EA031203B1 - Гуманизированные антитела к il-25 - Google Patents

Гуманизированные антитела к il-25 Download PDF

Info

Publication number
EA031203B1
EA031203B1 EA201290977A EA201290977A EA031203B1 EA 031203 B1 EA031203 B1 EA 031203B1 EA 201290977 A EA201290977 A EA 201290977A EA 201290977 A EA201290977 A EA 201290977A EA 031203 B1 EA031203 B1 EA 031203B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
antibody
amino acid
sequence
ser
Prior art date
Application number
EA201290977A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201290977A1 (ru
Inventor
Хуан Карлос Альмагро
Патрик Брейниган
Коллин Кейн
Уилльям Строл
Сузанн Таудте
Марк Торнетта
Джон Уилер
Original Assignee
Янссен Байотек Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Янссен Байотек Инк. filed Critical Янссен Байотек Инк.
Publication of EA201290977A1 publication Critical patent/EA201290977A1/ru
Publication of EA031203B1 publication Critical patent/EA031203B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к выделенному антителу, которое связывается с IL-25, композиции для лечения воспалительных заболеваний или состояний, содержащей терапевтически эффективное количество вышеуказанное выделенного антитела и фармацевтически приемлемый носитель, выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую вышеуказанное выделенное антитело, вектору экспрессии, содержащему вышеуказанную нуклеиновую кислоту, клетке-хозяину для экспрессии вышеуказанной выделенной нуклеиновой кислоты, содержащей вышеуказанный вектор экспрессии, применению вышеуказанного выделенного антитела при лечении или для профилактики астмы и применению вышеуказанного выделенного антитела при лечении или для профилактики воспалительного заболевания кишечника.

Description

Изобретение относится к выделенному антителу, которое связывается с IL-25, композиции для лечения воспалительных заболеваний или состояний, содержащей терапевтически эффективное количество вышеуказанное выделенного антитела и фармацевтически приемлемый носитель, выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую вышеуказанное выделенное антитело, вектору экспрессии, содержащему вышеуказанную нуклеиновую кислоту, клетке-хозяину для экспрессии вышеуказанной выделенной нуклеиновой кислоты, содержащей вышеуказанный вектор экспрессии, применению вышеуказанного выделенного антитела при лечении или для профилактики астмы и применению вышеуказанного выделенного антитела при лечении или для профилактики воспалительного заболевания кишечника.
Предпосылки создания изобретения
Интерлейкин-25 (IL-25), также известный как IL-17E, относится к группе цитокинов IL-17 и секретируется лимфоцитами - Т-хелперами второго типа (Th2), а также тучными клетками. IL-25 индуцирует выработку других цитокинов, включая цитокины IL-4, IL-5 и IL-13, в различных тканях и стимулирует увеличение численности эозинофилов.
Отмечено участие цитокина IL-25 в хронических воспалительных процессах желудочно-кишечного тракта, а ген IL-25 располагается в хромосомной области, ассоциируемой с развитием аутоиммунных заболеваний кишечника, например с воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК). Общепринятая терапия ВЗК основывается на приеме антибиотиков либо стероидных препаратов, тем не менее, данная стратегия не приводит к клинической ремиссии у пациентов.
Повышенная экспрессия IL-25 отмечена в образцах, полученных от пациентов, страдающих астмой - заболеванием, которому по оценкам подвержены более 300 миллионов человек во всем мире, что позволяет предполагать, что повышенная экспрессия данного цитокина имеет отношение к патофизиологии астмы и других сходных заболеваний.
Таким образом, существует необходимость получения эффективных антагонистов IL-25, которые могут найти применение при лечении заболеваний и состояний, характеризуемых повышенной экспрессией IL-25, включая такие заболевания, как астма и воспалительное заболевание кишечника.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к связывающимся с мишенью агентам, включая антитела и их связывающие фрагменты, направленным на взаимодействие с интерлейкином 25 (IL-25).
Настоящее изобретение дополнительно относится к разновидностям RH2.5_R71V, которое представляет собой гуманизированный (CDR-привитый) вариант мышиного антитела 2C3, также называемого в настоящем документе huDDG91 и М9. Одна из указанных разновидностей называется в настоящем документе M6 антитело, или просто M6. M6 проявляет целый ряд полезных свойств как in vitro, так и in vivo, включая, например, повышенную аффинность связывания с IL-25 по сравнению с исходным антителом huDDG91, повышенную способность ингибировать рецептор IL-25 в клеточных и рецепторных тестовых системах по сравнению с исходным антителом huDDG91, а также другие характеристики, такие как высокий уровень экспрессии, высокая растворимость, отсутствие сколько-нибудь значимой агрегации белков при очистке, отсутствие нежелательных посттрансляционных модификаций, белокбелковых взаимодействий и окисления при очистке.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающемуся с мишенью агенту, который связывается с IL-25, причем связывающийся с мишенью агент связывается с одной или более аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из аминокислотных остатков 46-63 последовательности SEQ ID NO:17, аминокислотных остатков 66-84 последовательности SEQ ID NO:17 и аминокислотных остатков 129-135 последовательности SEQ ID NO:17. В одном конкретном варианте осуществления предложенный в настоящем изобретении связывающийся с мишенью агент может связываться с аминокислотными остатками 56-63 последовательности SEQ ID NO:17 и аминокислотными остатками 66-74 последовательности SEQ ID NO: 17. В другом варианте осуществления связывающийся с мишенью агент содержит домен VL антитела, включающий в себя участок CDR3, который, в свою очередь, содержит аминокислотную последовательность QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8).
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающемуся с мишенью агенту, который связывается с IL-25, причем связывающийся с мишенью агент содержит:
a) домен VL антитела, содержащий участок CDR1, включающий аминокислотную последовательность SASQGISNYLN (SEQ ID NO:6), участок CDR2, включающий аминокислотную последовательность YTSSLHS (SEQ ID NO:7), и участок CDR3, включающий аминокислотную последовательность QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8); и
b) домен VH антитела, содержащий участок CDR1, включающий аминокислотную последовательность GYTMN (SEQ ID NO:10), участок CDR2, включающий аминокислотную последовательность LINPYNGGTSYNQNFKG (SEQ ID NO:11), и участок CDR3, включающий аминокислотную последовательность EDYDGYLYFAMDY (SEQ ID NO:12).
В одном конкретном варианте осуществления связывающийся с мишенью агент содержит домен VL, содержащий последовательность SEQ ID NO:5, и домен VH, содержащий последовательность SEQ ID NO:9. В дополнительном варианте осуществления связывающийся с мишенью агент целиком содержит антитело.
В различных вариантах осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую предложенный в настоящем изобретении связывающийся с мишенью агент, к содержащему указанную нуклеотидную последовательность вектору экспрессии и к несущей такие векторы экспрессии клетке-хозяину.
В дальнейшем варианте осуществления настоящее изобретение представляет композиции, содержащие предложенный в настоящем изобретении связывающийся с мишенью агент и фармацевтически приемлемый носитель.
В дальнейшем варианте осуществления в настоящем изобретении описано использование предло
- 1 031203 женных в настоящем изобретении связывающихся с мишенью агентов, например, в форме фармацевтической композиции, для лечения заболеваний или состояний, включая воспалительные состояния, такие как астма (включая аллергическую астму), а также воспалительное заболевание кишечника (например, болезнь Крона и язвенный колит).
В другом варианте осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к предложенному в настоящем изобретении связывающемуся с мишенью агенту, содержащему:
a) домен VL антитела, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую от 1 до приблизительно 20 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:5;
b) домен VH антитела, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую от 1 до приблизительно 20 аминокислотных замен по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:9; или
c) их комбинацию.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение предлагает способ выработки представленного в настоящем изобретении связывающегося с мишенью агента, содержащий:
a) обеспечение исходного набора кодирующих домен VL нуклеиновых кислот, причем нуклеиновые кислоты либо включают в себя подлежащий замене участок, кодирующий участок CDR3, либо не содержат участок, кодирующий участок CDR3;
b) объединение исходного набора с нуклеиновой кислотой донора, кодирующей участок CDR3 домена VL и имеющей аминокислотную последовательность QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8), причем нуклеиновая кислота донора встраивается в одну или более нуклеиновых кислот исходного набора для получения набора продуктов нуклеиновых кислот, кодирующих домен VL, содержащих участок CDR3 домена, имеющий аминокислотную последовательность QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8);
c) экспрессию нуклеиновых кислот набора продуктов для предоставления связывающихся с мишенью агентов;
d) отбор связывающегося с мишенью агента, который специфически связывается с одной или более последовательностями, выбранными из группы, состоящей из аминокислотных остатков 56-63 последовательности SEQ ID NO: 17, аминокислотных остатков 66-74 последовательности SEQ ID NO: 17 и аминокислотных остатков 129-135 последовательности SEQ ID NO:17; и
e) выделение связывающегося с мишенью агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающийся с мишенью агент.
Краткое описание чертежей
Патент или комплект материалов заявки содержит по меньшей мере один цветной рисунок. Копии данного патента или публикации заявки на патент с цветным рисунком (рисунками) можно получить при подаче соответствующей заявки и внесении оплаты.
На фиг. 1 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) легкой цепи каппа антитела huDDG91/RH2.5_R71V. Подчеркнутые участки в аминокислотной последовательности соответствуют участкам CDR. Лидерная последовательность не включена.
На фиг. 2 показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:3) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4) тяжелой цепи антитела huDDG91/RH2.5_R71V. Подчеркнутые участки в аминокислотной последовательности соответствуют участкам CDR. Лидерная последовательность не включена.
В приведенной на фиг. 3 таблице представлены свойства 9 потенциальных моноклональных антител, включая M6, идентифицированных при скрининге 25-членной комбинаторной библиотеки, построенной на основе антитела huDDG91/RH2.5_R71V. Курсивом выделены числа, полученные из другого набора данных. R71V G1 относится к антителу huDDG91. Два ряда R71V G1 представляют собой измерения из двух разных наборов данных. Остатки с повышенной гидрофобностью выделены желтым цветом.
На фиг. 4А показаны аминокислотные последовательности легкой цепи антитела M6 (SEQ ID NO:5) и ее участки CDR (SEQ ID NOS:6-8). Подчеркнутые участки в аминокислотной последовательности указывают расположение участков CDR. Лидерная последовательность не включена. Выделенные красным жирным шрифтом аминокислотные остатки обозначают аминокислотные замены по отношению к исходной последовательности huDDG91/RH2.5_R71V.
На фиг. 4В показаны аминокислотные последовательности тяжелой цепи антитела M6 (SEQ ID NO:9) и ее участки CDR (SEQ ID NO:10-12). Подчеркнутые участки в аминокислотной последовательности указывают расположение участков CDR. Лидерная последовательность не включена.
На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий, что антитела M6 подавляют IL-4/IL25зависимую продукцию IL-5 в наивных Т-клетках CD4+ человека, предварительно стимулированных в течение 4 дней аутогенными дендритными клетками в присутствии rhIL-4 и rhIL-25, в большей степени, чем антитело huDDG91 (M9). В качестве контроля использовали антитело к изотипу IgG1 (iso), n=4 донора.
- 2 031203
На фиг. 6А и 6В представлены графики, показывающие увеличение подавления IL-25-зависимой продукции GROa антителом M6 по отношению к антителу huDDG91 (M9) в клетках LS174T, стимулированных рекомбинантным IL-25 человека в течение 24 ч. На графиках, представленных на фиг. 6А и 6В, показаны данные, полученные в двух разных экспериментах.
На фиг. 7А показана карта покрытия последовательности аминокислотных остатков 1-78 IL-25 человека (SEQ ID NO:13) при расщеплении пепсином в присутствии 2М мочевины, 1М ТСЕР, гашение при рН 3,0. Черной линией показан наблюдаемый пептид.
На фиг. 7В показана карта покрытия последовательности аминокислотных остатков 79-146 IL-25 человека (SEQ ID NO:14) при расщеплении пепсином в присутствии 2М мочевины, 1М ТСЕР, гашение при рН 3,0. Черной линией показан наблюдаемый пептид.
На фиг. 8А и 8В показаны различия в уровнях дейтерирования различных сегментов белка IL-25 человека (SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16) при связывании с антителом M6 в экспериментах по H/Dобмену. Каждый блок соответствует пептиду IL-25 человека и содержит данные для шести временных интервалов: 150 и 500 с при рН 6, а также 150, 500, 1500 и 5000 с при рН 7. Темно-синий цвет указывает на отсутствие защиты при связывании с антителом M6. Другие цвета указывают на большее содержание дейтерия после обмена ассоциация-в-растворе/диссоциация-в-колонке, чем после обмена ассоциация-вколонке/диссоциация-в-колонке, как показано в правой вставке. Дейтерий, присоединенный к одному из двух первых аминокислотных остатков каждого иона, теряется в процессе анализа (расщепление/разделение/масс-спектрометрический анализ в водной среде), что является причиной небольших пропусков в распределении H/D-обменов.
На фиг. 9A-9F представлены графики, показывающие содержание дейтерия в различных сегментах IL-25 человека после обмена при ассоциации/диссоциации при рН 6 и рН 7 при 3°С в колонке, содержащей антитело M6. Синим цветом показан обмен типа ассоциация-в-растворе/диссоциация-в-колонке, темно-красным цветом показан обмен типа ассоциация-в-колонке/диссоциация-в-колонке. Все промежутки времени обмена переведены в эквивалентное время обмена при рН 7 и 23°С (например, 150 с при рН 6 и 3°С равно 1,85 с при рН 7 и 23°С). Представляемые в каждом сегменте остатки IL-25 человека указаны в верхней части каждого графика.
На фиг. 10 представлена аминокислотная последовательность IL-25 человека (SEQ ID NO:17).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение касается выделенного антитела, которое связывается с IL-25, содержащее домен вариабельной области легкой цепи (VL), содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SASQGISNYLN (SEQ ID NO:6), CDR2, имеющий аминокислотную последовательность YTSSLHS (SEQ ID NO:7), и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8), и домен вариабельной области тяжелой цепи (VH), содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность GYTMN (SEQ ID NO:10), CDR2, имеющий аминокислотную последовательность LINPYNGGTSYNQNFKG (SEQ ID NO:11), и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность EDYDGYLYFAMDY (SEQ ID NO:12).
Вариантом настоящего изобретения является выделенное антитело, где антитело связывает аминокислотные остатки 56-63 последовательности SEQ ID NO: 17 и аминокислотные остатки 66-74 последовательности SEQ ID NO:17.
Другим вариантом настоящего изобретения является, где антитело связывает одну или более аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из аминокислотных остатков 46-63 SEQ ID NO:17 или аминокислотных остатков 66-84 последовательности SEQ ID NO:17.
Вариантом настоящего изобретения также является антитело, содержащее домен VL легкой цепи с последовательностью последовательности SEQ ID NO:5.
Другим вариантом настоящего изобретения является антитело, содержащее домен VH тяжелой цепи с последовательностью последовательности SEQ ID NO:9.
Еще одним вариантом настоящего изобретения является антитело, содержащее константный участок антитела.
Вариантом настоящего изобретения является антитело, в котором константный участок антитела представляет собой константный участок IgG1 или константный участок IgG4.
Другим вариантом настоящего изобретения является антитело, содержащее легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO:5 и тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO:9.
Еще одним вариантом настоящего изобретения является антитело, содержащее фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из фрагмента антитела Fab, фрагмента антитела F(ab')2 и фрагмента антитела scFv.
Другим вариантом настоящего изобретения является антитело, где антитело имеет аффинность связывания с IL-25 человека, которая равна приблизительно 50 пМ или менее.
Другим вариантом настоящего изобретения является антитело, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.
Настоящее изобретение также касается композиции для лечения воспалительных заболеваний или состояний, содержащей терапевтически эффективное количество вышеуказанного выделенного антитела
- 3 031203 и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также касается выделенной нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеотидов, кодирующую вышеуказанное антитело.
Настоящее изобретение касается вектора экспрессии, содержащего вышеуказанную нуклеиновую кислоту, причем нуклеиновая кислота функционально связана с промотором.
Настоящим изобретением является клетка-хозяин для экспрессии вышеуказанной нуклеиновой кислоты, содержащая вышеуказанный вектор экспрессии.
Настоящее изобретение также касается применения вышеуказанного выделенного антитела при лечении или для профилактики астмы.
Настоящее изобретение также касается применения вышеуказанного выделенного антитела при лечении или для профилактики воспалительного заболевания кишечника.
Настоящее изобретение также касается применения вышеуказанного выделенного антитела при лечении или для профилактики язвенного колита или болезни Крона.
Настоящее изобретение основывается частично на идентификации высокоафинного антитела к IL25 человека,называемого в настоящем документе M6 (см. пример 1), а также на идентификации аминокислотных остатков в IL-25 человека, которые связываются с антителом M6, проводимой с помощью масс-спектрометрии водородно-дейтериевого (H/D) обмена (см. пример 3). Соответственно в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к связывающемуся с мишенью агенту, который связывается с IL-25, причем связывающийся с мишенью агент связывается с одной или более аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из аминокислотных остатков 46-63, 66-84 и 129-135 IL-25 человека (SEQ ID NO:17). Так связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут связываться с аминокислотными остатками 46-63 последовательности SEQ ID NO:17, аминокислотными остатками 66-84 последовательности SEQ ID NO: 17, аминокислотными остатками 129-135 последовательности SEQ ID NO:17 или любой их комбинацией. В одном варианте осуществления связывающиеся с мишенью агенты, представляющие предмет настоящего изобретения, связываются с аминокислотами 56-63 последовательности SEQ ID NO: 17 и аминокислотами 66-74 последовательности SEQ ID NO:17.
Используемый в настоящем документе термин связывающийся с мишенью агент относится к любому белку или пептиду, содержащему молекулу, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, которая включает в себя по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность, (CDR) тяжелой либо легкой цепей, или же ее связывающий лиганд фрагмент, который специфически связывается с белком IL-25 млекопитающего (в т. ч. человека), либо его фрагмент. Такие связывающиеся с мишенью агенты могут дополнительно включать в себя по меньшей мере часть вариабельного участка тяжелой или легкой цепи антитела, по меньшей мере часть константного участка тяжелой или легкой цепи антитела, по меньшей мере часть каркасного участка антитела или любую их комбинацию. Подобные связывающиеся с мишенью агенты модулируют, уменьшают, антагонируют, смягчают, снижают, блокируют, ингибируют, аннулируют и(или) интерферируют по меньшей мере для одной активности или связывания IL-25 или для активности или связывания рецептора IL-25, in vitro, in situ и(или) in vivo. В качестве неограничивающего примера должным образом выбранный связывающийся с мишенью агент, составляющий предмет настоящего изобретения, может с высокой аффинностью связываться с ингибирующим и(или) нейтрализующим эпитопом IL-25 человека, распознаваемым описываемым в настоящем документе антителом M6.
Связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, не ограничиваются агентами, которые связываются только с аминокислотными остатками 46-63, аминокислотными остатками 66-84 и(или) аминокислотными остатками 129-135 последовательности SEQ ID NO:17. Так в некоторых вариантах осуществления связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут дополнительно связываться с одним или более другими фрагментами IL-25 человека, которые не охватывают аминокислотные остатки 46-63, аминокислотные остатки 66-84 и(или) аминокислотные остатки 129-135 последовательности SEQ ID NO:17. В других случаях связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут дополнительно связываться с одним или более аминокислотными остатками IL-25 человека, фланкирующими аминокислотные остатки 46-63, аминокислотные остатки 66-84 и(или) аминокислотные остатки 129-135 последовательности SEQ ID NO:17.
В настоящем изобретении дополнительно предусматриваются связывающиеся с мишенью агенты, которые связываются с одним или более участками IL-25 человека, находящимися в пределах аминокислотных остатков 46-63, аминокислотных остатков 66-84 и(или) аминокислотных остатков 129-135 последовательности SEQ ID NO:17, таких как, например, участки IL-25, состоящие по меньшей мере из 5 аминокислот в пределах аминокислотных остатков 46-63, аминокислотных остатков 66-84 и(или) аминокислотных остатков 129-135 последовательности SEQ ID NO:17. Примеры участков IL-25, с которыми могут связываться связывающиеся с мишенью агенты, включают в себя аминокислоты 56-63 и(или) аминокислоты 66-74 последовательности SEQ ID NO:17.
Участок IL-25, или эпитоп, с которым связывается связывающийся с мишенью агент, составляю
- 4 031203 щий предмет настоящего изобретения, может быть определен с использованием любого из нескольких стандартных способов картирования эпитопов, хорошо известных специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. Подобные способы включают в себя, например, сайт-направленный мутагенез в сочетании с анализами связывания, картирование эпитопов с использованием пептидных пинов (см., например, Geysen et al., Peptides: Chemistry and Biological, Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium, с. 519-523, под ред. G.R. Marshall, Escom, Leiden, 1988), рентгенокристаллографию, а также способы водородно-дейтериевого (H/D) обмена (например, масс-спектрометрию H/D-обмена).
Согласно приведенному в данном документе описанию масс-спектрометрию H/D-обмена использовали для определения эпитопа(ов) в IL-25 человека, опознаваемом и связываемом антителом M6 (см. пример 3, а также фиг. 8 А, 8В и 9A-9F). При переносе из воды в содержащий дейтерий раствор (тяжелая вода) происходит увеличение массы белка, поскольку атомы водорода в белке постепенно замещаются дейтерием (более тяжелым изотопом водорода). Вероятность водородно-дейтериевого обмена в основном определяется структурой белка и доступностью для растворителя. Масс-спектрометрия H/D-обмена используется для измерения интенсивности обмена и, как следствие, структуры белка и доступности для растворителя. При связывании небольшой молекулы, или партнера по связыванию с белком, с белкоммишенью последний испытывает экспериментально наблюдаемые изменения интенсивности H/Dобмена. Участки поверхности, в которых растворитель вытесняется при формировании комплекса, H/Dобмен осуществляют значительно медленнее. Недоступные растворителю участки можно использовать для выяснения местонахождения сайта связывания. Например, в случае взаимодействия антигенантитело такие изменения указывают на местонахождение эпитопа.
Как правило, связывающийся с мишенью агент, составляющие предмет настоящего изобретения, содержит домен вариабельного участка легкой цепи (VL) антитела в паре с доменом вариабельного участка тяжелой цепи (VH) антитела, образующие домен связывания с IL-25. При создании описанного в настоящем документе изобретения было обнаружено, что аффинность связывания антитела huDDG91 может быть улучшена за счет замены участка, определяющего комплементарность, (CDR) в домене VL антитела huDDG91 (SEQ ID NO:1), а именно участка CDR3, на QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8). Соответственно описанное в настоящем документе изобретение предусматривает домены VL, содержащие SEQ ID NO:8, и связывающиеся с мишенью агенты, содержащие такие домены VL. В некоторых вариантах осуществления домены VL связывающихся с мишенью агентов, составляющих предмет настоящего изобретения, также содержат участки CDR1 (SASQGISNYLN (SEQ ID NO:6)) и CDR2 (YTSSLHS (SEQ ID NO:7)) антител M6 и huDDG91. Другие соответствующие участки VL CDR для включения в связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, включают в себя, помимо прочего, любые участки VL CDR1, показанные на фиг. 3. В одном варианте осуществления связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, содержат последовательность SEQ ID NO:5, а также домен VL антитела M6.
В некоторых вариантах осуществления связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, содержат домен VH, который содержит последовательности SEQ ID NO:10-12, соответствующие участкам CDR антител M6 и huDDG91. Другие соответствующие участки VH CDR для включения в связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, включают в себя, помимо прочего, любые участки VH CDR3, показанные на фиг. 3. В предпочтительном варианте осуществления связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, содержат последовательность SEQ ID NO:9, домен VH антител M6 и huDDG91. Домен VH может быть объединен в пару с рядом доменов VL, отличных от домена VL антитела M6 (SEQ ID NO:5). Предпочтительно домен VH объединен в пару с доменом VL, содержащим участок CDR3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.
Описанные в настоящем документе последовательности участков CDR антитела M6 могут быть модифицированы путем вставок, замен или делеций и могут быть включены в связывающийся с мишенью агент, составляющий предмет настоящего изобретения, таким образом, чтобы связывающийся с мишенью агент (например, антитело), имеющий модифицированный участок(и) CDR, сохранял способность связываться с IL-25 человека и ингибировать его. Специалист в данной области может удостовериться в сохранении указанной активности с помощью описанных в настоящем документе функциональных анализов. Участок CDR связывающегося с мишенью агента, составляющего предмет настоящего изобретения, может иметь, например, степень гомологии от приблизительно 50 до приблизительно 100%, предпочтительно степень гомологии от приблизительно 80 до приблизительно 100%, более предпочтительно степень гомологии от приблизительно 90 до приблизительно 100% с соответствующим участком CDR антитела M6, представленным последовательностями SEQ ID NO: 6, 7, 8, 10, 11 или 12. В одном варианте осуществления участок CDR связывающегося с мишенью агента, составляющего предмет настоящего изобретения, может иметь степень гомологии приблизительно 100% с соответствующим участком CDR антитела M6, представленным последовательностями SEQ ID NO: 6, 7, 8, 10, 11 или 12.
Связывающийся с мишенью агент в соответствии с настоящим изобретением может связываться с IL-25 с аффинностью, по существу, близкой к аффинности антитела M6, описанного в настоящем документе, или превышающей ее. Например, связывающийся с мишенью агент, составляющий предмет на
- 5 031203 стоящего изобретения, может проявлять аффинность связывания по отношению к IL-25 (например, по отношению к IL-25 человека) приблизительно 50 пМ (например, приблизительно 53 пМ) или менее, например приблизительно 45 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 35 пМ, приблизительно 30 пМ, приблизительно 25 пМ или приблизительно 20 пМ. Связывающийся с мишенью агент, как правило, специфичен к IL-25. Так связывающийся с мишенью агент не будет проявлять сколько-нибудь значимое связывание по отношению к молекулам, отличающимся от своего специфичного партнера(-ов) по связыванию. Например, было обнаружено, что описанное в настоящем документе антитело M6 не дает перекрестную реакцию с IL-17A, IL-17C, IL-17D или IL-17F. Устранение такой перекрестной реакции с другими цитокинами, причастными к развитию астмы и сходным процессам, является желательной характеристикой связывающихся с мишенью агентов в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения.
Аффинность, или авидность, связывающегося с мишенью агента и антигена может быть определена экспериментально любым соответствующим способом (см., например, Berzofsky et al., Antibody-Antigen Interactions, in Fundamental Immunology, под ред. Paul, W.E., Raven Press: г. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк (1984); Kuby, Janis, Immunology, W.H. Freeman and Company: г. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк (1992); а также способами, описанными в настоящем документе). Измеренная аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может варьироваться в зависимости от различных условий (например, концентрации солей, рН). Таким образом, измерение аффинности и других параметров связывания антигена (например, KD, Ka, Kd) предпочтительно производить с применением стандартизированных растворов антитела и антигена и стандартизированного буферного раствора, такого как буферный раствор, описанный в настоящем документе.
Например, специфичность может быть определена с помощью анализа связывания, такого как, среди прочих, ELISA с использованием стандартного набора антигенов, анализа Biacore и(или) анализа Octet. Связывающийся с мишенью агент в соответствии с настоящим изобретением может распознавать IL25, но не другие члены семейства IL-17, в частности любой из IL-ПА, IL-17B, IL-17C, IL-17D и IL-17F; в одном варианте осуществления не распознаются все пять указанных молекул. Связывание связывающегося с мишенью агента в соответствии с настоящим изобретением с IL-25 можно предотвратить за счет конкуренции с рекомбинантным IL-25.
Аффинность связывания и эффективность нейтрализации различных связывающихся с мишенью агентов можно сравнивать при соответствующих условиях.
Для определения того, какие белки, антитела и другие антагонисты конкурируют за связывание с IL-25 со связывающимся с мишенью агентом, составляющим предмет настоящего изобретения, и(или) совместно используют участок эпитопа, возможно проведение анализа конкурентного связывания связывающегося с мишенью агента (например, антитела), составляющего предмет настоящего изобретения. Эти анализы, хорошо известные специалистам в данной области, позволяют оценить конкуренцию между антагонистами или лигандами за ограниченное количество сайтов связывания белка, например IL-25. Белок и(или) антитело иммобилизуют или переводят в нерастворимую форму до или после конкурентного анализа, и часть образца, связавшегося с белком IL-25, отделяют от несвязавшейся части образца, например, путем декантирования (если белок/связывающийся с мишенью агент предварительно перевели в нерастворимую форму) или центрифугирования (если белок/антитело осадили после реакции конкурентного связывания). Кроме того, конкурентное связывание можно определить по тому, изменяется ли функционирование белка в результате связывания или отсутствия связывания связывающегося с мишенью агента с данным белком, например, молекула связывающегося с мишенью агента может ингибировать или стимулировать ферментативную активность, например, метки. Как хорошо известно специалистам, для этих целей можно также применять иммуноферментный анализ (ELISA) и другие функциональные анализы.
Антитела.
Связывающийся с мишенью агент, составляющий предмет настоящего изобретения, предпочтительно является молекулой антитела. В целях настоящего изобретения термин антитело охватывает цельные антитела, продукты их ферментативного расщепления, их конкретные фрагменты и варианты, включая миметики антител, или фрагменты антител, имитирующие структуру и(или) функцию антитела или его конкретного фрагмента или части, включая одноцепочечные антитела и их фрагменты; каждый из которых содержит по меньшей мере один участок CDR. Функциональные фрагменты включают в себя антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с IL-25 млекопитающего. Например, настоящее изобретение охватывает фрагменты антитела, способные связываться с IL-25 или его частями, включая, помимо прочего, фрагменты Fab (например, в результате расщепления папаином), Fab' (например, в результате расщепления пепсином и частичного восстановления) и F(ab')2 (например, в результате расщепления пепсином), facb (например, в результате расщепления плазмином), pFc' (например, в результате расщепления пепсином или плазмином), Fd (например, в результате расщепления пепсином, частичного восстановления и реагрегации), Fv или ScFv (например, при применении способов молекулярной биологии) (см., например, под ред. Colligan, et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., г. Нью-Йорк (1994, 2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, г. Нью
- 6 031203
Йорк, штат Нью-Йорк, (1997, 2001)).
Такие фрагменты могут быть получены путем ферментативного расщепления, синтетическими или рекомбинантными способами, как известно специалистам и(или) описано в настоящем документе. Антитела также могут быть получены в различных укороченных формах при помощи генов антител, в которых перед естественным стоп-сайтом введен один или более стоп-кодонов. Например, комбинационный ген, кодирующий участок тяжелой цепи F(ab')2, может быть подготовлен с возможностью включать в себя последовательность ДНК, кодирующую домен CH1 и(или) шарнирную область тяжелой цепи. Различные участки антител могут быть связаны химически при применении обычных способов или могут быть получены как единый непрерывный белок при применении способов генной инженерии.
Используемый в настоящем документе термин антитело также охватывает химерные антитела, гуманизированные или CDR-привитые антитела, включающие в себя любую комбинацию описанных в настоящем документе участков CDR M6 с одним или более белками или пептидами, полученными из немышиного, предпочтительно человеческого антитела. В соответствии с настоящим изобретением предлагается получение химерных или гуманизированных антител, в которых участки CDR получены из антитела M6. Так в одном варианте осуществления человеческая часть антитела может включать в себя участки, которые, по существу, не обладают иммуногенными свойствами у людей. Участки антител, полученные из человеческих антител, не обязательно должны быть на 100% идентичны человеческим антителам. В предпочтительном варианте осуществления сохраняется по возможности как можно большее число аминокислотных остатков для получения пренебрежимо малой иммуногенности, однако аминокислотные остатки человеческого антитела могут быть при необходимости модифицированы с целью обеспечения эффективности образованного участками CDR сайта связывания с антигеном при одновременной максимальной гуманизации антитела. Такие изменения или вариации необязательно и предпочтительно сохраняют или ослабляют иммуногенность у человека или других видов относительно немодифицированных антител. Гуманизированное антитело может быть выработано нечеловеческой животной, или прокариотической, или эукариотической клеткой, способной экспрессировать функционально перестроенные гены человеческих иммуноглобулинов (например, тяжелой цепи и(или) легкой цепи). Кроме того, если антитело представляет собой одноцепочечное антитело, оно может содержать связующий пептид, отсутствующий в нативных антителах человека. Например, Fv может содержать связующий пептид, такой как от двух до приблизительно восьми глицинов или других аминокислотных остатков, который соединяет вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи. Считается, что такие связующие пептиды имеют человеческое происхождение.
В альтернативном варианте осуществления весь вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи антитела M6, показанные на фиг. 4А и 4В (SEQ ID NO:5 и 9), могут быть объедены с человеческим константным и каркасным участками с получением связывающегося с мишенью агента, составляющего предмет настоящего изобретения.
Гены человека, кодирующие константные (С) участки связывающегося с мишенью агента, составляющего предмет настоящего изобретения, могут быть получены известными способами из генов генной библиотеки эмбриональной печени человека. Гены С-участков человека могут быть получены из генов любой клетки человека, включая клетки, экспрессирующие и вырабатывающие иммуноглобулины. СНучасток человека может быть получен из любого известного класса изотипов Н-цепи человека, включая гамма, мю, альфа, дельта, эпсилон, а также любые их подтипы, такие как G1, G2, G3 и G4. Поскольку изотип Н-цепи отвечает за различные эффекторные функции антитела, при выборе СН-участка следует ориентироваться на желаемые эффекторные функции, такие как связывание комплемента, или активность зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (ADCC). В одном варианте осуществления СНучасток получен из гамма 1 (IgG1).
CL-участок человека может быть получен из одного из изотипов L-цепи человека, каппа или лямбда, предпочтительнее каппа.
Гены, кодирующие С-участки иммуноглобулина человека, могут быть получены из клеток человека с помощью стандартных способов клонирования (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., Cold Spring Harbor Press, Колд-Спринг-Харбор, штат Нью-Йорк (1989) и под ред. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, 1993)). Гены, кодирующие С-участок человека, легко доступны из известных клонов, содержащих гены, представляющие указанные два класса L-цепи, пять классов Н-цепи, а также их подклассы. Фрагменты химерного антитела, такие как F(abi)2 и Fab, могут быть получены путем дизайна соответствующим образом укороченного гена химерной Нцепи. Например, химерный ген, кодирующий участок Н-цепи фрагмента F(ab1)2, включает в себя последовательности ДНК, кодирующие домен СН1 и шарнирный участок Н-цепи, со следующим за ними трансляционным стоп-кодоном для получения укороченной молекулы.
Как правило, в одном примере химерные антитела, фрагменты и участки, составляющие предмет настоящего изобретения, получают путем клонирования сегментов ДНК, кодирующих антигенсвязывающие участки Н- и L-цепей антитела M6, а также присоединения указанных сегментов ДНК к сегментам ДНК, кодирующим СН- и CL-участки соответственно с получением химерных генов, кодирующих иммуноглобулин.
- 7 031203
Так в одном варианте осуществления создан слитый химерный ген, который содержит первый сегмент ДНК, кодирующий, по меньшей мере, антигенсвязывающий участок не-человеческого происхождения, такой как функционально модифицированный V-участок с соединяющим (J) сегментом, связанный со вторым сегментом ДНК, кодирующим по меньшей мере часть С-участка человека.
Последовательность вариабельных участков антитела M6 может быть модифицирована с помощью вставок, замен и делеций, при этом связывающийся с мишенью агент должен сохранять свою способность связываться с IL-25 человека и ингибировать его.
Для удобства в настоящем документе мы придерживаемся схемы обозначений, предложенной Kabat et al. Остатки обозначаются строчными буквами или дефисами, так чтобы представленные последовательности соответствовали стандартной нумерации последовательности по Kabat.
В соответствии с настоящим изобретением в случае CDR-привитого или гуманизированного антитела, когда участок CDR антитела M6 объединен с человеческим участком, в участке FR могут быть сохранены остатки, специфические для исходного антитела, например M6. Также могут быть сохранены остатки, которые согласно имеющимся данным являются критичными для гуманизации других антител. Этих рекомендаций следует придерживаться в той степени, которая необходима для формирования образованного участками CDR сайта связывания при одновременной максимальной гуманизации антитела.
Также могут применяться и хорошо известные специалистам способы конструирования или гуманизации не-человеческих или человеческих антител. Как правило, гуманизированное или сконструированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков из источника не-человеческого происхождения, например, помимо прочего, мыши, крысы, кролика, низших приматов или других млекопитающих. Эти аминокислотные остатки для человека обычно называют импортированными остатками, они обычно берутся из импортированных вариабельных, константных или других доменов известной человеческой последовательности. Известные последовательности Ig человека раскрыты, например, в ряде открытых баз данных, таких как база данных NCBI Национального институт здравоохранения США, или в публикациях, например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Министерство здравоохранения США (1983).
Как известно специалистам, такие импортированные последовательности можно использовать для снижения иммуногенности или для снижения, усиления или модификации связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, периода полужизни или любой другой соответствующей характеристики. Как правило, часть или все последовательности участков CDR не-человеческого или человеческого происхождения могут сохраняться, а последовательности вариабельных и константных участков нечеловеческого происхождения заменяются человеческими или иными аминокислотами. Антитела могут также быть необязательно гуманизированы с сохранением высокой аффинности к своему антигену и иных благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели гуманизированные антитела могут быть необязательно получены в процессе анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов, используя трехмерные модели исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов доступны и хорошо известны специалистам в данной области. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных потенциальных последовательностей иммуноглобулинов. Изучение этих изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании потенциальной последовательности иммуноглобулина, то есть провести анализ остатков, которые влияют на способность потенциального иммуноглобулина к связыванию со своим антигеном. Таким образом, из общего типичного элемента структуры и импортированных последовательностей могут быть выбраны и объединены остатки каркасной области так, чтобы получить желаемую характеристику антитела, например повышенную аффинность к целевому антигену (антигенам). Как правило, остатки участка CDR непосредственно и в наибольшей степени вовлечены в антигенсвязывающее воздействие. Гуманизация или конструирование антител, составляющих предмет настоящего изобретения, могут быть выполнены любым известным способом, включая, помимо прочего, способы, описанные в работах (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), патентах США №№ 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, PCT/US 98/16280, US 96/18978, US 91/09630, US 91/05939, US 94/01234, GB 89/01334, GB 91/01134, GB 92/01755; WO 90/14443, WO 90/14424, WO 90/14430, ЕР 229246, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки, включая цитированные литературные источники.
Человеческий константный участок связывающегося с мишенью агента, составляющего предмет настоящего изобретения, может принадлежать любому классу (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD и т.д.) или изотипу и содержать легкую цепь каппа или лямбда. В одном варианте осуществления человеческий константный участок содержит тяжелую цепь IgG или определенный фрагмент, например по меньшей мере один из изотипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В другом варианте осуществления связывающийся с мишенью агент содержит тяжелую цепь IgG1 и легкую цепь IgG1 K. Выделенный связывающийся с мишенью
- 8 031203 агент, составляющий предмет настоящего изобретения, может содержать описанные в настоящем документе аминокислотные последовательности антитела, кодируемые любым соответствующим полинуклеотидом. Связывающийся с мишенью агент предпочтительно связывается с IL-25 человека и таким образом частично или по существу нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность белка. Связывающийся с мишенью агент, или его указанная часть или разновидность, частично или предпочтительно, по существу, нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность по меньшей мере одного белка IL-25 или фрагмента, ингибируя тем самым активности, опосредованные связыванием IL25 с рецептором IL-25 или иными IL-25-зависимыми или опосредованными механизмами. Использованный в настоящем документе термин нейтрализующее антитело обозначает антитело, которое может ингибировать IL-25-зависимую активность приблизительно на 20-100%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более в зависимости от типа используемого для определения активности анализа. Способность связывающегося с мишенью агента ингибировать IL-25-зависимую активность предпочтительно оценивается с помощью по меньшей мере одного соответствующего анализа с использованием белка или рецептора IL-25, как описано в настоящем документе и(или) как известно специалистам в данной области.
По меньшей мере одно антитело, составляющее предмет настоящего изобретения, связывается по меньшей мере с одним представленным в настоящем документе эпитопом, с которым связывается антитело M6. По меньшей мере один эпитоп может содержать по меньшей мере одну область связывания с антителом, которая содержит по меньшей мере один участок белка, причем данный эпитоп предпочтительно содержит по меньшей мере один внеклеточный, растворимый, гидрофильный внешний или цитоплазматический участок белка. Как правило, связывающийся с мишенью агент, составляющий предмет настоящего изобретения, содержит антигенсвязывающий участок, содержащий по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность, (CDR1, CDR2 и CDR3) последовательностей SEQ ID NOS. 10, 11 и 12 или варианта по меньшей мере одного вариабельного участка тяжелой цепи и по меньшей мере одного человеческого участка, определяющего комплементарность, (CDR1, CDR2 и CDR3) (SEQ ID NO. 6, 7 и 8) или варианта по меньшей мере одного вариабельного участка легкой цепи.
Связывающиеся с мишенью агенты, которые связываются с IL-25 человека и которые содержат определенный вариабельный участок тяжелой или легкой цепи или участки CDR, могут быть получены соответствующими способами, такими как фаговое отображение (Katsube, Y., et al., Int J. Mol. Med, 1(5):863 868 (1998)) или известные и(или) описанные в настоящем документе способы с применением трансгенных животных. Например, антитело, конкретный участок или вариант может быть экспрессировано в соответствующей клетке-хозяине с использованием кодирующей его нуклеиновой кислоты или ее участка.
Излагаемое изобретение также относится к антителам, антигенсвязывающим фрагментам, иммуноглобулиновым цепям и участкам CDR, содержащим аминокислоты в последовательности, по существу, идентичной аминокислотной последовательности антитела M6, описанной в настоящем документе. Подобные анти-ГЬ^З антитела могут включать в себя одну или более аминокислотных замен, делеций или вставок, являющихся результатом либо естественного мутационного процесса, либо результатом описанных в настоящем документе манипуляций. Предпочтительно подобные антитела или антигенсвязывающие фрагменты и антитела, содержащие такие цепи или участки CDR, могут связываться с человеческим IL-25 с высокой аффинностью (например, при KD приблизительно 10-9М или меньше). Аминокислотные последовательности, по существу, идентичные последовательностям, описанным в настоящем документе, включают в себя последовательности, содержащие консервативные замены аминокислот, а также аминокислотные делеции и(или) вставки. Консервативной заменой аминокислоты называется замена первой аминокислоты на вторую аминокислоту, физические и(или) химические свойства которой (например, заряд, структура, полярность, гидрофобность/гидрофильность) сходны со свойствами первой аминокислоты. К консервативным заменам относятся замена одной аминокислоты на другую в следующих группах: лизин (K), аргинин (R) и гистидин (Н); аспартат (D) и глутамат (Е); аспарагин (N), глутамин (Q), серин (S), треонин (Т), тирозин (Y), K, R, H, D и Е; аланин (А), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I), пролин (Р), фенилаланин (F), триптофан (W), метионин (М), цистеин (С) и глицин (G); F, W и Y; С, S и Т.
Количество замен аминокислот, которое может произвести квалифицированный специалист, зависит от многих факторов, включая описанные выше. Говоря в целом, количество замен, вставок и делеций аминокислот для любого данного анти-IL-25 антитела, фрагмента или варианта будет составлять не более 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1, например 1-30 или любой диапазон или значение в этих пределах, как указано в настоящем документе.
Аминокислоты в связывающемся с мишенью агенте, составляющем предмет настоящего изобретения, которые необходимы для его функционирования, могут быть идентифицированы известными специалистам способами, такими как сайт-направленный мутагенез или сканирующий аланином мутагенез (см., например, Ausubel, цитированный выше, главы 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:10811085 (1989)). В последней процедуре по каждому остатку молекулы вводят одиночные аланиновые мутации. Полученные мутантные молекулы затем тестируются на биологическую активность, включая, помимо
- 9 031203 прочего, по меньшей мере одну активность по нейтрализации IL-25. Критичные для связывания с антителом сайты также могут быть идентифицированы путем анализа структуры, например путем кристаллизации, ядерного магнитного резонанса или фотоафинного мечения (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899904 (1992) и de Vos, et al., Science 255:306312 (1992)).
Связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут без ограничений включать в себя по меньшей мере один участок, последовательность или комбинацию, выбираемую из диапазона от 5 до всех последовательных аминокислот, описываемых по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NOS:5-12.
Связывающийся с мишенью агент может необязательно дополнительно содержать полипептид из по меньшей мере одной из последовательности, включающей 70-100% последовательных аминокислот по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NOS: 5 или 9.
В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность иммуноглобулиновой цепи или ее участка (например, вариабельный участок, CDR) имеет степень идентичности приблизительно 70100% (например, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любой диапазон или значение в этих пределах) с аминокислотной последовательностью соответствующей цепи по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NOS: 5 или 9. Например, аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи можно сравнить с последовательностью SEQ ID NO:5, или аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи можно сравнить с последовательностью SEQ ID NO:9. Предпочтительно 70-100%-ную степень идентичности последовательности аминокислот (например, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% либо любой диапазон или значение в этих пределах) определяют с помощью соответствующего компьютерного алгоритма, как известно специалистам в данной области.
Примеры последовательностей вариабельных участков тяжелой и легкой цепей представлены в последовательностях SEQ ID NO:5 и 9. Связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, или их конкретные варианты, могут содержать любое количество последовательных остатков аминокислот из антитела, составляющего предмет настоящего изобретения, причем данное количество выбирается из группы целых чисел в диапазоне 10-100% от общего количества последовательных остатков в связывающемся с мишенью агенте. Длина данной подпоследовательности последовательных аминокислот необязательно составляет по меньшей мере приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 или более аминокислот, или любой диапазон или значение в этих пределах. Кроме того, количество таких подпоследовательностей может представлять собой любое целое число, выбираемое из группы, состоящей из от 1 до 20, например по меньшей мере 2, 3, 4 или 5.
Как определят специалисты, настоящее изобретение включает в себя по меньшей мере одно биологически активное антитело, составляющее предмет настоящего изобретения. Биологически активные антитела обладают специфической активностью, составляющей по меньшей мере 20, 30 или 40%, предпочтительно по меньшей мере 50, 60 или 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 90 или 95, 100% от активности природного (несинтетического), эндогенного или родственного ему и известного антитела. Способы качественного и количественного анализа ферментативной активности и субстратной специфичности хорошо известны специалистам в данной области.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к связывающимся с мишенью агентам, как описано в настоящем документе, которые модифицированы путем ковалентного присоединения органического фрагмента. Такая модификация позволяет создать антитело или антигенсвязывающий фрагмент с улучшенными фармакокинетическими свойствами (например, увеличенным временем полужизни in vivo в сыворотке). Органический фрагмент может представлять собой линейную или разветвленную гидрофильную полимерную группу, остаток жирной кислоты или эфира жирной кислоты. В конкретных вариантах осуществления гидрофильная полимерная группа может иметь молекулярную массу в диапазоне от приблизительно 800 до приблизительно 120000 Да и может представлять собой полиалкангликоль (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль (ИНГ)), углеводный полимер, аминокислотный полимер или поливинилпирролидон, а остаток жирной кислоты или эфира жирной кислоты может содержать от приблизительно 8 до приблизительно 40 атомов углерода.
Модифицированные связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут содержать один или более органических фрагментов, непосредственно или косвенно ковалентно связанных с антителом. Каждый органический фрагмент, связанный с антителом или с антигенсвязывающим фрагментом, составляющими предмет настоящего изобретения, может независимо представлять собой гидрофильную полимерную группу, остаток жирной кислоты или эфира жирной кислоты. Используемый в настоящем документе термин жирная кислота включает в себя одноосновные и двухосновные карбоновые кислоты. Используемый в настоящем документе термин гидрофильная полимерная группа обозначает органический полимер, имеющий более высокую растворимость в воде, чем в октане. Например, полилизин лучше растворяется в воде, чем в октане. Так антитело, модифицированное путем ковалентного присоединения полилизина, охватывается настоящим изобретением. Гидрофильные полимеры, допустимые для модификации антител, составляющих предмет настоящего изо
- 10 031203 бретения, могут быть линейными или разветвленными и включают в себя, например, полиалкангликоль (например, ПЭГ, монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ), 1ШГ и т.п.), углеводороды (например, декстран, целлюлозу, олигосахариды, полисахариды и т.п.), полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин, полиаспартат и т.п.), оксиды полиалканов (например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и т.п.) и поливинилпирролидон. Гидрофильный полимер, модифицирующий антитело, составляющее предмет настоящего изобретения, предпочтительно имеет молекулярную массу своего фрагмента в диапазоне от приблизительно 800 до приблизительно 150000 Да. Например, можно использовать ПЭГ5000 и ПЭГ20000, где нижний индекс означает средний молекулярный вес полимера в дальтонах. Гидрофильная полимерная группа может иметь от одного до приблизительно шести заместителей, выбираемых из алкилов, остатков жирных кислот или эфиров жирных кислот. Гидрофильные полимеры, имеющие в качестве заместителей остатки жирных кислот или эфиров жирных кислот, могут быть получены соответствующими способами. Например, полимер, содержащий аминогруппу, можно ввести в реакцию сочетания с карбоксилатом жирной кислоты или эфира жирной кислоты, а активированный карбоксилат (например, активированный Ν,Ν-карбонилдиимидазолом) жирной кислоты или эфира жирной кислоты может быть введен в реакцию сочетания с гидроксильной группой полимера.
Жирные кислоты и эфиры жирных кислот, допустимые для модификации антител, составляющих предмет настоящего изобретения, могут быть насыщенными или могут содержать одну или более ненасыщенных связей. Жирные кислоты, допустимые для модификации антител, составляющих предмет настоящего изобретения, например, включают в себя н-додеканоат (С12, лаурат), н-тетрадеканоат (С14, миристат), н-октадеканоат (С18, стеарат), н-эйкозаноат (С20, арахидат), н-докозаноат (С22, бегенат), нтриаконтаноат (C30), н-тетраконтаноат (С40), (цис)-ПЕЕТА9-октадеканоат (С18, олеат), полностью цисDELTA5, 8, 11, 14-эйкозатетраеноат (С20, арахидонат), октандикарбоновую кислоту, тетрадекандикарбоновую кислоту, октадекандикарбоновую кислоту, докозандикарбоновую кислоту и т. п. Соответствующие эфиры жирных кислот включают в себя моноэфиры дикарбоновых кислот, содержащие линейную или разветвленную группу низшего алкила. Группа низшего алкила может содержать от одного до приблизительно двенадцати, предпочтительно от одного до приблизительно шести атомов углерода.
Модифицированные связывающиеся с мишенью агенты могут быть получены соответствующими способами, например, путем взаимодействия с одним или более модифицирующими агентами. Используемый в настоящем документе термин модифицирующий агент обозначает соответствующую органическую группу (например, гидрофильный полимер, жирную кислоту, эфир жирной кислоты), содержащую активирующую группу. Активирующая группа представляет собой химический фрагмент или функциональную группу, способную в соответствующих условиях реагировать со второй химической группой с образованием ковалентной связи между модифицирующим агентом и второй химической группой. Например, активирующие для реакции с аминами группы включают в себя электрофильные группы, такие как тозилат, мезилат, галоген (хлор, бром, фтор, йод), N-гидроксисукцинимидиловые эфиры (NHS) и т.п. Активирующие группы, способные взаимодействовать с тиолами, включают в себя, например, малеинимид, йодацетил, акрилолил, пиридилдисульфиды, тиол 5-тиол-2-нитробензойной кислоты (TNB-тиол) и т.п. Альдегидная функциональная группа может связываться с амин- или гидразидсодержащими молекулами, а азидная группа может взаимодействовать с трехвалентной фосфогруппой с образованием фосфорамидатной или фосфоримидной связи. Соответствующие способы введения активирующих групп в молекулы хорошо известны специалистам (см., например, Hermanson G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: г. Сан-Диего, штат Калифорния (1996)). Активирующая группа может быть связана с органической группой (например, гидрофильным полимером, жирной кислотой, эфиром жирной кислоты) непосредственно или через соединительный фрагмент, например двухвалентную группу C1-C12, где один или более атомов углерода могут быть замещены гетероатомом, например атомом кислорода, азота или серы. Соответствующие соединительные фрагменты включают в себя, например, тетраэтиленгликоль, -(СН2)3-, -NH-(CH-2)6-NH-, -(CH2)2-NH- и -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-. Модифицирующие агенты, содержащие соединительный фрагмент, могут быть получены, например, путем взаимодействия моно-Вос-алкилдиамина (например, моно-Вос-этилендиамина, моно-Восдиаминогексана) с жирной кислотой в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) с образованием амидной связи между свободным амином и карбоксилатом жирной кислоты. Защитную группу Boc можно в последствии удалить из продукта путем обработки трифторуксусной кислотой (TFA) с открытием первичного амина, который может быть связан с другим карбоксилатом, как описано выше, или может реагировать с малеиновым ангидридом с замыканием полученного продукта в цикл и получением активированного малеинимидного производного жирной кислоты (см., например, Thompson, et al., WO 92/16221, содержание которого полностью включено в настоящий документ путем ссылки).
Модифицированные связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут быть получены путем взаимодействия человеческого антитела или антигенсвязывающего фрагмента с модифицирующим агентом. Например, органические фрагменты могут быть связаны с антителом сайт-неспецифичным образом при помощи реагирующего с амином модифицирующего агента, например N-гидроксисукцинимидилового (NHS) эфира ПЭГ. Модифицированные человеческие анти
- 11 031203 тела или антигенсвязывающие фрагменты также могут быть получены путем восстановления дисульфидных связей (например, внутрицепочечных дисульфидных связей) антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Восстановленное антитело или антигенсвязывающий фрагмент затем может вступать в реакцию с реагирующим с тиолом модифицирующим агентом с получением модифицированного антитела, составляющего предмет настоящего изобретения. Модифицированные человеческие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, содержащие органический фрагмент, связанный с конкретными сайтами антитела, составляющего предмет настоящего изобретения, могут быть получены соответствующими способами, такими как обратный протеолиз (Fisch et al, Bioconjugate Chem., 3:147 153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411 417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233 2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1):59 68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456 463 (1997)) и способы, описанные в работе Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques, Academic Press: г. Сан-Диего, штат Калифорния (1996).
Связывающиеся с мишенью агенты, которые могут найти применение в способах и композициях, составляющих предмет настоящего изобретения, характеризуются высокой аффинностью связывания с IL-25 и необязательно обладают низкой токсичностью. В частности, в целях настоящего изобретения можно использовать связывающийся с мишенью агент, составляющий предмет настоящего изобретения, в котором отдельные компоненты, такие как вариабельный участок, константный участок и каркас, по отдельности и(или) в совокупности, необязательно и предпочтительно обладают низкой иммуногенностью. Связывающиеся с мишенью агенты, которые могут применяться в целях настоящего изобретения, необязательно характеризуются своей способностью воздействовать на пациентов в течение продолжительного периода с заметным облегчением симптомов и низкой и(или) приемлемой токсичностью. Низкая или приемлемая иммуногенность и(или) высокая аффинность, а также другие соответствующие свойства, могут способствовать достижению терапевтических результатов. Под низкой иммуногенностью в настоящем документе понимается индуцирование существенных НАНА-, НАСА- или НАМАиммунных ответов менее чем у приблизительно 75%, или предпочтительно менее чем у приблизительно 50% проходящих лечение пациентов, и(или) индуцирование низких титров в процессе лечения (менее чем приблизительно 300, предпочтительно менее чем приблизительно 100 по результатам измерения иммуноферментным анализом с использованием двойных антигенов), см. работу Elliott et al., Lancet 344:1125 1127 (1994), которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки.
Биспецифические, гетероспецифические, гетероконъюгатные или подобные антитела также могут быть использованы как моноклональные гуманизированные антитела, обладающие специфичностью связывания по меньшей мере к двум различным антигенам. В данном случае одна из связывающих специфичностей реализуется по меньшей мере для одного белка IL-25, а другая - для любого другого антигена. Способы получения биспецифических антител хорошо известны специалистам в данной области. Обычно в основе рекомбинантного образования биспецифических антител лежит коэкспрессия двух пар тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулинов, где две тяжелые цепи обладают различными специфичностями (Milstein and Cuello, Nature 305:537 (1983)). Из-за случайного распределения генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов эти гибридомы (квадромы) образуют потенциальную смесь из 10 различных молекул антител, причем только одна из них имеет правильную биспецифическую структуру.
Очистка правильной молекулы, которая обычно выполняется путем аффинной хроматографии, является довольно трудоемким процессом с низким выходом продукта. Аналогичные процедуры описаны, например, в публикации WO 93/08829, патентах США №№ 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, публикациях WO 91/00360, WO 92/00373, ЕР 03089, работах Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986), содержание которых полностью включено в настоящий документ путем ссылки.
IL-25.
Белок IL-25, также известный как IL-17E, доступен на рынке (например, производится компанией R&D Systems, штат Миннесота, США), а также может быть клонирован или синтезирован по последовательностям IL-25, доступным специалистам в данной области. Последовательность IL-25 человека (SEQ ID NO: 17) показана на фиг. 3. Для выработки антител или использования в иммуноанализе можно использовать любой фрагмент или комбинацию фрагментов белка IL-25 (например, рекомбинантный белок IL-25), в особенности фрагменты, укороченные с N-конца. Например, представленный на рынке рекомбинантный IL-25 человека (IL-17E) содержит зрелую последовательность белка Tyr 33-Gly 177, инв. № Q9H293, а представленный на рынке IL-25 мыши содержит остатки Val 17-Ala 169 мышиного IL-17E (инв. № NP_542767).
Молекулы нуклеиновых кислот.
Используя предоставленную в настоящем документе информацию и описанные в настоящем изобретении или широко известные специалистам способы, можно получить молекулу нуклеиновой кислоты, составляющую предмет настоящего изобретения, которая кодирует по меньшей мере один связывающийся с мишенью агент, составляющий предмет настоящего изобретения.
Молекулы нуклеиновых кислот, составляющие предмет настоящего изобретения, могут иметь фор
- 12 031203 му РНК, таких как мРНК, гяРНК, тРНК или любой другой формы, или форму ДНК, включая, помимо прочего, кДНК и геномную ДНК, полученные путем клонирования, путем синтеза или любых их комбинаций. ДНК может быть трехцепочечной, двухцепочечной, одноцепочечной или любой их комбинацией. Любой участок по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может являться кодирующей цепью, также называемой смысловая нить, или некодирующей цепью, также называемой антисмысловая цепь.
Выделенные молекулы нуклеиновых кислот, составляющие предмет настоящего изобретения, могут включать в себя молекулы нуклеиновых кислот, содержащие открытую рамку считывания (ORF), необязательно с одним или более интронами, например, помимо прочего, по меньшей мере одним специфическим участком по меньшей мере одного CDR, такого как CDR1, CDR2 и (или) CDR3, по меньшей мере одной тяжелой цепи (например, последовательности SEQ ID NOS:10-12) или легкой цепи (например, последовательности SEQ ID NOS:6-8); молекулы нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую последовательность для вариабельного участка анти-ГЬ-ЗЗ (например, последовательности SEQ ID NOS:5 или 9); и молекулы нуклеиновых кислот, содержащие нуклеотидную последовательность, по существу, отличающуюся от вышеописанных, но вследствие вырождения генетического кода также кодирующую по меньшей мере одно анти-IL-25 антитело, как описано в настоящем документе и(или) известно специалистам. Конечно, генетический код хорошо известен специалистам в данной области. Следовательно, для специалиста создание подобных вырожденных вариантов нуклеиновых кислот, кодирующих специфические анти-1Ь-25 антитела, составляющие предмет настоящего изобретения, является обычной процедурой (см., например, цитированную выше работу Ausubel et al.). Все подобные варианты нуклеиновых кислот считаются включенными в настоящее изобретение.
Как указано в настоящем документе, молекулы нуклеиновых кислот, составляющие предмет настоящего изобретения, которые содержат кодирующую анти-IL-25 антитело нуклеиновую кислоту, могут, помимо прочего, включать в себя молекулы, кодирующие аминокислотную последовательность фрагмента самого антитела, кодирующую последовательность для всего антитела или его участка, кодирующую последовательность для антитела, фрагмента или участка, а также дополнительные последовательности, например кодирующую последовательность по меньшей мере для одного сигнального лидерного или слитого пептида, содержащую или не содержащую вышеупомянутые дополнительные кодирующие последовательности, такие как по меньшей мере один интрон, в сочетании с дополнительными некодирующими последовательностями, включая, помимо прочего, некодирующие 5' и 3' последовательности, такие как транскрибированные нетранслированные последовательности, играющие важную роль в транскрипции, процессинге мРНК, включая сигналы сплайсинга и полиаденилирования (например, связывание рибосомы и стабильность мРНК), дополнительную кодирующую последовательность, которая кодирует дополнительные аминокислоты, например, обеспечивающие добавочную функциональность. Так кодирующая антитело последовательность может быть слита с маркерной последовательностью, такой как последовательность, кодирующая пептид, который облегчает очистку слитого антитела, содержащего фрагмент или участок антитела.
Полинуклеотиды, селективно гибридизируемые с полинуклеотидом.
В настоящем изобретении описаны выделенные нуклеиновые кислоты, которые в условиях селективной гибридизации гибридизуются с полинуклеотидом, раскрытым в настоящем документе. Таким образом, полинуклеотиды данного варианта осуществления можно использовать для выделения, определения и(или) количественного анализа нуклеиновых кислот, содержащих подобные полинуклеотиды. Например, полинуклеотиды, составляющие предмет настоящего изобретения, могут быть использованы для идентификации, выделения или амплификации частичных или полных клонов в хранимых библиотеках. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды представляют собой последовательности геномных или комплементарных ДНК, выделенные или иным образом комплементарные к кДНК из библиотеки нуклеиновых кислот человека или другого млекопитающего.
Библиотека кДНК предпочтительно содержит по меньшей мере 80% полных последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 85 или 90% полных последовательностей и более предпочтительно по меньшей мере 95% полных последовательностей. Библиотеки кДНК могут быть нормализованными для повышения представительства редких последовательностей. С последовательностями, имеющими пониженную степень идентичности относительно комплементарных последовательностей, обычно, но не исключительно, применяют условия гибридизации низкой или средней строгости. Условия средней и высокой строгости могут также необязательно применяться для последовательностей с более высокой степенью идентичности. Условия низкой строгости позволяют проводить селективную гибридизацию последовательностей, имеющих степень идентичности приблизительно 70%, и могут использоваться для идентификации ортологических и паралогичных последовательностей.
Полинуклеотиды, составляющие предмет настоящего изобретения, необязательно кодируют по меньшей мере часть антитела, кодируемого полинуклеотидами, описанными в настоящем документе. Полинуклеотиды, составляющие предмет настоящего изобретения, охватывают последовательности нуклеиновых кислот, которые можно использовать для селективной гибридизации с полинуклеотидом, кодирующим антитело, составляющее предмет настоящего изобретения (см., например, цитированные выше работы Ausubel и Colligan, каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем
- 13 031203 ссылки).
Конструирование нуклеиновых кислот.
Как хорошо известно специалистам, выделенные нуклеиновые кислоты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут быть получены с использованием (а) рекомбинантных способов, (b) синтетических способов, (с) способов очистки или их сочетаний.
Для удобства нуклеиновые кислоты могут содержать другие последовательности в дополнение к полинуклеотиду, составляющему предмет настоящего изобретения. Например, в нуклеиновую кислоту для удобства выделения полинуклеотида может быть вставлен сайт множественного клонирования, содержащий один или более сайтов рестрикции эндонуклеазой. Также для удобства выделения транслированного полинуклеотида, составляющего предмет настоящего изобретения, могут быть вставлены транслируемые последовательности. Например, гексагистидиновая маркерная последовательность позволяет использовать удобные способы очистки белков, составляющих предмет настоящего изобретения. Нуклеиновая кислота, составляющая предмет настоящего изобретения, исключая кодирующую последовательность, необязательно представляет собой вектор, адаптер или линкер для клонирования и(или) экспрессии полинуклеотида, составляющего предмет настоящего изобретения. Для оптимизации функций таких последовательностей для клонирования и(или) экспрессии при клонировании и(или) экспрессии, удобства выделения полинуклеотида или улучшения внедрения полинуклеотида в клетку в них могут быть введены дополнительные последовательности. Использование векторов клонирования, векторов экспрессии, адаптеров и линкеров хорошо известно специалистам (см., например, цитированные выше работы Ausubel или Sambrook).
Рекомбинантные способы конструирования нуклеиновых кислот.
Выделенные композиции нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением, например РНК, кДНК, геномная ДНК или их комбинация, могут быть получены из биологических источников с помощью любого количества способов клонирования, известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления для идентификации нужной последовательности в библиотеке кДНК или геномной ДНК используют олигонуклеотидные зонды, селективно гибридизующиеся в строгих условиях с полинуклеотидами, составляющими предмет настоящего изобретения. Выделение РНК и конструирование библиотек кДНК и геномных ДНК хорошо известно специалистам (см., например, цитированные выше работы Ausubel или Sambrook).
Способы скрининга и изолирования нуклеиновых кислот.
Скрининг по библиотеке кДНК или генома можно осуществлять с помощью зонда на основе последовательности полинуклеотида, составляющего предмет настоящего изобретения, такого как описанный в настоящем документе. Зонды могут использоваться для гибридизации с последовательностью геномной ДНК или кДНК с целью выделения гомологичных генов в одинаковых или различных организмах. Специалисты в данной области определят, что при выполнении анализа могут использоваться различные степени строгости гибридизации, и как среда для гибридизации, так и среда для отмывки клеток могут соответствовать жестким условиям. По мере того как условия гибридизации становятся все более строгими, требуемая для образования дуплекса степень комплементарности между зондом и мишенью возрастает. Степень строгости можно контролировать одним или более параметрами, такими как температура, ионная сила, рН, присутствие частично денатурирующего растворителя, например формамида. Например, степень строгости гибридизации обычно изменяют путем смены полярности раствора реагентов, например путем изменения концентрации формамида в диапазоне от 0 до 50%. Степень комплементарности (идентичности последовательностей), необходимая для детектируемого связывания, варьируется в соответствии со строгостью среды для гибридизации и(или) среды для отмывки клеток. Оптимальная степень комплиментарности составляет 100%, или от 70 до 100%, или любой диапазон или значение в этих пределах. Однако следует понимать, что небольшие вариации последовательностей в зондах и праймерах могут быть компенсированы путем уменьшения строгости среды для гибридизации и(или) среды для отмывки клеток. Способы амплификации РНК или ДНК хорошо известны специалистам и могут быть использованы согласно настоящему изобретению без лишних экспериментов на основе описаний и рекомендаций, представленных в настоящем документе. Известные способы амплификации ДНК или РНК без ограничений включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и родственные способы амплификации (см., например, патенты США №№ 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, Mullis, et al.; патенты США №№ 4795699 и 4921794 Tabor, et al.; патент США № 5142033 Innis; патент США № 5122464 Wilson, et al.; патент США № 5091310 Innis; патент США № 5066584 Gyllensten, et al; патент США № 4889818 Gelfand, et al; патент США № 4994370 Silver, et al; патент США № 4766067 Biswas; патент США № 4656134 Ringold), а также опосредованную РНК амплификацию, которая использует антисмысловую к целевой последовательности РНК в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США № 5130238 Malek, et al., торговое наименование: NASBA); каждый цитированный источник полностью включен в настоящий документ путем ссылки (см., например, цитированные выше работы Ausubel или Sambrook). Например, для амплификации последовательностей полинуклеотидов, составляющих предмет настоящего изобретения, и связанных с ними генов, непосредственно из библиотек геномной ДНК или кДНК можно использовать технологию полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР и другие способы
- 14 031203 амплификации in vitro также допустимы, например, для клонирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих экспрессируемые белки, для получения нуклеиновых кислот, используемых в качестве зондов для обнаружения присутствия требуемой мРНК в образцах, для секвенирования нуклеиновых кислот или для других целей. Примеры методик, которыми может руководствоваться специалист для использования способов амплификации in vitro, можно найти в цитированных выше работах Berger, Sambrook и Ausubel, а также в патенте США № 4683202 (1987) Mullis, et al.; и работе Innis et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, ред., Academic Press Inc., г. Сан-Диего, штат Калифорния (1990). Представленные на рынке наборы для геномной ПЦР-амплификации хорошо известны специалистам (см., например, набор для геномной ПЦР Advantage-GC (Clontech). Кроме того, для повышения выхода продуктов продолжительной ПЦР можно использовать, например, белок гена 32 фага Т4 (Boehringer Mannheim).
Синтетические способы конструирования нуклеиновых кислот.
Выделенные нуклеиновые кислоты, составляющие предмет настоящего изобретения, также могут быть получены путем прямого химического синтеза известными способами (см., например, цитированную выше работу Ausubel, et al.). При химическом синтезе, как правило, создается одноцепочечный олигонуклеотид, который может быть преобразован в двухцепочечную ДНК путем гибридизации с комплементарной последовательностью или путем полимеризации ДНК-полимеразой с использованием одиночной цепи в качестве матрицы. Специалист в данной области определит, что хотя химический синтез ДНК может быть ограничен последовательностью из 100 или более оснований, последовательности большей длины могут быть получены путем лигирования более коротких последовательностей.
Кассеты рекомбинантной экспрессии.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает кассеты рекомбинантной экспрессии, содержащие нуклеиновую кислоту, составляющую предмет настоящего изобретения. Последовательность нуклеиновой кислоты, составляющая предмет настоящего изобретения, например последовательность кДНК или геномной ДНК, кодирующая антитело, составляющее предмет настоящего изобретения, можно использовать для конструирования кассеты рекомбинантной экспрессии, которая может быть введена по меньшей мере в одну необходимую клетку-хозяина. Кассета рекомбинантной экспрессии, как правило, содержит полинуклеотид, составляющий предмет настоящего изобретения, функционально связанный с инициирующими транскрипцию регуляторными последовательностями, которые направляют транскрипцию полинуклеотида в предназначенной для этого клетке-хозяине. Для управления экспрессией нуклеиновых кислот, составляющих предмет настоящего изобретения, можно применять как гетерологичные, так и негетерологичные (т. е. эндогенные) промоторы. В некоторых вариантах осуществления выделенные нуклеиновые кислоты, выполняющие функцию промотора, энхансера или других элементов, могут быть введены в соответствующие положения (до, после или в интрон) негетерологичной формы полинуклеотида, составляющего предмет настоящего изобретения, с целью уменьшения или увеличения экспрессии полинуклеотида, составляющего предмет настоящего изобретения. Например, в эндогенные промоторы могут быть внесены изменения in vivo или in vitro путем мутации, делеции или замены.
Векторы и клетки-хозяева.
Настоящее изобретение также относится к векторам, включающим в себя выделенные молекулы нуклеиновых кислот, составляющие предмет настоящего изобретения, клеткам-хозяевам, созданным методом генной инженерии с применением рекомбинантных векторов, и к выработке по меньшей мере одного анти-Гк-25 антитела с применением хорошо известных специалистам рекомбинантных способов (см., например, цитированные выше работы Sambrook, et al. и Ausubel, et al.), каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки. Полинуклеотиды могут необязательно быть присоединены к содержащему селектируемый маркер вектору для распространения в организме хозяина. Как правило, плазмидный вектор вводят в преципитат, например в преципитат с фосфатом кальция или в комплекс с заряженным липидом. Если вектор представляет собой вирус, он может быть упакован in vitro в соответствующую пакующую клеточную линию, а затем трансдуцирован в клетки-хозяева. ДНКвставка должна быть функционально связана с соответствующим промотором. Экспрессирующие конструкции дополнительно содержат сайты для инициации и остановки транскрипции, а также сайт связывания с рибосомой для трансляции в транскрибируемом участке. Кодирующая часть зрелого транскрипта, экспрессируемого описываемыми конструкциями, предпочтительно включает в себя старт-кодон в начале и стоп-кодон (например, UAA, UGA или UAG), должным образом расположенный на конце транслируемой мРНК, причем для экспрессии в клетках млекопитающих или эукариот предпочтительными являются стоп-кодоны UAA и UAG. Экспрессирующие векторы предпочтительно, но необязательно, включают в себя по меньшей мере один селектируемый маркер. К таким маркерам без ограничений относятся метотрексат (МТХ), дигидрофолатредуктаза (DHFR, патенты США №№ 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017), ампициллин, неомицин (G418), микофеноловая кислота или глутаминсинтетаза (GS, патенты США №№ 5122464; 5770359; 5827739), устойчивые в культурах эукариотических клеток и гены устойчивости к тетрациклину или ампициллину в культивируемых клетках Е. coli и других бактерий или прокариот (вышеупомянутые патенты полностью включены в настоящий документ путем ссылки). Соответствующие среды и условия культивирования вышеописанных клеток-хозяев хо
- 15 031203 рошо известны специалистам. Соответствующие векторы должны быть очевидны для специалистов в данной области. Введение векторной конструкции в клетку-хозяина может быть произведено путем кальций-фосфатной трансфекции, трансфекции, опосредованной ДЭАЭ-декстраном, трансфекции, опосредованной катионными липидами, электропорации, трансдукции, инфицирования или другими известными способами. Такие способы описаны в таких публикациях, как цитированные выше работы Sambrook, главы 14, 16, 18; и Ausubel, главы 1, 9, 13, 15, 16. По меньшей мере одно антитело, составляющее предмет настоящего изобретения, может быть экспрессировано в модифицированной форме, такой как слитый пептид, и может включать в себя не только секреторные сигналы, но и дополнительные гетерологичные функциональные области. Например, к N-концу антитела может быть добавлена область дополнительных аминокислот, в особенности заряженные аминокислоты, для повышения его стабильности и персистенции в клетке-хозяине, а также в ходе очистки или в ходе последующих манипуляций и хранения. Кроме того, к антителу, составляющему предмет настоящего изобретения, для упрощения очистки могут быть добавлены пептидные фрагменты. Эти области могут быть удалены перед получением готового антитела или по меньшей мере одного его фрагмента. Подобные способы описаны во многих стандартных лабораторных руководствах, таких как цитированные выше работы Sambrook, главы 17.29-17.42 и 18.1-18.74; и Ausubel, главы 16, 17 и 18. Специалистам известны многочисленные экспрессирующие системы, с помощью которых можно экспрессировать нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, составляющий предмет настоящего изобретения. В альтернативном варианте осуществления нуклеиновые кислоты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут экспрессироваться в клетке-хозяине путем запуска (манипуляционного) экспрессии в клетке-хозяине, содержащей эндогенную ДНК, кодирующую антитело, которое составляет предмет настоящего изобретения. Такие способы хорошо известны специалистам и, например, описаны в патентах США №№ 5580734, 5641670, 5733746 и 5733761, полностью включенных в настоящий документ путем ссылки. Примером клеточных культур, используемых для получения антител, их специфических фрагментов или вариантов, являются клетки млекопитающих. Клеточная культура млекопитающих зачастую имеет форму клеточных монослоев, хотя также могут применяться суспензии клеток или биореакторы млекопитающих. В данной области разработан ряд соответствующих линий клеток-хозяев, способных экспрессировать интактные гликозилированные белки. К ним относятся клеточные линии COS-1 (например, АТСС CRL 1650), COS-7 (например, АТСС CRL-1651), HEK293, BHK21 (например, АТСС CRL-10), СНО (например, АТСС CRL 1610) и BSC-1 (например, АТСС CRL-26), клетки Cos-7, клетки СНО, клетки hep G2, клетки P3X63Ag8.653, SP2/0-Agl4, клетки 293, клетки HeLa и подобные, например, производства компании American Type Culture Collection, г. Манассас, штат Вирджиния (www.atcc.org). К предпочтительным клеткам-хозяевам относятся клетки лимфоидного происхождения, такие как миеломные и лимфомные. Наиболее предпочтительны в качестве клеток-хозяев клетки P3X63Ag8.653 (инв. номер АТСС CRL-1580) и клетки SP2/0Agl4 (инв. номер АТСС CRL-1851). В особенно предпочтительном варианте осуществления рекомбинантная клетка представляет собой клетку линий P3X63Ag8.653 или SP2/0-Agl4. Экспрессионные векторы для таких клеток могут включать в себя одну или более из следующих последовательностей контроля экспрессии, таких как, помимо прочего, включающих точку начала репликации; промотор (например, поздние или ранние промоторы SV40, промотор CMV) (патенты США №№ 5168062; 5385839), промотор HSV tk, промотор pgk (фосфоглицераткиназа), промотор EF-1 alpha (патент США № 5266491), по меньшей мере один иммуноглобулиновый промотор человека; энхансер и(или) сайты информации для обработки, например сайты связывания рибосомы, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования (например, сайт добавления poly A большого Т-антигена SV40) и последовательности, терминирующие транскрипцию (см., например, цитированные выше работы Ausubel et al. и Sambrook, et al). Другие клетки, использующиеся для получения нуклеиновых кислот или белков, составляющих предмет настоящего изобретения, известны и(или) доступны специалистам по каталогу American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) или из других известных или коммерческих источников. Если используются эукариотические клетки-хозяева, в вектор обычно встраиваются последовательности полиаденилирования или терминирующие транскрипцию последовательности. Примером терминаторной последовательности является последовательность полиаденилирования из гена бычьего гормона роста. Также могут включаться последовательности для точного сплайсинга транскрипта. Примером последовательности для сплайсинга является интрон VP1 из SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773781 (1983)). Кроме того, как хорошо известно специалистам, в вектор можно вводить генные последовательности для контроля репликации в клетке-хозяине.
Композиции.
Настоящее изобретение также предусматривает по меньшей мере одну композицию со связывающимся с мишенью агентом, содержащую по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или более связывающихся с мишенью агентов, описанных в настоящем документе и(или) известных специалистам, в виде не встречающейся в природе композиции, смеси или формы. Процентные доли подобной композиции определяются по весу, объему, концентрации, молярности или моляльности в жидких или сухих растворах, смесях, суспензиях, эмульсиях или коллоидах, как известно специалистам или описано в настоящем документе. Композиции, со
- 16 031203 ставляющие предмет настоящего изобретения, могут дополнительно содержать по меньшей мере одно из любого соответствующего и эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один анти-ГЕ-25 связывающийся с мишенью агент для клетки, ткани, органа, животного или пациента, нуждающегося в такой модуляции, лечении или терапии, необязательно дополнительно содержащих по меньшей мере один антагонист ФНО (например, в том числе антитело или фрагмент ФНО, растворимый рецептор или фрагмент ФНО, их слитые белки или низкомолекулярный антагонист ФНО), противоревматический препарат (например, метотрексат, ауранофин, ауротиоглюкоза, азатиоприн, этанерцепт, тиомалат золота и натрия, сульфат гидроксихлорохина, лефлуномид, сульфасалазин), миорелаксант, наркотическое средство, нестероидное противовоспалительное средство (НПВС), анальгетик, анестетик, седативный препарат, местный анестетик, нейромышечный блокатор, бактерицидный препарат (например, аминогликозид, противогрибковые, противопаразитические, противовирусные препараты, карбапенемы, цефалоспорины, фторхинолоны, макролиды, пенициллины, сульфаниламиды, тетрациклины, другие противомикробные препараты), антипсориатический препарат, кортикостероидный препарат, анаболический стероид, антидиабетический препарат, минеральный, нутритивный, тиреоидный препараты, витамин, гормон, связанный с обменом кальция, противодиарейный, противокашлевой, противорвотный, противоязвенный, слабительный, антикоагулянтный препараты, эритропоэтин (например, эпоэтин альфа), филграстим (например, Г-КСФ, нейпоген), сарграмостим (ГМКСФ, лейкин), иммунизатор, иммуноглобулин, иммуносупрессоры (например, базиликсимаб, циклоспорин, даклизумаб), гормон роста, гормонзаместительный препарат, модулятор эстрогеновых рецепторов, мидриатический препарат, мидриатик, алкилирующий препарат, антиметаболит, ингибитор митоза, радиофармацевтический препарат, антидепрессант, антиманийный препарат, нейролептик, седативный, снотворный препараты, симпатомиметик, стимулятор, донепезил, такрин, антиастматический препарат, бета-агонист, ингаляционный стероид, ингибитор лейкотриенов, метилксантин, кромолин, адреналин или его аналог, дорназа альфа (пульмозим), цитокин или антагонист цитокинов. Неограничивающие примеры таких цитокинов включают в себя, помимо прочего, любые из интерлейкинов от IL-1 до IL-23 Соответствующие дозировки хорошо известны специалистам (см., например, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2-е изд., Appleton and Lange, г. Стэмфорд, штат Коннектикут (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, г. Лома-Линда, штат Калифорния (2000 г.), каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Подобные противораковые или противомикробные препараты также могут включать в себя молекулы токсинов, ассоциированные, связанные с, входящие в состав или совместно вводимые по меньшей мере с одним антителом, составляющим предмет настоящего изобретения. Токсин может необязательно обеспечивать избирательное уничтожение патологических клеток или тканей. Патологической клеткой может быть раковая или другая клетка. Такие токсины могут без ограничений представлять собой очищенный или рекомбинантный токсин или фрагмент токсина, содержащий по меньшей мере один функциональный цитотоксический домен токсина, например, выбранный по меньшей мере из одного из рицина, дифтерийного токсина, токсина змеиного яда или бактериального токсина. Термин токсин также включает в себя эндотоксины и экзотоксины, продуцируемые любыми природными, мутантными или рекомбинантными бактериями или вирусами, способными вызывать любые патологические состояния у людей и других млекопитающих, в том числе токсический шок, который может приводить к смерти. Такие токсины без ограничений могут включать в себя термолабильный энтеротоксин (LT) энтеротоксигенной Е. coli, термостабильный энтеротоксин (ST), цитотоксин Shigella, энтеротоксины Aeromonas, токсин-1 синдрома токсического шока (TSST-1), стафилококковый энтеротоксин A (SEA), В (SEB) или С (SEC), стрептококковые энтеротоксины и т. п. Такие бактерии без ограничений включают в себя штаммы энтеротоксигенных видов Е. coli (ЕТЕС), энтерогемморагических Е. coli (например, штаммы серотипа 0157:Н7), бактерии Staphylococcus (например, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), бактерии Shigella (например, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii и Shigella sonnei), бактерии Salmonella (например, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), бактерии Clostridium (например, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), бактерии Camphlobacter (например, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), бактерии Heliobacter, (например, Heliobacter), бактерии Aeromonas (например, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas pylon caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, бактерии Vibrios (например, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), бактерии Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa и Streptococci (см., например, Stein, ed., INTERNAL MEDICINE, 3-е изд., с. 1-13, Little, Brown and Co., г. Бостон, (1990); под ред. Evans et al., Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2-е изд., с. 239-254, Plenum Medical Book Co., г. Нью-Йорк (1991); Mandell et al., Principles and Practice of Infectious Diseases, 3-е изд., Churchill Livingstone, г. НьюЙорк (1990); под ред. Berkow et al., The Merck Manual, 16-е изд., Merck and Co., г. Рауэй, штат НьюДжерси, 1992; Wood et al., FEMS Microbiology Immunology, 76:121 134 (1991); Marrack et al., Science, 248:705 711 (1990), содержание которых полностью включено в настоящий документ путем ссылки. Композиции, составляющие предмет настоящего изобретения, могут дополнительно содержать по меньшей мере одно из любых соответствующих вспомогательных компонентов, включая, помимо прочего, разбавитель, связующее вещество, стабилизатор, буферы, соли, липофильные растворители, консервант,
- 17 031203 адъювант и т.п. Предпочтительными являются фармацевтически приемлемые вспомогательные компоненты. Неограничивающие примеры таких стерильных растворов и способов их получения хорошо известны специалистам и, в частности, без ограничений описаны в работе Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., Mack Publishing Co. (г. Истон, штат Пенсильвания) 1990. Фармацевтически приемлемые носители можно выбрать обычным способом исходя из способа введения, растворимости и(или) стабильности композиции, содержащей анти-ГЬ^ связывающийся с мишенью агент, фрагмент либо вариант, как хорошо известно специалистам или описано в настоящем документе. Фармацевтические наполнители и добавки, которые можно использовать в настоящей композиции, без ограничений включают в себя белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводы (например, сахара, в том числе моносахариды, ди-, три-, тетра- и олигосахариды; производные сахаров, такие как альдиты, альдоновые кислоты, этерифицированные сахара и т.п.; и полисахариды или полимерные сахара), которые могут присутствовать отдельно или в комбинации, составляя отдельно или в комбинации от 1 до 99,99% по массе или по объему. Примеры белковых наполнителей включают в себя сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин (HSA), рекомбинантный человеческий альбумин (rHA), желатин, казеин и т.п. Типичные представители аминокислотных/антительных компонентов, которые также могут выполнять функцию буферного компонента, включают в себя аланин, глицин, аргинин, бетаин, гистидин, глютаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам и т. п. Предпочтительной аминокислотой является глицин. Примеры углеводных наполнителей, которые могут использоваться в целях настоящего изобретения, включают в себя, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, D-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как рафиноза, мелезитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит сорбит (глюцит), миоинозит и т.п. Предпочтительными углеводными наполнителями для использования в целях настоящего изобретения являются маннит, трегалоза и рафиноза. Композиции могут также включать в себя буферный раствор или регулирующий рН агент; как правило, буферным раствором является соль, полученная из органической кислоты или основания. Типичные буферные растворы включают в себя соли органических кислот, например соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; буфер Трис, гидрохлорид трометамина или фосфатные буферы. Предпочтительными буферами для использования в описываемых композициях являются соли органических кислот, такие как цитраты. Дополнительно композиции, составляющие предмет настоящего изобретения, могут включать в себя полимерные наполнители/добавки, такие как поливинилпирролидоны, фиколлы (полимерный сахар), декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-бетациклодекстрин), полиэтиленгликоли, вкусовые добавки, бактерицидные агенты, подсластители, антиоксиданты, антистатические агенты, ПАВ (например, полисорбаты, такие как TWEEN 80 и TWEEN 20), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты), стероиды (например, холестерин) и хелатирующие агенты (например, ЭДТК). Эти и другие известные фармацевтические наполнители и(или) добавки, которые могут использоваться в целях настоящего изобретения, хорошо известны специалистам, например, перечислены в работе Remington: The Science & Practice of Pharmacy, 19-е изд., Williams & Williams, (1995), и в работе Physician's Desk Reference, 52-е изд., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998), которые полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Предпочтительными носителями или наполнителями являются углеводы (например, сахариды и альдиты) и буферные агенты (например, цитраты) или полимерные агенты.
Терапевтические применения.
В одном аспекте в настоящем изобретении предложен способ профилактики или понижения гиперчувствительности дыхательных путей у нуждающегося в таком лечении объекта (например, человека), который содержит введение объекту связывающегося с мишенью агента, в частности молекулы антитела, связывающейся с IL-25. Вышеперечисленные способы могут применяться с использованием связывающихся с мишенью агентов (включая их композиции) в соответствии с настоящим изобретением, которые могут найти применение для связывания и предпочтительно антагонистического действия по отношению к IL-25, причем указанные способы имеют терапевтический потенциал при различных заболеваниях и расстройствах с участием IL-25. Способы также могут применяться с использованием других связывающихся с мишенью агентами (включая их композиции), которые связываются с IL-25 и могут быть получены с помощью описанных ниже, в сопровождающих примерах, способов.
Связывающиеся с мишенью агенты (включая их композиции) в соответствии с настоящим изобретением можно использовать при лечении (включая профилактическое лечение) или диагностике у людей или животных. Такой способ лечения или диагностики (который может включать в себя профилактическое лечение) может содержать введение указанному объекту эффективной дозы связывающегося с мишенью агента, составляющего предмет настоящего изобретения. Примеры соответствующих заболеваний и расстройств обсуждаются ниже.
Также описывается использование связывающегося с мишенью агента (включая содержащие его композиции), составляющего предмет настоящего изобретения, для производства лекарственного препа
- 18 031203 рата для введения людям или животным.
Клинические показания, при которых анти-ГЕ-25 связывающийся с мишенью агент можно использовать для обеспечения положительных клинических результатов, включают в себя любые показания, при которых IL-25 приводит к патологическим последствиям. Таким образом, в целом, связывающийся с мишенью агент, составляющий предмет настоящего изобретения, можно использовать для лечения любого состояния, связанного с нежелательным ответом клеток Th2 или ответом клеток 2-го типа. Например, связывающийся с мишенью агент, составляющий предмет настоящего изобретения, можно использовать для лечения аллергии и астмы, в особенности астмы.
Анти-ГЕ-25-терапию можно проводить инъекционно (например, внутривенно) или местным путем. Анти-ГЕ-25 можно вводить с использованием генных технологий. Альтернативные стратегии приготовления фармацевтической композиции могут дать препараты, допустимые для перорального введения или введения в виде суппозиториев. Способ введения препарата может определяться психохимическими особенностями лечения и особенностями заболевания с целью оптимизации эффективности лечения и минимизации побочных эффектов.
В соответствии с настоящим изобретением, представленные композиции можно вводить пациентам. Предпочтительно осуществлять введение в терапевтически эффективных количествах, являющихся достаточными для улучшения состояния пациента. Улучшение состояния может заключаться по меньшей мере в улучшении по меньшей мере одного симптома. Фактически вводимое количество, а также интенсивность и график лечения будут зависеть от природы и тяжести протекания заболевания. Выдача рекомендаций по лечению, например решения по дозировке и т.д., находится в сфере ответственности врачей общей практики и других медицинских работников. Соответствующие дозировки антитела хорошо известны специалистам (см. Ledermann J.A. et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922).
Точная дозировка зависит от ряда факторов, включая цель использования антител (для диагностики или лечения), размер и расположение обрабатываемой области, точную природу антитела (например, цельное антитело, фрагмент или диатело), а также природу любой детектируемой метки или другой молекулы, прикрепленной к антителу. Типичная дозировка антитела составляет 0,5 мг - 1,0 г. Такую дозу может вводить внутривенно как болюсное введение или инфузионно в течение нескольких часов для получения необходимой дозы. Другие способы введения включают в себя инфузионное внутривенное введение в течение нескольких часов для достижения аналогичной полной кумулятивной дозировки. Последняя представляет собой дозировку для единичного введения взрослому пациенту, которая может быть пропорционально скорректирована для детей и младенцев, а также для других форматов антитела пропорционально его молекулярному весу. Введение можно повторять ежедневно, два раза в неделю, еженедельно или ежемесячно, по усмотрению врача.
В качестве дополнительного способа введения используется нанесение поверхностного слоя или включение иным способом препарата во вводимое в тело пациента устройство, для которых оптимальное количество антитела будет определяться с помощью соответствующих экспериментов.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения молекула антитела представляет собой мономерный фрагмент, такой как F(ab) или scFv. Такие фрагменты антитела могут иметь преимущество в виде относительно короткого периода полувыведения и меньшего риска активации тромбоцитов, вызываемой кластеризацией рецепторов. Кластеризоваться с активацией тромбоцитов могут либо молекулы IL-25, либо молекулы IL-25 с FcyRH.
При использовании цельного антитела оно предпочтительно должно находиться в форме, неспособной активировать и(или) уничтожить тромбоциты. Предпочтительным является IgG4-изотип или, в альтернативном варианте осуществления, сконструированный изотип, полученный на основе каркаса IgG1 (новые Fc-генные конструкции из публикации WO 99/58572, Clark, Armour, Williamson). Можно использовать и меньшие фрагменты антитела, такие как F(ab')2. Кроме того, можно использовать цельные антитела или фрагменты (например, F(ab')2 или диатела) с двойной эпитопной специфичностью (например, эпитопы, распознаваемые scFv 2C3). Хотя такой вариант осуществления может способствовать кластеризации рецепторов, высокая скорость ассоциации отдельных рецепторов может решить эту проблему.
Связывающиеся с мишенью агенты, составляющие предмет настоящего изобретения, как правило, вводят пациентам в виде фармацевтической композиции, в состав которой, помимо связывающегося с мишенью агента, может входить по меньшей мере один дополнительный компонент.
Связывающийся с мишенью агент, составляющий предмет настоящего изобретения, можно вводить в качестве самостоятельного препарата или в комбинации с другими видами лечения, одновременно или последовательно, в зависимости от подлежащего лечению состояния. Другие способы лечения могут включать в себя введение соответствующих дозировок болеутоляющих препаратов, таких как нестероидные противовоспалительные препараты (например, аспирин, парацетамол, ибупрофен или кетопрофен) или опиаты, такие как морфин; введение противорвотных средств; или введение по меньшей мере одного другого соединения, активно действующего против астмы, как правило, бронхорасширяющего средства, которое вызывает релаксацию дыхательных путей или усиливает очищение слизистых оболо
- 19 031203 чек, например бета-агонисты (например, сальбутамол, сальметерол), динатрия кромогликат, стероиды или ингибитор PDEIV.
Способы анализа.
В настоящем изобретении описан способ, включающий провоцирование или разрешение связывания связывающегося с мишенью агента, описанного в настоящем документе, с IL-25. Как отмечено, такое связывание может происходить in vivo, например, после введения пациенту связывающегося с мишенью агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей связывающийся с мишенью агент, или же связывание может происходить in vitro, например, в тестовых системах иммуноферментного анализа, теста Biacore, теста Octet, Вестерн-блоттинга, при использовании способов иммуноцитохимии, иммунопреципитации или аффинной хроматографии.
Возможно количественное определение степени связывания связывающегося с мишенью агента с IL-25. Результат количественного определения может быть связан с количеством антигена в тестируемом образце, что представляет собой диагностический интерес.
Реакционная способность антител к образцу может быть определена любым соответствующим способом. Одним из возможных способов является радиоиммуноанализ (RIA). При этом антиген с радиоактивной меткой смешивают с немеченым антигеном (тестируемый образец) и проводят связывание с антителом. Связанный антиген физически отделяют от несвязанного антигена и определяют количество радиоактивного антигена, связавшегося с антителом. Чем больше антигена содержится в тестируемом образце, тем меньше будет количество радиоактивного антигена, связавшегося с антителом. Возможен также тест на конкурентное связывание с нерадиоактивным антигеном, с использованием антигена или его аналога, связанного с репортерной молекулой. Репортерная молекула может представлять собой флюорохром, фосфоресцирующий агент или лазерный краситель со спектрально изолированными полосами поглощения или эмиссии. Соответствующие целям настоящего изобретения флюорохромы включают в себя флюоресцеин, родамин, фикоэритрин и Texas Red. Соответствующие целям настоящего изобретения хромогенные красители включают в себя диаминобензидин.
Другие репортерные агенты включают в себя макромолекулярные коллоидные частицы или другие частицы, такие как латексные шарики, которые могут быть окрашенными, магнитными или парамагнитными, а также биологически или химически активные вещества, которые могут прямо или косвенно приводить к образованию регистрируемых сигналов, которые будут обнаруживаться и регистрироваться визуально, электронным или иным способом. Эти молекулы могут представлять собой ферменты, катализирующие реакции, которые приводят к появлению или изменению окраски, или, например, вызывают изменение электрических свойств. Они могут быть молекулярно возбудимыми, так что электронные переходы между энергетическими уровнями приводят к характерным спектрам поглощения или эмиссии. Они могут включать в себя химические объекты, используемые в сочетании с биосенсорами. Также можно использовать систему определения типа биотин/авидин или биотин/стрептавидин с щелочной фосфатазой.
Сигналы, генерируемые отдельными конъюгатами антитело-репортер, можно использовать для получения количественных абсолютных или относительных данных по степени связывания соответствующего антитела в образцах (стандартных и тестируемых).
В настоящем изобретении также предложено использование связывающегося с мишенью агента, как описано выше, для измерения уровней антигенов с использованием конкурентного анализа, то есть способ измерения уровня антигена в образце путем использования предложенного в настоящем изобретении связывающегося с мишенью агента для конкурентного анализа. Этот способ можно использовать в тех случаях, когда не требуется физическое отделение связанного антигена от несвязанного. Одной из возможностей является присоединение к связывающемуся с мишенью агенту репортерной молекулы, так чтобы при связывании происходили физические или оптические изменения. Репортерная молекула может прямо или косвенно создавать регистрируемые и предпочтительно измеряемые сигналы. Присоединение репортерных молекул может быть осуществлено прямо или опосредовано, ковалентно, например, с использованием пептидной связи, или нековалентно. Присоединение с помощью пептидной связи может быть произведено в результате рекомбинантной экспрессии слитого гена, кодирующего антитело и репортерную молекулу.
В настоящем изобретении также предложено непосредственное измерение уровней антигена путем использования связывающегося с мишенью агента в соответствии с настоящим изобретением, например, в биосенсорной системе.
Специалист в данной области может выбрать соответствующий режим связывания в соответствии со своими предпочтениями и общими знаниями.
Примеры
Ниже приведены описания примеров осуществления настоящего изобретения.
Пример 1. Получение M6, высокоаффинного гуманизированного антитела к IL-25.
В качестве исходной молекулы для получения вариантов с улучшенной аффинностью связывания с IL-25 был выбран huDDG91, гуманизированный (CDR-привитый) вариант мышиного 2C3 моноклонального анти-IL25 антитела. Легкая каппа-цепь последовательности huDDG91, исключая лидерную после
- 20 031203 довательность, показана на фиг. 1 (SEQ ID NO:2), где подчеркнуты аминокислотные последовательности CDR-петель, в соответствии с обозначениями Kabat. Последовательность тяжелой цепи huDDG91 (SEQ ID NO:4) показана на фиг. 2, где подчеркнута аминокислотная последовательность участков CDR, в соответствии с обозначениями Kabat. huDDG91 также известен как RH2.5_R71V. Создание и характеризация мышиных 2C3 моноклонального анти-ГЕ25 антитела описаны в международной заявке № PCT/GB2008/001365, опубликованной 30 октября 2008 г. как документ WO 2008/129263, содержание которой полностью включено в настоящий документ путем ссылки.
Для создания вариантов huDDG91 с использованием стандартной методологии были сконструированы библиотеки фагового отображения, основанные на последовательности huDDG91. Библиотеки Fab аффинно сортировали с использованием биотинилированного IL-25. С помощью иммуноферментного анализа (ELISA) выбрали связывающие антиген фрагменты (Fab) со степенью связывания, сравнимой со степенью связывания huDDG91 (IgG4) или превосходящей ее.
Выбранные Fab преобразовали в моноклональные антитела (mAb) следующим образом. Сконструировали комбинаторную библиотеку из 5 различных легких цепей и 5 различных тяжелых цепей (включая легкие и тяжелые цепи huDDG91). Использованные в библиотеке легкие и тяжелые цепи отличались друг от друга в аминокислотных последовательностях участков CDR1 и CDR3 легкой цепи и в последовательности участка CDR3 тяжелой цепи. Используя данные легкие и тяжелые цепи, сконструировали 25 mAb (IgG1), которые экспрессировали в небольшом количестве в клетках линии HEK293 и очистили. Каждый из полученных mAb протестировали на аффинность связывания с IL-25, клеточное ингибирование и ингибирование рецепторов следующим образом:
определили аффинность связывания с IL-25 с использованием стандартной тестовой системы IL-25 ELISA и при проведении анализа связывания Biacore. Отобрали кандидатов, у которых KD меньше 50 пМ для IL-25 человека и KD больше 100 нМ для IL-17A, С, D и F человека;
исследовали клеточное ингибирование с помощью стандартного теста с использованием клеток почечной карциномы человека линии ТК-10 (реагирующих на IL-25; регистрация по реакции на IL-25 и IL8; способных различить между собой растворимый IL-25R и исходное mAb), а также тест на основе Тклеточной системы CD4+. Для тестовой системы ТК-10 отобрали mAb с концентрацией IC50 меньшей, чем у исходного антитела huDDG91, и ингибированием секреции IL-25 >90% при концентрации mAb 10нМ. Для тестовой Т-клеточной системы CD4+ отобрали mAb, вызывающие ингибирование продукции IL-5, равное или превышающее ингибирование, вызываемое исходным антителом huDDG91;
оценивали ингибирование рецепторов с использованием технологии электрохемилюминесцентного иммуноанализа (ECLIA) на основе модифицированных шариков. Отобрали кандидатов, вызывающих более чем трехкратное увеличение концентрации IC50 для связывания IL-25 с рецептором по сравнению с исходным антителом huDDG91 при концентрации mAb 10 нМ.
Основываясь на этих критериях, выбрали 9 потенциальных mAb (фиг. 3). Все кандидаты продемонстрировали приемлемые уровни экспрессии и желаемые профили SE-HPLC и SDS-PAGE при экспрессии в клетках линии HEK293 и очистке с использованием стандартных протоколов. Все 9 кандидатов транзитно экспрессировали в масштабе 10л в клетках линии СНО (яичника китайского хомячка), очистили с помощью системы Mab Select SuRe (GE Healthcare Life Sciences), заместили буфер на фосфатный буферный раствор (PBS) и сконцентрировали. Аффинность связывания с IL-25 каждого из 9 потенциальных mAb была значительно выше, чем у huDDG91. Используя стандартные способы и анализы, каждое mAb также исследовали на уровень экспрессии, идентичность (SDS-PAGE), растворимость, агрегацию (SEHPLC), посттрансляционную модификацию, белок-белковые взаимодействия и окисление. Некоторые из потенциальных mAb при экспрессии в клетках линии СНО и очистке и обработке в стандартных условиях выпадали в осадок при концентрировании, имели низкие выходы и(или) нежелательные профили SDS-PAGE и SE-HPLC.
Одно mAb, обозначенное M6, отобрали для последующего изучения исходя из его более высокого уровня экспрессии, высокой растворимости, отсутствия значительной агрегации белков при очистке и отсутствия нежелательных посттрансляционных модификаций, белок-белковых взаимодействий и окисления при очистке.
Пример 2. Характеризация антитела M6.
Материалы и способы.
Тестовая система на основе клеток эпителия толстого кишечника человека линии LS 174T.
Клеточную линию клеток эпителия толстого кишечника человека LS 174T (CL-188) получили от компании АТСС (г. Манассас, штат Вирджиния) и культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM, компания Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния) с добавлением 10% FBS, пенициллина и стрептомицина, при температуре 37°С в атмосфере 5% СО2. Клетки высевали на 96луночный планшет для культивирования с плотностью 1x105 клеток/мл и общим объемом 100 мкл и оставили на ночь для закрепления. Предварительно приготовили комплексы антител к IL-25 (M6 и М9) с рекомбинантным белком IL-25 человека (Centocor), для этого одно и то же количество белка IL-25 (конечная концентрация 10 нг/мл) смешивали с варьируемым количеством анти-ГЕ-25 антитела, титрованного в последовательных 3-х кратных или полулогарифмических разведениях, и инкубировали при тем
- 21 031203 пературе 37°С в течение 1 ч. Культуральную среду осторожно отсасывали и заменяли на комплекс белок Ш-25/Ш-25-антитело, и клетки инкубировали в течение ночи 18-22 ч. Затем планшеты с культурой центрифугировали при 1200 об/мин в течение 2 мин для предотвращения переноса клеточных остатков, и супернатант собирали и тестировали на GROa с использованием иммуноферментного анализа (ELISA, R&D Systems, г. Миннеаполис, штат Миннесота).
Результаты.
Анализ последовательности M6 показал наличие трех аминокислотных замен по сравнению с последовательностью huDDG91, все три замены находились в участке CDR3 легкой цепи (см. фиг. 3). Аминокислотные последовательности легкой (SEQ ID NO:5) и тяжелой (SEQ ID NO:9) цепей антитела M6 и их участков CDR представлены на фиг. 4.
С помощью тестовой системы Biacore установили, что антитело M6 имеет аффинность связывания с IL-25 человека, которая в 3-5 раз превышает аффинность связывания huDDG91 с IL-25 человека (фиг. 3). Более того, антитело M6 связывалось с IL-25 селективно, поскольку связывания с IL-17A, С, D или F человека не происходило. Перекрестную реакционную способность антитела M6 исследовали на IL-25 яванских обезьян cynoIL-25 и IL-25 грызунов (мыши). На перекрестную реакционную способность с cynoIL-25 указывала аффинность в пределах 5-кратной аффинности к IL-25 человека, ингибирование лигандов рецептора и тест с использованием клеток линии TK-10. Используя эти критерии, было установлено, что антитело M6 связывается с IL-25 обезьян и мышей.
Используя описанные в примере 1 клеточные тест-системы, было показано, что антитело M6 обладает повышенным ингибированием рецепторной активности по сравнению с huDDG91, имея более чем в три раза меньшую концентрацию IC50 по сравнению с huDDG91 (фиг. 3). Кроме того, использование описанных в примере 1 клеточных тест-систем показало, что антитело M6 проявляет повышенное клеточное ингибирование IL-25 человека по сравнению с huDDG91 (фиг. 3 и 5). Этот результат был подтвержден с помощью анализа на клетках эпителия толстого кишечника человека линии LS 174Т (фиг. 6А и 6В), проведенного как описано выше.
Пример 3. H/D-обменное картирование эпитопа в IL-25 человека, опознаваемом антителом M6.
Краткое описание.
Предполагаемый эпитоп в IL-25 человека, опознаваемом антителом M6, картировали с использованием масс-спектрометрии водородно-дейтериевого обмена ExSar™, выполненной компанией ExSar Corporation (г. Монмут-Джанкшн, штат Нью-Джерси).
Материалы и способы.
I. Оптимизация расщепления/разделения IL-25.
(1) IL-25 разморозили на льду.
(2) Разделили на 18x100 мкл аликвот и заморозили все аликвоты, кроме одной.
(3) Смешали 10 мкл раствора 0,28 мг/мл (16,6 мкМ) IL-25 с 30 мкл фосфатного буфера (PBS), рН 7,0 в воде^[Ш-25]=0,07 мг/мл (4,2 мкМ).
(4) Смешали 40 мкл (3) с различными гасящими растворами.
(5) Ввели 55 мкл образца в систему ExSAR.
(6) Пропустили образец через колонку с иммобилизованным пепсином с расходом 200 мкл/мин в буфере А (0,05% TFA в НО).
(7) Продукты расщепления пепсином ввели в колонку-ловушку с обращенной фазой и обессолили буфером А с расходом 200 мкл/мин в течение 3 мин.
(8) Пептиды, полученные в результате расщепления пепсином, разделили в колонке С18, используя линейный градиент 13%^40% буфера В (95% ацетонитрил, 5% Н2О, 0,0025% TFA) в течение 23 мин.
(9) Пептиды регистрировали с помощью масс-спектрометрии.
II. Иммобилизация M6.
4.1. Экспериментальная процедура для иммобилизации M6.
Конъюгация антитела на смоле.
(1) Разморозили 1,5 мл раствора 0,96 мг/мл M6 на льду.
(2) Использовали 400 мкл полученного раствора (неиспользованный материал заморозили обратно).
(3) В пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой добавили 4 мг NaCNBH3 (87,5 мкмоль)^40 мг NaCNBH3 на 1 г POROS AL.
(4) Добавили в пробирку 400 мкл раствора антитела.
(5) Перед добавлением смолы POROS AL убедились, что NaCNBH3 полностью растворился.
(6) Поместили 100 мг POROS AL в пробирку.
(7) Реакционную смесь для связывания инкубировали при комнатной температуре при встряхивании в течение 3 ч.
(8) Добавили 2,8М раствор Na2SO4 общим объемом 400 мкл в порциях 5x80 мкл, одна порция в час^| антитело |=0,48 мг/мл, [NaCNBH3]=5,0 мг/мл [Na2SO4]=1,4М.
(9) Смесь инкубировали при комнатной температуре при встряхивании в течение ночи.
(10) Смесь тщательно промыли фосфатным буферным раствором (PBS), рН 7,0, используя воронку
- 22 031203 с фильтром.
Покрытие.
(11) Приготовили раствор для покрытия, смешав 250 мкл этаноламина (FW=61,08, плотность=1,012 г/мл, 8,3 ммоль, ~1М) с 3,5 мл PBS, рН 7,0, и довели рН раствора до рН 7,2, добавив ледяную уксусную кислоту (~200 мкл). Конечный объем раствора составлял приблизительно 4 мл.
(12) Растворили 4 мг NaCNBH3 в 500 мкл раствора для покрытиям[NaCNBH3]=8 мг/мл, [этаноламин]=~1М.
(13) Ресуспендировали промытую высушенную смолу в растворе NaCNBH3.
(14) Инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч, постоянно встряхивая.
(15) Смесь профильтровали и тщательно промыли фосфатным буферным раствором (PBS), рН 7,0, используя воронку с фильтром.
(16) Отфильтрованную смолу ресуспендировали в 0,75 мл фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,0.
(17) Конъюгированный материал хранили в холодильнике при 4°С.
III. Экспериментальная процедура по определению емкости по связыванию колонки M6.
Подготовка буферных растворов.
(1) Подготовили раствор 50 мМ цитрата, рН 6,0 в воде.
(2) Подготовили раствор 50 мМ цитрата, 2 мМ фосфохолина-12 (Fos-choline-12), рН 6,0 в воде.
(3) Подготовили фосфатный буферный раствор (PBS), рН 7,0 в воде.
(4) В качестве буфера Н использовали один из растворов (1), (2) или (3).
Тест емкости связывания.
(5) Колонку mAb (104 мкл) заполнили 600 мкл антитела M6, связанного со смолой POROS, используя поток 500 мкл/мин буфера А (0,05% TFA в Н2О) и держатель колонки из нержавеющей стали размером 2,1x30 мм.
(6) Колонку с антителами поместили в ванну охладителя, установленного на температуру 3°С, обеспечив линии подачи реагента в колонку и сбора реагента на выходе колонки. В линии подачи реагентов установили стеклянный фильтр с порами размером 2 мкм для фильтрования реагентов и образцов.
(7) Уравновесили колонку с антителами с использованием 2x250 мкл буфера Н. Для измерения рН раствора в конце линии использовали индикаторную бумагу, чтобы удостовериться в нейтральном значении рН.
(8) Смешали 10 мкл раствора 0,28 мг/мл (16,6 мкМ) IL-25 с 30 мкл буфера 4^[IL-25]=4,1 мкМ (эквивалентно 166 пмоль).
(9) Указанную смесь ввели в уравновешенную колонку с антителами.
(10) Используя шприцевой насос, при температуре 3°С ввели в колонку 200 мкл буфера Н (помещенного в шприц Гамильтона объемом 500 мкл) и собрали 5x40 мкл фракций.
(11) Используя шприцевой насос, при температуре 3°С ввели в колонку 200 мкл 0,8% муравьиной кислоты и собрали 5x40 мкл фракций.
(12) В стеклянной вставке приготовили контрольный образец, смешав 10 мкл раствора 0,28 мг/мл (16,6 мкМ) IL-25 с 30 мкл буфера Н.
(13) Центрифугировали все вставки, содержащие фракции или контрольный образец, чтобы стряхнуть вниз капли жидкости на стенках вставки. Закрыли и промаркировали пробирки со вставками.
(14) Нейтральные и кислотные фракции и контрольный образец установили в поддон 4 термостата Cool Stack в нечетные гнезда с номерами от 3 до 23 в следующем порядке: контрольный образец, нейтральная промывка 1, 2, 3, 4, 5 и кислотная промывка 1, 2, 3, 4, 5.
(15) В четные гнезда с номерами от 4 до 24 поддона 4 термостата Cool Stack установили 11 пустых пробирок с крышками.
(16) Каждую фракцию смешали с 20 мкл 2М мочевины, 1М ТСЕР, рН 3,0.
(17) Ввели 55 мкл погашенного раствора в систему ExSAR без пепсиновых колонок.
(18) Образец ввели в колонку-ловушку в буфере А с расходом 200 мкл/мин (0,05% TFA), обессолили в течение 3 мин и элюировали с линейным градиентом 13-40% буфера В (95% ацетонитрила, 5% Н2О, 0,0025% TFA) в течение 23 мин.
(19) Элюаты анализировали масс-спектрометрически в режиме MS1:Centroid.
IV. Экспериментальная процедура обмена типа ассоциация-в-растворе/диссоциация-в-колонке. Подготовка буферных растворов.
(1) Подготовили раствор 50 мМ цитрата, 2 мМ фосфохолина-12 (Fos-choline-12), рН 6,0 в Н2О.
(2) Подготовили фосфатный буферный раствор (PBS) с 2 мМ фосфохолина-12, рН 7,0 в Н2О.
(3) Подготовили фосфатный буферный раствор (PBS), рН 7,0 в Н2О.
(4) В качестве буфера для обмена Н использовали один из растворов (1)-(3).
(5) Подготовили буфер для обмена НН, смешав 1 часть фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,0 в Н2О и 3 части буфера для обмена Н.
(6) Подготовили раствор 50 мМ цитрата, 2 мМ фосфохолина-12 (Fos-choline-12), рН 6,0 в D2O).
- 23 031203 (7) Подготовили фосфатный буферный раствор (PBS) с 2 мМ фосфохолина-12 (Fos-choline-12), рН 7,0 в D2O.
(8) Подготовили фосфатный буферный раствор (PBS), рН 7,0 в D2O.
(9) В качестве буфера для обмена D использовали один из растворов (6)-(8).
(10) Подготовили буфер для обмена HD, смешав 1 часть фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,0 в Н2О и 3 части буфера для обмена D.
Ассоциация в растворе.
(1) Колонку с mAb (объем слоя 104 мкл) разместили и уравновесили внутри холодного бокса при температуре 3°С.
(2) Колонку с mAb очистили 2x250 мкл 0,8% муравьиной кислоты.
(3) Колонку с mAb промыли 2x250 мкл буфера для обмена HD для уравновешивания колонки.
(4) Смешали 10 мкл раствора 0,28 мг/мл (16,6 мкМ) IL-25 с 30 мкл буфера для обмена D при температуре 3°С^^|IL-25|=0.07 мг/мл (4,2 мкМ), [D2O]=75% (начат отсчет времени ассоциации).
(5) Инкубировали смесь в течение 150, 500, 1500 или 5000 с при температуре 3°С.
(6) Смесь (40 мкл) ввели в колонку с mAb.
(7) Колонку с mAb промыли 100 мкл буфера для обмена HD при температуре 3°С.
Диссоциация в колонке.
(8) Колонку с mAb промыли 200 мкл охлажденного буфера для обмена НН (при первом же контакте Н2О с колонкой окончен отсчет времени ассоциации и начат отсчет времени диссоциации).
(9) Инкубировали смесь при температуре 23°С в течение 75, 250, 750 или 2500 с.
Элюирование.
(10) В колонку с mAb ввели 120 мкл охлажденной 0,8% муравьиной кислоты (при введении кислоты в колонку сразу же окончен отсчет времени диссоциации).
(11) Ввели дополнительно 40 мкл охлажденной 0,8% муравьиной кислоты, чтобы элюировать антиген из колонки с mAb.
(12) 40 мкл фракции собрали в стеклянную вставку.
Анализ.
(13) В собранные 40 мкл фракции добавили 20 мкл охлажденного раствора 2М мочевины, 1М ТСЕР, рН 3,0.
(14) Ввели 55 мкл погашенного раствора с проведенным обменом в систему ExSAR с пепсиновой колонкой и колонкой С18 (пепсиновая колонка: объем слоя 104 мкл; скорость потока в пепсиновой колонке 200 мкл/мин; колонка С18: градиент 13-40% буфера В в течение 23 мин). Установили время расщепления 3 мин.
(15) Элюаты анализировали масс-спектрометрически в режиме MS1:Profile.
V. Экспериментальная процедура обмена типа ассоциация-в-колонке/диссоциация-в-колонке. Ассоциация в колонке.
(1) Колонку с mAb (объем слоя 104 мкл) разместили и уравновесили внутри холодного бокса при температуре 23°С.
(2) Колонку с mAb очистили 2x250 мкл 0,8% муравьиной кислоты.
(3) Колонку с mAb промыли буфером для обмена НН для уравновешивания колонки.
(4) Смешали 10 мкл раствора 0,28 мг/мл (16,6 мкМ) IL-25 с 30 мкл буфера для обмена Н при температуре 3°С^|1Ь-25|=0.07 мг/мл (4,2 мкМ), [D2O]=0%.
(5) Смесь ввели в колонку с mAb.
(6) Колонку с mAb промыли 100 мкл буфера для обмена НН.
(7) Реакцию ассоциации инициировали пропусканием 200 мкл буфера для обмена HD через колонку с mAb (начат отсчет времени ассоциации).
(8) Инкубировали колонку с mAb в течение 150, 500, 1500 или 5000 с при температуре 3°С.
Диссоциация в колонке. Аналогично 5.2.
Элюирование. Аналогично вышеописанной процедуре IV, стадии 10-14.
Анализ. Аналогично вышеописанной процедуре IV, стадия 15.
VI. Экспериментальная процедура для эксперимента с полным дейтерированием.
Подготовка полностью дейтерированного образца.
(1) Смешали 10 мкл раствора 0,28 мг/мл (16,6 мкМ) IL-25 с 30 мкл буфера для обмена D.
(2) Полученную смесь выдержали при температуре 60°С в течение 3 ч.
(3) Затем охладили ее до комнатной температуры.
(4) Поместили 40 мкл смеси в колонку с mAb.
(5) Ввели 100 мкл буфера для обмена HD в колонку с mAb.
Элюирование. Аналогично вышеописанной процедуре IV, стадии 10-14.
Анализ. Аналогично вышеописанной процедуре IV, стадия 15.
Дейтерий, присоединенный к первым двум аминокислотным остаткам каждого иона, теряется в процессе анализа (расщепление/разделение/масс-спектрометрический анализ в водной среде). Этим и
- 24 031203 объясняются небольшие пропуски в профиле H/D-обмена на фиг. 8 А и 8В. Эксперименты без дейтерирования, обменные эксперименты и эксперименты полного дейтерирования проводили для каждого белка. Эксперименты без дейтерирования использовали для идентификации ионов, а также для точного определения m/z каждого иона без дейтерия. Эксперименты полного дейтерирования идентифицировали потерю дейтерия каждым ионом в процессе анализа (расщепление/разделение/масс-спектрометрия в водной среде). В экспериментах этого типа можно рассчитать число дейтронов до масс-спектрометрического анализа и после обменной реакции типа ассоциации или ассоциации-диссоциации. В экспериментах с обменом типа ассоциации-диссоциации время диссоциации составляло половину времени ассоциации. Это является следствием того, что при одинаковых значениях рН истинная скорость обмена HxD составляет половину истинной скорости обмена DxH.
Результаты.
Расщепление IL-25.
IL-25 расщепляли обработкой пепсином в различных условиях. Наилучшее результаты расщепления IL-25 пепсином получили при гашении 2 частей разбавленного раствора IL-25 1 частью раствора 2М мочевины, 1М ТСЕР, рН 3,0 и расщеплении в пепсиновой колонке при расходе 200 мкл/мин. Наилучшими условиями для разделения оказались следующие: колонка С18 с линейным градиентом 13-40% буфера В (95% ацетонитрила, 5% Н2О и 0,0025% TFA) в буфере А в течение 23 мин. Степень покрытие последовательности IL-25 после расщепления пепсином составила 100% (=146/146; фиг. 7А и 7В).
Иммобилизация M6 и тест связывающей способности колонки с M6.
Образец IL-25 без расщепления пепсином дал один хроматографический пик при 8,5 мин. Образец оказался чистым. Антитело M6 успешно конъюгировали со смолой POROS AL, используя химию оснований Шиффа. Результаты тестирования связывающей способности колонки с M6 при трех различных условиях в системе ExSAR показаны в табл. 1. Следили за интактным пиком с m/z=1875 (+18) и 1985 (+17). При всех проанализированных условиях связывания испытания IL-25 не элюировался из колонки при промывании нейтральными растворами, указывая на то, что при нейтральных условиях весь введенный IL-25 (166 пмоль) связывается с колонкой с M6. IL-25 может неспецифически прилипать к колонке с M6. Только 17-18% введенного IL-25 было выведено из колонки при промывании кислым раствором в отсутствие детергента. Кроме того, обратное давление колонки с M6 при повторных введениях IL-25 постепенно увеличивалось. Выведение улучшилось при добавлении фосфохолина-12.
Таблица 1
Условия, использованные для тестирования связывающей способности колонки с антителами M6 «буфер Н» температура пепсин нейтральный кислый
(а) 50 мМ цитрат, pH 6 з°с - 0% 18%
(Ь) 50 мМ цитрат, 2
мМ фосфохолин- з°с - 0% 24%
12, рН 6
(с) ФБР , pH 7 з°с - 0% 17%
Столбец между температура и нейтральный озаглавлен пепсин.
Идентификация эпитопа.
Эксперименты по обмену при ассоциации IL-25 в растворе.
Эксперименты по обмену при ассоциации IL-25 в растворе проводили при температуре 23°С и рН 7. Показано, что IL-25 является относительно динамичным белком.
Эксперименты по обмену при ассоциации/диссоциации IL-25 с использованием или без использования колонки M6.
Самую сильную защиту наблюдали в сегментах, охватывающих аминокислотные остатки 56-63 и 66-74 (фиг. 8А и 9С; табл. 2). Аналогичные сегменты, охватывающие аминокислотные остатки 46-63 и 66-84, показали стабильную слабую защиту (фиг. 8А, 9С и 9D; табл. 2). Пограничные показатели защиты наблюдали для сегментов, охватывающих аминокислотные остатки 129-135 (фиг. 8В, 9Е и 9F; табл. 2).
- 25 031203
Таблица 2 Различия в уровнях дейтерирования в различных сегментах IL-25 человека после экспериментов обмена при ассоциации/диссоциации
при рН 7 и рН 8 при температуре 23°С
начал о конец заряд рНб 150 рНб 500 рН7 150 рН7 500 рН7 1 500 рН7
5 000 среднее значение
3 9 1 -3% 2% -1% -1% -1% 5% 0%
3 15 2 -3% -5% 1% 0% -3% -1% -2%
3 20 2 1% 0% 2% 1% -3% -1% 0%
12 20 1 0% 4% -1% 0% 0% 1% 1%
23 42 2 3% 1% 1% 0% -1% 3% 1%
23 43 2 3% 1% 0% 0% -1% 0% 0%
23 45 3 2% 1% 2% 1% 1% -2% 1%
23 53 3 2% 1% 0% 1% 1% -1% 1%
46 53 1 2% -1% 2% 1% 0% 0% 1%
46 63 3 8% 5% 11% 7% 1% 0% 5%
56 63 1 7% 7% 9% 8% 6% 2% 6%
66 74 2 6% 10% 11% 13% 7% 0% 8%
66 84 2 9% 2% 5% 7% 6% -2% 4%
77 84 2 - - - - -2% -2% -2%
87 101 2 3% 2% 1% 3% -2% 1% 1%
90 101 2 2% 0% 3% 3% 0% 1% 1%
104 109 1 2% 0% 0% 1% 0% -2% 0%
105 109 1 0% 0% 0% 1% 4% 0% 1%
112 126 2 3% 2% 3% 2% 1% 0% 2%
112 127 2 7% -4% 1% 4% -3% 1% 1%
129 135 2 3% 6% 8% 4% 8% 0% 5%
133 135 1 -2% 3% 7% 5% 5% 2% 3%
138 146 1 1% 1% -1% -2% 0% 1% 0%
140 146 1 -1% 7% 3% -2% -2% 2% 1%
Содержание всех цитированных в настоящем документе патентов, опубликованных заявок и литературных источников полностью включено в настоящий документ путем ссылки.
Хотя данное изобретение было изложено и описано со ссылками на приведенные примеры вариантов его осуществления, специалисты в данной области определят, что возможны различные изменения в форме и деталях без отступления от существа изобретения, охватываемого прилагаемой формулой изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> CENTOCOR ORTHO BIOTECH INC.
<120> ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА К IL-25 <130> SPC5341PCT <140> To Be Assigned <141> 2011-03-28 <150> 61/341458 <151> 2010-03-30 <150> 61/319260 <151> 2010-03-31 <160> 17 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 313 <212> ДНК <213> Homo sapiens
- 26 031203 <400> 1 gatgacccag tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg60 cagtgcatcc cagggcatta gcaattatct gaattggtat cagcagaaac cagggaaagt120 tcctaaactc ctgatctatt acacatcaag tttacactca ggggtcccat ctcggttcag180 cggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc agcctgcagc ctgaagatgt240 tgcaacttat tactgtcagc agtatagcaa gctgccgtac acgtttggcc aggggaccaa300 gctggagatc aaa313 <210> 2 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 2
Asp 1 Ile Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3 <211> 363 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 3 gaggtgcagc tggtcgagag cggagccgag gtgaagaagc caggcgccag cgtcaaggtg60 tcctgcaagg ccagcggcta cagcttctcc ggctacacca tgaactgggt gcggcaggcc120 ccaggccaga ggctggaatg gatgggcctg atcaacccct acaacggcgg caccagctac180 aaccagaact tcaagggcag ggtgacactg accgtggata ccagcgccag caccgcctac240 ctggaactga acagcctgag aagcgaggac accggcgtgt actactgcgc cagagaggac300 tacgacggct acctgtactt cgccatggac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg360 agc363 <210> 4 <211> 121 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp
- 27 031203
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 <210> 5 <211> 214 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 5
Asp 1 Ile Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Ala Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 6 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 6
Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
5 10 <210> 7 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 7
Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser
5 <210> 8 <211> 9 <212> БЕЛОК
- 28 031203 <213> Homo sapiens <400> 8
Gln Gln Tyr Leu Ala Phe Pro Tyr Thr
5 <210> 9 <211> 452 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 9
Glu Val 1 Gln Leu Val 5 Glu Ser Gly Ala Glu Val 10 Lys Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Asp Tyr Asp Gly Tyr Leu Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
- 29 031203
Pro Val Leu Asp Ser 405 Asp Gly Ser Phe Phe 410 Leu Tyr Ser Lys Leu 415 Thr
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210>
<211>
<212>
<213>
БЕЛОК
Homo sapiens <400>
Gly Tyr Thr Met Asn <210>
<211>
<212>
<213>
БЕЛОК
Homo sapiens <400>
Leu Ile Asn Pro Tyr
Gly
Asn
Gly
Gly
Thr
Ser
Tyr
Asn
Gln
Asn
Phe
Lys <210>
<211>
<212>
<213>
БЕЛОК
Homo sapiens <400>
Glu Asp Tyr Asp Gly
Tyr
Leu
Tyr
Phe
Ala
Met
Asp
Tyr <210>
<211>
<212>
<213>
БЕЛОК
Homo sapiens <400>
Met Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gln Asp Thr
1 5 10 15
Ser Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val Pro Pro Leu Glu
20 25 30
Pro Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp
35 40 45
Gly Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Glu Leu Asp
50 55 60
Arg Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His Ala Arg
65 70 75
<210> 14 <211> 68 <212> БЕЛОК
- 30 031203 <213> Homo sapiens <400> 14
Cys Leu Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His Met Asp
1 5 10 15
Pro Arg Gly Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val Phe Tyr
20 25 30
Arg Arg Pro Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr Cys Leu
35 40 45
Glu Ala Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro
50 55 60
Arg Val Met Gly
65
<210> 15 <211> 75 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 15
Met Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gln Asp Thr
1 5 10 15
Ser Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val Pro Pro Leu Glu
20 25 30
Pro Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp
35 40 45
Gly Pro Leu Asn Ser Arg Ala Ile Ser Pro Trp Arg Tyr Glu Leu Asp
50 55 60
Arg Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr
65 70 75
<210> 16 <211> 71 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 16
His Ala Arg Cys Leu Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser
1 5 10 15
His His Asp Pro Arg Gly Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr
20 25 30
Val Phe Tyr Arg Arg Pro Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly
35 40 45
Tyr Cys Leu Glu Arg Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys
50 55 60
Val Arg Pro Arg Val Met Gly
65 70
<210> 17 <211> 146 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 17
Met Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gln Asp Thr
1 5 10 15
Ser Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val Pro Pro Leu Glu
20 25 30
Pro Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp
35 40 45
- 31 031203
Gly Pro Leu Asn Ser Arg Ala 55 Ile Ser Pro Trp Arg Tyr 60 Glu Leu Asp
50
Arg Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gln Asp Leu Tyr His Ala Arg Cys Leu
65 70 75 80
Cys Pro His Cys Val Ser Leu Gln Thr Gly Ser His Met Asp Pro Arg
85 90 95
Gly Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gln Thr Val Phe Tyr Arg Arg
100 105 110
Pro Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr Cys Leu Glu Arg
115 120 125
Arg Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro Arg Val
130 135 140
Met Gly
145

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенное антитело, которое связывается с IL-25, содержащее домен вариабельной области легкой цепи (VL), содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SASQGISNYLN (SEQ ID NO:6), CDR2, имеющий аминокислотную последовательность YTSSLHS (SEQ ID NO:7), и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8), и домен вариабельной области тяжелой цепи (VH), содержащий CDR1, имеющий аминокислотную последовательность GYTMN (SEQ ID NO: 10), CDR2, имеющий аминокислотную последовательность LINPYNGGTSYNQNFKG (SEQ ID NO: 11), и CDR3, имеющий аминокислотную последовательность EDYDGYLYFAMDY (SEQ ID NO:12).
    2. Выделенное антитело по п.1, где антитело связывает аминокислотные остатки 56-63 последовательности SEQ ID NO:17 и аминокислотные остатки 66-74 последовательности SEQ ID NO:17.
    3. Выделенное антитело по п.1, где антитело связывает одну или более аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей последовательности, состоящие из аминокислотных остатков 46-63 SEQ ID NO:17 или аминокислотных остатков 66-84 последовательности SEQ ID NO:17.
    4. Выделенное антитело по п.1, содержащее домен VL легкой цепи последовательности SEQ ID NO:5.
    5. Выделенное антитело по п.1, содержащее домен VH тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO:9.
    6. Выделенное антитело по п.1, где антитело также содержит константный участок.
    7. Выделенное антитело по п.6, в котором константный участок представляет собой константный участок IgG1 или константный участок IgG4.
    8. Выделенное антитело по п.7, содержащее легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO:5 и тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO:9.
    9. Фрагмент антитела по п.1, выбранный из группы, состоящей из фрагмента антитела Fab, фрагмента антитела F(ab')2 и фрагмента антитела scFv.
    10. Выделенное антитело по п.1, где антитело имеет аффинность связывания с IL-25 человека, которая равна приблизительно 50 пМ или менее.
    11. Выделенное антитело по п.1, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.
    12. Композиция для лечения воспалительных заболеваний или состояний, содержащая терапевтически эффективное количество выделенного антитела по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
    13. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую выделенное антитело по пп.1-9.
    14. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.13, причем нуклеиновая кислота функционально связана с промотором.
    15. Клетка-хозяин для экспрессии выделенной нуклеиновой кислоты по п.13, содержащая вектор экспрессии по п.14.
    16. Применение выделенного антитела по пп.1-9 при лечении или для профилактики астмы.
    17. Применение выделенного антитела по пп.1-9 при лечении или для профилактики воспалительного заболевания кишечника.
    18. Применение по п.17, причем воспалительное заболевание кишечника представляет собой язвенный колит или болезнь Крона.
    - 32 031203
    GATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAG GAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGTGCATCCCAGGGC ATTAGCAATTATCTGAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGG AAAGTTCCTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGTTTAC ACTCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGCGGCAGTGGATCT GGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCC TGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGTATAGCAA GCTGCCGTACACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAG ATCAAA (SEQ ID N0:1)
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKP GKVPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DVATYYCQQYSKLPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID N0:2)
    Фиг. 1
    GAGGTGCAGCTGGTCGAGAGCGGAGCCGAGGT GAAGAAGCCAGGCGCCAGCGTCAAGGTGTCCTG CAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCTCCGGCTACAC CATGAACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGCCAGAG GCTGGAATGGATGGGCCTGATCAACCCCTACAAC GGCGGCACCAGCTACAACCAGAACTTCAAGGGC AGGGTGACACTGACCGTGGATACCAGCGCCAGC ACCGCCTACCTGGAACTGAACAGCCTGAGAAGC GAGGACACCGGCGTGTACTACTGCGCCAGAGAG GACTACGACGGCTACCTGTACTTCGCCATGGACT ACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGC (SEQ ID N0:3)
    EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYTM NWVRQAPGQRLEWMGLINPYNGGTSYNQNFKGR VTLTVDTSASTAYLELNSLRSEDTGVYYCAREDYQG YLYFAMDYWGQGTLVTVS (SEQ ID N0:4)
    Фиг. 2
    L C 0 R 1 L C D R 3 H c 0 R 3 KD (nM), Biacore, для ДИСС. 7200 c IC50 для ингибирования рецепторов, пМ Клеточное ингибирование huDOGSI S A S Q G S N У L Q Q Y s К L P Y T E 0 Y 0 G Y L Y F A M D Y Панель A/В кратность изменения I25M6 L A F - - 53 12 4 I25M10 L A F F S T F 36 14 5 I25M11 A S F S F . F s v\ T F 57 14 5 I25M20 L A F - - - Y s T F 45 13 20 I25M32 - - - - N E N F - Y s T F 87 11 4 I25M28 L A F - - F - s T Y 19 14 16 I25M30 H W N F N S F F s A T Y 44 20 3 I25M31 - F - s V) T Y .. 40 18 12 I25M34 - - N E N F - F s T Y 64 13 7 IL-17BR 17 63 1 R71VG1 194 45,2-64,3 R71VG1 136
    Фиг. 3
    Аминокислотная последовательность легкой цепи (LC) антитела Мб
    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKP GKVPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DVATYYCQQYLAFPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEqDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHqGL SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:5)
    LC CDR 1: SASQGISNYLN (SEQ ID N0:6)
    LC CDR 2: YTSSLHS (SEQ ID N0:7)
    LC CDR 3: QQYLAFPYT (SEQ ID N0:8)
    Фиг. 4А
    - 33 031203
    Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (НС) антитела Мб
    EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYTMNVWRQ APGQRLEWMGLINPYNGGTSYNQNFKGRVTLTVDTSASTA YLELNSLRSEDTGVYYCAREDYDGYLYFAMDYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT QTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID N0:9)
    НС CDR 1: GYTMN (SEQ ID N0:10)
    НС CDR 2: LINPYNGGTSYNQNFKG (SEQ ID N0:11)
    НС CDR 3: EDYDGYLYFAMDY (SEQ ID N0:12)
    Фиг. 4В
    Фиг. 5
    Скрининг mAb к IL-25 человека в клетках линии
    Фиг. 6А М6.011
    Δ М9.008 о Только среда • Только 10 нг/мл IL-25
    М6.011 М9.008 ЕС50 1,55е-009 1,17е-008
    - 34 031203
    Фиг. 6В М6.011 δ М9.008
    О Только среда • Только 10 нг/мл IL-25
    М6.011 М9.008 ЕС50 1,26е-009 4,57е-008
    (SEQ ID N0:13)
    20 30 40 50 60 70 I myshwps|cc|pskgqdtseellrwstvpvppleparpnahpes|c|rasedgplnsraispwryeldadlnrlpqdlyhar
    Фиг. 7А
    (SEQ ID NO: 14) 80 90 100 110 120 130 140 I
    cl|c|ph с vs lqtg s η h d prg n s e llyh N qt vfyr r p[c|h g e kgt h kg y|c)le rrlyrwsl a|c|v[c|vrp rvm g
    Фиг. 7В (SEQ IO NO: 15)
    00 » 40 % 70 ''λ .- ц.
    MYSH*POSNSQOTS€EILRWSTVPVPPLEPARPNRHPE©ASEOGPLNSRAISP1RYELORBL'NRLPODIY
    ШЯШШ 500 с при рп о
    150 с при pH 7
    500 с при pH 7 1 500 с при pH 7
    000 с при pH 7
    Возмущение < = 5 % > 5% »> 10%
    М> 15% %
    Фиг. 8А
    - 35 031203
    Фиг. 8В
    Фиг. 9В
    120% 23-42(+2) 120% 23-43(+2) 100% 100% 80% 80% 60% 60% 40% 40% 20% 0% 20% л о/ U /о -20% 1 -20% I 10 100 1000 10000 I 10 100 1000 10000
    - 36 031203
    Фиг. 9С
    120% 46-53 (+1) 120% 46-63(+3) 100 % 100% 80% 80% 60% 60% 40% 40% 20% 20% 0% 0% -20% -20% 10 100 1000 10000 10 100 1000 10000
    120 % 100 % 80% 60% 40% 20% 0% -20% 1 104-109(+1) 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% -20% 1 105-109(+1) Л—О . · 1 1 I 10 100 1000 10000 1 10 100 1000 10000
    120 % 113-136(+3) 120 % 112-137 (+3) 100% 100% 80% 80% 60% 60% 40% 40% 20% 0% 20% 0% -20% 1 -20% 1 I 10 100 1000 10000 I 10 100 1000 10000
    Фиг. 9Е
    - 37 031203
    120% 129-135(+2) 120% 133-135(+1) 100% 100% 80% 80% 60% 60% 40% 40% 20% л о/ 20% 0% -20% U /о -20% 1 10 100 1000 10000 1 10 100 1000 10000
    120% 100% ОЛ 0/ 138-146(+1) 120% 100% ОЛ 0/ 140-145(+1) o(J 7о 60% 40% 20% 0% -20% 8U % 60 % 40% 20% Л 0/ А и % -20% 1 ·£Π— ι------ I 10 100 1000 10000 1 10 100 1000 10000
    Фиг. 9F
    MYSHWPSCCPSKGQDTSEELLRWSTVPVPP LEPARPNRHPESCRASEDGPLNSRAISPWR YELDRDLNRLPQDLYHARCLCPHCVSLQTG SHMDPRGNSELLYHNQTVFYRRPCHGEKGT HKGYCLERRLYRVSLACVCVRPRVMG (SEQ ID N0:17)
    Фиг. 10
EA201290977A 2010-03-30 2011-03-30 Гуманизированные антитела к il-25 EA031203B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34145810P 2010-03-30 2010-03-30
US31926010P 2010-03-31 2010-03-31
PCT/US2011/030469 WO2011123507A1 (en) 2010-03-30 2011-03-30 Humanized il-25 antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201290977A1 EA201290977A1 (ru) 2013-04-30
EA031203B1 true EA031203B1 (ru) 2018-11-30

Family

ID=44712602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201290977A EA031203B1 (ru) 2010-03-30 2011-03-30 Гуманизированные антитела к il-25

Country Status (34)

Country Link
US (1) US8785605B2 (ru)
EP (1) EP2552961B1 (ru)
JP (1) JP5887337B2 (ru)
KR (1) KR101830181B1 (ru)
CN (1) CN103097416B (ru)
AU (1) AU2011235232B2 (ru)
BR (1) BR112012024786A2 (ru)
CA (1) CA2795043C (ru)
CL (1) CL2012002745A1 (ru)
CR (1) CR20120553A (ru)
CY (1) CY1120468T1 (ru)
DK (1) DK2552961T3 (ru)
EA (1) EA031203B1 (ru)
EC (1) ECSP12012202A (ru)
ES (1) ES2656336T3 (ru)
GT (1) GT201200266A (ru)
HK (1) HK1185088A1 (ru)
HR (1) HRP20180340T1 (ru)
HU (1) HUE036157T2 (ru)
IL (1) IL222015B (ru)
LT (1) LT2552961T (ru)
MX (1) MX2012011479A (ru)
MY (1) MY163133A (ru)
NI (1) NI201200144A (ru)
NO (1) NO2552961T3 (ru)
NZ (1) NZ602720A (ru)
PE (1) PE20130192A1 (ru)
PL (1) PL2552961T3 (ru)
PT (1) PT2552961T (ru)
RS (1) RS56904B1 (ru)
SG (1) SG184195A1 (ru)
SI (1) SI2552961T1 (ru)
WO (1) WO2011123507A1 (ru)
ZA (1) ZA201208136B (ru)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0817891D0 (en) * 2008-09-30 2008-11-05 Medical Res Council Antibodies against il-25
US9090694B2 (en) 2012-04-30 2015-07-28 Janssen Biotech, Inc. ST2L antibody antagonists
CN103792375B (zh) * 2014-01-29 2017-07-07 华中科技大学同济医学院附属同济医院 外周血白细胞介素25水平在哮喘分型中的应用及分型方法
WO2016049000A2 (en) * 2014-09-23 2016-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-il-25 antibodies and uses thereof
WO2017160587A1 (en) * 2016-03-16 2017-09-21 Abeome Corporation Neutralizing monoclonal antibodies to il-25 and uses thereof
WO2018018082A1 (en) 2016-07-26 2018-02-01 The Australian National University Immunostimulatory compositions and uses therefor
KR102598319B1 (ko) * 2018-11-19 2023-11-02 쑤저우 카노바 바이오파마슈티컬 컴퍼니 리미티드 항-il-25 항체 및 그의 용도
GB202018015D0 (en) * 2020-11-16 2020-12-30 Res & Innovation Uk Composition and methods for the treatment of intestinal cancer

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020155114A1 (en) * 1998-08-31 2002-10-24 James D. Marks Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
US6562578B1 (en) * 1999-01-11 2003-05-13 Schering Corporation IL-17-like cytokine binding compounds and antibodies
US20060078966A1 (en) * 2000-03-16 2006-04-13 Amgen Inc. IL-17 receptor like polypeptides and uses thereof
US20060204506A1 (en) * 2005-03-10 2006-09-14 Wolfgang Ebel Anti-mesothelin antibodies
US20070280950A1 (en) * 2004-01-19 2007-12-06 Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. Inflammatory Cytokine Inhibitors
WO2008129263A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-30 Medical Research Council Antibodies against il-25
US20090148435A1 (en) * 2007-10-30 2009-06-11 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography
US20090263401A1 (en) * 2000-04-18 2009-10-22 Schering Corporation USES OF IL-174 ANTAGONISTS FOR INHIBITING A Th2 IMMUNE RESPONSE

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
GB2183661B (en) 1985-03-30 1989-06-28 Marc Ballivet Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptides or proteins by means of a dna recombinant technique
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US6010902A (en) 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
DE3909708A1 (de) 1989-03-23 1990-09-27 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung bispezifischer antikoerper
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
EP0478627A4 (en) 1989-05-16 1992-08-19 William D. Huse Co-expression of heteromeric receptors
CA2062795A1 (en) 1989-06-29 1990-12-30 Michael W. Fanger Bispecific reagents for aids therapy
TW212184B (ru) 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
WO1992000373A1 (en) 1990-06-29 1992-01-09 Biosource Genetics Corporation Melanin production by transformed microorganisms
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
US5582996A (en) 1990-12-04 1996-12-10 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Bifunctional antibodies and method of preparing same
CA2106079C (en) 1991-03-15 2000-04-25 Robert C. Thompson Pegylation of polypeptides
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
ES2202310T3 (es) 1991-12-13 2004-04-01 Xoma Corporation Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos.
DE4207475A1 (de) 1992-03-10 1993-09-16 Goldwell Ag Mittel zum blondieren von menschlichen haaren und verfahren zu dessen herstellung
AU5322494A (en) 1992-10-02 1994-04-26 Trustees Of Dartmouth College Bispecific reagents for redirected targeting of low density lipoprotein
DE4337197C1 (de) 1993-10-30 1994-08-25 Biotest Pharma Gmbh Verfahren zur selektiven Herstellung von Hybridomazellinien, die monoklonale Antikörper mit hoher Zytotoxizität gegen humanes CD16-Antigen produzieren, sowie Herstellung bispezifischer monoklonaler Antikörper unter Verwendung derartiger monoklonaler Antikörper und des CD30-HRS-3-Antikörpers zur Therapie menschlicher Tumore
PT749325E (pt) 1994-03-07 2002-11-29 Medarex Inc Mpleculas biespecificas possuindo utilidades clinicas
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6037453A (en) 1995-03-15 2000-03-14 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
EP0826695B1 (de) 1996-09-03 2001-12-12 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Zerstörung von kontaminierenden Tumorzellen in Stammzelltransplantaten mit bispezifischen Antikörpern
US6569645B2 (en) 1999-05-14 2003-05-27 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
US6884879B1 (en) * 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EP2258848B1 (en) * 1999-12-23 2014-03-05 Genentech, Inc. Il-17 homologous polypeptide and therapeutic uses thereof
AR030554A1 (es) * 2000-03-16 2003-08-27 Amgen Inc Moleculas similares a receptores il-17 y usos de las mismas
EP1863520B1 (en) 2005-03-08 2014-12-31 Aptose Biosciences Inc. Use of interleukin 17e for the treatment of cancer
WO2007044450A2 (en) * 2005-10-06 2007-04-19 Baylor Research Institute Compositions and methods for the treatment of cancer
JP2011514335A (ja) * 2008-02-21 2011-05-06 アムジェン インコーポレイテッド Ｉｌ−１７ｒａ−ｉｌ−１７ｒｂアンタゴニストおよび該アンタゴニストの使用
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
GB0817891D0 (en) 2008-09-30 2008-11-05 Medical Res Council Antibodies against il-25
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020155114A1 (en) * 1998-08-31 2002-10-24 James D. Marks Therapeutic monoclonal antibodies that neutralize botulinum neurotoxins
US6562578B1 (en) * 1999-01-11 2003-05-13 Schering Corporation IL-17-like cytokine binding compounds and antibodies
US20060078966A1 (en) * 2000-03-16 2006-04-13 Amgen Inc. IL-17 receptor like polypeptides and uses thereof
US20090263401A1 (en) * 2000-04-18 2009-10-22 Schering Corporation USES OF IL-174 ANTAGONISTS FOR INHIBITING A Th2 IMMUNE RESPONSE
US20070280950A1 (en) * 2004-01-19 2007-12-06 Medical And Biological Laboratories Co., Ltd. Inflammatory Cytokine Inhibitors
US20060204506A1 (en) * 2005-03-10 2006-09-14 Wolfgang Ebel Anti-mesothelin antibodies
WO2008129263A1 (en) * 2007-04-18 2008-10-30 Medical Research Council Antibodies against il-25
US20090148435A1 (en) * 2007-10-30 2009-06-11 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography

Also Published As

Publication number Publication date
NZ602720A (en) 2014-10-31
PT2552961T (pt) 2018-03-01
EP2552961A1 (en) 2013-02-06
EA201290977A1 (ru) 2013-04-30
CN103097416B (zh) 2015-09-09
KR101830181B1 (ko) 2018-02-20
IL222015B (en) 2020-08-31
JP5887337B2 (ja) 2016-03-16
NI201200144A (es) 2013-04-19
CA2795043C (en) 2019-04-23
US8785605B2 (en) 2014-07-22
ZA201208136B (en) 2014-03-26
NO2552961T3 (ru) 2018-05-19
EP2552961B1 (en) 2017-12-20
US20110318353A1 (en) 2011-12-29
BR112012024786A2 (pt) 2017-01-10
GT201200266A (es) 2014-03-14
CR20120553A (es) 2013-05-15
PL2552961T3 (pl) 2018-04-30
DK2552961T3 (en) 2018-03-05
MY163133A (en) 2017-08-15
WO2011123507A1 (en) 2011-10-06
CN103097416A (zh) 2013-05-08
ES2656336T3 (es) 2018-02-26
CL2012002745A1 (es) 2013-01-25
LT2552961T (lt) 2018-02-12
JP2013523132A (ja) 2013-06-17
EP2552961A4 (en) 2013-10-30
CA2795043A1 (en) 2011-10-06
CY1120468T1 (el) 2019-07-10
HK1185088A1 (zh) 2014-02-07
PE20130192A1 (es) 2013-02-27
AU2011235232A1 (en) 2012-10-25
RS56904B1 (sr) 2018-05-31
SG184195A1 (en) 2012-11-29
MX2012011479A (es) 2012-12-17
ECSP12012202A (es) 2012-10-30
SI2552961T1 (en) 2018-02-28
AU2011235232B2 (en) 2015-05-21
HUE036157T2 (hu) 2018-06-28
KR20130009999A (ko) 2013-01-24
HRP20180340T1 (hr) 2018-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5789192B2 (ja) ヒト化抗ｉｌ−６抗体
JP6787796B2 (ja) 抗Ａｘｌ抗体
DK2552961T3 (en) HUMANIZED IL-25 ANTIBODIES
AU2017268687A1 (en) Anti-CD22 antibodies
KR20170020476A (ko) 항―axl 항체
TR201902033T4 (tr) Anti-IL-23 antikorları, bileşimleri, yöntemleri ve kullanımları.
JP7405831B2 (ja) ヒトｉｌ－４ｒ結合抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医学的使用
KR20100120246A (ko) 항 ｉｌ-6 항체, 조성물, 방법 및 용도
WO2021213245A1 (zh) 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途
US20220251228A1 (en) Anti-bcma antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
RU2819660C2 (ru) Антитело к BCMA, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение
TWI840399B (zh) 結合人il-4r的抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
RU2779649C1 (ru) Антитело, связывающее человеческий il-4r, его антигенсвязывающий фрагмент и его медицинское применение
US20220041706A1 (en) Anti-fgf19 antibodies
US20240165252A1 (en) Antibody-drug conjugate and medical use thereof
KR20230086712A (ko) 항-trop-2 항체, 이의 항원-결합 단편 또는 이의 돌연변이체, 및 이의 의학적 용도

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): MD