DE69129896T2

DE69129896T2 - Gegen cd3 gerichtete antikörper

Info

Publication number: DE69129896T2
Application number: DE69129896T
Authority: DE
Inventors: Scott David Great Shelford Cambridge Cb2 5Jn Gorman; Edward Graham Cambridge Cb1 4Xq Routledge; Herman Cambridge Cb4 2Ed Waldmann
Original assignee: British Technology Group Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1990-10-05
Filing date: 1991-10-04
Publication date: 1998-12-10
Anticipated expiration: 2011-10-05
Also published as: AU8546891A; ATE169058T1; DE69129896D1; CA2070659C; GB9021679D0; GB2249310A; ZA917960B; CA2070659A1; WO1992006193A1; GB9121126D0; EP0504350A1; EP0504350B1; GB2249310B; KR927003816A; JP3081641B2; KR100245564B1; NZ240080A; AU651623B2; JPH05502384A; ES2121788T3

Description

Die Erfindung betrifft Antikörper, insbesondere umgestaltete Antikörper, die gegen das CD3-Antigen auf der Oberfläche menschlicher T-Zellen gerichtet sind.
Antikörper oder Immunglobuline umfassen zwei schwere Ketten, die miteinander durch Disulfidbindungen verbunden sind, und zwei leichte Ketten, wobei jede leichte Kette mit einer jeweiligen schweren Kette durch Disulfidbindungen in einer "Y"-förmigen Konfiguration verbunden ist. Die zwei "Arme" des Antikörpers sind für die Antigenbindung verantwortlich, indem sie Regionen aufweisen, wo die Polypeptidstruktur variiert, und werden als Fab'-Fragmente (Fragment-Antigen-Bindung) oder F(ab')&sub2;, was bedeutet, daß zwei Fab'-Arme miteinander durch Disulfidbindungen verbunden sind, bezeichnet. Der "Schwanz" oder die zentrale Achse des Antikörpers enthält eine festgelegte oder konstante Sequenz von Peptiden und wird als Fc-Fragment (Fragment-kristallin) bezeichnet. Die Erzeugung monoklonaler Antikörper wurde erstmals durch Köhler und Milstein (Köhler & Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975)) offenbart. Solche monoklonalen Antikörper haben umfassende Verwendung als diagnostische Mittel und auch in der Therapie gefunden.
Jede schwere Kette hat an einem Ende eine variable Domäne, gefolgt von einer Anzahl konstanter Domänen. Jede leichte Kette hat eine variable Domäne an einem Ende und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende, wobei die variable Domäne der leichten Kette bezüglich der variablen Domäne der schweren Kette über Hybridisierung ausgerichtet ist (Alignment) und die konstante Domäne der leichten Kette bezüglich der ersten konstanten Domäne der schweren Kette (CH1) über Hybridisierung ausgerichtet ist (Alignment). Die konstanten Domänen in den leichten und schweren Ketten sind nicht direkt an der Antikörper-Antigen-Bindung beteiligt. Die konstante Region der leichten Kette und die CH1- Region der schweren Kette bilden 50% jedes Fab'-Fragments.
Die variablen Domänen jedes Paars leichter und schwerer Ketten bilden die Antigenbindungsstelle. Die Domänen auf den leichten und schweren Ketten haben die gleiche allgemeine Struktur und jede Domäne umfaßt vier Gerüstregionen, deren Sequenzen relativ konserviert sind und die durch drei "complementarity- determining regions" (CDR) verbunden sind (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1987)). Die vier Gerüstregionen nehmen im wesentlichen eine β-Faltblattkonformation an und die CDR bilden Schleifen oder Loops, die die β-Faltblattstruktur verbinden und in einigen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDR werden durch die Gerüstregionen in großer Nähe gehalten und tragen mit den CDR der anderen Domäne zu der Bildung der Antigenbindungsstelle bei.
In den letzten Jahren haben molekularbiologische Techniken die Erzeugung einer großen Vielzahl heterologer Polypeptide durch Transformation von Wirtszellen mit DNS-Sequenzen, die das gewünschte Polypeptid kodieren, ermöglicht. Immunglobulin- Polypeptide sind durch rekombinante DNS-Verfahren hergestellt worden, siehe beispielsweise EP-A-0088994 (Schering Corporation), EP-A-1102634 (Takeda Chemical Industries Ltd.) und EP-A- 0125023 (Genentech Inc.). Diese Techniken haben auch die stabile Einführung von Immunglobulingenen in Myelomzellen ermöglicht.
Wenn monoklonale Antikörper aus Maus oder Ratte oder sogar teilweise menschliche chimäre Antikörper (Antikörper, in denen der Antigenbindungs-Abschnitt eines Immunglobulins an zumindest einen Teil eines anderen Proteins durch Peptid-Verknüpfung angeheftet ist), umfasend eine variable Domäne von Maus oder Ratte, in einen Menschen im Rahmen einer Therapie injiziert wird, könnte das Immunsystem des menschlichen Körpers diese variable Domäne als fremd erkennen und folglich eine Immunantwort produzieren. Daher würde bei wiederholten Injektionen des monoklonalen Antikörpers aus Maus oder Ratte oder des chimären Antikörpers in Menschen die Wirksamkeit verloren gehen oder verringert werden durch die Reaktion des Immunsystems des Körpers gegen den fremden Antikörper.
EP-A-0239400 (Winter) beschreibt einen monoklonalen Antikörper, in dem nur die CDR des Antikörpers dem Körper fremd sind, um Nebenwirkungen aufgrund von dessen Antigenität zu minimieren, wenn dieser für eine Therapie am Menschen verwendet wird. Obwohl beispielsweise Gerüstregionen von Mensch, Maus und Ratte charakteristische Sequenzen aufweisen, scheint es keine charakteristischen Eigenschaften zu geben, die menschliche CDR von jenen aus Maus und Ratte unterscheiden. Folglich könnte ein Antikörper, der CDR aus Maus oder Ratte in einer menschlichen Gerüstsequenz umfaßt, sehr wohl dem Körper nicht fremder sein als ein rein menschlicher Antikörper.
Es ist jedoch nicht klar, daß das Verfahren einer "Humanisierung" ("humanizing") von Antikörpern, das in der vorstehend genannten Anmeldung beschrieben ist, geeignet sein wird, um als ein allgemeines Verfahren auf alle Antikörper angewendet zu werden. Antikörper haben entweder leichte kappa- oder lambda-Ketten und eine der schweren alpha-, mu-, gamma-, epsilon- oder delta- Ketten, von denen spezielle Kombinationen das vorstehend angesprochene Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern unanwendbar machen könnten.
Bis jetzt enthielten alle humanisierten Antikörper eine leichte Kette des kappa-Typs. Es hat sich jedoch jetzt als möglich erwiesen, einen gegen das humane T-Zell-CD3-Antigen gerichteten Antikörper (den durch das Ratten-Hybridom YTH12.5.14.2., nachfolgend bezeichnet als YTH12.5, sezernierten monoklonalen Antikörper) zu humanisieren, sogar obwohl der Antikörper eine leichte Kette vom lambda-Typ aufweist. Die Gegenwart der leichten lambda-Kette erforderte eine andere Strategie als jene, die für die Humanisierung des monoklonalen Antikörpers aus der Maus verwendet worden war, wie in EP-A-0239400 beschrieben.
Demgemäß umfaßt die Erfindung einen Liganden, Antikörper oder ein Antikörperfragment mit einer Bindungsaffinität für das CD3-Antigen, welcher bzw. welches eine menschliche konstante Region, eine variable Gerüstregion von Mensch oder Ratte und mindestens eine "complementarity-determining region" (CDR), ausgewählt aus den Aminosäuresequenzen:
(a) Ser-Phe-Pro-Met-Ala,
(b) Thr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val- Lys-Gly,
(c) Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr,
(d) Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn-Tyr-Val-His,
(e) Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp,
(f) His-Ser-Tyr-Val-Ser-Ser-Phe-Asn-Val,
und konservativ modifizierten Varianten davon, aufweist.
Der Begriff "konservativ modifizierte Varianten" ist im Stand der Technik wohlbekannt und bezeichnet Varianten, die Änderungen enthalten, die im wesentlichen ohne Auswirkung auf die Antikörper-Antigen-Affinität sind.
Die CDR der Erfindung befinden sich innerhalb von Gerüstregionen der variablen Domänen der schweren Kette (für (a), (b) und (c)) bzw. der leichten Kette (für (d), (e) und (f)). Die variablen Gerüstregionen können von Mensch oder Ratte stammen. Im letzteren Falle kann die variable Gerüstregion beispielsweise von der YTH 12.5-Zellinie abgeleitet sein. Jedoch sind die variablen Gerüstregionen und die konstanten Regionen vorzugsweise beide menschlichen Ursprungs.
Erfindungsgemäße Liganden können variierende Anzahlen von CDR enthalten. So enthalten beispielsweise die als molekulare Erkennungseinheiten bekannten Liganden eine einzige CDR; von wesentlich größerem Interesse unter den Liganden, die entweder eine schwere oder eine leichte Kette enthalten, sind aber die Einzeldomänenliganden, die in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0368684 beschrieben sind, die drei CDR enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat dementsprechend der Ligand drei CDR, entsprechend den vorstehend aufgeführten Aminosäuresequenzen (a), (b) und (c) oder konservativ modifizierten Varianten davon, und/oder drei CDR, entsprechend den Aminosäuresequenzen (d), (e) und (f) oder konservativ modifizierten Varianten davon, wobei die CDR der schweren Kette (a), (b) und (c) von größter Bedeutung sind.
Die Erfindung ist jedoch von besonderem Interesse in Bezug auf ganze Antikörper oder Fragmente davon, die sowohl variable Regionen der schweren Ketten als auch solche der leichten Kette enthalten. Folglich hat der Ligand der Erfindung vorzugsweise die Form eines Antikörpers oder Fragments davon mit einer Bindungsaffinität für das CD3-Antigen, welcher bzw. welches eine schwere Kette mit mindestens einer CDR, ausgewählt aus den Aminosäuresequenzen:
(a) Ser-Phe-Pro-Met-Ala,
(b) Thr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val-Lys-Gly,
(c) Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr,
und konservativ modifizierten Varianten davon, und/oder eine leichte Kette mit mindestens einer CDR, ausgewählt aus den Aminosäuresequenzen:
(d) Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn-Tyr-Val-His,
(e) Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp,
(f) His-Ser-Tyr-Val-Ser-Ser-Phe-Asn-Val.
und konservativ modifizierten Varianten davon, aufweist.
Obwohl, wie vorstehend angegeben, erfindungsgemäße Liganden nicht sowohl eine oder mehrere der angegebenen CDR der schweren Kette als auch eine oder mehrere der angegebenen CDR der leichten Kette enthalten müssen, wird das bei den Antikörpern oder Fragmenten davon üblicherweise der Fall sein. Die CDR (a), (b) und (c) sind in der schweren Kette des Ratten-Hybridoms YTH12.5 in der Reihenfolge: Gerüstregion 1/(a)/Gerüstregion 2/(b)/Gerüstregion 3/(c)/Gerüstregion 4 in Richtung Leader T konstante Region angeordnet; und die CDR (d), (e) und (f) sind in der leichten Kette des Hybridoms in der Reihenfolge: Gerüstregion 1/(d)/Gerüstregion 2/(e)/Gerüstregion 3/(f)/Gerüstregion 4 in Richtung Leader T konstante Region angeordnet. Es ist dementsprechend bevorzugt, daß in den Fällen, wo alle drei anwesend sind, die CDR der schweren Kette in der Reihenfolge (a), (b), (c) in Richtung Leader T konstante Region und die CDR der leichten Kette in der Reihenfolge (d), (e), (f) in Richtung Leader T konstante Region angeordnet sind.
Es sollte berücksichtigt werden, daß es möglich sein kann, daß schwere Ketten und insbesondere leichte Ketten nur eine oder zwei der CDR (a), (b) und (c) bzw. (d), (e) und (f) enthalten. Obwohl jedoch die Gegenwart aller sechs vorstehend definierten CDR dementsprechend in einem erfindungsgemäßen Antikörper oder Fragment davon nicht notwendigerweise erforderlich ist, werden in der Regel alle sechs CDR vorliegen. Ein besonders bevorzugter Antikörper oder ein derartiges Fragment davon hat dementsprechend eine schwere Kette mit drei CDR, umfassend die Aminosäuresequenzen (a), (b) und (c) oder konservativ modifizierte Varianten davon, und eine leichte Kette mit drei CDR, umfassend die Aminosäuresequenzen (d), (e) und (f) oder konservativ modifizierte Varianten davon, wobei die CDR der schweren Kette in der Reihenfolge (a), (b), (c) in Richtung Leader T konstante Region und die CDR der leichten Kette in der Reihenfolge (d), (e), (f) in Richtung Leader T konstante Region angeordnet sind.
Die Erfindung kann auf Antikörper angewendet werden, die eine "Y"-förmige Konfiguration aufweisen und die zwei identische leichte und zwei identische schwere Ketten haben und folglich hinsichtlich jeder Antigenbindungsstelle mit einer Affinität für das CD3-Antigen bivalent sind. Alternativ können Fab'- oder F(ab')&sub2;-Fragmente, die noch die CDR enthalten, hergestellt werden. Die Erfindung ist auch auf Antikörper und gegebenenfalls Fragmente davon anwendbar, in denen nur einer der Arme des Antikörpers eine Bindungsaffinität für das CD3-Antigen aufweist. Solche Antikörper können verschiedene Formen annehmen. So kann der andere Arm des Antikörpers eine Bindungsaffinität für ein anderes Antigen als CD3 aufweisen, so daß der Antikörper ein bispezifischer Antikörper ist, wie beispielsweise in dem U.S.- Patent Nr. 4,474,893 und den Europäischen Patentanmeldungen Nr. 87907123.1 und 87907124.9 beschrieben. Alternativ kann der Antikörper nur einen Arm haben, der eine Bindungsaffinität ausübt, wobei ein solcher Antikörper als "monovalent" bezeichnet wird.
Monovalente Antikörper (oder Antikörperfragmente) können auf mehrere Weisen hergestellt werden. Glennie und Stevenson (Nature, 295, 712-713 (1982)) beschreiben ein Verfahren zum Herstellen monovalenter Antikörper durch enzymatischen Verdau. Stevenson et al. beschreiben eine zweite Strategie zur Herstellung von monovalenten Antikörpern, in der enzymatisch erzeugte Fab'- und Fc-Fragmente chemisch vernetzt werden (Anticancer Drug Design, 3, 219-230 (1989)). In diesen Verfahren haben die resultierenden monovalenten Antikörper einen ihrer Fab'-Arme verloren. Ein drittes Verfahren zur Herstellung monovalenter Antikörper ist in dem Europäischen Patent Nr. 131424 beschrieben. Bei dieser Strategie wird die "Y"-Gestalt des Antikörpers beibehalten, aber nur eine der zwei Fab'-Domänen bindet das Antigen. Dies wird erreicht, indem in das Hybridom ein Gen eingeführt wird, das eine irrelevante leichte Kette kodiert, die sich mit der schweren Kette des Antikörpers verbindet unter Erzeugung eines Gemisches von Produkten, in welchem der monovalente Antikörper der von Interesse ist.
Noch bevorzugter werden jedoch die monovalenten CD3- Antikörper der Erfindung durch ein neues Verfahren hergestellt. Dieses umfaßt, ein Gen, das eine verkürzte schwere Kette kodiert, in der die Domäne der variablen Region und die Domäne der ersten konstanten Region der schweren Kette fehlen, wobei dem Gen das Exon für jede dieser Domänen fehlt, zusammen mit Genen, die die schweren und leichten Ketten kodieren, in ein geeignetes Expressionssystem, beispielsweise ein Zellsystem, wie nachfolgend beschrieben, einzuführen. Dies führt zu der Produktion einer Mischung von (a) Antikörpern, die vollständige bivalente Antikörper sind, (b) Antikörperfragmenten, die nur aus zwei verkürzten schweren Ketten bestehen (d.h. einem Fc-Fragment), und (c) Antikörperfragmenten, die hinsichtlich des CD3-Antigens monovalent sind, bestehend aus einer verkürzten schweren Kette und einer leichten Kette assoziiert mit der normalen schweren Kette. Ein solches Antikörperfragment (c) ist monovalent, da es nur einen Fab'-Arm hat. Eine Produktion eines monovalenten Antikörpers in Form eines solchen Fragments durch dieses Verfahren ist aus einer Reihe von Gründen bevorzugt. So ist das resultierende Antikörperfragment leicht aus einer Mischung von Antikörpern, die durch das Zellsystem produziert werden, zu reinigen; z.B. kann es einfach auf Grundlage seines Molekulargewichts abtrennbar sein. Dies ist bei dem Verfahren des Europäischen Patents Nr. 131424 nicht möglich, bei dem der erzeugte monovalente Antikörper ähnliche Eigenschaften wie ein bivalenter Antikörper hinsichtlich dessen Größe und äußerem Erscheinungsbild aufweist. Zusätzlich setzt die Produktion eines monovalenten Antikörperfragments durch das neue Verfahren Bedingungen ein, die leichter gesteuert werden können, und wird folglich nicht so vom Zufall bestimmt wie ein Enzym-Verdau/chemische Kopplung-Verfahren, das die Auftrennung eines komplexen Reaktionsprodukts erfordert, mit dem zusätzlichen Vorteil, daß die verwendete Zellinie fortlaufend monovalente Antikörperfragmente produziert, ohne daß kontinuierliche Syntheseverfahren benötigt werden, wie sie bei dem Enzym-Verdau/chemische Kopplung-Verfahren erforderlich sind.
Die CDR der Erfindung entsprechen jenen, die in dem Ratten- CD3-Antikörper YTH 12.5 vorliegen.
Für die Humanisierung der Ratten-CDR sind bestimmte Gerüstsequenzen der variablen Region vom Menschen für eine Kombination mit den erfindungsgemäßen CDR-Sequenzen bevorzugt, da die dreidimensionale Konformation der CDR in solchen Sequenzen besser bewahrt wird und der Antikörper ein hohes Maß an Bindungsaffinität für das Antigen beibehalten wird. Wünschenswerte Eigenschaften in solchen variable Domäne-Gerüstsequenzen sind die Anwesenheit von Schlüssel-Aminosäuren, die die Struktur der CDR-Loops aufrechterhalten, um die Affinität und Spezifität des Antikörpers für das CD3-Antigen sicherzustellen, wobei der lambda-Typ für die leichte Kette bevorzugt ist.
Wir haben Gerüstsequenzen der variablen Region vom Menschen identifiziert, die für eine Verwendung in Verbindung mit den CDR der Erfindung besonders geeignet sind. Die Gerüstsequenzen der variablen (V-) Region der schweren Kette sind jene, die durch das humane VH Typ III-Gen VH26.D.J., das von der B-Zell-Hybridom-Zellinie 18/2 (Genbank-Code: Huminghat, Dersimonian et al., Journal of Immunology, 139, 2496-2501) stammt, kodiert werden. Die Gerüstsequenzen der variablen Region der leichten Kette sind jene des humanen VLλ Typ VI-Gens SUT (Swissprot-Code; LV6CSHum, Solomon et al.: in: Glenner et al. (Hsg.), Amyloidosis, Plenum Press N.Y., 1986, S. 449).
Die eine oder die mehreren CDR der schweren Kette des anti- CD3-Antikörpers der Ratte liegen dementsprechend vorzugsweise in einer variable Domäne-Gerüstsequenz vom Menschen vor, die die folgende Aminosäuresequenz, gelesen in Richtung Leader T konstante Region, aufweist, wobei CDR eine CDR (a), (b) oder (c), wie vorstehend definiert, eine konservativ modifizierte Variante davon oder eine alternative CDR angibt:
In einem bevorzugten Antikörper, der alle drei CDR enthält, umfaßt die variable Region der schweren Kette die folgende Sequenz:
In ähnlicher Weise liegen die eine oder die mehreren CDR der leichten Kette des CD3-Antikörpers der Ratte dementsprechend vorzugsweise in einer variable Domäne-Gerüstsequenz vom Menschen vor, die die folgende Aminosäuresequenz, gelesen in Richtung Leader T konstante Region, aufweist, wobei CDR eine CDR (d), (e) und (f), wie vorstehend definiert, eine konservativ modifizierte Variante davon oder eine alternative CDR angibt:
In einem bevorzugten Antikörper, der alle drei CDR der variablen Region der leichten Kette enthält, ist die folgende Sequenz enthalten:
Die variablen Domänen, die eine oder mehrere CDR, wie vorstehend beschrieben, vorzugsweise in der humanisierten Form mit menschlichen, von Antikörpern abgeleiteten Gerüstregionen enthalten, können passenderweise an ein anderes Protein oder einen Träger oder an konstante Domänen von leichten und schweren Ketten von Antikörpern angeheftet sein.
Die Natur der konstanten Regionen der schweren und leichten Kette hat weniger Auswirkungen auf die Bindungsaffinität als jene der Gerüstsequenz der variablen Domäne und diese können auf Antikörpern unterschiedlicher Typen beruhen, sofern gewünscht, stammen aber vorzugsweise von jenen menschlichen Ursprungs oder sind davon abgeleitet und können aus verschiedenen unterschiedlichen Klassen stammen, obwohl hinsichtlich der leichten Kette die konstante Region in aller Regel vom lambda-Typ sein wird und hinsichtlich der schweren Kette sie geeigneterweise von einer IgG-Klasse, insbesondere IgG1, stammen wird. Folglich können die konstanten Domänen passenderweise ausgewählt werden, so daß sie die gewünschten Effektorfunktionen aufweisen, die für die beabsichtigte therapeutische Verwendung des Antikörpers geeignet sind.
Es ist auch zu berücksichtigen, daß ein erfindungsgemäßer Antikörper in einer Form verwendet werden kann, in der die CDR noch enthalten sind, der jedoch andere Teile des Moleküls, die für dessen Bindungsfunktion nicht essenziell sind, fehlen. Insbesondere können, wie vorstehend angegeben, Fab'- und F(ab')&sub2;- Fragmente verwendet werden oder die die CDR der Erfindung enthaltenden variablen Regionen können an ein geeignetes Protein oder ein geeignetes Trägermolekül angeheftet sein.
Es ist im Stand der Technik wohlbekannt, daß der Ersatz einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften, beispielsweise der Ersatz eines Glutaminsäurerests durch einen Asparaginsäurerest, die Eigenschaften oder die Struktur des Peptids oder Proteins, in dem die Substitution oder Substitutionen vorgenommen wurde(n), nicht wesentlich verändern muß. Folglich umfaßt die Erfindung jene CDR-Aminosäuresequenzen, in denen eine solche Substitution oder solche Substitutionen aufgetreten sind, ohne die Bindungsaffinität und Spezifität der CDR wesentlich zu verändern. Alternativ können Deletionen in der Aminosäuresequenz der CDR vorgenommen werden oder die Sequenzen können an dem N-Terminus oder dem C-Terminus oder an beiden verlängert werden, wobei sie nach wie vor ihre Aktivität beibehalten.
Wie vorstehend angegeben, erstreckt sich die Erfindung dementsprechend auf Liganden, in denen die CDR konservativ modifiziert sein können unter Bereitstellung einer Variante davon, die eine Bindungsaffinität für das CD3-Antigen bewahrt. Bevorzugte Liganden sind dergestalt, daß die Affinitätskonstante für das Antigen 10&sup5; mol&supmin;¹ oder mehr beträgt, beispielsweise bis zu 10¹² mol&supmin;¹. Liganden unterschiedlicher Affinitäten können für unterschiedliche Verwendungen nützlich sein, so daß beispielsweise eine Affinität von 10&sup6;, 10&sup7; oder 10&sup8; mol&supmin;¹ oder mehr in einigen Fällen geeignet sein kann. Jedoch werden Liganden mit einer Affinität im Bereich von 10&sup6; bis 10&sup8; mol&supmin;¹ oftmals geeignet sein. Passenderweise weisen die Liganden auch keine substantielle Bindungsaffinität für andere Antigene auf. Bindungsaffinitäten des Liganden und die Ligandenspezifität können durch Assayverfahren, wie jene, die in dem nachfolgenden Beispiel-Abschnitt beschrieben sind (Effector-Cell-Retargetting-Assay), oder durch Techniken, wie ELISA, und andere Immunoassays,untersucht werden.
Die Liganden der Erfindung können auf mehrere Weisen hergestellt werden. Am bequemsten werden jedoch geeignete Genkonstrukte für die konstanten und variablen Regionen der schweren und leichten Ketten, die in dem Liganden vorliegen, getrennt erhalten und dann in ein geeignetes Expressionssystem insertiert. Ein Antikörperfragment kann aus ganzen Antikörpermolekülen auf übliche Weise hergestellt oder wie vorstehend für monovalente Antikörperfragmente beschrieben direkt durch das Expressionssystem produziert werden.
Gene, die die variablen Domänen eines Liganden der gewünschten Struktur kodieren, können produziert und in geeigneter Weise an Gene, die die konstanten Domänen eines Antikörpers des gewünschten Isotyps und der gewünschten therapeutischen Anwendbarkeit kodieren, angefügt werden. Diese konstanten Gene können aus Hybridom-cDNS oder aus der chromosomalen DNS oder durch Mutagenese (ortsgerichtet) solcher Gene, um konstante Regionen mit neuen Eigenschaften zu produzieren, erhalten werden. Gene, die die variablen Regionen kodieren, können ebenfalls durch Gensynthesetechniken, die bei der Identifizierung der darin enthaltenen CDR verwendet werden, abgeleitet werden. Mehrere Typen von Klonierungshilfsmitteln für die DNS können geeignet sein.
Eine Expression dieser Gene durch Züchtung eines Zellsystems, um einen funktionalen CD3-Liganden zu produzieren, wird am bequemsten ausgeführt durch Transformieren eines geeigneten prokaryotischen oder insbesondere eukaryotischen Zellsystems, insbesondere einer immortalisierten Säugetier-Zellinie, wie einer Myelomzelllinie, beispielsweise der YB2/3.01/Ag20-Rattenmyelomzelle (nachfolgend bezeichnet als Y0) oder Eierstockzellen von chinesischen Hamstern, (obwohl die Verwendung von Pflanzenzellen ebenfalls von Interesse ist) mit Expressionsvektoren, die DNS enthalten, die die verschiedenen Antikörperregionen kodiert, und darauffolgendes Züchten des transformierten Zellsystems zur Erzeugung des gewünschten Antikörpers. Solche allgemeinen Techniken zur Verwendung für die Herstellung von erfindungsgemäßen Liganden sind in dem unmittelbar zu berücksichtigenden Stand der Technik der Gentechnologie wohlbekannt und sind in Veröffentlichungen, wie "Molecular Cloning" von Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989 (2. Auflage) beschrieben. Die Techniken werden ferner durch die hier enthaltenen Beispiele veranschaulicht.
Demgemäß umfaßt die Erfindung ferner DNS-Sequenzen, die die CDR des Liganden/Antikörpers der Erfindung kodieren. Eine Gruppe von Nukleotidsequenzen, die die vorstehend beschriebenen CDR (a) bis (f) kodieren, wird nachfolgend jeweils unter (a) bis (f) angegeben, aber es versteht sich, daß die Degeneriertheit des genetischen Codes die Vornahme von Variationen in diesen Sequenzen zuläßt, wobei diese nach wie die Aminosäuresequenzen der CDR kodieren.
Die Erfindung umfaßt insbesondere auch größere DNS- Sequenzen, die (1) DNS, die Gerüstregionen der menschlichen schweren Kette und eine oder mehrere von (a), (b) und (c) exprimiert, und (2) DNS, die Gerüstregionen der menschlichen leichten Kette und eine oder mehrere von (d), (e) und (f) exprimiert, umfassen. Ein spezielles Beispiel einer derartigen DNS ist jene Sequenz (1), die nachfolgend angegeben ist und die die CDR (a), (b) und (c) kodiert, angeordnet in der Gerüstsequenz der schweren Kette, die durch das menschliche VH Typ III-Gen VH26.D.J., wie vorstehend diskutiert, kodiert wird, und jene Sequenz (2), die nachfolgend angegeben ist und die die CDR (d), (e) und (f) kodiert, angeordnet in der Gerüstsequenz der leichten Kette, die durch das menschliche VLλ Typ VI-Gen SUT kodiert wird. Die CDR- Sequenzen (a), (b), (c), (d), (e) und (f) sind unterstrichen.
Die humanisierten Liganden gemäß der Erfindung sind von Wert für die Therapie. Insbesondere hat ein umgestalteter, insbesondere ein humanisierter Antikörper, mit einer Spezifität für das CD3-Antigen wertvolle Anwendungsmöglichkeiten zur Immunsuppression, insbesondere zur Kontrolle von Transplantatabstoßung und möglicherweise auch in anderen Gebieten, wie der Behandlung von Krebs, insbesondere von lymphatischen Krebserkrankungen und tatsächlich allgemein von Lymphomen.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt umfaßt die Erfindung folglich ein Verfahren zum Behandeln von Patienten mit Lymphomen oder zum Zwecke der Immunsuppression, beispielsweise in einem Falle, wo eine Transplantatabstoßung auftreten könnte, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Liganden.
Erfindungsgemäße Liganden können für eine Verabreichung an Patienten formuliert werden, indem der Ligand zusammen mit einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger formuliert wird. Die Liganden werden vorzugsweise in einer injizierbaren Form zusammen mit einem solchen Verdünnungsmittel oder Träger, der steril und pyrogenfrei ist, verabreicht. Als Richtlinie kann angegeben werden, daß eine geeignete Dosis des Liganden ungefähr 1 - 10 mg beträgt, die täglich über einen Zeitraum von beispielsweise 10 Tagen injiziert werden. Um eine schwerwiegende Reaktion auf die erste Dosis zu vermeiden, können geeignete Anti-Cytokine mit der ersten Injektion verabreicht werden. Eine solche Vorgehensweise vereinfacht die Verwendung einer Dosierung an der Obergrenze des 1-10 mg-Bereichs oder sogar von etwas mehr.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die durch die nachfolgend aufgeführten Zeichnungen veranschaulicht werden.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1:

Position und Sequenz der Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotidprimer, die bei der cDNS-Synthese und PCR-Amplifizierung des YTH12.5 VL lambda-Gens aus Ratte verwendet worden sind.

Figur 2:

Klonierung und Umgestaltung des YTH12.5 VH-Gens.

Figur 3:

Umgestaltung des YTH12.5 VL-Gens und Konstruktion des Expressionsvektors für die leichte Kette des YTH12.5-Immunglobulins.

Figur 4:

Konstruktion des Expressionsvektors für die umgestaltete schwere Kette des YTH12.5-Immunglobulins.

Figur 5:

Konstruktion des Expressionsvektors für das verkürzte menschliche Gen für die schwere IgG1-Kette (tH).

Figur 6:

Native PAGE von Protein A-gereinigtem Gesamtimmunglobulin, sezerniert durch Zellen, die mit den Expressionsvektoren für die Gene der humanisierten schweren, leichten und verkürzten schweren CD3-Ketten cotransfiziert worden sind.

Figur 7:

Reduzierte (unter reduzierenden Bedingungen durchgeführte) (7a) und nicht-reduzierte (unter nicht-reduzierenden Bedingungen durchgeführte) (7b) SDS-PAGE der Antikörpermoleküle entsprechend den native PAGE-Banden 1, 2 und 3 (Bahnen 1, 2 bzw. 3).

Figur 8:

Humanisierte bivalente und monovalente CD3-Antikörper wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die T-Zell-Abtötung von Fc- Rezeptor tragenden U937-Zellen zu bewirken, untersucht. Der bivalente monoklonale YTH12.5-CD3-Antikörper aus Ratte und der humanisierte CDw52-Antikörper wurden als Kontrollen untersucht.

Figur 9:

Vergleich der Antikörperbindung von humanisierten monovalenten und bivalenten CD3-Antikörpern mit bivalentem monoklonalem YTH12.5-CD3-Antikörper aus Ratte. Der humanisierte CDw52- Antikörper wurde als Negativkontrolle aufgenommen.

Figur 10:

Humanisierte bivalente und mönovalente monoklonale CD3-Antikörper wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, eine Komplement-vermittelte Lyse von humanen T-Zell-Blasten zu bewirken. Bivalenter monoklonaler YTH12.5-CD3-Antikörper aus Ratte wurde zu Vergleichszwecken untersucht.

BEISPIELE

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die Techniken wie jene, die in Molecular Cloning von Sambrook et al. beschrieben sind, einsetzen.

BEISPIEL 1: ZÜCHTUNG VON RATTEN-HYBRIDOM- UND CHINESISCHE HAMSTER-EIERSTOCKZELLEN

YTH12.5-Rattenhybridomzellen, die gamma-2b-Antikörper aus der Ratte, die für die Epsilon-Kette des menschlichen CD3- Antigenkomplexes spezifisch sind (Clark et al., Eur. J. Immunol., 19, 381-388 (1989)), sezernieren, wurden gezüchtet oder in Iscove's Modifizierung von Dulbecco-Medium mit Antibiotika bzw. 5% fötalem Kälberserum vom Rind gehalten. Y0-Zellen, eine keine Antikörper sezernierende Rattenmyelomzellinie, wurden auf ähnliche Weise gezüchtet (Clark und Milstein, Somatic Cell Genetics, 7 (6), 657-666 (1981), und Europäisches Patent 0043718).
Eierstockzellen vom chinesischen Hamster (CHO-Zellen) mit einem Dihydrofolatreduktase-negativen (dhfr&supmin;) Phänotyp wurden in mit Hypoxanthin und Thymidin ergänztem Medium gezüchtet.

BEISPIEL 2: KLONIERUNG DER GENE FÜR DIE VARIABLE SCHWERE (VH) UND VARIABLE LEICHTE (VL) REGION DES YTH12.5-HYBRIDOM-IMMUN- GLOBULINS

YTH12.5-Zellen wurden mit einer Guanidinthiocyanatlösung lysiert und Gesamt-RNA durch Zentrifugation durch ein CsCl-Kissen (Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294 (19879)) isoliert. Messenger-RNA wurde daraus durch Affinitätschromatographie an Oligo-dT-Cellulose hergestellt (Maniatis et al., Molecular Cloning. A laboratory manual; veröffentlicht von Cold Spring Harbour Laboratory. (1982)).
Die cDNS-Synthese der Gene für die YTH12.5-VH- und -VL- Regionen und deren nachfolgende Amplifizierung unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurden ausgeführt durch das Verfahren von Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 3833-3837 (1989)). Die Oligonukleotidprimer VH1-Vorwärts und VH1-Rückwärts und der spezialisierte M13VHPCR1-Klonierungsvektor, die während dieses Verfahrens für das VH-Gen verwendet wurden, wurden ebenfalls von Orlandi et al. beschrieben. Die cDNS-Synthese und Amplifizierung des VL-Gens wurde ausgeführt unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotidprimern, die von einer veröffentlichten Sequenz des lambda-VL-Gens aus Ratte (Steen et al., Gene, 55, 75-84 (1987)) abgeleitet worden waren (Figur 1). Figur 1 zeigt die Position und Sequenz der bei der cDNS-Synthese und PCR-Amplifizierung des YTH12.5-VL- lambda-Gens aus Ratte verwendeten Vorwärts- und Rückwärts-Oligonukleotidprimer. In Figur 1 bezeichnet FW eine Gerüstregion, VL bezeichnet die variable Region der leichten Kette, JL die Verbindungsregion der leichten Kette und CL bezeichnet das 5'-Ende der konstanten Region der leichten Kette.
Das VL-PCR-Produkt wurde durch Ligation stumpfer Enden (blunt end-Ligation) in durch HincII geschnittenen M13mp18 kloniert (Figur 2). Der resultierende Klon war als M13 1a bekannt. Didesoxy-DNS-Sequenzierung wurde verwendet, um Klone zu identifizieren, die VH- und VL-Inserts enthalten.

BEISPIEL 3: AUSWAHL DER GERÜSTREGIONEN DER VARIABLEN DOMÄNE

Eine Recherche in den Genbank-, EMBL- und Swissprot-Datenbanken identifizierte jene bekannten menschlichen VH- und VL- Aminosäuresequenzen, die das höchste Ausmaß an Homologie mit den Genen der VH- und VL-Region von YTH12.5 aufwiesen. Bei der Wahl der endgültigen menschlichen Sequenz zur Umgestaltung wurde jener Sequenz der Vorzug gegeben, in der die Längen der Gerüstregionen und der "complementarity determining regions" (CDR; wie durch Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest; 4. Auflage, veröffentlicht vom U.S. Department of Health and Human Services (1987)) jenen des entsprechenden Rattengens am nächsten kamen. Die für die Umgestaltung der VH- und VL-Gene aus Ratte ausgewählten Gerüstsequenzen stammten aus dem menschlichen VH Typ III-Gen VH26-D-J (aus der B-Zell-Hybridomzellinie 18/2; Genbank-Code: Humighat; Derismonian et al., J. Immunol., 139, 2496-2501 (1987)) bzw. dem menschlichen VL lambda Typ VI- Gen SUT (Swissprot-Code: Lv6c$h; Solomon et al. (in:) Amyloidosis, S. 449-462, Hsg.: Glenner, G.G., Osserman, E.F., Benditt, E.P., Calkins, E., Cohen, A.S. und Zucker-Franklin, D., Verlag Plenum Press, New York (1986)).

BEISPIEL 4: UMGESTALTUNG DES YTH12.5 VH-GENS

Die Vorgehensweise zur Umgestaltung des YTH12.5-VH-Gens ist in Figur 2 gezeigt. In Figur 2 bezeichnen V, D und J die variable, Diversitäts- ("diversity") bzw. Verbindungs- ("joining") Region des VH-Gens. Die Leadersequenz ist als L bezeichnet und der Immunglobulingen-Promotor als Ig Pro.
Ortsgerichtete Oligonukleotidmutagenese wurde ausgeführt unter Verwendung des von Amersham International PLC vertriebenen Mutagenese-Kits. Sechs mutagene Oligonukleotide mit einer Länge von 30 bis 60 Basen, die zu dem positiven DNS-Strang des VH-Gens komplementär waren, wurden verwendet. Der M13-Klon 1a wurde als Matrize in den Mutagenesereaktionen verwendet, um die Gerüstsequenzen (Figur 2) umzugestalten, und die Mutanten durch Didesoxy-DNS-Sequenzierung analysiert. Zusätzlich zu den für die Veränderung der geeigneten Codons der VH-Gerüstsequenz erforderlichen Mutationen wurde eine HindIII-Stelle unmittelbar 5' bezüglich des VH-Startcodons unter Verwendung eines siebten Oligonukleotids eingeführt (Figur 2c); dies erfolgte, um die Entfernung des M13VHPCR1-Immunglobulin-Promotors durch HindIII-Verdau zu vereinfachen. Der M13-Klon war als M13 407 bekannt. Die Aminosäuresequenzen, die durch das Ratten-VH-Gen (Grundsequenz) und das umgestaltete VH-Gen (obere Sequenz) kodiert werden, sind nachfolgend gezeigt, wobei die CDR in der letztgenannten unterstrichen sind (ein Gedankenstrich in der Rattensequenz zeigt Identität hinsichtlich jenes Rest bezogen auf die umgestaltete Sequenz an):
Die eckig umrandet gezeigten Sequenzen werden durch die VH- Vorwärts- und -Rückwärts-PCR-Primer kodiert und müssen nicht die wahre Sequenz der YTH12.5-VH-Region sein.
Die Nukleotidsequenz des umgestalteten VH-Gens ist nachfolgend gezeigt, wobei die CDR-Sequenzen unterstrichen sind:

BEISPIEL 5: UMGESTALTUNG DES YTH12.5-VL-GENS

Die Vorgehensweise zur Umgestaltung des YTH12.5-VL-Gens ist in Figur 3 gezeigt. Figur 3(a) zeigt die Strategie für die Klonierung des YTH12.5-VL-Gens aus Ratte. Die Abkürzungen V und J bezeichnen die variablen Regionen und die Verbindungs- ("joining") Regionen des VL-Gens. C' bezeichnet das 5'-Ende der konstanten lambda-Region von YTH12.5 aus Ratte. Das PCR-Produkt wurde in M13 zur Erzeugung des Klons M13 13a kloniert. Mutagenese wurde ausgeführt, um Restriktionsenzymschnittstellen einzuführen und zu deletieren. Das VL-Gen wurde aus M13 13a durch PvuII-TaqI-Verdau isoliert.
Ursprühglich in M13mp18 kloniert (Beispiel 2), fehlten dem YTH12.5 VL-Gen stromaufwärts und stromabwärts liegende Signale, die für die Genexpression erforderlich waren. Dementsprechend wurde das VL-Gen vor der Umgestaltung in den Vektor M13VKPCR1 (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 3833-3837 (1989)) (Figur 3 (c) + (d)) zusammen mit dem Gen für die menschliche konstante Kern-Oz-lambda-Region (CL) (Rabbitts und Forster, Mol. Biol. Med., 1, 11-19 (1983)) subkloniert, isoliert, wie in Figur 3 (b) gezeigt, aus dem genomischen 8kb-Fragment. In Figur 3 (b) bezeichnet C die menschliche konstante Kern-Oz- Region. Der Klonierungsvektor M13VKPCR1 wurde hergestellt, indem die variable Region der humanisierten leichten kappa-Kette (HuVKlys), die einen Teil des M13VKPCR1-Klonierungsvektors bildet, herausgeschnitten wurde. Bevor die Drei-Stufen-Ligation von Vektor, VL und CL ausgeführt werden konnte, war eine ortsgerichtete Mutagenese erforderlich, um geeignete Restriktionsenzymschnittstellen einzuführen und/oder zu deletieren. Einzelheiten dieses Verfahrens sind in den Figuren 3 (a), (b) und (c) veranschaulicht. Das resultierende chimäre Ratten VL-humanes CL-Gen wurde durch NcoI-BamHI-Verdau isoliert und zwischen die HindIII- und BamHI-Stellen des Vektors pHBAPr-1-gpt (Gunning et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 4831-4835 (1987)) subkloniert, was den Verlust des M13VKPCR3-Immunglobulinpromotors, der NcoI- und HindIII-Stellen verursachte. Das Gen wurde schließlich als SalI-BamHI-Fragment in M13mp18 subkloniert, um den Klon 281, die Matrize für die nachfolgenden Mutagenesereaktionen für die Umgestaltung, zu erzeugen. Die Mutagenese wurde ausgeführt, wie für das VH-Gen aus Ratte beschrieben; es wurden mutagene Oligonukleotide hergestellt, die aufgrund der Orientierung des Gens in dem M13mp18-Vektor komplementär zu dem negativen DNS-Strang des VL-Gens waren. Fünf Oligonukleotide mit einer Länge von 27 bis 72 Nukleotiden wurden verwendet. Die Aminosäuresequenzen, die durch das Ratten-VL-Gen (Grundsequenz) und das umgestaltete VL- Gen (obere Sequenz) kodiert werden, sind nachfolgend gezeigt, wobei die CDR in der letztgenannten unterstrichen sind (ein Gedankenstrich in der Rattensequenz zeigt Identität hinsichtlich jenes Rest bezogen auf die umgestaltete Sequenz an):
Die in eckiger Umrandung gezeigte Aminosäuresequenz wird durch den Vλ-Rückwärts-Primer kodiert und kann dementsprechend in der ursprünglichen YTH12.5 Vλ-Sequenz vorliegen oder auch nicht.
Die Nukleotidsequenz des umgestalteten VL-Gens ist nachfolgend gezeigt, wobei die CDR-Sequenzen unterstrichen sind:

BEISPIEL 6: EXPRESSION DER UMGESTALTETEN YTH12.5- IMMUNGLOBULINGENE IN DHFR&supmin; CHO-ZELLEN

Ein Expressionsvektor für das umgestaltete schwere (H) Kette-Immunglobulingen wurde von dem Vektor pHBAPr-1-gpt gpt-EcoRI Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferasegen) abgeleitet, wie schematisch in den Figuren 4 (a), (b) und (c) veranschaulicht. Das Gen für die menschliche genomische konstante IgG1-Region (HuIgG1) wurde in einem 2,2 kb-BamHI-BglII-DNS-Fragment (Takahashi et al., Cell, 29, 671 - 679 (1982)), wie in Figur 4 (b) gezeigt, isoliert. Die menschliche genomische konstante IgG1-Region wurde zuerst in die BamHI-Stelle von pHBAPr-1-gpt insertiert. Ein 1,65 kb-DNS-Fragment, das das dhfr-Gen aus der Maus (Chang et al., Nature, 275, 617-624 (1978)) kodiert, flankiert von dem frühen SV40-Promotor und den frühen SV40- Terminations- und Polyadenylierungssignalen (Subramani et al., Mol. Cell. Biol., 1, 854-864 (1981)), mit einem verkrüppelten Promotor (isoliert, wie in Figur 4 (a) gezeigt) wurde dann in die EcoRI-Stelle kloniert, gefolgt von dem umgestalteten YTH12.5-VH-Gen (siehe Beispiel 4) zwischen die HindIII- und Bam-HI-Stellen des Vektors (unter Erzeugung des Klons 278).
Das umgestaltete leichte (L) Kette-Immunglobulingen wurde in einem SalI-BamHI-DNS-Fragment zwischen die SalI- und BamHI- Stellen des Expressionsvektors pHBAPr-1 (Gunning et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 4831-4835 (1987)) insertiert (unter Erzeugung des Klons 274). Dieser Vektor hat keinen selektierbaren eukaryotischen Zellmarker.
Die Expressionsvektoren für die H- und L-Kette wurden durch Verdau mit PvuI linearisiert und dann damit dhfr&supmin; CHO-Zellen unter Verwendung des Transfektionsmittels DOTMA (Boehringer) cotransfiziert. Stabile Transfektanten wurden durch ihre Fähigkeit, in Xanthin/Hypoxanthin-freiem IMDM, enthaltend dialysiertes fötales Kälberserum vom Rind, zu wachsen, eine Eigenschaft, die durch das dhfr-Gen des H-Kette-Expressionsvektors vermittelt wird, selektioniert. Transfektanten, kloniert in Weichagar und gezüchtet in Platten mit 24 Vertiefungen wurden hinsichtlich einer Antikörperproduktion durch ELISA gescreent.

BEISPIEL 7: ENZYMIMMUNASSAY (ELISA)

Test-Zellkulturüberstände wurden in Falcon Microtest III Platten mit flachem Boden, die vorab über Nacht mit 1/4000 polyklonalem Ziege-anti-Mensch-IgFc-Antikörper (Sigma) in PBS, pH 7,4 bei 4ºC beschichtet worden waren, titriert. Die Anwesenheit von gebundenem menschlichem Antikörper wurde unter Verwendung von 1/4000 biotinyliertem polyklonalem Ziege-anti-Mensch-lambda L-Kette-Antikörper (Amersham), gefolgt von 1/1000 biotinylierter, mit Streptavidin komplexierter Meerrettich-Peroxidase (Amersham) und dem Substrat OPD, nachgewiesen. PBS, enthaltend 0,02 % (Vol./Vol.) Tween 20 und 1% (Gew./Vol.) BSA wurde als Antikörper-Verdünnungsmittel nach der Antikörperbindungsstufe verwendet. Die Inkubationsdauern für den Test-Antikörper, Detektor- Antikörper, Peroxidase und Substrat betrugen 1h, 1h, 1h bzw. 30 min bei 37ºC; die Platten wurden viermal 3 min lang zwischen jeder Stufe gespült.

BEISPIEL 8: HERSTELLUNG VON MONOVALENTEM ANTIKÖRPER (1Fab', 1Fc) DURCH DIE EINFÜHRUNG EINES GENS FÜR EINE N-TERMINAL VERKÜRZTE MENSCHLICHE SCHWERE IgG1-KETTE (th) IN EINE ANTIKÖRPER SEZERNIERENDE ZELLINIE

Das Gen für die menschliche genomische konstante IgG1-Region (Takahashi et al., Cell, 29, 671-679 (1982)) auf einem BamHI- SphI-DNS-Fragment von 2,2 kb in M13Tg131 wurde mit PstI und SphI verdaut unter Erzeugung eines DNS-Fragments von 1,4 kb Länge, das die (CH2- und CH3-) Exons der Gelenkdomäne und der Domäne der zweiten und dritten konstanten Region kodierte. An diesem Fragment wurden durch T4-DNA-Polymerase stumpfe Enden erzeugt, um die 3'-überhängenden einzelsträngigen DNS-Enden, die durch die PstI- und SphI-Endonukleasen erzeugt worden waren, zu entfernen. Das verkürzte Gen wurde dann in den Vektor M13VKPCR1 (Orlandi et al., Proc. Natl., Acad. Sci., USA, 86, 3833-3837 (1989)) zwischen die PvuII- und BamHI-Stellen des Vektors insertiert, um das Gen mit einem Startcodon und einer Leaderpeptidsequenz, die für die Genexpression erforderlich sind, zu versehen. Die BamHI-Stelle des Vektors wurde durch Endmodifizierung unter Verwendung von Klenow-Fragment von DNA-Polymerase 1 während dieser Vorgehensweise rekonstituiert. Das vervollständigte Gen wurde aus M13VKPCR1 durch Verdau mit NcoI und BamHI herausgeschnitten (und somit der Immunglobulin-Promotor des Vektors von dem Gen getrennt) und dann zwischen die HindIII- und BamHI-Stellen des Expressionsvektors pHBAPro-I-Neo (Gunning et al., Proc. Natl., Acad. Sci., USA, 85, 7719-7723 (1987)), in dem die Expression durch den menschlichen β-Aktin-Promotor kontrolliert wird, insertiert, um den tH-Expressionsvektorklon 68 zu erzeugen. Die vorstehend beschriebenen Schritte sind in Figur 5 zusammengefaßt.
Es wird vorhergesagt, daß das vervollständigte tH-Gen ein Polypeptid kodiert, welches ein Leaderpeptid der variablen Region der schweren Kette eines Immunglobulins von der Maus umfaßt, gefolgt von den ersten drei N-terminalen Aminosäuren der humanisierten variablen Region der leichten kappa-Kette von Anti- Lysozym, fusioniert mit den CH2-CH3-Gelenkdomänen von menschlichem IgG1.
Der tH-Gen-Expressionsvektor (Klon 68) wurde mit PvuI linearisiert und dann Y0- oder CHO-Zellen damit und mit Expressionsvektoren, die die Gene für die humanisierte schwere (Vektor 276 für Y0-Zellen, Vektor 278 für CHO-Zellen) und die humanisierte leichte (Vektor 274) Kette tragen, transfiziert (siehe Beispiel 6 hinsichtlich der Einzelheiten bezüglich der Vektoren 274 und 278; Vektor 276 ist identisch mit 278 mit der Ausnahme, daß das EcoRI-DNS-Fragment, das das DHFR-Gen trägt, fehlt). Transfizierte Y0-Zellen wurden in IMDM, enthaltend 5% normales Rinder-FCS, 2 mg/ml G418, 2 ug/ml Mycophenolsäure, 250 ug/ml Xanthin, 13,6 ug/ml Hypoxanthin und 3,87 ug/ml Thymidin, selektioniert. Transfizierte CHO-Zellen wurden in IMDM, enthaltend 5% dialysiertes Rinder-FCS und 2 mg/ml G418, selektioniert. Transfektanten wurden hinsichtlich der Sekretion aller drei Immunglobulinketten durch Analyse des Gesamt-Immunglobulins (hergestellt durch Protein-A-Affinitätsadsorption) an nativen und SDS enthaltenden 10- 15% Gradienten-Polyacrylamidgelen unter Verwendung eines Pharmacia Phast-Gel-Systems analysiert.

Ergebnisse

Native (nicht-denaturierende) PAGE-Analyse von Gesamt- Immunglobulin (beispielsweise von der Zellinie EGRY068/H+L.3.7) zeigte die Anwesenheit von drei hauptsächlichen Proteinbanden (Figur 6). Eine Reinigung der Bande mit dem hohen Molekulargewicht (Bande 1), gefolgt von einer weiteren PAGE-Analyse unter reduzierenden denaturierenden Bedingungen zeigte, daß sie aus schweren (H) und leichten (L) Immunglobulinketten bestand (Figur 7a). In ähnlicher Weise bestand die Proteinbande mittlerer Größe (Bande 2) aus H + L + tH Polypeptiden, und die kleinere Bande (Bande 3) enthielt nur tH-Polypeptide. Die Banden können dementsprechend als bivalente Antikörper-, monovalente Antikörper- bzw. Fc-Moleküle identifiziert werden. Eine Bildanalyse des SDS- PAGE-Gels unter Verwendung des Pharmacia Phast-Image-Systems zeigte, daß die H-, L- und tH-Polypeptide in den Banden 1 und 2 der nativen PAGE innerhalb jeder Bande, wie erwartet, in ungefähr äquimolaren Mengen vorlagen. Denaturierende, nicht- reduzierende PAGE zeigte, daß die Polypeptide, umfassend alle drei Proteinbanden des nativen Gels, durch Disulfidbrücken miteinander verbunden waren. Die Möglichkeit, daß die Banden nicht- spezifische Aggregate der H-, L- und tH-Polypeptide darstellen, wurde dementsprechend ausgeschlossen (Figur 7b).

BEISPIEL 9: REINIGUNG VON ANTIKÖRPERN

Die monovalenten und bivalenten humanisierten CD3-Antikörper wurden, wie folgt, gereinigt: Gesamt-Immunglobulin wurde durch Protein A-Affinitätschromatographie, wie von Harlow und Lage (Antibodies: A Laboratory Manual, Hsg.: Cold Spring Harbor 1988) aus dem Kulturüberstand von CHO-Zellen isoliert, die mit Expressionsvektoren cotransfiziert worden waren, die die Gene für die tH-, die humanisierten H- und L-Ketten trugen. Die mono- und bivalenten Antikörperspezies wurden aus diesem Gemisch durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines LKB HPLC- Systems, ausgestattet mit einer 7,5 x 60 mm TSK-5PW-DEAE- Glaspac-Säule, äquilibriert mit 20 mM Tris, pH 8,5, getrennt und mit einem Gradienten des gleichen Puffers, der 1 M NaCl enthielt, eluiert. Der YTH12.5-Mab aus Ratte wurde auf gleiche Weise gereinigt mit der Ausnahme, daß die Ionenaustauschchromatographie in 20 mM Piperazin, pH 9,5, enthaltend 0,1% Betain, ausgeführt wurde. Der humanisierte CDw52-Mab (IgG1) (Reichmann et al., Nature, 332, 323-327, 1988), erzeugt in CHO-Zellen, wurde Protein A-gereinigt durch Dr. G. Hale (Cambridge University Division of Immunology) zur Verfügung gestellt. Antikörperkonzentrationen wurden unter Verwendung des Lowry-Assay bestimmt und die Reinheit von Antikörperpräparationen durch SDS-PAGE an 10- 15%-Gradientengelen unter Verwendung eines Pharmacia-Phast Gel- Systems abgeschätzt.

BEISPIEL 10: KOMPETITIVER BINDUNGSASSAY

Aliquots von 5 x 10&sup4; HPBALL-Zellen (menschliche akute Lymphoblastenleukämie-Zellen des peripheren Bluts) wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit 2,0 ug ml&supmin;¹ biotinyliertem monovalenten monoklonalen humanisierten CD3-Antikörper (hergestellt aus der Zellinie EGRCHOH+L/68.2) in Gegenwart steigender Konzentrationen von nicht-biotinyliertem Kompetitor-Mab angefärbt. Nach 1 h wurden die Zellen gespült und eine weitere Stunde mit Streptavidin-FITC (Amersham RPN 1232) gefärbt. Die Zellen wurden erneut gespült und mit 1% (Vol./Vol.) Formaldehyd in PBS fixiert. Inkubationen wurden bei 4ºC ausgeführt und es wurde PBS, enthaltend 0,1% (Gew./Vol.) Natriumazid, 1% (Gew./Vol.) BSA und 5% (Vol./Vol.) hitzeinaktiviertes normales Kaninchenserum, als Verdünnungsmittel und Spüllösung verwendet. Die mittlere zelluläre Fluoreszenz von ungefähr 3500 Zellen pro Vertiefung wurde unter Verwendung eines FACScan (Becton Dickinson) bestimmt.

Vergleich der Antikörperbindung

Die Ergebnisse sind in Figur 8 gezeigt, wobei (a) die CDw52- Mab-Kontrolle, (b) der humanisierte monovalente CD3-Mab, (c) der YTH12.5-Mab aus Ratte und (d) der humanisierte bivalente CD3-Mab ist.
1-2 ug ml&supmin;¹ humanisierter bivalenter CD3-Mab war ausreichend, um die CD3-Antigenbindungsstellen auf 5 x 10&sup4; HPBALL- Zellen abzusättigen, wohingegen 250 ug ml&supmin;¹ des humanisierten monovalenten Mab nicht ausreichten (Daten nicht gezeigt). Aus diesem Grunde wurde der monovalente Mab als biotinylierter Detektor in den kompetitiven Bindungsassays verwendet, da relativ geringe Konzentrationen des bivalenten YTH12.5-Antikörpers aus der Ratte und des bivalenten humanisierten CD3-Antikörpers erforderlich sein würden, um ein bedeutendes Ausmaß an Kompetition zu erzielen.
Die Konzentrationen des Ratten-Mab und des humanisierten bivalenten Mab, die für die Erzielung einer 50%-igen Kompetition des monovalenten Detektors erforderlich waren, waren sehr ähnlich. Es wurde nur 1,3-mal mehr humanisierter Mab im Vergleich zu Ratten-Mab benötigt.
Eine 6-fach bis 8,25-fach höhere Konzentration (in separaten Experimenten) des humanisierten monovalenten Mab war erforderlich, um das gleiche Ausmaß an Kompetition wie der humanisierte bivalente Mab zu erhalten. Da die Antikörperkonzentration bezogen auf die molare Konzentration an Fab'-Domäne ausgedrückt worden ist (um der Anwesenheit von 2 bzw. 1 Antigenbindungsstelle(n) pro bivalentem bzw. monovalentem Molekül Rechnung zu tragen), muß dieser Unterschied den Anstieg an Antikörper-Avidität anzeigen, der aus der Verknüpfung von zwei Fab-Domänen in einem bivalenten Mab-Molekül resultiert. CD3-antigene Modulation durch den bivalenten Mab kann als Ursache ausgeschlossen werden, da die Anfärbung in Gegenwart von 15 mM Natriumazid bei 4ºC ausgeführt worden war. Es ist gezeigt worden, daß Azid in einer Konzentration von 10 mM die Antikörper-induzierte Umverteilung von Zelloberflächenmolekülen inhibiert (Taylor und Duffus, (1971), Nature, New Biol. 233, S. 225).

BEISPIEL 11 : EFFECTOR-CELL-RETARGETTING-ASSAY ZUM NACHWEIS VON ANTIKÖRPER MIT SPEZIFITÄT FÜR MENSCHLICHES CD3-ANTIGEN

Dieser wurde, wie anderswo beschrieben (Gilliland et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 7719-7723 (1988)), ausgeführt. Kurz zusammengefaßt wurden menschliche &sup5;¹Cr-markierte U937- Monozyten-Tumorzellen, die das Fcγ-Rezeptor 1-Molekül exprimieren, als Zielzellen (Targets) verwendet. CD3-Antigen-positive Fcγ-Rezeptor 1-Effektorzellen wurden aus menschlichen Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) erzeugt, mit mitogenern CD3-Antikörper aktiviert und in IL-2 enthaltendem Medium gehalten. Target- und Effektorzellen wurden in einem Verhältnis von 1:2 in Gegenwart von Test- oder Kontrollantikörper gemischt. Eine Lyse der Targetzellen (was eine Vernetzung von Targetzellen und zytotoxischen Effektorzellen durch CD3-Antigen-CD3-Antikörper- und CD3-Antikörper (Fc)-Fcγ-Rezeptor 1-Wechselwirkungen, und daher die Anwesenheit von für das CD3-Antigen spezifischem Antikörper anzeigt) wurde durch die Menge an durch die Zielzellen in das Kulturmedium freigesetztemn &sup5;¹Cr gemessen. Jede Antikörperverdünnung wurde viermal getestet. Durch CHO-Zellinien erzeugte humanisierte monovalente und bivalente CD3-Antikörper wurden mit dem YTH12.5-Antikörper aus Ratte verglichen; humanisierter anti-CD1- Antikörper (CDw52) wurde als Negativkontrolle aufgenommen. Die Ergebnisse sind in Figur 9 gezeigt, in der (d) humanisierter bivalenter CD3-Mab, (c) bivalenter YTH12.5-Mab aus Ratte, (b) humanisierter monovalenter CD3-Mab und (a) die CDw52-Kontrolle ist. Wie erwartet, war die &sup5;¹Cr-Freisetzung aus den humanisierten CDw52 sehr gering und wurde durch steigende oder abnehmende Antikörpermengen nicht beeinflußt (kein Dosis-Effekt). Die humanisierten CD3-Antikörper zeigten geringfügig bessere Ergebnisse als der YTH12.5-Antikörper aus Ratte.

BEISPIEL 12: KOMPLEMENT-VERMITTELTE ZELLYSE (CML)

Die CML-Aktivität von humanisierten monoklonalen CD3- Antikörpern wurde unter Verwendung von 1-Zell-Blasten als Zielzellen (Targets) (siehe Beispiel 11 hinsichtlich Einzelheiten zu deren Herstellung) und Serum des T-Zell-Donors als Komplementquelle verglichen. Der Assay wurde im wesentlichen ausgeführt, wie von Bindon et al. (European Journal of Immunology, 18, 1507- 1514 (1988)) beschrieben. Kurz zusammengefaßt wurden Aliquots von 1 x 10&sup5; &sup5;¹Cr-markierten T-Zell-Blasten in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen 1 h bei 37ºC in Anwesenheit von Test- Antikörper (in verschiedenen Konzentrationen) und einer Endkonzentration von humanem Serum von 25% (Vol./Vol.) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletisiert. Die Hälfte des Überstands wurde sorgfältig aus jeder Vertiefung entfernt und analysiert, um dessen &sup5;¹Cr-Gehalt zu bestimmen.
Die Ergebnisse sind in Figur 10 gezeigt, in der (d) humanisierter bivalenter CD3-Mab, (b) humanisierter monovalenter CD3- Mab und (c) bivalenter Ratten-Mab ist. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von zwei Bestimmungen dar.
Der bivalente humanisierte CD3-Mab ergab sogar bei einer Konzentration von 100 ug ml&supmin;¹, die die Sättigungskonzentration um einen Faktor von ungefähr 50 übersteigt, überhaupt keine nachweisbare Lyse. Im Gegensatz dazu muß der Unterschied zwischen dem nicht-lytischen bivalenten humanisierten CD3-Mab und dessen lytischem Mab-Gegenstück aus Ratte auf den unterschiedlichen konstanten Antikörperregionen beruhen, da die Antigen-Spezifitäten, die diese aufweisen, die gleichen sind. Es ist nicht ein Ergebnis der Expression des humanisierten Antikörpers in CHO- Zellen, da sich Antikörper, der durch Y0-Rattenmyelomzellen erzeugt worden war, gleich verhielt (Daten nicht gezeigt).
Der Effekt auf die CML-Aktivität, humanisierte CD3-Mab monovalent zu machen, war recht dramatisch. Während der bivalente Mab keine Lyse bei 100 ug ml&supmin;¹ ergab, erzeugte der monovalente Mab fast 30% Lyse. Diese ist ungefähr 2-mal höher als die maximale Lyse, die mit dem bivalenten YTH12.5-Mab aus Ratte erzielt wurde, aber es war eine 10-fach höhere Antikörperkonzentration als bei dem Ratten-Mab erforderlich, um diese zu erzielen. Das Erfordernis einer höheren Antikörperkonzentration für CML aufgrund von monovalentern Mab kann teilweise auf dem Unterschied in der Bindungsavidität beruhen, die bereits früher für monovalente und bivalente Mab gezeigt worden ist; folglich ist eine höhere Konzentration an monovalentem Mab erforderlich, um die gleiche Menge Antikörper an die Zelloberfläche zu binden.
Unter Verwendung eines Mab, der Zellen mit Komplement effektiv lysiert, ist vermutlich ein Vorteil in Situationen, wo die Zell-Clearance das Ziel ist, aber dies muß nicht von ausschlaggebender Bedeutung sein. Das Verhalten der humanisierten CD3- Mab in dem Effector-Cell-Retargetting-Assay, der von Fc-Fc- Rezeptor-Wechselwirkungen abhängt, ist dementsprechend ermutigend.

ANMERKUNG

In diesen Unterlagen sind die Aminosäurereste auf Standardweise (Pure and Applied Chemistry, 1974, 40, 317, und European Journal of Biochemistry, 1984, 138, 9) angegeben, was auch auf die Nukleotidreste zutrifft (Molecular Cloning, Sambrook et al., a.a.O.).

Claims

1. Ligand, Antikörper oder Antikörperfragment mit einer Bindungsaffinität für das CD3-Antigen, welcher bzw. welches eine menschliche konstante Region, eine variable Gerüstregion von Mensch oder Ratte und mindestens eine "complementarity- determining region" (CDR), ausgewählt aus den Aminosäuresequenzen:

(a) Ser-Phe-Pro-Met-Ala,

(b) Thr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val-Lys-Gly,

(c) Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr,

(d) Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn-Tyr-Val-His,

(e) Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp,

(f) His-Ser-Tyr-Val-Ser-Ser-Phe-Asn-Val,

und konservativ modifizierten Varianten davon, aufweist.

2. Ligand, Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 1, welcher bzw. welches eine schwere Kette mit mindestens einer CDR, ausgewählt aus den Aminosäuresequenzen:

(a) Ser-Phe-Pro-Met-Ala,

(b) Thr-Ile-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Arg-Asp-Ser-Val-Lys-Gly,

(c) Phe-Arg-Gln-Tyr-Ser-Gly-Gly-Phe-Asp-Tyr,

und konservativ modifizierten Varianten davon, und/oder eine leichte Kette mit mindestens einer CDR, ausgewählt aus den Aminosäuresequenzen:

(d) Thr-Leu-Ser-Ser-Gly-Asn-Ile-Glu-Asn-Asn-Tyr-Val-His,

(e) Asp-Asp-Asp-Lys-Arg-Pro-Asp,

(f) His-Ser-Tyr-Val-Ser-Ser-Phe-Asn-Val,

und konservativ modifizierten Varianten davon, aufweist.

3. Ligand, Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 1, welcher bzw. welches die drei CDR, entsprechend den Aminosäuresequenzen (a), (b) und (c), in der schweren Kette oder die drei CDR, entsprechend den Aminosäuresequenzen (d), (e) und (f), in der leichten Kette aufweist.

4. Ligand, Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 1, welcher bzw. welches die drei CDR, entsprechend den Aminosäuresequenzen (a), (b) und (c), in der schweren Kette und die drei CDR, entsprechend den Aminosäuresequenzen (d), (e) und (f), in der leichten Kette aufweist.

5. Ligand, Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 3 oder 4, in welchem die CDR der schweren Kette in der Reihenfolge (a), (b), (c) in Richtung Leader T konstante Region und die CDR der leichten Kette in der Reihenfolge (d), (e), (f) in Richtung Leader T konstante Region angeordnet sind.

6. Ligand, Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 1, in dem die Gerüstregion der variablen Domäne der schweren Kette in Richtung Leader T konstante Region

umfaßt, wobei CDR die Anwesenheit einer CDR angibt, von denen mindestens eine (a), (b) oder (c) oder eine konservativ modifizierte Variante davon ist.

7. Ligand, Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 1, in dem die Gerüstregion der variablen Domäne der leichten Kette in Richtung Leader T konstante Region

umfaßt, wobei CDR die Anwesenheit einer CDR angibt, von denen mindestens eine (d), (e) oder (f) oder eine konservativ modifizierte Variante davon ist.

8. Ligand, Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 6, welcher bzw. welches eine variable Domäne der schweren Kette aufweist, welche umfaßt:

9. Ligand, Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 7, welcher bzw. welches eine variable Domäne der leichten Kette aufweist, welche umfaßt:

10. Antikörper oder Fragment davon nach einem der vorangegangenen Ansprüche, in welchem nur einer der Arme davon eine Affinität für das CD3-Antigen hat.

11. Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 10, welcher bzw. welches monovalent ist.

12. Antikörperfragment nach Anspruch 11, das nur einen Fab'-Arm aufweist.

13. Rekombinante DNS, umfassend eine Klonierungshilfsmittel- oder Expressionsvektorsequenz und eine Nukleotidsequenz, die mindestens eine der Aminosäuresequenzen (a) bis (f), wie in Anspruch 1 angegeben, kodiert.

14. Rekombinante DNS nach Anspruch 13, welche eine Klonierungshilfsmittel- oder Expressionsvektorsequenz und mindestens eine der Nukleotidsequenzen

umfaßt.

15. Rekombinante DNS nach Anspruch 13, welche eine Klonierungshilfsmittel- oder Expressionsvektorsequenz und eine Nukleotidsequenz, die eine oder beide der in den Ansprüchen 7 und 8 angegebenen Aminosäuresequenzen kodiert, umfaßt.

16. Rekombinante DNS nach Anspruch 13, die eine Klonierungshilfsmittel- oder Expressionsvektorsequenz und eine oder beide der Nukleotidsequenzen

umfaßt.

17. Verfahren zur Herstellung eines Liganden oder eines Antikörpers oder Fragments davon gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, welches umfaßt, eine Expression eines Liganden, Antikörpers oder Fragments davon durch ein Expressionssystem zu bewirken und, sofern erforderlich, ein Antikörpermolekül zu behandeln, so daß ein Fragment davon gebildet wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Expressionssystem rekombinante DNS nach einem der Ansprüche 14 bis 16 umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, welches umfaßt, in das Expressionssystem zusammen mit Genen, die die schweren und leichten Ketten kodieren, ein Gen einzuführen, das eine verkürzte schwere Kette kodiert, in der die Domäne der variablen Region und die Domäne der ersten konstanten Region der schweren Kette fehlen, wobei dem Gen das Exon für jede dieser Domänen fehlt.

20. Wirtszellen, umfassend rekombinante DNS nach einem der Ansprüche 13 bis 16.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Liganden oder einen Antikörper oder ein Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zusammen mit einem physiologisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger.

22. Ligand oder Antikörper oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für eine Verwendung zur Therapie.

23. Verwendung eines Liganden oder eines Antikörpers oder Fragments davon nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für die Herstellung eines Arzneimittels für eine Verwendung zur Immunsuppression.

24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Arzneimittel für eine Verwendung zur Behandlung von Transplantatempfängern bestimmt ist.