ES2218546T3 - Anticuerpos recombinantes especificos contra interleuquina-5. - Google Patents
Anticuerpos recombinantes especificos contra interleuquina-5.Info
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Abstract
UNA MOLECULA DE ANTICUERPO RECOMBINANTE ANTI-IL-5, EFECTIVA, QUE COMPRENDE RESIDUOS DE CADENA LIGERA Y/O PESADA, LIGANTES DE ANTIGENOS, PROCEDENTES DE UN ANTICUERPO DONADOR.
Description
Anticuerpos recombinantes específicos contra
interleuquina-5.
La presente invención se refiere a una molécula
de anticuerpo recombinante (RAM) y, especialmente, a una molécula de
anticuerpo humanizada (HAM) que tiene especificidad por la
interleuquina-5 humana (hIL-5), a
los ácidos nucleicos que codifican los dominios variables de cadena
ligera y pesada de dicho anticuerpo recombinante, a un
procedimiento para producir dicho anticuerpo usando tecnología de
ADN recombinante y al uso terapéutico del anticuerpo
recombinante.
En la presente solicitud, la expresión
"molécula de anticuerpo recombinante" (RAM) se usa para
describir un anticuerpo producido por un proceso que implica el uso
de tecnología de ADN recombinante. La expresión "molécula de
anticuerpo humanizado" (HAM) se usa para describir una molécula
derivada de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión del
antígeno puede comprender dominios variables completos condensados
con dominios constantes o una o más de las regiones determinantes
complementarias (CDRs) injertadas sobre las regiones marco
conservadas apropiadas en el dominio variable. La abreviatura
"MAb" se usa para indicar un anticuerpo monoclonal.
La expresión "molécula de anticuerpo
recombinante" no sólo incluye moléculas completas de
inmunoglobulina sino también cualquier fragmento de inmunoglobulina
que se une a un antígeno, como por ejemplo los fragmentos Fv, Fab y
F(ab')_{2}, y cualquier derivado de los mismos, como por
ejemplo fragmentos Fv monocatenarios.
Las inmunoglobulinas naturales se han usado en
ensayo, diagnóstico y, con una extensión limitada, en terapia. El
uso de inmunoglobulinas en terapia se ha visto obstaculizado pues la
mayoría de los anticuerpos de uso potencial como agentes
terapéuticos son MAbs producidos por fusiones de esplenocitos de
roedor con células de mieloma de roedor. Por lo tanto, estos MAbs
son básicamente proteínas de roedor. El uso de estos MAbs como
agentes terapéuticos en humanos puede dar lugar a una respuesta
inmune indeseable denominada HAMA (anticuerpo
anti-ratón humano). El uso de MAbs de roedor como
agentes terapéuticos en humanos está inherentemente limitado por el
hecho de que el sujeto humano provocaría una respuesta inmunológica
al MAb que lo retiraría completamente o al menos reduciría su
eficacia.
Se han desarrollado numerosas técnicas para
reducir las características antigénicas de dichos MAbs no humanos.
Estas técnicas implican, generalmente, el uso de tecnología de ADN
recombinante para manipular secuencias de ADN que codifican las
cadenas polipeptídicas de la molécula de anticuerpo. Estos
procedimientos se denominan, habitualmente, técnicas de
"humanización".
Los primeros procedimientos para humanizar MAbs
implicaban la producción de anticuerpos quiméricos en los que un
sitio de unión de antígeno que comprende los dominios variables
completos del anticuerpo se condensan a dominios constantes
provenientes de otro anticuerpo. Los procedimientos para llevar a
cabo dichos procedimientos de quimerización se describen en el
documento EP 0120694 (Celltech Limited) y EP 0125023 (Genentech Inc.
and City of Hope). Sin embargo, los anticuerpos quiméricos
humanizados aún contienen una parte significativa de secuencias de
aminoácidos no humanas y aún pueden provocar alguna respuesta HAMA,
particularmente si se administran durante un periodo prolongado
[Begent et al., Br. J. Cancer, 62, 487 (1990)].
Un planteamiento alternativo, descrito en el
documento EP-A-0239400 (Winter),
implica injertar la región determinante de complementariedad (CDRs)
de un MAb de ratón en las regiones marco conservadas de los dominios
variables de una inmunoglobulina humana usando técnicas de ADN
recombinante. Hay tres CDRs (CDR1, CDR2 y CDR3) en cada uno de los
dominios variables de cadena ligera y pesada. Es mucho menos
probable que dichos anticuerpos humanizados injertados a CDR den
lugar a una respuesta HAMA que los anticuerpos quiméricos
humanizados en vista de la proporción mucho menor de secuencias de
aminoácidos no humanas que contienen. En Riechmann et al.,
[Nature, 332, 323-324 (1988)] se encontró
que la transferencia de CDRs solos, según define Kabat [Sequences of
Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and
Human Services, NIH, USA (1987)] no era suficiente para proporcionar
una actividad satisfactoria de unión a antígeno en el producto
injertado a CDR. Riechmann et al., encontraron que era
necesario transformar un cierto número de residuos fuera de los
CDRs, en particular el bucle adyacente CDR1. Sin embargo, la
afinidad de unión de los mejores anticuerpos injertados a CDR
obtenidos aún fue significativamente menor que la del MAb
original.
En el documento WO 91/09967, Adair et al.,
describieron las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo injertado
a CDR, y determinaron una jerarquía de residuos donadores.
En el documento WO 93/16184, Chou et al.,
describieron el diseño, clonación y expresión de anticuerpos
monoclonales humanizados contra interleuquina-5
humana. Se sugiere un procedimiento para seleccionar las secuencias
de anticuerpos humanos para usar como marcos para la humanización de
un anticuerpo animal, que comprende las etapas de comparar las
secuencias humanas de dominio variable con las secuencias de dominio
variable del MAb animal que se va a humanizar para calcular los
porcentajes de identidad, ambigüedades de secuencia y espaciado de
las regiones PIN similares. El espaciado de las regiones PIN se
define como el número de residuos entre los residuos de cisteína que
forman los puentes disulfuro del intradominio. Se selecciona el
anticuerpo humano que tiene la mejor combinación de estas
características. También se sugiere un procedimiento para determinar
que residuos del dominio variable de un MAb animal se deberían
seleccionar para la humanización, que comprende determinar los
residuos potenciales mínimos (residuos que comprenden bucles
estructurales de CDR y los residuos necesarios para soportar y/o
orientar los bucles estructurales de CDR) y los residuos máximos
(residuos que comprenden CDRs Kabat, bucles estructurales de CDR,
residuos necesarios para soportar y/o orientar los bucles
estructurales de CDR y residuos que caen en el intervalo de 10
\ring{A} de un bucle estructural de CDR y posee una superficie
accesible a disolvente acuoso de aproximadamente 5 \ring{A}^{2}
o mayor) del anticuerpo monoclonal animal. Además, se realiza el
modelado por ordenador en todos los anticuerpos recombinantes
posibles, comprendiendo la secuencia marco conservada del
anticuerpo humano en la que se han insertado los residuos mínimos y
máximos. Los residuos mínimos o máximos se seleccionan basándose en
la combinación que produce un anticuerpo recombinante que tiene una
estructura modelada por ordenador cercana a la del anticuerpo
monoclonal animal. El anticuerpo
anti-IL-5 humanizado obtenido parece
haber perdido una cantidad sustancial de su afinidad por la
molécula hIL-5.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar una molécula de anticuerpo humanizada que tiene una
afinidad mejorada por la molécula hIL-5.
En consecuencia, la presente invención
proporciona una RAM según la reivindicación 1. La RAM de la
invención tiene afinidad por IL-5 humana y comprende
regiones de unión a antígeno derivadas de los dominios variables de
cadena ligera y pesada de un anticuerpo donador que tiene afinidad
por la IL-5 humana, teniendo la RAM una afinidad de
unión similar a la del anticuerpo donador.
El anticuerpo donador es MAb 39D10.
Los dominios variables de las cadenas ligera y
pesada de MAb 39D10 se describen específicamente en este documento
con referencia a las figuras 1 y 2.
La RAM de la presente invención se una molécula
de anticuerpo anti-IL-5 que tiene
afinidad por el antígeno IL-5 humano que comprende
una cadena pesada compuesta, dicha cadena pesada compuesta tiene un
dominio variable que comprende residuos marco conservados de cadena
pesada de anticuerpos predominantemente aceptores y residuos de
unión a antígeno de cadena pesada de anticuerpo donador, en los que
dicha cadena pesada compuesta comprende residuos donadores en las
posiciones 31-35, 50-65 y
95-102 (de acuerdo con el sistema de numeración de
Kabat) [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological
Interest, Vol I, Fifth Edition, 1991, US Department of Health and
Human Services, National Institute of Health].
La cadena pesada compuesta marco conservada
comprende, adicionalmente, residuos donadores en las posiciones 23,
24, 27-30, 37, 49, 73 y 76-78 o 24,
27-30, 37, 49, 73, 76 y 78.
La RAM de la presente invención comprende además
una cadena ligera compuesta, dicha cadena ligera compuesta tiene un
dominio variable que comprende residuos marco conservados de cadena
ligera de anticuerpos predominantemente aceptores y residuos de
unión a antígeno de cadena ligera de anticuerpo donador, en los que
dicha cadena ligera compuesta comprende residuos donadores en las
posiciones 24-34, 50-56 y
89-97 (de acuerdo con el sistema de numeración de
Kabat).
La cadena ligera compuesta marco conservada
comprende, adicionalmente, residuos donadores en las posiciones 22,
68 y 71 o en las posiciones 68 y 71.
Preferiblemente, cada RAM de la invención tiene
una afinidad constante por la IL-5 humana mayor de
10^{-9} M.
El anticuerpo aceptor es un anticuerpo
humano.
Preferiblemente, el tipo de aceptor marco
conservado es de una clase o tipo igual o similar al del anticuerpo
donador. Convenientemente, el marco conservado elegido tiene la
mayor homología con el anticuerpo donador. Preferiblemente, los
marcos conservados de la línea germinal gamma del grupo humano III
se usan para la cadena pesada compuesta y los marcos conservados de
línea germinal kappa del grupo humano I se usan para las cadenas
ligeras compuestas.
Los dominios de la región constante de las RAMs
de la invención se pueden seleccionar teniendo en cuenta las
funciones propuestas del anticuerpo, en particular las funciones
efectoras que se pueden necesitar. Por ejemplo, los dominios de la
región constante pueden ser dominios humanos IgA, IgE, IgG o IgM. En
particular, los dominios de la región constante de IgC humano,
especialmente del isotipo IgG1 y IgG3, cuando la molécula de
anticuerpo humanizado se pretende para usos terapéuticos, se
necesitan las funciones efectoras de un anticuerpo.
Alternativamente, los isotipos IgG2 e IgG4 se pueden usar cuando la
molécula de anticuerpo humanizada se pretenda para propósitos
terapéuticos y no se necesiten las funciones efectoras del
anticuerpo, por ejemplo para la unión específica a y neutralización
de la actividad biológica de IL-5 humana. También
se pueden usar los dominios modificados de la región constante
humana en los que uno o más residuos de aminoácido se han alterado o
suprimido para cambiar una función efectora particular.
Preferiblemente, los dominios de la región constante de las RAMs son
IgG4 humanos.
Las denominaciones de los residuos dadas
anteriormente y en cualquier otro lugar de la presente solicitud se
numeran de acuerdo con la numeración de Kabat [Kabat et al.,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, Vol I, Fifth
Edition, 1991, US Department of Health and Human Services, National
Institute of Health]. Por lo tanto, las denominaciones de los
residuos no siempre se corresponden directamente con una numeración
lineal de los residuos de aminoácido. La secuencia de aminoácido
lineal real puede contener menos o aminoácidos adicionales que en la
numeración de Kabat, correspondiendo a un acortamiento o una
inserción en la estructura básica del dominio variable.
También en las moléculas de anticuerpo
anti-IL-5 de la presente invención
pueden llevar unidas moléculas efectoras o informadoras.
Alternativamente, se pueden usar los procedimientos de la tecnología
de ADN recombinante para producir moléculas de inmunoglobulina en
las que el fragmento Fc o el dominio CH3 de una inmunoglobulina
completa se ha sustituido por, o se ha unido a la misma mediante
unión peptídica, una proteína funcional no inmunoglobulina, como por
ejemplo una enzima, citoquina, factor de crecimiento o molécula de
toxina.
Por lo tanto, las moléculas de anticuerpo
restantes no es necesario que comprendan sólo secuencias de
inmunoglobulinas. Por ejemplo, se puede construir un gen en el que
una secuencia de ADN que codifica parte de una cadena de
inmunoglobulina humana está condensada con una secuencia de ADN que
codifica la secuencia de aminoácido de un efector polipeptídico o
una molécula informadora.
Otros aspectos de la invención incluyen
secuencias de ADN que codifican la cadena pesada compuesta y la
cadena ligera compuesta. Los vectores de clonación y expresión que
contienen las secuencias de ADN, células huésped transformadas con
las secuencias de ADN y los procedimientos para producir las
moléculas de anticuerpo que comprenden expresar las secuencias de
ADN en las células huésped transformadas son también otros aspectos
adicionales de la invención.
Los procedimientos generales por los que se
pueden construir vectores, los procedimientos de transfección y los
procedimientos de cultivo son bien conocidos en la técnica y no
forman parte de la invención.
Las secuencias de ADN que codifican las
secuencias de aminoácido dador de
anti-IL-5 se pueden obtener mediante
procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la
solicitud internacional de patente Nº WO 93/16184). Por ejemplo, las
secuencias que codifican el
anti-IL-5 se pueden obtener mediante
clonación genómica o clonación de ADNc de líneas celulares de
hibridoma adecuadas, por ejemplo, la línea celular 39D10. Los clones
positivos se pueden detectar usando las sondas apropiadas para las
cadenas ligera y pesada necesarias. También se puede usar clonación
PCR.
El ADN que codifica las secuencias de aminoácido
aceptor se pueden obtener de una manera apropiada. Por ejemplo, las
secuencias de ADN que codifican armazones aceptores humanos
preferidos como por ejemplo cadenas ligeras del grupo I y cadenas
pesadas del grupo III, están disponibles ampliamente para los
trabajadores de la técnica.
Se pueden usar las técnicas convencionales de
biología molecular para preparar las secuencias de ADN deseadas. Las
secuencias se pueden sintetizar completamente o en parte usando
técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Se pueden usar, como
apropiadas, las técnicas de mutagénesis dirigida a un sitio y
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por ejemplo, se puede
usar la síntesis dirigida por oligonucleótidos según describen Jones
et al. [Nature, 321, 522 (1986)]. También se puede
usar la síntesis dirigida por oligonucleótidos de una región
variable preexistente, como por ejemplo la descrita por Verhoeyen
et al. [Science, 239, 1534-1536
(1988)]. También se puede usar el llenado enzimático en
oligonucleótidos arracimados usando ADN polimerasa T4, como por
ejemplo el descrito por Queen et al. [Procedimiento. Natl.
Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033 (1989) y WO
90/07861.
Se puede usar cualquier célula huésped y sistema
de vectores adecuados para la expresión de secuencias de ADN que
codifican la RAM. Preferiblemente, se usan los sistemas de expresión
de célula huésped eucariota, por ejemplo de mamíferos. En
particular, las células huésped de mamífero adecuadas incluyen
células CHO y las líneas celulares de mieloma o hibridoma.
Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la
presente invención se proporciona un procedimiento para producir una
RAM anti-IL-5, que comprende:
- (a)
- producir en un primer vector de expresión un primer operón que tiene una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada compuesta según se ha definido anteriormente;
- (b)
- producir, opcionalmente, en el primer o un segundo vector de expresión un segundo operón que tiene una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera complementaria, que puede ser una cadena ligera compuesta según se ha definido anteriormente;
- (c)
- transfectar una célula huésped con el o cada vector; y
- (d)
- cultivar una línea celular transfectada para producir la RAM.
Alternativamente, el procedimiento puede implicar
el uso de secuencias que codifican una cadena ligera compuesta y una
cadena pesada complementaria.
Para producir las RAM que comprenden ambas
cadenas ligera y pesada, las líneas celulares se pueden transfectar
con dos vectores. El primer vector puede contener un operón que
codifica una cadena pesada compuesta o complementaria y el segundo
vector puede contener un operón que codifica una cadena ligera
complementaria o compuesta. Preferiblemente, los vectores son
idénticos excepto en lo que respecta a las secuencias de
codificación y a los marcadores que se pueden seleccionar para
asegurar, tanto como sea posible, que cada cadena polipeptídica se
expresa equitativamente. En una alternativa preferida, se puede usar
un solo vector, que incluye las secuencias que codifican ambas
cadenas ligera y pesada.
El ADN de estas secuencias de codificación para
las cadenas ligera y pesada puede comprender ADNc o ADN genómico o
ambos.
La presente invención incluye también
composiciones terapéuticas y de diagnóstico que comprenden las RAM y
los usos de dichas composiciones en terapia y diagnóstico.
En consecuencia, en otro aspecto la invención
proporciona una composición terapéutica o de diagnóstico que
comprende una RAM de acuerdo con los aspectos anteriores de la
invención, en combinación con un excipiente, diluyente o vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Estas composiciones se pueden preparar usando las
RAM de la presente invención, por ejemplo como anticuerpos
completos, fragmentos Fv de cadena sencilla o fragmentos de
anticuerpo, como por ejemplo fragmentos Fab o Fv. Dichas
composiciones tienen efectos de bloqueo de IL-5 o
antagonistas y se pueden usar para suprimir la actividad de
IL-5.
Las composiciones de acuerdo con la invención se
pueden formular de acuerdo con la práctica convencional para
administración por cualquier vía adecuada, y generalmente pueden
estar en forma líquida [por ejemplo, una solución de la RAM en un
tampón estéril fisiológicamente aceptable] para administrar, por
ejemplo, por vía intravenosa, intraperitoneal o intramuscular; en
forma de pulverizador, por ejemplo para administrar por vía nasal o
bucal; o en una forma adecuada para implantación.
La invención proporciona también el anticuerpo de
acuerdo con la invención para usar en un procedimiento de terapia o
diagnóstico que comprende administrar una cantidad eficaz,
preferiblemente de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal, de una RAM de
acuerdo con los aspectos anteriores de la invención a un sujeto
humano o animal. La dosificación exacta y la dosis total variará de
acuerdo con el uso pretendido de la RAM y de la edad y del estado
del paciente a tratar. La RAM se puede administrar como una sola
dosis, o de manera continua durante un periodo de tiempo. Las dosis
se pueden repetir según sea apropiado.
La RAM de acuerdo con los aspectos anteriores de
la invención se puede usar para cualquiera de los usos terapéuticos
para los que los anticuerpos
anti-IL-5, por ejemplo 39D10, se han
usado o se pueden usar en el futuro.
IL-5 es un activador primario de
eosinófilos, y se ha demostrado que el bloquear la función de esta
citoquina con anticuerpos previene o reduce la eosinofilia que está
relacionada con ciertas enfermedades alérgicas. Por lo tanto la RAM
de acuerdo con la invención se puede con este propósito, y en
particular puede ser útil en el tratamiento del asma, cuando se
espere prevenir la acumulación y activación de eosinófilos en
pulmones asmáticos, reduciendo de esta manera la inflamación
bronquial y el estrechamiento de las vías respiratorias. Para usar
en el tratamiento del asma, la RAM de acuerdo con la invención
puede ser, ventajosamente, un fragmento Fv de cadena sencilla,
formulado como pulverizador, para administrar por ejemplo por vía
nasal.
A continuación se expone un protocolo preferido
para obtener una molécula de anticuerpo
anti-IL-5 de acuerdo con la presente
invención. Este protocolo se da sin perjudicar a la generalidad de
la invención como se ha descrito y definido anteriormente en este
documento.
Se usó el anticuerpo monoclonal de rata 39D10
erigido contra IL-5 humano como anticuerpo dador.
Los dominios variables de las cadenas ligera y pesada de 39D10 se
han clonado anteriormente (WO 93/16184) y las secuencias
nucleotídica y de aminoácidos predichas de estos dominios se
muestran en las Figuras 1 y 2. Se deben determinar los dominios
variables de la cadena ligera y pesada del aceptor apropiado y
conocer la secuencia de aminoácidos. Entonces se diseña la RAM
partiendo de las bases de la secuencia del aceptor.
Como primera etapa, los residuos dadores se
sustituyen por residuos aceptores en los CDR. Para este fin, los CDR
se definen, preferiblemente, de la siguiente manera:
\newpage
| cadena pesada: | CDR1 | residuos 31 - 35 |
| CDR2 | residuos 50 - 65 | |
| CDR3 | residuos 95 - 102 | |
| cadena ligera: | CDR1 | residuos 24 - 34 |
| CDR2 | residuos 50 a 56 | |
| CDR3 | residuos 89 a 97 |
Las posiciones en las que los residuos dadores se
tienen que sustituir por los residuos aceptores en el armazón se
eligen entonces como sigue, en primer lugar con respecto a la cadena
pesada y posteriormente con respecto a la cadena ligera.
2.1 Los residuos dadores se usan en todas las
posiciones 24, 27 a 30, 37, 49, 73, 76 y 78 o en todas las
posiciones 23, 24, 27 a 30, 37, 49, 73 y 76 a 78 de la cadena
pesada.
3.1 Los residuos dadores se usan en todas las
posiciones 22, 68 y 71 o en todas las posiciones 68 y 71.
La presente invención se refiere a una molécula
recombinante de anticuerpo anti-IL-5
que tiene afinidad de unión prácticamente igual a la del anticuerpo
dador. La presente invención se describe ahora, como ejemplo,
haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 muestra la secuencia nucleotídica y
de aminoácidos de la cadena pesada de 39D10;
La Figura 2 muestra la secuencia nucleotídica y
de aminoácidos de la cadena ligera de 39D10;
La Figura 3 muestra la alineación de las regiones
del armazón del dominio variable de la cadena pesada de 39D10 con
las regiones del armazón del dominio variables de la cadena pesada
de la secuencia consenso de las cadenas pesadas del grupo III
humano;
La Figura 4 muestra la alineación de las regiones
del armazón del dominio variable de la cadena ligera de 39D10 con
las regiones del armazón del dominio variables de la cadena ligera
de la secuencia consenso de las cadenas ligeras del grupo I
humano;
La Figura 5 muestra las secuencia nucleotídica y
de aminoácidos de la cadena ligera de
anti-IL-5 injertada con CDR,
CTIL-5-gL6;
La Figura 6 muestra las secuencia nucleotídica y
de aminoácidos de la cadena pesada de
anti-IL-5 injertada con CDR,
CTIL-5-10gH;
La Figura 7 muestra un mapa del plásmido
pMR14;
La Figura 8 muestra un mapa del plásmido
pMR15.1;
La Figura 9 muestra las constantes de afinidad y
las velocidades de asociación y disociación de un anticuerpo 39D10
quimérico y el anticuerpo
CTIL-5-10gH\-gL6;
La Figura 10 muestra un gráfico de la
neutralización de IL-5 en el ensayo TF1 por un
grupo de anticuerpos;
La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo
de competición para 39D10 de rata, un anticuerpo 39D10 quimérico y
el anticuerpo CTIL-5-10gH\-gL6;
y
La Figura 12 muestra el efecto de
CTIL-5-10gH\-gL6 en la eosinofilia
en monos.
39D10 es un anticuerpo monoclonal de rata erigido
contra IL-5 humano. Los genes para los dominios
variables de las cadenas ligera y pesada de 39D10 se han clonado
anteriormente (WO 93/16184) y las secuencias nucleotídica y de
aminoácidos de estos dominios se muestran en las Figuras 1 y 2.
Debido a la estrategia usada en la clonación del dominio variable de
la cadena pesada de 39D10, los cinco primeros aminoácidos de las
regiones del armazón son desconocidos. Sin embargo, había disponible
una cadena pesada que contenía la secuencia líder y los cinco
primeros aminoácidos del armazón 1 del anticuerpo YTH 34.5HL,
Riechmann et al., [Nature, 332,
323-327 (1988)].
Los procedimientos de biología molecular usados
fueron como los descritos en Maniatis et al., [Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, volúmenes 1 a 3,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
Se generó una región Vh de cadena pesada por PCR
usando los oligonucleótidos R3601 y R2155. Las secuencias de los
mismos son:
R3601
5'GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGAAG(A,T)TGTGGTTAAACTGGGTTTT3'
R2155
5'GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A,C)(A,G)GAGAC(G,T,A)GTGA3'
La mezcla de reacción (100 \mul) contenía
Tris-HCl 10 mM pH 8,3, MgCl 1,5 mM, KCl 50 mM,
gelatina 0,01% p/v, 0,25 mM de cada desoxirribonucleósido
trifosfato, 0,1 \mug de ADN de la cadena pesada de 39D10, 6 pmoles
de R3601 y R2155 y 0,25 unidades de Taq polimerasa. La mezcla de
reacción se calentó a 94ºC durante 5 minutos y después se sometió a
un ciclo a 94ºC durante 1 minuto, a 55ºC durante 1 minuto y a 72ºC
durante 1 minuto. Después de 30 ciclos, la reacción se extrajo con
un volumen igual de fenol/cloroformo (1:1 v/v), después con
cloroformo antes de precipitarlo por adición de 2,5 volúmenes de
etanol. El producto de PCR se disolvió en el tampón apropiado, se
digirió con HindIII y ApaI, se purificó en un gel de agarosa y se
ligó en el vector pMR14 (Figura 7) que se había digerido también con
HindIII y ApaI. Tras la transformación en E. coli LM1035, las
colonias se desarrollaron durante una noche y se analizaron los
plásmidos de ADN para localizar los insertos Vh. En la Figura 1 se
muestra la secuencia nucleotídica de la región Vh del plásmido
pARH1217.
Se generó un gen Vl de cadena ligera a partir del
Vl original, según se describe en WO 93/16184, se clonó por PCR con
los oligonucleótidos R3585 y R3597. Las secuencias de los mismos
son:
R3585
5'GGACTGTTCCAAGCCGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3'
R3597
5'GGATAACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3'
La PCR se llevó a cabo como se ha descrito
anteriormente. El producto de PCR se digirió con las enzimas BstBI y
SplI y, después de la purificación, se ligó en pMR15.1 (Figura 8)
que anteriormente se había digerido con las mismas enzimas.
Se identificó una colonia, después de la
transformación de E. coli LM1035, que contenía un plásmido
(pARH1215) con un inserto Vl. En la Figura 2 se muestra la secuencia
nucleotídica del inserto Vl.
Para decidir los armazones aceptores humanos más
apropiados para los bucles de CDR de 39D10, se comparó la secuencia
de aminoácidos de los armazones 1 - 3 de 39D10 con las conocidas de
las cadenas ligeras kappa humanas. Se encontró que 39D10 tenía más
homología con las cadenas ligeras del grupo I humano. Basándose en
esto, se decidió usar los armazones de la línea germinal del grupo I
humano para el injerto por CDR. Las homologías entre estas
secuencias se muestran en la Figura 3. Se muestra también la
homología entre las regiones del armazón 4 de 39D10 y la secuencia
consenso de las cadenas ligeras del grupo I humano conocidas. Los
residuos de 39D10 que difieren de la secuencia consenso humana están
subrayados. Se analizó la contribución que estos residuos pueden
hace a la unión de antígenos y se construyeron dos genes para la
cadena ligera injertada por CDR. Fueron CTIL-5- gL5
y CTIL-5-gL6 en los que, así como
los residuos de CDR, cualquiera de los residuos 22, 68 y 71 y los
residuos 68 y 71 también eran de 39D10, respectivamente. En la
Figura 5 se muestran las secuencias nucleotídica y de aminoácidos de
CTIL-5-gL6.
El injerto por CDR de la cadena pesada de 39D10
se llevó a cabo según se ha descrito para la cadena ligera. Se
encontró que las regiones del armazón de 39D10 tenían más homología
con las de los anticuerpos del grupo III humano y, en consecuencia,
se usó la secuencia consenso de los armazones de los genes de la
línea germinal del grupo III humano para aceptar los CDR de la
cadena pesada de 39D10. Como en el caso anterior, se eligió también
la secuencia consenso para las regiones del armazón 4 del grupo III
humano. En la Figura 4 se muestra una comparación de estas
secuencias estando subrayados los residuos de 39D10 que difieren de
la secuencia consenso humana.
Se llevó a acabo el análisis de los residuos del
armazón de 39D10 que podían influir en la unión de antígenos y,
basándose en ello, se construyeron dos genes,
CTIL-5-9gH y
CTIL-5-10gH, en los que los residuos
23, 24, 27 a 30, 37, 49, 73 y 76 a 78 o los residuos 24,
27-30, 37, 49, 73, 76 y 78, respectivamente, eran
de 39D10. En la Figura 6 se muestran las secuencias nucleotídica y
de aminoácidos de CTIL-5-10gH.
Los 39D10 quiméricos (rata/humano) e injertados
con CDR se produjeron para la evaluación biológica por expresión
transitoria de los pares de cadenas ligeras y pesadas después de la
co-transfección en células ováricas de hámster chino
(CHO) usando precipitación de fosfato cálcico.
El día anterior a la transfección, se
tripsinizaron matraces semi-confluyentes de células
CHO-L761h (Cockett et al., Nucl. Acids. Res.,
19, 319-325, 1991), las células se contaron
y los matraces T75 se prepararon cada uno con 10^{7} células. Al
día siguiente, el medio de cultivo se cambió 3 horas antes de la
transfección. Para la transfección, se preparó el precipitado de
fosfato cálcico mezclando 1,25 ml de CaCl_{2} 0,25 M que contiene
50 \mug de cada uno de los vectores de expresión de la cadena
ligera y pesada con 1,25 ml de 2xHBS (16,36 g de NaCl, 11,9 g de
HEPES y 0,4 g de Na_{2}HPO_{4} en 1 litro de agua con el Ph
ajustado a 7,1 con NaOH) y añadiendo inmediatamente al medio de las
células. Después de 3 horas a 37ºC en un incubador de CO_{2}, el
medio y el precipitado se retiraron y las células se chocaron por
la adición de 15 ml de glicerol al 15% en solución salina tamponada
con fosfato (PBS) durante 1 minuto. El glicerol se retiró, las
células se lavaron una vez con PBS y se incubaron durante
48-96 horas en 25 ml de medio que contenía butirato
sódico 10 mM. El anticuerpo se purificó del medio de cultivo
uniendo a y eluyendo desde la proteína A - Sefarosa. La
concentración de anticuerpo se determinó usando ELISA de Ig humana
(véase a
continuación).
continuación).
Se evaluó la expresión del anticuerpo
transfiriendo pares de genes de cadena ligera y pesada en células
CHO y, después de una incubación de 3 días, se midió la cantidad de
anticuerpo acumulado en el medio de cultivo por ELISA.
Para el ELISA, se recubrieron placas Nunc para
ELISA durante una noche a 4ºC con un fragmento F(ab')_{2}
de un anticuerpo específico de un fragmento Fc policlonal cabra
anti-humano (Jackson Immunoresearch, código
109-006-098) a 5 \mug/ml en tampón
de recubrimiento (carbonato sódico 15 mM, hidrogenocarbonato sódico
35 mM, pH 6,9). El anticuerpo no recubierto se retiró lavando 5
veces con agua destilada. Las muestras y los patrones a cuantificar
se diluyeron a aproximadamente 1 \mug/ml en tampón conjugado
(Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0, NaCl 0,1 M, Tween 20 al
0,2% v/v, caseína Hammersten al 0,2% p/v). Las muestras se tritiaron
en los pocillos de microtitulación en diluciones de 2 veces para
dar un volumen final de 0,1 ml en cada pocillo y las placas se
incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación.
Después de la primera etapa de incubación, las placas se lavaron 10
veces con agua destilada y después se incubaron durante 1 hora como
anteriormente con 0,1 ml de un anticuerpo conjugado monoclonal de
ratón anti-humano kappa (clon GD12) peroxidasa The
Binding Site, código MP135) a una dilución de 1 en 700 en tampón
conjugado. La placa se lavó de nuevo y se añadió solución de
sustrato (0,1 ml) a cada pocillo. La solución de sustrato contenía
150 \mul de N,N,N,N- tetrametilbencidina (10 mg/ml en DMSO), 150
\mul de peróxido de hidrógeno (solución al 30%) en 10 ml de
acetato sódico 0,1 M/citrato sódico a pH 6,0. La placa se
desarrolló durante 5-10 minutos para el patrón
superior. Se midió la absorbancia a 630 nm usando un lector de
placa y se determinó la concentración de la muestra comparando las
curvas de titulación con las de los patrones.
Se determinaron las afinidades de los anticuerpos
anti-IL-5 quiméricos e injertados
con CDR usando Análisis de Interacción Bioespecífica (BIA). Los
anticuerpos se produjeron en células CHO por transfección de las
combinaciones de genes de cadena ligera y pesada y purificación de
los sobrenadantes de los cultivos en Proteína A Sefarosa. Para las
medidas de afinidad, se unión un anticuerpo Fc
anti-humano policlonal al Chip Biosensor Pharmacia
(12150 unidades de respuesta relativa, UR) y se usó para capturar
anti-IL-5, que se pasó sobre el
chip a 5 \mug/mlo en HEPES 10 mM, NaCl 0,15 mM, EDTA 3,4 mM, pH
7,4. La cantidad de anti-IL-5
capturado para cada ejecución fue de aproximadamente 1600 UR.
Después el IL-5 recombinante humano se pasó sobre el
chip Sensor a diversas concentraciones (de 0,6 a 5 \mug/ml) en el
tampón anterior. El chip Sensor se limpió después de cada ejecución
con HCl 100 mM y ácido ortofosfórico 100 mM para retirar el
IL-5 unido y el anticuerpo. Los sensogramas
generados se analizaron usando el software cinético disponible con
el aparato BIAcore.
Se determinaron los valores de las constantes de
afinidad y las velocidades de asociación y disociación de los dos
anticuerpos, 39D10 quimérico y
CTIL-5-10gH/-gL6. Los resultados se
muestran en la Figura 9. Se puede ver que el 39D10 quimérico tiene
una afinidad extremadamente alta por IL-5 humano y
que este valor se ha reproducido en
CTIL-5-10gH/-gL6.
Se compararon las actividades de diversos
anticuerpos injertados por CDR con las de 39D10 quiméricos en un
bioensayo in vitro usando células TF1. TF1 es una línea
celular eritroleucémica que necesita GM-CSF para
crecer. GM-CSF se puede sustituir por
IL-5, pero en este caso las células sólo sobreviven
y no proliferan. Sin embargo, la dependencia de IL-5
para la supervivencia significa que las células TF1 se pueden usar
en un bioensayo para comparar las actividades de diversos
anticuerpos anti-IL-5.
La neutralización de anticuerpo
anti-IL-5 se midió usando una
cantidad constante de IL-5 (2 ng/ml) y cantidades
variables de anticuerpo incubado con 5 x 10^{4} células por
pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano durante 3 días.
Durante las últimas 4 horas, las células se cultivan en presencia de
500 \mug/ml de azul de tiazolilo (MIT). Este colorante se
transforma en una forma púrpura insoluble por enzimas
mitocondriales en células viables. El material insoluble se
disolvió incubando durante una noche después de añadir 100 \mul
de dimetilformamida al 50%, SDS al 20% pH 4,7 y la cantidad de
colorante recogida se determinó espectrofotométricamente. Los
niveles de IL-5 bioactivo restantes en presencia de
los anticuerpos se extrapola a partir de una curva patrón que
relaciona la absorción de colorante con la concentración de
IL-5.
Se evaluaron las actividades de diversas
combinaciones de cadenas ligera y pesada usando el bioensayo de TF1.
Los resultados se muestran en la Figura 10. Se puede observar que
todas las combinaciones de cadenas ligera y pesada injertadas con
CDR producen anticuerpos que son equipotentes con el 39D10
quimérico. Estos resultados indican que no se necesitan ni el
residuo 22 de la cadena ligera ni los residuos 23 ó 78 en la cadena
pesada para ser específicos para 39D10 para una unión óptima. La
combinación con los residuos inferiores específicos de 39D10 es, por
lo tanto, CTIL-5-10gH/-gL6.
El IL-5 humano recombinante se
diluyó a 1 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS)
y se añadieron alícuotas de 100 \mul a las placas de
microtitulación (placas de unión Costar Amine) y se incubaron
durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron tres veces con PBS
que contenía Tween 20 al 0,5% y permanecieron activos los sitios
bloqueados con albúmina de suero bovina (BSA) al 2% en PBS durante
30 minutos. Después, las placas se aspiraron y se secaron. Para
comparar la actividad de unión relativa del anticuerpo precursor de
rata (39D10) con los anticuerpo quiméricos e injertados, se
prepararon diluciones en serie de cada anticuerpo
anti-IL-5 en PBS/1% BSA y se
añadieron 50 \mul para duplicar los pocillos, seguido
inmediatamente de 50 \mul de conjugado
39D10-biotina a 0,125 \mug/ml. El ensayo se incubó
durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación y después se
lavó dos veces con PBS. Se añadió conjugado peroxidasa de rábano a
estreptavidina (1 \mug/ml) a todos los pocillos y se incubaron
durante otros 30 minutos. Las placas se lavaron cuatro veces y se
añadieron 100 \mul del sustrato tetrametilbencidina (TMB). Se leyó
el desarrollo de color a 630 nm (referencia a 490 nm) y se dibujó
la DO (630 - 490) contra el log (10) de la concentración de
anticuerpo.
Cuando se compararon las actividades de 39D10 de
rata, 39D10 quimérico y
CTIL-5-10gH/-gL6 en el ensayo de
competición anterior, en la Figura 11 se muestran los resultados
obtenidos. Los tres anticuerpos compitieron igualmente bien con
39D10 biotinilado para unirse a IL-5, lo que
indicaba que los bucles de CDR de 39D10 se habían transferido
satisfactoriamente a los armazones humanos.
En ensayó el anticuerpo
anti-IL-5
(CTIL-5-10gH/-gL6) en un sistema de
mono con condiciones asmáticas modelo (véase Mauser, P.J. et
al., Ann. Rev. Respir. Dis., publicada en prensa). Cuando se
administró, una hora antes de la estimulación con Ascaris, a
los monos de respuesta,
CTIL-5-10gH/-gL6 inhibe la
eosinofilia de lavado pulmonar al 75% a una dosis de 0,3 mg/kg por
vía intravenosa. Este grupo de monos no da una hipersensibilidad a
histamina, por lo que no se pudieron determinar los efectos sobre
CTIL-5-10gH/-gL6 en la
hipersensibilidad. Tres meses después de esta dosis única, la
acumulación eosinófila en la respuesta a la estimulación con
Ascaris aún estaba inhibida en un 75%.
En el ratón alérgico,
CTIL-5-10gH/-gL6 inhibe la
eosinofilia pulmonar a 1 mg/kg por vía intraperitoneal.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CELLTECH LIMITED
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 216 BATH ROAD
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: SLOUGH
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: BERKSHIRE
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: REINO UNIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: SL1 4EN
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 0753 534655
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 0753 536632
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 848473
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPOS RECOMBINANTES ESPECÍFICOS CONTRA INTERLEUQUINA-5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 28
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatenIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCGCAAGC TTGCCGCCAC CATGAAGATT GTGGTTAAAC TGGGTTTT
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAGATGGGC CCTTCGTTGA GGCTGACAGG AGACGTAGTG A
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACTGTTCG AAGCCGCCAC CATGAGTGTG CTCACTCAGG TCCT
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATACAGTT GGTGCAGCAT CCGTACGTTT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 333 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..333
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 111 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 384 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..384
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 128 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
Ser Ala Ser Val Gly}
\sac{Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu
Ser Ala Ser Leu Gly}
\sac{Glu Thr Ile Ser Ile Glu Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
Leu Leu Ile Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln
Leu Leu Ile Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
Gly Thr Asp Phe Thr}
\sac{Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
Ala Thr Tyr Tyr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
Ala Thr Gln Tyr Ser}
\sac{Leu Lys Ile Ser Ser Met Gln Pro Glu Asp Glu
Gly Asp Tyr Phe Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
Val Gln Pro Gly Gly}
\sac{Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
Thr Phe Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
Thr Leu Ser Leu Thr}
\sac{Cys Thr Val Ser Gly Leu Ser Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
Trp Val Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
Trp Met Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
Thr Leu Tyr Leu Gln}
\sac{Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
Tyr Tyr Cys Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser
Gln Val Phe Leu Lys}
\sac{Met Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met
Tyr Phe Cys Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser
Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 399 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..399
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 133 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 420 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..420
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 140 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
Claims (9)
1. Una molécula de anticuerpo recombinante que
tiene afinidad por el antígeno de IL-5 humana, que
comprende:
- a)
- una cadena pesada injertada a CDR en la que, de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, los residuos 31-35, 50-65 y 95-102 son residuos donadores del anticuerpo monoclonal de rata 39D10; y
- b)
- una cadena ligera injertada a CDR en la que, de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, los residuos 24-34, 50-56 y 89-97 son residuos donadores del anticuerpo monoclonal de rata 39D10:
dicha cadena pesada injertada a CDR que tiene un
dominio variable comprende predominantemente residuos marco
conservados de cadena pesada de anticuerpo aceptor humano y dicho
dicha cadena ligera injertada a CDR que tiene un dominio variable
que comprende predominantemente residuos marco conservados de cadena
ligera de anticuerpo aceptor humano,
en la que, de acuerdo con el sistema de
numeración de Kabat, en dicha cadena pesada injertada a CDR, los
residuos marco conservados 24, 27-30, 37, 49, 73, 76
y 78 son al menos residuos donadores adicionalmente del anticuerpo
monoclonal de rata 39D10 y en dicha cadena ligera injertada a CDR,
los residuos marco conservados 68 y 71 son al menos residuos
donadores adicionalmente del anticuerpo monoclonal de rata
39D10.
2. Una molécula de anticuerpo recombinante de
acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además residuos
donadores del anticuerpo monoclonal de rata 39D10 en los residuos
marco conservados 23 y 77 de dicha cadena pesada injertada a
CDR.
3. Una molécula de anticuerpo recombinante de
acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende
además residuos donadores del anticuerpo monoclonal de rata 39D10 en
el residuo marco conservado 22 de dicha cadena ligera injertada a
CDR.
4. Una molécula de anticuerpo recombinante de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que
los residuos aceptores humanos para la cadena pesada injertada a CDR
son residuos de cadena pesada del grupo III humano, y los residuos
aceptores de la cadena ligera injertada a CDR son residuos de cadena
ligera del grupo I humano.
5. Una molécula de anticuerpo recombinante de
acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la región variable de
cadena pesada mostrada en la figura 6 <SEC ID 28> y la región
variable de cadena ligera mostrada en la figura 5 <SEC ID
26>.
6. Una secuencia de ADN que codifica el dominio
variable de la cadena pesada injertada a CDR y/o el dominio variable
de la cadena ligera injertada a CDR de un anticuerpo de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. Una composición terapéutica o de diagnóstico
que comprende la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 combinada con un vehículo, diluyente o
excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. Una molécula de anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en terapia o
diagnóstico.
9. Uso de una cantidad eficaz de una molécula de
anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
5 en la fabricación de un medicamento para administrar a un sujeto
humano o animal para tratar la eosinofilia.
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|---|---|---|---|
| GB9412230A GB9412230D0 (en) | 1994-06-17 | 1994-06-17 | Interleukin-5 specific recombiant antibodies |
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| Publication Number | Publication Date |
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|---|---|---|---|
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