CN101061235A - 用基因诊断热不稳定性表型症风险的方法 - Google Patents

用基因诊断热不稳定性表型症风险的方法 Download PDF

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木下盛敏
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Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
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University of Tokushima NUC
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Abstract

本发明涉及一种诊断方法，该方法用以诊断因高热而致死或出现中枢神经系统症状或多种器官功能衰竭等后遗症状可能性高的疾病，包括流感脑炎/脑病、雷氏综合症、RS病毒感染症、腺病毒感染症、鼻病毒感染症、风疹、乙型脑炎、疟疾、川崎病和婴幼儿猝死综合症或由上述疾病引起的热不稳定表型症的风险，该诊断方法的特征是，检测转运物、肉碱循环、长链β氧化循环、中链/短链β氧化循环、电子传递、酮体合成和ATP产生等过程中至少一种酶的活性，以37℃时其活性为100％，观察其在39℃以上的温度，特别是在41℃时的活性是否较健康人显著降低。

Description

用基因诊断热不稳定性表型症风险的方法
技术区域
本发明涉及诊断热不稳定性表型症风险的方法。热不稳定性表型症，指由于高热诱发的致死性多器官功能衰竭或中枢神经系统紊乱留下后遗症的可能性较健康人显著增高的体质，本发明可以诊断这种热不稳定性表型症风险。
背景技术
婴幼儿发热到39℃以上时常常出现热抽搐，其中有些是不明原因的综合症，以持续高热引发产生严重中枢神经系统综合症，造成肝脏、心脏、肾脏等器官功能衰竭而死亡的，对这些疾病的预防、诊断和治疗方法都还不了解。
非专利文献1是考察CPT II的突变与其生化功能的文献，测定了37℃和41℃棕榈酸的氧化率。但没有由温度改变引起的CPT II的功能改变与具体的某种疾病的关系的报道，特别是没有提示它和出现中枢神经系统症状的流感相关脑炎/脑病、雷氏综合症的关系。
非专利文献2虽然暗示了雷氏综合症与CPT I和CPT II活性降低有关，但没有论及温度和这些酶的活性的关系。
非专利文献3叙述了流感脑炎/脑病的严重程度与CYP2C9多态性的关系，也没有报告温度和酶活性的关系。
非专利文献1：S.E.Olpin，等J.Inherit.Metab.Dis.26，543-557页，2003。
非专利文献2：阿部博纪、千叶医学74：9——16页，1998。
非专利文献3：船渡忠勇等，临床病理，50：2，140-145页，2002。
发明的公开
本发明拟解决的问题
本发明的目的是预先诊断(预测)以高热引发产生严重中枢神经系统综合症的热不稳定性表型症风险。
解决问题的方法
通过本发明的发明人的研究，得以了解，由流感引发的伴有极严重中枢神经系统症状、脑水肿的流感相关脑炎/脑病等热不稳定性表型症状中，潜在地存在高频率遗传变异，该变异导致体内对能量产生不可缺少的线粒体中参与脂肪酸代谢的酶的酶活性的丧失。这种遗传变异，在正常体温下酶活性几乎没有异常，即使观察到酶活性有所降低，由于轻微通常也不表现任何症状，多数情况下只要不发高热就不出现症状。而且多数患者中遗传变异是杂合型，混合存在的酶一半是变异的，一半正常的。因此，多数人在日常生活中不曾经历异常情况。与此不同的是，存在着先天性代谢疾病，其中脂肪酸代谢酶有关的基因发生变异而导致酶活性显著降低。在这种情况下，有关于出生后几个月内表现雷氏综合症而无流感的伴有脑水肿和多种器官功能衰竭而死亡的病例报告(Tomaoki Y.，Kimura M.，Hasegaawa Y.，Iga M.，InoueM.，Yamagishi S.，Brain Dev.2002；24；675-80)。认识到包括流感相关脑炎-脑病等热不稳定性表型病症，其根源不在于严重的酶缺失症，而是由于发热变得不稳定的遗传变异，从而明确了这是发病的原因。
由此，据推测由于同样的原因而而导致的疾病的可能性也是高的，所述疾病除流感脑炎-脑病外，还包括一组疾病，其中由于高热导致全身能量产生系统损伤而诱发多种器官功能衰竭，例如迄今不明原因诱发的的婴幼儿猝死综合症、除外流感脑炎-脑病的种种感染症，像RS病毒感染症、腺病毒感染症、鼻病毒感染症、风疹、乙型脑炎、疟疾感染，造成的病情恶化和多种脏器功能衰竭的综合症，服用阿司匹林、扶他林(voltaren)、甲天酸(mefenamic acid，扑湿痛)等药物引起的雷氏综合症和川崎病。因此，本发明将这些疾病归作“热不稳定性表型症”，成功地开发出确切诊断这些导致疾病发作的热不稳定基因突变的新方法。
本发明提供以下风险诊断方法和诊断试剂盒。
1诊断热不稳定性表型症状的风险的方法，所述疾病包括流感脑炎/脑病、雷氏综合症、RS病毒感染症、腺病毒感染症、鼻病毒感染症、风疹、乙型脑炎、疟疾、婴幼儿猝死综合症、川崎病等疾病，或因这些疾病引起的疾病，其特征是检测涉及线粒体中参与能量代谢的各种转运体、肉碱循环、长链β氧化循环、中链/短链β氧化循环、电子传递、酮体合成和ATP产生等过程中至少一种酶的活性，如果以37℃时其活性为100％，检测39℃以上时是否比健康人显著降低。
2第1项所述方法，上述热不稳定性表型症为流感脑炎/脑病。
3第1项所述方法，其特征是，借助检测选自编码上述酶的基因的SNP、插入和缺失的多态性，从而预测39℃以上时上述酶活性较之37℃时活性降低的程度。
4第1项所述方法，参与各种转运体、肉碱循环、长链β氧化循环、中链/短链β氧化循环、电子传递、酮体合成和ATP产生等过程的酶，是下表中所示之至少一种酶。
(表1)
  酶的名称
  转运体   三羧酸转运蛋白(TCT)
  电压依赖性阴离子通道(VDAC)
  腺苷酸转运体(ANT)
  肉碱转运体(CRNT；OCTN2；SLC22A5)
  脂肪酸质膜转运体(LCFAT)
  肉碱循环   酰基辅酶A合成酶(ACS)
  肉碱棕榈酰基转移酶1，肝型(CPTLA；CPT1)
  肉碱棕榈酰基转移酶1，肌肉型(CPT1b；CPT1B)
  肉碱棕榈酰基转移酶2(CPT2)
  肉碱/酰基肉碱移位酶(CACT 1；SLC25A20)
  极长链酰基辅酶A脱氢酶(VLCAD)
  长链β氧化循环   TFP线粒体三功能蛋白α亚基(TFPα：HADHA)
  TFP线粒体三功能蛋白β亚基((TFPβ：HADHB)
  长链酰基辅酶A脱氢酶(LCAD)
  中链短链氧化循环   中链酰基辅酶A脱氢酶(MCAD)
  中链酰基辅酶A硫解酶(MCKAT)
  短链酰基辅酶A脱氢酶(SCAD)
  短链烯酰辅酶A水合酶(SCEH)
  短链羟基酰基辅酶A脱氢酶(SCHAD)
  短链酰基辅酶A硫解酶(SCKAT)
  电子传递   电子传递体黄素蛋白α亚基(ETFA)
  电子传递体黄素蛋白β亚基(ETFB)
  电子传递体黄素蛋白脱氢酶(，ETFDH)
  NADH-泛醌还原酶复合体，复合体I
  琥珀酸-泛醌还原酶复合体，复合体II
  泛醌-细胞色素C还原酶，复合体III
  细胞色素C氧化酶，复合体IV
  ATP产生   ATP合酶
  解偶联蛋白(UCP)
  酮体合成   羟甲基戊二酰辅酶A合成酶1、2(HMGCS1或2；HMGS1或2)
  羟甲基戊二酰辅酶A连接酶(HMGCL；HMGL)
5第4项所述的方法，上述酶是选自CPT II、ETFA、ETFB、ETFDH、HADHB、HMGCS、VLCAD、LCAD和HADHA的至少一种。
6第1项所述的方法，其特征是检测与CPT II、ETFA、ETFB、HADHA、HADHB、HMGCS、VLCAD、LCAD和ETFDH有关的以下22种位点上1个或2个以上的位点或与其有连锁不平衡关系的基因的单核苷酸多态性，并利用2种或更多基因多态性或单倍体的组合。
(表2)
  酶的名称   SNP位点
  CPT2   (外显子4)      1055
  CPT2   (外显子4)      1102
  ETFA   (内含子10)     +642
  ETFB   (外显子1)      -320
  ETFB   (外显子3)      -113
  ETFB   (外显子8)      447
  ETFB   (外显子8)      461
  HADHA   (外显子6)      474
  HADHA   (内含子6)      +26
  HADHA   (内含子6)      +32
  HADHA   (外显子18)     2519
  HADHA   (外显子I8)     2619
  HADHB   (外显子2)      4
  HADHB   (内含子12)     -14
  HADHB   (内含子14)     +4
  HADHB   (内含子14)     -26
  HADHB   (外显子17)     1607
  HMGCS   (内含子8)      -37
  HMGCS   (内含子8)      +53
  VLCAD   (内含子8)      +33
  LCAD   (外显子9)      997
  ETFDH   (外显子13)     1989
7第1项所述的方法，以是否具备下述(1)～(8)中任一种SNP之组合为标准，诊断热不稳定性表型症的风险。
(表3)
  组合   酶   多态性位点(碱基编号)   基因型   风险
  (1)   ETFB   447   C/T   大
  CPT2   1102   G/A
  (2)   ETFA   +642   C/C   大
  ETFB   -113   G/T
  (3)   ETFA   +642   C/C   大
  CPT2   1055   G/G或G/T
  (4)   HADHB   4   -/ACT或ACT/ACT   大
  HMGCS   -37   C/T或T/T
  (5)   VLCAD   +33   T/G或G/G   大
  LCAD   997   A/A
  (6)   CPT2   1055   T/G或G/G   大
  CPT2   1102   G/A或A/A
(7) HADHB 4 -/ACT或ACT/ACT 大
  ETFDH   1989   G/T
  (8)   LCAD   997   A/C或C/C   小
  HADHA   2619   G/G
  HMGCS   +53   T/T
8第1～7项任何一项所述的方法，单核苷酸多态性检测是从核苷酸碱基序列直接测定法、等位基因特异寡核苷酸(ASO)斑点印迹分析、单碱基引物延长法、PCR-单链构象多态(SSCP)分析、PCR-限制酶切片段长度多态性(RFLP)分析、侵入物方法、定量实时PCR检测法和使用质谱分析仪的检测单核苷酸多态性方法(质谱阵列massarray)中选取的至少一种方法。
9第3项所述的方法，其特征是对编码上述酶的基因的SNP、插入及缺失的多态性使用至少一种探针被固定的固相载体进行测定。
10诊断热不稳定性表型症风险的试剂盒，该试剂盒含有引物、探针、dNTP混合物、逆转录酶、DNA多聚酶、缓冲液等，可以检测参与线粒体脂肪酸β氧化代谢系统的酶的特定多态性中的1种或2种以上组合。
发明的效果
根据本发明，如果采用本发明诊断热不稳定性表型症的风险和进行管理，对于那些风险高的患者，特别是婴幼儿，有可能采取预防高热疾病或在患有疾病的情况下通过早期治疗疾病等管理手段而使得不发展热不稳定性表型症。
附图的简要说明
[图1]高热/抽搐时和正常体温条件下，流感相关脑炎(Influenza-associated encephalopathy；IAE)患者的酰基肉碱(C16:0+C18:1)/C2比的分布分析了IAE患者和编号21患者家族、以及一位未感染流感的志愿者家族的酰基肉碱比。最大截取范围＝0.048，而高风险患者范围在0.09以上，分别用细虚线和粗体虚线表示。+：致死的，▲：后遗症，×：编号21号患者的姐姐
图2表示对照和编号21患者的肝脏匀浆中CPT II活性在37℃和41℃时随时间发生的改变。数据以平均±标准差(SD，n＝6)表示。
图3COS-7细胞中过量表达的WT和变异型CPT II在37℃和41℃时活性的比较，在37℃和41℃下测定了WT(FVM-CPT II)、F352C(CVM-CPT II)、V368I(FIM-CPT II)和F352C+V368I(CIM-CPT II)的CPT II活性，数据用平均±标准差(SD，n＝5)表示。
图4表示编码用于诊断风险的酶的基因及其SNP或插入/缺失，以及它们的区域和位置，基因型、表型及其近旁的序列。
图5在患者中可见到的显著高频率出现的基因多态性。
实施发明的最佳方式
现有报告指出，引起参与能量代谢紊乱的酶类的基因变异中存在人种差异。已知在日本基因突变常常发生在参与β氧化循环的长链脂肪酸代谢的酶类和电子传递系统的酶类，在欧美的高加索人种中基因突变则是常常发生在参与中链脂肪酸代谢的酶类。可以认为，由高热诱发的热不稳定性基因突变，也以同样的基因突变的发生率为基础。
从热不稳定性表型症对象获得的酶类，可举例如下。
1)转运物：肉碱转运物(OCTN2，OCTN)，脂肪酸转运物(CD36)，电压依赖性阴离子通道(Voltage-dependent anion channel，VDAC)、肉碱/酰基肉碱移位酶(Carnitine/Acylcarnitine translocase，CACT 1)三羧酸转运蛋白(Tricarboxylate transport protein，TCT)、腺苷酸转运体(Adenine nucleotide Transporter，ANT)。
2)肉碱循环相关酶类：酰基辅酶A合成酶(Acyl-CoAsynthetase，ACS)、肉碱棕榈酰基转移酶1，肝型(Carnitine palmitoyltransferase 1 liver form，CPT1A；CPT1)肉碱棕榈酰基转移酶，肌肉型(Carnitine palmitoyl transferase 1 muscle form，CPTlb；CPT1B)肉碱棕榈酰基转移酶2(Carnitine palmitoyl transferase 2，CPT2)，肉碱/酰基肉碱移位酶(Carnitine/Acylcarnitine translocase，CACT 1；SLC25A20)。
3)长链β氧化循环：极长链酰基辅酶A脱氢酶(Very-long-chainacyl-CoA dehydrogenase，VLCAD)、TFP线粒体三功能蛋白α亚基(TFPmitochondrial trifunctional protein alpha-subunit，TFPα：HADHA)、TFP线粒体三功能蛋白β亚基(TFP mitochondrial trifunctional proteinbeta-subunit(TFPβ：HADHB)
4)中链/短链β氧化循环：长链酰基辅酶A脱氢酶(Long-chainacyl-CoA dehydrogenase，LCAD)、中链酰基辅酶A脱氢酶(Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase，MCAD)、中链酰基辅酶A硫解酶(Medium-chain acyl-CoA thiolase，MCKAT)、短链酰基辅酶A脱氢酶(Short-chain acylCoAdehydrogenase，SCAD)、短链烯酰辅酶A水合酶(Short-chain enoyl-CoA hydratase，SCEH)短链羟基酰基辅酶A脱氢酶(Short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，SCHAD)、短链酰基辅酶A硫解酶(Short-chain acyl-CoA thiolase，SCKAT)
5)电子传递：电子传递黄素蛋白α亚基(Electron TransferFlavoprotein Alpha subunit，ETFA)、电子传递黄素蛋白β亚基(Electron Transfer Flavoprotein beta subunit，ETFB)、电子传递黄素蛋白脱氢酶(Electron Transfer Flavoprotein dehydrogenase，ETFDH)、NADH-泛醌还原酶复合体，复合体I(NADH-ubiquinone reductasecomplex，Complex I)、琥珀酸-泛醌还原酶复合体，复合体II(Succinatc-ubiquinone reductase，Complex II)、泛醌-细胞色素C还原酶，复合体III(Ubiquinol-cytochrome c reductase，Complex III)、细胞色素C氧化酶，复合体IV((Cytochrome-c oxidase，Complex IV)。
6)ATP产生：ATP合酶(ATP synthase)，解偶联蛋白(UCP)。
7)酮体合成：羟甲基戊二酰辅酶A合酶1或2(Hydroxymethylglutaryl CoA synthetase 1.2，HMGCS1或2；HMGS1或2)、羟甲基戊二酰辅酶A连接酶(Hydroxymethylglutaryl-CoA ligase，HMGCL；HMGL)
在本说明书中，所谓“诊断风险的方法”，是指患有包括流感脑炎/脑病、雷氏综合症、RS病毒感染症、腺病毒感染症、鼻病毒感染症、风疹、乙型脑炎、疟疾、川崎病、婴幼儿猝死综合症、或由这些疾病引起的热不稳定性表型症的患者发生高热(体温通常在39℃以上，甚至40℃以上，特别是41℃以上)的情况下，预测致死的或遗留后遗症的多种器官功能衰竭或中枢神经系统症状的风险。
因此，重要的是要在患热不稳定性表型症之前进行这种风险的诊断或预测。尽管包括高龄人在内的成人也会罹患热不稳定性表型症，但乳婴和儿童更易产生致死性的和遗留多种器官功能衰竭或中枢神经系统症状的热不稳定性表型症。因此，本发明的风险诊断对象，只要是人类，并不特别限定年龄。例如更着眼于18岁或以下的人，尤其是15岁或以下，特别是12岁或以下的儿童，婴幼儿(特别是乳婴)，以求控制他们罹患热不稳定性表型症。
对包括婴幼儿(特别是乳婴)在内的人类进行风险诊断后，在被诊断为罹患热不稳定性表型症可能性高的时候，重要的是如何使他们不遭受与热不稳定性表型症有关的高热性疾病，对于病毒或细菌感染疾病，可以包括采用漱口、洗手、戴面罩、注射预防性药物例如疫苗等手段。当罹患可能成为热不稳定性表型症原因的伴有高热的疾病时，则应尽快投给治疗药物和安全的解热药物，控制其体温不升高到41℃，以至40℃以下，特别是39℃以下，最好在38.5℃以下。
本说明书中，与热不稳定性表型症有关的一类疾病，可以举出流感脑炎/脑病、雷氏综合症、RS病毒感染症、腺病毒感染症、鼻病毒感染症、风疹、乙型脑炎、疟疾、川崎病、婴幼儿猝死综合症等。
本发明的依据是，高热时可以见到由于线粒体β氧化脂肪酸代谢系统的酶活性急剧降低，从而引起致死的或遗留严重的多种器官功能衰竭或中枢神经系统症状。
就发生这类多种器官功能衰竭/中枢神经系统症状而言，如果以正常体温(例如37℃)时的酶活性为100％，则正常人在41℃时酶活性约降低5～10％。如果这些酶的活性降低50％以上，则有可能出现多种器官功能衰竭/中枢神经系统症状。如果降低达到60％或以上、70％或以上、80％或以上、90％或以上，则出现多种器官功能衰竭/中枢神经系统症状的概率就越来越高。在39℃或以上，酶活性降低超过80％时，出现多种器官功能衰竭/中枢神经系统症状的概率则极高。
本发明通过对作为诊断对象的被试验者进行酶核苷酸序列的测定，再根据该基因序列用遗传工程技术制造出酶，将这种酶在37℃和39℃或更高的温度(例如39℃、40℃、41℃)处理一定时间后，比较酶的活性，即可对酶活性的降低进行评估。通过对在39℃或以上(例如39℃、40℃、41℃)的酶活性比正常人的酶活性显著降低的酶的核苷酸序列进行测定，即可依据这种序列诊断热不稳定性表型症的风险大小。例如，当以CTP II酶作为指标，在F352C和V3681二者都存在多态性时，则发热引起严重神经系统症状的可能性就高，即可诊断为热不稳定性表型症。
上述酶的活性在39℃或以上比37℃下上述酶活性的降低程度，可以通过测定编码上述酶的基因的SNP加以预测。
可以特别有效用于风险诊断的酶，可以举出CPT II、ETFA、ETFB、ETFDH、HADHB、HMGCS、VLCAD、LCAD和HADHA等为例。
编码可以用于风险诊断的酶的基因及其SNP或插入/缺失，以及其区域和位置、基因型和表型等，总结于表4中，更以图4表示了SNP附近的序列。
[表4]
  基因   区域   dbSNP   位置   多态性   基因型   表型
  VLCAD   外显子1   rs6145976   -72   INS/DEL   -/gggcgtgcaggacgc   -
  VLCAD   外显子1   rs2230178   128   SNP   G/A   G43D
  VLCAD   内含子8   未知   33   SNP   T/G   -
  VLCAD   内含子16   rs17671352   6   SNP   T/C   -
  LCAD   内含子3   未知   88   INS/DEL   CAAA   -
  LCAD   外显子9   rs2286963   997   SNP   A/C   K333Q
  HADHA   外显子6   未知   474   SNP   C/T   Y158Y
  HADHA   内含子6   未知   26   SNP   G/C   -
  HADHA   内含子6   rs7593175   32   SNP   T/C   -
  HADHA   外显子18   rs7260   2519   SNP   A/G   -
  HADHA   外显子18   rs1049987   2619   SNP   G/A   -
  HADHA/B   启动子   rs3806516   -202   SNP   C/T   -
  HADHB   外显子2   rs3839049   4   INS/DEL   ACT   -2T
  HADHB   内含子I2   未知   -14   SNP   A/G   -
  HADHB   内含子14   rs2303893   4   SNP   T/A   -
  HADHB   内含子14   rs17528653   -26   SNP   T/C   -
  HADHB   外显子17   rs1056471   1607   SNP   G/C   -
  HMGCL   启动子   未知   -497   INS/DEL   -/TTTTT   -
  HMGCL   启动子   rs6697805   -91   SNP   G/T   -
  HMGCL   外显子5   443   SNP   A/G   Q148R
  HMGCL   外显子7   rs17858097   654   SNP   G/A   L218L
  HMGCL   外显子9   未知   1131   SNP   C/T   -
  HMGCL   外显子9   rs11714   1464   SNP   A/C   -
  CPT2   启动子   rs10888776   -850   SNP   G/A   -
  CPT2   外显子4   rs2229291   1055   SNP   T/G   F352C
  CPT2   外显子4   rs1799821   1102   SNP   G/A   V3681
  CPT2   外显子4   未知   429   INS/DEL   -/TG   E144V.Y145*
  CPT2   外显子4   未知   1511   SNP   C/T   P504L
  CPT2   外显子5   未知   1813   SNP   G/C   V502L
  CPT2   外显子5   rs1799822   1939   SNP   A/G   M647V
  ETFA   内含子1   未知   -776   SNP   A/G   -
  ETFA   内含子1   未知   -270   INS/DEL   -/ACGCGCC   -
  ETFA   外显子6   rs2229292   512   SNP   C/T   T1711
  ETFA   内含子10   未知   +642   SNP   C/T   -
  ETFB   外显子1   未知   -320   SNP   C/T   -
  ETFB   外显子3   未知   -113   SNP   C/T   -
  ETFB   外显子8   未知   447   SNP   C/T   F149F
  ETFB   外显子8   rs3177751   461   SNP   C/T   T154M
  ETFDH   外显子2   rs11559290   92   SNP   C/T   T311
  ETFDH   外显子13   未知   1989   SNP   A/C   -
  HMGCS2   外显子1   rs2289459   -11   SNP   C/T   -
  HMGCS2   内含子8   rs668156   -37   SNP   C/T   -
  HMGCS2   内含子9   rs667246   +53   SNP   A/G   -
  HMGCS2   内含子9   rs667226   +68   SNP   A/G   -
  MCAD   内含子13   rs3841786   1263   INS/DEL   -/A   -
本发明的风险诊断，可以采用表5所示HADHA、HADHB的位点的多态性，借助单个基因的多态性进行。
[表5]
  基因   区域   位点   多态性类型   基因型   表型
  HADHA   外显子6   474   SNP   C＞T   Y 158Y
  HADHA   内含子6   +26   SNP   G＞C   -
  HADHA   内含子6   +32   SNP   T＞C   -
  HADHA   外显子18   2519   SNP   A＞G   -
  HADHA   外显子18   2619   SNP   G＞A   -
  HADHB   外显子2   4   INS/DEL   -＞ACT   1-2Tins
  HADHB   内含子12   -14   SNP   A＞G   -
  HADHB   内含子14   +4   SNP   T＞A   -
  HADHB   内含子14   -26   SNP   T＞C   -
  HADHB   外显子17   1607   SNP   G＞C   -
此外，采用两种以上多态性组合进行诊断时，最好采用表6所示之组合。
[表6]
  组合   酶   多态性位点(碱基编号)   基因型   风险
  (1)   ETFB   447   C/T   大
  CPT2   1102   G/A
  (2)   ETFA   +642   C/C   大
  ETFB   113   G/T
  (3)   ETFA   +642   C/C   大
  CPT2   1055   G/G或/T
  (4)   HADHB   4   -/ACT或ACT/ACT   大
  HMGCS   -37   C/T或T/T
  (5)   VLCAD   +33   T/G或G/G   大
  LCAD   997   A/A
  (6)   CPT2   1055   T/G或G/G   大
  CPT2   1102   G/A或A/A
  (7)   HADHB   4   -/ACT或ACT/ACT   大
  ETFDH   1989   G/T
  (8)   LCAD   997   A/C或C/C   小
  HADHA   2619   G/G
  HMGCS   +53   T/T
同时，与各单核苷酸多态性的等位基因有连锁不平衡关系的别的等位基因，也可以用于判定风险。
各单核苷酸多态性与和它们邻接的遗传多态性一起通过亲代至子代而遗传的情况经常发生，这些等位基因之间关系就称为连锁不平衡关系。连锁不平衡随着等位基因间的距离增加而有减弱的倾向。因此，在相近的基因中，多发现强的连锁不平衡关系。本说明书中，当存在所述基因与邻近基因间存在强连锁不平衡关系时，有时基因多态性的频率或基因多态性出现的样式相同，从而得以预测本实施例中的基因多态性。另一方面，并不限于本说明书所述的基因，通过对另外的邻接基因的分析，其有可能被利用来诊断这种风险。有时即使是弱连锁不平衡关系，也能用来进行风险诊断。
例如，HADHA和HADHB多存在连锁不平衡关系。因此，利用与该基因相邻接的遗传多态性，也可能实行风险诊断。
存在连锁不平衡的遗传多态性会受到制约，形成特定的遗传多态性的有限排列。在一条染色体上的这些遗传多态性的排列的组合，称为单倍体。
本发明的风险诊断，可以采用诊断试剂盒来进行。该试剂盒含有能检测1种或2种以上参与线粒体脂肪酸β氧化代谢系统的酶的特定多态性组合的引物、探针、dNTP混合物、逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲液等。
本发明还涉及这种诊断试剂盒。
此外，本发明的风险诊断方法，也可以用其它方法实行。
遗传多态性的检测，并不限定于本方法，可以采用碱基序列直接测定法、单碱基引物延长法、PCR-单链构象多态(SSCP)分析、PCR-限制酶切片段长度多态性(RFLP)分析、侵入物检测法、和采用质谱分析仪的方法。关于风险的诊断方法，不限定于DNA，也可以用RNA作材料分析遗传多态性，借助定量实时PCR检测法进行基因表达的定量。此外，对于产生氨基酸置换的基因多态性，还可以采用放射免疫抗体检测法、酶联免疫测定法(ELISA)等方法。为了使以上方法行之有效，将它们固定在例如珠、芯片和膜等固体支持物上。
实施例
以下用实施例就本发明进行更详细的说明。
实施例1
本发明人进行的特定的实验方法和它们的结果显示如下。
材料
流感相关脑病患者标本31份，疑似流感相关脑病患者标本1份(已获各机构伦理委员会认可，已获所有患者知情同意)，健康人标本100份。
方法
将分别从31份流感相关脑病患者标本，1份疑似流感相关脑病患者标本和100份健康人标本中抽提的基因组DNA，用表A(此处应为表7，原文同一个表用了两个表题号)所示的PCR引物(PCR-F，PCR-R)进行各基因的扩增。用分别扩增的基因，用表A所示的引物(Seq-F，Seq-R)，以碱基序列直接测定法进行碱基序列分析。基因多态性的参比，采用NCBI的数据库(http://www.nlm.nih.ncbi.gov，http://www.ncbi.nlm.nih.gov，/projects/SNP/)、HGMD( http://www.hgmd.cf.ac.uk/hgmd0.html)等数据库。表4中以rs开始的编号是数据库的参比编号，写作“未知”的基因多态性，表示未在NCBI登录的基因多态性。涉及CPT II、ETFA、ETFB、ETFDH、VLCAD、LCAD、HADHA、HADHB等酶的基因，得以对31份患者标本进行基因分析。至于其它基因，得以在27份标本中进行基因分析。另一方面，在100份标本中分析健康人标本的CPT II、ETFA、ETFB、ETFDH，其它有关基因则在99份健康人标本中进行。健康人对照中常见的纯合的等位基因用W，少见的其他纯合的等位基因用M，杂合的等位基因用H表示。(表4，图4中的W、M和H)
                                    表A
  CPT2名称CPT2-FCPT2-RCTP2ex1IAFCTP2ex1IARCPT2e1s1CPT2e1RCPT2e2FCPT2e2RCPT2e3FCPT2e3RCPT2e4FCPT2e4RCPT2e4s1CPT2e4s2CPT2e4s3CPT2e4s4CPT2e4s5CPT2e4s6CPT2e5FCPT2e5RCPT2e5s1CPT2e5s2CPT2e5s3CPT2e5s4SubtotalETFA名称ETFAe1FETFAe1RETFAe2FETFAe2RETFAe3FETFAe3RETFAe4FETFAe4RETFAe5FETFAe5RETFAe6FETFAe6RETFAe7FETFAe7-261RETFAe8FETFAe8RETFAe8FETFAe9RETFAe10FETFAe10RETFAe11FETFAe11RETFAe12FETFAe12RETFAe13FETFAe13RETFAe10s1EFEAe10s2ETFAe10s3ETFAe10s4SubtotalETFB名称ETFB-FETFB-RETFB-s1ETFB-s2ETFBe1-F 序列(5′至3′)AGACTTCCTAGAGCCGGAGAAACGTGATTGGAATCTGATAACCCTACTAGTGGGCGGGGCCTGTCAGTGAGCGGAAACGGGTTCACTAGAGAGTCATGAGTGACTGAGCCAGTCCGGGGCGCGATCCTGGGACGGCGGATTAACCTCTTGCATATAGTGTCAGCCCCACCACTACTTGCCAGCGTCATGAACCTAAAAATCATGTATTCCCTACATTATGGAGGGCTCTGGGAGGGGACAGCATTAACATTFTATGTTATTTCCAAGCACTGAGGACAAGACCCTTCACTGATGACAAGGCCAGACTGTCATCAGTGAAGAGTTCATCCCCTCTACTGCCGTCCACTTTGAGCCATTAAAAAATCTGAGCACTGCCACGCCACCTACGAGTCCTGTAGCAGCGGATGGTCTCAGTGCGCCTTTTCCATCCTGAGACGCTAGATCTTTGTGAGGATTAGGAATTAGGTAGGCAAATCCATCAAAAGTTAACTTCTTTCATGATGAGGAAGTGATGGTAGGGCGAGAGAGCGAGAGTGTCCACGCACTGGCTACACAGGC序列(5′至3′)CTCGCGAGCATTAGGTGACTGGCCGTCCCTGGGTTCGAAAAAAAACCCTGTGACAACATTCTTGCCATCTTTTCCTGTCTCTTGAGATTTTATGATCTGTTGATATTTATAGTGGTGTCAAGCGTAATTTAGACACTACATTTTTTTTTCCAGTAGAAAAAAATGTAGTGTCTAAATTTCTAACCCTTTCAAGCAGTGATATCAGTCTTCCATCACTATGTATGTGTGTTAACTTGGTTTGATTTAAAATTCTATCTTCAAGATTACCAAGCATCAAAGGAGTGCTAGTGTCTATGAATTAAAAAAGTAAGAAACAAAACAAATATAGAACTTGAAATCATAGTCATTGTTTTATTATGTAAAAAAAAAAATCAAAGTATTTTCAATTTACAGAATGTATTTGATGTTTGCCTAATTTTTTCCAACAAAAAGGGAATATCTTTCCTAGCTGAATAATAGAGCTTOAAAAAAATGCAACAAATACATACAGTACTTATCCCCATACATCCCAGAGCAGCAGTTCAAGTGGGCTCCTTGGCTCTCAAGACTTAAATTGCTAACAGCAAACACTTCCAAATCCTAAAAATGTGGAAACGTGTCTGTGTGAAATGTTTTCTTGGTAAAACCATTTCTGAGAGTTTCTCGGACAGTGAAGGCTCTAGTTGCTTAATTACTCATGAACAAGAAAGGCAAAAAAATAAACATTGCCTGCAGCATGGAGTCGGTGGATGAAGTTCCGAGTCATTGGCGGGAATCACCTGGTGGGAGTGTAAGAACGTCCTCC序列(5′至3′)GGCTTCTGCTTTCTGCTGACTCAGGGATGTGGGAGAGAGAGTGGAGAGACCGACGGGACCTGGAGAGAGAAGGGGCCGAACCCGTAGTGAGT PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R24PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R30PCR-FPCR-RPCR-F Seq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-TSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-F
                                        表A(续)
  ETFBe1-RETFBe2-2IFETFBe2-RETFBe3 FETFBe3-RETFBe4-FETFBe4-RETFBe5-2861FETFBe5-3263RETFBe-FETFBe6-RETFBex7FETFBex7RETFBe8-FETFBe8-306RETFBe9-FETFBe9-RSubtotalETFOH名称ETFDH-HETFDH-RLTFDH-s1ETFDH-s2ETFDHe1-FETFDHe1-RETFDHe2-FFTFDHe2-RETTDHe3-FETFDHe3-RETFDHe4-FETFDHe4-RETFDHe5-FETFDHe5-RETFDHe6-IETFDHe6-RETFDHe7-FETFDHe7-RETFDHe8 7HETFDHe8-HETFDHe9-FLTFDHe9-HFTFDHe10-FFTFDHe10 RETFDHe11-FETFDHe11-RETFDHe12-TETFDHe12-RETFDHe13-FETFDHe13-RSubtotalHMGCS2名称HMGCS2-Ex1-S1HMGCS2-Ex1-S2HMGCS2-Ex2-S1HMGCS2-Ex2-S2HMGCS2-Ex2-S3HMGCS2-Ex2-S4HMGCS2-Ex2-S5HMGCS2-Ex2-S6HMGCS2-Ex3-S2HMGCS2-Ex3-S4HMGCS2-Ex4-S1HMGCS2-Ex4-S2HMGCS2-Ex5-S1HMGCS2-Ex5-S2   CAGGCCCCTCCATCACCGGGCGGGTCTGAAGGGGGCAGTCTCCTCCACGCTCCCACCTTCCTCTCCCTGCTCCGCTAAAAAAAGCCGTTCCTTTGCGGGCTGACCCTGTCGGGACTCAGGGATGTGGCTGTGTGACCCCGGACAAGGGGTCCAGACTTCCAGCCTCGTCCCGCTGAGGATAGCAGCCCCGTATCTCCACCACCCTTCCATGAGCTCCACTGATTGTCAGTTTGAGGGATGAGGCCCTGCTGAATTAGCCTCACCCACTCTCGTGCTTGCCACCCCCAGCAGGAGTTCCACAGCCCTTGAACCAAATAATGGGTCTCTAGGA序列(5′至3′)CACCAACTGTCTTTTAACCACTCGCGAGAGGTGCCTACAGCCGTCGTGCTGTGGGATTCCACCTCCTTCTCCCTCTGGGCAGAGCGAGAAGGAGGTCCTAACTCCTCCACTTATCCCCACAAAGTGTTCACCTAGGAAAGATTATAGTATATTAAGTATCCAGAAAAGTCTCAGGAATTGTCATGTGATTATTGGGTTATATTAATCCCCCACTAATTTGGGAACAATTACT GAAACACTTGCAAATATAAACTAAAAACATTTCTTAATGTAGTTCCTTCCAGCTGTGCGTGACCATCAATGTAGCACTTATGTAGATCTCCACTTATTAAAAAAAGAGAGTTCCTATAGTTTTTTTCAAGATTATTATGAATTCTAAGGTATTTCTTTCTGTTGTTTGTCGCTTTATTAAGGAATGTGAATGTATTTTAAATTGTCAAATGATCGCAAATAAGTTTTAGTCATAATGAACAGACTTTTTTGTTTGCTTTTTITTTTTTTAGAAACCCTTATTTTATAACACTGATGGTAATGCTTACATTTTAGCTTGATTTAATTTGATCAATTCTGAATTTATAATACAGAAACAAGGAGGAGTATTCTGTTGTTCTTGTTTAATATGAATAACCCAGCAATTTTCTTTTGTATACTTTTTGGGCAGTTTCGCACTTATCTCTAATTAACAGATCCCATTCATGAAAAAATCATATTTTGTTAAGCATTTCCCTCACATTCCTAAAATGTTTAAACCAAATATTTTCTGTGGGTACTCTTTCCTTAAATTTTAGAGGTAGGAAGATGCTGCATTCT序列(5′至3′)GAGCCACGGTGAGCAGAGCTTGTCTAAGGCTGCTGTGCGGGTCAATTCAATGAAAAGATAATAACTGAGCAGAAGGCCCATACGGTCCTGGCCCTGGAGGTCGGAGGCAGTACCACCGTAGGCGCATACAGCTCCCATGGGATGATAGCAGCAGCTGTGTGGTTTATCACTCTATATCCAGGACCAGGAATACCATCCTCAAACGCGACACAGATAATGACCAGAAACCCAAGGCAGGAGAGGAAAAGACCAGTTCCCTGGGAGGCCTGGATTGCGATTTGTCCCCCAC   PCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R22PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R30PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R   Seq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-RSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-FSeq-RSeq-RSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-R
                                        表A(续)
  HMGCS2-Ex6-S1HMGCS2-Ex6-S2HMGCS2-Ex7-F1HMGCS2-Ex7-R1HMGCS2-Ex7-F2HMGCS2-Ex7-R2HMGCS2-Ex8-S1HMGCS2-Ex8-S2HMGCS2-Ex9-S1HMGCS2-Ex9-S2HMGCS2-Ex10-S1HMGCS2-Ex10-S2HMGCS2-Ex10-S3HMGCS2-Ex10-S4HMGCS2-Ex10-S5HMGCS2-Ex10-S6SubtotalMCAD名称MCAD-EX1-S1MCAD-EX1-S2MCAD-Ex2-S1MCAD-Ex2-S2MCAD-Ex3-S1MCAD-Ex3-S2MCAD-Ex4-S1MCAD-Ex4-S2MCAD-Ex5-S1MCAD-Ex5-S2MCAD-Ex6-S1MCAD-Ex6-S2MCAD-Ex7-S1MCAD-Ex7-S2MCAD-Ex8-S1MCAD-Ex8-S2MCAD-Ex9-S1MCAD-Ex9-S2MCAD-Ex10-S1MCAD-Ex10-S2MCAD-Ex11-S1MCAD-Ex11-S2MCAD-Ex12-S1MCAD-Ex12-S3MCAD-Ex12-S2MCAD-Ex12-S4MCAD-Ex13-S1MCAD-Ex13-S2SubtotalSLC22A5名称SCL22A5-FSCL22A5-RSCL22A5-s1SCL22A5-s2SCL22A5-S3SCL22A5-S4SCL22A5-s5SCL22A5-s6SLC22A5ex1-F2SLC22A5ex1-54SLC22A5ex1-S3SLC22A5ex1-s1SLC22A5ex1-s2SLC22A5ex1-RSLC22A5ex2-FSLC22A5ex2-RSLC22A5ex3-F   GTAGGAAAAACATGCGCCCCCACTACACCAGGCCCCTTCAGAAGATCGGGATGATAGGGCTCAGTAATGGTGGCGAAGACAGCCACTCTGCCCAAGCAAACTTACTCCATGCTTAAATCCGCCTGCATGTTTTGCTAACAAGAAATCCCTGGCTCCCAGGCCAGCCAAGAGAGCTTCACTCCTGTCACCCCAATCCTCGGAGCCCCTCTGCACAGCTCCATCTTGCTCTTTCACAAAGCAGGGTGCCCAAGAGGAGATGCACATTTCTGGAGTCCAGTGTCCTGGGCTTATGGTGCGCCCTCTGACCCACAAGG序列(5′至3′)GAGGTGGAAACGCAGAAAACCTGCTCCGACACCACAATACTCAAACCAGTTGCTCTACTCACGTTCTACTCATTGAAAGACATTATTAAGAATCAAGGATTTAAGTCCCCACACCAAGTTCCCAGGCTCTTCGAATATGATAAAACTGGTGAAGTAGGAAACACTGTAGTCTGAGCAGGACACACATTCCAGAGAACTGTGACTGGGTCTGAGGAAAAGAATCGCCAGCCAGAACACATGTAGGTAGTAACTGACTTTCCTTTTTTTTTCCCAGTTCTTTGGACTTACCTGGCCATCCTTGACACATCATTGTTGAGTGGTTTCTTTGATTTTGTAAGCTTTAGGCCTTCCAGTTCCACGGTAATAATAATTGGGATTGTTAAGAGCTGTTCACAAAATCTTCAGTAGTATATAGACCAGACTACAGTTTGTTGATCCCGATATTAAAAAGAGAAACACACTGAACCCTGTTCCCCACCAGTTTCTCTTTGAAACTCATCTTGATAAAACCCTGGGCAACATAGCAAGACCCTGAAATGGCAATGAAAGTTGAAGGATTTTGGCATCCCTCATTAGCAAAAACTGGCTCACAGCCATAAATCTGTAGAGGCTACAGACCCAAGCTGCTTAAGAGACATAACAGAG序列(5′至3′)AAATATGCAGCATTGGCCCAGTGTTGAAAACGCACCGCTTCTGAATAAACTCTGCACGCAGCGAGGTGATTCTAAAGCCAGTGACTTTCTCCTTACCTCCCTGAGCAGGAAGAAGATGAGGCGGCTGGCCTTACATAGGGGCCTCAGGTGCACTCCCGCCCGGGCCTGAGGTGCACTCGCACCCGCCGCCGACCAGGCAAGGCGGCCCAGGCCCGCAACCTTCCAGGCCGGTGAAGCCATTGGGCATGCGGGACTACCACGAGGTGTCCTCCGAGCCCTGGTCTCTCATTTTCCACGATGCCTTTGGACGCTTCTTCCTCAGTGCTGGTGGAGCCCATTCCTGCTG   PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPGR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R30PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R28PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-RPCR-FPCR-RPCR-F   Seq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-RSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-RSeq-FSeq-RSeq-F
                                        表A(续)
  SLC22A5ex3-RSLC22A5ex4-FSLC22A5ex4-RSLC22A5ex5-FSLC22A5ex5-RSLC22ASex6-1-FSLC22A5ex6-1-RSLC22A5ex6-2-FSLC22A5ex6-2-RSLC22A5ex6-s1SLC22A5ex7-RSLC22A5ex8-FSLC22A5ex8-RSLC22A5ex9-FSLC22A5ex9-s1SLC22A5ex9-s2SLC22A5ex9-s3SLC22A5ex9-s4SLC22A5ex9-s5SLC22A5ex9-s6SLC22A5ex9-s7SLC22A5ex9-sBSLC22A5ex9-RSubtotalSLC25A20名称SLC25A20-FSLC25A20-RSLC25A20-s1SLC25A20-s2SLC25A20-s3SLC25A20-s4SLC25A20ex1-FSLC25A20ex1-RSLC25A20ex2-FSLC25A20ex2-RSLC25A20ex3-FSLC25A20ex3-RSLC25A20ex4-FSLC25A20ex4-RSLC25A20ex5-FSLC25A20ex5-RSLC25A20ex6-FSLC25A20ex6-RSLC25A20ex7-FSLC25A20ex7-RSLC25A20ex8-FSLC25A20ex8-RSLC25A20ex9-FSLC25A20ex9-s1SLC25A20ex9-s2SLC25A20ex9-RSubtotalHMCCL名称HMGCL-FHMGCL-RHMGCL-s1HMGCL-s2HMGCL-s3HMGCL-s4HMGCLex1-FHMGCLex1-RHMGCLex2-FHMGCLex2-RHMGCLex3-FHMGCLex3-R   TAGGTGATGGGATGATGGTGAAATACAATAAGGAAGGAACCCAAATTAAACTGCAGACAGAAATCATCCTGCCAGCTGTGGGTCTGCTGTTGGCGGGTGCTGCTGCTCTCAAATTGCTCTGAGTCTCTGACCACCTCTCCCAATGGCCACTTCAAGAAGTTGGGAAAGATGTGGATACTGCATTAATTGAGACAGCCTGGTAGACAGGAGACAGCCTGGTAGACAGTAAGAGACTCCCAGCTCACATTCAAGCCAGTTCCAAGTCTAACTGCAGCCCTGGCTCCTGAGACCTGGCCAGTGGAGACTGGGAGGCATCTTTGGTTCTAGTGAAAAATTAACTGCTTTGGCATATGGCCCTAGAGCACCAGGGTGATCTGCATCTGCTCATTCGCACAAGGAGTTTGATTCTTACCTTAAAACCCACATTACAGCTTTGAGAGGCTCATAATAAATGCTCCATTGAATCTGAGCTACTCTGAAAGACTATGAAGACAAGCCCTAGCCTCTAGCACTTCTCAAAGGCAGATGACAGTGTGGC序列(5′至3′)GGGTTTCTCCATGTTGGTCGGCCAGGAGGTTCTTGAGCAGGCACAGACCATCTCAAGGCCTTCCCAGACTTCCATGTGTGTTGTACTACCAGGGGTGAAGGTGACAGGATTCAAGACCGCTGAGAAGCCAGGACGGCCCCATGCTTTCCGCGCCCCGCTGACAGGCAGTTCTGATTCTGGTAGCAAATCAACCCCGTGAATGTGTAAAAGGTGGTGGTGTCTGTAAACATCTTTATTTTAACCCATGTCACGCTATCTGTCGTCGGTGGTTAGTCACAGGGACATAAACATGCACACGAAATTAGCTGGGTCTGTGACTCTGATGTTTCTGCAGCAGACCCACCTCAGGTGCTTTCAGATTCACCCACAGGAGAGCACCATGCCTGGCGAAGAGTTGCAGGATAGTCTGAATGCCACTCTCTTATGAGCTTTGCACCCCAGTTAACTGCTAGTTTCTCCTTCCTGAAAACAAGCAAAAGTCAAACCACATGGCAAAGCATAGTGCTTTGAATAGTCTATGAAGCAGGATGTCATTAAGGCAACAGTCTCTCTGGATGCTGGAAGCTGTCGTTTGAGAAGCTGAGATTCTCTCTTTAATGAGG序列(5′至3′)GCATTTTCTTTGCCTCAGGACCCTGACAGTCAGAGTGCCTCTAAACACAAGAAGCCACAGTGTAATCCTAGCACTTTGGGAGGTTTCGCCATGTTAGCCAGCGCCTGTAATCCCAGCTACGACGAGCCATCGGTCACGCCCAACCCTGACAGTCAGAGTGGAATTGTGGCAATCTCTTCCGCCATTGCACCTATCACACGTACATTTTGAGGCTGTTTTGTTACTAACTCTTGCTTCAAAGGCAAATGC   PCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R40PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R39PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R   Seq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-TSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-TSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-R
                                           表A(续)
  HMGCLex4-FHMGCLex4-RHMGCLex5-FHMGGLex5-RHMGCLex6-FHMGCLex6-RHMGCLex7-FHMGCLex7-S1HMGCLex7-S2HMGCLex7-RHMGCLex8-FMMGCLexB-RHMGDLex9-FHMGCLex9-s1HMGCLex9-s2HMGCLex9-RSubtotalACATI名称ACAT1ex1-FACAT1ex1-RACAT1ex2-FACAT1ex2-RACAT1ex3-FACAT1ex3-R2ACAT1ex4-FACAT1ex4-RACAT1ex5-FACAT1ex5-RACAT1ex7-FACAT1ex7-RACAT1ex8-FACAT1ex8-RACAT1exB-S1ACAT1ex9-FACAT1ex9-RACAT1ex9-F2ACAT1ex9-R2ACAT1ex10-F2ACAT1ex10-s1ACAT1ex10-s2ACAT1ex10-RACAT1ex11-FACAT1ex11-RACAT1ex12-F2ACAT1ex12-R2ACAT1ex13-FACAT1ex13-RSubtotalCPT1A名称CPT1A-FCPT1A-RCPT1A-s1CPT1A-s2CPT1Aex1-F2CPT1Aex1-R2CPT1Aex2-FCPT1Aex2-RCPT1Aex3-FCPT1Aex3-RCPT1Aex4-FCPT1Aex4-RCPT1Aex5-FCPT1Aex5-RCPT1Aex6-FCPT1Aex6-R   ACTCTCTGTCTGCTGTTGGTGATGGCGCCAAGACAAGGCAGGTGGATGTTGGCAGGTTGCTTTTGTGGCAGGAGGACCAAGCCAAAAAGCTCAGGACACACCTATGCGCTCAGGAGTGCATGGATCCCCTGGGACCATTGGTGTGGGCACCCGGTGTCATGGCAGTGGACAGTGCTGAAAGAATAAATGATAACAAGCGGCCTCTTGTCCCCAGCAACCCATCCACTTTTGTTCTCAGCTGATGTTTTCCCTGGTGTTGACCACACGTCCTCAGGCATTACCTCCTGCCCAGACCTGTCTCGATTTTCCTCTCAGAGTGC序列(5′至3′)TGAGAGGCGACTATTGGAGGAAAGCTTCCGAGGCGGGTGCAGGAAGAAACCACTATAACCTTTTTATTGACATTTGCTTTAAATTCTGGATTAATGAAATACGATTTGGGTAAAATACCTATAATTCCATGGAATCTTTTTGCTCCCATTCCTATTGTGTAATGTCACCTACCTTATTCGGCCCCTTTTACACATTTTAAGTAGAGTTGTGTTTGAGTATCGGTTTTTCACTAGATTTTTGTGTCTTTTAGCGCTAGGTATGTAGCTGTATAAAGGGTGTCATGGGTTGCCCATCTTTCAGTTCAGTTTGTAAAGTGGGCAGCTGTGCTGAGAATACAGGTTGAAATGAACCAAGATAATGTCCCACTATAAGTTAGGCAAAGTTAATAGTGAATGACTACTTGTTTTGAGCGATTGGCAATTCTAAGAACTAGATATGGTATACTGGCATCTTGTACAACAGTTGCTTGCAGATGTTTTCTAGAATTTTTCAAAATCCTTAAACATTTAGCAGCCCAGGCAATAGGGCAAGAATAGTAGGTAAGGCCCTATATTGCCCAGGCTGATTTCGTAGAGACGAAGTCTCACTATATTGCCCTAGGAAATGTGCATTTAATCGGCAACATTTAAAATCTTAAAAACTGCAACCCTTATGTCAAACTGTAGTATTTCAAGGGTTTAGCTAGAAACACAAAGGCAGCTCCATTTTGGTTAGTCATAAATTCTGTACTTCATTAGACTCAGAATGCAAAAATGGTATCAAACTTT序列(5′至3′)ACACAGACACCAGAGGCAGATGAAGTCCAGAGAGATAGATTTGGCCAGAGTTGAGGTACCACGCTTAGAGCCCCAAGATGATCTCAGCCAATCCGCTGCTGCCGCGGTCCGGTTCCCGGCAGCTGAGGGTTTTTTAGTGTCTGGTCACAGCAGCCAGAGCCCCGTTCCCTGTGGGTTGTGGGAGGACCACATTTGAAGAGACATAAAAACAGCAAGGCACCGTGTGGCCTCACGCCCAAACTGTCCACCCCCCCTTCAGAGTAGTATGGCAGTAGTCTGAAAGACCTAGTTCATCATAATTAAGACCTAAGCCTTAAGGCACAAGTGAGGCAAACATAGGCCCCTCAAAATTAGCGTCTTCA   PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-FPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R28PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPGR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-F29PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R   Seq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-R
                                        表A(续)
  CPT1Aex7-FCPT1Aex7-RCPT1AexB-FCPT1Aex8-RCPT1Aex9-FCPT1Aex9-RCPT1Aex10-FCPT1Aex10-RCPT1Aex11-FCPT1Aex11-RCPT1Aex12-FCPT1Aex12-RCPT1Aex13-FCPT1Aex13-RCPT1Aex14-FCPT1Aex14-RCPT1Aex15-FCPT1Aex15-RCPT1Aex16-FCPT1Aex16-RCPT1Aex17-FCPT1Aex17-RCPT1Aex18-FCPT1Aex18-RCPT1Aex19-FCPT1Aex19-RSubtotalHADHA名称HADHAex1-FHADHAex1-RHADHAex2-FHADHAex2-RHADHAex3-FHADHAex3-RHADHAex4-FHADHAex4-RHADHAex4-S1HADHAex5-F2HADHAex5-RHADHAex6-FHADHAex6-RHADHAex7-FHADHAex7-RHADHAex8-FHADHAex8-RHADHAex9-FHADHAex9-RHADHAex10-FHADHAex10-RHADHAex11-FHADHAex11-RHADHAex12-FHADHAex12-RHADHAex13-FHADHAex13-RHADHAex13-S1HADHAex14-FHADHAex14-RHADHAex15-1-FHADHAex15-1-RHADHAex15-1-S1HADHAex15-2-FHADHAex15-2-RHADHAex15-3-FHADHAex15-3-RHADHAex16-F   CCGCGGCTCTGGGCTTGTGAAGAGGCCACCTCTGTGTGCAGGATGTGCTGTGATTATTTAAATGTGCAATATGTCAATTATACCTCTGTAAAGTTTCTTCTGTGGGATTTTCGTTGCCTTTGACACTTCCTAATTCTGAGCATGGGACTCTTGGTTTTGTGTCTCCCCCAGTGAGGAAGAGCGCCCCATCGCTGCAGGTCGGGGGGTATTTTCTTCCAAGCTCATGGGCCTCATTGTTGCCTCTTTAAACACTTCACTGCGCCTGGCCAGCTTCATGTTGGAGGTTAATGTGTTTTAACGGTTGGAAAATTCATGTGTAAGACGGTGTGCGTCAGGTACTTTTCTCCCTGGGTGAACAGTCTTGGGCAAGACATATCAGCATGCCCTGCCGGCCTCCAGAAGCCTTTTAGGACTGCTCAACTTGAGACATGCAACAAAATATGTTCATGCAAGGCTGTAGTAATGAGGGACGGTAGAGGAGGGATCACACCCCATTACCCATCCGTCCCTTTTTCACGTTGTCTCATTTTTCTGTCAAATTAAAGATGTGTTTCCTTAAACATTGGGTCAGATTGCAAATGAGTGTTTCATCCCGAGCTAAGGTC序列(5′至3′)GTCAGGCAGTGCTGCAGGCGAAAGGGAGACGGGGCTCTGTTGTTGTTATTATTGTAAATTACAGCTTTGCATAGTTAATATGGGTTCTGGCTAAAAAGAACAGGGTCTTCTGCTTTGCTGACTGCCAGATTGGTAGATTTGGGGCTACTGACTTGCTGGGAGAATGATGTGCCCAGCACTTCTACTTTCTTATTTGATGGTGGTACGTACATCCGTGTATAGTGAATAAGTATTGAACCGCCTAAGGGTTTACAGCTGATGAACCCTTATCCATCTCAAGTTGCTACTAATGCCCATATTATGCATTTTATACAAGAAAATTATCACCCTGATTTTTTTCCCCGCCTGGCCTAAGAGGTTAACTCTTTCTGGCTTTTTCACTACCTGGGAACTTCCTCATTTTGAATCTACAGCAAACATAAACTAACAAGGGAATCTAGGCTCTTGAATGGCAATAAGGAGGAGTGATCTATTTATTCAGCATTATTGTACATCTCGCCTTTTCAGCTTTATACAGAGGATTGGATCTCTGAACTGAAGGAATCCATATAACCTAGATGTAGATCTTCAAAGCCTCTGTGAACTGGCAATCTTCCACTTTGACTGAACCAAGCCACCACAAAAAACAACTATGGCCGATGGACATTCAATAACATGAGTTTCCTATAGCTCCTTTAAAAAAAATATAGCTCCTTTAAAAAAAAAATCTCTGTGCTCATTAGCTTTGATGTGGCCTCTCTTCTGTACTCAAGCTGTAAGCCTTTATCCTTTCTTTCTAGTGTTTTCCTAGCAGAGAATCATATCAAAGTCTGGTCATTTGCCATAAACAAGCCTGGAGGTAAAAGGTGACCGTGGGAAAGGTAGAGTGTGTATCAGAAGGAAGCTTGGTCCTCTTTGGGGGGATTTGGGCTGCCGCTTCTGTAACTCTTTGGTCTCAGGCCAGGCCAGGGTTCTGAGA   PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R42PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-F   Seq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-F
                                           表A(续)
  HADHAex16-RHADHAex17-FHADHAex17-RHADHAex18-1-FHADHAex18-1-RHADHAex18-2-FHADHAex18-2-RHADHAex18-3-FHADHAex18-3-RHADHAex18-4-FHADHAex18-4-RSubtotalHADHB名称HADHAB-FHADHAB-RHADHAB-S1HADHAB-S2HADHBex1 THADHBex1-RHADHBex2-THADHBex2-RHADHBex3-FHADHBex3-RHADHBex5-FHADHBex5-RHADHBex6-FHADHBex6-RHADHBex7-FHADHBex7-RHADHBex8-FHADHBex8-RHADHBex9-FHADHBex9-RHADHBex10-FHADHBex10-RHADHBex11-FHADHBex11-RHADHBex12-FHADHBex12-RHADHBex13-FHADHBex13-RHADHBex14-FHADHBex14-RHADHBex15-FHADHBex15-RHADHBex16-FHADHBex16-RHADHBex17-FHADHBex17-RSubtotalVLCAO名称VLCAD-FVLCAD-RVLCAD-S1VLCAD-S2VLCADex1-F2VLCADex1-RVLCADex1-S1VLCADex2-FVLCADex2-S2VLCADex2 S1VLCADex2-RVLCADex3-F2VLCADex3-R2VLCADex4-F   GCACATGTATCCCAGGACTTAAAGTATTATCCCGACTTGCATTCTGCATCTGACTTCGTTGAAGGAGACGCAAGGAAGGAAGCTCACTTTAGCCTGCCGGAGTTTGTGTTCTCGTTACTCCAAGTTCTACCAGTGAGCAGGCCGAGGTGGCTTCAGATGGGTCTTTCTCTCCCTCCTGGTGAAGTGTGTCCCACTTTCTCTCATCCCAGTCGGATCTTTGCCCTTCTGGTTTAACTCTGCTTAGCACCAACGTTCC序列(5′至3′)TCAACTCCCACTTTCCCAGGTCCCGGCAGGAGTTCTGTCTCGGAGCAAGGTTCAGAGCACTGCCTGACTAAAACCGCCGGAGGGCAGCCCTCGGCGACAGTTGCGGGGGCATGGATGAGGTTATCAGAGTTCCATTCAGTATCTGTGCGAGATGTTTTTTTTATTTTTAGAGATTGGATTTGGATTTAGTTTTGGTTTTTATTCAGAGTTCACAAGGTGACAGAGCGAGACTCCATCTAATTTCATGGGACTGCTATCCAAAGATCTCTGGGTATTTCAAATAGAATGAAAATGCTTAAATTTGTATAGTACAGATGGCTAAAATGATCTCTGGCACTGCCTTGATAGGCTTTTGTAAAGTAACTTCTATTAATTGAAATGATTAGTGCTCAAAGCATCATTTACATGGAGGTTCTGTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGCTTAAATTGGAATGGTATGTTATTACAGCATAGCAGAGTCCACACTGAATCDTAGGTGTTAGCATAACACCGCACTCGGGATGTTTTTTGAGTTTTGGTAAGGTTTATATTTCATTTGTTTTTGTAATTTTCATAACACACACAAAAAGTTATATTAGGCTTGATATATAAGATGGCTGGAGAAAGACCTCGAGACATACATAAAATCCCTACGTAAAAAAATCCGAAGGCATATTTGAGGTAAAGTAATCAGGGCTTAATATACTCTCAAACCAGTCATTAGAGTACCTATGTAAAACTGAGTTTGGGTCATAAACCATGCCTTGCTCTCTCCAACCATTCCTATAAGAAAGCGTAGAGGTCAAAAGAAAGAGAAGCTTTCCCTTAGTACTAAGAGCCTAGCTTGATTCTGATCTTAAGAAAAATATTGCTTTAAGAAGGTTTCAAACTAACTGTCCCTGTACTAGGTGGATTCATCTTTATCTTCCCAGCAGCCTC序列(5′至3′)TTTCCATGTCTCTGCCTCTGGGCACCAAGAGGGAGATGTTCTGTCCCATCCTATCCCGGTACCTGGCACCAAGAGCACTCCAGGGGGCACCTDTGGCCCCAACATGGACTGTCTCTGTATCACTCCAGGGGGCACCTGTGGCGAGGGACGCTTGGAGATCCCTCGGATGGCCCCGAGCTTGCACCCCCGGCATAGGGCCGGATCCCTGCCGATGGCGGGCGTCACCGCTTCGCGCCGCCTCGGTGAGCTGGCCTTTGAACATTCCCTGACCAGGAAAAAACCGGC   PCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R49PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-FPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R36PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-RPCR-FPCR-RPCR-F   Seq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-F
                                        表A(续)
  VLCADex4-RVLCADex5-FVLCADex5-HVLCADex6-FVLCADex6-RVLCADex7-FVLCADex7-RVLCADex8-FVLCADex8-S1VLCADex8 S2VLCADex8-S3VLCADex8-S4VLCADex8 S5VLCADex8-S6VLCADex8-RVLCADex9-FVLCADex9-RVLCADex10-FVLCADex10-RVLCADex11-FVLCADex11-RVLCADex12-FVLCADex12-RVLCADex13-FVLCADex13-RVLCADex14-FVLCADex14-RVLCADex15-FVLCADex15-RVLCADex16-FVLCADex16-RVLCADex17-FVLCADex17-RSubtotalLCAD名称LCAD-FLCAD-RLCADex1-FLCADex1-HLCADex2-FLCADex2-RLCADex3-FLCADex3-RLCADex4-FLCADex4-RLCADex5-FLCADex5-RLCADex6-FLCADex6-RLCADex7-FLCADex7-RLCADex8-FLCADex8-RLCADex9-FLCADex9-RLCADex10-FLCADex10-RLCADex11-FLCADex11-RSubtotal   AGCTCTTTAAGAAACTGTGTCTGCTCTATACCCGTCCGGTAAGGGAAGCATTCTTGGCGGGATCGTTCTGGTGAGGTGTTTGGAGATGTTCATACTGGGATGTGGCGATAGGCTCCTGTTAAGGTCAGGTCCGCTCTCCTAGGGTTGCCTCACCAGTGGATACTCCCAGGTGTTAAGGGGAAGAATGGGATATTCAGGGCGCGTTCTCCTCCGCCCAATTGGGTGACTTGCAACAGCCAGCGAAGGAGCAGTTTTTCCCCCAGGGACACATGGCAAGGGCCCTCTGGCGCAAGCCGAGACCCACTGCCCCAGGTGGTGATGAGGCCAAGTCTGACAGAACAGATGAGACTGGTTTTGGGAGCAAAATCTTTGGCTCGGTGAGCGAAGATCTGGGAGCACACGCTAAGGTACAGGACGGTCTTCTGCAGCTCCTTTCCTTTGTCCTATGGGTGGTAAGACAGAGAATTGGGTGGCCCCCCTGAGAGGAAGAGGGAGGCAGGCAAACAGCTGAGCACAGTGGCAAACTGCTCCACGGAGTGGCGAGCTGGTAAGTTCTGCCAGCCGCTGCACTCCTTGAGACTAATGCCCCCAGCAGGAAGCAGGAGATGAAAATAAGGGAATGCCTGAGCCGATGCCCTCTCGGATCCGIGACACCTGGTGTATCGAGGTGACAATAGAGGCAAACTCCCCACG序列(5′至3′)TGGCTAACACGGTGAAATCGGAGGACGATCAGCTGAGGCAAAGGCAGCAGTTTGGCTGAGTGACTCGCTGCCCCACAGTGGCACTAATTTGGATATGAAGAAAAGCCCTGAACATACTATGTTTTCTGCATAAGTTCAAAGTTGTGGCCATTCAAGAGTGCATGAGCGGTATAATCACTACCAAACAATTTGATAGGACCTTAATCCTTCCTCCTAGCATATAGCTCAGTCGCAATTTTATAATGGTGTAGCCAGTTTGGAGTCCCTAGATTTAATAGAATTAATGAGTTGTCTTTCTCCCAATCATAACTTGCACCATGTAATCCTCTATGTAAGTCTCCTATCTGACAATTTGTGTTTTGTTTTTTTGGAAACACAAGTTTTGCATGTATAAATTTGAATGAATTGTGTGAAAATCACTTGCATAATTCAAACTTCTATTTACCCCAGGCCTGATATGTTAAGTGGGTTGAAGTTTATATTTCTAGCTGAGCTTAAAATTGGCAGAATTCCCGTTCTAATTGCTTAATAAATGTGCACTTTCCCTCTACATTTGATGTACAAAGTAAATTGAATAGTTTATGAGTTACCTGGTAAGACTTTTATTTCCTTCTCTATAGAGAGAGC   PCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R47PCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-RPCR-FPCR-R24   Seq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-ISeq-RSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-Fseq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-RSeq-FSeq-R
结果
1基因多态性的检测
从由CPT II缺失引起的流感相关脑病，和疑似流感相关脑病的患者中检测到图4所示45处基因多态性(单核苷酸多态性：SNP，或插入或缺失)。
1.1经Fisher两侧检验，与健康人对照相比，在患者中观察到单核苷酸多态性显著更高频率出现的基因多态性
在HADHA的第6外显子区域(外显子6)、HADHA的第6内含子区域(内含子6)、HADHA的第18外显子区域(外显子18)、HADHB的第2外显子区域(外显子2)、HADHB的第12内含子区域(内含子12)、HADHB的第14内含子区域(内含子14)、HADHB的第17外显子区域(内含子17)都在患者中检测到以高频率出现。这些结果列举在图5中。
以起始密码ATG的A位置作为第一号碱基，记录了对应于外显子区域的基因多态性的位置。对应于内含子区域的碱基编号，是以对应于外显子区域的位置的终点开始，向上游(以“-”表示)或向下游(以“+”表示)计算的位置，以及NCBI基因组数据库的核酸编号。
检测到在HADHA碱基编号474号具有基因型C/C、C/T和T/T的SNP。虽然SNP是不影响表型的cSNP，但具有次要等位基因T的SNP(健康人11+2名＝13名，患者10+0＝10名)比不具有次要等位基因T的SNP(健康人86名，患者21名)，在患者中显著(p＝0.028)更高频率存在，让步比(odds ratio)为3.15倍。这是一个新发现的SNP，HGMD数据库或dbSNPs中都没有过报告。
检测到HADHA的第6外显子下游+26位(NT.022184.14编号5270935)的第6内含子内的具有基因型G/G、G/C和C/C等基因型的SNP。该SNP虽然是内含子SNP，但具有次要等位基因C的SNP(健康人11+2名＝13名，患者10+0＝10名)比不具有次要等位基因C的SNP(健康人86名，患者21名)，在患者中以显著(p＝0.028)更高频率存在，让步比为3.15倍。这是一个新发现的SNP，HGMD数据库或dbSNPs中都没有过报告。
检测到HADHA的第6外显子下游+32位(NT.022184.14编号5270929)的第6内含子内的具有T/T和C/C基因型的SNP。该SNP是内含子SNP。具有次要等位基因C的SNP(健康人5+1名＝6名，患者7+0＝7名)比不具有次要等位基因C的SNP(健康人82名，患者25名)相比，差异不显著(p＝0.0958)，但在患者中也以更高频率出现，让步比为2.81倍。
检测到HADHA的碱基的第2519位的基因型具有A/A和A/G和G/G基因型的SNP。该SNP是不影响表型的cSNP。具有次要等位基因A的SNP(健康人11+2名＝13名，患者10+0＝10名)比不具有次要等位基因A的SNP(健康人86名，患者21名)，在患者中以显著(p＝0.0280)更高频率存在，让步比为3.15倍。
检测到HADHA的碱基的第2619位的基因型具有G/G和G/A和A/A等基因型的SNP。该SNP是不影响表型的cSNP。具有次要等位基因A的SNP(健康人8+3名＝11名，患者9+0＝9名)比不具有次要等位基因A的SNP(健康人89名，患者22名)，在患者中以显著(p＝0.0171)更高频率存在，让步比为3.64倍。
检测到HADHB的碱基的第4位具有基因型ACT/ACT(插入)的SNP。由于这种多态性，对具有ACT的等位基因而言，产生了第二位氨基酸插入了苏氨酸(T)的表型。具有插入了ACT的等位基因的SNP(健康人16+0名＝16名，患者10+0＝10名)比不具有插入了ACT的等位基因的SNP(健康人83名，患者16名)，在患者中以显著(p＝0.0005)更高频率存在，让步比为4.86倍。
检测到HADHB的第13外显子的上游-14位的第12内含子内(NT.022184.14编号5321791)具有A/A、A/G和G/G基因型的SNP。该SNP是内含子SNP。具有次要等位基因G的SNP(健康人11+2名＝13名，患者10+0＝10名)比不具有次要等位基因G的SNP(健康人86名，患者21名)在患者中以显著(p＝0.0280)更高频率存在，让步比为3.15倍。这是一个新发现的SNP，HGMD数据库或dbSNPs中都没有过报告。
检测到HADHB的第14外显子的下游第4位的第14内含子内(NT.022184.14编号5323009)的具有T/T、T/C和C/C基因型的SNP。该SNP是内含子SNP。具有次要等位基因C的SNP(健康人11+2名＝13名，患者10+0＝10名)比不具有次要等位基因C的SNP(健康人86名，患者21名)在患者中以显著(p＝0.0280)更高频率存在，让步比为3.15倍。
检测到HADHB的第15外显子的上游第26位的第14内含子内(NT.022184.14编号5323658)具有T/T、T/A和A/A基因型的SNP。该SNP是内含子SNP，具有次要等位基因A的SNP(健康人23+3名＝26名，患者15+0＝15名)比不具有次要等位基因A的SNP(健康人73名，患者16名)在患者中以显著(p＝0.0271)更高频率存在，让步比为2.63倍。
检测到HADHB的碱基编号第1607的基因型具有G/G、G/C和C/C的基因型的SNP。虽然SNP是不影响表型的cSNP，但具有次要等位基因C的SNP(健康人16+3名＝19名，患者13+1＝14名)比不具有次要等位基因C的SNP(健康人86名，患者21名)在患者中以显著(p＝0.0280)更高频率存在，让步比为3.47倍。
1.2用于两个或以上基因的组合分析的基因多态性
以下仅举出检测到的基因多态性的代表性例子，全部记录总结在图4中。(在编码区域内可见到的基因多态性)
在CPT II的第4外显子区域(外显子4)和第5外显子区域(外显子5)检测到多个cSNP。
检测到碱基编号第1055位具有T/T、T/G和G/G基因型的SNP，由于这种多态性，具有T的等位基因编码第352位氨基酸是苯丙氨酸(F)，具有G的等位基因编码的氨基酸是丝氨酸(C)，因此，在氨基酸水平上产生(F/F)、(F/C)和(C/C)的表型。
检测到碱基编号第1102位具有G/G、G/A和A/A基因型的SNP，由于这种多态性，具有G的等位基因编码第368位氨基酸为缬氨酸(V)，具有A的等位基因编码的氨基酸是异亮氨酸(I)，因此，在氨基酸水平上产生(V/V)、(V/I)和(I/I)的表型。
检测到碱基编号第1939位具有A/A、A/G和G/G基因型的SNP，由于这种多态性，具有A的等位基因编码第647位氨基酸为蛋氨酸(M)，具有G的等位基因编码的氨基酸是缬氨酸(V)，因此，在氨基酸水平上产生(M/M)、(M/V)和(V/V)的表型。
在ETF基因群中也观察到了cSNP。在ETFA中，检测到碱基编号第512位具有C/C和C/T基因型的SNP。由于这种多态性，具有C的等位基因编码第171位氨基酸为苏氨酸(T)，具有T的等位基因编码的氨基酸是异亮氨酸(I)，因此，在氨基酸水平上产生(T/T)、(T/I)的表型。
在ETFB中，检测到碱基编号第461位具有C/C和C/T T/T基因型的SNP。由于这种多态性，具有C的等位基因编码第154位氨基酸为苏氨酸(T)，具有T的等位基因编码的氨基酸是蛋氨酸(M)，因此，在氨基酸水平上产生(T/T)、(T/M)和(M/M)的表型。
还从ETFB中，检测到碱基编号第447位具有C/C和C/T T/T基因型的SNP。这种多态性不对表型产生影响。
从ETFDH中还检测到碱基编号第92位具有C/C和C/T T/T基因型的SNP。由于这种多态性，具有C的等位基因编码第31位氨基酸为苏氨酸(T)，具有G的等位基因编码的氨基酸是异亮氨酸(I)，因此，在氨基酸水平上产生(T/T)、(T/I)和(I/I)的表型。
在ETFB中，检测到碱基编号第-320位的基因型具有C/C和C/TT/T基因型的SNP。还在碱基编号第-113位的基因型具有G/G和G/T基因型的SNP。
在ETFDH中，检测到碱基编号第1989位具有A/A和A/C和C/C基因型的SNP。这种多态性，是一个新发现的SNP，HGMD数据库或dbSNPs中都没有过报告。
从ETFA内含子区域检测到SNP。在第2548228位(相当于编码序列NT024654.13中从第10外显子的起始位置开始的第642位碱基，由于不存在相应的氨基酸，可以认为是内含子序列)检测到具有C/C、C/T和T/T基因型的SNP。这些SNP是新发现的SNP，HGMD数据库或dbSNPs中都没有过报告。
此外，各基因多态性常常会各自与相邻接的基因多态性一起通过亲代-子代传递而遗传，这些等位基因关系被称为连锁不平衡关系。连锁不平衡随着等位基因间的距离而有减弱的倾向。因此，在相近的基因中，多发现强的连锁不平衡关系。本说明书中，当存在所述基因与邻近基因间存在强连锁不平衡关系时，有时基因多态性的频率或基因多态性出现的样式相同，从而得以预测本实施例中的基因多态性。另一方面，并不限于本说明书所述的基因，通过对与其邻接基因的分析，有可能被利用来诊断这种风险。有时即使是弱连锁不平衡关系，也能用来进行风险诊断。
例如，例如，HADHA和HADHB附近的基因多态性多存在连锁不平衡关系。因此，利用与这些基因相邻接的基因的多态性，也可能实行风险诊断。
3通过SNP组合诊断患者流感相关脑病的风险(表B)，
3.1患者候选标记物的研究
为了利用已获得的上述基因多态性进行风险诊断，试图寻找了只在患者中观察到的基因多态性的组合，或在多数患者中具有的基因多态性的组合。通过利用两种或两种以上基因多态性，从患者人群中得到了显示高让步比的基因多态性。以下列举这种基因多态性的代表性例子。
在HADHB的第2外显子内的碱基编号第4位具有ACT/ACT或-/ACT(插入了苏氨酸)的基因型的插入，和HMGCS2的第9内含子的-37位(NT019273.17编号16279498)具有基因型C/T或T/T的SNP的组合，能够在通过进行基因分析而被评估的27名患者中见到5例，而在99例健康人中只见到1例。HMGCS2的第9内含子的第-37位的等位基因与HMGCS2的第9内含子的第+68位(NT019273.17编号16279714)的等位基因之间，存在强连锁不平衡关系。因此，在采用G/G或A/G的基因型与HADHB的第2外显子内的ACT/ACT或-/ACT的基因型相组合时，得到相同的结果(较之27名患者中见到5例，在99例健康人中只见到1例)。在所有这些情况下，让步比都是22.4倍。
ETFB的第8外显子内的碱基编号第447位带有C/T的基因型，与CPT II的第4外显子的碱基编号第1102位的基因型G/A的组合，在能够进行基因分析的31名患者中见到2例，而在100例健康人中没有见到。
ETFA的第10内含子内的第+642位带有C/C的基因型，与ETFB的第3内含子内的碱基编号第-113位的基因型C/T组合，在能够进行基因分析的31名患者中见到1例，而在100例健康人中没有见到。
VLCAD外显子8的下游第+33位的第8内含子内(NT.010718.15编号6722966)具有T/G或G/G的基因型，与LCAD的第9外显子的碱基编号第997位的基因型A/A(表型为谷氨酸)组合，在能够进行基因分析的27名患者中见到4例，而在99例健康人中没有见到。
CPT II的第4外显子内的碱基编号第1055位含有C/C(表型为丝氨酸)的基因型，使其与ETFA的第10内含子内的第+642位G/G或G/T的基因多态性组合，在能够进行基因分析的31名患者中见到9例，而在99例健康人中见到4例。此时的让步比是9.72。
HADHB的第2外显子内的碱基编号第4位的基因型含有ACT/ACT或-/ACT(苏氨酸插入)的多态性，使其与与ETFDH的第13外显子内的第1989位的G/T基因型组合，在能够进行基因分析的27名患者中见到10例，而在99例健康人中见到12例。
对上述组合进行进一步的归纳，可以提高对患者风险诊断的命中率。例如在采用ETFB447C/T、CPT21102G/A、ETFA+642C/C、TFB-113G/T、VLCAD+33T/G或G/G、LCAD997A/A、HADHB 4-/ACT或ACT/ACT、HMGCS2-37C/T或T/T等8种进行组合时，在满足这些条件的31例标本中见到11例(有1例组合重复)。另一方面，从健康人中，在99例健康人中只有1例。该组合覆盖了35.5％的患者，而只在1％的健康人中发现(表B(a))
在采用HADHB 4-/ACT或ACT/ACT、HMGCS2-37C/T或T/T、VLCAD+33T/G或G/G、LCAD 997A/A、ETFA+642C/C、CPTII 1055G/G或G/T等6种进行组合时，从31例患者中检测到16例(有2例组合重复)，占患者中的51.6％，而从健康人中，99例健康人中检测到5例，占5.1％(表B(b))。
在采用VLCAD+33T/G或G/G、LCAD 997A/A、HADHB 1989G/T、ETFDH 1989G/T，ETFA+642C/C、CPTII 1055G/G或G/T等6种进行组合时，从31例患者中检测到22例(有3例组合重复)，占患者中的71％，而从健康人中，99例健康人中检测到14例(有1例组合重复)，占13.1％(表B(c))。
以上述结果为代表的方法中，基因多态性可以作为诊断标记物，用于诊断以流感相关脑病为主的热不稳定性表型症的风险。
3.2健康人候选标记物的研究
通过研究健康人中见到的特征性基因多态性指标，可了解为何患病风险低，以及可以认为，在不具有这些基因多态性指标时患病风险就低。
LCAD的第9外显子的碱基编号第997位的基因型所具有的A/C或C/C的基因型、HADHA基因的第18外显子的碱基编号第2619位的G/G基因型，和HMGCS2的内含子区域+53(NCBI)的基因型T/T形成的组合，在能够进行基因分析的99健康人中观察到30例(30.3％)，而在患者中没有见到(表B(d))。根据上述结果，可以将此组合用作风险小的诊断标记物。
表B(a)
  基因型   患者   健康人
  &   ETFB   447   C＞T   C/T   2   0
  CPT2   1102   G＞A   G/A
  &   ETFA   +642   C＞T   C/C   1   0
  ETFB   -113   G＞T   G/T
  &   VLCAD   +33   T＞G   T/G或G/G   4   0
  LCAD   997   A＞C   A/A
  &   HADHB   4   ＞ACT   -/ACT或ACT/ACT   5   1
  HMGCS2   -37   C＞T
                                              总计   11/31(35.5％)   1/99(1.0％)
(b)
  基因型   患者   健康人
  &   HADHB   4   ＞ACT   -/ACT或ACT/ACT   5   1
  HMGCS2   -37   C＞T   C/T或T/T
  &   VLCAD   +33   T＞G   T/G或G/G   4   0
  LCAD   997   A＞C   A/A
  &   ETFB   +642   C＞T   C/C   9   4
  CPT2   1055   T＞G   G/G或G/T
                                          总计   16/31(51.6％)   5/99(5.1％)
(c)
  基因型   患者   健康人
  &   VLCAD   +33   T＞G   T/G或G/G   4   0
  LCAD   997   A＞C   A/A
  &   HADHB   4   ＞ACT   -/ACT或ACT/ACT   12   10
  ETFDH   1989   G＞T   G/T
  &   ETFA   +642   C＞T   C/C   9   4
  CPT2   1055   T＞G   G/G或G/T
                                          总计   22/31(71.0％)   13/99(13.1％)
(d)
  基因型   患者   健康人
  &   LCAD   997   A＞C   A/C或C/C   0   30
  HADHA   2619   G＞C   G/G
  &   HMGCS2   -37   C＞T   T/T
                                        总计   0/27(0％)   30/99(30.30％)
实施例2
材料与方法
患者
本研究得到德岛大学人类基因组分析的伦理审查委员会认可。全部参加实验者都给予了书面的知情许可书。2000-2003年的流感季节在日本的西南地区对流感相关脑炎(Influenza-associatedencephalopathy；IAE)进行了监控。IAE的诊断依据临床症状进行。34位患者全部都有病毒抗原，高热后12小时至48小时内开始突然发作并出现昏睡。在一个死亡病例(患者编号21)中，开始发热时即投以双氯芬酸钠，(Diclofenac Sodium)，在肝脏未观察到脂肪变性和雷氏综合症的典型病理学改变。包括21号患者在内的被诊断为IAE的13位患者和79位的健康志愿者，均同意接受基因组分析。
临床数据的分析
由患者取得来自经EDTA处理的外周血标本、尿标本和咽喉棉拭子标本。尿中有机酸图谱和血清中酰基肉碱分别用气相色谱-质谱(Shimazu Model Qp5000，Shimazu，Kyoto，Japan)，电子喷雾串连质谱仪(electron spray tanden mass spector，Model TSQ7000，Thermo-Quest，Tokyo，Japan)分析。流感病毒抗原用酶联免疫吸附法(ELISA)对用棉拭子取得的来自咽喉的标本进行检测。
CPT II活性测定
在有1％Tween20存在的反应混合物中，用CPT II的cDNA突变体转化的COS-7细胞和肝活检标本，通过检测由L-[甲基-3H]肉碱和棕榈酰-CoA形成的棕榈酰-L-[甲基-3H]肉碱测定CPT II活性。为了分析野生型和突变型的CPT II的热稳定性，在37℃和41℃测定肝和细胞匀浆的活性。
CPT II突变的分析
将IAE患者和79位未感染流感的日本人的，按已报道的方法(Fukao T.Mitchell GA，Song X-Q，Nakamura H.Kasso vska-Bratinova S，等Genemics 2000，68，144-51)从全血中纯化基因组DNA。CPT II基因的5个外显子的PCR用基于内含子的引物(表C)进行分析。PCR产物的序列，用ABI DyeDeoxy Terminator Cycle测序试剂盒在ABI-PRISM 3100Genetic Analyzer(PE-Applied Biosystems)上直接进行分析。对各种PCR产物的双链确定其序列，分析至少独立进行两次。
表C
用于CPTII基因的PCR扩增的外显子引物；MA或MB引物用于诱变。
  区域   正向引物   逆向引物   产物大小(bp)
  外显子1   cttgtgtttagactccagaactcc   gtcatgagtgactgcagtcaggttg   292
  外显子2   ctgtcagccttacactgaccc   aactctcggggcttggtc   305
  外显子3   Tttagggctatgctgttggg   aggaagggaggatgagacgt   358
  外显子4-1   ctctggaggttgatgccatt   acccaagcactgaggacaag   1,472
  外显子4-2   tagagttcagtgggtagctggct   atccaggcacatctgaagtac   401
  外显子5   tttcctgaggtccttttccatcctg   atgaggaagtgatggtagcttttca   425
  MA-V352I   ggcacaa accgctggtgtgataaat   atttatcacaccagcggtttgtgc
  Mlq-V362I   ctactgccgtccactttagcactcttg   caagagtgctcaaagtggacggcagtag
诱变和COS-7细胞中CPT II突变体及WT的表达
包括人CPT II的全部编码区域的全长WT cDNA克隆(pCMV6-WT)由德克萨斯大学V.Esser博士惠赠。质粒pCMV6-WT作为亲本载体以借助Quickchange(注册商标)诱发特定部位突变的试剂盒(site-directed mutagenesis Kit)(Stratagene)生成3种全长的CPT II突变体cDNA克隆，pCMV6-MA(F352C)、pCMV6-MB(V3621)和pCMV6-MA+B(F352C/V3621)。用于诱导突变的引物列于表C(表16)中。通过序列分析确认了CPT II cDNA的突变和其完全性(perfectibility)。pSVb-半乳糖苷酶对照载体(Promega)作为内标，同时转化各种pCMV-6-CPT II质粒，通过测定酶活性监测转化效率。同时进行空白(Mock)转化。转化72小时后，用生理盐水洗涤COS-7细胞2次，分析WT和突变体的CPT II活性。
结果
患者与酰基肉碱比
0～16岁不具有潜在疾病的34名患者(男22人，女12人)患有IAE疾病。22名患者(64.7％)未满4岁，平均年龄2岁。鼻咽部棉拭子所取标本中，检出流感病毒A、流感病毒B和A+B的抗原分别占91.2％、5.9％和2.9％。2.9％的患者接种过疫苗。除1名患者(患者编号21)为死亡病例外，在患流感过程中均未用过阿司匹林或双氯芬酸。
患者血清的实验室检验，41.2％的IAE患者显示血清酰基肉碱比值(C16:0+C18:1)/C2特征性的增高，所述比值超过临界值上限0.048(图1)。特别在重症IAE患者(7人)，有一半以上患者该比值超过0.09，其结果是致死性的(3名女性)和具有后遗症(1名男性)。这些结果表明高风险的患者人群中，线粒体长链脂肪酸代谢存在明显障碍，但这些患者在发病前的诊断未见异常症状。在日本人中，最典型的线粒体脂肪酸β氧化代谢先天异常有两种类型，其一为CPT II缺失症，表现出血清中长链酰基肉碱积累；另为戊二酸酸性尿2型(GA2)，各自的出现频率为26.6％和21.9％，而这种频率在白人中则较低，分别为11％和5.5％，白人中最典型的缺失症，是缺失中链酰基辅酶A脱氢酶(MCAD)，其频率最高达27.5％。然而，在全部IAE患者中，随着体温恢复正常，(C16:0+C18:1)/C2值降低到0.048～0.06的边界比的正常化水平。这些结果暗示该比值在高热到40℃以上伴有抽搐时会暂时增高。带有组合的热不稳定性CPT II多态性的21号患者的全部家属，除母亲外，在非感染状态下在0.042～0.054的边界范围内的比值，见下述。显示与患者带有同样组合的热不稳定性CPT II多态性的患者姐姐在正常体温下，其比值为0.042。也有两名高风险组的患者的该比值大于0.09，但没有后遗症，感染3～4周后即复原。
有1名该比值为0.004的因IAE死亡的患者(图1)，该患者尿中戊二酸含量异常增加。这是根据线粒体中电子传递发生障碍而被诊断为GA2型的死亡病例。该比值在0.09以下的其他全部IAE患者都没有严重后遗症而恢复。作为MCAD缺失症诊断指标的辛烯酰肉碱含量，其并不是在所有患IAE的日本人中都增高。
热不稳定性CPT II的多态性
酰基肉碱比值高达0.168的21号患者的肝脏活体标本匀浆中CPTII的比活性为0.4±0.06nmol/min/mg蛋白质，此数值是37℃时正常对照值(1.1±0.3nmol/min/mg，n＝6)的约36％。
值得注意的是，该患者的CPT II对热非常不稳定，41℃保温120分钟后比活性降低至约50％，而对照CPT II在同样检测条件下，只降低到91.4％(图2)。为了分析该患者CPT II对热不稳定的病因，本发明的发明人分析了与该21号患者和其家族成员的基因型。CPT II基因序列分析表明患者具有杂合子多态性，即F352C和V3681两个位点的置换，但未检测到其它报道的CPT II突变。F352C多态性突变只在日本人中发现，迄今为止在白人中没有报道过。而V3681变异型则在两个人种中都有发现，但在CPT II的缺失症方面，认为只不过可能有比较和缓的害处。21号患者及其姐姐，都有F352C和V3681两个位点发生置换的杂合子，其父亲是F352C和V3681发生置换的纯合子，其母亲只有V3681位点发生置换的杂合子，而其兄F352C为杂合子而V3681位点则是纯合子。在家族和亲属中没有鉴定出CPT II的其它置换。曾经报道过的M647V置换突变也在几位IAE患者中发现，但未观察到IAE患者和健康志愿者之间的出现频率有显著差异。比较IAE患者和健康志愿者之间的CPT II的单体型的频率(表3的1-9型)，9型与F352C、V3681和M647V的组合匹配，其与21号患者的基因型相同，并且其在患者中的频率比健康志愿者的显著增高(p＜0.025)。由于被分析的患者人数有限，迄今在其它IAE患者中未见比健康志愿者显著增高频率的其他单倍体(表D)。
[表17]
表D IAE患者和健康志愿者中CPT II的单倍体及其频率
  单体型   患者   健康志愿者   P
  编号   频率(％)   编号   频率(％)
  1型(F/F-V/V-M/M)   0   0   11   13.9
  2型(F/F-I/I-V/V)   0   0   1   1.2
  3型(F/F-V/I-M/V)   1   7.7   3   3.8
  4型(F/F-I/I-M/V)   1   7.7   1   1.2
  5型(F/F-I/I-M/M)   3   23.1   25   31.6
  6型(F/F-V/I-M/M)   2   15.4   27   34.2
  7型(C/C-I/I-M/M)   1   7,7   5   6.3
  8型(F/C-I/I-M/M )   1   7.7   0   0
  9型(F/C-V/I-M/M)   4   30.8   6   7.6   ＜0.025
  总数   13   79
WT和突变型CPT II cDNA的体外表达，是在COS-7细胞中过量表达4种cDNA(图3)：含有WT CPTII的pCMV-6-WT(FVM-CPT II)；含有F352C多态性的pCMV-6-MA(CVM-CPT II)；含有V3621多态性的pCMV-6-M(FIM-CPT II)；和含有F352C+V3621352C多态性的pCMV-6-MA+B(CIM-CPT II)。载体的本身的CPT II的比活性为0.27±0.03nmol/min/mg蛋白质，n＝6)，这和内源性酶活性一致，以下所示数据，都是减除了载体本身的CPT II的比活性的数据。过量表达pCMV-6-WT的COS-7细胞中的CPT II的比活性是0.46±0.07nmol/min/mg蛋白质，n＝5)。在37℃下从CVM-CPTII，FIM-CPTII和CIM-CPTII的CPTII活性分别是WT FVM-CPT II活性的62.8±7.2％、102.5±19.6％和34.7±1.3％(图3)。由于氨基酸的置换造成蛋白质构型改变从而可能会影响热稳定性，本发明的发明人分析了代表39℃以上温度的41℃热胁迫条件下的CPT II活性。WT FVM-CPT II的活性在41℃保温120分钟后，只降低到91％、FIM-、CVM-和CIM-CPT II在41℃的比活性与37℃下的活性相比，各自减少为91％、48％和72％。在这些突变体中，CIM-CPT II和CVM-CPT II二者的酶活性，都降低为WT FVM-CPT II活性的约25-30％。
在这个实验中，对41℃下酶活性降低进行了研究，由于39℃或以上的任何温度(39℃、40℃、42℃等)下，酶活性都同样显著降低，因此可以用来诊断热不稳定性症。
这些结果都来自CPT II置换的纯合子，这些数据支持了图2所示21号患者在41℃时所出现的CPT II活性降低的事实。
讨论
脑炎和脑病是各种小儿疾病出现的症状之一。据报道，IAE就是流感并发症其中一种，特别是在日本儿童中，曾报告有高频率出现。本发明中，发明者发现，有41.2％的IAE患者在高热抽搐期间血清酰基肉碱的比值增加[超过(C16:0+C18:1)/C2临界值的上限0.048]，比值超过0.09的高风险患者中有57％死亡或严重后遗症等临床结果。这个比值是长链脂肪酸代谢障碍的指标，在日本显示这种症状的最一般的疾病是先天性代谢异常的CPT II缺失症，其出现频率约为人口的十万分之几，是一种极罕见的疾病。应该特别强调的是，在被诊断为IAE的患者中，酰基肉碱比值异常的捡出率为41.2％。在被研究的人群中，非CPT II而导致死亡的疾病还有GA2，但患这种疾病时，患者线粒体的电子传递发生障碍，而患者的酰基肉碱比值并未超过0.048。从这些结果可看到，导致死亡(4名患者)和重度后遗症(1名患者)的所有严重IAE患者都存在例如CPT II异常和GA2的线粒体能量代谢障碍。值得注意的是因高热而增高的酰基肉碱比值，在所有跟踪调查的患者中，随着体温恢复正常而显著降低，这说明热不稳定性表型症是可逆的。这些发现说明在连续高热并经常伴有呕吐和禁食，特别是存在能量代谢酶缺失或热不稳定性多态性的患者中，可能造成全身性的能量危机。
日本人中存在CPT II缺失症和GA2的，在白人中有MCAD缺失症之类的先天性线粒体脂肪酸β氧化异常的儿童，并没有严重急性脑病和多种器官功能衰竭(雷氏综合症)的病症。然而有这些先天异常的儿童一旦感染了流感，成为重症乃至死亡的可能性特别高。迄今在本专利申请数据来自这样的IAE患者，他们即使具有增高的酰基肉碱比值，也不是缺失这些酶缺乏症，而是由于多种热不稳定性多态性或多个CPT II热不稳定多态性叠加的情形。这些多态性协同降低酶活性。所有这些IAE患者都未遭遇过明显的意外事件，因此，在新生儿时期由于无症状而无法检测。由于在感染同时服用阿司匹林而引起的雷氏综合症患者，如果存在线粒体脂肪酸β氧化有关酶的类似遗传背景，也有可能发病，但在肝脏进行的病理学检验，发现伴随发生的脂肪变性比在IAE患者中见到的更强。
本发明的发明者，发现使CPT II热不稳定性F352C多态性和特定的轻微有害的V3681多态性进行组合，将在高热期协同诱发CPT II的功能缺损，由于了解到这个现象，因而建议把这些多态性作为易诱导IAE的突变型。F352C突变体迄今只在日本人中有报告，V3681和M647V则是日本人和白人两者中的CPT II缺失症患者的基因多态性以及在无症状儿童中有报告。然而，CPT II不是β氧化代谢途径的限速酶，CPT II活性超过对照30％时，脂肪酸的β氧化在正常范围内，并不出现异常症状。不过，在39℃或以上，例如41℃的热胁迫条件下，21号患者的CPT II活性和被转化的CIM-及CVM-CPT II的活性则不到WT-CPT II活性的30％，推测这是由于脂肪酸β氧化发生了障碍。关于F352C、V3681和M647V等类CPT II的多态性，在IAE患者和健康志愿者中进行了观察，如表3所示，发现在27个预期的杂合型中有9个杂合型。其中，在IAE患者中，9型(F/C-V/I-M/M)的频率比健康人群频率显著增高。在图3中，CMI-CPT II(7型，C/C-I/I-M/M)显示最低的活性，然而，在IAE患者和健康志愿者之间7型频率的差异还不是显著的，看来这可能是由于被分析IAE患者的数量太少。这些发现，并没有否认在热不稳定性多态性和/或/热不稳定性表型症的病因方面，有参与能量代谢的其它酶的缺乏症或温和的变异潜在参与。虽然还不清楚存在线粒体β氧化障碍的IAE患者中所见脑病和急性脑水肿的分子机制，但线粒体β氧化先天或后天异常的小鼠的脑毛细血管中积聚着微纤溶酶(miniplasmin)，感染流感后，血脑屏障由于微纤溶酶等蛋白酶的作用而遭到破坏，有可能证明这是一个有关的病因。
考虑到具有热不稳定性多态性的IAE患者的能量代谢异常，为了增加柠檬酸循环的速度，可以施用能活化长链脂肪酸氧化的L-肉碱和葡萄糖等药物，为了防止高热诱发的酶失活还可采用降低体温的治疗方法，在热不稳定性表型症的病例中，这些措施也许能证明是有效的。
工业实用性
1鉴定作为发病因素的易感疾病基因，得以确诊迄今原因不明的伴随高热而发生的脑水肿活多种器官功能衰竭的疾病。
2根据对作为发病因素的易感疾病基因的鉴定，使开发治疗方法成为可能。
再者，通过检测是否具有SNP来判断是否有发生热不稳定性表型症的高风险，可认为是一种可行的技术。

Claims (10)

1.诊断包括流感脑炎/脑病、雷氏综合症、RS病毒感染症、腺病毒感染症、鼻病毒感染症、风疹、乙型脑炎、疟疾、川崎病和婴幼儿猝死综合症等疾病的或因这些疾病引起的热不稳定性表型症风险的方法，其特征是检测涉及线粒体中参与能量代谢的各种转运体、肉碱循环、长链β氧化循环、中链/短链β氧化循环、电子传递、酮体合成和ATP产生等过程中至少一种酶的活性，如果以37℃时酶活性为100％，检测39℃以上的温度时与健康人相比是否显著降低。
2.权利要求1所述的方法，上述热不稳定性表型症为流感脑炎/脑病。
3.权利要求1所述的方法，其特征是，通过检测选自编码上述酶的基因的SNP、插入和缺失的多态性，从而预测39℃以上时上述酶活性较之37℃时活性降低的程度。
4.权利要求1所述的方法，其中参与线粒体中能量代谢的各种转运体、肉碱循环、长链β氧化循环、中链/短链β氧化循环、电子传递、酮体合成和ATP产生等任一过程的酶，是下表中所示之至少一种酶：
(表1)   酶的名称   转运体   三羧酸转运蛋白(TCT)   电位依赖性阴离子通道(VDAC)   腺苷酸转运体(ANT)   肉碱转运体(CRNT；OCTN2；SLC22A5)   脂肪酸质膜转运体(LCFAT)   肉碱循环   酰基辅酶A合成酶(ACS)   肉碱棕榈酰基转移酶1，肝型(CPTLA；CPT1)
  肉碱棕榈酰基转移酶1，肌肉型(CPT1b；CPT1B)   肉碱棕榈酰基转移酶2(CPT2)   肉碱/酰基肉碱移位酶(CACT1；SLC25A20)   极长链酰基辅酶A脱氢酶(VLCAD)   长链β氧化循环   TFP线粒体三功能蛋白α亚基(TFPα：HADHA)   TFP线粒体三功能蛋白β亚基(TFPβ：HADHB)   长链酰基辅酶A脱氢酶(LCAD)   中链短链氧化循环   中链酰基辅酶A脱氢酶(MCAD)   中链酰基辅酶A硫解酶(MCKAT)   短链酰基辅酶A脱氢酶(SCAD)   短链烯酰辅酶A水合酶(SCEH)   短链羟基酰基辅酶A脱氢酶(SCHAD)   短链酰基辅酶A硫解酶(SCKAT)   电子传递   电子传递体黄素蛋白α亚基(ETFA   电子传递体黄素蛋白β亚基(ETFB   电子传递体黄素蛋白脱氢酶(ETFDH)   NADH-泛醌还原酶复合体，复合体I(ComplexI)   琥珀酸-泛醌还原酶复合体，复合体II(ComplexII)   泛醌-细胞色素C还原酶，复合体III(ComplexIII)   细胞色素C氧化酶，复合体IV(Complex IV)   ATP产生   ATP合酶   解偶联蛋白(UCP)   酮体合成   羟甲基戊二酰辅酶A合成酶1、2(HMGCS1或2；HMGS1或2)   羟甲基戊二酰辅酶A连接酶(HMGCL；HMGL)
。
5.权利要求4所述的方法，上述酶是选自CPT II、ETFA、ETFB、ETFDH、HADHB、HMGCS、VLCAD、LCAD和HADHA中的至少一种。
6.权利要求1所述的方法，其特征是检测与CPT II、ETFA、ETFB、ETFDH、HADHB、HMGCS、VLCAD、LCAD和HADHA有关的以下22个位点中1个或2个以上位点的基因，或与其有连锁不平衡关系的基因的单核苷酸多态性，并利用2个以上基因多态性或单倍体的组合
(表2)     酶的名称     SNP位点     CPT2     (外显子4)  1055     CPT2     (外显子4)  1102     ETFA     (内含子10) +642     ETFB     (外显子1)  -320     ETFB     (外显子3)  -113     ETFB     (外显子8)  447     ETFB     (外显子8)  461     HADHA     (外显子6)  474     HADHA     (内含子6)  +26     HADHA     (内含子6)  +32     HADHA     (外显子18) 2519     HADHA     (外显子I8) 2619     HADHB     (外显子2)  4     HADHB     (内含子12) -14     HADHB     (内含子14) +4     HADHB     (内含子14) -26     HADHB     (外显子17) 1607     HMGCS     (内含子8)  -37     HMGCS     (内含子8)  +53     VLCAD     (内含子8)  +33     LCAD     (外显子9)  997     ETFDH     (外显子13) 1989
。
7.权利要求1所述的方法，以是否具备下述(1)～(8)中任一种SNP之组合为标准，诊断热不稳定性表型症的风险
(表3)     组合     酶     多态性位点(碱基编号)     基因型     风险     (1)     ETFB     447     C/T     大     CPT2     1102     G/A     (2)     ETFA     +642     C/C     大     ETFB     -113     G/T     (3)     ETFA     +642     C/C     大     CPT2     1055     G/G或G/T     (4)     HADHB     4     -/ACT或ACT/ACT     大     HMGCS     -37     C/T或T/T     (5)     VLCAD     +33     T/G或G/G     大     LCAD     997     A/A     (6)     CPT2     1055     T/G或G/G     大     CPT2     1102     G/A或A/A     (7)     HADHB     4     -/ACT或ACT/ACT     大     ETFDH     1989     G/T     (8)     LCAD     997     A/C或C/C     小     HADHA     2619     G/G     HMGCS     +53     T/T
。
8.权利要求1～7任何一项所述的方法，单核苷酸多态性(SNP)检测的方法选自核苷酸碱基序列直接测定法、等位基因特异寡核苷酸(ASO)斑点印迹分析、单碱基引物延长法、PCR-单链构象多态(SSCP)分析、PCR-限制酶切片段长度多态性(RFLP)分析、侵入物检测法、定量实时PCR检测法和采用质谱分析仪的单核苷酸多态性检测方法等中的至少一种方法。
9.权利要求3所述的方法，其特征是通过使用其上已经固定至少一种对应的探针的固相载体测定选自编码上述酶的基因的SNP、插入和缺失的所述多态性。
10.用于诊断热不稳定性表型症风险的试剂盒，该试剂盒含有检测参与线粒体脂肪酸β氧化代谢系统的酶的1个多态性或2个以上特定多态性组合的引物、探针、dNTP混合物、逆转录酶、DNA聚合酶和缓冲液。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108152497A (zh) * 2017-11-29 2018-06-12 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司 一种人的atp合酶突变蛋白及其应用

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