EA018073B1 - Антитела к il-25 - Google Patents

Abstract

Изобретение включает антитело 2C3 и мишень-связывающие частицы на основе 2C3, которые связывают интерлейкин-25. Они применимы в терапии, например, для лечения астмы.

Description

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам, включая их связывающие фрагменты, направленным на интерлейкин 25 (1Ъ-25). В предпочтительных вариантах настоящего изобретения в качестве антитела используют УН и/или УЪ домены антитела 2С3. Другой аспект изобретения включает одну или более областей СОЯ УН и УЪ доменов, раскрываемых в данном описании, прививаемых к человеческим УН и УЪ каркасным областям соответственно.

Предпосылки создания изобретения

Астма является общим хроническим воспалительным расстройством дыхательных путей. За последние десятилетия число страдающих ею резко увеличилось, и по оценкам Всемирной организации здравоохранения во всём мире от астмы страдает около 300 миллионов человек. Аллергическая астма характеризуется неконтролируемой гиперреактивностью (АНЯ) дыхательных путей, вызываемой различными раздражителями, и ассоциируется с воспалительными инфильтратами в лёгких типа 2.

Цитокины типа 2 играют важную роль в опосредовании защитного иммунитета к заражению паразитическими червями (гельминтами), регулирующими эффекторные функции, такие как рост В-клеток и секреция 1дЕ, индуцирующими гиперплазию бокаловидных клеток и связанные с ней образование слизи, эозинофилию, мастоцитоз и фиброз (1). Именно главная роль, которую играют эти цитокины в регуляции этих эффекторных функций, сделала их основными терапевтическими мишенями при астме. Действительно, мышиные модели, в которых сверхэкспрессируются эти цитокины, проявляют заметные признаки астмы. В таком случае удивительно, что попытки улучшить состояние, вызванное экспериментальной астмой, блокируя специфические цитокины типа 2, за исключением ингибирования 1Ъ-13, оказались безуспешными.

Ингибирование ЪС-13 подавляет как АНЯ, так и воспаление дыхательных путей, хотя механизм остаётся неясным (2, 3). Однако, если принимать во внимание сложную патофизиологию и недостаточно понятную этиологию астмы, неясно, окажется ли в конце концов нацеливание на отдельные пути удачным с терапевтической точки зрения.

Недавно было показано, что сверхэкспрессия 1Ъ-25/1Ъ-17Е, члена семейства цитокинов 1Ъ-17 с родственной структурой (8), индуцирует типа 2 реакции ίη νίνο (4-6) и повышает реактивность дыхательных путей к агонистам (7). Из мышей 1Ъ25^-/- не удаётся выгнать паразитических гельминтов; главный показатель неэффективного ответа типа 2 (9, 10).

Основная структура антитела общеизвестна в уровне техники. Природное антитело обычно имеет четыре полипептидные цепи: две идентичные тяжёлые цепи и две идентичные лёгкие цепи, связанные дисульфидными связями. Каждая из тяжёлой и лёгкой цепей имеет константную и вариабельную области (или домен). За связывание антигена отвечают главным образом вариабельные области. В каждой вариабельной области три подобласти, известные как гипервариабельные участки (области) (СИЯк), контактируют (осуществляют контакт) с антигеном. СИЯк каждого вариабельного домена нумеруют от Ν- к С-концу как СИЯ1, СИЯ2 и СИЯ3. Между Ν- и С-концом к СИЯк находятся четыре так называемые каркасные области, которые осуществляют слабый контакт, если вообще осуществляют какой-либо контакт, с антигеном. Более подробно структура антител описана во множестве документов, цитируемых ниже, которые вводятся в данное описание в качестве ссылки.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения получили антитела против 1Ъ-25 и идентифицировали молекулу антитела, которое связывается с высокой аффинностью и специфичностью с 1Ъ-25. Так как последовательности человеческого и мышиного 1Ъ-25 идентичны на 80%, то полагали маловероятной возможность получения антител против 1Ъ-25 обычной иммунизацией мышей или крыс, так как толика (степень) подобия уменьшает число иммуногенных эпитопов. Кроме того, граница раздела (интерфейс) рецепторлиганд, по-видимому, проявляет наивысшую степень консервации, тем самым исключая образование антител, способных блокировать взаимодействие 1Ъ-25 с его рецептором. Чтобы преодолеть эти сложности, авторы настоящего изобретения иммунизировали мышей, созданных таким образом, чтобы в них отсутствовала экспрессия 1Ъ-25 (1Ъ-25^-/-), надеясь, что такой подход повысит вероятность развития антител, направленных против границы раздела (интерфейса) 1Ъ-25/1Ъ-25Я.

Этот подход с большим успехом был применён для получения антител против 1Ъ-25, вероятно, вследствие того, что 1Ъ-25, сам по себе, повышает гуморальный иммунный ответ. Однако даже с помощью такого подхода удалось идентифицировать только 2 блокирующих антитела из 70, подвергшихся скринингу, и только одно из них удалось выделить.

Пытаясь преодолеть трудности, вызванные подобием мышиного и человеческого 1Ъ-25, которое, как считалось, препятствует получению эффективных блокирующих антител обычными способами, были убеждены, что это подобие последовательностей может способствовать образованию антитела, которое с равной эффективностью блокирует взаимодействие мышиного и человеческого 1Ъ-25 со своими рецепторами. Настоящее изобретение показывает теперь, что это происходит на самом деле.

Хотя существуют другие антитела к 1Ъ-25, авторы изобретения считают, что настоящее изобретение является первой демонстрацией таких антител, способных блокировать 1Ъ-25 биоактивность. В частности, настоящее раскрытие включает тест, проведённый на мышиных моделях астмы, который показыва- 1 018073 ет, что антитело по изобретению имеет полезные и неожиданные свойства, в особенности его способность предупреждать или снижать гиперреактивность дыхательных путей ίη νίνο, основной симптом астмы.

Хотя сообщалось, что введение слитого белка 1Ь-25К-ЕС уменьшает воспаление типа 2 дыхательных путей, эффект был менее значительным (резким), чем эффект, сообщаемый в данном описании, а критическая оценка АНК не проводилась (11). В данной работе авторы изобретения продемонстрировали, что 1Ь-25 играет важную роль в воспалении и АНК, сначала усиливая воспаление, опосредуемое цитокинами типа 2, но также играет важную роль в индукции АНК независимо от классических цитокинов типа 2. Идентификация 1Ь-25-зависимой АНК даёт возможность идентифицировать терапевтические мишени, которые лежат ниже (после), даунстрим 1Ь-25. В настоящее время авторам изобретения неизвестно, действует ли 1Ь-25 непосредственно на гладкие мышцы дыхательных путей или его действие опосредуется индукцией известных бронхоконстрикторов, таких как лейкотриены. Однако бифазная активность 1Ь-25 делает его превосходной терапевтической мишенью для подавления воспаления дыхательных путей и ингибирования гиперреактивности дыхательных путей ίη νίνο.

Соответственно, настоящее изобретение относится к новому антителу, а в более общем плане, к участкам (частицам) связывания с (молекулой-) мишенью (мишень-связывающим участкам (частицам)), содержащим последовательности СЭК антител, а также к применению участников целевого связывания для лечения патологических состояний, таких как астма.

В одном варианте изобретение включает участника целевого связывания, который связывает 1Ь-25 и который содержит УН домен антитела, включающий УН СИКЗ с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 7. Эта последовательность представляет собой УН С'ЭКЗ последовательность антитела 2СЗ по настоящему изобретению.

В более специфических вариантах изобретения участник целевого связывания по изобретению представляет собой УН домен, который содержит УН СИКЗ §ЕЦ ΙΌ N0: 7 вместе с СЭК1 8ЕЦ ΙΌ N0: 5 и СЭК2 8ЕО ΙΌ N0: 6.

УН домен может иметь человеческие каркасные области или каркасные области, показанные в 8ЕО ΙΌ N0: 2.

УН домен может быть спарен с УЪ доменом по изобретению, например УЪ доменом с СЭК1 8Е0 ΙΌ N0: 8, СЭК2 8ЕЦ ΙΌ N0: 9 и СИКЗ 8Е0 ΙΌ N0: 10. Эти СЭК могут находиться в УЪ домене, имеющем человеческие каркасные области или представляющем собой УЪ домен 8Е0 ΙΌ N0: 4.

Так, в одном аспекте настоящее изобретение включает участки связывания с мишенью, который связывает Ш-25 и который содержит 2С3 УН домен (8ЕЦ ΙΌ N0: 2) и/или 2С3 УЪ домен (8ЕЦ ΙΌ N0: 4).

Изобретение также включает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую участки связывания с мишенью по изобретению, векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, и способы экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине с целью получения участков связывания с мишенью по изобретению.

Далее, изобретение включает применение участков связывания с мишенью по изобретению, например, в виде фармацевтической композиции для лечения заболеваний, включая астму.

Эти и другие аспекты изобретения более подробно описаны ниже и со ссылкой на прилагаемые примеры.

Описание фигур

На фиг. 1 показана нейтрализация Ш-25 перед сенсибилизацией, а также в процессе теста на астму (провокации астмы):

А - чувствительность к метахолину 0УА-сенсибилизированных мышей определяли через один день после последней ингаляторной антигенной стимуляции. Показаны данные 2 экспериментов, которые представляют собой среднее ± 8ЕМ для 14-18 мышей/группа (*р<0,05 по сравнению с изотипическим контролем, **р<0,01 по сравнению с изотипическим контролем);

В - срезы лёгких окрашивали красителем Гимзы и оценивали периваскулярную инфильтрацию, п=8/группа;

С - содержание слизи определяли окрашиванием срезов лёгких периодной кислотой - реактивом Шиффа (РА8), п=8/группа;

Ό - антигенспецифический сывороточный ЦЕ определяли методом ЕЫ8А, результат 0Ό переводили в произвольные единицы, сравнивая со стандартной сывороткой, п=8/группа;

Е - долю эозинофилов в ВАЬ (БАЛ, бронхиальный лаваж) определяли дифференциальным подсчётом клеток клеточного материала (полученного по методике цитоспина), окрашенных красителем Гимзы, п=6/группа;

Е - индуцированное антигеном продуцирование цитокинов при использовании рестимулированных клеток медиастинальных лимфоузлов. Уровни белков определяли методом ЕЫЗА, п=6/группа.

Символами показаны результаты для отдельных животных, а среднее значение показано в виде столбца. Представлены данные по меньшей мере из 2 независимых экспериментов; 5сп5 = антитело, введённое перед сенсибилизацией, аего = антитело, вводимое за 4 ч перед каждой ингаляторной стимуляцией.

- 2 018073

На фиг. 2 показана нейтрализация 1Б-25 только в процессе теста на астму (провокации астмы):

А - чувствительность к метахолину 0УА-сенсибилизированных мышей определяли через один день после последней ингаляторной антигенной стимуляции. Показаны данные 2 экспериментов, которые представляют собой среднее ± 8ЕМ для 14-18 мышей/группа (*р<0,05 по сравнению с изотипическим контролем, **р<0,01 по сравнению с изотипическим контролем);

В - срезы лёгких окрашивали красителем Гимзы и оценивали периваскулярную инфильтрацию, п=8/группа;

С - содержание слизи определяли окрашиванием срезов лёгких периодной кислотой - реактивом Шиффа (РА8), п=8/группа;

Ό - долю эозинофилов в ВАЬ (БАЛ, бронхиальный лаваж) определяли дифференциальным подсчётом клеток клеточного материала (полученного по методике цитоспина), окрашенных красителем Гимзы, п=6/группа;

Е - антигенспецифический сывороточный 1дЕ определяли методом ЕЬ18А, результат 0Ό переводили в произвольные единицы, сравнивая со стандартной сывороткой, п=8/группа;

Б - индуцированное антигеном продуцирование цитокинов при использовании рестимулированных клеток медиастинальных лимфоузлов. Уровни белков определяли методом ЕЬ18А, п=6/группа.

Символами показаны результаты для отдельных животных, а среднее значение показано в виде столбца. Представлены данные по меньшей мере из 2 независимых экспериментов; 5сп5 = антитело, введённое перед сенсибилизацией, аего = антитело, вводимое за 4 ч перед каждой ингаляторной стимуляцией.

На фиг. 3 показано введение гт1Ь-25 наивным мышам. Мышам дикого типа (А), 1113^-/- (В) или 114^-/ί15^-/-ί19^-/-ί113^-/- (С) вводили 1,8 мкг т1Ь-25 или РВ8 интраназально. Чувствительность к метахолину определяли через 16 ч после стимуляции. *р<0,05 по сравнению с изотипическим контролем, **р<0,01 по сравнению с изотипическим контролем, п=4-8/группа. Представлены данные по меньшей мере из 2 незави симых экспериментов.

Последовательности.

Участки связывания с мишенью по настоящему изобретению представлены в данном описании далее со ссылкой на нижеприведённые идентификационные номера последовательностей:

кодирующая 2С3 УН нуклеотидная последовательность. аминокислотная последовательность 2С3 УН.

кодирующая 2С3 УЪ нуклеотидная последовательность. аминокислотная последовательность 2С3 УЪ. аминокислотная последовательность 2С3 УН СЭЯ1. аминокислотная последовательность 2С3 УН СЭЯ2. аминокислотная последовательность 2С3 УН СЭЯ3. аминокислотная последовательность 2С3 УЪ СЭЯ1. аминокислотная последовательность 2С3 УЪ СЭЯ2.

8ЕО ГО N0: 1

8ЕО ГО N0: 2

8ЕО ГО N0: 3

8ЕО ГО N0: 4

8ЕО ГО N0: 5

8ЕО ГО N0: 6

8ЕО ГО N0: 7

8ЕО ГО N0: 8

8ЕО ГО N0: 9

8Е0 ГО N0: 10 - аминокислотная последовательность 2С3 УЪ СЭЯ3.

Другие последовательности представлены в прилагаемом списке последовательностей.

Подробное описание изобретения

Мишень-связывающая частица (мишень-связывающий участок, элемент; участок, связывающийся с мишенью).

Это выражение описывает молекулу (частицу, участок, элемент) из пары молекул, обладающих специфичностью связывания друг с другом. Молекулы (партнёры) из специфически связывающейся пары молекул могут быть природными или могут быть получены, полностью или частично, синтетическими методами. У одного партнёра из пары молекул имеется на поверхности область или углубление (карман), которая(ое(ый)) специфически связывается с и, следовательно, комплементарна(о) конкретной пространственной и полярной структуре (организации) другого партнёра из пары молекул. Таким образом, члены пары обладают свойством специфически связываться друг с другом. Примерами специфически связывающихся пар являются пары антиген-антитело, биотин-авидин, гормон-рецептор гормона, рецептор-лиганд, фермент-субстрат.

Данное изобретение имеет отношение к реакциям типа антиген-антитело. Соответственно, участок (партнёр), связывающийся с мишенью, по изобретению содержит, по меньшей мере, участок молекулы антитела, более конкретно, по меньшей мере, участок антигенсвязывающего домена такой молекулы.

Обычно вариабельная область тяжёлой цепи антитела (УН домен) играет значительную роль в связывании антитела с антигеном. Обнаружено, что область СЭЯ3 УН домена является более разнообразной, чем области СЭВ1 и СЭВ2. и поэтому большинству антител сообщает специфичность к мишени антитела. Поэтому участки, связывающиеся с мишенью, по изобретению базируются вокруг УН СЭЯ3 области антитела 2С3. Более предпочтительно, участки, связывающиеся с мишенью, по изобретению содержат все три области СЭЯ УН домена антитела 2С3.

Структура участка, связывающегосяся с мишенью, который содержит СЭЯ по изобретению, обычно состоит из последовательности тяжёлой или лёгкой цепи молекулы антитела или её значительной час

- 3 018073 ти, причём область СЭЕ локализована в местоположении, соответствующем области СЭЕ природных УН и УЪ вариабельных доменов антитела, кодированных реаранжированными генами иммуноглобулинов. Структуры и местоположения вариабельных доменов иммуноглобулинов можно определить по КаЬа!, Е.А. е! а1. Зедиепсе^ οί Рго!еш8 οί 1ттипо1од1са1 1п1еге№ 4^!Е Εάίίίοη. ИЗ ЭераПтеЩ οί Неа1!Е аиб Нитап 8егу1се§. 1987, и по более поздним переизданиям. Различные академические и коммерческие онлайн ресурсы (источники информации) позволяют получить доступ к этой базе данных. Например, см. Майш, А.С.Е. Ассе881ид (Не КаЬа! ΑπΙίόοάν Зедиепсе Эа1аЬа8е Ьу СотрШег ΡΚΌΤΕΙΝ8: З!гис!иге, Еипс!юп апб Сепебсз, 25 (1996), 130-133 и соответствующий он-лайн ресурс, в настоящее время по веб-адресу Ьΐίр://^^^.Ь^ο^иί.ο^д.ик/аЬ8/8^ткаЬ.Ьΐт1.

Как правило, участок, связывающийся с мишенью, содержит УН домен, спаренный с УЪ доменом, что сообщает антителу антигенсвязывающий домен, хотя, как подробнее обсуждается ниже, для связывания антигена может использоваться один УН домен. В одном предпочтительном варианте изобретения 2С3 УН домен (ЗЕС ΙΌ N0: 2) спаривается с 2С3 УБ доменом (ЗЕС ΙΌ N0: 4), так что образуется антигенсвязывающий сайт антитела, содержащий как 2С3 УН, так и УБ домены. В других вариантах изобретения 2С3 УН спаривается с УБ доменом, отличным от 2С3 УБ.

Разнородность лёгких цепей твёрдо установлена в уровне техники, как подробнее обсуждается в данном описании.

Участок, связывающийся с мишенью, по настоящему изобретению может связывать 1Б-25 с аффинностью, практически аналогичной аффинности антитела 2С3, например ±10%. Участок, связывающийся с мишенью, как правило, специфичен к 1Б-25. Так, участок, связывающийся с мишенью, обычно не проявляет какого-либо заметного связывания с молекулами, отличными от его конкретного партнёра по связыванию (конкретных партнёров по связыванию). Например, было найдено, что антитело 2С3 не вступает в перекрёстную реакцию с 1Б-4, ГБ-5 и ЕБ-13, и, следовательно, предотвращение такой перекрёстной реактивности с другими цитокинами, непосредственно связанными с астмой и аналогичными процессами, является желательным признаком участков, связывающихся с мишенью, по изобретению.

Как правило, специфичность можно определить с помощью анализов связывания, таких как ЕБ1ЗА, с применением панели антигенов. Участок, связывающийся с мишенью, по настоящему изобретению может узнавать ГБ-25, но не другие члены семейства 1Б-17, в частности любой из 1Б-17А, 1Б-17В и 1Б-17С; более предпочтительно все три из 1Б-17А, 1Б-17В и 1Б-17С. Связывание связывающегося с мишенью участка по изобретению с ЕБ-25 можно нарушить конкуренцией с рекомбинантным 1Б-25.

Аффинность связывания и эффективность нейтрализации различных связывающихся с мишенью участков можно сравнивать в соответствующих условиях.

Молекула антитела.

Это выражение описывает иммуноглобулин либо природный, либо частично или полностью полученный синтетическим путём. Было показано, что фрагменты целого антитела могут осуществлять функцию связывания антигенов. Поэтому ссылка на антитело также охватывает любой полипептид или белок, содержащий связывающий фрагмент антитела.

Примерами связывающих фрагментов являются:

(ί) фрагмент ЕаЬ, состоящий из доменов УБ, УН, СБ и СН1;

(ίί) фрагмент Еб, состоящий из доменов УН и СН1;

(ίίί) фрагмент Εν, состоящий из доменов УБ и УН единичного антитела;

(ίν) фрагмент бАЬ (\Уагб. Е.З. е! а1., №а!иге. 341, 544-546 (1989)), который состоит из УН домена;

(ν) выделенный СЭЕ области;

(νί) фрагменты Е(аЬ')₂, бивалентные фрагменты, содержащие два связанных ЕаЬ фрагмента;

(νίί) одноцепочечные Εν молекулы СсЕу), в которых УН домен и УБ домен связаны пептидным линкером, который способствует ассоциации двух доменов с образованием антигенсвязывающего сайта (В1гб е! а1., ЗДепсе, 242, 423-426, 1988; НизЮп е! а1., ΡNАЗ ИЗА, 85, 5879-5883, 1988);

(νίίί) димеры биспецифические одноцепочечных Εν (РСТ/ОЗ92/09965) и (ίχ) диатела - б^аЬοб^е8 (диабоди), мультивалентные или мультиспецифические фрагменты, полученные слиянием генов (\УО94/13804; Р. ^б^ег е! а1., Рюс. №111. Асаб. Зсг ИЗА. 90, 6444-6448, 1993).

Молекулы Εν, 8сΕν или диател (б^аЬοб^е8) можно стабилизировать введением дисульфидных мостиков, связывающих УН и УБ домены (Υ. Еебег е! а1., №а!иге Вю!есЬ, 14, 1239-1245, 1996). Можно также получать мини-антитела, содержащие 8сΕν фрагмент, соединённый с доменом СН3 (З. Ни е! а1., Сапсег Еез., 56, 3055-3061, 1996).

Если нужно применять биспецифические антитела, эти антитела могут представлять собой обычные биспецифические антитела, которые можно получать различными способами (НЫНдег, Р. апб ХУиНег С. Сиггеп! Ортюп В^есЕшЬ 4, 446-449 (1993)), например полученные химическими методами или при использовании гибридных гибридом, или могут представлять собой любые биспецифические фрагменты антител, указанные выше. Диатела (б^аЬοб^е8) и 8сΕν можно получать без области Ес, используя только вариабельные домены, потенциально ослабляющие действие антиидиопатических взаимодействий (реакций).

- 4 018073

Биспецифические диатела (б1аЬоб1ез), в отличие от биспецифических полных антител, могут также быть особенно полезны, так как их легко создать и экспрессировать в Е.еоБ. Диатела (б1аЬоб1ез) (и многие другие полипептиды, такие как фрагменты антител) с подходящими специфичностями связывания можно легко выбрать, используя фаговый дисплей (νθ 94/13804) из библиотек. Если одно плечо диатела следует оставлять константным, например, со специфичностью, направленной против 1Ь-25, затем можно создать библиотеку, с помощью которой изменяют другое плечо, и выбирают антитело с подходящей специфичностью. Биспецифические полные антитела можно получать с помощью техники кпоЬз-1п1о-йо1ез (1.В.В. Ктбдетау е1 а1., Рго1еш епд., 9, 616-621, 1996). Можно брать моноклональные и другие антитела и использовать методы рекомбинантной ДНК для получения других антител или химерных молекул, которые сохраняют специфичность исходного антитела. Такие методы могут включать введение ДНК, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина, или гипервариабельные области (СЭК), антитела, в константные области, или константные области плюс каркасные области, другого иммуноглобулина. См., например, Европейскую патентную заявку ЕР-А-184187, патент Великобритании СВ 2188638А или ЕР-А-239400.

Предпочтительно СЭК области прививают в человеческую каркасную область. Человеческую каркасную область можно выбирать различными методами, например, сравнением последовательностей мышиной каркасной области или мышиной V области с известными последовательностями человеческой каркасной области, имеющими наивысшую степень, или одну из наивысших степеней, подобия или идентичности. Можно сделать модификации в каркасных областях нативных последовательностей, чтобы далее оптимизировать полученные в результате СЭК-привитые антитела.

Хотя в предпочтительном аспекте изобретения предпочтительны молекулы антител, содержащие пару νΗ и νΕ доменов, другие аспекты изобретения составляют единичные связывающие домены. Известно, что единичные домены иммуноглобулина, в особенности νΗ домены, способны связывать антигены-мишени специфическим образом.

В случае любого из одноцепочечных связывающих доменов эти домены можно использовать для скрининга комплементарных доменов, способных образовывать двухдоменный участок, связывающийся с мишенью, способный связывать 1Ь-25, как подробнее описано ниже.

Молекулы антител по настоящему изобретению могут далее содержать константные области антитела или их участки. Например, νΕ домен может быть связан по своему С-концу с константными доменами лёгкой цепи антитела, включающими человеческие Ск или Сл цепи, предпочтительно СХ. Аналогично, связывающийся с мишенью участок на основе νΗ домена может связываться по своему С-концу с целой или с частью тяжёлой цепи иммуноглобулина, образованной из антитела любого изотипа, например 1дС, 1дА, 1дЕ и 1дМ, и любого подкласса изотипов, в особенности 1дС1 и 1дС4. Предпочтительным является 1дС4. Можно использовать Ее-области, такие как ДпаЬ и Дпае, раскрываемые в международной патентной заявке νθ 99/58572.

Соответственно, включаются химерные молекулы, содержащие домен, связывающийся с мишенью, или его эквивалент, слитый с другим полипептидом. Клонирование и экспрессия химерных антител описаны в Европейских патентных заявках ЕР-А-0120694 и ЕР-А-0125023.

Каркасные области молекул антител по изобретению могут также включать последовательности гликозилирования, которые содержать один или более сайтов гликозилирования. В зависимости от клетки-хозяина, в которой экспрессируется участок, связывающийся с мишенью, паттерн гликозилирования может меняться. Эти нуклеотидные конструкции, которые кодируют сайты гликозилирования, можно модифицировать, удаляя сайт, или же такие сайты можно вводить в белок. Например, сайты Ν-гликозилирования в эукариотических белках характеризуются аминокислотным триплетом Азр-Х-Υ, где X обозначает любую аминокислоту за исключением Рго, а Υ обозначает Бет или ТНг. Подходящие замены, добавления или делеции в нуклеотидной последовательности этих триплетов приводят к предотвращению связывания углеводных остатков по боковой цепи Азп. Изменение единичного нуклеотида, выбранное таким образом, чтобы, например, Азп был заменён на другую аминокислоту, достаточно для того, чтобы инактивировать сайт Ν-гликозилирования. Известные методы инактивирования сайтов Ν-гликозилирования в белках включают методы, описанные в патентах США № 5071972 и ЕР 276846.

Термин антигенсвязывающий домен описывает участок молекулы антитела, который содержит область, специфически связывающуюся с частью антигена или полным антигеном, и комплементарную части антигена или полному антигену. Если антиген велик, антитело может связываться лишь с конкретным участком антигена, и этот участок называется эпитопом. Антигенсвязывающий домен может предоставляться (создаваться) одним или более вариабельных доменов антитела (например, так называемый Еб фрагмент антитела, состоящий из νΗ домена). Предпочтительно антигенсвязывающий домен содержит по меньшей мере значительную часть вариабельной области лёгкой цепи антитела (νΕ) и по меньшей мере значительную часть вариабельной области тяжёлой цепи антитела (νΕ).

Значительная часть вариабельного домена иммуноглобулина содержит по меньшей мере три С'ЭК-области совместно с промежуточными каркасными областями. Предпочтительно эта часть (этот участок) включает по меньшей мере 50% любой из первой и четвёртой каркасной области или обеих этих

- 5 018073 каркасных областей, причём эти 50% представляют собой С-концевые 50% первой каркасной области и Ν-концевые 50% четвёртой каркасной области. Дополнительные остатки на Ν- или С-конце этой значительной части вариабельного домена могут представлять собой остатки, обычно не ассоциированные с природными областями вариабельных доменов. Например, создание связывающихся с мишенью участков по настоящему изобретению, получаемых методами рекомбинантной ДНК, может привести к введению Ν- или С-концевых остатков, кодированных линкерами, введёнными с целью содействовать клонированию или другим манипуляциям. Другие манипуляции включают введение линкеров для присоединения вариабельных доменов по изобретению к другим белковым последовательностям, включая тяжёлые цепи иммуноглобулинов, другие вариабельные домены (например, при получении диател (искусственных мини-антител, ЛаЬоЛек)) или белковые метки, более подробно обсуждаемые ниже.

Термин содержат обычно применяют в смысле включают, т.е. допускают присутствие одного или более признаков или компонентов.

Термин выделенный относится к состоянию, в котором связывающийся с мишенью участок по изобретению, или нуклеотид, кодирующий такие связывающие участки, обычно находятся в соответствии с настоящим изобретением. Участки и нуклеотид (нуклеиновая кислота) не содержат или практически не содержат материал, с которым они ассоциированы в природе (в естественных условиях), такой как другие полипептиды или нуклеиновые кислоты, с которыми они находятся в естественной окружающей среде или в среде, в которой их получают (например, культура клеток), когда такое получение осуществляют на практике методами рекомбинантной ДНК ίη νίΐτο или ίη νίνο.

Связывающиеся с мишенью участки и нуклеиновая кислота могут быть приготовлены с разбавителями или адъювантами и всё же с практической точки зрения будут являться выделенными, например связывающиеся участки (партнёры, участники, элементы связывания) обычно смешаны с желатином или другими носителями, если они применяются для покрытия микротитрационных планшетов с целью применения в иммуноанализах, или смешаны с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, если они применяются в диагностике или терапии. Связывающиеся с мишенью участки могут быть гликозилированными либо естественным путём (в природе), либо с применением гетерологичных систем эукариотических клеток (например, СНО или N80 (ЕСАСС 85110503), или они могут быть (например, если они продуцируются экспрессией в прокариотической клетке) негликозилированными.

Дополнительные признаки участков, связывающихся с мишенью.

Помимо последовательностей антитела, связывающийся с мишенью участок по настоящему изобретению может содержать другие аминокислоты, например, образующие пептид или полипептид, такой как складчатый домен, или для придания молекуле других функциональных характеристик помимо способности связывать антиген. Связывающиеся с мишенью участки по изобретению могут нести детектируемую метку или могут быть конъюгированы с токсином или ферментом (например, за счёт пептидильной связи или линкера).

Детектируемые метки включают радиометки (радиоактивные метки), такие как ¹³¹1 или ⁹⁹Тс, которые могут связываться с антителами по изобретению обычными химическими методами, известными в уровне техники для визуализации антител. Метки также включают ферментные метки, такие как пероксидаза хрена. Кроме того, метки включают химические молекулы, такие как биотин, которые можно обнаружить, связывая их со специфической распознаваемой детектируемой молекулой, например с меченым авидином.

Если дополнительным признаком является полипептидный домен или метка, связывающийся с мишенью участок можно получать методами рекомбинантной ДНК, т.е. экспрессией нуклеиновой кислоты, кодирующей слияние члена (партнёра, участника) целевого связывания и дополнительного домена.

Другие связывающиеся с мишенью участки по изобретению.

Варианты последовательностей.

Варианты УН и УЪ доменов и СОЯ, из которых собираются последовательности в данном описании и которые можно применять в связывающихся с мишенью участках для 1Ь-25, можно получать с помощью методов изменения, мутаций и скрининга последовательностей. Такие методы также включает настоящее изобретение.

Связывающийся с мишенью участок по настоящему изобретению может также представлять собой участок (партнёр), который конкурирует за связывание с антигеном с любым связывающимся с мишенью участком, который как связывает антиген, так и содержит связывающийся с мишенью участок, УН и/или УЬ домен, раскрываемый в данном описании, или УН СЭИЗ антитела 2С3, или вариант любого из них, последовательность которого практически такая, как собранная по данному описанию. Так, другой аспект настоящего изобретения включает связывающийся с мишенью участок, содержащий антигенсвязывающий сайт человеческого антитела, который конкурирует с 2С3 за связывание с 1Ь-25. Анализ конкуренции между связывающими (мишень) участками можно легко осуществить ίη νίΐτο, например используя метод ЕЬ18А или добавляя к одному связывающему участку специфическую репортёрную молекулу, которую можно обнаруживать в присутствии другого (других) немеченого (немеченых) связывающего участка (учатков), чтобы способствовать идентификации членов целевого связывания, которые связывают тот же самый эпитоп или перекрывающий эпитоп.

- 6 018073

В уровне техники существуют различные методы получения связывающихся с мишенью участков против ЕЬ-25 и тех, которые конкурируют с 2С3 за связывание с ГЕ-25.

Как обсуждалось, варианты аминокислотной последовательности вариабельных доменов любого из УН и УЪ доменов, последовательности которых конкретно раскрываются в данном описании, можно использовать по настоящему изобретению. Конкретные варианты могут включать одно или более изменений аминокислотной последовательности (добавление, делецию, замену и/или инсерцию аминокислотного остатка), могут представлять собой менее примерно 20 изменений, менее примерно 15 изменений, менее примерно 10 изменений или менее примерно 5 изменений, 4, 3, 2 или 1. Изменения можно делать в одной или более каркасных областях и/или в одной или более СОЯ.

В одном аспекте аминокислотная последовательность СОЯ, практически (в основном, по сути) по данному описанию (как представлено в данном описании), переносится в виде СОЯ в человеческий вариабельный домен или значительную его часть. УН СГОЯ3 последовательности практически по данному описанию представляют собой предпочтительные варианты настоящего изобретения, и предпочтительно, чтобы каждая из них переносилась в виде УН СГОЯ3 в вариабельный домен человеческой тяжёлой цепи или значительную его часть.

Под выражением практически как представлено (практически по (данному описанию)) понимают, что релевантный СОЯ или УН или УЪ домен по изобретению будет либо идентичен, либо будет иметь высокую степень подобия указанным областям, последовательность которых представлена в данном описании. Под высокой степенью подобия подразумевают, что от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например от 1 до 3 или 1, или 2, или 3, или 4 аминокислотных замен можно сделать в СОЯ и/или в УН или УЪ домене.

Варианты последовательностей участков, связывающихся с мишенью, можно получать случайным мутагенезом одного или обоих 2С3 УН и/или УЪ генов, генерируя мутации в целом вариабельном домене. Такой метод описан Стат еГ а1. (1992, Ргос. Ыаб. Асаб. 8сГ, И8Л, 89: 3576-3580), который использует склонную к ошибкам (ненадёжную) ПЦР.

Другой метод, который можно использовать, представляет собой направленный мутагенез в СГОЯобласти УН или УЪ генов. Такие методы раскрываются ВагЬак еГ а1. (1994, Ргос. Νη11. Асаб. 8сЦ И8Л, 91: 3809-3813) и 8сЫет еГ а1. (1996, I. Мо1. Вю1. 263: 551-567).

Все описанные выше методы сами по себе известны в уровне техники и в этом качестве не являются частью настоящего изобретения. Специалист способен применить такие методы для получения связывающихся с мишенью участков по изобретению, используя обычные методики из уровня техники.

Соответственно в другом аспекте изобретение охватывает способ получения антитела против ГЬ-25, который включает:

предоставление исходной нуклеиновой кислоты, кодирующей участок, связывающийся с мишенью, который содержит одну или более СОЯ последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 или 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4;

модификацию указанной нуклеиновой кислоты с целью изменить последовательность или последовательности СЭЯ;

экспрессию указанного модифицированного участка, связывающегося с мишенью; и тестирование указанного модифицированного участка, связывающегося с мишенью, на связывание с ГО-25.

Предпочтительно модификацию осуществляют на совокупности исходных нуклеотидных молекул, чтобы получить набор модифицированных последовательностей с разнообразными аффиностями связывания.

В одном аспекте изобретения исходная нуклеиновая кислота содержит все три СЭЯ тяжёлой цепи 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2 либо в виде самой 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2, либо перенесённые в другую каркасную последовательность.

В одном варианте изобретения модификации могут быть направлены на единичную СЭЯ, например на СЭЯ3. или модификации могут быть направлены на две или три области СЭЯ одновременно.

Получение связывающихся с мишенью участков на основе СЭЯ3.

Вариабельные домены, применяемые в изобретении, можно получать из человеческого вариабельного домена зародышевой линии или реаранжированного человеческого вариабельного домена, или они могут представлять собой синтетические вариабельные домены на основе консенсусных последовательностей известных человеческих вариабельных доменов. СЭЯ последовательность по изобретению (например, СЭЯ3) можно вводить в набор вариабельных доменов, не содержащих СЭЯ (в частности, СЭЯ3), используя методы рекомбинантной ДНК.

Например, Маткк еГ а1. (Вю/Тесйио1о§у, 1992, 10: 779-783) описывают методы получения набора (спектра) вариабельных доменов антитела, в которых консенсусные праймеры, направленные на 5' конец или прилегающие к 5' концу области вариабельного домена, используют в сочетании с консенсусными праймерами к третьей каркасной области человеческого УН гена, чтобы получить спектр (набор) УН вариабельных доменов, не содержащих СЭЯ3. Далее Маткк еГ а1. описывают, как этот набор можно объединять (комбинировать) с СЭЯ3 конкретного антитела. Используя аналогичные методы, можно провести шаффлинг (перетасовку) СЭЯ3 последовательностей по настоящему изобретению со спектром (набором)

- 7 018073

УН или УЪ доменов, не содержащих СЭК3, и перетасованные (после шаффлинга) полные УН или УЪ домены объединяют с родственным УЪ или УН доменом, получая связывающиеся с мишенью участки по изобретению. Набор (спектр) можно затем визуализировать в подходящей системе-хозяине, такой как фаг-дисплейная система по \¥О 92/01047, так чтобы можно было выбрать подходящие участки, связывающиеся с мишенью. Набор (спектр) может состоять более чем из 10⁴ отдельных участков (членов), например из 10⁶-10⁸ или 10¹⁰ участков (членов).

Аналогичные методы шаффлинга или комбинаторные методы раскрываются 5>1стшсг (Ыа1иге, 1994, 370: 389-391), который описывает этот метод по отношению к гену β-лактамазы, но отмечает, что такой подход можно применять для получения антител.

Поэтому другой аспект изобретения охватывает способ получения связывающегося с мишенью участка, специфического к 1Ъ-25, причём этот способ включает:

(а) предоставление исходного набора (спектра) нуклеиновых кислот, кодирующих УН участок, которые либо содержат область, кодирующую подлежащую замене СЭК3, либо не содержат область, кодирующую СЭК3;

(б) объединение (смешивание) указанного набора (спектра) с донорной нуклеиновой кислотой, кодирующей аминокислотную последовательность главным образом (практически) по данному описанию для УН С(ОК3, так что указанная донорная нуклеиновая кислота встраивается в наборе в область СЭК3, с тем, чтобы получить продукт реакции - набор нуклеиновых кислот, кодирующих УН домен;

(в) экспрессию нуклеиновых кислот указанного результирующего (полученного) набора;

(г) селекцию (отбор) связывающего мишень участка, специфического к 1Ъ-25; и (д) выделение указанного участка, связывающегося с мишенью, или кодирующей его нуклеиновой кислоты.

Полученный продукт реакции, результирующий набор, можно коэкспрессировать, при использовании одного и того же вектора или различных векторов, с УЪ доменом. УЪ домен может представлять собой УЪ домен по настоящему изобретению или один или более различных УЪ доменов, как описано ниже относительно шаффлинга (перетасовки) цепей.

Можно применять аналогичный метод, в котором УЪ СЭК3 по изобретению объединяют с набором нуклеиновых кислот, кодирующих УЪ домен, которые либо содержат область, кодирующую подлежащую замене СПК.3, либо не содержат область, кодирующую С.ПК3. Как и в вышеприведённом методе, полученный набор для УЪ можно коэкспрессировать, при использовании одного и того же вектора или различных векторов, с УН доменом. УН домен может представлять собой УН домен по настоящему изобретению или один или более различных УН доменов, как описано ниже относительно шаффлинга (перетасовки) цепей.

Аналогичным образом одну или более или все три СОК можно привить к набору УН или УЪ доменов, которые затем подвергают скринингу на участок, связывающийся с мишенью, или участки, связывающиеся с мишенями, специфические к 1Ъ-25.

Участки, связывающиеся с мишенью, полученные таким образом, образуют другой аспект изобретения.

Шаффлинг (перетасовка) цепей.

Другой аспект изобретения включает способ получения антигенсвязывающего домена антитела для 1Ъ-25, причём этот способ включает осуществление соединения УН домена связывающегося с мишенью участка по изобретению (включая варианты, обсуждавшиеся выше) с одним или более УЪ доменов и тестирование комбинации или комбинаций УН/УЪ на антитело-антиген связывающий домен к 1Ъ-25.

Указанный УЪ домен может иметь аминокислотную последовательность, которая является практически (главным образом) последовательностью по данному описанию.

Можно применять аналогичный способ, в котором один или более вариантов последовательности УЪ домена по данному описанию соединяют (объединяют) с одним или более УН доменов.

Это можно осуществить методами фаг-дисплейного скрининга, используя так называемый иерархический двойственный комбинаторный способ, раскрываемый в Международной заявке \¥О 92/01047, в соответствии с которым индивидуальную колонию, содержащую клон либо Н, либо Ъ цепи, используют для заражения полной библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (Ъ или Н), и полученный в результате участок, связывающийся с мишенью, выбирают в соответствии с методами фагового дисплея, как описано в данном ссылочном материале.

Таким образом, настоящее изобретение включает способ отбора (селекции) молекулы антитела к ГЪ-25, причём этот способ включает:

(а) предоставление УН домена, содержащего мишень-связывающий участок (частицу), который связывает 1Ъ-25 и который содержит УН домен, включающий УН С.ПК3 с аминокислотной последовательностью δΕβ ΙΌ N0: 7;

(б) объединение указанного УН домена с совокупностью УЪ доменов антитела с целью получения молекул антитела;

(в) скрининг указанных молекул антитела на связывание с 1Ъ-25;

(г) селекцию (отбор) молекулы антитела, которая связывается с ГЪ-25.

- 8 018073

УН и УЪ домены могут предоставляться в виде белков, экспрессированных при использовании рекомбинантной ДНК, в частности фаговой или фаг(е)мидной ДНК.

Совокупность УЪ доменов может представлять собой совокупность более 10⁴ индивидуальных доменов, например от 10⁶ до 10⁸ или 10¹⁰ доменов.

Молекулы антител и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие молекулы, могут образовывать другую часть настоящего изобретения.

ГБ-25.

ГБ-25, также известный в уровне техники как ГБ-17Е, получают от производителя (например, Κ.&Ό 8ук!етк, ΜΝ, ϋ8Ά) или его можно клонировать или синтезировать исходя из последовательностей ЕЬ-25, доступных в уровне техники. Мышиный 1Ь-25 (Νί,’ΒΙ РгоГеш ΝΡ_542767) описан НигкГ е! а1., 2002 (ссылка 7, см. ниже). Человеческий 1Ь-25 (Νί,’ΒΙ Рго!еш О9Н293) описан Рой е! а1. (ссылка 4, см. ниже). Для получения антител или применения в иммуноанализах можно использовать фрагменты рекомбинантного ГБ-25, в частности фрагменты, усечённые (процессированные) по Ν-концу. Например, продажный рекомбинантный человеческий ГБ-25 (ГБ-17Е) содержит последовательность зрелого белка Туг 33С1у 177 (регистрационный Νο. О9Н293), а продажный мышиный 1Ь-25 содержит остатки Уа1 17-А1а 169 мышиного 1Й-17Е (регистрационный Νο. ΝΡ_542767).

Нуклеиновые кислоты и векторы.

В других аспектах изобретение охватывает выделенную нуклеиновую кислоту, которая содержит последовательность, кодирующую мишень-связывающий участок, УН домен или УЬ домен по настоящему изобретению и способы получения мишень-связывающего участка, УН домена или УЪ домена, которые включают экспрессию указанных нуклеиновых кислот в условиях, позволяющих осуществить получение указанного мишень-связывающего участка, УН домена или УЪ домена, и их выделение.

Другой аспект настоящего изобретения включает нуклеиновую кислоту, обычно выделенную, кодирующую УН СЭЙ или УЪ СЭЙ последовательность, раскрываемую в данном описании, в особенности последовательность УН СОЙ, выбранную из 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 65 и 7, последовательность УЪ СЭЙ, выбранную из 8Е0 ГО ΝΟ: 8, 9 и 10, наиболее предпочтительно 2С3 (8Е0 ГО ΝΟ: 7).

Нуклеиновые кислоты по изобретению могут содержать последовательности, или их релевантные участки (например, СЭР-кодирующие области) 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3. Однако использование кодона может варьироваться, например, для оптимизации экспрессии последовательности в заданной клетке-хозяине.

Настоящее изобретение далее включает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую мишеньсвязывающий участок по настоящему изобретению. Нуклеиновая кислота включает ДНК и РНК. В предпочтительном аспекте настоящее изобретение включает нуклеиновую кислоту, которая кодирует СЭЙ, или УН, или УЕ домен по изобретению по определению выше.

Нуклеиновая кислота по изобретению может содержать ДНК или РНК и может быть полностью или частично синтетической. Ссылка на нуклеотидную последовательность по данному описанию охватывают молекулу ДНК со специфической последовательностью и молекулу РНК со специфической последовательностью, в которой остаток и заменён на Т, если по смыслу не требуется иное.

Настоящее изобретение также включает векторы, например, в форме плазмид, вирусов, например, фаг или фагемиду, космиды, кассеты транскрипции или экспрессии, которые содержат по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, как указано выше.

Можно выбрать или сконструировать подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, терминирующие последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие подходящие последовательности. Подробнее см., например, Мо1еси1аг С1опищ: а БаЬога!огу Мапиа1: 2⁶ ебйюп, 8атЬгоок е! а1., 1989, Со1б 8ргшд НагЬог БаЬогаГогу Ргекк.

Векторы по изобретению также включают вирусные векторы, способные инфицировать человеческие клетки ίη νί\Ό, например аденовирусные, ретровирусные или аденоассоциированные вирусные векторы. Такие векторы могут применяться для экспрессии мишень-связывающего участка по изобретению в клетке субъекта - человека или животного, чтобы обеспечить продуцирование и доставку мишеньсвязывающего участка указанному субъекту.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая мишень-связывающий участок по изобретению, в одном аспекте функционально связывается с промотором, чтобы осуществить экспрессию мишеньсвязывающего участка в клетке-хозяине.

Последовательность может включать на своем 5' конце лидерную последовательность, способствующую экспрессии и/или секреции мишень-связывающего участка в клетке-хозяине и/или при использовании клетки-хозяина. В уровне техники известны сами по себе многочисленные подходящие лидерные последовательности, и их может выбрать специалист в данной области техники с учётом клеткихозяина.

Многие известные методы и протоколы манипуляции с нуклеиновыми кислотами, например получения нуклеотидных конструкций, мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и экспрессии генов, и анализа белков подробно описаны в СштепГ Рго!оеок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 8есопб Ебйюп,

- 9 018073

АикиЬс1 с1 а1. сбк., Σοΐιη \УПсу & 8опк, 1992. Раскрытие 8атЬгоок с1 а1. и АикиЬс1 с1 а1. вводится в данное описание ссылкой.

Клетки-хозяева и получение мишень-связывающих участков.

Другой аспект включает клетку-хозяина, трансформированную нуклеиновой кислотой (например, нуклеотидной последовательностью в виде вектора) по изобретению.

В одном варианте изобретения нуклеиновая кислота по изобретению интегрируется в геном (например, хромосому) клетки-хозяина. Интеграцию можно промотировать включением последовательностей, которые инициируют рекомбинацию с геномом, в соответствии со стандартными методами.

Ещё один аспект охватывает способ получения мишень-связывающего участка по изобретению, причём этот способ включает содействие экспрессии при использовании кодирующей нуклеиновой кислоты. Такой способ может включать культивирование клеток-хозяев в условиях получения указанного мишень-связывающего участка.

После получения методом экспрессии УН или УЪ домен или мишень-связывающий участок можно выделить и/или очистить любым подходящим методом, затем использовать при необходимости. Способ получения может включать стадию выделения и/или очистки продукта.

После очистки продукта мишень-связывающий участок можно модифицировать физическими или химическими методами, например, чтобы ввести защитные группы, которые изменяют, например повышают, устойчивость или биологический период полужизни белка. Например, само по себе пегилирование белков для достижения такого эффекта известно в уровне техники, и мишень-связывающие участки по изобретению могут быть в пегилированной форме.

Способ получения может охватывать приготовление из продукта композиции, включающей по меньшей мере один дополнительный компонент, такой как фармацевтически приемлемый эксципиент.

Настоящее изобретение также включает рекомбинантную клетку-хозяина, которая содержит одну или более нуклеиновых кислот или векторов по описанию выше. Получение самой нуклеиновой кислоты, кодирующей любой СОЯ, УН или УЪ домен или мишень-связывающий участок, образует аспект настоящего изобретения, так же как и способ получения кодированного продукта, причём этот способ включает экспрессию при использовании нуклеиновой кислоты, кодирующей продукт.

Хорошо известны системы клонирования и экспрессии полипептида во множестве различных клеток-хозяев. Подходящие клетки-хозяева включают системы бактериальных клеток, клеток млекопитающих, дрожжевые и бакуловирусные системы. Линии клеток млекопитающих, имеющиеся в уровне техники для экспрессии гетерологичного полипептида, включают клетки яичников китайского хомячка, клетки НсЬа, почечные клетки детёныша китайского хомячка, клетки N80 мышиной меланомы, клетки ΥΒ2/0 крысиной меланомы и многие другие. Обычно предпочтительной бактериальной клеткойхозяином является Е.со11.

Экспрессия антител и фрагментов антител в прокариотических клетках, таких как Е.со11, хорошо известна в уровне техники. См., например, обзор Р1иск1йип, А. Вю/Тссйпо1о§у 9: 545-551 (1991). Экспрессия в эукариотических клетках в культуре также известна специалистам в данной области техники как вариант получения мишень-связывающего участка (элемента), см. недавние обзоры, например Яс£, М.Е. (1993), Сигг. Орююп Вю1сс11. 4: 573-576; Тп11 Ы. с! а1. (1995), Сигг. Орююп Вю1сс11. 6: 553-560.

Композиции.

Итак, фармацевтические композиции по настоящему изобретению, и для применения по настоящему изобретению, помимо активного ингредиента могут содержать фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные специалистам в данной области техники. Такие материалы должны быть нетоксическими и не должны отрицательно влиять на эффективность активного ингредиента. Конкретный тип носителя или другого материала зависит от способа введения, который может быть пероральным или с помощью инъекции, например внутривенной.

Терапевтические препараты мишень-связывающего участка (мишень-связывающей частицы) можно приготовить для хранения, смешивая мишень-связывающий участок (частицу) нужной степени чистоты с оптимальными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (см., например, ЯсттЦоп: ТНс 8сюпсс апб Ргасбсс о£ РНагтасу, 20^4Ь Ебйюп, 2000, риЬ. ЫрртсоИ, \νί111атк & νΗΚ^ικ), в виде лиофилизированного порошка или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксическими для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный, и буферы других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА (ΕΌΤΑ); спирты класса углеводов, такие как манит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как ион натрия; и/или неионные поверхностноактивные вещества, такие как Твин, Плуроникс или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Мишень-связывающий участок (элемент, частица), применяемый для введения ш νί\Ό, должен быть стерильным. Это легко осуществить фильтрацией через стерильные фильтрующие мембраны, до или

- 10 018073 после лиофилизации и реконституции. Мишень-связывающий участок (частица) хранится в лиофилизированном виде или в растворе.

Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть в виде таблеток, капсул, порошков или в жидком виде. Таблетка может содержать твёрдый носитель, такой как желатин, или адъювант. Жидкие фармацевтические композиции обычно содержат жидкий носитель, такой как вода, углеводороды, минеральное, животное или растительное масло, минеральное масло или синтетическое масло. В состав могут входить физиологический солевой раствор, раствор декстрозы или других сахаридов или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Для внутривенной инъекции или инъекции в место поражения активный ингредиент должен быть в виде парентерально приемлемого водного раствора, который является апирогенным и имеет соответствующие рН, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области техники легко смогут приготовить соответствующие растворы, используя, например, изотонические носители, такие как раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор Рингера с лактатом для инъекций. При необходимости могут включаться консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки.

Терапевтическое применение изобретения.

Настоящее изобретение включает первую демонстрацию того, что антитела против ΙΕ-25 эффективно предупреждают или уменьшают гиперреактивность дыхательных путей ш νίνο, главный, основной симптом астмы. Так, в одном аспекте изобретение предусматривает способ предупреждения или уменьшения гиперреактивности у субъекта (например, человека), нуждающегося в лечении, который включает введение субъекту мишень-связывающей частицы (мишень-связывающего участка), в частности молекулы антитела, которая связывает Ш-25. В другом аспекте изобретение предусматривает способ предупреждения, уменьшения или лечения астмы у субъекта, нуждающегося в лечении, который включает введение субъекту мишень-связывающей частицы (мишень-связывающего участка), в частности молекулы антитела, которая связывает ΙΕ-25.

Вышеприведённые способы можно на практике применять с мишень-связывающими частицами (участками) (включая их композиции) по настоящему изобретению, которые применимы для связывания и, предпочтительно, для противодействия эффекту антигена ΙΕ-25. с терапевтическим потенциалом, позволяющим лечить различные заболевания и расстройства, в которых принимает участие ΙΕ-25. Способы могут применяться на практике с другими мишень-связывающими частицами (участками) (включая их композиции), которые связывают ΙΕ-25, которые можно получать по описанию, приведённому ниже, в прилагаемых примерах.

Мишень-связывающие частицы (участки) (включая их композиции) по настоящему изобретению можно использовать в способе лечения (включая профилактическое лечение) или диагностики человека или животного. Такой способ лечение или диагностики (который может включать профилактическое лечение) может включать введение указанному субъекту эффективного количества мишеньсвязывающей частицы (участка) по изобретению. Примеры заболеваний и расстройств обсуждаются ниже.

Также предусматривается применение мишень-связывающей частицы (участка) (включая её (его) композиции) по изобретению для получения лекарственного препарата для введения человеку или животному.

Клинические показания, по которым может применяться мишень-связывающая частица (антитело) против ΙΕ-25, чтобы обеспечить терапевтическую пользу, включает любое состояние, при котором ΙΕ-25 вызывает патологические последствия (результаты). Так, обычно мишень-связывающую частицу по изобретению можно использовать для лечения любого состояния, ассоциированного с нежелательной Т11-2 реакцией. Например, мишень-связывающую частицу по изобретению можно использовать для лечения аллергии и астмы, в особенности астмы.

Лечение антитело против ΙΕ-25 можно проводить с помощью инъекции (например, внутривенно) или методами локальной доставки. Антитело против ΙΕ-25 можно доставлять методами, опосредованными генами. Стратегии с альтернативной рецептурой могут включать препараты, пригодные для перорального введения или для применения в виде суппозиториев. Путь введения может определяться физико-химическими характеристиками лекарства, особыми медицинскими соображениями, с целью оптимизировать эффективность и свести к минимуму побочные эффекты.

В соответствии с настоящим изобретением полученные композиции можно вводить индивидуумам. Предпочтительно введение осуществляют в терапевтически эффективном количестве, которого достаточно, чтобы оказать благотворное воздействие на пациента. Такое благотворное воздействие (польза) может представлять собой, по меньшей мере, ослабление по меньшей мере одного симптома. Действительное вводимое количество и скорость, а также продолжительность курса введения зависят от характера и тяжести пролечиваемого заболевания (расстройства). За медицинские назначения, например решение о выборе дозы и т.д., отвечают врачи-терапевты и другие врачи. Подходящие дозы антитела хорошо известны в уровне техники; см. Ьейегшапп РА. е! а1. (1991), ШЕ I. Сапсег. 47: 6590, 664; Ва§511а\\'е Κ.Ό. е! а1. (1991), АпЦЬойу, Iттиηοсοη^идаΐе8 апб КайюрйагтасеиНсаК 4: 915-922.

- 11 018073

Точная доза зависит от ряда факторов, в том числе предназначено антитело для диагностики или для лечения, от размера и местоположения пролечиваемой области, конкретных характеристик антитела (например, полное антитело, фрагмент или диатело (ЛаЬобу)), природы любой детектируемой метки или другой молекулы, связанной с антителом. Типичная доза антитела находится в диапазоне 0,5 мг-1,0 г, и эту дозу можно вводить внутривенно в виде болюса. Другие способы введения включают внутривенную инфузию в течение нескольких часов, чтобы достичь аналогичной общей кумулятивной дозы. Эта доза представляет собой дозу для однократного лечения взрослого пациента, которую можно пропорционально уменьшить (корректировать) для детей и младенцев, а также корректировать для форматов других антител пропорционально молекулярной массе. Процедуры можно повторять через день, дважды в неделю, еженедельно или через месяц, по предписанию врача.

В другом способе применения используется предварительное покрытие или иной путь введения в постоянные устройства, оптимальное количество антитела в этом случае определяют соответствующими опытами.

Молекула антитела в некоторых предпочтительных вариантах изобретения представляет собой мономерный фрагмент, такой как Б(аЬ) или 5сБу. Такие фрагменты антител могут иметь преимущество: относительно короткий период полужизни и меньший риск активации эритроцитов, которая может вызываться кластеризацией рецепторов. Кластеризация, которая вызывает активацию эритроцитов, может представлять, например, кластеризацию либо молекул 1Ь-25, либо 1Ь-25 с молекулами БсуЯП.

Если применяется полное антитело, предпочтительно оно применяется в форме, не способной активировать и/или разрушить эритроциты. Изотип 1дС4 или же изотипы альтернативного дизайна, образованные из каркаса 1дС1 (новые конструкции Бс гена международная заявка \¥0 99/58572. С1агк, Агтоиг, ^1Шат5оп), являются предпочтительным выбором. Можно использовать фрагменты антител меньшего размера, такие как Б(аЬ')₂. Кроме того, можно использовать целые антитела или фрагменты (например, Б(аЬ')₂ или диатела) с двойной специфичностью эпитопов (например, для эпитопов, узнаваемых 5сБу 2С3). Хотя такой вариант изобретения может промотировать кластеризацию рецепторов, высокая скорость ассоциации с отдельными рецепторами может исключить эту проблему.

Мишень-связывающую частицу по настоящему изобретению обычно вводят в форме фармацевтической композиции, которая может содержать по меньшей мере один компонент, помимо мишеньсвязывающей частицы.

Мишень-связывающую частицу по изобретению можно вводить индивидуально или в комбинации с другим терапевтическим лечением либо одновременно, либо последовательно, в зависимости от пролечиваемого состояния. Другое терапевтическое лечение может включать введение подходящих доз обезболивающих лекарств, таких как нестероидные противовоспалительные препараты (например, аспирин, парацетамол, ибупрофен или кетопрофен) или опиаты, такие как морфин; введение противорвотных препаратов или введение по меньшей мере одного другого антиастматического соединения, обычно бронходилатирующего агента, который вызывает релаксацию (расслабление) органов дыхания или повышает клиренс слизи, например, бета-агониста (например, сальбутамола, сальметерола), динатрия кромогликата, стероидов или ингибитора РИЕ_1у.

Методы анализа.

Настоящее изобретение предусматривает способ, включающий побуждение или содействие к связыванию мишень-связывающей частицы по данному описанию с 1Ь-25. Как отмечалось, такое связывание может происходить т у1уо, например, после введения мишень-связывающей частицы или нуклеиновой кислоты, кодирующей мишень-связывающую частицу, или связывание может осуществляться ш νί1го, например, в методах анализа, включая ЕЬ18А, вестерн-блоттинг, иммуногистохимический анализ, иммунопреципитацию или аффинную хроматографию.

Величину связывания мишень-связывающей частицы (молекулы) с 1Ь-25 можно определить. Рассчитанное количество можно отнести к количеству антигена в тестируемом образце, что может представлять интерес для диагностики.

Реактивность антител по отношению к образцу можно определять любым подходящим способом. Радиоиммуноанализ (Я1А) представляет собой одну такую возможность. Меченный радиоактивной меткой антиген смешивают с немеченым антигеном (тестируемый образец) и оставляют связываться с антителом. Связанный антиген физически отделяют от несвязанного антигена и определяют количество радиоактивного антигена, связанного с антителом. Чем больше антигена находится в тестируемом образце, тем меньше радиоактивного антигена связывается с антителом. Анализ конкурентного связывания можно также применять с радиоактивным антигеном, используя антиген или аналог, связанный с репортёрной молекулой. Репортёрная молекула может представлять собой флуорохром, люминесцентный или лазерный краситель со спектральными характеристиками поглощения и возбуждения (эмиссии). Подходящие флуорохромы включают флуоресцеин, родамин, фикоэритрин и техасский красный. Подходящие хромогенные красители включают диаминобензидин.

Другие репортёры (маркеры) включают макромолекулярные коллоидные частицы или макрочастицы, такие как латексные гранулы, окрашенные, магнитные или парамагнитные, и биологически или химически активные агенты, которые могут прямо или опосредованно вызывать детектируемые сигналы,

- 12 018073 наблюдаемые визуально, обнаруживаемые в электронном виде или регистрируемые иным способом. Эти молекулы могут представлять собой ферменты, которые катализируют реакции с появлением или изменением цвета или с изменением, например, электрических свойств.

Эти молекулы могут возбуждаться, так что электронные переходы между энергетическими состояниями вызывают в результате поглощение или эмиссию, определяемые спектрально. Они (молекулы) включают химические агенты, применяемые в сочетании с биосенсорами. Можно использовать системы детекции биотин/авидин и биотин/стрептавидин и щелочную фосфатазу.

Сигналы, генерируемые отдельными конъюгатами антитело-репортёр (маркер), можно использовать для получения измеримых количественно абсолютных или относительных данных связывания релевантного антитела в образцах (нормальном и тестируемом).

Настоящее изобретение также включает применение мишень-связывающей частицы по определению выше для измерения уровней антигенов в конкурентном анализе, т.е. способ определения уровня антигена в образце с применением мишень-связывающей частицы по настоящему изобретению в конкурентном анализе. В этом способе не требуется физическое отделение связанного отделения от несвязанного. Одной такой возможностью является связывание репортёрной молекулы с мишень-связывающей частицей таким образом, что при связывании происходят изменения физических или оптических свойств. Репортёрная молекула может прямо или опосредованно генерировать детектируемые и предпочтительно измеримые сигналы. Репортёрные молекулы могут связываться непосредственно или опосредованно, ковалентной связью, например пептидной связью, или нековалентной связью. Связывание пептидной связью может появиться в результате рекомбинантной экспрессии слияния генов, кодирующих антитело и репортёрную молекулу.

Настоящее изобретение включает также непосредственное измерение уровней антигенов с применением мишень-связывающей частицы по изобретению, например, в биосенсорной системе.

Способ определения связывания не является признаком настоящего изобретения, и специалисты в данной области техники способны выбрать подходящий способ в соответствии со своими предпочтениями и с известным уровнем техники.

Далее настоящее изобретение охватывает мишень-связывающую частицу, которая конкурирует за связывание с ГБ-25 с любой мишень-связывающей частицей, которая как связывается с антигеном, так и содержит У домен, включающий область СЭЯ с аминокислотной последовательностью, практически такой как представленная в данном описании, или У домен с аминокислотной последовательностью, практически такой, как представленная в данном описании. Конкуренцию между (мишень)связывающими частицами можно просто анализировать ίη νίΐτο, например, присоединяя в виде тэга (метки) к одной (мишень)-связывающей частице репортёрную молекулу, которую можно детектировать в присутствии немеченой связанной частицы (немеченых связанных частиц), чтобы содействовать идентификации мишень-связывающих частиц, которые связываются с тем же самым эпитопом или перекрывающимся эпитопом. Конкуренцию можно определять, например, методами ЕБ18А или проточной цитометрии. Конкурентную реакцию можно использовать для селекции одной или более мишеньсвязывающих частиц, таких как производные 2С3, которые обладают одним или более дополнительными или улучшенными свойствами. Этот метод аналогичен методу селекции (отбора) на 2С3 по изобретению за исключением того, что ББ-25, извлекают элюируют не из его комплекса с мини-лигандом, а из комплекса с молекулой антитела. Это может быть важно, так как такая процедура даёт более высокую долю дочерних антител, которые непосредственно конкурируют с исходным (родительским) антителом. На самом деле такие дочерние антитела, как отобранные, могут обладать более высокой аффинностью (сродством) к антигену, чем исходное (способствуя усилению авидности в результате того, что визуализируется более одной молекулы антитела на фаг). Современные методы отбора (селекции) дочерних фаговых антител с повышенной аффинностью включают:

применение концентраций (меченого) целевого антигена (антигена-мишени) ниже константы диссоциации исходного родительского антитела;

применение избытка немеченого целевого антигена (антигена-мишени) в качестве конкурента, как показано в На\\кй15 а1 а1. (1992). Однако они не обязательно указывают, что улучшенное антитело должно вытеснять/занимать тот же эпитоп, что и родительское. Введение стадии элюции должно дать более высокое число (высокую долю) дочерних антител, которые вытесняют родительское. Дочерние антитела, отобранные таким образом, могут связывать эпитоп, очень похожий на эпитоп, который связывает родительское антитело, но с более высокой аффинностью.

При тестировании конкуренции можно использовать пептидный фрагмент антигена, в особенности пептид, включающий эпитоп, представляющий интерес. Можно использовать пептид, содержащий эпитопную последовательность плюс одну или более аминокислот по обоим концам. Можно сказать, что такой пептид состоит практически (главным образом, в основном) из указанной последовательности. Мишень-связывающие частицы по настоящему изобретению могут представлять собой такие частицы, что их связывание с антигеном ингибируется пептидом с данной последовательностью или пептидом, включающим данную последовательность. При тестировании на этот признак можно применять пептид с любой последовательностью плюс одна или более аминокислот.

- 13 018073

Мишень-связывающие частицы, которые связывают специфический пептид, могут быть выделены, например, с помощью фаг-дисплейной библиотеки пэннингом с пептидом (пептидами).

Примеры

Аспекты и варианты настоящего изобретения далее иллюстрируются на примерах со ссылкой на нижеприведённые опыты.

Пример 1. Получение антител против 1Ь-25.

Большую панель антител, полученных в мышах 1125^-/-, иммунизированных против мышиного 1Ь-25 (К&Э Буз1етз), подвергают скринингу. Найдено, что одно из этих антител против 1Ь-25 (2С3) ингибирует как взаимодействие между гт1Ь-25 растворимым т1Ь-25К-Ес слитым белком в зависимости от дозы, так и 1Ь-25-зависимое продуцирование 1Ь-13 первичными мышиными не-В-, не-Т-клетками в ш νίΐΐΌ биоанализе. Антитело также ингибирует взаимодействие между ЫЬ-25 растворимым слитым ЫЬ-25К-Ес. Сочетание этих свойств далее исследуют на ш νί\Ό системах, чтобы продемонстрировать полезность при лечении астмы.

Пример 2. Экспериментальная модель аллергической астмы.

Мышей Ва1Ь/с сначала сенсибилизируют антигеном овальбумином (ΟVА), а затем стимулируют (провоцируют) ΟVА в виде аэрозоля (ингаляторная провокация). У сенсибилизированных и стимулированных Ва1Ь/с мышей развивается характерный фенотип астмы. Он характеризуется повышенной АНК (гиперреактивностью дыхательных путей) после экспозиции с провоцирующим агентом метахолином, эозинофильной инфильтрацией дыхательных путей и секрецией сывороточного 1дЕ по сравнению с контрольными мышами Ва1Ь/с, стимулированными с помощью РВБ (фиг. 1).

Напротив, введение антитела тАЬ против 1Ь-25 перед каждой сенсибилизацией и введением аэрозоля (аэрозолизацией) ΟVА приводит к заметной нейтрализации АНК после ингаляторной провокации метахолином, причём величины резистентности сравнимы с РВБ контрольными мышами (фиг. 1А). Введение изотипически родственного контрольного тАЬ не подавляет АНК (фиг. 1А).

Антитело тАЬ против 1Ь-25 также значительно снижает уровни клеточной инфильтрации близ сосудистой системы (фиг. 1В и 3А), гиперплазию бокаловидных эпителиальных клеток в дыхательных путях (фиг. 1С и 3В) и уровни антиген-специфического сывороточного 1дЕ (фиг. 1Ό).

Анализ бронхоальвеолярного лаважа (ВАЬ) показывает, что эозинофильная инфильтрация также в значительной степени подавляется после введения тАЬ против 1Ь-25 по сравнению с мышами, получавшими изотопический контроль (фиг. 1Е). Так как известно, что цитокины типа 2 регулируют эти эффекторные функции, определили уровни цитокинов, секретированных при использовании клеток, выделенных из дренирующих медиастинальных (средостенных) лимфоузлов после рестимуляции антигеном. В противоположность повышенным уровням цитокинов типа 2, 1Ь-4, 1Ь-5 и 1Ь-13, индуцированных ОVАсенсибилизацией и стимуляцией в Ва1Ь/с мышах, введение тАЬ против ЕЬ-25 приводит к значительному снижению уровней этих цитокинов (фиг. 1Е).

Эти результаты подтверждают гипотезу, что блокируя передачу сигнала 1Ь-25, ограничивается продуцирование цитокинов типа 2, приводя к аннулированию эффекторных функций типа 2, включая воспаление и АНК. Таким образом, антагонисты 1Ь-25 эффективно подавляют воспаление типа 2, если вводятся с момента стимуляции ответа.

Материалы и методы.

Мышей Ва1Ь/с получают от Наг1ап ИК и сохраняют в лабораторном оборудовании БАВИ/СВБ или Национального института заболеваний сердца и лёгких (№11юпа1 НеаЛ апб Ьипд 1пзШи!е) в специфической беспатогенной среде. Все эксперименты на животных, приведённые в данном сообщении, проводятся с разрешения Министерства внутренних дел Великобритании (ИК Ноте ОГПсе).

Сенсибилизация и экспозиция с аллергеном.

Мышей Ва1Ь/с (в возрасте 6-12 недель) сенсибилизируют, вводя внутрибрюшинно (интраперитонеально) овальбумин (20 мкг/инъекция) в комплексе с квасцами или только квасцы (контроль) в дни 0 и 12. Введение аэрозоля 1% овальбумина осуществляют на 19-, 20-, 21-й дни в течение 20 мин/день. На 22-й день животных проверяют, используя плетизмографию для оценки АНК.

Введение моноклональных антител против гт1Ь-25.

Г иперреактивность дыхательных путей (АНК) вызывают, как описано выше и интраперитонеально вводят тАЬ против 1Ь-25 (500 мкг/доза) за день до каждой интраперитонеальной сенсибилизации с помощью ОVА, за день до ОVА стимуляции в лёгкие и за 4 ч перед каждой ОVА аэрозолизацией. В других экспериментах тАЬ против 1Ь-25 (500 мкг/доза) вводят только в день аэрозолизации, но перед каждой аэрозолизацией. Контрольные мыши получают либо физиологической раствор, либо изотипический контроль (500 мкг/доза) вместо тАЬ против 1Ь25. Изотипическим контролем является антитело против с-тус (мышиный 1дС1, клон 9Е10.2).

Определение чувствительности (отвечаемости) дыхательных путей.

Животных анестезируют, проводят трахеостомию и подсоединяют к аппарату искусственной вентиляции лёгких (серия БАК-830, СVЕ 1пс) с частотой дыхания 150 вдохов/мин, дыхательный объём 0,2 мл. Мышей контролируют с помощью плетисмографа, позволяющего определять изменение объёма всего тела (ЕМКА Тес11по1ощез, Рапз), а транспульмонарное давление определяют с помощью подклю

- 14 018073 чённого датчика. После регистрации фонового лёгочного сосудистого сопротивления с помощью ультразвукового небулайзера вводят увеличивающиеся концентрации ацетил-в-метилхолина хлорида (метахолина) (81дта, Эог5е1, иК) в виде аэрозоля в течение 15 с при каждой концентрации, и лёгочную сосудистую сопротивляемость регистрируют в течение 5 мин. Для анализа лёгочного сосудистого сопротивления, изменения объёма лёгких и стандартных параметров лёгких используют программное обеспечение ΙΟΧ.

Бронхоальвеолярный лаваж (ВАЬ).

Мышей умерщвляют цервикальной дислокацией и аликвоты РВ8 4x500 мкл инъецируют через трахеостому и извлекают. Определение лейкоцитарной формулы на 150 клетках осуществляют на препаратах, полученных на цитоцентрифуге (цитоспин), окрашенных красителем Гимзы.

Пример 3. Введение перед стимуляцией (провокацией).

Определим, эффективно ли тАЬ против 1Ь-25 при введении только перед ΟΥΑ ингаляторной стимуляцией. Обработка с помощью тАЬ против ЕЬ-25 резко снижает сопротивляемость дыхательных путей, индуцированную провокацией метахолином, даже когда её проводят на более поздней стадии реакции (фиг. 2А). Напротив, введение контрольного родственного изотипически тАЬ не отменяет АНЯ.

Важно отметить, что анализ гистологических срезов лёгких не показывает значительных изменений уровней клеточной инфильтрации вокруг кровеносных сосудов (фиг. 2В) или гиперплазии бокаловидных клеток дыхательных путей (фиг. 2С) при сравнении мышей, получавших тАЬ против ЕЬ-25, или контрольных мышей Ва1Ь/с, стимулированных ΟVΑ, или контрольных мышей, получавших родственное по изотипу тАЬ.

Далее, не наблюдается уменьшения содержания эозинофилов в ВАЬ жидкости (фиг. 2Ό) или уровней антиген-специфического сывороточного 1дЕ (фиг. 2Е) после введения тАЬ против 1Ь-25. Поразительно, но цитокинов типа 2 ЕЬ-5 и ЕЬ-13 остаются сравнимыми с их уровнями у стимулированных ΟVΑ контрольных мышей Ва1Ь/с или контрольных мышей, получавших родственное по изотипу тАЬ после рестимуляции (фиг. 2Е), а уровни ГЬ-13 в ВАЬ также остаются неизменными. Таким образом, введение антитела против 1Ь-25 в фазе стимуляции (провокации, сенсибилизации) реакции может специфически отменить АНЯ даже когда цитокины типа 2 и их даунстрим эффекторы не подавляются. Эти результаты наводят на мысль, что 1Ь-25 может инициировать АНЯ по метаболическому пути, независимому от классического типа 2 реакции.

Материалы и методы.

Применяют материалы и методы, описанные в примере 2 с добавлением.

Сбор и гистологическое исследование лёгочной ткани.

Для гистологического анализа лёгкие фиксируют в формалине (10% раствор в формальдегида в 0.9% физиологическом солевом растворе). Срезы лёгких окрашивают красителем Гимзы для обнаружения воспалительного инфильтрата и периодной кислотой-реактивом Шиффа (РА8) для изучения бокаловидных клеток. Окрашенные РА8 бокаловидные клетки эпителия дыхательных путей определяют вслепую (слепым методом), используя количественную шкалу (0: <5% бокаловидных клеток; 1: 5-25%; 2: 25-50%; 3: 50-75%; 4: >75%). Суммарную оценку для каждого лёгкого делят на число изученных дыхательных путей, по 20-40 дыхательных путей/мышь, и выражают в виде РА8 баллов в условных единицах. Воспаление оценивают, пользуясь количественной шкалой для определения числа клеток инфильтрата вокруг кровеносных сосудов (0: слой клеток воспалительного инфильтрата вокруг сосудов <2 клеток толщиной, 1: 2-4 клетки толщиной, 2: 5-8 клеток толщиной, 3: >8 клеток толщиной). Сумму баллов для каждого лёгкого делят на число изученных сосудов, 20-40 дыхательных путей/мышь, и выражают в относительных единицах.

Пример 4. 1Ь-25 действует по независимому пути типа 2.

Проверим, может ли экзогенно вводимый гтГЬ-25 вызвать усиленную АНЯ даже в отсутствие антигенной сенсибилизации или провокации. Уже через 16 ч после интраназального введения гтГЬ-25 мышам Ва1Ь/с обнаруживаем значительно повышенное сопротивление дыхательных путей (бронхиальное сопротивление, гиперреактивность дыхательных путей) (фиг. 3А). В предыдущих сообщениях имеются указания на центральную роль, которую играет ГЬ-13 в фенотипе астмы и, в частности, в АНЯ. Для того чтобы определить, опосредует ли 1Ь-25 эту роль в АНЯ через 1Ь-13, вводили гтГЬ-25 мышам 1113^-/-. И снова наблюдается повышенная АНЯ после введения гтГЬ-25 (фиг. 3В). Так как было показано, что другие цитокины типа 2 участвуют в фенотипе астмы, также определяем реакцию ϊ14^-/-ΐ15^-/-ΐ19^-/-ϊ113^-/- на вводимый интраназально гтГЬ-25. Даже в отсутствие всех цитокинов классического типа 2 введение 1Ь-25 усиливает АНЯ провокации метахолином (фиг. 3с). Эти результаты подтверждают роль ГЬ-25 в усилении АНЯ по независимому от типа 2 метаболическому пути.

- 15 018073

Материалы и методы.

Применяют материалы и методы, описанные выше, в примерах 2 и 3, с добавлением.

Мыши.

Трансгенные ί14^-/-ί15^-/-ί19^-/-ί113^-/- мыши (Р.6. Ра11оп е1 а1., 2002. Гттипйу 17, 7) и 1113^-/- мыши (6.1. МсКегШе еГ а1., 1998. Сигг Βίο1. 8, 339) на основе мышей Ва1Ь/с по описанию. 1125^-/- мыши на основе С57ВЬ/6х 129 Р2 по описанию (Р.6. Ра11оп еГ а1., 2006. Р Ехр. Мей. 203, 1105).

Интраназальное введение 1Ь-25.

Мышам вводят 1,8 мкг г1Ь-25 (Κ&Ό 8укГетк) или 1,8 мкг г1Ь-13 (РергоГесй) в 40 мкл РВ8 каждой интраназально в день 0. Контрольные мыши получают только РВ8.

Пример 5. Клонирование вариабельных доменов 2С3.

Выделяют РНК из трёх субклонов 2с3 и получают кДНК реакцией обратной транскрипции.

кДНК тяжёлой цепи иммуноглобулина (1дН) амплифицируют с помощью ПЦР, используя консервативный праймер 5' УН-области, МНУ7 (8ЕЦ ΙΌ N0: 11) в комбинации с праймером константной области 1д61 МНС61 (8ЕЦ ΙΌ N0: 12).

Аналогично лёгкую цепь иммуноглобулина (1§К) используют с помощью праймеров консервативной 5' 1дК области МКУ9 (8ЕЦ ΙΌ N0: 13) в комбинации с праймером каппа константной области (8ЕЦ ΙΌ N0: 14).

При проведении ПЦР реакций используют термостабильную полимеразу Р1шкюп (кЕВ Р-531Ь).

Продукты 2с3 амплификации реакцией ПЦР с праймерами УН7 + МНС61 - при использовании трёх независимых кДНК непосредственно лигируют в вектор рСКП®В1ип1- ТОРО®, используя набор для клонирования ТОРО-Ь1ип1 с1оп1пд® (СаГ 45-0245), как и продукты реакции амплификации лёгкой цепи. Бактерии Е.сой Т0Р10, трансформированные при использовании лигированных рСКП-ЫииГ векторных конструкций, клонируют на планшетах ЬВ-амлициллин-Х6а1-агар, собирая белые колонии на сетку из агар-агара и в смесь для ПЦР скрининга. Клонированные инсерты в плазмиду ПЦР амплифицируют. Продукты амплификации подвергают электрофорезу в геле и получают ожидаемые продукты. Ночные культуры (5 мл) каждого клона, продуцирующие продукт ПЦР-амплификации корректного размера, процессируют, используя протокол набора ОМргер 8рш М1шргер К1Г (саГ 27106) для получения минипрепаратов ДНК-плазмид.

Плазмиды секвенируют, используя готовый набор для секвенирования В1§Вуе® Тегт1паГог ν3.0 Сус1е 8ес.|иепстд Кеайу Кеасйоп Кй (ΑΒI саГ. 4390242). Каждую выбранную плазмиду секвенируют в обоих направлениях, используя циклы с М13 прямым и обратным праймерами на ПЦР-амплификаторе 6епеАтр9600. Электрофоретический анализ последовательностей проводят на капиллярном ДНКсеквенаторе АВР

Полный цикл КТ-РСК (РВ-ПЦР), клонирования и анализа ДНК-последовательностей повторяют для получения трёх совершенно независимых наборов данных о последовательностях для каждой цепи иммуноглобулина.

Полные предсказанные нуклеотидные последовательности генов УН и Ук показаны как 8Е0 ΙΌ N0: 15 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 16 соответственно. Эти последовательности включают лидерную последовательность в начале каждого вариабельного генного сегмента, который кодирует сигнальную последовательность, используемую для транспорта вновь синтезированных цепей антитела в эндоплазматический ретикулум; они отсутствуют в конечной тяжёлой и лёгкой цепях.

Ссылки

1. Р.6. Ра11оп еГ аР, Iттиийу. 17, 7 ЦиР, 2002).

2. 6. 6гатд еГ а1., 8с1епсе. 282, 2261 (1998).

3. М. ^Шк-Кагр еГ а1., 8аепсе. 282, 2258 (1998).

4. М.М. Рой еГ а1., Iттишίу. 15, 985 (Вес., 2001).

5. М.К. К1т еГ а1., В1оой. 100, 2330 (0сГ. 1, 2002).

6. 6. Рап еГ а1., Р Iттииο1. 167, 6559 (Бес. 1, 2001).

7. 8.Ώ. НигкГ еГ а1., Р ^типоР 169, 443 (М 1, 2002).

8. Т.А. Моке1еу, Ό.Κ. НаийепксйПй, Ь. Коке, А.Н. Кейй1, СуГокте 6го\\111 РасГог Кет. 14, 155 (Арг., 2003).

9. Р.6. Ра11оп еГ а1., Р Ехр. Мей. 203, 1105 (Арг. 17, 2006).

10. А.М. 0\\уап§ еГ а1., Р Ехр. Мей. 203, 843 (Арг. 17, 2006).

11. Т. ТатасЫ еГ а1., Р А11егду С1т. Iттииο1. 118, 606 (8ер., 2006).

Claims (30)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Мишень-связывающая частица, которая связывает ГБ-25 и содержит УН домен антитела, включающий область УН СБЕ3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 7.
2. 2. Мишень-связывающая частица по п.1, отличающаяся тем, что УН домен дополнительно содержит область СБЕ1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 5, и область СБЕ2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 6.
3. 3. Мишень-связывающая частица по п.1, отличающаяся тем, что УН домен содержит человеческую каркасную область.
4. 4. Мишень-связывающая частица по п.1, отличающаяся тем, что УН домен содержит ЗЕО ΙΌ N0: 2.
5. 5. Мишень-связывающая частица по п.1, которая дополнительно содержит УБ домен с областью СБЕ1, имеющей аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 8, областью СБЕ2, имеющей аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 9, и областью СБЕ3, имеющей аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 10.
6. 6. Мишень-связывающая частица по п.5, отличающаяся тем, что УБ домен содержит человеческую каркасную область.
7. 7. Мишень-связывающая частица по п.5, отличающаяся тем, что УБ домен содержит ЗЕО ΙΌ N0: 4.
8. 8. Мишень-связывающая частица по п.1, отличающаяся тем, что она представляет собой ЕаЬ, Е(аЬ')₂, 8сГу фрагмент антитела.
9. 9. Мишень-связывающая частица по п.1, отличающаяся тем, что она содержит константную область антитела.
10. 10. Мишень-связывающая частица по п.9, отличающаяся тем, что константная область представляет собой константную область !дС1 или [§С4.
11. 11. Мишень-связывающая частица по п.9, отличающаяся тем, что она содержит полное антитело.
12. 12. Выделенная нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую мишень-связывающую частицу по п.1.
13. 13. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.12, функционально связанную с промотором.
14. 14. Клетка-хозяин, несущая экспрессирующий вектор по п.13.
15. 15. Способ получения мишень-связывающей частицы, заключающийся в культивировании клетокхозяев по п.14 в условиях, пригодных для продуцирования указанной мишень-связывающей частицы.
16. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что он дополнительно включает выделение указанной мишень-связывающей частицы.
17. 17. Способ получения композиции, включающий приготовление из мишень-связывающей частицы композиции, включающей по меньшей мере один дополнительный компонент.
18. 18. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения астмы, содержащая мишеньсвязывающую частицу по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
19. 19. Композиция по п.18 в виде лиофилизированного порошка.
20. 20. Применение мишень-связывающей частицы по п.1 для получения лекарственного препарата для лечения или предупреждения астмы.
21. 21. Применение мишень-связывающей частицы по п. 1 для лечения или предупреждения астмы.
22. 22. Способ получения антител против ΙΕ-25, включающий следующие стадии:

    (а) объединение УН домена, содержащего мишень-связывающую частицу, способную связывать ΙΕ-25 и содержащую УН домен области СБЕ3 антитела, имеющей аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 7, с совокупностью УБ доменов антитела с целью получения молекул антител;

    (б) скрининг молекул антител, полученных на стадии а) на связывание с ΙΕ-25;

    (в) отбор молекул антитела, способных связываться с ΙΕ-25.
23. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что УН домен дополнительно содержит область СБЕЕ имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 5, и область СБЕ2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 6.
24. 24. Способ получения мишень-связывающей частицы против ЕБ-25, включающий следующие стадии:

    (а) объединение исходного набора нуклеиновых кислот, кодирующих УН домен, либо содержащих область, кодирующую подлежащую замене СБЕ3, либо не содержащих область, кодирующую СБЕ3; и донорной нуклеиновой кислоты, кодирующей область УН СБЕ3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 7, таким образом, что указанная донорная нуклеиновая кислота встраивается в набор, с получением набора нуклеиновых кислот, кодирующих УН домен, содержащий область УН СБЕ3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕО ΙΌ N0: 7;

    (б) экспрессию нуклеиновых кислот набора, полученного на стадии а) для получения мишень

    - 17 018073 связывающих частиц;

    (в) селекцию мишень-связывающей частицы, специфической к ΙΕ-25; и (г) выделение полученной на стадии в) мишень-связывающей частицы или кодирующей её нуклеиновой кислоты.
25. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что нуклеиновые кислоты указанного набора коэкспрессируются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими УЪ домен.
26. 26. Мишень-связывающая частица по п.6, отличающаяся тем, что УН домен содержит человеческую каркасную область.
27. 27. Мишень-связывающая частица, которая конкурирует за связывание с Ш-25 со второй мишеньсвязывающей частицей, причем вторая мишень-связывающая частица связывает Ш-25 и содержит УН домен антитела, включающий область УН СЭКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 7.
28. 28. Мишень-связывающая частица, содержащая антигенсвязывающий сайт человеческого антитела, отличающаяся тем, что эта мишень-связывающая частица конкурирует за связывание с Ш-25 со второй мишень-связывающей частицей, причём вторая мишень-связывающая частица связывает Ш-25 и содержит УН домен антитела, включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, и УЪ домен антитела, включающий 8ЕЦ ΙΌ N0: 4.
29. 29. Мишень-связывающая частица, которая связывает Ш-25, отличающаяся тем, что эта мишеньсвязывающая частица содержит УН домен антитела, включающий область УН СЭКЗ, имеющую аминокислотную последовательность, которая содержит от 1 до примерно 10 аминокислотных замен в 5ЕО ΙΌ N0: 7.
30. 30. Мишень-связывающая частица, которая связывает Ш-25, отличающаяся тем, что эта мишеньсвязывающая частица содержит УН домен антитела, включающий аминокислотную последовательность, которая содержит от 1 до примерно 20 аминокислотных замен в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.