制限部
位に相当する。
ＰＣＨのための反応条件は、次のとおりである：９４゜
Ｃにおいて９０分間予備インキユベーションする。次い
で、９４℃において１分、５５℃において２分、７２℃
において３分から成る２５サイクルで処理する。７２℃
においてｌＯ分間後インキユベーションする。等しい体
積の７ェノール／クロロホルムｌ×、および等しい体積
のクロロホルムｌ×を添加する。２．５×体積の１００
％のエタノールで沈澱させる。５％のポリアクリルアミ
ドゲルで分画する。適当な大きさのＤＮＡ断片を含有す
るゲル断片を分離する。ゲルスライスからＤＮＡを電気
泳動する。等しい体積のフェノール／クロロホルムｌＸ
１および等しい体積のクロロホルムｌ×を添加する。２
．５ＸＩＯＯ％のエタノールを沈澱させる。制限エンド
ヌクレアーゼ緩衝液中に再懸濁させ、モしてＥｃｏＲＩ
ＢよＣ／”ＨｉｎｄＩＩＩとインキユベーシヨンする。
Ｃにおいて９０分間予備インキユベーションする。次い
で、９４℃において１分、５５℃において２分、７２℃
において３分から成る２５サイクルで処理する。７２℃
においてｌＯ分間後インキユベーションする。等しい体
積の７ェノール／クロロホルムｌ×、および等しい体積
のクロロホルムｌ×を添加する。２．５×体積の１００
％のエタノールで沈澱させる。５％のポリアクリルアミ
ドゲルで分画する。適当な大きさのＤＮＡ断片を含有す
るゲル断片を分離する。ゲルスライスからＤＮＡを電気
泳動する。等しい体積のフェノール／クロロホルムｌＸ
１および等しい体積のクロロホルムｌ×を添加する。２
．５ＸＩＯＯ％のエタノールを沈澱させる。制限エンド
ヌクレアーゼ緩衝液中に再懸濁させ、モしてＥｃｏＲＩ
ＢよＣ／”ＨｉｎｄＩＩＩとインキユベーシヨンする。
７エノール／クロロホルムおよびエタノールを前述のよ
うに添加する。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ Ｉ Ｉ切断し
たＭｌ３中に結合する。ある数の異なる透明なプラーク
を分離し、ヌクレオチド配列を決定し、そして前述の合
成オリゴヌクレオチドを使用する手順の同じように分析
する。
うに添加する。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩ Ｉ Ｉ切断し
たＭｌ３中に結合する。ある数の異なる透明なプラーク
を分離し、ヌクレオチド配列を決定し、そして前述の合
成オリゴヌクレオチドを使用する手順の同じように分析
する。
ＡＨ７ １ ０ ７重鎮キメラ抗体の構成出発ベクター
は、次の修飾をもつｐｓＶ２ＮＥ０である：ｐＳＶ２Ｎ
ＥＯ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨｌ断片（ｂｐ２６３５−
３３８６）を、Ｍｌ３ｍｐｌ８ （ｂｐ６２３１−６９
３５）から分離したＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ断片と置換
した。このベクターをｐＭＴＩ−６と呼び、ヒトＴｇＧ
−１一定領域遺伝子を含有する６．５ｋｂのＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、平滑末端の断片として、ｐＭ
ＴＩ−６のＭｌ３ボリリンカー中に充填したＳａｌＩ部
位中にサブクローニングした。このベクターをｐＭＴＩ
−１０と呼ぶ。
は、次の修飾をもつｐｓＶ２ＮＥ０である：ｐＳＶ２Ｎ
ＥＯ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨｌ断片（ｂｐ２６３５−
３３８６）を、Ｍｌ３ｍｐｌ８ （ｂｐ６２３１−６９
３５）から分離したＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ断片と置換
した。このベクターをｐＭＴＩ−６と呼び、ヒトＴｇＧ
−１一定領域遺伝子を含有する６．５ｋｂのＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、平滑末端の断片として、ｐＭ
ＴＩ−６のＭｌ３ボリリンカー中に充填したＳａｌＩ部
位中にサブクローニングした。このベクターをｐＭＴＩ
−１０と呼ぶ。
ＡＨＴ １ ０ ７重鎮キメラ遺伝子は、次の成分を使
用して構成した：Ｊ領域の最後の８アミノ酸を除外した
、すべての可変領域の解読配列を含有するＡＨＴ １
０ ７重鎮ｃＤＮＡのクローンからのＸｈｏｌ−Ｂａｎ
ｌ断片。この断片のＸｈｏＩ部位はクレノーを使用して
充填した。ほぼ８ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓａｃｌ断片をｐ
ＭＴＩ−１０から分離した（ＢａｍＨ１部位はＭｌ３ポ
リリンカー中に存在し、Ｓａｃｌｒ部位はヒトＩｇＧ−
１定常領域のＣＨ２ドメイン中に位置する）。この断片
のＢａｍＨ１部位をクレノーを使用して充填した。
用して構成した：Ｊ領域の最後の８アミノ酸を除外した
、すべての可変領域の解読配列を含有するＡＨＴ １
０ ７重鎮ｃＤＮＡのクローンからのＸｈｏｌ−Ｂａｎ
ｌ断片。この断片のＸｈｏＩ部位はクレノーを使用して
充填した。ほぼ８ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓａｃｌ断片をｐ
ＭＴＩ−１０から分離した（ＢａｍＨ１部位はＭｌ３ポ
リリンカー中に存在し、Ｓａｃｌｒ部位はヒトＩｇＧ−
１定常領域のＣＨ２ドメイン中に位置する）。この断片
のＢａｍＨ１部位をクレノーを使用して充填した。
Ａｐａ Ｉ−Ｓａｃ Ｉ Ｉ断片をｐＭＴＩ−１０から
分離した（ＡｐａｌおよびＳａｃ Ｉ １部位は、それ
ぞれ、ヒトｌｇＧ−１一定領域のＣＨＩおよびＣＨ２ド
メイン中に位置する）。２つのオーバーラップする合成
オリゴヌクレオチドは、５′末端にＢａｎＩ部位および
３″末端にＡｐａ１部位を有し、そしてＪ領域の最後の
８アミノ酸およびＣＨｌドメイン中のＡｐａ１部位まで
のヒト定常領域の最初の数個のアミノ酸を含有する。オ
リゴマーのヌクレオチド配列は、次のとおりである：５
′３′ ＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣんＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣ
ＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧ（：ＣＧＴＧＡＧＡＧＴＧＴ
ＣＡＧＡＧＧＡＧＴＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣ３′５・ 合成オリゴヌクレオチドをまず互いにアニリールし、次
いですべての成分を結合反応に添加した。
分離した（ＡｐａｌおよびＳａｃ Ｉ １部位は、それ
ぞれ、ヒトｌｇＧ−１一定領域のＣＨＩおよびＣＨ２ド
メイン中に位置する）。２つのオーバーラップする合成
オリゴヌクレオチドは、５′末端にＢａｎＩ部位および
３″末端にＡｐａ１部位を有し、そしてＪ領域の最後の
８アミノ酸およびＣＨｌドメイン中のＡｐａ１部位まで
のヒト定常領域の最初の数個のアミノ酸を含有する。オ
リゴマーのヌクレオチド配列は、次のとおりである：５
′３′ ＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣんＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣ
ＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧ（：ＣＧＴＧＡＧＡＧＴＧＴ
ＣＡＧＡＧＧＡＧＴＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣ３′５・ 合成オリゴヌクレオチドをまず互いにアニリールし、次
いですべての成分を結合反応に添加した。
すべての成分を含有するクローンを放射性プローブへの
ハイブリダイゼーンヨンにより分離した。
ハイブリダイゼーンヨンにより分離した。
陽性のクローンをざらにサザン分析およびジデオキシ配
列決定により特性決定した。正しい立体配置ですべての
成分を含有する１つのクローンをそれ以上の研究のため
に選択し、そしてそれをｐＭＴｌ−３１０１と呼ぶ。
列決定により特性決定した。正しい立体配置ですべての
成分を含有する１つのクローンをそれ以上の研究のため
に選択し、そしてそれをｐＭＴｌ−３１０１と呼ぶ。
啼乳動物細胞中でｐＭＴＩ−３１０１を発現するために
、種々のプロモーターおよびエンハンサーの組み合わせ
をベクターに添加した。金属チオネイングロモーターを
含有する１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限断片
を、ｐＭＴＩ−３１０ｌのＭｌ３ポリリンカー中のＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨ１部位中にスクリーニングした。生ず
るベクターをｐＭＴＩ−３１０３と呼ぶ。ラウス肉腫ウ
イルス（ＲＳＶ）を含有する６００ｂｐのＮｄｅ１−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ制限断片をクレノーで充填して、平滑末端
を生成し、そしてｐＭＴＩ−３１０１のＭ１３ポリリン
カー中のＳｍａ １部位中にスクリーニングした。生ず
るベクターをｐＭＴＩ−３１０５と呼ぶ。サイトメガロ
ウイルスの直ぐの早期エンハンサーおよびＨＩＶ Ｌ
ＴＲを含有する８５０ｂｐのＭ ｌ ｕ Ｉ − Ｈ
ｉ ｎ ｄ Ｉ Ｉ Ｉ制限断片をクレノーで充填して
、平滑末端を生成し、そしてｐＭＴＩ−３１０１のＭ１
３ポリリンカー中のＳＭＡ １部位中にスクリーニン
グした。生ずるベクターをｐＭＴＩ−３１０６と呼ぶ。
、種々のプロモーターおよびエンハンサーの組み合わせ
をベクターに添加した。金属チオネイングロモーターを
含有する１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限断片
を、ｐＭＴＩ−３１０ｌのＭｌ３ポリリンカー中のＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨ１部位中にスクリーニングした。生ず
るベクターをｐＭＴＩ−３１０３と呼ぶ。ラウス肉腫ウ
イルス（ＲＳＶ）を含有する６００ｂｐのＮｄｅ１−Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ制限断片をクレノーで充填して、平滑末端
を生成し、そしてｐＭＴＩ−３１０１のＭ１３ポリリン
カー中のＳｍａ １部位中にスクリーニングした。生ず
るベクターをｐＭＴＩ−３１０５と呼ぶ。サイトメガロ
ウイルスの直ぐの早期エンハンサーおよびＨＩＶ Ｌ
ＴＲを含有する８５０ｂｐのＭ ｌ ｕ Ｉ − Ｈ
ｉ ｎ ｄ Ｉ Ｉ Ｉ制限断片をクレノーで充填して
、平滑末端を生成し、そしてｐＭＴＩ−３１０１のＭ１
３ポリリンカー中のＳＭＡ １部位中にスクリーニン
グした。生ずるベクターをｐＭＴＩ−３１０６と呼ぶ。
第５Ａ図は、重鎮免疫グロブリン遺伝子のための発現ベ
クターを示す。
クターを示す。
キメラＡＨＴ １ ０ ７重鎮遺伝子の発現３つのキメ
ラＡＨ７１０７重鎮ベクター ｐＭＴｌ−３１０３、ｐ
ＭＴｒ−３１０５およびｐＭＴｌ−３１０６の発現のレ
ベルを、ＣＯＳ細胞中の一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）
発現アツセイにおいて分析した。一時的発現アッセイの
ためのプロトコルは、次のとおりである：無菌のエツペ
ンドルフ管にＩＯμｇのＤＮＡ，１２μαのＤＥＡＥ−
デキストラン（２５ｍｇ／ｍα）を添加し、そして体積
をＴＳ緩衝液で０．６ｍＱにした。１０７のＣｏＳ細胞
を含有するｌＯｃｍのペトリ皿から培地を途去し、そし
てＤＮＡ混合物を細胞上に滴々添加した。ＣＯ，インキ
ュペーター内で３７℃において６０分間インキユベーシ
ョンする。
ラＡＨ７１０７重鎮ベクター ｐＭＴｌ−３１０３、ｐ
ＭＴｒ−３１０５およびｐＭＴｌ−３１０６の発現のレ
ベルを、ＣＯＳ細胞中の一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）
発現アツセイにおいて分析した。一時的発現アッセイの
ためのプロトコルは、次のとおりである：無菌のエツペ
ンドルフ管にＩＯμｇのＤＮＡ，１２μαのＤＥＡＥ−
デキストラン（２５ｍｇ／ｍα）を添加し、そして体積
をＴＳ緩衝液で０．６ｍＱにした。１０７のＣｏＳ細胞
を含有するｌＯｃｍのペトリ皿から培地を途去し、そし
てＤＮＡ混合物を細胞上に滴々添加した。ＣＯ，インキ
ュペーター内で３７℃において６０分間インキユベーシ
ョンする。
８〜ｌｏｍＱのＴＳ緩衝液で洗浄する。０．１ミリモル
のクロロキンを含有する１０ｍＱの培地（ＤＭＥＭ＋ペ
ニシリン＋ストレプトマイシン＋５％の血清）を添加す
る。Ｃｏ２インキュベーター内で３７℃において３．５
時間インキユベーションする。クロロキンを含有する培
地を除去し、そして新鮮な培地を添加する。３７℃にお
いて４８時間インキユベーションする。培地を陳去し、
そして２５０μＱのＲＩＰＡ溶菌緩衝液を添加する。
のクロロキンを含有する１０ｍＱの培地（ＤＭＥＭ＋ペ
ニシリン＋ストレプトマイシン＋５％の血清）を添加す
る。Ｃｏ２インキュベーター内で３７℃において３．５
時間インキユベーションする。クロロキンを含有する培
地を除去し、そして新鮮な培地を添加する。３７℃にお
いて４８時間インキユベーションする。培地を陳去し、
そして２５０μＱのＲＩＰＡ溶菌緩衝液を添加する。
氷上で２０分間インキユベーションし、そして細胞を集
める。４℃においてエツペンドルフ管中で５分間回転す
る。上澄み液を取り出し、そしてウエスタンおよびＥＬ
Ｉ ＳＡ分析により発現のレベルを決定する。ｐＭＴ
ｒ−３１０５によりつくられたキメラ重鎮の量は、ｐＭ
ＴＩ−３１０１によりつくられた量の約５倍より高いｐ
ＭＴＩ−３１０６よりわずかに高い（データは示されて
いない）。
める。４℃においてエツペンドルフ管中で５分間回転す
る。上澄み液を取り出し、そしてウエスタンおよびＥＬ
Ｉ ＳＡ分析により発現のレベルを決定する。ｐＭＴ
ｒ−３１０５によりつくられたキメラ重鎮の量は、ｐＭ
ＴＩ−３１０１によりつくられた量の約５倍より高いｐ
ＭＴＩ−３１０６よりわずかに高い（データは示されて
いない）。
５′末端におけるプライミングのための同義性オリゴマ
ーのヌクレオチド配列は、次のとおりである： ５’ ＡＣＧＴＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＧＡＡＧ
ＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧ ３’Ｇ Ｔ ．Ａ Ｃ
Ｔ Ｃ ＡＣ Ａ ＧＡ ＴＡ ＴＧ ハイライト（肉太）のヌクレオチドは、処理した重鎮の
最初の５つのアミノ酸に相当する。上に線を引いたヌク
レオチドは、キメラ遺伝子の配列決定および構成のため
に適当なベクター中へのスクリーニングのために使用し
たＥｃｏＲＩおよびＮｒｕｌｍ＠部位に相当する。３′
末端におけるプライミングのためのオリゴマーのヌクレ
オチド配列は、次のとおりである： ５゜ＴＡＣＴＡＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴ
ＣＧＴＴＴＴＧＧＣ ３’ハイライトのヌクレオチドは
、処理した重鎮の最初の５つのアミノ酸に相当する。上
に線を引いたヌクレオチドは、キメラ遺伝子の配列決定
およびｌ１ｌｌ成のために適当なベクター中へのスクリ
ーニングのために使用したＨｉｎｄｌＩＩ制限部位に相
当する。
ーのヌクレオチド配列は、次のとおりである： ５’ ＡＣＧＴＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＧＡＡＧ
ＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧ ３’Ｇ Ｔ ．Ａ Ｃ
Ｔ Ｃ ＡＣ Ａ ＧＡ ＴＡ ＴＧ ハイライト（肉太）のヌクレオチドは、処理した重鎮の
最初の５つのアミノ酸に相当する。上に線を引いたヌク
レオチドは、キメラ遺伝子の配列決定および構成のため
に適当なベクター中へのスクリーニングのために使用し
たＥｃｏＲＩおよびＮｒｕｌｍ＠部位に相当する。３′
末端におけるプライミングのためのオリゴマーのヌクレ
オチド配列は、次のとおりである： ５゜ＴＡＣＴＡＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴ
ＣＧＴＴＴＴＧＧＣ ３’ハイライトのヌクレオチドは
、処理した重鎮の最初の５つのアミノ酸に相当する。上
に線を引いたヌクレオチドは、キメラ遺伝子の配列決定
およびｌ１ｌｌ成のために適当なベクター中へのスクリ
ーニングのために使用したＨｉｎｄｌＩＩ制限部位に相
当する。
ＰＣＨの反応条件は次のとおりである：９４゜Ｃにおい
てｌＯ分間予備インキユベーションする。
てｌＯ分間予備インキユベーションする。
次いで、９４°Ｃにおいて１分、５５゜Ｃにおいて２分
、７２゜Ｃにおいて３分から成る２５サイクルで処理す
る。７２゜ＣにおいてｌＯ分間、後インキユベーション
する。等しい体積の７ェノール／クロロホルムｌ×、お
よび等しい体積のクロロホルムｌ×を添加する。２．５
×体積の１００％のエタノールで沈澱させる。５％のポ
リアクリルアミドゲルで分画する。適当な大きさのＤＮ
Ａ断片を含有するゲル断片を分離する。ゲルのスライス
からＤＮＡを電気溶離する。等しい体積のフェノール／
クロロホルム１ｘ，および等しい体積のクロロホルム１
ｘを添加する。２．５×体積の１００％のエタノールで
沈澱させる。制限エンドヌクレアーゼの緩衝液中に再懸
濁し、そしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌとともに
インキユベーションする。前述のようにフェノール／ク
ロロホルムを添加する。ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈ ｉ ｎｄ
Ｉ Ｉ Ｉ切断Ｍｌ３中に結合する。ある数の異なる透
明なブラークを分離し、ヌクレオチド配列を決定し、そ
して前述の合成オリゴヌクレオチドを使用する手順と同
じように分析する。ヌクレオチド配列およびＡＨＴ５４
重鎮のアミノ酸配列を第２図に示す。
、７２゜Ｃにおいて３分から成る２５サイクルで処理す
る。７２゜ＣにおいてｌＯ分間、後インキユベーション
する。等しい体積の７ェノール／クロロホルムｌ×、お
よび等しい体積のクロロホルムｌ×を添加する。２．５
×体積の１００％のエタノールで沈澱させる。５％のポ
リアクリルアミドゲルで分画する。適当な大きさのＤＮ
Ａ断片を含有するゲル断片を分離する。ゲルのスライス
からＤＮＡを電気溶離する。等しい体積のフェノール／
クロロホルム１ｘ，および等しい体積のクロロホルム１
ｘを添加する。２．５×体積の１００％のエタノールで
沈澱させる。制限エンドヌクレアーゼの緩衝液中に再懸
濁し、そしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌとともに
インキユベーションする。前述のようにフェノール／ク
ロロホルムを添加する。ＥｃｏＲ Ｉ／Ｈ ｉ ｎｄ
Ｉ Ｉ Ｉ切断Ｍｌ３中に結合する。ある数の異なる透
明なブラークを分離し、ヌクレオチド配列を決定し、そ
して前述の合成オリゴヌクレオチドを使用する手順と同
じように分析する。ヌクレオチド配列およびＡＨＴ５４
重鎮のアミノ酸配列を第２図に示す。
ＡＨ７５４重鎮キメラの構成
次の手順を、ＡＨ７５４重鎮のキメラの構成に使用する
ことができる： 出発ベクターは、次の修飾をもつｐｓＶ２ＮＥＯである
：ｐＳＶ２ＮＥＯ ＥｃｏＲＩ−ＢａｎＨｌ断片（ｂ
ｐ２６３５−３３８６）を、Ｍ１３ｍｐ ｌ ８ （ｂ
ｐ６２３ １−６９３５）から分離したＥｃｏＲＩ−Ｂ
ｇｌ Ｉ Ｔ断片と置換した。このベクターをｐＭＴｒ
−ａと呼び、ヒトＩｇＧｌ一定領域遺伝子を含有する６
．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、平滑末
端の断片として、ｐＭＴＩ−６のＭｌ３ボリリンカー中
に充填したＳａｌＩ部位中にサブクローニングした。こ
のベクターをｐＭＴＩ−１０と呼び。
ことができる： 出発ベクターは、次の修飾をもつｐｓＶ２ＮＥＯである
：ｐＳＶ２ＮＥＯ ＥｃｏＲＩ−ＢａｎＨｌ断片（ｂ
ｐ２６３５−３３８６）を、Ｍ１３ｍｐ ｌ ８ （ｂ
ｐ６２３ １−６９３５）から分離したＥｃｏＲＩ−Ｂ
ｇｌ Ｉ Ｔ断片と置換した。このベクターをｐＭＴｒ
−ａと呼び、ヒトＩｇＧｌ一定領域遺伝子を含有する６
．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、平滑末
端の断片として、ｐＭＴＩ−６のＭｌ３ボリリンカー中
に充填したＳａｌＩ部位中にサブクローニングした。こ
のベクターをｐＭＴＩ−１０と呼び。
ＡＨ７５４重鎮キメラ遺伝子は、次の成分を使用して構
成した： Ｊ領域の最後の９アミノ酸を除外した、すべての可変領
域の解読配列を含有するＡＨＴ５ ４！ｌ鎖ｃＤＮＡの
クローンからのＸＥｃｏＲＩ−Ｓｔｙ■断片。ほぼ８ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ−ＳｃａＩ断片をｐＭＴＩ−１０から分
離した（ＥｃｏＲ１部位はＭｌ３ポリリンカー中に存在
し、Ｓａｃ１１部位はヒトＩｇＧ−１定常領域のＣＨ２
ドメイン中に位置する）．１０１４ｂｐのＡｐａＩ−Ｓ
ｃａＩ断片をｐＭＴＩ−１０から分離した（ＡｐａｌＢ
よびＳａｃ Ｉ １部位は、それぞれ、ヒトｒｇｃｌ定
常領域のＣＨＩおよびＣＨ２ドメイン中に位置する）。
成した： Ｊ領域の最後の９アミノ酸を除外した、すべての可変領
域の解読配列を含有するＡＨＴ５ ４！ｌ鎖ｃＤＮＡの
クローンからのＸＥｃｏＲＩ−Ｓｔｙ■断片。ほぼ８ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ−ＳｃａＩ断片をｐＭＴＩ−１０から分
離した（ＥｃｏＲ１部位はＭｌ３ポリリンカー中に存在
し、Ｓａｃ１１部位はヒトＩｇＧ−１定常領域のＣＨ２
ドメイン中に位置する）．１０１４ｂｐのＡｐａＩ−Ｓ
ｃａＩ断片をｐＭＴＩ−１０から分離した（ＡｐａｌＢ
よびＳａｃ Ｉ １部位は、それぞれ、ヒトｒｇｃｌ定
常領域のＣＨＩおよびＣＨ２ドメイン中に位置する）。
２つのオーバーラップする合成オリゴヌクレオチドは、
５″末端にｓｔｙｘ部位および３′末端にＡｐａ１部位
を有し、そしてＪ領域の最後の９アミノ酸およびＣＨＩ
ドメイン中のＡｐａｒ部位までのヒト定常領域の最初の
数個のアミノ酸を含有する。オリゴマーのヌクレオチド
配列は、次のとおりである： ５’ ＣＡＡＧＧＧＡＣ：ＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴ
ＣＴ（：ＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣ
３″ＣＣＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＣＧＴ
ＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣ３′５′ 合成オリゴヌクレオチドをまず互いにアニリールし、次
いですべての成分を結合反応に添加した。
５″末端にｓｔｙｘ部位および３′末端にＡｐａ１部位
を有し、そしてＪ領域の最後の９アミノ酸およびＣＨＩ
ドメイン中のＡｐａｒ部位までのヒト定常領域の最初の
数個のアミノ酸を含有する。オリゴマーのヌクレオチド
配列は、次のとおりである： ５’ ＣＡＡＧＧＧＡＣ：ＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴ
ＣＴ（：ＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣ
３″ＣＣＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＧＡＣＧＴ
ＣＧＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣ３′５′ 合成オリゴヌクレオチドをまず互いにアニリールし、次
いですべての成分を結合反応に添加した。
すべての成分を含有するクローンを放射性プローブへの
ハイブリダイゼーションにより分離した。
ハイブリダイゼーションにより分離した。
陽性のクローンをざらにサザン分析およびジデオキシ配
列決定により特性決定した。
列決定により特性決定した。
同様な手順を分析およびジデオキシ配列決定のために利
用することができる。
用することができる。
同様な手順を軽ｃＤＮＡ鎖のために利用することができ
、そして次のように記載される：ＡＨＴ１０７重鎮を発
現するクローンを、次のようにして分離した：ＡＨＴｌ
０７ ｃＤＮＡライブラリーを、発表されたマウスカ
ッパ一定領域のヌクレオチド配列に対して相補的とした
合成オリゴヌクレオチドのプローブを使用してスクリー
ニングした。このブローブのヌクレオチド配列は、次の
とおりである： ５’ ＣＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＣＡＣＴＧ ３
’高い厳格さでこのプローブにハイブリダイゼーション
したクローンを、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼの
消化によりさらに分析した。最長のインサートを有する
クローンをプラーク精製し、そしてそれらのインサート
をジデオキシ配列決定のためにバクテリオファージＭｌ
３中にスクリーニングした。コンピューターに助けられ
た分析を使用して、可変領域のアミノ酸配列をクローン
のヌクレオチド配列から誘導した。精製したＡＨＴ１０
７重鎮タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。精
製した抗体と同一のＮ末端アミノ酸配列を有する完全な
長さのＡＨＴ ｌ ０ ７重鎮タンパク質をエンコード
することがコンピューター分析により予測されたクロー
ンを、サザン分析によりさらに特性決定した。第３図は
、ＡＨＴ １ ０ ７重鎮の可変領域のヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列を示す。ＡＨＴ５４重鎮ｃＤＮＡ
クローンを、ＡＨＴＩＱ７重鎮ｃＤＮＡについて前述し
たように分離し、そして特性決定した。第４図は、ＡＨ
Ｔ５４重鎮の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を示す。
、そして次のように記載される：ＡＨＴ１０７重鎮を発
現するクローンを、次のようにして分離した：ＡＨＴｌ
０７ ｃＤＮＡライブラリーを、発表されたマウスカ
ッパ一定領域のヌクレオチド配列に対して相補的とした
合成オリゴヌクレオチドのプローブを使用してスクリー
ニングした。このブローブのヌクレオチド配列は、次の
とおりである： ５’ ＣＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＣＡＣＴＧ ３
’高い厳格さでこのプローブにハイブリダイゼーション
したクローンを、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼの
消化によりさらに分析した。最長のインサートを有する
クローンをプラーク精製し、そしてそれらのインサート
をジデオキシ配列決定のためにバクテリオファージＭｌ
３中にスクリーニングした。コンピューターに助けられ
た分析を使用して、可変領域のアミノ酸配列をクローン
のヌクレオチド配列から誘導した。精製したＡＨＴ１０
７重鎮タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。精
製した抗体と同一のＮ末端アミノ酸配列を有する完全な
長さのＡＨＴ ｌ ０ ７重鎮タンパク質をエンコード
することがコンピューター分析により予測されたクロー
ンを、サザン分析によりさらに特性決定した。第３図は
、ＡＨＴ １ ０ ７重鎮の可変領域のヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列を示す。ＡＨＴ５４重鎮ｃＤＮＡ
クローンを、ＡＨＴＩＱ７重鎮ｃＤＮＡについて前述し
たように分離し、そして特性決定した。第４図は、ＡＨ
Ｔ５４重鎮の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ
酸配列を示す。
ＡＨＴ Ｉ Ｏ ７重鎮は、次の手順に従い分離するこ
とができる。
とができる。
５′末端においてブライミングするだめの同義性オリゴ
マーのヌクレオチド配列は、次のとおりである： ５’ ＡＣＧＴＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＧＡＣＡＴ
ＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡ ３’ＴＴＡ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ ハイライトの（肉太）のヌクレオチドは、処理した重鎮
の最初の５つのアミノ酸に相当する。上に線を引いたヌ
クレオチドは、キメラの配列決定および構成のために適
当なベクター中にスクリーニングするために使用しＩ：
，ＥｃｏＲＩお１びＮｒｕｌの制限部位に相当する。３
′末端においてプライミングするためのオリゴマーのヌ
クレオチド配列は、次のとおりである： ５゜ＴＡＣＴＡＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴ
ＧＣＴＧＣＡＣＣＡ ３’ハイライトの（肉太）のヌク
レオチドは、マウスカッパの定常領域の最初の５つのア
ミノ酸に相当する。上に線を引いたヌクレオチドは、キ
メラの配列決定および構成のために適当なベクター中に
スクリーニングするために使用した、ＨｉｎｄＩＩＩの
制限部位に相当する。
マーのヌクレオチド配列は、次のとおりである： ５’ ＡＣＧＴＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＣＧＡＣＡＴ
ＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡ ３’ＴＴＡ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ ハイライトの（肉太）のヌクレオチドは、処理した重鎮
の最初の５つのアミノ酸に相当する。上に線を引いたヌ
クレオチドは、キメラの配列決定および構成のために適
当なベクター中にスクリーニングするために使用しＩ：
，ＥｃｏＲＩお１びＮｒｕｌの制限部位に相当する。３
′末端においてプライミングするためのオリゴマーのヌ
クレオチド配列は、次のとおりである： ５゜ＴＡＣＴＡＡＴＧＣＧＧＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴ
ＧＣＴＧＣＡＣＣＡ ３’ハイライトの（肉太）のヌク
レオチドは、マウスカッパの定常領域の最初の５つのア
ミノ酸に相当する。上に線を引いたヌクレオチドは、キ
メラの配列決定および構成のために適当なベクター中に
スクリーニングするために使用した、ＨｉｎｄＩＩＩの
制限部位に相当する。
ＰＣＨのための反応条件は、次のとおりである二９４℃
において９０分間予備インキユベーションする。次いで
、９４゜Ｃにお、いて１分、５５℃において２分、７２
℃において３分から成る２５サイクルで処理する。７２
℃においてｌＯ分間後インキユベーションする。等しい
体積のフェノール／クロロホルムｌ×、および等しい体
積のクロロホルムｌｘを添加する．２．５Ｘ体積の１０
０％のエタノールで沈澱させる。５％のポリア．クリル
アミドゲルで分画する。適当な大きさのＤＮＡ断片を含
有するゲル断片を分離する。ゲルスライスからＤＮＡを
電気泳動する。等しい体積の７ェノール／クロロホルム
ｌ×、および等しい体積のクロロホルムｌ×を添加する
。２．５Ｘｌ００％のエタノールを沈澱させる。制限エ
ンドヌクレアーゼ緩衝液中に再懸濁させ、そしてＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌとインキユベーションスル。
において９０分間予備インキユベーションする。次いで
、９４゜Ｃにお、いて１分、５５℃において２分、７２
℃において３分から成る２５サイクルで処理する。７２
℃においてｌＯ分間後インキユベーションする。等しい
体積のフェノール／クロロホルムｌ×、および等しい体
積のクロロホルムｌｘを添加する．２．５Ｘ体積の１０
０％のエタノールで沈澱させる。５％のポリア．クリル
アミドゲルで分画する。適当な大きさのＤＮＡ断片を含
有するゲル断片を分離する。ゲルスライスからＤＮＡを
電気泳動する。等しい体積の７ェノール／クロロホルム
ｌ×、および等しい体積のクロロホルムｌ×を添加する
。２．５Ｘｌ００％のエタノールを沈澱させる。制限エ
ンドヌクレアーゼ緩衝液中に再懸濁させ、そしてＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌとインキユベーションスル。
フェノール／クロロホルムおよびエタノールを前述のよ
うに添加する。ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌ Ｉ Ｉ切断し
たＭｌ３中に結合する。ある数の異なる透明なブラーク
を分離し、ヌクレオチド配列を決定し、そして前述の合
成オリゴヌクレオチドを使用する手順の同じように分析
する。
うに添加する。ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌ Ｉ Ｉ切断し
たＭｌ３中に結合する。ある数の異なる透明なブラーク
を分離し、ヌクレオチド配列を決定し、そして前述の合
成オリゴヌクレオチドを使用する手順の同じように分析
する。
ＡＨＴ Ｉ Ｏ ７重鎮キメラ抗体の構成ＡＨＴ Ｉ
Ｏ ７重鎮のｃｈｍは、次のようにして構成した： 出発ベクターは、次の修飾をもつｐＳＶ２ＧＰＴである
：ｐＳＶ２ＧＴＰ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨｌ断片（ｂ
ｐ２６３５−３３８６）を、Ｍｌ３ｍｐ １８ （ｂｐ
６２３ １−６９３５）から分離したＥｃｏＲＩ−Ｂｇ
ｌ Ｉ Ｉ断片と置換した。このベクターをｐＭＴＩ−
３０５０と呼び、ヒトカッパ一定領域遺伝子を含有する
２．８ｋｂのＥｃｏＲｌ断片を、平滑末端の断片として
、ｐＭＴＩ−３０５０のＭｌ３ポリリンカー中に充填し
たＳａＩＩ部位中にサブクローニングした。このベクタ
ーをｐＭＴＩ−３０５２と呼ぶ。
Ｏ ７重鎮のｃｈｍは、次のようにして構成した： 出発ベクターは、次の修飾をもつｐＳＶ２ＧＰＴである
：ｐＳＶ２ＧＴＰ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨｌ断片（ｂ
ｐ２６３５−３３８６）を、Ｍｌ３ｍｐ １８ （ｂｐ
６２３ １−６９３５）から分離したＥｃｏＲＩ−Ｂｇ
ｌ Ｉ Ｉ断片と置換した。このベクターをｐＭＴＩ−
３０５０と呼び、ヒトカッパ一定領域遺伝子を含有する
２．８ｋｂのＥｃｏＲｌ断片を、平滑末端の断片として
、ｐＭＴＩ−３０５０のＭｌ３ポリリンカー中に充填し
たＳａＩＩ部位中にサブクローニングした。このベクタ
ーをｐＭＴＩ−３０５２と呼ぶ。
ＡＨＴｌ０７重鎮キメラ遺伝子は、次の成分を使用して
構成した： Ｊ領域の最後の２０アミノ酸を除外した、すべての可変
領域の解読配列を含有するＡＨＴｌ０７重鎮ｃＤＮＡの
クローンからのＸｈｏＩ−Ａｃｅ■断片。この断片のＸ
ｈｏ１部位はクレノーを使用して充填した。ほぼ８ｋｂ
のＢａｍＨＩ−Ｃｌａｌ断片をＩ）ＭＴＩ−３０５２か
ら分離した。ＢａｍＨ１部位はＭｌ３ボリリンカー中に
存在し、ＣｌａＩ部位はヒトカッパ定常領域の解読配列
の開始から３７ｂｐ下流の部位特異的突然変異誘発によ
り導入された。この断片のＢａｍＨＩ部位をクレノーを
使用して充填した。２つのオーバーラッブする合成オリ
ゴヌクレオチドは、５゛末端にＡｃｃＩ部位および３′
末端においてオーバーハングするＣｌａＩに対して相補
的であるヌクレオチドを有し、そして可変領域の最後の
２０アミノ酸およびｐＭＴＩ−３０５２中のＣｌａｌ部
位までのヒトカッパ定常領域の最初の１３アミノ酸を含
有する。オリゴマーのヌクレオチド配列は、次のとおり
である： ５″ＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＣＧＴＧ
ＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧ
ＧＡ −３’ ＴＧＣＣＡＴＡＣＴＡＣＴＡＧＡＡＧＧ
ＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＴＣ
ＧＡＣＣＴ−ＡＧＴＣＡＧＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴ
ＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣ
ＣＡＴＣ ３’ＴＣＡＧＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＣＧ
ＡＣＧＴＧＧＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＧＧＧＣ
Ｇ（；ＴＡＧＧＣ ５’合成オリゴヌクレオチドをまず
互いにアニリールし、次いですべての成分を結合反応に
添加した。
構成した： Ｊ領域の最後の２０アミノ酸を除外した、すべての可変
領域の解読配列を含有するＡＨＴｌ０７重鎮ｃＤＮＡの
クローンからのＸｈｏＩ−Ａｃｅ■断片。この断片のＸ
ｈｏ１部位はクレノーを使用して充填した。ほぼ８ｋｂ
のＢａｍＨＩ−Ｃｌａｌ断片をＩ）ＭＴＩ−３０５２か
ら分離した。ＢａｍＨ１部位はＭｌ３ボリリンカー中に
存在し、ＣｌａＩ部位はヒトカッパ定常領域の解読配列
の開始から３７ｂｐ下流の部位特異的突然変異誘発によ
り導入された。この断片のＢａｍＨＩ部位をクレノーを
使用して充填した。２つのオーバーラッブする合成オリ
ゴヌクレオチドは、５゛末端にＡｃｃＩ部位および３′
末端においてオーバーハングするＣｌａＩに対して相補
的であるヌクレオチドを有し、そして可変領域の最後の
２０アミノ酸およびｐＭＴＩ−３０５２中のＣｌａｌ部
位までのヒトカッパ定常領域の最初の１３アミノ酸を含
有する。オリゴマーのヌクレオチド配列は、次のとおり
である： ５″ＣＴＡＣＧＧＴＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＣＧＴＧ
ＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧ
ＧＡ −３’ ＴＧＣＣＡＴＡＣＴＡＣＴＡＧＡＡＧＧ
ＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＴＣ
ＧＡＣＣＴ−ＡＧＴＣＡＧＡＣＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴ
ＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣ
ＣＡＴＣ ３’ＴＣＡＧＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＣＧ
ＡＣＧＴＧＧＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＡＧＡＡＧＧＧＣ
Ｇ（；ＴＡＧＧＣ ５’合成オリゴヌクレオチドをまず
互いにアニリールし、次いですべての成分を結合反応に
添加した。
すべての成分を含有するクローンを放射性プローブへの
ハイブリダイゼーションにより分離した。
ハイブリダイゼーションにより分離した。
陽性のクローンをさらにサザン分析およびジデオキシ配
列決定により特性決定した。正しい立体配置ですべての
成分を含有する１つのクローンをそれ以上の研究のため
に選択し、そしてそれをｐＭＴＩ−３０５６と呼ぶ。
列決定により特性決定した。正しい立体配置ですべての
成分を含有する１つのクローンをそれ以上の研究のため
に選択し、そしてそれをｐＭＴＩ−３０５６と呼ぶ。
晴乳動物細胞中でｐＭＴＩ−３０５６を発現するために
、種々のプロモーターおよびエンハンサーの組み合わせ
をベクターに添加した。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）
を含有する６００ｂｐのＮｄｅｌ−ＨｉｎｄｌｌＩ制限
断片をクレノーで充填して、平滑末端を生成し、モして
ｐＭＴＩ−３０５６のＭｌ３ポリリンカー中のＳｍａ
１部位中にスクリー二冫グした。生ずるベクターをｐＭ
Ｔ１−３］０５と呼ぶ。サイトメガロウイルスの直ぐの
早期エンハンサ−およびＨＩＶ ＬＴＲを含有する８
５０ｂｐのＭｌｕｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片をクレノ
ーで充填して、平滑末端を生成し、そしてｐＭＴＩ−３
０５６のＭ１３ポリリンカー・゛電中のＳＭＡ Ｉ部
位中にスクリーニングした。生ずるベクターをｐＭＴＩ
−３０５７と呼ぶ。第５Ｂ図は、重鎮キメラのための発
現ベクターを示す。
、種々のプロモーターおよびエンハンサーの組み合わせ
をベクターに添加した。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）
を含有する６００ｂｐのＮｄｅｌ−ＨｉｎｄｌｌＩ制限
断片をクレノーで充填して、平滑末端を生成し、モして
ｐＭＴＩ−３０５６のＭｌ３ポリリンカー中のＳｍａ
１部位中にスクリー二冫グした。生ずるベクターをｐＭ
Ｔ１−３］０５と呼ぶ。サイトメガロウイルスの直ぐの
早期エンハンサ−およびＨＩＶ ＬＴＲを含有する８
５０ｂｐのＭｌｕｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限断片をクレノ
ーで充填して、平滑末端を生成し、そしてｐＭＴＩ−３
０５６のＭ１３ポリリンカー・゛電中のＳＭＡ Ｉ部
位中にスクリーニングした。生ずるベクターをｐＭＴＩ
−３０５７と呼ぶ。第５Ｂ図は、重鎮キメラのための発
現ベクターを示す。
キメラＡＨＴ Ｉ Ｏ ７重鎮遺伝子の発現３つのキメ
ラＡＨＴ Ｉ Ｏ ７重鎮ベクター ｐＭＴｌ−３１０
５およびｐＭＴＩ−３０５７の発現のレベルを、ＣＯＳ
細胞中の一時的発現アッセイにおレ）で分析しｔ；。（
データは示されていない）。
ラＡＨＴ Ｉ Ｏ ７重鎮ベクター ｐＭＴｌ−３１０
５およびｐＭＴＩ−３０５７の発現のレベルを、ＣＯＳ
細胞中の一時的発現アッセイにおレ）で分析しｔ；。（
データは示されていない）。
キメラＡＨＴ Ｉ Ｏ ７抗体を産土する安定な細胞系
の分離 ＡＨＴ！鎖および重鎮のベクターの発現後、構成を一時
的発現ベクターにおいて確証し、次いでベクターを安定
な細胞系の分離のために使用した。
の分離 ＡＨＴ！鎖および重鎮のベクターの発現後、構成を一時
的発現ベクターにおいて確証し、次いでベクターを安定
な細胞系の分離のために使用した。
次の手順を重鎮および重鎮の両者のために利用する。ベ
クター（各々１０μｇ）をプラスミドの非必須部分にお
ける制限消化により直線化した。直線化したベクターの
ＤＮＡを組み合わせ、モして０−５ｍｌ２の体積のリン
酸塩緩衝液中のＡＨＴ １０′細胞に添加した。非直線
化ベクターを、また、ＩＯμｇのＤＮＡ／ＡＨＴｌ Ｏ
’細胞／．５ｍｆｆの濃度で使用した。この混合物を遺
伝子バルサークペット（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ
Ｃｕｖｅｔｔｅ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，カル７才ルニア州リットモンド）に移し、
氷上に１０分間配置し、そして電気衝撃を与えた。
クター（各々１０μｇ）をプラスミドの非必須部分にお
ける制限消化により直線化した。直線化したベクターの
ＤＮＡを組み合わせ、モして０−５ｍｌ２の体積のリン
酸塩緩衝液中のＡＨＴ １０′細胞に添加した。非直線
化ベクターを、また、ＩＯμｇのＤＮＡ／ＡＨＴｌ Ｏ
’細胞／．５ｍｆｆの濃度で使用した。この混合物を遺
伝子バルサークペット（Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ
Ｃｕｖｅｔｔｅ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，カル７才ルニア州リットモンド）に移し、
氷上に１０分間配置し、そして電気衝撃を与えた。
氷上でｌＯ分間インキユベーションした後、細胞を生存
能力についてアッセイし、そして培地中に再懸濁し、そ
して５ＸＩＯ’細胞／ ｍ Ｑの濃度で平板培養した。
能力についてアッセイし、そして培地中に再懸濁し、そ
して５ＸＩＯ’細胞／ ｍ Ｑの濃度で平板培養した。
４８時間インキユベーションした後、適当な薬物を補充
した新鮮な培地を添加した。
した新鮮な培地を添加した。
３〜４週間後、薬物抵抗性クローンからの上澄み液をキ
メラ重鎮および重鎮の存在についてＥＬＩＳＡによりス
クリーニングした。次いで、両者の抗体鎖の存在につい
て陽性である培養物の上澄み液を、ＰＭＡ刺激Ｔ−リン
パ球に特異的に結合する能力についてアッセイした。次
いで、陽性の培養物を制限希釈によりクローニングした
。
メラ重鎮および重鎮の存在についてＥＬＩＳＡによりス
クリーニングした。次いで、両者の抗体鎖の存在につい
て陽性である培養物の上澄み液を、ＰＭＡ刺激Ｔ−リン
パ球に特異的に結合する能力についてアッセイした。次
いで、陽性の培養物を制限希釈によりクローニングした
。
ＴＮＦに対するキメラモノクローナル抗体ＴＮＦキメラ
抗体は、インターリューキンー２受容体のキメラ抗体の
構成に使用したのと同一の手順およびベクターを使用し
てつくることができる。合成オリゴヌクレオチドプロー
ブを使用する、メッセンジャーＲＮＡの分離、Ｃ Ｄ
Ｎ Ａ合成、ラムダＧＴＩＯライブラリーおよびＴＮＦ
重鎮および重鎮ｃＤＮＡクローンの分離は、すべて前述
したよう通りである。重鎮および重鎮の抗ＴＮＦ抗体の
可変領域のヌクレオチド配列の決定後、可変領域中の便
利な制限部位から前に記載した発現ベクターのヒト定常
領域中の独特制限部位までに及ぶ、オーバーラップする
合成オリゴヌクレオチドリン力一を使用してキメラをつ
くる。ポリメラーゼ連鎖反応により抗ＴＮＦ抗体の可変
領域のｃＤＮＡを分離するために、まず抗体の重鎮およ
び重鎮のＮ末端アミノ酸配列を決定する。次いで、処理
したタンパク質の最初の数個のアミノ酸に相当する、同
義性オリゴマーを合成する。オリゴマーは、スクリーニ
ングおよびキメラの構成のための適当な制限部位を有す
るべきである。３″末端におけるグライミングのための
オリゴマーおよびＰＣＲプロトコルは、ＡＨＴｌ０７抗
体について前述した通りである。
抗体は、インターリューキンー２受容体のキメラ抗体の
構成に使用したのと同一の手順およびベクターを使用し
てつくることができる。合成オリゴヌクレオチドプロー
ブを使用する、メッセンジャーＲＮＡの分離、Ｃ Ｄ
Ｎ Ａ合成、ラムダＧＴＩＯライブラリーおよびＴＮＦ
重鎮および重鎮ｃＤＮＡクローンの分離は、すべて前述
したよう通りである。重鎮および重鎮の抗ＴＮＦ抗体の
可変領域のヌクレオチド配列の決定後、可変領域中の便
利な制限部位から前に記載した発現ベクターのヒト定常
領域中の独特制限部位までに及ぶ、オーバーラップする
合成オリゴヌクレオチドリン力一を使用してキメラをつ
くる。ポリメラーゼ連鎖反応により抗ＴＮＦ抗体の可変
領域のｃＤＮＡを分離するために、まず抗体の重鎮およ
び重鎮のＮ末端アミノ酸配列を決定する。次いで、処理
したタンパク質の最初の数個のアミノ酸に相当する、同
義性オリゴマーを合成する。オリゴマーは、スクリーニ
ングおよびキメラの構成のための適当な制限部位を有す
るべきである。３″末端におけるグライミングのための
オリゴマーおよびＰＣＲプロトコルは、ＡＨＴｌ０７抗
体について前述した通りである。
緩衝液
ＬＳＴ
０．０２モルのトリス、ｐＨ７．５
０．ＯｌモルのＮａＣ １
３ミリモルのＭｇＣ １，
４ ＸＴＮＬＢ
５％スクロース
１．２％のトリトンＸ−１００
ＡＣＥ
０．０５モルのＮａＣ １
０．０１モルの酢酸ナトリウムｐＨ５．１３ミリモルの
ＥＤＴＡ ＡＣＥ／７エノール １００ｍ（２の７エノールに添加した３０ｍαのＡＣＥ
緩衝液 ＴＢＥ ０．０８９モルのトリスーホウ酸塩 ０．０８９モルのホウ酸 ０．００８モルのＥＤＴＡ ＴＳ緩衝液 溶液１（２＋２）： １６．０ｇのＮａＣ １ ０．７６ｇのＫＣＩ ０．２０ｇのＮａ，Ｐ０． ６．０ｇのトリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）塩基ＨＣＩでｐＨ
７．４〜７．５に調節する。９５ｍＱをびん中に分布す
る。
ＥＤＴＡ ＡＣＥ／７エノール １００ｍ（２の７エノールに添加した３０ｍαのＡＣＥ
緩衝液 ＴＢＥ ０．０８９モルのトリスーホウ酸塩 ０．０８９モルのホウ酸 ０．００８モルのＥＤＴＡ ＴＳ緩衝液 溶液１（２＋２）： １６．０ｇのＮａＣ １ ０．７６ｇのＫＣＩ ０．２０ｇのＮａ，Ｐ０． ６．０ｇのトリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）塩基ＨＣＩでｐＨ
７．４〜７．５に調節する。９５ｍＱをびん中に分布す
る。
溶液２（２００ｍｌ２）：
０．４ｇのＭｇＣ＋．
０．４ｇのＣａＣＩ２
溶液ｌおよび２を２０分間オートクレープ処理する。冷
却する。溶液２を溶液１の９５ｍαのびんの各々に添加
する。室温において貯蔵する。
却する。溶液２を溶液１の９５ｍαのびんの各々に添加
する。室温において貯蔵する。
ＲＩＰＡ溶菌緩衝液
１．０％のノニオデット（Ｎｏｎ ｉ ｏｄｅ ｔ）５
０ミリモルのトリスｐＨ８．０ ＣＨＯ細胞系中のインターリューキンー２受容体に対す
るキメラ抗体の発現レベルは、ＨＩＶＴＡＴ遺伝子を重
鎮および重鎮のキメラ抗体ためのベクターを含有する現
存する細胞系中にトランスフエクションすることによっ
て、大きく、すなわち、１０倍増加することができる。
０ミリモルのトリスｐＨ８．０ ＣＨＯ細胞系中のインターリューキンー２受容体に対す
るキメラ抗体の発現レベルは、ＨＩＶＴＡＴ遺伝子を重
鎮および重鎮のキメラ抗体ためのベクターを含有する現
存する細胞系中にトランスフエクションすることによっ
て、大きく、すなわち、１０倍増加することができる。
ＴＡＴ遺伝子がプロモーターの転写調節下にあるように
，金属チオネインプロモーターと組み合わせたＨＩＶＴ
ＡＴは、現存する細胞系中に導入するか、あるいはキメ
ラの重鎮または重鎮のためのエンコード配列を含有する
少なくとも１つのベクター中に組み込むことができるこ
とが認識される。金属チオネインプロモーターの転写調
節下にＨＩＶ ＴＡＴ遺伝子を含有する別のベクター
を発生するという利点は、ベクターをインターリューキ
ン−２受容体以外の抗キメラ抗体を産土する細胞系にお
ける発現のレベルを増加するｔ；めの「試薬」のベクタ
ーとして使用できるということである。
，金属チオネインプロモーターと組み合わせたＨＩＶＴ
ＡＴは、現存する細胞系中に導入するか、あるいはキメ
ラの重鎮または重鎮のためのエンコード配列を含有する
少なくとも１つのベクター中に組み込むことができるこ
とが認識される。金属チオネインプロモーターの転写調
節下にＨＩＶ ＴＡＴ遺伝子を含有する別のベクター
を発生するという利点は、ベクターをインターリューキ
ン−２受容体以外の抗キメラ抗体を産土する細胞系にお
ける発現のレベルを増加するｔ；めの「試薬」のベクタ
ーとして使用できるということである。
第６図の発現ベクターを使用すると、キメラ抗体の発現
は、ＨＩＶ ＴＡＴ遺伝子のトランス７エクション後
分離された、安定なトランス７エクション体において大
きく、すなわち、ｌＯ倍増加することができる。ＨＩＶ
ＴＡＴ遺伝子、すなわち、ＨＩＶ遺伝子の発現を活
性化するトランスー作用因子は、アリア（Ａｒｙａ）ら
、ｌ９８５、ヒトＴ−リンパ栄養のウイルスＩ Ｉ Ｉ
（ＨＩＬＶ−ＩＩＴ）のトランスーアクチベイター遺
伝子（Ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｇｅｎｅ
ｏｆＨｕｍａｎ Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ
Ｖｉｒｕｓ ＩＩＩ（ＨＩＬＶ−ＩＩＩ））により
局在化された。 発現ベクター ｐＭＴＴＩ−３０２３
は、金属チオネインプロモーターの転写調節下にＴＡＴ
遺伝子、およびＳＶ４０プロモーターの転写調節下にＧ
ＰＴ抵抗性マーカーを含有するように構成した、第６図
参照。他の薬物抵抗性マーカーを利用できることが認め
られる。ベクターヲエレクトロポレイション（ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により、前述のもとのＡＨＴ
Ｉ０７キメラ抗体産生細胞系中にトランスフエクション
し、そしてマイクフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌ
ｉｃ ａｃｉｄ）抵抗性細胞系を分離した。実験結果
は、翻訳されたＴＡＴタンパク質をキメラ抗体の転写の
原因であるＨＩＶプロモーターをトランス活性化するで
あろうことが実証された。最高量のキメラ抗体を産生ず
ることがわかった細胞系をクロー二冫グした。最高のレ
ベルのＡＨＴ Ｉ Ｏ ７キメラ抗体を産土する安定な
細胞系は、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０２９８として受託さ
れた。
は、ＨＩＶ ＴＡＴ遺伝子のトランス７エクション後
分離された、安定なトランス７エクション体において大
きく、すなわち、ｌＯ倍増加することができる。ＨＩＶ
ＴＡＴ遺伝子、すなわち、ＨＩＶ遺伝子の発現を活
性化するトランスー作用因子は、アリア（Ａｒｙａ）ら
、ｌ９８５、ヒトＴ−リンパ栄養のウイルスＩ Ｉ Ｉ
（ＨＩＬＶ−ＩＩＴ）のトランスーアクチベイター遺
伝子（Ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｇｅｎｅ
ｏｆＨｕｍａｎ Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ
Ｖｉｒｕｓ ＩＩＩ（ＨＩＬＶ−ＩＩＩ））により
局在化された。 発現ベクター ｐＭＴＴＩ−３０２３
は、金属チオネインプロモーターの転写調節下にＴＡＴ
遺伝子、およびＳＶ４０プロモーターの転写調節下にＧ
ＰＴ抵抗性マーカーを含有するように構成した、第６図
参照。他の薬物抵抗性マーカーを利用できることが認め
られる。ベクターヲエレクトロポレイション（ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により、前述のもとのＡＨＴ
Ｉ０７キメラ抗体産生細胞系中にトランスフエクション
し、そしてマイクフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌ
ｉｃ ａｃｉｄ）抵抗性細胞系を分離した。実験結果
は、翻訳されたＴＡＴタンパク質をキメラ抗体の転写の
原因であるＨＩＶプロモーターをトランス活性化するで
あろうことが実証された。最高量のキメラ抗体を産生ず
ることがわかった細胞系をクロー二冫グした。最高のレ
ベルのＡＨＴ Ｉ Ｏ ７キメラ抗体を産土する安定な
細胞系は、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０２９８として受託さ
れた。
本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。
ｌ１ヒト免疫グロブリンの重鎮および／または重鎮の定
常領域からなるキメラモノクローナル抗体を産土するた
めの宿主細胞をトランスフェクションするための発現ベ
クターであって、前記発現ベクターは、突然変異誘発な
しで、ヒト以外の抗体の可変領域の挿入のために適合す
ることができ、こうして生ずる発現ベクターは、全体の
ヒト定常領域および全体のヒト以外の可変領域を含み、
前記可変領域は、通常免疫グロブリンゲノムＤＮＡに関
連する組織特異的プロモーターおよび／またはエンハン
サー領域を欠くことを特徴とする発現ベクター ２、前記ヒト定常領域の上流にプロモーターをさらに含
み、前記プロモーターは、前記ベクターに対しておよび
前記可変領域に対して独特である、少なくとも［つの制
限部位を含有するボリリンカ一により、前記定常領域に
結合している、上記第ｌ項記載の発現ベクター ３、挿入すべき前記可変領域は合成オリゴヌクレオチド
のリンカーを含み、こうして前記可変領域および前記リ
ンカーがプロモーターおよび定常領域の間に挿入される
とき、生ずるベクターはインフレームで融合した全体の
定常領域および全体のヒト以外の可変領域を含む、上記
第１または２項記載の発現ベクター ４、前記合成オリゴヌクレオチドリンカーは前記可変領
域に融合している、上記第３項記載の発現ベクター ５、前記合成オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖
反応のプライマーに結合しており、そして増幅した可変
領域に組み込まれるようになる、上記第３まｔ；は４項
記載の発現ベクター６、前記制限部位はｍ１３ＭＰ７ポ
リリン力一を含む、上記第２〜５項のいずれかに記載の
発現ベクター ７、前記ヒト定常領域は導入された制限部位を含み、前
記制限部位は前記ヒト定常領域および前記可変領域を含
む前記ベクターに対して独特である、上記第１〜６項の
いずれかに記載の発現ベクター ８、前記制限部位はＣｌａｌである、上記第７項記載の
発現ベクター ９、第５Ａｆ図に示されている発現ベクター１０Ｓ第５
Ｂ図に示されている発現ベクター１１，宿主細胞系中に
トランスフェクシミンされた、上記第１−１ ０項のい
ずれかに記載の発現ベクター Ｉ２、前記宿主細胞はリンパ球および非リンパ球の細胞
系から選択される、上記第１１項記載の発現ベクター ｌ３、工程： （ａ）上記第１項記載の発現ベクターを調製し、（ｂ）
永久分裂能を与えた啼乳動物細胞系を工程（ａ）の前記
ベクターで形質転換し、そして（ｃ）前記形質転換され
た細胞を培養してキメラ抗体を産生ずる、 からなることを特徴とする、リンパ球および非リンパ球
の細胞系中でキメラモノクローナル抗体ヲ産生する方法
。
常領域からなるキメラモノクローナル抗体を産土するた
めの宿主細胞をトランスフェクションするための発現ベ
クターであって、前記発現ベクターは、突然変異誘発な
しで、ヒト以外の抗体の可変領域の挿入のために適合す
ることができ、こうして生ずる発現ベクターは、全体の
ヒト定常領域および全体のヒト以外の可変領域を含み、
前記可変領域は、通常免疫グロブリンゲノムＤＮＡに関
連する組織特異的プロモーターおよび／またはエンハン
サー領域を欠くことを特徴とする発現ベクター ２、前記ヒト定常領域の上流にプロモーターをさらに含
み、前記プロモーターは、前記ベクターに対しておよび
前記可変領域に対して独特である、少なくとも［つの制
限部位を含有するボリリンカ一により、前記定常領域に
結合している、上記第ｌ項記載の発現ベクター ３、挿入すべき前記可変領域は合成オリゴヌクレオチド
のリンカーを含み、こうして前記可変領域および前記リ
ンカーがプロモーターおよび定常領域の間に挿入される
とき、生ずるベクターはインフレームで融合した全体の
定常領域および全体のヒト以外の可変領域を含む、上記
第１または２項記載の発現ベクター ４、前記合成オリゴヌクレオチドリンカーは前記可変領
域に融合している、上記第３項記載の発現ベクター ５、前記合成オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖
反応のプライマーに結合しており、そして増幅した可変
領域に組み込まれるようになる、上記第３まｔ；は４項
記載の発現ベクター６、前記制限部位はｍ１３ＭＰ７ポ
リリン力一を含む、上記第２〜５項のいずれかに記載の
発現ベクター ７、前記ヒト定常領域は導入された制限部位を含み、前
記制限部位は前記ヒト定常領域および前記可変領域を含
む前記ベクターに対して独特である、上記第１〜６項の
いずれかに記載の発現ベクター ８、前記制限部位はＣｌａｌである、上記第７項記載の
発現ベクター ９、第５Ａｆ図に示されている発現ベクター１０Ｓ第５
Ｂ図に示されている発現ベクター１１，宿主細胞系中に
トランスフェクシミンされた、上記第１−１ ０項のい
ずれかに記載の発現ベクター Ｉ２、前記宿主細胞はリンパ球および非リンパ球の細胞
系から選択される、上記第１１項記載の発現ベクター ｌ３、工程： （ａ）上記第１項記載の発現ベクターを調製し、（ｂ）
永久分裂能を与えた啼乳動物細胞系を工程（ａ）の前記
ベクターで形質転換し、そして（ｃ）前記形質転換され
た細胞を培養してキメラ抗体を産生ずる、 からなることを特徴とする、リンパ球および非リンパ球
の細胞系中でキメラモノクローナル抗体ヲ産生する方法
。
１４、キメラモノクローナル抗体ＡＨＴ Ｉ ０ ７産
生することができる、ＡＴＣＣ ＣＲＬＩＯＯ３０で
あるハイブリドーマ細胞。
生することができる、ＡＴＣＣ ＣＲＬＩＯＯ３０で
あるハイブリドーマ細胞。
１５、キメラモノクローナル抗体ＡＨＴ ｌ ０ ７産
生することができる、ＡＴＣＣ ＣＲＬｌ０２９８で
あるハイブリドーマ細胞。
生することができる、ＡＴＣＣ ＣＲＬｌ０２９８で
あるハイブリドーマ細胞。
ｌ６、上記第１−１０項のいずれかに記載のベクターで
形質転換された宿主細胞系。
形質転換された宿主細胞系。
第１図は、ＡＨＴ Ｉ Ｏ ７重鎮の可変領域のヌクレ
オチド配列およびアミノ酸配列である。 第２囚は、ＡＨＴ５４重鎮の可変領域のヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列である。 第３囚は、ＡＨＴ １ ０ ７重鎮の可変領域のヌクレ
才チド配列およびアミノ酸配列である。 １４図は、ＡＨＴ５４重鎮の可変領域のヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列である。 第５図は、金属チオネイングロモーターの転写調節下に
ＴＡＴ遺伝子、およびＳＶ４Ｑプロモーターの転写調節
下にＧＰＴ薬物抵抗性を含有する発現ベクター（ｐＭＴ
Ｉ−３ ０ ２ ３）の線図的表示である。 ＭＧＷ”ｊＣＩ ｆＬＦＬＡＡＴＡＴＳＶＨＳＱＶＱＬＱＱＳ特許出願人
モレキュラー・セラビューティクス・インコーボレー
テッド Ｇ ｐ ε ＶＶＲＰＧＶＳＶＫＩＳＣ κ
ａｓａｖＴＦＴｎＹＡＬＨＷ（７ＫＯＳ｝ＩＡＫ！
ｉｉＬＥＷＺＧＺ ＩＳＳＹＮＧＤＴＳＹＮＤＲＦＫ
ＧＫ八 Ｔ Ｎ Ｔ Ｖ’Ｏ Ｋ ５ Ｓ
５ Ｔ Ａ Ｙ ｌ’ｌ Ｅ Ｌ
Ａ Ｒ Ｌ ＴＳ ε ＤＳＡＩＹＹＣＡＡＧＳ
ＮＬＤＹＷＧＯＦＩＧ．１ ｃｔｃヒｇａｇｇｃｅａｇｅｃセ９９ａａ ｔｌ：９ａ
ｊｔｃｃａ９ｔ ｔｅｃ ｔｅａ ９ａＣ ｔ ｔｃ
ａｑ ｅ９ａ Ｃ９ａ ９ＣａＣ ｔｇａ ａｃｇａｇ
ａｇｃｔｃｃｇｇｔｃａｇａｃｃｔｅａａｃｔａａｇｇ
ｔｃａａｇｇａｇセＣセｇａａｇｅｃａｃｅａｃｅｃｇ
セｇａｃｔｔ９民，一哀 ｅｔｃセｅｔｃｇａｇｔｃａｇｃａｔｇｇｇｃａセｃａ
ａｇａ仁９９ａ９セＣａＣａｑａＣセｃａｇｇｔｃｔｔ
七９員セａｃａ仁９ａａｇａｇａｇｃｔｃａｇｔｃｇｌ
−ａｃｃｅｇｔａｇｔｔｃｔａｃｃセｃａｇｔｇ虹ｃｔ
ｇａｇｔｃｃａｇａａａｃａｔａｔｇヒａＣ￥ ＦＩＧ．４ ｇ ｌａ ｔ ｔｃｓ ｒ ＩＣｇ ｔ ｔｃｔｃ’ｉ
’ｃ９１９９ａ９ ＴｈＣ９ｔ ｔｇ ｔａｇ Ａａ
３ ”．９１９ＡＣＣ９ ｔｃ ｔａ ｔｔｃｘｇ ｔ
ｔｃｃ ｔ９９Ｃ ｔｔａａｇ ｔａ ｔｇｃａ３９ａ
ｇａｇｃ ｔｅｃｔｃｔ９（ｉ ａｃ３ｔｅｔｔｔａｃ
ｔｃ ｔｇｇｅ為ｇａｔａａｇｔｅｉａｇｇａｃｅＭ
ｎ ９ Ｓ Ｉ Ｏ Ｆ Ｌ ＧＱ Ｑ Ｑ Ｆ．！ Ｑ ６ ．１） Ｊｔ ．Ｌ 』 Ｑ ε 図面のｄ：書・１内容に変更なし） ＦＩＧ．６ 図面の浄書（内容に変更なし） Ｂ ＦＩＧ．５ 手続補正書（放） 平成２年５月２４日 特許庁長官 吉 田 文 毅 殿 １，事件の表示 平成２年特許願第１４７４３号 ２．発明の名称 キメラモノクローナル抗体の産生のための発現系３．補
正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 モレキュラー・セラビューティクス・インコ
ーボレーテツド ４．代 理 人 〒１０７ ７１細書の「図面の簡単な説明」の欄の第５３頁の第１
行〜第５行を削除し、代りに下記文章を挿入する． ｒ 第５図は、キメラ抗体発現ベクターの線図的表示で
ある． 第６図は、金属チオネインプロモーターの転写調節下に
ＴＡＴ遺伝子、およびＳＶ４０プロモーターの転写調節
下にＧＰＴ薬物抵抗性を含有する発現ベクター（ｐＭＴ
Ｉ−３０２３）の線区的表示である．
１以上
オチド配列およびアミノ酸配列である。 第２囚は、ＡＨＴ５４重鎮の可変領域のヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列である。 第３囚は、ＡＨＴ １ ０ ７重鎮の可変領域のヌクレ
才チド配列およびアミノ酸配列である。 １４図は、ＡＨＴ５４重鎮の可変領域のヌクレオチド配
列およびアミノ酸配列である。 第５図は、金属チオネイングロモーターの転写調節下に
ＴＡＴ遺伝子、およびＳＶ４Ｑプロモーターの転写調節
下にＧＰＴ薬物抵抗性を含有する発現ベクター（ｐＭＴ
Ｉ−３ ０ ２ ３）の線図的表示である。 ＭＧＷ”ｊＣＩ ｆＬＦＬＡＡＴＡＴＳＶＨＳＱＶＱＬＱＱＳ特許出願人
モレキュラー・セラビューティクス・インコーボレー
テッド Ｇ ｐ ε ＶＶＲＰＧＶＳＶＫＩＳＣ κ
ａｓａｖＴＦＴｎＹＡＬＨＷ（７ＫＯＳ｝ＩＡＫ！
ｉｉＬＥＷＺＧＺ ＩＳＳＹＮＧＤＴＳＹＮＤＲＦＫ
ＧＫ八 Ｔ Ｎ Ｔ Ｖ’Ｏ Ｋ ５ Ｓ
５ Ｔ Ａ Ｙ ｌ’ｌ Ｅ Ｌ
Ａ Ｒ Ｌ ＴＳ ε ＤＳＡＩＹＹＣＡＡＧＳ
ＮＬＤＹＷＧＯＦＩＧ．１ ｃｔｃヒｇａｇｇｃｅａｇｅｃセ９９ａａ ｔｌ：９ａ
ｊｔｃｃａ９ｔ ｔｅｃ ｔｅａ ９ａＣ ｔ ｔｃ
ａｑ ｅ９ａ Ｃ９ａ ９ＣａＣ ｔｇａ ａｃｇａｇ
ａｇｃｔｃｃｇｇｔｃａｇａｃｃｔｅａａｃｔａａｇｇ
ｔｃａａｇｇａｇセＣセｇａａｇｅｃａｃｅａｃｅｃｇ
セｇａｃｔｔ９民，一哀 ｅｔｃセｅｔｃｇａｇｔｃａｇｃａｔｇｇｇｃａセｃａ
ａｇａ仁９９ａ９セＣａＣａｑａＣセｃａｇｇｔｃｔｔ
七９員セａｃａ仁９ａａｇａｇａｇｃｔｃａｇｔｃｇｌ
−ａｃｃｅｇｔａｇｔｔｃｔａｃｃセｃａｇｔｇ虹ｃｔ
ｇａｇｔｃｃａｇａａａｃａｔａｔｇヒａＣ￥ ＦＩＧ．４ ｇ ｌａ ｔ ｔｃｓ ｒ ＩＣｇ ｔ ｔｃｔｃ’ｉ
’ｃ９１９９ａ９ ＴｈＣ９ｔ ｔｇ ｔａｇ Ａａ
３ ”．９１９ＡＣＣ９ ｔｃ ｔａ ｔｔｃｘｇ ｔ
ｔｃｃ ｔ９９Ｃ ｔｔａａｇ ｔａ ｔｇｃａ３９ａ
ｇａｇｃ ｔｅｃｔｃｔ９（ｉ ａｃ３ｔｅｔｔｔａｃ
ｔｃ ｔｇｇｅ為ｇａｔａａｇｔｅｉａｇｇａｃｅＭ
ｎ ９ Ｓ Ｉ Ｏ Ｆ Ｌ ＧＱ Ｑ Ｑ Ｆ．！ Ｑ ６ ．１） Ｊｔ ．Ｌ 』 Ｑ ε 図面のｄ：書・１内容に変更なし） ＦＩＧ．６ 図面の浄書（内容に変更なし） Ｂ ＦＩＧ．５ 手続補正書（放） 平成２年５月２４日 特許庁長官 吉 田 文 毅 殿 １，事件の表示 平成２年特許願第１４７４３号 ２．発明の名称 キメラモノクローナル抗体の産生のための発現系３．補
正をする者 事件との関係 特許出願人 名 称 モレキュラー・セラビューティクス・インコ
ーボレーテツド ４．代 理 人 〒１０７ ７１細書の「図面の簡単な説明」の欄の第５３頁の第１
行〜第５行を削除し、代りに下記文章を挿入する． ｒ 第５図は、キメラ抗体発現ベクターの線図的表示で
ある． 第６図は、金属チオネインプロモーターの転写調節下に
ＴＡＴ遺伝子、およびＳＶ４０プロモーターの転写調節
下にＧＰＴ薬物抵抗性を含有する発現ベクター（ｐＭＴ
Ｉ−３０２３）の線区的表示である．
１以上
Claims (1)
- １、ヒト免疫グロブリンの重鎮および／または重鎮の定
常領域からなるキメラモノクローナル抗体を産生するた
めの宿主細胞をトランスフェクションするための発現ベ
クターであって、前記発現ベクターは、突然変異誘発な
しで、ヒト以外の抗体の可変領域の挿入のために適合す
ることができ、こうして生ずる発現ベクターは、全体の
ヒト定常領域および全体のヒト以外の可変領域を含み、
前記可変領域は、通常免疫グロブリンゲノムＤＮＡに関
連する組織特異的プロモーターおよび／またはエンハン
サー領域を欠くことを特徴とする発現ベクター。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30121689A | 1989-01-24 | 1989-01-24 | |
| US44170289A | 1989-12-04 | 1989-12-04 | |
| US441702 | 1989-12-04 | ||
| US301216 | 2002-11-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02295487A true JPH02295487A (ja) | 1990-12-06 |
Family
ID=26972226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014743A Pending JPH02295487A (ja) | 1989-01-24 | 1990-01-24 | キメラモノクローナル抗体の産生のための発現系 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0380068B1 (ja) |
| JP (1) | JPH02295487A (ja) |
| AT (1) | ATE81153T1 (ja) |
| AU (1) | AU641907B2 (ja) |
| CA (1) | CA2008259A1 (ja) |
| DE (1) | DE69000338T2 (ja) |
| DK (1) | DK0380068T3 (ja) |
| ES (1) | ES2052077T3 (ja) |
| FI (1) | FI900332A0 (ja) |
| IL (1) | IL93118A0 (ja) |
| NZ (1) | NZ232201A (ja) |
| PT (1) | PT92900A (ja) |
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