JP6250351B2 - 好酸球性気道炎症に関する情報の取得方法およびそのような情報を取得するためのマーカー - Google Patents
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Description
例えば、非特許文献1には、喀痰中好酸球数に基づく治療管理は、従来の標準的な治療管理と比べて、喘息の急性増悪(または重症発作)を顕著に抑制することが記載されている。
また、非特許文献2には、好酸球性炎症の情報を用いることで難治療の喘息患者から好酸球性炎優勢群(症状の程度は低いが好酸球性炎症が高い群)を特定できること、その群に対して喀痰中好酸球に基づく治療管理を行った場合、標準的な治療管理と比べて喘息の悪化を抑制できることが記載されている。
例えば、非特許文献3には、吸入コルチコステロイド治療を受けてもなお症状を呈していた重度の喘息患者において、血中Periostinレベルを好酸球性気道炎症の全身性バイオマーカーとして用い得ることが記載されている。
被験者の血液試料中の、CCL27およびCXCL9から選択される少なくとも1つのマーカーの量を測定し、
得られた測定値に基づいて、前記被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得する方法が提供される。
当該技術において、CCL27タンパク質のアミノ酸配列自体は公知である。このタンパク質のアミノ酸配列は、例えばSWISS-PROT(アクセッション番号:Q9Y4X3)などの公知のデータベースから知ることができる。
当該技術において、CXCL9タンパク質のアミノ酸配列自体は公知である。このタンパク質のアミノ酸配列は、例えばNational Center for Biotechnology Information (NCBI;アクセッション番号:NM_002416)などの公知のデータベースから知ることができる。
IL-25は、Th2細胞、気道上皮細胞、および肥満細胞などによって産生される、Pro-Th2サイトカインであり、IL-17ファミリーのサイトカインとして公知である。
当該技術において、IL-25タンパク質のアミノ酸配列自体は公知である。このタンパク質のアミノ酸配列は、例えばSWISS-PROT(アクセッション番号:Q9H293)などの公知のデータベースから知ることができる。
マーカータンパク質の量の測定方法は、当業者に周知の抗原抗体反応に基づくタンパク質測定法であれば特に限定されないが、例えばELISA法、ウェスタンブロット法などが挙げられ、好ましくはELISA法である。これらの測定方法に用いられる抗体は、血液試料中の各マーカータンパク質を特異的に認識して結合することができる抗体であれば特に限定されない。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルの全長抗体または抗体フラグメント(Fab、F(ab')2)などであり得る。このような抗体の作製方法は、当業者に公知である。あるいは、抗体は市販製品であってもよい。
マーカータンパク質の量の測定には、当業者に公知の市販のタンパク質定量キット、例えば、R&D systems社製Duoset ELISA測定用キット、Peprotech社製ELISA development kitなどを用いてもよい。
マーカーの量の測定値は、測定値そのもの(生データ)又はその値に基づいて算出された値であってもよく、例えば、濃度、強度、レベル、質量(重量)、比、などのいずれの形式又は単位でも表すことができる。
本実施形態では、被験者から採取した血液試料中のマーカーの量の測定値に基づいて、前記被験者における好酸球性気道炎症に関する情報を取得することができる。なお、マーカーの量の測定および好酸球性気道炎症に関する情報の取得については、これまでに述べたことと同様である。
被験者の血液試料中のCCL27およびCXCL9から選択される少なくとも1つのマーカーの量に関する情報を取得する測定部と、
前記測定部で取得したマーカーの量に関する情報に基づいて、前記被験者についての好酸球性気道炎症に関する情報を取得する情報処理部と、
前記情報処理部で得られた情報を出力する出力部と
を備える、好酸球性気道炎症に関する情報の取得装置(以下、単に「情報取得装置」ともいう)が提供される。
コンピュータに、
被験者の血液試料中のCCL27およびCXCL9から選択される少なくとも1つのマーカーの量に関する情報を受け取る受領ステップと、
前記受領ステップで受け取ったマーカーの量に関する情報に基づいて、前記被験者についての好酸球性気道炎症に関する情報を取得する情報取得ステップと、
前記情報取得ステップで得られた情報を出力する出力ステップと、
を実行させるためのコンピュータプログラムが提供される。
本実施形態に係る情報取得装置は、本発明の実施形態に係る情報取得方法を実施するのに好適な装置の一例である。なお、本実施形態に係る情報取得装置は、上記マーカーの量に関する情報として、タンパク質測定で得られた発光強度に基づいて算出した量の測定値を採用し、該測定値と測定値についての閾値とを比較して情報取得を行なう装置である。
本実施の形態に係る情報取得装置1は、タンパク質測定装置100(以下、「測定部100」ともいう)と、これと接続された情報処理装置200(以下、「コンピュータ200」ともいう)とから構成されている。
測定部100は、全自動ELISA装置などのタンパク質測定法を実行可能なタンパク質測定装置からなる。測定部100は、血液試料中のマーカーの量の測定時に観測されたマーカーの量に関する情報、例えば発光強度などを測定する装置である。
測定部100には、コンピュータ200が接続されている。コンピュータ200は、測定部100の動作を制御するとともに、測定部100で測定された上記の発光強度などのデータに基づいて、好酸球性気道炎症に関する情報を取得する。
情報処理部210は、CPU210aと、ROM210bと、RAM210cと、ハードディスク210dと、読出装置210eと、入出力インタフェース210fと、画像出力インタフェース210hと、バス210iとを備えている。
情報処理部210内において、CPU210a、ROM210b、RAM210c、ハードディスク210d、読出装置210e、入出力インタフェース210fおよび画像出力インタフェース210hは、それぞれバス210iによって、データの送受信が可能に接続されている。
ハードディスク210dには、オペレーティングシステム(OS)、アプリケーションプログラムなど、CPU210aに実行させるための種々のコンピュータプログラムおよびそのコンピュータプログラムの実行に用いられるデータがインストールされている。
ハードディスク210dにインストールされているプログラムには、好酸球性気道炎症に関する情報の取得方法を実現するためのアプリケーションプログラム240aおよび測定部100を制御するプログラムが含まれている。また、ハードディスク210dには、好酸球性気道炎症に関する情報の取得方法を実現するためのプログラムの実行に用いられるデータとして、閾値などが記憶されている。
また、CPU210aが外部記録媒体240から当該アプリケーションプログラム240aを読み出し、アプリケーションプログラム240aをハードディスク210dにインストールすることも可能である。
発光強度が閾値以上である場合(Yes)、ステップS4−1に処理を進める。反対に、発光強度が閾値未満である場合(No)、ステップS4−2に処理を進める。
なお、本実施形態において、タンパク質測定で得られた発光強度のデータは、測定部100から入出力インタフェース210fを介して取得されるが、これに限定されるものではない。ユーザーがタンパク質測定で得られた発光強度のデータを入力デバイス230により入力し、CPU210aが、これら入力された値を発光強度として取得してもよい。
本発明のマーカーCCL27およびCXCL9を単独で用いた場合の性能を調べるため、下記のような試験を行った。また、比較のために、好酸球性気道炎症の既知マーカーであるPeriostin、好酸球との関連性が示唆されているEotaxinおよびTARC(CCL17, CC Chemokine Ligand 17)についても同様に試験を行った。
国立病院機構相模原病院より、喘息患者39名の血清試料を入手した。これらの喘息患者について、喀痰を用いてハンセル法による好酸球検査を行った結果、喀痰好酸球が検出された(喀痰好酸球陽性)患者は33名、喀痰好酸球が検出されなかった(喀痰好酸球陰性)患者は6名であった。
上記で得た血清試料を用いて、各マーカーの量を測定するために下記のようにしてELISA測定を行った。
(2-1) CCL27
ELISA測定用キットとしてR&D systems社製 Duoset (DY376)を使用した。
まず、96ウェルELISAプレートに100μLの抗体希釈液(4μg/mL固相抗体,0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、4℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファー(0.05%Tween20, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)で3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファー(1% BSA,0.5% Casein, 0.05% Tween20, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)で、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer (1% BSA, 0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)で4倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.075μg/mL標識抗体, 1% BSA, 0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1:1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase [R&D systems AR001 ], 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS PH7.4)を添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファー(20mM Tris 10mM MgCl pH9.8)で1回洗浄し、基質(CDP-Star Ready-to-use Sapphire II Tropix)を100μL添加し、化学発光検出装置(FLUO star OPTIMA BMG LabTech)で発光シグナルを検出した。
ELISA測定用キットとしてR&D systems社製 Duoset (DY392)を使用した。
まず、96ウェルELISAプレートに100μLの抗体希釈液(1μg/mL固相抗体, PBS pH7.4)を添加し、4℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer (1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)にて4倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.2μg/mL標識抗体, 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4) を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄する。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1:1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase, 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)100μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファーで洗浄し、基質を添加し、100μLの化学発光検出装置で発光シグナルを検出した。
ELISA測定用キットとしてR&D systems社製 Duoset (DY3548)を使用した。
まず、384ウェルELISAプレートに50μLの抗体希釈液( 1μg/mL固相抗体,PBS pH7.4)を添加し、4℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、100μLのブロッキングバッファー(1% BSA,0.5% Casein, 0.05% Tween20, 0.05% NaN3, PBS pH7.4) で、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer (1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)で100倍希釈した血清を50μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し50μLの標識抗体液(2μg/mL標識抗体, 1% BSA, 0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。50μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1:1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase, 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)を50μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、100μLのALP活性化バッファーで洗浄し、50μLの基質を添加し、化学発光検出装置(FLUO star OPTIMA BMG LABTECH)で発光シグナルを検出した。
ELISA測定用キットとしてR&D systems社製 Duoset (DY320)を使用した。
まず、96ウェルELISAプレートに100μLの抗体希釈液( 2μg/mL固相抗体, PBS pH7.4)を添加し、4℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer (1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)で4倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.1μg/mL標識抗体, 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄する。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1:1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase, 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)を100μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファーで洗浄し、100μLの基質を添加し、化学発光検出装置で発光シグナルを検出した。
ELISA測定用キットとしてR&D systems社製 Duoset (DY364)を使用した。
まず、96ウェルELISAプレートに100μLの抗体希釈液(2μg/mL固相抗体, PBS pH7.4)を添加し、4℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer (1% BSA, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)で4倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.1μg/mL標識抗体, 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)を添加する。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1:1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase, 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)100μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファーで洗浄し、100μLの基質を添加し、化学発光検出装置で発光シグナルを検出した。
各マーカーについて、濃度既知のスタンダードの発光シグナル(RLU)から4-Parameter fitにより検量線を作成した。検体から得られた発光シグナル(RLU)を検量線にあてはめ、血清中のマーカー濃度を算出した。解析には解析ソフトMARS(BGM LABTECH)を使用した。
統計解析にはStatFlex Version 6.0 (YUMIT)を使用した。
(4-1) 有意差検定
喀痰好酸球の陽性または陰性に応じて患者群を2群に分け、マンホイットニー検定にて血清中のマーカー濃度差を検定した。検定結果を表1−1にまとめる。
ROC曲線を求め喀痰好酸球陽性または陰性のカットオフを設定し感度および特異度を算出した。
カットオフの設定は、ROC曲線において、(感度、1−特異度)が(1、0)である点から最も近いポイント(図中に矢印で表記)に設定した。
(4-3) ROC曲線の比較
各項目間でHanleyの方法によりROC曲線の曲線下面積(AUC)を比較した。
実施例2において、本発明者は、CCL27およびCXCL9について、好酸球性気道炎症の一次スクリーニング用マーカーとしての性能を調べるために、非喘息健常成人の血清中のマーカー濃度を測定し、実施例1で得られたマーカー濃度を比較および解析する実験を行った。具体的には、非喘息健常成人検体として健常ボランティア12名から得られた血清試料を用いて実施例1と同様にELISAによるマーカー濃度測定を行い、実施例1で用いた血清試料39検体から得られたマーカー濃度のデータと組み合わせて実施例1と同様の統計解析を行った。なお、非喘息健常成人は、喀痰好酸球陰性群に含めて扱った。
実施例3において、本発明者は、単独で良好な判別性能を示した本発明のマーカーCCL27とCXCL9とを組み合わせて、更に優れた判別性能が得られるかどうかを調べた。また、本発明のマーカーCCL27とCXCL9にさらにIL-25を組み合わせて、更に優れた判別性能が得られるかどうかを調べた。
ELISA測定にはPeprotech社製 ELISA development kit (900-K234)を使用した。
まず、ELISAプレートに100μLの抗体希釈液(1μg/mL固相抗体, PBS pH12.0)を添加し、4℃で一晩抗体を固相化した。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのブロッキングバッファーで、室温で2時間以上ブロッキングした。ELISA Dilution Buffer(1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)で4倍希釈した血清を100μL添加し、4℃で一晩反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し100μLの標識抗体液(0.25μg/mL標識抗体, 1% BSA,0.5% Casein, 0.05% NaN3, PBS)を添加した。2時間室温で反応し、洗浄バッファーで3回洗浄した。100μLのアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン液(1:1000希釈Streptavidin-Alkaline Phosphatase, 1% BSA, 0.05% NaN3, PBS pH7.4)100μL添加し、20分間反応させた。洗浄バッファーで3回洗浄し、250μLのALP活性化バッファーで洗浄し、100μLの基質を添加し、化学発光検出装置で発光シグナルを検出した。
更に、本発明のマーカーに加えて、IL-25を組み合わせた場合(図3B)には、CCL27およびCXCL9を組み合わせた場合(図3A)よりも優れた判別性能が得られることが示唆された。
200 情報処理装置(コンピュータ)
210 情報処理装置本体(情報処理部)
220 表示部(出力部)
230 入力デバイス
240 外部記録媒体
210a CPU
210b ROM
210c RAM
210d ハードディスク
210e 読出装置
210f 入出力インタフェース
210h 画像出力インタフェース
210i バス
240a アプリケーションプログラム
Claims (6)
- 被験者の血液試料中の、CCL27およびCXCL9から選択される少なくとも1つのマーカーの量を測定し、
得られた測定値と所定の閾値とを比較し、その比較結果に基づいて、前記被験者が、喀痰好酸球陽性であるか又は喀痰好酸球陰性であるかを判別する方法。 - 被験者の血液試料中の、CCL27およびCXCL9のマーカーの量を測定し、
CCL27の測定値およびCXCL9の測定値に基づいて、前記被験者が、喀痰好酸球陽性であるか又は喀痰好酸球陰性であるかを判別する請求項1に記載の方法。 - CCL27の測定値およびCXCL9の測定値に基づいて、多重ロジスティックモデルにより予測値を取得し、
取得された予測値と所定の閾値とを比較し、その比較結果に基づいて、前記被験者が、喀痰好酸球陽性であるか又は喀痰好酸球陰性であるかを判別する請求項2に記載の方法。 - さらにIL-25マーカーの量を測定する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 被験者の血液試料中のCCL27およびCXCL9から選択される少なくとも1つのマーカーの測定値を取得する測定部と、
前記測定部で取得したマーカーの測定値と、所定の閾値とを比較し、その比較結果に基づいて、前記被験者が、喀痰好酸球陽性であるか又は喀痰好酸球陰性であるかについての情報を取得する情報処理部と、
前記情報処理部で得られた情報を出力する出力部と
を備える、喀痰好酸球に関する情報の取得装置。 - コンピュータに、
被験者の血液試料中のCCL27およびCXCL9から選択される少なくとも1つのマーカーの測定値を受け取る受領ステップと、
前記受領ステップで受け取ったマーカーの測定値と、所定の閾値とを比較し、その比較結果に基づいて、前記被験者が、喀痰好酸球陽性であるか又は喀痰好酸球陰性であるかについての情報を取得する情報取得ステップと、
前記情報取得ステップで得られた情報を出力する出力ステップと、
を実行させるためのコンピュータプログラム。
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