CN1692161A - 哮喘或过敏症的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了哮喘或过敏症患者肺中几种基因的上调。哮喘中许多上调的基因参与肺中精氨酸的代谢。此外，发现一组291个标记基因可用来表明患者发展为哮喘的倾向或表明患者的患病程度。此外，发现一组59个标记基因可用来表明患者发展为过敏症的倾向。许多与哮喘有关的上调基因来自于精氨酸代谢途径。其它基因如ADAM8、SPRR2A和SPRR2B在哮喘中也明显上调。通过给予能够降低肺中精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2或其它精氨酸酶途径成员的水平的组合物可实现哮喘的治疗。此外，对这些蛋白或编码这些蛋白的mRNA的变化水平的检测可用于诊断患有哮喘的患者。

Description

哮喘或过敏症的治疗

政府利益

[0001]本发明得到国家健康研究所/国家过敏症和传染病研究所(National Institutes of Health/National Institute of Allergy and InfectiousDiseases)的政府基金支持，基金号为R01AI42242-04。政府拥有本发明的权利。

发明背景

发明领域

[0002]本发明的实施方案一般涉及用来治疗或检测哮喘或过敏症的组合物及方法。

相关技术说明

[0003]哮喘是一种慢性损伤性疾病，有时可引起致死性肺部炎症，其影响着1千5百万美国人的健康，每年花费约127亿美元的卫生保健经费。虽然目前进行了广泛的研究，但哮喘的发病率仍在上升。研究人员不能发现有效治疗哮喘的方法，这很大程度上是由于这种疾病的复杂性。因为哮喘由广泛的多种因素致病，所以发现具有广泛适用性的有效治疗异常困难。例如多种特异的炎症途径中很多并不清楚，而认为是通过它们之间的相互作用产生症状，并通过此症状来诊断患者的哮喘。此外，这些途径在哮喘患者中的相对重要性可能不同，使得研究更为复杂。

[0004]有关哮喘领域的实验大多集中于对致敏性动物(主要是小鼠)和人体中过敏原暴露所诱导的细胞和分子事件的分析。这些研究已证实在哮喘反应中出现IgE含量升高、粘液分泌过多、气道阻塞、炎症及对致痉药增强的支气管反应性。临床和实验研究证明，CD4⁺2型T辅助淋巴细胞(Th2细胞)的存在与疾病的严重程度密切相关，这表明这些细胞在哮喘的病理生理过程中全程发挥作用。人们认为，Th2细胞通过分泌直接和间接活化炎症和居宿效应因子途径的大批细胞因子来诱导哮喘。特别地，在哮喘肺中可产生高水平的白介素4(IL-4)和白介素13(IL-13)，并被认为是此疾病许多特征性表现的中心调控因子。

精氨酸代谢

[0005]L-精氨酸是参与两种生化途径(如图1所示的瓜氨酸-氧化氮(NO)循环和尿素循环)的半必需碱性氨基酸。多数的尿素循环在肝中进行，肝是包含尿素循环所必须的全部酶系统的主要器官。精氨酸酶是唯一的尿素循环酶，其有两种异构体(60％氨基酸同源性)，这两种异构体可由不同染色体上不同的基因编码，分别称为I型和II型。精氨酸酶I为细胞浆蛋白，主要在肝脏中表达；而精氨酸酶II为线粒体蛋白，可在各种组织特别是肾脏和前列腺中表达。下游酶(鸟氨酸脱羧酶(ODC)和L-鸟氨酸氨基转移酶(OAT))分别在胞浆和线粒体中有特定表达，这表明与两种异构体酶的生物化学链有关。

[0006]人体中精氨酸酶I缺失可导致高精氨酸血症和通常是致命的进行性神经退变。精氨酸酶I缺失的转基因小鼠在出生后9-11天死亡，而精氨酸酶II缺失的小鼠却非常正常。近些年来有关L-精氨酸代谢的一个进展是发现在各种细胞因子和试剂中暴露后，精氨酸酶可在多种类型的组织和细胞中表达。在所发现的调节精氨酸的细胞因子中，特别是在巨噬细胞中，IL-4、IL-10和IL-13的作用明显。尽管两种精氨酸酶在离体时可被多种刺激诱导，但精氨酸酶I可由Th2细胞因子更强烈地诱导。然而还没有就此对除巨噬细胞之外的其它细胞类型进行广泛研究。

[0007]精氨酸酶在肝外组织中的确切功能还不十分清楚。然而精氨酸酶产物L-鸟氨酸是生成多胺(如腐胺、亚精胺和精胺)和脯氨酸的前体，而多胺和脯氨酸可分别控制细胞的增殖和胶原的产生。事实上，仅增加精氨酸酶I的表达就足以增加血管平滑肌和内皮细胞的增殖率。因此，精氨酸酶活性与细胞生长和结缔组织的产生具有潜在的密切关系，特别需注意的是这两种过程是慢性哮喘和过敏症的病理学特性标志(图1)。

[0008]除代谢产生L-鸟氨酸外，L-精氨酸也是NO的前体，而NO是一种参与广泛的生物学过程的自由基分子。L-精氨酸经酶NOS作用产生NO。NOS有三种异构体。NOS1与NOS3为组成型表达，并为钙依赖型活性。NOS1在神经元中表达，并被认为在神经传递中发挥作用；而NOS3或称内皮性NOS在平滑肌和支气管舒张中发挥作用。诱导性NOS(iNOS)的NOS2为钙非依赖型，在诸如内毒素和干扰素-γ等炎症诱导剂的作用下表达上调，从而导致大量NO的产生。

[0009]图1中说明了阳离子氨基酸转运因子-2(CAT2)在精氨酸酶途径中的作用。细胞外的L-精氨酸对于从L-精氨酸持续合成的NO和L-鸟氨酸是必要的，这表明L-精氨酸对跨质膜转运具有重要作用。在介导L-精氨酸摄取的这些转运系统中，系统y⁺被广泛表达，并被认为是多数细胞和组织中的主要L-精氨酸转运因子。由阳离子氨基酸转运因子CAT1、CAT2和CAT3编码的系统y⁺是Na⁺-非依赖性的高亲和性阳离子氨基酸转运系统。除肝脏外，CAT1在几乎所有组织中表达，而且对生存是必需的，而CAT2只在有限数量的组织中表达；CAT3主要表达在脑中。

[0010]由于两个外显子的不同拼接，CAT2 mRNA存在有两种异构体：主要表达在肝脏中的低亲和性转运因子CAT2A和高亲和性的CAT2(CAT2B)。CAT1与CAT2为同源蛋白，其缺少信号肽但含12个跨膜扫描区和细胞内氨基末端。有趣的是，CAT2最早是从淋巴细胞系cDNA中克隆的，且因为它早期诱导正常T细胞向有丝分裂原反应而被命名为Tea(T细胞早期活化因子)。然而，除了初步的研究表明这种分子在实验性自身免疫性脑炎中发挥重要作用外，未见报道CAT2在T细胞免疫反应中的作用。前炎症分子(如脂多糖[LPS])调节CAT2表达的发现，首次显示出CAT2可能参与iNOS或精氨酸酶底物的关键性调节。相反，cat-l基因是“看家基因”，在诱导CAT2的条件下不能诱导其表达。嗜伊红细胞阳离子蛋白能抑制巨噬细胞对L-精氨酸的摄取的发现揭示了其间更令人感兴趣的关系。最近对CAT2缺失小鼠的分析表明，巨噬细胞中NO的持续合成需要CAT2的作用。CAT2缺失的巨噬细胞对L-精氨酸的摄取降低95％，这表明CAT2是巨噬细胞中L-精氨酸的主要转运因子。

[0011]CAT2最早是从淋巴细胞系cDNA中克隆的，且因为它早期介导正常T细胞向有丝分裂原反应而被命名为Tea(T细胞早期活化因子)(MacLeod et al.，J Exp Biol，196：109-21(1994))。然而，以往有关CAT2在免疫反应中作用的研究主要限制于对产生NO所起的作用(Nicholson et al.，J Biol Chem，276：15881-5(2001))。因而进一步准确确定哪一种CAT2异构体在哮喘肺中被表达是很重要的。根据外显子7(2B型)或外显子8(2A型)的特定利用，CAT2被表达为两种独立的异构体(Nicholson et al.，J BiolChem，276：15881-5(2001))。CAT2A对L-精氨酸的亲和性较低，并被认为主要表达在肝脏中(MacLeod et al.，J Exp Biol，196：109-21(1994))。

[0012]由于哮喘和过敏症的发病率正在上升，所以需要对这种疾病进行更好地了解和治疗的研究。因此，本领域急需的是治疗哮喘或过敏症患者的新方法、鉴定可能患有哮喘和过敏症的个体的新方法以及表型患者的新方法(例如预测患者的预后和对治疗的反应)。

发明概要

[0013]本发明的一个实施方案是一种治疗哮喘或过敏症患者的方法，包括：鉴定需要哮喘或过敏症治疗的个体；及给予能够降低参与精氨酸代谢的蛋白产生的分子。

[0014]另一实施方案是检测患有哮喘或过敏症的患者的方法，包括：测量参与该患者中精氨酸代谢的至少一种基因产物的水平；测量参与精氨酸代谢的至少一种基因产物的遗传多样性(表达或基因序列)；及将测量结果与对照个体的测量结果进行比较，其中与对照个体相比该至少一种基因表现出较高水平的患者被确定为患有哮喘或过敏症。

[0015]另一实施方案是治疗哮喘或过敏症的治疗性组合物，其包括含在药物上可接受的载体中的精氨酸酶抑制剂。

[0016]另一实施方案是治疗哮喘或过敏症的治疗性组合物，其包括在药物上可接受的载体中的CAT2活性抑制剂。

[0017]另一实施方案是鉴定可能患有哮喘或过敏症的个体的方法，包括：鉴定仍没表现出哮喘或过敏症症状的个体，测量精氨酸酶途径中基因产物的水平；及将该产物水平与对照个体的测量结果进行比较，其中该产物表现出较高水平的患者被确定为可能患有哮喘或过敏症。

[0018]另一实施方案是治疗哮喘或过敏症患者的方法，包括：鉴定需要哮喘或过敏症治疗的个体；及给予该患者能够降低ADAM8蛋白的活性的分子。

[0019]另一实施方案是治疗哮喘或过敏症患者的方法，包括：鉴定需要哮喘或过敏症治疗的个体；及给予该患者能够降低SPRR2A、SPRR2B或相关SPRR家族成员蛋白的活性的分子。

[0020]另一实施方案是检测可能发展为哮喘的患者的方法，包括：提供该患者的生物样品；及检测该生物样品中如表1所示的基因亚组的表达水平，其中与对照生物样品相比，该基因亚组表达水平的提高表明该患者发展为哮喘的可能增加。

[0021]另一实施方案是检测可能发展为过敏症的患者的方法，包括：提供该患者的生物样品；及检测该生物样品中如表2所示的基因亚组的表达水平，其中与对照生物样品相比，该基因亚组表达水平的提高表明该患者发展为过敏症的可能增加。

[0022]另一实施方案是发现可有效治疗哮喘或过敏症的化合物的方法，包括：提供候选化合物；检测该化合物是否抑制精氨酸代谢，其中对精氨酸代谢的抑制表明该化合物可有效治疗哮喘或过敏症。

附图简要说明

[0023]图1为精氨酸代谢途径的示意图。

[0024]图2A为过敏原致敏试验方法的一个实施方案的示意图。在第0天和第14天两次给小鼠腹腔内注射卵清蛋白(OVA)(100μg)和明矾(1mg)。随后，经鼻腔内给予小鼠OVA(50μg)或盐水进行致敏，在第一次或第二次过敏原致敏后的3小时或18小时进行分析。

[0025]图2B为柱状图，表明对盐水和OVA处理的小鼠的嗜酸性细胞活化趋化因子-1(eotaxin-1)的信号定量分析，误差柱代表标准偏差。

[0026]图3为维恩图，说明在OVA处理的小鼠的实验性哮喘的特定阶段中诱导的基因的交迭。

[0027]图4为维恩图，说明经OVA过敏原和烟曲霉菌抗原诱导的小鼠基因表达的交迭。

[0028]图5说明精氨酸代谢酶的表达结果。在过敏原致敏的小鼠中，通过基因芯片分析检测的精氨酸酶I和iNOS的表达分别如图5A和图5B所示。图中给出了经盐水(灰色柱)和过敏原(黑色柱)致敏后的杂交信号的平均差异。误差柱代表标准偏差。时间点为：3H-1致敏，3h；18H-1致敏，18h；2C-2致敏，18h；asp-曲霉菌。精氨酸代谢途径的示意图如图5C所示。基因芯片列上没有的基因用白色方块表示，芯片列上有但没有显著增加的基因用灰色方块表示，显著增加的基因用黑色方块表示。在图5D中，表明经盐水和OVA致敏的小鼠肺中的精氨酸活性。通过血液尿素氮试剂检测肺裂解液中的精氨酸酶的活性。作为对照，盐水和OVA致敏的小鼠在肝脏中的精氨酸酶活性分别为1522±183和1390±78。

[0029]图6为柱状图，说明通过基因芯片分析检测的过敏原致敏的小鼠中ADAM-8的诱导。图中给出了经盐水(灰色柱)和过敏原(黑色柱)致敏后的ADAM-8杂交信号的平均差异，误差柱代表标准偏差。时间点为：3H-1致敏，3h；18H-1致敏，18h；2C-2致敏，18h。

[0030]图7表明通过基因芯片分析检测的卵清蛋白(OVA)和烟曲霉菌(Asp)致敏的小鼠中L-精氨酸代谢酶(精氨酸酶I(图7A)、精氨酸酶II(图7B)、CAT2(图7C))的表达。图中给出了经盐水(灰色柱)和过敏原(黑色柱)致敏后的杂交信号的平均差异，误差柱代表标准偏差。

[0031]图8说明IL-13和STAT6对精氨酸酶的调节。图8A为柱状图，表明肺中IL-13诱导的气道高反应性(AHR)的动力学特点和精氨酸mRNA的水平。按Penh记录(可产生最大反应的甲胆碱量为25mg/ml)，在气管内给予小鼠(n＝4-10/组)一次剂量的IL-13(10μg)或PBS，并分析各时间点的AHR。在图的下部分，肺中RNA反转录为cDNA并用来作精氨酸酶I(ArgI)、精氨酸酶II(ArgII)或对照次黄嘌呤磷酸核糖体转移酶(HPRT)的PCR分析。“对照”泳道不含cDNA模板。图8B为柱状图，说明经盐水和OVA致敏的野生型(WT)和STAT6-缺失型(STAT6-KO)小鼠肺中的精氨酸酶活性。通过血液尿素氮试剂检测肺裂解液中的精氨酸酶活性。

[0032]图9为用于确定实验性哮喘中CAT2(特别是CAT2A与CAT2B异构体)参与度的方法的示意图。通过RT-PCR方法从过敏原致敏小鼠肺中扩增CAT2，并将其亚克隆到pCR2.1载体中。随后克隆物用EcoRI或EcoRI/BamHI限制性酶切，来分别分化CAT2A亚型和CAT2B亚型。

[0033]图10为说明人哮喘中的精氨酸酶I蛋白表达的示意图。分别对过敏症型哮喘患者和健康对照者进行纤维支气管镜的检查，同时也为精氨酸酶I的免疫组化分析了BALF。免疫阳性细胞的数量用占细胞总数的百分比表示。

[0034]图11A和图11B为线型图，说明用N(ω)-羟基-L-精氨酸(NOHA)处理肺裂解液的结果。用NOHA离体处理卵清蛋白致敏的小鼠肺裂解液的结果如图11A所示。用NOHA离体处理白介素4过表达的转基因小鼠的结果如图11B所示。

[0035]图12为线型图，说明用气管内NOHA处理的哮喘小鼠(IL4/IL5双转基因肺小鼠)中气道高反应性的检测结果(按Penh记录)。

详细说明

[0036]本发明的实施方案涉及对参与哮喘和过敏症的基因的发现。因此，本发明的一个实施方案涉及发现一组291个“标记”基因(表1)，在疾病的哮喘模型中这些基因被持续调控。此外，发现一亚组59个基因(表2)在与参与的组织(肺与肠)无关的多种过敏性疾病中持续升高，这提供了普遍性的过敏症遗传“标记”。据此，可依据每个标记基因的表达或遗传多样性对患者进行基因分型，来确定其发展为哮喘或过敏症的可能。此外，可以通过检测哮喘或过敏症患者的这些标记基因表达来更准确地预测其预后和对治疗方案的反应。此外，可将每个基因作为用于干预/治疗过敏症的可能药物的目标。

[0037]尽管本发明的实施方案涉及到通过将患者的哮喘或过敏症标记基因的表达水平与表1和表2所示的基因表达水平相比来确定该患者发展为哮喘或过敏症的可能，但在本发明的范围内并不要求其有准确的关系。例如，确认患者只表现出某些标记基因表达的增加后，仍可预示患者有发展为过敏症或哮喘的可能。因此，从患者身上采集的生物样品被检测到有如1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的标记基因的表达增加后，仍可确定其有过敏症或哮喘的可能。标记基因的基因表达方式与每个基因的表达水平的组合被用来表明测试者发展为过敏症或哮喘的可能。为此，本发明的范围不限于通过匹配所有291个哮喘标记基因的表达水平来确定患者有患哮喘的可能。相似地，不要求使所有59个过敏症标记基因的表达水平匹配来确定患者发展为过敏症的可能。为此，不需要患者的基因表达分布与过敏症标记基因或哮喘标记基因准确匹配来预测现有患者的预后或对治疗方案的反应。

[0038]此外，本发明的实施方案涉及发现肺精氨酸酶信号途径与哮喘之间的关系。所描述的方法用来揭示精氨酸酶途径参与了实验性哮喘和人的哮喘。一些重要的包括那些编码CAT2、精氨酸酶I和精氨酸酶II蛋白在内的精氨酸酶代谢基因的表达增加与哮喘和过敏症密切相关。同时还发现，由IL-4/IL-13信号诱导的精氨酸酶不仅是过敏性气道反应的标志，而且精氨酸酶参与了哮喘的多方面的发病机理。据此，改变这些精氨酸酶的途径基因或其产物可用于设计治疗哮喘或过敏症的治疗和诊断策略。

[0039]本发明的实施方案还涉及发现明显的精氨酸酶参与的精氨酸代谢，此过程在哮喘和相关疾病的表现中是重要的作用机制。由此，精氨酸代谢途径是治疗所有过敏性肺病的重要治疗性干预策略。通过抑制精氨酸酶本身的活性或抑制精氨酸酶途径的其它成员的活动可控制精氨酸酶途径，并可能提供有效的哮喘治疗。此外，对肺精氨酸酶途径的控制对预防哮喘的发作也有效。同样，通过计量哮喘代谢途径酶或产物的水平可用来分析参与精氨酸代谢的基因，这可用于诊断哮喘或过敏症的发病。

[0040]本发明的另一个实施方案涉及到发现标记基因之一的ADAM8，该基因与哮喘和过敏症密切相关。因此本发明的实施方案包括试剂盒、系统及通过鉴定患者ADAM8水平来诊断哮喘的方法。此外，预测到通过给予治疗有效剂量的可抑制ADAM8的化合物能用来治疗哮喘或过敏症。Schlomann等(Schlomann，et al.，J Biol Chem 2002 Dec 13；277(50)：48210-9)报道了一种此类化合物的实例，即巴马司他(batimastat，BB-94)。据此，本发明的一个实施方案是通过给予患者治疗有效量的巴马司他以对哮喘或过敏症进行治疗。

[0041]本发明的另一个实施方案涉及到发现含有分子家族的标记基因，该分子以前并不与哮喘相关而被称为富含脯氨酸的小分子蛋白(SPRR)，特别是SPRR2A和SPRR2B。已知SPRR蛋白家族参与角状上皮细胞的分化和生长(Tesfaigzi J，Carlson DM，Cell Biochem Biophys 1999；30(2)：243-65，Expression，regulation，and function of the SPR family ofproteins.综述)

[0042]SPRR2A和SPRR2B与哮喘和过敏症密切相关。此外，用被认为是哮喘的核心调节因子的IL-13处理野生型小鼠后，可显著增加肺中SPRR2水平(数据未显示)。

[0043]因此，本发明的实施方案包括试剂盒、系统及通过鉴定患者SPRR蛋白或基因的水平和多样性(遗传或蛋白水平)来诊断哮喘的方法。此外，预测到通过给予可改变SPRR蛋白功能的化合物能用来治疗哮喘或过敏症。

[0044]如下所述通过芯片分析程序对用不同类型的抗原处理的小鼠进行分析，其结果初步确定了哮喘发病机制中基因表达的上调。

实验性哮喘动物基因表达的芯片分析

[0045]此处所述的经受实验性哮喘的小鼠DNA芯片谱分析揭示了以往未进行深入研究的参与发病机制的复杂途径。所检测基因组的～6％基因的动力学表达与哮喘反应有关，这种检测结果显示出有大量的基因产物参与发病机制。在肺过敏症中发现不仅有如表1所示的一组一般性“哮喘标记基因”的参与，而且还有根据疾病诱导的类型而决定的特定基因转录谱的参与。以所揭示的CAT2介导的精氨酸代谢途径和精氨酸酶途径为例，鉴定出以往未发现其在哮喘发病中有作用的多种基因。

[0046]为在已建立的哮喘模型中可重复地、准确地鉴定差异表达的基因，在以14天为分界的两个时间点上腹腔给予小鼠过敏原卵清蛋白(OVA)与明矾佐剂以进行致敏(图2A和实施例1)。随后，在以3天为分界的两个时间点上对复制的小鼠鼻腔内给予OVA或盐水(对照)致敏。最后一次过敏原致敏后18h，取一叶小鼠的肺用于组织学分析，剩下的肺组织用于RNA分析。如所预料的，组织学分析结果表明，与以往报道(Rothenberg，M.E.，MacLean，J.A.，Pearlman，E.，Luster，A.D.，and Leder，P.1997.Targeted disruption of the chemokine eotaxin partially reducesantigen-induced tissue eosinophilia.J Exp Med 185：785-790)相同，过敏原致敏的小鼠具有明显的富含嗜伊红细胞炎症反应。

[0047]为验证过敏原诱导的mRNA转录的存在，通过Northern blot方法对RNA进行检测，分析其中嗜酸性细胞活化趋化因子-1的诱导作用，先前已证明了过敏原致敏对趋化因子有明显的诱导作用(Rothenberg，etal.，1997，supra)。发现过敏原致敏的肺中嗜酸性细胞活化趋化因子-1mRNA表达丰富，而经盐水处理的小鼠只表达很低的水平，此结果验证了试验诱导方案。

[0048]下一步，利用AFFYMETRIX芯片U74Av2对RNA进行基因芯片分析，该芯片含有代表12,422个遗传单元(实施例2)的寡核苷酸探针。根据实施例4提供的方法对基因芯片数据做进一步分析。

[0049]两个盐水致敏的小鼠间的相互比较和两个过敏原致敏小鼠间的相互比较显示，＞2倍变化的基因为≤1％。对现有基因的散点分析显示超出2倍范围的点几乎没有。相反，对过敏原致敏小鼠与盐水致敏小鼠的平行比较显示，＞2倍变化的基因占6.5±0.8％。如图所示，在过敏原诱导的基因中，嗜酸性细胞活化趋化因子-1为可再生性表达(2B)。对过敏原与盐水致敏的嗜酸性细胞活化趋化因子-1平均差异表达信号的定量分析显示，其间存在25倍的诱导(P＝0.001)。综上所述，这些数据验证了根据试验所作的分析并证明了所应用科学方法的潜在价值，因此为以下的实验奠定了基础。

哮喘的遗传控制：基因表达与交迭诱导的基因

[0050]其它试验是在实验性哮喘区域的急性和慢性阶段对较大一组的小鼠肺中mRNA转录类型进行鉴定。其假说是，与接受第二次致敏的后一时间点比较，第一次过敏原致敏后能急性诱导特定的一组基因。首先检测了在第一次过敏原介入后的早期时间点(3h)，其依据是这个检测能够对过敏原暴露后肺的初始反应提供更深的理解。事实上，早期过敏原介入后，只有100个基因被诱导(图3)。

[0051]下一步，检测了第一次过敏原致敏后18h诱导的基因。在较晚的时间点，有132个进行性诱导增加的基因，其中很多没有在过敏原致敏后的急性反应中出现。事实上，有41个早期活化基因仍保持升高水平，而另有91个基因表达增加(图3)。与急性反应时间点不同，与两个过敏原致敏后18h诱导的基因比较，没有出现特定的“遗传标记”。事实上，在第一次过敏原致敏18h后被诱导的基因大多数在随后的第二次致敏中进一步升高。

[0052]为了深入理解慢性过敏性肺反应的发病机制，对实验性哮喘相对“慢性”阶段诱导的基因表达特点进行分析。在实验性哮喘的慢性阶段中，作为适应性免疫反应的扩展指示，免疫相关基因与降低组(4.4％)相比较，增加组(44％)占据主导地位。相反，在发展和稳态的基因中，降低的基因占多数(54％)，而增加的基因只占20％。

过敏原特异基因的比较：OVA与Asperigillus诱导的哮喘

[0053]下面针对两个独立的哮喘模型进行全部转录谱的比较。，由于烟曲霉菌(Aspergillus Fumigates)抗原诱导的实验性哮喘模型与OVA模型相比具有唯一的粘膜感受途径(鼻腔内途径)(Huang，W.W.，Garcia-Zepeda，E.A.，Sauty，A.，Oettgen，H.C.，Rothenberg，M.E.，and Luster，A.D.1998.Molecular and biological characterization of the murine leukotriene B₄receptor expressed on eosinophils.J.Exp.Med.188：1063-1074)，而且烟曲霉菌还是普遍存在的通用气源性致敏原，因此对烟曲霉菌抗原诱导的实验性哮喘进行了分析。重要的是，两种哮喘模型具有相似的表型，包括Th2相关的嗜伊红细胞炎症反应、粘液产生及气道的高反应性。与最后一次OVA致敏18h后的分析相同，在九次剂量的鼻腔内烟曲霉菌过敏原致敏18h后，对肺中RNA进行基因芯片分析和数据处理分析。与鼻腔内盐水致敏的小鼠比较，烟曲霉菌致敏的小鼠有527个诱导的基因(图4)。

[0054]在两个实验性哮喘模型之间，多数诱导的转录基因发生交迭(OVA中的63％和Aspergillus中的61％)，然而，有182个基因(占两次OVA致敏后的496个增加基因的37％)和208个基因(占Aspergillus致敏的增加基因的39％)分别为OVA和烟曲霉菌模型所独有。

[0055]对两种哮喘模型诱导的基因进行比较，发现在一些信号途径的上游存在有特殊的不规律调节的基因，如OVA模型中的12-脂质氧化酶。因此，虽然这两种模型的哮喘表型大致相似，但这两种独立的哮喘模型却以众多独特的不规律调节基因为特征。这表明个体的过敏性气道炎症反应状态可能具有大量不同遗传标记和实施途径。

实验性哮喘与参与L-精氨酸代谢基因的诱导有关

[0056]试验结果鉴定出一组291个基因(表1)，其是通常参与疾病发病机制过程的基因，而不是过敏原或疾病诱导类型的特殊基因。这些哮喘标记基因为确定过敏性气道炎症反应的发病机制中的新信号途径提供了有价值的契机。作为实例，参与L-精氨酸代谢的基因的高水平转录非常显著。

                                       表1

                                   哮喘标记基因

系统号	OVA-标准化	Asp-标准化	基因库登录号	基因说明
					101616_at	225540	39246.668	M19911	免疫球蛋白κ链
93717_at	108733.336	90790	NM_011331	SCYA12(MCP-5)
					101436_at	84566.664	32.45614	NM_008599	SCYB9(Mig)
101027_s_at	98806.664	4.946778	NM_013917	垂体肿瘤转型因子1
					101803_at	87700	8790	AJ010792	Muc5AC-样基因
93755_at	89523.336	101145	NM_023881	抵抗素样因子β
					94330_at	72116.664	103670	AK002734	EST
99578_at	59720	55400	NM_011623	拓扑异构酶(DNA)IIα
					103289_at	38193.332	60.650017	NM_016869	低密度脂蛋白受体相关蛋白4
103088_at	16663.334	9.3210535	NM_007697	L1近同系物
					102782_at	15660	8526.667	BC006884	EST
162287_r_at	157.68481	95.58796	NM_017474	氯离子途径钙激活蛋白3
					94761_at	101.713	50.726936	X70058	EST
93097_at	98.76876	108.230156	NM_007482	精氨酸酶I
					101870_at	48.64205	224780	V00793	免疫球蛋白重链(IgG1)
92459_at	43.723305	383.66388	NM_021443	SCYA8(MCP-2)
					161968_f_at	35.185265	22.420723	D83648	CCR5
93099_f_at	30.061855	57323.332	NM_011121	polo样激酶同系物
					92742_at	24.619387	22.648064	U77462	SCYA11(嗜酸性细胞活化趋化因子-1)
102337_s_at	23.430752	19.95273	M31312	II型βFc受体
					100127_at	23.669697	11203.333	BC018397	细胞视黄酸结合蛋白II
102736_at	23.493471	68.94838	M19681	CCL2(JE)
					102204_at	23.287586	67830	L36434	Kreisler
101075_f_at	23.076147	18.475286	NM_011783	anterior gradient2
					160159_at	21.610453	9.571152	NM_007629	细胞周期蛋白B1，相关序列1
101024_i_at	16.942549	240.79553	AJ005559	SPRR2A
					95338_s_at	16.297825	78.58169	NM_008605	基质金属蛋白酶12
103024_at	15.965419	274.74274	NM_007403	去组合蛋白(disintegrin)与金属蛋白酶

				结构域8
					101752_fa_t	15.405419	5.4361067	BC003888	免疫球蛋白重链
96973_f_at	15.03831	2.604794	X02468	免疫球蛋白κ链
					97563_fat	15.637967	8.38196	AF042798	VAV
94383_at	13.320507	10.951402	NM_009364	组织因子信号途径抑制因子2
					96336_at	13.159998	4.711911	NM_025961	甘氨酸氨基转移酶
96081_at	12.9895525	3.1729324	X60980	EST
					101747_f_at	12.68841	14.8531	BC010324	EST
102719_f_at	11.682585	11.263889	D83648	CCR5
					95339_r_at	11.653785	32.66752	NM_008605	基质金属蛋白酶12
101464_at	11.270443	6.67038	NM_011593	金属蛋白酶组织抑制因子
					97574_f_at	10.615792	3.4934838	AF036736	Tyk2
99701_f_at	10.283908	15.477636	AJ005560	信息素受体V2R1
					99412_at	10.213736	7.2845774	U29677	5HT1B
102718_at	9.953823	5.3958616	AF022990	CCR5
					101320_f	11.34985	4.766794	L28059	IgB细胞抗原受体基因
101025_fat	9.405751	12.41217	AJ005559	SPRR2A
					103507_at	9.453025	3.9533896	X93328	含EGF样结构，粘液素样蛋白，激素受体样序列1
104388_at	9.408694	18.71653	NM_011338	SCYA9(MRP-2)
					101871_f_at	9.909628	8.040251	BC003435	免疫球蛋白重链(IgG1)
102860_at	8.93476	5.155658	BC002065	丝氨酸蛋白酶抑制因子2-1
					97575_f_at	9.2360935	2.769376	AF036737	免疫球蛋白重链
98372_at	8.64797	13.498421	AF253409	醛脱氢酶家族1，亚家族A3
					93302_at	8.627996	22.25536	U78770	三叶形蛋白；解痉多肽(mSP)基因
102155_f_at	9.713297	171.56984	K03461	免疫球蛋白κ链
					103362_at	8.536932	8.227436	NM_008965	前列腺素E受体4(亚型EP4)
104374_at	8.047283	5.9670243	NM_009252	丝氨酸蛋白酶抑制因子2-2
					103715_at	7.910169	10.097453	NM_009132	肌切蛋白
97008_f_at	7.836625	3.1931891	L33943	精子移动激酶2
					92737_at	7.588307	9.6024885	U20949	淋巴特异性干扰素调节因子(LSIRF)
93858_at	7.483522	2.8942115	NM_021274	SCYB10(IP-10)
					100362_f_at	7.8602414	4.154518	X02463	免疫球蛋白重链
98765_f_at	8.378079	4.30979	U23095	小家鼠CAG密码子重复mRNA
					97567_f_at	7.817849	374396.66	AF045026	免疫球蛋白κ链
96020_at	7.235781	5.5908856	NM_009777	补体成分1、q亚成分，β多肽
					93871_at	7.205034	220793.33	L32838	白介素-1受体拮抗剂
99457_at	7.0135965	11.358481	X82786	由单克隆抗体Ki67识别的抗原
					92898_at	6.921668	10.98594	NM_007825	细胞色素P450、7b1
99413_at	6.865213	6.676117	NM_009912	CCR1
					93441_at	6.86	8.001611	BC002320	EST
161898_i_at	6.715635	4.932269	NM_013604	metaxm
					99384_at	6.4949207	3.227118	M13945	2′-5′寡腺苷酸合成酶
100299_f	7.053511	6.5434785	U68543	免疫球蛋白κ链
					100360_f_at	6.9094634	3.2684014	X02466	免疫球蛋白重链
103821_at	6.4850364	3.5823884	NM_011799	细胞分裂周期蛋白6同系物
					104712_at	6.410893	6.9562626	L00039	c-myc
94792_at	6.60177	5.1981874	AV230061	EST
					97577_f_at	7.0308433	7.3983607	AF042086	免疫球蛋白重链
95749_at	6.5904636	4.886688	AK014338	富含精氨酸、肿瘤早期变异蛋白
					100376_f_at	7.1667223	3.663984	AF025445	免疫球蛋白重链

99564_at	6.2264986	5.7295732	NM_010931	核蛋白95
					96972_f_at	6.6524925	10.578374	X00651	免疫球蛋白κ链
97826_at	6.095861	4.748955	BF578028	EST
					101920_at	6.945455	10730	AF036898	DNA合成酶∈亚单位2
102076_at	6.6639376	9.057281	AJ235940	免疫球蛋白κ基因
					92694_at	5.997402	2.850934	NM_009892	壳多糖酶3样分子3
98500_at	5.9301085	4.8730392	D13695	白介素1受体样分子1
					160509_at	5.902416	3.263418	NM_023186	酸性壳多糖酶
101716_at	6.3816996	9.589625	AF017260	核糖核酸酶5前体
					94425_at	5.785283	2.5883076	NM_010745	淋巴细胞抗原86
100721_f_at	6.602228	4.1458287	NM_019633	免疫球蛋白重链
					161000_i_at	5.7863874	5.6846313	BC009096	EST
97576_f_at	5.836974	6.7057757	AF036738	免疫球蛋白重链
					103492_at	5.7621274	34.26642	NM_019696	金属羧肽酶CPX-1
92471_i_at	5.6972423	4.1381645	NM_011408	schlafen2
					102157_f_at	6.223431	8.301306	M15520	免疫球蛋白κ链
104423_at	5.5257926	4.04915	AK012919	EST
					97566_f_at	5.7326064	3.3756723	AF045024	细胞周期调节转录因子DP1
99850_at	5.6840267	13.790022	X01857	EST
					99799_at	5.2402177	4.7810144	NM_011691	vav癌基因
103977_at	5.242547	5.874125	NM_007972	凝血因子X
					100682_f_at	5.7159605	6.4657617	BC018315	免疫球蛋白重链(IgM)
102712_at	5.00839	114.47321	X03505	血清淀粉样蛋白A(SAA)3
					95546_g_at	5.007943	5.40468	NM_010512	胰岛素样生长因子1
102334_at	4.9804444	5.37676	NM_010071	酪氨酸激酶下游调节因子2
					161476_at	4.8584557	6.1884484	NM_011179	Saposin前体
94747_at	5	11.483464	NM_007780	集落刺激因子2受体，β1，低亲和性(粒细胞-巨噬细胞)
					160973_at	4.754941	5.9356265	AV113368	EST
94774_at	4.751594	3.7062113	NM_008327	干扰素活化基因202A
					97519_at	4.717509	2.4604154	NM_009263	分泌性磷蛋白1
92406_at	4.697705	3.7283828	D31956	CD7抗原
					97527_at	4.71631	6.0879946	NM_025415	EST
104509_at	4.7671666	3.9175062	NM_009890	胆固醇25-羟化酶
					92736_at	4.6499114	2.43423	NM_007514	可溶性载体家族7(阳离子氨基酸转运因子，y+系统)，成员2
94357_at	4.6305223	15.957945	NM_019810	可溶性载体家族5，成员1
					103563_at	4.566576	3.228621	AK015966	EST
100325_at	4.565603	5.2161465	NM_008147	糖蛋白49A
					101718_f_at	4.6051664	2.784962	U68543	免疫球蛋白κ链
92223_at	4.38655	3.4771063	NM_007574	补体成分1、q亚成分，c多肽
					92877_at	4.3477926	3.3488877	NM_009369	转化生长因子，β诱导的，68kDa
162362_f_at	4.7214866	13.813264	NM_011607	腱生蛋白C
					92217_s_at	4.1649747	6.179337	U05265	BALB/c gp49B
104174_at	4.2072635	10.121372	NM_008813	外核苷焦磷酸/磷酸二酯酶1
					99057_at	4.254866	2.0512702	M12379	EST
161173_f_at	4.3232756	2.716511	AV229143	EST
					103226_at	4.126826	3.1783247	NM_008625	甘露糖受体，C型1
95753_at	4.1263847	2.7586782	BG175174	EST
					97763_at	4.260391	4.074452	L11455	中性粒细胞浆因子1

99541_at	4.104807	24.215685	AJ223293	运动素样因子1
					96971_f_at	4.3104587	3.9387467	X00652	免疫球蛋白重链
104308_at	4.0227704	3.8388264	NM_021334	整合素αX
					92639_at	4.0441484	7.0198045	BC014711	丝氨酸/苏氨酸激酶6
102585_f_at	4.230241	2.8028138	AB017349	免疫球蛋白轻链
					96964_at	3.894107	17.932245	L14554	免疫球蛋白轻链
102354_at	3.9053602	4.594614	BC004617	EST
					101640_f_at	4.131984	4.4899344	U68543	免疫球蛋白κ链
101331_f_at	4.1094975	10.231754	U68543	免疫球蛋白κ链
					92762_at	3.7854714	18.729609	NM_011999	C型(钙离子依赖，碳水化合物识别功能域)凝集素，超家族成员6
99979_at	3.879566	4.449123	NM_009994	细胞色素P450，1b1，苯并[a]蒽诱导
					102755_at	3.8250763	42.851036	NM_010584	intelectin
99876_at	3.7478104	2.71695	AJ131777	src-样适应蛋白
					100771_at	3.7049873	52.361767	Y17159	淋巴细胞抗原57
102025_at	3.746413	11.825412	NM_018866	SCYB13(BLC/BCA-1)
					101521_at	3.7192738	3.4149444	BC004702	杆状病毒IAP重复序列5
98562_at	3.5959404	3.0973809	NM_007572	补体成分1、q亚成分，α多肽
					100116_at	3.8081882	2.2723222	NM_026515	EST
103210_at	3.5521066	3.5796819	NM_007781	集落刺激因子2受体，β2，低亲和性(粒细胞-巨噬细胞)
					97444_at	3.5403333	3.7394972	NM_023065	干扰素γ诱导蛋白30
103040_at	3.5184398	5.563819	NM_009856	CD83抗原
					92832_at	3.5796704	2.58255	NM_009896	细胞因子诱导含SH2基蛋白1
101468_at	3.499593	2.9337993	X12905	P因子，补体
					101656_f_at	3.572765	5.152894	U68543	免疫球蛋白κ链
160406_at	3.5679104	6.6120887	AJ006033	ctsk
					161511_f_at	3.6552558	2.4223258	AK019325	EST
100479_at	3.5037563	5.1488533	NM_007872	DNA甲基转移酶3A
					96784_at	3.5443184	7.2892175	BE573736	EST
98473_at	3.414378	4.315487	NM_009705	精氨酸酶II
					103690_at	3.4046066	2.7740142	AW125574	EST
97411_at	3.432237	5.097896	NM_007900	ect2癌基因
					102990_at	3.3784416	3.176364	AK019448	前胶原，III型，α1
101913_at	3.3619032	2.298871	NM_010423	与YRPW基序1相关的断裂毛发/增强因子
					96511_s_at	3.349278	2.489442	NM_011691	vav癌基因
96515_at	3.3318715	5.013796	U70430	雌激素受体β
					99509_s_at	3.304514	2.4309058	NM_010589	Janus激酶3
102658_at	3.29768	2.4413974	NM_010555	白介素受体，II型
					99405_at	3.4179718	2.6559134	Z95479	免疫球蛋白κ链
102001_at	3.2696967	4.6717634	NM_009104	核糖核酸还原酶M2
					100772_g_at	3.2473373	3.9850318	Y17159	淋巴细胞抗原57
100156_at	3.2375228	5.1784253	NM_008566	微小染色体维持缺陷5
					102884_at	3.2394269	5.047297	NM_010566	肌醇多磷酸-5-磷酸酶，145kDa
98772_at	3.2060094	9.574579	NM_009141	SCYB5(LIX)
					98859_at	3.1933463	3.7756183	M99054	葡萄糖依赖胰岛缩氨酸
93465_at	3.1908364	2.0911632	AK020278	EST
					102697_at	3.2435853	50750	NM_019640	磷脂酰肌醇转移蛋白，β
104548_at	3.1858604	2.3911338	NM_009434	肿瘤抑制亚染色体转移片段3

160446_at	3.0992258	2.0170536	U46068	von Ebner小唾液腺蛋白mRNA
					92918_at	3.2433689	3.870666	U66079	凝血因子VII
99926_at	3.0930579	2.6117299	AB001489	EST
					98034_at	3.0988965	2.399438	NM_010387	组织相容性2，II类，locus Mb1
103441_at	3.1662524	2.6342456	NM_007788	酪蛋白激酶II，α1相关序列4
					101868_i_at	3.0873947	3.2774441	NM_010388	组织相容性2，II类，locus Mb2
104065_at	3.104958	2.903548	AB042828	EDEM，与α-甘露糖苷酶相似
					103418_at	3.0449538	4.5369325	BC003335	EST
103201_at	3.1155026	2.5040376	NM_009445	Ttk蛋白激酶
					102892_at	2.965567	2.3691757	U31908	K离子电压门控途径，阵颤相关亚家族，β成员2
101020_at	3.0216243	4.072408	NM_009982	组织蛋白酶C
					102372_at	2.962975	4.9571853	BC006026	免疫球蛋白连接链
96295_at	2.980223	4.0674667	BC004827	DNA片段，Chr8，ERATO Doi 814表达
					103089_at	2.977104	2.9797423	X53526	CD48抗原
160663_at	3.0093396	3.73139	BC011308	EST
					160119_at	2.9357014	2.8572135	NM_007961	TEL癌基因
104547_at	3.0306945	2.5664012	J00388	二氢叶酸还原酶
					162198_f_at	2.930065	3.8110802	NM_009139	SCYA6(C10.MRP-1)
98948_at	2.913645	2.3195322	BE914613	EST
					92472_f_at	2.915114	2.61941	NM_011408	schlafen2
92232_at	2.943417	3.4743614	NM_007707	细胞因子诱导含SH2基蛋白3
					101878_at	2.8530445	4.578556	NM_007654	CD72抗原
94294_at	2.7738435	2.6131907	NM_007630	细胞周期素B2
					AFFX-TransRecMur/X57349_M_at	2.8628469	39776.668	NM_011638	转铁蛋白受体
102809_s_at	2.7613506	2.1943572	BC011474	淋巴细胞蛋白酪氨酸激酶
					99973_s_at	2.749837	5.1267667	NM_019664	钾离子内控途径，亚家族J，成员15
103205_at	2.698056	3.892967	NM_016921	T细胞免疫调节因子1
					97421_at	2.7415438	2.267686	NM_008017	成纤维细胞因子诱导16
95148_at	2.6961179	2.801927	NM_016895	腺苷酸激酶2
					95032_at	2.7158015	6.0467033	BC005475	DNA片段，Chr7，ERATO Doi 348表达
95532_at	2.7031207	2.6633081	BG070246	EST
					98035_g_at	2.6737032	2.1324506	NM_010387	组织相容性2，II类，locus Mb1
161103_at	2.6972256	7.9766407	BG064768	EST
					103662_at	2.6623814	2.36007	NM_008677	粒细胞胞浆因子4
104464_s_at	2.6995149	2.8936243	BC011472	EST
					160298_at	2.701887	2.6409597	AK011256	EST
162206_f_at	2.6395187	2.7735467	NM_007707	细胞因子诱导含SH2基蛋白3
					102310at	2.622947	2.9848456	NM_009137	SCYA22(ABCD-1)
98433_at	2.5899887	2.410541	BC002031	BH3相互作用功能区死亡激动剂
					99974_at	2.6164083	6.7606096	NM_019664	钾离子内控途径，亚家族J成员15
104099_at	2.6075976	2.9022658	NM_009402	肽多糖识别蛋白
					104147_at	2.568291	2.4725318	NM_053179	硅铝酸合成酶
101506_at	2.5859814	2.4086373	NM_021336	U2小核核蛋白多肽A′
					103203_f_at	2.611314	4.093791	W29450	EST
93112_at	2.5585814	3.6827056	NM_008564	微小染色体维持缺陷因子2
					104097_at	2.586194	4.50625	U89795	苯并咪唑非抑制性出芽因子1同系物

99669_at	2.5426898	2.2998266	NM_008495	凝集素，半乳糖结合，可溶性因子1
					99149_at	2.6465125	4.2806926	NM_025863	EST
102326_at	2.535973	4.4882274	NM_010877	粒细胞胞浆因子2
					102293_at	2.5311453	2.1284976	NM_009578	锌指蛋白，亚家族1A，1(Ikaros)
92833_at	2.515559	5.7817793	NM_010401	组氨酸氨基水解酶
					92540_f_at	2.5182536	2.2194166	Z67748	亚精胺合成酶基因
92633_at	2.4970362	4.8684945	NM_022325	组织蛋白酶Z
					94521_at	2.5898051	2.126383	NM_009878	细胞周期因子依赖激酶抑制因子2D(p19，抑制CDK4)
102748_at	2.5555553	3.159657	NM_007976	凝血因子V
					98026_g_at	2.4942427	2.6773672	NM_010161	亲嗜性病毒整合位点2
104155_f_at	2.4959242	3.0125077	U19118	活化转录因子3
					104606_at	2.476346	2.9692168	NM_013706	CD52抗原
95423_at	2.4727428	2.26199	NM_009787	钙结合蛋白，肠源
					102914_s_at	2.4644232	2.763536	U23778	造血特异早期反应蛋白Al-b
100322_at	2.506151	3.7979157	U68543	免疫球蛋白κ链
					101561_at	2.5639465	3.3606117	K02236	金属硫蛋白II
94208_at	2.4507363	2.1223657	AK005989	EST
					92978_s_at	2.5112484	57173.336	NM_011111	丝氨酸(或半光氨酸)蛋白激酶抑制因子，分化枝B(卵清蛋白)，成员2
98968_at	2.4667523	3.6377416	NM_010864	肌球蛋白Va
					93869_s_at	2.409471	2.9823458	U23781	造血特异早期反应蛋白A1-d
100955_at	2.4169822	2.8062625	NM_026024	EST
					94939_at	2.3913658	2.5653691	NM_007651	CD53抗原
94831_at	2.3831258	2.396902	M65270	EST
					98147_at	2.3919983	2.7486196	AC002397	EST
97468_at	2.373815	2.054054	NM_016904	CDC28蛋白激酶1
					99333_at	2.3824167	2.1954718	M80778	Opioid受体δ1
97327_at	2.3735232	2.2973487	NM_007999	片状结构特异核酸内切酶1
					102851_s_at	2.338283	2.0963266	NM_013545	造血细胞磷酸酶
95608_at	2.387856	3.330935	NM_007798	组织蛋白酶B
					98025_at	2.3166697	2.6697729	NM_010161	亲嗜性病毒整合位点2
99051_at	2.3099425	3.3240612	M36579	M-窖蛋白
					98822_at	2.3430436	3.46114	NM_015783	干扰素刺激蛋白(15kDa)
103016_s_at	2.2778614	3.1853485	NM_009853	CD68抗原
					102156_f_at	2.2706146	3.39309	M80423	免疫球蛋白κ链
104701_at	2.257285	3.2854443	NM_011498	碱性螺旋-环-螺旋结构域，B2类
					100981_at	2.2767577	4.706134	NM_008331	含三十四肽重复序列的干扰素诱导蛋白1
98603_s_at	2.2418516	2.015457	U20857	RNA1同系物(Fug1)
					92913_at	2.2495005	2.0332723	NM_011994	ATP结合cassette，亚家族D(ALD)，成员2
102957_at	2.2281997	2.137948	BC006948	淋巴细胞胞浆因子2
					101221_at	2.219952	2.729755	BG065737	EST
160314_at	2.2163954	2.1361492	NM_026438	EST
					96963_s_at	2.2737944	3.4263778	L14553	TAX反应元件结合蛋白107
98572_at	2.2201126	2.0962021	NM_026400	DnaJ(Hsp40)同系物，亚家族B，成员11
					95348_at	2.2361295	7.687291	NM_008176	CXCL1(GRO-1)
103562_f_at	2.1999772	2.665438	M26005	删减的，小鼠内源性逆转录病毒删减

				gag蛋白，完全cds，克隆del env-1 3.1.
					96319_at	2.1911578	3.0398011	NM_023223	细胞分裂周期20同系物
96602_g_at	2.1935015	2.0309908	NM_023268	静止素Q6
					102353_at	2.1822197	3.2570171	NM_008404	整合素β2
94367_at	2.1611505	2.059546	NM_030724	尿苷-胞苷激酶2
					97894_at	2.162856	2.2836409	AF109905	TLP21(21-kDa TBP样蛋白)
98996_at	2.160693	2.2494855	L29479	丝氨酸/苏氨酸激酶18
					99632_at	2.1773741	3.8635976	NM_019499	MAD2(有丝分裂停留缺陷，同系物)样因子1
104527_at	2.15728	2.0993714	NM_011234	RAD51同系物
					95706_at	2.133521	4.0946174	BI414633	凝集素，半乳糖结合，可溶性因子3
160496_s_at	2.125215	2.1330795	X62154	微小染色体维持缺陷
					97733_at	2.1464872	2.5439253	NM_007413	腺苷酸A2b受体
98436_s_at	2.1127503	2.2659311	U54803	腺苷琥珀酸酯合成酶
					96357_at	2.110278	2.6390922	NM_023142	肌动蛋白相关蛋白2/3复合体，亚单元1B(41kDa)
92567_at	2.099979	2.7503965	NM_007737	前胶原，V型，α2
					93861_f_at	2.1034112	2.1940186	M17327	小鼠内源性鼠白血病病毒改良双嗜性前病毒DNA
95803_at	2.103923	2.652425	D87968	蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体型底物1
					93250_r_at	2.124497	2.4762044	NM_008252	高移动性box2
100328_s_at	2.1381612	2.3473186	NM_011090	双链Ig样受体A3
					160246_at	2.099816	2.0582118	BC009090	EST
103614_at	2.104216	2.412715	NM_019408	B2细胞κ轻链多肽基因增强因子的细胞核因子，p49/p100
					161984_f_at	2.093358	2.7761269	AK019448	前胶原，III型，α1
93167_f_at	2.0522046	3.1834278	AF303744	氧化LDL受体(Lox-I)
					95159_at	2.0587687	2.1079147	AK010250	Mrps18b
97824_at	2.0229275	2.1522021	NM_026631	EST
					103625_at	2.0461566	2.641253	NM_054070	AFG3(ATP酶家族基因3)样因子1
161345_f_at	2.0326214	2.405795	NM_007825	细胞色素P450，7b1
					93495_at	2.0277393	2.0939586	NM_016764	过氧化氧化还原酶4
93860_i_at	2.0132427	2.0345182	M17327	小鼠内源性鼠白血病病毒改良双嗜性前病毒DNA

[0057]如表1所示，精氨酸酶I(Genbank登录号NM_007482)、精氨酸酶II(Genbank登录号NM_009705)及L-精氨酸转运因子阳离子氨基酸转运因子CAT2(Genbank登录号NM_007514)的表达明显增加。其它参与精氨酸代谢的酶，如精氨基琥珀酸酯合成酶、L-鸟氨酸脱羧酶和L-鸟氨酸氨基转移酶在经盐水和过敏原致敏的小鼠中没有显著差异。有趣的是，基因芯片分析显示，与氧化氮合成酶(NOS)比较，精氨酸酶表现为非常特殊的非规律性调节。例如，在盐水和过敏原致敏的肺中，内皮细胞NOS和神经元NOS的杂交信号均低于背景信号(数据未显示)。尽管在多数条件下能检测到诱导性的NOS(iNOS)mRNA，但在盐水致敏和过敏原致敏之间没有显著变化。

[0058]随后的Northern blot分析(实施例3)表明，在OVA诱导的实验性哮喘的进行中精氨酸酶I的表达表现出时间和剂量的依赖关系；在第一次过敏原致敏18h后，精氨酸酶I表达增加，而且在两次过敏原致敏后表达进一步增加。此外，尽管精氨酸酶II mRNA的诱导弱于精氨酸酶I的诱导，但其在实验性哮喘的发展中更早地被诱导。例如，在第一次过敏原致敏3h后，精氨酸酶II易被检测到。此外，Northern blot分析证明过敏原致敏可诱导CAT2，并在第一次过敏原致敏后3h已有明显的表达。iNOS mRNA信号很难被检测到而且没有明显被OVA诱导。此外，与九次剂量的鼻腔内盐水致敏小鼠比较，烟曲霉菌(Aspergillus Fufnigatus)致敏小鼠的精氨酸酶I、精氨酸酶II及CAT2表达明显。与OVA模型的结果相同，只有很低水平的iNOS mRNA诱导表达。因此，由过敏原致敏的精氨酸酶和CAT2的诱导表达对于所使用的抗原不具特异性，但表现为实验性哮喘的部分遗传程序。

[0059]此外，表2所示为通过实施例14的方法建立的胃肠过敏症模型中显著上调的基因。

                             表2

                        过敏症标记基因

系统号	通用	Genbank登录号	说明
				94330_at	Npl	NM_028749	N-丙酮酸神经胺乙酯水解酶
99578_at	Top2a	NM_011623	拓扑异构酶(DNA)IIα
				102782_at	5430416A05Rik	NM_024242	RIKEN cDNA 5430416A05基因
94761_at	Ccl7	X70058	趋化因子(C-C基序)配体7
				161968_f_at	Cmkbr5	D83648	趋化因子(C-C)受体5
92742_at	Ccl11	U77462	小分子趋化因子(C-C基序)配体11
				102736_at	Ccl2	M19681	趋化因子(C-C基序)配体2
102204_at	Mafb	BC038256	v-maf肌腱纤维肉瘤癌基因家族蛋白B(鸟类)
				101024_i_at	Sprr2a	AJ005559	小分子脯氨酸富含蛋白2A
99701_f_at	Sprr2b	AJ005560	小分子脯氨酸富含蛋白2B
				101025_f_at	Sprr2a	AJ005559	小分子脯氨酸富含蛋白2A
102860_at	Serpina3g	BC002065	丝氨酸(或半光氨酸)蛋白激酶抑制因子，分化枝A.，成员3G
				103362_at	Ptger4	NM_008965	前列腺素E受体4(亚型EP4)
103715_at	Scin	NM_009132	肌切蛋白
				92251_f_at	Ifi204	NM_008329	干扰素激活基因204
92780_f_at	env	M90535
				93871_at	Illm	L32838	白介素1受体拮抗剂
102877_at	Gzmb	NM_013542	颗粒酶B

98500_at	Illrll	D13695	白介素1受体样因子1
				102712_at	Saa3	X03505	血清淀粉样蛋白A3
94774_at	Ifi202a	NM_008327	干扰素激活基因202A
				100325_at	Gp49a	NM_008147	糖蛋白49A
92286_g_at	I14	NM_021283	白介素4
				92217_s_at	Gp49b	U05265	糖蛋白49B
103226_at	Mrcl	NM_008625	甘露糖受体，C型1
				93776_at	1500001L15Rik	BC023770	RIKEN cDNA 1500001L15基因
103210_at	Csf2rd2	NM_007781	集落刺激因子2受体，β2，低亲和性(粒细胞-巨噬细胞)
				92832_at	Cishl	NM_009896	细胞因子诱导含SH2基蛋白1
99958_at	Mcpt2	NM_008571	肥大细胞蛋白酶2
				94375_at	Hk2	Y11666	己糖激酶2
98772_at	Cxc15	NM_009141	趋化因子(C-X-C基序)配体5
				98034_at	H2-DMbl	NM_010387	组织相容性2，II类，locus Mb1
104696_at	Ctse	AJ009840	组织蛋白酶E
				98948_at	MGC46970	NM_153547	假想蛋白MGC46970
93411_at		BG974696	ESTs
				92232_at	Cish3	NM_007707	细胞因子诱导含SH2基蛋白3
95673_s_at	Baspl	AK011545	脑富含，膜接触信号蛋白1
				104333_at	G7e-pending	U69488	G7e蛋白
161103_at		BG064768	ESTs
				100062_at	Mcmd	BC031700	微小染色体维持缺陷(S.cerevisiae)
162206_f_at	Cish3	NM_007707	细胞因子诱导含SH2基蛋白3
				98433_at	Bid	BC002031	BH3相互作用结构域死亡激动剂
160469_at	Thbsl	M62470	血小板凝集素1
				98045_s_at	Dab2	NM_023118	disabled同系物2(果蝇)
104155_f_at	Atf3	BC019946	激活的转录因子3
				101561_at	Mt2	K02236	金属疏蛋白2
98524_f_at	Enc1	AK008780	外胚层神经皮层蛋白1
				93869_s_at	Bcl2ald	U23781	B2细胞白血病/淋巴瘤相关蛋白Ald
94939_at	Cd53	NM_007651	CD53抗原
				104225_at	D2Ertd52e	NM_024225	DNA片段，Chr2，ERATODoi52表达
97327_at	Fen1	NM_007999	片状结构flap_structure特异核酸内切酶1
				104701_at	Bhlhb2	NM_011498	含碱性螺旋-环-螺旋结构域，B2类
101958_f_at	Tfdpl	NM_009361	转录因子Dp1
				102957_at	Lcp2	BC006948	淋巴细胞胞浆因子2
100046_at	Mthfd2	NM_008638	亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NAD+依赖)，甲叉亚甲基四氢叶酸环化水解酶
				96602_g_at	Qscn6	NM_023268	静止素Q6
92567_at	Co15a2	NM_007737	前胶原，V型，α2
				160246_at	AA987150	NM_134131	表达序列AA987150
102407_at	Mcpt5	M73760	肥大细胞蛋白酶5

哮喘中精氨酸酶的增加

[0060]此外还发现，在经实验性哮喘诱导后，肺中精氨酸酶活性显著增加。与对照组小鼠肺中没有精氨酸mRNA的结果一致，盐水致敏的肺中的精氨酸酶活性水平接近背景水平。作为对照，经盐水和OVA致敏的小鼠肝脏中的精氨酸酶活性分别为1522±183nmol/min/mg蛋白和1390±78nmol/min/mg蛋白。

[0061]因此表明，在哮喘小鼠肺中精氨酸由精氨酸酶(至少是部分由精氨酸酶)代谢。此外，哮喘中NO水平的变化可间接表明精氨酸酶活性，精氨酸酶是可通过底物去除作用来抑制NOS酶的功能的酶(Morris，S.M.，Jr.Annual Review of Nutrition 22，87-105(2002)；Mills，C.D.Crit RevImmunol 21，399-425(2001))。

[0062]此外，由于发现了哮喘中精氨酸酶I和精氨酸酶II为上调的，有可能针对精氨酸酶途径中的反应物和产物的多样性来发现靶向药物，从而为哮喘和过敏症提供治疗方法。例如，精氨酸酶的下游产物是调节细胞生长和结缔组织重新塑型的多胺和脯氨酸。已知这些途径参与了哮喘的病理生理过程，抑制精氨酸酶途径的任何部分将有可能抑制哮喘或过敏症。

精氨酸酶I mRNA的原位杂交

[0063]为开始确定这些分子的细胞来源，进行了精氨酸酶I mRNA的原位杂交，如下面的实施例7所示。对两次剂量的OVA或盐水致敏的OVA/明矾敏感的小鼠检测其精氨酸酶I反义(AS)和正义(S)探针的杂交信号。在第二次用盐水或过敏原致敏后18h，对组织进行分析。反义染色的哮喘肺在血管周围和支气管周围的炎症灶中显示出较强水平的精氨酸酶I。在OVA致敏的小鼠中没有发现正义探针的特异性染色。将盐水致敏肺中反义和正义探针的杂交信号与背景信号作比较。在具有大部分与巨噬细胞相同的丰富细胞浆的大单核细胞亚群中，存在反义探针的特异性染色。嗜伊红细胞亚群表达较少量的精氨酸酶I。此外，反义探针可与肺泡巨噬细胞和粘膜下梭形细胞杂交(与肌成纤维细胞或平滑肌细胞一致)。

通过给予可降低或抑制肺中精氨酸酶的组合物来治疗或预防哮喘或过敏症

[0064]本发明的一个实施方案是通过给予需要治疗的个体治疗有效量的精氨酸酶抑制剂来抑制哮喘的方法(实施例15-20)。例如，L-精氨酸转运因子CAT2和精氨酸酶下游酶L-鸟氨酸脱羧酶(ODC)是治疗的目标。例如二氟甲基鸟氨酸(DFMO)为ODC的抑制剂，其可用于抑制哮喘和过敏症(实施例17-19)。因此，本发明的一个实施方案是通过已知的鸟氨酸脱羧酶(ODC)抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO)来治疗哮喘或过敏症。本发明的另一个实施方案包括对患有哮喘或过敏症的个体给予有效剂量的DFMO。

[0065]此处使用的抗精氨酸酶化合物是能抑制或降低精氨酸酶作用的化合物。在一个实施方案中，精氨酸酶抑制剂是精氨酸酶途径中的小分子或基因的反义抑制剂。

[0066]在本发明的另一实施方案中，精氨酸酶抑制剂是精氨酸酶I或精氨酸酶II的抑制剂。精氨酸酶抑制剂优选给药至个体的肺部，但其它治疗方式也可达到预期效果。优选的精氨酸酶抑制剂是小分子，例如N(ω)-羟基-L-精氨酸(NOHA)、N-羟基-去-L-精氨酸(nor-NOHA)及诸如2(S)-氨基-6-二羟硼己酸(ABH)和S-(2-二羟硼乙基)-L-半光氨酸(BEC)等的硼酸基过渡态类似物。其它的抑制剂是由Que等(Nitric Oxide.2002 Feb；6(1)：1-8)所公开的那些。如实施例15所示，NOHA可以阻断哮喘肺中的精氨酸酶活性，以及在实施例20中其可阻断过敏原诱导的气道高反应性的发展。因此，本发明的一个实施方案通过给予治疗有效量的NOHA来治疗哮喘。

[0067]此外，一些NO合成酶抑制剂可阻断精氨酸转运因子CAT2，并由此通过减少精氨酸的可用水平来产生预期的降低哮喘作用。据此，本发明的一个实施方案是通过给予哮喘或过敏症个体有效剂量的化合物来治疗哮喘或过敏症，其中该化合物可降低个体的ArgI、ArgII或CAT2的水平或功能。

[0068]本发明的另一个实施方案是一种用于治疗哮喘或过敏症的治疗组合物，其包括在药学上可接受的载体中的精氨酸酶抑制剂。其它的实施方案包括抑制性治疗组合物，其包括在药学上可接受的载体中的ADAM8抑制剂。这种ADAM8抑制剂例如可通过将ADAM8从跨膜形式转变为溶解形式来改变ADAM8的构象或结构。

[0069]此处使用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”均指治疗性处理和防病或预防的措施，其目的是防止或减缓(减轻)不希望的生理性变化或失调，如癌症的发展或扩散。术语“治疗(treat)”还指疾病的类型或严重程度的特征，该疾病在预后过程中可能有分支表现或需要特殊的治疗。为此发明目的，有益或所期望的临床结果包括但不限于无论是可检测到的还是不可检测到的症状的缓解、疾病程度的消失、疾病的稳定(即不恶化)、疾病发展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻以及疾病的免除(部分或全部)。“治疗(treatment)”还指与未接受治疗所预计的存活率相比延长的存活率。需要治疗的人包括那些已经处于疾病状态或失调的人以及有发展为疾病状态或失调倾向的人，或应预防这种疾病状态或失调的人。

[0070]通过将具有所需纯度的抗精氨酸酶化合物与可选择的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington：The Science and Practice ofPharmacy，19th Edition，Alfonso，R.，ed，Mack Publishing Co.(Easton，PA：1995))混合能够制备抗精氨酸酶或抗ADAM8化合物的治疗性制剂，并可以冻干块或水溶液的形式储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所应用的剂量和浓度下对受者是无毒性的，其包括：诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸等的缓冲剂；包括抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子量(残基约少于10个)的多肽；诸如血清白蛋白、凝胶或免疫求蛋白等的蛋白；诸如聚乙烯吡咯烷酮等的亲水性聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸等的氨基酸；包括葡萄糖、甘露糖或糊精等的单糖、二糖和其它碳水化合物；诸如EDTA等的螯合剂；诸如甘露醇或山梨醇等的糖醇；诸如钠的成盐抗衡离子；和/或诸如吐温(Tween)、聚醚或聚乙二醇(PEG)等的非离子表活性面剂。

[0071]在体给药的抗精氨酸酶、抗CAT2或抗ADAM8化合物必须经灭菌。此步骤在冻干和复原之前或之后，可以很容易地通过无菌滤膜过滤来完成。此化合物通常以冻干或溶液形式储存。

[0072]通常将治疗性的抗精氨酸酶、抗CAT2或抗ADAM8化合物放入带有无菌接入口的容器中，例如带有通过皮下注射针能够刺破的塞子的静脉内注射溶液袋或小瓶。

[0073]给予化合物的途径与已知的方法一致，如静脉内、腹腔内、脑内、皮下、皮上、鼻腔内、气管内、雾化、肌肉内、眼内、动脉内、脑脊髓腔内或病灶内注射或输注，或如下文所述的缓释给药系统。

[0074]适宜的缓释制剂的实例包括成形物形式的半渗透性聚合基质，例如薄膜或微囊。缓释基质包括聚酯、水凝胶、聚交酯(U.S.3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman et al.，Biopolymers，22：547-556(1983))、聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)(Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer et al.，supra)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。缓释化合物还可包含脂质体俘获组合物。可通过DE3,218,121；Epstein et a1.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-3692(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；U.S.4,485,045和4,544,545；以及EP 102,324所公布的方法制备含脂质体的化合物。通常脂质体为小的(约200-800埃)单载体类型，其中脂质含胆固醇量大于约30mol.％，所选择的比例应满足最佳的治疗效果。

[0075]抗精氨酸酶、抗CAT2或抗ADAM8化合物还能通过吸入给药。商业销售的液体制剂喷雾器(包括喷射喷雾器和超声喷雾器)均可用于给药。液体制剂可直接雾化，冻干粉可在复原后雾化。可选择地，这些化合物能应用氟碳化合物制剂和计量吸入器使其烟雾化，或以冻干粉和研碎粉吸入。

[0076]用于治疗的化合物的“有效量”取决于例如治疗目的、给药途径、所使用化合物的类型以及患者的病情。据此，为实现理想的治疗效果，治疗者有必要根据需要选择剂量和改变给药途径。一般地，临床医生将给予化合物到能够获得理想效果的剂量为止。这种治疗过程很容易通过常规分析来监控。

[0077]在应用抗精氨酸酶、抗CAT2或抗ADAM8化合物对哮喘或过敏症的治疗和预防中，化合物的组方、剂量和给药方式应与有效的医学实践相一致。此过程要考虑的因素包括被治疗的哮喘/过敏症的程度、患者的临床情况、化合物的给药点、化合物的特定类型、给药方法、给药疗程以及开业医生已知的其它因素。这种欲给予的化合物的“治疗有效量”应结合这些因素来监控，并且应是预防、改善或治疗哮喘必需的最小量。此量优选应低于对宿主产生毒性的量或低于导致宿主明显易于感染的量。

[0078]通常建议肠道外给药的抗精氨酸酶、或抗ADAM8化合物的初始药物上的有效量优选约为0.1～50mg/kg体重/天，典型的化合物初始范围优选为0.3～20mg/kg/天，更优选为0.3～15mg/kg/天。根据医生所希望实现的药代动力学衰减形式，可以通过一次给药、多次给药或连续输入给药来给予所要求的剂量。

[0079]然而如上所述，化合物的这些建议的量需要经过许多的治疗验证，包括使用的化合物的类型。选择合适剂量和疗程的关键因素是按上述得到的结果。例如，此化合物可选择性地可与一种或多种目前使用的预防或治疗哮喘的药物一起组方。这种其它药物的有效量取决于制剂中存在的化合物的量、哮喘的临床程度和上述讨论的其它因素。它们通常以相同的剂量使用，并且与上文使用的给药途径相同，或以约为1～99％的以前使用的剂量使用。

通过在特定的组织中增加精氨酸酶而在其它组织中降低精氨酸酶来治疗哮喘或过敏症

[0080]本发明的另一个实施方案包括在患者特定的组织中增加精氨酸酶水平来提供保护性反应。这涉及到增加精氨酸酶可通过功能性地(直接或间接地)抑制NO合成酶来减少NO的合成的事实。因为NO的氧化产物可诱导多种炎症反应，所以肺中的精氨酸酶的合成可通过降低NO依赖性炎症反应的方式来增加其保护性，但其在肺的慢性变化(如平滑肌细胞生长和纤维化)中有损伤性。本发明的一个实施方案包括给予患者可增加肺中特异型细胞(巨噬细胞)中的精氨酸酶、但降低肺中其它细胞(内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞)中的精氨酸酶的化合物。

与精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2或ADAM8基因或蛋白相互作用或与其结合的分子的筛选

[0081]本发明的其它实施方案提供筛选或鉴定能诱导或抑制精氨酸酶I基因和蛋白表达的蛋白、小分子或其它化合物的方法。此分析可通过离体使用转形或非转形细胞、永生细胞系或通过在体使用转形哺乳动物细胞来进行。特别地，此分析以mRNA表达的增加或降低、精氨酸酶I蛋白水平的增加或降低或诸如腐胺或鸟氨酸等的精氨酸酶途径产物表达水平的增加或降低为基础，来确定精氨酸酶I基因或精氨酸酶I蛋白表达的增加或降低。此外，可以用来源于呼吸道的生物液体(如肺提取物、痰、支气管肺泡灌洗液)或血液样品(白细胞)来分析精氨酸酶活性，并随后用于酶活性抑制剂的筛选。

[0082]例如，对已知为表达精氨酸酶I多肽的分离细胞或转化为表达精氨酸酶I多肽的分离细胞进行培养，并在培养基中加入一种或多种试验化合物。给化合物一段充分长的时间来诱导或抑制精氨酸酶I的表达后，例如在0-72h内的任意时间点或更长，可检测出从已确立的基线开始的表达水平的任何变化。

[0083]本发明的另一个实施方案提供一种鉴定能结合精氨酸酶I蛋白或直接与其相互作用的蛋白和其它化合物的方法。这些蛋白和化合物包括在体与精氨酸酶I相互作用的内源性细胞组分，并因此能够提供药物的新目标；同时还包括具有精氨酸酶I结合能力的重组、合成和其它外源性化合物，并因此能够成为抑制哮喘反应的候选物质。

[0084]因此，在一系列实施方案中，高通量筛选(HTS)蛋白或DNA芯片、细胞裂解液或组织匀浆可用来筛选能够与精氨酸酶I基因/蛋白、精氨酸酶II基因/蛋白、CAT2基因/蛋白、ADAM8基因/蛋白相结合的蛋白或其它化合物。可选择地，可对多种天然存在的和/或合成的外源性化合物中的任意化合物(例如小分子库或肽库)的精氨酸结合能力进行筛选。

[0085]在各种实施方案中，为确定精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2、ADAM8和其它部分的结合能力需进行分析。在这些分析中的精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2、ADAM8可以是任何含有或来源于正常或突变精氨酸酶I蛋白的多肽，包括精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2或ADAM8融合蛋白的功能区或抗原决定区。可以通过非特异方法(例如，可以通过差异显示、双向凝胶电泳、差异杂交或SAGE方法检测的转录调节变化、染色质结构改变、其它下游基因表达的多肽产物或变化)或通过直接方法(如免疫共沉淀、生物分子间相互作用分析(BIAcore)或蛋白凝胶电泳变化方法)检测结合能力。优选的方法包含了以下技术的变体：(1)通过亲合性色谱直接提取；(2)通过免疫共沉淀共同分离精氨酸酶I组分和结合蛋白或其它化合物；(3)BIAcore分析；及(4)酵母双杂交系统。

[0086]本发明的另一个实施方案提供鉴定能够改变正常或变异的精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2或ADAM8的活性的蛋白、小分子和其它化合物的方法。

[0087]本发明的另一个实施方案是提供鉴定化合物的方法，该方法以化合物影响精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2或ADAM8的表达、精氨酸酶I活性、其它精氨酸酶I调节的基因活性或与正常或变异精氨酸酶I蛋白相互作用的蛋白活性的能力来进行的。对精氨酸酶I基因或精氨酸酶I蛋白具有活性的化合物的鉴定方法可通过使用正常细胞、重组细胞或使用本文所述的小鼠实验性哮喘模型来进行。

[0088]根据本发明的另一方面，本发明的蛋白可作为合理化学设计的起点，来设计配体或其它类型的小化学分子。可选择地，通过上述筛选方法鉴定的小分子或其它化合物在哺乳动物精氨酸酶I途径的调节剂设计中可用作“先导化合物”。

精氨酸酶的检测和定量可用于患者哮喘或过敏症的诊断

[0089]本发明的另一实施方案是通过测量个体的生物液体/组织(如肺、痰、支气管肺泡灌洗液、血液、血浆、尿或鼻分泌物/洗液)中精氨酸酶水平来检测个体哮喘的方法。精氨酸酶水平高于正常表明该个体患有哮喘。此外，精氨酸酶水平可以是具有诊断价值的表型标记。例如，精氨酸酶活性升高的患者很大程度上具有过敏性病因、近期过敏原暴露或疾病严重的可能性。

细胞因子与精氨酸酶I诱导间的关系

[0090]如上所述，本发明的实施方案涉及发现了在哮喘中精氨酸酶I和精氨酸酶II的明显上调，如下面的实施例8所示。精氨酸酶可催化反应：L-精氨酸+水→L-尿氨酸+尿素。已知的是精氨酸酶参与Krebs-Henseleit尿素循环并在哺乳动物肝脏中高度浓缩。

[0091]此外，还发现信号-传感器和催化剂转录6(STAT-6)依赖形式中的细胞因子白介素-4(IL-4)和细胞因子白介素-13(IL-13)能显著诱导肺中的精氨酸酶I。如上所述，如下面的实例9所示，已发现IL-4和IL-13在激活炎症和居宿效应因子途径中具有重要作用，因而可导致临床上哮喘和过敏症发病。因此，阻断IL-4、IL-13、STAT6的药物有可能降低精氨酸酶水平，从而对哮喘或过敏症患者发挥治疗作用。因此，在诸如血液、痰、肺液、活检样品等生物液体中的精氨酸酶活性的降低可以视为诸如糖皮质激素或抗IL-4、抗IL-13或抗STAT6化合物的药物阳性反应的表现。

过敏性气道炎症反应与肺腐胺产生的增加有关

[0092]本发明的其它实施方案涉及发现了Th2细胞因子介导的过敏症可能与明显由精氨酸酶诱导的精氨酸代谢相关。为验证在过敏症肺中精氨酸酶下游产物为过表达，我们检测了多胺腐胺(一种精氨酸酶依赖的精氨酸代谢物)。

[0093]我们发现，当对全肺组织进行分析时，OVA致敏小鼠的腐胺水平显著增加(在盐水和OVA致敏的小鼠中分别为14.7±5.6和32±13nmol/g组织[P＜0.05])。考虑到全肺的检测，2倍的腐胺增加是非常明显的。因气道的炎症反应与肺腐胺产生的增加有关，所以本发明的一个实施方案是降低肺中腐胺的水平来为患有过敏症肺的个体提供有效的治疗。据此，本发明的一个实施方案是通过使用可降低肺中腐胺水平的组合物来治疗过敏症肺。此外，本发明的另一实施方案是通过检测肺中腐胺的增加水平来鉴定和/或诊断过敏症肺。

人哮喘中精氨酸酶的诱导

[0094]实验性小鼠哮喘模型中的结果被证明与人哮喘有关(图10)。为将小鼠模型结果翻译为人的结果，分析了哮喘患者和对照组患者的支气管肺泡灌洗液细胞中的精氨酸酶I蛋白表达(实例13)。利用免疫组化方法，发现哮喘组中精氨酸酶I表达的细胞数量明显增加(图10)。

[0095]在两组中，免疫阳性细胞主要为有巨噬细胞形态特征的单核细胞。在哮喘组中出现少量的免疫阳性粒细胞。此外，精氨酸酶I正义探针的原位杂交显示，与非哮喘肺(对照组)相比哮喘肺中的精氨酸酶ImRNA表达水平增加。哮喘肺中的精氨酸酶I阳性细胞包括上皮细胞及粘膜下细胞(如平滑肌细胞和渗透性髓样细胞)。

CAT2参与实验性哮喘的变化过程

[0096]本发明的另一个实施方案涉及发现氨基酸转运因子CAT2也通过精氨酸酶途径参与哮喘的发病机制。为确定在哮喘肺中表达的是那种CAT的异构体，我们通过PCR克隆肺中的CAT2cDNA(图9)。

[0097]我们随后将PCR产物克隆到TA载体中(pCR2.1，Invitrogen，Inc)，并利用EcoRI(特异酶切外显子8)和BamHI(特异酶切外显子7)酶切插入片段(图9)。所有对克隆插入片段的分析(n＝6)表明用BamHI酶切可得到所希望的片段，而用EcoRI不能。作为对照，来源于肝脏的cDNA通过EcoRI单酶切后可得到所希望的4kb载体及600和100bp插入产物片段，这表明为CAT2A异构体。这些结果表明，过敏症肺中的CAT2以高亲合性的CAT2B异构体为主。

[0098]研究表明，来源于CAT2缺失小鼠的巨噬细胞的L-精氨酸的摄取降低95％，并且NO的产生也明显降低(Nicholson et al.，J Biol Chem，276：15881-5(2001))。为分析CAT2在实验性哮喘中的作用，对CAT2缺失小鼠(和其同窝出生的对照小鼠)给予OVA诱导的实验性哮喘处理。利用基因芯片检测通过分析这些过敏原致敏后的小鼠转录谱，来筛选一大批可能的内标。值得注意的是与野生型小鼠相比CAT2缺陷小鼠的过敏原诱导的基因产物水平降低6.8％。这些产物中的一种为CAT2本身，也验证了基因组分析的可靠性。有趣的是，CAT2缺失小鼠诱导在过敏性气道反应中公知的关键分子(包括趋化因子TARC)(Lloyd et al.，J Exp Med，191：265-74(2000)；Kawasaki et al.，J Immunol，166：2055-62(2001))和15-脂质氧化酶(Sigal et al.，J Lipid Mediat，6：75-88(1993)；Kuitert et al.，Thorax，51：1223-8(1996)；Bradding et al.，Am J Respir Grit Care Med，151：1201-4(1995))的能力减弱。此外，CAT2缺失小鼠诱导小分子富含脯氨酸(SPR)蛋白2A(一种由上皮细胞分泌的分子，已知其对细胞外基质的完整性起重要作用)的能力减弱(Cabral et al.，J Biol Chem，276：19231-7(2001)；DeHeller-Milev et al.，Br J Dermatol，143：733-40(2000))。对于每个基因，通过Northern blot分析确实了CAT2为适当的过敏原诱导所必需的分子。

[0099]尽管CAT2最初被描述为T细胞活化分子，但其在T细胞介导的免疫反应中的作用此前仍未见报道(MacLeod et al.，J Exp Biol，196：109-21(1994))。CAT2可能参与iNOS或精氨酸酶的可用底物关键性调节的第一个证据是对前炎症分子(如脂多糖)调节CAT2表达的发现(MacLeod et al.，J Exp Biol，196：109-21(1994))。最近发现，CAT2缺失的巨噬细胞的精氨酸摄取和NO合成能力明显减弱，这有力地支持了CAT2在免疫反应中的作用(Nicholson et al.，J Biol Chem，276：15881-5(2001))。尽管通过CAT2的氨基酸转运对与哮喘有关的生化途径可能影响，但基因芯片分析被用于确定CAT2是否影响哮喘肺中的基因表达。确实我们发现在过敏原诱导基因(包括TARC和15-脂质氧化酶以及编码蛋白的基因)的选择亚群中的减弱已证实其参与某些过敏性气道反应(Kawasaki et al.，JImnunol，166：2055-62(2001)；Sigal et al.，J Lipid Mediat，6：75-88(1993)；Bradding et al.，Am J Respir Crit Care Med，151：1201-4(1995))。CAT2可调节基因表达并通过多种机制在哮喘中发挥作用(包括对转录的直接影响或可选择地通过级联的下游生化信号事件介导的间接影响)。

降低或抑制肺中CAT2的方法可用于治疗或预防哮喘或过敏症

[0100]由于CAT2在哮喘中的作用，通过能够降低或抑制肺中CAT2的组合物可治疗哮喘或过敏症。例如，向肺给予CAT2抑制剂可能实现这一目的。也可通过向肺中给予CAT2基因序列的反义片段或给予能够释放这种反义片段的核酸载体序列来实现这一目的。任何能够降低CAT2表达或功能的方法都可用于治疗哮喘或过敏症。

通过在特定组织中增加CAT2来治疗哮喘或过敏症

[0101]本发明的另一个实施方案包括在患者特定的组织中增加CAT2的水平来提供与通过eNOS产生的气管舒张剂NO有关的保护反应。这涉及到增加CAT2水平或功能会增加NO合成的事实。本发明的一个实施方案包括给予患者能够增加肺特定细胞(如内皮细胞)中的CAT2水平而降低肺其它细胞中的精氨酸酶的化合物。

ADAM-8与哮喘的关系

[0102]本发明的另一个实施方案涉及发现了在特殊哮喘模型中的ADAM-8(也称CD156)的诱导，该模型是通过用气源性过敏原烟曲霉菌重复粘膜过敏原致敏所诱导的。已鉴定ADAM-8作为与抗原诱导的气道炎症有关的遗传程序的一部分，并与特异参与其表达调节的信号分解有关。通过向肺中传输IL-4和IL-13可明显增加ADAM-8的表达，而且这种诱导作用很大程度上是STAT-6非依赖的。因此，减少患者ADAM-8水平的治疗预计能产生有益的治疗效果。此外，通过患者ADAM-8水平增加的发现可诊断哮喘和过敏症，其中这种增加的水平是哮喘或过敏症的提示。

[0103]ADAM-8属于ADAM(一种去整合蛋白和金属蛋白酶)家族中的I型跨膜蛋白(Yamamoto，S.，Higuchi，Y.，Yoshiyama，K.，Shimizu，E.，Kataoka，M.，Hijiya，N.，and Matsuura，K.1999.ADAM family proteins inthe immune system.Immunol Today 20：278-284)。尽管ADAM 1～ADAM 7主要在生殖器官中表达并在精卵融合和精子发生中发挥重要作用，但此家族的其它成员表达更加广泛。已证实ADAM家族的特殊成员(ADAM-10和ADAM-17)在免疫系统中的作用，其中它们参与了细胞表面TNF-α前体形式的发展。ADAM-8在免疫系统中的作用与其相似。这种蛋白从巨噬细胞的cDNA库中被鉴定，并记录在小鼠和人的PMN和巨噬细胞中(Yoshiyama，K.，Higuchi，Y.，Kataoka，M.，Matsuura，K.，andYamamoto，S.1997.CD 156(human ADAM8)：expression，primary aminoacid sequence，and gene location.Genomics 41：56-62)。在肝脏和肾脏中表达ADAM-8细胞外组分的转基因小鼠研究显示，在噁唑酮介导的接触超敏性后有中性粒细胞渗出。研究还表明，LPS和IFN-γ诱导后ADAM-8基因表达上调(Kataoka，M.，Yoshiyama，K.，Matsuura，K.，Hijiya，N.，Higuchi，Y.，and Yamamoto，S.1997，Structure of the murine CD 156 gene，characterization of its promoter.and chromosomal location.J.Biol.Chem.272：18209-18215)。

[0104]然而，ADAM-8在过敏症中的作用机制至今并不清楚。尽管上述的基因芯片包括ADAM家族的18个成员，但只有一个ADAM基因被明显诱导表达。与盐水处理小鼠比较，重复鉴定表明这个基因在每个过敏原处理的小鼠中高水平表达。此外，因ADAM家族成员的I型跨膜蛋白具有调节免疫反应的作用(如细胞表面TNF-α前体的蛋白水解过程)(Black，R.A.，Rauch，C.T.，Kozlosky，C.J.，Peschon，J.J.，Slack，J.L.，Wolfson，M.F.，Castner，B.J.，Stocking，K.L.，Reddy，P.，Srinivasan，S.，et al.1997.A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosisfactor-alpha from cells.Nature 385：729-733)，这种分子代表实验性哮喘中的可能的重要途径。与其在肺、脾、睾丸中的低水平的基础性表达比较，随后的Northern blot分析进一步肯定了ADAM-8是由过敏原致敏诱导的。

哮喘特定模型中ADAM-8的诱导

[0105]我们对ADAM-8与实验性哮喘模型的关系是否限定于使用OVA的特定模型进行了验证。据此，我们通过鼻腔内给予重复剂量的抗原烟曲霉菌来诱导实验性哮喘模型(Huang，w.W.，Garcia-Zepeda，E.A.，Sauty，A.，Oettgen，H.C.，Rothenberg，M.E.，and Luster，A.D.1998.Molecular and biological characterization of the murine Leukotriene B4receptor expressed on eosinophils.J Exp.Med.188：1063-1074.)。值得注意的是，这种模型并没有使用腹腔内致敏，并且烟曲霉菌是普遍通用的气源性过敏原。鼻腔内给予9次剂量的烟曲霉菌18h后，肺总RNA用来作Northern blot分析和用作ADAM-8的探针。与9次剂量的鼻腔内盐水致敏的小鼠比较，烟曲霉菌致敏小鼠的ADAM-8mRNA表达明显增加，因此过敏原致敏对ADAM-8的诱导对所用的抗原不具特异性，而是参与实验性哮喘的遗传程序的基因(图6和表1)。

ADAM-8表达调控

[0106]鉴定ADAM-8为过敏性气道反应的新基因后，我们对参与ADAM-8调节的分子进行了研究。因过敏症的主要特征是诸如IL-4和IL-13等Th2细胞因子的过度表达，于是我们对这些细胞因子是否直接诱导ADAM-8的表达进行了检测。为验证这一假说，我们检测了肺中特异IL-4过度表达的转基因小鼠中的ADAM-8表达。

[0107]与野生型小鼠比较，IL-4肺转基因小鼠的ADAM-8mRNA表达明显升高。于是我们检测了在肺中给予IL-13对ADAM-8的诱导能力。与盐水处理的动物比较，通过鼻腔内途径将IL-13向肺给药可诱导ADAM-8mRNA表达水平的升高。IL-4和IL-13共用通用的受体信号途径，该途径包括STAT-6依赖和非依赖的受体后事件。因此我们对STAT-6在ADAM-8诱导中是否是必需的进行了分析。为验证这一假说，我们对STAT-6野生型或缺失型的IL-4肺转基因小鼠中的ADAM-8表达进行了分析。有趣的是，Northern blot分析表明，IL-4诱导的ADAM-8表达很大程度上是STAT-6非依赖性的。

通过改变肺中ADAM-8的表达水平来治疗哮喘或过敏症

[0108]据此，本发明的另一个实施方案是通过给予患者能够降低患者中ADAM-8水平的组合物来治疗哮喘或过敏症的方法。例如，可通过向肺中给予ADAM-8基因序列的反义片段或给予能够释放这种反义片段的核酸载体序列来实现这一目的。任何能够降低ADAM-8表达的方法都可用于治疗哮喘或过敏症。此外，患者中ADAM-8水平或基因序列的多样性检测和定量分析可用于诊断哮喘或过敏症的存在或严重程度。

[0109]本领域所属技术人员应该理解，在不脱离本发明的精神下可作出多种不同的改变。结合下面的具体实施例可对本发明有更加全面的理解，本文提供的实施例仅是为了说明本发明而不意图限制本发明的范围。

实施例

实施例1

小鼠实验性哮喘的诱导

[0110]从国家癌症研究所(National Cancer Institute，Frederick，MD)获得Balb/c小鼠，并在无病原体的条件下饲养。哮喘模型按如下过程诱导：在第0天和第14天腹腔注射OVA和1mg氢氧化铝(明矾)，随后在第24天和第27天鼻腔内给予OVA或盐水致敏(在促进蛋白向肺内释放的条件下)，烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)抗原诱导的哮喘是在麻醉小鼠鼻腔内重复使用这种蛋白超过3周的过程中诱导的，见如下的报道：Huang，W.W.，Garcia-Zepeda，E.A.，Sauty，A.，Oettgen，H.C.，Rothenberg，M.E.，and Luster，A.D.1998.Molecular and biological characterization of themurine Leukotriene B4 receptor expressed on Eosinophils.J.Exp.Med.188：1063-1074及Mishra，A.，Weaver，T.E.，Beck，D.C.，and Rothenberg，M.E.2001.Interleukin-5-mediated allergic airway in flammation inhibits thehuman surfactant protein C promoter in transgenic mice.J.Biol.Chem.276：8453-8459。

实施例2

RNA的制备和芯片杂交

[0111]根据制造商的指导，使用Trizol试剂提取RNA。用Trizol纯化后，用苯酚-氯仿提取法和乙醇沉淀法再次纯化RNA。通过儿童医院医疗中心的AFFYMETRIX基因芯片中心设备进行芯片杂交。简单讲，先用Agilent生物分析仪(Agilent technologies，Palo Alto，CA)对RNA的质量进行分析，只有28S/18S比值为1.3-2的样品才能在随后的试验中使用。通过用于cDNA合成的Superscript选择(Invitrogen，Carlsbad，CA)将RNA反转录为cDNA，随后使用Enzo High Yield RNA转录标记试剂盒(Enzodiagnostics，Farmingdale NY)将其反转录为生物素化的cRNA。与小鼠U74Av2基因芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)杂交后，通过射流系统自动冲洗基因芯片，并用链亲霉素-藻红蛋白(streptaVidin-phycoerythrin)染色。用Hewlett Packard GeneArray扫描仪对芯片进行扫描。此分析按每个芯片一只小鼠进行(每个过敏原致敏组n≥3；每个盐水致敏对照组n≥2)。

实施例3

Northern blot与RT-PCR分析

[0112]从野生型Balb/c小鼠的肺中、从含STAT-6野生型或缺失基因拷贝(Shimoda et al.，Nature，380：630-3(1996))的IL-4Clara细胞10肺转基因小鼠(Rankin et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，93：7821-7825(1996))的肺中以及从用盐水或重组小鼠IL-13处理(此前有报道，Yang et al.，Am J Respir Cell Mol Biol，25：522-30(2001)；Pope et al.，J Allergy Clin Immunol，108：594-601(2001))的小鼠肺中提取RNA。通过PCR产生的或商业销售载体(从美国组织培养保藏中心(American Tissue Culture Collection)获得的图像集，Rockville，MD or Incyte Genomics，Palo Alto，CA)制备的cDNA探针被测序验证、用³²P进行放射性标记，并在常规条件下杂交。利用基因特异引物通过的常规方法以肺cDNA为模板进行RT-PCR。

实施例4

数据分析

[0113]针对基因芯片的数据图像文件，利用Microarray Analysis SuiteVersion 4软件(Affymetrix)中的算法，对基因的转录水平进行分析。为比较芯片与芯片间的基因进行全比例缩放(Global scaling)，因此每个芯片标准化到一个任意值(1500)。每个基因通常由一组16-20个探针对代表。每个探针对由完全匹配的寡核苷酸和在中心位置含一个不匹配碱基的不匹配寡核苷酸组成。使用完全称谓和平均差异(absolute call and averagedifference)两种基因表达的检测方法。完全称谓是一种定性检测方法，其中根据RNA与探针组的杂交信号，将每个基因指定为表达、边缘或不表达的称谓。平均差异是一种基因表达水平的定量检测方法，其中利用每个探针对中完全匹配和不匹配间的差异并平均全部探针组的差异来计算。还通过GeneSpring软件(Silicon Genetics，Redwood City，CA)对用盐水和OVA处理的小鼠间的差异进行了分析。将每个过敏原致敏的时间点数据标准化为盐水处理小鼠的平均值。将P＜0.05且＞2倍变化的基因列于基因表中。通过GenBank从未知的表达序列标签中确定cDNA的名称。根据从NetAfix服务器(www.netaffx.com)获得的基因存在论分类方法(GeneOntology classification)(Ashbumer，2000 #2003)和GenBank中的公共信息进行功能分类。通过Student′s非配对t检验对试验组的平均值差异的显著性进行分析。数值以平均值±平均值的标准误差(SEM)来表示。当P＜0.05时，认为平均值具有显著性差异。

实施例5

体积描记法检测

[0114]通过大气压体积描记法使用Buxco(Troy，NY)提供的仪器和软件，分析清醒的无限制的小鼠中甲胆碱的气道反应性。此系统能够产生用于经验地监测气道功能的所谓增强脉冲(Penh)的无因次参数，该参数通过与早期、晚期呼吸的定时比较相结合的体积描记室来反应压力信号的波形变化。根据Yang，M.等(Am J Respir Cell Mol Biol 25，522-30(2001))和Hamelmann，E.等(American Journal of Respiratory & Critical CareMedicine 156，766-75(1997))所述的方法进行检测。

[0115]简单讲，将小鼠放入室中，读取基线值并平均3分钟内的值。将雾化的甲胆碱(溶液中的浓度范围为3.125-50mg/ml)从入口释放入室中达2分钟，然后平均每次给药剂量3分钟时间段内的读数。

实施例6

精氨酸酶活性和腐胺水平的检测

[0116]根据Wei，L.H.，et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 98，9260-4.(2001)；Li，H.et al.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 282，R64-R69.(2002)；Wei，L.H.et al.，Am J Physiol Cell Physiol 279，C248-56.(2000)中所建立的技术，利用血液尿素氮试剂(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)对精氨酸酶活性进行检测。酸提取后的腐胺水平通过离子对反相高效液相色谱进行检测。

实施例7

通过原位杂交定位精氨酸酶I mRNA

[0117]为确定精氨酸酶I mRNA的细胞分布，进行了原位杂交分析。在第二次盐水或过敏原致敏后的第18h分析组织。为制备探针，先将质粒pCMV-SPORTT6(Incyte Genomics，St.Louis，MO)中的小鼠精氨酸酶IcDNA通过EcoRI或NotI酶切线性化。分别通过T7和T3 RNA聚合酶(Riboprobe Gemini Core System II转录试剂盒；Promega，Madison，WI)生成反义和正义RNA探针。通过可控制的碱性水解将放射性标记的[αS³⁵-UTP]探针还原到200个碱基的平均长度。对两种剂量的OVA或盐水致敏的OVA/明矾敏感小鼠中的精氨酸酶I反义(AS)和正义(S)探针的杂交信号进行检测。在高度严格的条件下冲洗杂交玻片。以盐水致敏肺的反义和正义探针杂交信号为对比背景。

实施例8

精氨酸酶I表达的分析

[0118]在一次致敏后第3小时或者一次或两次致敏后的第18小时，通过上述基因芯片的分析方法来检测编码精氨酸代谢酶精氨酸酶I和iNOS的基因表达。此外，精氨酸酶I和iNOS表达的Northern blot分析表明，OVA-诱导的过敏症使得在第3小时时精氨酸酶I没有显著的表达，但在第18小时时有相当的表达，当进行最初的两次致敏时第18小时出现高水平表达。相比而言，在iNOS的Northern blot检测中，未见其表达。通过血液尿素氮试剂检测在盐水和OVA致敏的小鼠肺中的精氨酸酶在肺裂解液中的活性。作为对照，盐水和OVA致敏的小鼠在肝脏中的精氨酸酶活性分别为1522±183和1390±78。

实施例9

IL-4和IL-3相关的精氨酸酶I的分析

[0119]为揭示肺中诱导精氨酸酶的哮喘相关信号，本研究集中于确定精氨酸酶I是否为Th2细胞因子IL-4和IL-13的下游信号。对IL-4肺转基因小鼠和IL-13处理的肺中的精氨酸酶I做Northern blot分析。与野生型小鼠比较，IL-4肺转基因小鼠的精氨酸酶I表达水平明显增加。此外，与盐水处理的动物比较，对肺的IL-13药理性给药可增加精氨酸酶I的mRNA水平。IL-4与IL-13具有部分相似的信号需要，如使用IL-4Rα链及诱导双面(janus)激酶1和信号传感器和转录催化剂(STAT)6。为证明精氨酸酶I的诱导是否具有STAT6依赖性，对含野生型或基因靶的STAT6的IL-4肺转基因小鼠进行分析。发现IL-4诱导的精氨酸酶I表达具有STAT-6依赖性。此外，发现过敏原诱导的精氨酸酶I诱导也具有STAT-6依赖性。

[0120]这些研究结果与离体条件下巨噬细胞中IL-4和IL-13诱导精氨酸酶的能力一致，因而限制了NOS依赖的NO的合成。这些发现不能否定氧化氮在哮喘中的作用，相反我们认为精氨酸的代谢很大程度上依赖哮喘肺中的精氨酸酶。最近的发现支持了这一观点，即在与小鼠Th1和Th2相关的肉芽肿反应中，NOS和精氨酸酶分别有不同的调节途径。

实施例10

IL-4的过表达可在体内有效诱导肺精氨酸酶

[0121]由于哮喘是与Th2细胞相关的发展过程，并且已证实IL-4在多种离体细胞系(如巨噬细胞、平滑肌细胞)中能够诱导精氨酸酶(Munder，M.et al.J Immunol 163，3771-7(1999)；Wei，L.H.，et al.，Am J Physiol CellPhysiol 279，C248-56(2000))，我们对IL-4的过表达、特别是在肺中的过表达足以诱导精氨酸酶的假说进行了研究。肺上皮细胞IL-4过表达的转基因小鼠(在Clara细胞的10个启动子的控制下)具有多种哮喘特征，包括嗜伊红炎症细胞侵润、粘液产生、基线气道状态变化的(Rankin，J.A.et al.Proc.Nat.Acad.Sci U.S.A.93，7821-7825(1996))。我们假定IL-4转基因能够诱导精氨酸酶mRNA的表达。实际上，IL-4肺转基因小鼠能使两种精氨酸酶异构体的mRNA的表达水平明显增加。此外，在IL-4肺转基因小鼠中CAT2也同时被诱导。

实施例11

IL-13在期限内可快速诱导与气道高反应性(AHR)有关的精氨酸酶

[0122]为验证肺精氨酸酶是否也由IL-13(一种细胞因子，已证明其在实验性哮喘几种特征的形成中起关键作用(Wills-Karp，M.，J AllergyClin Immunol 107，9-18(2001)；Grunig，G.et al.Science 282，2261-3(1998))诱导，并在离体细胞系中诱导精氨酸酶的表达(Wei，L.H.，et al.，Am JPhysiol Cell Physiol 279，C248-56(2000)；Rutschman，R.et al.J Immunol166，2173-7(2001))，我们对麻醉小鼠进行IL-13鼻腔内重复给药。此试验方法可诱导包括嗜伊红细胞炎症反应、化学运动的诱导、粘液产生和AHR在内的多种实验性哮喘特征(Grunig，G.et al.Science 282，2261-3(1998)；Yang，M.et al.Am J Respir Cell Mol Biol 25，522-30(2001))。与盐水处理的对照小鼠比较，给予IL-13可诱导精氨酸酶I mRNA的表达水平。与IL-4转基因小鼠增加精氨酸酶II mRNA的表达水平的结果相一致，IL-13也可增加精氨酸酶II mRNA的表达水平。

[0123]气管内给予IL-13一次在12h内可明显诱导AHR；IL-13诱导的AHR反应先于白细胞向气道的聚集(Yang，M.et al.Am J Respir CellMol Biol 25，522-30(2001)，这表明IL-13诱导早期AHR的能力与白细胞的侵润无关。因此，进行了IL-13对精氨酸酶诱导的动力学分析。显然，在给予一次剂量的IL-13后，I型同功酶mRNA在12小时的时间点有诱导(图8A)；而II型异构体则为基础表达，只有较小程度的诱导。在早期AHR发展中可以检测到精氨酸酶的诱导表达。精氨酸酶和AHR的早期诱导先于白细胞聚集(Yang，M.et al.，supra)。我们推测，IL-13对AHR的诱导可能与精氨酸酶通过底物消耗而功能性地抑制气管舒张剂NO的合成的能力有关(Morris，S.M.，Jr.Annual Review of Nutrition 22，87-105(2002)和Mills，C.D.Crit Rev Immunol 21，399-425(2001))。

实施例12

在体肺精氨酸酶的诱导主要为STAT6依赖性

[0124]IL-4和IL-13具有相似的信号需要，如使用IL-4Rα链及janus激酶1和STAT6的诱导等。研究表明，它们反应中的一部分为STAT6依赖型(Shimoda，K.et al.Nature 380，630-3(1996)；Ihle，J.N.Curr Opin CellBiol 13，211-7(2001))。为验证STAT6对在体精氨酸酶I的诱导作用，我们对包括野生型或基因靶的STAT-6的IL-4肺转基因小鼠进行了研究。尽管IL-4肺转基因小鼠含有丰富的精氨酸酶I mRNA，但缺失STAT6将使IL-4对精氨酸酶I mRNA的诱导作用完全丧失。有趣的是，STAT6缺失的小鼠中，IL-4转基因诱导的精氨酸酶II mRNA信号只被部分抑制(不是全部)，这显示出精氨酸酶II与精氨酸酶I相比其主要是STAT6非依赖的。这些发现支持了离体研究的结果，该研究发现这两种同功酶有不同的信号需要(Morris，S.M.，Jr.Annual Review of Nutrition 22，87-105(2002))。以下的试验用于验证过敏原诱导的精氨酸酶是否为STAT6依赖型。此研究将确定过敏原诱导的精氨酸酶在IL-4和IL-13信号途径的下游是否占主导地位。很明显，STAT6缺失的小鼠在过敏原诱导的肺精氨酸酶活性上降低了90％(图8B)，这显示出精氨酸酶I在哮喘肺中是诱导的主要酶类型。综合上述结果，这些发现表明在过敏原肺炎症反应中精氨酸酶的诱导很大程度上是IL-4、IL-13和STAT6的下游。这些结果与近来发现的IL-4和IL-13在巨噬细胞中通过STAT6-依赖途径抑制NO合成的结果一致(Rutschman，R.et al.J Immunol 166，2173-7(2001)。与这些发现相一致的是，小鼠精氨酸酶I启动子含有一个对IL-4反应所必需的STAT6位点(Morris，S.M.，Jr.Annual Review of Nutrition 22，87-105(2002)。

实施例13

人支气管肺泡灌洗液细胞的分析

[0125]如之前的报道(Olivenstein et al.，J Allergy Clin Immunol 103，238-45(1999))，在经过敏性哮喘患者(12周未服用糖皮质激素)和健康对照者同意后，对他们进行支气管镜的检查。通过1/100稀释的小鼠IgG1抗人精氨酸酶I单克隆抗体(BD Biosciences)对涂片(经甲醇/丙酮固定后)进行染色，实施免疫组化分析。按Hamid，Q.Immunohistochemistry.inAllergy and Allergic Disease，1：775-778(Blackwell Science Ltd，London，1997)所述的方法，在快红(Fast Red)(Sigma Chemical)中，有左旋咪唑(levamisole)存在下处理玻片。在阴性对照制备中，用盐水或非免疫小鼠IgG1代替一抗。随机分析细胞涂片上的最少1000个细胞来进行阳性细胞记数，结果以阳性细胞占总细胞百分比表示。

实施例14

过敏症标记基因的确定

[0126]通过腹腔内注射给予50μg卵清蛋白(OVA grade V；SIGMAA-5503)和1mg硫酸钾铝佐剂(明矾：AlK(SO₄)₂-12H₂O；SIGMAA-7210)使小鼠致敏两次，两周一次。在每次胃内致敏之前，将小鼠禁食3-4h。一周三次，将小鼠置于仰卧姿势，口服给予溶解在250μl 0.9％的无菌盐水中的OVA。用胃内给食针(22G-1.5in-1.25mm ball；Fisher 01-290-2B)致敏。口服致敏后，观测1h内小鼠的腹泻情况。

[0127]在Trizol提纯后，用苯酚-氯仿提取液和乙醇沉淀来再次纯化RNA。其后，将从4只盐水处理和4只OVA致敏小鼠得到的纯化RNA(10OVA或盐水致敏后90分钟内获得)合并在一起，并通过儿童医院医疗中心的Affymetrix基因芯片中心设备进行处理。简单讲，先用Agilent生物分析仪(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)分析RNA的质量，只有28S/18S的比值在1.3-2之间的样品才能在随后的试验中使用。通过用于cDNA合成的Superscript选择(Invitrogen，Carlsbad，CA)将RNA反转录为cDNA，随后使用Enzo High Yield RNA转录标记试剂盒(Enzo diagnostics，Farmingdale NY)将其反转录为生物素化的cRNA。

[0128]与小鼠U74Av2基因芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)杂交后，通过射流系统自动冲洗基因芯片，并用链亲霉素-藻红蛋白染色。用Hewlett Packard GeneArray扫描仪对芯片进行扫描。针对基因芯片的数据图像文件，利用Microarray Analysis Suite Version 4软件(Affymetrix)中的算法，对基因的转录水平进行分析。使用完全称谓和平均差异两种基因表达的检测方法。完全称谓是一种定性检测方法，其中根据RNA与探针组的杂交信号，将每个基因指定为表达、边缘或不表达的称谓。平均差异是一种基因表达水平的定量检测方法，其中利用每个探针对中完全匹配和不匹配间的差异并平均全部探针组的所有差异来计算。

[0129]还通过GeneSpring软件(Silicon Genetics，Redwood City，CA)对用盐水和OVA处理的小鼠间的差异进行了分析。将数据标准化为盐水处理小鼠的平均值。将P＜0.05且＞2倍变化的基因列于基因表中(使用杂交信号中表达称谓的基因)。随后，将基因表中哮喘“标记”基因和GI过敏症“标记”基因叠加得出一组公用的一般性“过敏症”标记基因。

实施例15

离体和在体NOHA对肺精氨酸酶的抑制

[0130]IL-4肺转基因小鼠具有显著升高的肺精氨酸酶mRNA水平和活性，并被用来观察离体和在体NOHA的作用(图11)。在图11A中，显示了用NOHA孵育的IL-4肺转基因小鼠肺裂解液及不同剂量的NOHA(x轴)和精氨酸条件下的精氨酸酶活性变化。在图11B中，显示了IL-4肺转基因小鼠用气管内NOHA处理(两种剂量：10和100mcg)及4h后肺精氨酸酶活性的分析结果。如图所示，当IL-4肺转基因小鼠经气管内NOHA处理后，NOHA可有效地降低肺裂解液中精氨酸酶的活性。

实施例16

用抗精氨酸酶化合物治疗患者

[0131]鉴定患有哮喘的患者。给予患者治疗有效剂量的N(ω)-羟基-L-精氨酸来降低哮喘的症状。吸入这种化合物后，患者的哮喘症状减轻。

实施例17

调节精氨酸酶下游产物的其它化合物

[0132]二氟甲基鸟氨酸(DFMO)为ODC的抑制剂，并预期可在抑制哮喘或过敏症的治疗中发挥作用。其它可能有用的化合物包括但不限于有可能抑制哮喘症状的N(ω)-羟基-L-精氨酸及诸如2(S)-氨基-6-二羟硼己酸(ABH)和S-(2-二羟硼乙基)-L-半光氨酸(BEC)的硼酸基过渡态类似物。其它的抑制剂是由Que等(Nitric Oxide.2002Feb；6(1)：1-8)所公开的那些。

实施例18

精氨酸酶途径抑制剂DFMO对免疫发病机制的作用

[0133]对精氨酸酶途径中的下游精氨酸酶作用的阻断对小鼠实验性哮喘有重要的作用。DFMO是一种可阻断鸟氨酸脱羧酶(ODC)作用的不可逆抑制剂，该作用为催化前体分子鸟氨酸合成腐胺的生化步骤。DFMO是一种商业销售的药物(Sigma and llex Oncology，Inc)，已在包括小鼠在内的很多物种中进行了充分的研究(Prakash，et al(1978)Cancer Res 38：3059-3062；Meyskens and Gerner(1999)Clin.Cancer Res 5：945-951)。

实施例19

在实验性哮喘小鼠模型中进行哮喘诱导后给予精氨酸酶途径抑制剂 DFMO的作用

[0134]一旦在患者肺中建立其作用机制，可阻断肺中精氨酸酶途径的试剂可用于缓解或降低哮喘的作用。为验证阻断精氨酸酶途径是否起作用，通过常规方法将精氨酸酶途径活性示例性抑制剂DFMO给予患者。我们发现，与经盐水处理的患者比较，接受DFMO的患者表现出较低的哮喘作用。

实施例20

给予精氨酸酶I抑制剂NOHA对过敏原诱导的气道高反应性发展的作用

[0135]通过大气压体积描记法使用Buxco(Troy，NY)提供的仪器和软件，分析清醒的无限制的小鼠中甲胆碱的气道反应性。此系统能够产生用于经验地监测气道功能的所谓增强脉冲(Penh)的无因次参数，该参数通过与早期、晚期呼吸的定时比较相结合的体积描记室来反应压力信号的波形变化。根据Yang，M.等(Am J Respir Cell Mol Biol25，522-30(2001)和Hamelmann，E.等(American Journal of Respiratory & Critical CareMedicine 156，766-75(1997))所述的方法进行检测。

[0136]简单讲，将小鼠放入室中，读取基线值并平均3分钟内的值。将雾化的甲胆碱(溶液中的浓度范围为3.125-50mg/ml)从入口释放入室中达2分钟，然后平均每次给药剂量3分钟时间段内的读数。

[0137]为研究NOHA的作用，在IL-4/IL-5转基因肺(经Penh检测证实其气道高反应性得到提高)中经气管给予NOHA(100mcg)，并记录4h后的Penh检测结果(图12)。作为对照，列出了未处理的IL4/IL5肺转基因小鼠的Penh值。

[0138]尽管在此已经充分完全地描述了本发明所包括的优选实施方案，但本领域所属技术人员应该理解在不脱离本发明精神下可做出各种修改。因此，尽管以某些特定的优选实施方案说明了本发明，但本领域所属技术人员参照本文的说明所做出的其它显而易见的实施方案也在本发明的保护范围内。因此，本发明的保护范围仅由所附的权利要求及其等价物所限定。

Claims (39)

1.能够降低参与精氨酸代谢的蛋白产生的化合物在制备用于治疗哮喘或过敏症的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的化合物，其中所述的蛋白选自CAT2、精氨酸酶I和精氨酸酶II。

3.如权利要求1所述的化合物，其中所述的分子通过抑制编码所述蛋白的基因来降低所述蛋白的产生。

4.如权利要求1所述的化合物，其中所述的化合物是N(ω)-羟基-L-精氨酸(NOHA)。

5.如权利要求1所述的化合物，其混合有药学上可接受的载体。

6.一种检测患有哮喘或过敏症的患者的方法，包括：

测量参与所述患者中精氨酸代谢的至少一种基因产物的水平；

测量参与精氨酸代谢的至少一种基因产物的遗传多样性(表达或基因序列)；及

将所述的测量结果与对照个体的测量结果进行比较，其中与对照个体相比所述的至少一种基因表现出较高水平的患者被确定为患有哮喘或过敏症。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述的至少一种基因选自CAT2、精氨酸酶I和精氨酸酶II。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述的产物是mRNA。

9.如权利要求6所述的方法，其中所述的产物是蛋白。

10.一种鉴定可能患有哮喘或过敏症的个体的方法，包括：

鉴定仍没表现出哮喘或过敏症症状的个体，

测量精氨酸酶途径中基因产物的水平；及

将所述的产物水平与对照个体的测量结果进行比较，其中所述产物表现出较高水平的患者被确定为可能患有哮喘或过敏症。

11.如权利要求10所述的方法，其中精氨酸酶途径中的所述基因选自精氨酸酶I、精氨酸酶II和CAT2。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述的产物是mRNA。

13.如权利要求10所述的方法，其中所述的产物是蛋白。

14.一种治疗哮喘或过敏症患者的方法，包括：

鉴定需要哮喘或过敏症治疗的个体；及

给予所述患者能够降低ADAM8蛋白的活性的分子。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述的分子可改变ADAM8的结构。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述的分子将ADAM8从跨膜形式转变为溶解形式。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述的分子通过抑制编码ADAM8蛋白的基因来降低ADAM8蛋白的活性。

18.如权利要求14所述的方法，还包括给予能够降低或抑制肺白介素-4或白介素-13水平的化合物。

19.一种治疗哮喘或过敏症患者的方法，包括：

鉴定需要哮喘或过敏症治疗的个体；及

给予所述患者能够降低SPRR2A、SPRR2B或相关SPRR家族成员蛋白的活性的分子。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述的分子通过抑制编码SPRR2A蛋白的基因来降低SPRR2A蛋白的活性。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述的分子通过抑制编码SPRR2B蛋白的基因来降低SPRR2B蛋白的活性。

22.一种检测可能发展为哮喘的患者的方法，包括：

提供所述患者的生物样品；及

检测所述生物样品中如表1所示的基因亚组的表达水平，其中与对照生物样品相比，所述基因亚组表达水平的提高表明所述患者发展为哮喘的可能增加。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述的亚组包含如表1所示基因的至少1％。

24.如权利要求22所述的方法，其中所述的亚组包含如表1所示基因的至少30％。

25.如权利要求22所述的方法，其中所述的亚组包含如表1所示基因的至少50％。

26.如权利要求22所述的方法，其中所述的亚组包含如表1所示基因的至少80％。

27.一种检测可能发展为过敏症的患者的方法，包括：

提供所述患者的生物样品；及

检测所述生物样品中如表2所示的基因亚组的表达水平，其中与对照生物样品相比，所述基因亚组表达水平的提高表明所述患者发展为过敏症的可能增加。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述亚组包含如表2所示基因的至少1％。

29.如权利要求27所述的方法，其中所述亚组包含如表2所示基因的至少30％。

30.如权利要求27所述的方法，其中所述亚组包含如表2所示基因的至少50％。

31.如权利要求27所述的方法，其中所述亚组包含如表2所示基因的至少80％。

32.一种发现可有效治疗哮喘或过敏症的化合物的方法，包括：

提供候选化合物；

检测所述化合物是否抑制精氨酸代谢，其中对精氨酸代谢的抑制表明所述化合物可有效治疗哮喘或过敏症。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述的化合物是精氨酸酶I活性的抑制剂。

34.如权利要求32所述的方法，其中所述的化合物是精氨酸酶II活性的抑制剂。

35.如权利要求32所述的方法，其中所述的化合物是CAT2活性的抑制剂。

36.一种治疗哮喘或过敏症患者的方法，包括：

鉴定需要哮喘或过敏症治疗的个体；及

给予能够降低参与精氨酸代谢的蛋白产生的分子。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述的蛋白选自CAT2、精氨酸酶I和精氨酸酶II。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述的分子通过抑制编码所述蛋白的基因来降低所述蛋白的产生。

39.如权利要求36所述的方法，还包括给予能够降低或抑制肺白介素-4或白介素-13水平的化合物。

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