JPH05502384A

JPH05502384A - 抗体の調製

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Publication number: JPH05502384A
Application number: JP3516117A
Authority: JP
Inventors: ゴーマン，スコット・デービッド; ルートレッジ，エドワード・グラハム; ワルドマン，ハーマン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-10-05
Filing date: 1991-10-04
Publication date: 1993-04-28
Anticipated expiration: 2015-08-28
Also published as: EP0504350B1; CA2070659A1; DE69129896D1; DE69129896T2; AU651623B2; EP0504350A1; ATE169058T1; JP3081641B2; GB9121126D0; AU8546891A; CA2070659C; ZA917960B; ES2121788T3; GB2249310A; GB9021679D0; NZ240080A; KR927003816A; GB2249310B; KR100245564B1; WO1992006193A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】抗体の調製本発明は抗体、特にヒトＴ細胞の表面にあるＣＤ３抗原に対して作用する改変された抗体に関するものである。

抗体、即ち免疫グロブリンはジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖と２つの軽鎖からなり、各軽鎖はジスルフィド結合によってそれぞれ１つの１鎖と繋がっており、全体としては”Ｙ”字型の形状をとっている。抗体の２つの”腕 “は抗原結合を担っており、ポリペプチド構造が様々に変化する領域を持ち、５Ｆａｂ”フラグメント（抗原結合性フラグメンｌ−；ｆｒａｇｍｅｎｔ−ａｎｔｉｇｅｎ−ｂ　ｉ、ｎｄ　ｉｎｇ）またはンスルフイド結合により互いに繋がっている２つのＦａｂ−を表して、Ｆ（ａｂ−）ｚと呼ばれている。抗体の“尾” 、即ち中心軸は固定されているか、または一定のペプチド配列を含んでおりＦｃフラグメント（結晶性フラグメント＋ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ’）と呼ばれている。モノクローナル抗体の産生はコーラ−とミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉ　Ｉ　ｓ　ｔ　ｉｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６．４９５−４９７　（１９７５））により最初に開示された。このようなモノクローナル抗体は診断試薬や治療においても幅広い用途が見出だされている。

各重鎮はその一端に、いくつもの定常ドメインに続く１つの可変ドメインを持っている。各軽鎖は一方の端に１つの可変ドメインを、もう一方の端に１つの定常ドメインを持っており、軽鎖可変ドメインは重鎮可変ドメインに、軽鎖定常ドメインは重鎮の第１定富ドメイン（ＣＨＩ）に並行している。軽鎖および重鎖の定常ドメインは抗体が抗原に結合することに直接関わっているわけではない。軽鎖定常部と重鎮のＣＨ１領域は各Ｆ　ａ　ｌ）−フラグメントの５０％を占めている。

軽鎖、重鎮の各組からなる可変ドメインは抗原結合部位を形成している。軽鎖と重鎖のそのドメインは同じ普遍的な構造を持ち、各ドメインは４つの枠組み構造領域からなる。枠組み構造領域の配列は比較的保存されており、３つの相補性決定部位（ＣＤＲ）によって繋がっている（カバー（、Ｋａｂａｔ、）ら、５ｅｑｕ６ｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔ、ｅｊｎｓ　ｏｆ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉ、ｃａｌ　Ｉ特表平５−５０２３８４　（３）ｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄＨｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　（１９８７））ｏ　４つの枠組み構造領域は大きくいってベータノートのフンフすメーションをとっており、ｃＤＲはループ構造をとりベータノート構造を、場合によってはベータノート構造の一部となって、繋げている。ＣＤＲは枠組み構造領域によって極めて接近して保持されており、他のドメインからのＣＤＲとともに抗原結合部位の形成に寄与している。

近年、分子生物学の技術は、目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で宿主細胞を形質転換することにより広範囲の非相同ポリペプチドを生産することを可能にした。免疫グロブｊルポリペプチドは組み換えＤＮＡ技術により生産されている。例えば、ＥＰ−Ａ　Ｏ０８８９９４（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　Ｃ。

ｒｐｏｒａｔ、１ｏｎ）、ＥＰ−Ａ−１１０２６３４（Ｔａｋｅｄａ　Ｃｈｅｒｎｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｌｔｄ、）、ＥＰ−Ａ、−０１２５０２３（Ｃｅｎｅｎｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、）を参照。こうした技術は免疫グロブリン遺伝子をミニローマ細胞に安定に導入することも可能にした。

治療においてマウスまたはラッ］・のモノクローナル抗体、あるいはマウスまたはラットの可変ドメインを含む部分１＝トキメラ抗体（免疫グロブリンの抗原結合部分をペプチドリンケージにより別のタンパク質の少なくとも一部分につけた抗体）でさえヒトに注射すると、人体の免疫系は可変ドメインを異物と認識し免疫応答を生じる。従って、マウスまたはラットモノクローナル抗体あるいはキメラ抗体を人体に繰り返し注射しても、外来抗体に対する人体の免疫系の応答によってその有効性は失われたり減少したりすることだろう。

ＥＰ−Ａ−０２３９４００（”ｚ’ンター（Ｗｉｒｒｔｅｒ））ｔｔ、人体ノ治療に使用された場合にその抗原性による副作用を抑えるために抗体のＣＤＲのみが人体にとって異物であるようなモノクローナル抗体を記載している。例えば１＝ト、マウス、ラットの枠組み構造領域は特徴的な配列を持っているが、ｈ　ｈｃＤＲどマウスやラッｌ−ＣＤ　Ｒとを区別する特徴は見られない。このことがら、ヒトの枠組み構造領域中にマウスまたはラッ］・のＣＤＲを含ませた抗体は、本来の１＝トの抗体と同じくらいにしか異物性がないと考えることができる。

しかし、上記の出願に記載されている抗体を”ヒト化”する方法が普遍的な方法としてすべての抗体に適用可能であるかは明らかではない。抗体はカッパまたはラムダのいずれか一方の軽鎖と、アルファ、ミュー、ガンマ、イブ７０ン、デルタのいずれか１つの重鎮を持ち、これらの特異的な組み合わせが、抗体をヒ］・化する上記の方法を適用不可能にしていると考えることができる。

現在までのところ、ヒト化されたすべての抗体はカッパ型の軽鎖を含んでいた３゜しかしながら、ヒＩ−Ｔ、ｍ抱ＣＤ３抗原（ラットハイブリドーマＹＴＨ１２，５１４２（以降ＹＴＨ１２，５と呼ぶ）により分泌されるモノクローナル抗体）に対する抗体を、その抗体がラムダ型の軽鎖を持っていてもヒト化できることが現在見出だされている。ラムダ軽鎖の存在は、ＥＰ−Ａ、−０２３９４００で記載されたマウスモノクローナル抗体のヒト化に使用されたものとは異なるアプローチを必要とした。

したがって、本発明はＣＤ３抗原に対する結合親和性を持つが、可変枠組み構造領域や定常部とは異なるオリジンのＣＤＲを少なくとも１つ持つリガンドを含んでいる。この少なくとも１つ含まれるＣＤＲは以下のアミノ酸配列（ａ）　５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ｎｅｔ−Ａｌａ。

（ｂ）　Ｔｈｒ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒ（２ −Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−３ｅｒＪａｌ| Ｌｙｓ−Ｇｌｙ。

（ｃ）　Ｐｈｅ−＾ｒｇ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ− ＾５ｐ−Ｔｙｒ。

（ｄ）　Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−＾５ｎ−１１ｅ−Ｇｌｕ− Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ。

（ｅ）　Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ。

（ｆ）　Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ− ｖａｌ。

および、保存的に改変されたその変異体から選択される。

”保存的に改変された変異体”という用語は、本分野で良く知られたものであり、抗体−抗原親和性に実買的な影響を及ぼさない変化を含んでいる変異体を指゛ｉ０本発明のＣＤＲは重鎮（（ａ）、（１））および（Ｃ））および軽鎖（（ｄ）。

（ｅ）および（ｆ））可変ドメインの枠組み構造領域内に置かれている。さらにすべてではないが多くの場合、リガンドは定常部も１つ含んでいる。少なくとも１つ含まれるＣＤＲが、その可変枠組み構造領域と同じオリジンをもつが、定常部とは異なるオリジンをもっことも可能である（例えば部分ヒトキメラ抗体）。

しかしながら、少なくとも１つ含まれるＣＤＲが、例えば後に記述されるような定常部を含まない単一ドメインリガンドのように、可変枠組み構造領域とは異なるオリジンをもつ方がより一般的であり、また抗体やそのフラグメントのように、ＣＤＲが存在する定常部と異なるオリジンをもつ場合もよく見られる。

本発明記載のリガンドは様々な数のＣＤＲを含むことができる。このことがら例えば、分子認識単位として知られるものは単一のＣＤＲを含んでいるが、重鎮も軽鎖も含まないリガンドの中でより興味深いのはＥｕｒｏｐｉａｎ　Ｆａｔｅｎｔ　Ａ、ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、０　３６８　６８４に記載された３つのＣＤＲを含んでいる単一ドメインリガンドである。

したがって、本発明の好適な態様では、そのリガンドは前記（ａ）、　（ｌ〕）および（Ｃ）あるいは保存的に改変されたその変異体のアミノ酸配列に相当する３つのＣＤＲ，および／または（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）あるいは保存的に改変されたその変異体のアミノ酸配列に相当する３つのＣＤＲをもっている。その中でも重鎖ＣＤＲ（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）が最も重要である。

しかし、本発明は重鎮および軽鎖の可変部両方を含んでいる抗体全体またはそのフラグメントに関して特に興味が置かれている。従って本発明のリガンドは、ＣＤ３抗原に対する結合親和性を持つ抗体またはそのフラグメントの形をとっていることが望ましく、以下のアミノ酸配列から選択されるＣＤＲを少なくとも１つは含むような重鎮（ａ）　Ｓｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ。

（ｂ）　Ｔｈｒ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａ、ｒｇ −Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａ、ｒｇ−Ａｓｐ−３ｅｒ−ｖ≠戟| ！、ｙｓ−Ｇｌｙ。

（ｃ）Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−＾５ｐ−Ｔｙｒ。

および保存的に改変されたその変異体、そして／または以下のアミノ酸配列（ｄ）　Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−＾５ｎ−１１ｅ−Ｇｌｕ−＾５ｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−１１ｉｓ。

（ｅ）＾ｓｐ−＾Ｓｐ−＾５ｐ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ。

（ｆ）　Ｉ（ｉｓ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ −Ｖａｌ。

および保存的に改変されたその変異体から選択されるＣＤＲを少なくとも１つは含むような軽鎖を持っている。

以前に示したように、本発明記載のりガントは、１つまたはそれ以上の特定された重鎖ＣＤＲと１つまたはそれ以上の特定された軽鎖ＣＤＲとの両方を含んでいる必要はないが、抗体やそのフラグメントはそうなっていることが普通である。

ＣＤＲ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）はラットバイブリド−７ＹＴＨ１２，５重鎮では以下の順に編成されている。リーダー→定常部の向きに、枠組み構造領域１／　（ａ）／枠組み構造領域２／　（ｂ）／枠組み構造領域３／　（ｃ）／枠組み構造領域４゜モしてＣＤＲ（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）は本ハイブリドーマ軽鎖では以下の順に編成されている・リーダー一定常部の向きに、枠組み構造領域１／（ｄ）／枠組み構造領域２／　（ｅ）／枠組み構造領域３／　（ｆ）／枠組み構造領域４゜それ故、３つすべてのＣＤＲが存在している場合は、重鎖ＣＤＲがリーダー一定常部の向きに（ａ）、（ｂ）、　（ｃ）の順に、軽鎖ＣＤＲがリーダー一定常部の向きに（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）の順に編成されていることが望ましい。

重鎮にＣＤＲ（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）のうち１つまたは２つのみ、そして特に軽鎖にＣＤＲ（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）のうち１つまたは２つのみを含む場合も可能であるということは理解されるべきである。しかしながら、前記の６つのＣＤＲすべてが存在することはそれ故、本発明記載の抗体またはそのフラグメントにおいて必然的にめられるものではないが、６つのＣＤＲすべてが存在することが最も一般的であろう。したがって、（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）または保存的に改変されたその変異体から成る３つのＣＤＲを持つ重鎮と、（ｄ）。

（ｅ）および（ｆ）または保存的に改変されたその変異体から成る３つのＣＤＲを持つ軽鎖とを、重鎖ＣＤＲがリーダー一定常部の向きに（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の順に、軽鎖ＣＤＲがリーダー→定常部の向きに（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）の順に編成されて持っている抗体またはそのフラグメントは特に好ましい。

本発明は”Ｙ”字型の形状を持ち、２つの同一な軽鎖と２つの同一な重鎮を持ち、従ってＣＤ３抗原に対する親和性を各々の抗原結合部位が持つ２価性の抗体に適用することができる。また、ＣＤＲを保持したＦａｂ−またはＦ　（ａｂ’）２フラグメントを調製することができる。本発明はまた抗体および、適当な場合にはそのフラグメントにも適用可能であり、その場合、抗体の腕の一方のみがＣＤ３抗原に対して結合親和性を持つ。このような抗体は様々な形をとることができる。このことからその抗体のもう一方の腕は、抗体が例えばＴＪ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４．４７４．８９３およびＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｎｏｓ、８７９０７１２３．１と８７９０７１２４．９に記載されたような二特異性抗体となるように、ＣＤ３以外の抗原に対する結合親和性を有していてもよい。また、その抗体はご１価”と呼ばれる抗体のように、結合親和性を示す腕が１本しかなくてもよい。

１価抗体（または抗体フラグメント）は多くの方法により調製することができる。グレンニーとステイーブンソン（Ｇｌｅｎｎｉｅ＆５ｔｅｖｅｎｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９５．７１２−７１３．　（１９８２））は酵素消化にょる１価抗体の調製法を記載している。ステイーブンソンらは、酵素学的に産生したＦａｂ゛とＦｃフラグメントを化学的に架橋するという１価抗体の第２のアプローチを記載している（、Ａｎ’ｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ、３．２１９−２３０　（１９８９））。以上の方法で作られた１価抗体はＦａｂ−腕の一方を失っティた。１側坑体調製の第３の方法はＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎ。

１３１４２４に記載されている。このアプローチでは抗体の”Ｙ”字型は維持されているが、２つのＦａｂ”ドメインの一方しか抗原と結合しない。このことは、抗体の重鎮と組み合って興味の対象である１価抗体を含む混合産物を産生ずる、不適切な軽鎖をコードする遺伝子をハイブリドーマに導入することによって連成される。

しかし、本発明の１価のＣＤ３抗体は新しい方法により調製されることがより望ましい。これは、重鎮と軽鎖をコードする遺伝子をもつ、例えば後に記載されるような細胞系などの適切な発現系に、末端除去して可変部ドメインと第１定常部ドメインを欠いた重鎮をコードする遺伝子、即ちこれらの各ドメインのエクソンを欠く遺伝子を導入することが必要である。これにより、（ａ）完全な２側坑体、（ｂ）２つの末端除去した重鎮のみ（即ちＦｃフラグメント）からなる抗体フラグメント、（Ｃ）末端除去した重鎮と、正常な重鎮に結合した軽鎖とから成る、ＣＤ３抗原に対して１価の抗体フラグメントの混合物の、細胞系による産生が行われる。このような抗体フラグメント（Ｃ）は、Ｆａｂ−腕を１つしが持たないので１価である。この方法によるそのようなフラグメントの形での１価抗体の産生は多くの理由から好ましい。即ち、産生された抗体フラグメントは、例えばその分子量をもとに簡単に分離することができるので、細胞系により産生された抗体混合物から容易に精製できる。これは、生産された１価抗体が大きさと外観で２側坑体と同様の性質を持つＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、１３１４２４の方法では不可能なことである。さらに、この新しい方法による１側坑体フラグメントの産生は、より制御しやすい条件を使う、従って複合反応産物の分離を必要とする酵素消化／化学共投法のような偶然性はな（、さらに使用する細胞系列が、酵素消化／化学共投法で必要とされるような連続的な合成工程の必要もなく１価抗体を生産し続けるという利点がある。

示されたように、１側坑体フラグメントの調製に記載される手法は新しく、その単一結合親和性がＣＤ３抗原以外にある抗体フラグメントの産生に適用することができる。従って本発明は、抗体重鎖と軽鎖をコードする遺伝子と、Ｆｃドメイン当りＦａｂ−ドメインを１つしか持たない抗体フラグメントを発現させるため、可変ドメインと第１定常部ドメインを欠く末端除去した重鎖をコードする遺伝子を含む発現系を培養することからなる、１側坑体フラグメントの調製プロセスを含んでいる。

本発明のＣＤＲはラットＣＤ３抗体から得られる。従って、可変ドメイン枠組み構造領域は様々な形をとりつるが、ラットまたはヒト由来のものであることが望ましい。１つの可能性としては、本リガンドが、定常部はＹＴＨ１２，５ハイブリドーマのものとは必然的に異なるが、このハイブリドーマに相当する可変ドメイン枠組み構造を持っていることである。しかし、本発明の抗体は可変ドメイン枠組み構造と後述するように定常部との両方に関してヒト化された形をとっていることが望ましい。

従って、本発明はさらに、ひとつまたは複数のＣＤＲがヒトオリジン由来であるかあるいはその可変ドメイン枠組み構造領域と組み合わさっているようなリガンドまたは抗体またはそれらのフラグメントを含んでいる。ある種のヒト可変ドメイン枠組み構造配列は、ＣＤＲの３次元コンフォメーションがその配列内でうま（維持され、抗体が抗原に対して高レベルの結合親和性を保持することから、本発明記載のＣＤＲ配列の接ぎ木に好適である。そのような可変ドメイン枠組み構造においてめる特徴は、ラムダ型が軽鎖に好んで使われる、本抗体のＣＤ３抗原に対する親和性と特異性を確かなものとするために、ＣＤＲループの構造を維持する鍵となるアミノ酸の存在である。

我々は、本発明のＣＤＲの接続の使用に特に適したヒト可変部枠組み構造を同定した。この重鎮可変（Ｖ）部枠組み構造は、Ｂ細胞ハイブリドーマ細胞系列１８／２　（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ｃｏｄｅ　：ハミンガート、デルノモニアン（Ｈｕｍｉｎｇｈａｔ、Ｄｅｒｓｉｍｏｎｉａｎ）　ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３９．２４９６−２５０１）からのヒトＶＨ型、Ｉ　Ｉ　Ｉ遺伝子ＶＨ２６、Ｄ、Ｊ　によりコードされるものである。この軽鎖可変部枠組み構造は、ヒトＶＬλ型Ｖｌ遺伝子ＳＵＴ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　ｃｏｄｅ；　ＬＶ５Ｃ３Ｈｕｍ、　サロモン（Ｓ　ｏ　ｌ　ｏｍｏ　ｎ）ら、グレンナー（Ｇｌｅｎｎｅｒ）ら編集、Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎ、Ｙ、、１９８６．　ｐ。

４４９）のものである。

したがって、ラット抗ＣＤ３抗体重鎮の１つまたはそれ以上のＣＤＲがヒト可変ドメイン枠組み構造に存在することが好ましく、該枠組み構造はリーダー→定常部の向きに読んで以下の配列を持ち、その際ＣＤＲは前に記述したＣＤＲ（ａ）、　（ｂ）または（Ｃ）、保存的に改変されたその変異体もしくは代わりのＣＤＲを示す、− Ｇｌ　ｕ−Ｖａ　１−Ｇｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　］、］ｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇ１　ｙ−Ｇｌ　ｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ　−Ｇｌ　ｎ−Ｐ窒潤|Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ｍｅｔ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ｔｈｒ− ＡｌａＪａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−＾１ａ−Ｌｙｓ−／ＣＤＲ／−Ｔｒｐ −Ｇｌ　ｙ−Ｇ　１　ｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＴｈｒＪａｌ　− ３ｅｒ−３ｅｒ。

３つのＣＤＲすべてを含む好適な抗体では重鎮可変部は以下の配列からなる：Ｇ　１　ｕ−Ｖａ　１−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｕ−３ｅｒ−Ｇｌ　ｙ− Ｇｌ　ｙ−Ｇ　１　ｙ−ＬｅｕＪａｌ−Ｇｌ　ｎ−Ｐｒｏ|Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｙ − ３ｅｒ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−＾１ａ−＾１ａ−３ｅｒ− Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｐｈｅ| Ｐｒｏ−Ｍｅｍ−＾１ａ−ＴｒｐＪａｌ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＴｒｐＪａｌ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−３ｅｒ−Ｔｈ　ｒ−３ｅｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｙ　−Ａ　ｒｇ−Ｔｈ　ｒ −Ｔｙ　ｒ−Ｔｙ　ｒ−Ａｒｇ−Ａｓ吹|５ｅｒ−Ｖａｌ　− Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−１１ｅ−８ｅｒ−へｒｇ−＾ｓｐ− へ５ｎ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−八５ｎ−Ｔｈｒ−１＋ｅｕ−Ｔｙ秩| Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−＾５ｎ−３ｅｒ−１．ｅｕ−＾ｒｇ−＾１ａ−Ｇｌｕ −＾５ｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−’／ａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃ凾刀| ＾１ａ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−＾ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ| Ｔｈｒ−ＬｅｕＪａｌ−Ｔｈｒ−％’ａｌ−Ｓｅｒ−３ｅｒ。

同様１こ、ラットＣＤ３抗体軽１ｉＪＩＣＤＲの１つまたはそれ以上が、リーダー→定常部の向きに読んで以下のアミノ酸配列を持つヒト可変ドメイン枠組み構造に好ましく存在していることが好ましく、その際ＣＤＲは前に定義したＣＤＲ（ｄ）。

（ｅ）および（ｆ）、保存的に改変されたその変異体または代わりのＣＤＲを示す、− Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ− Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−０１ｙ−Ｌｙｓ| Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ（１ｅ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−／ＣＤＲ／−丁ｒｐ−Ｔｙｒ −Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌ＝| Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−１１ａｉ　−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−／ＣＤＲ／　−Ｇ　１　ｙ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−＾ｒｇ−Ｐｈｅ−８ｅ秩|Ｇｌｙ−８ｅｒ − １１ｅ−Ａｓｐ−＾ｒｇ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ａ　ｌ　ａ−Ｓｅｒ−１，ｅｕ−Ｔｈ　ｒ−Ｉ　１　ｅ−３ｅｒ−Ｇ　１　ｙ|Ｌｅｕ−Ｇ１　ｎ − Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−＾５ｐ−Ｇ１．ｕ−Ａｌａ−八５ｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ −／ＣＤＲ／−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−kｙｓ− Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１＋ｅｕ。

３つのＣＤＲすべてを含む好適な抗体では軽鎖可変部は以下の配列がら成る・人５ｐ−Ｐｈｅ−１ｉｅｔ−１，ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｅｌｉｓ−３ｅｒ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−kｙｓ− Ｔｈｒ４ａｌ−Ｉｌｅ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−、へｓｎ−メＬＳ氏| Ｔｙｒ−Ｖａｌ−ロ１５−丁ｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ− Ｇｌｙ−人ｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ| Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａ　５ｐ−Ｌｙｓ−Ａ　ｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｙ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｈ■|８ｅｒ− Ｇｌｙ−３ｅｒ−工１ｅ−八ｓｐ−＾ｒｇ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ａｓｎ−３ｅｒ− Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｇｌｙ| Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−＾１ａ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ− Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−１１ａｌ−３ｅ煤| ３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｙ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｍａｌ−Ｌｅｕ、前述のＣＤＲを１つまたはそれ以上含む可変ドメインは、１＝１・抗体由来の枠組み構造領域をもつヒト化された形を好適にとっているが、別のタンパク質または担体に、あるいは抗体の軽鎖、重鎮の定常部に便宜上つけられてもよい。

重鎖および軽鎖の定常部の性質は可変部に比べ結合親和性への影響が小さく、これらはめるような異なる型の抗体の基部になることができるが、ヒトオリジンまたはその誘導体のものであることが望ましく、定常部は軽鎖にはラムダ型のものが最も普通であり重鎖にはＩｇＧクラス、特にＩ　ｇＧ　ｌが都合がよいが、様々な異なるクラスのものであってもよい。従って定常ドメインは本抗体の目的の治療用途に適した請求めるエフニクター機能を持つよう、都合により選択することができる。

本発明記載の抗体が、ＣＤＲは保持されているが本分子の結合機能に必須でない他の部分を欠いた形で使われてもよいということも理解されるだろう。特に前述したように、Ｆａｂ　’およびＦ　（ａｂ’）２フラグメントを使用してもよいし、あるいは本発明のＣＤＲを取り込んだ可変部を適当なタンパク質や担体分子につけてもよい。

あるアミノ酸を類似の性質を持つ別のアミノ酸（例えばグルタミン酸残基からアスパラギン酸残基）に置き換えることが、置換がなされたペプチドやタンパク質の性質や構造を実質的に変えないことは、本分野ではよく認識されている。従って、本発明は、こうした置換がＣＤＲの結合親和性と特異性を実質的に変化させずに行われたＣＤＲアミノ酸配列配列む。また、欠失がＣＤＲのアミノ酸残基配列になされていてもよいし、活性が保持されるならＮ−１Ｃ一端の一方または両方に配列が付は加えられてもよい。

それ故、示されたように、本発明は、ＣＤＲが保存的に改変されてＣＤ３に対する結合親和性を保持したその変異体を提供しうるようなりガントにも及ぶ。好適なリガンドは抗原に対する親和定数が１０５１モルかそれ以上（例えばＩＱ＋２１モル）である。異なる親和性のりガントは異なる用途に適しており１、例えば１０６．１０７．１０’１モルまたはそれ以上の親和性が場合によっては適していることがあってもよい。しかし１０６から１０ｅ１モルの範囲の親和性を持つリガンドが適していることがしばしばある。都合の良いことに、本リガンドも他の抗原には親和性を示さない。本リガンドの結合親和性とリガンド特異性は、後の実施例の項で記述されるようなアッセイ法（エフェクター細胞再ターゲツティングアッセイ）またはＥＬＩＳＡや池のイムノアッセイ技術によって検定することができ本発明のリガンドは多（の方法で調製することができる。しかしながら、本リガンドに存在する重鎮および軽鎖の定常部と可変部に対する適当な遺伝子構成物を別々に得て、適当な発現系に挿入するのが最も簡便である。抗体フラグメントは抗体分子全体から通常法で調製することもでき、また１側坑体フラグメントについて前述したように発現系により直接生産することもできる。

目的とする構造のりガントの可変ドメインをコードする遺伝子を生産し、そして目的とするアイソタイプで治療応用性をもつ抗体の定常ドメイン番コードする遺伝子に簡便につけてもよい。これらの定常遺伝子は／ＳイブリドーマｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡから、あるいは新規の性質を持った定常部を生産するためこうした遺伝子に（部位特異的に）突然変異導入することにより得てもよい。可変部をコードする遺伝子はここに含まれるＣＤＲの同定に使われる遺伝子合成技術によって誘導してもよい。そのＤＮＡに対する適当なりローニングビークルにはさまざまな型が考えられる。

機能的なＣＤ３リガンドを産生ずる細胞系の培養を通じてのこうした遺伝子の発現は、適した原核または特に真核細胞系、特に例えば（植物細胞の利用も興味深いものがあるが）ＹＢ２／３．０１／Ａ、ｇ２０　（以降ＹＯと略記）やチャイニーズハムスターオバリー細胞などのミニローマ細胞系列のような不死化された補乳動物細胞系列を、様々な抗原領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換し、形質転換したその細胞系を培養してめる抗体を生産させることによって、もっとも都合よく作用される。本発明記載のリガンドの作製に使用するこうした一般的な技術は、遺伝子工学というまさにこの分野においてよく知られたものであり、サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　、フリノチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔ、ｉｓ）による”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ］、ｏｎｉｎｇ”　（Ｃｏｌｄ　５ｐｒｉ、ｎｇ　Ｈａｒｂ　Ｏｕｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９８９　（第２版））などの出版物に記載されている。本技術はここに含まれる実施例によりさらに詳しく述べられている。

従って、本発明はさらに、本発明のリガンド／抗体のＣＤＲをコードしているＤＮＡ配列を含む。前述の（ａ）から（ｆ）のＣＤＲをコードしている一群のヌクレオチド配列はそれぞれ以下の（ａ）から（ｆ）で示されるようなものであるが、本ＣＤＲのアミノ酸配列をコードしている＠す、遺伝暗号のｗ１退により、：れらの配列に多様性が生じうろことは理解されるだろう。

（ａ）　ＡＧＣＴＴＴＣＣＡＡ　ＴＧＧＣＣ（ｂ）＾ＣＣＡＴＴＡＧＴＡ　ＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧ　ＴＡＧＡＡＣＴＴＡＣＴＡＴＣＧＡＧＡＣＴ　ＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧ　Ｃ（ｃ）ＴＴＴＣＧＧＣＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣ（ｄ）ＡＣＡＣＴＣＡＧＣＴ　ＣＴＧＧＴＡＡＣＡＴ　ＡＧＡＡ、ＡＡＣＡＡＣＴＡＴＧＴＧＣＡＣ（ｅ）　ＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡ　ＡＧＡＧＡＣＣＧＧＡ　Ｔ（ｆ）　ＣＡＴＴＣＴＴＡＴＧ　ＴＴＡＧＴＡＧｍ　Ｔ入＾ＴＧＴＴ本発明はまた特に、（１）ヒト重鎖枠組み構造領域と１つまたはそれ以上の（ａ）、（＋））および（Ｃ）を発現するＤＮＡ、および（２）ヒト軽鎖枠組み構造領域と１つまたはそれ以上の（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を発現するＤＮＡから成るより大きなりＮＡ配列も含む。このようなりＮＡ、の特定例は、前述のヒトＶＨタイプＩＴＩ遺伝子ＶＨ２６，Ｄ、Ｊ　によってコードされる重鎮枠組み構造領域中に編成された、（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）のＣＤＲをコードする、以下に示すような配列（１）、および前述のヒトＶｌ、λタイプＶｒ遺伝子ＳＵＴによってコードされる軽鎖枠組み構造領域中に纒成された、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）のＣＤＲをコードする以下に示すような配列（２）である。ＣＤＲ配列（ａ）、（ｂ）、（（：）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）には下線が引いである。

（１）　ＧＡＧＧＴＣＣＡＡ、ＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＣＧＧＴ　ＴｒＡＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧ　ＣＣＴＣＡ、ＧＧＡＴＴ　ＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴ　ＡＧＣＴＴＴＣＣＡＡＡＴＴＣＡ、ＣＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＴＣＡＴＡＧＣＡＡＡＡＡ　ＴＡＣＣＣＴＡＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＧＴＣＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴ、ＡＣＴＧＴＧＣＡＡＡノｔＴＴＴｃＧｃＣＡＧＴＡＣＡＧＴＧ　ＧＴＧＧＣｍＧＡ　ＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（２）　ＧＡＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧ　ＴＣＴＧＡＧτＣＴＣＣＣＧＧ＾＾ＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＴＡＴＴ　ＴＣＴＴＧＣＡＣＡＣＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧ　ＴＡＡＣＡＴＡＧ＾＾　＾＾Ｃ＾＾Ｃ丁＾ＴＧＴＧＣＡＣＴ（、ＧＴＡ　ＣＣＡＧＣＡＡＡＧＧ　ＣＣＧＧＧ入＾ＧＡＧ　ＣＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＧＴＧＡＴＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣＧＧＴＧ　ＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴ　ＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴ本発明記載のヒト化されたリガンドは治療面での価値を持っている。特に、抗原ＣＤ３に対する特異性をもつ改変された抗体、特にヒト化された抗体は、免疫抑制、特に移植拒絶の制御において育用な応用性を持ち、また潜在的にはガン、殊に悪性リンパ腫瘍や概してリンパ腫の治療のような池の分野においても応用性を持つ。

さらに、本発明は従って、リンパ腫患者の治療法または、例えば、本発明に従った治療上有効量のりガントの投与を含む、移植注射がおき得る場合の免疫抑制を目的とした方法を含む。

本発明のりガントは、生理学的に許容される希釈物または担体とともに記載のリガンドを投与することによる患者への投薬のために製剤され得る。リガンドは滅菌され、発熱物質を含まない、上述したような希釈物または担体と共に注射可能な形状で投与されることが望ましい。手引としては、適切なリガンドの服用量は、例えば１０日間の期間にわたって毎日約１−１０ｍｇ注射する量であると言ってよいであろう。苛酷な最初の服用応答を避けるために、最初の注射時に適切な抗−サイトカインを投与することが可能である。このような方法は、１−１０ｍｇ範囲の上限またはさらに幾分高いレベルでの服用を促進する。

本発明は以下に挙げる図面で説明される以下に続〈実施例によって例示される。

ラットＹＴＨ１２，５ＶＬラムダ遺伝子のｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅に用いられる正方向および逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーの位置と配列。

図２：ＹＴＨ１２，５ＶＨ遺伝子のクローニングおよび改変。

ＹＴＨ１２，５ＶＬ遺伝子の改変およびＹＴＨ１２，５イムノグロブリン軽鎖発現ベクターの構築。

」土− 改変されたＹＴＨ１２，５イムノグロブリン重鎮発現ベクターの構築。

」互二末端を削ったヒトＩｇＧ１重鎖（ｔＨ）発現ベクターの構築。

盈旦− ヒトＣＤ３重鎮、軽鎖および末端を削った重鎮遺伝子発現ベクターによって共形質転換された細胞から分泌された全イムノグロブリンの、プロティン−Ａにより精製された両分の非変性ＰＡＧＥ０星ヱユ非変性ＰＡＧＥバンドの１，２および３（それぞれｌノーン１，２および３）に対応する抗体分子の還元（７ａ）および非還元（７ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。

客３− ヒト化２価および１価ＣＤ３抗体は、Ｆｃ受容体を持つＵ９３７細胞をＴ細胞がキラーすることを制御する能力があるがどうかを検査し：。ラット２価ＹＴＨ１２，５ＣＤ３モノクローナル抗体およびヒト化ＣＤｗ５２抗体は対照として検査した。

茎旦− ラット２価ＹＴＨ］、２．５ＣＤ３モノクローナル抗体に対する、ヒト化１価ＣＤ３抗体とヒト化２価ＣＤ３抗体の結合の比較。ヒト化ＣＤＷ５２抗体は陰性対照として含まれた。

図１０ヒト化２価および１価ＣＤ３モノクローナル抗体は補体を介したヒトＴ細胞芽細胞の溶解を制御する能力があることを検査される。クツ８２価ＹＴＨ１２，５ＣＤ３モノクローナル抗体は比較のために検査される。

！施撚本発明はサムプルツク（ＳａＩＩｂｒｏｏｋ）らにょるＭｏ１．ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇで記述されたような技術を用いた、以下に示す実施例によって例示される。

実施例１　ラットハイブリドーマおよびチャイニーズハムスター卵巣細胞の培養ヒトＣＤ３抗原複合体のイプノロン鎖（クラーク（Ｃ１ａｒｋ）ら、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍ＋ｗｕｎｏ１．　。

１９、３８１−３８８（１９８９））に特異的なラットガンマ−２ｂ抗体を分泌するＹＴＨ１２，５ラツトハイブリドーマ細胞は抗体および５％ウソ胎児血清を含むデウルベソコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の培地のイスコブ（Ｉｓｃｏνｅ）の修正培地のなかで増殖させるがもしくは保存された。非抗体産生ラットミエローマ細胞系であるＹＯ細細胞同様に培養された（クラークとミルスタイン（Ｃ１ａｒｋ　ａｎｄ　１ｌｉｌｓｔｅｉｎ）、　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　７（６）６５７−６６６、　（１９８１）および欧州特許００４３７１８）。

ジヒドロ葉酸リダクターゼ陰性（ｄｈｆｒつの表現形のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞はヒボキサンチンおよびチミジンを添加した培地で培養された。

実施例２　：ＹＴＨ１２，５ハイブリド一マイムノグロブリン可変重＠　（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域遺伝子のクローニングＹＴＨ１２，５細胞のグアニジノチオシアネート溶液によって溶解され、全ＲＮＡはＣｓＣｌを緩衝剤とした遠心操作によって単離された（ンヤーダイン（Ｃｈｉｒｇｖｉｎ）ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１８．５２９４（１９８７））。メツセンジャーＲＮＡはここから、オリゴｄＴセロルースを用いた親和性クロマトグラフィーによって調製された（マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、＾１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ @ｂｙＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｅ［ａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　（１９８２））。

ＹＴＨ１２，５ＶＨおよびＶＬ領域遺伝子のｃＤＮＡ合成および、複製連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたそれらの増幅オルランディ（Ｑｒｌａｎｄｉ）らの記述（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＬＩＳＡ、　８６．３８３３−３８３７（１９８９））に従って行った。オリゴヌクレオチドプライマーであるＶ■＝順方向およびＶ■−逆方向、およびＶＨ遺伝子のための本方法ｌこおいて用いられる特殊化されたＭ１３ＶＨＰＣＲ１クローニングベクターもまたオルランディらによって記述されている。ｃＤＮＡ合成およびＶＬ遺伝子の増幅は公表されているラットラムダＶＬ遺伝子配列（ステイーン（Ｓｔｅｅｎ）ら、Ｇｅｎｅ。

５５、７５−８４（１９８７）Ｘ図１）から得られた順方向および逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われた。図１はＹＴＨ１２，５ラツトＶＬラムダ遺伝子のｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅において用いられた順方向および逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーの位置と配列を示す。図１は、ＦＷは枠組構造領域、ＶＬは可変軽鎖領域、ＪＬは軽鎖結合領域およびＣＬは軽鎖不変領域の５′末端を表す。

グはＭ１３１ａとして知られており、ＶＨおよびＶＬ挿入配列を含むクローンを同定するためにダイブオキシーＤＮＡノークエンソングを行った。

実施例３　可変領域枠組構造領域の選択Ｇｅｎｂａｎｋ、　Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌおよび５ｗ１ｓｓｐｒｏｔデータベースを検索することにより、ＹＴＨ１２，５ＶＨおよびＶＬ領域遺伝子と最も高い相同性を持つ既知のヒトＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を同定した。改変するための最終的なヒトの配列を選択するに当って、枠組と相補性決定領域の長さくＣＤＲ５；カバー（Ｋａｂａｔ）らによって定義されている（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　１ｎｔｅｒｅｓｔ＋第４版、　Ｐｕｂｌ、　、ＵＳ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　（１９８７）））が鞄魔■ るラット遺伝子の長さに近いものが好ましい。ラットＶＨおよびＶＬ遺伝子の改変に選ばれた枠組は、それぞれ、ヒトＶＨｍ型遺伝子ＶＨ２６−Ｄ−Ｊ　（Ｂ細胞ハイブリドーマ細胞系１８／　２　：　Ｇｅｎｂａｎｋ、　ｃｏｄｅ：Ｈｕａ＋ｉｇｈａｔ、デリスモニアン（Ｄｅｒｉｓｍｏｎｉａｎ）ら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１３９．２４９６−２．５０１（１９８７））およびヒトＶＬラムダＶＩ型遺伝子Ｓ　ＵＴ　（Ｓｖｉｓｓｐｒｏｔ　ｃｏｄｅ：Ｌｖ６ｃ＄ｈ、ソロモン（Ｓｏｌｏｍｏｎ）ら、（Ｉｎ）Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ、　ｐｐ　４４９−４６２．グレンナ−（Ｇｌｅｎｎｅｒ、　Ｇ、　Ｇ、　）、オツセルマンＣＯｓＣ０５ｓｅｒ。

Ｅ、Ｆ、）、ベンゾイツト（Ｂｅｎｄｉｔｔ、　Ｅ、　Ｐ、　）、カルキンス（Ｃａｌｋｉｎｓ、　Ｅ、　）、コーエン（Ｃｏｈｅｎ、　Ａ、　Ｓ、　）およびラッカー−フランフリ：／　（Ｚｕｃｋｅｒ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ、　Ｄ、　）Ｐｕｂｌ。

Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８６））である。

実施例４−：ＹＴＨ１２，５ＶＨ遺伝子の改変ＹＴＨ１２，５ＶＨ遺伝子の改変方法を図２に示す。図２では、Ｖ、　ＤおよびＪは、ｖＨ遺伝子の可変、多様性、および結合領域をそれぞれ表している。リーダーシーフェンスはＬと表し、イムノグロブリン遺伝子プロモーターはＩｇＰｒ。

と表す。

オリゴヌクレオチド部位特異的変異導入は、＾ｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｌｏｎａｌ　Ｐ　Ｌ　Ｃによって販売されている変異導入キットを用いて行われた。３ｏから６０塩基の範囲の長さの６つの変異を導入されたオリゴヌクレオチドが用いられたが、これらはＶＨ遺伝子のプラスＤＮＡＭに相補的であった。

Ｍ１３クローン１ａが枠組み構造の改変のための変異導入反応に鋳型として用いられ（図２）、そして変異導入産物はダイデオキシ−ＤＮＡンークエンノングによって解析された。適切なＶＨ枠組み構造コドンを変化させるのに必要な変異に加えて、７番目のオリゴヌリンプロモーターを除去することを容易にするために行われた。Ｍ１３クローンはＭ１３　４０７として知られている。ラン１−ＶＨ遺伝子によってコードされているアミノ酸配列（最下段の配列）および改変されたＶＨ遺伝子の配列（最上段の配の列）はＣＤ　Ｒ，ｓ相当部分の文字に下線を引いた配列と合わせて以下に示す（配列中の横線は改変された配列と同一の残基を示している）。

ＧｌｕＪａＬ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−１１ａｌ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ| −Ｍｅｔ−Ｌｙｓ　−−−−−−−〜　−−一一一−−−−−−−−−−Ｇｌｙ　−５ｅｒ−１１ｅ　−−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−１ｉｅｔ−＾５ｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ −Ａ、ｒｇ−＾１ａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−丁ｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃ凾刀| −−−−−−−Ｓｅｒ　−−−−Ｔｈｒ　−−−Ｔｈｒ−ＬｅｕＪａｌ−ＴｈｒＪａｌ−３ｅｒ−３ｅｒ四角で囲まれた配列はＶＨ順方向および逆方向プライマーをコードしており、ＹＴＨ１２，５ＶＨ領域配列と異なる場合がある。

改変されたＶＨ遺伝子の核酸配列はＣＤＲ配列に下線を引いて以下に示す。

＾ＴＴＣＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡ、ＧＡＧＡＴＡ　ＡＴＡＧＣＡＡＡＡＡ　ＴＡＣＣＣＴＡＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧ＾ＣＴＣＣＴＣ＾実施例５　：　ＹＴＨ１２，３ＶＬｉｌ伝子の改変ＹＴＨ１２，５ＶＬ遺伝子の改変方法を図３に示す。図３（ａ）はランｈ　Ｙ　Ｔ　Ｒ１２，５ＶＬ遺伝子のクローニングの手順を示している。省略記号ＶおよびＪはＶＬ遺伝子の可変領域および結合領域を示している。Ｃ′はラットＹＴＨ１２，５ラムダ不変領域の５゛端を表している。ＰＣＲ産物はＭ２Ｓ中にクローニングし、クローンＭ１３　１３ａとした。制限酵素切断部位を導入したり削除するために変異導入を行った。ＶＬ遺伝子は旦ヱ旦ＩＩ−工且旦工切断によってＭ１３　１３ａから単離した。

最初にＭ１３ｒｒｒｐｌＢ（実施例２）中にクローニングされたため、ＹＴＨ１２，５ＶＬ遺伝子は遺伝子発現に必要な上流および下流シグナル配列を欠落していた。

従って、改変前に、ＶＬ遺伝子はベクターＭ１３　ＶＫＰＣＲＩ（オルランディ（Ｏｒｌａｎｄｉ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　８６．３８３３−３８３７（１９８９））　（Ｋ■窒氏|Ｏｚ−ヒトラムダ不変領域遺伝子（ＣＬ）（ラビッｔとフォスター（Ｒａｂｂｉｔｔｓ　ａｎｄ　Ｆｏｒｓｔｅｒ）、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　、　Ｌ、　１ｌ− １９（１９８３）とともに図３　（ｃ）＋　（ｄ）参照）中にサブクローンされ、図３（ｂ）に示されるように８ＫＢゲノミック断片から単離された。

図３（ｂ）では、ＣはヒトＫｅｒｎ−Ｏｚ不変領域を示す、クローニングベクターＭ１３ＶＫＰＣＲＩは、Ｍ１３　ＶＫＰＣＲＩの一部をなしているヒト化カッパ軽鎖可変領域（ＨｕＶＫｌｙｓ）を切り出すことによって調製された。ベクター、ＶＬおよびＣＬの３つのライゲーションを行う前に、適切な制限酵素切断部位を導入および／あるいは削除するために部位特異的変異導入を行う必要がある。この方法の詳細は図３　（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）に説明している。生じたキメラのラットＶＬ−１：１−ＣＬ遺伝子はＮｃｏｌ−ＢａｍＨＩ切断によって単離し、ベクターｐＨＢＡＰｒ−１−ｇｐｔ　（ガニング（Ｇｕｎｎｉｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　。

ＵＳＡ、　８４．４８３１−４８３５（１９８７））のＨ１ｎｄ工ＩＴ　および旦ａｍＨ！切断部位の間ニサブクローニングし、Ｍ１３　ＶＫＰＣＲ’３イムノグロブリンプロモーター、Ｎｃｏ１２８１を産生ずるが、これは、その後の改変変異導入反応に鋳型として用いられる。変異導入はラットＶＨ遺伝子における記述に従って行った。変異導入用オリゴヌクレオチドは遺伝子のＭ１３　ｍｐ１８ベクター中の向きのために、ｖＬ遺伝子のマイナスＤＮＡ鎖と相補的に作成した。長さが２７から７２ヌクレオチドの範囲の５つのオリゴヌクレオチドを用いた。ラットＶＬ遺伝子（最下段の配列）および改変されたＶＬ遺伝子（最上段の配列）をコードするアミノ酸配列はＣＤＲ５部分に文字に下線を引いて以下に示している（ラット配列中の横線は改変された配列と同一の残基であることを示している）ニー　−−−−−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ　−−Ｓｅｒ　−−−１１ｅｔ −−−−−−−−−−ｐｈｅ−−４ｉＳ−＾５ｎＬｅｕ−Ｇｉｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−＾５ｐ−Ｇｌｕ−＾１ａ−＾５ｐ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−３ｅｒ| Ｖａｌ−Ａｌａ−１１ｅ　−−−−１１ｅ　−Ｐｈｅ　−−−−−−四角で囲まれた配列はＶλ逆方同プライマーをコードしており、したがってＹＴＨ１２，５Ｖλ配列中に存在する場合としない場合がある。

改変されたＶＬ遺伝子の核酸配列はＣＤＲ配列に下線を引いて以下に示すＧＡＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣＴＣＴＧＴＧ　ＴＣＴＧＡＧＴＣＴＣＣＣＧＧＡＡＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＧＴＣＴ　ＴＣＣＡＡＣＴＣＡＧ　ＣＣＴＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＴＧＧＴ　ＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＴｒＣＴＴ　ＡＴＧＴＴＡＧＴＡＧ　ＴＴＴＴＡ、ＡＴＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＴＧ　ＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴ　ＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴ改変されたイムノグロブリン重（Ｈ）鎖遺伝子のための発現ベクターは、図４（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）で図解して例示されているように、ベクターｐＨＢＡＰｒ−１−ｇｐｔ　（ｇｐｔ−ＥｃｏＲＩキサンチン−グアニンフォスフｔリボシル　トランスフェラーゼ遺伝子）から得られた。ＤＮＡ　（タカ／Ｘシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら、　Ｃｅ１１．２９．６７１−６７９（１９８２））の２．２ＫＢ　且ａｍＨＩ一旦呈上ＩＩ断片上のヒトＩｇＧ１ゲノミツク不変領域遺伝子（ＨｕｌｇＧｌ）は図４（ｂ）に示された様に単離した。ヒ１− ＩｇＧ１ゲノミック不変領域は最初にｐＨＢＡＰ　ｒ−１−ｇｐｔのＢａｍＨＩ切断部位に挿入した。ＳＶ４０初期プロモーターおよびＳＶ４０初期転初期転写終結シグナルポリアデニル化シグナル（スブラマニ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ）ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　、　！、　８５４−８６４（１９８１）　；機能しないプロモーター（図４（ａ）に示したように単離された）を伴う）を隣にもった、マウスｄｂｆｒ遺伝子（チャン（Ｃｈ　ａ　ｎ　ｇ）ら、　Ｎａｔｕｒｅ、２７５，６１７−６２４（１９７８））をコードする１、ａ５ＫＢのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ切断部位にクローニングし、続いて改変されたＹＴＨ１２，５ＶＨ遺伝子（実施例４参照）をベクターのＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ切断部位の間に挿入した（このクローンをクローン２７８とする）。

ＳａＸｌ−ＢａｍＨＩ　ＤＮ、Ａ断片上の改変されたイムノグロブリン軽（Ｌ）鴫は発現ベクターｐＨＢＡＰｒ−，１（ガニング（Ｇｕｎｎｔｎｇ）ら、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　８４．４８３１−４８３５（１９８７乃の５ａｉｌおよびＢａｍＨＩ切断部位の間に挿入した（これをクローン２７４とする）。このベクターは真核細胞の選択可能なマーカーを全く含んでいない。

ＨおよびＬ鎖発現ベクターはＰｖｕＩで切断することにより直鎖状にし、次にｄｈｆ　ｒ”ｃＨｏ細胞中に形質導入試薬ＤＯＴＭＡ　（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅ　ｒ）を用いて共形質導入した。安定な形質導入体は透析されたウソ胎児血清を含みキサンチン／ヒボキサンチンを含まないＩＭＤＭ中で生育する能力によって選択されたが、この特性はＨｆ＆発現ベクターのｄｈｆｒ遺伝子によって与えられた。軟寒天でクローニングし、２４穴プレートで培養された形質導入体は、ＥＬＩＳＡｉ：よって抗体産生に関して検索した。

実施例　７・エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）予め１／４０００のポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＦｃ抗体（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）のＰＢＳ、ｐＨ７，４溶液を使って４℃で一晩コードンた、Ｆａｌｃｏｎ　Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ　ＩＩＩ平底プレートに試験細胞培養土清液を滴定した。捕獲されたヒトの抗体の存在は、１／４０００のビオチン化したポリクローナルヤギ抗ヒトラムダし＠抗体（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）を使い、次いで１／１０００のビオチン化した、ストレプトアビジンとコンプレックスを成しているホースラディッンユペルオキシダーゼ（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）とその基質○ＰＤを用いて検出した。００２％　ｖ／ｖ　Ｔｗｅｅｎ２０と１％　ｗ／ｖ　ＢＳＡを含むＰＢＳは、抗体捕獲ステージ後の抗体希釈剤として使われた。試験抗体、検出抗体、ペルオキシダーゼおよび基質のインキユベーシヨンは、３７℃でそれぞれ１時間、１時間、１時間および３０分間行われ、プレートは各ステージの間ごとに３分ずつ４０す胞への導入による１側坑体（ＩＦａｂ−、ＩＦｃ）の調製Ｍ１３Ｔｇ１３１内にある２、２ＫＢのＢａｍＨＩ−８ｐｈＩＤＮＡ断片上のヒトＩｇＧ１ゲノム定常部遺伝子（タカハン（Ｔａｋａｈａｓｉ）ら、Ｃｅ１ｌ。

２９．６７１−６７９　（１９８２））　をＰｓ　ｔ　Ｉおよび５ｐｈＩでｆｉ（ｔｊ、ｒ、ヒンジおよび第２および第３定常部ドメイン（ＣＨ２とＣＨ３）のエクソンをコードする長さ１．４ＫＢのＤＮＡを得た。この断片を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで修復して、Ｐｓｔｌおよび５ｐｈｌエンドヌクレアーゼにより生じた３′突出−重鎖ＤＮＡ端を取り除くことにより平滑末端とした。次に末端除去した遺伝子をベクターＭ１３．ＶＫＰＣＲ１（オルランディ　（Ｏｒ　Ｉ　ａｎｄ　ｉ）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、、ＵＳＡ、８６．３８３３−３８３７　（１９８９））のＰｖｕＩ　ＴおよびＢａｍＨＩ部位の間に挿入し、遺伝子発現に必須な開始コドンとリーダーペプチド配列を持つ遺伝子を提供した。この操作の際、ベクターのＢａｍＨＩ部位はＤＮＡポリメラーゼ１のフレノウ断片を用いた末端修復により再構築された。完成した遺伝子をＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩ消化によりＭ１３ＶＫＰＣＲＩから切り離しくこのようにして本遺伝子からベクターの免疫グロブリンプロモーターを分離した）、次に、ヒトβアクチンのプロモーターにより発現を制御する発現ベクターｐＨＢＡＰｒｏ−Ｉ−Ｎｅｏ　（ガニング（Ｇｕｎｎｉｎｇ）　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、８５．７７１９−７７２３　（１９８７））のＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩおよびＢａｍＨ１部位の間に挿入し、ｔＨ発現ベクタークローン６８を作製した。以上の過程は図５にまとめられている。

完成したｔＨ遺伝子は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインと融合した、ヒト化された抗リゾチームカッパ軽鎖可変部のＮ端の最初の３アミノ酸がついた、マウス免疫グロブリン重鎖可変部リーダーペプチドをコードしていると予想される。

このｔＨ遺伝子発現ベクター（クローン６８）をＰｖｕＩで直鎖状にし、次にヒト化された重鎮遺伝子を含むベクター（ＹＯ細細胞はベクター２７６、ＣＨＯ細胞にはベクター２７８）およびヒト化された軽鎖遺伝子を含むベクター（ベクター２７４）とともにＹＯまたはＣＨ○細胞にトランスフェクトした（ベクター２７４と２７８の詳細については実施例６を参照。ベクター２７６はＤＨＦＲ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ断片がない以外は２７８と同一である。）。トランスフェクトされたＹｏ細細胞、５％正常ウつＦＣ８，２ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８．２μｇ／ｍｌミコフェノリン酸、２５０μｇ／ｍｌキサンチン、１３．６μｇ／ｍｌヒポキサンチンおよび３．８７μｇ／ｍｌチミジンを含むＩＭＤＭで選択した。トランスフェクトされたＣＨ○細胞は、５％透析済ウつＦＣ３，２ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を含むＩＭＤＭで選択した。トランスフェクトントは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓｔ　Ｇｅｌシステムを使用した１０−１５％勾配ネイティブケルおよびＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で全免疫グロブリン（プロティンＡアフィニティ吸着により調製）を分析することによって、３つの免疫グロブリン鎖すべてを分泌しているかどうかについてスクリーニングした。

結果（例えばＥＧＲＹＯ６８／Ｈ＋Ｌ、３．７の細胞系列からの）全免疫グロブリンのネイティブ（非変性）ＰＡＧＥ分析により３つの主要なタンパク質のバンドの存在が明らかになった（図６）。高分子量のバンド（バンド１）を精製し還元変性条件下で更にＰＡＧＥ分析をしたところ、それが免疫グロブリン重（Ｈ）鎖と軽（Ｌ）ｆａから成ることが示された（図７ａ）。同様に、中間サイズのバンド（バンド２）はＨ＋Ｌ十ｔＨポリペプチドを、低分子量のバンド（バンド３）はｔＨポリペプチドのみを含んでいた。それ故、本バンドはそれぞれ、２側坑体、１側坑体およびＦｃ分子と同定することができる。Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓｔ−Ｉｍａｇｅシステムを使った５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像分析により、ネイティブＰＡＧＥのバンド１および２中のＨ，ＬおよびｔＨポリペプチドが予想されたように各バンドにほぼ等モル存在することが示された。変性、非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ネイティブゲルの３つのタンパク質のバンドすべてを含むポリペプチドは、ジスルフィド結合によって架橋されていることを示した。これらのバンドがＨ，ＬおよびｔＨポリペプチドの非特異的凝集体である可能性は、以上のことから除外された（図７ｂ）。

実施例　９　抗体の調製１価および２価のヒト化されたＣＤ３抗体は以下のようにして精製された：全免疫グロブリンをハロウ（Ｈａ　ｒ　ｌ　ｏｗ）とレイン（Ｌａｎｅ）（Ａｎｔ　ｉｂ。

ｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｐｕｂｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　１９８８）により記載されたように、プロティンＡアフィニティクロマトグラフィによって、ｔＨ，ヒト化されたＨおよびＬ＠遺伝子を含む発現ベクターでコトランスフヱクトしたＣＨＯ細胞の培養上清液から分離した。この混合物からＴＳＫ−５ＰＷ−ＤＥ、ＡＥ　７．５ｘ６０ｍｍ　Ｇｌａｓｐａｃカラム（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，５で平衡化し、ＩＭＮａＣｌを含む同バッファーで溶出した）を取り付けたＬＫＢ　ＨＰＬＣシステムを使用したイオン交換クロマトグラフィによって１価および２価の抗体種を分離した。

ラットＹＴＨ１２，５Ｍａｂは、イオン交換りａマドグラフィを０．　１％ベタインを含む２０ｍＭ　ピペラジンｐＨ９，５で行った点を除き、同様にして精製した。ヒト化されたＣＤｗ５２　Ｍａｂ　（Ｉ　ｇＧｌ）　（ライヒマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２．３２３−３２７．１９８８）はＧ、ヘイル博士（Ｄｒ、Ｇ、Ｈａｌｅ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）により提供され、プロティンＡｉｒ。

より精製された。抗体濃度はＬｏｗｒｙ法を用いて決定し、抗体調製物の純度はＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓｔ　Ｇｅｌシステムを使用した１０−１５％勾配ゲル上の５ＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。

実施例　１０．競合結合アンセイ９６穴のマイクロタイタープレート中の５ｘｌＯ’のＨＰＢＡＬＬ　（ヒト末梢血液急性リンパ芽球白血病）細胞のアリコートを、ビオチン化していないコンペティターＭａｂの濃度を上げながら、２．　０μｇ／ｍｌのビオチン化した１価のヒト化されたＣＤ３モノクローナル抗体（、ＥＧＲＣＨＯＨ＋Ｌ／６８．２の細胞系列から調製）で染めた。１時間後その細胞をリンスし、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＲＰＮ　１２３２）で更に１時閲染めた。その細胞を再びリンスし、そして１％　Ｖ／Ｖのホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液で固定した。インキユベーシヨンは４℃で行われ、０．１％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウム２１％　ｗ／ｖ　ＢＳＡおよび５％　Ｖ　／　Ｖ加熱により不活化した正常ウサギ血清を希釈剤とリンス液として使用した。１穴当たりの約３５００細胞からの平均細胞蛍光はＦＡＣ３ｃａｎ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使って決その結果を図８に示す。ここで（ａ）はＣＤｗ５２　Ｍａｂコントロール、（ｂ）はヒト化された１価のＣＤ３Ｍａｂ、（ｃ）はラットＹＴＨ１２，５ＣＤ３Ｍａｂ、そして（ｄ）はヒト化された２価のＣＤ３　Ｍａｂである。

１−２　μｇ／ｍｌのヒト化された２価のＣＤ３　Ｍａｂは３Ｘ１０’のＨＰＢＡ　ｉ−Ｌ細胞上のＣＤ３抗原結合部位を飽和させるのに十分であったが、一方２５０μｇ／ｍｌのヒ］・化された１価のＣＤ　、３　Ｍ　ａ　ｂでは不十分であった（データは示していない）。以上の理由から、比較的低濃度の２価のＹＴＨ１２，５ラツトおよびヒト化されたＣＤ３抗体が有意な競合度を連成するために要求される場合、１価Ｍａｂをこの競合結合アッセイにおけるビオチン化された検出器として使用した。

１価の検出器の５０％の競合を与えるのに必要なラットおよびヒト化された２価のＭａｂの濃度は非常に類似している。うｙｌ−Ｍａｂに比べてヒト化された：ｑａｂは１３倍しか必要とされなかった。

ヒト化された２価のＭａｂと同程度の競合を得るために、（独立した実験で）６から８２５倍高い濃度のヒト化された１ＧのＭａｂを必要とした。抗体濃度は（２価分子、１価分子あたりのそれぞれ２つ、１つの抗原結合部位の存在を考慮するため）Ｆａｂ−ドメインのそルｉｌ［で表しであるので、この差は２価のＭａｂ分子において２つのＦ　ａ　ｂドメインが結合していることから生ずる抗体の結合能の増加を示しているに他ならない。染色が１５ｍＭのアシ化す）・リウム存在下で４℃で行わねだので、２価ＭａｂによるＣＤ３−抗原のモノユレーノヨンはその原因としては考えにくい。アンドは１０ｍＭの濃度で抗体により誘導される細胞表面分子の再分布を阻害することが示されている（ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）とダ７ス（Ｄｕｆｆｕｓ）、１９７１）ｏＮａｔｕｒｅ、Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ、２これは別のところに記載されているように（ギリランド（Ｇｉ　１１　ｉ　１ａｎｄ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、、てＪＳＡ、８５．　７７１９−７７２３　（１９８８））行った。簡単に述べると、５　ｌ（：　ｒラベルしたＣＤ３７ヒ）・単球ガン細胞（Ｆｃγ受容体１分子を発現する）を標的として使用した。ＣＤ３抗原ポジテイブなＦｃγ受容体ｌエフェクター細胞を、有糸分裂促進的なＣＤ３抗体で活性化されたヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）から作成し、Ｉ　Ｌ−２を含む培地で維持した。標的およびエフェクター細胞を、試験抗体またはコン］・ロール抗体存在下で１．２の比率で混合した。標的細胞の溶解（ＣＤ３抗原−ＣＤ３抗体およびＣＤ３抗体（Ｆｃ）−Ｆｃγ受容体１相互作用による、標的と細胞障害性エフェクターの架橋、つまりＣＤ３抗原特異的な抗体の存在を示している）を、標的により培養液中に放出さねる５　ｌ　（：　ｒの量によって測定する。各抗体希釈液を４回ずつ検定した。ＣＨＯ細胞系列により産生されたヒト化されたＣＤ３の１価および２側坑体をラッ１−ＹＴＨ１２゜５　ＣＤ３抗体と比較した。その際、抗ＣＤＩ抗体（ＣＤＷ、５２）がネガティブコントロールとして含まれている。その結果を図９に示すが、その際、（ｄ）はヒト化された２価のＣＤ３　Ｍａｂ、（Ｃ）はラット２価性ＹＴＨ１２，５ＣＤ３　Ｍａｂ、（ｂ）はヒト化された１価のＣＤ３　Ｍａｂそして（ａ）はＣＤｗ５２コン］・ロールである。期待されたように、ｌ＝１・化されたＣＤｗ５２からの５ＩＣ７放出は非常にユく抗体量の増加や減少に影響されなかった（服量反応を示さなかった）。ヒト化されたＣＤ３抗体はラッｈＹＴＨ１２，５抗体より非常に優れた挙動を示した。

実施例　１２：補体を介した細胞溶解（ＣＭ　Ｌ　）１＝］・化されたＣＤ３モノクローナル抗体のＣＭＬ活性は、Ｔ細胞芽細胞を標的として（その調製の詳細は実施例１１参照）、Ｔ細胞ドナーからの血清を補体のソースとして使用して比較した。本アッセイは本質的にビントン（Ｂｉｎｄｏｎ）ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍ、ｍｕｎ、ｏｌｏｇｙ、１８゜１５０７−１５１４　（１９８８）、　によって記載されたように行われた。簡単に述べると、９６穴のミクロタイクープＩノート中のｌＸｌ０Ｓの５１（：ｒラベルしたＴ細胞芽細胞を、試験抗体（様々な濃度）と最終濃度２５％　ｖ／ｖのヒト血清の存在下で、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心により落とした。上清の半分を各穴より注意深く取り、分析してそこに含まれる５１Ｃ，の量を決定した。

その結果を図１０に示すが、その際、（ｄ）はヒト化された２価のＣＤ３　Ｍａｂ、（ｂ）はヒト化された１伍のＣＤ　３　Ｍ　ａ　ｂ　、そして（ｃ）はラット２価のＭａｂである。各点は２つの決定短の平均値を表す。

２価のヒト化されたＣＤ３　Ｍａｂは、飽和１度を杓５０超える、１００μｇ／ｍｌの１度でも溶解をまったく検出できなかった。逆に言えば、非溶解性の２価のヒ］・化されたＣＤ３　Ｍａｂとその溶解性のラットＭ　ａ　＋）の対応物との間の相違は、両者が持つ抗原特異性が同じであるから異なる抗体定常部によるにちがいない。ＹＯクラットエローマ細胞により産生された抗体が同様に挙動するので（データは示していない）、ｌニド化抗体のＣＨＯ細胞における発現のために生じた結果ではない。

ヒ］・化されたＣＤ３　Ｍａｂを１価にするＣＭＬ活性に与える影響は実に劇的である。２価Ｍａｂが１００μｇ／ｍｌで溶解を示さなかったのに対し、１価Ｍａｂはほぼ３０％溶解した。これは２価のラットＹＴＨ１２，５Ｍａｂで得られた最大溶解に比べ約２倍奄い、しかしラットＭａｂが最大値を達成したときに比べて［０倍の抗体濃度を必要とした。１価Ｍ　ａ　Ｉ）　ＣＭ　Ｌでより高い抗体濃度が必要とされるのは、部分的には、ＸＦ４　ａｂと２価Ｍａｂについて前に示した結合能力における相違によると言える。従って、細胞表面に同じ量の抗体が結合するにはより高濃度の１価Ｍａｂを要する。

補体とともに効果的に細胞を溶解するＭ　ａ　＋）を使用することは、細胞除去が目的となる状況においては有利であろうが、最優先の重要事項とは言えない。

Ｆｃ−Ｆｃ受容体相互作用に依存するエフェクター細胞再ターゲツティングアッセイにおける、ヒト化されたＣＤ３　Ｍａｂの挙動はそれ故、楽しみである。

庄本明細書においてアミノ酸残基は標準様式（Ｐｕｒｅ　ａｎｄ　、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７４．４０．３１７　およびＥ　ｕ　ｒ　ｏ　ｐ　ｅ　ａ　ｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８４．　１３８．　９）ｌこで表しである。ヌクレオチド残基においても同様（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ、サムプルツク（Ｓａｍｌ）ｒｏｏｋ）ら　１ｂｉｄ）である。

μ】浄書（内容に変更なし）ＰｓｔＩ　ＢｓｔＥＵ浄書（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし、）浄：Ｊｉ（内５にユ更なし）浄書（内′ｆ：：こ変更なし）浄書（内容に変更なし）浄：ｉｉ＜内容に変更なし）競合抗体濃度（ＬＯ（１１０ｎａｎｏｍｏＬａｒ　Ｆｏｂ）浄書（内容に変更なし）抗体濃度（Ｌｏ９１０　μｍ／ｒｒ＋ｔ）浄書（内容に二叉なし）要約書抗体の調製ＣＤ３抗原に対する結合親和性を持ち、そのリガンドの可変枠組み構造領域および／または定常部とは異なるオリジン由来のＣＤＲであ、て、以下のアミノ酸（ａ）　Ｓｅｔ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ。

（ｂ）　Ｔｈｒ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ− Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−八ｒｇ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｖａｌ| Ｌｙｓ−Ｇｌｙ。

（ｃ）　Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ− Ａｓｐ−Ｔｙｒ。

（ｄ）　Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−人５ｎ−１１ｅ−Ｇｌｕ− ＾５ｎ−Ａｓｎ−ＴｙｒＪａｌ−Ｈｉｓ。

（ｅ）　Ａｓｐ−Ａｓｐ−＾ｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ。

手続補正書平成　４年　８月メア日

Claims

【特許請求の範囲】１．下記のアミノ酸配列：（ａ）【配列があります】（ｂ）【配列があります】（ｃ）【配列があります】（ｄ）【配列があります】（ｅ）【配列があります】（ｆ）【配列があります】から選択される、本来のリガンドの可変枠組み構造領域および／または定常領域とは由来が異なるＣＤＲを少なくとも１つ有し、そしてＣＤ３抗原に対する結合親和性を持つリガンドおよび保存的に改変されたその変異体。２．アミノ酸配列（ａ），（ｂ）および（ｃ）に相当する３つのＣＤＲおよび／またはアミノ酸配列（ｄ），（ｅ）および（ｆ）に相当する３つのＣＤＲを有する請求項１記載のリガンド。３．本来の可変枠組み構造領域および／または定常領域とは異なる由来の以下のアミノ酸配列：（ａ）【配列があります】（ｂ）【配列があります】（ｃ）【配列があります】および保存的に改変されたその変異体から選択されるＣＤＲを少なくとも１つ有する重鎖、および／または本来の可変枠組み構造領域および／または定常領域とは異なる由来の以下のアミノ酸配列：（ｄ）【配列があります】（ｅ）【配列があります】（ｆ）【配列があります】および保存的に改変されたその変異体から選択されるＣＤＲを少なくとも１つ有する軽鎖を持ち、そしてＣＤ３抗原に対する結合親和性を持つ抗体またはそのフラグメント。４．３つのＣＤＲ（ａ），（ｂ）および（ｃ）または保存的に改変されたそれらの変異体が存在するような、請求項１ないし３のいずれか１項記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメント。５．本来の可変枠組み構造領域および／または定常領域とは異なる由来の以下のアミノ酸残基：（ａ）【配列があります】（ｂ）【配列があります】（ｃ）【配列があります】および保存的に改変されたその変異体から選択されるＣＤＲを少なくとも１つ有する重鎖、および本来の可変枠組み構造領域および／または定常領域とは異なる由来の以下のアミノ酸残基：（ｄ）【配列があります】（ｅ）【配列があります】（ｆ）【配列があります】および保存的に改変されたその変異体から選択されるＣＤＲを少なくとも１つ有する軽鎖を持ち、重鎖ＣＤＲはリーダー→定常領域の向きに（ａ），（ｂ），（ｃ）の順に、軽鎖ＣＤＲはリーダー→定常領域の向きに（ｄ），（ｅ），（ｆ）の順に編成されている、ＣＤ３抗原に対する結合親和性を持つ、抗体またはそのフラグメント。６．単数または複数のＣＤＲがヒト由来のものであるかまたはそれから派生したものである可変ドメイン枠組み構造領域と組み合わされた、請求項１ないし５のいずれか１項記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメント。７．重鎖可変ドメイン枠組み構造領域が、リーダー→定常領域の内きに読んで、【配列があります】（配列中の記号ＣＤＲはＣＤＲの存在を示すものであり、それらのうちの少なくとも一つは（ａ），（ｂ）もしくは（ｃ）であるかまたは保存的に改変されたその変異体である）から成る、請求項６記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメント。８．軽鎖可変ドメイン枠組み構造領域が、リーダー→定常領域の向きに読んで、【配列があります】（配列中の記号ＣＤＲはＣＤＲの存在を示すもめであり、それらのうちの少なくとも一つは（ｄ），（ｅ）ものであり（ｆ）であるかまたは保存的に改変されたその変異体である）から成る、請求項６または７記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメント。９．【配列があります】から成る重鎖可変ドメインを持つ請求項６記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメント。１０．【配列があります】から成る軽鎖可変ドメインを持つ請求項６または９記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメント。１１．ヒト由来の定常ドメインまたはそれから派生した定常ドメインを持つ、請求項１ないし１０のいずれか１項記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメント。１２．その腕の一方のみがＣＤ３抗原に対する親和性を持つ、請求項３ないし１１のいずれか１項記載の抗体またはそのフラグメント。１３．１価性の、請求項１２記載の抗体またはそのフラグメント。１４．抗体分子の半分は完全な重鎖と軽鎖とから成り、もう半分は類似しているが軽鎖との結合部位を欠く短縮された重鎖から成る、請求項１３記載の抗体フラグメント。１５．クローニングビークルまたは発現ベクター配列、および請求項１で定義した（ａ）ないし（ｅ）のアミノ酸配列の少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列からなる組み換えＤＮＡ。１６．クローニングビークルまたは発現ベクター配列、および（ａ）【配列があります】（ｂ）【配列があります】（ｃ）【配列があります】（ｄ）【配列があります】（ｅ）【配列があります】（ｆ）【配列があります】の少なくとも１つのヌクレオチド配列からなる、請求項１５記載の組み換えＤＮＡ。１７．クローニングビークルまたは発現ベクター配列、および請求項９と１０で定義したアミノ酸配列の一方または両方をコードするヌクレオチド配列からなる、請求項１５記載の組み換えＤＮＡ。１８．クローニングビークルまたは発現ベクター配列、および（１）【配列があります】（２）【配列があります】の一方または両方のヌクレオチド配列からなる、請求項１５記載の組み換えＤＮＡ。１９．発現系によるリガンド、抗体またはそのフラグメントの発現を生じさせること、および適切な場合には抗体を処理してそのフラグメントを作製することから成る、請求項１ないし１４のいずれか１項記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメントの産生のための方法。２０．発現系が請求項１６ないし１８のいずれか１項記載の組み換えＤＮＡを含む、請求項１９記載の方法。２１．請求項１５ないし１８のいずれか１項記載の組み換えＤＮＡを含む宿主細胞。２２．先理学的に許容しうる希釈剤または担体を含む薬剤組成物の形の、請求項１ないし１４のいずれか１項記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメント。２３．治療において使用するための、請求項１ないし１４のいずれか１項記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメント。２４．免疫抑制において使用する薬剤の製造のための、請求項１ないし１４のいずれか１項記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメントの用途。２５．薬剤が移植の受容者の治療に利用されることを特徴とする、請求項１９記載の用途。２６．ガンを患った、または免疫抑制を要する患者に治療上有効量の請求項１ないし１４のいずれか１項記載のリガンドまたは抗体またはそのフラグメントを投与することからなる、該患者の治療方法。