ES2373947T3 - Anticuerpos monoclonales humanos contra interleucina 8 (il-8). - Google Patents

Anticuerpos monoclonales humanos contra interleucina 8 (il-8). Download PDF

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Paul Parren
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Debra Hudson
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Genmab AS
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Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a IL-8 humana que comprende las seis secuencias de CDR VLCDR1 de SEC ID Nº: 16, VLCDR2 de SEC ID Nº: 17, VLCDR3 de SEC ID Nº: 18, VHCDR1 de SEC ID Nº: 22, VHCDR2 de SEC ID Nº: 23 y VH CDR3 de SEC ID Nº: 24.

Description

Anticuerpos monoclonales humanos contra interleucina 8 (IL-8)
Antecedentes de la invención
Las quimiocinas representan una superfamilia de aproximadamente 30 citocinas quimiotácticas que actúan de iniciadores y promulgadores vitales de reacciones inflamatorias. Oscilan de 8 a 11 kD de peso molecular, son activas en un intervalo de concentración de 1 a 100 ng/ml y son producidas por una amplia variedad de tipos de células.
La interleucina 8 (IL-8), anteriormente llamada factor quimiotáctico de neutrófilos derivados de monocitos (MDNCF) o proteína-1 atrayente/de activación de neutrófilos (NAP-1), es una quimiocina y un miembro de la familia de las citocinas que muestra actividad quimiotáctica para tipos específicos de leucocitos. La IL-8 es un miembro de la familia de las quimiocinas CXC en la que un aminoácido está presente entre los dos primeros de los cuatro residuos de cisteína altamente conservados. La IL-8 es un polipéptido del que dos formas predominantes consisten en 72 aminoácidos y 77 aminoácidos. Los monocitos, macrófagos, neutrófilos, linfocitos, fibroblastos dérmicos, queratinocitos, células endoteliales vasculares, melanocitos, hepatocitos y diversas líneas celulares tumorales producen IL-8. La IL-8 es una potente quimiocina neutrófila y participa en la migración de neutrófilos hacia sitios inflamatorios. Tras la unión a sus receptores de alta afinidad (CXCR1 y CXCR2) que están presentes sobre la superficie de neutrófilos, la IL-8 activa los neutrófilos acelerando la desgranulación y elevando la concentración de Ca2+ libre en el citoplasma y también induce migración de neutrófilos para así destruir el tejido infiltrado.
Aunque la respuesta inflamatoria de los neutrófilos es esencial para la destrucción de bacterias que están invadiendo el cuerpo, la activación inapropiada de neutrófilos puede producir varios trastornos inflamatorios. Por ejemplo, se ha recuperado IL-8 de sitios inflamatorios tales como lesiones de pustulosis palmoplantar (PPP), escamas psoriásicas, líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (AR), líquido pleural de pacientes con empiema, macrófagos alveolares de pulmones con fibrosis pulmonar idiopática, líquidos de lavado broncoalveolar de pacientes con síndrome disneico del adulto, fibrosis quística, bronquitis crónica y bronquiectasia. La IL-8 también está asociada a septicemia, asma, glomerulonefritis, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), lesión por isquemiareperfusión y mieloma múltiple. Tales afecciones se caracterizan por inflamación acompañada de infiltración de neutrófilos y lesión de tejido.
También se sabe que la IL-8 promueve angiogénesis y, por tanto, el crecimiento de tumores. Tal actividad se ha asociado al motivo de ELR dentro de la secuencia de IL-8. Las líneas celulares tumorales humanas tales como carcinoma tiroideo, carcinoma de células transitorias, triquilemona, carcinoma de células escamosas y melanoma que expresa constitutivamente IL-8 que desempeña una función en la invasión y metástasis de tumores.
Por consiguiente, los anticuerpos específicos para IL-8 son terapéuticamente importantes para tratar enfermedades mediadas por actividad de IL-8. Previamente se ha descrito un hibridoma que produce un anticuerpo humano contra IL-8 humana, denominado en lo sucesivo 2C6 (patente de EE.UU. nº 6.300.129 por Lonberg y Kay). Sin embargo, todavía se necesitan anticuerpos adicionales específicos para IL-8.
También se reconocen los siguientes documentos: Yang y col. (1999) Journal of Leukocyte Biology 66:401-410 y Huang y col. (2002) American Journal of Pathology 161:125-134, que están ambos relacionados con anticuerpos anti-IL-8 completamente humanos para posibles aplicaciones terapéuticas. Los documentos WO 01/40306 y WO 01/25492, que están ambos relacionados con el anticuerpo M1-25 anti-IL-8 humano.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen a IL-8 humana, además de moléculas biespecíficas y multiespecíficas y otras composiciones terapéuticas que contienen tales anticuerpos, solos o en combinación con agentes terapéuticos adicionales.
En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a IL-8 humana que comprende las seis secuencias de CDR VLCDR1 de SEC ID Nº: 16, VLCDR2 de SEC ID Nº: 17, VLCDR3 de SEC ID Nº: 18, VHCDR1 de SEC ID Nº: 22, VHCDR2 de SEC ID Nº: 23 y VHCDR3 de SEC ID Nº: 24.
La invención también proporciona los anticuerpos y composiciones de la invención para su uso en procedimientos para tratar una variedad de enfermedades mediadas por IL-8.
Los anticuerpos completamente humanos de la presente invención se unen a IL-8 e inhiben la función de IL-8 (y los efectos mediados por IL-8) bloqueando la unión de IL-8 a su receptor. Por ejemplo, los anticuerpos pueden inhibir efectos proinflamatorios y angiogénicos inducidos por IL-8 tales como actividad quimiotáctica inducida por IL-8 para leucocitos y flujo de calcio inducido por IL-8. Los anticuerpos también pueden inhibir el aumento de expresión inducido por IL-8 de CD11b (Mac-1) y la disminución de la expresión de L-selectina (CD62L). Por consiguiente, anticuerpos particulares de la invención tienen una o más de las siguientes características:
(i)
inhibe la unión de IL-8 a sus receptores (CXCR1 y CXCR2);
(ii)
inhibe los efectos proinflamatorios inducidos por IL-8;
(iii) inhibe la actividad quimiotáctica inducida por IL-8 para neutrófilos;
(iv)
inhibe el flujo de calcio inducido por IL-8;
(v)
inhibe los cambios inducidos por IL-8 en los niveles de expresión de moléculas de adhesión sobre neutrófilos;
(vi)
inhibe el aumento de la expresión inducida por IL-8 de CD11b (Mac-1) e inhibe la disminución de la expresión inducida por IL-8 de L-selectina sobre neutrófilos;
(vii) no reacciona de forma cruzada con quimiocinas relacionadas seleccionadas del grupo que consiste en GRO-a humana, GRO-� humana, IP-10 humana y NAP-2 humana;
(viii) inhibe significativamente la quimiotaxia inducida por líquidos biológicos que contienen múltiples factores quimiotácticos que incluyen IL-8.
Por tanto, los anticuerpos humanos de la presente invención proporcionan un medio mejorado para su uso en el tratamiento y la prevención de trastornos mediados por actividad de IL-8 atribuibles en parte a su especificidad única (por ejemplo, especificidad por epítopes y falta de reactividad cruzada con quimiocinas relacionadas), afinidad, estructura, actividad funcional y el hecho de que sean completamente humanos, haciéndolos significativamente menos inmunogénicos y más terapéuticamente eficaces y útiles cuando se administran a pacientes humanos que otros anticuerpos para IL-8 previamente generados (por ejemplo, anticuerpos murinos y humanizados).
Anticuerpos humanos aislados de la invención incluyen una variedad de isotipos de anticuerpos tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgA secretora, IgD y IgE. Normalmente, incluyen isotipos IgG1 (por ejemplo, IgG1,K o IgG1A), IgG3, IgG4 y IgM. Los anticuerpos pueden ser intactos (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG3) o pueden incluir sólo una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv monocatenario).
Anticuerpos terapéuticos particulares de la invención incluyen el anticuerpo monoclonal humano (HuMab) 10F8.
Los anticuerpos humanos de la invención comprenden un dominio de CDR que tiene una región CDR1 de cadena pesada y ligera humana, una región CDR2 de cadena pesada y ligera humana y una región CDR3 de cadena pesada y ligera humana, en el que el anticuerpo comprende las seis secuencias CDR VL CDR1 de SEC ID Nº: 16, VL CDR2 de SEC ID Nº: 17, VL CDR3 de SEC ID Nº: 18, VH CDR1 de SEC ID Nº: 22, VH CDR2 de SEC ID Nº: 23 y VH de SEC ID Nº: 24.
También se refiere a anticuerpos que se unen a un epítope sobre IL-8 humana definida por el anticuerpo 10F8, y/o que compite por la unión a IL-8 con el anticuerpo 10F8, o que tienen otra unión funcional característica presentada por el anticuerpo 10F8. Tales anticuerpos incluyen aquellos que se unen a IL-8 con una constante de equilibrio de disociación (KD) de aproximadamente 10-10 M o menos, o 10-11 M o incluso menos. Tales anticuerpos también incluyen aquellos que no reaccionan de forma cruzada con quimiocinas relacionadas, por ejemplo, GRO-a humana, GRO-� humana, IP-10 o NAP-2 humana, y por tanto, no inhiben su función.
En otro aspecto, los anticuerpos humanos de la invención pueden coadministrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Pueden coadministrarse simultáneamente con tales agentes (por ejemplo, en una única composición o por separado) o pueden administrarse antes o después de la administración de tales agentes. Tales otros agentes pueden incluir agentes para tratar trastornos inflamatorios o hiperproliferativos de la piel, agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios o agentes quimioterapéuticos.
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas o de diagnóstico que comprenden uno o más (es decir, una combinación de) anticuerpos humanos anti-IL-8 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por tanto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención o el vector de expresión de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede incluir adicionalmente uno o varios agentes terapéuticos, tales como los desvelados anteriormente.
La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para su uso en procedimientos de tratamiento y prevención de enfermedades mediadas por IL-8 en los que los anticuerpos humanos de la presente invención se administran a pacientes (por ejemplo, sujetos humanos) a dosificaciones terapéuticamente eficaces usando cualquier vía de administración adecuada tal como inyección o infusión y otras vías de administración conocidas en la técnica para productos clínicos basados en anticuerpos.
En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo, un vector de expresión o una composición farmacéutica de la invención para su uso en un procedimiento para inhibir efectos proinflamatorios inducidos por IL-8 en un sujeto. El efecto proinflamatorio de IL-8 puede ser, por ejemplo, actividad quimiotáctica inducida por IL-8 para leucocitos.
La invención también proporciona el uso de un anticuerpo, un vector de expresión o una composición farmacéutica de la invención en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno inmunitario, autoinmunitario, inflamatorio o infeccioso mediado por IL-8 humana o que implica actividad de IL-8 humana o para tratar o prevenir cáncer.
Por consiguiente, se proporcionan anticuerpos humanos de la presente invención para su uso en el tratamiento de y/o la prevención de una variedad de enfermedades mediadas por IL-8 administrando los anticuerpos a pacientes que padecen tales enfermedades.
Enfermedades a modo de ejemplo que pueden tratarse (por ejemplo, mejorarse) o prevenirse usando los anticuerpos y composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, trastornos inflamatorios o hiperproliferativos de la piel, enfermedades inmunitarias, autoinmunitarias o infecciosas y enfermedades que implican angiogénesis mediada por IL-8 tales como tumores y cánceres.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar in vitro la presencia de IL-8en una muestra o un individuo, por ejemplo, para diagnosticar una enfermedad relacionada con IL-8. Éste también puede ser útil para monitorizar una enfermedad relacionada con IL-8 y el efecto de tratamiento con un anticuerpo anti-IL-8 y para determinar y ajustar la dosis del anticuerpo que va a administrarse. En una realización, la presencia de IL-8 se detecta poniendo en contacto una muestra que va a probarse, opcionalmente junto con una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano de la invención en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y IL-8. Entonces se detecta la formación de complejos (por ejemplo, usando un ELISA). Si se usa una muestra de control junto con la muestra de prueba, el complejo se detecta en ambas muestras y cualquier diferencia estadísticamente significativa en la formación de complejos entre las muestras es indicativa de la presencia de IL-8 en la muestra de prueba.
En otro aspecto, la invención se refiere a anticuerpos antiidiotípicos que se unen a los anticuerpos monoclonales humanos de la invención. Estos anticuerpos antiidiotípicos pueden usarse como herramienta de inmunodiagnóstico para detectar y cuantificar niveles de anticuerpos monoclonales humanos contra IL-8 en laboratorio o muestras de paciente. Esto puede ser útil para examinar la farmacocinética del anticuerpo anti-IL-8 o para determinar y ajustar la dosificación del anticuerpo anti-IL-8 y para monitorizar la enfermedad y el efecto de tratamiento en un paciente.
Pueden prepararse anticuerpos antiidiotípicos de ratón, por ejemplo, inmunizando ratones BALB/C con los anticuerpos monoclonales humanos según la invención y generando hibridomas a partir de bazos de estos ratones por fusión con células de mieloma tales como células NS1 usando técnicas convencionales.
En otro aspecto más, la invención proporciona un animal no humano transgénico que expresa un anticuerpo de la invención, en el que el animal no humano transgénico tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera humana.
El animal puede ser, por ejemplo, un ratón transgénico. El animal no humano transgénico puede inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de antígeno de IL-8, antígeno de IL-8 recombinante y/o células que expresan IL-8, que incluyen células transfectadas con IL-8. Preferentemente, el animal no humano transgénico, por ejemplo, el ratón transgénico, puede producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para IL-8 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgM) sometiéndose a recombinación de V-D-J y cambio de isotipo. El cambio de isotipo puede producirse, por ejemplo, por cambio de isotipo clásico o no clásico.
Por consiguiente, en otro aspecto más, la invención proporciona linfocitos B aislados de un animal no humano transgénico como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, un ratón transgénico que expresa anticuerpos humanos anti-IL-8 de la invención. LOS linfocitos B aislados pueden entonces inmortalizarse por fusión con una célula inmortalizada para proporcionar una fuente (por ejemplo, un hibridoma) de anticuerpos humanos anti-IL-8. Tales hibridomas (es decir, que producen anticuerpos humanos anti-IL-8) también están incluidos dentro del alcance de la invención.
Por tanto, la presente invención también proporciona un hibridoma que comprende un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico en el que los reordenamientos del segmento del gen V-(D)-J han producido la formación de un transgén de cadena pesada humana funcional y un transgén de cadena funcional, fusionado con una célula inmortalizada, en el que el hibridoma produce una cantidad detectable del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes. La invención proporciona además un transfectoma, una célula huésped eucariota o procariota o un animal no humano transgénico o planta que comprende ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada humana y una cadena ligera humana, o una línea celular tal como una línea celular CHO o NS/0, que produce una cantidad detectable del anticuerpo de la invención.
Como se ejemplifica en este documento, los anticuerpos humanos de la invención pueden obtenerse directamente a partir de hibridomas que expresan el anticuerpo, o pueden clonarse y expresarse recombinantemente en una célula huésped (por ejemplo, una célula CHO o una célula NS/0). Otros ejemplos de células huésped son células HEK293, células vegetales, microorganismos tales como E. coli y hongos tales como levadura. Alternativamente, pueden producirse recombinantemente en un animal no humano transgénico o planta.
Por consiguiente, en otro aspecto más, la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que incluyen moléculas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos humanos anti-IL-8 de la invención, y células huésped transfectadas con tales vectores. Los procedimientos de producción de los anticuerpos cultivando estas célulashuésped también están englobados por la invención. Ácidos nucleicos particulares empleados por la invención comprenden las secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID Nº:10 y SEC ID Nº:6, que codifican las cadenas pesadas y ligeras respectivamente de 10F8.
Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos que no deben interpretarse como limitantes.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra las secuencias de nucleótidos de las regiones VL y VH (SEC ID Nº:1 y 3), respectivamente, de HuMab 10F8. Las secuencias conductoras están subrayadas.
La Figura 2 es una comparación de alineamientos de la secuencia de nucleótidos de la región V de la cadena lineal (kappa) de HuMab 10F8 (SEC ID Nº:6) y la secuencia de nucleótidos de la línea germinal de VK A-27 correspondiente (SEC ID Nº:5).
La Figura 3 es una comparación de alineamientos de la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena lineal (kappa) de HuMab 10F8 (SEC ID Nº:8) y la secuencia de aminoácidos codificada por la línea germinal de VK A-27 correspondiente (SEC ID Nº:7).
La Figura 4 es una comparación de alineamientos de la secuencia de nucleótidos de la región V de la cadena pesada de HuMab 10F8 (SEC ID Nº:10) y la secuencia de nucleótidos de la línea germinal de VH 3-33 correspondiente (SEC ID Nº:9).
La Figura 5 es una comparación de alineamientos de la secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena pesada de HuMab 10F8 (SEC ID Nº:12) y la secuencia de aminoácidos codificada por la línea germinal de VH 3-33 correspondiente (SEC ID Nº:11).
La Figura 6 es una gráfica que muestra que HuMab 10F8 se une tanto a IL-8 derivada de células endoteliales como derivada de monocitos, pero que no se une a IP-10, GRO-a o GRO-�.
La Figura 7A es una gráfica que muestra la inhibición de la unión de [125I]-IL-8 a neutrófilo por HuMab 10F8 (cuadrados blancos) con respecto a un anticuerpo específico para IL-8 murino (m-a-IL8) (asteriscos).
La Figura 7B es una gráfica que muestra la inhibición de la unión de [125I]-IL-8 a neutrófilo por HuMab 10F8 (10F8 H) derivado de hibridoma (cuadrados blancos) y HuMab 10F8 (10F8 T) derivado de transfectoma (cuadrados rellenos), respectivamente.
La Figura 8A es una gráfica que muestra la inhibición de quimiotaxia de neutrófilos mediada por IL-8 por HuMab 10F8 (triángulos) con respecto a un anticuerpo específico para IL-8 murino (6217.111) (cuadrados).
La Figura 8B es una gráfica que muestra la inhibición de quimiotaxia de neutrófilos mediada por IL-8 por HuMab 10F8 como se ha determinado por un ensayo de transmigración usando una cámara Boyden.
La Figura 9A es una gráfica que muestra la inhibición de eliminación mediada por IL-8 de L-selectina (CD62L) sobre la superficie de neutrófilos por HuMab 10F8 (cuadrados rellenos) con respecto a un anticuerpo de control de isotipo humano irrelevante (asteriscos).
La Figura 9B es una gráfica que muestra la inhibición de la expresión mediada por IL-8 de CD11b sobre la superficie celular de neutrófilos por HuMab 10F8 (cuadrados rellenos) con respecto a un anticuerpo de control de isotipo humano irrelevante (asteriscos).
La Figura 10 es una gráfica que muestra la presencia de IL-8 y GRO-a en material de pacientes con pustulosis palmoplantar (PPP) como se ha determinado por ELISA.
La Figura 11 muestra los resultados de la medición de IL-8, GRO-a y C5a presentes en líquido de agua de los pies obtenido de controles sanos (n=6), pacientes con eccema (n=6) o pacientes con PPP (n=6).
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos humanos mejorados que se unen a IL-8 humana y tales anticuerpos para su uso en el tratamiento y el diagnóstico de una variedad de trastornos mediados por IL-8 (por ejemplo, trastornos producidos por los efectos proinflamatorios y los efectos angiogénicos de IL-8). Como se usa en este documento, el término “efectos proinflamatorios” incluye cualquier respuesta inmunitaria humoral o mediada por células inducida por IL-8, tal como la actividad quimiotáctica para leucocitos. El término “efectos angiogénicos de IL8” incluye el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos o la vascularización de células tumorales inducida por IL-8. La invención emplea anticuerpos monoclonales humanos que se unen a e inhiben tales funciones de IL-8, proporcionando particularmente tales anticuerpos para su uso en procedimientos de terapia humana.
En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, más particularmente un isotipo IgG1,K o IgG1,A. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG3, más particularmente un isotipo IgG3,K o IgG3,A. En otra realización más, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4, más particularmente un isotipo IgG4,K o IgG4,A. En todavía otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgA1 o IgA2. En todavía otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgM.
En una realización, los anticuerpos humanos se producen en un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico que puede producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para IL-8 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) experimentando recombinación de V-D-J y cambio de isotipo. Tal animal transgénico también puede ser un conejo transgénico para producir anticuerpos policlonales tal como se desvela en el documento US 2003/0017534.
Por consiguiente, aspectos particulares de la invención incluyen no sólo anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y composiciones farmacéuticas de los mismos, sino también animales transgénicos no humanos, linfocitos B, hibridomas y transfectomas que producen anticuerpos monoclonales de la invención. Los procedimientos de uso de los anticuerpos de la invención para detectar una célula productora de IL-8 también están englobados por la invención.
La invención también proporciona los anticuerpos de la invención para su uso en un procedimiento para bloquear o inhibir actividades inducidas por IL-8, por ejemplo, actividades proinflamatorias, actividades quimiotácticas y angiogénesis. Los anticuerpos son útiles en el tratamiento de trastornos asociados a IL-8.
En una realización, los anticuerpos humanos de la invención pueden usarse en procedimientos para tratar trastornos inflamatorios o hiperproliferativos de la piel tales como pustulosis palmoplantar (PPP), psoriasis, que incluye psoriasis en placas y psoriasis de tipo gotosa, enfermedades ampollosas de la piel tales como penfigoide ampolloso, dermatitis de contacto, eccema, dermatitis eritematosa y atópica.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención se proporcionan para su uso en procedimientos para tratar enfermedades inmunitarias, autoinmunitarias o infecciosas tales como artritis psoriásica, esclerodermia y esclerosis sistémica, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lesión pulmonar aguda tal como síndrome disneico agudo o síndrome disneico del adulto, meningitis, encefalitis, uveítis, mieloma múltiple, glomerulonefritis, nefritis, asma, aterosclerosis, deficiencia de adhesión leucocitaria, esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjögren, diabetes juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behcet, nefritis inmunocompleja, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM, trombocitopenias inmunomediadas tales como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis lúpica, lupus eritematoso, artritis reumatoide (AR), espondilitis anquilosante, pénfigo, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, vasculitis de vasos pequeños tales como granulomatosis de Wegener, síndrome de Omen, insuficiencia renal crónica, enfermedad tiroidea autoinmune, mononucleosis infecciosa aguda, VIH, enfermedades asociadas al virus del herpes, infecciones por virus humanos tales como resfriado como se produce por rinovirus humano, coronavirus, otros enterovirus, virus del herpes, virus de la gripe, virus paragripal, virus respiratorio sincitial o infección por adenovirus, neumonía bacteriana, heridas, septicemia, infarto cerebral/edema cerebral, lesión por isquemia-reperfusión y hepatitis C.
En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se proporcionan para su uso en un procedimiento de tratamiento de lesión por isquemia-reperfusión después de trombólisis, derivación cardiopulmonar, intervención coronaria percutánea (ICP), derivación de las arterias coronarias o trasplante cardíaco.
En otra realización más, los anticuerpos humanos de la invención se proporcionan para su uso en un procedimiento de tratamiento de hepatitis alcohólica y pancreatitis aguda.
En todavía otra realización, los anticuerpos humanos de la invención se proporcionan para su uso en un procedimiento para tratar enfermedades que implican angiogénesis mediada por IL-8 tales como tumores y cánceres, por ejemplo, melanoma, carcinoma tiroideo, carcinoma de células transitorias, triquilemona, carcinoma de células escamosas y cáncer de mama.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención se proporcionan para su uso en un procedimiento para tratar enfermedades en las que el bloqueo de la migración de granulocitos es beneficioso, por ejemplo, en enfermedades que afectan el sistema nervioso central tales como angeítis cerebral aislada; enfermedades que afectan el sistema nervioso periférico tales como mononeuritis múltiple; trastornos cardiovasculares tales como infarto agudo de miocardio, miocarditis, pericarditis y endocarditis de Liebman-Sacks; trastornos pulmonares tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), alveolitis, bronquiolitis obliterante, fibrosis quística, aspergilosis alérgica y síndrome de Löffer; trastornos hepáticos tales como colangitis esclerosante; trastornos urogenitales tales como cistitis crónica; trastornos renales tales como nefritis tubulointersticial; enfermedades infecciosas tales como síndrome respiratorio agudo grave (SRAG); trastornos reumáticos tales como vasculitis de vasos grandes (incluyendo arteritis de células gigantes, polimialgia reumática y arteritis de Takayasu), vasculitis de vasos de tamaño medio (incluyendo poliarteritis nodosa, poliarteritis nodosa localizada y enfermedad de Kawasaki), vasculitis de vasos pequeños (incluyendo síndrome de Churg- Strauss, poliarteritis microscópica, vasculitis crioglobulinémica y angeítis leucocitoclástica), vasculitis secundaria (incluyendo vasculitis reumatoide y vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico o síndrome de Sjögren), sacroileítis aislada, el síndrome de SAPHO y discitis (incluyendo discitis posoperatoria); trastornos endocrinos tales como tiroiditis subaguda; trastornos de la piel tales como penfigoide cicatricial, dermatitis herpetiforme, dermatosis pustulosa subcorneal, epidermolisis ampollosa adquirida, rosácea, dermatosis febril aguda, granuloma anular (incluyendo síndrome de Sweet), piodermia gangrenosa y acné (incluyendo acné conglobata); trastornos del tejido conjuntivo tales como sarcoidosis, policondritis recurrente, fiebre mediterránea familiar, paniculitis, eritema nodoso, enfermedad de Weber-Christian y fibrosis retroperitoneal.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención se proporcionan para su uso en un procedimiento para tratar enfermedades en el que la interferencia con interacciones entre IL-8 y osteoclastos es beneficiosa, tal como osteoporosis y metástasis osteolíticas.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención se proporcionan para su uso en un procedimiento para tratar enfermedad en el que la interferencia con interacciones entre IL-8 y células tumorales es beneficiosa, tal como cáncer gástrico, cáncer colorrectal y cáncer de la vejiga urinaria.
Con el fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, ciertos términos se definen primero. Definiciones adicionales se exponen en toda la descripción detallada.
Los términos “IL-8”, “antígeno de IL-8” e “interleucina 8” se usan indistintamente en este documento e incluyen cualquier variante o isoforma que sea naturalmente expresada por células o se exprese por células transfectadas con el gen IL-8.
El término “anticuerpo” como se denomina en este documento incluye anticuerpos intactos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, “porción de unión a antígeno”) o cadenas individuales del mismo. Un “anticuerpo” se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) entreconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en este documento como VH) y una región constante de la cadena pesada. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en este documento como VL) y una región constante de la cadena ligera. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden. FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores huésped, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.
El término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción de anticuerpo”), como se usa en este documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse a un antígeno (por ejemplo, IL-8). Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col., (1989) Nature 341:544-546) que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, por ejemplo, VH CDR3. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse usando procedimientos recombinantes, por un ligador
sintético que permite que se preparen como una única cadena de proteínas en la que la que las regiones de VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como cadenas individuales Fv (scFv); véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos monocatenarios también pretenden englobarse dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo. Además, los fragmentos de unión a antígeno incluyen proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que comprenden (i) un polipéptido de dominio de unión (tal como una región variable de la cadena pesada, una región variable de la cadena ligera o una región variable de la cadena pesada fusionada con una región variable de la cadena ligera por un péptido ligador) que está fusionado con un polipéptido de la región bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina fusionada con la región bisagra, y (iii) una región constante CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina fusionada con región constante CH2. La región bisagra se modifica preferentemente reemplazando uno o más residuos de cisteína con residuos de serina para evitar la dimerización. Tales proteínas de fusión de las inmunoglobulinas del dominio de unión se desvelan adicionalmente en los documentos US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas para aquellos expertos en la materia, y los fragmentos se criban para utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.
El término “epítope” significa un determinante de proteína que puede unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopes consisten normalmente en agrupaciones de superficies químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, además de características de carga específicas. Los epítopes conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión al primero, pero no al último, se pierde mediante tratamiento con disolventes desnaturalizantes.
Como se usa en este documento, los términos “inhibe la unión” y “bloquea la unión” (por ejemplo, con referencia a la inhibición/bloqueo de la unión de IL-8 a sus receptores, CXCR1 y CXCR2) se usan indistintamente y engloban tanto la inhibición/bloqueo parcial como completa. La inhibición/bloqueo de IL-8 reduce o altera preferentemente el nivel o tipo normal de actividad que se produce cuando se produce la unión de IL-8 sin inhibición o bloqueo, por ejemplo, la inhibición de IL-8 indujo liberación de elastasa o flujo de calcio o inhibición del aumento de la expresión inducida por IL-8 de CD11b (Mac-1) y disminuyó la expresión de L-selectina. La inhibición y el bloqueo también pretenden incluir cualquier disminución medible en la afinidad de unión de IL-8 cuando está en contacto con un anticuerpo anti-IL-8 con respecto a IL-8 que no está en contacto con un anticuerpo anti-IL-8, por ejemplo, el bloqueo de la unión de IL-8 a su receptor por al menos aproximadamente el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% o el 100%.
Los términos “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal” como se usan en este documento se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítope particular. Por consiguiente, el término “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a anticuerpos que presentan una única especificidad de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera fusionado con una célula inmortalizada.
El término “anticuerpo humano recombinante” como se usa en este documento pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir del mismo (descrito adicionalmente en la Sección I, más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinante combinatoria y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique cortar y empalmar las secuencias del gen de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, si se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de y están relacionadas con las secuencias de VH y VL de la línea germinal humana, pueden existir no naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Como se usa en este documento, un “anticuerpo heterólogo” se define en relación con el organismo no humano transgénico que produce un anticuerpo tal. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos codificante correspondiente a la encontrada en un organismo que no consiste en el animal no humano transgénico, y generalmente de una especie distinta de la del animal no humano transgénico.
Un “anticuerpo aislado”, como se usa en este documento, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une a IL-8 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen a antígenos distintos de IL-8). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une a un epítope, isoforma o variante de IL-8 humana puede tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de IL-8). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. En una realización de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales “aislados” que tienen diferentes especificidades se combinan en una composición bien definida.
Como se usa en este documento, “unión específica” se refiere a la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado. Normalmente, el anticuerpo se une con una afinidad correspondiente a una KD de aproximadamente 10-8 M o menos, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad (como se expresa por KD) que es al menos 10 veces inferior, y preferentemente al menos 100 veces inferior a su afinidad por la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Alternativamente, el anticuerpo puede unirse con una afinidad correspondiente a una KA de aproximadamente 107 M-1 o superior, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad (como se expresa por KA) que es al menos 10 veces superior, y preferentemente al menos 100 veces superior, a su afinidad por la unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Las frases “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico para un antígeno” se usan indistintamente en este documento con el término “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno”.
El término “kd” (s-1), como se usa en este documento, pretende referirse a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Dicho valor también se denomina en lo sucesivo el valor kdis.
El término “ka” (M-1 x s-1), como se usa en este documento, pretende referirse a la constante de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
El término “KA” (M), como se usa en este documento, pretende referirse a la constante de equilibrio de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
El término “KD” (M-1), como se usa en este documento, pretende referirse a la constante de equilibrio de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
Como se usa en este documento, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por genes de la región constante de la cadena pesada.
Como se usa en este documento, “cambio de isotipo” se refiere al fenómeno por el que la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a una de las otras clases de Ig.
Como se usa en este documento, “isotipo sin cambiar” se refiere a la clase isotípica de cadena pesada que se produce cuando no ha tenido lugar cambio de isotipo; el gen CH que codifica el isotipo sin cambiar es normalmente el primer gen CH inmediatamente en la dirección 3' del gen VDJ funcionalmente reordenado. El cambio de isotipo se ha clasificado como cambio de isotipo clásico o no clásico. El cambio de isotipo clásico se produce por acontecimientos de recombinación que implican al menos una región de secuencias de cambio en el transgén. El cambio de isotipo no clásico puede producirse, por ejemplo, por recombinación homóloga entre oμ humana y Lμ humana (deleción asociada a5 ). Pueden producirse mecanismos de cambio de isotipo no clásico alternativos tales como recombinación intertransgénica y/o intercromosómica, entre otros, y efectuar el cambio de isotipo.
Como se usa en este documento, el término “secuencia de cambio” se refiere a aquellas secuencias de ADN responsables de la recombinación en el cambio. Una secuencia “donante de cambio”, normalmente una región de cambio μ, estará 5' (es decir, aguas arriba) de la región de construcción que va a delecionar durante la recombinación en el cambio. La región “aceptora de cambio” estará entre la región de construcción que va a delecionarse y la región constante de sustitución (por ejemplo, y, E, etc.).
Como se usa en este documento, “patrón de glicosilación” se define como el patrón de unidades de hidratos de carbono que están covalentemente unidas a una proteína, más específicamente a una proteína de inmunoglobulina. Un patrón de glicosilación de un anticuerpo heterólogo puede caracterizarse como que es sustancialmente similar a los patrones de glicosilación que se producen naturalmente en anticuerpos producidos por las especies del animal transgénico no humano, en las que un experto en la materia reconocería el patrón de glicosilación del anticuerpo heterólogo como que es más similar a dicho patrón de glicosilación en las especies del animal transgénico no humano que en las especies de las que se derivaron los genes CH del transgén.
El término “que se produce naturalmente” como se usa en este documento cuando se aplica a un objeto se refiere al hecho de que un objeto pueda encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o de polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio se produce naturalmente.
El término “reordenado” como se usa en este documento se refiere a una configuración de un locus de inmunoglobulina de la cadena pesada o cadena ligera en el que un segmento V está posicionado inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio VH o VL completo, respectivamente. Un locus del gen de inmunoglobulina reordenado puede identificarse por comparación con ADN de la línea germinal; un locus reordenado tendrá al menos un elemento de homología heptámero/nonámero recombinado.
El término “sin reordenar” o “configuración de línea germinal” como se usa en este documento en referencia a un segmento V se refiere a la configuración en la que el segmento V no está recombinado, de manera que está inmediatamente adyacente a un segmento D o J.
El término “molécula de ácido nucleico”, como se usa en este documento, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario.
El término “molécula de ácido nucleico aislada”, como se usa en este documento en referencia a ácidos nucleicos que codifican anticuerpos intactos o porciones de anticuerpo (por ejemplo, VH, VL, CDR3) que se unen a IL-8 pretende referirse a una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo intacto o porción de anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos intactos o porciones de anticuerpos que se unen a antígenos distintos de IL-8, otras secuencias que pueden flanquear naturalmente el ácido nucleico en ADN genómico humano. En una realización, el anticuerpo humano antiIL-8 incluye la secuencia de aminoácidos de 10F8, además de regiones de aminoácidos variables de la cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) que tienen las secuencias mostradas en SEC ID Nº:12 y 8 o codificadas por las secuencias de nucleótidos mostradas en SEC ID Nº: 10 y 6.
La presente invención también engloba “derivados” de las secuencias de aminoácidos como se exponen en SEC ID Nº: 8 ó 12 en las que uno o más de los residuos de aminoácidos se han derivatizado, por ejemplo, por acilación o glicosilación sin afectar o alterar significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene las secuencias de aminoácidos.
Además, la presente invención comprende anticuerpos en los que se han hecho una o más alteraciones en la región Fc con el fin de cambiar las propiedades funcionales o farmacocinéticas de los anticuerpos. Tales alteraciones pueden producir una disminución o aumento de la unión de Clq y CDC (citotoxicidad dependiente del complemento)
o de la unión de FcyR y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Las sustituciones pueden hacerse, por ejemplo, en una o más de las posiciones de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 de la región constante de la cadena pesada, produciendo así una alteración en una función efectora a la vez que se retiene la unión al antígeno en comparación con el anticuerpo sin modificar, véanse los documentos US 5.624.821 y US
5.648.260. Puede hacerse más referencia al documento WO 00/42073 que desvela anticuerpos con regiones Fc alteradas que aumentan ADCC, y al documento WO 94/29351 que desvela anticuerpos que tienen mutaciones en la región del extremo N del dominio CH2 que alteran la capacidad de los anticuerpos para unirse a FcRI y así disminuye la capacidad de los anticuerpos para unirse a Clq, que a su vez disminuye la capacidad de los anticuerpos para fijar el complemento. Además, Shields y col., J. Biol. Chem. (2001) 276:6591-6604 enseñan variantes de combinación, por ejemplo, T256A/S298A, S298A/E333A y S298A/E333A/K334A, que mejoran la unión a FcyRIII.
La semivida in vivo de los anticuerpos también puede mejorarse modificando el epítope del receptor silvestre del dominio constante de Ig o un dominio constante similar a Ig de forma que la molécula no comprenda un dominio CH2 intacto o una región Fc de Ig intacta, véanse los documentos US 6.121.022 y US 6.194.551. La semivida in vivo puede además aumentarse haciendo mutaciones en la región Fc, por ejemplo, sustituyendo leucina por treonina en la posición 252, serina por treonina en la posición 254 o fenilalanina por treonina en la posición 256, véase el documento US 6.277.375.
Además, el patrón de glicosilación de los anticuerpos puede modificarse con el fin de cambiar la función efectora de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden expresarse en un transfectoma que no añade la unidad de fucosa normalmente unida al hidrato de carbono a Asn en la posición 297 de Fc con el fin de potenciar la afinidad de Fc por FcyRIII, que a su vez producirá un aumento de ADCC de los anticuerpos en presencia de células NK, véase. Shield y col. (2002) J. Biol. Chem., 277:26733. Además, puede hacerse la modificación de la galactosilación con el fin de modificar CDC. Puede hacerse otra referencia al documento WO 99/54342 y Umana y col., Nat. Biotechnol. (1999) 17:176 que desvela una línea celular CHO manipulada por ingeniería para expresar GntIII que produce la expresión de anticuerpos monoclonales con glicoformas alteradas y actividad de ADCC mejorada.
Además, los fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos Fab, de la invención pueden pegilarse para aumentar la semivida. Esto pueden llevarse a cabo por reacciones de pegilación conocidas en la técnica como se describen, por ejemplo, en Focus on Growth Factors (1992) 3:4-10, documentos EP 154 316 y EP 401 384.
Por consiguiente, la invención incluye anticuerpos codificados por las secuencias de nucleótidos (de la región variable de la cadena pesada y ligera) desveladas en este documento y/o que contienen las secuencias de aminoácidos (de la región variable de la cadena pesada y ligera) desveladas en este documento (es decir, SEC ID Nº: 10, 6, 12 y 8).
Para secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos, el término “homología” indica el grado de identidad entre dos secuencias, cuando se alinean y se comparan óptimamente, con inserciones o deleciones apropiadas. Alternativamente, existe homología sustancial cuando los segmentos de ADN se hibridan bajo condiciones de hibridación selectivas con el complemento de la hebra.
La identidad en porcentaje entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, homología en % = nº de posiciones idénticas/nº total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que necesitan introducirse para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación de la identidad en porcentaje entre dos secuencias pueden llevarse a cabo usando un algoritmo matemático como se describe más adelante en los ejemplos no limitantes.
La identidad en porcentaje entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com) usando una matriz NWSgapADN.CMP y un peso por hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. La identidad en porcentaje entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos también puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) usando una tabla de residuos por peso PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, la identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com) usando tanto una matriz Blossum 62 como una matriz PAM250, y un peso por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
Las secuencias de ácidos nucleicos y de proteínas de la presente invención pueden usarse adicionalmente como “secuencia de búsqueda” para realizar una búsqueda por comparación en bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos con BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Las búsquedas de proteínas con BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineamientos con huecos para los fines de comparación puede utilizarse BLAST Gapped como se describe en Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Si se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está “aislado” o “se convierte en sustancialmente puro” cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares por técnicas convencionales que incluyen tratamiento alcalino/SDS, bandeado con CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros muy conocidos en la técnica. Véase F. Ausubel, y col., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987).
Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención, aunque frecuentemente en una secuencia nativa (excepto para sitios de restricción modificados y similares), a partir de tanto ADNc, genómico como mezclas de los mismos, pueden mutarse según técnicas convencionales para proporcionar secuencias de genes. Para codificar secuencias, estas mutaciones pueden afectar las secuencias de aminoácidos según se desee. En particular se contemplan secuencias de ADN sustancialmente homólogas a o derivadas de V, D, J nativas, constantes, cambios y otras secuencias tales descritas en este documento (en las que “derivadas” indica que una secuencia es idéntica o modificada de otra secuencia).
Un ácido nucleico está “operativamente ligado” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente ligado a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la transcripción, operativamente ligado significa que las secuencias de ADN que están ligadas son contiguas y, si fuera necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, contiguas y en marco de lectura. Para secuencias de cambio, operativamente ligadas indica que las secuencias pueden efectuar recombinación en el cambio.
El término “vector”, como se usa en este documento, pretende referirse a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma vírico. Ciertos vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y así replicarse junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente ligados. Tales vectores se denominan en este documento “vectores de expresión recombinantes” (o simplemente “vectores de expresión”). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas tales de vectores de expresión tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que desempeñan funciones equivalentes.
El término “célula huésped recombinante” (o simplemente “célula huésped”), como se usa en este documento, pretende referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que tales términos pretenden referirse no sólo a la célula objeto particular, sino también a la progenie de una célula tal. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a tanto la mutación como a influencias del medioambiente, tal progenie no puede, en realidad, ser idéntica a la célula parental, pero todavía está incluida dentro del alcance del término “célula huésped” como se usa en este documento. Las células huésped recombinantes incluyen, por ejemplo, células CHO y células NS/0.
El término “transfectoma”, como se usa en este documento, incluye una célula huésped eucariota recombinante que expresa el anticuerpo tal como células CHO, células NS/0, células HEK293, células vegetales, u hongos, que incluyen células de levadura.
Como se usa en este documento, el término “sujeto” incluye cualquier animal humano o no humano. El término “animal no humano” incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.
Los términos “animal no humano transgénico” se refiere a un animal no humano que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes o transcromosomas de la cadena pesada y/o ligera humana (tanto integrados como no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que pueden expresar anticuerpos completamente humanos. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgén de la cadena ligera humana y tanto un transgén de la cadena pesada humana como un transcromosoma de la cadena pesada humana, de forma que el ratón produce anticuerpos humanos anti-IL-8 cuando se inmuniza con antígeno de IL-8 y/o células que expresan IL
8. El transgén de la cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso para ratones transgénicos, por ejemplo, HuMAb, o el transgén de la cadena pesada humana puede mantenerse extracromosómicamente, como es el caso para ratones transcromosómicos (por ejemplo, KM) como se describen en el documento WO 02/43478. Tales ratones transgénicos y transcromosómicos pueden producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para IL-8 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) sometiéndose a recombinación de V-D-J y cambio de isotipo. Los animales no humanos transgénicos también pueden usarse para la producción de un anticuerpo anti-IL-8 específico introduciendo genes que codifican tal anticuerpo anti-IL-8 específico, por ejemplo, ligando operativamente los genes a un gen que se expresa en la leche del animal.
En las siguientes subsecciones se describen en más detalle diversos aspectos de la invención.
I. Producción de anticuerpos humanos para IL-8
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden producirse mediante una variedad de técnicas que incluyen metodología de anticuerpos monoclonales convencional, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas convencional de Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpo monoclonal, por ejemplo, transformación vírica u oncogénica de linfocitos B.
El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy establecido. En la técnica se conocen protocolos de inmunización y las técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión. También se conocen componentes de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión.
En una realización preferida, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra IL-8 pueden generarse usando ratones transgénicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en vez del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos, denominados en este documento ratones “HuMAb”, contienen un miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de la cadena pesada (μ y y) y ligera K humana sin reordenar junto con mutaciones elegidas como diana que inactivan los loci endógenos de la cadena 1 y K (Lonberg, y col. (1994) Nature 368(6474):856-859). Por consiguiente, los ratones presentan expresión reducida de IgM de ratón o cadena ligera K y, en respuesta a inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humana introducidos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgGK humanos de alta afinidad (Lonberg, N. y col. (1994), arriba; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. vol. 13:65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación de ratones HuMAb se describe en detalle en la Sección II más adelante y en Taylor, L. y col. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. y col. (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi y col. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. y col. (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon y col. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg, N. y col., (1994) Nature 368(6474):856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. y col. (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93; Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild, D. y col. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Véanse además las patentes de EE.UU. nº 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas a Lonberg, N. y Kay, R. M. y GenPharm International; patente de EE.UU. nº 5.545.807 a Surani y col.; publicaciones internacionales nº WO 98/24884 publicada el 11 de junio de 1998; WO 94/25585 publicada el 10 de noviembre de 1994; WO 93/1227 publicada el 24 de junio de 1993; WO 92/22645 publicada el 23 de diciembre de 1992; y WO 92/03918 publicada el 19 de marzo de 1992. Los ratones HuMAb preferidos tienen una alteración de JKD en sus genes endógenos de la cadena ligera (kappa) (como se describe en Chen y col. (1993) EMBO J. 12: 821-830), una alteración de CMD en sus genes endógenos de la cadena pesada (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424 por Korman y col.), un transgén de la cadena ligera kappa humana KCo5 (como se describe en Fishwild y col. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) y un transgén de la cadena pesada humana HCo7 (como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.770.429 por Lonberg, N. y Kay, R.M.) y/o un transgén de la cadena pesada humana HCo12 (como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/14424 por Korman y col.).
Alternativamente, los ratones que llevan genes de inmunoglobulina humana sobre un fragmento transcromosómico pueden usarse para generar anticuerpos anti-IL-8. La preparación de tales ratones transcromosómicos se describe en el documento WO 97/07671 por Tomizuka y col. Un ratón preferido es uno en el que ciertos genes de inmunoglobulina humana son llevados sobre un transgén y otros son llevados sobre un transcromosoma, tal como un ratón que lleva un transgén de la cadena ligera humana (por ejemplo, el transgén de la cadena kappa KCo5) y un transcromosoma de la cadena pesada humana (por ejemplo, el transcromosoma SC20) como se describe en detalle en el documento WO 02/43478 por Ishida y col.
Inmunizaciones de HuMAb
Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para IL-8, ratones HuMAb pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de antígeno de IL-8 y/o células que producen IL-8 y/o IL-8 recombinante, como se describe por Lonberg, N. y col. (1994) Nature 368(6474):856-859; Fishwild, D. y col. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851 y el documento WO 98/24884. Preferentemente, los ratones tendrán 6-16 semanas de edad tras la primera infusión. Por ejemplo, la IL-8 recombinante puede usarse para inmunizar los ratones HuMAb intraperitonealmente.
La experiencia acumulada con diversos antígenos ha mostrado que los ratones transgénicos HuMAb responden mejor cuando se inmunizan inicialmente intraperitonealmente (IP) con antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido de inmunizaciones i.p. cada dos semanas (hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. La respuesta inmunitaria puede monitorizarse durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma que se obtienen por sangrados retroorbitales. El plasma puede cribarse por ELISA (como se describe más adelante), y los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana dirigida contra IL-8 pueden usarse para fusiones. Los ratones pueden reforzarse intravenosamente con antígeno 3 días antes del sacrificio y extirpación del bazo. Se espera que puedan necesitar realizarse 2-3 fusiones para cada antígeno. Varios ratones se inmunizarán para cada antígeno. Por ejemplo, pueden inmunizarse un total de doce ratones HuMAb de las cepas HCo7 y HCo12.
Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos para IL-8
Los esplenocitos de ratón pueden aislarse y fusionarse con PEG dando una línea de células de mieloma de ratón basándose en los protocolos convencionales. Entonces, los hibridomas resultantes se criban para la producción de anticuerpos específicos para antígeno. Por ejemplo, suspensiones de una sola célula de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se fusionan a un sexto del número de células de mieloma de ratón no secretoras de P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50% de PEG. Las células se siembran a aproximadamente 2 x 105 en placas de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene 20% de suero de clon fetal, 18% de medio acondicionado “653”, 5% de Origen (IGEN), L-glutamina 4 mM, L-glutamina 1 mM, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1X HAT (Sigma; el HAT se añade 24 horas después de la fusión). Después de dos semanas, las células se cultivan en medio en el que el HAT se reemplaza por HT. Entonces, los pocillos individuales se criban por ELISA para anticuerpos monoclonales IgM y IgG humanas dirigidas contra IL-8. Una vez se produce el extenso crecimiento de hibridomas, el medio se observa normalmente después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpo se vuelven a sembrar en placa, se criban de nuevo y, si todavía son positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales anti-IL-8 pueden subclonarse al menos dos veces por dilución limitante. Entonces, los subclones estables se cultivan in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para la caracterización.
Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales humanos para IL-8
Los anticuerpos humanos de la invención también pueden producirse en un transfectoma de célula huésped usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y procedimientos de transfección de genes como es muy conocido en la técnica (Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
Por ejemplo, para expresar los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de los mismos, los ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o completa pueden obtenerse por técnicas de biología molecular convencionales (por ejemplo, amplificación por PCR, mutagénesis dirigida a sitio) y pueden insertarse en vectores de expresión de forma que los genes estén operativamente ligados a secuencias de control de la transcripción y de la traducción. En este contexto, el término “operativamente ligado” pretende significar que un gen de anticuerpo está ligado en un vector de forma que las secuencias de control de la transcripción y de la traducción dentro del vector desempeñan su función prevista de regular la transcripción y la traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para ser compatibles con la expresión de la célula huésped usada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, más normalmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios sobre el fragmento del gen del anticuerpo y vector, o ligación de extremos romos si no están presentes sitios de restricción). Las regiones variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en este documento pueden usarse para crear genes de anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolos en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de la cadena pesada y constantes de la cadena ligera del isotipo deseado de forma que el segmento VH esté operativamente ligado a el (los) segmento(s) CH dentro del vector y el segmento VL esté operativamente ligado al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena del anticuerpo de una célula huésped. El gen de la cadena del anticuerpo puede clonarse en el vector de forma que el péptido señal esté ligado en marco con el extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina
o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de un proteína de no inmunoglobulina).
Además de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en una célula huésped. El término “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de la cadena del anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Se apreciará por aquellos expertos en la materia que el diseño del vector de expresión, que incluye la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Secuencias reguladoras preferidas para la expresión de células huésped de mamífero incluyen elementos víricos que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero tales como promotores y/o potenciadores derivados del citomegalovirus (CMV), virus simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal del adenovirus (AdMLP)) y polioma. Alternativamente pueden usarse secuencias reguladoras no víricas tales como el promotor de la ubicuitina o el promotor de �-globina.
Además de los genes de la cadena del anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden llevar secuencias adicionales tales como las secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes de marcadores de selección. El gen del marcador de selección facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas por Axel y col.). Por ejemplo, normalmente el gen del marcador de selección confiere resistencia a fármacos tales como G418, higromicina o metotrexato sobre una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Genes de marcadores de selección preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células huésped dhfr con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para selección con G418).
Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, el (los) vector(es) de expresión que codifica(n) las cadenas pesadas y ligeras se transfectan en una célula huésped por técnicas convencionales. Las diversas formas del término “transfección” pretenden englobar una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en tanto células huésped procariotas como eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y lo más preferentemente células huésped de mamífero, es la más preferida debido a que es más probable que tales células eucariotas, y en particular células de mamífero, se ensamblen que las células procariotas y secretan un anticuerpo adecuadamente plegado e inmunológicamente activo.
Células huésped de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células CHO (incluyendo células dhfr-CHO descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:42164220, usadas con un marcador de selección de DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NS/O, células COS, células HEK293 y células SP2.0. En particular para su uso con células de mieloma NS/0, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión génico GS (glutamina sintetasa) desvelado en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338 841. Si los vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos se introducen en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferentemente, secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando procedimientos de purificación de proteínas convencionales.
Otros medios recombinantes para producir anticuerpos monoclonales humanos para IL-8
Alternativamente, los genes de anticuerpos clonados pueden expresarse en otros sistemas de expresión que incluyen células procariotas tales como microorganismos, por ejemplo, E. coli para la producción de anticuerpos scFv, algas, además de células de insecto. Además, los anticuerpos pueden producirse en animales no humanos transgénicos tales como en leche de oveja y conejos o huevos de gallinas, o en plantas transgénicas. Véase, por ejemplo, Verma, R., y col. (1998). Antibody engineering: Comparison of bacterial, yeast, insect and mammalian expression systems. J. Immunol. Meth. 216:165-181; Pollock, y col. (1999). Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies. J. Immunol. Meth. 231:147-157; y Fischer, R, y col. (1999). Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biol.Chem. 380:825-839.
Uso de secuencias de anticuerpos parciales para expresar anticuerpos intactos
Los anticuerpos interactúan con antígenos diana predominantemente por residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada y ligera. Por este motivo, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más variadas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos específicos que se producen naturalmente construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo específico que se produce naturalmente injertado sobre las secuencias de la región estructural de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (véase, por ejemplo, Riechmann, L. y col., 1998, Nature 332:323-327; Jones, pág. y col., 1986, Nature 321:522-525; y Queen, C. y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 86:10029-10033). Tales secuencias de la región estructural pueden obtenerse a partir de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Estas secuencias de la línea germinal se diferenciarán de secuencias de genes de anticuerpos maduras en que no incluyen genes variables completamente ensamblados que se forman uniendo V(D)J durante la maduración de linfocitos B. Las secuencias de genes de la línea germinal también se diferenciarán de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad que contiene mutaciones por todo el gen variable, pero normalmente agrupados en las CDR. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente poco frecuentes en la porción del extremo amino de la región estructural 1 y en la porción del extremo carboxi de la región estructural 4. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran significativamente las propiedades de unión del anticuerpo. Por este motivo, no es necesario obtener toda la secuencia de ADN de un anticuerpo particular con el fin de recrear un anticuerpo intacto recombinante que tiene propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (véase el documento WO 99/45962). La secuencia parcial de cadena pesada y ligera que extiende las regiones CDR es normalmente suficiente para este fin. La secuencia parcial se usa para determinar qué segmentos variables de la línea germinal y de genes de unión contribuyeron a los genes variables de anticuerpos recombinados. Entonces, la secuencia de la línea germinal se usa para llenar porciones que faltan de las regiones variables. Las secuencias conductoras de la cadena pesada y ligera se escinden durante la maduración de proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para añadir las secuencias que faltan, las secuencias de ADNc clonadas pueden combinarse con oligonucleótidos sintéticos por ligación o amplificación por PCR. Alternativamente, toda la región variable puede sintetizarse como un conjunto de oligonucleótidos solapantes cortos y combinarse por amplificación por PCR para crear un clon de la región variable completamente sintética. Este procedimiento tiene ciertas ventajas tales como eliminación o inclusión de sitios de restricción particular, u optimización de codones particulares.
Las secuencias de nucleótidos de transcritos de la cadena pesada y ligera de un hibridoma se usan para diseñar un conjunto solapante de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades de codificación de aminoácidos idénticas a las de las secuencias naturales. Las secuencias de cadenas pesadas y kappa sintéticas pueden diferenciarse de las secuencias naturales de tres formas: series de bases de nucleótidos repetidas se interrumpen para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación por PCR; sitios de iniciación de la traducción óptimos se incorporan según las reglas de Kozak (Kozak (1991) J. Biol. Chem. 266:19867-19870); y sitios HindIII se manipulan por ingeniería en la dirección 5' de los sitios de iniciación de la traducción.
Para tanto, las regiones variables de la cadena pesada como ligera, las secuencias de hebra codificante optimizada, y no codificante correspondiente, se descomponen en 30 - 50 nucleótidos aproximadamente en el punto medio del oligonucleótido no codificante correspondiente. Por tanto, para cada cadena, los oligonucleótidos pueden ensamblarse en conjuntos bicatenarios solapantes que extienden segmentos de 150 - 400 nucleótidos. Entonces, los conjuntos se usan como moldes para producir productos de amplificación por PCR de 150-400 nucleótidos. Normalmente, un conjunto de oligonucleótidos de una única región variable se descompondrá en dos conjuntos que se amplificarán por separado para generar dos productos de PCR solapantes. Entonces, estos productos solapantes se combinan por amplificación por PCR para formar la región variable completa. También puede desearse incluir un fragmento solapante de la región constante de la cadena pesada o ligera (incluyendo el sitio BbsI de la cadena ligera kappa, o el sitio AgeI de la cadena pesada gamma) en la amplificación por PCR para generar fragmentos que pueden clonarse fácilmente en las construcciones de vectores de expresión.
Entonces, las regiones variables de la cadena pesada y ligera reconstruidas se combinan con promotor clonado, secuencia conductora, iniciación de la traducción, región constante, sin traducir en 3', poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción para formar construcciones de vectores de expresión. Las construcciones de expresión de cadenas pesadas y ligeras pueden combinarse en un único vector, cotransfectarse, transfectarse seriadamente o transfectarse por separado en células huésped que luego se fusionan para formar una célula huésped que expresa ambas cadenas.
Los plásmidos para su uso en la construcción de vectores de expresión para IgGK humana se describen más adelante. Los plásmidos se construyeron de manera que las secuencias del ADNc de la cadena pesada V y ligera kappa de V amplificadas por PCR pudieran usarse para la reconstrucción de minigenes de la cadena pesada y ligera completa. Estos plásmidos pueden usarse para expresar anticuerpos IgG1,K o IgG4,K completamente humanos. Pueden construirse plásmidos similares para la expresión de otros isotipos de la cadena pesada, o para la expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda.
Por tanto, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo humano anti-IL-8 de la invención, por ejemplo, 10F8, se usan para crear anticuerpos humanos anti-IL-8 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como la unión a IL-8. Más específicamente, las seis CDR de 10F8 pueden combinarse recombinantemente con regiones estructurales humanas conocidas y CDR para crear anticuerpos humanos anti-IL-8 recombinantemente manipulados adicionales de la invención.
Por consiguiente, en otra realización, la invención proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo anti-IL8 que comprende:
Preparar un anticuerpo que comprende (1) regiones estructurales de la cadena pesada humana y CDR de la cadena pesada humana, en el que las CDR de la cadena pesada humana comprenden las secuencias de aminoácidos de las CDR mostradas en la Figura 5 (SEC ID Nº: 22, 23 ó 24); y (2) regiones estructurales de la cadena ligera humana y CDR de la cadena ligera humana, en el que las CDR de la cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de las CDR mostradas en la Figura 3 (SEC ID Nº: 16, 17 ó 18); en el que el anticuerpo retiene la capacidad para unirse a IL-8.
La capacidad del anticuerpo para unirse a IL-8 puede determinarse usando ensayos de unión convencionales tales como aquellos expuestos en los ejemplos (por ejemplo, un ELISA).
También se refiere a anticuerpos anti-IL-8 que comprenden una región variable de la cadena pesada y/o una región variable de la cadena ligera que es homóloga a o derivada de su secuencia de la región variable de la línea germinal correspondiente, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la línea germinal de VK A-27 mostrada en las Figuras 2 y 3 (SEC ID Nº: 5 y 7, respectivamente) y/o las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la línea germinal de VH 3-33 mostradas en las Figuras 4 y 5 (SEC ID Nº: 9 y 11, respectivamente), y que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como la unión a IL-8.
Otros anticuerpos particulares se unen a IL-8 humana y comprenden una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos aproximadamente el 94%, preferentemente aproximadamente el 96%, más preferentemente idéntica aproximadamente el 97%, 98% o el 99% a la secuencia de aminoácidos de la línea germinal mostrada en la Figura 3 (SBQ ID NO:7) y/o una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos aproximadamente el 92%, preferentemente aproximadamente el 94%, más preferentemente idéntica aproximadamente el 96%, 97%, 98% o el 99% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 5 (SEC ID Nº:11). Alternativamente, los anticuerpos pueden comprender una región variable de la cadena ligera codificada por una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos aproximadamente el 94%, preferentemente aproximadamente el 96%, más preferentemente idéntica aproximadamente el 97%, 98% o el 99% a la secuencia de nucleótidos de la línea germinal mostrada en la Figura 2 (SEC ID Nº:5) y/o una región variable de la cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos aproximadamente el 92%, preferentemente aproximadamente el 94%, más preferentemente idéntica aproximadamente el 96%, 97%, 98% o el 99%, a la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 4 (SEC ID Nº:9).
También se refiere a anticuerpos humanos que se unen a IL-8 humana y comprenden una región variable de la cadena ligera derivada de la secuencia de aminoácidos de la línea germinal de VK A-27 como se muestra en la Figura 3 (SEC ID Nº:7) y tienen una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste en una isoleucina en la posición 29, un residuo de prolina en la posición 52, un residuo de alanina en la posición 93, un residuo de glicina en la posición 94, un residuo de leucina en la posición 96, un residuo de prolina en la posición 100, un ácido aspártico en la posición 105, como se muestra en la Figura 3, y cualquier combinación de los mismos. Alternativamente o además, los anticuerpos pueden comprender una región variable de la cadena pesada derivada de la secuencia de aminoácidos de la línea germinal de VH 3-33 como se muestra en la Figura 5 (SEC ID Nº:11) y tienen una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste en una glutamina en la posición 3, un residuo de histidina en la posición 31, un residuo de tirosina en la posición 35, un residuo de isoleucina en la posición 51, un residuo de tirosina en la posición 57, un residuo de asparagina en la posición 60, un residuo de alanina en la posición 61, un residuo de isoleucina en la posición 70, un residuo de asparagina en la posición 74, un residuo de glutamina en la posición 82, un residuo de arginina en la posición 100, un residuo de leucina en la posición 103, como se muestra en la Figura 5, y cualquier combinación de los mismos.
También se refiere a anticuerpos humanos anti-IL-8 que comprenden un dominio de CDR que tiene una región CDR1 de la cadena pesada y ligera humana, una región CDR2 de la cadena pesada y ligera humana y una región CDR3 de la cadena pesada y ligera humana, en los que las regiones de la cadena pesada de CDR1, CDR2 y CDR3 se derivan de las secuencia de aminoácidos de la línea germinal de VH 3-33 como se muestra en la Figura 5 (SEC ID Nº:11) o en los que las regiones de la cadena ligera de CDR1, CDR2 y CDR3 se derivan de la secuencia de aminoácidos de la línea germinal de VK A-27 como se muestra en la Figura 3 (SEC ID Nº:7), y en los que
(a)
la región de la cadena pesada humana CDR1 comprende un residuo de histidina y de tirosina en las posiciones 1 y 5, respectivamente, como se muestra en la Figura 5 (SEC ID Nº:22);
(b)
la región de la cadena pesada humana CDR2 comprende un residuo de isoleucina, tirosina, asparagina y alanina en las posiciones 2, 8,11 y 12, respectivamente, como se muestra en la Figura 5 (SEC ID Nº:23);
(c)
la región de la cadena pesada humana CDR3 comprende un residuo de arginina y leucina en las posiciones 2 y 5, respectivamente, como se muestra en la Figura 5 (SEC ID Nº:24);
(d)
la región de la cadena ligera humana CDR1 comprende un residuo de isoleucina en la posición 6, como se muestra en la Figura 3 (SEC ID Nº:16);
(e)
la región de la cadena ligera humana CDR2 comprende un residuo de prolina en la posición 2, como se muestra en la Figura 3 (SEC ID Nº:17);
(f)
la región de la cadena ligera humana CDR3 comprende un residuo de tirosina, alanina, glicina y leucina en las posiciones 3, 4, 5 y 6, respectivamente, como se muestra en la Figura 3 (SEC ID Nº:18); y
(g)
cualquier combinación de (a), (b), (c), (d), (e) o (f).
También se refiere a anticuerpos humanos que pueden comprender la región CDR1 de la cadena pesada y ligera humana, una región CDR2 de la cadena pesada y ligera humana y una región CDR3 de la cadena pesada y ligera humana en los que las regiones de la cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 se derivan de la secuencia de aminoácidos de la línea germinal de VH 3-33 como se muestra en la Figura 5 (SEC ID Nº:11) y/o en los que las regiones de la cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 se derivan de la secuencia de aminoácidos de la línea germinal de VK A-27 como se muestra en la Figura 3 (SEC ID Nº:7), y en los que al menos uno de los dominios de CDR se selecciona del grupo que consiste en:
(a)
una región CDR1 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 92% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3 (SEC ID Nº:16);
(b)
una región CDR2 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 86% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3 (SEC ID Nº:17);
(c)
una región CDR3 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 43% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 3 (SEC ID Nº:18);
(d)
una región CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 61% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 5 (SEC ID Nº:22);
(e)
una región CDR2 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 77% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 5 (SEC ID Nº:23); y
(f)
una región CDR3 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos el 76% a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 5 (SEC ID Nº:24); y
(g)
cualquier combinación de (a), (b), (c), (d), (e) o (f).
Al menos uno de los dominios de CDR de los anticuerpos humanos comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a)
la secuencia de aminoácidos de la región CDR1 de la cadena ligera comprende un residuo de isoleucina en la posición 6, como se muestra en la Figura 3 (SEC ID Nº:16);
(b)
la secuencia de aminoácidos de la región CDR2 de la cadena ligera comprende un residuo de prolina en la posición 2, como se muestra en la Figura 3 (SEC ID Nº:17);
(c)
la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 de la cadena ligera comprende un residuo de tirosina en la posición 3, un residuo de alanina en la posición 4, un residuo de glicina en la posición 5 y un residuo de leucina en la posición 7, como se muestra en la Figura 3 (SEC ID Nº:18);
(d)
la secuencia de aminoácidos de la región CDR1 de la cadena pesada comprende un residuo de histidina en la posición 1 y un residuo de tirosina en la posición 5, como se muestra en la Figura 5 (SEC ID Nº:22);
(e)
la secuencia de aminoácidos de la región CDR2 de la cadena pesada comprende un residuo de isoleucina en la posición 2, un residuo de tirosina en la posición 8, un residuo de asparagina en la posición 11 y un residuo de alanina en la posición 12, como se muestra en la Figura 5 (SEC ID Nº:23);
(f)
la secuencia de aminoácidos de la región CDR3 de la cadena pesada comprende un residuo de arginina en la posición 2 y un residuo de leucina en la posición 5, como se muestra Figura 5 (SEC ID Nº:24); y
(g)
cualquier combinación de (a), (b), (c), (d), (e) o (f).
También se refiere a un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a IL-8 humana que comprende un dominio de VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos:
Gln-Gln-Tyr-X1-X2-Ser-X3-Thr
en la que X1, X2 y X3 representan cada uno un residuo de aminoácido natural y X1 es diferente de Gly, o X2 es diferente de Ser, o X3 es diferente de Pro.
En un ejemplo, X1 es diferente de Gly, X2 es diferente de Ser y X3 es diferente de Pro.
En otro ejemplo, X1 es Ala, y X2 y X3 son independientemente Gly, Ala, Val, Leu o Ile.
También se refiere a un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a IL-8 humana que comprende un dominio de VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos:
Asp-X4-Val-Gly-X5-Phe-Asp-Tyr,
en la que X4 es Lys, Arg o His, y X5 es Gly, Ala, Val, Leu o Ile.
También se refiere a un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a IL-8 humana que comprende un dominio de VL CDR3 como se desvela anteriormente y un dominio de VH CDR3 como se desvela en las realizaciones anteriores.
Además, o alternativamente, para simplemente unir IL-8, anticuerpos tales como aquellos descritos anteriormente pueden seleccionarse para su retención de otras propiedades funcionales tales como:
(1)
unión a IL-8 humana e inhibición de efectos proinflamatorios inducidos por IL-8;
(2)
inhibición de la unión de IL-8 a sus receptores sobre neutrófilos;
(3)
inhibición de la actividad quimiotáctica inducida por IL-8 para neutrófilos;
(4)
inhibición del flujo de calcio inducido por IL-8;
(5)
inhibición de los cambios inducidos por IL-8 en los niveles de expresión de moléculas de adhesión sobre neutrófilos;
(6)
unión a IL-8 humana e inhibición del aumento de la expresión inducida por IL-8 de CD11b (Mac-1) y expresión disminuida de L-selectina sobre neutrófilos;
(7)
reacción no cruzada con quimiocinas relacionadas tales como GRO-a humana, GRO-� humana, IP-10 humana y NAP-2 humana;
(8)
unión a IL-8 humana con una constante de equilibrio de disociación (KD) de aproximadamente 10-8 M o menos, tal como 10-9 M o menos, 10-10 M o menos, o 10-11 M o incluso menos; y/o
(9)
inhibición significativa de la quimiotaxia inducida por líquidos biológicos que contienen múltiples factores quimiotácticos que incluyen IL-8.
Caracterización de la unión de anticuerpos monoclonales humanos para IL-8
Para caracterizar la unión de anticuerpos monoclonales humanos para IL-8 de la invención, pueden probarse sueros de ratones inmunizados, por ejemplo, por ELISA. En un ejemplo típico (pero no limitante) de un protocolo de ELISA, placas de microtitulación se recubren con IL-8 purificada a 025 μg/ml en PBS, y luego se bloquean con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. Las diluciones de plasma de ratones inmunizados con IL-8 se añaden a cada pocillo y se incuban durante 1-2 horas a 37ºC. Las placas se lavan con PBS/Tween y luego se incuban con un reactivo policlonal específico para Fc de cabra dirigido contra IgG humana conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37ºC. Después de lavar, las placas se revelan con sustrato pNPP (1 mg/ml) y se analizan a DO de 405-650. Preferentemente, los ratones que revelaron los mayores títulos se usarán para las fusiones.
También puede usarse un ensayo de ELISA como se ha descrito anteriormente para cribar hibridomas que muestran reactividad positiva con el inmunogén de IL-8. Los hibridomas que se unen con alta avidez a IL-8 se subclonarán y se caracterizarán adicionalmente. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células parentales (por ELISA), puede elegirse para hacer un banco de células de 5-10 viales guardados a -140ºC, y para la purificación de anticuerpo.
Para purificar anticuerpos humanos anti-IL-8, hibridomas seleccionados pueden cultivarse en matraces con agitación centrífuga de dos litros para la purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). La IgG eluida puede comprobarse por electroforesis en gel y cromatografía líquida de alta resolución para garantizar la pureza. La disolución de tampón puede cambiarse a PBS, y la concentración puede determinarse por DO280 usando el coeficiente de extinción 1,43. Pueden tomarse alícuotas de los anticuerpos monoclonales y guardarse a -80°C.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales humanos anti-IL-8 seleccionados se unen a epítopes únicos puede usarse mutagénesis dirigida a sitio o dirigida a multisitio.
Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados pueden realizarse ELISA de isotipo. Por ejemplo, los pocillos de placas de microtitulación pueden recubrirse con 10 μg/ml de Ig anti-humana durante la noche a 4ºC. Después de bloquearse con 5% de BSA, las placas se hacen reaccionar con 10 μg/ml de anticuerpos monoclonales o controles de isotipo purificados a temperatura ambiente durante dos horas. Entonces, los pocillos pueden hacerse reaccionar con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específica tanto para IgG1 humana como para IgM humana. Las placas se revelan y se analizan como se ha descrito anteriormente.
Las IgG humanas anti-IL-8 pueden probarse para reactividad con antígeno de IL-8 por transferencia Western. Por ejemplo, pueden prepararse extractos de células de células que producen IL-8 y someterse a electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio (SDS)-poliacrilamida. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transferirán a membranas de nitrocelulosa, bloqueadas con 20% de suero de ratón, y se sondarán con los anticuerpos monoclonales que van a probarse. La unión a IgG humana puede detectarse usando fosfatasa alcalina anti-IgG humana y revelarse con comprimidos del sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
II. Producción de animales no humanos transgénicos que generan anticuerpos anti-IL-8 monoclonales humanos
En otro aspecto más, la invención proporciona animales no humanos transgénicos y transcromosómicos tales como ratones transgénicos o transcromosómicos que pueden expresar los anticuerpos humanos de la invención que se unen específicamente a IL-8. En una realización particular, la invención proporciona un ratón transgénico o transcromosómico que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana, de forma que el ratón produce anticuerpos humanos anti-IL-8 de la invención cuando se inmuniza con células que producen IL-8. El transgén de la cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso para ratones transgénicos, por ejemplo, HuMAb, como se describe en detalle en este documento y se ejemplifica. Alternativamente, el transgén de la cadena pesada humana puede mantenerse extracromosómicamente, como es el caso para ratones transcromosómicos (por ejemplo, KM). Más particularmente, en la cepa de ratón KM, el gen de la cadena ligera kappa de ratón endógeno se ha alterado homocigóticamente como se describe en Chen y col. (1993) EMBO J. 12:811-820 y el gen de la cadena pesada de ratón endógeno se ha alterado homocigóticamente como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/09187. Esta cepa de ratón lleva un transgén de la cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild y col. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Esta cepa de ratón también lleva un transcromosoma de la cadena pesada humana compuesto por el fragmento hCF del cromosoma 14 (SC20) como se describe en el documento WO 02/43478.
Tales animales transgénicos y transcromosómicos pueden producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para IL-8 (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) sometiendo a recombinación de V-D-J/V-J y cambio de isotipo.
El diseño de un animal no humano transgénico o transcromosómico que responde a la estimulación de antígenos extraños con un repertorio de anticuerpos heterólogos requiere que los transgenes de la inmunoglobulina heteróloga contenidos dentro del animal transgénico funcionen correctamente durante la ruta del desarrollo de linfocitos B. Esto incluye, por ejemplo, cambio de isotipo del transgén de la cadena pesada heteróloga. Por consiguiente, los transgenes se construyen de forma que pueda inducirse el cambio de isotipo y una o más de las siguientes características de genes de anticuerpos: (1) expresión de alto nivel y específica del tipo de célula, (2) reordenamiento de genes funcionales, (3) activación de y respuesta a exclusión alélica, (4) expresión de un repertorio primario suficiente, (5) transducción de señales, (6) hipermutación somática y (7) dominación del locus del anticuerpo del transgén durante la respuesta inmunitaria.
No necesitan cumplirse todos los criterios anteriores. Por ejemplo, en aquellas realizaciones en las que los loci de la inmunoglobulina endógena del animal transgénico están funcionalmente alterados, el transgén necesita activar la exclusión alélica. Además, en aquellas realizaciones en las que el transgén comprende un gen de la inmunoglobulina de la cadena pesada y/o ligera funcionalmente reordenado, el segundo criterio de reordenamiento de genes funcionales es innecesario, al menos para ese transgén que ya se ha reordenado. Para información previa sobre la inmunología molecular véase Fundamental Immunology, 2ª edición (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.
En ciertas realizaciones, los animales no humanos transgénicos o transcromosómicos usados para generar los anticuerpos monoclonales humanos de la invención contienen transgenes de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina heterólogos reordenados, sin reordenar o una combinación de reordenados y sin reordenar en la línea germinal del animal transgénico. Cada uno de los transgenes de la cadena pesada comprende al menos un gen CH. Además, el transgén de la cadena pesada puede contener secuencias de cambio de isotipo funcional que pueden soportar el cambio de isotipo de un transgén heterólogo que codifica múltiples genes CH en los linfocitos B del animal transgénico. Tales secuencias de cambio pueden ser aquellas que se producen naturalmente en el locus de la inmunoglobulina de la línea germinal a partir de especies que sirven de fuente de genes CH del transgén, o tales secuencias de cambio pueden derivarse de aquellas que se producen en la especie que va a recibir la construcción de transgén (el animal transgénico). Por ejemplo, una construcción de transgén humana que se usa para producir un ratón transgénico puede producir una mayor frecuencia de acontecimientos de cambio de isotipo si incorpora secuencias de cambio similares a aquellas que se producen naturalmente en el locus de la cadena pesada de ratón, ya que supuestamente las secuencias de cambio del ratón se optimizan para funcionar con el sistema de enzima recombinasa de cambio de ratón, pero no las secuencias de cambio humanas. Las secuencias de cambio pueden aislarse y clonarse por procedimientos de clonación convencionales, o pueden sintetizarse de novo a partir de oligonucleótidos sintéticos solapantes diseñados basándose en la información de secuencias publicadas referente a las secuencias de la región de cambio de inmunoglobulina (Mills y col., Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras y col., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989)). Para cada uno de los anteriores animales transgénicos, los transgenes de la inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera heterólogos funcionalmente reordenados se encuentran en una fracción significativa de los linfocitos B del animal transgénico (al menos el 10%).
Los transgenes usados para generar los animales no humanos transgénicos de la invención incluyen un transgén de la cadena pesada que comprende ADN que codifica al menos un segmento del gen variable, un segmento del gen de diversidad, un segmento del gen de unión y al menos un segmento del gen de la región constante. El transgén de la cadena ligera de la inmunoglobulina comprende ADN que codifica al menos un segmento del gen variable, un segmento del gen de unión y al menos un segmento del gen de la región constante. Lo segmentos de genes que codifican los segmentos del gen de la cadena ligera y pesada son heterólogos al animal transgénico ya que se derivan de, o se corresponden con, ADN que codifica segmentos del gen de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina de una especie que no consiste en el animal no humano transgénico. En un aspecto de la invención, el transgén se construye de forma que los segmentos de genes individuales están sin reordenar, es decir, no reordenados para codificar una cadena ligera o pesada de la inmunoglobulina funcional. Tales transgenes sin reordenar soportan la recombinación de los segmentos de los genes V, D y J (reordenamiento funcional) y preferentemente soportan la incorporación de todos o una parte de un segmento del gen de la región D en la cadena pesada de la inmunoglobulina reordenada resultante dentro del animal transgénico cuando se expone a antígeno de IL-8.
En una realización alternativa, los transgenes comprenden un “mini-locus” sin reordenar. Tales transgenes comprenden normalmente una porción sustancial de los segmentos C, D y J, además de un subconjunto de los segmentos del gen V. En tales construcciones de transgén, las diversas secuencias reguladoras, por ejemplo, promotor, potenciadores, regiones de cambio de clase, secuencias de corte y empalme-donante y de corte y empalme-aceptor para el procesamiento de ARN, señales de recombinación y similares comprenden secuencias correspondientes derivadas del ADN heterólogo. Tales secuencias reguladoras pueden incorporarse en el transgén de la misma especie o de una especie relacionada del animal no humano usado en la invención. Por ejemplo, los segmentos de genes de la inmunoglobulina humana pueden combinarse en un transgén con una secuencia de potenciador de la inmunoglobulina de roedor para su uso en un ratón transgénico. Alternativamente, las secuencias reguladoras sintéticas pueden incorporarse en el transgén, en el que tales secuencias reguladoras sintéticas no son homólogas a una secuencia de ADN funcional que se sabe que se produce naturalmente en los genomas de mamíferos. Las secuencias reguladoras sintéticas se diseñan según reglas consenso tales como, por ejemplo, aquellas que especifican las secuencias permisibles de un sitio de corte y empalme-aceptor o un motivo de promotor/potenciador. Por ejemplo, un minilocus comprende una parte del locus de la inmunoglobulina genómica que tiene al menos una deleción interna (es decir, no en un extremo de la porción) de una porción de ADN no esencial (por ejemplo, secuencia interviniente; intrón o porción del mismo) en comparación con el locus de Ig de la línea germinal que se produce naturalmente.
Los animales no humanos transgénicos y transcromosómicos preferidos, por ejemplo, ratones, presentarán producción de inmunoglobulina con un repertorio significativo, idealmente sustancialmente similar al de un ser humano después de ajustar el volumen.
El repertorio se aproximará idealmente al mostrado en un ser humano cuando se ajusta el volumen, normalmente con una diversidad de al menos aproximadamente el 10% como mucho, preferentemente del 25 al 50% o más. Generalmente, al menos se producirán aproximadamente un millar de inmunoglobulinas diferentes (idealmente IgG), preferentemente 104 a 106 o más, dependiendo del número de regiones V, J y D diferentes introducidas en el genoma del ratón y accionadas por la diversidad adicional generada por los reordenamientos del gen V(-D-)J y adiciones de nucleótidos al azar en las regiones de unión. Normalmente, las inmunoglobulinas presentarán una afinidad (KD) para antígenos preseleccionados de aproximadamente 10-10 M o incluso inferior.
Los animales no humanos transgénicos y transcromosómicos, por ejemplo, ratones, como se ha descrito anteriormente, pueden inmunizarse con, por ejemplo, células que producen IL-8. Alternativamente, los animales transgénicos pueden inmunizarse con ADN que codifica IL-8 humana. Entonces, los animales producirán linfocitos B que experimentan cambio de clase mediante recombinación en el cambio (cambio cis) y expresan inmunoglobulinas reactivas con IL-8. Las inmunoglobulinas serán anticuerpos humanos (también denominados en lo sucesivo “anticuerpos de la secuencia humana”) en los que los polipéptidos de la cadena pesada y ligera están codificados por secuencias del transgén humano que pueden incluir secuencias derivadas por mutación somática y uniones recombinatorias de la región V, además de secuencias codificadas por la línea germinal; estos anticuerpos humanos pueden denominarse en lo sucesivo sustancialmente idénticos a una secuencia de polipéptidos codificada por VL y JL o VH humana. Los segmentos de los genes DH y JH, incluso otras secuencias no de la línea germinal, pueden estar presentes como resultado de mutación somática y uniones de recombinación de V-J y V-D-J diferenciales. Las regiones variables de cada cadena de anticuerpo son normalmente al menos el 80% similares a los segmentos de genes V y J de la línea germinal humana y, en el caso de cadenas pesadas, segmentos de genes V, D y J de la línea germinal humana; frecuentemente al menos el 85% similar a secuencias de la línea germinal humana presentes en el transgén; frecuentemente el 90 o el 95% o más similares a las secuencias de la línea germinal humana presentes en el transgén. Sin embargo, ya que las secuencias no de la línea germinal se introducen por mutación somática y la unión de VJ y VDJ, los anticuerpos de la secuencia humana tendrán frecuentemente algunas secuencias de la región variable que no están codificadas por segmentos de los genes V, D o J humanos como se encuentra en el (los) transgén (transgenes) humano(s) en la línea germinal de los ratones. Normalmente, tales secuencias no de la línea germinal (o posiciones de nucleótidos individuales) se agruparán en o cerca de CDR, o en regiones en las que se sabe que se agrupan las mutaciones somáticas.
Otro aspecto de la invención incluye linfocitos B derivados de animales no humanos transgénicos o transcromosómicos como se describe en este documento. Los linfocitos B pueden usarse para generar hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales humanos que se unen con alta afinidad a IL-8 humana. Por tanto, en otra realización, la invención proporciona un hibridoma que produce un anticuerpo humano que tiene una afinidad (KD) de aproximadamente 10-10 M o menos cuando se determina por tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento BIACORE 3000 usando IL-8 recombinante humana como analito y el anticuerpo como ligando, o cuando se determina por análisis de Scatchard de células que expresan IL-8 usando un anticuerpo monoclonal radiactivamente marcado, o por determinación de la concentración de unión al 50% usando análisis por FACS.
En este documento, el anticuerpo monoclonal comprende una cadena ligera de la secuencia humana compuesta por
(1)
una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de polipéptidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento del gen VL humano y un segmento de JL humano, y (2) una región constante de la cadena ligera codificada por un segmento del gen CL humano; y una cadena pesada de la secuencia humana compuesta por (1) una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de polipéptidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento del gen VH humano, una región D y un segmento de JH humano, y (2) una región constante codificada por un segmento del gen CH humano.
El desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad contra IL-8 puede facilitarse mediante un procedimiento para expandir el repertorio de segmentos de genes de la región variable humana en un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de inmunoglobulina humana integrada, comprendiendo dicho procedimiento introducir en el genoma un transgén del gen V que comprende segmentos del gen de la región V que no están presentes en dicho transgén de inmunoglobulina humana integrada. Frecuentemente, el transgén de la región V es un cromosoma artificial de levadura (YAC) que comprende una porción de una matriz de segmentos de genes VH o VL (VK) humanos que pueden producirse naturalmente en un genoma humano o que pueden cortarse y empalmarse juntos por separado mediante procedimientos recombinantes, que puede incluir segmentos de genes V fuera de orden u omitidos. Frecuentemente, al menos cinco
o más fragmentos del gen V funcionales están contenidos en el YAC. En esta variación es posible producir un animal transgénico producido por el procedimiento de expansión del repertorio V, en el que el animal expresa una cadena de la inmunoglobulina que comprende una secuencia de la región variable codificada por un segmento del gen de la región V presente en el transgén de la región V y una región C codificada en el transgén de Ig humana. Por medio del procedimiento de expansión del repertorio de V pueden generarse animales transgénicos que tienen al menos 5 genes V distintos; como pueden ser animales que contienen al menos aproximadamente 24 genes V o más. Algunos fragmentos del gen V pueden ser no funcionales (por ejemplo, pseudogenes y similares); estos segmentos pueden retenerse o pueden delecionarse selectivamente mediante procedimientos recombinantes disponibles para el experto, si se desea.
Una vez se ha manipulado la línea germinal del ratón para contener un YAC funcional que tiene un repertorio de segmentos V expandido, sustancialmente no presente en el transgén de Ig humana que contiene los segmentos de los genes J y C, el rasgo puede propagarse y criarse en otros contextos genéticos que incluyen contextos en los que el YAC funcional que tiene un repertorio de segmentos de V expandido se cría en un línea germinal de animal no humano que tiene un transgén de Ig humana diferente. Pueden criarse múltiples YAC funcionales que tienen un repertorio de segmentos V expandido en una línea germinal para trabajar con un transgén de Ig humana (o múltiples transgenes de Ig humana). Aunque en este documento se denominan transgenes de YAC, tales transgenes cuando se integran en el genoma pueden carecer sustancialmente de secuencias de levadura tales como las secuencias requeridas para la replicación autónoma en levadura; tales secuencias pueden eliminarse opcionalmente por manipulación genética (por ejemplo, digestión por restricción y electroforesis en gel de campo pulsado u otro procedimiento adecuado) después de que la replicación en levadura ya no sea necesaria (es decir, antes de la introducción en una célula ES de ratón o procigoto de ratón). Los procedimientos de propagación del rasgo de la expresión de la inmunoglobulina de secuencia humana incluyen criar un animal transgénico que tiene el (los) transgén (transgenes) de Ig humana, y que opcionalmente también tienen un YAC funcional que tiene un repertorio de segmentos V expandido. Tanto los segmentos VH como VL del gen pueden estar presentes en el YAC. El animal transgénico puede criarse en cualquier contexto deseado por el médico, que incluye contextos que alojan otros transgenes humanos que incluyen transgenes de Ig humana y/o transgenes que codifican otras proteínas de linfocitos humanos. La invención también proporciona una inmunoglobulina de secuencia humana de alta afinidad producida por un ratón transgénico que tiene un transgén de YAC del repertorio de segmentos V expandido. Aunque lo anterior describe una realización preferida del animal transgénico de la invención, se contemplan otras realizaciones que se han clasificado en tres categorías:
I. Animales transgénicos que contienen un transgén de inmunoglobulina de cadena pesada sin reordenar y ligera reordenada;
II. Animales transgénicos que contienen un transgén de inmunoglobulina de cadena pesada sin reordenar y ligera sin reordenar; y
III. Animal transgénico que contiene un transgén de inmunoglobulina de cadena pesada reordenado y ligera sin reordenar;
De estas categorías de animal transgénico, el orden preferido de preferencia es del siguiente modo II > I > III en el que los genes endógenos de la cadena ligera (o al menos el gen K) han sido inactivados por recombinación homóloga (u otro procedimiento) y I > II > III en el que los genes endógenos de la cadena ligera no se han inactivado y deben dominarse por exclusión alélica.
III. Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene al menos un anticuerpo monoclonal humano de la presente invención, formulado junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición incluye una combinación de múltiples (por ejemplo, dos o más) anticuerpos humanos aislados de la invención. Preferentemente, cada uno de los anticuerpos de la composición se une a un epítope de IL-8 preseleccionado distinto.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición de la presente invención con al menos un agente para tratar trastornos inflamatorios o hiperproliferativos de la piel, al menos un agente antiinflamatorio, al menos un agente inmunosupresor o al menos un agente quimioterapéutico.
En una realización, tales agentes terapéuticos incluyen uno o más agentes para trastornos inflamatorios o hiperproliferativos de la piel tales como medicaciones tópicas que incluyen alquitrán de hulla, vitamina A, antralina, calcipotrieno, tarazoteno y corticosteroides, medicaciones orales o inyectadas tales como corticosteroides, metotrexato, retinoides, por ejemplo, acitretina, ciclosporina, etanercept, alefacept, efalizumab, 6-tioguanina, micofenolato mofetilo, tacrolimus (FK-506) e hidroxiurea. Otros ejemplos son CTLA4Ig e infliximab. Otros tratamientos pueden incluir exposición a la luz del sol o fototerapia, que incluye UVB (ultravioleta B de banda ancha y de banda estrecha), UVA (ultravioleta A) y PUVA (psoraleno-metoxaleno más ultravioleta A).
En otra realización, las composiciones de la invención se administran conjuntamente con dos o más de las terapias anteriores tales como metotrexato + fototerapia (PUVA o UVA); metotrexato + acitretina; acitretina + fototerapia PUVA o UVA); metotrexato + acitretina + fototerapia (PUVA o UVB); hidroxiurea + fototerapia (PUVA o UVB); hidroxiurea + acitretina; ciclosporina + metotrexato; o calcipotrieno + fototerapia (UVB).
En otra realización, tales agentes terapéuticos incluyen uno o más agentes antiinflamatorios tales como un fármaco esteroideo o un AINE (fármaco antiinflamatorio no esteroideo). Agentes preferidos incluyen, por ejemplo, aspirina y otros salicilatos, inhibidores de la Cox-2 tales como rofecoxib y celecoxib, AINE tales como ibuprofeno, fenoprofeno, naproxeno, sulindac, diclofenac, piroxicam, ketoprofeno, diflunisal, nabumetona, etodolac, oxaprozina e indometacina.
En otra realización, tales agentes terapéuticos incluyen uno o más FAME (fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad) tales como metotrexato, hidroxicloroquina, sulfasalazina, inhibidores de la síntesis de pirimidina, por ejemplo, leflunomida, agentes de bloqueo de receptores de IL-1, por ejemplo, anakinra y agentes de bloqueo de TNF-a, por ejemplo, etanercept, infliximab y adalimumab. Otros representantes son IL-10, anticuerpos anti-IL-15, IL15R soluble y anticuerpos anti-CD20.
En otra realización, tales agentes terapéuticos incluyen uno o más agentes inmunosupresores tales como ciclosporina, azatioprina, ácido micofenólico, micofenolato mofetilo, corticosteroides tales como prednisona, metotrexato, sales de oro, sulfasalazina, antipalúdicos, brequinar, leflunomida, mizoribina, 15-desoxiespergualina, 6mercaptoporina, ciclofosfamida, rapamicina y tacrolimus (FK-506).
En otra realización, las composiciones de la invención se administran en combinación con dos o más agentes inmunosupresores tales como prednisona y ciclosporina; prednisona, ciclosporina y azatioprina; o prednisona, ciclosporina y micofenolato mofetilo.
En otra realización, tales agentes terapéuticos incluyen uno o más agentes quimioterapéuticos tales como doxorubicina, cisplatino, bleomicina, carmustina, ciclofosfamida y clorambucilo.
En otra realización, los presentes anticuerpos monoclonales humanos pueden administrarse conjuntamente con radioterapia.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención pueden administrarse en combinación con uno o varios anticuerpos, por ejemplo, uno o más anticuerpos humanos tales como, por ejemplo, anticuerpos anti-CD4, anticuerpos anti-EGFr, anticuerpos anti-CD20, anticuerpos anti-IL15 o anticuerpos anti-IL15R.
En otra realización más, los anticuerpos humanos de la invención pueden administrarse en combinación con uno o más agentes que bloquean o interfieren con la función de CC o receptores de quimiocinas CXC tales como anticuerpos para CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2 o CCR5, o moléculas naturales o sintéticas que actúan de antagonistas de receptores de quimiocinas.
En todavía otra realización, los anticuerpos humanos de la invención pueden administrarse en combinación con uno
o más agentes que bloquean la función de ligandos de quimiocinas tales como anticuerpos para MIP-1a, MIP-1�, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3 o MCP-4.
Además, los anticuerpos humanos anti-IL-8 de la presente invención pueden derivatizarse, ligarse a o coexpresarse con otras especificidades de unión. En una realización particular, la invención proporciona una molécula biespecífica
o multiespecífica que comprende al menos una primera especificidad de unión por IL-8 (por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-8 humano o mimético del mismo) y una segunda especificidad de unión por una célula efectora humana tal como una especificidad de unión por un receptor de Fc (por ejemplo, un receptor de Fcy humano tal como FcyRI, o un receptor de Fca humano) o un receptor de linfocitos T, por ejemplo, CD3.
Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas que se unen tanto a IL-8 humana como a un receptor de Fc o un receptor de linfocitos T, por ejemplo, CD3. Ejemplos de receptores de Fc son, por ejemplo, un receptor de IgG humana, por ejemplo, un receptor de Fc-gamma (FcyR) tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). También pueden elegirse como diana otros receptores de Fc tales como receptores de IgA humana (por ejemplo, FcaRI). El receptor de Fc está preferentemente localizado sobre la superficie de una célula efectora, por ejemplo, un monocito, macrófago o una célula mononuclear activada. En una realización preferida, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas se unen a un receptor de Fc en un sitio que es distinto del sitio de unión de Fc a inmunoglobulina (por ejemplo, IgG o IgA) del receptor. Por tanto, la unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas no está bloqueada por niveles fisiológicos de inmunoglobulinas.
Como se usa en este documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de isotonicidad y retardantes de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión).
Una “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto parental y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., y col. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Sales de adición de ácido incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos tales como ácidos clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, además de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono-y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Sales de adición de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, además de aminas orgánicas no tóxicas tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.
Una composición de la presente invención puede administrarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Como será apreciado por el experto, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protegerán al compuesto contra la liberación rápida tales como una formulación de liberación controlada que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biocompatibles biodegradables tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de tales formulaciones están patentados o generalmente son conocidos para aquellos expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Para administrar un compuesto de la invención por ciertas vías de administración puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y disoluciones acuosas de tampón. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua, además de liposomas convencionales (Strejan y col. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones inyectables estériles o dispersión. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto en la medida de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.
Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de preparación y almacenamiento. La composición puede formularse como una disolución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos. En muchos casos será preferible incluir agentes de isotonicidad, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como glicerol, manitol, sorbitol, o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención se administran en forma cristalina por inyección subcutánea, véase Yang y col. (2003) PNAS, 100(12):6934-6939.
Pueden prepararse disoluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con una o una combinación de componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por microfiltración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización que proporcionan un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración del mismo.
Las pautas de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Forma unitaria de dosificación como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que van a tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que va a lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en la materia de combinar un compuesto activo tal para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes de metales tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Para las composiciones terapéuticas, las formulaciones de la presente invención incluyen aquellas adecuadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una forma de dosificación unitaria variará dependiendo del sujeto que está tratándose y el modo particular de administración. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una forma de dosificación unitaria será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, del 100%, esta cantidad oscilará de aproximadamente el 0,01% a aproximadamente el 99% de principio activo, preferentemente de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 70%, lo más preferentemente de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 30%.
Las formulaciones de la presente invención que son adecuadas para administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en espray que contienen tales vehículos como se conocen en la técnica por ser apropiados. Formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de composiciones de la presente invención incluyen polvos, esprays, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede mezclarse bajo condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservante, tampón o propulsor que pueda requerirse.
La frases “administración parenteral” y “administrado parenteralmente” como se usa en este documento significa modos de administración distintos de administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección o infusión, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, usando materiales de recubrimiento tales como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y por el uso de tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto por procedimientos de esterilización, arriba, como por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede desearse incluir agentes isotónicos tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede provocarse por la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Si los compuestos de la presente invención se administran como productos farmacéuticos a seres humanos y animales, pueden administrarse solos o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, del 0,01 al 99,5% (más preferentemente, del 0,1 al 90%) de principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden usarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante procedimientos convencionales conocidos para aquellos expertos en la materia.
Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición y modo de administración, sin ser tóxicas para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, sal o amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de secreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, afección, salud general y antecedentes médicos del paciente que está tratándose, y factores similares muy conocidos en las ciencias médicas.
Un médico o veterinario experto en la materia puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría empezar con dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos con el fin de lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se logre el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la invención será esa cantidad del compuesto que es la menor dosis eficaz para producir un efecto terapéutico. Una dosis eficaz tal dependerá generalmente de los factores anteriormente descritos. Se prefiere que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, preferentemente administrada próxima al sitio de la diana. Si se desea, la dosis diaria eficaz de una composición terapéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados durante todo el día, opcionalmente en formas de dosificación unitaria. Aunque es posible que un compuesto de la presente invención se administre solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación (composición) farmacéutica. La dosificación puede determinarse o ajustarse midiendo la cantidad de anticuerpos monoclonales anti-IL-8 en circulación en diferentes momentos de tiempo tras la administración en una muestra biológica haciendo uso de anticuerpos antiidiotípicos que eligen como diana los anticuerpos anti-IL-8 o usando otros procedimientos específicos para detectar los anticuerpos anti-IL-8, por ejemplo, por un ensayo de ELISA usando IL-8 como recubrimiento.
En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos según la invención pueden administrarse por infusión en una dosificación de 0,15 a 8 mg/kg, por ejemplo, 0,15 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4 mg/kg o 8 mg/kg, en el día 0 seguido de 2 a 8 administraciones una vez a la semana, tal como 4 administraciones una vez a la semana empezando en el día 28. La administración puede realizarse por infusión continua durante un periodo de 24 horas o durante un periodo superior a 24 horas con el fin de reducir los efectos secundarios tóxicos.
En otra realización más, los anticuerpos monoclonales humanos se administran por terapia de mantenimiento tal como, por ejemplo, una vez a la semana, una vez cada dos semanas o una vez al mes durante un periodo de 6 meses o más.
Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición terapéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja tal como los dispositivos desvelados en las patentes de EE.UU. nº 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Ejemplos de implantes y módulos muy conocidos útiles en la presente invención incluyen: la patente de EE.UU. nº 4.487.603 que desvela una bomba de micro-infusión implantable para dispensar medicación a una tasa controlada; la patente de EE.UU. nº 4.486.194 que desvela un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos por la piel; la patente de EE.UU. nº 4.447.233 que desvela una bomba de infusión de medicación para administrar medicación a una tasa de infusión precisa; la patente de EE.UU. nº 4.447.224 que desvela un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración de fármaco continua; la patente de EE.UU. nº 4.439.196 que desvela un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y la patente de EE.UU. nº 4.475.196 que desvela un sistema de administración de fármaco osmótico. Muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos tales son conocidos para aquellos expertos en la materia.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden formularse para garantizar la apropiada distribución in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos de la invención puedan atravesar la BBB (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para procedimientos de preparación de liposomas véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que son transportados selectivamente en células u órganos específicos, potenciando así la administración del fármaco elegido como diana (véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Restos de elección de diana a modo de ejemplo incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.416.016 a Low y col.); manósidos (Umezawa y col., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman y col. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais y col. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A tensioactiva (Briscoe y col. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), especies diferentes las cuales pueden comprender las formulaciones de las invenciones, además de componentes de las moléculas inventadas; p120 (Schreier y col. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véanse también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. En una realización de la invención, los compuestos terapéuticos de la invención se formulan en liposomas; en una realización más preferida, los liposomas incluyen un resto que elige diana. En una realización más preferida, los compuestos terapéuticos en los liposomas se administran mediante inyección en bolo a un sitio proximal al área deseada, por ejemplo, el sitio de inflamación o infección, o el sitio de un tumor. La composición debe ser líquida hasta el punto de que exista fácil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de preparación y almacenamiento y debe preservarse de la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.
Las dosificaciones eficientes y las pautas de dosificación para los anticuerpos monoclonales humanos de la invención dependen de la enfermedad o afección que va a tratarse y pueden ser determinadas por el experto en la materia.
Una “dosificación terapéuticamente eficaz” para PPP preferentemente producirá una reducción en la evaluación de PPP global comparando la impresión de mejora después del tratamiento con fármaco con la afección de pretratamiento. Esto puede evaluarse, por ejemplo, por la reducción en el número de pústulas frescas, un PASI como puntuación adaptada a PPP denotado PPPASI. Preferentemente, el tratamiento producirá un PPPASI50, más preferentemente un PPPASI75, e incluso más preferentemente un PPPASI90.
Una “dosificación terapéuticamente eficaz” para psoriasis preferentemente producirá un PASI50, más preferentemente un PASI75, e incluso más preferentemente un PASI90 en los pacientes o una reducción en la evaluación de la psoriasis global comparando la impresión de mejora después del tratamiento con fármaco con la afección de pretratamiento. El PASI (índice de área y gravedad de la psoriasis) es un sistema de puntuación usado para la evaluación del área y la gravedad de la enfermedad. El PASI50 se define como �50% de mejora de la puntuación. De la misma forma, PASI75 y PASI90 se definen como �75% y �90% de mejora de la puntuación, respectivamente.
Una “dosificación terapéuticamente eficaz” para artritis reumatoide producirá preferentemente una definición preliminar de ACR20 de mejora en los pacientes, más preferido una definición preliminar de ACR50 de mejora e incluso más preferido una definición preliminar de ACR70 de mejora.
La definición preliminar de ACR20 de mejora se define como: �20% de mejora en: recuento de articulaciones dolorosas (TJC) y recuento de articulaciones inflamadas (SJC) y� 20% mejora en 3 de las 5 siguientes evaluaciones: evaluación del dolor del paciente (VAS), evaluación global del paciente (VAS), evaluación global del médico (VAS), incapacidad autoevaluada por el paciente (HAQ) y reactivo de fase aguda (CRP o ESR).
ACR50 y ACR70 se definen de la misma forma con �50% y �70% de mejoras, respectivamente. Para más detalles véase Felson y col. en American College of Rheumatology Preliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis; Arthritis Rheumatism (1995) 38:727-735.
Alternativamente, una dosificación terapéuticamente eficaz para artritis reumatoide puede medirse por DAS (puntuación de la actividad de la enfermedad), que incluye DAS28 y más preferentemente DAS56, como se define por EULAR.
Una “dosificación terapéuticamente eficaz” para terapia tumoral puede medirse por respuestas tumorales objetivas que pueden ser tanto completas como parciales. Una respuesta completa (CR) se define como una prueba no clínica, radiológica u otra prueba de enfermedad. Una respuesta parcial (PR) resulta de una reducción en el tamaño tumoral agregado de más del 50%. El tiempo medio para la progresión es una medida que caracteriza la durabilidad de la respuesta tumoral objetiva.
Una “dosificación terapéuticamente eficaz” para terapia tumoral también puede medirse por su capacidad para estabilizar la progresión de la enfermedad. La capacidad de un compuesto para inhibir cáncer puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en tumores humanos. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño tumoral, o mejorar de otro modo los síntomas en un sujeto. Un experto en la materia podría determinar tales cantidades basándose en factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición particular o vía de administración seleccionada.
IV. Usos y procedimientos de la invención
Los anticuerpos humanos y las composiciones de anticuerpos de la presente invención tienen numerosas utilidades terapéuticas y de diagnóstico in vivo e in vitro que implican el tratamiento y diagnóstico de trastornos mediados por IL-8 o trastornos que implican actividad de IL-8. Estas moléculas pueden administrarse a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, o a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, para tratar, prevenir y para diagnosticar una variedad de trastornos. Como se usa en este documento, el término “sujeto” pretende incluir animales humanos y no humanos. Sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos producidos por o asociados a actividad de IL-8.
Más particularmente, los anticuerpos humanos y derivados de los mismos se proporcionan para su uso en un procedimiento para inhibir actividades inducidas por IL-8 asociadas a ciertos trastornos, por ejemplo, actividad proinflamatoria, actividad quimiotáctica y angiogénesis. Otras actividades inducidas por IL-8 que son inhibidas por los anticuerpos de la presente invención incluyen inhibir el aumento de la expresión inducida por IL-8 de CDR11b (Mac-1) e inhibir la disminución de la expresión inducida por IL-8 de L-selectina. Poniendo en contacto el anticuerpo con IL-8 (por ejemplo, administrando el anticuerpo a un sujeto), la capacidad de IL-8 para unirse a sus receptores y para inducir posteriormente tales actividades se inhibe y, por tanto, se trata el trastorno asociado. Anticuerpos preferidos se unen a epítopes que son específicos para IL-8 y, por tanto, inhiben ventajosamente actividades inducidas por IL-8, pero no interfieren con la actividad de quimiocinas estructuralmente relacionadas tales como GRO-a, GRO-�, IP-10 y NAP-2.
En una realización, los anticuerpos humanos de la invención pueden usarse en procedimientos para tratar trastornos inflamatorios o hiperproliferativos de la piel tales como PPP, psoriasis que incluye psoriasis en placas y psoriasis de tipo gotosa, enfermedades ampollosas de la piel tales como penfigoide ampolloso, dermatitis de contacto, eccema, dermatitis eritematosa y atópica.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención pueden usarse en procedimientos para tratar enfermedades inmunitarias, autoinmunitarias o infecciosas tales como artritis psoriásica, esclerodermia y esclerosis sistémica, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lesión pulmonar aguda tal como síndrome disneico agudo o síndrome disneico del adulto, meningitis, encefalitis, uveítis, mieloma múltiple, glomerulonefritis, nefritis, asma, aterosclerosis, deficiencia de adhesión leucocitaria, esclerosis múltiple, síndrome de
Raynaud, síndrome de Sjögren, diabetes juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behcet, nefritis inmunocompleja, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM, trombocitopenias inmunomediadas tales como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis lúpica, lupus eritematoso, artritis reumatoide (AR), espondilitis anquilosante, pénfigo, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, vasculitis de vasos pequeños tal como granulomatosis de Wegener, síndrome de Omen, insuficiencia renal crónica, enfermedad tiroidea autoinmune, mononucleosis infecciosa aguda, VIH, enfermedades asociadas al virus del herpes, infecciones por virus humanos tales como resfriado como se produce por rinovirus humano, coronavirus, otros enterovirus, virus del herpes, virus de la gripe, virus paragripal, virus respiratorio sincitial o infección por adenovirus, neumonía bacteriana, heridas, septicemia, infarto cerebral/edema cerebral, lesión por isquemia-reperfusión y hepatitis C.
En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se proporcionan para su uso en un procedimiento para tratar lesión por isquemia-reperfusión después de trombólisis, derivación cardiopulmonar, intervención coronaria percutánea (ICP), derivación de las arterias coronarias o trasplante cardíaco.
En otra realización más, los anticuerpos humanos de la invención se proporcionan para su uso en un procedimiento para tratar hepatitis alcohólica y pancreatitis aguda.
En todavía otra realización, los anticuerpos humanos de la invención pueden usarse en procedimientos para tratar enfermedades que implican angiogénesis mediada por IL-8 tales como tumores y cánceres, por ejemplo, melanoma, carcinoma tiroideo, carcinoma de células transitorias, triquilemona, carcinoma de células escamosas y cáncer de mama.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención se proporcionan para su uso en un procedimiento para tratar enfermedades en las que el bloqueo de la migración de granulocitos es beneficioso, por ejemplo, en enfermedades que afectan el sistema nervioso central tales como angeítis cerebral aislada; enfermedades que afectan el sistema nervioso periférico tales como mononeuritis múltiple; trastornos cardiovasculares tales como infarto agudo de miocardio, miocarditis, pericarditis y endocarditis de Liebman-Sacks; trastornos pulmonares tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), alveolitis, bronquiolitis obliterante, fibrosis quística, aspergilosis alérgica y síndrome de Löffler; trastornos hepáticos tales como colangitis esclerosante; trastornos urogenitales tales como cistitis crónica; trastornos renales tales como nefritis tubulointersticial; enfermedades infecciosas tales como síndrome respiratorio agudo grave (SRAG); trastornos reumáticos tales como vasculitis de vasos grandes (incluyendo arteritis de células gigantes, polimialgia reumática y arteritis de Takayasu), vasculitis de vasos de tamaño medio (incluyendo poliarteritis nodosa, poliarteritis nodosa localizada y enfermedad de Kawasaki), vasculitis de vasos pequeños (incluyendo síndrome de Churg- Strauss, poliarteritis microscópica, vasculitis crioglobulinémica y angeítis leucocitoclástica), vasculitis secundaria (incluyendo vasculitis reumatoide y vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico o síndrome de Sjögren), sacroileítis aislada, el síndrome de SAPHO y discitis (incluyendo discitis posoperatoria); trastornos endocrinos tales como tiroiditis subaguda; trastornos de la piel tales como penfigoide cicatricial, dermatitis herpetiforme, dermatosis pustulosa subcorneal, epidermolisis ampollosa adquirida, rosácea, dermatosis febril aguda, granuloma anular (incluyendo síndrome de Sweet), piodermia gangrenosa y acné (incluyendo acné conglobata); trastornos del tejido conjuntivo tales como sarcoidosis, policondritis recurrente, fiebre mediterránea familiar, paniculitis, eritema nodoso, enfermedad de Weber-Christian y fibrosis retroperitoneal.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención se proporcionan para su uso en un procedimiento para tratar enfermedades en las que la interferencia con interacciones entre IL-8 y osteoclastos es beneficiosa, tal como osteoporosis y metástasis osteolíticas.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención se proporcionan para su uso en un procedimiento para tratar enfermedad en la que la interferencia con interacciones entre IL-8 y células tumorales es beneficiosa, tal como cáncer gástrico, cáncer colorrectal y cáncer de la vejiga urinaria.
Los procedimientos implican administrar a un sujeto una composición de anticuerpo de la presente invención en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el trastorno. La composición de anticuerpo puede administrarse sola o junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales tales como uno o más agentes seleccionados de agentes para tratar trastornos inflamatorios o hiperproliferativos de la piel, agentes antiinflamatorios, agentes inmunosupresores y agentes quimioterapéuticos, que actúan conjuntamente con o sinérgicamente con la composición de anticuerpo para tratar o prevenir la enfermedad mediada por IL-8.
Vías adecuadas de administración de las composiciones de anticuerpo de la invención in vivo e in vitro son muy conocidas en la técnica y pueden seleccionarse por aquellos expertos. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpo pueden administrarse mediante inyección o infusión (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las
dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y el peso del sujeto, la concentración y/o la formulación de la composición de anticuerpo, y la enfermedad que está tratándose.
Como se describe previamente, los anticuerpos humanos anti-IL-8 de la invención pueden co-administrase con uno u otros agentes terapéuticos más. El anticuerpo puede administrarse antes, después de o simultáneamente con el agente.
También están dentro del alcance de la presente invención kits que comprenden las composiciones de anticuerpo de la invención e instrucciones para su uso. El kit puede contener adicionalmente uno o más agentes adicionales tales como un agente inmunosupresor, o uno o más anticuerpos humanos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítope en el antígeno de IL-8 distinto del primer anticuerpo humano).
Por consiguiente, los pacientes tratados con composiciones de anticuerpo de la invención pueden administrarse adicionalmente (antes de, simultáneamente con o tras la administración de un anticuerpo humano de la invención) con otro agente terapéutico tal como un agente antiinflamatorio que potencia o aumenta el efecto terapéutico de los anticuerpos humanos.
En otra realización más, la invención proporciona procedimientos para diagnosticar enfermedades asociadas a IL-8 por detección ex vivo o in vitro de IL-8 en una muestra, por ejemplo, una muestra de tejido, una muestra de fluido corporal o una muestra de células. Esto puede lograrse, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra que va a probarse, opcionalmente junto con una muestra de control, con el anticuerpo humano en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo e IL-8. Entonces puede detectarse la formación del complejo (por ejemplo, usando un ELISA). Si se usa una muestra de control junto con la muestra de prueba, el complejo puede detectarse en ambas muestras y cualquier diferencia estadísticamente significativa en la formación de complejos entre las muestras es indicativa de la presencia de IL-8 en la muestra de prueba.
La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como adicionalmente limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 Producción de anticuerpos monoclonales humanos (HuMab) contra IL-8
Los anticuerpos monoclonales humanos contra IL-8 humana (forma de 72 aminoácidos) se produjeron del siguiente modo en ratones transgénicos que llevaban transgenes de inmunoglobulina humana.
Antígeno: Se preparó antígeno de IL-8 humana recombinante (rhIL-8) usando técnicas de ADN recombinante convencionales y se proporcionó a una concentración de proteína de 0,713 mg/ml en PBS. El antígeno soluble se almacenó a -80ºC hasta su uso. La IL-8 soluble se mezcló con adyuvante completo de Freund (CF) (Sigma F5881) para la primera inmunización. Después, el antígeno se mezcló con adyuvante incompleto de Freund (IF) (Sigma F5506). Veinticinco microgramos de IL-8 recombinante en 100 μl de PBS se mezclaron 1:1 con el adyuvante usando una aguja de emulsión. Los ratones se inyectaron con 0,2 ml de antígeno preparado en la cavidad intraperitoneal.
Ratones transgénicos: Los ratones se alojaron en jaulas de filtro y se evaluaron para que estuvieran en buena condición física en las fechas de inmunización y sangrados, y en el día de la fusión.
El ratón que produjo el anticuerpo monoclonal (mAb) 10F8 fue un macho, nº ID 81645 del genotipo (CMD)++; (HCo7) 19952+; (JKD) ++; (KCo5) 9272+. Las designaciones de transgenes individuales están entre paréntesis, seguido de los números de línea para los transgenes integrados al azar. Los símbolos ++ y + indican homocigoto o hemicigoto. Sin embargo, debido a que los ratones se criban rutinariamente usando un ensayo basado en PCR que no permite la distinción entre heterocigosidad y homocigosidad para los transgenes de Ig humana integrados al azar, una designación + puede darse a ratones que en realidad son homocigotos para estos elementos.
Los ratones HCo7 tienen una alteración JKD en sus genes de la cadena ligera (kappa) endógenos (como se describe en Chen y col. (1993) EMBO J. 12: 821-830), una alteración CMD en sus genes de la cadena pesada endógenos (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), un transgén de la cadena ligera kappa humana KCo5 (como se describe en Fishwild y col. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) y un transgén de la cadena pesada humana HCo7 (como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.770.429).
Los ratones HCo12 tienen una alteración JKD en sus genes de la cadena ligera (kappa) endógenos (como se describe en Chen y col. (1993) EMBO J. 12: 821-830), una alteración CMD en sus genes de la cadena pesada endógenos (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424 por Korman y col.), un transgén de la cadena ligera kappa humana KCo5 (como se describe en Fishwild y col. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) y un transgén de la cadena pesada humana HCol2 (como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/14424 por Korman y col.).
Procedimiento de inmunización: El programa de inmunización usado para los ratones se enumera en la siguiente Tabla 1. Los esplenocitos de diez ratones de genotipos HCo7 y HCo12 inmunizados con rIL-8 se fusionaron en el día 101.
Tabla 1
Fechas
Procedimiento
Día 0
Inmunización 25 μg de IL-8 ip CF
Día 15
Inmunización 25 μg de IL-8 ip IF
Día 28
Inmunización 25 μg de IL-8 ip IF
Día 38
Título
Día 50
Inmunización 25 μg de IL-8 ip IF
Día 59
Título
Día 63
Inmunización 25 μg de IL-8 ip IF
Día 73
Título
Día -3 y -2 antes de la fusión
Inmunización 25 μg de IL-8 iv
Día 101
Fusión
Preparación de hibridomas: Para las fusiones se usó la línea de células de mieloma P3 X63 ag8.653 (ATCC CRL 1580, lote F-15183). El vial de ATCC original se descongeló y el cultivo se expandió. A partir de esta expansión se preparó un caldo de siembra de viales descongelados. Las células se mantuvieron en cultivo durante 3-6 meses, se
10 sometieron a pases dos veces a la semana. La línea celular P388D1 (ATCC TIB-63 FL) se expandió a 200 ml y se agotó. El sobrenadante se centrifugó y se filtró y se usó como adición de medio conocido como medio acondicionado. Esta línea celular se sometió a pases durante 3-6 meses y luego se descongeló un nuevo vial.
Se usó DMEM con alto contenido en glucosa (Mediatech, Cellgro nº 10013245) que contenía 5% de SBF y
15 penicilina-estreptomicina (Cellgro nº 30004030) para cultivar el mieloma y células P388D1. Se añadieron complementos de medio adicional al medio de crecimiento de hibridomas que incluían: 3% de factor de clonación de hibridomas Origen (Igen, 36335), 10% de medio acondicionado con P388D1 (8/10/99 DH), 10% de FBS (Hyclone, SH30071 lote nº AGH6843), L-glutamina (Gibco nº 1016483) 0,1% de gentamicina (Gibco nº 1020070), 2mercaptoetanol (Gibco nº 1019091), HAT ((Sigma, H0262), hipoxantina 1,0 x 104 M, aminopterina 4,0 x 10-7 M,
20 timidina 1,6 x 10-5 M) o HT ((Sigma, H0137) hipoxantina 1,0 x 10-4 M, timidina 1,6 x 10-5 M).
El bazo del ratón nº 18645 era de tamaño normal y dio 1,8 x 108 células viables. Se dispensaron 10 placas (de 96 pocillos) a 200 μl/pocillo. Entonces, los esplenocitos se fusionaron y se realizó un cribado por ELISA inicial para anticuerpos IgG,K humana 10-12 días después de la fusión.
25 Entonces, los pocillos positivos para IgG,K humana se cribaron en placas de ELISA recubiertas con IL-8 soluble. Entonces, los hibridomas positivos para antígeno se transfirieron a placas de 24 pocillos y eventualmente a matraces de cultivo de tejido. Los hibridomas específicos para IL-8 se subclonaron por dilución limitante para asegurar la monoclonalidad. Los hibridomas positivos para antígeno se preservaron en varias etapas en el procedimiento de
30 desarrollo congelando las células en DMEM complementado con 50% de SBF más 10% de DMSO (Sigma, D2650).
Los títulos para el ratón nº 18645 fueron como se muestra a continuación en la Tabla 2. Los títulos son específicos para antígeno Huy. Los valores de los títulos se definen con el recíproco de la mayor dilución que produce una DO igual a dos veces la de la referencia.
Tabla 2
Fecha
Título
Día 0
200
Día 21
1600
Día 35
1600-3200
La fusión se cribó para la reactividad del antígeno Huy por ELISA. Tras el cribado para antígeno (basado en ELISA), a partir de la fusión se identificaron dos posibles hibridomas específicos para antígeno. Estos dos hibridomas, junto 40 con otros seis hibridomas de fusiones previas, se evaluaron para el potencial terapéutico. Estas líneas se subclonaron y los sobrenadantes agotados se purificaron sobre proteína A. Las determinaciones de las KD se hicieron usando BIAcore. Cuando se compararon con el mAb de control, se identificó que el hibridoma 10F8 tenía
afinidad muy alta y se seleccionó para la posterior caracterización.
Ejemplo 2 Determinación de las regiones VH y VL de los anticuerpos
Cultivo celular: Se cultivó la línea celular de hibridoma del HuMab 10F8 en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco BRL) complementado con 10% de SBF, L-glutamina 2 mM, 100 UI/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina (pen/estrep) (todos derivados de Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, R.U.) y piruvato de sodio 1 mM. Las células se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2.
Preparación de ARN: Se preparó ARNm poliA+ a partir de 2x106 células de HuMab-IL-8 (10F8) usando el kit Micro-Fast Track (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante.
Preparación de ADNc: Se preparó ADN complementario (ADNc) de ARN a partir de células de HuMab-IL-8 (10F8) a partir de ¼ del ARNm obtenido usando el kit DNAc Cycle (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante.
Las regiones VH y VL se amplificaron usando los siguientes cebadores:
Cebadores en 5' de VH FR1:
AB62 CAg gTK CAg CTg gTg CAg TC (SEC ID Nº:25) AB63 SAg gTg CAg CTg KTg gAg TC (SEC ID Nº:26) AB65 gAg gTg CAg CTg gTg CAg TC (SEC ID Nº:27)
Cebadores en 5' conductores de VH:
AB85 ATg gAC Tgg ACC Tgg AgC ATC (SEC ID Nº:28) AB86 ATg gAA TTg ggg CTg AgC Tg (SEC ID Nº:29) AB87 ATg gAg TTT ggR CTg AgC Tg (SEC ID Nº:30) AB88 ATg AAA CAC CTg Tgg TTC TTC (SEC ID Nº:31) AB89 ATg ggg TCA ACC gCC ATC CT (SEC ID Nº:32)
Cebador en 3' de VH:
AB90 TgC CAg ggg gAA gAC CgA Tgg (SEC ID Nº:33)
Cebadores en 5' de VK FR1:
AB8 RAC ATC CAg ATg AYC CAg TC (SEC ID Nº:34) AB9 gYC ATC YRg ATg ACC CAg TC (SEC ID Nº:35) AB10 gAT ATT gTg ATg ACC CAg AC (SEC ID Nº:36) AB11 gAA ATT gTg TTg ACR CAg TC (SEC ID Nº:37) AB12 gAA ATW gTR ATg ACA CAg TC (SEC ID Nº:38) AB13 gAT gTT gTg ATg ACA CAG TC (SEC ID Nº:39) AB14 gAA ATT gTg CTg ACT CAg TC (SEC ID Nº:40)
Cebadores en 5' conductores de VK:
AB123 CCC gCT Cag CTC CTg ggg CTC CTg (SEC ID Nº:41) AB124 CCC TgC TCA gCT CCT ggg gCT gC (SEC ID Nº:42) AB 125 CCC AgC gCA gCT TCT CTT CCT CCT gC (SEC ID Nº:43) AB126 ATg gAA CCA Tgg AAg CCC CAg CAC AgC (SEC ID Nº:44)
Cebador en 3' de VK:
AB16 Cgg gAA gAT gAA gAC AgA Tg (SEC ID Nº:45)
En las secuencias de cebadores anteriores, K, S, R, Y y W tienen los siguientes significados:
K = G o T; S =C o G; R = A o G; Y = C o T; y W = A o T
Condiciones de PCR usadas para amplificar las regiones VH y VL para la clonación: Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se realizaron con polimerasa Pfu clonada (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.) en un GeneAmp PCR Sysmtem 9700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.).
Protocolo de ciclado por PCR:
94ºC 2 min
10 ciclos 94ºC 45 s
65ºC 45 s, menos 1ºC por ciclo
72ºC 1 min
20 ciclos 94ºC 45 s
55ºC 45 s
72ºC 1 min
72ºC 10 min
Enfriar a 4ºC
Clonación de VH y VL en el sistema pCR-Blunt-Vector: Después de analizar los productos de PCR en un gel de agarosa, los productos se ligaron directamente en el sistema pCR-Blunt vector (Invitrogen) según el protocolo del 5 fabricante. Se clonaron y se secuenciaron tres productos de PCR de VH independientemente amplificados y cinco productos de PCR de VL independientemente amplificados usando cebadores de FR1 o conductores.
Después de la transformación en TOP 10 de E. coli (Invitrogen), el ADN de plásmido de colonias se purificó usando el kit Qiaprep Spin miniprep (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). Los clones individuales se cribaron para el inserto del 10 producto de PCR de VH o VL por digestión con EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.) y análisis en un gel de agarosa.
Secuenciación: Las regiones V se secuenciaron después de la clonación en el sistema pCR-Blunt Vector usando los cebadores T7 y T3, por ACGT, Inc., Northbook, IL, EE.UU. Las secuencias se analizaron con el programa DNAStar, 15 SeqmanII. Las secuencias se alinearon con las secuencias del gen V de la línea germinal en Vbase (www.mrccpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/intro.htm).
Familia de la línea germinal para la región VH de 10F8 según el alineamiento en Vbase: VH3-33 (subgrupo de VH3), JH4(b) (segmento de JH). No pudieron reconocerse regiones complementarias para el segmento DH por el software 20 V-base, probablemente debido a hipermutaciones somáticas en el segmento D.
Familia de la línea germinal para la región VL de 10F8 según el alineamiento en Vbase: VK A-27 (subgrupo de VKIII) y JK3 (segmento de JK).
25 La Figura 1 muestra las secuencias de nucleótidos de las regiones VL y VH de 10F8. Las Figuras 2 y 4 muestran el alineamiento de las secuencias de nucleótidos de las regiones VL y VH de 10F8, respectivamente, con sus secuencias de la línea germinal correspondientes. Las Figuras 3 y 5 muestran el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las regiones VL y VH de 10F8, respectivamente, con sus secuencias codificadas de la línea germinal correspondientes.
30 10F8: Un anticuerpo IgG1,K monoclonal humano con secuencias de aminoácidos de VH y VL: SEC ID Nº: 12 y 8, respectivamente.
Ejemplo 3 Expresión de HuMab 10F8 recombinante
35 Las regiones VL y VH clonadas de HuMab 10F8 se subclonaron en los casetes de expresión de un vector de expresión de inmunoglobulina. Las regiones V se insertaron en la dirección 5' de las regiones constantes kappa y gamma humanas y codificaron cadenas pesadas y ligeras de 10F8 de longitud completa. El vector de expresión de 10F8 se transfectó en células de ovario de hámster chino (CHO) y se establecieron líneas celulares de transfectoma
40 que expresaban el anticuerpo recombinante. Se midió que la afinidad de 10F8 recombinante producida a partir de células CHO era idéntica a la afinidad del anticuerpo 10F8 derivado del hibridoma como se evaluó por los análisis cinéticos de resonancia de plasmones superficiales usando BIAcore.
Ejemplo 4 Unión de HuMab 10F8 (Fab y IgG) a IL-8
45 Purificación de anticuerpo monoclonal a partir de sobrenadante de cultivo: HuMab 10F8 se purificó por cromatografía de afinidad en proteína A usando el siguiente procedimiento: (1) Condiciones de carga: el sobrenadante se cargó en una columna de proteína A de 5 ml que se equilibró con solución salina tamponada con fosfato (PBS); (2) Lavado: PBS; (3) Elución: glicina 0,1 M con NaCl 150 mM, pH 2,9. El eluato se neutralizó con tampón Tris 1 M (30 μl para
50 cada fracción de 2 ml). Cada fracción eluída se ejecutó en gel antes de enfriarse. Una vez se había verificado la pureza por tinción con Coomassie, las fracciones se reunieron y se dializaron contra tampón fosfato de sodio 10 mM con NaCl 150 mM, pH 7,2.
Preparación del fragmento Fab: Se realizó una preparación del fragmento Fab a partir de HuMab 10F8 según las instrucciones del kit (bibliografía de Pierce Technical 44885). Para este fin se usaron cinco mg de la IgG purificada. El producto de Fab aislado se dializó contra fosfato de sodio 10 mM con NaCl 150 mM, pH 7,2, y su concentración de proteína se determinó por ensayo de BCA (Pierce) usando BSA como patrón. El Fab se caracterizó para su
5 pureza e identidad por SDS-PAGE.
Constantes de afinidad: Las constantes de afinidad para Fab 10F8 se determinaron y se compararon con valores correspondientes de IgG1,K 10F8. Las moléculas de IgG completas conducen a efectos de re-unión durante la fase de disociación de procedimientos experimentales para determinar las constantes de afinidad, conduciendo así a una
10 constante de velocidad de disociación aparentemente menor y a su vez a una constante de afinidad mucho mayor. Para eliminar estos efectos de afinidad de artificiales, se usaron moléculas de Fab en lugar de IgG1,K para determinar la afinidad y las constantes de velocidad. Se usó un chip CM-5 para inmovilizar la IL-8 mediante acoplamiento con amina.
15 Usando BIAcore 3000, las constantes de asociación y de velocidad basadas en sensogramas (datos no mostrados) de IgG1,K y Fab a 25ºC y 37ºC se resumen a continuación.
Constantes de asociación y de velocidad a 25ºC
IgG Fab
ka (x 105 /M-1 x s-1) 2,31 1,01
kd (x 10-5 s-1) 0,21 1,96
KD (x 10-10 M) 0,1 1,94
Semivida (In (2/k_dis h)) 90,4 8,3 20 Constantes de asociación y de velocidad a 37ºC
IgG Fab
ka (x 105 M-1 x s-1) 2,75 1,06
kd (x 10-5 s-1) 0,54 3,94
KD (x 10-10 M) 0,2 3,72
Semivida (In (2/k_dis h)) 38,2 4,9
La interacción de IgG1,K intacta con IL-8 dio una constante de velocidad de disociación de 0,21 x 10-5 s-1, mientras
25 que el valor correspondiente para Fab fue 1,96 x 10-5 s-1, que indica que los efectos de re-unión y afinidad influyen en la constante de disociación de IgGl,K (dando una mayor constante de afinidad). Estos artefactos se eliminaron con el uso de Fab en lugar de IgG1,K intacta.
El análisis de la interacción a la temperatura fisiológica de 37ºC con respecto a 25ºC (temperatura ambiente) mostró
30 que las constantes de velocidad están adicionalmente afectadas, conduciendo a constantes de afinidad relativamente menores, para tanto IgG1,k como Fab. La constante de afinidad de Fab a 37ºC se corresponde con la afinidad real de cada sitio de unión a temperatura fisiológica.
La semivida (es decir, el tiempo necesario para que se disocie el 50% del complejo) se redujo al 50% a 37ºC. Esto 35 es una aproximación de la semivida biológica real a temperaturas fisiológicas.
A menos que se establezca de otro modo, el hibridoma derivado del anticuerpo 10F8 se ha usado en los siguientes ejemplos.
40 Ejemplo 5 Unión de HuMab 10F8 a IL-8 nativa sin reaccionar de forma cruzada con otras quimiocinas CXC
La posible reactividad cruzada del clon de HuMab 10F8 hacia otras quimiocinas se evaluó por ELISA. Brevemente, placas de ELISA de microtítulo (Greiner, Alemania) se recubrieron durante la noche a temperatura ambiente (TA) con 1 μg/ml de GRO-a recombinante humana (rh), rh-GRO-�, rh-IP-10, la forma de 72 aa de rh-IL-8 que se deriva de 45 monocitos (IL-8M o IL-SMpepretech) o la forma de 77 aa de rh-IL-8 77 (IL-8E) que se deriva de células endoteliales, 100 μl por pocillo. Las placas se lavaron dos veces con PBST (solución salina tamponada con fosfato complementada con 0,05% v/v de Tween-20 (Fischer Scientific, EE.UU.)) y los pocillos se bloquearon con 100 μl/pocillo de PBSTC (PBST más 2% v/v de suero de pollo) durante 1 hora, TA. Después, los pocillos se incubaron durante 1 hora, TA, bajo condiciones de agitación con el clon de HuMab-IL-8 10F8, 20 μg/ml diluido 1:3 en PBSTC. 50 Posteriormente, los pocillos se lavaron tres veces con PBST y se incubaron con tanto fragmentos F(ab')2 de conejo dirigidos contra IgG de ratón conjugada con HRP (Jackson; diluido 1:3000 en PBSTC) o F(ab')2 de conejo dirigido
contra IgG humana conjugada con HRP (DAKO, Dinamarca; diluido 1:2000 en PBSTC) para la detección de anticuerpos de ratón o humanos, respectivamente. Las placas se lavaron tres veces con PBST y los ensayos se revelaron con disolución ABTS recientemente preparada (1 mg/ml) (ABTS: ácido 2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6sulfónico; 2 pastillas de 5 mg en 10 ml de tampón ABTS, Boehringer Mannheim, Alemania) durante 30 minutos a TA en la oscuridad. La absorbancia se midió a 405 nm en un lector de placas de ELISA (Biotek Instruments Inc., Winochi, EE.UU.). Los resultados mostrados en la Figura 6 son representativos de tres experimentos realizados. Como parece, HuMab 10F8 se une tanto a IL-8 humana derivada de células endoteliales como a IL-8 humana derivada de monocitos. Sin embargo, no reacciona de forma cruzada con las quimiocinas GRO-a, GRO-� o IP-10.
Ejemplo 6 Inhibición de la unión de IL-8 a IL-8R en neutrófilos
La capacidad de HuMab 10F8 para inhibir la unión de IL-8 radiomarcada a receptores de IL-8 (CXCR1 y CXCR2) sobre neutrófilos se evaluó del siguiente modo:
Los neutrófilos se enriquecieron a partir de sangre completa heparinizada de voluntarios normales. La sangre se estratificó sobre Ficoll-Hypaque y se centrifugó a 1500 rpm durante 30 minutos. La capa de células mononucleares se eliminó, y los eritrocitos se lisaron hipotónicamente. Los neutrófilos resultantes se resuspendieron en PBS que contenía 0,1% de BSA y 0,02% de azida de Na (0,1% de PBA) y se mantuvieron sobre hielo. El ensayo de unión de IL-8 se realizó como se describe previamente (Yang y col., (1999) J. Leukoc. Biol. 66:401-410). Brevemente, en un volumen final de 150 μl, 4 x 105 neutrófilos se incubaron durante 1,5-3 horas sobre hielo con [125I]-IL-8 recombinante humana 0,25 nM (Amersham Life Sciences, Piscataway, NJ) junto con concentraciones variables de 10F8 (derivado de hibridoma), 10F8 (derivado de transfectoma), mAb de ratón anti-IL-8 humana 6712.111, R & D Systems, y anticuerpo de control. Todas las incubaciones se realizaron en placas de filtro Multiscreen de 96 pocillos (Millipore, Bedford, MA). Las placas se lavaron exhaustivamente con 0,1% de PBA frío y los filtros se contaron en un contador gamma Wallac. Los resultados se muestran en las Figuras 7A y 7B, expresados como medias de triplicados o cuadruplicados. La inhibición de unión se expresa como porcentaje de anticuerpo de control.
Como se muestra en las Figuras 7A y 7B, HuMab 10F8 inhibió la unión de IL-8 marcada a neutrófilos de un modo dependiente de la dosis. El anticuerpo anti-IL-8 murino también pudo inhibir la unión de IL-8 marcada a neutrófilos de un modo dependiente de la dosis, pero 10F8 fue coherentemente más potente que el anticuerpo murino en la inhibición de la unión de IL-8 a neutrófilos. En el experimento mostrado en la Figura 7B, las CI50 de 10F8 (derivado de hibridoma) (10F8 H) y 10F8 (derivado de transfectoma) (10F8 T) fueron 0,19 nM y 0,30 nM, respectivamente.
En conjunto, los resultados anteriores demuestran que HuMab 10F8 inhibe la unión de IL-8 a sus receptores de un modo dependiente de la dosis, y puede inhibir esta unión a concentraciones menores que un anticuerpo anti-IL-8 murino comercialmente disponible.
Ejemplo 7 Inhibición de quimiotaxia de neutrófilos mediada por IL-8
La capacidad de HuMab 10F8 y un anticuerpo anti-IL-8 murino (MAb 6217.111, R & D Systems) para inhibir la migración de neutrófilos inducida por IL-8 se evaluó utilizando un ensayo de quimiotaxia.
Los neutrófilos se incubaron en una cámara de una placa Transwell. La IL-8 (rhIL-8) se incubó con concentraciones variables de HuMab 10F8, MAb murino anti-IL-8 y un anticuerpo de control en la otra cámara de la placa Transwell. El ensayo se incubó a 37ºC durante dos horas, y se cuantificó la migración de células.
Los datos representados en la Figura 8A muestran que la quimiotaxia de neutrófilos se inhibió de un modo dependiente de la dosis por HuMab 10F8 y también por el anticuerpo murino específico para IL-8. El anticuerpo de control no inhibió la quimiotaxia. Estos datos demuestran que HuMab 10F8 pueden inhibir la migración de neutrófilos, una función importante de IL-8 in vivo.
Además, se estudió la capacidad de HuMab 10F8 para inhibir la transmigración de neutrófilos humanos hacia IL-8 humana utilizando una cámara de Boyden.
La IL-8 humana (10-8 M) se incubó con concentraciones variables de HuMab 10F8 en el compartimento inferior de la cámara de Boyden. Los neutrófilos (4 x 105 células) se incubaron en el compartimento superior. El ensayo se incubó a 37ºC durante 1 hora, y se cuantificó la migración de células.
Los datos representados en la Figura 8B muestran que la quimiotaxia de neutrófilos se inhibió de un modo dependiente de la dosis por HuMab 10F8. Estos datos también demuestran que HuMab 10F8 pueden inhibir la migración de neutrófilos, una función importante de IL-8 in vivo.
Ejemplo 8 Cambio de la expresión de moléculas de adhesión inducida por IL-8 sobre neutrófilos
Los neutrófilos humanos muestran un aumento en la expresión de CD11b (Mac-1) y una disminución en la expresión de L-selectina (CD62L) cuando se estimulan con IL-8. La capacidad de 10F8 para inhibir los cambios inducidos por IL-8 en la expresión de moléculas de adhesión sobre PMN se estudió por citometría de flujo. Brevemente, 100 μl de sangre completa diluida 1:5 se incubó con diluciones seriadas de 10F8 (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3 12, 0 μg/ml) en ausencia o presencia de 25 ng/ml de IL-8 recombinante humana (rh-IL-8, 72 aa, Peprotech) en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos, a un volumen final de 200 μl por pocillo, durante 2 horas a 37ºC y 5% de CO2. Después, las células se centrifugaron y el sobrenadante se almacenó a -20ºC hasta la posterior evaluación de la presencia de lactoferrina. Las células se repusieron con 200 μl de tampón de FACS frío (PBS, complementado con 0,02% (v/v) de azida y 0,1% (peso/volumen) de BSA) y se lavaron dos veces con 200 μl de tampón de FACS frío. Las células se centrifugaron y se incubaron con 1,5 mg/ml de anti-CD11b humano de ratón conjugado con PE (BectonDickinson) y 1,5 mg/ml de anti-CD62L humano de ratón conjugado con FITC (Becton Dickinson) a un volumen final de 20 μl por pocillo durante 30 minutos a 4ºC en la oscuridad. Después, los eritrocitos se lisaron con tampón de lisis de FACS según el protocolo del fabricante (kit de disolución FACSlysing, Becton Dickinson, cat nº 349202). Posteriormente, las células se lavaron con tampón de FACS frío. La intensidad de fluorescencia de las células se analizó por citometría de flujo (FACS Calibur, Becton Dickinson) usando el software Cell Quest.
La estimulación de PMN con IL-8 produjo una expresión alterada de moléculas de adhesión, por ejemplo, un potenciamiento de la expresión de CD11b y una disminución de la expresión de CD62L debido a la eliminación de la molécula. La expresión inicial media de CD116 sobre PMN fue 1538 ± 37 (n=3) IFM (intensidad de fluorescencia media, una medición del número de moléculas por célula) y la expresión de CD11b se reguló por incremento a 2341 ± 274 unidades después de la estimulación de células con 25 ng/ml de IL-8. La expresión de referencia de CD62L fue 274 ± 24 (n=3) IFM y la expresión de CD62L se reguló por disminución a 176 ± 60 unidades después de la adición de 25 ng/ml de IL-8. En el presente estudio se demostró que 10F8 puede inhibir estos cambios inducidos por IL-8 en la expresión de las moléculas de la superficie celular. La expresión de la superficie celular de CD11b, además de CD62L, se midió por citometría de flujo después de la estimulación de células con 25 ng/ml de IL-8 sola
o en presencia de 10F8 o un anticuerpo de control irrelevante. La Figura 9A muestra la expresión de CD62L sobre PMN estimulados con IL-8. En presencia de un anticuerpo de control de isotipo irrelevante (asteriscos), la IFM sobre estos PMN estimulados fluctuó aproximadamente 150, que indica que este anticuerpo no bloquea la activación de PMN mediados por IL-8. Sin embargo, cuando las células se estimularon con IL-8 en presencia de concentraciones crecientes de 10F8 (cuadrados rellenos), se observó una eliminación reducida de CD62L mediada por IL-8 de un modo dependiente de la dosis, indicativo de una inhibición de la activación inducida por células IL-8 por 10F8. De acuerdo con esto, 10F8 (cuadrados rellenos) redujo la regulación por incremento de CD11b mediada por IL-8, mientras que un anticuerpo de control de isotipo irrelevante (asteriscos) fracasó en mostrar un efecto, es decir, el nivel de expresión de CD11b siguió sin estar afectado (IFM aproximadamente 2400) (n=3; Figura 9B). Las concentraciones crecientes de 10F8 guardaron relación con menor expresión de CD11b, demostrando claramente un efecto inhibidor de 10F8 sobre la activación de PMN por IL-8.
En resumen, los resultados mostrados en las Figuras 9A y 9B demuestran que HuMab 10F8 puede inhibir: a) el aumento de la expresión de CD11b sobre neutrófilos que está mediada por IL-8; b) la eliminación de L-selectina (CD62L) sobre la superficie de neutrófilos que está mediada por IL-8.
Ejemplo 9 IL-8 presente en material de pustulosis palmoplantar (PPP)
Se obtuvo material estéril de ampollas de pacientes con PPP (ampolla de ppp), pacientes con eccema o voluntarios sanos. Además, los pacientes y los controles sanos proporcionaron material de prueba envolviendo los pies o las manos en una lámina que contenía 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los pies o las manos envueltos se colocaron en un baño de agua a 37ºC para facilitar la difusión del contenido de las ampollas en PBS (baño de agua de ppp). Los materiales de las ampollas o los materiales del baño de agua se analizaron para la presencia de quimiocinas CXC o factor C5a de complemento por ELISA disponibles comerciales (IL-8: Pelikine Compact™, CLB, Amsterdam, Los Países bajos; o IL-8: kit de IL-8 humana Quantikine®, kit de R&D; GRO-a: kit de GRO-a humana Quantikine®, R&D Systems; ENA-78: kit de ENA-78 Quantikine®, R&D Systems; kit de C5a, Opteia, BD-Pharmingen). Se usó suero humano normal como control negativo. Los ELISA se realizaron según los protocolos del fabricante.
Los datos representados en la Figura 10 muestran que la IL-8 está presente en material del paciente obtenido de ampollas y del material del baño de agua, mientras que la IL-8 no pudo demostrarse en suero normal de un voluntario sano. La IL-8 se midió en dos ocasiones separadas y se demostró que el contenido de IL-8 en el material del paciente no disminuyó con el tiempo. GRO-a también estaba presente en los materiales del paciente, aunque a un menor grado. La quimiocina CXC ENA-78 no pudo demostrarse en ninguno de los materiales obtenidos.
La Tabla 3 muestra que la IL-8 está presente en pacientes con PPP, mientras que la IL-8 fue indetectable en el material del baño de agua obtenido de un paciente con eccema o control sano. GRO-a también estaba presente en material de pacientes con PPP, aunque a un menor grado. Las muestras se midieron en 3 ocasiones separadas y se demostró que el contenido de IL-8 o GRO-a en el material del paciente no disminuyó en el tiempo y no se degradó por la presencia de proteasas.
Tabla 3
Muestra nº
μg/ml IL-8 EEM n μg/ml GRO-a EEM n
Nº 1 - Líquido de pústulas (ppp)
17 3 3 2 0 1
Nº 2 - Líquido de pústulas (ppp)
517 213 3 39 8 2
Nº 3 - Líquido de lavado de los pies (ppp)
52 2 3 21 4 2
Nº 4 - Líquido de lavado de los pies (ppp)
15 3 3 42 6 2
Nº 5 - Líquido de lavado de los pies (ppp)
15 4 3 45 1 2
Nº 6 - Líquido de lavado de las manos (eccema)
0 0 3 0 0 2
Nº 7 - Líquido de lavado de las manos (control)
0 0 3 0 0 2
Nº 8 - Líquido de pústulas (ppp)
32 16 2 2 0 1
Nº 9 - Líquido de lavado de los pies (ppp)
45 13 2 32 13 3
La Figura 11 muestra los resultados de la medición de quimiocinas presentes en el líquido de agua de los pies obtenido de controles sanos (n=6), pacientes con eccema (n=6) o pacientes con PPP (n=6). El análisis se realizó en 5 datos transformados logarítmicamente por ANOVA unilateral con la prueba de Tukey. P< 0,05 se consideró significativamente diferente.
Tanto los pacientes con eccema como con PPP muestran un aumento significativo de IL-8 y GRO-a con respecto a los controles sanos. La comparación de los pacientes con eccema y con PPP muestra que la cantidad de IL-8 es
10 significativamente diferente entre pacientes con eccema y con PPP (P < 0,05), mientras que la cantidad de GRO-a no es significativamente diferente entre los dos grupos (P > 0,05). Además, se midió la cantidad de C5a y, aunque algunas muestras mostraron un aumento de la cantidad de C5a (presente tanto en los grupos de PPP como de eccema), no pudieron observarse diferencias significativas con el grupo de control.
15 Estos datos subrayan la presencia de L-8 en material obtenido de pacientes con PPP y proporcionan una exposición razonada para usar un anticuerpo anti-IL-8 como agente terapéutico en esta enfermedad.
Equivalentes
20 Aquellos expertos en la materia reconocerán, o podrán determinar usando nada más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descritas en este documento. Tales equivalentes pretenden englobarse por las siguientes reivindicaciones. También se contempla que cualquier combinación de las realizaciones desveladas en las reivindicaciones dependientes está dentro del alcance de la invención.
25 LISTA DE SECUENCIAS
<110> Mederax, Inc., y col.
<120> ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS CONTRA INTERLEUCINA 8 (IL-8) 30 <130> MXI-278PC
<150> 60/433.728
<151> 16/12/2002
<160> 45
<170> FastSEQ para Windows version 4.0 35 <210> 1
<211> 381
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> 40 <221> CDS
<222> (1)...(381)
<400> 1
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 408
<212> ADN
<213> Homo sapiens 15 <220>
<221> CDS
<222> (1)...(408)
<400> 3
<210> 4
<211> 136
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 287
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 322
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 6
10 <210> 7
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7 15
<210> 8
<211> 107
<212> PRT 20 <213> Homo sapiens
<400> 8
25 <210> 9
<211> 342
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 9 30
<210> 10
<211> 352
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15 <400> 11
<210> 12 20 <211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 36
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 13 agggccagtc agagtattag cagcagctac ttagcc 36
<210> 14
<211> 21
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 14 ggtccatcca gcagggccac t 21
<210> 15
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 15 cagcagtatg ctggctcact cact 24
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
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<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
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<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 15
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 19 15 cactatggca tgtac 15
<210> 20
<211> 51
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 20 gttatatggt atgatggaag ttatgaatac aatgcagact ccgtgaaggg c
<210> 21
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 21 gatagggtgg ggctctttga ctac 24
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
<210> 25
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 25 caggtkcagc tggtgcagtc 20
<210> 26
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 26 saggtgcagc tgktggagtc 20
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 27 gaggtgcagc tggtgcagtc 20
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<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 28 atggactgga cctggagcat c 21
<210> 29
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 29 atggaattgg ggctgagctg 20
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<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 30 atggagtttg grctgagctg
<210> 31
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 31 atgaaacacc tgtggttctt c
<210> 32
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 32 atggggtcaa ccgccatcct
<210> 33
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 33 tgccaggggg aagaccgatg g
<210> 34
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 34 racatccaga tgayccagtc
<210> 35
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 35 gycatcyrga tgacccagtc
<210> 36
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 36 gatattgtga tgacccagac
<210> 37
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 37 gaaattgtgt tgacrcagtc
<210> 38
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 38
gaaatwgtra tgacacagtc
20
<210> 39
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 39
gatgttgtga tgacacagtc
20
<210> 40
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 40
gaaattgtgc tgactcagtc
20
<210> 41
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 41
cccgctcagc tcctggggct cctg
24
<210> 42
<211> 23
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 42
ccctgctcag ctcctggggc tgc
23
<210> 43
<211> 26
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 43
cccagcgcag cttctcttcc tcctgc
26
<210> 44
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 44
atggaaccat ggaagcccca gcacagc
27
<210> 45
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> cebador
<400> 45
cgggaagatg aagacagatg
20

Claims (38)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a IL-8 humana que comprende las seis secuencias de CDR VLCDR1 de SEC ID Nº: 16, VLCDR2 de SEC ID Nº: 17, VLCDR3 de SEC ID Nº: 18, VHCDR1 de SEC ID Nº: 22, VHCDR2 de SEC ID Nº: 23 y VH CDR3 de SEC ID Nº: 24.
  2. 2.
    El anticuerpo de la reivindicación 1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable como se expone en SEC ID Nº: 12 y/o una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable como se expone en SEC ID Nº: 8.
  3. 3.
    El anticuerpo de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el anticuerpo se selecciona de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgA secretora, IgD y IgE.
  4. 4.
    El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es un isotipo IgG1,K o IgG1,A.
  5. 5.
    El anticuerpo de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo es un isotipo IgG4,K o IgG4,A.
  6. 6.
    El anticuerpo de la reivindicación 3 ó 4 que comprende una cadena pesada de IgG1 o IgG3.
  7. 7.
    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo tiene una o más de las siguientes características:
    (i)
    inhibe la unión de IL-8 a sus receptores (CXCR1 y CXCR2);
    (ii)
    inhibe los efectos proinflamatorios inducidos por IL-8;
    (iii) inhibe la actividad quimiotáctica inducida por IL-8 para neutrófilos;
    (iv)
    inhibe el flujo de calcio inducido por IL-8;
    (v)
    inhibe los cambios inducidos por IL-8 en los niveles de expresión de moléculas de adhesión o neutrófilos;
    (vi)
    inhibe el aumento de la expresión inducida por IL-8 de CD11b (Mac-1) e inhibe la disminución de la expresión inducida por IL-8 de L-selectina sobre neutrófilos;
    (vii) no reacciona de forma cruzada con quimiocinas relacionadas seleccionadas de GRO-a humana, GRO� humana, IP-10 humana y NAP-2 humana;
    (viii) inhibe significativamente la quimiotaxia inducida por líquidos biológicos que contienen múltiples factores quimiotácticos que incluyen IL-8.
  8. 8.
    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene una constante de equilibrio de disociación (KD) de aproximadamente 10-10 M o menos cuando se determina por tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un instrumento BIACORE 3000 usando IL-8 recombinante humana como analito y el anticuerpo como ligando.
  9. 9.
    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un anticuerpo intacto seleccionado de un anticuerpo IgG1 intacto, un anticuerpo IgG2 intacto, un anticuerpo IgG3 intacto, un anticuerpo IgG4 intacto, un anticuerpo IgGM intacto, un anticuerpo IgA1 intacto, un anticuerpo IgA2 intacto, un anticuerpo IgA secretor intacto, un anticuerpo IgD intacto y un anticuerpo IgE intacto, en el que el anticuerpo está glicosilado en una célula eucariota.
  10. 10.
    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario.
  11. 11.
    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que es una proteína de fusión de dominio de unióninmunoglobulina que comprende:
    (i)
    una región variable de la cadena pesada como se define en la reivindicación 2, una región variable de la cadena ligera como se define en la reivindicación 2 o una región variable de la cadena pesada como se define en la reivindicación 2 fusionada con una región variable de la cadena ligera como se define en la reivindicación 2 por un péptido ligador que está fusionado con un polipéptido de la región bisagra de la inmunoglobulina,
    (ii)
    una región constante CH2 de la cadena pesada de la inmunoglobulina fusionada con la región bisagra, y
    (iii) una región constante CH3 de la cadena pesada de la inmunoglobulina fusionada con la región constante CH2.
  12. 12.
    Un hibridoma que produce una cantidad detectable del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
  13. 13.
    El hibridoma de la reivindicación 12 que comprende un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico en el que los reordenamientos del segmento del gen V-(D)-J han producido la formación de un transgén de la cadena pesada humana funcional y un transgén de la cadena ligera funcional, fusionado con una célula
    inmortalizada.
  14. 14.
    El hibridoma de la reivindicación 12 ó 13, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano codificado por ácidos nucleicos de la cadena pesada de IgG1 humana y de la cadena ligera kappa humana.
  15. 15.
    Un animal no humano transgénico que expresa un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el animal no humano transgénico tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera humana.
  16. 16.
    Un transfectoma, una célula huésped eucariota o procariota o un animal no humano transgénico o planta que comprende ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada humana y una cadena ligera humana, o una línea celular tal como una línea celular CHO o NS/0, que produce una cantidad detectable del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
  17. 17.
    Un procedimiento de producción del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que comprende:
    inmunizar un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera humana con IL-8 humana o una célula que expresa IL-8 humana, de forma que los anticuerpos son producidos por linfocitos B del animal; aislar los linfocitos B del animal; fusionar los linfocitos B con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortales que secretan anticuerpos monoclonales humanos que se unen a IL-8 humana; y aislar los anticuerpos monoclonales humanos específicos para IL-8 humana del sobrenadante de cultivo del hibridoma, o de un derivado de transfectoma de tal hibridoma.
  18. 18.
    Una molécula biespecífica o multiespecífica que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y una especificidad de unión por una célula efectora humana tal como una especificidad de unión por un receptor de Fc receptor tal como un receptor de Fcy humano, por ejemplo, FcyRI, o un receptor de Fca humano, o un receptor de linfocitos T tal como CD3.
  19. 19.
    Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
  20. 20.
    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o el vector de expresión de la reivindicación 19 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  21. 21.
    Una composición farmacéutica de la reivindicación 20 que comprende además uno o más agentes terapéuticos adicionales.
  22. 22.
    La composición de la reivindicación 21, en el que el uno o más agentes adicionales se seleccionan de agentes para tratar un trastorno inflamatorio o hiperproliferativo de la piel, agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios y agentes quimioterapéuticos.
  23. 23.
    El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, un vector de expresión según la reivindicación 19
    o una composición farmacéutica según la reivindicación 20 para su uso en un procedimiento para inhibir efectos proinflamatorios inducidos por IL-8 en un sujeto.
  24. 24.
    Uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, de un vector de expresión según la reivindicación 19 o de una composición farmacéutica según la reivindicación 20 en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno inmunitario, autoinmunitario, inflamatorio o infeccioso mediado por IL-8 humana o que implica actividad de IL-8 humana o para tratar o prevenir cáncer.
  25. 25.
    El uso de la reivindicación 24, en el que el trastorno es:
    (i)
    un trastorno inflamatorio o hiperproliferativo de la piel seleccionado de PPP, psoriasis que incluye psoriasis en placas y psoriasis de tipo gotosa, enfermedades ampollosas de la piel tales como penfigoide ampolloso, dermatitis de contacto, eccema, dermatitis eritematosa y atópica;
    (ii)
    una enfermedad inmunitaria, autoinmunitaria o inflamatoria seleccionada de artritis psoriásica, esclerodermia y esclerosis sistémica, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lesión pulmonar aguda tal como síndrome disneico agudo o síndrome disneico del adulto, meningitis, encefalitis, uveítis, mieloma múltiple, glomerulonefritis, nefritis, asma, aterosclerosis, deficiencia de adhesión leucocitaria, esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjögren, diabetes juvenil, enfermedad de Reiter, enfermedad de Behcet, nefritis inmunocompleja, nefropatía por IgA, polineuropatías por IgM, trombocitopenias inmunomediadas tales como púrpura trombocitopénica idiopática aguda y púrpura trombocitopénica idiopática crónica, anemia hemolítica, miastenia grave, nefritis lúpica, lupus eritematoso, artritis reumatoide (RA), espondilitis anquilosante, pénfigo, enfermedad de Graves, tiroiditis de
    Hashimoto, vasculitis de vasos pequeños tales como granulomatosis de Wegener, síndrome de Omen, insuficiencia renal crónica, enfermedad tiroidea autoinmune, mononucleosis infecciosa aguda, VIH, enfermedades asociadas al virus del herpes, infecciones por virus humanos tales como resfriado como se produce por rinovirus humano, coronavirus, otros enterovirus, virus del herpes, virus de la gripe, virus paragripal, virus respiratorio sincitial o infección por adenovirus, neumonía bacteriana, heridas, septicemia, infarto cerebral/edema cerebral, lesión por isquemia-reperfusión y hepatitis C; o
    (iii) se selecciona de angeítis cerebral aislada, mononeuritis múltiple, infarto agudo de miocardio, miocarditis, pericarditis, endocarditis de Liebman-Sacks, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), alveolitis, bronquiolitis obliterante, fibrosis quística, aspergilosis alérgica, síndrome de Löffler, colangitis esclerosante, cistitis crónica, nefritis tubulointersticial, síndrome respiratorio agudo grave (SRAG), vasculitis de vasos grandes (incluyendo arteritis de células gigantes, polimialgia reumática y arteritis de Takayasu), vasculitis de vasos de tamaño medio (incluyendo poliarteritis nodosa, poliarteritis nodosa localizada y enfermedad de Kawasaki), vasculitis de vasos pequeños (incluyendo síndrome de Churg-Strauss, poliarteritis microscópica, vasculitis crioglobulinémica y angeítis leucocitoclástica), vasculitis secundaria (incluyendo vasculitis reumatoide y vasculitis asociada a lupus eritematoso sistémico o síndrome de Sjögren), sacroileítis aislada, el síndrome de SAPHO, discitis (incluyendo discitis posoperatoria), tiroiditis subaguda, penfigoide cicatricial, dermatitis herpetiforme, dermatosis pustulosa subcorneal, epidermolisis ampollosa adquirida, rosácea, dermatosis febril aguda, granuloma anular (incluyendo síndrome de Sweet), piodermia gangrenosa, acné (incluyendo acné conglobata), sarcoidosis, policondritis recurrente, fiebre mediterránea familiar, paniculitis, eritema nodoso, enfermedad de Weber-Christian, fibrosis retroperitoneal, osteoporosis, metástasis osteolíticas, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y cáncer de la vejiga urinaria.
  26. 26.
    El uso de la reivindicación 24, en el que el trastorno se selecciona de melanoma, carcinoma tiroideo, carcinoma de células transitorias, triquilemona, carcinoma de células escamosas y cáncer de mama.
  27. 27.
    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que dicho procedimiento comprende la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales tales como agentes para tratar un trastorno inflamatorio o hiperproliferativo de la piel, agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios o agentes quimioterapéuticos y opcionalmente comprende además la exposición a la luz del sol o fototerapia que incluye UVB (ultravioleta B de banda ancha y de banda estrecha), UVA (ultravioleta A) y PUVA (psoraleno-metoxaleno más ultravioleta A).
  28. 28.
    El procedimiento de la reivindicación 27, en el que el uno o más agentes adicionales se seleccionan de agentes para tratar un trastorno inflamatorio o hiperproliferativo de la piel seleccionado de medicaciones tópicas, orales o inyectadas.
  29. 29.
    El procedimiento de la reivindicación 28, en el que:
    -
    la medicación tópica se selecciona de alquitrán de hulla, vitamina A, antralina, calcipotrieno, tarazoteno y corticosteroides; o
    -
    la medicación oral o inyectada se selecciona de corticosteroides, metotrexato, retinoides, ciclosporina, etanercept, alefacept, efalizumab, 6-tioguanina, micofenolato mofetilo, tacrolimus (FK-506) e hidroxiurea.
  30. 30.
    El procedimiento de la reivindicación 29, en el que el retinoide es acitretina.
  31. 31.
    El procedimiento de la reivindicación 27, en el que el uno o más agentes adicionales se seleccionan de agentes que bloquean o interfieren con la función de receptores de quimiocinas CC o CXC, o agentes que bloquean la función de ligandos de quimiocinas.
  32. 32.
    El procedimiento de la reivindicación 31, en el que el agente que bloquea o interfiere con la función de receptores de quimiocinas CC o CXC se selecciona de un anticuerpo contra o un antagonista natural o sintético de CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2 o CCR5.
  33. 33.
    El procedimiento de la reivindicación 31, en el que el agente que bloquea la función de ligandos de quimiocinas se selecciona de un anticuerpo para MIP-1a, MIP-1�, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3 o MCP-4.
  34. 34.
    Un procedimiento para detectar la presencia de antígeno de IL-8 o una célula que expresa IL-8 en una muestra que comprende:
    poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y IL-8, y detectar la formación de un complejo en el que una diferencia en la formación del complejo entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa la presencia de IL-8 en la muestra.
  35. 35.
    Un kit para detectar la presencia de IL-8, o una célula que produce IL-8, en una muestra que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
  36. 36. El kit de la reivindicación 35, que comprende el anticuerpo en forma marcada. 5
  37. 37.
    Un anticuerpo antiidiotípico que se une a un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
  38. 38.
    Uso de un anticuerpo antiidiotípico de la reivindicación 37 para detectar el nivel de anticuerpo monoclonal
    humano contra IL-8 en una muestra. 10
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