CN103097416B - 人源化il-25抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合人IL-25的特定表位的靶结合成员(如抗体)。本发明还涉及包含一条或多条人源化抗体VL结构域序列并且结合IL-25的靶结合成员(如抗体)。本发明还涉及包含结合IL-25的靶结合成员(如抗体)的组合物，产生此类靶结合成员的方法，以及将此类靶结合成员用于疾病和病症(如哮喘、炎性肠疾病)的治疗或预防。

Description

人源化IL-25抗体
背景技术
白介素-25(IL-25)也称为IL-17E，是属于IL-17细胞因子家族的细胞因子，并且通过2型辅助T细胞(Th2)和肥大细胞分泌。IL-25在多个组织中诱导其他细胞因子(包括IL-4、IL-5和IL-13)的产生，并且刺激嗜酸粒细胞的扩增。
IL-25和胃肠道相关的慢性炎症有关系，并且经鉴定，IL-25基因位于肠自身免疫疾病(例如炎性肠疾病(IBD))相关的染色体区域。治疗IBD的传统疗法涉及抗生素或类固醇衍生的药物；然而，目前这些药物尚未成功用于诱导或维持患者的临床缓解。
IL-25在哮喘患者的样品中也显示出上调(据估计哮喘这种病症在世界范围内影响超过3亿人)，这表明该细胞因子的过表达导致了哮喘和相关病症的病变。
因此，需要可用于治疗以IL-25过表达为特征的疾病和病症(包括哮喘和炎性肠疾病)的有效IL-25拮抗剂。
发明内容
本发明涉及针对白介素25(IL-25)的靶结合成员，包括抗体及其结合片段。
本发明还涉及鼠2C3抗体的人源化(CDR-移植)类型RH2.5R71V的变体，本文也使用术语“huDDG91”和“M9”称呼。一种此类变体在本文中称为“M6抗体”或“M6”。M6表现出多种有益的体外和体内特性，包括(例如)相对于亲本huDDG91抗体而言增强了对IL-25的结合亲和力，在基于受体和细胞的测定法中相对于亲本huDDG91抗体而言提高了抑制IL-25受体的能力，以及其他特性，例如高表达水平，高溶解度，在纯化时不发生显著的蛋白质聚集，以及在纯化时不存在不需要的翻译后修饰、蛋白质-蛋白质相互作用和氧化。
在一个实施例中，本发明涉及结合IL-25的靶结合成员，其中靶结合成员结合一条或多条选自如下的氨基酸序列：SEQ ID NO：17的第46-63位氨基酸残基、SEQ ID NO：17的第66-84位氨基酸残基和SEQ ID NO：17的第129-135位氨基酸残基。在具体实施例中，本发明的靶结合成员结合SEQ IDNO：17的第56-63位氨基酸残基和SEQ ID NO：17的第66-74位氨基酸残基。在另一个实施例中，靶结合成员包含抗体VL结构域，抗体VL结构域包含具有氨基酸序列QQYLAFPYTF(SEQ ID NO：8)的CDR3。
在另一个实施例中，本发明涉及结合IL-25的靶结合成员，其中靶结合成员包含：
a)抗体VL结构域，其包含具有氨基酸序列SASQGISNYLN(SEQ IDNO：6)的CDR1、具有氨基酸序列YTSSLHS(SEQ ID NO：7)的CDR2和具有氨基酸序列QQYLAFPYTF(SEQ ID NO：8)的CDR3；以及
b)抗体VH结构域，其包含具有氨基酸序列GYTMN(SEQ ID NO：10)的CDR1、具有氨基酸序列LINPYNGGTSYNQNFKG(SEQ IDNO：11)的CDR2和具有氨基酸序列EDYDGYLYFAMDY(SEQ IDNO：12)的CDR3。
在具体实施例中，靶结合成员包含具有SEQ ID NO：5的VL结构域和具有SEQ ID NO：9的VH结构域。在其他实施例中，靶结合成员包含全抗体。
在多个实施例中，本发明还涉及分离的核酸(其包含编码本发明靶结合成员的核苷酸序列)、包含此类核酸的表达载体和携带此类表达载体的宿主细胞。
在另一个实施例中，本发明涉及产生靶结合成员的方法，该方法包括在适于产生靶结合成员的条件下培养本发明的宿主细胞。
在其他实施例中，本发明提供包含本发明靶结合成员和可药用载体的组合物。
在另外的实施例中，本发明涵盖在有所需要的受试者中治疗或预防疾病或病症的方法，包括(但不限于)哮喘和炎性肠疾病。
在其他实施例中，本发明提供本发明靶结合成员的用法，例如以药物组合物的形式用于治疗疾病或病症，包括炎性病症例如哮喘(包括变应性哮喘)和炎性肠疾病(如克罗恩氏病(Crohn’s disease)和溃疡性结肠炎)。
在另一个实施例中，本发明涉及与结合一条或多条氨基酸序列的靶结合成员竞争结合IL-25的靶结合成员，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：17的第46-63位氨基酸残基、SEQ ID NO：17的第66-84位氨基酸残基和SEQID NO：17的第129-135位氨基酸残基。在具体实施例中，靶结合成员对人IL-25具有小于或等于约50pM的结合亲和力。
在另一个实施例中，本发明还涉及本发明靶结合成员，其包含：
a)抗体VL结构域，其包含相对于SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有1至约20个氨基酸置换的氨基酸序列；
b)抗体VH结构域，其包含相对于SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有1至约20个氨基酸置换的氨基酸序列；或
c)它们的组合。
在另一个实施例中，本发明提供产生本发明靶结合成员的方法，其包括：
(a)提供编码VL结构域的核酸的起始库，其中核酸包含待置换的CDR3编码区或缺乏CDR3编码区；
(b)将起始库与编码具有氨基酸序列QQYLAFPYTF(SEQ ID NO：8)的VL CDR3的供体核酸组合，其中供体核酸插入库中的一条或多条核酸中，以形成编码VL结构域的核酸的产物库，所述VL结构域包含具有氨基酸序列QQYLAFPYTF(SEQ ID NO：8)的VL CDR3；
(c)表达产物库的核酸以形成靶结合成员；
(d)选择特异性结合一条或多条序列的靶结合成员，所述序列选自SEQ ID NO：17的第56-63位氨基酸残基、SEQ ID NO：17的第66-74位氨基酸残基和SEQ ID NO：17的第129-135位氨基酸残基；以及
(e)回收靶结合成员或编码靶结合成员的核酸。
附图说明
本专利或专利申请文件包含至少一张绘制成彩色的附图。在提出请求并且支付必要的费用后，美国专利和商标局将会提供本专利或专利申请公开的带彩图副本。
图1示出了huDDG91/RH2.5 R71V抗体的κ轻链核苷酸序列(SEQ IDNO：1)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。加下划线的氨基酸序列代表CDR。不包含前导序列。
图2示出了huDDG91/RH2.5 R71V抗体的重链核苷酸序列(SEQ IDNO：3)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。加下划线的氨基酸序列代表CDR。不包含前导序列。
图3是显示9个候选单克隆抗体(包括M6)的性质的表格，这些抗体通过筛选基于huDDG91/RH2.5 R71V抗体的25个成员组合文库来识别。斜体代表从不同的数据集获得的数字。R71V G1是指huDDG91抗体。两行R71V G1代表来自两个不同数据集的测量值。疏水性增加的残基以黄色突出显示。
图4A示出了M6抗体的轻链(SEQ ID NO：5)及其CDR(SEQ ID NO：6-8)的氨基酸序列。加下划线的氨基酸序列代表CDR的位置。不包含前导序列。加粗红色字体的氨基酸残基表示相对于亲本huDDG91/RH2.5 R71V序列的氨基酸置换。
图4B示出了M6抗体的重链(SEQ ID NO：9)及其CDR(SEQ ID NO：10-12)的氨基酸序列。加下划线的氨基酸序列代表CDR的位置。不包含前导序列。
图5为图表，显示在抑制IL-4/IL25介导的天然人CD4+T细胞的IL-5分泌方面，M6抑制程度大于huDDG91(M9)抗体，所述天然人CD4+T细胞在存在rhIL-4和rhIL-25的情况下使用自体树突状细胞刺激4天。同种型IgG1抗体(iso)用作对照。n＝4个供体。
图6A和6B为图表，显示在LS174T细胞中相对于huDDG91(M9)抗体而言，M6抗体增强了对IL-25介导的GROa分泌的抑制，所述LS174T细胞使用重组人IL-25刺激24小时。图6A和6B的图表代表来自两个单独实验的教据。
图7A显示人IL-25的第1-78位氨基酸残基(SEQ ID NO：13)的序列覆盖图，所述人IL-25用胃蛋白酶消化，用2M脲、1M TCEP(pH 3.0)淬灭反应。黑色线条是观察到的肽。
图7B显示人IL-25的第79-146位氨基酸残基(SEQ ID NO：14)的序列覆盖图，所述人IL-25用胃蛋白酶消化，用2M脲、1M TCEP(pH 3.0)淬灭反应。黑色线条是观察到的肽。
图8A和8B显示在H/D交换实验中M6抗体结合时人IL-25蛋白质(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)的不同片段氘化水平的差异。每个方块代表人IL-25肽，并且包含六个时间点的数据：pH 6下150s和500s，以及pH 7下150s、500s、1,500s和5,000s。深蓝色表示在M6抗体结合时无保护。其他颜色表示溶液正向/柱逆向(on-solution/off-column)交换后的氘比柱正向/柱逆向(on-column/off-column)交换后的更多，如右侧插图所示。连接到每个离子的前两个氨基酸残基中任一个的氘在分析(水环境中的消化/分离/质量分析)期间失去，这解释了H/D-Ex图案中的小间隙。
图9A-9F是图表，显示在pH 6和pH 7、3℃下使用M6抗体柱进行正向/逆向交换后，人IL-25的不同片段中的氘含量。蓝色表示溶液正向/柱逆向交换，紫色表示柱正向/柱逆向交换。所有交换时间均转换为在pH 7、23℃下的等效值(如在pH 6、3℃下的150s等于在pH 7、23℃下的1.85s)。每个片段中代表的人IL-25残基在每个图的顶部示出。
图10示出人IL-25的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。
具体实施方式
本发明部分基于高亲和力人IL-25抗体(本文称为“M6”)的鉴定(参见实例1)以及M6抗体结合的人IL-25中氨基酸残基的鉴定，如通过氢/氘(H/D)交换质谱法确定(参见实例3)。因此，在一个实施例中，本发明涉及结合IL-25的靶结合成员，其中靶结合成员结合一条或多条氨基酸序列，其选自人IL-25(SEQ ID NO：17)的第46-63位、第66-84位和第129-135位氨基酸残基。因此，本发明的靶结合成员可结合SEQ ID NO：17的第46-63位氨基酸残基、SEQ ID NO：17的第66-84位氨基酸残基、或SEQ IDNO：17的第129-135位氨基酸残基、或它们的任何组合。在一个实施例中，本发明的靶结合成员结合SEQ ID NO：17的第56-63位氨基酸和SEQ IDNO：17的第66-74位氨基酸。
如本文所用，“靶结合成员”是指包含具有免疫球蛋白分子的至少一部分的分子的任何蛋白质或肽，所述免疫球蛋白分子的至少一部分包含重链或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或它们的配体结合部分，所述配体结合部分特异性结合哺乳动物(例如人)IL-25蛋白质或它们的一部分。此类靶结合成员还可包括抗体重链或轻链可变区的至少一部分、抗体重链或轻链恒定区的至少一部分、抗体骨架区的至少一部分、或它们的任何组合。此类靶结合成员在体外、原位和/或体内调节、减小、拮抗、减轻、缓解、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种IL-25的活性或结合，或IL-25受体的活性或结合。作为非限制性例子，合适的本发明靶结合成员可高亲和力地结合至本文所述M6抗体所识别的人IL-25的抑制和/或中和表位。
本发明的靶结合成员不限于仅结合SEQ ID NO：17的第46-63位氨基酸残基、第66-84位氨基酸残基和/或第129-135位氨基酸残基的那些成员。因此，在一些实施例中，本发明的靶结合成员可另外结合至人IL-25中不涵盖SEQ ID NO：17的第46-63位氨基酸残基、第66-84位氨基酸残基和/或第129-135位氨基酸残基的一个或多个其他部分。在其他例子中，本发明的靶结合成员可另外结合至人IL-25中侧接SEQ ID NO：17的第46-63位氨基酸残基、第66-84位氨基酸残基和/或第129-135位氨基酸残基的一个或多个氨基酸残基。
本发明还设想这样的靶结合成员，其结合涵盖在SEQ ID NO：17的第46-63位氨基酸残基、第66-84位氨基酸残基和/或第129-135位氨基酸残基内的人IL-25的一个或多个部分，例如由SEQ ID NO：17的第46-63位氨基酸残基、第66-84位氨基酸残基和/或第129-135位氨基酸残基中至少5个氨基酸组成的IL-25部分。靶结合成员可结合的IL-25的示例性部分包括SEQID NO：17的第56-63位氨基酸和/或第66-74位氨基酸。
本发明靶结合成员结合的IL-25的区或表位可使用本发明所属领域熟知的多种标准表位绘图技术中的任何一种确定。此类技术包括(例如)与结合测定法联合使用的定点诱变、使用肽针进行的表位绘图(例如Geysen et al.，Peptides：Chem istry and Biological，Proceedings of the Twelfth American PeptideSymposium，p.519-523，Ed，G.R.Marshall，Escom，Leiden，1988(Geysen等人，“肽：化学和生物学”，《第十二届美国肽研讨会论文集》，第519-523页，G.R.Marshall、Escom、Leiden编辑，1988年))、X射线结晶学和氢/氘(H/D)交换技术(如H/D交换质谱法)。
如本文所述，H/D交换质谱法用于确定M6抗体识别和结合的人IL-25中的表位(参见实例3和图8A、8B和9A-9F)。在从水向基于氘的溶剂体系(重水)转移时，随着蛋白质的氢原子逐渐被氘核(氢的更重同位素)置换，蛋白质将经历质量的增加。氢/氘交换事件的可能性主要由蛋白质结构和溶剂可及性决定。H/D交换质谱法用于测量交换，从而测量蛋白质结构和溶剂可及性。当小分子或蛋白质结合伙伴结合至蛋白质靶标时，该靶标经历实验上可观察的交换速率的变化。在复合物形成时排斥溶剂的表面区交换要慢很多。溶剂被排斥区域可用于推断结合位点的位置。例如，就抗原-抗体相互作用来说，这些变化突出显示了表位的位置。
通常，本发明的靶结合成员将包含抗体轻链可变区(VL)结构域，其与抗体重链可变区(VH)结构域配对形成IL-25结合域。在制备本文所述发明的过程中，发现将huDDG91抗体VL结构域(SEQ ID NO：1)中的互补决定区(CDR)，特别是CDR3区改变为QQYLAFPYTF(SEQ ID NO：8)，可改善huDDG91抗体的结合亲和力。因此，本文所述的发明设想了包含SEQ IDNO：8的VL结构域和包含此类VL结构域的靶结合成员。在一些实施例中，本发明靶结合成员中的VL结构域还包含来自M6和huDDG91抗体的CDR1(SASQGISNYLN(SEQ ID NO：6))和CDR2(YTSSLHS(SEQ ID NO：7))区。适于包含在本发明靶结合成员中的其他VL CDR区包括(但不限于)图3中示出的任何VL CDR1区。在一个实施例中，本发明的靶结合成员包括M6抗体的VL结构域SEQ ID NO：5。
在一些实施例中，本发明的靶结合成员还包括具有对应于M6和huDDG91抗体的CDR区的SEQ ID NO：10-12的VH结构域。适于包含在本发明靶结合成员中的其他VH CDR区包括(但不限于)图3中示出的任何VH CDR3区。在优选的实施例中，本发明的靶结合成员包括M6和huDDG91抗体的VH结构域SEQ ID NO：9。VH结构域可与除M6抗体的VL结构域(SEQ ID NO：5)之外的多个VL结构域配对。优选地，VH结构域与包含CDR3区的VL结构域(具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列)配对。
本文所述的M6抗体的CDR的序列可通过插入、置换和缺失来修饰，并且包括在本发明的靶结合成员中，只要具有修饰的CDR的靶结合成员(例如抗体)能维持结合到人IL-25和抑制人IL-25的能力。普通技术人员可通过执行本文所述的功能测定法来确定该活性的维持。本发明靶结合成员中的CDR与对应的SEQ ID NO：6、7、8、10、11或12表示的M6CDR相比，可具有(例如)约50％至约100％的同源性，优选地约80％至约100％的同源性，更优选地约90％至约100％的同源性。在一个实施例中，本发明靶结合成员中的CDR与对应的SEQ ID NO：6、7、8、10、11或12表示的M6CDR相比，可具有约100％的同源性。
根据本发明的靶结合成员可结合IL-25，其亲和力基本上类似于、或大于本文所述的M6抗体的亲和力。例如，本发明的靶结合成员对IL-25(例如人IL-25)可具有约50pM(例如约53pM)或更小，例如约45pM、约40pM、约35pM、约30pM、约25pM或约20pM的结合亲和力。靶结合成员将通常具有IL-25特异性。因此，靶结合成员将不会表现出任何显著的与除其特异性结合伙伴之外的分子结合。例如，已经发现的是本文所述的M6抗体不会与IL-17A、IL-17C、IL-17D或IL-17F交叉反应。在本发明的一些实施例中，避免此类与其他涉及哮喘的细胞因子的交叉反应和类似过程是靶结合成员的所需特征。
靶结合成员抗原的亲和力或亲合力可使用任何合适的方法通过实验确定。(参见例如Berzofsky et al.，“Antibody-Antigen Interactions，”inFundamental Immunology，Paul，W.E.，Ed.，Raven Press：New York，N.Y.(1984)(Berzofsky等人，“抗体-抗原相互作用”，载于《基础免疫学》，Paul，W.E.编辑，雷文出版社，纽约州纽约市，1984年)；Kuby，Janis，Immunology，W.H.Freeman and Company：New York，N.Y.(1992)(Kuby、Janis，《免疫学》，W.H.弗里曼公司，纽约州纽约市，1992年)；以及本文所述的方法)。如果在不同的条件(例如，盐浓度、pH)下测量，则测得的特定抗体-抗原相互作用的亲和力会不同。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如KD、Ka、Kd)的测量优选地用抗体和抗原的标准溶液以及标准缓冲液(例如本文所述的缓冲液)来进行。
例如，特异性可通过结合测定法，例如使用一组抗原的ELISA、Biacore测定法和/或Octet测定法等等来确定。根据本发明的靶结合成员可识别IL-25而非IL-17家族的其他成员，尤其是IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D和IL-17F中的任何一者；在一个实施例中，所有五个这些分子。根据本发明的靶结合成员与IL-25的结合可以通过用重组IL-25竞争消除。
不同靶结合成员的结合亲和力和中和效价可在适当的条件下比较。
本发明还涉及与结合一条或多条氨基酸序列的本发明靶结合成员竞争结合IL-25的靶结合成员，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：17的第46-63位氨基酸残基、SEQ ID NO：17的第66-84位氨基酸残基和SEQ ID NO：17的第129-135位氨基酸残基。在具体实施例中，靶结合成员对人IL-25具有小于或等于约50pM的结合亲和力。
可用本发明的靶结合成员(例如抗体)进行竞争性测定法，以确定什么蛋白质、抗体和其他拮抗剂与本发明的靶结合成员竞争与IL-25的结合和/或共享表位区。这些测定法是本领域普通技术人员熟知的，用来评估拮抗剂或配体之间对某种蛋白质(例如IL-25)上的有限数目的结合位点的竞争。将蛋白质和/或抗体在竞争之前或之后进行固定化或不溶解化，并且将结合到IL-25蛋白的样品与未结合的样品分离，例如通过倾析(在蛋白质/靶结合成员进行预先不溶解化的情况下)或通过离心(在蛋白质/抗体在竞争性反应后沉淀出来的情况下)进行分离。另外，可通过靶结合成员与蛋白的结合或无结合是否会使功能发生改变，例如靶结合成员分子是否会抑制或增强(例如)标记物的酶活性，来确定竞争性结合。可使用ELISA和其他的功能测定法，这是本领域公知的。
抗体
优选地，本发明的靶结合成员是抗体分子。术语“抗体”旨在涵盖全抗体、其消化片段、特定部分或变体，包括抗体模拟物或模拟抗体或其特定片段或部分的结构和/或功能的抗体部分，包括单链抗体及其片段；每个均包含至少一个CDR。功能片段包括结合哺乳动物IL-25的抗原结合片段。例如，能够结合到IL-25或其部分的抗体片段涵盖在本发明中，包括(但不限于)：Fab片段(如通过木瓜蛋白酶消化得到)、Fab′片段(如通过胃蛋白酶消化和部分还原得到)和F(ab′)2片段(如通过胃蛋白酶消化得到)、facb片段(如通过纤溶酶消化得到)、pFc′片段(如通过胃蛋白酶或纤溶酶消化得到)、Fd片段(如通过胃蛋白酶消化、部分还原以及重聚集得到)、Fv或scFv片段(如通过分子生物学技术得到)(参见例如Colligan，et al.，eds.，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1994 2001)(Colligan等人编辑，《免疫学实验室指南》，约翰·威利父子出版公司，纽约，1994、2001年)；Colligan et al.，Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY，N.Y.，(1997 2001)(Colligan等人，《蛋白质科学实验室指南》，约翰·威利父子出版公司，纽约州纽约，1997、2001年))。
通过本领域中已知和/或本文描述的酶促切割、合成或重组技术可制备这些片段。使用其中在天然终止位点上游引入了一个或多个终止密码子的抗体基因也可以产生多种截短形式的抗体。例如，可以将编码F(ab’)2重链部分的组合基因设计成包括编码重链的CH1结构域和/或铰链区的DNA序列。抗体的各个部分可通过常规技术用化学方法连接在一起，或可使用遗传工程技术制备为连续蛋白质。
如本文所用，术语“抗体”还旨在涵盖“嵌合”抗体和“人源化”或“CDR-移植”抗体，所述抗体包括本文描述的M6CDR与一种或多种衍生自非鼠源，优选地人抗体的蛋白质或肽的任何组合。根据本发明，提供嵌合或人源化抗体，其中CDR衍生自M6抗体。因此，在一个实施例中，抗体的人源部分可以包括基本上在人体中为非免疫原性的区域。衍生自人抗体的抗体的区域不需要与人抗体具有100％的同一性。在优选的实施例中，保留了尽可能多的人氨基酸残基，使得免疫原性可以忽略不计，但可以根据需要修饰人残基以支持CDR形成的抗原结合位点，同时使抗体的人源化程度最大化。这些改变或变异任选且优选相对于未经修饰的抗体而言保持或减少在人或其他物种中的免疫原性。人源化抗体可由能够表达功能性重排的人免疫球蛋白(例如重链和/或轻链)基因的非人动物或原核或真核细胞产生。此外，当抗体是单链抗体时，它可包含在天然人抗体中不存在的连接肽。例如，Fv可包含连接重链可变区和轻链可变区的连接肽，例如2至约8个甘氨酸或其他氨基酸残基。此类连接肽被认为是人源的。
作为另外一种选择，图4A和4B中M6抗体的整个重链可变区和轻链可变区(SEQ ID NO：5和9)可以与人恒定区和骨架区组合形成本发明的靶结合成员。
编码本发明靶结合成员恒定(C)区的人基因可通过已知的方法衍生自人胎肝库。人C区基因可衍生自任何人细胞，包括表达和产生人免疫球蛋白的那些细胞。人CH区可衍生自任何已知类型或同种型的人H链，包括γ、μ、α、δ、ε及其亚型，例如G1、G2、G3和G4。由于H链同种型负责抗体的各种效应子功能，所以CH区的选择将由所需的效应子功能，例如补体结合或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的活性来引导。在一个实施例中，CH区衍生自γ1(IgG1)。
人CL区可衍生自人L链同种型κ或λ中的一者，优选地κ。
编码人免疫球蛋白C区的基因可通过标准克隆技术从人类细胞获得(例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，第2版，冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港，1989年)和Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology(1987，1993)(Ausubel等人编辑，《分子生物学实验室指南》，1987、1993年))。人C区基因可从包含代表两种类型L链、五种类型H链及其亚类的基因的已知克隆容易地获得。嵌合抗体片段，例如F(ab1)2和Fab可通过设计适当截短的嵌合H链基因来制备。例如，编码F(ab1)2片段的H链部分的嵌合基因可包含编码H链的CH1结构域和铰链区的DNA序列，然后是翻译终止密码子以产生截短的分子。
一般来讲，在一个例子中，通过克隆编码M6抗体的H和L链抗原结合区的DNA片段，并将这些DNA片段与分别编码CH和CL区的DNA片段连接，以产生编码嵌合免疫球蛋白的基因来产生本发明的嵌合抗体、片段和区域。
因此，在一个实施例中，产生包含第一DNA片段的融合嵌合基因，所述第一DNA片段编码至少非人源的抗原结合区，例如功能重排V区，并通过连接(J)片段连接至编码至少部分人C区的第二DNA片段。
M6抗体可变区的序列可以通过插入、置换和缺失来修饰，只要靶结合成员能维持结合到人IL-25和抑制人IL-25的能力。
为了方便起见，本文采取Kabat等人的编号方案。残基以小写数字或必要的连字符标明，以使本发明的序列与标准Kabat编号序列一致。
根据本发明，就CDR-移植或人源化抗体(其中M6抗体的CDR区与人源区组合)来说，亲本抗体(例如M6)特异性的残基可保留在FR区中。已证明在其他抗体的人源化中具有关键作用的残基也可以保留。可在一定程度上遵循这些准则，但必需支持CDR形成的抗原结合位点，同时使抗体的人源化程度最大化。
用于工程化的或人源化非人或人抗体的方法也可以使用并且是本领域所熟知的。一般来讲，人源化或工程化的抗体具有来自非人来源的一个或多个氨基酸残基，所述非人来源例如(但不限于)小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或其他哺乳动物。这些人氨基酸残基通常称为“输入”残基，它们一般取自已知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其他结构域。已知的人Ig序列是公开的，例如在多个公共数据库(例如美国国立卫生研究院(National Institute of Health)的NCBI数据库)或出版物(例如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)(Kabat等人，《具有免疫学重要性的蛋白质序列》，美国卫生部，1983年))中公开。
如本领域所知，此类输入序列可用于减少免疫原性，或减少、增强或修饰结合性、亲和力、结合速率、解离速率、亲合力、特异性、半衰期或任何其他合适的特征。一般来讲，可保留部分或全部非人或人CDR序列，而可变区和恒定区的非人序列用人源或其他氨基酸置换。抗体还可任选是人源化的，保留对抗原的高度亲和力以及其他有利的生物学特性。为了实现该目标，可任选通过这样的过程来制备人源化抗体，该过程是用亲本序列和人源化序列的三维模型对亲本序列和各种构想的人源化产物进行分析。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是为本领域的技术人员所熟悉的。有能说明并显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序可供使用。对这些显示结果进行检查，可以分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可从共有序列和输入序列中选择FR残基并进行组合，从而可实现所需的抗体特征，例如对靶抗原的亲和力增加。通常，CDR残基直接且最显著地参与影响抗原结合。本发明抗体的人源化或工程化可使用任何已知方法进行，例如但不限于Jones et al.，Nature 321：522(1986)(Jones等人，《自然》，第321卷，第522页，1986年)；Riechmann et al.，Nature 332：323(1988)(Riechmann等人，《自然》，第332卷，第323页，1988年)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534(1988)(Verhoeyen等人，《科学》，第239卷，第1534页，1988年)；Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)(Sims等人，《免疫学杂志》，第151卷，第2296页，1993年)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196：901(1987)(Chothia和Lesk，《分子生物学杂志》，第196卷，第901页，1987年)；Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)(Carter等人，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第4285页，1992年)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993)(Presta等人，《免疫学杂志》，第151卷，第2623页，1993年)；美国专利No.5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539、4,816,567、PCT/US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755、WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246(每个专利全文，包括其中引用的文献以引用方式并入本文)中描述的那些方法。
本发明靶结合成员的人恒定区可以为任何类型(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同种型，并且可包含κ或λ轻链。在一个实施例中，人恒定区包含IgG重链或限定片段，例如，至少一种同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另一个实施例中，靶结合成员包含IgG1重链和IgG1K轻链。本发明分离的靶结合成员可包含任何合适的多核苷酸编码的本文所公开的抗体氨基酸序列。优选地，靶结合成员结合人IL-25，因此部分或基本上中和蛋白质的至少一种生物活性。靶结合成员或其特定部分或变体，部分地或优选地基本上中和至少一种IL-25蛋白或片段的至少一种生物活性，从而抑制通过IL-25与IL-25受体结合或通过其他IL-25依赖性或介导的机制介导的活性。如本文所用，术语“中和抗体”是指取决于测定，可以使IL-25依赖性活性抑制约20-100％的抗体，优选地抑制至少约10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或更多。靶结合成员抑制IL-25依赖性活性的能力优选地通过本文所述的和/或本领域已知的至少一种合适的IL-25蛋白或受体测定来进行评估。
至少一种本发明的抗体结合至少一个本文具体说明的表位，M6抗体结合至该表位。该至少一个表位可包含至少一个抗体结合区，该抗体结合区包含所述蛋白质的至少一部分，该表位优选由所述蛋白质的至少一个细胞外的、可溶性的、亲水的、外部的或胞质的部分构成。一般来讲，本发明的靶结合成员将包含这样的抗原结合区，该抗原结合区包含SEQ ID NO.10、11和12的至少一个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)或至少一个重链可变区的变体和至少一个人互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)(SEQ IDNO.6、7和8)或至少一个轻链可变区的变体。
结合到人IL-25并且包含限定重链或轻链可变区或CDR区的靶结合成员可使用合适的方法，例如噬菌体展示(Katsube，Y.，et al.，Int J.Mol.Med，1(5)：863868(1998)(Katsube，Y.等人，《国际分子医学杂志》，第1卷，第5期，第863-868页，1998年))或采用转基因动物的方法制备，如本领域已知的和/或本文所述的。例如，抗体、特定部分或变体可以使用编码核酸或其部分在合适的宿主细胞中表达。
如上所述，本发明还涉及包含氨基酸序列的抗体、抗原结合片段、免疫球蛋白链和CDR，所述氨基酸序列基本上与本文所述的M6氨基酸序列相同。此类抗IL-25抗体可包含一个或多个得自天然突变或人为操纵的氨基酸置换、缺失或添加，如本文所说明。优选地，此类抗体或抗原结合片段和包含此类链或CDR的抗体可以高亲和力(例如小于或等于约10-9M的KD)结合人IL-25。基本上与本文所述序列相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸置换以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸置换是指用第二种氨基酸置换第一种氨基酸，所述第二种氨基酸具有的化学和/或物理性质(例如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)与第一种氨基酸相似。保守置换包括一个氨基酸被另一个如下组中的氨基酸置换：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
技术人员可以进行的氨基酸置换数取决于许多因素，包括上文所述的那些。一般来讲，对于任何给定的抗IL-25抗体、片段或变体的氨基酸置换、插入或缺失数目将不超过40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个，例如1-30个或其中的任何范围或值，如本文说明。
可通过本领域已知的方法来鉴定本发明的靶结合成员中对于功能而言必需的氨基酸，所述方法例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如Ausubel，出处同上，第8、15章；Cunningham and Wells，Science 244：1081 1085(1989)(Cunningham和Wells，《科学》，第244卷，第1081-1085页，1989年))。后一种方法在分子的每个残基处引入单丙氨酸突变。随后测试所得突变分子的生物活性，例如但不限于至少一种IL-25中和活性。抗体结合至关重要的位点也可以通过结构分析进行鉴定，例如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith，et al.，J.Mol.Biol.224：899 904(1992)(Smith等人，《分子生物学杂志》，第224卷，第899-904页，1992年)和de Vos，et al.，Science 255：306 312(1992)(de Vos等人，《科学》，第255卷，第306-312页，1992年))。
本发明的靶结合成员可包括(但不限于)选自SEQ ID NO：5-12中至少一者的5个至全部邻接氨基酸的至少一个部分、序列或组合。
靶结合成员还可任选包含SEQ ID NO：5或9中至少一者的70-100％的邻接氨基酸中的至少一者所成的多肽。
在一个实施例中，免疫球蛋白链或其部分(如可变区、CDR)的氨基酸序列与SEQ ID NO：5或9中至少一者的相应链的氨基酸序列具有约70-100％的同一性(如70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任何范围或值)。例如，轻链可变区的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：5的序列进行比较，或者重链可变区的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：9进行比较。优选地，用本领域已知的合适计算机算法确定出70-100％氨基酸同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或者其中的任何范围或值)。
在SEQ ID NO：5和9中提供了示例性重链和轻链可变区序列。本发明的靶结合成员或其特定变体可包含任何数目的来自本发明抗体的邻接氨基酸残基，其中该数目选自靶结合成员中邻接残基数目的10-100％的整数。任选地，该邻接氨基酸亚序列长度为至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多个氨基酸，或其中的任何范围或数值。此外，所述亚序列的数目可以为选自1至20的任何整数，例如至少2、3、4或5。
技术人员将会知道，本发明包括本发明的至少一种生物活性抗体。生物活性抗体的比活性为天然(非合成)的、内源性或相关的和已知的抗体比活性的至少20％、30％或40％，并且优选地至少50％、60％或70％，并且最优选至少80％、90％或95％-1000％。测定和定量酶活性和底物特异性的度量的方法是本领域技术人员公知的。
在另一个方面，本发明涉及通过共价连接有机部分进行修饰的本文所述靶结合成员。这种修饰可产生具有改善的药物代谢动力学性质(如体内血清半衰期增加)的抗体或抗原结合片段。有机部分可以是线性或分支的亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在具体实施例中，亲水性聚合物基团可具有约800至约120,000道尔顿的分子量，并且可以是聚链烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，并且脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含约8至约40个碳原子。
本发明的修饰的靶结合成员可包含一个或多个直接或间接地共价键合到该抗体的有机部分。与本发明的抗体或抗原结合片段结合的每个有机部分可以独立地是亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文所用，术语“脂肪酸”涵盖单羧酸和二羧酸。本文所用的术语“亲水聚合基团”是指在水中比在辛烷中更易溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶。因此，通过共价连接聚赖氨酸来修饰的抗体包括在本发明内。适用于修饰本发明抗体的亲水聚合物可以是直链或支链的，并且包括(例如)聚链烷二醇(例如PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水性氨基酸聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚环氧链烷(例如，聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明抗体的亲水聚合物作为单独的分子实体具有约800至约150,000道尔顿的分子量。例如可使用PEG5000和PEG20,000，其中下标是聚合物的平均分子量(道尔顿)。亲水聚合基团可以由1至约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。由脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水聚合物可以通过采用合适的方法制备。例如，包含胺基的聚合物可以与脂肪酸或脂肪酸酯的羧基偶联，并且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧基(例如用N，N-羰基二咪唑活化)可以与聚合物上的羟基偶联。
适用于修饰本发明抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的或可包含一个或多个不饱和单位。适用于修饰本发明抗体的脂肪酸包括(例如)正十二烷酸(C12，月桂酸)、正十四烷酸(C14，肉豆蔻酸)、正十八烷酸(C18，硬脂酸)、正二十烷酸(C20，花生酸)、正二十二烷酸(C22，山嵛酸)、正三十烷酸(C30)、正四十烷酸(C40)、顺式-δ9-十八烷酸(C18，油酸)、全顺式-δ5，8，11，14-二十碳四烯酸(C20，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含直链或支链的低级烷基的二羧酸单酯。低级烷基可包含1至约12个，优选1至约6个碳原子。
修饰的靶结合成员可使用合适的方法来制备，例如通过与一种或多种修饰剂反应来制备。本文所用的术语“修饰剂”是指包含活化基团的合适有机基团(例如亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”是化学部分或官能团，它们可在合适条件下与第二化学基团反应，由此在修饰剂和第二化学基团之间形成共价键。例如，胺反应性活化基团包括亲电子基团，例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可以与硫醇反应的活化基团包括(例如)马来酰亚胺、碘代乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛官能团可以与含胺或酰肼的分子偶联，并且叠氮基可以与三价含磷基团反应以形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键。将活化基团引入分子的合适方法是本领域已知的(参见例如Hermanson，G.T.，BioconjugateTechniques，Academic Press：San Diego，Calif.(1996)(Hermanson，G.T.，《生物交联技术》，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥，1996年))。活化基团可直接或通过接头部分与有机基团(例如亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)键合，所述接头部分例如为其中一个或多个碳原子可由杂原子(例如氧、氮或硫)取代的二价C1-C12基团。合适的接头部分包括例如四乙二醇、--(CH2)3--、--NH--(CH2)6--NH--、--(CH2)2--NH--和--CH2--O--CH2--CH2--O--CH2--CH2--O--CH--NH--。包含接头部分的修饰剂，可例如通过使单-Boc-烷基二胺(例如单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)存在下反应以在游离胺和脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键来产生。可通过用三氟乙酸(TFA)处理从产物除去Boc保护基以暴露出伯胺，后者可偶联到另一羧酸酯(如所描述)，或者可与马来酸酐反应并且所得的产物环化以产生脂肪酸的活化马来酰亚胺基衍生物。(参见例如Thompson等人的WO 92/16221，该专利的全部教导内容以引用方式并入本文。)
本发明的修饰的靶结合成员可以通过使人抗体或抗原结合片段与修饰剂反应来产生。例如，有机部分可以通过使用胺反应性改性剂(例如PEG的NHS酯)以非位点特异性方式结合至抗体。修饰的人抗体或抗原结合片段还可以通过使抗体或抗原结合片段的二硫键(例如链内二硫键)还原来制备。还原的抗体或抗原结合片段随后可以与硫醇反应性改性剂反应以产生本发明的修饰抗体。包含与本发明抗体特定位点键合的有机部分的修饰的人抗体和抗原结合片段可使用合适的方法制备，所述方法例如为逆向蛋白水解作用(Fisch et al.，Bioconjugate Chem.，3：147 153(1992)(Fisch等人，《生物交联化学》，第3卷，第147-153页，1992年)；Werlen et al.，BioconjugateChem.，5：411 417(1994)(Werlen等人，《生物交联化学》，第5卷，第411-417页，1994年)；Kumaran et al.，Protein Sci.6(10)：22332241(1997)(Kumaran等人，《蛋白质科学》，第6卷，第10期，第2233-2241页，1997年)；Itoh et al.，Bioorg.Chem.，24(1)：5968(1996)(Itoh等人，《生物有机化学》，第24卷，第1期，第59-68页，1996年)；Capellas et al.，Biotechnol.Bioeng.，56(4)：456463(1997)(Capellas等人，《生物技术和生物工程》，第56卷，第4期，第456-463页，1997年))，以及Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，Calif.(1996)(Hermanson，G.T.，《生物交联技术》，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥，1996年)中描述的方法。
用于本发明方法和组合物的靶结合成员特征在于结合到IL-25的高亲和力，并且任选地具有低毒性。具体地讲，本发明的靶结合成员(其中各个组分，例如可变区、恒定区和骨架区单独和/或共同地、任选地并且优选地具有低免疫原性)可用于本发明中。可用于本发明的靶结合成员任选特征在于它们能长期用于治疗患者，可显著减轻症状并且具有低毒性和/或可接受的毒性。低的或可接受的免疫原性和/或高亲和力以及其他合适的特性，可有助于实现治疗结果。“低免疫原性”在本文中定义为在低于约75％，或优选低于约50％的受治疗的患者中产生显著的HAHA、HACA或HAMA应答，和/或在受治疗的患者中引起低滴度(以双抗原酶免疫测定法测量小于约300，优选地小于约100)(Elliott et al.，Lancet 344：1125 1127(1994)(Elliott等人，《柳叶刀》，第344卷，第1125-1127页，1994年)，其以引用方式并入本文)。
还可以使用双特异性抗体、异种特异性抗体、异种缀合抗体或类似抗体，它们是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆的、人源化的抗体。在这种情况下，一种结合特异性针对至少一种IL-25蛋白，另一种结合特异性针对任何其他抗原。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。通常，双特异性抗体的重组产生是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein and Cuello，Nature 305：537(1983)(Milstein和Cuello，《自然》，第305卷，第537页，1983年)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生可能的10种不同抗体分子的混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤进行)相当繁琐，并且产物得率低。类似的方法在例如WO 93/08829、美国专利No.6,210,668、6,193,967、6,132,992、6,106,833、6,060,285、6,037,453、6,010,902、5,989,530、5,959,084、5,959,083、5,932,448、5,833,985、5,821,333、5,807,706、5,643,759、5,601,819、5,582,996、5,496,549、4,676,980、WO 91/00360、WO 92/00373、EP 03089、Traunecker et al.，EMBO J.10：3655(1991)(Traunecker等人，《欧洲分子生物学组织杂志》，第10卷，第3655页，1991年)、Suresh et al.，Methods inEnzymology 121：210(1986)(Suresh等人，《酶学方法》，第121卷，第210页，1996年)中有所公开，每个这些专利全文以引用方式并入本文。
IL-25
Il-25在本领域中也称为IL-17E，可得自商业来源(例如美国明尼苏达州安迪生物(R&D Systems，MN，USA))，或可以通过参考本领域可获得的IL-25的序列来克隆或合成。人IL-25的序列(SEQ ID NO：17)在图3中示出。对于抗体的产生或在免疫测定法中的使用，可使用IL-25蛋白的任何片段或片段组合(例如重组IL-25蛋白)，尤其是N-末端截短的那些。例如，市售的重组人IL-25(IL-17E)包含Tyr 33-Gly 177的成熟蛋白质序列(登录No.Q9H293)，并且市售的鼠IL-25包含小鼠IL-17E的Val 17-Ala 169残基(登录No.NP 542767)。
核酸分子
使用本文提供的信息，编码至少一个本发明靶结合成员的本发明核酸分子可使用本文所述的或本领域已知的方法获得。
本发明的核酸分子可以是RNA的形式，例如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式，或者为DNA的形式，包括但不限于，通过克隆或合成产生的cDNA和基因组DNA，或它们的任何组合。DNA可以为三链的、双链的或单链的或它们的任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以是编码链，也称为有义链，或其可以是非编码链，也称作反义链。
本发明的分离核酸分子可包括具有开放阅读框(ORF)，任选地具有一个或多个内含子的核酸分子，例如但不限于至少一个CDR的至少一个指定部分，如至少一条重链(如SEQ ID NO：10-12)或轻链(如SEQ ID NO：6-8)的CDR1、CDR2和/或CDR3；具有抗IL-25可变区的编码序列的核酸分子(如SEQ ID NO：5或9)；以及具有基本上不同于上述那些的核苷酸序列，但由于遗传密码的简并性，仍编码至少一种抗IL-25抗体的核酸分子，如本文所述和/或如本领域已知的。当然，遗传密码是本领域所熟知的。因此，对于本领域技术人员而言，应该可以按常规产生编码本发明的特异性抗IL-25抗体的此类简并核酸变体。参见，例如Ausubel等人(出处同上)，并且此类核酸变体包括在本发明中。
如本文所指出，本发明核酸分子包含编码抗IL-25抗体的核酸，所述核酸可包括(但不限于)单独编码抗体片段的氨基酸序列的那些核酸；整个抗体或其部分的编码序列；抗体、片段或部分的编码序列以及另外的序列，例如具有或不具有上述另外的编码序列的至少一种信号前导肽或融合肽的编码序列；例如至少一个内含子；还包括另外非编码序列，包括(但不限于)非编码5′和3′序列，如在转录、mRNA加工(包括剪接和聚腺苷化信号(例如mRNA的核糖体结合和稳定))中发挥作用的转录、非翻译序列；编码另外的氨基酸，例如提供另外的功能的那些氨基酸的另外编码序列。因此，编码抗体的序列可与标记序列融合，所述标记序列例如编码可促进包含抗体片段或部分的融合抗体的纯化的肽的序列。
与多核苷酸选择性杂交的多核苷酸
本发明提供在选择性杂交条件下与本文所公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，该实施例的多核苷酸可用于分离、检测和/或定量包含此类多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可用于在保藏的文库中鉴定、分离或扩增部分或全长克隆。在一些实施例中，多核苷酸是分离的基因组或cDNA序列，或者与来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA互补。
优选地，cDNA文库包含至少80％的全长序列，优选至少85％或90％的全长序列，且更优选至少95％的全长序列。cDNA文库可以进行标准化以增加罕见序列的表现。低或中等严格杂交条件一般但不是唯一地用于相对于互补序列具有减少的序列同一性的序列。中等和高严格条件可以任选用于同一性更大的序列。低严格条件允许具有约70％序列同一性的序列进行选择性杂交，并且可以用于鉴定直系同源或旁系同源序列。
任选地，本发明的多核苷酸将编码由本文所述多核苷酸编码的抗体的至少一部分。本发明的多核苷酸包含可以用于与编码本发明抗体的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见例如Ausubel(出处同上)；Colligan(出处同上)，各自全文引用方式并入本文。
核酸的构建
本发明的分离的核酸可用本领域熟知的(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术或它们的组合进行制备。
所述核酸可方便地包含除了本发明的多核苷酸之外的序列。例如，可以将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入核酸中以帮助该多核苷酸的分离。此外，可以插入可翻译序列以帮助分离翻译出的本发明多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列为纯化本发明的蛋白质提供了便利手段。本发明的核酸除编码序列以外，任选是用于本发明的多核苷酸的克隆和/或表达的载体、衔接子或接头。
可将额外序列加入这些克隆和/或表达序列来优化它们在克隆和/或表达中的功能，以帮助分离所述多核苷酸，或改进该多核苷酸向细胞中的导入。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用是本领域熟知的。(参见例如Ausubel(出处同上)；或Sambrook(出处同上))
用于构建核酸的重组方法
本发明的分离核酸组合物，例如RNA、cDNA、基因组DNA或它们的任何组合，可用多种本领域技术人员已知的克隆方法从生物来源获得。在一些实施例中，将在严格条件下与本发明多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针用于在cDNA或基因组DNA文库中鉴定所需序列。RNA的分离，以及cDNA和基因组文库的构建是本领域普通技术人员熟知的。(参见例如Ausubel(出处同上)；或Sambrook(出处同上))
核酸筛选和分离方法
cDNA或基因组文库可用基于本发明多核苷酸的序列(例如本文所公开的那些)的探针进行筛选。探针可以用于与基因组DNA或cDNA序列杂交以分离相同或不同生物中的同源基因。本领域的技术人员将会知道各种严格度的杂交可用于测定；并且杂交或洗涤介质可以是严格的。随着用于杂交的条件变得更严格，在发生双链体形成的探针和靶之间必须存在更大程度的互补性。严格性的程度可以由温度、离子强度、pH和部分变性溶剂如甲酰胺的存在中的一者或多者加以控制。例如，通过(例如)在0％至50％的范围内操纵甲酰胺的浓度使反应物溶液的极性变化，从而方便地改变杂交的严格性。对于可检测结合所需的互补性程度(序列同一性)将根据杂交介质和/或洗涤介质的严格性而变化。互补性程度将最佳为100％或70至100％或其中的任何范围或值。然而，应当理解探针和引物中较小的序列变异可以通过减少杂交和/或洗涤介质的严格性进行补偿。
扩增RNA或DNA的方法是本领域熟知的，并且基于本文给出的教导和指导，无需过多实验即可根据本发明进行使用。已知的DNA或RNA扩增方法包括(但不限于)聚合酶链反应(PCR)和相关的扩增方法(参见例如授予Mullis等人的美国专利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor等人的美国专利No.4,795,699和4,921,794；授予Innis的美国专利No.5,142,033；授予Wilson等人的美国专利No.5,122,464；授予Innis的美国专利No.5,091,310；授予Gyllensten等人的美国专利No.5,066,584；授予Gelfand等人的美国专利No.4,889,818；授予Silver等人的美国专利No.4,994,370；授予Biswas的美国专利No.4,766,067；授予Ringold的美国专利No.4,656,134)以及使用靶序列的反义RNA作为双链DNA合成模板的RNA介导的扩增(授予Malek等人的美国专利No.5,130,238，其商品名为NASBA)，这些参考文献的全部内容以引用方式并入本文。(参见例如Ausubel(出处同上)；或Sambrook(出处同上)。)
例如，可用聚合酶链反应(PCR)技术直接从基因组DNA或cDNA文库扩增本发明的多核苷酸和相关基因的序列。例如PCR和其他体外扩增方法也可用于克隆编码待表达的蛋白质的核酸序列、制备核酸以用作探针来检测样品中所需mRNA的存在，用于核酸测序，或用于其他目的。足以在整个体外扩增方法中指导技术人员的技术的例子可见于Berger(出处同上)、Sambrook(出处同上)和Ausubel(出处同上)，以及Mullis等人的美国专利No.4,683,202(1987年)；以及Innis，et al.，PCR Protocols A Guide toMethods and Applications，Eds.，Academic Press Inc.，San Diego，Calif.(1990)(Innis等人编辑，《PCR方案：方法和应用指南》，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥，1990年)。用于基因组PCR扩增的市售试剂盒是本领域已知的。参见例如，Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech)。另外，例如，T4基因32蛋白质(Boehringer Mannheim)可用于提高长PCR产物的得率。
用于构建核酸的合成方法
本发明的分离的核酸还可通过已知方法通过直接化学合成进行制备(参见，例如Ausubel等人(出处同上))。化学合成一般产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列杂交，或使用单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合来转变成双链DNA。本领域技术人员会认识到，虽然DNA的化学合成可能局限于约100个或更多个碱基的序列，但更长的序列可通过连接较短序列来获得。
重组表达盒
本发明还提供包含本发明核酸的重组表达盒。本发明的核酸序列，例如编码本发明抗体的cDNA或基因组序列，可用于构建可导入到至少一种所需宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒通常会包含与转录起始调节序列可操作地连接的本发明多核苷酸，所述转录起始调节序列会引导所述多核苷酸在预定的宿主细胞中的转录。异源和非异源(即内源)启动子两者均可用于引导本发明核酸的表达。
在一些实施例中，可在非异源形式的本发明多核苷酸的合适位置(上游、下游或内含子中)引入作为启动子、增强子或其他元件的分离核酸，以便上调或下调本发明的多核苷酸的表达。例如，可通过突变、缺失和/或置换在体内或体外改变内源启动子。
载体和宿主细胞
本发明还涉及包括本发明的分离的核酸分子的载体、用重组载体基因工程改造的宿主细胞，以及通过本领域熟知的重组技术产生至少一种抗IL-25抗体。参见例如Sambrook等人(出处同上)；Ausubel等人(出处同上)，各自全文以引用方式并入本文。
可将所述多核苷酸任选与含有可选择标记的载体连接，以在宿主中增殖。一般来讲，质粒载体在沉淀物例如磷酸钙沉淀物中，或在与带电脂质的复合物中被导入。如果载体是病毒，其可用合适的包装细胞系在体外进行包装并随后转导至宿主细胞中。
应将DNA插入物与合适的启动子可操作地连接。表达构建体还会含有转录起始位点、终止位点以及在转录区中含有用于翻译的核糖体结合位点。该构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选包括在待翻译的mRNA开始处的翻译起始密码子和在该mRNA末端适宜位置的终止密码子(例如，UAA、UGA或UAG)，对于哺乳动物或真核细胞表达优选UAA和UAG。
表达载体将优选但任选包括至少一种选择标记。此类标记包括(例如但不限于)：对于真核细胞培养，为甲氨蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利No.4,399,216、4,634,665、4,656,134、4,956,288、5,149,636、5,179,017)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利No.5,122,464、5,770,359、5,827,739)抗性基因，对于大肠杆菌(E.coli)和其他细菌或原核生物培养，为四环素或氨苄青霉素抗性基因(以上专利全文以引用方式并入本文)。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。合适的载体对于技术人员来说将是显而易见的。载体构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他已知方法来实现。此类方法已在本领域中有所描述，例如Sambrook(出处同上)，第1、4和16、18章；Ausubel(出处同上)，第1、9、13、15、16章。
本发明的至少一种抗体可以以修饰形式(例如融合蛋白)表达，并且可不仅包括分泌信号，而且还可包括额外的异源功能区。例如，可将额外的氨基酸(尤其是带电氨基酸)的区域加至抗体的N-端，以提高纯化期间或随后的处理和保藏期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。同样，可将肽部分加至本发明的抗体以帮助纯化。这些区域可在抗体或其至少一个片段的最终制备前除去。此类方法在许多标准实验室手册中有所描述，例如Sambrook(出处同上)，第17.29、17.42和18.1、18.74章；Ausubel(出处同上)，第16、17和18章。
本领域技术人员可认识到许多表达系统可用于表达编码本发明蛋白质的核酸。
或者，本发明的核酸可以在包含编码本发明抗体的内源DNA的宿主细胞中通过开启(通过操纵)在宿主细胞中进行表达。此类方法是本领域熟知的，例如，如美国专利No.5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中所述，这些专利全文以引用方式并入本文。
可用于生产抗体、其特定部分或变体的细胞培养物的例子是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统通常将是细胞单层的形式，但是也可以使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。在本领域中已经开发了许多能够表达完整糖基化蛋白的合适宿主细胞系，包括COS-1(例如ATCC CRL 1650)、COS-7(例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCC CRL-10)、CHO(例如ATCC CRL 1610)和BSC-1(例如ATCC CRL-26)细胞系、Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等，它们可容易地从(例如)弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Va)(www.atcc.org)获得。优选的宿主细胞包括淋巴样来源的细胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC登记号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登记号CRL-1851)。在尤其优选的实施例中，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。
这些细胞的表达载体可包括以下的表达控制序列中的一者或多者，例如但不限于：复制起点；启动子，例如晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利No.5,168,062、5,385,839)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利No.5,266,491)、至少一种人免疫球蛋白启动子；增强子和/或加工信息位点例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag聚A添加位点)和转录终止子序列。参见例如Ausubel等人(出处同上)；Sambrook等人(出处同上)。可用于产生本发明的核酸或蛋白质的其他细胞也是已知的和/或可例如从美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(www.atcc.org)或其他已知的来源或商业来源得到。
当采用真核宿主细胞时，通常将多腺苷酸化或转录终止序列整合进载体内。终止序列的例子是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。还可包括用于正确剪接转录物的序列。剪接序列的例子是来自SV40的VP1内含子(Sprague，et al.，J.Virol.45：773781(1983)(Sprague等人，《病毒学杂志》，第45卷，第773-781页，1983年))。此外，如本领域已知的，可以将控制宿主细胞中的复制的基因序列整合进载体内。
组合物
本发明还提供至少一种靶结合成员组合物，其包含如本文所述和/或本领域已知的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多靶结合成员，它们以非天然存在的组合物、混合物或形式提供。此类组合物百分数按照液体或无水溶液、混合物、悬浮液、乳液或胶体的重量、体积、浓度、摩尔浓度或重量摩尔浓度计算，如本领域已知或本文所描述的。
本发明的组合物还可包含任何合适和有效量的组合物或药物组合物的至少一种，该组合物或药物组合物包含至少一种给予需要这种调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者的抗IL-25靶结合成员，任选地还包含至少一种选自以下的药剂：至少一种TNF拮抗剂(例如但不限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或片段、它们的融合蛋白质、或者小分子TNF拮抗剂)、抗风湿剂(例如甲氨蝶呤、金诺芬、金硫葡糖、硫唑嘌呤、依那西普、硫代苹果酸金钠、硫酸羟氯喹、来氟米特、柳氮磺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉剂(narcotic)、非甾类抗炎药物(NSAID)、止痛药、麻醉剂(anesthetic)、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂(例如氨基糖苷、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂、碳青霉烯类、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺药物、四环素、别的抗微生物剂)、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、糖尿病相关药剂、矿物质、营养剂、甲状腺剂、维生素、钙相关激素、止泻剂、镇咳剂、止吐剂、抗溃疡剂、缓泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如红细胞生成素α)、非格司亭(例如G-CSF、优保津)、沙格司亭(GM-CSF、瘤肯)、免疫接种剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环孢霉素、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药物、雌激素受体调节剂、散瞳剂、睫状肌麻痹剂、烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药物、抗焦虑药物、催眠剂、拟交感神经药物、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药物、β激动剂、吸入类固醇、白三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、阿法链道酶(百慕时)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。此类细胞因子的非限制性例子包括但不限于IL-1至IL-23中的任何一者。合适的剂量是本领域公知的。参见例如Wells et al.，eds.，Pharmacotherapy Handbook，2nd Edition，Appleton and Lange，Stamford，Conn.(2000)(Wells等人编辑，《药物疗法手册》，第2版，阿普尔顿和兰格，康涅狄格州斯坦福德)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，Loma Linda，Calif.(2000)(《PDR药典：塔拉斯康袖珍药典2000》，精装本，塔拉斯康出版公司，加利福尼亚州洛玛连达，2000年)，每个参考文献全文以引用方式并入本文。
此类抗癌药或抗感染药还可包括与本发明的至少一种抗体缔合、结合、共配制或共施用的毒素分子。毒素可以任选起作用以选择性杀死病理性细胞或组织。病理性细胞可以是癌细胞或其他细胞。此类毒素可以是(但不限于)纯化或重组毒素或包含毒素的至少一个功能性细胞毒性结构域的毒素片段，例如选自蓖麻毒素、白喉毒素、毒液毒素或细菌毒素中的至少一种。术语毒素还包括由任何天然存在的、突变型或重组细菌或病毒产生的内毒素和外毒素，所述细菌或病毒可以在人和其他哺乳动物中引起任何病理状况，包括毒素休克，这可导致死亡。此类毒素可包括(但不限于)肠产毒性大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、热稳定肠毒素(ST)、志贺氏菌属(Shigella)细胞毒素、气单胞菌属(Aeromonas)肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素A(SEA)、B(SEB)或C(SEC)、链球菌(Streptococcal)肠毒素等等。此类细菌包括(但不限于)下列细菌的菌株：肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠出血性大肠杆菌(例如血清型0157:H7菌株)、葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、化脓性葡萄球菌(Staphylococcus pyogenes))、志贺氏菌属(例如痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)和宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei))、沙门氏菌属(例如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella cholera-suis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis))、梭菌属(例如产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、艰难梭菌(Clostridium dificile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum))、弯曲菌属(例如空肠弯曲菌(Camphlobacterjejuni)、胎儿弯曲菌(Camphlobacter fetus))、螺杆菌属(例如幽门螺杆菌(Heliobacter pylon))、气单胞菌属(例如温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae))、类志贺邻单胞菌(Pleisomonas shigelloides)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinaenterocolitica)、弧菌属(例如霍乱弧菌(Vibrios cholerae)、副溶血弧菌(Vibrios parahemolyticus))、克雷伯氏菌属、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和链球菌属。参见例如Stein，ed.，INTERNAL MEDICINE，3rd ed.，pp 113，Little，Brown and Co.，Boston，(1990)(Stein编辑，《内科学》，第3版，第1-13页，利特尔和布朗出版社，波士顿，1990年))；Evans et al.，eds.，Bacterial Infections of Humans：Epidemiology and Control，2d.Ed.，pp 239254，Plenum Medical Book Co.，New York(1991)(Evans等人编辑，《人的细菌感染：流行病学和控制》，第2版，第239-254页，全医学图书公司，纽约，1991年)；Mandell et al，Principles and Practice of Infectious Diseases，3d.Ed.，Churchill Livingstone，N.Y.(1990)(Mandell等人，《感染性疾病的原理和实践》，第3版，丘吉尔利文斯顿出版社，纽约，1990年)；Berkow etal，eds.，The Merck Manual，16th edition，Merck and Co.，Rahway，N.J.，1992(Berkow等人编辑，《默克诊疗手册》，第16版，默克公司，新泽西州拉威，1992年)；Wood et al，FEMS Microbiology Immunology，76：121 134(1991)(Wood等人，《欧洲微生物学会联合会微生物免疫学》，第76卷，第121-134页，1991年)；Marrack et al，Science，248：705 711(1990)(Marrack等人，《科学》，第248卷，第705-711页，1990年)，这些参考文献的全部内容以引用方式并入本文。
本发明的组合物还可包含任何合适辅助剂中的至少一种，例如但不限于：稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。可药用辅助剂是优选的。制备此类无菌溶液的非限制性例子和方法是本领域熟知的，例如但不限于Gennaro，Ed.，Remington′s PharmaceuticalSciences，18th Edition，Mack Publishing Co.(Easton，Pa.)1990(Gennaro编辑，《雷明顿药物科学》，第18版，麦克出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，1990年)。可按常规方式选择适合于抗IL-25靶结合成员、片段或变体组合物的给药方式、溶解性和/或稳定性的可药用载体，如本领域所熟知或者如本文所述。
用于本发明组合物的药物赋形剂和添加剂包括(但不限于)：蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和低聚糖；衍生糖例如糖醇、醛糖酸、酯化糖等等；以及多糖或糖聚合物)，药物赋形剂和添加剂可以单独或组合的方式存在，其单独或组合具有1-99.99重量％或体积％。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲能力方面起作用的代表性氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括(例如)单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等等；以及糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、肌醇等等。用于在本发明中使用的优选碳水化合物赋形剂是甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
组合物还可包括缓冲剂或pH调节剂；通常，缓冲剂是从有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；盐酸三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐缓冲剂。用于本发明组合物的优选缓冲剂是有机酸盐，例如柠檬酸盐。
另外，本发明的组合物可包括聚合赋形剂/添加剂，例如聚乙烯基吡咯烷酮、聚蔗糖(聚合糖)、葡萄糖结合剂(例如环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯，如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。
适用于根据本发明组合物的这些和另外的已知药物赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，例如在“Remington：The Science & Practice of Pharmacy”，19th ed.，Williams & Williams，(1995)(《雷明顿：药学科学和实践》，第19版，威廉斯和威廉斯出版社，1995年)，以及“Physician′s DeskReference”，52nd ed.，Medical Economics，Montvale，N.J.(1998)(《医师案头参考》，第52版，医药经济出版社，新泽西州蒙特威尔，1998年)中列出，其公开内容全文以引用方式并入本文。优选的载体或赋形剂材料是碳水化合物(例如糖和糖醇)和缓冲剂(例如柠檬酸盐)或聚合剂。
治疗应用
在一个方面，本发明提供预防或减轻需要治疗的受试者(例如人)的气道高反应性的方法，该方法包括给受试者施用靶结合成员，尤其是结合IL-25的抗体分子。在另一个方面，本发明提供预防、减轻或治疗需要治疗的受试者的哮喘的方法，该方法包括给受试者施用靶结合成员，尤其是结合IL-25的抗体分子。哮喘包括变应性哮喘。
上述方法可以使用根据本发明的靶结合成员(包括它们的组合物)实施，所述靶结合成员用于结合到并且优选地拮抗IL-25的作用，在IL-25发挥作用的各种疾病和紊乱中具有治疗潜能。除哮喘之外，此类疾病包括与炎症例如炎性肠疾病(IBD)，如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎相关的其他病症。该方法也可使用其他结合IL-25的靶结合成员(包括它们的组合物)实施，所述靶结合成员可按照下面随附实例中所述的方法获得。
根据本发明的靶结合成员(包括它们的组合物)可用于人或动物受试者的治疗(包括预防性治疗)或诊断方法。此类治疗或诊断方法(可包括预防性治疗)可包括给所述受试者施用有效量的本发明靶结合成员。示例性疾病和紊乱在下面进一步讨论。
还提供了在用于给人或动物受试者施用的药剂的制造中使用本发明靶结合成员(包括它们的组合物)。
其中抗IL-25靶结合成员可用于提供治疗有益效果的临床适应症包括其中IL-25具有病理后果的任何病症。因此，本发明的靶结合成员通常可用于与不需要的Th2响应或2型响应相关的任何病症的治疗。例如，本发明的靶结合成员可用于变态反应和哮喘，尤其是哮喘的治疗。
抗IL-25治疗可以通过注射(如静脉内注射)或通过局部递送方法给予。抗IL-25可以通过基因介导的技术递送。替代制剂策略可提供适用于口服或栓剂途径的制剂。给药途径可通过疾病的特殊考量，由治疗的物理化学特性确定，以优化功效或使副作用最小化。
根据本发明，提供的组合物可以施用给个体。施用优选地以“治疗有效量”进行，这足以显示出对患者的有益效果。此类有益效果可以为对至少一种症状进行的至少改善。实际施用量，以及施用速率和时间过程将取决于被治疗疾病的性质和严重性。治疗处方，例如决定剂量等属于全科医师和其他医师的职责。适当的抗体剂量是本领域熟知的；参见Ledermann J.A.et al.(1991)Int.J.Cancer 47：659-664(Ledermann J.A.等人，1991年，《国际癌症杂志》，第47卷，第659-664页)；Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4：915-922(Bagshawe K.D.等人，1991年，《抗体、免疫交联物和放射性药物》，第4卷，第915-922页)。
精确剂量将取决于多种因素，包括抗体是用于诊断还是用于治疗，待治疗区域的大小和位置，抗体(如全抗体、片段或双价抗体)的确切性质，以及连接到抗体的任何可检测标记或其他分子的性质。典型的抗体剂量将在0.5mg-1.0g的范围内，并且该抗体可视情况通过推注或输注在静脉内施用数小时，以达到所需的剂量。其他施用模式包括静脉输注数小时，以达到类似的总累积剂量。这是成年患者单次治疗的剂量，对于儿童和婴儿可按比例调整，并且对于其他抗体形式也可与分子量成比例调整。治疗可按照医师的判断，以每日、每周两次、每周或每月的间隔重复。
其他施用模式利用留置装置的预包被层，或以其他方式掺入留置装置，对于该模式最佳抗体量将通过适当的实验方法确定。
在本发明的一些优选实施例中，抗体分子是单体片段，例如F(ab)或scFv。此类抗体片段可具有相对较短的半衰期和较小的血小板活化风险的优点，所述血小板活化可由受体聚集引发。引起血小板活化的聚集可以为(例如)IL-25分子的聚集或IL-25与FcγRII分子的聚集。
如果使用全抗体，则优选的是不能活化和/或破坏血小板的形式。IgG4同种型，或作为另外一种选择，衍生自IgG1主链的“设计者”同种型(新型Fc基因构建体WO99/58572，Clark、Armour、Williamson)是优选的选择。可以使用较小的抗体片段，例如F(ab’)2。此外，可以使用具有双表位特异性(如对于被scFv 2C3识别的表位)的全抗体或片段(如F(ab’)2或双价抗体)。虽然该实施例可以促进受体聚集，但与单个受体的高缔合率可以消除此问题。
本发明的靶结合成员通常将以药物组合物的形式施用，所述药物组合物除靶结合成员之外还可包含至少一种组分。
本发明的靶结合成员可以单独施用或联合其他治疗方式同时或顺序施用，具体取决于待治疗的病症。其他治疗方式可以包括施用合适剂量的止痛药例如非甾族抗炎药(如阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬或酮洛芬)或阿片类例如吗啡；施用止吐药；或施用至少一种对哮喘有活性的其他化合物，通常为产生气道松弛或增强粘液清除的支气管舒张剂，例如β-激动剂(如沙丁胺醇、沙美特罗)、色甘酸二钠、类固醇或PDEIV抑制剂。
测定方法
本发明提供包括引发或允许本文提供的靶结合成员与IL-25结合的方法。正如所述，此类结合可在体内发生，如在施用靶结合成员或编码靶结合成员的核酸后发生，或可在体外发生，例如在ELISA、Biacore测定法、Octet测定法、蛋白质印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀法或亲和色谱法中发生。
可确定靶结合成员与IL-25结合的量。定量可能与测试样品中抗原的量相关，这可能具有诊断重要性。
抗体对样品的活性可以通过任何适当的方法确定。放射性免疫测定(RIA)是一种可行的方法。放射性标记抗原与未标记的抗原(测试样品)混合，并且让其结合到抗体。将结合的抗原与未结合的抗原物理分离，并且确定结合到抗体的放射性抗原的量。测试样品中的抗原越多，则结合到抗体的放射性抗原越少。也可使用连接到报告分子的抗原或类似物，用非放射性抗原进行竞争性结合测定。报告分子可以是具有光谱分离吸收或发射特性的荧光染料、磷光体或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、若丹明、藻红蛋白和德克萨斯红。合适的显色染料包括二氨基联苯胺。
其他报告分子包括大分子胶体颗粒或颗粒物质例如有色、磁性或顺磁性乳胶小珠，以及可直接或间接产生可检测信号的生物或化学活性剂，所述信号可通过目测观察、用电子检测或以其他方式记录。这些分子可以是催化例如显色或变色或引起电性质改变的反应的酶。它们可以是分子激发型，使得能态之间的电子跃迁导致特征性光谱吸收或发射。它们可包括与生物传感器结合使用的化学实体。可采用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉抗生物素蛋白和碱性磷酸酶检测系统。
单个抗体-报告分子缀合物产生的信号可用于得出样品(常规样品和测试样品)中相关抗体结合的可定量的绝对或相对数据。
本发明还提供按照如上方法在竞争测定中使用靶结合成员测量抗原水平，也就是说，提供通过在竞争测定中采用本发明提供的靶结合成员来测量样品中抗原水平的方法。在这种情况下可以不必将结合抗原与未结合抗原物理分离。一种可行方法是将报告分子与靶结合成员连接，使得结合时发生物理或光学变化。报告分子可以直接或间接产生可检测的，并且优选地可测量的信号。报告分子的连接可以是直接或间接的、共价(例如经由肽键)连接、或非共价连接。经由肽键的连接可以是编码抗体和报告分子的融合基因重组表达的结果。
本发明还提供通过例如在生物传感器系统中采用根据本发明的靶结合成员来直接测量抗原的水平。
本领域的技术人员能够根据他们的偏好和常识选择合适的模式或结合。
实例
本发明的示例性实施例的描述如下：
实例1：高亲和力人源化IL-25抗体M6的构建
huDDG91是鼠2C3单克隆抗IL25抗体的人源化(CDR移植)类型，被选用作母体分子，用于构建对IL-25具有改进的结合亲和力的变体。huDDG91的κ轻链序列(不包括前导序列)如图1所示(SEQ ID NO：2)，其中CDR环的氨基酸序列(如Kabat所定义)已加下划线。huDDG91重链的序列(SEQ ID NO：4)如图2所示，其中CDR的氨基酸序列(如Kabat所定义)已加下划线。huDDG91也称为RH2.5_R71V。鼠2C3单克隆抗IL25抗体的构建和表征在如下专利中有所描述：于2008年10月30日作为WO2008/129263发布的国际专利申请No.：PCT/GB2008/001365，该专利全文的内容以引用方式并入本文中。
为得到huDDG91的变体，使用标准方法构建了基于huDDG91序列的噬菌体展示库。将Fab文库针对生物素化的IL-25进行淘选。选择表现出与huDDG91(IgG4)相当或更高结合力(由ELISA测定)的Fab。
按下列方式将Fab转换为mAb。设计含有5条不同轻链和5条不同重链(包括huDDG91轻链和重链)的组合文库。文库中使用的轻链和重链彼此不同之处在于轻链CDR1和CDR3氨基酸序列和重链CDR 3序列。使用这些轻链和重链构建总数为25的mAb(IgG1)，它们在HEK293细胞中小规模表达，将这些mAb纯化。测试各个mAb的IL-25结合亲和力、细胞抑制性和受体抑制性，具体如下：
●使用标准的IL-25ELISA和Biacore结合测定来确定IL-25的结合亲和力。选择对于人IL-25的KD小于50pM并且对于人IL-17A、C、D和F的KD大于100nM的候选者；
●使用标准的TK-10人肾癌细胞测定方法(IL-25应答；IL-25和IL-8读数；能够区分可溶性IL-25R和亲本mAb的差别)和CD4+T细胞测定方法来评估细胞抑制性。对于TK-10测定，选择展现出IC50低于亲本huDDG91抗体并且在10nM mAb浓度下IL-25释放的抑制率＞90％的mAb。对于CD4+T细胞测定，则选择这样的mAb：其对IL-5分泌的抑制性大于或等于亲本huDDG91所表现出的抑制性；
●使用改进的基于微球的电化学发光免疫测定(ECLIA)方法来评估受体抑制性。选择在10nM mAb浓度下相比亲本huDDG91抗体能使IL-25与受体结合的IC50值降低三倍多的候选者。
根据这些标准选出9种候选的mAb(图3)。当在HEK293中表达并使用标准方案进行纯化时，所有候选者均显示出可接受的表达水平并展现出期望的SE-HPLC和SDS-PAGE图谱。然后将这9种候选者以10L的规模在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中进行瞬时表达，使用Mab Select SuRe(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare Life Sciences))进行纯化，缓冲液更换为磷酸盐缓冲液(PBS)并进行浓缩。在这9种候选mAb中，每一个的IL-25结合亲和力相比huDDG91都有明显的改进。同时使用常规的技术和测定方法来测试各个mAb的表达水平、类别(SDS-PAGE)、溶解度、聚集性(SE-HPLC)、翻译后修饰、蛋白质与蛋白质之间的相互作用以及氧化作用。当在中国仓鼠卵巢细胞内表达并在标准条件下进行纯化和处理时，多种候选mAb在浓缩过程出现沉淀，并显示出低收率和/或不期望的SDS-PAGE和SE-HPLC图谱。
根据优异的表达水平、高溶解度、纯化时无明显的蛋白质聚集，以及不存在不期望的翻译后修饰、蛋白质与蛋白质之间的相互作用和纯化时的氧化作用来选择一种mAb(即指定的M6)以进一步研究。
实例2：M6抗体的表征
材料和方法
LS174T人结肠上皮细胞测定
从ATCC(Manassas，VA)获得人结肠上皮细胞系LS 174T(CL-188)，并在37℃、5％CO2下维持在补充有10％FBS、青霉素和链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。以1×105细胞/ml的密度在96孔组织培养板上接种总体积为100μl的细胞，并使细胞贴壁过夜。IL-25抗体(M6和M9)与重组人IL-25蛋白(山陶克公司(Centocor))预先复合，其中固定量IL-25蛋白(10ng/ml最终浓度)与滴定成三倍稀释或半对数稀释系列的不同含量的抗IL-25抗体混合，并在37℃下孵育1小时。轻轻地抽吸细胞培养基并更换为IL-25蛋白质/IL-25抗体复合物，然后将细胞孵育过夜，时间为18-22小时。然后在1200rpm的转速下将培养板离心2分钟，以消除细胞碎屑的残留污染，然后收集上清液，并利用酶标板(明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物(R&D Systems，Minneapolis，MN))分析GROa。
结果
M6的序列分析表明，相对于huDDG91序列总共发生3个氨基酸置换，其均存在于轻链的CDR3中(见图3)。M6的轻链(SEQ ID NO：5)和重链(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列及其CDR如图4所示。
通过Biacore确定M6与人IL-25的结合亲和力是huDDG91与人IL25的结合亲和力的3到5倍(图3)。此外，M6对IL-25具有选择性，因为它不与人IL-17A、C、D或F结合。利用食蟹猴I2-25cynoIL-25和啮齿动物(小鼠)IL-25来评估M6的物种交叉反应性。通过5倍以内的人IL-25亲和力、受体配体抑制性以及TK-10细胞相关测定方法来指示与cynoIL-25的物种交叉反应性。利用这些标准确定M6与cyno-和小鼠IL-25均能结合。
利用实例1中所描述的细胞相关测定方法，表明M6相对于huDDG91具有增强的受体抑制性，而其IC50相比于huDDG91则显示减少3倍多(图3)。此外，利用实例1中所描述的细胞相关测定方法，显示M6相比于huDDG91在人IL25的细胞抑制性方面有所增强(图3和图5)。根据上述方法执行的LS 174T人结肠上皮细胞测定证实了此结果(图6A和6B)。
实例3：M6所识别的人IL-25表位的H/D交换图谱
发明内容
使用由ExSar公司(新泽西州蒙茅斯章克申(Monmouth Junction，NewJersey))实施的ExSarTM氢/氘交换质谱来绘制M6抗体所识别的人IL-25的推定表位。
材料和方法
I.IL-25的消化/分离优化
(1)在冰上解冻IL-25
(2)分装为18×100μL等分试样并留下一管，其余冻存。
(3)将10μL 0.28mg/mL(16.6μM)的IL-25与30μL的PBS水溶液(pH为7.0)混合→[IL-25]＝0.07mg/mL(4.2μM)
(4)将40μL的(3)与不同的淬火溶液混合
(5)将55μL注入ExSAR系统
(6)用缓冲液A(0.05％TFA水溶液)使样品以200μL/min的流速通过固定化胃蛋白酶色谱柱
(7)将肽段加载到反相捕集柱并使用缓冲液A以200μL/min的流速脱盐3分钟
(8)使用线性梯度为13％→40％的缓冲液B(95％乙腈，5％H2O，0.0025％TFA)通过C18色谱柱将胃酶肽分离23分钟
(9)使用质谱来检测肽
II.M6固定化
4.1.M6固定化的实验程序
<树脂上抗体的结合>
(1)在冰上解冻1.5mL的0.96mg/mL M6
(2)使用400μL(重新冻存未使用的材料)
(3)将4mg NaCNBH3(87.5μmol)添加到1.5mL螺旋盖瓶内→每1g的POROS AL加入40mg的NaCNBH3
(4)将400μL的抗体溶液加入瓶内
(5)确保NaCNBH3溶解后再加入POROS AL树脂
(6)将100mg的POROS AL加入到瓶内
(7)室温下温育偶联反应液3个小时，同时进行振荡
(8)以5×80μL部分分次添加总体积为400μL的2.8M Na2SO4，每小时一部分→[抗体]＝0.48mg/mL，[NaCNBH3]＝5.0mg/mL[Na2SO4]＝1.4M。
(9)混合物在室温下振荡过夜
(10)通过过滤漏斗使用大量的PBS缓冲液(pH为7.0)冲洗混合物
<封端>
(11)封端溶液的制备：将250μL的乙醇胺(FW＝61.08，密度＝1.012g/mL，8.3mmol，约1M)混入3.5mL PBS(pH为7.0)并使用冰醋酸(约200μL)将此溶液的pH调节为7.2。溶液的最终体积接近于4ml。
(12)将4mg的NaCNBH3溶解于500μL封端溶液内→[NaCNBH3]＝8mg/mL，[乙醇胺]＝约1M。
(13)将洗涤后的干燥树脂重悬于NaCNBH3溶液中
(14)室温下振荡2小时
(15)通过过滤漏斗过滤混合物并使用大量PBS(pH为7.0)进行冲洗。
(16)将树脂粉饼重悬于0.75mL的PBS缓冲液(pH为7.0)中。
(17)将偶联材料放入4℃的冰箱内保存。
III.M6色谱柱结合能力测试的实验程序
<缓冲液的制备>
(1)制备50mM的柠檬酸盐水溶液，pH为6.0
(2)制备50mM柠檬酸盐、2mM Foscholine-12的水溶液，pH为6.0
(3)制备PBS水溶液，pH为7.0
(4)(1)、(2)或(3)任一者用作“缓冲液H”
<结合能力测试>
(5)mAb色谱柱(104μL)填充600μL的与POROS树脂偶联的M6使用500μL/min流速的缓冲液A(0.05％TFA水溶液)，并使用2.1mm×30mm不锈钢柱套
(6)将抗体色谱柱放入设定为3℃的制冷机组的贮存器浴内，其中管路设置用于从色谱柱输入和输出试剂以及捕获出入色谱柱的试剂。将2微米滤头与输入管路对齐，以便过滤试剂和样品。
(7)使用2×250μL的“缓冲液H”平衡抗体色谱柱。使用pH试纸测试管路末端溶液的pH，以确保pH值为中性。
(8)将10μL 0.28mg/mL(16.6μM)的IL-25与30μL的“缓冲液H”混合→[IL-25]＝4.1μM(相当于166pmol)
(9)将上述混合物注入到平衡后的抗体色谱柱内。
(10)在3℃下使用注射泵将200μL的“缓冲液H”(放置于500μL的Hamilton注射器内)输送到色谱柱内，并且收集5×40μL的级分。
(11)在3℃下使用注射泵将200μL 0.8％的甲酸输送到色谱柱并收集5×40μL的级分。
(12)在玻璃衬管内制备对照注射剂：将10μL 0.28mg/mL(16.6μM)的IL-25与30μL的“缓冲液H”混合
(13)将含有级分或对照样品的所有衬管进行离心，使衬管壁上的所有液体沉降。将样品瓶加盖并贴标签，衬管放置于瓶内。
(14)将中性级分和酸性级分以及对照样品保留在堆叠式冷盘4内，按对照样品、中性洗涤物1、2、3、4、5以及酸性洗涤物1、2、3、4、5的顺序放置于3到23的奇数位置上。
(15)11个加盖空瓶设置在堆叠式冷盘4内，依次在4到24的偶数位置上。
(16)使用20μL的2M尿素、1M TCEP(pH为3.0)混合各级分。
(17)将55μL的淬火溶液注入到ExSAR系统内，无需胃蛋白酶色谱柱。
(18)使用缓冲液A(0.05％TFA)使样品以流速200μL/min加载到捕集柱上，脱盐3分钟，然后使用线性梯度为13％至40％的缓冲液B(95％乙腈、5％H2O、0.0025％TFA)洗脱23分钟。
(19)采用质谱在MS1：棒状图模式下分析洗出液。
IV.溶液正向/柱逆向交换的实验程序
<缓冲液的制备>
(1)制备50mM柠檬酸盐、2mM Foscholine-12的水溶液，pH为6.0
(2)制备PBS、2mM Foscholine-12的水溶液，pH为7.0
(3)制备PBS的水溶液，pH为7.0
(4)使用(1)-(3)作为“交换液H”
(5)制备“交换液HH”：将一份pH 7.0的PBS水溶液与3份“交换液H”混合
(6)制备50mM柠檬酸盐、2mM Foscholine-12的重水溶液，pH为6.0
(7)制备PBS、2mM Foscholine-12的重水溶液，pH为7.0
(8)制备PBS的重水溶液，pH为7.0
(9)使用(6)-(8)作为“交换液D”
(10)制备“交换液HD”：将1份pH 7.0的PBS水溶液与3份“交换液D”混合
<溶液正向交换>
(1)将mAb色谱柱(104μL柱床体积)放入3℃冷却箱内并进行平衡
(2)使用2×250μL 0.8％的甲酸清洗mAb色谱柱
(3)使用2×250μL的“交换液HD”冲洗mAb色谱柱，以平衡色谱柱
(4)将10μL 0.28mg/mL(16.6μM)的IL-25与30μL的“交换液D”在3℃下混合→[IL-25]＝0.07mg/mL(4.2μM)，[D2O]＝75％(启动计时器，记录正向交换时间)
(5)在3℃下孵育混合物150、500、1,500或5,000秒
(6)将混合物(40μL)注入mAb色谱柱内
(7)使用100μL的“交换液HD”在3℃下冲洗mAb色谱柱
<柱逆向交换>
(8)使用200μL冷却的“交换液HH ”(一旦水接触到色谱柱，即停止正向交换时间并开始记录逆向交换时间)
(9)在23℃下孵育75、250、750或2,500秒
<洗脱>
(10)将120μL冷却的0.8％甲酸注入到mAb色谱柱上(一旦酸进入色谱柱，即停止逆向交换时间)
(11)注入另外40μL冷却的0.8％甲酸，以便从mAb色谱柱上洗脱出抗原
(12)使用玻璃衬管收集该40μL级分
<分析>
(13)将20μL冷却的2M尿素、1M TCEP(pH为3.0)加入40μL级分
(14)将55μL的淬火交换样品注入到装有胃蛋白酶色谱柱和C18色谱柱(胃蛋白酶色谱柱104μL柱床体积；流过胃蛋白酶色谱柱的流速为200μL/min；缓冲液B以13％-40％的梯度流过C18色谱柱23分钟)的ExSAR系统内。设置消化时间为3分钟。
(15)利用质谱在MS1：轮廓模式下分析洗出液
V.柱正向/柱逆向交换的实验程序
<柱正向交换>
(1)将mAb色谱柱(104μL柱床体积)放入23℃冷却箱内并进行平衡
(2)使用2×250μL 0.8％的甲酸清洗mAb色谱柱
(3)使用“交换液HH”冲洗mAb色谱柱，以平衡色谱柱
(4)将10μL 0.28mg/mL(16.6μM)的IL-25与30μL的“交换液H”在3℃下混合→[IL-25]＝0.07mg/mL(4.2μM)，[D2O]＝0％
(5)将混合物注入mAb色谱柱内
(6)使用100μL的“交换液HH”进行冲洗
(7)将200μL的“交换液HD ”通过mAb色谱柱(开始记录正向交换时间)，从而启动正向交换反应
(8)在3℃下孵育mAb色谱柱150、500、1,500或5,000秒
<柱逆向交换>与5.2相同
<洗脱>与上述程序IV，步骤10-14相同。
<分析>与上述程序IV，步骤15相同。
VI.完全氘化实验的实验程序
<完全氘化样品的制备>
(1)将10μL 0.28mg/mL(16.6μM)的IL-25与30μL的“交换液D”混合
(2)将混合物于60℃加热3小时
(3)将其冷却至室温
(4)将40μL的混合物加载到mAb色谱柱上
(5)将100μL的“交换液HD”注入mAb色谱柱
<洗脱>与上述程序IV，步骤10-14相同。
<分析>与上述程序IV，步骤15相同。
分析(水环境内的消化/分离/质量分析)期间每个离子的前两个氨基酸残基上所连接的任何氘均缺失。这解释了图8A和8B中H/D-Ex图案中的小间隙。对每种蛋白进行无氘化实验、正向交换实验和完全氘化实验。无氘化实验用于鉴别离子以及每种不含氘的离子的精确m/z。完全氘化实验用于鉴定分析(水环境内的消化/分离/质量分析)期间每种离子的氘缺失。在这些类型的实验中，LCMS分析前和正向交换反应或正向-逆向交换反应之后的氘核数量可进行反算。对于正向-逆向交换实验，逆向交换时间是正向交换时间的一半。这是因为在相同的pH读数的情况下，固有H→D交换率是固有D→H交换率的一半。
结果
IL-25消化
IL-25在不同条件下由胃蛋白酶进行消化。当使用1份2M尿素、1MTCEP(pH为3.0)对2份稀释的IL-25溶液进行淬火处理并使用胃蛋白酶色谱柱以200μL/min的速率进行消化时，胃蛋白酶对IL-25的消化情况将达到最佳。最理想的分离条件为：使缓冲液A中线性梯度为13％至40％的缓冲液B(95％乙腈、5％H2O和0.0025％TFA)流过C18色谱柱23分钟。胃蛋白酶消化后IL-25的序列覆盖率为100％(＝146/146；图7A和7B)。
M6的固定化和M6色谱柱的结合能力测试
未经胃蛋白酶消化的IL-25样品在8.5分钟处显示色谱峰。样品看似洁净。通过席夫碱化学品将M6成功偶联至POROS AL树脂。ExSAR测试三个不同条件下M6色谱柱的结合能力，如表1所示。随后测试m/z＝1875(+18)和1985(+17)的完整峰。在所有经过测试的结合条件中，使用中性洗脱液未能洗脱出任何IL-25，这表明所有加载的IL-25(166pmol)在中性条件下与M6色谱柱结合。IL-25可与M6色谱柱非特异性结合。在不使用洗涤剂的情况下，酸洗只能回收到17-18％已加载的IL-25。当IL-25反复加载时，M6色谱柱的反压也会逐渐增加。添加Foscholine-12可提高回收量。
表1.测试M6抗体色谱柱的结合能力所采用的条件
介于“温度”和“中性”之间的一列的标题为“胃蛋白酶”。
表位鉴定
<溶液中IL-25的正向交换实验>
溶液中IL-25的正向交换实验在23℃和pH 7条件下进行。
据显示，IL-25是相对动态的蛋白质。
<使用或不使用M6色谱柱的IL-25正向/逆向交换实验>
据观察，含有氨基酸残基56-63和66-74的片段具有最强的保护性(图8A和9C；表2)。含有氨基酸残基46-63和66-84的类似片段显示出一致的弱保护性(图8A、9C和9D；表2)。据观察，含有氨基酸残基129-135的片段有边界线保护(图8B、9E和9F；表2)。
表2.在23℃下以pH 7和pH 8进行正向/逆向交换实验后不同人IL-25 片段氚化水平的差异。
本文引述的所有专利、已公布的专利申请和参考文献的教导内容全文以引用方式并入。
虽然通过参照本文的示例性实施例来具体示出和描述本发明，但本领域的技术人员将理解可以在不脱离所附权利要求书所涵盖的本发明范围的情况下对其形式和细节进行各种修改。

Claims (26)

1.一种结合IL-25的靶结合成员，其中所述靶结合成员包含：
a) 抗体VL结构域，其包含具有氨基酸序列SASQGISNYLN (SEQ ID NO:6)的CDR1、具有氨基酸序列YTSSLHS (SEQ ID NO:7)的CDR2和具有氨基酸序列QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8)的CDR3；以及
b) 抗体VH结构域，其包含具有氨基酸序列GYTMN (SEQ ID NO:10)的CDR1、具有氨基酸序列LINPYNGGTSYNQNFKG (SEQ ID NO:11)的CDR2和具有氨基酸序列EDYDGYLYFAMDY (SEQ ID NO:12)的CDR3。
2.根据权利要求1所述的靶结合成员，其中所述靶结合成员包含抗体恒定区。
3. 根据权利要求2所述的靶结合成员，其中所述抗体恒定区是IgG1恒定区或IgG4恒定区。
4. 根据权利要求3所述的靶结合成员，其中所述靶结合成员包括全抗体。
5. 根据权利要求1所述的靶结合成员，其中所述靶结合成员包括抗体片段，所述抗体片段选自Fab抗体片段、F(ab')2抗体片段和scFv抗体片段。
6. 根据权利要求1所述的靶结合成员，其中所述VL结构域包含SEQ ID NO:5，并且所述VH结构域包含SEQ ID NO:9。
7. 一种分离的核酸，所述分离的核酸包含编码权利要求1所述的靶结合成员的核苷酸序列。
8. 一种表达载体，所述表达载体包含权利要求7所述的核酸，其中所述核酸可操作地连接到启动子。
9. 一种携带权利要求8所述的表达载体的宿主细胞。
10. 一种产生靶结合成员的方法，所述方法包括在适于产生所述靶结合成员的条件下培养权利要求9所述的宿主细胞。
11. 根据权利要求10所述的方法，还包括分离所述靶结合成员。
12. 根据权利要求10所述的方法，还包括将所述靶结合成员配制成包含至少一种附加组分的组合物。
13. 一种组合物，所述组合物包含权利要求1所述的靶结合成员和可药用载体。
14. 根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物包含冻干的粉末。
15. 有效量的权利要求1所述的靶结合成员在制备用于治疗或预防有所需要的受试者的哮喘的药物中的用途。
16. 有效量的权利要求1所述的靶结合成员在制备用于治疗或预防有所需要的受试者的炎性肠疾病的药物中的用途。
17. 有效量的权利要求1所述的靶结合成员在制备用于治疗或预防有所需要的受试者的溃疡性结肠炎的药物中的用途。
18. 有效量的权利要求1所述的靶结合成员在制备用于治疗或预防克罗恩氏病的药物中的用途。
19. 根据权利要求1所述的靶结合成员，用于哮喘的治疗和预防。
20. 根据权利要求1所述的靶结合成员，用于炎性肠疾病的治疗和预防。
21. 根据权利要求20所述的靶结合成员，其中所述炎性肠疾病是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
22. 一种产生针对IL-25的靶结合成员的方法，其中所述靶结合成员结合一条或多条序列，所述序列选自SEQ ID NO:17的第56-63位氨基酸残基、SEQ ID NO:17的第66-74位氨基酸残基和SEQ ID NO:17的第129-135位氨基酸残基，所述方法包括：
(a) 提供编码VL结构域的核酸的起始库，其中所述核酸包含待置换的CDR3编码区或缺乏CDR3编码区；
(b) 将所述起始库与编码具有氨基酸序列QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8)的VL CDR3的供体核酸组合，其中所述供体核酸插入所述库中的一条或多条核酸中，以形成编码VL结构域的核酸的产物库，所述VL结构域包含具有氨基酸序列QQYLAFPYTF (SEQ ID NO:8)的VL CDR3；
(c) 表达所述产物库的所述核酸以形成靶结合成员；
(d) 选择特异性结合一条或多条序列的靶结合成员，所述序列选自SEQ ID NO:17的第56-63位氨基酸残基、SEQ ID NO:17的第66-74位氨基酸残基和SEQ ID NO:17的第129-135位氨基酸残基；以及
(e) 回收所述靶结合成员或编码所述靶结合成员的核酸。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述产物库的所述核酸与编码VH结构域的核酸共表达。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述VH结构域包含SEQ ID NO:9。
25. 根据权利要求22、23或24所述的方法，其中所述靶结合成员包括全抗体。
26. 根据权利要求1所述的靶结合成员，其中所述靶结合成员包括人源化抗体。
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