SK282625B6

SK282625B6 - Rekombinantné protilátky proti interleukínu-5

Info

Publication number: SK282625B6
Application number: SK1600-96A
Authority: SK
Inventors: John Spencer Emtage; Mark William Bodmer; Diljeet Singh Athwal
Original assignee: Celltech Therapeutics Limited
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 2002-10-08
Also published as: GB9412230D0; IL114179A; DE69532889T2; WO1995035375A1; SK160096A3; CA2192543C; CA2192543A1; US20020042089A1; FI965032A; EP0765392B1; US6316227B1; HU221641B1; HUT76672A; AU694783B2; AU2680395A; CZ371296A3; HU9603183D0; NO964808D0; JP3973682B2; JPH10501697A

Abstract

Je opísaná rekombinantná protilátková molekula, ktorá má afinitu pre ľudský IL-5 antigén, DNA sekvencia kódujúca ťažký a/alebo ľahký reťazec protilátky, farmaceutická kompozícia obsahujúca protilátku a použitie protilátky na výrobu liečiva.ŕ

Description

Predložený vynález sa týka rekombinantnej protilátkovej molekuly (RAM) a hlavne humanizovanej protilátkovej molekuly (HAM), majúcej špecifickosť pre ľudský interleu-kín-5 (hIL-5), nukleových kyselín, ktoré kódujú variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca uvedenej rekombinantnej protilátky, spôsobu produkcie uvedenej protilátky s použitím rekombinantnej DNA technológie a terapeutického použitia rekombinantnej protilátky.

V predloženej prihláške výraz „rekombinantná protilátková molekula“ (RAM) je použitý na opis protilátky produkovanej spôsobom zahrnujúcim použitie rekombinantnej DNA technológie. Výraz „humanizovaná protilátková molekula“ (HAM) je použitý na opis molekuly získanej z ľudského imunoglobulínu. Antigén viažuci miesto môže obsahovať buď kompletné variabilné domény fuzované ku konštantným doménam alebo jeden alebo viacero komplementárnych determinujúcich regiónov (CDR) naočkovaných k vhodným rámčekom regiónov vo variabilnej doméne. Skratka „MAb“ je použitá na označenie monoklonálnej protilátky.

Výraz „rekombinantná protilátková molekula“ zahrnuje nielen kompletné imunoglobulínové molekuly, ale tiež akékoľvek antigén viažuce imunoglobulínové fragmenty, ako Fv, Fab a F(ab')₂ fragmenty a akékoľvek ich deriváty, ako sú jednoreťazcové F v fragmenty.

Prírodné imunoglobulíny boli používané v esejach, diagnóze a v obmedzenom rozsahu v terapii. Použitiu imunoglobulínov v terapii sa bránilo tým, že väčšina protilátok potenciálneho použitia ako terapeutických činidiel sú MAb produkované fúziou buniek sleziny hlodavcov s bunkami myelómu hlodavcov. Tieto MAb sú tak v podstate hlodavčie proteíny. Použitie týchto MAb ako terapeutických činidiel u ľudí môže zvýšiť nežiaducu imunitnú odpoveď zvanú HAMA (z anglického Human Anti-mouse Antibody). Použitie hlodavčích MAb ako terapeutických činidiel u ľudí je inherentne obmedzené skutočnosťou, že ľudský subjekt bude poskytovať imunologickú reakciu k MAb, ktorá buď odstráni úplne alebo aspoň redukuje jej účinnosť.

Bolo vyvinutých veľa techník na zníženie antigenických charakteristík takýchto ľudských MAb. Tieto techniky všeobecne zahrnujú použitie rekombinantnej DNA technológie na zostavenie DNA sekvencií, kódujúcich polypeptidové reťazce protilátkovej molekuly. Tieto metódy sa všeobecne nazývajú „humanizačné“ techniky.

Najnovšie metódy na humanizáciu MAb zahrnujú produkciu chimémych protilátok, v ktorých antigén viažuci miesta obsahujúce kompletné variabilné domény jednej protilátky sú fuzované ku konštantným doménam získaným z inej protilátky. Metódy na vykonávanie takýchto chimerizačných postupov sú opísané v EP 0120694 (Celltech Limited) a EP 0125023 (Genentech Inc. a City of Hope). Humanizované chiméme protilátky však ešte obsahujú významný podiel nehumánnych aminokyselinových sekvencií a môžu ešte stále vyvolávať určitú HAMA reakciu, najmä ak sú podávané dlhší čas (Begent a spol., Br. J. Cancer, 62,487(1990)).

Alternatívne riešenie, opísané v EP-A-0239400 (Winter), zahrnuje naočkovanie komplementaritu determinujúceho regiónu (CDR) myšou MAb na rámčeky regiónov variabilných domén ľudského imunoglobulínu s použitím rekombinantných DNA techník. Existujú tri CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) v každých variabilných doménach ťažkého a ľahkého reťazca. Takéto CDR - štepené humanizované protilátky pravdepodobne oveľa menej zvyšujú HAMA odpoveď ako humanizované chiméme protilátky vzhľadom na oveľa nižší podiel nehumánnych aminokyselinových sekvencií, ktoré obsahujú. V Riechmann a spol. (Náture, 332, 323 - 324 (1988)) bolo zistené, že transfer CDR samotných, ako definuje Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (1987)) nebol dostatočný na poskytnutie vyhovujúcej antigén viažucej aktivity v CDR-štepenom produkte. Riechmann a spol. zistili, že bolo nevyhnutné konvertovať mnoho zvyškov mimo CDR, hlavne v slučke pripojenej k CDR1. Ale väzobná afinita najlepších CDR - očkovaných získaných protilátok bola ešte významnejšia ako pôvodná MAb.

Vo WO 91/09967, Adair a spol., opisujú CDR - štepenú protilátku ťažkého a ľahkého reťazca a determinujú hierarchiu donorových zvyškov.

Vo WO 93/16184 Chou a spol. opisujú dezén, klonovanie a expresiu humanizovaných monoklonálnych protilátok proti ľudskému interleukínu-5. Je navrhnutý spôsob selekcie ľudských protilátkových sekvencií, ktoré sa majú použiť ako humánne rámčeky na humanizáciu zvieracích protilátok, zahrnujúce stupne porovnania humánnych variabilných doménových sekvencií s variabilnými doménovými sekvenciami zo zvieracej MAb, ktorá sa humanizuje, na percentuálnu identitu, sekvenčné dvojznačnosti a podobné PIN - regiónové vzdialenosti. PIN - regiónová vzdialenosť je definovaná ako počet zvyškov medzi cysteínovými zvyškami, tvoriacimi intra doménové disulfidové mostíky. Vyberie sa ľudská protilátka majúca najlepšiu kombináciu týchto rysov. Navrhne sa tiež metóda stanovenia, ktoré variabilné doménové zvyšky zvieracej MAb by sa mali vybrať na humanizáciu, zahrnujúcu stanovenie potenciálneho minima zvyškov (zvyšky, ktoré obsahujú CDR štruktúrne slučky a zvyšky vyžadované na podporu a/alebo orientáciu CDR štruktúrnych slučiek) a maximum zvyškov (zvyšky, ktoré obsahujú Kabatove CDR, CDR štruktúrne slučky, zvyšky vyžadované na podporu a/alebo orientáciu CDR štruktúrnych slučiek a zvyšky, ktoré patria do asi 10 A CDR štruktúrnej slučky a majú povrch prístupný pre vodné rozpúšťadlo asi 5 A² alebo väčšie) zvieracej monoklonálnej protilátky. Ďalej sa vykonáva počítačové modelovanie na všetkých možných rekombinantných protilátkach, zahrnujúcich ľudskú protilátkovú rámčekovú sekvenciu, do ktorej bolo inzertované minimum a maximum zvyškov. Minimum a maximum zvyškov sa vyberie na základe kombinácie, ktorá produkuje rekombinantná protilátku, majúcu štruktúru počítačového modelu najbližšiu štruktúre zvieracej monoklonálnej protilátky. Humanizovaná získaná anti-IL-protilátka sa javí ako bez podstatného množstva svojej afinity pre hIL-5 molekulu.

Cieľom vynálezu je poskytnúť humanizovanú protilátkovú molekulu majúcu zlepšenú afinitu pre hIL-5 molekulu.

Podstata vynálezu

Podľa predloženého vynálezu je poskytnutá RAM, majúca afinitu pre ľudský IL-5 a obsahujúca antigén väzobné regióny získané z ťažkého a/alebo ľahkého reťazca variabilných domén donor protilátky, majúcej afinitu pre ľudský IL-5, RAM majúcej väzobnú afinitu podobnú afinite donor protilátky.

RAM podľa vynálezu môže obsahovať antigén viažuci regióny z akejkoľvek vhodnej donor anti-IL-5 protilátky. Typicky je donor anti-IL-5 protilátka hlodavčej MAb. Výhodne je donor protilátka MAb 3 9D10.

SK 282625 Β6

Variabilné domény ťažkých a ľahkých reťazcov MAb 39D10 sú tu ďalej opísané pri obrázkoch 1 a 2.

Podľa preferovaného aspektu vynálezu je RAM podľa predloženého vynálezu anti-IL-5 protilátková molekula, majúca afinitu pre ľudský IL-5 antigén, obsahujúci kompozitný ťažký reťazec a komplementárny ľahký reťazec, kde uvedený kompozitný ťažký reťazec má variabilnú doménu, obsahujúcu prevažne zvyšky rámčeka ťažkého reťazca protilátkového akceptora a väzobné zvyšky pre ťažký reťazec antigénu donor protilátky, kde uvedená donor protilátka má afinitu pre ľudský IL-5, pričom uvedený kompozitný ťažký reťazec obsahuje donor zvyšky aspoň v polohách 31 až 35, 50 až 65 a 95 až 102 (podľa Kabatovho systému číslovania) (Kabat a spol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Vol. I, 5. vydanie, 1991, US Department of Health and Human Services, National Inštitúte of Health).

Výhodne rámček kompozitného ťažkého reťazca ďalej obsahuje donor zvyšky v polohách 23, 24, 27 - 30, 37, 49, 73 a 76 - 78 alebo 24,27 - 30,37,49,72, 76 a 78.

Podľa druhého preferovaného aspektu predloženého vynálezu je poskytnutá anti-IL-5 protilátková molekula, majúca afinitu pre ľudský IL-5 antigén, obsahujúci kompozitný ľahký reťazec a komplementárny ťažký reťazec, kde uvedený kompozitný ľahký reťazec má variabilnú doménu, obsahujúcu prevažne zvyšky rámčeka ľahkého reťazca protilátkového akceptora a väzobné zvyšky pre ľahký reťazec antigénu donor protilátky, kde uvedená donor protilátka má afinitu pre ľudský IL-5, pričom uvedený kompozitný ľahký reťazec obsahuje donor zvyšky aspoň v polohách 24 až 34, 50 až 56 a 69 až 97 (podľa Kabatovho systému číslovania).

Výhodne rámček kompozitného ľahkého reťazca ďalej obsahuje donor zvyšky v polohách 22, 68 a 71 alebo v polohách 68 a 71.

Podľa tretieho preferovaného aspektu predloženého vynálezu je poskytnutá anti-IL-5 protilátková molekula, majúca afinitu pre ľudský IL-5 antigén, obsahujúca kompozitný ťažký reťazec podľa prvého aspektu vynálezu a kompozitný ľahký reťazec podľa druhého aspektu vynálezu.

Výhodne každá RAM podľa vynálezu má afinitnú konštantu pre ľudský IL-5 väčšiu ako 10'⁹M.

Bude zrejmé, že vynález je v širokom rozsahu použiteľný na produkciu anti-IL-5 RAM všeobecne. Donorová látka tak môže byť akákoľvek anti-IL-5 protilátka získaná z akéhokoľvek zvieraťa. Akceptorová protilátka môže byť získaná zo zvieraťa rovnakých druhov a môže to byť i rovnaká trieda alebo podtrieda protilátky. Bežnejšie však sú donorové a akceptorové protilátky získané zo zvierat iných druhov. Typicky donorová anti-IL-5 protilátka je neľudská protilátka, ako je hlodavčia MAb, a akceptorovou protilátkou je ľudská protilátka.

Akákoľvek vhodná rámčeková sekvencia sa môže použiť, pokiaľ ide o triedu alebo typ donorovej protilátky, z ktorej sú antigén viažuce regióny získané. Výhodne typ použitého akceptorového rámčeka je rovnakej alebo podobnej triedy alebo typu ako donorová protilátka. Výhodne má zvolený rámček najvyššiu homológiu k donorovej protilátke. Výhodne sa použijú rámčeky ľudskej skupiny III gama zárodočnej línie pre kompozit ťažkého reťazca a rámčeky ľudskej skupiny I kappa zárodočnej línie sa použijú pre kompozitné ľahké reťazce.

Konštantné regiónové domény RAM podľa vynálezu môžu byť zvolené s ohľadom na navrhnuté funkcie protilátky, hlavne efektorové funkcie, ktoré sa môžu vyžadovať. Napríklad konštantné regiónové domény môžu byť ľudské IdA, IgE, IgG alebo IgM domény. Hlavne sa môžu použiť IgG ľudské konštantné regiónové domény najmä izotypu

IgGl a IgG3, ak je humanizovaná protilátka zamýšľaná na terapeutické použitie a vyžadujú sa protilátkové efektorové funkcie. Alternatívne môžu byť použité IgG2 a IgG4 izotypy, ak je humanizovaná protilátková molekula zamýšľaná na terapeutické účely a nevyžadujú sa protilátkové efektorové funkcie, napr. špecifická väzba a neutralizácia biologickej aktivity ľudského IL-5. Môžu sa tiež použiť modifikované ľudské konštantné regiónové domény, v ktorých jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov bolo zamenených alebo deletovaných kvôli zmene určitej efektorovej funkcie. Výhodne sú konštantné regiónové domény RAM ľudskej IgG4.

Označenie zvyškov uvedené skôr a inde v predloženej prihláške sú vykonané podľa číslovania Kabata (Kabat a spol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, diel I, 5. vydanie, 1991, US Department of Health and Human Service, National Inštitúte of Health). Označenie zvyškov tak vždy nezodpovedá priamo lineárnemu číslovaniu aminokyselinových zvyškov. Aktuálne lineárne aminokyselinové sekvencie môžu obsahovať menej alebo ďalšie aminokyseliny ako v Kabátovom číslovaní, zodpovedajúce skráteniu alebo inzercii do základnej variabilnej doménovej štruktúry.

Tiež anti-L-5 protilátkové molekuly podľa predloženého vynálezu môžu byť pripojené k efektorovým alebo reportérovým molekulám. Alternatívne môžu byť použité postupy technológie rekombinantnej DNA na produkciu imunoglobulínových molekúl, v ktorých Fc fragment alebo CH3 doména kompletného imunoglobulínu boli nahradené, alebo boli k nemu pripojené peptidovou väzbou, funkčný neimunoglobulínový proteín, ako je enzým, cytokín, rastový faktor alebo toxínová molekula.

Preto zvyšok protilátkových molekúl nevyhnutne nemusí obsahovať iba sekvencie z imunoglobulínov. Napríklad môže byť konštruovaný gén, v ktorom DNA sekvencia kódujúca časť ľudského imunoglobulínového reťazca je fuzovaná k DNA sekvencii, kódujúcej aminokyselinovú sekvenciu molekuly polypeptidového efektora alebo reportéra.

Ďalšie aspekty vynálezu zahrnujú DNA sekvencie, kódujúce kompozitný ťažký reťazec a kompozitný ľahký reťazec. Klonovacie a expresné vektory, obsahujúce DNA sekvencie, hostiteľské bunky transformované s DNA sekvenciami a spôsoby produkcie molekúl protilátok, obsahujúcich DNA sekvencie v transformovaných hostiteľských bunkách, sú tiež ďalšie aspekty vynálezu.

Všeobecne metódy, ktorými môžu byť vektory konštruované, transfekčné metódy a kultivačné metódy sú dobre v odbore známe a netvoria časť vynálezu.

DNA sekvencie, ktoré kódujú anti-IL-5 donor aminokyselinovej sekvencie, môžu byť získané metódami dobre známymi v odbore (pozri napríklad medzinárodnú patentovú prihlášku č. WO 93/16184). Napríklad anti-IL-5 kódujúce sekvencie môžu byť získané genomickým klonovaním alebo cDNA klonovaním z vhodných hybridómových línií, napr. bunkovej línie 39D1O. Pozitívne klony môžu byť screenované s použitím vhodných sond na požadovane ťažké a ľahké reťazce. Tiež sa môže použiť PCR klonovanie.

DNA, kódujúca akceptorové aminokyselinové sekvencie, môže byť získaná akýmkoľvek vhodným spôsobom. Napríklad DNA sekvencie, kódujúce preferované ľudské akceptorové rámčeky, ako je ľudská skupina I ľahkých reťazcov a ľudská skupina III ťažkých reťazcov, sú v širokom rozsahu dostupné pracovníkom v odbore.

Na prípravu požadovaných DNA sekvencii sa môžu použiť štandardné techniky molekulárnej biológie. Sekvencie môžu byť syntetizované kompletne alebo čiastočne s použitím techník oligonukleotidovej syntézy. Vhodné je použitie techniky miestne riadenej mutagenézy a polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Napríklad môže byť použitá oligonukleotidová riadená syntéza, ako opísal Jones a spol. (Náture 321, 522 (1986)). Tiež sa môže použiť oligonukleotidová riadená mutagenéza už existujúceho variabilného regiónu, ako je napríklad opísaná Verhoeynom a spol. (Science, 239, 1534 - 1536 (1988)). Tiež sa môže použiť enzymatické plnenie prelomených („gapped“) oligonukleotidov s použitím T4 DNA polymerázy, ako je napríklad opísané Queenom a spol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029 - 10033 (1989) a vo WO 90/07861).

Na expresiu DNA sekvencií kódujúcich RAM môžu byť použité akékoľvek vhodné hostiteľské bunkové a vektorové systémy. Výhodne sa používajú eukaryotické, napr. cicavčie hostiteľské bunkové expresné systémy. Najviac vhodné cicavčie bunky zahrnujú CHO bunky a myelómové alebo hybridómové bunkové línie.

Podľa ďalšieho aspektu predloženého vynálezu je poskytnutý spôsob produkcie anti-IL-5 RAM zahrnujúci:

a) produkciu prvého expresného vektora prvého operónu, majúceho DNA sekvenciu, ktorá kóduje kompozitný ťažký reťazec, ako je definovaný podľa prvého preferovaného aspektu vynálezu,

b) prípadne v prvom alebo druhom expresnom vektore produkciu druhého operónu, majúceho DNA sekvenciu, ktorá kóduje komplementárny ľahký reťazec, ktorým môže byť kompozitný ľahký reťazec, ako je definovaný podľa druhého preferovaného aspektu vynálezu,

c) transfekciu hostiteľskej bunky vektorom alebo každým vektorom a

d) kultiváciu transfektovanej bunkovej línie na produkciu RAM.

Alternatívne môže spôsob zahrnovať použitie sekvencií, kódujúcich kompozitný ľahký reťazec a komplementárny ťažký reťazec.

Na produkciu RAM, obsahujúcich tak ťažký, ako aj ľahký reťazec, môžu byť bunkové línie transfektované dvoma vektormi. Prvý vektor môže obsahovať operón, kódujúci kompozitný alebo komplementárny ťažký reťazec a druhý vektor môže obsahovať operón kódujúci komplementárny alebo kompozitný ľahký reťazec. Výhodne sú vektory' identické, pokiaľ sú kódujúce sekvencie a selektujúce markéry obsiahnuté tak, že umožňujú, ako je to len možné, že je rovnako exprimovaný každý polypeptidový reťazec. V preferovanej alternatíve sa môže použiť jediný vektor, vektor obsahujúci sekvencie kódujúce tak ťažký reťazec, ako aj ľahký reťazec.

DNA v kódujúcich sekvenciách pre ťažký a ľahký reťazce môže zahrnovať cDNA alebo genomickú DNA alebo obidve.

Predložený vynález tiež zahrnuje terapeutické a diagnostické kompozície obsahujúce RAM a použitie takýchto kompozícií v terapii a diagnóze.

V súlade s tým v ďalšom aspekte vynález poskytuje terapeutickú alebo diagnostickú kompozíciu obsahujúcu RAM podľa predchádzajúcich aspektov vynálezu v kombinácii s farmaceutický prijateľnou prísadou, riedidlom alebo nosičom.

Tieto kompozície môžu byť pripravené použitím RAM podľa predloženého vynálezu, napríklad ako celých protilátok, jednoreťazcových Fv fragmentov alebo protilátkových fragmentov, ako sú Fab alebo Fv fragmenty. Takéto kompozície majú IL-5 blokujúce alebo antagonistické účinky a môžu byť použité na potlačenie IL-5 aktivity.

Kompozície podľa vynálezu môžu byť formulované v súlade s bežnou praxou na podanie akýmkoľvek vhodným spôsobom a môžu všeobecne byť v kvapalnej forme (napr.

roztok RAM v sterilnom fyziologicky prijateľnom pufri) na podanie napríklad intravenóznym, intraperitoneálnym alebo intramuskulámym spôsobom, v sprejovej forme, napríklad na podanie nazálnym alebo bukálnym spôsobom, alebo vo forme vhodnej na implantáciu.

Vynález tiež poskytuje spôsob terapie alebo diagnózy, zahrnujúci podanie účinného množstva, výhodne 0,1 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti, RAM podľa predchádzajúcich aspektov vynálezu ľudskému alebo zvieracemu subjektu. Presná dávka a celková dávka sa budú meniť podľa zamýšľaného použitia RAM, veku a stavu liečeného pacienta. RAM môže byť podaná ako jediná dávka alebo kontinuálnym spôsobom po časový úsek. Dávky môžu byť podľa potreby opakované.

RAM podľa predchádzajúcich aspektov vynálezu môže byť použitá na akékoľvek terapeutické použitia, na ktoré boli použité alebo v budúcnosti budú použité anti-IL-5 protilátky, napr. 39D10.

IL-5 je primárny aktivátor eozinofilov a blokovanie funkcie týchto cytokínov s protilátkami bolo zistené ako brániace alebo redukujúce eozinofílii, ktorá je spojená s určitými alergickými chorobami. RAM podľa vynálezu tak môže byť použitá na tento účel a hlavne môže byť použitá na liečenie astmy, kedy je možné očakávať, že bude brániť akumulácii a aktivácii eozinofilov v astmatických pľúcach, a tým redukovať bronchiálny zápal a zúženie dýchacích ciest. Na použitie pri liečení astmy môže RAM podľa vynálezu byť výhodne jednoreťazcový Fv fragment formulovaný ako sprej, na podanie napríklad nazálnou cestou.

Preferovaný protokol na získanie anti-IL-5 protilátkovej molekuly v súlade s predloženým vynálezom je uvedený ďalej. Tento protokol je uvedený kvôli zovšeobecneniu vynálezu, ako je tu opísaný a definovaný.

30D10 krysia monoklonálna protilátka pôsobiaca proti ľudskému L-5 je použitá ako donor protilátka. Variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca 30D10 boli už prv klonované (WO 93/16184) a nukleotidové a predpovedané aminokyselinové sekvencie týchto domén sú uvedené na obr. 1 a 2. Vhodné variabilné domény akceptora ťažkého a ľahkého reťazca musia byť stanovené a musia byť známe aminokyselinové sekvencie. RAM je potom číslovaná tak, že vychádza zo základu akceptorovej sekvencie.

1. CDR

V prvom stupni sú donorové zvyšky nahradené za akceptorové zvyšky v CDR. Na tento účel sú CDR definované nasledovne: ťažký reťazec: CDR1: zvyšky 31-35

CDR2: zvyšky 50 - 65 CDR3: zvyšky 95- 102 ľahký reťazec: CDR1: zvyšky 24 - 34

CDR2: zvyšky 50 - 56 CDR3: zvyšky 89 - 97

Polohy, v ktorých sú donorové zvyšky substituované za akceptorové zvyšky v rámčeku, sú potom zvolené nasledovne, najprv s ohľadom na ťažký reťazec a následne s ohľadom na ľahký reťazec.

2. Ťažký reťazec

2.1. Donorové zvyšky sú použité buď vo všetkých polohách 24, 27 až 30, 37, 49, 73 , 76 a 78 alebo vo všetkých polohách 23, 24, 27 až 30, 37, 49, 73 a 76 až 78 ťažkého reťazca.

3. Ľahký reťazec

3.1. Donorové zvyšky sú použité buď vo všetkých polohách 22, 68 až 71 alebo vo všetkých polohách 68 a 71.

SK 282625 Β6

Predložený vynález sa týka rekombinantnej anti-IL-5 protilátkovej molekuly, majúcej väzobnú afinitu v podstate rovnakú, ako je afinita donorovej protilátky. Predložený vynález bude teraz opísaný pomocou príkladov s odkazmi na pripojené obrázky.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 predstavuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu 3 OD 10 ťažkého reťazca.

Obrázok 2 predstavuje nukleotidovú a aminokyselinovú sekvenciu 30D10 ľahkého reťazca.

Obrázok 3 predstavuje porovnanie regiónov rámčeka variabilnej domény ťažkého reťazca s regiónmi rámčeka ťažkého reťazca súhlasnej sekvencie ľudskej skupiny III ťažkých reťazcov.

Obrázok 4 predstavuje porovnanie regiónov rámčeka variabilnej domény ľahkého reťazca s regiónmi rámčeka ťažkého reťazca súhlasnej sekvencie ľudskej skupiny III ľahkých reťazcov.

Obrázok 5 predstavuje nukleotidovú a sekvenciu CDR naštepeného anti-IL-5 CTIL-5-gL6.

Obrázok 6 predstavuje nukleotidovú a sekvenciu CDR naštepeného anti-IL-5 aminokyselinovú ľahkého reťazca aminokyselinovú ťažkého reťazca

CTIL-5-10gH.

Obrázok 7 predstavuje mapu plazmidu pMR14.

Obrázok 8 predstavuje mapu plazmidu pMR15.1.

Obrázok 9 predstavuje afinitné konštanty a asociačné a disociačné rýchlosti chimémej 39D10 protilátky a CTIL-5-10gH/-gL6 protilátky.

Obrázok 10 predstavuje graf neutralizácie IL-5 v TF1 eseji panelom protilátok.

Obrázok 11 predstavuje výsledky kompetičnej eseje pre krysiu 39D10, chimému 39D10 protilátku a CTIL-5-10gH/gL6 protilátku.

Obrázok 12 predstavuje účinok CTIL-5-10gH/gL6 na opičiu eozinofíliu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

1. Materiál a metódy

39D10 je krysia monoklonálna protilátka pôsobiaca proti ľudskému 1L-5. Gény pre variabilné domény ťažkého a ľahkého reťazca 39D10 boli už prv klonované (WO 93/16184) a nukleotidové a predpovedané aminokyselinové sekvencie sú uvedené na obr. 1 a 2. Vďaka stratégii použitej pri klonovaní variabilnej domény 39D10 ťažkého reťazca nie je prvých päť aminokyselín rámčekových regiónov známych. Ale bol dostupný ťažký reťazec, ktoiý obsahuje leader sekvenciu a prvých päť aminokyselín rámčeka 1 z protilátky YTH 34.5HL, Riechmann a spol. (Náture, 332, 323 - 327 (1988)).

2. Molekulárne biologické postupy

Použili sa postupy molekulárnej biológie, ako opísal Maniatis a spol. (Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, 2. vydanie, zv. 1 až 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

3. Konštrukcia génov rekombinačného ťažkého a ľahkého reťazca

Ťažký reťazec

Vh región ťažkého reťazca bol generovaný PCR s použitím oligonukleotidov R3601 a R2155. Ich sekvencie sú:

U6oi s '«xccauu»;rTCcccccxccxTCMC(&,T)TeTcaTTAMicTccGnn3 K2155 S *CCJUSATGGacCCTTCCTTGlUXCTC(A,C) (Ä,G)GAGXC(G,T,A}GTGA3

Reakčná zmes (100 μΐ), obsahujúca 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl, 50 mM KC1, 0,01 hmotn./objem. želatíny, 0,25 mM každého deoxyribonukleozid trifosfátu, 0,1 pg 39D10 DNA ťažkého reťazca, 6 pmól R3601 a R2155 a 0,25 jednotiek Taq polymerázy. Reakčná zmes bola zahrievaná na 94 °C 5 minút a potom cyklovaná pri 94 °C 1 minútu, 1 min. pri 55 °C a 1 min. pri 72 °C. Po 30 cykloch bola reakčná zmes extrahovaná s rovnakým objemom fenol/chloroformu (1:1 obj./obj.), potom s chloroformom predtým, ako bola zrážaná prídavkom 2,5 objemu etanolu. PCR produkt bol rozpustený vo vhodnom pufri, očkovaný s HindlII a Apal, čistený na agarózovom géli a ligovaný do vektora pMR14 (obr. 7), ktorý potom bol tiež očkovaný s HindlII a Apal. Po transformácii do E. coli LM1035 rástli kolónie cez noc a plazmidová DNA bola analyzovaná na Vh inzerty. Nukleotidová sekvencia vH regiónu v plazmide, pARH1217 je uvedená na obr. 1.

Ľahký reťazec

Gén V1 ľahkého reťazca bol generovaný z pôvodného VI, ako je opísané vo WO 93/16184, klonu PCR s oligonukleotidmi R3585 aR3597. Ich sekvencie sú:

R3 58 5 5¹CGACTGTTCGAAGCCGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTS R3597 5^lCCATACACTTGGTGCJlGCATCCCTACCTTT3

PCR bola vykonaná, ako je opísané. PCR produkt bol štiepený enzýmami BstBI a Spil a po čistení ligovaný do pMR15.1 (obr. 8), ktorý už bol prv štiepený rovnakými enzýmami.

Boli identifikované kolónie, po transformácii E. coli LM1035, ktoré obsahujú plazmid (pARH1215) s VI inzertom. Nukleotidová sekvencia VI inzertu je uvedená na obr. 2.

CDR očkovanie 39D10

Kvôli zvoleniu najvhodnejších ľudských akceptorových rámčekov pre CDR slučky 39D10 boli aminokyselinové sekvencie rámčekov 1 - 3 39D10 porovnané so sekvenciami známych ľudských kapa ľahkých reťazcov. 39D10 sa pokladá za najviac homológny k ľudskej skupine I ľahkých reťazcov. Na tomto základe bolo rozhodnuté použiť rámčeky ľudskej skupiny I zárodočnej línie na CDR očkovanie. Homológie medzi sekvenciami sú uvedené na obr. 3. Uvedená je tiež homológia medzi rámčekom 4 regiónov 39D10 a súhlasná sekvencia známych ľahkých reťazcov ľudskej skupiny I. Zvyšky v 39D10, ktoré sa odlišujú od ľudskej súhlasnej sekvencie, sú podčiarknuté. Príspevok, ako by sa tieto zvyšky mohli podieľať na antigénovej väzbe, bol analyzovaný a dva gény boli konštruované pre CDR očkovaný ľahký reťazec. Boli to CTIL-5-gL5 a CTIL-5-gL6, v ktorých, ako i v CDR zvyškoch, buď zvyšky 22, 68 a 71 alebo zvyšky 68 a 71 boli tiež z 39D10. Nukleotidové a aminokyselinové sekvencie CTIL-5-gL6 sú uvedené na obr. 5.

Ťažký reťazec

CDR očkovanie 39D10 ťažkého reťazca bolo vykonané, ako je opísané pre ľahký reťazec. Rámčekové regióny

39D10 sa pokladajú za najviac homológne k regiónom ľudskej skupiny III protilátok, a následne súhlasná sekvencia rámčekov génov ľudskej skupiny III zárodočnej línie bola použitá na akceptovanie CDR 39D10 ťažkého reťazca. Ako prv bola tiež zvolená súhlasná sekvencia pre ľudskú skupinu III rámčeka 4 regiónov. Porovnanie týchto sekvencií je uvedené na obr. 4 s podčiarknutými zvyškami v 39D10, ktoré sa odlišujú od ľudskej súhlasnej sekvencie.

Vykonala sa analýza rámčekových zvyškov v 39D10, ktoré by mohli ovplyvniť antigénovú väzbu a boli konštruované dva gény, CTIL-5-9gH a CTIL-5-10gH, v ktorých buď zvyšky 23, 24, 27 až 30, 37, 49, 73 a 76 až 78 alebo zvyšky 24, 27 - 30, 37, 49, 73, 76 a 78 boli z 39D10. Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia CTIL-5-10gH je uvedená na obr. 6.

Expresia a bioaktivita anti-IL-5 protilátok

Chiméme (krysie/ľudské) a CDR očkovaný 39D10 boli vyrobené na biologické hodnotenie prechodnej expresie párov ťažkého a ľahkého reťazca po ko-transfekcii do buniek vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) s použitím zrážania fosforečnanom vápenatým.

Deň po ko-transfekcii boli polokonfluentné fľaše CHO-L761h buniek (Cockett a spol., Nucl. Acids. Res., 19, 319 - 325, 1991) trypzinizované, bunky boli spočítané a každá T75 fľaša bola naplnená J O⁷ bunkami. Ďalší deň bolo kultivačné médium vymenené 3 hodiny pred transfekciou. Na transfekciu bola pripravená zrazenina fosforečnanu vápenatého zmiešaním 1,25 ml 0,25M CaCl₂, obsahujúca 50 pg každého z expresných vektorov ťažkého a ľahkého reťazca s 1,25 ml 2 x HBS (16,36 g NaCl, 11,9 g HEPES a 0,4 g Na₂HPO₄ v 1 litri vody a pH upraveným na 7,1 pomocou NaOH) a ihneď pridané do média buniek. Po 3 hod. pri 37 °C v CO₂ inkubátore boli médium a zrazenina odstránené a bunky šokované prídavkom 15 ml 15 % glycerínu vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (PBS) 1 minútu. Glycerín bol odstránený, bunky boli raz premyté PBS a inkubované 48 - 96 hodín v 25 ml média, obsahujúceho 10 mM butyrátu sodného. Protilátka bola čistená z kultivačného média naviazaním na a eluáciou z proteín A - Sepharosy. Koncentrácia protilátky bola stanovená s použitím ľudského Ig ELISA (pozri ďalej).

ELISA

Expresia protilátky bola hodnotená transfekciou párov génov ťažkého a ľahkého reťazca a po troch dňoch inkubácie, meraním množstva protilátky nahromadenej v kultivačnom médiu pomocou ELISA.

Pre ELISA boli Nunc ELISA platne potiahnuté cez noc pri 4 °C F(ab')₂ fragmentom polyklonálnej kozej antiľudský Fc fragment špecifickej protilátky (Jackson Immunoresearch, kód 109-006-098) pri 5 pg/ml v poťahovacom pufŕi (15 mM uhličitan sodný, 35 mM hydrogenuhličitan sodný, pH 6,9). Nepotiahnutá protilátka bola odstránená premytím 5-krát destilovanou vodou. Vzorky a čistené štandardy na kvantifikáciu boli zriedené na približne 1 pg/ml v konjugátovom pufŕi (0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,1 M NaCl, 0,2 % obj./obj. Tween 20, 0,2 % hmotn./obj. Hammersten kazeínu). Vzorky' boli titrované v mikrotitračných jamkách v 2-násobnom zriedení kvôli poskytnutiu konečného objemu 0,1 ml v každej jamke a platne boli inkubované pri teplote miestnosti 1 hodinu za trepania. Po prvom inkubačnom stupni boli platne premyté 10-krát destilovanou vodou a potom inkubované 1 hodinu ako prv s 0,1 ml myšou monoklonálnej antiľudskej kapa (kloň GD12) peroxidáza konjugovanej protilátky (The Binding Site, kód MP135) pri riedení 1 v 700 v konjugátovom pufŕi. Platne boli opäť premyté a do každej jamky bol pridaný substrátový roztok (0,1 ml). Substrátový roztok obsahuje 150 μΐ Ν,Ν,Ν,Ν-tetrametylbenzidínu (10 mg/ml v DMSO), 150 μΐ peroxidu vodíka (30 % roztok) v 10 ml 0,lM octanu sodného/citrátu sodného, pH 6,0. Platňa sa vyvíjala 5 až 10 minút, až absorbancia pri 630 nm bola približne 1,0 pre špičkový štandard. Absorbancia 630 nm bola meraná použitím platňovej čítačky a koncentrácia vzorky stanovená porovnaním titračných kriviek s krivkou štandardu.

Stanovenie afinitných konštánt pre anti-IL-5 protilátky

Afinity chimémych a CDR očkovaných anti-IL-5 protilátok boli stanovené s použitím Biospecifíc Interaction Analysis (BIA). Protilátky boli produkované v CHO bunkách transfekciou kombináciou génov ťažkého a ľahkého reťazca a čistené zo supematantov kultúry na Proteín A Sepharose. Na aflnitné meranie bola polyklonálna anti-ľudská Fc protilátka naviazaná k Pharmacia Biosensor chip (12150 relatívnej odozvovej jednotky, RU) a použité na zachytenie anti-IL-5, ktorý prešiel nad čipom pri 5 pg/ml v 10 mM HEPES, 0,15M NaCl, 3,4 mM EDTA, pH 7,4. Množstvo anti-IL-5 zachytené pre každý beh bolo približne 1600 RU. Rekombinantný ľudský IL-5 potom prešiel cez Sensorchip v rôznych koncentráciách (0,6 až 5 pg/ml) v uvedenom pufŕi. Sensorchip bol čistený po každom behu pomocou 100 mM HC1 a 100 mM kyseliny ortofosforečnej kvôli odstráneniu naviazaného IL-5 a protilátky. Generované sensogramy boli analyzované s použitím kinetického softvéru dostupného s prístrojom BIAcore.

Boli stanovené hodnoty pre afinitné konštanty a asociačné a disociačné rýchlosti dvoch protilátok, chimémej 39D10 a CTIL-5-10gH/-gL6. Výsledky sú uvedené na obr. 9. Je možné vidieť, že chiméma 39D10 má vysokú afinitu pre ľudský IL-5 a že táto hodnota bola reprodukovaná v CTIL-5-10gH/-gL6.

Aktivita anti-IL-5 protilátok v in vitro bioeseji

Aktivity rôznych CDR očkovaných protilátok boli porovnané s aktivitami chimémej 39D10 v in vitro bioeseji s použitím TF1 buniek. TF1 je erytroleukemická bunková línia, ktorá sa vyžaduje pre rast GM-CSF. GM-CSF môže byť nahradený IL-5, ale v tomto prípade bunky iba prežívajú a nemnožia sa. Ale závislosť od IL-5 na prežitie znamená, že TF1 bunky môžu byť použité v bioeseji kvôli porovnaniu aktivít rôznych anti-IL-5 protilátok.

Neutralizácia anti-IL-5 protilátkami bola meraná s použitím konštantného množstva IL-5 (2 ng/ml) a premenných množstva protilátky inkubovanej s 5 x 10⁴ bunkami na jamku v 96 jamkových platniach s plochým dnom 3 dni. Počas posledných 4 hodín sú bunky kultivované za prítomnosti Thiazolyl blue (MIT). Toto farbivo sa konvertuje na nerozpustnú purpurovú formu mitochondriálnymi enzýmami v životaschopných bunkách. Nerozpustný materiál bol rozpustený inkubáciou cez noc po prídavku 100 μΐ 50 % dimetylformamidu, 20 % SDS pH 4,7 a množstva prijatého farbiva stanoveného spektrofotometricky. Hodnota bioaktívneho IL-5 zostávajúceho za prítomnosti protilátok sa extrapoluje zo štandardnej krivky, vyjadrujúcej príjem farbiva ku koncentrácii IL-5 koncentrácie.

Aktivity rôznej kombinácie ťažkého a ľahkého reťazca boli hodnotené s použitím TF1 bioeseje. Výsledky sú uvedené na obr. 10. Je možné vidieť, že všetky kombinácie CDR očkovaného ťažkého a ľahkého reťazca produkujú protilátky, ktoré sú ekvipotentné s chimémym 39D10. Tieto výsledky indikujú, že ani zvyšok 22 v ľahkom reťazci ani zvyšky 23 alebo 78 v ťažkom reťazci sa nevyžadujú, aby 39D10 bol špecifický pre optimálne viazanie. Kombiná cia s menej 39D10 špecifickými zvyškami je preto CTIL-5-10gH/-gL6.

Aktivita anti-IL-5 protilátok v kompetičných esejach

Rekombinantný ľudský IL-5 bol riedený na 1 pg/ml vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (PBS) a 100 μΐ podiely boli pridané na mikrotitračné platne (Costar Amine Binding plates) a inkubované cez noc pri 4 °C. Platne boli premyté trikrát s PBS, obsahujúcim 0,5 % Tweenu 20 a akékoľvek zvyšné aktívne miesta blokované s 2 % hovädzieho sérového albumínu (BSA) v PBS počas 30 minút. Platne boli potom odsaté a vyklepané do sucha. Kvôli porovnaniu relatívnej väzobnej aktivity rodičovskej krysej protilátky (39D10) s chimémou a očkovanou protilátkou boli pripravené postupné riedenia každej anti-IL-5 protilátky v PBS/1 % BSA a 50 μΐ bolo pridaných k duplicitným jamkám a ihneď nasledované 50 μΐ 39D10-biotín konjugátu pri 0,125 pg/ml. Esej bola inkubovaná 2 hodiny pri teplote miestnosti za miešania a potom dvakrát premytá PBS. Do všetkých jamôk bola pridaná chrenová peroxidáza konjugovaná k streptavidínu (1 pg/ml) a inkubovaná ďalších 30 minút. Platne boli štyrikrát premyté a bolo pridaných 100 μΐ tetrametylbenzidínového (TMB) substrátu. Vývoj farby bol odpočítaný pri 630 nm (referenčných 490 nm) a OD (630 - 490) bola vynesená proti log (10) koncentrácie protilátky.

Pri porovnaní aktivít krysieho 39D10, chimémeho 39D10 a CTIL-5-10gH/gL6 v uvedenej kompetičnej eseji, boli získané výsledky uvedené na obr. 11. Všetky tri protilátky súťažia rovnako dobre s biotinylatovaným-39Dl kvôli naviazaniu k IL-5, čo indikuje, že CDR slučky 39D10 boli úspešne transferované do ľudských rámčekov.

Vplyv anti-IL-5 protilátky na opičiu eozinofíliu

Anti-IL-5 protilátka (CTIL-5-10gH/gL6) bola testovaná v opičom systéme, ktorý modeluje astmatické podmienky (pozri Mauser P. J. a spol., Ann. Rev. Respir. Dis., v tlači). Pri podaní jednu hodinu pred podnetom s Ascaris responzívnym opiciam inhibuje CTIL-5-10gH/gL6 pľúcny výplach eozinofilie zo 75 % v dávke 0,3 mg/kg i. v. Tento súbor opíc nie je hyperresponzívny k histamínu, takže účinky CTIL-5-10gH/gL6 na hyperresponzivitu nemohli byť stanovené. Tri mesiace po tejto jedinej dávke je akumulácia eozinofilu v odpovedi na podnet s Ascaris ešte inhibovaná zo 75 %.

U alergickej myši CTIL-5-10gH/gL6 inhibuje pľúcnu eozinofíliu pri 1 mg/kg i. p.

Zoznam sekvencií (1) Všeobecná informácia:

(i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: CELLTECH LIMITED (B) Ulica: 216 ΒΑΤΗ ROAD (C) Mesto: SLOUGH (D) Štát: BERKSHIRE (E) Krajina: Veľká Británia (F) Poštový kód (ZIP): SLI4EN (G) Telefón: 0753 534655 (H) Telefax: 0753 536632 (I) Telex: 848473 (ii) Názov vynálezu: Interleukín-5 špecifické rekombinantné protilátky (iii) Počet sekvencií: 28 (iv) Počítačovo čítacia forma:

(A) Typ média: Floppydisk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Pracovný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Softvér: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) Informácia o SEQ ID NO. 1:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 48 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 1:

GCGCGCAAGC TTGCCGCCAC CATGAAGATT

GTGGTTAAAC TGGGTTTT 4 (2) Informácia o SEQ ID NO. 2:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 41 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 2:

GCAGATGGGC CCTTCGTTGA GGCTGACAGG

AGACGTAGTG A 41 (2) Informácia o SEQ ID NO. 3:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 44 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 3:

GGACTGTTCG AAGCCGCCAC CATGAGTGTG

CTCACTCAGG TCCT 44 (2) Informácia o SEQ ID NO. 4:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 4:

GGATACAGTT GGTGCAGCAT CCGTAGGTTT 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 5:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 333 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 1..333 (xi) Opis sekvencie: SEQID NO. 5:

*TC CCT CTC CCC ACT CM CTC CTC QCC TTC

Het Mi v<l Pro Thr Cln L«uciy

S10

GAT GCC ATA TCT CAC ATC CAC ATC ACACAG

A«p XI* II· Cy« Αίρ II· Cln Het ThrGin

2025

GCA TCT CTC CCA CAA ACT ATC TCC ATC CAA

Α1» Sir ta Gly Clu Tbc II· 11«Clu

3540

ATT TCC ACT TAT TTA CCG TOC TAT CAC CAO

II· Ser Ser Tyr Leu Alt Trp Tyr Cln Cln

SO55

CAC CTC CTC ATC TAT CCT CCA ΛΑΤ ACC TTC

Cln teu ta íle Tyr Gly Ale Aen β·Γ teu

6570

CCC TTC ACT GCC ACT CCA TCT CCC ACA CAA

Arq Ph· S*r CLy Ser Gly Ser Kla Thr Cln

8590

ACC ATC CAA CCT CAA CAT CAA CCC GATTAT

Set tt«t Gin Tra GLu Aap Gin Gly AapTy r

100105

AAC TTT CCC AAC ACC TTT CCA CCT CGGACC ty· Ph· Pro Aen Thr Ph· Gly Kla Oly Thr

11$ 120 ττα ttc crc tcc att aca<e

Leu Ĺ«ii Leu Trp XI· Thr

TCT CCA CCT TCC CTC TCT9«

Ser Pro Kla Ser L«u S«r

TCT CTA CCA ACT CAC GCC1(4

Cy· Lau Ala Sar Glu Gly

AAC CCA OCO AAA TCT CCT192 ty· Pro Gly ty· tce Pro

M

CAA ACT CCG CTC CCA TCA240

Gla Ihr Gly Val Pro Sar

7500

TAT TCT CTC AAC ATC AGC288

Tyr Ser Leu ty· T La Ser

TTC TCT CAA CAC ACT TAC33«

Pba Cya GLn Gin S«r Tyr

110

AAC CTG CAA CTC AAA CGG384

Lya Leu Glu L·· Lya Arg

125 (2) Informácia o SEQ ID NO. 8:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 128 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 8:

(2) Informácia o SEQ ID NO. 6:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 111 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia. lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 6:

Clu

Ser

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

1

5

10

15

cya

Thr

Val

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Aen

Ser

Val

Aen

Trp

Xle

20

25

30

Arg

Cln

Pro

Gly

Ly.

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Leu

11»

Trp

Ser

3S

40

45

Asn

Gly

Λ·ρ

Thr

Asp

Tyr

Am

Ser

Ala

íle

Lya

Ser

Arg

Leu

Ser

íle

so

55

60

Ser

Arg

Aap

Thr

Ser

Ly·

Ser

Gin

Val

Phe

Leu

Ly·

Met

Α·η

Ser

Leu

65

70

7S

80

Gin

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Het

Tyr

Phe

Cy·

Ala

Arg

Glu

Tyr

Gly

85

90

95

Ty r

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

val

Met

Val

Thr

Val

Ser

100 10$ 110 (2) Informácia o SEQ ID NO. 7:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 384 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Meno/kľúČ: CDS (B) Lokácia: 1..384 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 7:

Het

Ala

Val

Pro

Thr

GLn

Leu

CLy

Leu

Trp

íle

Thr

1

5

10

15

ASp

Ala

íle

cys

Aep

íle

GLn

Met

Thr

GLn

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ser

20

25

30

Ala

ser

Leu

Gly

Glu

Thr

íle

Ser

íle

Glu

cy·

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

35

40

45

íle

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lye

Pro

Gly

Lya

Ser

Pro

50

55

60

Gin

Leu

íle

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

65

70

75

eo

Arg

Phe

Ser

Gly

ser

Gly

ser

Ala

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Ly·

íle

Ser

85

90

95

Ser

Met

Gin

Pro

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Gin

Ser

Tyr

100

105

110

Lys

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Ly·

Leu

Glu

Leu

Ly·

Arg

115

120

125

(2) Informácia o SEQ ID NO. 9:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 9:

Asp lle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ite Thr Cys (2) Informácia o SEQ ID NO. 10:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 23 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 10:

Asp lle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Thr lle Ser lle Glu Cys 20 (2) Informácia o SEQ ID NO. 11:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 15 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 11:

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu le Tyr 15 10 15 (2) Informácia o SEQ ID NO. 12:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 15 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 12:

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr 15 10 15 (2) Informácia o SEQ ID NO. 13:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 13:

Gly V» Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15

Leu Thr lle Ser Sec Leu Gin Pro Gu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 14:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 14:

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gin Tyr Ser 1 5 10 15

Leu Lys I le Ser Ser Met Gin Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys 20 25 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 15:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 15:

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lle Lys Arg 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 16:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 16:

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 17:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 30 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 17:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vsí Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 18:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 25 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 18:

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr 15 10 15

Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr

25 (2) Informácia o SEQ ID NO. 19:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 14 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 19:

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 20:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 14 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQID NO. 20:

Trpíte Arg Gin Pre Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 21:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 21:

Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ty r Leu Gin 15 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ale Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 22:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 32 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 22:

Arg Leu Ser lle Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu Lys 15 10 15

Met Asn Ser Leu Gin Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala Arg 20 25 30 (2) Informácia o SEQ ID NO. 23:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 23:

Tip Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 24:

(1) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 24:

Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO. 25:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 399 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 1..399 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 25:

TTC GAA GCC GCC ACC ATG TCT GTC CCC MX CAA GTC CTC GGT CTC CTS4B ?h« Clu M* Ala Thr Kat Ser Val Pro Thr Gin Val Leu Cly LeuLeu

S 1015

CTO CTC TCC CTT ACA GAT CCC AGA TCT GAG ATT CAA ATG ACC CAG AGC96

Leu Leu Trp La U Thr lep Ala Arg Cya A«p íle Čln Hat thr C InSer

2530

CCA TCC ACC CTC ACC CCA TCT CTA CCA CAC CCC CTC ACC ATC ACA TCT14«

Prn Ser Sar Leu Ser Ala Ser Val Cly Atep Arg Val Thr II· ThrCya

4045

CTA CCA AGT CAC CCC ATC TCC ACT TAC TT* CCC TCC TAC CAC CAC AAC192

Leu Ala sax βία cly ii· ser ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Cla GinLya

SS60

CCC GGC AAA CCT CCT AAC CTC CTC ATC TAT CCT CCC AAt ACC TTC CAC240 rro Gly Lya Ala fro Lya Leu Leu íle Tyr Cly Ala Asn $er LeuGin ⁶⁵ 70 7$80

ACT CCA CTA CCA TCA ACA TTC ACT CCC TCA CCA TCC CCT ACA CAC TAC2Θ8

Thr Gly Val Pre Ser Arg Phe Sar Gly Ser Gly Ser AL* Thr AapTyr

8$ go»5

ACG CTC ACC ATC TCC AGC CTA CAC CCT CAA GAT TTC CCA ACC TAT TAC336

Thr Ltu Thr lle ser ser Leu Gin Pro clu A«p Phe AU Thr TyrTyr loo íasne

TCT CAA CAC TCG TAT AAC TTC CCG AAC ACA TTC GG? CAA GGC ACC AAG384

Cya Gin Cln Ser Tyr ty* pne Pro Asn Thr Pha cly eia Gly ThrLya

11S 120na

GTC GAA GTC AAA CGT399

Val Glu Val Lya Arg

1JC (2) Informácia o SEQ ID NO. 26:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 133 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 26:

Phe

Clu

Ala

Al*

Thr

Met

Ser

Val

Pro

Thr

Cln

Val

Leu <

Cly

Leu

L

S

10

xs

Leu

Trp

Leu

Thr

Asp

Al*

Arg

Cys

Asp

íle

Cln

Met '

Thr 1

Gin

ser

20

25

30

pro

Ser

Ser 35

Leu

Ser

Ml

Ser

Val 40

Cly

Asp

Arg

Val

Thr 45-

íle

Thr

Cys

Leu

Ale 50

Ser

Clu

Cly

íle

Ser $5

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp 60

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lya

Ale

Pro

Lys

Leu

íle

Tyr

Cly

Al*

Asn

Ser

Leu

Cln

65

70

7S

60

Thr

Cly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

ser

Cly

Ser

Ala

Thr

Asn

Tyr

es

90

95

Thr

Leu

Thr

íle

Ser

Leu

Cln

Pro

Glu

Aep

Phe

Ala

Thr

Tyr

100

10S

110

Cys

Gin

Gin 115

Ser

Tyr

Lya

Phe

Pro 120

Aan

Thr

Phe

Cly

Cln 12S

Cly

Thr

Lys

Val Clu Val Lys Are

130 (2) Informácia o SEQ ID NO. 27:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 420 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jediný (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Meno/kľúč: CDS (B) Lokácia: 1..420 (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 27:

AAC CTT ccc ccc

ACC ATG CCC TCC ACC TCT ATC ATC CTC TTC TTA CTA

Ly. 1

Lau Al·

Al*

Thr S

Met Cly

Trp

ser Cya íle íle Leu Phe Leu

v*i

10

15

CCA

ACA

CCT

ACA

CCT

CTC

CAC

TCC

CAC

CTC

CAA

CTC

CTA

CAA

TCT

CCA

Al*

Thr

Al*

Thr

Cly

V«1

Hla

Ser

Clu

v*l

Gin

Leu

Val

clu

Ser

Cly

20

25

30

CGT

CCT

crc

CTX

CAC

CCA

TCT

CTC

CSA

CTG

ACT

TCC

ccc

CTC

Cky

Cly

L«u

Val

Gin

Pro

Cly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cya

Al*

Val

35

40

45

TCT

GGG

TTA

TCA

TTA

ACT

AAT

ACT

CTC

AAC

TCC

ATA

CCC

CAA

CCA

Ser

Cly

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Aan

Ser

v*i

Aan

Trp

Zle

Arg

CLn

Al*

50

SS

60

CCT

CCC

AAC

GCT

CTC

CAC

TCC

CTT

CCA

CTA

ATA

TCC

ACT

AAT

CCA

CAC

Pro

Cly

Ly»

Cly

Leu

Clu

Trp

V*1

Cly

Leu

11«

Trp

Ser

Aaa

Cly

Aap

6S

70

75

80

ACA

CAT

TKT

AAT

TCA

CCT

ATC

AAA

TCT

CCA

TTC

ACA

ATC

TCT

ACA

CAC

Thr

Aap

Tyr

A*n

Ser

M*

11«

Lya

Sec

ΛΓψ

rne

Thr

íle

ser

Are

Aap

85

90

95

ACT

TCC

AAG

ACC

CTA

TAC

CTC

CAC

ATC

AAC

ACT

CTG

ACA

CCT

CAA

Thr

ser

Lye

Ser

Thr

V*1

Tyr

Leu

cín

Het

Aan

Ser

Leu

Arg

AL*

Clu

1OO

105

110

GAT

ACT

CCA

CTC

TAC

TGT

CCT

CAC

TAC

ΤΑΓ

CCA

TAT

TTC

GAC

A»p

Thr

Al*

Val

Tyr

Cya

Al*

Arg

Clu

Tyr

Cly Tyr

Phe

Aap

115

120

12S

TAT

TCC

CCT

CAA

CGT

ACC

CTA

CTC

ACA

CTC

TCC

TCA

Tyr

Trp

Cly

Gin

Cly

Thr

Leu

Val

Thr. Val

Ser

130

135

140

»6

144

192

240

2B8

33«

384

420 (2) Informácia o SEQ ID NO. 28:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 140 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO. 28:

Lys

Leu

Ala

Thr

Het

Cly

Trp

Ser

Cys

11·

Zle

Lau

Phe

Leu

Val

1

S

10

1S

Ala

Thr

Ala

Thr

Cly

Val

Hla

ser

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Cly

20

2S

30

Gly

Leu

Val

Glň

Pro

Gly

ser

Leu

Arg

Lea

s«r

cye

Ala

val

35

40

45

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Aan

Ser

Val

Aan

Trp

íle

Arg

Gin

Ale

so

55

60

Pro

Gly

Lye

Gly

Leu

Clu

Trp

Val

Gly

Leu

Zle

Trp

Ser

Aen

Gly

Aap

65

70

7S

80

Thr

Alp

Tyr

Aan

Ser

Ala

íle

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

Íle

Ser

Arg

Aap

8$

90

95

Thr

Ser

Ly.

Ser

Thr

val

Tyr

Leu

Gin

Met

Aan

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

100

105

110

Aap

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

Arg

Clu

Tyr

cly

Tyr

Phe

Aap

lis

120

12S

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

130

135

140

5. Anti-IL-5 protilátková molekula majúca afinitu na ľudský IL-5, obsahujúca kompozitný ťažký reťazec podľa nároku 1 alebo 2 a kompozitný ľahký reťazec podľa nároku 3 alebo 4.

6. Protilátková molekula podľa niektorého z nárokov 1 až 5, kde akceptorové zvyšky pre kompozitný ťažký reťazec sú zvyšky ťažkého reťazca ľudskej skupiny III a akceptorové zvyšky pre kompozitný ľahký reťazec sú zvyšky ľahkého reťazca ľudskej skupiny I.

7. Rekombinantná protilátková molekula majúca afinitu pre ľudský IL-5 antigén, obsahujúca variabilný región ťažkého reťazca znázornený na obr. 6 <SEQ ID 28> a variabilný región ľahkého reťazca znázornený na obr. 5 <SEQ ID 26>.

8. DNA sekvencia, ktorá kóduje kompozitný ťažký reťazec a/alebo kompozitný ľahký reťazec protilátky podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov.

9. Terapeutická alebo diagnostická kompozícia obsahujúca protilátkovú molekulu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom, rozpúšťadlom alebo excipientom.

10. Protilátková molekula podľa niektorého z nárokov 1 až 7 na použitie v terapii alebo diagnostike.

11. Použitie účinného množstva protilátkovej molekuly podľa niektorého z nárokov 1 až 7 na výrobu liečiva na podanie ľudskému alebo zvieraciemu subjektu na terapiu alebo diagnostiku.

výkresov

Claims

1. Rekombinantná protilátková molekula obsahujúca kompozitný ťažký reťazec a ľahký reťazec, majúca afinitu pre ľudský IL-5 antigén, kde variabilná doména uvedeného kompozitného ťažkého reťazca obsahuje väčšinou zvyšky rámca ťažkého reťazca protilátkového akceptora, variabilná doména obsahuje donorové zvyšky z ťažkého reťazca krysej monoklonálnej protilátky 39D10 na zvyškoch 31-35, 50-65 a 95-102 a rámčekových zvyškoch 24, 27-30, 37, 49, 73,76 a 78.

2. Rekombinantná protilátková molekula podľa nároku 1, ďalej obsahujúca donorové zvyšky z krysej monoklonálnej protilátky 39D10 na rámčekových zvyškoch 23 a 77.

3. Rekombinantná protilátková molekula obsahujúca ťažký reťazec a kompozitný ľahký reťazec, majúca afinitu pre ľudský IL-5 antigén, kde variabilná doména uvedeného kompozitného ľahkého reťazca obsahuje prevažne zvyšky rámca ľahkého reťazca protilátkového akceptora, variabilná doména obsahuje donorové zvyšky z ľahkého reťazca krysej monoklonálnej protilátky 39D10 na zvyškoch 24-34, 50-66 a 89-97 a na rámčekových zvyškoch 68 a 71.

4. Rekombinantná protilátková molekula podľa nároku 3, ďalej obsahuje donorové zvyšky z krysej monoklonálnej protilátky 39D10 na zvyšku 22.

Obx- . 1

GAA TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCA TCA CAG ACC CTG TCT CTC E S G G G L V Q P S Q T L S L> ACC TGC ACT GTC TCT GGG TTA TCA TTA ACC AGC AAT AGT GTG AAC T C T V s G L S L T S N S V N> TGG ATT CGG CAG CCT CCA GGA AAG GGT CTG GAG TGG ATG GGA CTA W I R Q P P G K G L E W M G L> ATA TGG AGT AAT GGA GAC ACA GAT TAT AAT TCA GCT ATC AAA TCC I W S N G D T D Y N S A I K s> CGA CTG AGC ATC AGT AGG GAC ACC TCG AAG AGC CAG GTT TTC TTA R L S I S R D T S K S Q V F L AAG ATG AAC AGT CTG CAA AGT GAA GAC ACA GCC ATG TAC TTC TGT K M N S L Q S E D T A M Y F O GCC AGA GAG TAC TAC GGC TAC : ttt GAT ' TAC : TGG GGC ! CAA GGA . GTC A R E Y Y G Y F D Y W G Q G V

ATG GTC ACA GTC TCC TCA M V T v s S>

ATG GCT GTG CCC ACT CAG CTC CTG GGG TTG TTG TTG CTG TGG ATT H A V P T Q L L G L L L L W I> ACA GAT GCC ATA TGT GAC ATC CAG ATG ACA CAG TCT CCA < GCT TCC 10 T D A I C D I Q H T Q s P A s> CTG TCT GCA TCT CTG GGA GAA ACT ATC TCC ATC GAA TGT CTA GCA L S A s· L G £ T I s I E C L A> 15 AGT GAG GGC ATT TCC AGT TAT TTA GCG TGG TAT CAG CAG AAG CCA S E G I s S Y L A W Y Q Q K P> GGG AAA TCT CCT CAG CTC CTG ATC TAT GGT GCA AAT AGC TTG CAA G K S P Q L L I Y G A N S L Q> 20 ACT GGG GTC CCA TCA CGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GCC ACA CAA T G V P S R F S G S G S A T Q TAT TCT CTC AAG ATC AGC : AGG 1 ATG CAA CCT GAA GAT ¹ GAA z·***· WkXkf GAT 25 Y S L K I S S M Q P E D E G D> TAT ’ TTC : tgt ¹ CAA CAG AGT TAC AAG TTT CCG AAC ACG TTT GGA GCT Y F c Q Q S Y K F P N T F G A>

3 0 GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA CGG G T K L E L K R>

rámček 1

10 1 1112 2 9 5 7890 2 hu gpl 39D10 DIQMIQSPSSLSASVGDHVTITC DIOMTOSPASLSASLGETTSIEC rámček 2 4 4 15 3 5 hu gpl WYQQKPGKAPKLLIY 39D10 WYQQKPGKSPQLLIY 20 rámček 3 6 777 7 7 888 8 8 012 4 8 345 7 hu gpl GVPSPTSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 39dl0 GVPSRFSGSGSATOYSĽKISSMOPEDEGDYFC 25 rámček 4 1 11 0 0 0 30 0 4 6 hu gpl FGQGTKVEIKR 39D10 FGAGTKLEĽKR

Obr . 4 rámček 1 111 1 2 22 2223 567 9 1 34 7890 hu gp3 39D10 EVQLVESGGGLVQPGGSĽKLSCAASGFTFS ? ??? 7ESGGGLVOPSOTLSLTCTVSGLSLT

rámček 2

3 444

7 089 hu gp3 WVRQAPGKGLEWVS 39D10 WTRQPPGKGLEWMG rámček 3

66 7 7777 8 8889

78 3 6789 1 3491 hu gp3 RFTISRDKSKNTLYLQMNSIiRAEDTAVYYCAR

39D10 rlsisrdtsksovfi^mnslosedt?kyfcak rámček 4 hu gp3 WGQGTLVTVSS

39D10 WGQGVMVTVSS

TTCCAAGCCGCCA.CC ATG TCT GTC CCC ACC CAA GTC CTC GGT CTC CTG M s V P T Q V L G L L> CTG CTG TGG CTT ACA GAT GCC AGA TGT GAC ATT CAA ATG ACC CAG L L M L T D A R C D I Q M T Q> AGC CCA TCC AGC CTG AGC GCA TCT GTA GGA GAC CGG GTC ACC ATC S P S S L S A S V G D R V T I> ACA TGT CTA GCA AGT GAG GGC ATC TCC AGT TAC TTA GCG TGG TAC T C L A S E G I S S Y L A W Y> CAG CAG AAG CCC GGG AAA GCT CCT AAG CTC CTG ATC TAT GGT GCG Q Q K P G K A P K L L L Y G A> AAT AGC TTG CAG ACT GGA GTA CCA TCA AGA TTC AGT GGC TCA GGA N S L Q T G V P S R F S G S G> TCC GCT ACA GAC TAC ACG CTC ACG ATC.TCC AGC CTA CAG CCT GAA S A T D Y T L T I S S L Q P E> GAT TTC GCA ACG TAT TAC TGT CAA CAG TCG i TAT ¹ AAG ί TTC CCG AAC D F A T Y Y C Q Q S Y K F P N>

ACA TTC GGT CAA GGC ACC AAG GTC GAA GTC AAA CGT T F G Q G T K V E V K R>

Obr . (5

AAGCTTGCCGCCACC ATG GGC TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTA GTA M G W S C I I L F L V> GCA ACA ' GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG GTC CAA CTG GTA GAA TCT 10 A T A T G V H s E V Q L V E s> GGA GGT GGT CTC GTA CAG CCA GGA GGA TCT CTG CGA CTG AGT TGC G G G L V Q P G G s L R L S O 15 GCC GTC TCT GGG TTA TCA TTA ACT AGT AAT AGT GTG AAC TGG ATA A V S G L S L T S N S V N W I> CGG CAA GCA CCT GGC AAG GGT CTC GAG TGG GTT GGA CTA ATA TGG R Q A P G K G L E W V G L I W> 20 AGT AAT GGA GAC ACA GAT TAT AAT TCA GCT ATC AAA TCT CGA TTC S N G D T D Y N S A I K S R F> ACA ATC TCT AGA GAC ACT TCG AAG AGC I ACC GTA . TAC : ctg 1 CAG ATG 25 T I S R D T S K S T V Y L Q M> AAC AGT CTG AGA . GCT GAA . GAT ACT GCA GTC TAC TAC TGT GCT CGT K S L R A E D T A V Y Y C A R> 30 GAG TAC : TAT GGA TAT TTC GAC TAT TGG GGT CAA GGT ACC CTA GTC E Y Y G Y F D Y W G Q G T L V>

ACA GTC TCC TCA

T V S S>

lgG4-CH3 -ι ľ SV40 polyA

SV40ori konštantný región

SV40E

Protilátka kd (X1O’^1OM)

Chimerická

39D10 1.14

0.63

CTIL-5-10gH/gL6 0.89

1.18 kass (xioVsec’¹) 5.77

6.27

4.55

4.72 zbytkový IL-5 v pg/ml

Obr,11 kontrola

C3>

x

C3>

iň

1 —1 u

d r—I O Ll P

C O

I---1 1—I—I I r

Q o O o o O o O Q O a o O O o a O m o m o m o in to o m o to o m +5 CO CO CM CM T“ 1-- CO CO CM CM Ί— T—

>1 l“4 Ή Ή 0

G -H

VI

9)

O O r—i •H Ή o S •H n O o

-β <-1 Φ Ό