HU221641B1

HU221641B1 - Interleukin-5 specifikus rekombináns antitestek

Info

Publication number: HU221641B1
Application number: HU9603183A
Authority: HU
Inventors: Diljeet Singh Athwal; Mark William Bodmer; John Spencer Emtage
Original assignee: Celltech Therapeutics Ltd.
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-16
Publication date: 2002-12-28
Also published as: DE69532889D1; JPH10501697A; NO964808L; WO1995035375A1; ES2218546T3; SK160096A3; ATE264389T1; ZA954990B; IL114179A; AU2680395A; US6734286B2; US20020042089A1; GB9412230D0; EP0765392B1; CZ371296A3; HU9603183D0; FI965032A; US6316227B1; US5998586A; AU694783B2

Abstract

A találmány tárgya rekombináns antitestmolekula, amely összetett nehézláncot és könnyű láncot tartalmaz, affinitása van humán IL–5antigénhez, az összetett nehéz lánc variábilis doménje túlnyomórésztakceptorantitest nehéz lánc frameworkcsoportokat tartalmaz, avariábilis domén 39D10 patkány monoklonális antitest nehéz láncábólszármazó donorcsoportokat tartalmaz a 31–35, 50–65 és 95–102pozíciókban és a framework 24, 27–30, 37, 49, 73, 76 és 78pozícióiban. A találmány további tárgya egy olyan rekombinánsantitestmolekula, amely nehéz láncot és összetett könnyű láncottartalmaz, affinitása van humán IL–5 antigénhez, az összetett könnyűlánc variábilis doménje túlnyomórészt akcep- torantitest könnyű láncframeworkcsoportokat tartalmaz, a variábilis domén 39D10 patkánymonoklonális antitest könnyű láncából származó donorcsoportokattartalmaz a 24–34, 50–56 és 89–97 pozíciókban és a framework 68 és 71pozícióiban. ŕ

Description

A találmány rekombináns antitestmolekulára (RAM) vonatkozik, különösen egy humán interleukin-5 (hIL-5) specifikus humanizált antitestmolekulára, továbbá az említett rekombináns antitest nehéz és könnyű láncai variábilis doménjeit kódoló nukleinsavakra. A találmány az említett antitest előállítására alkalmas eljárásra is vonatkozik, amelyben rekombináns DNS-technológiát használunk és a rekombináns antitest terápiás alkalmazására.

Ebben a bejelentésben a „rekombináns antitestmolekula” (RAM) kifejezés alatt olyan antitestet értünk, amelyet rekombináns DNS-technológiát tartalmazó eljárással állítunk elő. A „humanizált antitestmolekula” (HAM) kifejezés egy olyan molekulára vonatkozik, amely humán immunglobulinból származik. Az antigénkötő hely vagy teljes variábilis doméneket tartalmazhat a konstans doménekhez fuzionálva, vagy pedig a variábilis doménben a megfelelő variábilis szakasz vázakba (framework=FW) beültetve egy vagy több komplementaritást meghatározó szakaszt (complementary determining region=CDR) tartalmazhat. A mAt rövidítés monoklonális antitestet jelent.

A „rekombináns antitestmolekula” kifejezés nemcsak teljes immunglobulin-molekulákra vonatkozik, hanem minden antigénkötő immunglobulin-fragmentumra is - ilyenek az Fv-, Fab- és Ffab’^-fragmentumok - és ezek származékaira, ilyenek az egyláncú Fv-fragmentumok.

A természetes immunglobulinokat eddig vizsgálati és diagnosztikai célra használták és korlátozott mértékben gyógyításra. Az immunglobulinok gyógyászatban való felhasználását az gátolta, hogy a legtöbb, potenciálisan terápiás szerként használható antitest olyan mAt, amelyet rágcsálólépsejtek rágcsáló-mielómasejtekkel való fúziója révén állítottak elő. Ezek a mAt-ek tehát lényegében rágcsálóproteinek. Ezeknek a mAt-eknek mint terápiás szereknek a felhasználása emberben nem kívánt immunválaszt idézhet elő, amelyet HAMA(Human Anti-mouse Antibody) válasznak neveznek. Tehát embereknél a rágcsáló-mAt-eknek mint terápiás szereknek a használatát önmagában korlátozza az a tény, hogy a beteg ember olyan immunológiai választ fog adni a mAt-re, amely ezt vagy teljesen kiküszöböli, vagy legalábbis csökkenti hatékonyságát.

Számos technikát fejlesztettek ki annak érdekében, hogy az ilyen nem humán mAt-ek antigén tulajdonságait csökkentsék. Ezek a technikák általában a rekombináns DNS-technológia használatát is magukban foglalják, hogy az antitestmolekula polipeptidláncait kódoló DNS-szekvenciákat manipulálhassák. Ezeket a módszereket általánosságban „humanizáló” technikáknak nevezik.

A humanizált mAt-ek előállítására szolgáló korai módszerekkel olyan kiméra antitesteket termeltek, amelyekben az antitest teljes variábilis doménjét tartalmazó antigénkötő helyet egy másik antitestből származó konstans doménekkel fuzionálták. Az ilyen kimerizációs eljárások kivitelezésére alkalmas módszerek leírását tartalmazza az EP-0120694 számú szabadalmi leírás (Celltech Limited) és az EP-0120023 számú szabadalmi leírás (Genentech Inc. és City of Hope). Ezeknek a humanizált kiméra antitesteknek azonban egy jelentős része még nem humán aminosavszekvenciákból áll és még bizonyos HAMA-válaszokat idézhetnek elő, különösen, ha hosszú időn keresztül alkalmazzák [Begent et al., Br. J. Cancer, 62, 487 (1990)] ezeket.

Egy másik megközelítés szerint - leírását lásd az EP-A-0239400 számú szabadalmi bejelentésben (Winter) - rekombináns DNS-technikák használatával egy egér-mAt-komplementaritást meghatározó szakaszait (CDR-eit) beültették egy humán immunglobulin variábilis doménjeinek FW-szakaszaiba. Mind a nehéz, mind a könnyű lánc variábilis domének három CDR-t tartalmaznak (CDR1, CDR2 és CDR3). Valószínű, hogy az ilyen CDR-beültetett (CDR-grafted) humanizált antitestek sokkal kevésbé idéznek elő HAMAválaszt, mint a humanizált kiméra antitestek, mivel sokkal kisebb arányban tartalmaznak nem humán aminosavszekvenciákat. Riechmann és munkatársai [Natúré, 332, 323-324 (1988)] azt találták, hogy csupán a CDR-ek átvitele - mint Kábát megállapította [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Humán Services, NIH, USA (1987)] - nem volt elégséges ahhoz, hogy megfelelő antigénkötő aktivitással rendelkezzék a CDR-beültetett tennék. Riechmann és munkatársai megállapították^ hogy a CDR-eken kívül számos csoportot meg kell változtatni, különösen a CDR1 szomszédságában lévő hurokban. Azonban a legjobb CDR-beültetéssel kapott an» titestek kötőaffinitása is még mindig jelentősen kisebbe volt, mint az eredeti mAt-é.

A WO 91/09967 számon nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésben Adair és munkatársai CDRbeültetett antitest nehéz és könnyű láncokat írtak le, és meghatározták a donorcsoportok hierarchiáját

A WO 93/16184 számon nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésben Chou és munkatársai humán interleukin-5 elleni humanizált monoklonális antitestek tervezését, klónozását és expresszióját ismertették. Módszert javasoltak állati antitest humanizálásához humán ffameworkszakaszok gyanánt használható humán antitestszekvenciák kiválasztására. A módszer a következő lépéseket tartalmazza: a humán variábilis doménszekvenciákat össze kell hasonlítani a humanizálandó állati mAt variábilis doménszekvenciákkal azonosságaik százalékos aránya, a szekvenciák eltérései és a PIN-szakasz-távolság (PIN-region spacing) hasonlósága szempontjából. A PIN-szakasz-távolságot a doménen belüli diszulfidhidakat alkotó ciszteincsoportok közötti csoportok száma határozza meg. Azt a humán antitestet választották, amely ezen jellemzők legjobb kombinációját tartalmazta. Annak meghatározására is módszert javasoltak, hogy egy állati mAt mely variábilis doméncsoportjait kell kiválasztani humanizáláshoz. A módszer abból állt, hogy meghatározták az állati monoklonális antitest potenciális minimumcsoportjait (idetartoznak a CDR strukturális hurkok, és azok a csoportok, amelyek a CDR strukturális fenntartásához és/vagy orientálásához szükségesek) és maximumcsoportjait [ilyen csoportok a Kabat-féle CDR-ek, a CDR

HU 221 641 Bl strukturális hurkok, azok a csoportok, amelyek a CDR strukturális hurkok fenntartásához és/vagy orientálásához szükségesek és olyan csoportok, amelyek egy CDR strukturális huroktól körülbelül 1 nm-en belül (10 Á-ön belül) foglalnak helyet és körülbelül 0,5 nm²-nél vagy ennél nagyobb, vizes oldószer által hozzáférhető felülettel rendelkeznek]. Ezenkívül számitógépes modellt készítettek minden lehetséges rekombináns antitestről, amelyek olyan humán antitest framewoikszekvenciát tartalmaznak, amelybe minimum- és maximumcsoportokat építettek be. A minimum- vagy maximumcsoportokat úgy választották ki, hogy kombinációjuk az állati monoklonális antitest szerkezetét legjobban megközelítő komputermodell-struktúrával rendelkező rekombináns antitestet eredményezze. A kapott humanizált anti-IL-5 antitest azonban úgy tűnt, hogy a hIL-5 molekulához való affinitásának lényeges részét elvesztette.

A találmány célul tűzi ki, hogy olyan humanizált antitestmolekulát bocsásson rendelkezésre, amely a hIL-5 molekulával szemben javított affinitással rendelkezik.

A találmány tehát egy olyan rekombináns antitestmolekulát ismertet, amely összetett nehéz láncot és könnyű láncot tartalmaz, affinitása van humán IL-5 antigénhez, az összetett nehéz lánc variábilis doménje túlnyomórészt akceptorantitest nehéz lánc frameworkcsoportokat tartalmaz, a variábilis dómén 39D10 patkány monoklonális antitest nehéz láncából származó donorcsoportokat tartalmaz a 31-35,50-65 és 95-102 pozíciókban és a ffamework 24, 27-30, 37, 49, 73, 76 és 78 pozícióiban [a Kabat-féle számozási rendszernek megfelelően, Kábát et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1. kötet, 5. kiadás (1991), US Department of Health and Humán Services, National Institute of Health],

Előnyös, ha az említett rekombináns antitestmolekula a 23 és 77 ffameworkpozíciókban is 39D10 patkány monoklonális antitestből származó donorcsoportokat tartalmaz.

A találmány továbbá egy olyan rekombináns antitestmolekulát is ismertet, amely nehéz láncot és összetett könnyű láncot tartalmaz, affinitása van humán IL-5 antigénhez, az összetett könnyű lánc variábilis doménje túlnyomórészt akceptorantitest könnyű lánc frameworkcsoportokat tartalmaz, a variábilis dómén 39D10 patkány monoklonális antitest könnyű láncából származó donorcsoportokat tartalmaz a 24-34, 50-56 és 89-97 pozíciókban és a framework 68 és 71 pozícióiban.

Előnyös, ha az említett rekombináns antitestmolekula a 22 frameworkpozícióban is 39D10 patkány monoklonális antitestből származó donorcsoportokat tartalmaz.

A 39D10 mAt nehéz és könnyű lánc variábilis doméneket a továbbiakban részletesen ismertetjük az 1. és 2. ábrára való hivatkozással.

A találmány egy további előnyös elemét egy olyan humán IL-5-höz affinitással rendelkező anti-IL-5 antitestmolekula képezi, amely valamilyen, a fentiekben ismertetett összetett nehéz láncot és valamilyen, a fentiekben ismertetett összetett könnyű láncot tartalmaz.

A találmány szerinti RAM-ok affinitáskonstansa humán IL-5-tel szemben előnyösen nagyobb mint

10-’ M.

Kedvezően értékelendő, hogy a találmány általában széles körben alkalmazható anti-IL-5 RAM-ok előállítására. Az akceptorantitest ugyanazon fajhoz tartozó állatból származhat, mint a donorantitest, sőt ugyanazon antitestosztályhoz vagy alosztályhoz tartozhat. A donor- és akceptorantitestek azonban még gyakrabban különböző fajú állatokból származnak.

Bármilyen megfelelő akceptor variábilis FW szekvencia használható, azon donorantitest-osztály vagy -típus tekintetbevétele mellett, amelyből az antigénkötő szakaszok származnak. Előnyös, ha a használt akceptor FW-típusa ugyanahhoz vagy hasonló osztályhoz vagy típushoz tartozik, mint a donorantitest. Előnyös, ha a kiválasztott FW-nek a legnagyobb a homológiája a donorantitesthez. Előnyösen a humán III csoportú gammacsíravonal-FW-ket használjuk az összetett nehéz lánchoz és a humán I csoportú kappa-csiravonal-FW-ket használjuk az összetett könnyű láncokhoz.

A találmány szerinti RAM-ok konstans szakaszdoménjeit az antitest tervezett funkcióinak figyelembevételével választhatjuk ki, elsősorban az esetleg szükséges effektorfiinkciókat tekintve. A konstans szakaszdomének lehetnek például humán IgA, IgE, IgB vagy IgM domének Pontosabban, humán IgG konstans szakaszdoméneket - főként IgGl vagy lgG3 izotípust - hasz- i nálhatunk, ha a humanizált antitestmolekulát terápiása l használatra szánjuk és antitesteffektor funkciókra van ? f szükség. Vagy használhatjuk az IgG2 és IgG4 izotípu-< | sokat, ahol a humanizált antitestmolekulát terápiás célok- } ra szánjuk, de antitesteffektor-funkciókra nincs szükség, ? I például ha humán IL-5 specifikus kötéshez vagy a hu- · | mán IL-5 biológiai aktivitásának neutralizálására hasz- E náljuk. Használhatunk olyan módosított humán kons- * tans szakaszdoméneket is, amelyekben egy vagy több f aminosavmaradékot megváltoztattunk vagy töröltünk azért, hogy megváltoztassunk egy speciális effektorfunkciót. Előnyös, ha a RAM-ok konstans szakaszdoménjei humán IgG4 domének.

Ebben a bejelentésben a fentiekben és máshol a csoportjelölésekre használt számozás a Kabat-féle számozásnak felel meg [Kábát et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1. kötet, 5. kiadás (1991)

US Department of Health and Humán Services, National Institute of Health]. Ennélfogva a csoportjelölések nem felelnek meg mindig pontosan az aminosavcsoportok lineáris számozásának. Az aktuális lineáris amino- i savszekvencia kevesebb vagy több aminosavat tartalmazhat, mint a Kabat-féle számozásban, annak megfelelően, hogy vagy rövidítettük az alap variábilis doménszerkezetet vagy pedig abba beépítettünk.

A találmány szerinti anti-IL-5 antitestmolekulákhoz effektor- vagy riportermolekulák is kapcsolódhatnak. Egyébként a rekombináns DNS-technológia eljárásait felhasználhatjuk olyan immunglobulin-molekulák j előállítására is, amelyekben egy teljes immunglobulin Fc-ffagmentumát vagy CH3 doménjét egy funkcionáli- r san nem immunglobulin-proteinnel helyettesítettük, pél3

HU 221 641 Β1 dául enzimmel, citokinnel, növekedési faktorral vagy toxinmolekulával, vagy ezeket peptidkötéssel kapcsoltuk az előbb említett fragmentumhoz vagy doménhez.

Nem szükséges tehát, hogy az antitestmolekulák minden része csak immunglobulinokból származó szekvenciákat tartalmazzon. Szerkeszthetünk például egy olyan gént, amelyben egy humán immunglobulinláncrészt kódoló DNS-szekvenciát egy olyan DNS-szekvenciához fuzionálunk, amely egy polipeptideffektor- vagy riportermolekula aminosavszekvenciáját kódolja.

A találmány további elemeit olyan DNS-szekvenciák képezik, amelyek az összetett nehéz láncot és az összetett könnyű láncot kódolják. A DNS-szekvenciákat tartalmazó klónozó- és expressziós vektorok, a DNS-szekvenciákkal transzformált gazdasejtek, az antitestmolekulák termelésére szolgáló eljárások, amelyek a DNS-szekvenciáknak a transzformált gazdasejtekben való kifejezését tartalmazzák, ugyancsak a találmány további elemeit képezik.

A vektorok szerkesztésére szolgáló általános módszerek, a transzfekciós módszerek és tenyésztési módszerek jól ismertek ezen a szakterületen és nem képezik a találmány részét.

Az anti-IL-5 donor aminosavszekvenciákat kódoló DNS-szekvéne iákat a szakterület ismert módszereivel állíthatjuk elő (lásd például a WO 93/16184 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi bejelentést). AntiIL-5 antitestet kódoló szekvenciákat például megfelelő hibridóma-sejtvonalakból - ilyen például a 39D10 sejtvonal - genomiális klónozással vagy cDNS-klónozással kaphatunk. A pozitív kiónokat a kívánt nehéz és könnyű láncoknak megfelelő szondákkal szűrhetjük. PCR klónozást is végezhetünk.

Akceptor-aminosavszekvenciákat kódoló DNS-hez bármilyen alkalmas módon hozzájuthatunk. Előnyös humán akceptor-FW-ket - ilyenek a humán I csoportú könnyű láncok és a humán IQ csoportú nehéz láncok kódoló-DNS-szekvenciák a szakterületen dolgozók számára könnyen hozzáférhetőek.

A kívánt DNS-szekvenciák előállítására a molekuláris biológia standard technikáit használhatjuk. Oligonukleotidszintetizáló technikákkal a szekvenciák egészét vagy részét szintetizálhatjuk. Helyre irányuló mutagenizáló vagy polimeráz-láncreakció (PCR)-technikákat is alkalmazhatunk, szükség szerint. Használhatjuk például a Jones és munkatársai által leírt [Natúré, 321, 522 (1986)] oligonukleotidokra irányuló szintézist. Egy már meglévő variábilis szakasznál oligonukleotidra irányuló mutagenezist - például ahogyan Vemoeyen és munkatársai leírták [Science, 239, 1534-1536 (1988)] - szintén alkalmazhatunk. A hézagos oligonukleotidok enzimes betöltésének módszerét - polimeráz segítségével - szintén használhatjuk, például Queen és munkatársai szerint [Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 10029-10033 (1989)] és a WO 90/07861 számon nyilvánosságra hozott nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint.

Minden alkalmas gazdasejt- és vektorrendszer használható a RAM-ot kódoló DNS-szekvenciák kifejezésére. Előnyösen eukarióta - például emlős - gazdasejt expressziós rendszereket használunk. Pontosabban, alkalmas emlősgazdasejtek például a CHO-sejtek és a mielóma- vagy hibridóma-sejtvonalak.

A találmány további tárgyát képezi tehát egy eljárás, amely anti-IL-5 RAM előállítására alkalmas és a következő lépésekből áll:

a) az első expressziós vektorban egy olyan DNSszekvenciát tartalmazó operont állítunk elő, amely egy, a találmány első előnyös eleme szerint meghatározott összetett nehéz láncot kódol;

b) adott esetben az első vagy egy második expressziós vektorban egy olyan DNS-szekvenciát tartalmazó második operont állítunk elő, amely egy komplementer könnyű láncot kódol, és ez a könnyű lánc a találmány második előnyös eleme szerint meghatározott összetett könnyű lánc lehet;

c) a gazdasejtet a vektorral vagy mindegyik vektorral transzfektáljuk; és

d) a transzfektált sejtvonalakat tenyésztjük a RAM termelése céljából.

Az eljárás ezenkívül magában foglalhatja olyan szekvenciák használatát, amelyek összetett könnyű láncot és komplementer nehéz láncot kódolnak.

Mind nehéz, mind könnyű láncokat tartalmazó RAM-ok előállítása céljából asejtvonalakat két vektorral transzfektálhatjuk. Az első vektor egy összetett vagy komplementer nehéz láncot kódoló operont tárták mazhat és a második vektor egy komplementer vagy összetett könnyű láncot kódoló operont tartalmazhat Előnyös, ha a vektorok azonosak, kivéve azt az esetet; amikor a szóban forgó kódolószekvenciák és szelekciós maikerek - amennyire lehetséges - biztosítják, hogy mindegyik polipeptidlánc egyformán fejeződjék ki. Egy előnyös másik módszerben egyetlen vektort használhatunk, amennyiben a vektor mind a nehéz láncot, mind a könnyű láncot kódoló szekvenciákat tartalmazza.

A nehéz és könnyű láncok kódolószekvenciáiban a DNS vagy cDNS-t vagy genomiális DNS-t tartalmazhat, de tartalmazhatja mindkét típust.

A találmány RAM-okat tartalmazó terápiás és diagnosztikus készítményekre is vonatkozik, valamint az ilyen készítmények felhasználására a terápiában és a diagnosztikában.

Ennélfogva a találmány további elemét egy olyan terápiás vagy diagnosztikus készítmény képezi, amely a találmány előbb említett elemeinek megfelelő RAM-ot tartalmaz egy gyógyszerészeti szempontból elfogadott kötőanyaggal, hígítószerrel, vagy hordozóanyaggal kombinálva.

Ezeket a készítményeket a találmány szerinti RAMok felhasználásával állítjuk elő. Ezek a RAM-ok lehetnek például teljes antitestek, egyláncú Fv-fragmentumok vagy antitestfragmentumok, mint a Fab- vagy Fvfragmentumok. Ezek a készítmények IL-5-blokkoló vagy IL-5-antagonista hatással rendelkeznek és az IL-5-akti vitás szuppresszálására használhatók.

A találmány szerinti készítményeket bármilyen megfelelő módon való alkalmazáshoz formulázhatjuk, a megfelelő szokásos gyakorlat szerint, például folyadék formában (például: RAM-oldat, steril, fiziológiailag elfogadható pufferben) általában például intravé4

HU 221 641 Bl nás, intraperitoneális vagy intramuszkuláris alkalmazáshoz; permet (spray) formában, például orron vagy szájon keresztül történő alkalmazáshoz; vagy implantációhoz alkalmas formában.

A találmány egy olyan terápiás vagy diagnosztikai módszert ismertet, amely a találmány előző elemeinek megfelelő RAM hatásos mennyiségének, előnyösen 0,1-10 mg/kg testtömegnek, beteg embernél vagy állatnál való alkalmazását tartalmazza. A pontos adagolás és a teljes dózis a RAM kívánt felhasználásának és a kezelendő beteg korának és állapotának megfelelően változik. A RAM egyadagos formában, vagy egy ideig folyamatosan alkalmazható. A dózisok szükség esetén ismételten adhatók.

A találmány előbb említett elemei szerinti RAM minden olyan terápiás felhasználásra alkalmas, amelyekhez anti-IL-5 antitesteket - például a 39D10-et használtak, vagy a jövőben használhatnak.

Az IL-5 az eozinofil sejtek fő aktivátora, és kimutatták, hogy e citokin funkciójának antitestekkel való blokkolása megakadályozza vagy csökkenti az eozinofíliát, amely bizonyos allergiás betegségekhez társul. Ennélfogva a találmány szerinti RAM felhasználható erre a célra, és különösen az asztma kezelésében lenne hasznos, amikor is várhatóan megakadályozza az eozinofilek felgyülemlését és aktiválódását az asztmás tüdőben, miáltal csökkenti a hörgőgyulladást és a légutak beszűkülését. Az asztma kezeléséhez használt találmány szerinti RAM előnyösen egyláncú Fv-fragmentum lehet, amelyet például orron keresztül történő alkalmazáshoz sprayként formulázunk.

A találmány szerinti anti-IL-5 antitestmolekula előállításának egy előnyős technológiai előiratát az alábbiakban ismertetjük. Ez az előirat nem befolyásolja hátrányosan a találmányi leírás általánosító jellegét.

A humán IL-5 ellen termelt 39D10 patkány monoklonális antitestet használtuk donorantitestként. A 39D10 antitest nehéz és könnyű láncai variábilis doménjeinek klónozása előzőleg megtörtént (WO 93/16184). Ezen domének nukleotid- és előre látható aminosavszekvenciáit az 1. és a 2. ábrán mutatjuk be. A megfelelő akceptor nehéz és könnyű lánc variábilis doméneket meg kell határozni és ismerni kell az aminosavszekvenciát. Ezután tervezzük meg a RAM-ot, kiindulva az akceptorszekvencia-alapból.

1. CDR-ek

Első lépésként a CDR-ekben donorcsoportokkal helyettesítjük az akceptorcsoportokat. Ebből a célból a CDR-eket előnyösen a következőképpen definiáljuk:

nehéz lánc CDR1: 31-35 csoport CDR2: 50-65 csoport CDR3: 95-102 csoport könnyű lánc CDR1: 24-34 csoport CDR2: 50-56 csoport CDR3: 89-97 csoport

Azokat a pozíciókat, amelyeknél donorcsoportokkal kell szubsztituálnunk az akceptorcsoportokat az FW-ben, a következőképpen választjuk ki, mindenekelőtt a nehéz láncot illetően és ezután a könnyű láncot illetően.

2. Nehéz lánc

2.1 Donorcsoportokat használunk a nehéz láncban vagy a 24, 27-30, 37, 49, 73, 76 és 78 pozíciók mindegyikénél vagy a 23, 24, 27-30, 37, 49, 73 és 76-78 pozíciók mindegyikénél.

3. Könnyű lánc

3.1 Donorcsoportokat használunk vagy a 22, 68 és 71 pozíciókban mindenütt vagy mind a 68, mind a 71 pozícióban.

A találmány egy olyan rekombináns anti-IL-5 antitestmolekulára vonatkozik, amelynek a kötőaffinitása lényegében azonos a donorantitest kötőaffinitásával. A találmányt az alábbi példákkal - a csatolt ábrákra hivatkozva - szemléltetjük.

Az 1. ábra a 39D10 nehéz lánc nukleotid- és aminosavszekvenciáját mutatja be.

A 2. ábra a 39D10 könnyű lánc nukleotid- és aminosavszekvenciáját mutatja be.

A 3. ábrán a 39D10 könnyű lánc variábilis dómén framewoikszakaszoknak a humán I csoportú könnyű láncok általánosan elfogadott szekvenciájú könnyű lánc variábilis dómén frameworkszakaszokkal való összehasonlítása látható.

A 4. ábrán a 39D10 nehéz lánc variábilis dómén frameworkszakaszoknak a humán III csoportú nehéz láncok általánosan elfogadott szekvenciájú nehéz lánc variábilis dómén frameworkszakaszokkal való»; összehasonlítása látható.

Az 5. ábra a CDR-beültetett anti-IL-5 CTIL-5gL6 könnyű lánc nukleotid- és ami-? nosavszekvenciáját ábrázolja.

A 6. ábra a CDR-beültetett anti-IL-5 CTIL-5lOgH nehéz lánc nukleotid- és aminosavszekvenciáját ábrázolja.

A 7. ábrán a pMR14 plazmid térképe látható.

A 8. ábrán a pMR15.1 plazmid térképe látható.

A 9. ábra egy kiméra 39D10 antitest és a

CTIL-5-10gH/gL6 antitestaffinitás konstansát és asszociációs és dizasszociációs sebességét mutatja be.

A 10. ábrán az IL-5 neutralizációjának grafikonja látható. A neutralizálást a TFl-vizsgálatban egy antitestpanellel végeztük.

A11. ábra a patkány 39D10, egy kiméra 39D10 antitest és a cTIL-510gH/gL6 antitest versenyeztetési kísérletének eredményét mutatja be.

A 12. ábra a CTIL-5-10gH/gH6 majom-eozinofíliára gyakorolt hatását ábrázolja.

Példa

1. Anyagok és módszerek

A 39D10 egy humán IL-5 ellen termelt patkány monoklonális antitest. A 39D10 nehéz és könnyű lánc variábilis doménjeit kódoló gének klónozása előzőleg megtörtént (WO 93/16184). Ezen domének nukleotidszekvenciáit és kikövetkeztetett aminosavszekvenciáit az 1. és a 2. ábra mutatja be. A 39D10 variábilis

HU 221 641 Bl doménjeinek klónozásánál használt stratégia következtében a frameworkszakaszok első öt aminosava nem ismert. Azonban rendelkezésre állt egy nehéz lánc, amely az YTH 34.5HL antitest framework 1 vezérszekvenciáját és első öt aminosavát tartalmazta [Riechmann et al., Natúré, 332, 323-327 (1988)].

2. Molekuláris biológiai eljárások

A használt molekuláris biológiai eljárások leírása megtalálható Maniatis és munkatársai „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” [2. kiadás, 1-3. kötet, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] című munkájában.

3. Rekombináns nehéz és könnyű lánc gének szerkesztése

Nehéz lánc

Egy nehéz lánc Vh-szakaszt állítottunk elő PCR-rel, az R3601 és az R2155 oligonukleotidok használatával. Ezek szekvenciája a következő:

R3601

5’GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGAAG(A,T) TGTGGTTAAACTGGGTTTT3’ R2155 5’GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A,C)(A, G)GAGAC(G,T,A)GTGA3’

A reakcióelegy (100 μΐ) összetétele a következő: 10 mM trisz.HCl, pH 8,3, 1,5 mM magnézium-klorid, 50 mM kálium-klorid, 0,01% (tömeg/térf) zselatin, 0,25-0,25 mM az egyes dezoxiribonukleozid-trifoszfátokból, 0,1 pg 39D10 nehéz lánc DNS, 6-6 pM R3601 & R2155 és 0,25 egység Taq polimeráz. A reakcióelegyet 94 °C-on 5 percig melegítettük, majd ciklusonként a kővetkező hőmérsékleteket alkalmaztuk: 94 °C 1 percig, 55 °C 1 percig és 72 °C 1 percig. Harminc ciklus után a reakcióelegyet azonos térfogatú fenol/kloroform (1:1, térf/térf) elegyével, azután kloroformmal extraháltuk, majd 2,5 térfogat etanol hozzáadásával csaptuk ki. A PCR-terméket a megfelelő pufferben oldottuk, Hind III-mal és Apai-gyei emésztettük, agarózgélen tisztítottuk, majd a pMR14 vektorba (7. ábra) ligáitok, amelyet előzőleg szintén HindlII-mal és Apai-gyei emésztettünk. A kapott vektorral E. coli LM1035 sejteket transzformáltunk. Az E. coli LM1035 transzformálása után, egy éjszakán át telepeket tenyésztettünk ki és a plazmid-DNS-t Vh-inszertomokra analizáltuk. A pARH1217 plazmidban lévő Vhszakasz nukleotidszekvenciáját az 1. ábra mutatja be.

Könnyű lánc

A VI könnyű lánc gént az eredeti VI klónból állítottuk elő - a WO 93/16184 számú szabadalmi leírás szerint - PCR-rel, az R3585 és az R3597 oligonukleotidok felhasználásával. Ezek szekvenciája a következő: R3585 5’GGACTGTTCGAAGCCGCCACCATGAG TGTGCTCACTCAGGTCCT3 ’

R3597 5 ’GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTAC GTTT3’

A PCR-t úgy végeztük, ahogy fent leírtuk. A PCRterméket BstBI és SplI enzimekkel emésztettük és tisztítás után az előzőleg ugyanezen enzimekkel emésztett pMR15.1-be (8. ábra) ligáitok.

E. coli LH1035-be való transzformálás után azonosítottunk egy olyan telepet, amely VI inszertumot tartalmazó plazmidot (pARH1215) tartalmazott. A VI inszertum nukleotidszekvenciáját a 2. ábra mutatja be.

A 39D10 CDR beültetése

Könnyű lánc

Annak érdekében, hogy meghatározhassuk a legalkalmasabb humán akceptor FW-ket a 39D10 CDR hurkai számára, a 39D101-3 FW-k aminosavszekvenciáit összehasonlítottuk ismert humán kappa könnyű láncok ilyen szekvenciáival. Azt találtuk, hogy a 39D10 leginkább a humán I csoportba tartozó könnyű lánccal homológ. Ennek alapján elhatároztuk, hogy a humán I csoportú csíravonal-FW-ket használjuk a CDR-beültetéshez. Ezen szekvenciák homológiáját a 3. ábrán mutatjuk be. Ugyancsak bemutatjuk a 39D10 FW4 szakaszok és az ismert I csoportú könnyű láncok általánosan elfogadott (konszenzus) szekvenciája közötti homológiát. A 39D10 azon csoportjait, amelyek különböznek a humán konszenzusszekvencia csoportjaitól, aláhúztok. Megvizsgáltuk, hogy ezek a csoportok hozzájárulhatnak-e az antigénkötéshez, és két gént szerkesztettünk a CDR-beültetett könnyű lánc számára. ACTIL-5gL5 és CTIL-5-gL6 elnevezésű génben a CDR-csoportok, illetve vagy a 22,08 és 71-es csoport, vagy a 68 és 71-es csoport, szintén a 39D10-ből származtak. A CTIL-5gL6 nukleotid- és aminosavszekvenciája az 5. ábrán látható.

Nehéz lánc

A 39D10 nehéz lánc CDR-beültetését úgy végeztük, ahogyan a könnyű láncra leirtok. Úgy találtuk, hogy a 39D10 FW szakaszai leginkább a humán ΙΠ-as csoportú antitestekéivel homológok, következésképpen a humán IH-as csoportú csíravonalgének FW-inek konszenzusszekvenciáit használtuk a 39D10 nehéz lánc CDR-einek a befogadására. Mint fentebb, szintén a humán IH-as csoportú FIN 4 szakaszokat választottuk. Ezeknek a szekvenciáknak az összehasonlítását a 4. ábrán mutatjuk be. A 39D10 azon csoportjait, amelyek különböznek a humán konszenzusszekvenciától, aláhúztok.

Elvégeztük a 39D10 azon FW-csoportjainak az analízisét, amelyek befolyásolhatják az antigénkőtést és ennek alapján két gént - CTIL-5-9gH és CTIL-5-10gH - szerkesztettünk, amelyekben a 23,24, 27-30, 37,49, 73 és 76-78, illetve a 24, 27-30, 37, 49, 73, 76 és 78 csoportok a 39D10-ból származtak. A CTIL-5lOgH nukleotid- és aminosavszekvenciája a 6. ábrán látható.

Anti-IL-5 antitestek expressziója és bioaktivitása

Kiméra (patkány/ember) és CDR-beültetett 39D10et állítottunk elő biológiai kiértékelés céljából a nehéz és könnyű lánc párok tranziens expressziójával, miután ezeket kínaihörcsög-petefészek- (Chinese Hamster Ovary=CHO) sejtekbe kotranszfektáltuk kalcium-foszfát-precipitációs módszer segítségével.

A transzfekció előtti napon a félig összefolyt CHOL761h sejteket [Croekett et al., Nucl. Acaiads Rés., 19, 319-325 (1991)] tartalmazó palackokat tripszinnel kezeltünk, sejtszámolást végeztünk és T75-ös palackokat készítettünk, palackonként 10⁷ sejttel. A következő napon, a transzfekció előtt 3 órával, a táptalajt kicseréltük. A kalcium-foszfát-precipitátumot a következőkép6

HU 221 641 Bl pen készítettük el a transzfekcióhoz: 50-50 pg nehéz és könnyű lánc expressziós vektort tartalmazó 1,25 ml 0,25 M kalcium-kloridot összekevertünk 1,25 ml 2xHBS-sel (16,36 g nátrium-klorid, 11,9 g HEPES és 0,4 g dinátrium-hidrogén-foszfát 1 liter vízben; pH beál- 5 lítás 7,1-re nátrium-hidroxid-oldattal) és ezt az oldatot azonnal hozzáadtuk a sejtek táptalajához. A sejteket 3 órán át 37 °C-on CO₂-inkubátorban inkubáltuk, majd a precipitátumot eltávolítottuk és a sejteket 15 ml 15%os glicerinnel - foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban 10 (PBS) - 1 percig sokkoltuk. A glicerint eltávolítottuk, a sejteket egyszer mostuk PBS-sel és 48-96 órán át 10 mM nátrium-butirátot tartalmazó 25 ml táptalajban inkubáltuk. A táptalajból úgy tisztítottuk az antitestet, hogy protein A-Sepharosehoz kötöttük, majd innen ki- 15 oldottuk. Az antitestkoncentrációt humán IgELISA-val határoztuk meg (lásd alább).

ELISA

Az antitestexpresszió meghatározásához nehéz és könnyű lánc génpárokkal transzfektáltunk C40 sejteket 20 és háromnapos inkubálás után a táptalajban összegyűlt antitest mennyiségét ELISA-teszttel mértük.

Az ELISA-vizsgálathoz NUNC ELISA-lemezeket használtunk. A lemezeket egy éjszakán át 4 °C-on poliklonális kecske anti-humán Fc-fragment-specifikus an- 25 titest F(ab’)₂-fragmentumával (Jackson Immunoresearch, kódszám: 109-006-098) fedtük, amelynek a koncentrációja 5 pg/ml fedópuffer volt (fedőpuffer:

mM nátrium-karbonát, 35 mM nátrium-hidrogénkarbonát, pH 6,9). A reagálatlan antitestet úgy távolítot- 30 tűk el, hogy a lemezeket ötször mostuk desztillált vízzel. A vizsgálandó mintákat és a tisztított standardokat körülbelül 1 pg/ml-re hígítottuk konjugátumpufferrel [0,1 M trisz-HCl, pH 7,0, 0,1 M nátrium-klorid, 0,2% (térf./térf.) Tween 20, 0,2% (tömeg/térf.) Hammersten- 35 kazein). A mintákból 2-szeres sorozathígításokat készítettünk a mikrotitráló lemezek tartályaiban oly módon, hogy a tartályokban 0,1 ml legyen a végtérfogat, majd a lemezeket 1 órán át szobahőmérsékleten, rázással inkubáltuk. Az első inkubációs lépés után a lemezeket tíz- 40 szer mostuk desztillált vízzel, majd konjugátumpufferrel 1:700-ra hígított peroxidázzal konjugált monoklonális egér anti-humán kappa- (GD12 klón) antitesttel (The Binding Site, kódjel: MP135) inkubáltuk 1 órán át, mint előbb. A lemezeket újból mostuk és min- 45 den tartályba 0,1 ml szubsztrátumoldatot mértünk be.

A szubsztrátumoldat 150 pl Ν,Ν,Ν,Ν-tetrametilbenzidint (10 mg/ml DMSO), 150 pl hidrogén-peroxidot (30%-os oldat) tartalmazott 10 ml 0,1 M nátriumacetát/nátrium-citrát, pH 6,0, pufferben. A lemezek ki- 50 fejlesztését 5-10 percig végeztük, amíg az abszorpció 630 nm-en a standard legmagasabb, körülbelül 1,0 értéket el nem érte. A 630 nm-en kapott abszorpciót lemezleolvasó készüléken (plate-reader) mértük, és a minta koncentrációját a titrálással kapott görbe és a standard 55 görbe összehasonlításával határoztuk meg.

Anti-IL-5 antitestek affinitáskonstansainak meghatározása

A kiméra és CDR-beültetett anti-IL-5 antitestek affinitását biospecifikus kölcsönhatás-analízissel (Bio- 60 specific Interaction Analysis=BIA) határoztuk meg.

Az antitesteket CHO-sejtekben termeltük, amelyeket nehéz és könnyű lánc gének kombinációival transzfektáltunk és tenyészet-felülúszókból tisztítottuk protein

A-Sepharose használatával. Az affinitásmérésekhez egy poliklonális antihumán Fc-antitestet kötöttünk a

Pharmacia Biosensor chiphez (12 150 relatív válaszegység; relatíve response unit=RU), ezt használtuk az antiIL-5 befogására, amelyet átvittünk a chipen 5 pg/ml koncentráció mellett, a következő összetételű pufferben: 10 mM HEPES, 0,15 M nátrium-klorid,

3,4 mM EDTA, pH 7,4. A menetenként befogott antiIL-5 mennyisége körülbelül 1600 RU volt. Rekombináns humán IL-5-öt vittünk át ezután a Sensorchipen különböző koncentrációkban (0,6-5 pg/ml), a fenti pufferben. A Sensorchipet minden menet után 100 mM sósavval és 100 mM ortofoszforsawal tisztítottuk, hogy eltávolítsuk a megkötött IL-5-öt és az antitestet.

A kapott szenzorgrammokat kinetikai software használatával analizáltuk, amely a BIAcore-készülékkel rendelkezésre áll.

Meghatároztuk a két antitest - kiméra 39D10 és CTIL-5-10gH/gL6 - affinitás konstans értékeit és asszociációs és disszociációs fokát. Az eredményeket a 9. ábrán foglaljuk össze. Látható, hogy a kiméra 39D10-nek rendkívül erős az affinitása a humán IL-5höz és hogy ez az érték a CTIL-5-10gH/-gL6-ban reprodukálódik. Anti-IL-5 antitestek aktivitása az in vitro bioassayben

A különböző CDR-beültetett antitestek aktivitását'- t egy in vitro bioassayben - TF1 sejteket használva - ha- f sonlítottuk össze a kiméra 39D10 aktivitásával. |

A TF1 egy eritroleukémiás sejtvonal, amely GM-CSF-et | igényel a növekedéséhez. (GM-CSF=granulocyte-mo- | nocyte colony stimulating factor). A GM-CSF IL-5-tel f helyettesíthető, de ebben az esetben a sejtek csak túlélők f maradnak, de nem proliferálnak. A túlélésnek az IL-5től való függése azonban azt jelenti, hogy a TF1 sejteket fel lehet használni a különböző anti-IL-5 antitestek aktivitásának összehasonlítására bioassayben.

Az anti-IL-5 antitestekkel való neutralizálást 96 lapos fenekű tartállyal ellátott lemezeken méljük. Állandó mennyiségű IL-5-öt (2 ng/ml) és az antitest változó mennyiségeit használva, tartályonként őxlO⁴ sejtet inkubálunk 3 napon át. Az utolsó 4 órában a sejteket 500 pg/ml tiazolilkék (Thiazolyl blue=MTT) jelenlétében tenyésztjük. Élő sejtekben ezt a festéket oldhatatlan bíbor formává konvertálják a mitokondriális enzi- _r mek. Az oldhatatlan anyagot úgy oldjuk fel, hogy 100 pl 50%-os dimetil-formamid és 20%-os SDS (pH 4,7) hozzáadása után egy éjszakán át inkubálunk, és a felvett festék mennyiségét spektrofotometriásán határozzuk meg. Az antitestek jelenlétében fennmaradt bioaktív IL-5-szinteket egy olyan standard görbéiről extrapoláljuk, amely az IL-5-koncentráció függvényében ábrázolja a festékfelvételt. }

A nehéz és könnyű láncok különböző kombinációinak aktivitását TF1 bioassayvel értékeltük ki. Látha- T tó, hogy a CDR-beültetett nehéz és könnyű láncok

HU 221 641 Bl összes kombinációjával előállított antitestek ugyanolyan hatásosak, mint a kiméra 39D10. Ezek az eredmények arra mutatnak, hogy sem a könnyű lánc 22-es csoportja, sem a nehéz lánc 23-as vagy 78-as csoportja nem szükséges a 39D10 specificitáshoz az optimális kötés végett. A kevesebb 39D10 specifikus csoporttal való kombináció tehát a CTIL-5-10gH/gL6.

Anti-IL-5 antitestek aktivitása versenyeztetési vizsgálatokban

Rekombináns humán IL-5-öt 1 pg/ml-re hígítunk foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal (PBS). Az oldatból 100-100 μΐ-eket mérünk mikrotitráló lemezekre (Costar Amine Binding plates) és a lemezeket egy éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. A lemezeket háromszor mossuk 0,5% Tween 20-tartalmú PBS-sel és a fennmaradt aktív helyeket PBS-ben oldott 2% marhaszérumalbuminnal (BSA=bovine serum albumin) blokkoljuk 30 percen át. A lemezeket ezután leszívjuk és szárazra itatjuk. Az eredeti patkányantitest (39D10) relatív kötőaktivitásának a kiméra és beültetett antitestekével való összehasonlítása végett sorozathígításokat készítettünk minden egyes anti-IL-5 antitestből PBS/1% BSA-oldatban. A hígításokból 50 μΐ-eket mértünk 2-2 tartályba, majd közvetlenül ezután 39D10-biotén konjugátumból - 0,125 mg/ml - 50 μΐ-t adunk a tartályokhoz. A lemezeket 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk rázás közben, majd kétszer mossuk PBS-sel. Ezután minden tartályba sztreptavidinnel konjugált torma-peroxidázt (1 pg/ml) mérünk és a lemezeket további 30 percig inkubáljuk. A lemezeket négyszer mossuk és a tartályokba 100 μΐ tetrametil-benzidin- (TMB) szubsztrátumot mérünk. A kialakult szint 630 nm-en (referencia: 490 nm) olvassuk le és az OD-értéket (630-490) az antitestkoncentráció logaritmusával (10-es alap) szemben visszük fel egy grafikonra.

Amikor a patkány 39D10, kiméra 39D1O és a CTIL-5-10gH/gL6 aktivitását hasonlítottuk össze a fenti versenyeztetési vizsgálatban, a ll. ábrán bemutatott eredményeket kaptuk. Mind a három antitest egyformán jól versengett a biotinezett 39D10-zel az IL-5 kötéséért, ami azt mutatja, hogy a 39D10 CDRhurkait sikeresen vittük át a humán FW-kre.

Anti-IL-5 antitest hatása majom-eozinofiliára

Anti-IL-5 antitestet (CTIL-5-10gH/gL6) teszteltünk asztmás állapotokat modellező majomrendszerben (P. J. Manser et al., Ann. Rév. Respir. Dis., nyomdában). Ha Ascarisszal való provokálás (challenge) előtt egy órával alkalmaztuk érzékeny majmoknál, a CTIL-5-10gH/gL6 75%-ban gátolta a tüdőt elárasztó eozinofíliát 0,3 mg/kg iv. dózis mellett. Ez a majomcsoport nem túlérzékeny hisztaminra, tehát a CTIL-510gH/gL6 hatását a túlérzékenységre nem lehetett meghatározni. Három hónappal ezen egyszeri dózis után, az Ascaris-provokálásra adott válaszban az eozinofilek felszaporodása még mindig 75%-ban gátolt volt.

Allergiás egérben a CTIL-5-10gH/gL6 gátolta a tüdő-eozinoflliát 1 mg/kg ip. dózisnál.

Az 1. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZÚSÁG: 48 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCGCGCAAGC TTGCCGCCAAC CATGAAGATT GTGGTTAAAC TGGTTTT 48

A 2. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZÚSÁG: 41 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCAGATGGGC CCTTCGTTGA GGCTGACAGG AGACGTAGTG A 41

A 3. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZÚSÁG: 44 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGACTGTTCG AAGCCGCCAC CATGAGTGTG CTCACTCAGG TCCT

A 4. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZÚSÁG: 30 bázispár

HU 221 641 Bl (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGATACAGTT GGTGCAGCAT CCGTACGTTT 30

Az 5. számú szekvencia adatai 1. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI (A) HOSSZÚSÁG: 333 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS IX. SAJÁTOSSÁG:

(A) NÉV/JEL: CDS (B) HELYZET: 1...333

XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAA TCT GGA GGA GGC TTG GTA CAG CCA TCA CAG ACC

CTG Leu

TCT Ser 15

CTC Leu

Glu 1

Ser

Gly Gly Gly 5

Leu Val

Gin

Pro

Ser 10

Gin

Thr

ACC

Thr

48

TGC

ACT

GTC

TCT

GGG

TTA

TCA

TTA

ACC

AGC

AAT

AGT

GTG

AAC

TGG

Cys

Thr

Val

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Val

Asn

Trp

20

25

30

ATT

96

Ile

CGG

CAG

CCT

CCA

GGA

AAG

GGT

CTG

GAG

TGG

ATG

GGA

CTA

ATA TGG

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Me t

Gly

Leu

Ile

Trp

35

40

45

ATG

144

Ser

AAT

GGA

GAC

ACA

GAT

TAT

AAT

TCA

GCT

ATC

AAA

TCC

CGA

CTG

AGC

Asn

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Al a

Ile

Lys

Ser

Arg

Leu

Ser

50

55

60

ATC

192

Ile

AGT

AGG

GAC

ACC

TCG

AAG

AGC

CAG

GTT

TTC

TTA

AAG

ATG

AAC

AGT

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Ser

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Met

Asn

Ser

65

70

75

CTG

240

Leu

80

CAA

AGT

GAA

GAC

ACA

GCC

ATG

TAC

TTC

TGT

GGC

AGA

GAG

TAC

Gin

Ser

Glu

Asp

Thr

Al a

Met

Tyr

Phe

Cys

Al a

Arg

Glu

Tyr

85

90

95

GGC

288

Gly

TAC

TTT

GAT

TAC

TGG

GGC

CAA

GGA

GTC

ATG

GTC

ACA

GTC

TCC

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Val

Me t

Val

Thr

Val

Ser

100

105

110

TCA

333

Ser

HU 221 641 Bl

A 6. számú szekvencia adatai 1. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 111 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: lineáris (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Ser Gly Gly Gly Leu 1 5	Val	Gin	Pro	Ser 10	Gin	Thr	Leu	Ser	Leu 15
Thr Cys Thr Val Ser Gly 20	Leu	Ser	Leu	Thr 25	Ser	Asn	Ser	Val	Asn Trp 30
Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys 35	Gly	Leu 40	Glu	Trp	Me t	Gly	Leu 45	Ile	Trp
Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr 50	Asn 55	Ser	Al a	Ile	Lys	Ser 60	Arg	Leu	Ser
Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys 65 70	Ser	Gin	Val	Phe	Leu 75	Lys	Me t	Asn	Ser
Leu 80 Gin Ser Glu Asp Thr Alá 85	Me t	Tyr	Phe	Cys 90	Al a	Arg	Glu	Tyr	Tyr 95
Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100	Gin	Gly	Val 105	Me t	Val	Thr	Val	Ser 110	Ser
A 7. számú szekvencia adatai 1. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (A) HOSSZÚSÁG: 384 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris II. A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS IX. SAJÁTOSSÁG (A) NÉV/JEL CDS (B) HELYZET: 1...384 XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATG Met 1

GCT Al a

GTG Val

CCC Pro

ACT Thr 5

CAG Gin

CTC Leu

CTG Leu

GGG Gly

TTG Leu 10

TTG Leu

CTG Leu

TGG Trp

ATT Ile 15

ACA

48

....

Thr

GAT

GCC

ATA

TGT

GAC

ATC

CAG

ATG

ACA

CAG

TCT

CCA

GCT

TCC

CTG

Asp

Al a

Ile

Cys

Asp

Ile

Gin

Me t

Thr

Gin

Ser

Pro

Al a

Se r

Leu

20

25

30

TCT

96

Ser

HU 221 641 Bl

144

GCA

TCT

CTG

GGA

GAA

ACT

ATC

TCC

ATC

GAA

TGT

CTA

GCA

AGT

GAG

Al a GGC Gly

Ser

Leu 35

Gly

Glu

Thr

Ile

Ser 40

Ile

Glu

Cys

Leu

Al a 45

Ser

Glu

ATT

TCC

AGT

TAT

TTA

GCG

TGG

TAT

CAG

AAG

CCA

GGG

AAA

TCT

Ile CCT Pro

Ser 50

Ser

Tyr

Leu

Al a

Trp 55

Tyr

Gin

Lys

Pro 60

Gly

Lys

Ser

CAG

CTC

CTG

ATC

TAT

GGT

GCA

AAT

AGC

TTG

CAA

ACT

GGG

GTC

CCA

Gin 65 TCA Ser 80

Leu

Ile

Tyr

Gly 70

Al a

Asn

Ser

Leu

Gin 75

Thr

Gly

Val

Pr o

CGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

TCT

GCC

ACA

CAA

TAT

TCT

CTC

AAG

ATC

Arg AGC Ser

Phe

Ser

Gly

Ser 85

Gly

Ser

Al a

Thr

Gin 90

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile 95

AGC

ATG

CAA

CCT

GAA

GAT

GAA

GGG

GAT

TAT

TTC

TGT

CAA

CAG

AGT

Ser TAC Tyr

Met

Gin

Pro 100

Gin

Asp

Glu

Gly

Asp 105

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin 110

Ser

AAG

TTT

CCG

AAC

ACG

TTT

GGA

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAA

CTG

AAA

Lys

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Al a

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

115 120 125

192

240

288

336

384

CGG

Arg

A 8. számú szekvencia adatai 1. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 128 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Me t 1

Al a

Val

Pro Thr Gin 5

Leu

Gly

Leu 10

Leu

Trp

Ile 15

Thr Asp

Al a

Ile

Cys Asp Ile 20

Gin

Me t

Thr 25

Gin

Ser

Pro

Al a

Ser 30

Leu

Ser Ala

Ser

Leu 35

Gly Glu Thr

Ile

Ser 40

Ile

Glu

Cys

Leu

Al a 45

Ser

Glu

Gly Ile

Ser

Tyr Leu Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Ly s

Ser

Pro

55 60

HU 221 641 Bl

Gin 65

Leu

lle

Tyr

Gly 70

Al a

Asn

Ser

Leu

Gin 75

Thr

Gly

Val

Pro

Ser Arg

80 Phe

Ser

Gly

Ser 85

Gly

Ser

Al a

Thr

Gin 90

Tyr

Ser

Leu

Lys

lle 95

Ser Ser

Met

Gin

Pro 100

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp 105

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin 110

Ser

Tyr Lys

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Al a

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

Lys

115 120 125

Arg

A 9. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 23 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp lle Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser 1 5

Ser Leu Ser 10

Al a

Ser Val 15

Gly Asp Arg Val Thr lle Thr Cys 20

A10. számú szekvencia adatai

1. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Asp lle Gin Met Thr Gin Ser Pro Alá 1 5

Ser Leu 10

Ser Alá

Ser

Leu

Gly Glu Thr lle Ser lle Glu Cys 20

All. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 15 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Alá 1 5

Pro Lys Leu Leu 10 lle Tyr 15

A 12. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein

HU 221 641 BI

XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr 15 10 15

A 13. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 32 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly 1

Val

Pro

Ser

Arg 5

Phe

Ser Gly

Ser Gly 10

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 15

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Alá

Thr

Tyr

20

25

30

Cys

A 14. számú szekvencia adatai

1. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein

XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: l

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Alá Thr Gin Tyr i

5 10 15 <

fc t

Ser }

Leu Lys Ile Ser Ser Met Gin Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe J,

25 30 |

I

Cys ϊ

A 15. számú szekvencia adatai r

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: i (A) HOSSZÚSÁG: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

Π. A MOLEKUKLA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10

A 16. számú szekvencia adatai

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe Gly Alá Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

5 10 E

HU 221 641 Β1

A 17. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 30 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKUKLA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 1 5 10 15

Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Alá Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30

A 18. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 25 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu	Se r	Gly	Gly	Gly	Leu	Val	Gin	Pro	Ser Gin Thr	Leu Ser Leu
1				5					10	15	j
Thr	Cys	Thr	Val	Ser	Gly	Leu	Ser	Leu	Thr
				20					25

A 19. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 14 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Trp Val Arg Gin Alá Pro Gly Lys GLy Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10

A 20. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10

A 21. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 32 aminosav (B) TÍPUSaminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein

HU 221 641 Bl

XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
1 5	10	15
Gin Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu 20	Asp	Thr 25	Al a	Val	Tyr	Tyr	Cys 30	Al a
Arg A 22. számú szekvencia adatai I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (A) HOSSZÚSÁG: 32 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp 1 5	Thr	Ser	Lys 10	Ser	Gin	Val	Phe	Leu 15
Lys Met Asn Ser Leu Gin Ser Glu 20	Asp	Thr 25	Al a	Me t	Tyr	Phe	Cys 30	Alá

Arg i

A 23. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 5 (A) HOSSZÚSÁG: 11 aminosav 1 (B) TÍPUS: aminosav 1 (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú í (D) TOPOLÓGIA: lineáris |

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

A 24. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

A 25. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 399 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS IX. SAJÁTOSSÁG (A) NÉV/JEL CDS (B) HELYZET: 1...399

HU 221 641 Bl

XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TTC GAA

GCC Al a

ACC ATG TCT GTC

CCC ACC CAA GTC

CTC GGT CTC

Phe 1

Glu

Thr 5

Me t

Ser

Val

Pro

Thr 10

Gin

Val

Leu

Gly

Leu 15

CTG

48

Leu

CTG

TGG

CTT

ACA

GAT

GCC

AGA

TGT

GAC

ATT

CAA

ATG

ACC

CAG

Leu

Trp

Leu

Thr

Asp

Al a

Arg

Cys

Asp

Ile

Gin

Me t

Thr

Gin

20

25

30

AGC

96

Se r

CCA

TCC

AGC

CTG

AGC

GCT

TCT

GTA

GGA

GAC

CGG

GTC

ACC

ATC

ACA

Pro

Ser

Leu

Ser

Al a

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

35

40

45

TGT

144

Cys

CTA

GCA

AGT

GAG

GGC

ATC

TCC

AGT

TAC

TTA

GCG

TGG

TAC

CAG

Leu

Al a

Ser

Glu

Gly

Ile

Ser

Tyr

Leu

Alá

Trp

Tyr

Gin

50

55

60

AAG

192

Lys

1

CCC

GGG

AAA

GCT

CCT

AAG

CTC

CTG

ATC

TAT

GGT

GCG

AAT

AGC

TTG

Pro

Gly

Lys

Al a

Pro

Lys

Leu

Ile

Tyr

Gly

Al a

Asn

Se r

Leu

65

70

75

j-

CAG

240

1

Gin

80

i t-

ACT

GGA

GTA

CCA

TCA

AGA

TTC

AGT

GGC

TCA

GGA

TCC

GCT

ACA

GAC

|

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Al a

Thr

Asp

85

90

95

1

TAC

288

1

Tyr

ACG

CTC

ACG

ATC

TCC

AGC

CTA

CAG

CCT

GAA

GAT

TTC

GCA

ACG

TAT

1

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Al a

Thr

Tyr

100

105

110

TAC

336

Tyr

TGT

CAA

CAG

TCG

TAT

AAG

TTC

CCG

AAC

ACA

TTC

GGT

CAA

GGC

ACC

Cys

Gin

Ser

Tyr

Lys

Phe

Pr o

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

115

120

125

AAG

384

Lys

4-

GTC

GAA

GTC

AAA

CGT

399

Val Glu Val Lys Arg 130

A 26. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 133 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris E

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein

HU 221 641 Bl

XI: A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Phe 1

Glu Alá

Alá

Thr Met 5

Ser

Val

Pro Thr Gin 10

Val

Leu

Gly 15

Leu

Trp

Leu

Thr

Asp

Al a

Arg

Cys

Asp

lle

Gin

Me t

Thr

Gin

20

25

30

Pro

Ser

Leu

Se r

Al a

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

lle

Thr

35

40

45

Cys

Leu

Al a

Ser

Glu

Gly

lle

Ser

Tyr

Leu

Al a

Trp

Tyr

Gin

50

55

60

Lys

Pro

Gly

Lys

Al a

Pro

Lys

Leu

lle

Tyr

Gly

Al a

Asn

Ser

Leu

65

70

75

Gin

80

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Al a

Thr

Asp

85

90

95

Tyr

Thr

Leu

Thr

lle

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Alá

Thr

Tyr

100

105

110

Tyr

Cys

Gin

Ser

Tyr

Lys

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

115

120

125

Lys

Val

Glu

Val

Lys

Arg

130

A 27. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 420 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS IX. SAJÁTOSSÁG:

(A) NÉV/JEL CDS (B) HELYZET: 1...420

XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AAG CTT GCC GCC

ACC ATG Thr Met 5

GGC TGG AGC TGT ATC

ATC lle

CTC Leu

TTC Phe

TTA Leu 15

Lys 1

Leu

Alá

Al a

Gly

Trp

Ser

Cys 10

lle

GTA

Val

GCA

ACA

GCT

ACA

GGT

GTC

CAC

TCC

GAG

GTC

CAA

CTG

GTA

GAA

TCT

Alá

Thr

Al a

Thr

Gly

Val

His

Ser

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

20

25

30

GGA

Gly

GGT

CTC

GTA

CAG

CCA

GGA

TCT

CTG

CGA

CTG

AGT

TGC

GCC

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Al a

35

40

45

HU 221 641 Bl

GTC 144

Val

TCT GGG TTA TCA

TTA ACT AGT AAT

AGT GTG

AAC TGG Asn Trp 60

ATA lle

CGG Arg

CAA Gin

Ser

Gly 50

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser 55

Asn

Ser

Val

GCA

192

Al a

CCT

GGC

AAG

GGT

CTC

GAG

TGG

GTT

GGA

CTA

ATA

TGG

ACT

AAT

GGA

Pro

Gly

Lys

GLy

Leu

Glu

Trp

Val

Gly

Leu

lle

Trp

Ser

Asn

Gly

65

70

75

GAC

240

Asp

80

ACA

GAT

TAT

AAT

TCA

GCT

ATC

AAA

TCT

CGA

TTC

ACA

ATC

TCT

AGA

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Alá

lle

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

lle

Ser

Arg

85

90

95

GAC

288

Asp

ACT

TCG

AAG

AGC

ACC

GTA

TAC

CTG

CAG

ATG

AAC

AGT

CTG

AGA

GCT

Thr

Se r

Lys

Ser

Thr

Val

Tyr

Leu

Gin

Me t

Asn

Ser

Leu

Arg

Al a

100

105

110

GAA

336

Glu

GAT

ACT

GCA

GTC

TAC

TGT

GCT

CGT

GAG

TAC

TAT

GGA

TAT

TTC

Asp

Thr

Al a

Val

Tyr

Cys

Al a

Arg

Glu

Tyr

Gly

Tyr

Phe

115

120

125

GAC

384

Asp

TAT

TGG

GGT

CAA

GGT

ACC

CTA

GTC

ACA

GTC

TCC

TCA

420

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

130

135

140

A 28. számú szekvencia adatai

I. A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 140 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)TOPOLÓGIA: lineáris

II. A MOLEKULA TÍPUSA: protein XI. A SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys 1

Leu

Alá

Al a

Thr 5

Met

Gly

Trp

Ser

Cys 10

lle

Leu

Phe

Leu 15

Val

Al a

Thr

Al a 20

Thr

Gly

Val

Hi s

Ser

Glu 25

Val

Gin

Leu

Val

Glu 30

Ser

Gly

Leu 35

Val

Gin

Pro

Gly

Gly 40

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser 45

Cys

Al a

Val

Ser

Gly 50

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser 55

Asn

Ser

Val

Asn

Trp 60

lle

Arg

Gin

Al a

Pro 65

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu 70

Trp

Val

Gly

Leu

lle 75

HU 221 641 Β1

Trp Ser Asn Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Alá Ile Lys Ser Arg 80 85 90

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gin 95 100 105

Met Asn Ser Leu Arg Alá Glu Asp Thr Alá Val Tyr Tyr Cys Alá 110 115 120

Arg Glu Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 125 130 135

Val Thr Val Ser Ser

Claims

1. Rekombináns antitestmolekula, amely összetett 20 nehéz láncot és könnyű láncot tartalmaz, affinitása van humán IL-5 antigénhez, az összetett nehéz lánc variábilis doménje túlnyomórészt akceptorantitest nehéz lánc frameworkcsoportokat tartalmaz, a variábilis dómén 39D10 patkány monoklonális antitest nehéz láncából 25 származó donorcsoportokat tartalmaz a 31-35, 50-65 és 95-102 pozíciókban és a framework 24, 27-30, 37, 49, 73, 76 és 78 pozícióiban (a Kabat-féle számozás szerint).

2. Az 1. igénypont szerinti rekombináns an- 30 titestmolekula, amely a 23 és 77 frameworkpozíciókban is 39D10 patkány monoklonális antitestből származó donorcsoportokat tartalmaz.

3. Rekombináns antitestmolekula, amely nehéz láncot és összetett könnyű láncot tartalmaz, affinitása van 35 humán IL-5 antigénhez, az összetett könnyű lánc variábilis doménje túlnyomórészt akceptorantitest könnyű lánc frameworkcsoportokat tartalmaz, a variábilis dómén 39D10 patkány monoklonális antitest könnyű láncából származó donorcsoportokat tartalmaz a 24-34, 40 50-56 és 89-97 pozíciókban és a framework 68 és

71 pozícióiban (a Kabat-féle számozás szerint).

4. A 3. igénypont szerinti antitestmolekula, amely a 22 frameworkpozícióban is 39D10 patkány monoklonális antitestből származó donorcsoportokat tartalmaz. 45 szerinti összetett nehéz láncot és a 3. vagy 4. igénypont szerinti összetett könnyű láncot tartalmazza.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti antitestmolekula, amelyben az összetett nehéz lánchoz szolgáló akceptorcsoportok humán III csoportú nehéz lánc csoportok, és az összetett könnyű lánchoz szolgáló akceptorcsoportok humán I csoportú könnyű lánc csoportok.

7. Humán IL-5 antigénhez affinitással rendelkező rekombináns antitestmolekula, amelynek nehéz lánc variábilis szakasza a 6. ábrán bemutatott, 28-as szekvenciaazonosító számmal rendelkező szekvencia, és a könnyű lánc variábilis szakasza az 5. ábrán bemutatott, 26-os szekvenciaazonosító számmal rendelkező szekvencia.

8. DNS-szekvencia, amely az előző igénypontok bármelyike szerinti antitest összetett nehéz láncát és/vagy összetett könnyű láncát kódolja.

9. Terápiás vagy diagnosztikai készítmény, amely az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti antitestmolekulát tartalmazza egy gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal, hígítószerrel vagy kötőanyaggal kombinálva.

10. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti antitestmolekula terápiás vagy diagnosztikai alkalmazásra.

11. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti antitestmolekula hatékony mennyiségének alkalmazása embernek vagy állatnak, diagnosztikai vagy terápiás célból beadandó gyógyszer előállítására.