CZ292295B6 - Rekombinantní protilátková molekula, DNA sekvence, terapeutická nebo diagnostická kompozice a použití protilátkové molekuly - Google Patents

Abstract

Rekombinantn protil tkov molekula, obsahuj c kompozitn t k² °et zec a kompozitn lehk² °et zec, maj c afinitu pro lidsk² IL-5 antigen, kde variabiln dom na uveden ho kompozitn ho t k ho °et zce obsahuje p°ev n zbytky ·seku z kladn struktury t k ho °et zce protil tkov ho akceptoru, p°i em variabiln dom na t k ho °et zce obsahuje donorov zbytky z t k ho °et zce myÜ monoklon ln protil tky 39D10 na zbytc ch 31 a 35, 50 a 65 a 95 a 102 a zbytc ch ·seku z kladn struktury 24, 27 a 30, 37, 49, 73, 76 a 78, a variabiln dom na uveden ho kompozitn ho lehk ho °et zce obsahuje p°ev n zbytky ·seku z kladn struktury lehk ho °et zce protil tkov ho akceptoru, p°i em tato variabiln dom na obsahuje donorov zbytky z lehk ho °et zce myÜ monoklon ln protil tky 39D10 na zbytc ch 24 a 34, 50 a 66 a 89 a 97 a na zbytc ch ·seku z kladn struktury 68 a 71, podle slov n poloh dle Kabata. Do rozsahu °eÜen rovn n le DNA sekvence, terapeutick nebo diagnostick kompozice a pou it t to protil tkov molekuly v terapii nebo diagn ze.\

Description

Vynález se týká rekombinantní protilátkové molekuly (RAM) a zejména humanizované protilátkové molekuly (HAM), mající specifitu pro lidský interleukin-5 (hIL-5), nukleových kyselin, které kódují variabilní domény těžkého a lehkého řetězce uvedené rekombinantní protilátky, DNA sekvence kódující kompozitní těžký řetězec a/nebo kompozitní lehký řetězec protilátky, terapeutické nebo diagnostické kompozice a terapeutického použití rekombinantní protilátky.

Dosavadní stav techniky

V popisu předmětného vynálezu je termín „rekombinantní protilátková molekula“ (RAM) použit pro popis protilátky produkované způsobem, zahrnujícím použití rekombinantní DNA technologie. Výraz „humanizovaná protilátková molekula“ (HAM) je použit pro popis molekuly získané z lidského imunoglobulinu. Antigen vázající místo může obsahovat buď kompletní variabilní domény fúzované ke konstantním doménám, nebo jeden nebo více komplementárních determinujících regionů (CDR) naroubovaných ke vhodným úsekům základní struktury ve variabilní doméně. Zkratka „MAb“ je použita k označení monoklonální protilátky.

Výraz „rekombinantní protilátková molekula“ zahrnuje nejen kompletní imunoglobulinové molekuly, ale také všechny antigen vázající imunoglobulinové fragmenty jako Fv, Fab a F(ab')2 fragmenty a veškeré jejich deriváty jako jsou jednořetězcové Fv fragmenty.

Pokud se týče dosavadního stavu techniky byly přírodní imunoglobuliny užívány při testech, diagnóze a v omezeném rozsahu v terapii. Použití imunoglobulinů v terapii nebylo možné z toho důvodu, že většina protilátek majících potenciální použití jako terapeutická činidla jsou MAb produkované fúzí buněk sleziny hlodavců s buňkami myelomu hlodavců. Tyto MAb jsou tak v podstatě hlodavčí proteiny. Použití těchto MAb jako terapeutických činidel u lidí může zvýšit nežádoucí imunitní odpověď označovanou HAMA (z anglického Human Anti-mouse Antibody). Použití hlodavčích MAb jako terapeutických činidel u lidí je svojí povahou omezeno skutečností, že lidský subjekt bude poskytovat imunologickou odezvu k MAb, která buď odstraní úplně, nebo alespoň sníží její účinnost.

Až dosud bylo vyvinuto mnoho technik pro snížení antigenických charakteristik těchto nehumánních MAb. Tyto techniky obecně zahrnují použití rekombinantní DNA technologie k sestavení DNA sekvencí kódujících polypeptidové řetězce protilátkové molekuly. Tyto metody jsou obecně nazývány jako „humanizační“ techniky.

Nejnovější metody humanizace MAb zahrnují produkci chimémích protilátek, ve kterých antigen vázající místa obsahující kompletní doménám získaným zjiné protilátky. Metody provádění takovýchto chimérizačních postupů jsou popsány v EP 0120694 (Celltech Limited) a EP 0125023 (Genentech lne. a City of Hope). Humanizované chimémí protilátky však ještě obsahují významný podíl ne-humánních aminokyselinových sekvencí a mohou ještě stále vyvolávat určitou HAMA odezvu, zejména jsou-li podávány po delší dobu (Begent a kol., Br. J. Cancer, 62, 487 (1990)).

Alternativní řešení, popsané v EP-A-0239400 (Winter), zahrnuje naroubování komplementaritu determinujícího regionu (CDR) myší MAb na úseky základní struktury variabilních domén lidského imunoglobulinu za použití rekombinantních DNA technik. Existují tři CDR (CDR1, CDR2 a CDR3) v každé z variabilních domén těžkého a lehkého řetězce. Tyto CDR-roubované humanizované protilátky pravděpodobně mnohem méně způsobují HAMA odpověď než humani

-1CZ 292295 B6 zované chimémí protilátky vzhledem ke mnohem nižšímu podílu ne-humánních aminokyselinových sekvencí, které obsahují. V publikaci Riechmann a kol. (Nátuře, 332, 323-324 (1988)) se uvádí, že transfer CDR samotných, jak definuje Kabat (Sequences ofProteins of Immunological Interest, US Department ofHealth and Human Services, NIH, USA (1987)) nebyl dostačující pro poskytnutí vyhovující antigen vázající aktivity v CDR-roubovaném produktu. Riechman a kol. zjistili, že bylo nezbytné konvertovat mnoho zbytků mimo CDR, zejména ve smyčce připojené kCDRl. Avšak vazebná afinita nejlepších CDR-roubovaných získaných protilátek byla ještě významnější než původní MAb.

V publikované mezinárodní patentové přihlášce WO 91/09967 (Adair a kol.) se popisuje CDRroubovaná protilátka těžkého a lehkého řetězce a determinují hierarchie donorových zbytků.

V publikované mezinárodní patentové přihlášce WO 93/16184 (Chou a kol.) se popisuje uspořádání, klonování a exprese humanizovaných monoklonálních protilátek proti lidskému interleukinu-5. Podle tohoto řešení byl navržen způsob selekce lidských protilátkových sekvencí, které mají být použity jako humánní úseky základní struktury pro humanizaci zvířecích protilátek, zahrnující stupně porovnání humánních variabilních doménových sekvencí s variabilními doménovými sekvencemi za zvířecí MAb, která se humanizuje, na procentické identity, sekvenční dvojznačnosti a podobné PIN-regionové oddělení. PIN-regionová oddělení je definováno jako počet zbytků mezi cysteinovými zbytky, tvořícími intra doménové disulfidové můstky. Vybere se lidská protilátka mající nejlepší kombinaci těchto znaků. V této publikaci byla také navržena metoda určení, které variabilní doménové zbytky zvířecí MAb by měly být vybrány pro humanizaci, zahrnující stanovení potenciálního minima zbytků (zbytky, které obsahují CDR strukturní smyčky a zbytky vyžadované pro podporu a/nebo orientaci CDR strukturních smyček) a maximum zbytků (zbytky, které obsahují Kabatovy CDR, CDR strukturní smyčky, zbytky vyžadované pro podporu a/nebo orientaci CDR strukturních smyček a zbytky, které spadají do asi 10 A CDR strukturní smyčky a vykazují povrch přístupný pro vodné rozpouštědlo asi 5 A² nebo větší) zvířecí monoklonální protilátky. Dále se provede počítačové modelování na všech možných rekombinantních protilátkách zahrnujících lidskou protilátkovou sekvenci úseku základní struktury, do které bylo inzertováno minimum a maximum. Minimum a maximum zbytků se vybere na základě kombinace, která produkuje rekombinantní protilátku, mající strukturu počítačového modelu nejbližší struktuře zvířecí monoklonální protilátky. Humanizovaná získaná anti-IL-S protilátka se jeví jako postrádající podstatné množství své afinity pro hIL-5 molekulu.

Cílem vynálezu je poskytnout humanizovanou protilátkovou molekulu, mající zlepšenou afinitu pro hIL-5 molekulu.

Podstata vynálezu

Podstatou řešení podle vynálezu je rekombinantní protilátková molekula obsahující kompozitní těžký řetězec a kompozitní lehký řetězec, mající afinitu pro lidský IL-5 antigen, kde variabilní doména uvedeného kompozitního těžkého řetězce obsahuje převážně zbytky úseku základní struktury těžkého řetězce protilátkového akceptoru, přičemž variabilní doména těžkého řetězce obsahuje donorové zbytky z těžkého řetězce myší monoklonální protilátky 39D10 na zbytcích 31-35, 50-65 a 95-102 a zbytcích úseku základní struktury 24, 27-30, 37, 49, 73, 76 a 78, a variabilní doména uvedeného kompozitního lehkého řetězce, obsahuje převážně zbytky úseku základní struktury lehkého řetězce protilátkového akceptoru, přičemž tato variabilní doména obsahuje donorové zbytky z lehkého řetězce myší monoklonální protilátky 39D10 na zbytcích 24-34, 50-66 a 89-97 a na zbytcích úseku základní struktury 68 a 71, podle číslování poloh dle Kabata.

-2CZ 292295 B6

Uvedený kompozitní těžký řetězec ve výhodném provedení podle vynálezu dále obsahuje donorové zbytky z myší monoklonální protilátky 39D10 na zbytcích úseku základní struktury 23 a 77, podle číslování poloh dle Kabata.

Podle dalšího výhodného provedení rekombinantní protilátkové molekuly podle vynálezu uvedený lehký kompozitní řetězec dále obsahuje donorové zbytky z myší monoklonální protilátky 39D10 na zbytku úseku základní struktury 22.

Akceptorové zbytky pro kompozitní těžký řetězec jsou ve výhodném provedení podle vynálezu zbytky těžkého řetězce lidské skupiny ΙΠ a akceptorové zbytky pro kompozitní lehký řetězec jsou zbytky lehkého řetězce lidské skupiny I.

Rovněž je výhodná podle vynálezu rekombinantní protilátková molekula mající afinitu pro lidský IL-5 antigen podle některého z předchozích řešení obsahující variabilní region těžkého řetězce znázorněný na obr. 6 <SEQ ID 28> a variabilní region lehkého řetězce znázorněný na obr. 5 <SEQ ID 26>.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží DNA sekvence, která kóduje kompozitní těžký řetězec a/nebo kompozitní lehký řetězec protilátky podle kteréhokoliv z předchozích nároků.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží terapeutická nebo diagnostická kompozice obsahující protilátkovou molekulu podle kteréhokoliv z předchozích řešení v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo excipientem.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití protilátkové molekuly podle některého z předchozích řešení v terapii nebo diagnóze.

Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží použití účinného množství protilátkové molekuly podle některého z předchozích řešení pro výrobu léčiva pro podání lidskému nebo zvířecímu subjektu pro terapii nebo diagnózu.

Podle vynálezu byla vyvinuta RAM mající afinitu pro lidský IL-5 antigen a obsahující antigen vazebné regiony odvozené do variabilních domén těžkého a/nebo lehkého řetězce donorové protilátky mající afinitu pro lidský IL-5, přičemž tato RAM má vazebnou afinitu podobnou afinitě donorové protilátky.

RAM podle vynálezu může obsahovat antigen vázající regiony z jakékoliv vhodné donorové anti-IL-5 protilátky. Typickou donorovo anti-IL-5 protilátkou je hlodavčí MAb. Výhodně je donorovou protilátkou MAb 39D10.

Variabilní domény těžkých a lehkých řetězců MAb 39D10 jsou v tomto textu popsány v souvislosti s obrázky 1 a 2.

Podle prvního aspektu je RAM obecně anti-IL-5 protilátková molekula mající afinitu pro lidský IL-5 antigen obsahující kompozitní těžký řetězec a komplementární lehký řetězec, kde uvedený kompozitní řetězec má variabilní doménu obsahující převážně zbytky úseku základní struktury těžkého řetězce protilátkového akceptoru a vazebné zbytky pro těžký řetězec antigenu donorové protilátky, kde uvedená donorová protilátka má afinitu pro lidský IL-5, přičemž uvedený kompozitní těžký řetězec obsahuje donorové zbytky alespoň v polohách 31 až 35, 50 až 65 a 95 až 102 (podle Kabatova systému číslování) [Kabat a kol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Vol., I, páté vydání, 1991, US Department of Health and Human Services, National Institute of Health].

Výhodně úsek základní struktury kompozitního těžkého řetězce dále obsahuje donor zbytky v polohách 23, 24, 27-30, 37,49, 73 a 76-78 nebo 24, 27-30, 37, 49, 72, 76 a 78.

-3CZ 292295 B6

Podle druhého aspektu byla obecně podle vynálezu navržena anti-IL-5 protilátková molekula mající afinitu pro lidský IL-5 antigen a obsahující kompozitní lehký řetězec a komplementární těžký řetězec, kde uvedený kompozitní lehký řetězec má variabilní doménu obsahující převážně zbytky úseku základní struktury lehkého řetězce protilátkového akceptoru a vazebné zbytky pro lehký řetězec antigenu donorové protilátky, kde uvedená donorová protilátka má afinitu pro lidský IL—5, přičemž uvedený kompozitní lehký řetězec obsahuje donorové zbytky alespoň v polohách 24 až 34, 50 až 56 a 69 až 97 (podle Kabatova systému číslování).

Výhodně úsek základní struktury kompozitního lehkého řetězce dále obsahuje donorové zbytky v polohách 22,68 a 71 nebo v polohách 68 a 71.

Podle dalšího aspektu byla podle vynálezu vyvinuta anti-IL-5 protilátková molekula mající afinitu pro lidský IL-5 antigen obsahující kompozitní těžký řetězec podle prvního aspektu vynálezu a kompozitní lehký řetězec podle druhého aspektu vynálezu.

Výhodně každý RAM podle vynálezu má afinitní konstantu pro lidský IL-5 větší než 10‘⁹ M.

Z textu předmětného vynálezu je zřejmé, že vynález je v širokém rozsahu použitelný pro produkci anti-IL-5 RAM obecně. Donorová protilátka tak může být jakákoliv anti-IL-5 protilátka získaná z jakéhokoliv zvířete. Akceptorová protilátka může být získána ze zvířete stejných druhů a může to být i stejná třída nebo podtřída protilátky. Obvykleji však jsou donorové a akceptorové protilátky získány ze zvířat odlišných druhů. Typicky donorová anti-IL-5 protilátka je ne-lidská protilátka, jako je hlodavčí MAb a akceptorovou protilátkou je lidská protilátka.

Pokud jde o třídu nebo typ donorové protilátky, ze které jsou antigen vázající regiony získány, potom je třeba uvést, že je možno použít libovolnou vhodnou variabilní sekvenci úseku základní struktury akceptoru. Výhodně je typu použitého akceptorového úseku základní struktury stejný nebo podobné třídy nebo typu jako donorová protilátka. Výhodně má zvolený úsek základní struktury nej vyšší homologii s donorovou protilátkou. Výhodně se použijí úseky základní struktury lidské skupiny ΙΠ gama zárodečné linie pro kompozitní těžký řetězec a úseky základní struktury lidské skupiny I kappa zárodeční linie pro kompozitní lehké řetězce.

Konstantní regionové domény RMA podle vynálezu mohou být zvoleny s ohledem na navržené funkce protilátky, zejména mohou být vyžadovány efektorové funkce. Například konstantní regionové domény mohou být lidské IdA, igE, IgG nebo Igm domény. Zejména může být použity IgG lidské konstantní regionové domény, zejména isotypu IgGl a IgG3, je-li humanizovaná protilátková molekula zamýšlena pro terapeutická použití a jsou vyžadovány protilátkové efektorové funkce. Alternativně mohou být použity IgG2 a IgG4 isotypy, je-li humanizovaná protilátková molekula zamýšlena pro terapeutické účely a nejsou vyžadovány protilátkové efektorové funkce, například specifická vazba na lidský IL-5 a neutralizace biologické aktivity lidského IL-5. Mohou být také použity modifikované lidské konstantní regionové domény, ve kterých jeden nebo více aminokyselinových zbytků byl zaměněn nebo deletován pro změnu určité efektorové funkce. Výhodně jsou konstantní regionové domény RAM lidské IgG4.

Označení zbytků uvedené výše a dále v uvedeném textu je provedeno podle číslování Kabata (Kabat a spol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, díl I, páté vydání, 1991, US Department of Health and Human Services, National Institute of Health). Označení zbytků tak vždy neodpovídají přímo lineárnímu číslování aminokyselinových zbytků. Aktuální lineární aminokyselinové sekvence mohou obsahovat méně nebo další aminokyseliny než v Kabátově číslování, odpovídající zkrácení, nebo inzerci do základní variabilní doménové struktury.

Také anti-IL-5 protilátkové molekuly podle předloženého vynálezu mohou být připojeny k efektorovým nebo reportérovým molekulám. Alternativně mohou být k produkci imunoglobulino

-4CZ 292295 B6 vých molekul použity postupy technologie rekombinace DNA, ve kterých byly nahrazeny Fc fragment nebo CH3 doména kompletního imunoglobulinu, nebo byly k němu připojeny peptidovou vazbou, funkční ne-imunoglobulinový protein jako enzym, cytokin, růstový faktor nebo toxinová molekula.

Proto zbytek protilátkových molekul nezbytně nemusí obsahovat pouze sekvence z imunoglobulinů. Například může být konstruován gen, ve kterém DNA sekvence, kódující část lidského imunoglobulinového řetězce je fúzována kDNA sekvenci, kódující aminokyselinovou sekvenci molekuly polypeptidového efektoru nebo reportéru.

Další aspekty vynálezu zahrnují DNA sekvence, kódující kompozitní těžký řetězec a kompozitní lehký řetězec. Klonovací a expresní vektory obsahující DNA sekvence, hostitelské buňky transformované s DNA sekvencemi a způsoby produkce molekul protilátek obsahujících DNA sekvence ve transformovaných hostitelských buňkách jsou také dalšími aspekty vynálezu.

Obecné metody, kterými mohou být vektory konstruovány, transfekční metody a kultivační metody jsou v tomto oboru známé z dosavadního stavu techniky a netvoří podstatu řešení podle vynálezu.

DNA sekvence, které kódují anti-IL-5 donor aminokyselinové sekvence mohou být získány metodou běžně známými v tomto oboru (viz například publikovaná mezinárodní patentová přihláška č. WO 93/16184). Například anti-IL-5 kódující sekvence mohou být získány genomickým klonováním nebo cDNA klonováním ze vhodných hybridomových linií, například buněčné linie 39D10. Pozitivní klony mohou být screenovány za použití vhodných sond pro požadované těžké a lehké řetězce. Také může být použito PCR klonování.

DNA kódující akceptorové aminokyselinové sekvence může být získána jakýmkoliv vhodným způsobem. Například DNA sekvence, kódující preferované lidské akceptorové úseky základní struktury jako je lidská skupina I lehkých řetězců a lidská skupina ΙΠ těžkých řetězců, jsou běžně dostupné pracovníkům v daném oboru.

Pro přípravu požadovaných DNA sekvencí mohou být použity standardní techniky molekulární biologie. Sekvence mohou být syntetizovány kompletně nebo částečně za použití technik oligonukleotidové syntézy. Vhodné jsou techniky místně řízené mutagenese a polymerázové řetězové reakce (PCR). Například může být použita oligonukleotidová řízená syntéza podle Jonese a kol. (viz Nátuře 321, 522 (1986)). Rovněž může být použita oligonkleotidová řízená mutagenese již existujícího variabilního regionu, jako je například postup podle Verhoyena a kol. (viz Science, 239, 1534-1536 (1988)). Také může být použito enzymatické plnění prolomených („gapped“) oligonukleotidů za použití T4 DNA polymerázy, jak je například postup podle Queena a kol. (viz. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 10029-100033 (1989)) a v publikované mezinárodní patentové přihlášce WO 90/07861).

Pro expresi DNA sekvencí, kódujících RAM mohou být použity jakékoliv vhodné hostitelské buněčné a vektorové systémy. Výhodně se používají eukaryotické, např. savčí, hostitelské buněčné expresní systémy. Zejména vhodné savčí buňky zahrnují CHO buňky a myelomové nebo hybridomové buněčné linie.

Postup produkce anti-IL-5 RAM je možno provést tak, že zahrnuje následující stupně:

(a) produkci prvního expresního vektoru prvního operonu, majícího DNA sekvenci, která kóduje kompozitní těžký řetězec, jak je definován podle prvního preferovaného aspektu vynálezu;

(b) popřípadě v prvním nebo druhém expresním vektoru produkci druhého operonu, majícího DNA sekvenci, která kóduje komplementární lehký řetězec, kterým může být kompozitní lehký řetězec, jak je definován podle druhého preferovaného aspektu vynálezu;

-5CZ 292295 B6 (c) transfekci hostitelské buňky vektorem nebo každým vektorem; a (d) kultivaci transfektované buněčné linie pro produkci RAM.

Alternativně může tento postup zahrnovat použití sekvencí kódujících kompozitní lehký řetězec a komplementární těžký řetězec.

Pro produkci RAM, obsahujících jak těžký, tak lehký řetězec, mohou být buněčné linie transfektovány dvěma vektory. První vektor může obsahovat operon kódující kompozitní nebo komplementární těžký řetězec a druhý vektor může obsahovat operon kódující komplementární nebo kompozitní lehký řetězec. Výhodně jsou vektory identické kromě pokud se týče kódujících sekvencí a selektujících markérů, aby tak bylo zajištěno pokud je to možné, stejné exprimování každého polypeptidového řetězce. Ve vhodném alternativním provedení může být použit jediný vektor, kterým je vektor obsahující sekvence kódující jak těžký tak lehký řetězec.

DNA v kódujících sekvencích pro těžký a lehký řetězec může zahrnovat cDNA nebo genomickou DNA nebo obě.

Rovněž je možno podle vynálezu připravit terapeutické a diagnostické prostředky obsahující RAM a použít těchto prostředků v terapii a diagnóze.

Tento terapeutický nebo diagnostický prostředek obsahuje RAM podle předchozích aspektů předmětného vynálezu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným excipientem, ředidlem nebo nosičovou látkou.

Tyto prostředky mohou být připraveny použitím RAM podle předmětného vynálezu, například jako celých protilátek, jednořetězcových Fv fragmentů nebo protilátkových fragmentů, jako jsou Fab nebo Fv fragmenty. Takovéto prostředky mají IL-5 blokující nebo antagonistické účinky a mohou být použity pro potlačení IL-5 aktivity.

Prostředky podle vynálezu mohou být připraveny a upraveny v souladu s běžnou prací pro podání jakýmkoliv vhodným způsobem, přičemž obecně mohou být v kapalné formě (například roztok RAM ve sterilním fyziologicky přijatelném pufru) pro podání například intravenózním, intraperitoneálním nebo intramuskulámím způsobem; ve sprejové formě, například pro podání nasálním nebo bukálním způsobem; nebo ve formě vhodné pro implantaci.

Při terapeutickém nebo diagnostickém použití postup zahrnuje podání účinného množství, výhodně 0,1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti, RAM podle předchozích aspektů vynálezu lidské nebo zvířecímu subjektu. Přesná dávka a celková dávka se budou měnit podle zamýšleného použití RAM a věku a stavu léčeného pacienta. RAM může být podána ve formě jediné dávky nebo může být podávána kontinuálním způsobem po určitý časový úsek. Jednotlivé dávky mohou být podle potřeby opakovány.

RAM podle předchozích aspektů vynálezu může být použita pro jakákoliv terapeutická použití, pro která byly použity nebo v budoucnosti budou použity anti-IL-5 protilátky, například 39D10.

IL-5 je primární aktivátor eosinofilů, přičemž bylo zjištěno, že blokování funkce těchto cytokinů s protilátkami brání nebo redukuje eosinofilii, která je spojena s určitými alergickým chorobami. RAM podle vynálezu tak může být použita pro tento účel a zejména může být použita pro léčení astma, kdy je možno očekávat, že bude bránit akumulaci a aktivaci eosinofilů v astmatických plicích a tím redukovat bronchiální zánět a zúžení dýchacích cest. Pro použití při léčení astma může RAm podle vynálezu být výhodně jednořetězcový Fv fragment formulovaný jako sprej, pro podání například nasální cestou.

-6CZ 292295 B6

Výhodný postup získání anti-IL-5 protilátkové molekuly podle předmětného vynálezu je uveden dále. Tento postup nijak neomezuje rozsah předmětného vynálezu a zejména jeho obecné pojetí popsané výše.

Použije se 39D10 krysí monoklonální protilátka působící proti lidskému IL-5 jako donorová protilátka. Variabilní domény těžkého a lehkého řetězce 39D10 byly klonovány podle dosavadního stavu techniky (viz publikovaná patentová přihláška 93/16184) a nukleotidové a předem určené aminokyselinové sekvence těchto domén jsou uvedeny na obr. 1 a 2. Musí být stanoveny vhodné variabilní domény akceptoru těžkého a lehkého řetězce a musí být známa aminokyselinové sekvence. RAM je pak číslována tak, že vychází ze základu akceptorové sekvence.

1. CDR

V prvním stupni jsou donorové zbytky nahrazeny akceptorovými zbytky v CDR. Pro tento účel jsou CDR definovány následně:

těžký řetězec: CDR1: zbytky 31 až 35

CDR2: zbytky 50 až 65

CDR3: zbytky 95 až 102 lehký řetězec: CDR1: zbytky 24 až 34 CDR2: zbytky 50 až 56 CDR3: zbytky 89 až 97

Polohy, ve kterých jsou donorové zbytky substituovány akceptorovými zbytky v úseku základní struktury jsou pak zvoleny následovně, nejprve pokud se týče těžkého řetězce a následně pokud se týče lehkého řetězce.

2. Těžký řetězec

2.1 Donorové zbytky jsou použity buď ve všech polohách 24, 27 až 30, 37,49, 73, 76 a 78, nebo ve všech polohách 23, 24,27 až 30, 37,49, 73 a 76 až 78 těžkého řetězce.

3. Lehký řetězec

3.1 Donorové zbytky jsou použity buď ve všech polohách 22, 68 až 71, nebo ve všech polohách 68 a 71.

Předložený vynález se týká rekombinantní anti-IL-5 protilátkové molekuly mající vazebnou afinitu v podstatě stejnou jako je afinita donorové protilátky.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 představuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci 39D10 těžkého řetězce;

obrázek 2 představuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci 39D10 lehkého řetězce;

obrázek 3 představuje srovnání regionů úseku základní struktury variabilní domény těžkého řetězce s regiony úseku základní struktury těžkého řetězce souhlasné sekvence lidské skupiny ΠΙ těžkých řetězců;

obrázek 4 představuje srovnání regionů úseku základní struktury variabilní domény lehkého řetězce s regiony úseku základní struktury těžkého řetězce souhlasné sekvence lidské skupiny ΙΠ lehkých řetězců;

-7CZ 292295 B6 obrázek 5 představuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci CDR naroubovaného antiIL-5 lehkého řetězce CTIL-gL6;

obrázek 6 představuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci CDR naroubovaného antiIL-5 těžkého řetězce CTIL-5-10gH;

obrázek 7 představuje mapu plazmidu pMR14;

obrázek 8 představuje mapu plazmidu pMR15.1;

obrázek 9 představuje afinitní konstanty a asociační a disacociační rychlosti chimémí 39D10 protilátky a CTIL-5-10gH/-gL6 protilátky;

obrázek 10 představuje graf neutralizace IL-5 v TF1 testu za použití panelu protilátek;

obrázek 11 představuje výsledky konkurenčního testu pro krysí 39D10, chimémí 39D10 protilátku a CTTL-5-10gH/gL6 protilátku a obrázek 12 představuje účinek CTIL-5-10gH/gL6 na opičí eosinofilii.

Příklady provedení vynálezu

Vynález bude v dalším ilustrován s pomocí konkrétních příkladů provedení a s odkazem na připojené obrázky, přičemž tyto příklady jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.

1. Materiál a metody

39D10 je krysí monoklonální protilátka působící proti lidskému IL-5. Geny pro variabilní domény těžkého a lehkého řetězce 39D10 byly klonovány podle dosavadního stavu techniky (viz publikovaná mezinárodní patentová přihláška WO 93/16184), přičemž nukleotidové a předem určené aminokyselinové sekvence jsou uvedeny na obr. 1 a 2. Díky strategii použité při klonování variabilní domény 39D10 těžkého řetězce není prvních pět aminokyselin regionů základní struktury známých. Nicméně byl dostupný těžký řetězec, který obsahuje leader sekvenci a prvních pět aminokyselin úseku základní struktury 1 z protilátky YTH 34.5HL, viz Riechmann a kol., (Nátuře, 332, 323-327(1988)).

2. Molekulární biologické postupy

Byly použity postupy molekulární biologie podle Maniatise a kol. (Molecular Cloning: A. Laboratory Mcmual, Second Edition, Vol. 1 až 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

3. Konstrukce genů rekombinantního těžkého a lehkého řetězce

Těžký řetězec

Vh region těžkého řetězce byl generován PCR za použití oligonukleotidů R3601 a R2155. Jejich sekvencejsou:

-8CZ 292295 B6

R3 6 Oil S'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGAAG(A, T} TGTGGTTAAACTGGCTTTT3 *

R2155 5’GCAGATGGCCCCrrCGTTGAGGCTG(A,C) (K_rGyGkGKC(G.T,A.)G1X;K3 ’

Reakční směs (100 μ), obsahující 10 mM tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl, 50 mM KC1, 0,01 hmotn./objem želatiny, 0,25 mM každého deoxyribonukleosid trifosfátu, 0,1 pg 39D10 DNA těžkého řetězce, 6pmol R3601 a R2155 a 0,25 jednotek Taq polymerázy. Reakční směs byla zahřívána na 94 °C 5 minut a pak cyklována při 94 °C 1 minut, 1 min při 55 °C a 1 min při 72 °C. Po 30 cyklech byla reakční směs extrahována se stejným objemem fenol/chloroformu (1:1 obj./obj.), potom s chloroformem před tím, než byla srážena přídavkem 2,5 objemu ethanolu. PCR produkt byl rozpuštěn ve vhodném pufru, štěpen s Hindin a Apal, čištěn na agarosovém gelu a ligován do vektoru pMR14 (obr. 7), který pak byl také štěpen sHindlH a Apal. Po transformaci do E. coli LM1035, rostly kolonie přes noc a plazmidová DNA byla analyzována na Vh inzerty. Nukleotidová sekvence vH regionu v plazmidu, pARH1271 je uvedena na obr. 1.

Lehký řetězec

Gen VI lehkého řetězce byl generován z původního VI jak je popsáno ve WO 93/16184, klonu PCR s oligonukleotidy R3585 a R3597. Jejich sekvence jsou:

R3 5 8 5 5 · GGACTGTTCGAAGCCGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3 ·

R3597 5’GGATACAGTTGGTGCLAGCATCCGTACGTTT3’

PCR byla provedena jak je popsáno výše. PCR produkt byl štěpen enzymy BstBI a SplI a po čištění ligován do pMR15.1 (obr. 8), který již byl dříve štěpen stejnými enzymy.

Byly identifikovány kolonie, po transformaci E. coli LM1O35, které obsahují plazmid (pARH1215) s VI inzertem. Nukleotidová sekvence VI inzertu je uvedena na obr. 2.

CDR roubování 39D10

Za účelem zvolení nej vhodnějších lidských akceptorových rámečků pro CDR smyčky 39D10 byly aminokyselinové sekvence rámečků 1-3 39D10 porovnány se sekvencemi známých lidských kappa lehkých řetězců. 39D10 byl shledán jako nejvíce homologní k lidské skupině I lehkých řetězců. Na tomto základě bylo rozhodnuto použít rámečky lidské skupiny I zárodečné linie pro CDR roubování. Homologie mezi sekvencemi jsou uvedeny na obr. 3. Uvedena je také homologie mezi rámečkem 4 regionů 39D10 a souhlasná sekvence známých lehkých řetězců lidské skupiny I. Zbytky ve 39D10, které se liší od lidské souhlasné sekvence jsou podtrženy. Příspěvek, jak by se tyto zbytky mohly podílet na antigenové vazbě byl analyzován a dva geny byly konstruovány pro CDR roubovaný lehký řetězec. Byly to CTIL-5-gL5 a CTIL-5-gL6, ve kterých jak i v CDR zbytcích, buď zbytky 22, 68 a 71, nebo zbytky 68 a 71 byly také ze 39D10. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence CTIL-5-gL6 jsou uvedeny na obr. 5.

Těžký řetězec

CDR roubování 39D10 těžkého řetězce bylo provedeno jak je popsáno pro lehký řetězec. Rámečkové regiony 39D10 byly nalezeny jako nejvíce homologní k regionům lidské skupiny ΙΠ protilátek a, následně souhlasná sekvence rámečků genů lidské skupiny ΙΠ zárodečné linie byla použita k akceptování CDR 39D10 těžkého řetězce. Jako dříve byla také zvolena souhlasná sekvence pro lidskou skupinu ΙΠ rámečku 4 regionů. Porovnání těchto sekvencí je uvedeno na obr. 4 s podtrženými zbytky ve 39D10, které se liší od lidské souhlasné sekvence.

-9CZ 292295 B6

Byla provedena analýza rámečkových zbytků ve 39D10, které by mohly ovlivnit antigenovou vazbu a byly konstruovány dva geny, CTIL-5~9gH a CTIL-5-10gH, ve kterých buď zbytky 23, 24, 27 až 30, 37, 49 a 73 a 76 až 78, nebo zbytky 24, 27-30, 37, 49, 73, 76 a 78 byly ze 39D10. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence CTIL-5-10gH je uvedena na obr. 6.

Exprese a bioaktivita anti-IL-5 protilátek

Chimémí (krysí/lidský) a CDR roubovaný 39D10 byly vyrobeny pro biologické hodnocení přechodné exprese párů těžkého a lehkého řetězce po ko-transfekci do buněk vaječníků čínského křečka (CHO) za použití srážení fosforečnanem vápenatým.

Den před ko-transfekcí byly polo-konfluentní lahve CHO-L761h buněk (Cockett a spol., Nucl. Acids, Res., 19, 319-325, 1991) trypsinizovány, buňky byly spočteny a T75 lahve byly každá naplněny 10⁷ buněk. Další den bylo kultivační médium vyměněno 3 hodiny před transfekcí. Pro transfekci byla připravena sraženina fosforečnanu vápenatého smísením 1,25 ml 0,25M CaCl₂, obsahující 50 pg každého z expresních vektorů těžkého a lehkého řetězce s 1,25 ml 2xHBs (16,36 g, NaCl, 11,9 g HEPES a 0,4 g Na₂HPC>4 v 1 litru vody a pH upraveným na 7,1 pomoc NaOH) a ihned přidány do média buněk. Po 3 h při 37 °C v CO₂ inkubátoru byly médium a sraženina odstraněny a buňky šokovány přídavkem 15 ml 15% glycerinu ve fosfátem pufřovaném salinickém roztoku (PBS) po 1 minutu. Glycerin byl odstraněn, buňky byly jednou promyty PBS a inkubovány 48 až 96 hodin ve 25 ml média, obsahujícího 10 mM butyrátu sodného. Protilátka byla čištěna z kultivačního média navázáním ka elucí z protein A - Sepharosy. Koncentrace protilátky byla stanovena za použití lidský Ig ELISA (viz dále).

ELISA

Exprese protilátky byla hodnocena transfekcí párů genů těžkého a lehkého řetězce a, po třech dnech inkubace, měřením množství protilátky nahromaděné v kultivačním médiu pomocí ELISA.

Pro ELISA, byly Nunc ELISA plotny potaženy přes noc při 4°C F(ab')₂ fragmentem polyklonální kozí anti-lidský Fc fragment specifické protilátky (Jackson hnmunoresearch, kód 109-006-098) při 5 μg/ml vpotahovacím pufřu (15 mM uhličitan sodný, 35 mM hydrogenuhličitan sodný, pH 6,9). Nepotažená protilátka byla odstraněna promytím 5krát destilovanou vodou. Vzorky a čištěné standardy pro kvantifikaci byly zředěny na přibližně 1 pg/ml v konjugátovém pufřu (0,1 Tris-HCl pH 7,0, 0,lM NaCl, 0,2% obj./obj. Tween 20, 0,2% hmont./obj. Hammersten kaseinu). Vzorky byly titrovány v mikrotitračních jamkách ve 2-násobných zředěním pro poskytnutí konečného objemu 0,1 ml v každé jamce a plotny byly inkubovány při teplotě místnosti 1 hodinu za třepání. Po prvním inkubačním stupni byly plotny promyty 1 Okřát destilovanou vodou a pak inkubovány 1 hodinu jako dříve s 0,1 ml myší monoklonální anti-lidské kappa(klon GDI2) peroxidáza konjugované protilátky (The binding Site, kód MP135) při ředění 1 v 700 konjugátovém pufřu. Plotny byly opět promyty a do každé jamky byl přidán substrátový roztok (0,1 ml). Substrátový roztok obsahuje 150 μΐ Ν,Ν,Ν,Ν-tetramethylbenzidinu (110 mg/ml v DMSO), 150 μΐ peroxidu vodíku (30% roztok) v 10 ml 0,lM octanu sodného/citrátu sodného, pH 6,0. Plotna byla vyvíjena 5 až 10 minut až absorbance při 630 nm byla přibližně 1,0 pro špičkový standard. Absorbance 630 nm byla měřena použitím plotnové čtečky a koncentrace vzorku stanovena porovnáním titračních křivek s křivkou standardu.

Stanovení afinitních konstant pro anti-IL-5-protilátky

Afinity chimémích a CDR roubovaných anti-IL-5 protilátek byly stanoveny za použití Biospecific Interaction Analysis (BIA). Protilátky byly produkovány v CHO buňkách transfekcí kombinací genů těžkého a lehkého řetězce a čištěny ze supematantů kultury na Protein A Sepharose. Pro afinitní měření byla polyklonální anti-lidská Fc protilátka navázána k Pharmacia Biosensor chip (12150 relativní odezvové jednotky, RU) a použití k zachycení anti-IL-5, který

-10CZ 292295 B6 prošel nad chipem při 5 pg/ml v 10 mM HEPES, 0,15M NaCl, 3,4 mM EDTA, pH 7,4. Množství anti-IL-5 zachycené pro každý běh bylo přibližně 1600 RU. Rekombinantní lidský IL-5 pak prošel přes Sensorchip v různých koncentracích (0,6 až 5 gg/ml) ve výše uvedeném pufřu. Sensorchip byl čištěn po každém běhu pomocí 100 mM HCL a 100 mM kyseliny orthofosforečné 5 pro odstranění navázaného IL-5 a protilátky. Generované sensograma byly analyzovány za použití kinetického softwaru dostupného s přístrojem BIAcore.

Byly stanoveny hodnoty pro afinitní konstanty a asociační a disociační rychlosti dvou protilátek, chimémí 39D10 a CTIL-5-10gH/-gL6. Výsledky jsou uvedeny na obr. 9. Je možno vidět, že io chimémí 39K10 má extrémně vysokou afinitu pro lidský IL-5 a že tato hodnota byla reprodukována v CTIL-5-10gH/-gL6.

Aktivita anti-IL-5 protilátek v in vitro bioeseji

Aktivity různých CDR roubovaných protilátek byly porovnány s aktivitami chimémí 39D10 v in vitro bioeseji za použití TF1 buněk. TF1 je erythroleukemická buněčná linie, která vyžaduje pro růst GM-CSF. GM-CSF může být nahrazen IL-5, ale v tomto případě buňky pouze přežívají a nemnoží se. Nicméně závislost na IL-5 pro přežití znamená, že TFÍ buňky mohou být použity v bioeseji pro porovnání aktivity různých anti-IL-5 protilátek.

Neutralizace anti-IL-5 protilátkami byla měřena za použití konstantního množství IL-5 (2 ng/ml) a proměnných množství protilátky inkubované s 5x10⁴ buňkami na jamku v 96 jamkových plotnách s plochým dnem po 3 dny. Po poslední 4 hodiny jsou buňky kultivovány za přítomnosti Thiazolyl blue (MIT). Toto barvivo se konvertuje na nerozpustnou purpurovou formu mitochon25 driálními enzymy v životaschopných buňkách. Nerozpustný materiál byl rozpuštěn inkubací přes noc po přídavku 100 μΐ 50% dimethylformamidu, 20% SDS pH 4,7 a množství přijatého barviva stanoveného spektrofotometricky. Hodnoty bioaktivního IL-5 zůstávajícího za přítomnosti protilátek se extrapoluje ze standardní křivky, vyjadřující příjem barviva ke koncentraci IL-5 koncentraci.

\ 30

Aktivity různé kombinace těžkého a lehkého řetězce byly hodnoceny za použití TF1 bioseje. Výsledky jsou uvedeny na obr. 10. Je možno vidět, že všechny kombinace CDR roubovaného těžkého a lehkého řetězce produkují protilátky, které jsou ekvipotentní s chimémím 39D10. Tyto výsledky indikují, že ani zbytek 22 v lehkém řetězci ani zbytky 23 nebo 78 v těžkém řetězci 35 nejsou vyžadovány aby 39D10 byl specifický pro optimální vázání. Kombinace s méně 39D10 specifickými zbytky je proto CT1L-5-10gH/-gL6.

Aktivita anti-IL-5 protilátek v kompetičních esejích

Rekombinantní lidský IL-5 byl ředěn na 1 gg/ml ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) a 100 μΐ podíly byly přidány na mikrotitrační plotny (Costar Aine Binding plates) a inkubovány přes noc při 4 °C. Plotny byly promyty třikrát s PBS, obsahujícím 0,5 % Tweenu 20 a jakákoliv zbývající aktivní místa blokována se 2 % hovězího sérového albuminu (BSA) v PBS po 30 minut. Plotny pak byly odsáty a vyklepány dosucha. Pro porovnání relativní vazebné 45 aktivity rodičovské krysí protilátky (39D10) s chimémí a roubovanou protilátkou byla připravena postupná ředění každé anti-IL-5 protilátky v PBS/1 % BSA v 50 μΐ bylo přidáno k duplicitním jamkám a ihned následováno 50 μΐ 39D10-biotin konjugátu při 0,125 pg/ml. Esej byla inkubována 2 hodiny při teplotě místnosti za míchání a pak dvakrát promyta PBS. Do všech jamek byla přidána křenová peroxidáza konjugována ke streptavidinu (1 μg/ml) a inkubována dalších 50 30 minut. Plotny byly čtyřikrát promyty a bylo přidáno 100 μΐ tetramethylbenzidinového (TMB) substrátu. Vývin barvy byl odečten při 630 nm (referenčních 490 nm) a OD (630-490) byla vynesena proti log (10) koncentrace protilátky.

-11CZ 292295 B6

Při porovnání aktivit krysího 39D10, chimémího 39D10 a CTIL-5-10gH/gL6 ve výše uvedené kompetiční eseji, byly získány výsledky uvedené na obr. 11. Všechny tři protilátky soutěží stejně dobře s biotinylatovaným-39Dl pro navázání kIL-5, což indikuje, že CDR smyčky 39D10 byly úspěšně transferovány do lidských rámečků.

Vliv anti-IL-5 protilátky na opičí eosinofilii

Anti-IL-5 protilátka (CTIL-5-10gH/gL6) byla testována v opičím systému, který modeluje astmatické podmínky (viz Mauser P.J. a spol., Ann. Rev. Respir.Dis., v tisku). Při podání, jednu hodinu před podnětem sAscaris, responzivním opicím, inhibuje CTIL-5-10gH/gL6 plicní výplach eosinofílie ze 75 % v dávce 0,3 mg/kg i.v. Tato sada opic není hyperresponzivní khistaminu takže účinky CTIL-5-10gH/gL6 na hyperresponzivní nemohly být stanoveny. Tří měsíce po této jediné dávce je akumulace eosinofilu v odpovědi na podnět s Ascaris ještě inhibována ze 75 %.

U alergické myši CTHz-5-10gH/gL6 inhibuje plicní eosinofilii při 1 mg/kg i.p.

Seznam sekvencí (1) Obecná informace:

(i) Přihlašovatel:

(A) Jméno: CELLTECH LIMITED (B) Ulice: 216 ΒΑΊΉ ROAD (C) Město: SLOUGH (D) Stát: BERKSHIRE (E) Země: Velká Británie (F) Poštovní kód (ZIP): SLI4EN (G) Telefon: 0753 534655 (H) Telefax: 0753 536632 (I) Telex: 848473 (ii) Název vynálezu: Interleukin-5 specifické rekombinantní protilátky (iii) Počet sekvencí: 28 (iv) Počítačově čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC Kompatibiln (C) Pracovní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 48 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární

- 12CZ 292295 B6 (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

GCGCGCAAGC TTGCČGGCÁC CATGAAGATT GTGGTTAAAC TGGGxXTT (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 41 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

gcagatgggc ccttcgttga ggctgacagg agacctagtg a (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 44 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

GGACTG1TCC AAGCCCCCAC CATGAGTGTG CTGACTCAGG TCCT (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 30 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA

- 13CZ 292295 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

GCATACACTT GGTGCAGCAT CCGTAGGTT (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 333 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 1..333 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

CAA Clu i

TCT GGA Ser Gly

GGA Giy

GGC Gly 5

TTC Leu

GTA CAG CCA Val Gin Pro

TCA šer 10

CAG ACC CTG TCT

CTG ACC Leu Thr 15

48

Gin

Thr

Leu Ser

TGC

AC7 gtc

TCT

GGG

TTA

TCA

TTA

ACC

AGC

AAT

AGT

GTG

AAC

TGG

ATT

96

Cys

Thr Val

Ser

Gly Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Asn

šer

Val

Asn

Trp

Tle

20

25

30

CCG

CAC CCT

CCÁ

GGA

AAG

GGT

CTG

GAG

TGG

ATG

GGA

CTA

ATA

TGG

AGT

144

Arg

Glr. Pro

..Pro

Gly Lys Gly

Leu

Glu Trp

Met

Cly

Leu

Ile

Trp

Ser

3S

40

45

AAT

GGA GAC

AGA

GAT

TAT

AAT

TCA

GCT

ATC

aaa

TCC

CGA

CTG

AGC

ATC

192

Asn

Gly Asp

Thr

Asp Tyr

Asn

Ser

Ala

Ile

Lys Šer

Arg

Leu

Šer

Ile

5Č

55

60

ÁGT

AGG GAC

AGC

TCG

AAG

AGC

CAG

GTT

TTC

TTA AAC

ATG

AAC

AGT

CTG

240

ser

Are Asp

Thr

Sér

'Lva:

Sér

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Met

Asn

Šer

Leu

65

70

75

80

CAA

AG2 CAA

GAC

ACÁ

GCC

ATG

TAC

TTC

TGT

GCC

AGA

GAG

TAC

TAC

GGC

288

Gin

Ser Glu Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Phe

Cys

Ala

Arg

Glu Tyr

Tvr

Gly

85

90

95

TAC

TTT GAT

TAC

TGG

GGC

CAA

CCA

GTC

ATG

GTC

ACA

GTC

TCC

TCA

333

Tyr

Phe Asp

Tyr

Trp Gly Gin

Gly Val

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

100

105

110

14CZ 292295 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 111 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:

Glu

Se:

cly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Šer

Leu

Thr

1

5

10

15

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Vál

Asn

Trp

Tle

20

25

30

Arg

Glr:

Pro

Pro

Gly

Lys

cly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Leu

Ile

Trp

Šer

3S

40

45

Asn

Gly

ASp

Thr

Asp

Tyr

Asn

Sér

Ala

Ile

Lys

Ser

Arg

Leu

Ser

Ile

5Č

55

60

Ser

Are

Asp

Thr

Ser

Lys

ser

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Met

Asn

Ser

Leu

65

70

75

80

Gin

Sei

Glu

Asp

Thr

Ala

Mec

Tyr

Phe

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Gly

35

90

95

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Val

Met

Val

Thr

val

Ser

Ser

ίσο los no (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 384 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 1..384 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

-15CZ 292295 B6

ATG GCT

GTG

GCC

ACT

CAG

CTC

CTC

GGG

TTG

TTG

TTG

CTG

TGG

ATT

ACA

48

Met Ala

val

Pro

Thr

Gin

Léti

Leu

Gly

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Ile

Thr

1

5

10

15

GAT GCC

ATA

tgt

GAČ

ATC

CAG

ATG

AČA

CAG

TCT

CCA

GCT

TCC

CTG

TCT

96

Asp Ala

Ile

Cys

,ASp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

ALa

Ser 30

Leu

Ser

20

25

GCA TCT

CTG

GGA

GAA

ACT

ATC

TCC

ATC

GAA

TGT

CTA

GCA

AGT

CAG

GGC

144

Ala ser

Leu

Gly

Glu

Thr

Ile

ser

Ile

Glu

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

35

40

45

CCT

ATt TCC

AGT

TAT

TTA

GCG

TGG

TAT

CAG

CAG

AAG

CCA

GGG

AAA

TCT

192

Ile Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Tťp

Tyr

Gin

Glň

Lys

Pro

Gly

Lys

ser

Pro

5C

55

60

CAG CTC

CTG

ATC

TAT

GGT

GCA

AAT

AGC

TTG

CAA

ACT

GGG

GTC

CCA

TCÁ

240

Gin Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Aen.

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

65

70

75

80

CGG ttC.

AGT

GCC

AGT

GGA

TCT

GCC

ACA

CAA

TAT

TCT

CTC

AAG

ATC

AGC

286

Arg Fhe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

85

90

95

AGC Z TG

CAA

ccr

CAA

GAT

GAA

GGG

GAT

TAT

TTC

TGT

CAA

CAG

AGT

TAC

336

Ser ťet

Gin

Pro

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr-

100

105

110

AAG ZTT

CCG

aac

ACG

TTT

GGA

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAA

CTC

AAA

CGG

384

Lys Fhe

Pro

Aen

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

Arg

115

120

125

(2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 128 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

-16CZ 292295 B6

Hec

Ala

Val Pro

Thr Gin

Leu Leu

Gly

Leu

Leu

Leu

Leu

Trp

Zle

Thr

1

5

10

15

Asp

Ala

tle Cys

Asp Zlé

Gin Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

ser

Leu

Ser

zo

25

30

Ala

far

Leu Gly

Glu Thr

tle Ser

Ile

Glu

cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

35

40

45

tle-

Ser Ťys

Leu Ala

tra Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Cly

Lys

Ser

Pro

50

55

60

Gin

Leu

Leu tle

Tyr Gly

Ala Asn

Ser Leu

Gin

thr Gly

Val

Pro

Ser

65

70

75

80

Arg

í he

Ses Gly

Ser Gly

Ser Ala

Thr

Gin

Tyr

ser

Leu

Lys

Zle

Ser

85

90

95

Ser

Gin Pro 100

Glu Asp

Glu Gly

Asp 105

Tyt

Phe

Cys

Gin

Gin 110

Ser

tyr

Lys

řhe

PSů Asn

thr Phe

Gly Ala Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

Arg

115

120

125

(2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly : protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

Asp tle Gin Met Thr Gin Ser

5

Pro Ser Ser Leu Ser Ala Sér Val Gly

15

Asp Arg Val Thr Zle Thr Cya (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

-17CZ 292295 B6

Asp 11« Gin Met Thr Gin Ser Pro AI* ser Leu Ser AI* Ser Leu Gly i 5 10 15

Clu Thr Ile Ser Ile Glu Cys (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

Trp tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

trp Týr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser pro Gin Leu Leu Ile tyr i S 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

-18CZ 292295 B6

Cly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

Ser Gly Sér Gly Thr Asp Phe Thr 10 is

Leu Thr Tle ser Ser Leu Gin Pro

Glu Asp Phe Ala Thr

Tyr Tyr Cys (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:

Cly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gin 1 5 10

Leu Lys Ile Ser Ser Met Gin 20 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

Phe Gly Gin Gly (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární

Tyr Ser

Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys 25 30

Thr Lys val Glu Ile Lys Arg 5 iq

-19CZ 292295 B6 (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu tys Arg 1 S 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 30 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

Glu Val Gin Leu val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro i 5 10

Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 20

Ala ser Cly Phe

Thr Phe Ser (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

GLu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser 1 5 10

Cys Thr Val Sér Gly Leu Ser Leu Thr

25

Leu Thr

-20CZ 292295 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Glv Lea Clu Trp Val Sér 1 5 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 14 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Gla Trp Met Gly s 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Lea Tyr Lea Gin

S 10 1S

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Aap Thr Ala Val Tyr Tyr Čys Ala Arg

25 30

-21 CZ 292295 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

Arg Leu Ser IIa Ser Arg Asp Thr ser Lye Ser Gin Val Phe 1 5 10

Met Asn Ser Leu Gin Ser Glú Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 20 25 30 (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

Trp Gly Gin GLy Thr Leu Val Thr Val Sér Ser 1 S 10

Léu Lys

Ala Arg (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

-22CZ 292295 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 399 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 1..399 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

TTC GAA

GCC

GCC

ACC

ATG

TCT

GTC

CCC

ACC

CAA

GTC

CTC

GGT

CTC

CTG

48

Phe Clu

Ala

Ala

Thr

MOU

Ser

Val

Pro

Thr

Gin

Val

Leu

Cly

Lau

Leu

1

5

10

15

CTG C G

TGG

CTT

ACA

GAT

GCC

AGA

TGT

GAC

ATT

CAA

ATG

ACC

CAG

AGC

96

Leu Leu

Trp

Leu

Thr

Asp

Ala

Arg

Cys 25

Ašp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

20

30

CCA TÍC

ACC

CTG

ÁGC

CCA

TCT

GTA

CGA

GAC

CGG

GTC

ACC

ATC

ACA

TGT

144

Pro S-r

ser 35

Leu

Ser

Ala

Ser

val 4o

Gly

Asp

Arg

val

Thr 45

Ile

Thr

cys

CTA G-A

AGT

GAG

GGC

ATC

TCC

AGT

TAC

TTA

GCG

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

192

Leu Ala

Ser

Glu

Gly

Ile

Ser

ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

30

55

60

CCC G'G

AAA

CCT

CCT

AAG

CTC

CTG

ATC

TAT

GGT

GCG

AAT

AGC

TTG

CAG

240

Pro G’.y

Lys

Ala

Pro

LyS 70

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

65

75

80

act c ;a

GTA

CCA

TCA

AGA

TTC

AGT

GGC

TCA

GGA

TCC

CCT

ACA

GAC

TAC

288

Thr G Ly

val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ger

Ala

Thr

Asp

Tyr

85

90

95

ACG c:c

ACG

ATC

TCG

AGC

CTA

CAG

CCT

GAA

GAT

TTC

CCA

ACG

TAT

TAC

336

Thr L vj

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

100

105

110

TGT C A

CAG

TCG

TAT

AAG

TTC

CCC

AAC

ACA

TTC

GGT

CAA

GGC

ACC

AAG

384

Cys G '.n

Gin

Ser

Tyr

Lys

Phe

pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

11S

120

125

GTC C ΛΑ GTC AAA CGT 399

Val G'.u Val Lys Arg i:o

-23CZ 292295 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 133 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární ío (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

Phe Glu

Ala

Ala

Thr Met

Ser

Val

Pro

Thr

Gin

Val

Leu Gly Leu

Leu

1

5

10

15

Leu Leu

Trp Leu

Thr Asp Ala

Arg

Cys

Asp

Xle

Gin

Met Thr Gin

Ser

20

25

30

Pro Se z

Ser

Leu

Ser Ala

Ser

val

Cly

Asp Arg

Val

Thr

ILe Thr

Cys

35

40

45

Leu Ala

Ser

Glu

Gly ILe

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp Tyr

Gin Gin

Lys

50

55

60

Pro Glv

Lys

Ala

Pro Lys

Leu

Leu

Zle

Tyr Gly

Ala

Asn

Ser Leu

Gin

65

70

75

80

Thr Gly

Val

Pro

Ser Arg

Phe

Ser

cly

Ser

Gly

ser

Ala

Thr Asp

Tyr

as

90

95

Thr Leu

Thr

xxe

Ser Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr Tyr Tyr

100

105

110

Cys Gin

Gin

Ser

Tyr Lys

Phe

Pro Asn

Thr

Phe

Oly

Gin Gly Thr Lys

115

120

125

Vál Glu

Val

Lys

Arg

-24CZ 292295 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 420 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Rysy:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 1..420 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:

AAG

CTC

GCC

GCC

ACC

ATG GGC

TGG

AGC

TGT

ATC

ATC

CTG

TTC

TTA

GTA

48

Lys

Le ;

Ala

Ala

Thr

Met Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

Zle

Leu

Phe

Leu

Val

1

5

10

15

GCA

ACA

GCT

ACA

GGT

GTC CAC

TCC

GAG

GTC

CAA

CTG

GTA

GAA

TCT

GGA

96

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

Val His

Ser

Clu

val

Gin

Leu

Val

Clu

ser

Gly

20

25

30

GGŤ

GGT

CTC

GTA

CAC

CCA GGA

GGA

TCT

CTG

CGA

CTC

AGT

TCC

GCC

GTC

144

Gly

Cly

Leu

Val

Gin

Pro Cly

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

ser

Cys

Ala

Val

35

40

45

TCT

GCC

TTA

TCA

TTA

ACT AGT

AAT

AGT

GTG

AAC

TGG

ATA

CGG

CAA

GCA

192

Ser

Gly

Leu

Ser

Lén

Thr ser

Asn

Ser

Val

Asn

Trp

Zle

Arg

Gin

Ala

SO

55

60

CCT

GCC

AAC

GGT

CTC

GAG TGG

GTT

GGA

CTA

ATA

TGG

AGT

AAT

GGA

CAC

240

Pra

Gl·-·

Lys

Gly

Leu

Glu Trp

Val

Gly

Leu

Ile

Trp

Ser

Asn

Gly

Asp

65

70

75

80

ACA

GAT

TAT

AAT

TCA

GCT ATC

AAA

TCT

CGA

TTC

ACA

ATC

TCT

AGA

GAC

288

Thr

Asp

Tyr

Asn

Sér

Ala ile

Lys

sér

Arg

Phe

Thr

ILe

Ser

Arg-

Asp

85

90

95

ACT

TCP

AAG

AGC

ACC

GTA TAC

GTG

CAG

ATG

AAC

AGT

CTG

AGÁ

GCT

GAA

336

Thr

Ser

Lys

Ser

Thr

Val Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

100

105

110

CAT

ACT

CCA

CTC

TÁC

TAC TCT

GCT

CGT

GAG

TAC

TAT

GGA

TAT

TTC

CAC

384

Asp

T:-.r

Ala

Val

Tyr

Tyr cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Phe

Asp

115

120

125

TAT

TCG

GGT

CAA

GGT

ACC CTA

GTC

ACA

GTC

TCC

TCA

420

Tyr

T-p

Gly

Gin

Glý

Thr Leu

Val

Thr,

Val

Ser-

Ser

130 135 ' 140

-25CZ 292295 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 28:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 140 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein o

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:

Lys L‘:u Ala 1	Ala	Thr S	Hét	Gly	Trp	Ser	cys 10	Ile	Ile Leu Phe Leu 15	val
Ala Tfr Ala	Thr 20	Gly Val	His	ser	Glu 25	Val	Gin	Leu Val Glu ser 30	Gly
Gly GLy Leu 35	Val	Gin	Pro Gly Gly 40	Ser	Leu	Arg	Leu Ser Cys Ala 45	Val
Ser G).y Leu 50	Ser	Leu	Thr	Ser 55	Asn	Ser	Val	Asn	Trp Ile Arg Gin 60	Ala
Pro GI y Lys 65	Gly	Leu	Glu 70	Trp	Val Gly	Leu	Ile 75	Trp Ser Asn Gly	Ásp 80
Thr Af? Tyr	Asn	Ser 85	Ala	Tle	Lys	ser	Arg 90	Phe	Thr ile ser Arg 95	ASp
Thr Síi? Lys	Sér 100	Thr	Vál	Tyr	Leu	Gin 105	Met	Asn	Ser Leu Arg Ala HP	G1U
Asp Thr Ala 115	val	Tyr Tyr Cys	Ala 120	Arg	Glu tyr	Tyr Gly Tyt Phe Ásp 125
Tyr Τιό Gly 130	Gin	Gly Thr	Leu 135	Val	Thr	val	'Ser	Sér 140

-26CZ 292295 B6

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní protilátková molekula, obsahující kompozitní těžký řetězec a kompozitní lehký řetězec, mající afinitu pro lidský IL-5 antigen, kde variabilní doména uvedeného kompozitního těžkého řetězce obsahuje převážně zbytky úseku základní struktury těžkého řetězce protilátkového akceptoru, přičemž variabilní doména těžkého řetězce obsahuje donorové zbytky z těžkého řetězce myší monoklonální protilátky 39D10 na zbytcích 31 až 35, 50 až 65 a 95 až 102 a zbytcích úseku základní struktury 24, 27 až 30, 37, 49, 73, 76 a 78, a variabilní doména uvedeného kompozitního lehkého řetězce obsahuje převážně zbytky úseku základní struktury lehkého řetězce protilátkového akceptoru, přičemž tato variabilní doména obsahuje donorové zbytky z lehkého řetězce myší monoklonální protilátky 39D10 na zbytcích 24 až 34, 50 až 66 a 89 až 97 a na zbytcích úseku základní struktury 68 a 71, podle číslování poloh dle Kabata.
2. 2. Rekombinantní protilátková molekula podle nároku 1, kde uvedený kompozitní těžký řetězec dále obsahuje donorové zbytky z myší monoklonální protilátky 39D10 na zbytcích úseku základní struktury 23 a 77, podle číslování poloh podle Kabata.
3. 3. Rekombinantní protilátková molekula podle nároku 1 nebo 2, kde uvedený lehký kompozitní řetězec dále obsahuje donorové zbytky z myší monoklonální protilátky 39D10 na zbytku úseku základní struktury 22.
4. 4. Protilátková molekula podle některého z nároků 1 až 3, kde akceptorové zbytky pro kompozitní těžký řetězec jsou zbytky těžkého řetězce lidské skupiny ΙΠ a akceptorové zbytky pro kompozitní lehký řetězec jsou zbytky lehkého řetězce lidské skupiny I.
5. 5. Rekombinantní protilátková molekula mající afinitu pro lidský IL-5 antigen podle některého z předchozích nároků obsahující variabilní region těžkého řetězce znázorněný na obr. 6 <SEQ ID 28> a variabilní region lehkého řetězce znázorněný na obr. 5 <SEQ ID 26>.
6. 6. DNA sekvence, která kóduje kompozitní těžký řetězec a/nebo kompozitní lehký řetězec protilátky podle kteréhokoliv z předchozích nároků.
7. 7. Terapeutická nebo diagnostická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje protilátkovou molekulu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem nebo excipientem.
8. 8. Protilátková molekula podle některého z nároků 1 až 5 pro použití v terapii nebo diagnóze.
9. 9. Použití účinného množství protilátkové molekuly podle některého z nároků 1 až 5 pro výrobu léčiva pro podání lidskému nebo zvířecímu subjektu pro terapii nebo diagnózu.

   12 výkresů