DE69124387T2

DE69124387T2 - Rahmenbau-mutierte antikörper und ihre herstellung

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Publication number: DE69124387T2
Application number: DE69124387T
Authority: DE
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: British Technology Group Inter Corporate Licensing Ltd
Priority date: 1990-09-17
Filing date: 1991-09-16
Publication date: 1997-05-15
Anticipated expiration: 2011-09-17
Also published as: CA2091769A1; WO1992005274A1; NZ239826A; JPH06502762A; GR3023252T3; DE69124387T3; IE913257A1; IL99499A0; IL99499A; EP0549581B2; US20070212753A1; MX9101117A; USRE43898E1; ZA917407B; USRE46877E1; KR100217212B1; AU660151B2; DE69124387D1; KR930702535A; US6767996B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft veränderte Antikörper und ihre Herstellung. Die Erfindung kann typischerweise auf die Produktion humanisierter Antikörper angewendet werden.
Antikörper umfassen typischerweise zwei schwere Ketten, die durch Disulfidbindungen miteinander verknüpft sind, und zwei leichte Ketten. Jede leichte Kette ist an eine jeweilige schwere Kette über Disulfidbindungen gebunden. Jede schwere Kette besitzt an einem Ende eine variable Domäne, auf die eine Reihe von konstanten Domänen folgt. Jede leichte Kette besitzt eine variable Domäne an einem Ende und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende. Die variable Domäne der leichten Kette ist entlang der variablen Domäne der schweren Kette angeordnet. Die konstante Domäne der leichten Kette ist entlang der ersten konstanten Domäne der schweren Kette angeordnet. Die konstanten Domänen in den leichten und schweren Ketten sind nicht direkt an der Bindung des Antikörpers an ein Antigen beteiligt.
Die variablen Domänen jedes Paares aus leichter und schwerer Kette bilden die Antigenbindungsstelle. Die Domänen auf den leichten und schweren Ketten besitzen die gleiche allgemeine Struktur, und jede Domäne umfaßt eine Gerüstregion aus vier Regionen, deren Sequenzen relativ konserviert sind und durch drei Komplementarität-bestimmende Regionen (CDRs) verknüpft sind. Die vier Gerüstregionen nehmen hauptsächlich eine β-Blattkonformation an, und die CDRs bilden Schleifen, die die β-Blattstruktur verknüpfen und in einigen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDRs werden durch die Gerüstregionen in enger Nachbarschaft gehalten und tragen mit den CDRs aus der anderen Domäne zur Bildung der Antigenbindungsstelle bei.
Die Herstellung eines veranderten Antikörpers, in dem die CDRs sich von einer anderen Art als die Gerüstregion der variablen Domänen des Antikörpers ableitet, ist in der EP-A-0239400 beschrieben. Die CDRs können von einem monoclonalen Ratten- oder Maus-Antikörper abgeleitet sein. Die Gerüstregion der variablen Domänen und die konstanten Domänen des veränderten Antikörpers können von einem menschlichen Antikörper abgeleitet sein. Ein solcher humanisierter Antikörper ruft eine vernachlässigbare Immunantwort bei Verabreichung an einen Menschen hervor, verglichen mit der Immunantwort, die von einem Menschen gegen einen Ratten- oder Maus-Antikörper entwickelt wird. Ein humanisierter CAMPATH-1-Antikörper ist in der EP-A- 0328404 beschrieben.
Die WO-A-90 07861 beschreibt einen humanisierten Antikörper, der für das p55-Tac-Protein des IL-2-Rezeptors spezifisch ist, worin die Aminosäuresequenz der CDRs die eines Maus-Antikörpers gegen das gleiche Antigen ist und die Aminosäuresequenz der Gerüstregionen der variablen Domäne die eines menschlichen Antikörpers, ausgewählt auf der Basis der Homologie mit den Gerüstregionen des Nager-Antikörpers, ist. Die DNA, die den humanisierten Antikörper codiert, wird durch herkömmliche Methoden, beispielsweise unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide, produziert.
Es wurde nun ein neuer Weg zur Herstellung veränderter Antikörper entwickelt. Im Gegensatz zu früheren Vorschlägen betrifft dieser die Veränderung der Gerüstregion einer variablen Domäne anstelle der CDRs. Dieser Weg besitzt die Vorteile, daß eine vorher existierende cDNA, die beispielsweise eine menschliche Gerüstregion codiert, die neu zu formen ist, nicht notwendig ist und daß sie technisch einfacher ist als frühere Verfahren.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Antikörperkette, in der die CDRs der variablen Domäne der Antikörperkette von einer ersten Säugerart abgeleitet sind und die Gerüstregion der variablen Domäne und, sofern vorhanden, die oder jede konstante Domäne der Antikörperkette von einer zweiten unterschiedlichen Säugerart abgeleitet sind, wobei man
(i) die die Gerüstregion codierenden Regionen der DNA, die eine variable Domäne einer Antikörperkette der ersten Art codieren, so mutiert, daß die mutierten, die Gerüstregion codierenden Regionen die von der zweiten Art abgeleitete Gerüstregion codieren; und
(ii) die Antikörperkette exprimiert, wobei die mutierte DNA aus Stufe (i) verwendet wird;
wobei die Mutation in Stufe (i) so ist, daß ein Antikörper, in den die in Stufe (ii) exprimierte Antikörperkette eingebaut ist, die Bindungsfähigkeit des Antikörpers beibehält, von dem die CDRs abgeleitet sind.
Eine variable Domäne einer oder beider Ketten eines Antikörpers kann daher verändert werden durch:
(a) Bestimmen der Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenz einer variablen Domäne einer ausgewählten Antikörperkette der ersten Art;
(b) Bestimmen der Antikörpergerüstregion, gegenüber der die Gerüstregion der variablen Domäne zu verändern ist;
(c) Mutieren der die Gerüstregion codierenden Regionen der DNA, die die variable Domäne codiert, so daß die mutierten, die Gerüstregion codierenden Regionen die in Stufe (b) bestimmten Gerüstregionen codieren;
(d) Verknüpfen der in Stufe (c) erhaltenen mutierten DNA mit einer DNA die eine konstante Domäne der zweiten Art codiert, und Clonieren der DNA in einen Expressionsvektor; und
(e) Einschleusen des Expressionsvektors in eine kompatible Wirtszelle und Züchten der Wirtszelle unter solchen Bedingungen, daß die Antikörperkette exprimiert wird.
Die Antikörperkette kann gleichzeitig mit der komplementären Antikörperkette exprimiert werden. Mindestens die Gerüstregion der variablen Domäne und die oder jede konstante Domäne der komplementären Kette leiten sich im allgemeinen auch von der zweiten Art ab. Eine leichte Kette und eine schwere Kette können gleichzeitig exprimiert werden. Eine oder beide Ketten können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden. Bevorzugt leiten sich die CDRs beider Ketten von dem gleichen ausgewählten Antikörper ab. Ein Antikörper, umfassend beide exprimierten Ketten, kann isoliert werden.
Der Antikörper besitzt bevorzugt die Struktur eines natürlichen Antikörpers oder Fragments davon. Der Antikörper kann daher einen vollständigen Antikörper, ein (Fab')&sub2;-Fragment, ein Fab-Fragment, ein Dimeres der leichten Kette oder eine schwere Kette umfassen. Der Antikörper kann ein IgG, wie ein IgG1, IgG2, IgG3 oder IgG4, IgM, IgA, IgE oder IgD sein. Alternativ kann der Antikörper ein chimärer Antikörper des in der WO 86/01533 beschriebenen Typs sein.
Der chimäre Antikörper gemäß WO 86/01533 umfaßt eine Antigen-bindende Region und eine Nicht-Immunglobulinregion. Die Antigen-bindende Region ist eine variable Domäne einer leichten Kette eines Antikörpers oder eine variable Domäne einer schweren Kette eines Antikörpers. Typischerweise umfaßt der chimäre Antikörper variable Domänen sowohl der leichten als auch der schweren Kette. Die Nicht-Immunglobulinregion wird an ihrem C-terminalen Ende an die Antigen-bindende Region fusioniert. Die Nicht-Immunglobulinregion ist typischerweise ein Nicht-Immunglobulinprotein und kann eine Enzymregion, eine von einem Protein mit bekannter Bindungsspezifität, von einem Proteintoxin oder in der Tat von jedem Protein, das von einem Gen exprimiert wird, abgeleitete Region sein. Die zwei Regionen des chimären Antikörpers können über eine spaltbare Linkersequenz miteinander verknüpft sein.
Die Erfindung wird bevorzugt verwendet, um einen Anntikörper, typischerweise einen monoclonalen Antikörper, und beispielsweise einen Ratten- oder Maus-Antikörper zu humanisieren. Die Gerüstregion und die konstanten Domänen des so erhaltenen Antikörpers sind daher menschliche Gerüstregionen und konstante Domänen, während die CDRs der leichten und/oder schweren Kette des Antikörpers Ratte- oder Maus-CDRs sind. Bevorzugt sind alle CDRs Ratte- oder Maus-CDRs. Der Antikörper kann ein menschliches IgG, wie IgG1, IgG2, IgG3, IgG4; IgM; IgA; IgE oder IgD, welches Ratte- oder Maus-CDRs trägt, sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird so durchgeführt, daß der so erhaltene Antikörper die Antigenbindungsfähigkeit des Antikörpers, von dem er abgeleitet ist, beibehält. Ein Antikörper wird erfindungsgemäß durch Mutieren der die Gerüstregion codierenden Regionen der DNA, die die variablen Domänen des Antikörpers codieren, neu geformt. Dieser Antikörper und der neugeformte Antikörper sollten beide das gleiche Antigen binden können.
Der Ausgangs-Antikörper ist typischerweise ein Antikörper einer ausgewählten Spezifität. Um zu gewährleisten, daß diese Spezifität beibehalten wird, wird die Gerüstregion der variablen Domäne des Antikörpers bevorzugt entsprechend etwa der Gerüstregion der nächsten variablen Domäne eines Antikörpers einer anderen Art neu geformt. Unter "in etwa die nächste" wird etwa die am meisten homologe, ausgedrückt als Aminosäuresequenzen, verstanden. Bevorzugt liegt eine Homologie von mindestens 50 % zwischen den zwei variablen Domänen vor.
Es gibt vier allgemeine Stufen, um einen monoclonalen Antikörper neu zu formen. Diese sind:
(1) Bestimmen der Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenz der variablen Domäne der leichten und schweren Kette des Ansgangs-Antikörpers;
(2) Entwickeln des neugeformten Antikörpers, d.h. Bestimmen, welche Antikörpergerüstregion während des Neuformungsverfahrens verwendet wird;
(3) tatsächliche Neuformungsmethodes/-techniken; und
(4) Transfektion und Expression des neugeformten Antikörpers.
Diese vier Stufen werden nachstehend im Zusammenhang der Humanisierung eines Antikörpers erklärt. Jedoch können sie gleichermaßen gut angewendet werden, wenn ein Antikörper einer nichtmenschlichen Art neugeformt werden soll.

Stufe 1: Bestimmung der Nucleotid- und vorhergesagten Aminosäuresequenz der variablen Domänen der leichten und schweren Kette des Antikörpers

Um einen Antikörper neu zu formen, muß nur die Aminosäuresequenz der variablen Domänen der schweren und leichten Kette des Antikörpers bekannt sein. Die Sequenz der konstanten Domänen ist irrelevant, weil diese nicht zur Neuformungsstrategie beitragen. Das einfachste Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz einer variablen Domäne eines Antikörpers erfolgt aus clonierter cDNA, die die variable Domäne der schweren und leichten Kette codiert.
Es gibt zwei allgemeine Verfahren zur Clonierung von cDNAs einer gegebenen variablen Domäne der leichten und schweren Kette eines Antikörpers: (1) über eine herkömmliche cDNA-Bank oder (2) über die Polymerasekettenreaktion (PCR). Diese beiden Verfahren sind sehr gut bekannt. Wenn die Nucleotidsequenz der cDNAs gegeben ist, ist es einfach, diese Information in die vorhergesagte Aminosäuresequenz der variablen Domänen des Antikörpers zu übersetzen.

Stufe 2: Entwicklung des neugeformten Antikörpers

Es sind mehrere Faktoren bei der Entscheidung, welche menschliche Antikörpersequenz während der Neuformung verwendet wird, zu berücksichtigen. Die Neuformung der leichten und schweren Ketten wird unabhängig voneinander betrachtet, aber die Überlegung ist für jede im Grunde ähnlich.
Dieses Selektionsverfahren beruht auf der folgenden Überlegung: Die Antigenspezifität eines gegebenen Antikörpers und die Affinität werden primär durch die Aminosäuresequenz der CDRs der variablen Region bestimmt. Die Reste der Gerüstregion der variablen Domäne besitzen nur einen geringen oder keinen Beitrag. Die Primärfunktion der Gerüstregionen ist das Halten der CDRs in ihrer geeigneten räumlichen Orientierung, um das Antigen zu erkennen. So führt die Substitution der CDRs von Nagern in die Gerüstregion einer menschlichen variablen Domäne höchstwahrscheinlich zur Beibehaltung ihrer korrekten räumlichen Orientierung, wenn die menschliche variable Domäne der variablen Domäne des Nagers, aus dem sie stammte, sehr homolog ist. Eine menschliche variable Domäne sollte bevorzugt daher so gewählt werden, daß sie der variablen Domäne/den variablen Domänen des Nagers in hohem Maße homolog ist.
Eine geeignete Sequenz einer variablen Domäne eines menschlichen Antikörpers kann wie folgt ausgewählt werden:
1. Unter Verwendung eines Computerprogramms werden alle variablen Protein- (und DNA-) Datenbanken auf diejenigen Sequenzen der variablen Domäne eines menschlichen Antikörpers abgesucht, die den variablen Domänen eines Nager-Antikörpers äußerst homolog sind. Dies kann leicht mit einem Programm mit der Bezeichnung FASTA durchgeführt werden, aber andere geeignete Programme sind ebenfalls verfügbar. Die Ausgabe eines geeigneten Datenprogramms ist eine Liste von Sequenzen, die dem Nager-Antikörper äußerst homolog sind, die prozentuale Homologie jeder Sequenz und eine Anordnung jeder Sequenz entsprechend der Nagersequenz. Dies wird unabhängig für die Sequenzen der variablen Domäne sowohl der schweren als auch der leichten Kette durchgeführt. Die vorstehenden Analysen werden leichter durchgeführt, wenn im Handel erhältliche Unterdatenbanken zuerst erzeugt werden, die nur menschliche Immunglobulinsequenzen umfassen. Dies besitzt zwei Vorteile. Erstens wird die tatsächliche Computerzeit beträchtlich reduziert, weil die Analysen nur auf diejenigen Sequenzen von Interesse beschränkt sind, statt auf alle Sequenzen in den Datenbanken. Der zweite Nutzen ist, daß durch die Beschränkung der Analysen auf nur menschliche Immunglobulinsequenzen die Ausgabe nicht durch die Anwesenheit von Immunglobulinsequenzen von Nagern überladen wird. Es gibt weit mehr Nager- Immunglobulinsequenzen in Datenbanken als es menschliche Sequenzen gibt.
2. Aufführen der Sequenzen der variablen Domäne des menschlichen Antikörpers, die die höchste Gesamthomologie mit der variablen Domäne des Nager-Antikörpers besitzen (siehe vorstehend). Es wird kein Unterschied zwischen der Homologie innerhalb der Gerüstregionen und der CDRs gemacht. Es wird die Gesamthomologie beachtet.
3. Aus der Erwägung werden diejenigen menschlichen Sequenzen ausgeschlossen, die CDRs mit einer anderen Länge als die CDRs der Nager besitzen. Diese Regel gilt nicht für CDR 3, weil die Länge dieser CDR normalerweise ziemlich variabel ist. Auch gibt es manchmal keine oder sehr wenig menschliche Sequenzen, die die gleichen Längen der CDRs besitzen, wie die des Nager-Antikörpers. Wenn dies der Fall ist, kann diese Regel gelockert werden, und menschliche Sequenzen mit einem oder mehreren Unterschieden in der CDR-Länge können erlaubt werden.
4. Aus den verbleibenden menschlichen variablen Domänen wird die ausgewählt, die mit der des Nagers am meisten homolog ist.
5. Der tatsächliche neugeformte Antikörper (das Endergebnis) sollte von dem Nager-Antikörper abgeleitete CDRs und eine Gerüstregion der variablen Domäne von dem vorstehend gewählten menschlichen Antikörper besitzen.

Stufe 3: Tatsächliche Neuformungsmethod/-techniken

Eine cDNA die den gewünschten neugeformten Antikörper codiert, wird bevorzugt ausgehend von der Nager-cDNA, aus der die Sequenz/Sequenzen der variablen Domäne des Nager-Antikörpers ursprünglich bestimmt wurde/wurden, hergestellt. Die Aminosäuresequenz der variablen Domäne des Nagers wird mit der der gewählten Sequenz der variablen Domäne des menschlichen Antikörpers verglichen. Die Reste in dem Gerüst der variablen Domäne des Nagers werden markiert, die in den entsprechenden Rest beim Menschen verändert werden müssen, um das Nagergerüst dem menschlichen Gerüst identisch zu machen. Es gibt auch Reste, die der Nagergerüstsequenz hinzugefügt werden müssen oder daraus deletiert werden müssen, um sie der des Menschen identisch zu machen.
Oligonucleotide werden synthetisiert, die verwendet werden können, um das Gerüst der variablen Domäne des Nagers so zu mutieren, daß es die gewünschten Reste enthält. Diese Oligonucleotide können jede geeignete Größe besitzen. Eine ist normalerweise in der Länge durch die Fähigkeiten des speziellen zur Verfügung stehenden Synthesegeräts beschränkt. Das Verfahren der Oligonucleotid-gerichteten in vitro Mutagenese ist gut bekannt.
Die Vorteile dieses Verfahrens der Neuformung im Gegensatz zum Spleißen von CDRs in eine menschliche Gerüstregion sind, daß (1) dieses Verfahren keine vorher existierende cDNA benötigt, die die menschliche Gerüstregion codiert, entsprechend der sie neugeformt wird, und (2) des Spleißen von CDRs technisch schwieriger ist, weil es üblicherweise eine große Region schlechter Homologie zwischen dem zu mutierenden Oligonucleotid und der variablen Domäne des menschlichen Antikörpers gibt. Dies ist bei dem Verfahren des Spleißens menschlicher Gerüstreste in die variable Domäne eines Nagers nicht so sehr ein Problem, weil hier keine Notwendigkeit nach einer vorher existierenden cDNA, die die menschliche variable Domäne codiert, besteht. Das Verfahren beginnt stattdessen mit der Nager-cDNA-Sequenz. Auch ist des Spleißen von Gerüstregionen technisch leichter, weil ein hoher Homologiegrad zwischen dem zu mutierenden Oligonucleotid und der Gerüstregion der variablen Domäne des Nagers vorliegt. Dies trifft zu, weil eine Gerüstregion der variablen Domäne eines menschlichen Antikörpers so gewählt wurde, daß sie der des Nagers äußerst homolog ist.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens des Neuformens im Gegensatz zur Synthese der vollständigen neugeformten Version von Anfang an ist, daß dies technisch einfacher ist. Die Synthese einer neugeformten variablen Domäne von Anfang an benötigt einige Oligonucleotide mehr, mehrere Tage mens Arbeit, und technische Schwierigkeiten treten leichter auf.

Stufe 4: Transfektion und Expression des neugeformten Antikörpers

Nach den Mutagenesereaktionen zur Neuformung des Antikörpers werden die cDNAs an die geeignete DNA geknüpft, die die konstante Region der leichten oder schweren Kette codiert, in einen Expressionsvektor cloniert und in Säugerzellen transfiziert. Diese Stufen können routinemäßig durchgeführt werden. Ein neugeformter Antikörper kann daher nach einem Verfahren hergestellt werden, das Umfaßt:
a) Herstellung eines ersten replizierbaren Expressionsvektors einschließlich eines geeigneten Promotors in funktioneller Verknüpfung an eine DNA-Sequenz, die mindestens eine variable Domäne einer schweren oder leichten Kette eines Igs codiert, wobei die variable Domäne Gerüstregionen aus einem ersten Antikörper und CDRs, umfassend mindestens Teile der CDRs eines zweiten Antikörpers einer anderen Spezifität, umfaßt;
b) ggf. Herstellung eines zweiten replizierbaren Expressionsvektors einschließlich eines geeigneten Promotors in funktioneller Verknüpfung an eine DNA-Sequenz, die mindestens die variable Domäne einer leichten bzw. schweren Kette eines komplementären Igs codiert;
c) Transformieren einer Zellinie mit dem ersten oder beiden hergestellten Vektoren; und
d) Züchten der transformierten Zellinie, wobei der veränderte Antikörper produziert wird.
Bevorzugt codiert die DNA-Sequenz in Stufe a) sowohl die variable Domäne als auch die oder jede konstante Domäne der Antikörperkette, wobei die oder jede konstante Domäne von dem ersten Antikörper abgeleitet ist. Der Antikörper kann isoliert und gereinigt werden. Die Zellinie, die transformiert wird, um den veränderten Antikörper zu erzeugen, kann eine China- Hamster-Ovar-(CHO)-Zellinie oder eine immortalisierte Säugerzellinie sein, die vorteilhafterweise lymphoiden Ursprungs ist, wie eine Myelom-, Hybridom, Triom- oder Quadromzellinie. Die Zellinie kann auch normale lymphoide Zellen, wie eine B-Zelle, Umfassen, die durch Transformation mit einem Virus, wie dem Epstein-Barr-Virus, immortalisiert wurde. Am bevorzugtesten ist die immortalisierte Zellinie eine Myelomzellinie oder ein Derivat davon.
Obwohl die Zellinie, die zur Produktion des veränderten Antikörpers verwendet wird, bevorzugt eine Säugerzellinie ist, kann jede andere geeignete Zellinie, wie eine Bakterienzellinie oder eine Hefezellinie alternativ verendet werden. Insbesondere wird in Betracht gezogen, daß von E. coli abgeleitete Bakterienstämme verwendet werden können.
Es ist bekannt, daß einige immortalisierte Lymphoidzellinien, wie Myelomzellinien, in ihrem normalen Zustand isolierte leichte oder schwere Ketten von Ig sezernieren. Wenn eine solche Zellinie mit dem in Stufe (a) hergestellten Vektor transformiert wird, ist es nicht notwendig, die Stufe (b) des Verfahrens durchzuführen, vorausgesetzt, daß die normal sezernierte Kette der variablen Domäne der Ig-Kette, die von dem in Stufe (a) hergestellten Vektor codiert wird, komplementär ist.
Wenn jedoch die immortalisierte Zellinie keine Sekretion besitzt oder eine komplementäre Kette nicht sezerniert, ist es notwendig, Stufe (b) durchzuführen. Diese Stufe kann durch weitere manipulation des in Stufe (a) produzierten Vektors durchgeführt werden, so daß dieser Vektor nicht nur die variable Domäne einer veränderten leichten oder schweren Kette des Antikörpers codiert, sondern auch die komplementäre variable Domäne codiert.
Alternativ wird Stufe (b) dadurch durchgeführt, daß man einen zweiten Vektor herstellt, der verwendet wird, um die immortalisierte Zellinie zu transformieren. Diese Alternative führt zur leichteren Herstellung der Konstruktion, kann aber weniger bevorzugt sein als die erste Alternative dahingehend, daß sie zu einer nicht so effizienten Antikörperproduktion führt.
Im Falle, in dem die immortalisierte Zellinie eine komplementäre leichte oder schwere Kette sezerniert, kann die transformierte Zellinie, beispielsweise durch Transformieren einer geeigneten Bakterienzelle mit dem Vektor und anschließende Fusion der Bakterienzelle mit der immortalisierten Zellinie durch Spheroplastenfusion produziert werden. Alternativ kann die DNA direkt in die immortalisierte Zellinie durch Elektroporation oder ein anderes geeignetes Verfahren eingeschleust werden.
Folglich wird ein Antikörper produziert, bei dem CDRs einer variablen Domäne einer Antikörperkette den entsprechenden CDRs eines Antikörpers einer ersten Säugerart homolog sind und wobei die Gerüstregion der variablen Domäne und die konstanten Domänen des Antikörpers mit der entsprechenden Gerüstregion und den konstanten Domänen eines Antikörpers einer zweiten anderen Säugerart homolog sind. Typischerweise leiten sich alle drei CDRs der variablen Domäne einer leichten oder schweren Kette von der ersten Art ab.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde zum Erhalt eines Antikörpers gegen das menschliche CD4-Antigen angewendet. Folglich betrifft die Erfindung auch einen Antikörper, der an ein menschliches CD4-Antigen binden kann, wobei die CDRs der leichten Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenzen:
CDR1: LASEDIYSDILA
CDR2: NTDTLQN
CDR3: QQYNNYPWT
besitzen, worin die CDRs der schweren Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenzen:
CDR1: NYGMA
CDR2: TISHDGSDTYFRDSVKG
CDR3: QGTIAGIRH
besitzen, und worin die Gerüstregion der variablen Domäne und, sofern vorbanden, die oder jede konstante Domäne jeder Kette von einer Nicht-Ratten- Säugerart abgeleitet sind.
Der Antikörper besitzt vorzugsweise die Struktur eines natürlichen Antikörpers oder Fragments davon. Der Antikörper kann daher einen vollständigen Antikörper, ein (Fab')&sub2;-Fragment, ein Fab-Fragment, ein Dimeres einer leichten Kette oder eine schwere Kette umfassen.
Der Antikörper kann ein IgG, wie IgG1, IgG2, IgG3 oder IgG4, IgM, IgA, IgE oder IgD, sein. Alternativ kann der Antikörper ein chimärer Antikörper des in der WO 86/01533 beschriebenen Typs sein.
Der chimäre Antikörper gemäß der WO 86/01533 umfaßt eine Antigen-bindende Region und eine Nicht-Immunglobulinregion. Die Antigen-bindende Region ist die variable Domäne der leichten Kette eines Antikörpers oder die variable Domäne der schweren Kette eines Antikörpers. Typischerweise umfaßt der chimäre Antikörper variable Domänen sowohl der leichten als auch der schweren Kette. Die Nicht-Immuglobulinregion wird an ihrem C-terminalen Ende an die Antigen-bindende Region fusioniert. Die Nicht-Immunglobulinregion ist typischerweise ein Nicht-Immunglobulinprotein und kann eine Enzymregion, eine von einem Protein mit bekannter Bindungspezifität, von einem Proteintoxin oder in der Tat von jedem beliebigen Protein, das durch ein Gen exprimiert wird, abgeleitete Region sein. Die zwei Regionen des chimären Antikörpers können über eine spaltbare Linkersequenz miteinander verknüpft sein.
Die Erfindung wird bevorzugt verwendet, um einen CD4-Antikörper, wie einen Ratten- oder Maus-CD4-Antikörper, zu humanisieren. Die Gerüstregion und die konstanten Domänen des so erhaltenen Antikörpers sind daher menschliche Gerüstregion und menschliche konstante Domänen, wohingegen die CDRs der leichten und/oder schweren Kette des Antikörpers Ratte- oder Maus-CDRs sind. Bevorzugt sind alle CDRs Ratte- oder Maus-CDRs. Der Antikörper kann ein menschlicher IgG, wie IgG1, IgG2, IgG3, IgG4; IgM; IgA, IgE oder IgD, das Ratte- oder Maus-CDRs trägt, sein.
Bevorzugt ist die Gerüstregion der schweren Kette des Antikörpers der entsprechenden Gerüstregion des menschlichen Antikörpers KOL homolog (Schmidt et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364 713-747, 1983). Der sechste Reste der Gerüstregion in diesem Fall ist geeigneterweise Thr oder Pro, bevorzugt Thr. Dieser Rest ist der 121ste Rest in der variablen Region der schweren Kette des KOL-Antikörpers (Schmidt et al., 1983) und wird von Kabat als Rest 108 identifiziert (Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest", US Dept of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987). Alternativ ist die Gerüstregion der schweren Kette des Antikörpers der entsprechechen Gerüstregion des menschlichen Antikörpers NEW homolog (Saul et al., J. Biol. Chem. 253: 585-597, 1978). Der letzte Rest der Gerüstregion 1 in diesem Fall ist geeigneterweise Ser oder Thr, bevorzugt Ser. Dieser Rest befindet sich in Position 30 (Kabat et al., 1987). Bevorzugt ist die Gerüstregion der leichten Kette des Antikörpers der Gerüstregion der variablen Domäne des Proteins REI (Epp et al., Eur. J. Biochem., 45, 513-524, 1974) homolog.
Die Gerüstregionen einer oder beider Ketten eines CD4-Antikörpers können durch das erfindungsgemäße Verfahren neu geformt werden. Alternativ können eine oder beide Ketten eines CD4-Antikörpers durch das in der EP-A-0239400 beschriebene Verfahren neu geformt werden. Bei dem Verfahren gemäß der EP-A-0239400 werden CDRs anstelle von Gerüstregionen ersetzt. Die CDRs werden auf eine von einer Nicht-Ratten-Säugerart abgeleitete Gerüstregion, typischerweise eine menschliche Gerüstregion, aufgepfropft. Dies kann durch Oligonucleotid-gerichtete in-vitro-Mutagenese der CDR-codierenden Regionen einer Antikörperkette, leicht oder schwer, aus einer Nicht- Ratten-Säugerart durchgeführt werden. In solchen Fallen werden die Oligonucleotide so gewählt, daß der so erhaltene CDR-gepfropfte Antikörper die CDRs 1 bis 3 der leichten Kette und die CDRs 1 bis 3 der schweren Kette, wie vorstehend gezeigt, besitzt.
Der neugeformte CD4-Antikörper kann verwendet werden, um Toleranz gegen ein Antigen zu induzieren. Er kann verwendet werden, um Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, zu lindern. Er kann verwendet werden, um eine Transplantatabstoßung zu verhindern. Toleranz gegenüber einem Transplantat, wie einem Organtransplantat oder einem Knochenmarktransplantat, kann erzielt werden. Auch kann der neugeformte CD4-Antikörper verwendet werden, um Allergien zu lindern. Toleranz gegenüber Allergenen könnte erzielt werden.
Der CD4-Antikörper kann depletierend oder nichtdepletierend sein. Ein depletierender Antikörper ist ein Antikörper, der mehr als 50 %, beispielsweise von 90 bis 99 %, der Zielzellen in vivo depletiert. Ein nichtdepletierender Antikörper depletiert weniger als 50 %, beispielsweise 10 bis 25 % und bevorzugt weniger als 10 %, der Zielzellen in vivo. Ein CD4-Antikörper kann allein verabreicht werden oder kann zusammen mit einem nichtdepletierenden oder depletierenden CD8-Antikörper verabreicht werden. Der CD4-Antikörper, der depletierend oder nichtdepletierend ist, und der monoclonale CD8-Antikörper, der depletierend oder nichtdepletierend ist, können nacheinander in beliebiger Reihenfolge verabreicht werden oder können gleichzeitig verabreicht werden. Ein weiterer Antikörper, Arzneimittel oder Protein kann vor, während oder nach der Verabreichung der Antikörper verabreicht werden.
Ein CD4-Antikörper und in der Tat ein CD8-Antikörper, wie geeignet, werden parenteral, beispielsweise intravenös, verabreicht. Der Antikörper kann durch Injektion oder durch Infusion verabreicht werden. Dazu wird der Antikörper in einem pharmazeutischen Präparat, das weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel enthält, formuliert. Jeder beliebige geeignete Träger oder Verdünnungsmittel kann verwendet werden, beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung.
Die Menge des nichtdepletierenden oder depletierenden CD4s und ggf. des CD8-Antikörpers, die einem Patienten verabreicht wird, nangt von einer Vielzahl von Faktoren ab, umfassend das Alter und das Gewicht eines Patienten, den Zustand, der behandelt wird, und das Antigen/Antigene, gegen das/die Toleranz induziert werden soll. In einem Mausmodellsystem werden 1 µg bis 2 mg, bevorzugt 400 µg bis 1 mg, eines mAks auf einmal verabreicht. Bei Menschen werden 3 bis 500 mg, beispielsweise 5 bis 200 mg, Antikörper einmal verabreicht. Viele derartige Dosen können über eine Zeitspanne von mehreren Wochen, typischerweise 3 Wochen, verabreicht werden.
Ein Fremdantigen/Fremdantigene, gegen das/die Toleranz induziert werden soll, kann einem Wirt vor, während oder nach einem Behandlungszyklus mit einem CD4-Antikörper (depletierend oder nichtdepletierend) und/oder CD4-Antikörper (depletierend oder nichtdepletierend) verabreicht werden. Typischerweise jedoch wird das Antigen/die Antigene einmal wöchentlich nach Beginn der Antikörperverabreichung verabreicht, und die Verabreichung wird drei Wochen vor der letzten Antikörperverabreichung beendet.
Die Toleranz kann daher gegen ein Antigen in einem Wirt induziert werden, indem man nichtdepletierende oder depletierende CD4- und CD8-mAks und, unter dem Schutz der mAks das Antigen verabreicht. Ein Patient kann chirurgisch unter dem Schutz der nichtpletierenden oder depletierenden CD4- und CD8-mAks operiert werden, wobei ein Gewebetransplantat, wie ein Organtransplantat oder ein Knochenmarktransplantat, gegeben wird. Auch kann Toleranz gegen ein Antigen, das von einem Patienten bereits besessen wird, induziert werden. Spezifische Langzeittoleranz kann gegen ein Selbstantigen oder -antigene induziert werden, um Autoimmunerkrankungen, wie multiple Sklerose oder rheumatoide Arthritis, zu behandeln. Der Zustand eines Patienten, der an einer Autoimmunerkrankung leidet, kann daher gelindert werden.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung. In den beigefügten Figuren:
Zeigt die Fig. 1: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz einer variablen Region einer leichten Kette eines Ratten-CD4-Antikörpers. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotids in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die Basenpaare 1 bis 269 (HindIII-PuvII) und 577 bis 620 ([BglII/BclI]-BamHI) sind Teil des Vektors M13VKPCR3, während die Basenpaare 270 bis 576 aus dem PCR-Produkt der variablen Region der leichten Kette des CD4-Antikörpers (VL) stammen. Die CDRs (Kästen) wurden durch Vergleich mit bekannten immunologischen Sequenzen identifiziert (Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest, US Dept of Health und Human Services, US Government Printing Office, 1987).
Zeigt die Fig. 2: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz der cDNA der leichten Kette des neugeformten CAMPATH-1-Antikörpers. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch Kästen identifiziert.
Zeigt die Fig. 3: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz der cDNA der leichten Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VLREI. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch Kasten identifiziert.
Zeigt die Fig. 4: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz einer variablen Region der schweren Kette eines Ratten-CD4-Antikörpers. Die Zahl der ersten und letzten Aninosäure oder Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch Kasten identifiziert. Die Basenpaare 1 bis 272 (HindIII-PstI) und 603 bis 817 (BstEII-BamHI) sind Teil des Vektors M13VHPCR1, während die Basenpaare 273 bis 602 aus dem PCR-Produkt der variablen Region der schweren Kette des CD4-Antikörpers (VH) stammen.
Zeigt die Fig. 5: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz der cDNA der schweren Kette des neugeformten CAMPATH-1-Antikörpers. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch Kästen identifiziert.
Zeigt die Fig. 6: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz der cDNA der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHNEW- Thr³&sup0;. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch Kästen identifiziert.
Zeigt die Fig. 7: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz der cDNA der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHNEW- Ser³&sup0;. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch Kästen identifiziert.
Zeigt die Fig. 8: die Aminosäuresequenz der variablen Region (V) der schweren Kette des menschlichen Myelomproteins KOL. Die CDRs sind durch Kästen identifiziert. Diese Sequenz stammt aus der Swiss-Prot-Proteinsequenz-Datenbank.
Zeigt die Fig. 9: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz der V-Region der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHKOL-Pro¹¹³. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch Kästen identifiziert.
Zeigt die Fig. 10: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz der V-Region der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHKOL-Pro¹¹³ ohne Immunglobulinpromotor. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch Kästen identifiziert.
Zeigt die Fig. 11: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz der V-Region der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHKOL-Thr¹¹³. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch Kästen identifiziert.
Zeigt die Fig. 12: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz der V-Region der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHKOL-Thr¹¹³ ohne Immunglobulinpromotor. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch Kästen identifiziert.
Zeigt die Fig. 13: die Ergebnisse eines ELISAs, der die Bindungsfähigkeit der YNB46.1.8- und CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörper vergleicht. Die X- Achse zeigt die Konzentration (µg/ml) an YNB46.1.8- (Dreiecke) oder CD4VHOL-Thr¹¹³- (Kreise) Antikörper an. Die Y-Achse zeigt die optische Dichte bei 492 nm an.

Beispiel

1. Material und Methoden

Isolierung des monoclonalen Antikörpers.

Der von einer Ratte abgeleitete Anti-Mensch-CD4-Antikörper, Clon YNB46.1.8 (IgG2b, Serotyp der leichten Kette κ), war das Ergebnis einer Fusion zwischen einem Rattensplenocyten und der Rattenmyelonzellinie des Lou-Stamms Y3-Ag 1.2.3 (Galfre et al., Nature, 277: 131-133, 1979) und wurde durch seine Bindung an eine Ratten-T-Zellinie NB2-6TG, die mit einem Expressionsvektor stabil transfiziert worden war, der eine komplementäre DNA (cDNA), die das menschliche CD4-Antigen codiert, enthält (Madden et al., Cell, 42: 93- 104, 1985), selektioniert. Der Antikörper wurde durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt.

Isolierung der variablen Regionen des Antikörpers.

cDNAs, die die VL- und VH-Regionen des CD4-Antikörpers codieren, wurden durch ein Verfahren auf der Basis der Polymerasekettenreaktion (PCR) isoliert (Orlandi et al., PNAS USA, 86: 3833-3837, 1989), wobei einige Modifikationen vorgenommen wurden. Die Gesamt-RNA wurde aus den Hybridomzellen nach dem Guanidinthiocyanatverfahren (Chirgwin et al., Biochemistry, 18: 5294, 1979) isoliert, und Poly(A)&spplus;-RNA wurde durch Passage der Gesamt-RNA durch und Elution aus einer Oligo(dT)-Cellulosesäule (Aviv und Leder PNAS USA 69: 1408, 1972) isoliert. Poly(A)&spplus;-RNA wurde 5 min lang auf 70ºC erhitzt und kurz vor Gebrauch auf Eis abgekühlt. Eine 25 µl-Synthesereaktion für den ersten Strang bestand aus Poly(A)&spplus;-RNA, 250 µM jedes dNTPs, 50 mM Tris-HCl (pH 8,2 bei 42ºC), 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM KCl, 10 mM Dithiothreit, 23 Einheiten reverse Transkriptase (Anglian Biotec, Colchester, U.K.), 3,5 pmol des VL-Region-spezifischen Oligonucleotid-Primers VK1FOR [5'- d(GTT AGA TCT CCA GCT TGG TCC C)] oder des VH-Region-spezifischen Primers VH1FOR-B [5'-d(TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC)] und wurde 5 min lang bei 20ºC und dann 90 min lang bei 42ºC inkubiert.
Die anschließenden 50 µl-PCR-Amplifikationen bestanden aus 5 µl der Synthesereaktion des ersten Strangs (nichtgereinigt), 500 µM jedes dNTPs, 67 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 25ºC), 17 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 10 mM MgCl&sub2;, 20 µg/ml Gelatine, 5 Einheiten TAQ-DNA-Polymerase (Koch-Light, Haverhill, U.K.) und 25 pmol (jedes) der Primer VK1FOR und VK1BACK [5'-d(GAC ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA)] für die VL-Region oder VH1FOR-B und des gemischten Primers VHBACK [5'-d(AG GT(CG) (CA)A(GA) CTG CAG (GC)AG TC(TA) GG)] für die VH-Region. Die Reaktionsansätze wurden mit Mineralöl überschichtet und 30 Zyklen zu 1,5 min bei 95ºC (Denaturieren), 1,5 min bei 37ºC (VL) oder 50ºC (VH; Assoziieren) und 3 min bei 72ºC (Extension) mit einem programmierbaren cyclischen Techne-PHC-1-Reaktor unterworfen. Der letzte Zyklus enthielt eine 10minütige Extensionszeit.
Die Proben wurden bei -20ºC gefroren, und das Mineralöl (eine viskose Flüssigkeit bei -20ºC) wurde durch Absaugen entfernt. Die wäßrigen Phasen wurden aufgetaut, und die PCR-Produdte wurden durch Elektrophorese in 2%igen Agarosegelen gereinigt und dann doppelt gespalten mit entweder PvuII und BglII (VL) oder PstI und BstEII (VH)-Restriktionsenzymen und in die PvuII- und BclI-Restriktionsspaltstellen des Vektors M13VKPCR3 (für die VL-Region; Orlandi et al., 1989) oder die PstI- und BstEII-Restriktionsspaltstellen des Vektors M13VHPCR1 (für die VH-Region) cloniert. Wie in den Ergebnissen beschrieben, wurden die VL-Region-Clone zuerst durch Hybridisieren an eine mit ³²P-markierte Oligonucleotidsonde [5'-d(GTT TCA TAA TAT TGG AGA CA)], die für die CDR2 der Y3-Ag 1.2.3-VL-Region spezifisch ist, abgesucht. Die VL-Region-Clone, die mit dieser Sonde nicht hybridisierten, und die VH-Region-Clone wurden durch Didesoxykettenabbruchverfahren sequenziert (Sanger et al., PNAS USA 74: 5463, 1977).

Neugeformte variable Region der leichten Kette und Expression der Vektorkonstruktion.

Die neugeformte leichte Kette wurde durch Oligonucleotid-gerichtete in-vitro-Mutagenese in einem M13-Vektor durch Primen mit drei Oligonucleotiden gleichzeitig auf einer 748 Basen großen, einzelsträngigen cDNA-Matrize, die die vollständige VL-Region und die konstanten κ-Regionen (CK) des neugeformten CAMPATH-1-Antikörpers codiert (Reichmann et al., Nature 332: 323-327, 1988), konstruiert. Die drei Oligonucleotide
wurden so entwickelt, daß sie jede der drei CDRs in der REI-basierenden menschlichen Antikörper-VL- Region, die Teil der neugeformten CAMPATH-1-Antikörper-VL-Region ist (Reichmann et al., 1988), ersetzten. Ein Clon, der jeden der drei mutierten Oligonucleotide enthielt, wurde durch Nucleotidsequenzierung identifiziert und in die HindIII-Spaltstelle des Expressionsvektors pHβAPr-1 subcloniert (Gunning et al., PNAS, 84: 4831-4835, 1987), der auch ein Dihydrofolat-Rautasegen (Ringold et al., J. Mol. Appl. Genet. 1: 165-175, 1981) unter der Steuerung eines gekürzten SV40-Promotors enthielt.

Neugeformte variable Regionen der schweren Kette, besierend auf der Gerüstregion der variablen Region des menschlichen Antikörpers NEW, und Konstruktion des Expressionsvektors.

Zwei Versionen der neugeformten schweren Kette auf der Basis von NEW wurden erzeugt, CD4VHNEW-Thr³&sup0; und CD4VHNEW-Ser³&sup0;. Die CD4VHNEW- Thr³&sup0;-Version (Fig. 6) codiert einen Threoninrest in Position 30, während die CD4VHNEW-Ser³&sup0;-Version (Fig. 7) einen Serinrest in Position 30 codiert. Der Einfachheit halber wurde zuerst CD4VHNEW-Thr³&sup0; durch eine Oligonucleotid-gerichtete in-vitro-Mutagenese in den Vektor M13mp18 durch Primen mit drei Oligonucleotiden gleichzeitig auf einer 1467 Basen großen, einzelsträngigen cDNA-Matrize (Fig. 5), die die vollständige schwere Kette des neugeformten CAMPATH-1-Antikörpers codiert (Reichmann et al., 1988), erzeugt. Die drei Oligonucleotide
wurden so entwickelt, daß sie jede der drei Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDRs) in der VH-Region auf NEW- Basis ersetzten, die Teil des neugeformten CAMPATH-1-Antikörpers ist (Reichmann et al., 1988). Ein Clon (Fig. 6), der jedes der drei mutierten Oligonucleotide enthielt, wurde durch Nucleotidsequenzierung identifiziert. CD4VHNEW-Ser³&sup0; wurde dann durch Oligonucleotid-gerichtete in- vitro-Mutagenese in dem Vektor M13mp18 durch Primen mit einem Einzel-Oligonucleotid auf der 1458 Basen großen, einzelsträngig cDNA-Matrize (Fig. 6), die CD4VHNEW-Thr³&sup0; codiert, erzeugt. Das Oligonucleotid [5'-d(GCT TCA CCT TCA GCA ACT ATG GCA T)] wurde so entwickelt, daß es den Rest in Position 30 von Threonin [ACC] zu Serin [AGC] mutierte. Ein Clon (Fig. 7), der dieses mutierte Oligonucleotid enthielt, wurde durch Nucleotidsequenzierung identifiziert. Doppelsträngige Formen der Clone CD4VHNEW-Thr³&sup0; und CD4VHNEW-Ser³&sup0; wurden als HindIII-Fragmente in die HindIII-Spaltstelle des Expressionsvektors pNH316 subcloniert. Der Vektor pNH316 ist eine modifizierte Version des Vektors pHβAPr-1 (Gunning et al., PNAS, 84: 4831-4835, 1987), der so konstruiert wurde, daß er ein von einem Metallothionin-Promotor gesteuertes Neomycin-Resistenzgen enthielt.

Neugeformte variable Regionen der schweren Kette, basierend auf der Gerüstregion der variablen Region des menschlichen Antikörpers KOL, und Konstruktion des Expressionsvektors

Zwei Versionen der neugeformten schweren Kette auf KOL-Basis wurden erzeugt, CD4VHKOL-Thr¹³ und CD4VHKOL-Pro¹¹³. Die CD4VHKOL-Thr¹¹³-Version codiert einen Threoninrest in Position 113 (Fig. 11), während die CD4VHKOL-Pro¹¹³-Version einen Prolinrest in Position 113 (Fig. 9) codiert. Der Einfachheit halber wurde zuerst CD4VHKOL-Thr¹¹³ durch eine Oligonucleotid-gerichtete in-vitro-Mutagenese einer einzelsträngigen DNA- Matrize, die das 817 Basen große HindIII-BamHI-Fragment, das die VH- Region des Ratten-CD4-Antikörpers codiert, enthält (Fig. 4), erzeugt und in einen M13mp18 durch gleichzeitiges Primen mit fünf Oligonucleotiden
cloniert, die so entwickelt waren, daß sie die Gerüstregionen der Ratte durch die menschlichen Gerüstregionen aus KOL ersetzten. Ein Clon, der jedes der fünf mutierten Oligonucleotide enthielt, wurde durch Nucleotidsequenzierung identifiziert. CD4VHKOL-Pro¹¹³ wurde anschließend durch Oligonucleotid-gesteuerte in-vitro-Mutagenese einer einzelsträngigen DNA- Matrize erzeugt, die das 817 Basen große HindIII-BamHI-Fragment enthielt, das CD4VHKOL-Thr¹¹³ codiert, das in M13mp18 durch Primen nit dem Oligonucleotid [5'-d(TGG GGC CAA GGG ACC CCC GTC ACC GTC TCC TCA)] cloniert war. Ein Clon, der dieses mutierte Oligonucleotid enthielt, wurde durch Nucleotidsequenzierung identifiziert.
Die Immunoglobulinpromotoren wurden aus den doppelsträngigen DNA- Formen der Clone, die CD4VHKOL-Thr¹¹³ (Fig. 11) und CD4VHKOL-Pro¹¹³ (Fig. 9) codieren, durch Ersetzen (für beide Versionen) der ersten 125 bp (HindIII-NcoI) durch ein HindIII-NcoI-Oligonucleotid-Linkerfragment [5'- d(AGC TTT ACA GTT ACT GAG CAC ACA GGA CCT CAC) und dessen überlappendes Komplement 5'-d(CAT GGT GAG GTC CTG TGT GCT CAG TAA CTG TAA)] entfernt. Die so erhaltenen Clone, CD4VHKOL-Thr¹¹³ (Fig. 12) und CD4VHKOL-Pro¹¹³ (Fig. 10), nun 731 bp große HindIII-BamHI-Fragmente, wurden separat in die HindIII- und BamHI-Clonierungsstellen des Expressionsvektors pHβAPr-1-gpt (Gunning et al., PNAS USA 76, 1373, 1987) subcloniert, in die das Gen für die konstante Region von menschlichem IgG1 (Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166, 1351-1361, 1987) an die BamHI-Stelle cloniert worden war. So werden bei Transfektion und Expression als schwere Antikörperketten (siehe nachstehend) diese neugeformten VH-Regionen an die konstanten Regionen von menschlichem IgG1 geknüpft.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsorter- (FACS) Analyse

Die relativen Affinitäten der neugeformten Antikörper, das CD4- Antigen zu binden, wurden durch FACS-Analyse abgeschätzt. Die CD4-exprimierenden Zellen, die bei dieser Analyse verwendet wurden, waren eine clonierte Ratten-T-Zellinie NB2-6TG, die stabil mit einem Expressionsvektor transfiziert worden war, der eine komplementäre DNA (cDNA), die das menschliche CD4-Antigen codiert, enthält (Maddon et al., Cell, 42, 93- 104, 1985). Die Zellen wurden mit dem geeigneten neugeformten Antikörper, gefolgt von Fluorescein-konjugierten Schaf-Anti-Mensch-Antikörpern (Binding Site Ltd., Birmingham, UK), angefärbt. Die Kontrollfärbung (siehe Tabelle 1) bestand aus keinem vorhandenen Antikörper während der ersten Stufe der Zellfärbung. Die mittlere Zellfluoreszenz wurde mit einem Ortho-FACS bestimmt.

Analyse der Bindungsfähigkeit eines Antikörpers

Die relativen Bindungsfähigkeiten des Ratten-YNB46.1.8-Antikörpers und des neugeformten CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörpers wurden durch einen Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) bestimmt. Mikrotiterplatten wurden mit einem löslichen rekombinanten CD4-Antigen (Byrn et al., Nature, 344: 667-670, 1990) in einer Konzentration von 50 µl/Kavität, 10 µg/ml, beschichtet und dann mit 100 µl/Kavität Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die 1,0 % Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, blockiert. Die Antikörper wurden in PBS, die 0,1 % BSA enthielt, verdünnt und den Kavitäten (50 µl/Kavität) für 45 min bei Raumtemperatur zugesetzt. Ein biotinylierter CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörper (10 µl/Kavität; 20 µg/ml Endkonzentration) wurde dann jeder Kavität für weitere 45 min zugesetzt. Die Kavitäten wurden mit PBS, die 0,1 % BSA enthielt, gewaschen, und dann wurden 50 µl Streptavidin-biotinylierte Meerrettichperoxidase-Komplex (Amersham; Aylesbury, UK), verdünnt 1:1000, jeder Kavität 30 min lang zugesetzt. Die Kavitäten wurden mit PBS, die 0,1 % BSA enthielt, gewaschen, und 100 µl Substrat (25 mM Citronensäure, 50 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 0,1 % (Gew./Vol.) o-Phenylendiamin, 0,04 % (Vol./Vol.) 30 % Wasserstoffperoxid) wurden jeder Kavität zugesetzt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 50 µl/Kavität 1,0 M Schwefelsäure gestoppt. Die optischen Dichten bei 492 nm (OD&sub4;&sub9;&sub2;) wurden mit einem ELISA-Plattenlesegerät bestimmt.

Transfektionen

Dihydrofolatreduktase-defekte China-Hamster-Ovarzellen (CHODHFR-) (10&sup6;/T-75 Kolben) wurden, wie beschrieben (Wigler et al., PNAS USA 76, 1373, 1979), mit 9 µg schwere Kettenkonstruktion und 1 µg leichte Kettenkonstruktion kotransfiziert. Die Transfektanten wurden in einem Medium, das 5 % dialysiertes fötales Rinderserum enthielt, 2 bis 3 Wochen lang selektioniert, und die Antikörper-sezernierenden Clone wurden durch ELISAs der konditionierten Medien identifiziert. Der Antikörper wurde konzentriert und durch Protein-A-Sepharose (Warenzeichen)-Säulenchromatographie gereinigt.

2. Ergebnisse

Clonierung der cDNAs der variablen Region der leichten und schweren Kette.

cDNAs, die die VL- und VH-Regionen aus CD4-Antikörper-sezernierenden Hybridomzellen codieren, wurden durch PCR unter Verwendeng von Primern, die das mRNA-Segment, das die N-terminale Region codiert, bis zur J-Region (Orlandi et al., 1989) amplifizieren, isoliert. Die PCR- Produkte der VL- und VH-Region wurden in die Vektoren auf der Basis von M13 M13VKPCR3 bzw. M13VHPCR1 subcloniert. Die anfängliche Nucleotidsequenzanalyse der VL-Region-Zufalls-Clone zeigte, daß der Hauptteil der cDNAs die VL-Region der leichten Kette codierten und von der Y3-Ag 1.2.3- Ratten-Myelomzellinie (Crowe et al., Nucleic Acid Research, 17: 7992, 1989) exprimiert wurde, die als Fusionspartner zur Erzeugung des Anti- CD4-Hybridoms verwendet wurde. Es ist wahrscheinlich, daß die Expression der mRNA der Y3-Ag 1.2.3 leichten Kette größer als die der leichten Kette des CD4-Antikörpers ist oder daß die mRNA der Y3-Ag 1.2.3 leichten Kette bevorzugt während der PCR amplifiziert wird.
Um die Chance, cDNAs für die CD4-VL-Region aufzufinden, wurden zuerst alle M13-Clone durch Hybridisieren an eine ³²P-markierte Oligonucleotidsonde, die der CDR2 von Y3-Ag 1.2.3 komplementär ist (Crowe et al., Nucleic Acid Research, 17: 7992, 1989), abgesucht. Eine anschließende Sequenzanalyse wurde auf M13-Clone begrenzt, die keine dieser Sonde komplementäre Sequenz enthielten. So wurden zwei cDNA-Clone aus unabhängigen PCR-Amplifikationen identifiziert, die identische VL-Regionen codierten. Die Nucleotidsequenzanalyse von VH-Region-PCR-Zufallsprodukten zeigte eine einzelne Art einer VH-Region-cDNA. Es wurde gefunden, daß zwei VH-cDNA-Clone aus unabhängigen PCR-Amplifikationen identische Sequenzen enthielten, außer, daß das Codon des Rests 14 Prolin [CCT] in einem Clon codierte, während der zweite Clon Leucin [CTT] an der gleichen Position codierte.
Gemäß Kabat et al., 1987, enthalten 524 der 595 sequenzierten VH- Regionen einen Prolinrest an dieser Position, während nur sechs Leucin enthalten. Es wurde daher zur Erläuterung der Prolin-codierende Clon gewählt (siehe nachstehend). Da Rest 14 gut in der ersten VH-Gerüstregion und nicht in einer CDR liegt, ist es unwahrscheinlich, daß er direkt zur Antigenbindung beiträgt, und die Ambiguität an dieser Position beeinflußte die nachfolgende Neuformungsstrategie nicht. So wurde diese Sequenz- Ambiguität nicht weiter untersucht.
Die cDNA-Sequenzen und ihre vorhergesagten Aminosäuresequenzen sind in den Fig. 1 und 4 gezeigt. Da keine zusätzlichen VL- oder VH-Region-codierenden Clone gefunden wurden, wurde angenommen, daß diese Sequenzen von den CD4-Antikörpergenen abgeleitet waren.

Konstruktion der neugeformten Antikörper.

Es war Aufgabe, die Bedeutung der Selektion der geeigneten Gerüstregion der menschlichen V-Region während der Neuformung zu untersuchen. Zwei Neuformungsstrategien wurden verwendet.

Erste Neuformungsstrategie.

In der ersten Strategie wurde ein neugeformter Antikörper geschaffen, der die CDRs aus dem Ratten-CD4-Antikörper und die gleichen menschlichen V-Region-Gerüstsequenzen beherbergte, die zuvor erfolgreich für den neugeformten CAMPATH-1-Antikörper verwendet worden war, d.h. eine Gerüstregion auf REI-Basis für die VL-Region und eine Gerüstregion auf NEW-Basis für die VH-Region (Reichmann et al., 1988). Dies wurde durch Oligonucleotid-gerichtete in-vitro-Mutagenese der sechs CDRs der cDNAs der leichten und schweren Kette des neugeformten CAMPATH-1-Antikörpers, wie in den Fig. 2 bzw. 5 gezeigt ist, durchgeführt. Die so erhaltene neugeformte leichte Kette des CD4-Antikörpers (Fig. 3) wird als CD4VLREI bezeichnet. Zwei Versionen der neugeformten schweren Kette des CD4-Antikörpers auf NEW-Basis wurden geschaffen: CD4VHNEW-Thr³&sup0; (Fig. 6), codierend einen Threoninrest in Position 30 (in Gerüstregion 1), und CD4VHNEW-Ser³&sup0; (Fig. 7), codierend einen Serinrest in Position 30. Diese zwei verschiedenen Versionen wurden geschaffen, weil die erfolgreich neugeformte schwere Kette des CAMPATH-1-Antikörpers das Antigen gut band, unabhängig davon, ob Position 30 einen Threonin- oder Serinrest (Reichmann et al., 1988) codierte, und es wurde gewählt, beide Positionen in diesem Fall ebenfalls zu testen.

Zweite Neuformungsstrategie

Bei der zweiten Neuformungsstrategie wurde die VH-Region des CD4- Antikörpers neu geformt, so daß sie die Gerüstsequenzen der VH-Region des menschlichen Antikörpers KOL enthielt. Von allen bekannten menschlichen Antikörper-VH-Regionen ist die Gesamtaminosäuresequenz der VH-Region von KOL der der Ratten-CD4-Antikörper-VH-Region am meisten homolog. Die VH- Regionen der menschlichen Antikörper KOL und NEW sind 66 % bzw. 42 % der Ratten-CD4-Antikörper-VH-Region homolog.
Zwei Versionen der V-Region der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers auf KOL-Basis wurden erzeugt, die sich durch einen einzelnen Aminosäurerest in der vierten Gerüstregion unterscheiden: CD4VHKOL-Pro¹¹³ (Fig. 10) codiert einen Prolinrest in Position 113, und CD4VHKOL-Thr¹¹³ (Fig. 12) codiert einen Threoninrest in Position 113. CD4VHKOL-Pro¹¹³ ist "formecht", indem seine Gerüstsequenzen denjenigen der V-Region der schweren Kette des KOL-Antikörpers identisch sind (Fig. 8).
Von allen bekannten menschlichen Antikörper-VL-Regionen ist die Gesamtaminosäuresequenz der VL-Region der menschlichen leichten Kette NEW der Ratten-CD4-Antikörper-VL-Region am meisten homolog (67 %). So wird die identische neugeformte leichte Kette CD4VLREI (vorstehend beschrieben), die mit den neugeformten schweren Ketten des CD4-Antikörpers auf NEW-Basis, CD4VHNEW-Thr³&sup0; und CD4VHNEW-Ser³&sup0;, exprimiert wurde, ebenfalls mit den neugeformten schweren Ketten des CD4-Antikörpers auf KOL-Basis, CD4VHKOL-Pro¹¹³ und CD4VHKOL-Thr¹¹³, exprimiert. Dies ist vorteilhaft, weil die Expression der gleichen neugeformten leichten Kette mit unterschiedlichen neugeformten schweren Ketten einen direkten funktionellen Vergleich jeder neugeformten schweren Kette erlaubt.
Zusammenfassend wurden vier verschiedene neugeformte Antikörper geschaffen. Die neugeformte leichte Kette jedes Antikörpers wird als CD4VLREI bezeichnet. Die neugeformten schweren Ketten der Antikörper werden als CD4VHNEW-Thr³&sup0;, CD4VHNEW-Ser³&sup0;, CD4VHKOL-Pro¹¹³ bzw. CD4VHKOL-Thr¹¹³ bezeichnet. Jede der neugeformten schweren Ketten enthält die gleiche konstante menschliche IgG1-Region. Da jeder neugeformte Antikörper die gleiche neugeformte leichte Kette enthält, wird der Name einer neugeformten schweren Kette eines Antikörpers nachstehend verwendet, um den gesamten Antikörper zu bezeichnen (Kombination aus schwerer und leichter Kette).

Relative Affinitäten der neugeformten Antikörper

Die relativen Affinitäten der neugeformten Antikörper wurden durch Messen inrer Fähigkeit, CD4-Antigen-exprimierende Zellen in verschiedenen Antikörperkonzentrationen zu binden, abgeschätzt. Die FACS-Analyse bestimmte die mittlere zelluläre Fluoreszenz der gefärbten Zellen (Tabelle 1).
Ans dieser Analyse geht klar hervor, daß die neugeformten CD4-Antikörper das CD4-Antigen in variierenden Ausmaßen über einen breiten Konzentrationsbereich binden. In diesem Zusammenhang wird auf Versuch 1 von Tabelle 1 verwiesen. Ein Vergleich des CD4VHKOL¹¹³-Antikörpers mit dem CD4VHNEW-Thr³&sup0;-Antikörper zeigt, daß beide Antikörper CD4&spplus;-Zellen binden, verglichen mit der Kontrolle, neugeformter CAMPATH-1-Antikörper. Jedoch bindet der CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörper CD4&spplus;-Zellen mit weit größerer Affinität als der CD4VHNEW-Thr³&sup0;-Antikörper. Die niedrigste Konzentration des getesteten CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörpers (2,5 µg/ml) ergab eine mittlere zelluläre Fluoreszenz, die der der höchsten Konzentration des getesteten CD4VHNEW-Thr³&sup0;-Antikörpers nahezu äquivalent war (168 µg/ml). Versuch 2 zeigt, daß der CD4VHNEW-Ser³&sup0;-Antikörper die CD4&spplus;-Zellen etwas besser bindet als CD4VHNEW-Thr³&sup0;. Nur 2,5 µg/ml CD4VHNEW-Ser³&sup0;-Antikörper werden benötigt, um eine mittlere zelluläre Fluoreszenz zu ergeben, die der von 10 µg/ml CD4VHNEW-Thr³&sup0;-Antikörper nahezu äquivalent ist. Versuch 3 zeigt, daß der CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörper CD4&spplus;-Zellen etwas besser als der CD4VHKOL-Pro¹¹³-Antikörper binden kann.
Aus diesen Assays geht klar hervor, daß die neugeformten Antikörper auf KOL-Basis den neugeformten Antikörpern auf NEW-Basis hinsichtlich der Affinität gegenüber CD4&spplus;-Zellen bei weitem überlegen sind. Ebenso besteht ein geringerer Unterschied, wenn überhaupt, zwischen dem CD4VHNEW-Thr³&sup0;- Antikörper und dem CD4VHNEW-Ser³&sup0;-Antikörper und auf ähnliche Weise zwischen dem CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörper und dem CD4VHKOL-Pro¹¹³-Antikörper. Eine Rangordnung dieser neugeformten Antikörper kann somit, basierend auf ihren relativen Affinitäten, für die CD4&spplus;-Zellen abgeleitet werden:
CD4VHKOL-Thr¹¹³ > CD4VHKOL-Pro¹¹³ » CD4VHNEW-Ser³&sup0; > CD4VHNEW-Thr³&sup0;
Es sollte erneut betont werden, daß jeder der neugeformten Antikörper, der in den vorstehenden Versuchen verwendet wurde, identische konstante Regionen für die schwere Kette besitzt und mit identischen neugeformten leichten Ketten assoziiert ist. So beobachtete Unterschiede mit der Bindung an CD4&spplus;-Zellen müssen auf Unterschiede in ihren V-Regionen der schweren Kette zurückzuführen sein.

Relative Bindungsfähigkeiten des Ratten-YNB46.1.8-Antikörpers und des neugeformten CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörpers

Die relativen Bindungsfähigkeiten des Ratten-YNB46.1.8-Antikörpers und des neugeformten CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörpers wurden durch einen ELISA bestimmt. In diesem Assay wurde die Fähigkeit jedes Antikörpers, die Bindung des biotinylierten CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörpers an lösliches rekombinantes CD4-Antigen zu hemmen, bestimmt. Die Ergebnisse eines Versuchs sind in Fig. 13 gezeigt. Die Hemmung der Bindung des biotinylierten CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörpers war sowohl für den nichtmarkierten CD4VHKOL- Thr¹¹³- als auch für den YNB46.1.8-Antikörper linear in der Nähe der optischen Dichte von 0,3. Die Konzentrationen an CD4VHKOL-Thr¹¹³- und YNB46.1.8-Antikörpern, die eine optische Dichte von 0,3 ergeben, betragen 28,7 bzw. 1,56 µg/ml. So kann die Bindungsfähigkeit des YNB46.1.8-Antikörpers auf 28,7/1,56 oder etwa 18fach besser als die des CD4VHKOL- Thr¹¹³-Antikörpers abgeschätzt werden. Es ist darauf hinzuweisen, daß dieser Versuch nur eine grobe Annäherung der relativen Bindungsfähigkeiten, nicht Affinitäten, ergibt. Der Ratten-YNB46.1.8-Antikörper enthält eine andere konstante Region als der CD4VHKOL-Thr¹¹³-Antikörper, und dies könnte Einfluß darauf nehmen, wie gut die Antikörper das CD4-Antigen binden, unabhängig von deren tatsächlichen Affinitäten für das CD4-Antigen. Die tatsächliche Affinität der neugeformten Antikörper für das CD4-Antigen kann größer, kleiner oder gleich wie die des YNB46.1.8-Antikörpers sein. Die anderen neugeformten Antikörper CD4VHKOL-Pro¹¹³, CD4VHNEW-Ser³&sup0; und CD4VHNEW-Thr³&sup0; wurden in diesem Test noch nicht getestet. Tabelle 1 Mittlere zelluläre Fluoreszenz von mit den neugeformten Antikörpern gefärbten CD4&spplus;-Zellen

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Antikörperkette, in der die Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDRs) der variablen Domäne der Antikörperkette von einer ersten Säugerart abgeleitet sind und die Gerüstregion der variablen Domäne und, sofern vorhanden, die oder jede konstante Domäne der Antikörperkette von einer zweiten anderen Säugerart stammen, wobei man

(i) die die Gerüstregion codierenden Regionen der DNA, die eine variable Domäne einer Antikörperkette der ersten Art codiert, so mutiert, daß die mutierten, die Gerüstregion codierenden Regionen die von der zweiten Art abgeleitete Gerüstregion codieren; und

(ii) die Antikörperkette exprimiert, wobei die mutierte DNA aus Stufe (i) verwendet wird;

wobei die Mutation in Stufe (i) so ist, daß ein Antikörper, der die in Stufe (ii) exprimierte Antikörperkette umfaßt, die Bindungsfähigkeit des Antikörpers, von dem die CDRs abgeleitet sind, beibehält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die die Gerüstregion codierenden Regionen der DNA, die die variable Domäne einer schweren Kette eines Antikörpers codiert, in Stufe (i) mutiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die die Gerüstregion codierenden Regionen der DNA, die die variable Domäne einer leichten Kette eines Antikörpers codiert, in Stufe (i) mutiert werden.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die erste Art eine Ratte oder eine Maus ist.

5. Verfahren nach einen der vorstehenden Ansprüche, wobei die zweite Art der Mensch ist.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei man

(a) die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz einer variablen Domäne einer ausgewählten Antikörperkette der ersten Art bestimmt;

(b) die Antikörpergerüstregion bestimmt, gegenüber der die Gerüstregion der Domäne verändert werden soll;

(c) die die Gerüstregion codierenden Regionen der DNA, die die variable Domäne codiert, so mutiert, daß die mutierten, die Gerüstregion codierenden Regionen die in Stufe (b) bestimmte Gerüstregion codieren;

(d) die in Stufe (c) erhaltene mutierte DNA an die DNA knüpft, die eine konstante Domäne der zweiten Art codiert, und die DNA in einem Expressionsvektor cloniert; und

(e) den Expressionsvektor in eine kompatible Wirtszelle einschleust und die Wirtszelle unter solchen Bedingungen züchtet, daß die Antikörperkette exprimiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Gerüstregion mit etwa der meisten Homologie einer Antikörperkette einer anderen Art in Stufe (b) als die Gerüstregion ausgewählt wird, gegenüber der die variable Domäne verändert werden soll.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Antikörper der ersten Art ein CD4-Antikörper ist.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Antikörperkette mit einer komplementären Antikörperkette gleichzeitig exprimiert wird und ein Antikörper, der die zwei Ketten umfaßt, isoliert wird.

10. Antikörper, der an menschliches CD4-Antigen binden kann, wobei die CDRs der leichten Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenzen besitzen:

CDR1: LASEDIYSDLA

CDR2: NTDTLQN

CDR3: QQYNNYPWT

und wobei die CDRs der schweren Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenzen besitzen:

CDR1: NYGMA

CDR2: TISHDGSDTYFRDSVKG

CDR3: QGTIAGIRH

und wobei die Gerüstregion der variablen Domäne und, sofern vorhanden, die oder jede konstante Domäne jeder Kette von einer Nicht-Ratten-Säugerart abgeleitet sind.

11. Antikörper nach Anspruch 10, wobei die Nicht-Ratten- Säugerart der Mensch ist.

12. Antikörper nach Anspruch 11, wobei die Gerüstregion der variablen Domäne der schweren Kette der Gerüstregion der variablen Domäne der schweren Kette des Proteins KOL homolog ist.

13. Antikörper nach Anspruch 12, wobei die variable Region der schweren Kette die Aminosäuresequenz, die in der obersten Zeile der Fig. 10 oder 12 gezeigt ist, besitzt.

14. Antikörper nach Anspruch 11, wobei die Gerüstregion der variablen Domäne der schweren Kette der Gerüstregion der variablen Domäne der schweren Kette des Proteins NEW homolog ist.

15. Antikörper nach Anspruch 14, wobei die variable Region der schweren Kette die Aminosäuresequenz, die in der obersten Zeile von Fig. 6 oder 7 gezeigt ist, besitzt.

16. Antikörper nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei die Gerüstregion der variablen Domäne der leichten Kette der Gerüstregion der variablen Domäne des Proteins REI homolog ist.

17. Antikörper nach Anspruch 16, wobei die leichte Kette die Aminosäuresequenz, die in der obersten Zeile der Fig. 3 gezeigt ist, besitzt.

18. Pharmazeutisches Präparat, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel und als Wirkstoff einen Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 17.