KR20100021569A

KR20100021569A - Ｉｌ－２５에 대한 항체

Info

Publication number: KR20100021569A
Application number: KR1020097023939A
Authority: KR
Inventors: 앤드류 네일 제임스 맥켄지; 사라 발란틴
Original assignee: 메디칼 리서취 카운실
Priority date: 2007-04-18
Filing date: 2008-04-17
Publication date: 2010-02-25
Also published as: EP2144934A1; UA100377C2; GT200900271A; US8206717B2; BRPI0810418A2; NZ581178A; CY1118244T1; DK2144934T3; AU2008240436A1; LT2144934T; CN101711256B; PT2144934T; HN2009003038A; CO6260104A2; PL2144934T3; ES2604255T3; KR101605861B1; MX2009011234A; HRP20161548T1; EP2144934B1

Abstract

본 발명은 항체 2C3 및 인터루킨-25에 결합하는 2C3에 기초한 표적 결합 구성원을 제공한다. 이들은, 치료법, 예를 들어, 천식의 치료에 유용하다.

Description

ＩＬ－２５에 대한 항체{ANTIBODIES AGAINST IL-25}

발명의 분야

본 발명은 인터루킨 25(IL-25)에 대한 항체(이의 결합 단편을 포함)와 관련이 있다. 본 발명의 바람직한 구체예는 항체 2C3의 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 이용한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 각각 인간 VH 및 VL 프레임워크 영역내로 이식되는 본원에 개시된 VH 및 VL 도메인의 하나 이상의 CDR을 제공한다.

발명의 배경

천식은 기도의 흔한 만성 염증성 질환이다. 투병자들의 수는 최근 수십년에 걸쳐 급격하게 증가되었으며 세계 보건 기구는 전세계적으로 3억명의 사람들이 천식을 앓고 있는 것으로 평가하고 있다. 알레르기성 천식은 다양한 자극성 자극에 의해 유발된 조절불가능한 기도 과민반응(airways hyperresponsiveness, AHR)으로 특징지워지며 폐내의 타입-2 염증 침윤과 연관이 있다.

타입-2 사이토카인은 기생 연충(helminth) 감염에 대한 보호 면역력을 매개하고, B 세포 성장 및 IgE 분비와 같은 이펙터 기능을 조절하고, 배상세포의 과증식(goblet cell hyperplasia)과 관련 점액(mucus) 생산, 호산백혈구증가증(eosinophilia), 비만세포종(mastocytosis) 및 섬유증(fibrosis)을 유발하는데 중요한 역할을 한다(1). 천식에 있어서 상기 사이토카인을 치료학적 표적으로 만드는 것은 이들 이펙터 기능의 조절에 있어서 사이토카인에 의해 행해지는 중심적인 역할이다. 실제로, 이들 사이토카인이 과발현된 마우스 모델은 천식의 유의미한 특성들을 보여준다. 그런데 놀랍게도, 특이적인 타입-2 사이토카인을 차단함으로써 실험용 천식을 경감시키려는 노력은, IL-13을 억제시키는 것을 제외하면, 성공적이지 못한 것으로 증명되었다.

IL-13의 억제는, 비록 메커니즘은 여전히 불명확하지만, AHR과 기도 염증 둘 모두를 억제시킨다(2, 3). 그러나, 천식의 복잡한 병리생리학과 병인에 대한 빈약한 이해를 고려하면, 개별 경로들을 표적으로 삼는 것이 궁극적으로 치료학적으로 성공적인 것으로 입증될 것인지 여부는 불분명하다.

최근, 구조적으로 관련있는 IL-17 사이토카인 패밀리의 구성원인, IL-25/IL-17E의 과발현(8)이 생체내에서 타입-2 반응을 유도하며(4-6) 기도 효능제에 대한 반응성을 증가시키는 것으로 드러났다(7). Il25^-/- 마우스는 연충 기생충을 배출시키지 못하였다; 무익한 타입-2 반응의 중요 지시자(9, 10).

항체의 기본적인 구조는 당업계에 널리 공지되어 있다. 천연적으로 생성되는 항체는 일반적으로 4개의 폴리펩티드 쇄을 지닌다: 2개의 동일한 중쇄 및 2황화 결합에 의해 연결된 2개의 동일한 경쇄. 상기 중쇄 및 경쇄 각각은 불변 영역 및 가변 영역(또는 도메인)을 지닌다. 가변 영역은 주로 항원 결합에 관여한다. 각각의 가변 영역 내부에, 상보성-결정 영역(CDRs)으로 공지된, 3개의 하부영 역(subregion)이 항원과 접촉한다. 각각의 가변 도메인의 CDR들은 N-말단으로부터 C-말단으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 번호매겨진다. 상기 CDR의 N- 말단 및 C-말단 사이는 소위 4개의 프레임워크 영역인데, 항원과의 임의의 접촉은 매우 드물다. 항체의 구조에 관한 더 상세한 사항은, 참고문헌으로써 본원에 통합된, 하기 인용된 다수의 문헌들에 설명되어 있다.

발명의 교시

본 발명자들은 IL-25에 대한 항체를 생산하였고 IL-25에 대해 고 친화도 및 특이성을 지니면서 결합하는 항체 분자를 확인하였다. 인간과 마우스 IL-25는 80%의 서열 동일성을 공유하기 때문에, 마우스 또는 래트의 관용적인 면역화에 의해 유용한 항-IL-25 항체가 생성될 가능성은 없을 것으로 여겨졌는데, 그 이유는 유사도가 면역원성 에피토프의 수를 감소시킬 것이기 때문이다. 더욱이, 수용체-리간드 인터페이스는 가장 높은 보존도를 나타내고 그로 인해 IL-25와 이의 수용체의 상호작용을 차단할 수 있는 항체의 생성을 방해하는 것으로 여겨졌다. 이러한 문제점들을 극복하기 위해, 본 발명자들은 IL-25/IL-25R 인터페이스에 대해 유도되는 항체를 개발할 가능성을 증가시킬 것이라는 믿음을 가지고 IL-25 발현이 결여되게 조작된 마우스(IL-25^-/-)를 면역화시켰다.

이러한 접근법은 IL-25에 대한 항체를 생성시키는데 있어서 매우 성공적이었는데, 그 이유는 IL-25 그 자체가 체액성 면역 반응을 증가시키기 때문인 것으로 추정된다. 그러나, 이러한 접근법을 사용한다 하더라도, 스크리닝된 70개의 항체 중 단지 2개의 블록킹 항체만이 식별되었으며, 이들중 단지 하나만이 회수될 수 있었다.

관용적인 수단을 통해 효과적인 블록킹 항체의 생성을 막는 것으로 여겨진 뮤린과 인간 IL-25 사이의 유사도의 문제를 극복하였기 때문에, 이러한 서열 유사도는 마우스와 인간 IL-25가 이들의 수용체와 상호작용하는 것을 블록킹할 때 동일하게 유효한 항체의 생성을 가능케 할 수 있다고 여겨진다. 본 발명은 이제 실제 그러한 경우임을 제시한다.

IL-25에 대한 다른 항체가 존재하고 있지만, 본 발명은 IL-25 생체활성(bioactivity)을 차단할 수 있는 그러한 항체에 대한 최초의 입증인 것으로 믿어진다. 특히, 본 발명의 교시는 본 발명의 항체가 유익하며 예기치 못한 특성을 지닌다는 것, 특히 천식의 주요 증상인, 생체내 기도 과민반응을 예방 또는 감소시키는 항체의 활성을 지닌다는 것을 보여주는 뮤린 천식 모델에서 수행된 시험을 제공한다.

또한 가용성 IL-25R-Fc 융합 단백질의 투여가 타입-2 기도 염증을 감소시킨다는 것이 보고되었지만, 그 효과는 본원에 보고된 효과 보다 덜 현저하였으며 결정적으로 AHR은 평가되지 아니하였다(11). 본 발명자들은 여기서 IL-25가, 타입-2 사이토카인 매개 염증을 초기에 증강시키는 작용을 할 뿐만 아니라, 고전적인 타입-2 사이토카인과 독립적으로 AHR의 유도에 중요한 역할을 한다는 점에서, 기도 염증 및 AHR에 중요한 역할을 담당한다는 것을 입증한다. IL-25-의존성 AHR의 확인은 IL-25의 다운스트림에 존재하는 신규한 치료학적 표적을 확인할 가능성을 제공 한다. 현재, 본 발명자들은 IL-25가 기관지-수축(broncho-constriction)을 유도하기 위해 기도 평활근에 직접적으로 작용하거나 이의 효과가 루코트리엔과 같은 기존 기관지수축물질의 유도를 통해 매개되는지 여부를 알지 못한다. 그러나, IL-25의 이상(biphasic) 활성은 생체내 기도 염증의 억제 및 기도 과민증의 억제에 대한 탁월한 치료학적 표적이 되게 한다.

따라서, 본 발명은 신규한 항체, 더 일반적으로 항체 CDR 서열을 포함하는 표적 결합 구성원을 비롯한 천식과 같은 병태의 치료에 있어서의 표적 결합 구성원의 용도와 관련이 있다.

한 구체예에서, 본 발명은 IL-25에 결합하며 서열번호 7의 아미노산 서열을 지니는 VH CDR3를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 표적 결합 구성원을 제공한다. 상기 서열은 본 발명의 항체 2C3의 VH CDR3 서열이다.

더 구체적인 구체예에서, 본 발명의 표적 결합 구성원은 서열번호 5의 CDR1 및 서열번호 6의 CDR2와 함께 서열번호 7의 VH CDR3를 포함하는 VH 도메인이다.

VH 도메인은 인간 프레임워크 영역, 또는 서열번호 2로 제시된 프레임워크 영역을 지닐 수 있다.

VH 도메인은 본 발명의 VL 도메인, 예를 들어, 서열번호 8의 CDR1, 서열번호 9의 CDR2 및 서열번호 10의 CDR3를 지니는 VL 도메인과 쌍을 이룰 수 있다. 이들 CDR은 인간 프레임워크 영역을 지니는 VL 도메인내에 존재하거나 서열번호 4의 VL 도메인내에 존재할 수 있다.

따라서, 한 양상에서, 본 발명은 IL-25에 결합하고 2C3 VH 도메인(서열번호 2) 및/또는 2C3 VL 도메인(서열번호 4)을 포함하는 표적 결합 구성원을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 표적 결합 구성원을 엔코딩하는 분리된 핵산 및 본 발명의 표적 결합 구성원을 생산하기 위한 숙주 세포내에서 상기 핵산을 발현시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 천식을 포함하는, 질병의 치료를 위한, 예를 들어, 약제 조성물의 형태로, 본 발명의 표적 결합 구성원의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명의 이들 및 추가 양상은 아래에 더 상세하게 동반된 실시예들을 참조하여 기술되어 있다.

도면의 설명

도 1은 감작화 이전과 또한 천식 공격 진행중의 IL-25의 중화(neutralisation)를 보여준다. (A) OVA-감작화된 마우스의 메타콜린 민감도(sensitivity)를 마지막 에어로졸화된 항원 공격 1일 경과후 측정하였다. 데이터는 2회 실험으로부터 취합되고 14-18마리/그룹의 평균 ± SEM을 나타낸다. (*p<0.05 대 이소형 대조군, **p<0.01 대 이소형 대조군). (B) 폐 절편(Lung sections)을 짐사(giemsa)로 염색하고 혈관주위 침윤에 대해 점수매겼다(그룹 당 n=8). (C) 점액 함량을 폐 절편의 과요오드산 스키프(periodic acid Schiff, PAS) 염색으로 측정하였다(그룹 당 n=8). (D) 항원-특이적 혈청 IgE를 ELISA로 측정하고, OD 판독을 표준 혈청과 비교하여 임의 유닛(arbitrary units)으로 전환하였다(그룹 당 n=8). (E) BAL내의 호산구의 비율을 짐사로 염색한 사이토스 핀(cytospins)의 차등 세포 계수(differential cell counting)로 측정하였다(그룹 당 n=6). (F) 재자극시킨 종격동 림프절 세포로부터의 항원-유도 사이토카인 생산. 단백질 수준을 ELISA로 측정하였다(그룹 당 n=6). 기호들은 개별 동물들을 나타내고 평균은 막대로 제시된다. 데이터는 2회 이상의 독립된 실험들의 대표값이다. Sens = 감작화 이전에 투여된 항체, aero = 각각의 에어로졸 공격 4시간 전에 투여된 항체.

도 2는 오직 천식 공격 진행중의 IL-25의 중화를 보여준다. (A) OVA-감작화된 마우스의 메타콜린 민감도 마지막 에어로졸화된 항원 공격 1일 경과후 측정하였다. 데이터는 2회 실험으로부터 취합되고 14-18마리/그룹의 평균 ± SEM을 나타낸다. (*p<0.05 대 이소형 대조군, **p<0.01 대 이소형 대조군). (B) 폐 절편을 짐사로 염색하고 혈관주위 침윤에 대해 점수매겼다(그룹 당 n=8). (C) 점액 함량을 폐 절편의 과요오드산 스키프(PAS) 염색으로 측정하였다(그룹 당 n=8). (D) BAL내의 호산구의 비율을 짐사로 염색한 사이토스핀의 차등 세포 계수로 측정하였다(그룹 당 n=6). (E) 항원-특이적 혈청 IgE를 ELISA로 측정하고, OD 판독을 표준 혈청과 비교하여 임의 유닛(arbitrary units)으로 전환하였다(그룹 당 n=8). (F) 재자극시킨 종격동 림프절 세포로부터의 항원-유도 사이토카인 생산. 단백질 수준을 ELISA로 측정하였다(그룹 당 n=6). 기호들은 개별 동물들을 나타내고 평균은 막대로 제시된다. 데이터는 2회 이상의 독립된 실험들의 대표값이다. Sens = 감작화 이전에 투여된 항체, aero = 각각의 에어로졸 공격 4시간 전에 투여된 항체.

도 3은 무경험(naive) 마우스에 rmIL-25의 투여를 보여준다. 야생형(A), il13 ^-/- (B) 또는 il4 ^-/- il5 ^-/- il9 ^-/- il13 ^-/- (C) 마우스에 비강내로 1.8 ㎍ rIL-25 또는 PBS를 투여하였다. 메타콜린 민감도를 공격 16시간 후 측정하였다. *p<0.05 대 이소형 대조군, **p<0.01 대 이소형 대조군, 그룹 당 n = 4-8. 데이터는 2회 이상의 독립된 실험들의 대표값이다.

서열:

본 발명의 표적 결합 구성원은 하기 서열 식별 번호를 참조하여 본원에서 더 상세히 설명된다:

서열번호 1 2C3 VH 엔코딩 뉴클레오티드 서열

서열번호 2 2C3 VH 아미노산 서열

서열번호 3 2C3 VL 엔코딩 뉴클레오티드 서열

서열번호 4 2C3 VL 아미노산 서열

서열번호 5 2C3 VH CDR1 아미노산 서열

서열번호 6 2C3 VH CDR2 아미노산 서열

서열번호 7 2C3 VH CDR3 아미노산 서열

서열번호 8 2C3 VL CDR1 아미노산 서열

서열번호 9 2C3 VL CDR2 아미노산 서열

서열번호 10 2C3 VL CDR3 아미노산 서열

추가 서열은 첨부된 서열 목록에 제시되어 있다.

발명의 상세한 설명

표적 결합 구성원

이것은 서로에 대해 결합 특이성을 갖는 한쌍의 분자의 구성원을 의미한다. 특이 결합 쌍의 구성원은 천연적으로 유래되거나 전체로 또는 부분적으로 합성에 의해 생산될 수 있다. 상기 분자 쌍의 한 구성원은 이의 표면상에 영역, 또는 공동(cavity)을 지니며, 상기 분자 쌍의 다른 구성원의 특정 공간(spatial) 및 극성(polar) 구조(organisation)에 특이적으로 결합하고 그에 따라 상기 구조에 상보적이다. 따라서, 상기 쌍의 구성원들은 각자 서로에게 특이적으로 결합하는 특성을 지닌다. 특이 결합 쌍들의 유형에 대한 일예는 항원 항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이다.

본원은 항원 항체 유형의 반응과 관련이 있다. 따라서, 본 발명의 표적 결합 구성원은 적어도 소정 비율의 항체 분자, 더 특별하게는 그러한 분자의 항원-결합 도메인의 적어도 일부분을 포함할 것이다.

일반적으로, 항체의 중쇄 가변 영역(VH 도메인)은 항체의 항원에 대한 결합에 있어서 유의미한 역할을 한다. VH 도메인의 CDR3 영역은 CDR1과 CDR2 영역 보다 더 다양한 것으로 확인되었으며, 그에 따라 대부분의 항체에서 해당 항체의 표적에 대한 특이성을 제공한다. 따라서, 본 발명의 표적 결합 구성원은 2C3 항체의 VH CDR3 영역 주위 영역에 기초한다. 본 발명의 표적 결합 구성원은 2C3 항체의 VH 영역의 3개의 CDR 모두를 포함하는 것이 더 바람직하다.

본 발명의 CDR를 포함하는 표적 결합 구성원의 구조는 일반적으로, 상기 CDR이 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 엔코딩된 천연적으로 생성되는 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR에 상응하는 위치에 자리한, 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 요체 부분(substantial portion)일 것이다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 카바트 등의 문헌[Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services. 1987]과 이의 개정판을 참조하여 결정될 수 있다. 다수의 학문적 자료 및 상업적인 온-라인 자료가 이러한 데이터베이스에 관해 문의하는데 활용가능하다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Martin, A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133 및, 현재 인터넷 주소 http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html에서 가용한, 관련 온-라인 자료.

일반적으로, 표적 결합 구성원은 항체 항원 결합 도메인을 제공하기 위하여 VL 도메인과 쌍을 이룬 VH 도메인을 포함하는데, 아래에서 더 상세히 논의되겠지만, VH 도메인 단독으로 항원에 결합하는데 사용될 수 있다. 바람직한 한 구체예에서, 2C3 VH 도메인(서열번호 2)은 2C3 VL 도메인(서열번호 4)과 쌍을 이루고, 그래서 2C3 VH 및 VL 도메인 둘 모두를 포함하는 항체 항원 결합 부위가 형성된다. 다른 구체예에서, 2C3 VH는 2C3 VL 이외의 VL 도메인과 쌍을 이룬다.

경쇄 난잡성(promiscuity)은, 본원에서 더 상세히 논의된 것과 같이, 당업계에 잘 확립되어 있다.

본 발명에 따른 표적 결합 구성원은 2C3의 친화력과 실질적으로 유사한 친화력(예를 들어, ± 10%)으로 IL-25에 결합할 수 있다. 표적 결합 구성원은 일반적으로 IL-25에 특이적일 것이다. 따라서, 표적 결합 구성원은 이의 특이적 결합 파트너(들) 이외의 분자들에 임의의 유의미한 결합을 나타내지 아니할 것이다. 예를 들어, 2C3 항체가 IL-4, IL-5 및 IL-13과 교차-반응하지 아니하며 그에 따라 천식 및 유사 과정에 연루된 다른 사이토카인에 대한 그러한 교차-반응성의 회피가 본 발명의 표적 결합 구성원의 바람직한 특징임이 밝혀졌다.

전형적으로, 특이성은 항원 패널을 사용하는 ELISA와 같은 결합 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명에 따른 표적 결합 구성원은 IL-25를 인지하나, IL-17 패밀리의 다른 구성원들, 특히 IL-17A, IL-17B 및 IL-17C 중 임의의 하나; 더 바람직하게는 IL-17A, IL-17B 및 IL-17C 3개 모두를 인지하지 아니할 것이다. 본 발명에 따른 표적 결합 구성원과 IL-25의 결합은 재조합 IL-25와의 경쟁에 의해 파괴될 수 있다.

상이한 표적 결합 구성원의 결합 친화력 및 중화 능력은 적절한 조건하에서 비교될 수 있다.

항체 분자

이것은 천연 또는 부분 또는 전체로 합성에 의해 생산된 면역글로불린을 설명한다. 전체 항체의 단편은 결합 항원의 기능을 수행할 수 있는 것으로 드러났다. 따라서, 항체에 대한 참고문헌은 또한 항체 결합 단편을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 커버한다.

결합 단편의 일예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)); (v) 분리된 CDR 영역; (vi) F(ab')2 단편, 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가(bivalent) 단편; (vii) 단일 쇄 Fv 분자(scFv)(여기서 VH 도메인과 VL 도메인은 2개의 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 연결시키는 펩티드 링커에 의해 연결됨)(Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) 이특이적 단일 쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) "디아바디(diabody)", 유전자 융합으로 작제된 다가 또는 다특이적 단편(WO94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993)이다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결시키는 이황화결합 브릿지의 통합에 의해 안정화될 수 있다(Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디(minibodies)가 또한 제작될 수 있다(S. Hu et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996).

이특이적 항체가 사용되는 경우, 이들은 관용적인 이특이적 항체일 수 있으며, 이들은 다양한 방식으로 제조될 수 있는데(Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), 예를 들어, 화학적으로 제조되거나 하이브리드 하이브리도마로부터 유래하거나, 위에 언급된 이특이적 항체 단편들 중 임의의 단편일 수 있다. 디아바디 및 scFv는 항-이디오타입(항-idiotypic) 반응의 효과를 잠재적으로 감소시키면서, 가변 도메인만을 사용하여, Fc 영역 없이 작제될 수 있다.

이특이적 전체 항체와는 반대로, 이특이적 디아바디는 또한 특히 유용할 수 있는데, 그 이유는 이들이 대장균(E. coli)에서 용이하게 작제 및 발현될 수 있기 때문이다. 적절한 결합 특이성의 디아바디(및 많은 다른 폴리펩티드, 예컨대, 항체 단편)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이(WO94/13804)를 사용하여 용이하게 선택될 수 있다. 디아바디의 한 팔이, 예를 들어, IL-25에 대해 유도되는 특이성을 지니면서, 일정하게 유지되면, 이때 다른 팔이 변이된 라이브러리가 제작될 수 있고 적절한 특이성의 항체가 선택될 수 있다. 이특이적 전체 항체는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 조작에 의해 제조될 수 있다(J. B. B. Ridgeway et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

모노클로날 및 다른 항체를 획득하고 원래 항체의 특이성을 보유한 다른 항체 또는 키메라 분자를 생산하기 위해 재조합 DNA 기술의 기법들을 사용하는 것이 가능하다. 그러한 기법들은 항체의, 면역글로불린 가변 영역을 엔코딩하는 DNA, 또는 상보성 결정 영역(CDRs)을 상이한 면역글로불린의, 불변 영역, 또는 불변 영역 + 프레임워크 영역으로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187호, GB 2188638A호 또는 EP-A-239400호를 참조하라.

바람직하게는 CDR 영역이 인간 프레임워크 영역내로 이식된다. 인간 프레임워크 영역은 많은 방법, 예를 들어, 마우스 프레임워크 영역 또는 마우스 V 영역 서열을 공지의 인간 프레임워크 또는 V 영역 서열과 비교하고 아미노산 유사성 또는 동일성이 가장 높거나, 가장 높은 유사성 또는 동일성의 하나를 갖는 인간 프레임워크 영역을 선별함으로써 선별될 수 있다. 천연 인간 서열의 프레임워크 영역에 대한 변형은 그 결과 얻어진 CDR-이식 항체를 더 최적화시키기 위해 행해질 수 있다.

본 발명의 바람직한 양상에서, VH과 VL 도메인 쌍을 포함하는 항체 분자가 바람직할지라도, VH 또는 VL 도메인 서열 중 어느 하나에 기반한 단일 결합 도메인이 본 발명의 추가 양상을 구성한다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인은 특이적인 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있다는 것이 알려져 있다.

단일 쇄 결합 도메인들 중 어느 한 도메인에 있어서, 이들 도메인은, 본원의 하기에 더 상세히 논의된 바와 같이, IL-25에 결합할 수 있는 2-도메인 표적 결합 구성원을 형성할 수 있는 상보적인 도메인에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 항체 분자는 항체 불변 영역 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 이의 C-말단에서 인간 Cκ 또는 Cλ 쇄, 바람직하게는 Cλ 쇄를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기반한 표적 결합 구성원은 이의 C-말단에서 임의의 항체 이소형, 예를 들어, IgG, IgA, IgE 및 IgM으로부터 유래된 면역글로불린 중쇄의 전부 또는 일부에 부착될 수 있으며, 상기 이소형 서브-클래스 중 임의의 이소형, 특히, IgG1과 IgG4이 바람직하다. Fc 영역, 예컨대, WO99/58572호에 개시된 Δnab 및 Δnac가 사용될 수 있다.

또 다른 폴리펩티드에 융합된, 표적 결합 도메인을 포함하는 키메라 분자, 또는 등가물이 따라서 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694호 및 EP-A-0125023호에 기재되어 있다.

본 발명의 항체 분자의 프레임워크 영역은 또한 하나 이상의 당화 부위를 포함하는 당화 서열을 포함할 수 있다. 표적 결합 구성원이 발현되는 숙주 세포에 따라서, 당화 패턴을 달라질 수 있다. 그래서 당화 부위를 엔코딩하는 핵산 작제물은 상기 부위를 제거하기 위해 변형될 수 있거나 달리 그러한 부위가 당해 단백질내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 진핵생물 단백질의 N-당화 부위는 아미노산 트리플렛 Asn-X-Y에 의해 특징지워지며, 여기서 X는 Pro 이외의 아미노산이고 Y는 Ser 또는 Thr이다. 이들 트리플렛을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 적절한 치환, 부가 또는 결실은 Asn 측쇄에서 탄수화물 잔기의 부착을 막는 결과를 초래할 것이다. Asn이 다른 아미노산에 의해 대체되도록 선택된, 단일 뉴클레오티드의 변경은, 예를 들어, N-당화 부위를 불활성화시키는데 충분하다. 단백질내 N-당화 부위를 불활성화시키기 위한 공지의 절차는 미국 특허 제5,071,972호 및 EP 276,846호에 기재된 절차들을 포함한다.

항원-결합 도메인

이것은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 항원의 일부 또는 전부에 상보적인 영역을 포함하는 항체 분자의 부분을 의미한다. 항원이 거대한 경우, 항체는 단지 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있는데, 그러한 부분은 에피토프로 지칭된다. 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인(예를 들어, 소위 VH 도메인로 이루어진 Fd 항체 단편)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 도메인은 적어도 항체 경쇄 가변 영역(VL)의 요체 부분 및 적어도 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 요체 부분을 포함한다.

면역글로불린 가변 도메인의 요체 부분은 이들의 개입(intervening) 프레임워크 영역과 함께, 적어도 3개의 CDR 영역을 포함할 것이다. 바람직하게는, 상기 부분은 또한 제 1 및 제 4 프레임워크 영역 중 어느 하나 또는 둘 모두의 적어도 약 50%를 포함할 것인데, 상기 50%는 상기 제 1 프레임워크 영역의 C-말단 50%와 상기 제 4 프레임워크 영역의 N-말단 50%이다. 가변 도메인의 요체 부분의 N-말단부 또는 C-말단부의 추가 잔기들은 천연적으로 생성되는 가변 도메인 영역과 정상적으로 비관련된 잔기들일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 본 발명의 표적 결합 구성원의 작제는 클로닝 또는 다른 조작 단계들을 용이하게 하기 위해 도입된 링커에 의해 엔코딩된 N- 또는 C-말단 잔기의 도입을 야기시킬 수 있다. 다른 조작 단계들은 아래에서 더 상세하게 논의된 바와 같이 면역글로불린 중쇄, 다른 가변 도메인(예를 들어, 디아비디의 생산시) 또는 단백질 표지를 포함하는 추가 단백질 서열에 본 발명의 가변 도메인을 연결시키기 위해 링커의 도입을 포함한다.

포함하다(Comprise)

이것은 포함하다(include)의 의미로 일반적으로 사용되는데, 즉, 하나 이상의 특징 또는 성분의 존재를 허용한다는 의미이다.

분리된(Isolated)

이것은 본 발명의 표적 결합 구성원, 또는 그러한 결합 구성원을 엔코딩하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 따라 존재하는 상태를 지칭한다. 구성원 및 핵산은 이들이 천연적으로 결합된 물질, 예컨대, 이들의 천연 환경, 또는 시험관내 또는 생체내에서 실행되는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 때 마련되는(예를 들어, 세포 배양) 환경내에서 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 없거나 실질적으로 없을 것이다.

표적 결합 구성원 및 핵산은 희석제 또는 애주번트와 함께 제형화될 수 있고 여전히 실용적인 목적을 위해 분리될 수 있다-예를 들어, 당해 구성원은 만약 면역검정용 마이크로타이터 플레이트를 코팅하기 위해 사용되는 경우 젤라틴 또는 다른 담체와 일반적으로 혼합되거나, 진단 또는 치료법에 사용되는 경우 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다. 표적 결합 구성원은 천연적으로 또는 이종성 진핵생물 세포(예를 들어, CHO 또는 NS0 (ECACC 85110503) 세포)의 시스템에 의해 당화될 수 있거나, 이들은 비당화될 수 있다(예를 들어, 원핵생물 세포에서 발현에 의해 생산되는 경우).

표적 결합 구성원의 추가적인 특징.

항체 서열 이외에, 본 발명에 따른 표적 결합 구성원은, 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대, 폴딩된 도메인을 형성하거나, 항원에 결합하는 활성과 더불어 해당 분자에 또 다른 기능적 특징을 부여하기 위해, 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 표적 결합 구성원은 검출가능한 표지를 운반할 수 있거나, (예를 들어, 펩티딜 결합 또는 링커를 통해) 독소 또는 효소에 컨주게이션될 수 있다.

검출가능한 표지는 ¹³¹I 또는 ⁹⁹Tc와 같은 방사성표지를 포함하는데, 상기 방사성표지는 항체 이미지화 분야에서 공지된 관용적인 화학을 사용하여 본 발명의 항체에 부착될 수 있다. 표지는 또한 호스라디쉬 퍼옥시다제와 같은 효소 표지를 포함한다. 표지는 특이적 동족계 검출가능 모이어티(예를 들어, 표지된 아비딘)에 대한 결합을 통해 검출될 수 있는 비오틴과 같은 화학적 모이어티를 추가로 포함한다.

추가적인 특징이 폴리펩티드 도메인 또는 표지인 경우, 표적 결합 구성원은 재조합 기법에 의해, 예를 들어, 표적 결합 구성원과 추가 도메인의 융합체를 엔코딩하는 핵산의 발현에 의해 생산될 수 있다.

본 발명의 추가 표적 결합 구성원

서열 변이체

서열이 본 명세서에 제시되어 있고 IL-25에 대한 표적 결합 구성원으로 사용될 수 있는 VH와 VL 도메인 및 CDR의 변이체가 서열 변형 또는 돌연변이 및 스크리닝 방법을 사용하여 획득될 수 있다. 그러한 방법은 또한 본 발명에 의해 제공된다.

본 발명에 따른 표적 결합 구성원은 또한 항원에 결합하기 위해 상기 항원에 결합하는 임의의 표적 결합 항원과 경쟁하며 2C3의, 표적 결합 구성원, 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 도메인, 또는 VH CDR3, 또는 본원에 제시된 것과 실질적으로 서열이 동일한 상기한 것들중 임의의 것의 변이체를 포함하는 구성원일 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 양상은 IL-25에 결합하기 위해 2C3과 경쟁하는 인간 항체 항원-결합 부위를 포함하는 표적 결합 구성원을 제공한다. 결합 구성원들 사이의 경쟁은, 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프에 결합하는 표적 결합 구성원이 식별을 가능케하기 위해, 예를 들어, ELISA를 사용하고/거나 다른 비태깅된(untagged) 결합 구성원(들)의 존재시 검출될 수 있는 임의의 결합 구성원에 특이 리포터 분자를 태깅함으로써 시험관내에서 용이하게 검정될 수 있다.

IL-25에 대한 표적 결합 구성원이며 IL-25에 결합하기 위해 2C3과 경쟁할 수 있는 표적 결합 구성원을 획득하기 위한 다양한 방법이 당업계에서 가용하다.

서열이 본원에 특이적으로 개시된 VH와 VL 도메인 중 임의 도메인의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체가 논의된 바와 같이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변형(아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있는데, 그러한 변형은 약 20개 미만의 변형, 약 15개 미만의 변형, 약 10개 미만의 변형 또는 약 5개 미만의 변형, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 변형일 수 있다. 변형은 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다.

한 양상에서, 본원에 제시된 것과 실질적으로 동일한 CDR 아미노산 서열은 인간 가변 도메인의 CDR 또는 이의 요체 부분으로써 운반된다. 본원에 제시된 것과 실질적으로 동일한 VH CDR3 서열은 본 발명의 바람직한 구체예를 대표하며 이들 서열들 각각이 인간 중쇄 가변 도메인의 VH CDR3 또는 이의 요체 부분으로써 운반되는 것이 바람직하다.

"제시된 것과 실질적으로 동일한"은 본 발명의 적절한 CDR 또는 VH 또는 VL 도메인이 서열이 본원에 제시된 특정된 영역과 동일하거나 매우 유사할 것이라는 것을 의미한다. "매우 유사한"은 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 예컨대 1 내지 3개 또는 1개 또는 2개, 또는 3개 또는 4개의, 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인내에 이루어질 수 있다는 것으로 고려된다.

본 발명의 표적 결합 구성원의 서열 변이체는 전체 가변 도메인내에 돌연변이를 생성시키기위해 2C3 VH 및/또는 VL 유전자 중 어느 하나 또는 둘 모두의 무작위 돌연변이유발을 수행함으로써 생성될 수 있다. 그러한 기법은, 실수-유발(error-prone) PCR을 사용한, 그램 등의 문헌에 기재되어 있다(Gram et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:3576-3580).

사용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 대하여 돌연변이유발을 유도하는 것이다. 그러한 기법은 바르바스 등의 문헌(Barbas et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3809-3813) 및 쉬어 등의 문헌(Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551-567)에 소개되어 있다.

상기한 모든 기법들은 당업계에 공지된 대로 공지되어 있으며 이들 자체로 본 발명의 일부를 구성하는 것은 아니다. 당업계의 통상의 기술자는 당업계의 정규 방법학을 사용하여 본 발명이 표적 결합 구성원을 제공하기 위해 그러한 기법들을 사용할 수 있을 것이다.

따라서, 추가 양상에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 IL-25에 대한 항체를 수득하는 방법을 제공한다:

서열번호 2 또는 서열번호 4의 하나 이상의 CDR 서열을 지니는 표적 결합 구성원을 엔코딩하는 출발 핵산을 제공하는 단계;

상기 CDR 서열 또는 서열들을 변형시키기 위해 상기 핵산을 변형시키는 단계;

상기 변형된 표적 결합 구성원을 발현시키는 단계; 및

IL-25에 대한 결합에 관해 상기 변형된 표적 결합 구성원을 시험하는 단계.

바람직하게는 변형은 다양한 결합 친화력을 갖는 변형된 서열의 레퍼토리를 제공하기 위해 복수의 출발 핵산 분자에 대해 실행될 것이다.

한 양상에서, 출발 핵산은 서열번호 2 그 자체의 형태로 또는 또 다른 프레임워크 서열로 운반되는 형태로, 서열번호 2의 중쇄 CDR 3개 모두를 포함한다.

한 구체예에서, 변형은 단일 CDR, 예를 들어, CDR3에서 유도될 수 있거나, 변형은 동시적으로 2개 또는 3개의 CDR 영역에 유도될 수 있다.

CDR3-기반 표적 결합 구성원의 생산

본 발명에 사용된 가변 도메인은 임의의 생식선(germ-line) 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 획득될 수 있거나, 공지의 인간 가변 도메인의 컨센서스 서열에 기반한 합성 가변 도메인일 수 있다. 본 발명의 CDR 서열(예를 들어, CDR3)은 재조합 DNA 기술을 사용하여, CDR(특히 CDR3)이 결여된 가변 도메인의 레퍼토리내로 도입될 수 있다.

예를 들어, 마크 등(Marks et al., Bio/Technology, 1992, 10:779-783)은 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 생산하는 방법을 소개하고 있는데, 상기 방법에서 가변 도메인 영역의 5' 말단부 또는 이에 인접한 위치에 유도된 컨센서스 프라이머가 CDR3가 결여된 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공하기 위해 인간 VH 유전자의 제 3 프레임워크 영역에 컨센서스 프라이머를 연계시키는데 사용된다. 마크 등은 이 레퍼토리가 특정 항체의 CDR3와 어떻게 결합될 수 있는지에 대해 추가로 기술하고 있다. 유사한 기법들을 사용하여, 본 발명의 CDR3-유래 서열이 CDR3가 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 셔플링될 수 있으며, 셔플된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 동족계 VL 또는 VH 도메인과 결합되어 본 발명의 표적 결합 구성원을 제공할 수 있다. 레퍼토리는 이후 WO92/01047호의 파지 디스플레이 시스템과 같은 적당한 숙주 시스템에 디스플레이되어 적합한 표적 결합 구성원이 선택될 수 있게 만든다. 레퍼토리는 10⁴개 이상의 개별 구성원, 예를 들어, 10⁶ 내지 10⁸개 또는 10¹⁰개 구성원으로 이루어질 수 있다.

유사한 셔플링 또는 조합 기법들이 또한 스테머의 문헌(Stemmer, Nature, 1994, 370:389-391)에 의해 소개되어 있는데, 스테머는 β-락타마제 유전자와 관련하여 해당 기법을 기술하고 있으나 이 접근법은 항체의 제조에 사용될 수 있다는 것이 인정되고 있다.

따라서 본 발명의 추가 양상은, 하기 단계들을 포함하는, IL-25에 특이적인 표적 결합 구성원을 제조하는 방법을 제공한다:

(a) 대체될 CDR3를 포함하거나 CDR3 엔코딩 영역이 결여된 VH 도메인을 엔코딩하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하는 단계;

(b) VH 도메인을 엔코딩하는 핵산 생성물 레퍼토리를 제공하기 위하여, 상기 레퍼토리와 VH CDR3에 대해 본원에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 엔코딩하는 도너 핵산을 결합시키고, 이로써 상기 도너 핵산이 상기 레퍼토리내의 상기 핵산내로 삽입되는 단계;

(c) 상기 핵산 생성물 레퍼토리를 발현시키는 단계;

(d) IL-25에 특이적인 표적 결합 구성원을 선별하는 단계; 및

(e) 상기 표적 결합 구성원 또는 상기 구성원을 엔코딩하는 핵산을 회수하는 단계.

생성물 레퍼토리는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터로부터, VL 도메인과 함께 동시-발현될 수 있다. VL 도메인은 본 발명의 VL 도메인일 수 있거나 쇄 셔플링과 관련하여 하기한 것과 같이, 하나 이상의 상이한 VL 도메인일 수 있다.

유사한 방법이 사용될 수 있는데, 본 발명의 VL CDR3가 대체될 CDR3를 포함하거나 CDR3 엔코딩 영역이 결여된 VL 도메인을 엔코딩하는 핵산의 레퍼토리와 결합된다. 상기 방법에 따라, VL 생성물 레퍼토리는, 동일한 벡터 또는 상이한 벡터로부터, VH 도메인과 함께 동시-발현될 수 있다. VH 도메인은 본 발명의 VH 도메인일 수 있거나 쇄 셔플링과 관련하여 하기한 것과 같이, 하나 이상의 상이한 VH 도메인일 수 있다.

유사하게, 하나 이상, 또는 3개 CDR 모두가 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리내로 이식될 수 있고 이후 IL 25에 대해 특이적인 표적 결합 구성원 또는 표적 결합 구성원들에 대해 스크리닝된다.

이러한 방식으로 획득된 표적 결합 구성원은 본 발명의 추가 양상을 이룬다.

쇄 셔플링

본 발명의 추가 양상은 IL-25에 대한 항체-항원 결합 도메인을 획득하기 위한 방법을 제공하는데, 당해 방법은 (위에서 논의된 것과 같은 변이체를 포함하는) 본 발명의 표적 결합 구성원의 VH 도메인과 하나 이상의 VL 도메인을 조합하는 단계, 및 IL-25에 대한 항체-항원 결합 도메인의 VH/VL 조합물 또는 조합물들을 시험하는 단계를 포함한다.

상기 VL 도메인은 본원에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 지닐 수 있다.

유사한 방법이 본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체가 하나 이상의 VH 도메인과 조합하는데 사용될 수 있다.

이것은 소위 WO92/01047호에 개시된 것과 같은 계층적 이중 조합 접근법(hierarchical dual combinatorial approach)을 사용하여 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있는데, H 또는 L 쇄 클론 중 어느 하나를 함유하는 개별 콜로니가 나머지 쇄(L 또는 H)을 엔코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키기 위해 사용되며 그 결과 얻어진 2-쇄 표적 결합 구성원은 상기 참고문헌에 기재된 기법과 같은 파지 디스플레이 기법에 따라 선별된다.

따라서, 본 발명은 IL-25에 대한 항체 분자의 선별 방법을 제공하는데, 하기 단계들을 포함한다:

(a) IL-25에 결합하고 서열번호 7의 아미노산 서열을 지니는 VH CDR3를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는, 표적 결합 구성원을 구성하는 VH 도메인(VH domain comprising a target binding member)을 제공하는 단계;

(b) 항체 분자를 제공하기 위해 상기 VH 도메인과 복수의 항체 VL 도메인을 결합시키는 단계;

(c) IL-25에 대한 결합에 관해 상기 항체 분자를 스크리닝하는 단계; 및

(d) IL-25에 결합하는 항체 분자를 선별하는 단계.

VH 및 VL 도메인은 재조합 DNA, 특히, 파지 또는 파지미드 DNA에 의해 발현된 단백질의 형태로, 제공될 수 있다.

복수의 VL 도메인은 10⁴개 이상의 개별 도메인, 예를 들어, 10⁶ 내지 10⁸개 또는 10¹⁰개 도메인일 수 있다.

항체 분자, 및 그러한 분자를 엔코딩하는 핵산은 본 발명의 추가의 일부분을 이룰 수 있다.

IL-25

Il-25(IL-17E로도 당업계에서 불리움)는, 상업적인 공급원(예를 들어, R&D Systems, MN, USA)으로부터 구입가능하거나 당업계에서 가용한 IL-25의 서열을 참조하여 클로닝되거나 합성될 수 있다. 뮤린 IL-25(NCBI 단백질 NP_542767)는 후르스트 등의 문헌[Hurst et al, 2002 (하기 참고문헌 7 참조)]에 기재되어 있다. 인간 IL-25 (NCBI 단백질 Q9H293)는 포트 등의 문헌[Fort et al (하기 참고문헌 4 참조)]에 기재되어 있다. 항체의 생산 또는 면역검정에서 사용하는 경우, 재조합 IL-25의 단편이 사용될 수 있는데, 특히 N-말단에서 절단된(truncated) 단편이 사용될 수 있다. 예를 들어, 시중에서 입수가능한 재조합 인간 IL-25(IL-17E)는 Tyr 33 - Gly 177의 성숙한 단백질 서열(접근번호 Q9H293)을 포함하며 시중에서 입수가능한 뮤린 IL-25는 마우스 IL-17E의 잔기 Val 17 - Ala 169을 포함한다(접근번호 NP_542767).

핵산 및 벡터

추가 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 표적 결합 구성원, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 엔코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 및, 본 발명의 표적 결합 구성원, VH 도메인, 또는 VL 도메인을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 표적 결합 구성원, VH 도메인, 또는 VL 도메인의 생산을 여기시키는 조건하에서 상기 핵산을 발현시키는 단계, 및 상기 VH 도메인, 또는 VL 도메인을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양상은 핵산, 일반적으로, 본원에 개시된 VH CDR 또는 VL CDR 서열, 특히 서열번호 5, 6 및 7 중에서 선택된 VH CDR, 서열번호 8, 9 및 10 중에서 선택된 VL CDR, 가장 바람직하게는 2C3 VH CDR3(서열번호 7) 서열을 엔코딩하는, 분리된 핵산을 제공한다.

본 발명의 핵산은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 서열, 또는 이의 적절한 부분(예를 들어, CDR-엔코딩 영역)을 포함할 수 있다. 그러나, 코돈 사용빈도는, 예를 들어, 바람직한 숙주 세포에서 서열 발현을 최적화시키기 위해 달라질 수 있다.

본 발명은 추가로 본 발명의 표적 결합 구성원을 엔코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA와 RNA를 포함한다. 바람직한 양상에서, 본 발명은 위에 정의된 바와 같은 본 발명의 CDR 또는 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며 전체로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 본원에 제시된 것과 같은 뉴클레오티드 서열에 대한 레퍼런스는 특이화된 서열을 지니는 DNA 분자를 포함하며, 문맥에서 달리 요구하지 않는한, U가 T를 대체한 특이화된 서열을 지니는 RNA 분자를 포함한다.

본 발명은 또한 벡터를 제공하는데, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 예를 들어, 파지, 또는 파지미드, 코스미드, 상기한 핵산을 하나 이상 포함하는 전사 또는 발현 카세트의 형태로 제공한다.

프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인헨서 서열, 마커 유전자 및 적절한 다른 서열을 포함하는, 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택되거나 작제될 수 있다. 추가 세부내용에 대해서는, 예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

본 발명의 벡터는 또한 생체내에서 인간 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노부속바이러스 벡터를 포함한다. 그러한 벡터는 표적 결합 구성원의 생산 및 표적 결합 구성원의 인간 또는 동물 피검체의 전달을 제공하기 위해 상기 피검체의 세포내에서 본 발명의 표적 결합 구성원의 발현에 유용할 수 있다.

본 발명의 표적 결합 구성원을 엔코딩하는 핵산 서열은 한 양상에서 숙주 세포내에서 표적 결합 구성원의 발현을 유효하게 하기 위하여 프로모터에 작동가능하게 연결될 것이다. 서열은 이의 5' 말단에 숙주 세포내 및/또는 이로부터 표적 결합 구성원의 발현 및/또는 분비를 촉진시키기 위한 선도 서열을 포함할 수 있다. 다수의 적합한 선도 서열이 당업게에 공지된 것과 같이 공지되어 있으며 숙주 세포를 고려하여 당업계의 통상의 기술자에 의해 선택될 수 있다.

핵산 조작을 위한 다수의 공지된 기법들 및 프로토콜, 예를 들어, 핵산 작제물의 제조에 있어서, 돌연변이유발, 시퀀싱, DNA의 세포내 도입과 유전자 발현, 및 단백질의 분석이 하기 문헌에 상세하게 기재되어 있다: Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. 샘브룩의 문헌[Sambrook et al.]과 아우수벨의 문헌[Ausubel et al]의 교시는 참고문헌으로써 본원에 통합된다.

숙주 세포 및 표적 결합 구성원의 생산

추가 양상은 본 발명의 핵산(예를 들어, 벡터 형태의 핵산 서열)으로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

한 구체예에서, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예를 들어, 염색체)내로 통합된다. 통합은 표준 기법에 따라서, 게놈과의 재조합을 촉진시키는 서열의 통합에 의해 촉진될 수 있다.

아직 추가의 양상은 본 발명의 표적 결합 구성원의 생산 방법을 제공하는데, 당해 방법은 엔코딩하는 핵산으로부터 발현을 유발시키는 단계를 포함한다. 그러한 방법은 상기 표적 결합 구성원이 생산을 위한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

발현에 의한 생산후, VH 또는 VL 도메인, 또는 표적 결합 구성원은 임의의 적합한 기법을 사용하여 분리 및/또는 정제되고, 이후 적절한 때 사용될 수 있다. 생산 방법은 생성물의 분리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다.

생성물의 정제후, 표적 결합 구성원은 예를 들어, 단백질의 안정성 또는 생물학적 반감기를 변형, 예를 들어, 증가시키는 보호기를 도입하기 위해, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 그러한 효과를 달성하기 위한 단백질의 페길화(PEGylation)가 당업계에 공지되어 있고 본 발명의 표적 결합 구성원은 페길화된 형태로 존재할 수 있다.

생산 방법은 하나 이상의 추가 성분, 예컨대, 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로 상기 생성물을 제형화시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 상기한 바와 같이 하나 이상의 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 그 자체로 제공된 임의의 CDR, VH 또는 VL 도메인, 또는 표적 결합 구성원을 엔코딩하는 핵산은, 엔코딩된 생성물의 생산 방법이 그랬던 것과 같이, 본 발명의 양상을 이루는데, 상기 방법은 상기 엔코딩된 생성물을 위한 엔코딩 핵산으로부터의 발현 단계를 포함한다.

다양한 상이한 숙주 세포내에서 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템이 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 포유동물 세포, 효모 및 배큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종성 폴리펩티드의 발현을 위한 당업계에서 입수가능한 포유동물 세포주는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포 및 많은 기타 세포를 포함한다. 흔한, 바람직한 박테리아 숙주는 E. coli이다.

원핵생물 세포, 예컨대, E. coli내에서 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에 잘 확립되어 있다. 검토를 위해, 예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). 배양물 중의 진핵생물 세포에서의 발현이 또한 표적 결합 구성원의 생산을 위한 옵션으로써 당업계의 동상의 기술자에게 활용가능한데, 검토를 위해, 예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Ref, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.

조성물

따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물, 및 본 발명에 따른 용도를 위한 약학 조성물은 활성 성분 이외에, 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 버퍼, 안정화제 또는 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질은 무독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 간섭하지 아니하여야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정밀한 특성은 투여 경로에 좌우될 것인데, 그러한 경로는 경구, 또는 주사, 예를 들어, 정맥 주사일 수 있다.

표적 결합 구성원의 치료학적 제형은, 동결건조된 분말 또는 수성 용액의 형태로, 요망되는 순도를 지니는 표적 결합 구성원과 선택적인 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 혼합함으로써 저장용으로 제조될 수 있다(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins.). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 채용된 투여량 및 농도에서 수령체에게 무독하며 버퍼, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 잔기 미만의) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스라라진, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대, EDTA; 당 알코올, 예컨대, 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 카운터이온, 예컨대, 소디움; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 트윈(Tween), 플루로닉(Pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.

생체내 투여용으로 사용되는 표적 결합 구성원의 경우, 멸균되어야 한다. 멸균은 동결건조 및 재구성 이전 또는 이후에 멸균 여과 막을 통해 여과함으로써 용이하게 달성된다. 표적 결합 구성원은 보통 동결건조된 형태 또는 용액으로 저장될 것이다.

경구 투여용 약학 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예컨대, 젤라틴 또는 애주번트를 포함할 수 있다. 액체 약학 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대, 물, 석유(petroleum), 동물 또는 식물 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리학적 염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예컨대, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.

정맥 주사 또는 통증 부위에 주사의 경우, 활성 성분은 무-피로겐(pyrogen-free)이고 적당한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수성 용액의 형태일 수 것이다. 당업계의 통상의 기술자는, 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대, 소디움 클로라이드 주사, 링거 주사, 락테이트화된 링거 주사를 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 버퍼, 항산화제 및/또는 다른 첨가제는, 필요에 따라서, 포함될 수 있다.

본 발명의 치료학적 용도

본 발명은 IL-25에 대한 항체가 천식의 주요 증상인 생체내 기도 과민반응을 예방하거나 감소시키는데 효과적이라는 최초의 입증을 제공한다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 치료가 필요한 피검체(예를 들어, 인간)에서 기도 과민반응을 예방하거나 감소시키는 방법을 제공하는데, 당해 방법은 상기 피검체에게 IL-25에 결합하는, 표적 결합 구성원, 특히 항체 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 치료가 필요한 피검체에서 천식을 예방, 감소 또는 치료하는 방법을 제공하는데, 당해 방법은 상기 피검체에게 IL-25에 결합하는, 표적 결합 구성원, 특히 항체 분자를 투여하는 단계를 포함한다.

상기 방법은 IL-25가 소정 역할을 담당하는 다양한 질병 및 장애에 치료학적 효능을 지니면서, IL-25에 대한 결합에 유용하며 바람직하게는 IL 25의 길항 작용에 유용한, 본 발명에 따른 표적 결합 구성원(이의 조성물을 포함함)으로 실행된다. 상기 방법은 또한 첨부된 실시예에서 하기한 것과 같이 획득될 수 있는 IL-25에 결합하는 다른 표적 결합 구성원(이의 조성물을 포함함)으로 실행된다.

본 발명에 따른 표적 결합 구성원(이의 조성물을 포함함)은 인간 또는 동물 피검체에서 치료(예방적 치료를 포함함) 또는 진단 방법에서 사용될 수 있다. 그러한 치료 또는 진단 방법(예방적 치료를 포함할 수 있음)은 상기 피검체에게 유효량의 본 발명의 표적 결합 구성원을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 대표적인 질병 및 장애는 아래에서 상세하게 논의된다.

인간 또는 동물 피검체에게, 투여하기 위한 약제 제조에 있어서 본 발명의 표적 결합 구성원(이의 조성물을 포함함)의 용도가 또한 제공된다.

항-IL-25 표적 결합 구성원이 치료학적 혜택을 제공하기 위해 사용될 수 있는 임상적 징후(indications)는 IL-25가 병리학적 결과를 갖는 임의의 상태를 포함한다. 따라서, 일반적으로, 본 발명의 표적 결합 구성원은 원치 않는 Th-2 반응과 연관된 임의의 상태의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 표적 결합 구성원은 알레르기 및 천식, 특히 천식의 치료에 사용될 수 있다.

항-IL-25 치료제는 주사(예를 들어, 정맥으로) 또는 국소 전달 방법으로 주어질 수 있다. 항-IL-25는 유전자-매개 기술에 의해 전달될 수 있다. 대안적인 제형화 전략은 경구 또는 좌제 경로에 적합한 제조물을 제공할 수 있다. 투여 경로는 효능을 극대화시키거나 부작용을 최소화하기 위해 치료제의 물리화학적 특성, 질병에 관한 특별한 고려사항에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에 따라서, 제공된 조성물은 개체에 투여될 수 있다. 투여는 바람직하게는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되는데, 이것은 환자에게 혜택을 나타내기에 충분한 양이다. 그러한 혜택은 하나 이상의 증상의 적어도 완화일 수 있다. 투여되는 실제 양, 및 투여의 속도 및 시간-경과는 치료되어야 하는 것의 특성 및 극심도에 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투여량에 관한 결정 등은 일반적인 처방의 및 다른 의사의 책임에 속한다. 항체의 적절한 용량은 당업계에 잘 알려져 있다; 하기 문헌을 참조하라: Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922.

정확한 용량은 항체가 진단용인지 치료용인지 여부, 치료될 부위의 크기 및 위치, 항체의 정확한 특성(예를 들어, 전체 항체, 단편 또는 디아바디), 및 항체에 부착된 임의의 검출가능한 표지 또는 기타 분자의 특성을 포함하는, 다수의 인자들에 좌우될 것이다. 전형적인 항체 용량은 0.5mg - 1.0g 의 범위이내일 것이고, 이것은 정맥내로 볼루스(bolus)로서 투여될 수 있다. 투여의 다른 양상은, 유사한 총 축적 용량을 달성하기 위해, 수시간에 걸쳐 정맥내 주입을 포함한다. 이것은 성인 환자의 1회 치료를 위한 용량인데, 어린이와 유아에 대해 비율적으로 조정될 수 있으며, 또한 분자량에 비례하여 다른 항체 포맷으로 조정될 수 있다. 치료는 의사의 사리분별로, 매일, 1주에 2회, 매주 또는 매월 간격으로 반복될 수 있다.

투여의 추가 양상은 유치 장치(indwelling devices)의 사전코팅, 또는 달리 상기 장치내로의 통합을 포함하는데, 최적 항체양은 적절한 실험을 통해 결정될 것이다.

본 발명의 몇몇 바람직한 구체예에서 항체 분자는 단량체 단편, 예컨대, F(ab) 또는 scFv이다. 그러한 항체 단편은 비교적 짧은 반감기 및 더 적은 혈소판 활성화 위험의 이점을 가질 수 있는데, 혈소판 활성화는 수용체 클러스터화에 의해 유발될 수 있다. 혈소판 활성화를 야기시키는 클러스터화는, 예를 들어, IL-25 분자 또는 FcγRII 분자를 지니는 IL-25 중 어느 하나일 수 있다.

전체 항체가 사용되는 경우, 항체는 혈소판을 활성화시키고/거나 파괴할 수 없는 형태인 것이 바람직하다. IgG4 이소형 또는 대안적으로 IgG1 백본에서 유래된 "디자이너(designer)" 이소형(신규한 Fc 유전자 작제물(WO99/58572호, Clark, Armour, Williamson))이 바람직한 선택안이다. 더 작은 항체 단편, 예컨대, F(ab')₂가 사용될 수 있다. 또한, 이중 에피토프 특이성(예를 들어, scFv 2C3에 의해 인지되는 에피토프에 대한 특이성)을 지니는 전체 항체 또는 단편(예를 들어 F(ab')₂ 또는 디아바디)가 사용될 수 있다. 그러한 구체예가 수용체 클러스터화를 촉진할 수 있지만, 개별 수용체에 대한 높은 결합 속도는 이러한 문제를 배제시킬 수 있다.

본 발명의 표적 결합 구성원은 일반적으로 약학 조성물의 형태로 투여될 것인데, 표적 결합 구성원 이외에 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 표적 결합 구성원은 치료되는 상태에 의존하여 동시적으로 또는 순차적으로 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 다른 치료제는 적당한 용량의 진통약물(pain relief drugs), 예컨대, 비스테로이드계 항-염증 약물(예를 들어, 아스피린, 라라세타몰, 이부프로펜 또는 케토프로펜) 또는 오피에이트, 예컨대, 몰핀의 투여; 항-구토제의 투여; 또는 천식에 대하여 활성있는 하나 이상의 화합물, 일반적으로 기도 이완을 발생시키거나 점액 제거를 향상시키는 기관지확장제, 예를 들어, 베타-길항제(예를 들어, 살부타몰, 살메테롤), 디소디움 크로모글리케이트, 스테로이드 또는 PDEIV의 억제제의 투여를 포함할 수 있다.

검정 방법

본 발명은 본원에 제공된 것과 같은 표적 결합 구성원의 IL-25에 대한 결합을 초래하거나 가능하게 하는 방법을 제공한다. 언급된 대로, 그러한 결합은 생체내에서, 예를 들어, 표적 결합 구성원, 또는 표적 결합 구성원을 엔코딩하는 핵산의 투여후 일어날 수 있거나, 시험관내에서, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블랏팅, 면역-유세포분석, 면역-침전 또는 친화력 크로마토그래피에서 일어날 수 있다.

IL-25에 대한 표적 결합 구성원의 결합양은 결정될 수 있다. 정량은 진단학의 관심사가 될 수 있는 시험 샘플내의 항원의 양과 관련되어 있을 수 있다.

샘플에 대한 항체의 반응성은 임의의 적절한 수단에 의해 측정될 수 있다. 방사면역검정(Radioimmunoassay, RIA)이 가능한 수단이다. 방사성 표지된 항원이 비표지된 항원(시험 샘플)과 혼합되고 항체와 결합하게 된다. 결합된 항원은 비결합된 항원으로부터 물리적으로 분리되고 항체에 결합된 방사성 항원의 양이 측정된다. 항원이 시험 샘플내에 더 많이 존재하면 할수록, 방사성 항원은 항체에 더 적게 결합할 것이다. 경쟁적 결합 검정은 또한, 리포터 분자에 연결된 항원 또는 유사체를 사용하여, 비-방사성 항원과 함께 사용될 수 있다. 리포터 분자는 스펙트럼적으로 구별되는 흡수 또는 방출 특성을 지니는 형광발색단, 인광체 또는 레이저 염료일 수 있다. 적합한 형광발색단은 플루오레세인, 로다민, 피코에리쓰린 및 텍사스 레드(Texas Red)를 포함한다. 적당한 발색 염료는 디아미노벤지딘을 포함한다.

다른 리포터는 거대분자 콜로이드성 입자 또는 미립자화 물질, 예컨대, 채색된, 자상 또는 상자성 라텍스 비드, 및 눈으로 관찰되거나, 전자적으로 검출되거나 달리 기록되는 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 야기시킬 수 있는 생물학적 또는 화학석 활성제를 포함한다. 이들 분자는, 예를 들어, 색을 발달 또는 변화시키거나 전기적 특성에서 변화를 초래하는 반응을 촉매하는 효소일 수 있다. 이들은 분자적으로 여기될 수 있고, 이로써 에너시 상태들 간의 전자적 전이가 특징적인 스펙트럼 흡수 또는 방출을 야기시킬 수 있다. 이들은 바이오센서와 연계하여 사용되는 화학적 실체를 포함할 수 있다. 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙토아비딘 및 알카라인 포스파타제 검출 시스템이 사용될 수 있다.

개별 항체-리포터 컨주게이트에 의해 생성된 신호는 샘플(정상 및 시험)내에서 결합하는 적절한 항체의 정량가능한 절대 또는 상대적 데이터를 유도하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 경쟁 검정에서 항원 수준을 측정하기 위한 상기와 같은 표적 결합 구성원의 용도를 제공하는데, 즉 경쟁 검정에서 본 발명에 의해 제공된 것과 같은 표적 결합 구성원을 사용함으로써 샘플내 항원의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 이것은 비결합된 항원으로부터 결합된 항원의 물리적 분리가 요구되지 않는 경우일 수 있다. 물리적 또는 광학적 변화가 일어나도록 표적 결합 구성원에 리포터 분자를 연결시키는 것이 한 방법이 된다. 리포터 분자는 직접 또는 간접적으로 검출가능하며, 바람직하게는 측정가능한 신호를 생성시킬 수 있다. 리포터 분자의 연결은 직접 또는 간접적으로, 공유적으로, 예를 들어, 펩티드 결합을 통해서 또는 비공유적으로 이루어질 수 있다. 펩티드 결합을 통한 연결은 항체를 항체 및 리포터 분자를 엔코딩하는 유전자 융합물의 재조합 발현의 결과로서 이루어질 수 있다.

본 발명은 또한, 예를 들어, 바이오센서 시스템내에서 본 발명에 따른 표적 결합 구성원을 사용함으로써, 항원의 수준을 직접적으로 측정하는 방법을 제공한다.

결합을 측정하는 방식은 본 발명의 특징이 아니며 당업계의 통상의 기술자는 이들의 선호 및 일반적 지식에 따라서 적합한 방식을 선택할 수 있다.

본 발명은 임의의 표적 결합 구성원과 IL-25에 대한 결합을 위해 경쟁하는 표적 결합 구성원으로 더 확장되는데, 상기 표적 결합 구성원은 IL-25 항원에 결합하며 본원에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 지니는 CDR을 포함하는 V 도메인 또는 본원에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 지니는 V 도메인을 포함한다. 결합 구성원들 간의 경쟁은, 동일한 에피토프 또는 중첩되는 에피토프에 결합하는 표적 결합 구성원의 식별을 가능하도록 하기 위해, 시험관내에서, 예를 들어, 비태깅된 다른 결합 구성원(들)의 존재시에 검출될 수 있는 한 결합 구성원에 특이적 리포터 분자를 태깅함으로써 용이하게 검정될 수 있다. 경쟁은, 예를 들어, ELISA 또는 유세포분석기를 사용하여 측정될 수 있다.

경쟁 반응은 하나 이상의 표적 결합 구성원, 예컨대, 2C3의 유도체를 선별하는데 사용될 수 있는데, 상기 유도체는 하나 이상의 추가되거나 개선된 특성을 지닐 수 있다. 이것은, IL-25가 이의 미니-리간드로부터 용리되지 아니하나 항체 분자로부터 용리된다는 점을 제외하고는, 본 발명에 따른 2C3에 관한 선별 방법과 유사하다. 이것은 모 항체와 직접적으로 경쟁하는 훨씬 더 많은 비율의 딸 항체를 산출시켜야만 하므로 중요할 수 있다. 실제로, 선별되는 그러한 딸 항체는 모 항체보다 항원에 대한 훨씬 더 큰 친화력을 지닐 수 있다(파지당 하나 이상이 항체 분자의 디스플레이를 결과적으로 초래할 수 있는 결합력(avidity)에서의 증강을 가능케 함). 개선된 친화력의 "딸" 파지 항체를 선별하기 위한 현재의 방법들은 하기를 포함한다:

본래의 모 항체의 분리 상수 보다 더 낮은 (표지된) 표적 항원 농도를 사용;

호킨스 등의 문헌[Hawkins et al (1992)]에서 설명된 것과 같은 경쟁자로써 과량의 비표지된 표적 항원의 사용. 그러나, 이들 방법들은 "개선된" 항체가 모 항체와 동일한 에피토프를 디스플레이/점유해야만 함을 반드시 명시하고 있지 않다. 용리 단계의 포함은 모 항체를 정말로 대체하는 더 높은 비율의 딸 항체를 산출하여야 한다. 이러한 방식으로 선별된 딸 항체는 모 항체와 매우 유사한 에피토프에 결합할 수 있지만, 훨씬 더 큰 친화력으로 결합할 수 있다.

경쟁에 대한 시험시, 항원의 펩티드 단편, 특히 관심있는 에피토프를 포함하는 펩티드가 사용될 수 있다. 어느 한쪽 말단에 에피토프 서열과 더불어 하나 이상의 아미노산을 지니는 펩티드가 사용될 수 있다. 그러한 펩티드는 특이화된 서열로 "본질적으로 구성되어 있다"고 칭해질 수 있다. 본 발명에 따른 표적 결합 구성원은 항원에 대한 이들의 결합이 주어진 서열을 지니거나 상기 서열을 포함하는 펩티드에 의해 억제될 수 있다. 이에 대한 시험시, 어느 한 서열과 더불어 하나 이상의 아미노산을 지니는 펩티드가 사용될 수 있다.

특이 펩티드에 결합하는 표적 결합 구성원은 예를 들어 상기 펩티드(들)과 패닝됨으로써 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리될 수 있다.

실시예

본 발명의 양상 및 구체예는 이제 하기 실험을 참조하여 예시의 일환으로 설명될 것이다.

실시예 1: IL-25에 대한 항체의 생성

뮤린 IL-25(R&D Systems)에 대해 면역화된 il25^-/- 마우스에서 생성된, 항체의 거대 패널을 스크리닝하였다. 이들 항-IL-25 항체(2C3) 중 하나는 rmIL-25 과 가용성 mIL-25R-Fc 융합 단백질 사이의 상호작용을 용량 의존적으로 억제시키고 시험관내 생체검정에서 일차 마우스 비-B, 비-T 세포에 의한 IL-13의 IL-25-의존적 생산을 억제시키는 것으로 확인되었다. 상기 항체는 또한 hIL-25과 가용성 hIL-25R-Fc 융합체 사이의 상호작용을 억제시켰다. 이러한 특성의 조합을 천식의 치료에 유용성을 입증하기 위해 생체내 시스템에서 추가로 조사하였다.

실시예 2: 알레르기성 천식의 실험 모델

BALB/c 마우스를 에오로졸화된(aerosolised) OVA로 공격하기 전에, 제일 먼저 항원 알부민(OVA)로 감작화시켰다. 감작화되고 공격받은 BALB/c 마우스는 독특한 천식 표현형을 발달시켰다. PBS로 공격받은 대조군 BALB/c와 비교함으로써, 이 표현형을 자극제 메타콜린에 대한 노출후 증가된 AHR, 기도의 호산구(eosinophil) 침윤, 배상세포 과증식(goblet cell hyperplasia) 및 혈청 IgE 분비로 특성결정되었다(도 1).

대조적으로, OVA로의 각각의 감작화 및 에어로졸자극(aerosolization)에 앞서 항-IL-25 mAb의 대조 투여는, PBS 대조군 마우스에 필적할 수 있는 내성 값과 함께, 에어로졸화된 메타콜린으로 공격후 AHR에서 두드러진 폐기를 초래하였다(도 1A). 이소형-매칭된 대조군 mAb의 투여는 AHR을 억제시키지 못하였다(도 1A).

항-IL-25 mAb는 또한 폐 맥관구조 주위에 세포 침윤 수준, 기도내 배상세포 과증식 수준(도 1C 및 3B) 및 항원-특이적 혈청 IgE 수준(도 1D)을 유의미하게 감소시켰다.

기관지폐세포 세척(bronchoalveolar lavage, BAL) 분석은 호산구 침윤이 이소형-대조군 처치된 마우스와 비교할 때 항-IL-25 mAb 투여후 유의미하게 억제되었음을 입증하였다(도 1E). 타입-2 사이토카인은 이들 이펙터 기능을 조절하는 것으로 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 항원 재자극후 배수(draining) 종격동 림프절로부터 분리된 세포로부터 분비된 사이토카인의 수준을 측정하였다. BALB/c 마우스에서의 OVA 감작화 및 공격으로 유발된, 타입-2 사이토카인, IL-4, IL-5 및 IL-13의 상승된 수준과 대조적으로, 항-IL-25 mAb의 투여는 이들 사이토카인의 수 준에 있어서 유의미한 감소를 초래하였다(도 1F).

이러한 데이터는 IL-25 신호전달을 차단함으로써 본 발명자들이, 염증 및 AHR을 포함하는, 타입-2 이펙터 기능의 폐기를 유도하는 타입-2 사이토카인을 억제시켰음을 지지한다. 따라서, IL-25의 길항제는, 타입-2 염증 반응의 개시 시점 부터 투여된다면, 상기 염증을 효과적으로 억제시킨다.

실험재료 및 실험방법:

마우스

BALB/c 마우스를 하란(Harlan UK)로부터 획득하였으며 특이 병원균이 없는 환경에서 SABU/CBS 또는 국립 심폐 학회 시설내에 유지시켰다. 본 명세서에 개관된 모든 동물 실험은 UK 내무부의 승인을 받았다.

감작화 및 알레르겐 노출

BALB/c 마우스(6 - 12 주령)에게, 0일 및 12일에, 알룸과 복합체화된 오발부민(20 μg/주사), 또는 알룸 만(대조군)을 복강내로 투여하여 감작화시켰다. 1% 오발부님의 에어로졸 투여를 일당 20분 동안 19, 20, 21일째에 수행하였다. 22일째에, AHR을 평가하기 위해 체적변동기록법(plethysmography)을 사용하여 동물을 분석하였다.

항-mIL-25 모노클로날 항체의 투여

기도 과민반응(AHR)을 기재한 바와 같이 유발시켰고 항-IL-25 mAb(500 μg/용량)를 각각의 복강내 OVA 감작화 전날, 폐내로의 초기 OVA 공격 전날 및 각각의 OVA 에어로졸화 4시간 전에 복강내로 투여하였다. 추가 실험에서, 항-IL-25 mAb(500 μg/용량)를 각각의 에어로졸자극 이전에 해당일에만 복강내로 투여하였다. 대조군 마우스에게 항-IL25 mAb 대신 염수 또는 이소형 대조군(500 μg/용량)을 투여하였다. 이소형 대조군은 항-c-myc(마우스 IgG1, 클론 9E10.2)이었다.

기도 과민반응의 측정

동물을 안락사시키고, 기관절개하고(tracheostomised), 0.2ml의 일호흡용적(tidal volume)으로, 150회 호흡/분의 속도로 인공호흡기(SAR-830 series, CWE Inc)에 위치시켰다. 마우스를 전신 체적변동기록기(EMKA Technologies, Paris)로 모니터링하였고 경폐압력(transpulmonary pressure)을 인라인 변환기를 통해 평가하였다. 안정한 기준선 폐 내성을 기록한 후, 농도가 증가된 아세틸-β-메틸콜린 클로라이드(메타콜린)(Sigma, Dorset, UK)를 초음파 네뷸라이저로 각각의 농도로 15초 동안 에어로졸로 투여하였고, 폐 내성을 5분 동안 기록하였다. IOX 소프트웨어를 사용하여 기도 내성, 순응성 및 표준 폐 파라미터를 분석하였다.

기관지폐세포 세척(BAL)

마우스를 경추 분리로 절명시키고 4 x 500μl 앨리쿼트의 PBS를 기관절개를 통해 주입하고 봉합하였다. 150개 세포에 대한 차분 세포 계수를 짐사로 염색된 사이토스핀에 대해 실시하였다.

실시예 3: 공격 전 투여.

본 발명자들은 또한 항-IL-25 mAb가 OVA 에어로졸화 공격에 앞서 투여된 경우에만 효과적인지 여부를 평가하였다. 항-IL-25 mAb로의 처치는 심지어 반응에서 나중에 주어졌을 경우에도 메타콜린 자극에 의해 유발된 기도 내성을 급격하게 감 소시켰다(도 2A). 대조적으로, 대조 이소형-매칭된 mAb의 투여는 AHR을 폐기시키지 못하였다.

유의미하게, 폐 조직학 절편의 분석은 항-IL-25 mAb 처리된 마우와 OVA로 공격받은 BALB/c 대조군 또는 이소형-매칭된 mAb로 처리된 대조군 간에 혈관 주위의 세포 침윤물의 수준(도 2B) 또는 기도 배상세포 과증식 수준(도 2C)에서의 유의미한 변화를 나타내지 아니하였다.

더욱이, 항-IL-25 mAb 투여후, BAL 유체내 호산구 비율(도 2D) 또는 항원-특이적 혈청 IgE 수준(도 2E)에서의 관찰가능한 감소는 없었다. 놀랍게도, 타입-2 사이토카인 IL-5 및 IL-13의 수준은 항원 재자극후 OVA로 공격받은 BALB/c 대조군 또는 이소형-매칭된 mAb로 처리된 대조군의 수준과 비견될 수 있을 정도로 유지되었으며(도 2F), 또한 BAL 내 IL-13 수준은 변화가 없었다. 따라서, 반응의 공격 시기가 진행되는 동안의 항-IL-25 투여는 심지어 타입-2 사이토카인과 이들의 다운스트림 이펙터가 하향-조절되지 아니하는 때에도 특이적으로 AHR을 폐기시킬 수 있다. 이러한 발견은 IL-25가 고전적인 타입-2 반응과 독립된 경로에 의해 AHR을 개시시킬 수 있다는 것을 시사한다.

실험재료 및 실험방법

실험재료 및 실험방법은 실시예 2에서 기재한 것과 동일하였으며 하기한 것들이 추가되었다:

폐 조직 수집 및 조직학

폐를 조직학 분석을 위해 포르말린(0.9% 염수 용액 중의 10% 포름알데히드) 에서 고정시켰다. 폐 절편을 염증 침윤을 위해 짐사로 염색하고 배상세포를 위해 과요오드산-스키프(PAS)로 염색하였다. 기도 상피내 PAS-염색된 배상세포를 수치 스코어링 시스템을 사용하여 맹검하였다(0: < 5% 배상세포; 1: 5-25%; 2: 25-50%; 3: 50-75%; 4: >75%). 각각의 폐로부터의 기도 스코어의 합계를 시험된 기도의 갯수로 나누고(20-40 기도/마우스), PAS 스코어를 임의 유닛으로 나타내었다. 혈관 주위의 침윤 세포의 갯수를 평가하기 위해 수치 스코어링 시스템을 사용하여 염증을 평가하였다(0: 침윤된 염증 세포의 층 < 혈관 주위 2 세포 두께, 1: 2-4 세포 두께, 2: 5-8 세포 두께, 3 > 8 세포 두께). 각각의 폐로부터의 기도 스코어 합계를 시험된 혈관의 갯수로 나누고(20-40 기도/마우스), 임의 유닛으로 나타내었다.

실시예 4: IL-25는 타입-2-비의존성 경로를 통해 작용한다.

본 발명자들은 외인성으로 투여된 rmIL-25가 항원 감작 또는 공격의 부재시에도 증강된 AHR을 유도할 수 있는지 여부를 평가하였다. BALB/c 마우스에 rmIL-25의 비강내 투여 16시간 정도 이른 시점에, 본 발명자들은 유의미하게 향상된 기도 내성을 검출하였다(도 3A). 이전의 보고들은 천식 표현형 및 특히 AHR에서의 IL-13에 의해 행해진 핵심적 역할을 지적하였다. IL-25가 IL-13을 통해 AHR에서 이의 역할을 매개하였는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 il13^-/- 마우스에 rmIL-25를 투여하였다. 다시 한번 본 발명자들은 rmIL-25 처치 후 향상된 AHR을 관찰하였다(도 3B). 다른 타입-2 사이토카인이 또한 천식 표현형에 기여하는 것으로 드러났기 때문에, 본 발명자들은 또한 비강내로 투여된 rmIL-25에 대한 il4^-/-il5^-/- il9^-/-il13^-/-의 반응을 평가하였다. 고전적인 타입-2 사이토카인 모두의 부재에서 조차, IL-25 처치는 메타콜린 자극후 AHR을 증강시켰다(도 3C). 이러한 데이터는 타입-2 사이토카인 비의존성 경로를 통해 AHR을 악화시키는데 있어서 IL-25의 역할을 뒷받침한다.

실험재료 및 실험방법

실험재료 및 실험방법은 실시예 2와 3에서 기재한 것과 동일하였으며 하기한 것들이 추가되었다:

마우스

BALB/c 백그라운드의 트랜스제닉 il4^-/-il5^-/-il9^-/-il13^-/- 마우스(P. G. Fallon et al., 2002. Immunity 17, 7)와 il13^-/- 마우스(G. J. McKenzie et al., 1998. Curr Biol. 8, 339)은 소개된 대로 였다. C57BL/6 x 129 F2 백그라운드의 Il25^-/- 마우스는 소개된 대로 였다(P. G. Fallon et al. 2006. J. Exp. Med. 203, 1105).

비강내 IL-25 투여

0일째에 마우스 당 40μl PBS 중의 1.8 ㎍의 rIL-25(R&D Systems) 또는 1.8 ㎍의 rIL-13(Peprotech)을 마우스 비강내로 투여하였다. 대조군 동물에게는 PBS만을 투여하였다.

실시예 5: 2C3 가변 도메인 클로닝

2c3의 3개의 서브클론으로부터의 RNA를 분리하고 cDNA를 역전사 반응으로 제조하였다.

면역글로불린 중쇄(IgH) cDNA를 IgG1 불변 영역 프라이머 MHCG1(서열번호 12)와 조합하여 보존된 5' VH 영역 프라이머, MHV7(서열번호 11)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.

유사하게, 면역글로불린 경쇄(IgK)를 카파 불변 영역 프라이머 MKC(서열번호 14)와 조합하여 보존된 5' IgK 영역 프라이머 MKV9 (서열번호 13)를 사용하여 증폭시켰다.

열안정 중합효소 Phusion(NEB F-531L)을 PCR 반응 내내 사용하였다.

3개의 독립적인 cDNA로부터 VH7 + MHCG1-프라이임된 PCR 반응의 2c3 증폭 생성물을 경쇄 증폭 반응의 증폭 생성물에서와 같이 TOPO-블런트 클로닝^® 키트(Cat 45-0245)를 사용하여 pCRII®Blunt-TOPO® 벡터내로 직접적으로 라이게이션시켰다. 라이게이션된 pCRII-블런트 벡터 작제물로 형질전환된 E. coli TOP10 박테리아를 아가 그리드 상의 흰색 콜로니와 PCR 스크리닝 혼합물내에서 골라냄으로써 LB-앰피실린-XGal 아가 플레이트에서 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드 삽입물을 PCR-증폭시켰다. 증폭 생성물을 겔 전기영동시키고 예상된 생성물을 확인하였다. 정확한-크기의 PCR 증폭 생성물을 생산하는, 각각의 클론의 오버나잇 배양물(5ml)을, DNA 플라스미드 미니제조물(minipreps)을 생산하기 위해, QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol(cat 27106)을 사용하여 가공하였다.

플라스미드를 BigDye^® Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI cat. 4390242)를 사용하여 시퀀싱하였다. 각각의 선별된 플라스미드를 GeneAmp9600 PCR 기계에서 순환되는 M13 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 양 방향으로 시퀀싱하였다. 전기영동 서열 분석을 ABI 모세관 서열분석기로 수행하였다.

RT-PCR, 클로닝, 및 DNA 서열 분석의 완전한 순환주기를 반복하여 각각의 면역글로불린 쇄의 3개의 완적하게 독립된 서열 정보 세트를 획득하였다.

VH 및 V카파 유전자의 완전하게 도출된 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 15와 서열번호 16으로 제시된다. 이들 서열은 새롭게 합성된 항체 쇄을 소포체내로 운송하는데 사용되는 신호 서열을 엔코딩하는 각각의 가변 유전자 세그먼트의 개시부에 선도 서열을 포함한다; 상기 선도 서열은 최종 중쇄 및 경쇄에 존재하지 않는다

참고문헌

1. P. G. Fallon et al., Immunity 17, 7 (Jul, 2002).

2. G. Grunig et al., Science 282, 2261 (1998).

3. M. Wills-Karp et al., Science 282, 2258 (1998).

4. M. M. Fort et al., Immunity 15, 985 (Dec, 2001).

5. M. R. Kim et al., Blood 100, 2330 (Oct 1, 2002).

6. G. Pan et al., J Immunol 167, 6559 (Dec 1, 2001).

7. S. D. Hurst et al., J Immunol 169, 443 (Jul 1, 2002).

8. T. A. Moseley, D. R. Haudenschild, L. Rose, A. H. Reddi, 사Cytokine Growth Factor Rev 14, 155 (Apr, 2003).

9. P. G. Fallon et al., J Exp Med 203, 1105 (Apr 17, 2006).

10. A. M. Owyang et al., J Exp Med 203, 843 (Apr 17, 2006).

11. T. Tamachi et al., J Allergy Clin Immunol 118, 606 (Sep, 2006).

SEQUENCE LISTING <110> Medical Research Council McKenzie, Andrew NJ Ballantyne, Sarah <120> Antibodies against IL-25 <130> AHB/CP6539118 <150> GB 0707505.4 <151> 2007-04-18 <150> US 60/912,474 <151> 2007-04-18 <160> 16 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggagcttc aatgaagata 60 tcctgcaagg cttctggtta ctccttcact gactacacca tgaactgggt gaagcagagc 120 catggaaaga accttgagtg gattggactt attaatcctt acaatggtgg tactagctac 180 aaccagaact tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240 atggagctcc tcagtctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagagggc 300 tatgatggtt acctttactt tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 360 tcc 363 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 115 120 <210> 3 <211> 321 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaagca 120 gatggaactg ttgaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Asp Gly Thr Val Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Asp Tyr Thr Met Asn 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Glu Gly Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 1 5 10 15 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VH 5prime Primer <400> 11 atggratgga gckggrtctt tmtctt 26 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Heavy chain constant region primer <400> 12 cagtggatag acagatgggg g 21 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Vkappa 5prime primer <400> 13 atggtrtccw casctcagtt ccttg 25 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Light chain constant region primer <400> 14 actggatggt gggaagatgg 20 <210> 15 <211> 420 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 atggratgga gckggrtctt tmtcttcctc ctgtcgggaa ctgcaggtgt ccactctgag 60 gtccagctgc aacagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gagcttcaat gaagatatcc 120 tgcaaggctt ctggttactc cttcactgac tacaccatga actgggtgaa gcagagccat 180 ggaaagaacc ttgagtggat tggacttatt aatccttaca atggtggtac tagctacaac 240 cagaacttca agggcaaggc cacattaact gtagacaagt catccagcac agcctacatg 300 gagctcctca gtctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agagggctat 360 gatggttacc tttactttgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420 <210> 16 <211> 381 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 atggtrtccw casctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg taccagatgt 60 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120 atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtatca gcagaaagca 180 gatggaactg ttgaactcct gatctattac acatcaagtt tacactcagg agtcccatca 240 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagcaa cctggaacct 300 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccgtacac gttcggaggg 360 gggaccaagc tggaaataaa a 381

Claims

IL-25에 결합하며 서열번호 7에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는 표적 결합 구성원.
제 1항에 있어서, 상기 VH 도메인이 서열번호 5에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1 및 서열번호 6에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2를 추가로 포함하는, 표적 결합 구성원.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 VH 도메인이 인간 프레임워크 영역을 포함하는, 표적 결합 구성원.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 VH 도메인이 서열번호 2를 포함하는, 표적 결합 구성원.
제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 8에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 9에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 10에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR3를 지니는 VL 도메인을 추가로 포함하는, 표적 결합 구성원.
제 5항에 있어서, 상기 VL 도메인이 인간 프레임워크 영역을 포함하는, 표적 결합 구성원.
제 5항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열번호 4를 포함하는, 표적 결합 구성원.
제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, Fab, F(ab')₂, scFv 항체 단편인, 표적 결합 구성원.
제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 항체 불변 영역을 포함하는, 표적 결합 구성원.
제 9항에 있어서, 상기 불변 영역이 IgG1 또는 IgG4 불변 영역인, 표적 결합 구성원.
제 9항에 있어서, 전체 항체를 포함하는, 표적 결합 구성원.
제 1항 내지 제 11항중 어느 한 항의 상기 표적 결합 구성원을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
제 1항 내지 제 12항중 어느 한 항의 상기 표적 결합 구성원의 발현을 위한 발현 벡터로서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 제 12항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
제 13항의 발현 벡터를 운반하는 숙주 세포.
표적 결합 구성원을 생산하는 방법으로써, 상기 표적 결합 구성원의 생산을 위한 조건하에서 제 14항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
제 15항에 있어서, 상기 표적 결합 구성원을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 표적 결합 구성원을 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물로 제형화시키는(formulating) 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 표적 결합 구성원과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
제 18항에 있어서, 동결건조된 분말 형태의 조성물.
천식의 치료 또는 예방을 위한 방법으로써, 치료가 필요한 환자에게 유효량의 제 1항 내지 제 11항중 어느 한 항의 표적 결합 구성원 또는 제 18항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
천식의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 표적 결합 구성원 또는 제 18항의 조성물.
(a) IL-25에 결합하고 서열번호 7에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함하는, 표적 결합 구성원을 구성하는 VH 도메인을 제공하는 단계;

(b) 항체 분자를 제공하기 위해 상기 VH 도메인과 복수의 항체 VL 도메인을 결합시키는 단계;

(c) IL-25에 대한 결합에 관해 상기 항체 분자를 스크리닝하는 단계; 및

(d) IL-25에 결합하는 항체 분자를 선별하는 단계를 포함하는 IL-25에 대한 항체를 생산하는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 VH 도메인이 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 정의된 것인 방법.
(a) 대체될 CDR3를 포함하거나 CDR3 엔코딩 영역이 결여된 VH 도메인을 엔코딩하는 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하는 단계;

(b) VH 도메인을 엔코딩하는 핵산 생성물 레퍼토리를 제공하기 위하여, 상기 레퍼토리와 서열번호 7에 제시된 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3를 엔코딩하는 도너 핵산을 결합시키고, 이로써 상기 도너 핵산이 상기 레퍼토리내의 상기 핵산내로 삽입되는 단계;

(c) 상기 핵산 생성물 레퍼토리를 발현시키는 단계;

(d) IL-25에 특이적인 표적 결합 구성원을 선별하는 단계; 및

(e) 상기 표적 결합 구성원 또는 상기 구성원을 엔코딩하는 핵산을 회수하는 단계를 포함하는 IL-25에 대한 항체를 생산하는 방법.
제 24항에 있어서, 상기 생성물 레퍼토리가 VL 도메인과 함께 동시-발현(co-expression)되는 방법.