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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Antikörpermolekül (RAM)
und insbesondere ein humanisiertes Antikörpermolekül (HAM), das eine Spezifität für humanes
Interleukin-5 (hIL-5) aufweist, die Nukleinsäuren, die die variablen Domänen der
schweren und leichten Kette des rekombinanten Antikörpers kodieren,
ein Verfahren zur Herstellung des Antikörpers unter Verwendung rekombinanter
DNA-Technologie
und die therapeutische Verwendung des rekombinanten Antikörpers.
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In
der vorliegenden Anmeldung wird der Ausdruck „rekombinantes Antikörpermolekül" (RAM) zur Beschreibung
eines Antikörpers
verwendet, der durch ein Verfahren hergestellt wurde, das die Verwendung
der rekombinanten DNA-Technologie betrifft. Der Ausdruck „humanisiertes
Antikörpermolekül" (HAM) wird zur Beschreibung
eines Moleküls
verwendet, das von einem menschlichen Immunglobulin abgeleitet wurde.
Die Antigenbindungsstelle kann entweder vollständige variable Domänen, die
auf konstante Domänen
fusioniert wurden, oder eine oder mehrere hypervariable Regionen
(CDRs), die auf geeignete menschliche Gerüstregionen in den variablen
Domänen
gepfropft wurden, umfassen. Die Abkürzung „MAb" wird verwendet, um einen monoklonalen
Antikörper
anzuzeigen.
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Der
Ausdruck „rekombinantes
Antikörpermolekül" umfasst nicht nur
die vollständigen
Immunglobulinmoleküle,
sondern auch jegliche Antigen-bindenden Immunglobulinfragmente,
wie zum Beispiel Fv-, Fab- und F(ab')2-Fragmente
und alle Derivate davon, wie zum Beispiel einzelkettige Fv-Fragmente.
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Natürliche Immunglobuline
wurden in Assays, in der Diagnose und in einem beschränkten Ausmaß in der
Therapie verwendet. Die Verwendung von Immunglobulinen in der Therapie
wurde dadurch behindert, dass die meisten Antikörper mit möglicher Verwendung als therapeutische
Mittel MAbs sind, die durch Verschmelzungen von Nagetiermilzzellen
mit Nagetiermyelomzellen erzeugt wurden. Diese MAbs sind daher im Wesentlichen
Nagetierproteine. Die Verwendung dieser MAbs als therapeutische
Mittel im Menschen kann eine unerwünschte Immunreaktion hervorrufen,
die als HAMA (Human Anti-Mouse Antibody) Reaktion bezeichnet wird.
Die Verwendung von Nagetier-MAbs als therapeutische Mittel in Menschen
ist von Natur aus durch die Tatsache eingeschränkt, dass die menschliche Versuchsperson
eine Immunreaktion gegen den MAb aufbaut, die ihn entweder vollständig entfernt
oder zumindest seine Wirksamkeit verringert.
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Es
wurde eine Anzahl von Techniken zur Verringerung der antigenen Charakteristiken
derartiger nicht-menschlichen MAbs entwickelt. Diese Techniken betreffen
im Allgemeinen die Verwendung rekombinanter DNA-Technologie zur
Manipulation der DNA-Sequenzen, die die Polypeptidketten des Antikörpermoleküls kodieren.
Diese Verfahren werden im Allgemeinen als „Humanisierungs"-Techniken bezeichnet.
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Frühere Verfahren
zur Humanisierung von MAbs betrafen die Herstellung chimärer Antikörper, in
denen einen Antigenbindungsstelle, die die vollständigen variablen
Domänen
eines Antikörpers
umfasst, auf konstante Domänen
fusioniert wird, die von einem anderen Antikörper stammen. Verfahren zur
Ausführung
solcher Chimärisierungstechniken
sind in der
EP 0120694 (Celltech
Limited) und
EP 0125023 (Genentech
Inc. und City of Hope) beschrieben. Humanisierte chimäre Antikörper enthalten
jedoch noch einen signifikanten Teil an nicht-menschlichen Aminosäuresequenzen
und können
noch eine gewisse HAMA-Reaktion hervorrufen, insbesondere bei Verabreichung über einen
längeren
Zeitraum [Begent et al., Br. J. Cancer, 62, 487 (1990)].
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Eine
in der EP-A-0239400 (Winter) beschriebene alternative Methode betrifft
das Pfropfen der hypervariablen Region (CDRs) eines Maus-MAbs auf
die Gerüstregionen
der variablen Domänen
eines menschlichen Immunglobulins unter Verwendung rekombinanter
DNA-Techniken. Es gibt drei CDRs (CDR1, CDR2 und CDR3) in jeder
der variablen Domänen
der schweren und leichten Kette. Derartige CDR-gepfropfte humanisierte
Antikörper
rufen mit weitaus geringerer Wahrscheinlichkeit eine HAMA-Reaktion hervor als
humanisierte chimäre
Antikörper,
angesichts des viel geringeren Anteils an nicht menschlichen Aminosäuresequenzen,
die sie enthalten. In Riechmann et al. [Nature, 332 323-324 (1988)]
wurde festgestellt, dass die reine Übertragung von CDRs, entsprechend
der Definition von Kabat [Sequences of Proteins of Immunological
Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (1987)]
nicht ausreichend war, um für
eine zufriedenstellende Antigenbindungsaktivität in dem CDR-gepfropften Produkt
zu sorgen. Riechman et al. stellte fest, dass es notwendig war eine
Anzahl von Resten, die außerhalb
der CDRs lagen, insbesonde re in der zu CDR1 benachbarten Schleife,
umzuwandeln. Die Bindungsaffinität
der besten erhaltenen CDR-gepfropften Antikörper war jedoch noch signifikant
geringer, als diejenige des ursprünglichen MAbs.
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In
der WO 91/09967 beschreiben Adair et al. schwere und leichte Ketten
eines CDR-gepfropften
Antikörpers
und bestimmte eine Hierarchie von Donorresten.
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In
der WO 93/16184 beschreiben Chou et al. die Auslegung, Klonierung
und Expression humanisierter monoklonaler Antikörper gegen menschliches Interleukin-5.
Ein Verfahren zum Auswählen
menschlicher Antikörpersequenzen
wird vorgeschlagen, die als menschliches Gerüste zur Humanisierung eines
Tierantikörpers verwendet
werden sollen, umfassend die Schritte des Vergleichens der Sequenzen
der menschlichen variablen Domäne
mit den Sequenzen der variablen Domäne des zu humanisierenden Tier-MAbs,
bezüglich
des prozentualen Identitätsanteils,
der Sequenzzweideutigkeiten und eines ähnlichen PIN-Regionabstands.
Der PIN-Regionabstand ist als die Zahl von Resten zwischen den Cysteinresten,
die die Disulfidbrücken
innerhalb einer Domäne
bilden, definiert. Der menschliche Antikörper mit der besten Kombination
dieser Merkmale wird ausgewählt.
Es wird ebenfalls ein Verfahren zur Bestimmung, welche Reste der
variablen Domäne
eines Tier-MAbs zur Humanisierung ausgewählt werden sollten, vorgeschlagen,
umfassend das Bestimmen möglicher
Minimalreste (Reste, die die strukturellen CDR-Schleifen umfassen,
und Reste, die zum Unterstützen und/oder
Ausrichten der strukturellen CDR-Schleifen erforderlich sind) und
Maximalreste (Reste, die Kabat-CDRs umfassen, strukturelle CDR-Schleifen, Reste,
die zum Unterstützen
und/oder Ausrichten der strukturellen CDR-Schleifen erforderlich sind, und Reste,
die innerhalb von 10 Å einer
strukturellen CDR-Schleife liegen und eine für ein Wasserlösungsmittel
zugängliche
Oberfläche
von ungefähr
5 Å2 oder mehr besitzen) des monoklonalen Tierantikörpers. Weiterhin
wird eine Computermodellierung mit allen möglichen rekombinanten Antikörpern durchgeführt, umfassend
die menschliche Antikörpergerüstsequenz,
in die Minimal- und Maximalreste
eingeschoben worden sind. Die Minimal- und Maximalreste werden,
gestützt
auf die Kombination ausgewählt,
die einen rekombinanten Antikörper
mit einer Computermodellstruktur erzeugt, die der des monoklonalen
Tierantikörpers
am besten entspricht. Der erhaltene humanisierte Anti-IL-5 Antikörper scheint
eine wesentliche Menge seiner Affinität für das hIL-5-Molekül verloren
zu haben.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein humanisiertes Antikörpermolekül zur Verfügung zu
stellen, das eine verbesserte Affinität für das hIL-5-Molekül aufweist.
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Dementsprechend
stellt die vorliegende Erfindung ein RAM gemäß Anspruch 1 zur Verfügung. Das RAM
der Erfindung weist eine Affinität
für menschliches
IL-5 auf und umfasst Antigenbindungsregionen, die von den variablen
Domänen
der schweren und leichten Kette eines Donorantikörpers mit Affinität für menschliches
IL-5 stammen, wobei das RAM eine Bindungsaffinität aufweist, die zu der des
Donorantikörpers ähnlich ist.
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Der
Donorantikörper
ist MAb 39D10.
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Die
variablen Domänen
der schweren und leichten Ketten von MAb 39D10 werden hier nachstehend unter
Bezugnahme auf die 1 und 2 spezifisch beschrieben.
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Das
RAM der vorliegenden Erfindung ist ein Anti-IL-5-Antikörpermolekül mit Affinität für das menschliches
IL-5-Antigen, umfassend eine zusammengesetzte schwere Kette, wobei
die zusammengesetzte schwere Kette eine variable Domäne, die überwiegend
die Gerüstreste
der schweren Kette eines Akzeptorantikörpers und die Antigenbindungsreste
der schweren Kette eines Donorantikörpers umfaßt, aufweist und wobei die
zusammengesetzte schwere Kette Donorreste an den Positionen 31–35, 50–65 und
95–102
umfasst (entsprechend dem Kabat-Nummerierungssystem) [Kabat et al.,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, Bd. I, fünfte Auflage,
1991, US Department of Health and Human Services, National Institute
of Health].
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Das
Gerüst
der zusammengesetzten schweren Kette umfasst zusätzlich Donorreste an den Positionen
23, 24, 27–30,
37, 49, 73 und 76–78
oder 24, 27–30,
37, 49, 73, 76 und 78.
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Das
RAM der vorliegenden Erfindung umfasst weiterhin eine zusammengesetzte
leichte Kette, wobei die zusammengesetzte leichte Kette eine variable
Domäne,
die überwiegend
Gerüstreste
der leichten Kette eines Akzeptorantikörpers und Antigenbindungsreste
der leichten Kette eines Donorantikörpers umfasst, aufweist und
wo bei die zusammengesetzte leichte Kette Donorreste an den Positionen
24–34,
50–56
und 89–97 (entsprechend
dem Kabat-Nummerierungssystem) umfasst.
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Das
Gerüst
der zusammengesetzten leichten Kette umfasst zusätzlich Donorreste an den Positionen 22,
68 und 71 oder an den Positionen 68 und 71.
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Jedes
RAM der Erfindung weist vorzugsweise eine Affinitätskonstante
für menschliches
IL-5 auf, die größer als
10–9 M
ist.
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Der
Typ des verwendeten Akzeptorgerüsts
weist vorzugsweise die gleiche oder ähnliche Klasse oder Typ auf,
wie der Donorantikörper.
Praktischerweise weist das gewählte
Gerüst
die größte Homologie
mit dem Donorantikörper
auf. Die gamma-Keimbahngerüste der
menschlichen Gruppe III werden für
die zusammengesetzte schwere Kette und die kappa-Keimbahngerüste der
menschlichen Gruppe I werden für
die zusammengesetzten leichten Ketten verwendet.
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Die
konstanten Regiondomänen
der RAMs der Erfindung können
im Hinblick auf die vorgeschlagenen Funktionen des Antikörpers, insbesondere
die Effektorfunktionen, die erforderlich keinen können, ausgewählt werden.
Die konstanten Regiondomänen
können
zum Beispiel menschliche IgA-, IgE-, IgG- oder IgM-Domänen sein.
Insbesondere können
menschliche konstante IgG-Regiondomänen, besonders vom IgG1- und IgG3-Isotyp
verwendet werden, wenn das humanisierte Antikörpermolekül für therapeutische Verwendungen bestimmt
ist und Antikörpereffektorfunktionen
erforderlich sind. Alternativ dazu können IgG2- und IgG4-Isotypen
verwendet werden, wenn das humanisierte Antikörpermolekül für therapeutische Zwecke bestimmt
ist, und Antikörpereffektorfunktionen,
zum Beispiel für
das spezifische Binden an menschliches IL-5 und das Neutralisieren
seiner biologischen Aktivität,
nicht erforderlich sind. Modifizierte menschliche konstante Regiondomänen, in
denen ein oder mehrere Aminosäurereste
zur Änderung
einer speziellen Effektorfunktion geändert oder deletiert wurden,
können
ebenfalls verwendet werden. Die konstanten Regiondomänen der
RAMs sind vorzugsweise menschliches IgG4.
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Die
vorstehend und anderswo in der vorliegenden Anmeldung angegebenen
Restebezeichnungen sind entsprechend der Kabat-Nummerierung nummeriert
[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,
Band I, fünfte
Auflage, 1991, US Department of Health and Human Services, National
Institute of Health]. Daher entsprechen die Restebezeichnungen nicht
immer direkt einer linearen Nummerierung der Aminosäurereste.
Die tatsächliche
lineare Aminosäuresequenz
kann weniger oder zusätzliche
Aminosäuren
als bei der Kabat-Nummerierung aufweisen, was einer Verkürzung der
Grundstruktur der variablen Domäne
oder einem Einschub in diese entspricht.
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An
dem Anti-IL-5-Antikörpermolekül der vorliegenden
Erfindung können
ebenfalls Effektor- oder Reportermoleküle haften. Alternativ dazu
können
die Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie zur Herstellung
von Immunglobulinmolekülen
verwendet werden, in denen das Fc-Fragment oder die CH3-Domäne eines vollständigen Immunglobulins
gegen ein funktionales Nicht-Immunglobulinprotein, wie zum Beispiel
ein Enzym, ein Zytokin, ein Wachstumsfaktor oder ein Toxinmolekül, ersetzt
wurde oder dieses durch eine Peptidbindung daran angelagert wurde.
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Daher
muss der Rest des Antikörpermoleküls nicht
nur Sequenzen von Immunglobulinen umfassen. Zum Beispiel kann ein
Gen aufgebaut werden, in dem eine DNA-Sequenz, die einen Teil einer menschlichen Immunglobulinkette
kodiert, an eine DNA-Sequenz fusioniert wird, die die Aminosäuresequenz
eines Polypeptideffektor- oder
Reportermoleküls
kodiert.
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Weitere
Aspekte der Erfindung umfassen DNA-Sequenzen, die für die zusammengesetzte
schwere Kette und zusammengesetzte leichte Kette kodieren. Die Klonierungs-
und Expressionsvektoren, die die DNA-Sequenzen enthalten, Wirtszellen,
die mit den DNA-Sequenzen transformiert sind und die Verfahren zur Herstellung
der Antikörpermoleküle, die
das Exprimieren der DNA-Seugenzen in den transformierten Wirtszellen
umfassen, sind ebenfalls weitere Aspekte der Erfindung.
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Die
allgemeinen Verfahren, durch die Vektoren synthetisiert werden können, Transfektionsverfahren und
Kultivierungsverfahren, sind aus dem Stand der Technik gut bekannt
und bilden keinen Teil der Erfindung.
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Die
DNA-Sequenzen, die die Anti-IL-5-Donoraminosäuresequenzen kodieren, können durch
Verfahren erhalten werden, die aus dem Stand der Technik gut bekannt
sind (siehe zum Beispiel die internationale Patentanmeldung Nr.
WO 93/16184). Die Anti-IL-5 kodierende Sequenz kann zum Beispiel
durch genomisches Klonieren oder durch cDNA-Klonieren von geeigneten
Hybridomzelllinien, zum Beispiel die 39D10 Zelllinie, erhalten werden.
Positive Klone können
unter Verwendung geeigneter Sonden für die erforderlichen schweren
und leichten Ketten gescreent werden. Es kann ebenfalls die PCR-Klonierung
verwendet werden.
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Die
für die
Akzeptoraminosäuresequenzen
kodierende DNA kann auf jede geeignete Weise erhalten werden. Zum
Beispiel sind DNA-Sequenzen, die für die bevorzugten menschlichen
Akzeptorgerüste,
wie zum Beispiel die leichten Ketten der menschlichen Gruppe I und
die schweren Ketten der menschlichen Gruppe III, kodieren, für den Fachmann
weithin verfügbar.
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Zur
Herstellung der gewünschten
DNA-Sequenzen können
die Standardtechniken der Molekularbiologie verwendet werden. Die
Sequenzen können
vollständig
oder teilweise unter Verwendung von Oligonukleotidsynthesetechniken
synthetisiert werden. Die ortsspezifische Mutagenese und Polymerasekettenreaktions- (PCR)
Techniken können
in geeigneter Weise verwendet werden. Zum Beispiel kann die Oligonukleotid-spezifische
Synthese, entsprechend der Beschreibung von Jones et al. [Nature,
321, 522 (1986)] verwendet werden. Ebenfalls kann die Oligonukleotidspezifische
Mutagenese einer vorher bestehenden variablen Region, wie zum Beispiel
von Verhoeyen et al. [Science, 239, 1534–1536 (1988)] beschrieben ist,
verwendet werden. Ebenfalls kann enzymatisches Auffüllen von
Oligonukleotiden mit Lücken
unter Verwendung von T4 DNA-Polymerase, wie zum Beispiel von Queen
et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029–10033 (1989) und die WO 90/07861]
verwendet werden.
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Jede
geeignete Wirtszelle und Vektorsystem kann für die Expression von DNA-Sequenzen, die für das RAM
kodieren, verwendet werden. Vorzugsweise werden eukaryotische, zum
Beispiel Säugetier,
Wirtszellexpressionssysteme verwendet. Geeignet Säugetierwirtszellen
umfassen insbesondere CHO-Zellen und Myelom- oder Hybridomzelllinien.
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Daher
wird entsprechend einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung
ein Verfahren zur Herstellung eines Anti-IL-5-RAM zur Verfügung gestellt,
umfassend:
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- (a) das Erzeugen eines ersten Operons mit einer
DNA-Sequenz, die eine zusammengesetzte schwere Kette, wie vorstehend
definiert, kodiert, in einem ersten Expressionsvektor;
- (b) gegebenenfalls das Erzeugen eines zweiten Operons mit einer
DNA-Sequenz, die eine komplementäre leichte
Kette kodiert, die eine zusammengesetzte leichte Kette wie vorstehend
definiert sein kann, in dem ersten oder zweiten Expressionsvektor;
- (c) das Transfizieren einer Wirtszelle mit dem oder jedem Vektor;
und
- (d) das Kultivieren einer transfizierten Zelllinie zur Herstellung
des RAM.
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Alternativ
dazu kann das Verfahren die Verwendung von Sequenzen betreffen,
die eine zusammengesetzte leichte Kette und eine komplementäre schwere
Kette kodieren.
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Zur
Herstellung von RAMs, die sowohl schwere als auch leichte Ketten
umfassen, können
die Zellinien mit zwei Vektoren transfiziert werden. Der erste Vektor
kann ein Operon enthalten, das eine zusammengesetzte oder komplementäre schwere
Kette kodiert, und der zweite Vektor kann ein Operon enthalten,
das eine komplementäre
oder zusammengesetzte leichte Kette kodiert. Die Vektoren sind vorzugsweise
identisch, ausser dass, soweit es die kodierenden Sequenzen und
auswählbaren
Marker betrifft, es soweit wie möglich
sichergestellt wird, dass jede Polypeptidkette gleich exprimiert
wird. In einer bevorzugten Alternative kann ein einzelner Vektor
verwendet werden, wobei der Vektor die Sequenzen, die sowohl die
schwere Kette als auch die leichte Kette kodieren, umfasst.
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Die
DNA in den kodierenden Sequenzen für die schwere und leichte Kette
kann cDNA oder genomische DNA oder beides umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls therapeutische und diagnostische
Zusammensetzungen, die RAMS umfassen, und Verwendungen derartiger
Zusammensetzungen in der Therapie und Diagnose.
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Dementsprechend
stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt eine therapeutische
oder diagnostische Zusammensetzug zur Verfügung, die ein RAM, entsprechend
den vorhergehenden Aspekten der Erfindung, in Kombination mit einem
pharmazeutisch verträglichen
Arzneimittelträger,
Verdünnungsmittel
oder Träger
umfasst.
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Diese
Zusammensetzungen können
unter Verwendung der RAMs der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel
als ganze Antikörper,
einzelkettige Fv-Fragmente oder Antikörperfragmente, wie zum Beispiel
Fab- oder Fv-Fragmente, hergestellt werden. Derartige Zusammensetzungen
weisen Blockierungs- oder antagonistische Wirkungen bezüglich IL-5
auf und können
zum Unterdrücken
der IL-5-Aktivität
verwendet werden.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
können
entsprechend der üblichen
Praxis zur Verabreichung über
jeden geeigneten Weg formuliert werden und können im allgemeinen in einer
flüssigen
Form [zum Beispiel eine Lösung
des RAM in einem sterilen physiologisch verträglichen Puffer) zur Verabreichung über beispielsweise
einen intravenösen,
intraperitonealen oder intramuskulären Weg; in Sprayform, zum
Beispiel zur Verabreichung über
einen nasalen oder bukkalen Weg; oder in einer zur Einpflanzung
geeigneten Form vorliegen.
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Die
Erfindung stellt ebenfalls den erfindungsgemäßen Antikörper zur Verwendung in einem
Therapie- oder Diagnoseverfahren zur Verfügung, umfassend das Verabreichen
einer wirksamen Menge, vorzugsweise von 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht,
eines RAMs, entsprechend den vorhergehenden Aspekten der Erfindung, an
eine Versuchsperson oder ein Versuchstier. Die genaue Dosierung
und die Gesamtdosis werden entsprechend der beabsichtigten Verwendung
des RAMs und dem Alter und der Verfassung des zu behandelnden Patienten
variieren. Das RAM kann als Einzel dosis oder auf fortlaufende Art über einen
Zeitraum verabreicht werden. Die Verabreichungen können in
geeigneter Weise wiederholt werden.
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Das
RAM entsprechend den vorhergehenden Aspekten der Erfindung kann
für jede
der therapeutischen Verwendungen, bei denen Anti-IL-5-Antikörper, zum
Beispiel 39D10 verwendet wurden oder in Zukunft verwendet werden
können,
verwendet werden.
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IL-5
ist ein primärer
Aktivator von Eosinophilen und es wurde gezeigt, dass das Blockieren
der Funktion dieses Zytokins mit Antikörpern eine Eosinophilie, die
mit bestimmten allergischen Krankheiten verbunden ist, verhindert
oder verringert. Daher kann das erfindungsgemäße RAM für diesen Zweck verwendet werden und
insbesondere kann es in der Behandlung von Asthma Verwendung finden,
wobei erwartet wird, dass es die Anhäufung und Aktivierung von Eosinophilen
in asthmatischen Lungen verhindert, wodurch eine bronchiale Entzündung und
eine Verengung der Luftwege verringert wird. Für die Verwendung in der Asthmabehandlung kann
das erfindungsgemäße RAM vorteilhafterweise
ein einzelkettiges Fv-Fragment sein, das als Spray, zum Beispiel
zur Verabreichung über
den nasalen Weg, formuliert ist.
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Ein
bevorzugtes Protokoll zum Erhalten eines erfindungsgemäßen Anti-IL-5-Antikörpermoleküls wird im
Nachfolgenden ausgeführt.
Dieses Protokoll wird ohne eine Beeinträchtigung der Allgemeingültigkeit
der Erfindung, wie hier vorstehend beschrieben und definiert wurde,
angegeben.
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Der
monoklonale Rattenantikörper
39D10, der gegen menschliches IL-5 erzeugt wurde, wird als Donorantikörper verwendet.
Die variablen Domänen
der schweren und leichten Ketten von 39D10 wurden früher kloniert
(WO 93/16184) und das Nukleotid und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen
dieser Domänen sind
in den 1 und 2 gezeigt. Die geeigneten
variablen Domänen
der schweren und leichten Ketten des Akzeptors müssen bestimmt werden und die
Aminosäuresequenz
muss bekannt sein. Dann wird das RAM ausgehend von der Akzeptorsequenz
als Basis gentechnisch hergestellt.
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1. Die CDRs
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In
einem ersten Schritt werden in den CDRs Akzeptorreste durch Donorreste
ersetzt. Zu diesem Zweck sind die CDRs vorzugsweise wie folgt definiert:
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Die
Positionen an denen die Akzeptorreste durch Donorreste in dem Gerüst ersetzt
werden sollen, werden dann folgendermaßen, zuerst in Bezug auf die
schwere Kette und danach in Bezug auf die leichte Kette gewählt.
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2. SCHWERE KETTE
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2.1 Donorreste werden entweder
an den gesamten Positionen 24, 27 bis 30, 37, 49, 73, 76 und 78
oder an den gesamten Positionen 23, 24, 27 bis 30, 37, 49, 73 und
76 bis 78 der schweren Kette verwendet.
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3. LEICHTE KETTE
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3.1 Donorpositionen werden
entweder an den gesamten Positionen 22, 68 und 71 oder an den gesamten
Positionen 68 und 71 verwendet.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Anti-IL-5-Antikörpermolekül mit einer
Bindungsaffinität,
die im Wesentlichen gleich zu der des Donorantikörpers ist. Die vorliegende
Erfindung wird nun anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die
begleitenden Zeichnungen beschrieben, wobei:
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1 das Nukleotid und die
Aminosäuresequenz
der schweren Kette von 39D10 zeigt;
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2 das Nukleotid und die
Aminosäuresequenz
der leichten Kette von 39D10 zeigt;
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3 die Anordnung der Gerüstregionen
der variablen Domäne
der schweren Kette von 39D10 mit den Gerüstregionen der variablen Domäne der schweren
Kette von der Consensus-Sequenz der schweren Ketten der humanen
Gruppe III zeigt;
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4 die Anordnung der Gerüstregionen
der variablen Domäne
der leichten Kette von 39D10 mit den Gerüstregionen der variablen Domäne der leichten
Kette von der Consensus-Sequenz der leichten Ketten der humanen
Gruppe I zeigt;
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5 das Nukleotid und die
Aminosäuresequenz
der CDR-gepfropften Anti-IL-5 leichten Kette CTIL-5-gL6 zeigt;
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6 das Nukleotid und die
Aminosäureseugenz
der CDR-gepfropften Anti-IL-5 schweren Kette CTIL-5-10gH zeigt;
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7 eine Karte des Plasmids
pMR14 zeigt;
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8 eine Karte des Plasmids
pMR15.1 zeigt;
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9 die Affinitätskonstanten
und die Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten eine chimären 39 D10-Antikörpers und
des CTIL-5-10gH/gL6-Antikörpers
zeigt;
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10 eine graphische Darstellung
der Neutralisation von IL5 in dem TF1-Assay durch eine Tafel von Antiköpern zeigt;
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11 die Ergebnisse eines
Konkurrenzassays für
Ratten-39D10, einen chimären
Antikörper
und CTIL-5-10gH/gL6-Antikörper
zeigt; und
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12 die Wirkung von CTIL-5-10gH/gL6
auf Affen-Eosinophilie zeigt.
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BEISPIEL
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1. MATERIAL UND VERFAHREN
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39D10
ist ein monoklonaler Ratten-Antikörper, der gegen menschliches
IL-5 hervorgerufen wird. Die Gene für die variablen Domänen der
schweren und leichten Ketten von 39D10 wurden vorher kloniert (WO 93/16184)
und das Nukleotid und vorhergesagten Aminosäuresequenzen dieser Domänen sind
in den 1 und 2 gezeigt. Aufgrund der zur
Klonierung der variablen Domäne
der schweren Kette von 39D10 verwendeten Strategie sind die ersten
fünf Aminosäuren der
Gerüstregionen
unbekannt. Jedoch war eine schwere Kette verfügbar, die die Signalsequenz
und die ersten fünf
Aminosäuren
des Gerüsts
1 von dem Antikörper
YTH 34.5HL enthielt, Riechmann et al. [Nature, 332, 323–327 (1988)].
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2. MOLEKULARBIOLOGISCHE
VERFAHREN
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Die
verwendeten molekularbiologische Verfahren waren diejenigen, die
in Maniatis et al. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite
Auflage, Band 1 bis 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]
beschrieben sind.
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3. AUFBAU DER
REKOMBINANTEN GENE DER SCHWEREN UND LEICHTEN KETTE
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Schwere Kette
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Eine
Vh-Region der schweren Kette wurde durch PCR unter Verwendung der
Oligonukleotide R3601 und R2155 erzeugt. Die Sequenzen von diesen
sind:
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Die
Reaktionsmischung (100 μl)
enthielt 10 mM Tris-HCI pH-Wert 8,3, 1,5 mM MgCl, 50 mM KCl, 0,01 %
w/v Gelatine, 0,25 mM von jedem Desoxyribonukleosidtriphosphat,
0,1 μg DNA
der schweren Kette von 39D10, 6 pmol R3601 und R2155 und 0,25 Einheiten
Taq-Polymerase. Die Reaktionsmischung wurde bei 94 °C 5 Minuten
erwärmt
und dann wurden zyklisch 94 °C
während
1 Minute, 55 °C
während
1 Minute und 72 °C während 1
Minute durchlaufen. Nach 30 Zyklen wurde die Reaktion mit einem
gleichen Volumen an Phenol/Chloroform (1:1 v/v), dann mit Chloroform
extrahiert, bevor durch die Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol gefällt wurde.
Das PCR-Produkt wurde in dem geeigneten Puffer gelöst, mit
HindIII und Apal verdaut, auf einem Agarosegel gereinigt und in
den Vektor pMR14 (7)
ligiert, der ebenfalls mit HindIII und Apal verdaut worden war.
Nach der Transformation in E. coli LM1035 wurden über Nacht
Kolonien gezüchtet
und die Plasmid DNA bezüglich
Vh-Einschüben
analysiert. Die Nukleotidsequenz der Vh-Region in dem Plasmid, pARH1217, ist
in 1 gezeigt.
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Leichte Kette
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Ein
V1 Gen der leichten Kette wurde von dem ursprünglichen V1-Klon, wie in der
WO 93/16184 beschrieben, durch PCR mit den Oligonukleotiden R3585
und R3597 erzeugt. Deren Sequenzen sind:
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Die
PCR wurde wie vorstehend beschrieben ausgeführt. Das PCR-Produkt wurde
mit den Enzymen BstBI und Sp1I verdaut und nach der Reinigung in
pMR15.1 (8) ligiert,
das vorher mit denselben Enzymen verdaut worden war.
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Nach
Transformation von E. coli LM1035 wurde eine Kolonie identifiziert,
die ein Plasmid (pARH1215) mit einem V1-Einschub enthielt. Die Nukleotidsequenz
des V1-Einschubs
ist in 2 gezeigt.
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CDR-Pfropfen von 39D10
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Leichte Kette
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Zum
Entscheiden über
die für
die CDR-Schleifen von 39D10 am besten geeigneten menschlichen Akzeptorgerüste, wurde
die Aminosäuresequenz
der Gerüste
1–3 von
39D10 mit denjenigen der bekannten humanen kappa leichten Ketten
verglichen. Es wurde festgestellt, dass 39D10 zu den leichten Ketten
der humanen Gruppe I am weitesten homolog war. Gestützt darauf
wurde entschlossen, die Keimbahngerüste der humanen Gruppe I zum
CDR-Pfropfen zu verwenden. Die Homologien zwischen diesen Sequenzen
sind in 3 gezeigt. Ebenfalls
wird die Homologie zwischen den Regionen des Gerüsts 4 von 39D10 und der Consensus-Sequenz
der bekannten leichten Ketten der humanen Gruppe I gezeigt. Die
Reste in 39D10, die sich von der humanen Consensus-Sequenz unterscheiden,
sind unterstrichen. Der Beitrag, den diese Reste zur Antigenbindung
liefern könnten,
wurde analysiert und es wurden zwei Gene für die CDR-gepfropfte leichte
Kette aufgebaut. Diese waren CTIL-5-gL5 und CTIL-5-gL6, wobei in
denen, sowie die CDR-Reste, entweder die Reste 22, 68 und 71 beziehungsweise
die Reste 68 und 71 ebenfalls von 39D10 waren. Das Nukleotid und
die Aminosäuresequenzen
von CTIL-5-gL6 sind in 5 gezeigt.
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Schwere Kette
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Das
CDR-Pfropfen der schweren Kette von 39D10 wurde wie für die leichte
Kette beschrieben ausgeführt.
Es wurde festgestellt, dass die Gerüstregionen von 39D10 am weitesten
homolog zu denjenigen der Antikörper
der humanen Gruppe II sind und folglich die Consensus-Sequenz der
Gerüste
der Keimliniengene der humanen Gruppe III zur Aufnahme der CDRs
der schweren Kette von 39 D10 verwendet wurde. Wie vorher wurde
ebenfalls die Consensus-Sequenz für die Gerüst 4-Regionen der humanen Gruppe
III gewählt.
Ein Vergleich dieser Sequenzen ist in 4 gezeigt,
wobei die Reste in 39D10, die von der humanen Consensus-Sequenz
verschiedenen sind, unterstrichen sind.
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Eine
Analyse der Gerüstreste
in 39D10, die die Antigenbindung beeinflussen könnten, wurde ausgeführt und
darauf gestützt
wurden zwei Gene, CTIL-5-9gH und CTIL-5-10gH aufgebaut, in denen entweder
die Reste 23, 24, 27 bis 30, 37, 49, 73 und 76 bis 78 oder die Reste
24, 27–30,
37, 49, 73, 76 beziehungsweise 78 von 39D10 waren. Das Nukleotid
und die Aminosäuresequenzen
von CTIL-5-10gH sind in 6 gezeigt.
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Expression und
Bioaktivität
der Anti-IL-5-Antikörper
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Chimärer (Ratte/Mensch)
und CDR-gepfropfter 39D10 wurde zur biologischen Bewertung durch
transiente Expression der schweren und leichten Kettenpaare nach
Cotransfektion in Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen)
unter Verwendung von Calciumphosphatfällung hergestellt.
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Ein
Tag vor der Transfektion wurden halb-konfluente Kolben mit CHO-L761
h-Zellen (Cockett et al., Nucl. Acids. Res., 19, 319–325, 1991)
trypsiniert, die Zellen gezählt
und T75-Kolben mit jeweils 107-Zellen vorbereitet.
Am nächsten
Tag wurde das Kulturmedium drei Stunden vor der Transfektion ausgetauscht.
Für die Transfektion
wurde der Calciumphosphatniederschlag durch Mischen von 1,25 ml
0,25 M CaCl2, das 50 μg von den jeweiligen Expressionsvektoren
der schweren und leichten Kette mit 1,25 ml 2×HBS (16,36 g NaCl, 11,9 gm
HEPES und 0,4 g Na2HPO4 in
1 Liter Wasser, wobei der pH-Wert mit NaOH auf 7,1 eingestellt wurde)
enthielt, und sofortigem Zugeben in das Medium der Zellen hergestellt.
Nach 3 Stunden bei 37 °C
in einem CO2-Inkubator wurde das Medium
und der Niederschlag entfernt und die Zellen durch Zugabe von 15
ml 15 % Glycerin in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) während 1
Minute abgeschreckt. Das Glycerin wurde entfernt, die Zellen einmal
mit PBS gewaschen und während
48–96
Stunden in 25 ml Medium, das 10 mM Natriumbutyrat enthielt, inkubiert.
Der Antikörper
wurde von dem Kulturmedium durch Binden an Protein A-Sepharose und
dem Eluieren davon, gereinigt. Die Antikörperkonzentration wurde unter
Verwendung eines humanen Ig-ELISA (siehe nachstehend) bestimmt.
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ELISA
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Die
Antikörperexpression
wurde durch Transfizieren von Genpaaren der schweren und leichten
Kette in CHO-Zellen und, nach Inkubation während 3 Tagen, durch Messen
der Menge an Antikörpern,
die sich in dem Kulturmedium ansammelten, durch ELISA bewertet.
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Für den ELISA
wurden Nunc-ELISA-Platten über
Nacht bei 4 °C
mit einem F(ab')2-Fragment
eines polykolonalen Ziege-Anti-Mensch-Fc-Fragment-spezifischen Antikörpers (Jackson
Immunoresearch, Kennziffer 109-006-098) mit 5 μg/ml in Beschichtungspuffer
(15 mM Natriumcarbonat, 35 mM Natriumhydrogencarbonat, pH-Wert 6,9)
beschichtet. Nicht beschichteter Antikörper wurde durch 5 mal Waschen
mit destilliertem Wasser entfernt. Proben und gereinigte Standards,
die quantitativ bestimmt werden sollten, wurden auf näherungsweise
1 μg/ml
in Konjugatpuffer (0,1 M Tris-HCl
pH-Wert 7,0, 0,1 M NaCl, 0,2 % v/v Tween 20, 0,2 % w/v Hammersten
Casein) verdünnt.
Die Proben wurden in den Mikrotitervertiefungen in zweifachen Verdünnungen
titriert, was in jeder Vertiefung zu einem Endvolumen von 0,1 ml
führte,
und die Platten wurden bei Raumtemperatur während 1 Stunde unter Schütteln inkubiert.
Nach dem ersten Inkubationsschritt wurden die Platten 10 mal mit
destilliertem Wasser gewaschen und dann während 1 Stunde wie vorstehend
mit 0,1 ml eines Maus monoklonalen anti-Mensch kappa (Klon GD12)
Peroxidase-konjugierten Antikörpers
(The Binding Site, Kennziffer MP135) bei einer Verdünnung von
1 zu 700 in Konjugatpuffer inkubiert. Die Platte wurde wiederum
gewaschen und die Substratlösung
(0,1 ml) zu jeder Vertiefung gegeben. Die Substratlösung enthielt
150 μl N,N,N,N-Tetramethylbenzidin
(10 mg/ml in DMSO), 150 μl
Wasserstoffperoxid (30 % Lösung)
in 10 ml 0,1 M Natriumacetat/Natriumcitrat, pH-Wert 6,0. Die Platte
wurde während
5–10 Minuten
entwickelt, bis die Extinktion bei 630 nm näherungsweise 1,0 für den höchsten Standard
betrug. Die Extinktion bei 630 nm wurde unter Verwendung eines Plattenlesers
gemessen und die Konzentration der Probe wurde durch Vergleich der
Titrationskurven mit denen des Standards bestimmt.
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Bestimmung der Affinitätskonstanten
für Anti-IL-5-Antikörper
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Die
Affinitäten
der chimären
und CDR-gepfropften Anti-IL-5-Antikörper wurden unter Verwendung
einer biospezifischen Wechselwirkungsanalyse (BIA) bestimmt. Die
Antikörper
wurden in CHO-Zellen durch Transfektion von Kombinationen aus Genen
der schweren und leichten Kette und Reinigung aus den Kulturüberständen auf
Protein A-Sepharose hergestellt. Für die Affinitätsmessungen
wurde ein polyklonaler antihumaner Fc-Antikörper an den Pharmacia Biosensor-Chip
(12150 relative Reaktionseinheiten, RU) gebunden und zum Einfangen
von Anti-IL-5 verwendet, das mit 5 μg/ml in 10 mM HEPES, 0,15 M
NaCl, 3,4 mM EDTA, pH-Wert 7,4 über
den Chip geleitet wurde. Die bei jedem Durchlauf eingefangene Menge
an Anti-IL-5 betrug näherungsweise
1600 RU. Dann wurde rekombinantes menschliches IL-5 in verschiedenen
Konzentrationen (0,6 bis 5 μg/ml)
in dem vorstehenden Puffer über
den Sensorchip geleitet. Nach jedem Durchlauf wurde der Sensorchip
mit 100 mM HCl und 100 mM Orthophosphorsäure zum Entfernen von gebundenem
IL-5 und Antikörper
gereinigt. Die erzeugten Sensorgramme wurden unter Verwendung der
verfügbaren
Kinetik-Software mit dem BIAcore-Gerät analysiert.
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Es
wurden die Werte für
die Affinitätskonstanten
und Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten von zwei Antikörpern, chimärem 39D10
und CTIL-5-10gH/gL6 bestimmt. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Es ist ersichtlich,
dass chimäres
39D10 eine äußerst hohe
Affinität
für humanes
IL-5 aufweist und, dass dieser Wert in CTIL-5-10gH/-gL6 reproduziert
wurde.
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Aktivität von Anti-IL5-Antikörpern in
einem in vitro Bioassay
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Die
Aktivitäten
verschiedener CDR-gepfropfter Antikörper wurden mit denen von chimärem 39D10
in einem in vitro Bioassay unter Verwendung von TF1-Zellen verglichen.
TF1 ist eine erythroleukämische
Zelllinie, die zum Wachstum GM-CSF erfordert. GM-CSF kann durch
IL-5 ersetzt werden, in diesem Fall überleben jedoch die Zellen
nur und vermehren sich nicht stark. Die Abhängigkeit des Überlebens
von IL-5 bedeutet jedoch, dass TF1-Zellen in einem Bioassay zum
Vergleichen der Aktivitäten
verschiedener Anti-IL-5-Antikörper verwendet
werden kann.
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Die
Neutralisation durch Anti-IL-5-Antikörper wurde unter Verwendung
einer konstanten Menge an IL-5 (2 ng/ml) und variablen Mengen an
Antikörpern,
die mit 5 × 104 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96
Vertiefungen mit flachem Boden während
3 Tagen inkubiert wurden, gemessen. Während der letzten 4 Stunden werden
die Zellen in Gegenwart von 500 μl/ml
Thiazolylblau (MIT) kultiviert. Dieser Farbstoff wird in eine unlösliche purpurrote
Form durch Mitochondrien-Enzyme in lebensfähigen Zellen umgewandelt. Das
unlösliche Material
wurde durch Inkubieren über
Nacht nach Zugabe von 100 μl
50 % Dimethylformamid, 20 % SDS pH-Wert 4,7 und gelöst und die
Menge an aufgenommenem Farbstoff wurde spektrophotometrisch bestimmt. Die
Gehalte an bioaktivem IL-5, das in Gegenwart der Antikörper zurückblieb,
wird von einer Standardkurve ausgehend, die sich auf den Zusammenhang
von Farbstoffaufnahme und IL-5-Konzentration bezieht, extrapoliert.
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Die
Aktivitäten
von verschiedenen Kombinationen an schweren und leichten Ketten
wurden unter Verwendung des TF1-Bioassays bewertet. Die Ergebnisse
sind in 10 gezeigt.
Es ist ersichtlich, dass alle Kombinationen an CDR-gepfropften schweren
und leichten Ketten Antikörper
erzeugen, die bezüglich
des chimären
39D10 gleich wirksam sind. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass
weder der Rest 22 in der leichten Kette noch die Reste 23 oder 78
in der schweren Kette für
eine 39D10-Spezifität zum optimalen
Binden erforderlich sind. Die Kombination mit den weniger 39D10-spezifischen
Resten ist daher CTIL-5-10gH/-gL6.
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Aktivität von Anti-IL-5-Antikörpern in
Konkurrenzassays
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Rekombinantes
humanes IL-5 wurde auf 1 μg/ml
in phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS) verdünnt und
100 μl Aliquoten
wurden auf Mikrotiterplatten (Costar Amine-Binding-Platten) gegeben und über Nacht
bei 4 °C
inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS, das 0,5 % Tween 20
enthielt, gewaschen und jegliche übrigen aktiven Stellen wurden
mit 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS während 30 Minuten blockiert.
Dann wurden die Platten abgesaugt und ablaufen gelassen, bis sie
trocken waren. Zum Vergleich der relativen Bindungsaktivität des Stammrattenantikörpers (39D10)
mit chimären
und gepfropften Antikörpern
wurden Verdünnungsreihen
von jedem Anti-IL-5-Antikörper
in PBS/1 % BSA hergestellt und 50 μl zum Verdoppeln der Vertiefungen,
unmittelbar gefolgt von 50 μl
39D10-Biotinkonjugat mit 0,125 μg/ml
zugegeben. Der Assay wurde während
2 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert und dann zweimal
mit PBS gewaschen. Zu allen Vertiefungen wurden Meerrettichperoxidase
konjugiert an Streptavidin (1 μg/ml)
gegeben und während
weiteren 30 Minuten inkubiert. Die Platten wurden vier mal gewaschen
und 100 μl
Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat wurde zugegeben. Die Farbentwicklung
wurde bei 630 nm (Referenz 490 nm) abgelesen und die OD (630–490) wurde
gegen log(10) der Antikörperkonzentration
aufgetragen.
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Bei
dem Vergleich der Aktivitäten
des 39D10 der Ratte, des chimären
39D10 und CTIL-5-10gH/gL6 in dem vorstehenden Konkurrenzassay wurden
die in 11 ge zeigten
Ergebnisse erhalten. Alle drei Antikörper konkurrierten gut mit
biotinyliertem 39D10 um die Bindung an IL-5, was darauf hinweist,
dass die CDR-Schleifen von 39D10 erfolgreich auf die humanen Gerüste übertragen
worden sind.
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Wirkung des Anti-IL-5-Antikörpers auf
Affen-Eosinophilie
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Der
Anti-IL-5-Antikörper
(CTIL-5-10gH/gL6) wurde in einem Affensystem getestet, das die asthmatischen
Bedingungen modelliert (siehe Mauser, P.J. et al., Ann. Rev. Respir.
Dis., in Druck). Wird CTIL-5-10gH/gL6 eine Stunde vor der Herausforderung
mit Ascaris an ansprechende Alten verabreicht, so hemmt es die Lungenwascheosinophilie
um 75 % bei einer intravenösen
Dosis von 0,3 mg/kg. Dieser Satz Affen spricht nicht übermäßig auf
Histamin an, so dass die Wirkungen von CTIL-5-10gH/gL6 auf eine übermäßige Ansprechempfindlichkeit
nicht bestimmt werden konnten. Drei Monate nach dieser Einzeldosis
wird die Eosinophil-Anhäufung
als Reaktion gegen die Herausforderung mit Ascaris noch um 75 %
gehemmt.
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In
der allergischen Maus hemmt CTIL-5-10gH/gL6 die Lungen-Eosinophilie
mit 1 mg/kg intraperitoneal.
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