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Die
vorliegende Erfindung betrifft veränderte Antikörper und
ihre Herstellung. Die Erfindung kann auf die Produktion humanisierter
Antikörper
angewendet werden.
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Antikörper umfassen
typischerweise zwei schwere Ketten, die durch Disulfidbindungen
miteinander verknüpft
sind, und zwei leichte Ketten. Jede leichte Kette ist an eine jeweilige
schwere Kette über
Disulfidbindungen gebunden. Jede schwere Kette besitzt an einem
Ende eine variable Domäne,
auf die eine Reihe von konstanten Domänen folgt. Jede leichte Kette
besitzt eine variable Domäne
an einem Ende und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende. Die
variable Domäne
der leichten Kette ist entlang der variablen Domäne der schweren Kette angeordnet.
Die konstante Domäne
der leichten Kette ist entlang der ersten konstanten Domäne der schweren
Kette angeordnet. Die konstanten Domänen in den leichten und schweren
Ketten sind nicht direkt an der Bindung des Antikörpers an
ein Antigen beteiligt.
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Die
variablen Domänen
jedes Paares aus leichter und schwerer Kette bilden die Antigenbindungsstelle.
Die Domänen
auf den leichten und schweren Ketten besitzen die gleiche allgemeine
Struktur, und jede Domäne
umfaßt
eine Gerüstregion
aus vier Regionen, deren Sequenzen relativ konserviert sind und
durch drei Komplementarität-bestimmende
Regionen (CDRs) verknüpft
sind. Die vier Gerüstregionen
nehmen hauptsächlich
eine β-Blattkonformation
an, und die CDRs bilden Schleifen, die die β-Blattstruktur verknüpfen und
in einigen Fällen
einen Teil davon bilden. Die CDRs werden durch die Gerüstregionen
in enger Nachbarschaft gehalten und tragen mit den CDRs aus der
anderen Domäne
zur Bildung der Antigenbindungsstelle bei.
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Die
Herstellung eines veränderten
Antikörpers,
in dem die CDRs sich von einer anderen Art als die Gerüstregion
der variablen Domänen
des Antikörpers
ableitet, ist in der
EP-A-0239400 beschrieben.
Die CDRs können
von einem monoclonalen Ratten- oder Maus-Antikörper abgeleitet sein. Die Gerüstregion
der variablen Domänen
und die konstanten Domänen
des veränderten
Antikörpers
können
von einem menschlichen Antikörper
abgeleitet sein. Ein solcher humanisierter Antikörper ruft eine vernachlässigbare
Immunantwort bei Verabreichung an einen Menschen hervor, verglichen
mit der Immunantwort, die von einen Menschen gegen einen Ratten-
oder Maus-Antikörper
entwickelt wird. Ein humanisierter CAMPATH-1-Antikörper ist
in der
EP-A-0328404 beschrieben.
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Die
WO-A-90 07861 beschreibt
einen humanisierten Antikörper,
der für
das p55-Tac-Protein des IL-2-Rezeptors spezifisch ist, worin die
Aminosäuresequenz
der CDRs die eines Maus-Antikörpers
gegen das gleiche Antigen ist und die Aminosäuresequenz der Gerüstregionen
der variablen Domäne
die eines menschlichen Antikörpers,
ausgewählt
auf der Basis der Homologie mit den Gerüstregionen des Nager-Antikörpers, ist.
Die DNA, die den humanisierten Antikörper codiert, wird durch herkömmliche
Methoden, beispielsweise unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide,
produziert.
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Es
wurde nun ein neuer Weg zur Herstellung veränderter Antikörper entwickelt.
Im Gegensatz zu früheren
Vorschlägen
betrifft dieser die Veränderung
der Gerüstregion
einer variablen Domäne
anstelle der CDRs. Dieser Weg besitzt die Vorteile, daß eine vorher
existierende cDNA, die eine menschliche Gerüstregion codiert, die neu zu
formen ist, nicht notwendig ist und daß sie technisch einfacher ist
als frühere
Verfahren.
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Folglich
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
einer Antikörperkette, die
eine variable Domäne
aufweist, die drei komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs),
bezeichnet als CDR1, CDR2 und CDR3, und eine Gerüstregion umfasst, wobei die
CDRs von einer Nagetierspezies abgeleitet sind und wobei die Gerüstregion
und, falls vorhanden, die oder jede konstante Domäne der Antikörperkette
human ist, wobei das Verfahren umfasst:
- (i)
Bestimmen der Aminosäuresequenz
der variablen Domäne
der Nagetier-Antikörperkette;
- (ii) Auswählen
einer variablen Domäne
eines humanen Antikörpers
durch:
(1) Verwenden eines Computerprogramms, um alle verfügbaren Protein-
und DNA-Datenbanken nach jenen variablen Domänesequenzen humaner Antikörper zu
durchsuchen, die die höchste
Homologie zu den variablen Domänen
des Nagetier-Antikörpers
aufweisen;
(2) Auflisten der variablen Domänesequenzen der humanen Antikörper, die
die insgesamt höchste
Homologie zu der variablen Domäne
des Nagetier-Antikörpers
aufweisen, wobei kein Unterschied zwischen der Homologie innerhalb
der Gerüstregionen
und CDRs gemacht wird, aber wobei die Homologie insgesamt betrachtet
wird;
(3) aus der Betrachtung Eliminieren jener humanen Sequenzen,
die CDRs aufweisenden, die eine unterschiedliche Länge als
jene des Nagetiers haben, mit Ausnahme für die CDR3, und mit Ausnahme
derer, in denen keine oder sehr wenige humane Sequenzen, die die
gleiche CDR Länge
wie die des Nagetier-Antikörpers
haben, vorhanden sind, wobei humane Sequenzen mit einer oder mehreren
Abweichungen in der CDR Länge
gestattet sind;
(4) aus den verbleibenden humanen variablen
Domänen
Auswählen
der Einen, die die höchste
Homologie zu der des Nagetier-Antikörpers hat;
- (iii) Herstellen aus cDNA, die eine variable Domäne eines
Nagetiers kodiert, eine cDNA, die einen umgestalteten Antikörper kodiert,
der CDRs enthält,
die von dem Nagetier-Antikörper und
einem Gerüst
einer variablen Domäne
des humanen Antikörpers
abgeleitet sind, durch Vergleich der Aminosäurensequenz der variablen Domäne des Nagetier
mit der Sequenz der gewählten
variablen Domäne
des humanen Antikörpers
und Zugeben oder Löschen
von Resten in der Nagetier cDNA, so dass die Aminosäurensequenz
der Gerüstregion
des Nagetiers identisch ist zu der Sequenz der humanen Gerüstregion;
- (iv) gegebenfalls Verknüpfen
der cDNA, die die umgestaltete variable Domäne des Antikörpers kodiert,
mit passender DNA, die eine konstante Region kodiert, Klonen der
cDNA in einen Expressionsvektor, Transfizieren der Expressionsvektors
in Säugetier-
oder anderen geeigneten Zellen und Kultivieren der transformierten
Zelllinie um Antikörperketten
zu exprimieren;
das Zugeben oder Löschen in Schritt (iii) ist
von der Art, dass ein Antikörper,
der die in Schritt (iv) exprimierte Antikörperkette beinhaltet, die Antigenbindungsfähigkeit
für den
Antikörper
der Nagetierspezies beibehält.
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Die
Antikörperkette
kann gleichzeitig mit der komplementären Antikörperkette exprimiert werden.
Mindestens die Gerüstregion
der variablen Domäne
und die oder jede konstante Domäne
der komplementären Kette
sind im allgemeinen auch human. Eine leichte Kette und eine schwere
Kette können
gleichzeitig exprimiert werden. Eine oder beide Ketten können nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellt werden. Bevorzugt leiten sich die CDRs beider Ketten
von dem gleichen ausgewählten
Antikörper
ab. Ein Antikörper,
umfassend beide exprimierten Ketten, kann isoliert werden.
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Der
Antikörper
besitzt bevorzugt die Struktur eines natürlichen Antikörpers oder
Fragments davon. Der Antikörper
kann daher einen vollständigen
Antikörper,
ein (Fab')
2-Fragment, ein Fab-Fragment, ein Dimeres der
leichten Kette oder eine schwere Kette umfassen. Der Antikörper kann
ein IgG, wie ein IgG1, IgG2, IgG3 oder IgG4, IgM, IgA, IgE oder
IgD sein. Alternativ kann der Antikörper ein chimärer Antikörper des
in der
WO 86/01533 beschriebenen
Typs sein.
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Der
chimäre
Antikörper
gemäß
WO 86/01533 umfaßt eine
Antigen-bindende Region und eine Nicht-Immunoglobulinregion. Die
Antigen-bindende Region ist eine variable Domäne einer leichten Kette eines Antikörpers oder
eine variable Domäne
einer schweren Kette eines Antikörpers.
Typischerweise umfaßt
der chimäre
Antikörper
variable Domänen
sowohl der leichten als auch der schweren Kette. Die Nicht-Immunglobulinregion
wird an ihren C-terminalen Ende an die Antigen-bindende Region fusioniert.
Die Nicht-Immunoglobulinregion ist typischerweise ein Nicht-Immunglobulinprotein
und kann eine Enzymregion, eine von einem Protein mit bekannter
Bindungsspezifität,
von einen Proteintoxin oder in der Tat von jedem Protein, des von einem
Gen exprimiert wird, abgeleitete Region sein. Die zwei Regionen
des chimären
Antikörpers
können über eine
spaltbare Linkersequenz miteinander verknüpft sein. Die Erfindung wird
verwendet, um einen Nagetier-Antikörper, typischerweise einen
monoclonalen Antikörper,
und beispielsweise einen Ratten- oder
Maus Antikörper
zu humanisieren. Die Gerüstregion
und die konstanten Domänen
des so erhaltenen Antikörpers sind
daher menschliche Gerüstregionen
und konstante Domänen,
während
die CDRs der leichten und/oder schweren Kette des Antikörpers Ratte-
oder Maus-CDRs sind. Bevorzugt sind alle CDRs Ratte- oder Maus-CDRs.
Der Antikörper
kann ein menschliches IgG, wie IgG1, IgG2, IgG3, IgG4; IgM; IgA;
IgE oder IgD, welches Ratte- oder Maus-CDRs trägt, sein.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wird so durchgeführt,
daß der
so erhaltene Antikörper
die Antigenbindungsfähigkeit
des Antikörpers,
von dem er abgeleitet ist, beibehält. Ein Antikörper wird
erfindungsgemäß durch
Zugeben oder Löschen
der die Gerüstregion
codierenden Regionen der DNA, die die variablen Domänen des
Antikörpers
codieren, neu geformt. Dieser Antikörper und der neugeformte Antikörper sollten
beide das gleiche Antigen binden können.
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Der
Ausgangs-Antikörper
ist typischerweise ein Antikörper
einer ausgewählten
Spezifität.
Um zu gewährleisten,
daß diese
Spezifität
beibehalten wird, wird die Gerüstregion
der variablen Domäne
des Antikörpers
entsprechend der Gerüstregion
der nächsten
variablen Domäne
eines humanen Antikörpers
neu geformt. Unter ”die
nächste” wird die
am meisten homologe, im Bezug auf Aminosäuresequenzen, verstanden. Bevorzugt
liegt eine Homologie von mindestens 50% zwischen den zwei variablen
Domänen
vor.
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Es
gibt vier allgemeine Stufen, um einen monoclonalen Antikörper neu
zu formen. Diese sind:
- (1) Bestimmen der Nucleotid-
und vorhergesagten Aminosäuresequenz
der variablen Domäne
der leichten und schweren Kette des Ausgangs-Antikörpers;
- (2) Entwickeln des neugeformten Antikörpers, d. h. Bestimmen, welche
Antikörpergerüstregion
während des
Neuformungsverfahrens verwendet wird;
- (3) tatsächliche
Neuformungsmethoden/-techniken; und
- (4) Transfektion und Expression des neugeformten Antikörpers.
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Diese
vier Stufen werden nachstehend im Zusammenhang der Humanisierung
eines Antikörpers
erklärt.
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Stufe 1: Bestimmung der Nucleotid- und
vorhergesagten Aminosäuresequenz
der variablen Domänen
der leichten und schweren Kette des Antikörpers
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Um
einen Antikörper
neu zu formen, muß nur
die Aminosäuresequenz
der variablen Domänen
der schweren und leichten Kette des Antikörpers bekannt sein. Die Sequenz
der konstanten Domänen
ist irrelevant, weil diese nicht zur Neuformungsstrategie beitragen.
Das einfachste Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz
einer variablen Domäne
eines Antikörpers
erfolgt aus clonierter cDNA, die die variable Domäne der schweren
und leichten Kette codiert.
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Es
gibt zwei allgemeine Verfahren zur Clonierung von cDNAs einer gegebenen
variablen Domäne
der leichten und schweren Kette eines Antikörpers: (1) über eine herkömmliche
cDNA-Bank oder (2) über
die Polymerasekettenreaktion (PCR). Diese beiden Verfahren sind
sehr gut bekamt. Wenn die Nucleotidsequenz der cDNAs gegeben ist,
ist es einfach, diese Information in die vorhergesagte Aminosäuresequenz
der variablen Domänen
des Antikörpers
zu übersetzen.
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Stufe 2: Entwicklung des neugeformten
Antikörpers
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Es
sind mehrere Faktoren bei der Entscheidung, welche menschliche Antikörpersequenz
während
der Neuformung verwendet wird, zu berücksichtigen. Die Neuformung
der leichten und schweren Ketten wird unabhängig voneinander betrachtet,
aber die Überlegung
ist für
jede im Grunde ähnlich.
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Dieses
Selektionsverfahren beruht auf der folgenden Überlegung: Die Antigenspezifität eines
gegebenen Antikörpers
und die Affinität
werden primär
durch die Aminosäuresequenz
der CDRs der variablen Region bestimmt. Die Reste der Gerüstregion
der variablen Domäne
besitzen nur einen geringen oder keinen Beitrag. Die Primärfunktion
der Gerüstregionen
ist das Halten der CDRs in ihrer geeigneten räumlichen Orientierung, um das
Antigen zu erkennen. So führt
die Substitution der CDRs von Nagern in die Gerüstregion einer menschlichen
variablen Domäne
höchstwahrscheinlich
zur Beibehaltung ihrer korrekten räumlichen Orientierung, wenn
die menschliche variable Domäne
der variablen Domäne
des Nagers, aus den sie stammte, sehr homolog ist. Eine menschliche
variable Domäne
sollte bevorzugt daher so gewählt
werden, daß sie
der variablen Domäne/den
variablen Domänen
des Nagers in hohem Maße
homolog ist.
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Eine
geeignete Sequenz einer variablen Domäne eines menschlichen Antikörpers kann
wie folgt ausgewählt
werden:
- 1. Unter Verwendung eines Computerprogramms
werden alle variablen Protein-(und DNA-)Datenbanken auf diejenigen
Sequenzen der variablen Domäne
eines menschlichen Antikörpers
abgesucht, die den variablen Domänen
eines Nager-Antikörpers äußerst homolog
sind. Dies kann leicht mit einen Programm mit der Bezeichnung FASTA
durchgeführt
werden, aber andere geeignete Programme sind ebenfalls verfügbar. Die
Ausgabe eines geeigneten Datenprogramms ist eine Liste von Sequenzen,
die dem Nager-Antikörper äußerst homolog
sind, die prozentuale Homologie jeder Sequenz und eine Anordnung
jeder Sequenz entsprechend der Nagersequenz. Dies wird unabhängig für die Sequenzen
der variablen Domäne
sowohl der schweren als auch der leichten Kette durchgeführt. Die
vorstehenden Analysen werden leichter durchgeführt, wenn im Handel erhältliche
Unterdatenbanken zuerst erzeugt werden, die nur menschliche Immunglobulinsequenzen
umfassen. Dies besitzt zwei Vorteile. Erstens wird die tatsächliche
Computerzeit beträchtlich
reduziert, weil die Analysen nur auf diejenigen Sequenzen von Interesse
beschränkt
sind, statt auf alle Sequenzen in den Datenbanken. Der zweite Nutzen
ist, daß durch
die Beschränkung
der Analysen auf nur menschliche Immunglobulinsequenzen die Ausgabe
nicht durch die Anwesenheit von Immunglobulinsequenzen von Nagern überladen
wird. Es gibt weit mehr Nager-Immunglobulinsequenzen
in Datenbanken als es menschliche Sequenzen gibt.
- 2. Aufführen
der Sequenzen der variablen Domäne
des menschlichen Antikörpers,
die die höchste
Gesamthomologie mit der variablen Domäne des Nager-Antikörpers besitzen
(siehe vorstehend). Es wird kein Unterschied zwischen der Homologie
innerhalb der Gerüstregionen
und der CDRs gemacht. Es wird die Gesamthomologie beachtet.
- 3. Aus der Erwägung
werden diejenigen menschlichen Sequenzen ausgeschlossen, die CDRs
mit einer anderen Länge
als die CDRs der Nager besitzen. Diese Regel gilt nicht für CDR3,
weil die Länge
dieser CDR normalerweise ziemlich variabel ist. Auch gibt es manchmal
keine oder sehr wenig menschliche Sequenzen, die die gleichen Längen der
CDRs besitzen, wie die des Nager Antikörpers. Wenn dies der Fall ist, kann
diese Regel gelockert werden, und menschliche Sequenzen mit einem
oder mehreren Unterschieden in der CDR-Länge können erlaubt werden.
- 4. Aus den verbleibenden menschlichen variablen Domänen wird
die ausgewählt,
die mit der des Nagers am meisten homolog ist.
- 5. Der tatsächliche
neugeformte Antikörper
(das Endergebnis) sollte von dem Nager-Antikörper abgeleitete CDRs und eine
Gerüstregion
der variablen Domäne
von dem vorstehend gewählten
menschlichen Antikörper
besitzen.
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Stufe 3: Tatsächliche Neuformungsmethoden/-techniken
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Eine
cDNA, die den gewünschten
neugeformten Antikörper
codiert, wird bevorzugt ausgehend von der Nager-cDNA, aus der die
Sequenz/Sequenzen der variablen Domäne des Nager-Antikörpers ursprünglich bestimmt
wurde/wurden, hergestellt. Die Aminosäuresequenz der variablen Domäne des Nagers
wird mit der der gewählten
Sequenz der variablen Domäne
des menschlichen Antikörpers
verglichen. Die Reste in dem Gerüst der
variablen Domäne
des Nagers werden markiert, die in den entsprechenden Rest beim
Menschen verändert werden
müssen,
um das Nagergerüst
dem menschlichen Gerüst
identisch zu machen. Es gibt auch Reste, die der Nagergerüstsequenz
hinzugefügt
werden müssen
oder daraus deletiert werden müssen,
um sie der des Menschen identisch zu machen.
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Oligonucleotide
werden synthetisiert, die verwendet werden können, um das Gerüst der variablen
Domäne
des Nagers so zu mutieren, daß es
die gewünschten
Reste enthält.
Diese Oligonucleotide können
jede geeignete Größe besitzen.
Eine ist normalerweise in der Länge
durch die Fähigkeiten
des speziellen zur Verfügung
stehenden Synthesegeräts
beschränkt.
Das Verfahren der Oligonucleotid-gerichteten in vitro Mutagenese
ist gut bekannt.
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Die
Vorteile dieses Verfahrens der Neuformung im Gegensatz zum Spleißen von
CDRs in eine menschliche Gerüstregion
sind, daß (1)
dieses Verfahren keine vorher existierende cDNA benötigt, die
die menschliche Gerüstregion
codiert, entsprechend der sie neugeformt wird, und (2) das Spleißen von
CDRs technisch schwieriger ist, weil es üblicherweise eine große Region
schlechter Homologie zwischen dem zu mutierenden Oligonucleotid
und der variablen Domäne
des menschlichen Antikörpers
gibt. Dies ist bei dem Verfahren des Spleißen menschlicher Gerüstreste
in die variable Domäne
eines Nagers nicht so sehr ein Problem, weil hier keine Notwendigkeit
nach einer vorher existierenden cDNA, die die menschliche variable
Domäne
codiert, besteht. Das Verfahren beginnt stattdessen mit der Nager-cDNA-Sequenz.
Auch ist das Spleißen
von Gerüstregionen
technisch leichter, weil ein hoher Homologiegrad zwischen den zu
mutierenden Oligonucleotid und der Gerüstregion der variablen Domäne des Nagers
vorliegt. Dies trifft zu, weil eine Gerüstregion der variablen Domäne eines
menschlichen Antikörpers
so gewählt
wurde, daß sie
der des Nagers äußerst homolog ist.
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Die
Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens
des Neuformens im Gegensatz zur Synthese der vollständigen neugeformten
Version von Anfang an ist, daß dies
technisch einfacher ist. Die Synthese einer neugeformten variablen
Domäne
von Anfang an benötigt
einige Oligonucleotide mehr, mehrere Tage mehr Arbeit, und technische
Schwierigkeiten treten leichter auf.
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Stufe 4: Transfektion und Expression des
neugeformten Antikörpers
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Nach
den Mutagenesereaktionen zur Neuformung des Antikörpers werden
die cDNAs an die geeignete DNA geknüpft, die die konstante Region
der leichten oder schweren Kette codiert, in einen Expressionsvektor
cloniert und in Säugerzellen
transfiziert. Diese Stufen können
routinemäßig durchgeführt werden.
Ein neugeformter Antikörper
kann daher nach einen Verfahren hergestellt werden, das umfaßt:
- a) Herstellung eines ersten replizierbaren
Expressionsvektors einschließlich
eines geeigneten Promotors in funktioneller Verknüpfung an
eine DNA-Sequenz, die mindestens eine variable Domäne einer
schweren oder leichten Kette eines Igs codiert, wobei die variable
Domäne
Gerüstregionen
aus einem humanen Antikörper
und CDRs, welche abgeleitet sind von den CDRs eines Nagetier-Antikörpers einer
anderen Spezifität,
umfaßt;
- b) ggf. Herstellung eines zweiten replizierbaren Expressionsvektors
einschließlich
eines geeigneten Promotors in funktioneller Verknüpfung an
eine E Sequenz, die mindestens die variable Domäne einer leichten bzw. schweren
Kette eines komplementären
Igs codiert;
- c) Transformieren einer Zellinie mit den ersten oder beiden
hergestellten Vektoren; und
- d) Züchten
der transformierten Zellinie, wobei vier veränderte Antikörper produziert
wird.
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Bevorzugt
codiert die DNA-Sequenz in Stufe a) sowohl die variable Domäne als auch
die oder jede konstante Domäne
der Antikörperkette,
wobei die oder jede konstante Domäne von dem humanen Antikörper abgeleitet
ist. Der Antikörper
kann isoliert und gereinigt werden. Die Zellinie, die transformiert
wird, um den veränderten
Antikörper
zu erzeugen, kann eine China-Hamster-Ovar-(CHO)-Zellinie
oder eine immortalisierte Säugerzellinie
sein, die vorteilhafterweise lymphoiden Ursprungs ist, wie eine
Myelom-, Hybridom-, Triom- oder Quadromzellinie. Die Zellinie kann
auch normale lymphoide Zellen, wie eine B-Zelle, umfassen, die durch Transformation
mit einem Virus, wie dem Epstein-Barr-Virus, immortalisiert wurde.
Am bevorzugtesten ist die immortalisierte Zellinie eine Myelomzellinie
oder ein Derivat davon.
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Obwohl
die Zellinie, die zur Produktion des veränderten Antikörpers verwendet
wird, bevorzugt eine Säugerzellinie
ist, kann jede andere geeignete Zellinie, wie eine Bakterienzellinie
oder eine Hefezellinie alternativ verwendet werden. Insbesondere
wird in Betracht gezogen, daß von
E. coli abgeleitete Bakterienstämme verwendet
werden können.
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Es
ist bekannt, daß einige
immortalisierte Lymphoidzellinien, wie Myelomzellinien, in ihren
normalen Zustand isolierte leichte oder schwere Ketten von Ig sezernieren.
Wenn eine solche Zellinie mit den in Stufe (a) hergestellten Vektor
transformiert wird, ist es nicht notwendig, die Stufe (b) des Verfahrens
durchzuführen, vorausgesetzt,
daß die
normal sezernierte Kette der variablen Domäne der Ig-Kette, die von den
in Stufe (a) hergestellten Vektor codiert wird, komplementär ist.
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Wenn
jedoch die immortalisierte Zellinie keine Sekretion besitzt oder
eine komplementäre
Kette nicht sezerniert, ist es notwendig, Stufe (b) durchzuführen. Diese
Stufe kann durch weitere Manipulation des in Stufe (a) produzierten
Vektors durchgeführt
werden, so daß dieser
Vektor nicht nur die variable Domäne einer veränderten
leichten oder schweren Kette des Antikörpers codiert, sondern auch
die komplementäre
variable Domäne
codiert.
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Alternativ
wird Stufe (b) dadurch durchgeführt,
daß man
einen zweiten Vektor herstellt, der verwendet wird, um die immortalisierte
Zellinie zu transformieren. Diese Alternative führt zur leichteren Herstellung
der Konstruktion, kann aber weniger bevorzugt sein als die erste
Alternative dahingehend, daß sie
zu einer nicht so effizienten Antikörperproduktion führt.
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Im
Falle, in dem die immortalisierte Zellinie eine komplementäre leichte
oder schwere Kette sezerniert, kann die transformierte Zellinie,
beispielsweise durch Transformieren einer geeigneten Bakterienzelle
mit dem Vektor und anschließende
Fusion der Bakterienzelle mit der immortalisierten Zellinie durch
Spheroplastenfusion produziert werden. Alternativ kann die DNA direkt
in die immortalisierte Zellinie durch Elektroporation oder ein anderes
geeignetes Verfahren eingeschleust werden.
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Folglich
wird ein Antikörper
produziert, bei dem CDRs einer variablen Domäne einer Antikörperkette abgeleitet
von den CDRs eines Nagetier-Antikörpers und
bei dem die Gerüstregion
der variablen Domäne
des Antikörpers
von einem humanen Antikörper
sind. Alle drei CDRs der variablen Domäne einer leichten oder schweren
Kette leiten sich von der Nagetierspezies ab.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wurde zum Erhalt eines Antikörpers
gegen das menschliche CD4-Antigen angewendet. Folglich betrifft
die Erfindung auch einen Antikörper,
der an ein menschliches CD4-Antigen binden kann, wobei die CDRs
der leichten Kette des Antikörpers
die Aminosäuresequenzen:
CDR1: | LASEDIYSDLA |
CDR2: | NTDTLQN |
CDR3: | QQYNNYPWT |
besitzen, worin die CDRs der schweren Kette des
Antikörpers
die Aminosäuresequenzen:
CDR1: | NYGMA |
CDR2: | TISHDGSDTYFRDSVKG |
CDR3: | QGTIAGIRH |
besitzen, und worin die Gerüstregion der variablen Domäne und,
sofern vorhanden, die oder jede konstante Domäne jeder Kette von einer Nicht-Ratten-Säugerart abgeleitet sind.
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Der
Antikörper
besitzt vorzugsweise die Struktur eines natürlichen Antikörpers oder
Fragments davon. Der Antikörper
kann daher einen vollständigen
Antikörper,
ein (Fab')2-Fragment, ein Fab-Fragment, ein Dimeres
einer leichten Kette oder eine schwere Kette umfassen.
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Der
Antikörper
kann ein IgG, wie IgG1, IgG2, IgG3 oder IgG4, IgM, IgA, IgE oder
IgD, sein. Alternativ kann der Antikörper ein chimärer Antikörper des
in der
WO 86/01533 beschriebenen
Typs sein.
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Der
chimäre
Antikörper
gemäß der
WO 86/01533 umfaßt eine
Antigen-bindende Region und eine Nicht-Immunglobulinregion. Die
Antigen-bindende Region ist die variable Domäne der leichten Kette eines
Antikörpers
oder die variable Domäne
der schweren Kette eines Antikörpers.
Typischerweise umfaßt
der chimäre Antikörper variable
Domänen
sowohl der leichten als auch der schweren Kette. Die Nicht-Immunglobulinregion wird
an ihrem C-terminalen Ende an die Antigen-bindende Region fusioniert.
Die Nicht-Immunglobulinregion ist typischerweise ein Nicht-Immunglobulinprotein
und kann eine Enzymregion, eine von einem Protein mit bekannter
Bindungspezifität,
von einem Proteintoxin oder in der Tat von jedem beliebigen Protein,
das durch ein Gen exprimiert wird, abgeleitete Region sein. Die
zwei Regionen des chimären
Antikörpers
können über eine spaltbare
Linkersequenz miteinander verknüpft
sein.
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Die
Erfindung wird bevorzugt verwendet, um einen CD4-Antikörper, wie
einen Ratten- oder Maus-CD4-Antikörper, zu humanisieren. Die
Gerüstregion
und die konstanten Domänen
des so erhaltenen Antikörpers
sind daher menschliche Gerüstregion
und menschliche konstante Domänen,
wohingegen die CDRs der leichten und/oder schweren Kette des Antikörpers Ratte-
oder Maus-CDRs sind. Bevorzugt sind alle CDRs Ratte- oder Maus-CDRs.
Der Antikörper
kann ein menschlicher IgG, wie IgG1, IgG2, IgG3, IgG4; IgM; IgA;
IgE oder IgD, das Ratte- oder Maus-CDRs trägt, sein.
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Bevorzugt
ist die Gerüstregion
der schweren Kette des Antikörpers
der entsprechenden Gerüstregion des
menschlichen Antikörpers
KOL homolog (Schmidt et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 364 713–747, 1983).
Der sechste Reste der Gerüstregion
in diesem Fall ist geeigneterweise Thr oder Pro, bevorzugt Thr. Dieser
Rest ist der 121ste Rest in der variablen Region der schweren Kette
des KOL-Antikörpers
(Schmidt et al., 1983) und wird von Kabat als Rest 108 identifiziert
(Kabat et al., ”Sequences
of proteins of immunological interest”, US Dept of Health and Human
Services, US Government Printing Office, 1987). Alternativ ist die
Gerüstregion
der schweren Kette des Antikörpers
der entsprechenden Gerüstregion
des menschlichen Antikörpers
NEW homolog (Saul et al., J. Biol. Chem. 253: 585–597, 1978).
Der letzte Rest der Gerüstregion
1 in diesen Fall ist geeigneterweise Ser oder Thr, bevorzugt Ser.
Dieser Rest befindet sich in Position 30 (Kabat et al., 1987). Bevorzugt
ist die Gerüstregion
der leichten Kette des Antikörpers
der Gerüstregion
der variablen Domäne
des Proteins REI (Epp et al., Eur. J. Biochem., 45, 513–524, 1974)
homolog.
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Die
Gerüstregionen
einer oder beider Ketten eines CD4-Antikörpers können durch das erfindungsgemäße Verfahren
neu geformt werden. Alternativ können
eine oder beide Ketten eines CD4-Antikörpers durch das in der
EP-A-0239400 beschriebene
Verfahren neu geformt werden. Bei den Verfahren gemäß der
EP-A-0239400 werden
CDRs anstelle von Gerüstregionen
ersetzt. Die CDRs werden auf eine von einer Nicht-Ratten-Säugerart
abgeleitete Gerüstregion,
typischerweise eine menschliche Gerüstregion, aufgepfropft. Dies
kann durch Oligonucleotid-gerichtete in-vitro-Mutagenese der CDR-codierenden
Regionen einer Antikörperkette,
leicht oder schwer, aus einer Nicht-Ratten-Säugerart durchgeführt werden.
In solchen Fällen werden
die Oligonucleotide so gewählt,
daß der
so erhaltene CDR-gepfropfte Antikörper die CDRs 1 bis 3 der leichten
Kette und die CDRs 1 bis 3 der schweren Kette, wie vorstehend gezeigt,
besitzt.
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Der
neugeformte CD4-Antikörper
kann verwendet werden, um Toleranz gegen ein Antigen zu induzieren.
Er kann verwendet werden, um Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide
Arthritis, zu lindern. Er kann verwendet werden, um eine Transplantatabstoßung zu
verhindern. Toleranz gegenüber
einen Transplantat, wie einem Organtransplantat oder einem Knochenmarktransplantat,
kann erzielt werden. Auch kann der neugeformte CD4-Antikörper verwendet
werden, um Allergien zu lindern. Toleranz gegenüber Allergenen könnte erzielt
werden.
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Der
CD4-Antikörper
kann depletierend oder nichtdepletierend sein. Ein depletierender
Antikörper
ist ein Antikörper,
der mehr als 50%, beispielsweise von 90 bis 99%, der Zielzellen
in vivo depletiert. Ein nichtdepletierender Antikörper depletiert
weniger als 50%, beispielsweise 10 bis 25% und bevorzugt weniger
als 10%, der Zielzellen in vivo. Ein CD4-Antikörper kann allein verabreicht
werden oder kann zusammen mit einem nichtdepletierenden oder depletierenden
CD8-Antikörper
verabreicht werden. Der CD4-Antikörper, der depletierend oder
nichtdepletierend ist, und der monoclonale CD8-Antikörper, der
depletierend oder nichtdepletierend ist, können nacheinander in beliebiger
Reihenfolge verabreicht werden oder können gleichzeitig verabreicht
werden. Ein weiterer Antikörper,
Arzneimittel oder Protein kann vor, während oder nach der Verabreichung
der Antikörper
verabreicht werden.
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Ein
CD4-Antikörper
und in der Tat ein CD8-Antikörper,
wie geeignet, werden parenteral, beispielsweise intravenös, verabreicht.
Der Antikörper
kann durch Injektion oder durch Infusion verabreicht werden. Dazu wird
der Antikörper
in einem pharmazeutischen Präparat,
das weiterhin einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch
verträgliches
Verdünungsmittel
enthält,
formuliert. Jeder beliebige geeignete Träger oder Verdünnungsmittel
kann verwendet werden, beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung.
-
Die
Menge des nichtdepletierenden oder depletierenden CD4s und ggf.
des CD8-Antikörpers,
die einem Patienten verabreicht wird, hängt von einer Vielzahl von
Faktoren ab, umfassend des Alter und das Gewicht eines Patienten,
den Zustand, der behandelt wird, und das Antigen/Antigene, gegen
das/die Toleranz induziert werden soll. In einem Mausmodellsystem
werden 1 μg
bis 2 mg, bevorzugt 400 μg
bis 1 mg, eines mAks auf einmal verabreicht. Bei Menschen werden
3 bis 500 mg, beispielsweise 5 bis 200 mg, Antikörper einmal verabreicht. Viele
derartige Dosen können über eine
Zeitspanne von mehreren Wochen, typischerweise 3 Wochen, verabreicht
wenden.
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Ein
Fremdantigen/Fremdantigene, gegen das/die Toleranz induziert werden
soll, kann einem Wirt vor, während
oder nach einem Behandlungszyklus mit einem CD4-Antikörper (depletierend
oder nichtdepletierend) und/oder CD8-Antikörper (depletierend oder nichtdepletierend)
verabreicht werden. Typischerweise jedoch wird des Antigen/die Antigene
einmal wöchentlich
nach Beginn der Antikörperverabreichung
verabreicht, und die Verabreichung wird drei Wochen vor der letzten
Antikörperverabreichung
beendet.
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Die
Toleranz kann daher gegen ein Antigen in einem Wirt induziert werden,
indem man nichtdepletierende oder depletierende CD4- und CD8-mAks
und, unter den Schutz der mAks, das Antigen verabreicht. Ein Patient
kann chirurgisch unter den Schutz der nichtpletierenden oder depletierenden
CD4- und CD8-mAks operiert
werden, wobei ein Gewebetransplantat, wie ein Organtransplantat
oder ein Knochenmarktransplantat, gegeben wird. Auch kann Toleranz
gegen ein Antigen, das von einem Patienten bereits besessen wird,
induziert werden. Spezifische Langzeittoleranz kann gegen ein Selbstantigen oder
-antigene induziert werden, um Autoimmunerkrankungen, wie multiple
Sklerose oder rheumatoide Arthritis, zu behandeln. Der Zustand eines Patienten,
der an einer Autoimmunerkrankung leidet, kann daher gelindert werden.
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Das
folgende Beispiel erläutert
die Erfindung. In den beigefügten
Figuren:
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Zeigt
die 1: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
einer variablen Region einer leichten Kette eines Ratten-CD4-Antikörpers. Die
Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotids in jeder
Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die Basenpaare
1 bis 269 (HindIII-PvuII) und 577 bis 620 ([BglII/BclI]-BamHI) sind
Teil des Vektors M13VKPCR3, während die
Basenpaare 270 bis 576 aus dem PCR-Produkt der variablen Region
der leichten Kette des CD4-Antikörpers
(VL) stammen. Die CDRs (Kästen) wurden
durch Vergleich mit bekannten immunologischen Sequenzen identifiziert
(Kabat et al., ”Sequences
of proteins of immunological interest, US Dept of Health and Human
Services, US Government Printing Office, 1987).
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Zeigt
die 2: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
der cDNA der leichten Kette des neugeformten CAMPATH-1-Antikörpers. Die
Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder
Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch
Kästen
identifiziert.
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Zeigt
die 3: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
der cDNA der leichten Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VLREI. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder
Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben.
Die CDRs sind durch Kästen
identifiziert.
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Zeigt
die 4: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
einer variablen Region der schweren Kette eines Ratten-CD4-Antikörpers. Die
Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder
Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch
Kästen
identifiziert. Die Basenpaare 1 bis 272 (HindIII-PstI) und 603 bis
817 (BstEII-BamHI) sind Teil des Vektors M13VHPCR1,
während
die Basenpaare 273 bis 602 aus dem PCR-Produkt der variablen Region
der schweren Kette des CD4-Antikörpers (VH) stammen.
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Zeigt
die 5: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
der cDNA der schweren Kette des neugeformten CAMPATH-1-Antikörpers. Die
Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder
Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch
Kästen
identifiziert.
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Zeigt
die 6: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
der cDNA der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHNEW-Thr30. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder
Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben.
Die CDRs sind durch Kästen
identifiziert.
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Zeigt
die 7: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
der cDNA der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHNEW-Ser30. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder
Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben.
Die CDRs sind durch Kästen
identifiziert.
-
Zeigt
die 8: die Aminosäuresequenz
der variablen Region (V) der schweren Kette des menschlichen Myelomproteins
KOL. Die CDRs sind durch Kästen
identifiziert. Diese Sequenz stammt aus der Swiss-Prot-Proteinsequenz-Datenbank.
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Zeigt
die 9: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
der V-Region der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHKOL-Pro113. Die
Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder
Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch
Kästen
identifiziert.
-
Zeigt
die 10: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
der V-Region der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHKOL-Pro113 ohne
Immunglobulinpromotor. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder
Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben.
Die CDRs sind durch Kästen
identifiziert.
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Zeigt
die 11: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
der V-Region der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHKOL-Thr113. Die
Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder Nucleotid in jeder
Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben. Die CDRs sind durch
Kästen
identifiziert.
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Zeigt
die 12: die Nucleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenz
der V-Region der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers CD4VHKOL-Thr113 ohne
Immunglobulinpromotor. Die Zahl der ersten und letzten Aminosäure oder
Nucleotid in jeder Zeile ist am linken bzw. rechten Rand angegeben.
Die CDRs sind durch Kästen
identifiziert.
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Zeigt
die 13: die Ergebnisse eines ELISAs, der die Bindungsfähigkeit
der YNB46.1.8- und CD4VHKOL-Thr113-Antikörper vergleicht.
Die X-Achse zeigt
die Konzentration (μg/ml)
an YNB46.1.8-(Dreiecke) oder CD4VHKOL-Thr113-(Kreise)Antikörper an. Die Y-Achse zeigt
die optische Dichte bei 492 nm an.
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Beispiel
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1. Material und Methoden
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Isolierung des monoclonalen Antikörpers.
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Der
von einer Ratte abgeleitete Anti-Mensch-CD4-Antikörper, Clon
YNB46.1.8 (IgG2b, Serotyp der leichten Kette κ), war das
Ergebnis einer Fusion zwischen einem Rattensplenocyten und der Rattenmyelomzellinie
des Lou-Stamms Y3-Ag 1.2.3 (Galfre et al., Nature, 277: 131–133, 1979)
und wurde durch seine Bindung an eine Ratten-T-Zellinie NB2-6TG,
die mit einem Expressionsvektor stabil transfiziert worden war,
der eine komplementäre
DNA (cDNA), die das menschliche CD4-Antigen codiert, enthält (Madden
et al., Cell, 42: 93– 104,
1985), selektioniert. Der Antikörper
wurde durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) gereinigt.
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Isolierung der variablen Regionen des
Antikörpers.
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cDNAs,
die die VL- und VH-Regionen
des CD4-Antikörpers
codieren, wurden durch ein Verfahren auf der Basis der Polymerasekettenreaktion
(PCR) isoliert (Orlandi et al., PNAS USA, 86: 3833–3837, 1989),
wobei einige Modifikationen vorgenommen wurden. Die Gesamt-RNA wurde
aus den Hybridomzellen nach dem Guanidinthiocyanatverfahren (Chirgwin
et al., Biochemistry, 18: 5294, 1979) isoliert, und Poly(A)+-RNA wurde durch Passage der Gesamt-RNA
durch und Elution aus einer Oligo(dT)-Cellulosesäule (Aviv und Leder PNAS USA
69: 1408, 1972) isoliert. Poly(A)+-RNA wurde
5 min lang auf 70°C
erhitzt und kurz vor Gebrauch auf Eis abgekühlt. Eine 25 μl-Synthesereaktion
für den
ersten Strang bestand aus Poly(A)+-RNA,
250 μM jedes
dNTPs, 50 mM Tris-HCl (pH 8,2 bei 42°C), 10 mM MgCl2,
100 mM KCl, 10 mM Dithiothreit, 23 Einheiten reverse Transkriptase
(Anglian Biotec, Colchester, U. K.), 3,5 pmol des VL-Region-spezifischen
Oligonucleotid-Primers VK1FOR [5'-d(GTT AGA TCT CCA GCT TGG TCC C)] oder
des VH-Region-spezifischen Primers VH1FOR-B [5'-d(TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG
GCC)] und wurde 5 min lang bei 20°C
und dann 90 min lang bei 42°C
inkubiert.
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Die
anschließenden
50 μl-PCR-Amplifikationen
bestanden aus 5 μl
der Synthesereaktion des ersten Strangs (nichtgereinigt), 500 μM jedes dNTPs,
67 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 25°C),
17 mM (NH4)2SO4, 10 mM MgCl2, 20 μg/ml Gelatine,
5 Einheiten TAQ-DNA-Polymerase (Koch-Light, Haverhill, U. K.) und
25 pmol (jedes) der Primer VK1FOR und VK1BACK [5'-d(GAC
ATT CAG CTG ACC CAG TCT CCA)] für
die VL-Region oder VH1FOR-B
und des gemischten Primers VHBACK [5'-d(AG GT(CG) (CA)A(GA)
CTG CAG (GC)AG TC(TA) GG)] für
die VH-Region. Die Reaktionsansätze wurden
mit Mineralöl überschichtet
und 30 Zyklen zu 1,5 min bei 95°C
(Denaturieren), 1,5 min bei 37°C
(VL) oder 50°C (VH;
Assoziieren) und 3 min bei 72°C
(Extension) mit einem programmierbaren cyclischen Techne-PHC-1-Reaktor
unterworfen. Der letzte Zyklus enthielt eine 10minütige Extensionszeit.
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Die
Proben wurden bei –20°C gefroren,
und das Mineralöl
(eine viskose Flüssigkeit
bei –20°C) wurde durch
Absaugen entfernt. Die wäßrigen Phasen
wurden aufgetaut, und die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese
in 2%igen Agarosegelen gereinigt und dann doppelt gespalten mit
entweder PvuII und BglII (VL) oder PstI
und BstEII(VH)-Restriktionsenzymen und in
die PvuII- und BclI-Restriktionsspaltstellen des Vektors M13VKPCR3 (für
die VL-Region; Orlandi et al., 1989) oder
die PstI- und BstEII-Restriktionsspaltstellen des Vektors M13VHPCR1 (für
die VH-Region) cloniert. Wie in den Ergebnissen
beschrieben, wurden die VL-Region-Clone
zuerst durch Hybridisieren an eine mit 32P-markierte
Oligonucleotidsonde [5'-d(GTT
TCA TAA TAT TGG AGA CA)], die für
die CDR2 der Y3-Ag 1.2.3-VL-Region spezifisch
ist, abgesucht. Die VL-Region-Clone, die
mit dieser Sonde nicht hybridisierten, und die VH-Region-Clone
wurden durch Didesoxykettenabbruchverfahren sequenziert (Sanger
et al., PNAS USA 74: 5463, 1977).
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Neugeformte variable Region der leichten
Kette und Expression der Vektorkonstruktion.
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Die
neugeformte leichte Kette wurde durch Oligonucleotid-gerichtete
in-vitro-Mutagenese in einem M13-Vektor durch Primen mit drei Oligonucleotiden
gleichzeitig auf einer 748 Basen großen, einzelsträngigen cDNA-Matrize,
die die vollständige
VL-Region und die konstanten κ-Regionen
(CK) des neugeformten CAMPATH-1-Antikörpers codiert
(Reichmann et al., Nature 332: 323–327, 1988), konstruiert. Die
drei Oligonucleotide [5'-d(AGA
GTG ACC ATC ACC TGT CTA GCA AGT GAG GAC ATT TAC AGT GAT TTA GCA
TGG TAC CAG CAG AAG CCA), 5'-d(CTG
CTG ATC TAC AAT ACA GAT ACC TTG CAA AAT GGT GTG CCA AGC AGA TTC),
5'-d(ATC GCC ACC
TAC TAC TGC CAA CAG TAT AAC AAT TAT CCG TGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC)]
wurden so entwickelt, daß sie
jede der drei CDRs in der REI-basierenden menschlichen Antikörper-VL-Region,
die Teil der neugeformten CAMPATH-1-Antikörper-VL-Region
ist (Reichmann et al., 1988), ersetzten. Ein Clon, der jeden der
drei mutierten Oligonucleotide enthielt, wurde durch Nucleotidsequenzierung identifiziert
und in die HindIII-Spaltstelle des Expressionsvektors pHβAPr-1 subcloniert
(Gunning et al., PNAS, 84: 4831–4835,
1987), der auch ein Dihydrofolat-Reduktasegen (Ringold et al., J.
Mol. Appl. Genet. 1: 165–175,
1981) unter der Steuerung eines gekürzten SV40-Promotors enthielt.
-
Neugeformte variable Regionen der schweren
Kette, basierend auf der Gerüstregion
der variablen Region des menschlichen Antikörpers NEW, und Konstruktion
des Expressionsvektors.
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Zwei
Versionen der neugeformten schweren Kette auf der Basis von NEW
wurden erzeugt, CD4VHNEW-Thr30 und
CD4VHNEW-Ser30.
Die CD4VHNEW-Thr30-Version
(6) codiert einen Threoninrest in Position 30,
während
die CD4VHNEW-Ser30-Version
(7) einen Serinrest in Position 30 codiert. Der
Einfachheit halber wurde zuerst CD4VHNEW-Thr30 durch eine Oligonucleotid-gerichtete in-vitro-Mutagenese
in den Vektor M13mp18 durch Primen mit drei Oligonucleotiden gleichzeitig
auf einer 1467 Basen großen,
einzelsträngigen
cDNA-Matrize (5), die die vollständige schwere
Kette des neugeformten CAMPATH-1-Antikörpers codiert (Reichmann et
al., 1988), erzeugt. Die drei Oligonuclectide [5'-d(TCT GGC TTC ACC TTC ACC AAC TAT GGC
ATG GCC TGG GTG AGA CAG CCA CCT), 5'-d(GGT CTT GAG TGG ATT GGA ACC ATT AGT
CAT GAT GGT AGT GAC ACT TAC TTT CGA GAC TCT GTG AAG GGG AGA GTG),
5'-d(GTC TAT TAT TGT
GCA AGA CAA GGC ACT ATA GCT GGT ATA CGT CAC TGG GGT CAA GGC AGC
CTC)] wurden so entwickelt, daß sie
jede der drei Komplementarität-bestimmenden
Regionen (CDRs) in der VH-Region auf NEW-Basis ersetzten,
die Teil des neugeformten CAMPATH-1-Antikörpers ist (Reichmann et al.,
1988). Ein Clon (6), der jedes der drei mutierten
Oligonucleotide enthielt, wurde durch Nucleotidsequenzierung identifiziert.
CD4VHNEW-Ser30 wurde
dann durch Oligonucleotid-gerichtete in-vitro-Mutagenese in dem Vektor M13mp18
durch Primen mit einem Einzel-Oligonucleotid auf der 1458 Basen
großen,
einzelsträngig
cDNA-Matrize (6), die CD4HNEW-Thr30 codiert, erzeugt. Das Oligonucleotid [5'-d(GCT TCA CCT TCA
GCA ACT ATG GCA T)] wurde so entwickelt, daß es den Rest in Position 30
von Threonin [ACC] zu Serin [AGC] mutierte. Ein Clon (7),
der dieses mutierte Oligonucleotid enthielt, wurde durch Nucleotidsequenzierung identifiziert.
Doppelsträngige
Formen der Clone CD4VHNEW-Thr30 und
CD4VHNEW-Ser30 wurden
als HindIII-Fragmente in die HindIII-Spaltstelle des Expressionsvektors
pNH316 subcloniert. Der Vektor pNH316 ist eine modifizierte Version
des Vektors pHβAPr-1
(Gunning et al., PNAS, 84: 4831–4835,
1987), der so konstruiert wurde, daß er ein von einem Metallothionin-Promotor
gesteuertes Neomycin-Resistenzgen enthielt.
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Neugeformte variable Regionen der schweren
Kette, basierend auf der Gerüstregion
der variablen Region des menschlichen Antikörpers KOL, und Konstruktion
des Expressionsvektors
-
Zwei
Versionen der neugeformten schweren Kette auf KOL-Basis wurden erzeugt,
CD4VHKOL-Thr113 und
CD4VHKOL-Pro113.
Die CD4VHKOL-Thr113-Version
codiert einen Threoninrest in Position 113 (11), während die
CD4VHKOL-Pro113-Version
einen Prolinrest in Position 113 (9) codiert.
Der Einfachheit halber wurde zuerst CD4VHKOL-Thr113 durch eine Oligonucleotid-gerichtete
in-vitro-Mutagenese einer einzelsträngigen DNA-Matrize, die das 817 Basen große HindIII-BamHI-Fragment,
das die VH-Region des Ratten-CD4-Antikörpers codiert,
enthält
(4), erzeugt und in einen M13mp18 durch gleichzeitiges
Primen mit fünf
Oligonucleotiden [5'-d(CAC
TCC CAG GTC CAA CTG GTG GAG TCT GGT GGA GGC GTG GTG CAG CCT GG), 5'-d(AAG GTC CCT GAG
ACT CTC CTG TTC CTC CTC TGG ATT CAT CTT CAG TAA CTA TGG CAT G), 5'-d(GTC CGC CAG GCT
CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG), 5'-d(ACT ATC TCC AGA
GAT AAT AGC AAA AAC ACC CTA TTC CTG CAA ATG G), 5'-d(ACA GTC TGA GGC CCG AGG ACA CGG GCG
TGT ATT TCT GTG CAA GAC AAG GGA C)] cloniert, die so entwickelt
waren, daß sie
die Gerüstregionen
der Ratte durch die menschlichen Gerüstregionen aus KOL ersetzten.
Ein Clon, der jedes der fünf
mutierten Oligonucleotide enthielt, wurde durch Nucleotidsequenzierung
identifiziert. CD4VHKOL-Pro113 wurde
anschließend durch
Oligonucleotid-gesteuerte in-vitro-Mutagenese einer einzelsträngigen DNA-Matrize erzeugt,
die das 817 Basen große
HindIII-BamHI-Fragment enthielt, das CD4VHKOL-Thr113 codiert, das in M13mp18 durch Primen mit
dem Oligonucleotid [5'-d(TGG
GGC CAA GGG ACC CCC GTC ACC GTC TCC TCA)] cloniert war. Ein Clon,
der dieses mutierte Oligonucleotid enthielt, wurde durch Nucleotidsequenzierung
identifiziert.
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Die
Immunoglobulinpromotoren wurden aus den doppelsträngigen DNA-Formen der Clone,
die CD4VHKOL-Thr113 (11)
und CD4VHKOL-Pro113 (9)
codieren, durch Ersetzen (für
beide Versionen) der ersten 125 bp (HindIII-NcoI) durch ein HindIII-NcoI-Oligonucleotid-Linkerfragment
[5'-d(AGC TTT ACA GTT ACT
GAG CAC ACA GGA CCT CAC) und dessen überlappendes Komplement 5'-d(CAT GGT GAG GTC
CTG TGT GCT CAG TAA CTG TAA)] entfernt. Die so erhaltenen Clone,
CD4VHKOL-Thr113 (12)
und CD4VHKOL-Pro113 (10),
nun 731 bp große
HindIII-BamHI-Fragmente, wurden separat in die HindIII- und BamHI-Clonierungsstellen
des Expressionsvektors pHβAPr-1-gpt
(Gunning et al., PNAS USA 76, 1373, 1987) subcloniert, in die das
Gen für
die konstante Region von menschlichem IgG1 (Bruggemann et al., J.
Exp. Med. 166, 1351–1361,
1987) an die BamHI-Stelle cloniert worden war. So werden bei Transfektion
und Expression als schwere Antikörperketten
(siehe nachstehend) diese neugeformten VH-Regionen
an die konstanten Regionen von menschlichem IgG1 geknüpft.
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Fluoreszenz-aktivierte Zellsorter-(FACS)Analyse
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Die
relativen Affinitäten
der neugeformten Antikörper,
das CD4-Antigen
zu binden, wurden durch FACS-Analyse abgeschätzt. Die CD4-exprimierenden
Zellen, die bei dieser Analyse verwendet wurden, waren eine clonierte
Ratten-T-Zellinie NB2-6TG, die stabil mit einem Expressionsvektor
transfiziert worden war, der eine komplementäre DNA (cDNA), die das menschliche
CD4-Antigen codiert, enthält
(Maddon et al., Cell, 42, 93– 104,
1985). Die Zellen wurden mit dem geeigneten neugeformten Antikörper, gefolgt
von Fluorescein-konjugierten Schaf-Anti-Mensch-Antikörpern (Binding
Site Ltd., Birmingham, UK), angefärbt. Die Kontrollfärbung (siehe
Tabelle 1) bestand aus keinem vorhandenen Antikörper während der ersten Stufe der
Zellfärbung.
Die mittlere Zellfluoreszenz wurde mit einem Ortho-FACS bestimmt.
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Analyse der Bindungsfähigkeit eines Antikörpers
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Die
relativen Bindungsfähigkeiten
des Ratten-YNB46.1.8-Antikörpers
und des neugeformten CD4VHKOL-Thr113-Antikörpers
wurden durch einen Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) bestimmt. Mikrotiterplatten
wurden mit einem löslichen
rekombinanten CD4-Antigen (Byrn et al., Nature, 344: 667–670, 1990)
in einer Konzentration von 50 μl/Kavität, 10 μg/ml, beschichtet
und dann mit 100 μl/Kavität Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösung
(PBS), die 1,0% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, blockiert. Die
Antikörper
wurden in PBS, die 0,1% BSA enthielt, verdünnt und den Kavitäten (50 μl/Kavität) für 45 min
bei Raumtemperatur zugesetzt. Ein biotinylierter CD4VHKOL-Thr113-Antikörper
(10 μl/Kavität; 20 μg/ml Endkonzentration)
wurde dann jeder Kavität
für weitere
45 min zugesetzt. Die Kavitäten
wurden mit PBS, die 0,1% BSA enthielt, gewaschen, und dann wurden
50 μl Streptavidin-biotinylierte
Meerrettichperoxidase-Komplex (Amersham; Aylesbury, UK), verdünnt 1:1000,
jeder Kavität
30 min lang zugesetzt. Die Kavitäten
wurden mit PBS, die 0,1% BSA enthielt, gewaschen, und 100 μl Substrat
(25 mM Citronensäure,
50 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 0,1% (Gew./Vol.) o-Phenylendiamin,
0,04% (Vol./Vol.) 30% Wasserstoffperoxid) wurden jeder Kavität zugesetzt.
Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 50 μl/Kavität 1,0 M Schwefelsäure gestoppt.
Die optischen Dichten bei 492 nm (OD492)
wurden mit einem ELISA-Plattenlesegerät bestimmt.
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Transfektionen
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Dihydrofolatreduktase-defekte
China-Hamster-Ovarzellen (CHODHFR-) (106/T-75 Kolben) wurden, wie beschrieben (Wigler
et al., PNAS USA 76, 1373, 1979), mit 9 μg schwere Kettenkonstruktion
und 1 μg
leichte Kettenkonstruktion kotransfiziert. Die Transfektanten wurden
in einem Medium, das 5% dialysiertes fötales Rinderserum enthielt,
2 bis 3 Wochen lang selektioniert, und die Antikörper-sezernierenden Clone wurden durch
ELISAs der konditionierten Medien identifiziert. Der Antikörper wurde
konzentriert und durch Protein-A-Sepharose(Warenzeichen)-Säulenchromatographie
gereinigt.
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2. Ergebnisse
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Clonierung der cDNAs der variablen Region
der leichten und schweren Kette.
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cDNAs,
die die VL- und VH-Regionen
aus CD4-Antikörper-sezernierenden
Hybridomzellen codieren, wurden durch PCR unter Verwendung von Primern,
die das mRNA-Segment, das die N-terminale Region codiert, bis zur
J-Region (Orlandi et al., 1989) amplifizieren, isoliert. Die PCR-Produkte der VL- und VH-Region wurden
in die Vektoren auf der Basis von M13 M13VKPCR3
bzw. M13VHPCR1 subcloniert. Die anfängliche
Nucleotidsequenzanalyse der VL-Region-Zufalls-Clone
zeigte, daß der
Hauptteil der cDNAs die VL-Region der leichten
Kette codierten und von der Y3-Ag 1.2.3-Ratten-Myelomzellinie (Crowe et al.,
Nucleic Acid Research, 17: 7992, 1989) exprimiert wurde, die als
Fusionspartner zur Erzeugung des Anti-CD4-Hybridoms verwendet wurde. Es ist
wahrscheinlich, daß die
Expression der mRNA der Y3-Ag 1.2.3 leichten Kette größer als
die der leichten Kette des CD4-Antikörpers ist oder daß die mRNA
der Y3-Ag 1.2.3 leichten Kette bevorzugt während der PCR amplifiziert
wird.
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Um
die Chance, cDNAs für
die CD4-VL-Region aufzufinden, wurden zuerst
alle M13-Clone durch Hybridisieren an eine 32P-markierte
Oligonucleotidsonde, die der CDR2 von Y3-Ag 1.2.3 komplementär ist (Crowe et
al., Nucleic Acid Research, 17: 7992, 1989), abgesucht. Eine anschließende Sequenzanalyse
wurde auf M13-Clone begrenzt, die keine dieser Sonde komplementäre Sequenz
enthielten. So wurden zwei cDNA-Clone aus unabhängigen PCR-Amplifikationen
identifiziert, die identische VL-Regionen
codierten. Die Nucleotidsequenzanalyse von VH-Region-PCR-Zufallsprodukten
zeigte eine einzelne Art einer VH-Region-cDNA.
Es wurde gefunden, daß zwei
VH-cDNA-Clone aus unabhängigen PCR-Amplifikationen
identische Sequenzen enthielten, außer, daß das Codon des Rests 14 Prolin
[CCT] in einem Clon codierte, während
der zweite Clon Leucin [CTT] an der gleichen Position codierte.
-
Gemäß Kabat
et al., 1987, enthalten 524 der 595 sequenzierten VH-Regionen einen Prolinrest
an dieser Position, während
nur sechs Leucin enthalten. Es wurde daher zur Erläuterung
der Prolin-codierende Clon gewählt
(siehe nachstehend). Da Rest 14 gut in der ersten VH-Gerüstregion
und nicht in einer CDR liegt, ist es unwahrscheinlich, daß er direkt
zur Antigenbindung beiträgt,
und die Ambiguität
an dieser Position beeinflußte die
nachfolgende Neuformungsstrategie nicht. So wurde diese Sequenz-Ambiguität nicht
weiter untersucht.
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Die
cDNA-Sequenzen und ihre vorhergesagten Aminosäuresequenzen sind in den 1 und 4 gezeigt.
Da keine zusätzlichen
VL- oder VH-Region-codierenden
Clone gefunden wurden, wurde angenommen, daß diese Sequenzen von den CD4-Antikörpergenen
abgeleitet waren.
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Konstruktion der neugeformten Antikörper.
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Es
war Aufgabe, die Bedeutung der Selektion der geeigneten Gerüstregion
der menschlichen V-Region während
der Neuformung zu untersuchen. Zwei Neuformungsstrategien wurden
verwendet.
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Erste Neuformungsstrategie.
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In
der ersten Strategie wurde ein neugeformter Antikörper geschaffen,
der die CDRs aus dem Ratten-CD4-Antikörper und die gleichen menschlichen
V-Region-Gerüstsequenzen
beherbergte, die zuvor erfolgreich für den neugeformten CAMPATH-1-Antikörper verwendet
worden war, d. h. eine Gerüstregion
auf REI-Basis für
die VL-Region und eine Gerüstregion
auf NEW-Basis für
die VH-Region (Reichmann et al., 1988). Dies
wurde durch Oligonucleotid-gerichtete in-vitro-Mutagenese der sechs
CDRs der cDNAs der leichten und schweren Kette des neugeformten
CAMPATH-1 Antikörpers,
wie in den 2 bzw. 5 gezeigt
ist, durchgeführt.
Die so erhaltene neugeformte leichte Kette des CD4-Antikörpers (3)
wird als CD4VLREI bezeichnet. Zwei Versionen
der neugeformten schweren Kette des CD4-Antikörpers auf NEW-Basis wurden
geschaffen: CD4VHNEW-Thr30 (6),
codierend einen Threoninrest in Position 30 (in Gerüstregion
1), und CD4VHNEW-Ser30 (7),
codierend einen Serinrest in Position 30. Diese zwei verschiedenen
Versionen wurden geschaffen, weil die erfolgreich neugeformte schwere
Kette des CAMPATH-1-Antikörpers
das Antigen gut band, unabhängig
davon, ob Position 30 einen Threonin- oder Serinrest (Reichmann
et al., 1988) codierte, und es wurde gewählt, beide Positionen in diesem
Fall ebenfalls zu testen.
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Zweite Neuformungsstrategie
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Bei
der zweiten Neuformungsstrategie wurde die VH-Region
des CD4-Antikörpers neu
geformt, so daß sie
die Gerüstsequenzen
der VH-Region des menschlichen Antikörpers KOL
enthielt. Von allen bekannten menschlichen Antikörper-VH-Regionen
ist die Gesamtaminosäuresequenz
der VH-Region von KOL der der Ratten-CD4-Antikörper-VH-Region am meisten homolog. Die VH-Regionen
der menschlichen Antikörper
KOL und NEW sind 66% bzw. 42% der Ratten-CD4-Antikörper-VH-Region homolog.
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Zwei
Versionen der V-Region der schweren Kette des neugeformten CD4-Antikörpers auf
KOL-Basis wurden erzeugt, die sich durch einen einzelnen Aminosäurerest
in der vierten Gerüstregion
unterscheiden: CD4VHKOL-Pro113 (10)
codiert einen Prolinrest in Position 113, und CD4VHKOL-Thr113 (12) codiert
einen Threoninrest in Position 113. CD4VHKOL-Pro113 ist ”formecht”, indem
seine Gerüstsequenzen
denjenigen der V-Region der schweren Kette des KOL-Antikörpers identisch
sind (8).
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Von
allen bekannten menschlichen Antikörper-VL-Regionen
ist die Gesamtaminosäuresequenz
der VL-Region der menschlichen leichten
Kette NEW der Ratten-CD4-Antikörper-VL-Region am meisten homolog (67%). So wird
die identische neugeformte leichte Kette CD4VLREI
(vorstehend beschrieben), die mit den neugeformten schweren Ketten
des CD4-Antikörpers
auf NEW-Basis, CD4VHNEW-Thr30 und
CD4VHNEW-Ser30, exprimiert
wurde, ebenfalls mit den neugeformten schweren Ketten des CD4-Antikörpers auf
KOL-Basis, CD4VHKOL-Pro113 und
CD4VHKOL-Thr113,
exprimiert. Dies ist vorteilhaft, weil die Expression der gleichen
neugeformten leichten Kette mit unterschiedlichen neugeformten schweren
Ketten einen direkten funktionellen Vergleich jeder neugeformten
schweren Kette erlaubt.
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Zusammenfassend
wurden vier verschiedene neugeformte Antikörper geschaffen. Die neugeformte leichte
Kette jedes Antikörpers
wird als CD4VLREI bezeichnet. Die neugeformten
schweren Ketten der Antikörper
werden als CD4VHNEW-Thr30,
CD4VHNEW-Ser30,
CD4VHKOL-Pro113 bzw.
CD4VHKOL-Thr113 bezeichnet. Jede
der neugeformten schweren Ketten enthält die gleiche konstante menschliche
IgG1-Region. Da jeder neugeformte Antikörper die gleiche neugeformte
leichte Kette enthält,
wird der Name einer neugeformten schweren Kette eines Antikörpers nachstehend
verwendet, um den gesamten Antikörper
zu bezeichnen (Kombination aus schwerer und leichter Kette).
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Relative Affinitäten der neugeformten Antikörper
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Die
relativen Affinitäten
der neugeformten Antikörper
wurden durch Messen ihrer Fähigkeit,
CD4-Antigen-exprimierende Zellen in verschiedenen Antikörperkonzentrationen
zu binden, abgeschätzt.
Die FACS-Analyse bestimmte die mittlere zelluläre Fluoreszenz der gefärbten Zellen
(Tabelle 1).
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Aus
dieser Analyse geht klar hervor, daß die neugeformten CD4-Antikörper das
CD4-Antigen in variierenden Ausmaßen über einen breiten Konzentrationsbereich
binden. In diesem Zusammenhang wird auf Versuch 1 von Tabelle 1
verwiesen. Ein Vergleich des CD4VHKOL-Thr113-Antikörpers
mit dem CD4VHNEW-Thr30-Antikörper zeigt,
daß beide
Antikörper
CD4+-Zellen binden, verglichen mit der Kontrolle, neugeformter
CAMPATH-1-Antikörper.
Jedoch bindet der CD4VHKOL-Thr113-Antikörper CD4+-Zellen mit weit größerer Affinität als der
CD4HNEW-Thr30-Antikörper. Die
niedrigste Konzentration des getesteten CD4VHKOL-Thr113-Antikörpers
(2,5 μg/ml)
ergab eine mittlere zelluläre
Fluoreszenz, die der der höchsten
Konzentration des getesteten CD4VHNEW-Thr30-Antikörpers
nahezu äquivalent
war (168 μg/ml).
Versuch 2 zeigt, daß der
CD4HNEW-Ser30-Antikörper die
CD4+-Zellen etwas besser bindet als CD4VHNEW-Thr30. Nur 2,5 μg/ml CD4VHNEW-Ser30-Antikörper werden
benötigt,
um eine mittlere zelluläre
Fluoreszenz zu ergeben, die der von 10 μg/ml CD4VHNEW-Thr30-Antikörper
nahezu äquivalent
ist. Versuch 3 zeigt, daß der
CD4VHKOL-Thr113-Antikörper CD4+-Zellen etwas besser als der CD4VHKOL-Pro113-Antikörper binden
kann.
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Aus
diesen Assays geht klar hervor, daß die neugeformten Antikörper auf
KOL-Basis den neugeformten Antikörpern
auf NEW-Basis hinsichtlich der Affinität gegenüber CD4+-Zellen
bei weitem überlegen
sind. Ebenso besteht ein geringerer Unterschied, wenn überhaupt,
zwischen dem CD4VHNEW-Thr30-Antikörper und dem
CD4VHNEW-Ser30-Antikörper und
auf ähnliche
Weise zwischen dem CD4VHKOL-Thr113-Antikörper und dem
CD4VHKOL-Pro113-Antikörper. Eine
Rangordnung dieser neugeformten Antikörper kann somit, basierend auf
ihren relativen Affinitäten,
für die
CD4+-Zellen abgeleitet werden: CD4VHKOL-Thr113 > CD4VHKOL-Pro113 >> CD4VHNEW-Ser30 > CD4VHNEW-Thr30
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Es
sollte erneut betont werden, daß jeder
der neugeformten Antikörper,
der in den vorstehenden Versuchen verwendet wurde, identische konstante
Regionen für
die schwere Kette besitzt und mit identischen neugeformten leichten
Ketten assoziiert ist. So beobachtete Unterschiede mit der Bindung
an CD4+-Zellen müssen auf Unterschiede in ihren
V-Regionen der schweren Kette zurückzuführen sein.
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Relative Bindungsfähigkeiten des Ratten-YNB46.1.8-Antikörpers und
des neugeformten CD4VHKOL-Thr113-Antikörpers
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Die
relativen Bindungsfähigkeiten
des Ratten-YNB46.1.8-Antikörpers
und des neugeformten CD4V
HKOL-Thr
113-Antikörpers
wurden durch einen ELISA bestimmt. In diesem Assay wurde die Fähigkeit
jedes Antikörpers,
die Bindung des biotinylierten CD4V
HKOL-Thr
113-Antikörpers
an lösliches
rekombinantes CD4-Antigen zu hemmen, bestimmt. Die Ergebnisse eines
Versuchs sind in
13 gezeigt. Die Hemmung der Bindung
des biotinylierten CD4V
HKOL-Thr
113-Antikörpers war
sowohl für
den nichtmarkierten CD4V
HKOL-Thr
113-
als auch für
den YNB46.1.8-Antikörper
linear in der Nähe
der optischen Dichte von 0,3. Die Konzentrationen an CD4V
HKOL-Thr
113- und
YNB46.1.8-Antikörpern,
die eine optische Dichte von 0,3 ergeben, betragen 28,7 bzw. 1,56 μg/ml. So
kann die Bindungsfähigkeit
des YNB46.1.8-Antikörpers
auf 28,7/1,56 oder etwa 18fach besser als die des CD4V
HKOL-Thr
113-Antikörpers abgeschätzt werden.
Es ist darauf hinzuweisen, daß dieser
Versuch nur eine grobe Annäherung
der relativen Bindungsfähigkeiten,
nicht Affinitäten,
ergibt. Der Ratten-YNB46.1.8-Antikörper enthält eine andere konstante Region
als der CD4V
HKOL-Thr
113-Antikörper, und dies
könnte
Einfluß darauf
nehmen, wie gut die Antikörper
das CD4-Antigen binden, unabhängig
von deren tatsächlichen
Affinitäten
für das
CD4-Antigen. Die tatsächliche
Affinität
der neugeformten Antikörper
für das CD4-Antigen
kann größer, kleiner
oder gleich wie die des YNB46.1.8-Antikörpers sein. Die anderen neugeformten
Antikörper
CD4V
HKOL-Pro
113,
CD4V
HNEW-Ser
30 und
CD4V
HNEW-Thr
30 wurden
in diesem Test noch nicht getestet. Tabelle
1 Mittlere
zelluläre
Fluoreszenz von mit den neugeformten Antikörpern gefärbten CD4
+-Zellen
Neugeformter
Antikörper | Konzentration
(μg/ml) | Mittlere
zelluläre
Fluoreszenz |
Versuch
1. |
CD4VHKOL-Thr113
| 113 | 578,0 |
CD4VHKOL-Thr113
| 40 | 549,0 |
CD4VHKOL-Thr113
| 10 | 301,9 |
CD4VHKOL-Thr113
| 2,5 | 100,5 |
CD4VHNEW-Thr30
| 168 | 97,0 |
CD4VHNEW-Thr30
| 40 | 40,4 |
CD4VHNEW-Thr30
| 10 | 18,7 |
CD4VHNEW-Thr30
| 2,5 | 10,9 |
CAMPATH-1 | 100 | 11,6 |
CAMPATH-1 | 40 | 9,4 |
CAMPATH-1 | 10 | 9,0 |
CAMPATH-1 | 2,5 | 8,6 |
Kontrolle | - | 9,0 |
Versuch
2. | | |
CD4VHNEW-Thr30
| 168 | 151,3 |
CD4VHNEW-Thr30
| 40 | 81,5 |
CD4VHNEW-Thr30
| 10 | 51,0 |
CD4VHNEW-Thr30
| 2,5 | 39,3 |
CD4VHNEW-Ser30
| 160 | 260,2 |
CD4VHNEW-Ser30
| 40 | 123,5 |
CD4VHNEW-Ser30
| 10 | 68,6 |
CD4VHNEW-Ser30
| 2,5 | 49,2 |
Kontrolle | - | 35,8 |
Versuch
3. | | |
CD4VHKOL-Pro113
| 100 | 594,9 |
CD4VHKOL-Pro113
| 40 | 372,0 |
CD4VHKOL-Pro113
| 10 | 137,7 |
CD4VHKOL-Pro113
| 2,5 | 48,9 |
CD4VHKOL-Thr113
| 100 | 696,7 |
CD4VHKOL-Thr113
| 40 | 631,5 |
CD4VHKOL-Thr113
| 10 | 304,1 |
CD4VHKOL-Thr113
| 2,5 | 104,0 |
Kontrolle | - | 12,3 |