CZ291039B6 - Monoklonální protilátka, hybridom, polypeptid a způsob jeho přípravy, izolovaná DNA, rekombinantní vektor, hostitelská buňka, humanizovaná protilátka a farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

e en poskytuje monoklon ln protil tku, kter se specificky v e na lidsk² interleukin-5. D le poskytuje hybridom, kter² produkuje monoklon ln protil tku; komplement rn DNA, kter k duj variabiln oblasti t k ho a lehk ho °et zce monoklon ln protil tky a jejich CDR; humanizovan monoklon ln protil tky; a farmaceutick prost°edky obsahuj c monoklon ln protil tku pro l bu losinofilie spojen s alergick²mi onemocn n mi, jako je astma.\

Description

Monoklonální protilátka, hybridom, polypeptid a způsob jeho přípravy, izolovaná DNA, rekombinantní vektor, hostitelská buňka, humanizovaná protilátka a farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Předkládaný vynález se vztahuje k nukleovým kyselinám, které kódují variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce monoklonální protilátky proti lidskému interleukinu-5, ke komplementaritě, jejich determinujících oblastí a k humanizovaným protilátkám a vazebným proteinům založeným na této monoklonální protilátce.

Dosavadní stav techniky

Interleukin-5 (IL—5) je lymfokin vylučovaný aktivovanými T buňkami a jeho biologicky aktivní vůči B buňkám a eosinofilům. Protože IL—5 nahrazuje T lymfocyty v in vitro odpovědích protilátek na Thymus-dependentní angíny, byl původně nazýván T buňky nahrazujícím faktorem (TFR; Dutteon a kol., Prog. Immunol. 1, 355 (1971), Schimpl a kol., Nátuře 237 (15 (1972)). Vzhledem k tomu, že také stimuluje diferenciaci B lymfocytů na IgM a IgG plaky-tvoří buňky a růst lymfomatických B buněk in vitro, byl také nazýván růstový faktor B buněk II (BCGFII; Takatsu a kol., J. Immunol. 124, 2414 (1980)).

Myší IL-5 je tvořen 133 aminokyselinovými zbytky včetně signální sekvence o 20 zbytcích a 3 potenciálních míst pro N-glykosylaci. Deglykosylace nepostihuje biologickou aktivitu myšího IL-5 a esej proliferace B buněk (Tavemier a kol., DNA 8, 941 (1989)). Lidský IL-5 je tvořen 134 aminokyselinovými zbytky včetně signální sekvence o 19 zbytcích a 2 potenciálních míst pro N-glykoxylaci. Struktury obou proteinů byly popsány (Yokota a kol., Proč. Acad. Nati. Sci. USA 84, 7388 (1987) a Kinashi a kol., Nátuře 324, 70 (1986)). Stupně homologie nukleotidové a aminokyselinové sekvence myšího a lidského IL-5 jsou 77%, resp. 70%.

Oba, jak myší, tak lidský IL-5 existují jako homodimery spojené disulfidovými můstky. Glykosylovaný rekombinantní lidský IL-5 proto migruje při elektroforéze v polyakrylamidovém gelu s SDS se zdánlivou relativní molekulovou hmotností 40 000 daltonů za neredukujících podmínek a se zdánlivou relativní molekulovou hmotností 20 000 daltonů za redukujících podmínek (Tsujimoto a kol., J. Biochem. 106, 23 (1989)).

Klonování a exprese myšího IL-5 bylo popsáno, (např. Kinashi a kol., Nátuře 324, 70 (1986) a Takatsu a kol., J. Immunol. 134, 382 (1985)). Lidská IL-5 komplementární DNA (cDNA) byla izolována za použití myší IL-5 cDNA jako proby (Azuma a kol., Nucleic Acids Res. 14, 9149 (1986)).

IL-5 byl představen jako podpůrný a diferenční faktor eosinofílů. Zdá se, že u člověka je aktivita IL-5 specifická a postihuje primárně eosinofily. Lidský IL5 indukuje prekurzorové buňky eosinofílů tak, že z nich vznikají zralé buňky. Navíc lze prodloužit životnost eosinofílů izolovaných z krevního oběhu tím, že je v kultivačním médiu přítomen lidský IL-5. Lidský IL-5 také stimuluje degranulaci kultivovaných eosinofílů a uvolňování toxických proteinů jako je hlavní bazický protein (major basic protein, MBP) a neurotoxiny odvozené z eosinofílů (eosinophil-derive dneutoroxin, EDN) (Kita a kol., J. Immunol. 149, 629 (1992)).

Předpokládalo se, že eosinofily zabíjejí parazity po následném infikování a hrají také signifikantní roli při zánětových a alergických onemocněních (viz např. Sanderson, Blood 79, 3101 (1992)). Zvýšené hladiny eosinofílů mezi oběhovými leukocyty byly pozorovány následně po infekcích parazity a u jistých chronicky zánětlivých tkání, jako u astmatických alveolů.

-1 CZ 290039 B6

Infiltrace eosinofilu a uvolnění toxické granule z eosinofilů může hrát roli při destrukci tkání a může vyvolat symptomy astmatu.

Např. Gleich a kol. (Adv. Immunol. 39, 177 (1986)) a Frigas a kol. (J. Allergy Clin. Immunol.

77, 527 (1986)) zjistili, že vysokohustotní eosinofily a hlavní bazický protein eosinofilů (MBP) jsou asociovány s bronchiálním astmatem a od toho odvozenými poškozeními tkání.

Nedávno bylo zjištěno (Coffman a kol., Intemational Patent Application Publication no. WO/04979), že protilátky proti IL-5 mohou předcházet nebo redukovat eosinofilii spojenou 10 s jistými alergickými onemocněními jako je astma. Monoklonální protilátky, které se specificky vážou na a neutralizují biologickou aktivitu lidského IL-5, lze pro tento účel použít.

Monoklonální protilátka proti IL-5 byla popsána s tím, že má významný účinek při parazity indukované reverzní eosinofilii u experimentálních zvířat (Schumacher a kol., J. Immunol. 141, 15 1576 (1988); Coffman a kol., Science 245, 308 (1989)), což naznačuje, že neutralizující protilátky lze klinicky použít při zmírňování symptomů spojených s eosinofilii tím, že antagonizují IL-5. Bylo zjištěno, že u hlodavců nebo opic s experimentálně indukovanou eosinofilii, na které bylo působeno TRFK 5, krysí-antimyší IL—5 monoklonální protilátkou, byl eosinofil v obou obězích a bronchiální laváž se vrátila na normální úrovně. Tak mohou být 20 neutralizující monoklonální protilátky účinnými antagonisty.

Protože je většina monoklonálních protilátek původem z hlodavců, je zvýšená pravděpodobnost, že budou imunogenní při terapeutickém použití v humánní medicíně, zvláště při dlouhodobé aplikaci. Ke zmenšení této možnosti jsou nutné rekombinantní nebo „humanizované“ protilátky 25 proti lidskému IL-5. Takové protilátky lze použít pro léčbu stavů spojených s eosinofilii nebo pro léčbu kteréhokoli stavu, který lze připsat biologické aktivitě IL-5.

Počáteční úsilí o snížení imunogenicity protilátek z hlodavců zahrnovala produkci chimérických protilátek, do kterých byly včleněny myší variabilní oblasti spolu s lidskými konstantními 30 oblastmi (Liu a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 3439 (1987)). Ukázalo se však, že myši, kterým byly injikovány hybridy lidských variabilních oblastí a myších konstantních oblastí, vykazovaly silnou odpověď proti protilátce řízenou proti lidské variabilní oblasti. To naznačuje, že v lidském systému lze ještě zvýšit retenci celé Fv oblasti hlodavců v takových chimérických protilátkách vůči lidským anti-myším protilátkám.

Je obecně předpokládáno, že CDR smyčky variabilních domén obsahují vazebná místa pro molekuly protilátek, a proto bylo připojení CDR smyček hlodavců do lidských systémů (tj. humanizace) prožito k dalšímu minimalizování sekvencí původem z hlodavců (Jones a kol., Nátuře 321, 522 (1986); Varhoeyen a kol., Science 239, 1534 (1988)). Studie Kabata a kol.

(J. Immunol. 147, 1709 (1991)) ukázaly, že rezidua rámců variabilních domén protilátky jsou začleněny v podpůrné CDR smyčce. Bylo také zjištěno, že změny v podpůrných reziduích rámců v humanizovaných protilátkách mohou být nutné k ochraně antigen-vazebné afinity. Použití CDR připojení a ochrana rezidua rámce v mnoha humanizovaných konstruktech protilátek byla popsána např. Queen a kol. (Proč. nati. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989)), Gormanem a kol., 45 (Proč. nati. Acad. Sci. USA 88, 4181 (1991)) a Hodgsonem (Bio/Technology 9, 421 (1991)).

Přesné údaje o sekvencích byly popsány jen pro několik humanizovaných konstruktů.

Ačkoli vysoký stupeň sekvenční identity mezi lidskými a živočišnými protilátkami je důležitý pro výběr sekvencí lidské protilátky pro humanizaci, původní studie používaly různou lidskou 50 sekvenci pro lehké a těžké variabilní sekvence zvířat. Byly použity sekvence známých protilátek, nebo častěji tyto protilátky se známými strukturami podle X-paprskové krystalografie, protilátky NEW a KOL. Viz např. Jones a kol., viz výše; Verhoeyen a kol., viz výše; Gorman a kol., viz výše.

-2CZ 290039 B6

Metody konstrukce protilátek byly popsány např. viz Boss a kol. (US 4 816 397), Cabilly a kol. (US 4 816 567), Law a kol. (European Patent Application Publication No. 438 310) a Winter (European Patent Application Publication No. 293 400).

Spolehlivost relativně malého počtu protilátek se známými krystalografickými strukturami vedla k častému používání různých lidských sekvencí lehkých a těžkých řetězců různých protilátek, protože ačkoli jsou známy jen dvě lidské Fab krystalové struktury, bylo zjištěno několik krystalových struktur lidského lehkého řetězce. Takový postup vyžaduje změny reziduí rámce v lidských těžkých a lehkých řetězcích k zajištění správné asociace řetězců, a proto limituje aplikovatelnost humanizace.

Proto je potřeba vylepšených metod pro přípravu humanizovaných protilátek, které nejsou založeny na relativně málo známých krystalografických strukturách.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu jsou:

Monoklonální protilátka nebo její fragment, která se specificky váže na lidský interleukin-5, kde uvedená monoklonální protilátka obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce definovanou sekvencí číslo 1 a variabilní oblast lehkého řetězce sekvencí číslo 2.

Hybridom, vylučující monoklonální protilátku, která se specificky váže na lidský interleukin-5, kde uvedená monoklonální protilátka obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce definovanou sekvencí číslo 1 a variabilní oblast lehkého řetězce definovaného sekvencí číslo 2 uložený pod číslem ATCC HB 10959.

Polypeptid obsahující variabilní oblast monoklonální protilátky, která má aminokyselinovou sekvenci definovanou sekvencí číslo 1 nebo sekvencí číslo 2. Izolovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci definovanou sekvencí číslo 1 nebo nukleotidovou sekvenci definovanou sekvencí číslo 2.

Izolovaná DNA, která obsahuje nukleotidové sekvence, které kóduji aminokyselinovou sekvenci, definovanou sekvencí číslo 1 nebo sekvencí číslo 2.

Rekombinantní vektor, který obsahuje DNA podle nároku 4 nebo Hostitelská buňka, která obsahuje rekombinantní vektor.

Způsob přípravy polypeptidu kde se kultivuje hostitelská buňka za podmínek exprese DNA.

Humanizovaná monoklonální protilátka, nebo její fragment, která se specificky váže na lidský interleukin-5 a obsahuje CDR variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce monoklonální protilátky, kde CDR obsahuje aminokyselinové zbytky 21 až 27, nebo 26 až 30,47 až 50, 66 a 93 až 101 sekvence číslo 1 a aminokyselinové zbytky 46 až 51, 68, 70 až 72, 84, 91, 109 a 110 až 116 sekvence číslo 2.

Humanizovaná monoklonální protilátka obsahující variabilní oblast lehkého nebo těžkého řetězce, mající zralé aminokyselinové sekvence uvedené v sekvencích číslo: 36, 37, 40, 41, 46, 47, 56, 57, 64 nebo 65.

Humanizovaná monoklonální protilátka obsahující variabilní oblast těžkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci 36 a variabilní oblast lehkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 37.

-3CZ 290039 B6

Humanizovaná monoklonální protilátka obsahující variabilní oblast těžkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 40 a variabilní oblast lehkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 41.

Humanizovaná monoklonální protilátka obsahující variabilní oblast těžkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 46 a variabilní oblast lehkého řetězce mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 47.

Humanizovaná monoklonální protilátka obsahující variabilní oblast těžkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 56 a variabilní oblast lehkého řetězce mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 57.

Humanizovaná monoklonální protilátka obsahující variabilní oblast těžkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 64 a variabilní oblast lehkého řetězce mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 65.

Farmaceutický prostředek, který obsahuje humanizovanou monoklonální protilátku. Polypeptid obsahující variabilní oblast, humanizované monoklonální protilátky, která má zralé aminokyselinové sekvence uvedené v sekvencích číslo: 36, 37, 40, 41,46, 47, 56, 57, 64 nebo 65.

Izolovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující zralé aminokyselinové sekvence uvedené v sekvencích číslo 36, 37, 40, 41,46, 47, 56, 57, 64 nebo 65.

Rekombinantní vektor, obsahující tuto DNA a hostitelská buňka obsahující tyto rekombinantní vektory.

Způsob přípravy polypeptidu, kde se kultivuje hostitelská buňka za podmínek exprese DNA.

Předkládaný vynález dále poskytuje monoklonální protilátku produkovanou hydridomem s identifikujícími charakteristikami buněčné liniu uložené pod č. ATCC HC 10959 v Američan Type Culture Collection Accession a vlastní hybridom.

Předkládaný vynález dále poskytuje polypeptidy obsahující variabilní oblasti těžkého nebo lehkého řetězce monoklonální protilátky, které má aminokyselinovou sekvenci definovanou SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2, komplementaritu určující oblasti CDR z takových variabilních oblastí a izolované DNA kódující takové variabilní oblasti a CDR. Tyto DNA lze použít ke konstrukci vazebných prostředků, jednořetězcových vazebných proteinů, polypeptidů, které obsahují jeden nebo více CDR a zachovávají antigenvazebnou aktivitu, a rekombinantních protilátek obsahujících takové CDR, které všechny jsou součástí předkládaného vynálezu.

Tento vynález dále poskytuje farmaceutické prostředky obsahující takovou monoklonální protilátku nebo rekombinantní protilátky, vazebné prostředky, jednořetězcové vazebné proteiny a polypeptidy; a fyziologicky přijatelný nosič.

Všechny odkazy zde uvedené jsou inkorporovány pouze jako reference.

Zde uvedený termín „DNA“ definuje molekuly obsahující deoxyribonukleotidy spojené ve standardních od 5 do 3 fosfodiesterovém spojení a zahrnují oba menší oligodeoxyribonukleotidy a větší deoxyribonukleové kyseliny.

Protilátky obsahují seskupení polypeptidových řetězců spojených disulfidickými můstky. Dva hlavní polypeptidové řetězce popsané jako lehký a těžký řetězec tvoří všechny hlavní strukturální třídy (izotypy) protilátky. Těžké i lehké řetězce jsou dále rozděleny do suboblastí popsaných jako variabilní a konstantní oblasti. Těžké řetězce obsahují jednu variabilní oblast a 3 nebo 4 různé konstantní oblasti a lehké řetězce obsahují jednu oblast (různou od těžkého řetězce)

-4CZ 290039 B6 a jednu konstantní oblast (různou od oblastí těžkého řetězce). Variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce jsou odpovědné za vazebnou specifitu protilátky.

Zde uvedený termín „CDR strukturální smyčky znamenají oblasti tří lehkých a tří těžkých řetězců ve variabilní části protilátky, které spojují b vlákna na vazebnou část molekuly. Tyto smyčky mají charakteristické kanonické struktury (Chothia a kol., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987); Chothia a kol., J. Mol. Biol. 227, 799 (1992)).

Termín „Kabat CDR“ se vztahuje k hypervariabilní sekvenci protilátky na těžkém a lehkém řetězci, jak definoval Kabat a kol. (Sevvuences of Proteins of Immunological Interest, 4^th Edition, 1987, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health).

Zde uvedený termín „těžký řetězec variabilní oblasti“ znamená polypeptid o délce zhruba od 110 do 125 aminokyselinových zbytků, jehož aminokyselinová sekvence odpovídá sekvenci těžkého řetězce monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu počínaje od N-konce aminokyselinového zbytku těžkého řetězce. Kromě toho termín „lehký řetězec variabilní oblasti“ znamená polypeptid o délce zhruba od 95 do 130 aminokyselinových zbytků, jehož aminokyselinová sekvence odpovídá sekvenci lehkého řetězce monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu počínaje od N-konce aminokyselinového zbytku lehkého řetězce.

Termíny Fab, Fc, F(ab)2 a Fv jsou použity v jejich standardních imunologických významech (Klein, Immunology (John Wiley, New York, 1982): Parham, kapitola 14, v Weir, Ed. Immunochemisty, 4^th Ed. (Blackwell Scientifíc Publishers, Oxford, 1986)).

Zde uvedený termín „monoklonální protilátka“ znamená homogenní populaci imunoglobulinů, které jsou schopné specifické vazby na lidský IL-5. Lidský IL-5 může mít jeden nebo více antigenních determinantů obsahujících 1) peptidové antigenní determinanty, které sestávají zjednoho peptidového řetězce lidského IL-5, 2) konformační antigenní determinanty, které sestávají zvíce než jednoho prostorově blízkých peptidových řetězců, jejichž vlastní aminokyselinové sekvence jsou umístěny nesouvisle po sekvenci lidského polypeptidu IL-5, 3) post-translační antigenové determinanty, které sestávají buď z celé struktury nebo zčásti molekulárních struktur kovalentně připojených k lidskému IL-5 po translaci, jako jsou sacharidové skupiny atd. Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být zaměřeny proti jednomu nebo více takovým determionamtům.

Zde uvedený termín „vazebný prostředek“ znamená prostředek sestávající ze dvou polypeptidových řetězců 1), které jsou-li funkčně asociovány, zaujímají konformaci s vysokou vazebnou aktivitou vůči lidskému IL-5, a 2) které odvozeny od hybridomu produkujících monoklonální protilátky specifické pro lidský IL-5. Termín „funkčně asociovány“ znamená, že dva polypeptidové řetězce mohou být relativně vůči sobě postaveny mnoha způsoby, včetně postavení, které zaujímají v nativním fragmentu protilátky, jako je Fab nebo Fv, nebo genovou manipulací připravené cystein obsahující peptidové spoje nebo jiné spoje na C-konci.

Monoklonální protilátky lze připravit standardními způsoby, popsanými např. Kohlerem a kol., (Nátuře 256,495 (1975); Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976)). V zásadě je vždy živočich standardním způsobem imunizován za účelem produkce somatických buněk sekretujících protilátku. Tyto buňky jsou následně odebrány z imunizovaného živočicha pro fúzi s buňkami myelomu.

Somatické buňky s potenciálem pro produkci protilátek, zvláště B buňky, jsou vhodné pro fůzi s linií buněk myelomu. Tyto somatické buňky mohou být odvozeny od lymfatických uzlin, slezinných tkání nebo periferální krve aktivovaných živočichů. V typickém případě podle předkládaného vynálezu byly použity krysí slezinné buňky, protože tyto buňky poskytují relativně vysoká procenta stabilních fůzí s liniemi buněk myelomu myší. Namísto nich by bylo možno použít také lidské, myší, králičí, ovčí nebo kozí buňky nebo buňky jiných druhů.

-5CZ 290039 B6

Specializované linie buněk myelomu byly kultivovány z lymfatických tumorů pro použití v procedurách pro fúzi k produkci hybridomu (Kohled a Milstein, Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976); Shulman a kol., Nátuře 276, 269 (1978); Volk a kol., J. Virol. 42, 220 (1982)). Tyto buněčné linie byly kultivovány nejméně pro tři účely. Prvním je usnadnění výběru fúzovaných hybridomů z nefúzovaných a podobně neomezeně se rozmnožujících buněk myelomu. To je obvykle provedeno použitím myelomu s enzymovou deficiencí, což jim znemožňuje růst v určitém selektivním médiu a to podporuje růst hybridomů. Druhý důvod vyplývá z inherentní schopnosti buněk lymfatického nádoru produkovat jejich vlastní protilátky. Předpokladem použití monoklonálních technik je získání fúzovaných hybridních buněčných linií s neomezenou délkou života, které produkují jednu požadovanou proti látku za genetické kontroly složek hybridomu somatických buněk. K eliminaci produkce protilátek nádorových buněk hybridomem jsou použity linie buněk myelomu neschopné produkovat endogenní lehké nebo těžké imunoglobulinové řetězce. Třetí důvod výběru těchto buněčných linií je jejich vhodnost a efektivnost při fúzi.

Mnoho linií buněk myelomů lze použít k produkci fúzovaných buněčných hybridů včetně např. P3X63-Ag8, P3X63-AG8.653, P3/NSl-Ag4-l (NS-1), Sp2/0-Agl4 a S194/5.XXO-Bu.l. P3X63-Ag8 a NS-1 buněčné linie byly popsány viz Kohler a Milstein (Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976)). Shulman a kol. (Nátuře 276, 269 (1979)) vyvinuli Sp2/0-Agl4 linii myelomu.S194/5.XXO.Bu.l linie byla popsána viz Trowbridne (J. Exp. Med. 148, 313 (1979)).

Způsoby generování hybridů buněk sleziny produkující protilátku nebo buněk lymfatických uzlin a buněk myelomu obvykle zahrnují smísení somatických buněk s buňkami myelomu v poměru 10:1 ačkoli poměr se může lišit od asi 20:1 do asi 1:1), resp. v přítomnosti činidla nebo činidel (chemických, virálních nebo elektrických), která vyvolávají fúzi buněčných membrán. Fúzní způsoby byly popsány Kohlerem a Milsteinem viz výše, viz Gefter a kol. (Somatic Cell Genet. 3, 231 (1977)) a Volkem a kol. (J. Virol. 42, 220 (1982)). Činidla vyvolávající fúzi použitá těmito badateli byla Sendai virus a polyetylenglykol (PEG).

Protože fúzní procedury produkují životaschopné hybridy ve velmi nízké frekvenci (např. jsou-li slezinné buňky použity jako zdroj somatických buněk, je získán jen jeden hybrid na zhruba každých 10⁵ slezinných buněk), je nutné mít prostředky k selekci hybridů fúzovaných buněk ze zbylých nefúzovaných buněk, zvláště nefúzovaných buněk myoelomu. Jsou také nutné prostředky k detekci požadovaných hybridomů produkujících protilátku mezi ostatními výslednými hybridy fúzovaných buněk.

Obecně je selekce fúzovaných buněčných hybridů prováděna kultivováním buněk v médiu, které podporuje růst hybridomu, ale zamezuje růstu nefúzovaných buněk myoelomu, které by se normálně dělily neomezeně. Somatické buňky použité při fůzi se nevyznačují dlouhou životností v in vitro kultuře a nepředstavují proto problém. V příkladu podle předkládaného vynálezu byly použity buňky myelomu postrádající hypoxantin-fosforibosyltransferázu (HPRT-negativní). Selekce proti těmto buňkám je tvořena v hypoxantin/aminopterin/tymidin (HAT) médiu, tj. v médiu, kde hybridy fúzovaných buněk přežívají díky HPRT-pozitivnímu genotypu slezinných buněk. Je možné i použití buněk myelomu s různými genetickými defíciencemi (senzitivita vůči některým látkám atd). které mohou být vyselektovány v médiu podporujícím růst genotypicky kompetentních hybridů.

K selektivním kultivaci hybridů fúzovaných buněk je nutno několik týdnů. V rané fázi tohoto časového období je nutné identifikovat ty hybridy, které produkují požadovanou protilátku, takže mohou být následně klonovány a množeny. Obecně produkují požadovanou protilátku kolem 10% získaných hybridů, ačkoliv rozsah od asi 1 do 30 % není vzácný. Detekci hybridů produkujících protilátku lze provést některým ze standardních způsobů včetně ELISA testů a RIA technik, které byly popsány v literatuře (viz např. Kennet a kol. (Eds), Monoclonal Antibodies and Hyridomas: A New Dimension in Biological Analyses, str. 376-374, Plenům Press, New York, 1980).

-6CZ 290039 B6

Požadované hybridy fúzovaných buněk byly selektovány a klonovány do jednotlivých buněčných linií produkujících protilátku, přičemž každou buněčnou linii lze množit každým ze dvou standardních způsobů. Suspenze buněk hybridomu lze injikovat do histokompatibilního zvířete. Toto zvíře bude produkovat nádorové buňky, které sekretují specifickou monoklonální protilátku produkovanou hybridem fúzovaných buněk. Tělní tekutiny zvířete, jako je sérum nebo ascitová kapalina, jsou odebírány za účelem poskytnutí monoklonálních protilátek ve vysokých koncentracích. Alternativně lze jednotlivé buněčné linie množit in vitro v laboratorních kultivačních nádobách.

Kultivační médium obsahující vysoké koncentrace jedné specifické monoklonální protilátky lze získávat dekantací, filtrací nebo centrifugací a následně purifikovat.

Monoklonální protilátky lze také produkovat za použití dobře známých systémů fágových knihoven.

Použití a generování fragmentů protilátek je dobře známo, např. Fab fragmenty (Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam, 1985), Fv fragmenty (Hochman a kol., Biochemistry 12, 1130 (1973); Sharon a kol., Biochemistry 15, 1591 (1976); Ehrlich a kol., US 4 355 023), poloviny molekul protilátek (Auditore-Hrgreaves, US 4 470 925). Navíc lze takové sloučeniny a prostředky podle předkládaného vynálezu použít ke konstrukci bispecifických protilátek známými technikami, např. dalšími fúzemi hybridomů (tj. vznik vzt. quandromů; Reading, US 4 474 493) nebo chemickou reasociací poloviny molekul (Brennan a kol., Science 229, 81 (1985)).

Hybridomy a monoklonální protilátky proti lidskému IL-5 mohou být produkovány kterýmkoli zdrojem, např. z komerčních nebo přírodních zdrojů nebo aplikacemi chemických syntetických metod nebo technologií rekombinantní DNA. Zde použitý název „rekombinantní IL-5“ znamená IL-5 produkovaný expresí rekombinantní DNA (cDNA) kódující stejný jako prokaryotní, tak eukaryotní, tak eukaryotní expresní systém. Dále lze genomickou DNA použít pro produkci IL-5 v eukaryotních systémech. Vyprodukovaný IL-5 může a nemusí být glykosylovaný.

Vzhledem k tomu, že nukleotidová sekvence DNA kódující jak myší, tak lidský IL-5 je známa (viz např. Azuma a kol., Nucleic Acids Res. 14, 9149 (1986)), mohou být takové DNA syntetizovány na pevné fázi za použití fosforamiditového způsobu podle Matteucciho a kol. (J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)), podle Yooa a kol. (J. Biol. Chem. 764, 17078 (1989)) nebo jinými dobře známými způsoby. To lze uskutečnit např. tak, že jsou syntetizovány relativně malé oligonukleotidy, které jsou ligovány dohromady, analogicky způsoby syntézy DNA kódující IL-2 podle Barra a kol. (Intemational Patent Application Publication No. WO 85/02200).

Alternativně lze buňky schopné produkovat IL-5 stimulovat k produkci IL-5 m-RNA, která slouží jako templát pro přípravu IL-5 cDNA standardními způsoby. Poté lze konstruovat knihovny cDNA, ve kterých lze identifikovat IL-5 cDNA použití směsi oligonukleotidových prob založené na známé informaci o sekvenci. Takovou cDNA lze potom klonovat a exprimovat v jednom z mnoha bakteriálních, kvasinkových nebo savčích expresních systémů. Tento způsob byl použit pro přípravu rekombinantního krysího, myšího nebo lidského IL-5 (viz např. Tavemier a kol., DNA 8, 491 (1989), Minamitake a kol., J. Biochem. 107, 292 (1990), Uberla a kol., Cytokine 3, 72 (1991)). Lidský IL-5 byl připraven podle obecně vlastněné US patentové přihlášky (Sériové č. 07/615 061, vyplněné 16. 11. 1990) expresí cDNA kódující lidský IL-5 v buňkách ovarií čínského křečka (CHO buňky). Tsujimoto a kol. (J. Biochem. 106, 23 (1989)) popisuje taktéž produkci rekombinantního lidského IL-5 CHO buňkami.

Podle dalšího způsobu lze oligonukleotidových prob založenou na známé informaci o sekvenci IL-5 použít k identifikaci IL-5 genů v knihovnách genomových DNA, připravených

-7CZ 290039 B6 standardními způsoby. Takto identifikovanou DNA lze vyjmout z knihovny štěpením restrikčními endonukleázami, sekvenováním a expresí v eukaryotickém expresním systému nebo (po následné deleci intronu standardními způsoby, je-li to nutné) v prokaryotním expresním systému. Tímto způsobem Campbell a kol. (Proč. Acad. Nati. Sci. USA 84, 6629 (1987)) produkovali lidský IL-5 v opičích ledvinných buňkách (COS buňky).

Zajisté jak cDNA, tak knihovny genomových DNA lze zkoumat aplikací standardních expresních klonovacích způsobů, namísto použití oligonukleotidových prob. Takto produkovaný IL-5 je detekován za použití známých imunochemických způsobů a biotestů.

Polypeptidy IL-5 lze také připravit přímo za použití způsobů syntézy peptidů, viz Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)); IL-5 lze také získat komerčně.

Jakmile je hybridom produkující žádanou monoklonální protilátku získán, lze použít techniky pro získání interspecifíckých monoklonálních protilátek, kde je vazebná oblast species kombinována snevazebnou oblastí protilátky jiného species (Liu a kol.. Prpc. Acad. Nati. Sci USA 84, 3439 (1987)). Např. CDR z monoklonální protilátky hlodavce mohou být vloženy do lidské protilátky, a tak protilátku hlodavce „humanizovat“ (Riechmann a kol., Nátuře 332, 323 (1988)). Zvláště CDR mohou být vloženy do variabilní oblasti lidské protilátky s nebo bez lidských konstantních oblastí. Takový způsob byl použit např. pro humanizaci myší monoklonální protilátky proti p55 (Tac) podčástí receptoru lidského interleukinu-2 (Queen a kol., Proč. Acad. Nati. Sci. USA 86, 10029(1989)).

cDNA podle předkládaného vynálezu, které kódují lehké a těžké řetězce variabilních oblastí monoklonálních protilátek specifických proti lidskému IL-5 a CDR z takových protilátek lze takovým způsobem sestavit. Pozice CDR ve variabilních oblastech protilátek lze zjistit použitím mnoho dobře známých standardních způsobů. Např. Kabat a kol. viz výše publikoval pravidla pro určení pozice CDR. CDR nalezené podle těchto pravidel jsou zde nazývány „Kabat CDR“. Jsou také dostupné počítačové programy, které lze použít pro identifikaci CDR strukturálních smyček na základě aminokyselinových zbytků zahrnutých do trojrozměrných smyček vazebného místa řetězců protilátky, jak je popsáno např. viz níže.

Zde použité způsoby jsou použitelné pro humanizaci široké škály živočišných protilátek. Byl použit dvoukrokový postup, který zahrnuje: a) výběr sekvencí lidské protilátky, které byly použity jako lidský rámec pro humanizaci a b) zjištění, která rezidua variabilních oblastí živočišné monoklonální protilátky by měla být vybrána pro vložení do vybraného lidského rámce.

První krok zahrnuje výběr nejlepších dostupných sekvencí lidského rámce pro ty sekvence, pro které jsou tyto informace známy. Tento způsob výběru zahrnuje následující kritéria pro výběr:

1) procenta identity

Sekvence těžkých a lehkých řetězců variabilních oblastí živočišné monoklonální protilátky určené pro humanizaci jsou optimálně seřazeny a srovnány výhodně se všemi známými sekvencemi těžkých a lehkých řetězců variabilních oblastí. To je v kontrastu s předchozími způsoby, které se velmi spoléhají na použití pouze dvou lidských protilátek, NEW a KOL. U těchto protilátek jsou známy strukturní informace, pro které jsou odvozena označení podle iniciál pacientů, od nichž byly získány. Struktura protilátky HIL je nyní také známa (Brookhaven Code P8FAB).

Jakmile jsou sekvence takto porovnány, zbylé identity jsou zaznamenány a jsou určena procenta identit. Při rovnosti dalších faktorů je nutné selektovat lidskou protilátku, která má nejvyšší procento identity s živočišnou protilátkou.

-8CZ 290039 B6

2) nejednoznačnost sekvencí

Známé sekvence řetězců lidské protilátky jsou pak vyhodnoceny na přítomnost neidentifikovaných reziduí a/nebo nejednoznačností, které jsou sekvenčně nepravidelné. Nejběžnější nepravidelnosti jsou způsobeny chybnou identifikací kyselé aminokyseliny namísto amidu aminokyseliny v důsledku ztrát)· amoniaku v průběhu sekvenční procedury, např. nesprávná identifikace zbytku glutamové kyseliny v případě, že zbytek aktuálně přítomný v proteinu byl zbytek glutaminu. Nepravidelnosti jsou identifikovány examinací pomocí databází jako je např. viz výše Kabat a kol. Při rovnosti dalších faktorů je nutné selektovat řetězec lidské protilátky, která má co nejméně takových nejednoznačností.

3) Rozmístění Pin-oblastí

Variabilní oblasti řetězce protilátky obsahují intradoménové disulfidické můstky. Vzdálenost (počet reziduí) mezi cysteinovými zbytky zahrnující tyto můstky se týká rozmístění Pin-oblastí (Chothia a kol., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Při rovnosti dalších faktorů je nejvíce žádoucí selektovat řetězec s rozmístěním Pin-oblastí lidské protilátky s co nejpodobnějším nebo identickým s živočišnou protilátkou. Za účelem usnadnění počítačového modelování je také žádoucí, aby bylo rozmístění Pin-oblastí v lidské sekvenci podobné známé trojrozměrné struktuře protilátky.

Sekvence lidské protilátky nebo protilátek s nejlepší celkovou kombinací žádoucích charakteristik jako rámce pro humanizaci živočišné protilátky je založena na předchozích kritériích. Lze použít těžké a lehké řetězce selektované z té samé nebo různých lidských protilátek.

Druhý krok podle způsobu podle předkládaného vynálezu zahrnuje zjišťování, která ze sekvencí variabilních oblastí živočišné protilátky by měla být vybrána pro vložení do lidského rámce. Tento způsob selekce je založen na následujících kritériích pro selekci:

1) Selekce reziduí

Dva typy potenciálních reziduí variabilních oblastí ze sekvencí živočišné protilátky jsou vyhodnoceny; první z nich se nazývají „minimální rezidua“. Tato minimální rezidua zahrnují CDR strukturální smyčky plus nějaká další požadovaná rezidua podle nálezu z počítačového modelování za účelem podpory a/nebo orientace CDR strukturálních smyček.

Další typy potenciálních reziduí variabilních oblastí se nazývají „maximální rezidua“, která zahrnují minimální rezidua plus Kabat CDR plus nějaká další požadovaná rezidua zjištěná podle nálezu z počítačového modelování, která patří k 1,0 nm CDR strukturálním smyčkám a mají vodorozpustný dostupný povrch (Lee a kol., J. Bio. Chem. 55, 379 (1971) o 0,5 nm nebo větší. V příkladu viz níže byla selektována rezidua spadající do rozmezí 05 nm CDR strukturálních smyček.

2) Počítačové modelování

Za účelem identifikace potenciálních reziduí variabilních oblastí je provedeno počítačové modelování a) sekvencí variabilních oblastí živočišné protilátky, která je vybrána pro humanizaci, b) selektovaných sekvencí rámce lidské protilátky a c) všech možných rekombinantních protilátek včetně sekvence rámce lidské protilátky, do kterých byla vložena různá minimální a maximální rezidua živočišné protilátky.

Počítačové modelování je provedeno za použití softwaru vhodného pro modelování proteinů a strukturních informací získaných z protilátky, která a) má variabilní oblasti aminokyselinové sekvence co nejvíce identické s oblastmi živočišné protilátky a b) má známou trojrozměrnou

-9CZ 290039 B6 strukturu. Jako příklad softwaru, který lze použít, je softwar SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Protilátka, ze které lze strukturní informace získat může ale nemusí být nutně lidská protilátka. Pro příklad viz níže byla použita strukturní informace získaná z myší protilátky označované 1F19.

Na výsledcích předchozí analýzy počítačovým modelováním struktury byla založena selekce rekombinantních řetězců obsahujících živočišné variabilní oblasti s co největší podobností s živočišnou protilátkou určenou pro humanizaci.

Nukleotidová sekvence cDNA kódující částečně těžké a úplně lehké řetězce variabilních oblastí anti-lidské IL-5 monoklonální protilátky JES1-39D10, jejíž produkce je popsána viz níže, je definována ve Výpisu sekvencí pod identifikačním č. sekvence: 1 resp. 2. Aminokyselinové sekvence predikované na základě těchto nukleotidových sekvencí jsou také definovány pod identifikačním č. sekvence: 1 resp. 2.

V nukleotidové sekvenci definované pod identifikačním č. sekvence: 1 (sekvence těžkého řetězce), byly báze od 1 do 26 odvozeny z primeru pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Klonovaná sekvence proto začínala 27. bází. Aminokyselinová sekvence odpovídající sekvenci s identifikačním č. 1 odpovídá zralému polypeptidu V_H, nezahrnuje vedoucí nebo první 14 reziduí rámce 1. V nukleotidové sekvenci definované identifikačním č. sekvence: 2 (sekvence lehkého řetězce), báze 1 a 2 byly odvozeny z primeru pro PCR. Klonovaná sekvence proto začínala 3. bází. Aminokyselinová sekvence odpovídá proto vedoucímu a zralému polypeptidu V_L.

CDR variabilních oblastí těžkých řetězců monoklonální protilátky JES1-39D10 zjištěné způsobem podle Kabat a kol. viz výše zahrnují aminokyselinová rezidua 26-30,45-60 a 93-100 aminokyselinové sekvence definované identifikačním č. sekvence: 1. Jak bylo zjištěno počítačovou analýzou struktur smyček vazebného místa viz níže zahrnují CDR strukturní smyčky variabilních oblastí těžkých řetězců monoklonální protilátky JES1-39D10 aminokyselinová rezidua 21-27, 47-50 a 93-101 aminokyselinové sekvence definované identifikačním č. sekvence: 1.

Nukleotidové sekvence kódující předchozí těžký řetězec CDR zahrnují báze 76-90, 133-180 a 277-300 (zjištěno podle Kabata) a 61-81, 139-150 a 277-303 (analýza smyčky) nukleotidové sekvence definované identifikačním č. sekvence: 1.

CDR variabilních oblastí lehkých řetězců monoklonální protilátky JES1-39D10 zjištěné způsobem podle Kabata a kol. viz výše zahrnují aminokyselinová rezidua 44-54, 70-76 a 109-117 aminokyselinové sekvence definované identifikačním č. sekvence: 2. Jak bylo zajištěno počítačovou analýzou struktur smyček vazebného místa viz níže zahrnují CDR strukturní smyčky variabilních oblastí lehkých řetězců monoklonální protilátky JES1-39D10 aminokyselinová rezidua 46-51, 70-72 a 111-116 aminokyselinové sekvence definované identifikačním č. sekvence: 2.

Nukleotidové sekvence kódují předchozí lehký řetězec CDR zahrnují báze 130-162, 208-228 a 325-351 (zjištěno podle Kabata) a báze 136-222, 208-216 a 331-348 (analýza smyčky) nukleotidové sekvence definované identifikačním č. sekvence: 2.

Z předchozího je vidět, že takto zjištěné CDR jsou kódovány od 9 do 48 bází. Použitelná DNA pro přípravu proteinu genovou manipulací zahrnuje proto od 12 do 333 bází a od 9 do 384 bází nukleotidových sekvencí definovaných identifikačními či sekvencí: 1 a 2. Konstantní oblast je také důležitá pro selekci izotypu pro přípravu proteinu genovou manipulací.

Jsou-li CDR podle předkládaného vynálezu použity pro přípravu humanizovaných protilátek vládáním do lidské protilátky, může být žádoucí zahrnout jeden nebo více aminokyselinových

-10CZ 290039 B6 zbytků, které, ačkoli leží mimo CDR, pravděpodobně s CDR nebo IL-5 interagují (Queen a kol. viz výše).

CDR podle předkládaného vynálezu mohou také tvořit základ pro návrh nepeptidových mimetických sloučenin, které napodobují funkční vlastnosti protilátky JES1-39D10.

Způsob přípravy takových mimetických sloučenin byl popsán viz Saragovi a kol. (Science 253, 792(1991)).

Navíc kromě základu pro humanizaci protilátky lze informace v sekvenci o identifikačním č.: 1 a 2 použít pro přípravu jednovláknových IL-5 vazebných proteinů zahrnujících spojené CDR z lehkých a/nebo těžkých řetězců variabilních oblastí, jak bylo popsáno viz Bird a kol. (Science 242, 423 (1988)), nebo biosyntetických protilátku vázajících míst (BABS), jak bylo popsáno vizHuston a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci USA 85, 5879 (1988)). Protilátky s jednou doménou zahrnují izolovanou variabilní doménu těžkého řetězce lze také připravit (Ward a kol., Nátuře 341, 544 (1989)) za použití informace v sekvenci o identifikačním č.: 1.

Dvě nebo více CDR podle předkládaného vynálezu lze taktéž spojit dohromady v polypeptid, a to buď přímo, nebo pomocí spojovací sekvence. Jednu nebo více CDR lze také vložit do jiného (ne-imunoglobulinového)polypeptidu nebo proteinu, kterému tímto propůjčuje IL-5-vazebnou schopnost.

Polypeptidy „zahrnující těžké nebo lehké řetězce variabilních oblastí monoklonální protilátky mající sekvenci definovanou identifikačními č. sekvencí: 1 nebo 2 nebo jejich subsekvence“ jsou zde definovány tak, že zahrnují všechny předchozí CDR-zahmující případy.

DNA, které kódují těžké nebo lehké řetězce variabilních oblastí protilátky JES1-39D10 nebo od něho odvozené CDR lze přepravit za použití standardních způsobů za použití informace o sekvenci nukleové kyseliny definované identifikačními č. sekvence: 1 a 2. Takové DNA lze chemicky syntetizovat, např. na pevné fázi za použití fosforamiditového způsobu podle Matteucciho a kol. (J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)), podle Yooa a kol. (J. Biol. Chem. 764, 17078 (1989)) nebojinými dobře známými způsoby.

Nebo alternativně, vzhledem k tomu, že sekvence genu je známa a stejně tak místa specifického štěpení mnoha dostupných restrikčních endonukleáz, lze poměrně snadno identifikovat a izolovat zgenomové DNA hybridomu gen, který produkuje monoklonální protilátku JES1-39D10, a štěpit DNA a získat žádané sekvence. PCR (Saiki a kol., Science 239,487 (1988)) doložený viz Daugherty a kol. (Nucleic Acids Res. 19, 2471 (1991)) lze taktéž použít za získání totožného výsledku. Primery použité pro PCR lze je-li to žádoucí navrhnout tak, aby vzniklo příslušné nové restrikční místo, které by usnadnilo následnou inkorporaci do daného vektoru.

Ještě další způsob získání DNA, které kódují těžké nebo lehké řetězce variabilních oblastí protilátky JES1-39D10 vyžaduje připravit cDNA za použití mRNA izolované z hybridomu, který produkuje monoklonální protilátku JES1-39D10, jako templát a klonovat takto získané variabilní oblasti za použití standardních způsobů (viz např. Wall a kol., Nucleic Acids Res. 5,3113 (1978), Zalsut a kol., Nucleic Acids Res. 8, 3591 (1980), Cabilly a kol. Proč. Acad. Nati. Sci. USA 81, 3273 (1984), Boss a kol., Nucleic Acids Res. 12, 3791 (1984), Amster a kol., Nucleic Acids Res. 8, 2055 (1980), Moore a kol., US 4 642 234).

Je jasné, že vzhledem k degeneraci genetického kódu může mnoho různých nukleotidových sekvencí kódovat CDR, polypeptidy a protilátky o aminokyselinových sekvencích definovaných sekvencemi a identifikačních č.: 1 a 2 a CDR z nich. Jednoduše, humanizované protilátky o aminokyselinových sekvencích definovaných viz níže mohou být kódovány mnoha různými DNA.

- 11 CZ 290039 B6

Jednotlivé použité kodony lze selektovat jak pro výhodnou konstrukci, tak pro optimální expresi v prokaryotním nebo eukaryotním systému. Takové funkční ekvivalenty jsou taktéž součástí předkládaného vynálezu. Dále je zřejmé, že se mohou vytvořit konzervativně modifikované varianty polypeptidů a proteinů, ve kterých jsou minoritní aminokyselinové substituce, přidané zbytky nebo delece, které substanciálně nemění biologickou funkci (viz Anfinsen, Science, 181, 223 (1973), Grantman, Science 185, 862 (1974)).

Takové konzervativně modifikované varianty aminokyselinových sekvencí definovaných identifikačním č. sekvence: 1 a 2 a humanizované protilátky popsané viz níže jsou taktéž v záměru předkládaného vynálezu. Je taktéž zřejmé, že např. chemickou syntézou nebo použitím modifikovaných PCR primerů nebo místně specifickou mutagenezí lze modifikovat DNA podle předkládaného vynálezu a získat tolik variant, kolik je žádoucí.

Může být také výhodné připravit více závažné modifikace. Viz např. Roberts a kol. (Nátuře 328, 731 (1987)) připravili protilátku se zvýšenou afinitou a specifitou odstraněním dvou nabitých reziduí na periferii spojovacího místa místně specifickou mutagenezí.

Inzerci DNA, které kódují variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce protilátky JES1-39D10 do vektoru lze snadno provést, zahmují-li konce obou DNA a vektoru kompatibilní restrikční místa. Nelze-li toto zaručit, může být nutné modifikovat konce DNA a/nebo vektoru odštěpením jednovláknových přesahů ostrý ch konců (generovaných štěpením restrikčními endonukleázami) za vzniku tupých konců. Téhož výsledku lze dosáhnout doplněním jednovláknových konců příslušnou DNA polymerázou. Alternativně lze jakéhokoli žádoucího místa dosáhnout tak, že je na konec DNA přiligována nukleotidová sekvence (spojka, linker). Taková sekvence (spojka, linker) může obsahovat specifické oligonukleotidové sekvence, které definují žádané restrikční místa. Štěpený vektor a fragmenty DNA lze také modifikovat, je-li to žádoucí, připojením homopolymemích řetězců na konce použitím PCR.

Farmaceutické prostředky lze připravit za použití protilátek, vazebných prostředků nebo jednovláknových vazebných proteinů podle předkládaného vynálezu nebo antiidiotypických protilátek připravených proti monoklonálním protilátkám za účelem léčby onemocnění spojených sIL-5. Fragmenty nebo protilátky jako jsou Fab nebo Fv fragmenty, z toho izolované lehké a těžké řetězce fragmentů a krátké polypeptidy zahrnující např. individuální CDR oblasti lze také použití v takových prostředcích.

Některé z takových prostředků mají IL-5-blokující nebo antagonistický účinek a mohou být použity pro potlačení aktivity IL-5. Takové prostředky zahrnují protilátky, vazebné prostředky nebo jednovláknové vazebné proteiny podle předkládaného vynálezu a fyziologicky přijatelný nosič.

Další prostředky zahrnují anti-idiotypické protilátky připravené za použití monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu jako antigen a fyziologicky přijatelný nosič. Tyto anti-idiotypické protilátky, které mohou být jako monoklonální tak polyklonální a jsou připravovány standardními způsoby mohou napodobovat vazebnou aktivitu samotného IL-5, a mohou být proto užitečné jako agonisté nebo antagonisté IL-5.

Použitelný farmaceutický nosič může být jakýkoli kompatibilní netoxická sloučenina vhodná pro přenos prostředku podle předkládaného vynálezu do pacienta. V nosiči mohou být zahrnuty sterilní voda, alkohol, tuky, vosky a inertní pevné materiály. V nosiči mohou být také zahrnuty farmaceuticky přijatelné adjuvanty (pufrovací agens, dispergační agens). Obecně jsou takové prostředky použitelné pro parenterální administraci takových látek známých, viz např. Remington s Pharmaceutical Science, (15^th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). Alternativně lze prostředky podle předkládaného vynálezu vnést do pacientova těla implantovatelnými systémy pro vnášení látek, viz Urguhart a kol. (Ann. Rev. pharmacol. Toxicol. 24, 199(1984)).

- 12CZ 290039 B6

Přehled obrázků na výkresech

Předkládaný vynález lze lépe pochopit z popisů a příklad viz níže a připojených obrázků, kde

Obr. 1 je schematické znázornění plazmidu pSRSMPA5H.

Obr. 2 je schematické znázornění plazmidu pDSRGMPA5H.

Obr. 3 je schematické znázornění plazmidu pDSRGMPA5L.

Obr. 4 je schematické znázornění plazmidu pSRSMPA5L.

Příklady provedení vynálezu

Příklad

Následující příklad je uveden pouze pro ilustraci a předkládaný vynález nikterak neomezuje. Procenta u směsí pevných látek, kapaliny v kapalinách a pevných látek v kapalinách jsou označeny jako % hmotnostní, % objemová a % pevné látky v kapalině, pokud není uvedeno jinak. Manipulace s kulturami buněk byly prováděny ve sterilním prostředí.

Obecné postupy a reagencie

Pokud není uvedeno jinak, byly experimenty s rekombinantní DNA prováděny podle Maniatise a kol. (Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Minipreparace plazmidové DNA s přes noc saturovaných kultur byly podle Bimboima a kol. (Nucleic Acids Res 7, 1513 (1979)). Tento postup dovoluje izolovat malé množství DNA z bakteriálních kultur pro analytické účely. Pokud není uvedeno jinak, byly maxipreparace plazmidové DNA prováděny podle Clewalla a kol. (J. Bacteriol. 110, 1135 (1972)).

Specifické restrikční fragmenty získané štěpením plazmidové DNA byly izolovány preparativní elektroforézou a angarozovém gelu. Elektroforéza na gelech o rozměrech 9x5,5 cm byla prováděn při 50 mA po dobu 1 hodiny v Tris-borátovém pufru (viz Maniatis a kol. viz výše, str. 454) a barveny roztokem s 0,5 pg/ml etidiumbromidu za účelem vizualizace DNA. Příslušná místa gelů byla vyříznuta a DNA byla z gelu elektroeluována (voz Maniatis a kol. viz výše, str. 164). Po elektroeluci byla DNA extrahovna fenolem (viz Maniatis a kol. viz výše, str. 458) a precipitována etanolem při -20 °C (viz Maniatis a kol. viz výše, str. 461).

Restrikční enzymy a T4 DNA ligáza byly získány od New England Biolabs (Beverly, MA). Superskript RNAza H reverzní transkriptáza byla získána od BRL/GIBCO (Gaithersburg, MD), Taq DNA polymeráza byla získána od Stratagene (LaJolla, CA), DNA polymeráza Klenow Fragment byla získána od Pharmacia LK.B Biotechnology, lne. (Piscataway, NJ), telecí intestinální fosfatáza byla získána od Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianapolis, IN) aRNAsin byla získána od Promega (Madison, WI). Všechny enzymy byly používány podle instrukcí poskytnutých prodejcem. Sequenase version 2.0 sekvenční systém byla získána od Uniterd States Biochemical (Cleveland, OH).

Deoxynukleotidové trifosfáty a oligo dTi₂_₁₈ příměry byl získán od Boehringer Mannheim Biochemicals a redestrilovaný fenol od BRL/GIBCO.

- 13CZ 290039 B6

Plazmidové vektory pSV.Sport a pUC19 a kompletentní E. coli linie DH5-alpha (Max Efficiency) byly získány od BRL/GIBCO. COS-7 buňky (ATCC CRL 1651) byly získány od Americal Type Culture Collection, Bethesda, MD. Média pro tkáňové kultury, fetální hovězí sérum (FBS) a doplňky byly získány od BRL/GIBCO.

Rekombinantní lidský IL-5 byl expridomován v buňkách ovarií čínského křečka (CHO buňky) standardním způsobem za použití plazmidu pDSRG (ATCC 68233) a purifikován imunoafmitní chromatografií.

Králičí antisérum proti rekombinantnímu lidskému IL-5 bylo připraveno standardním postupem. Biotinylovaný kozí anti—králičí IgG byl získán od Vector Labs, Burlingame, CA, zatímco konjugát streptavidin-alkalická fosfatáza byl získán od BRL/GIBCO. Biotinylovaný králičí anti-krysí IgG byl získán od JacksonLabs, Wst Grove, PA. Nitro-tetrazolium modř (NBT) a 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfát (BCIP) byly získány od BRL/GIBCO.

Vysoce citlivý ELISA AMPLIFICATION SYSTÉM* použitý jako substrát pro mikrotitrační desky pro ELISA stanovení byl získán od BRL/GIBCO.

Buněčné kultury

Buňky hybridomu produkujícího monoklonální protilátku JES1-39D10 byly získány podle Denburga a kol., (Blood 77, 1462, (1991)) a zpočátku byly uchovávány v Dulbecco's Modifiend Eagle's médiu (DMEM/vysoký obsah glukózy, GIBCO, Bethesda, MD) dopněném 5% FSB, 2 mM glutaminem a 10 jednotkami/ml směsí penicilin/streptomycin v komoře ve zvlhčené atmosféře o teplotě 37 °C s 5% obsahem CO₂. Následně byly buněčné linie adaptovány na kultury prosté séra nahrazením séra IX HB101 doplňkem (Hana Biologics, Alameda, CA).

Charakterizace monoklonální protilátky JES1-39D10

Purifíkace

Médium upravené působením linie buněk produkujících protilátku 39D10.il (subklon ES1-39D10) bylo odděleno, filtrováno a naneseno na antigenní afinitní klonu připravenou spojením rekombinantního lidského IL-5 a Afigel-15^R pryskyřice (BioRad, Richmond, CA). Potom byla kolona promyta postupně fosfátem-pufrovaným roztokem šalinu (PBS) a PBS s 0,5 M NaCl a ekvilibrována roztokem PBS. Protilátka 39D10.11 byla eluována z kolony 0,2 M glycinovým pufrem (pH=2,95), po eluci byl roztok protilátky okamžitě neutralizován roztokem 1M tris-HCÍ (pH=8).

Purifikovaný protein byl podroben elektroforéze na 15 % polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) za redukujících podmínek, viz Leamli (Nátuře 227, 680 (1970)), za účelem separace lehkých a těžkých řetězců. Oba typy řetězců byly regenerovány z gelu přenesením na IMMOBILON* membránu (PVDF membrána od Millipore, Badford, MA) za použití elektroblotovacího způsobu viz Matsudaira (J. Biol. Chem. 261,10035 (1987)).

Pásy odpovídající lehkým a těžkým řetězcům byly vyříznuty z membrány s následným obarvením Coomassie Brilliant Blue a podrobeny sekvenční proceduře od N-konce za použití protein-peptidového sekvenceru Apllied Biosystems Model 477A. Stanovení sekvence izolovaných lehkých a těžkých řetězců blotovaných na IMMOBILON^R membránou bylo provedeno podle Yuena a kol. (Biotechniques 7, 74 (1989)).

Těžké řetězce nelze sekvenovat za použití standardních podmínek, lehké řetězce byly sekvenovány v 15 cyklech. Srovnání získaných sekvencí s publikovanými daty potvrdilo identitu lehkého řetězce krysího imugelobulinu.

- 14CZ 290039 B6

Stanovení izotypu antigenu

Stanovení izotopu antigenu JES1-39D10 bylo provedeno za použití kitu od Zymed (San Francisco, CA) a odhalilo, že těžký řetězec byl gama 2a izotyp a lehký řetězec byl kappa izotyp (γ2β/χ izotyp).

Účinek na biologickou aktivitu

Monoklonální protilátka JES1-39D10 silně inhibuje biologickou aktivitu rekombinantního lidského IL-5 (Denburg a kol., viz výše). Studie ukázaly, že protilátka vykazuje tento účinek inhibováním vazby IL-5 na jeho celulární receptory.

PCR klonování

Návrh oligonukleotidového primeru a klonovací strategie

Ve zkratce lze říci, že oligonukleotidové primery byl připraveny tak, aby odpovídaly známým N- a C sekvencím konců kappa lehkých a těžkých řetězců krysího IgG2a, viz Reichman a kol. (Nátuře 332, 323 (1988)), Bruggeman a kol. (Proč. Acad. Nati. Sci. USA 83, 6075 (1986)), Hellman a kol. (Gene 40, 17 1985)). Za použití těchto primerů byly izolovány cDNA fragmenty kompletního lehkého řetězce a zkrácené lehké řetězce způsobem PCR viz Saiki a kol. (Science 239, 487 (1988)). cDNA fragmenty byly sekvenovány a jejich sekvence byly potvrzeny srovnáním s dalšími klony generovanými PCR primery navrženými pro jiné oblasti cDNA. Vydedukované aminokyselinové sekvence lehkého řetězce byly ověřeny sekvenováním prvních 15 N-koncových zbytků lehkého řetězce JES1-39D10.

Syntéza oligonukleotidů

Oligonukleotidové primery založené na IgG2a/kappa izotypu protilátky JES1-39K10 o sekvencích definovaných výpisem sekvencí byly připraveny standardním způsobem za použití zařízení Applied BioSystems Model 380A nebo 380B Synthesizer.

Označení primerů (první písmo odpovídá modelu použitého syntetizátoru) a odpovídají identifikační čísla sekvencí jsou uvedena viz dále:

Oligonukleotid	Identifikační č. sekvence
B2051CC	3
B2031CC	4
A2064CC	5
A2065CC	6
B2137CC	7
B2108CC	8
B2101CC	9
B1852CC	10

Pro těžký řetězec protilátky JES1-39D10 byl 5' koncový primer B2051CC odvozen od segmentu sekvence krysího IgG2a publikované Reichmannem a kol., viz výše, zahrnující od 6 do 14 aminokyselinového zbytku maturovaného těžkého řetězce polypeptidu. Za účelem usnadnění klonování byl na 5' konec primeru přidána dvě restrikční místa: Xbal a HindlIII. Návrh 3'konce primeru B2031CC byl založen na segmentu publikované (Bruggemann a kol.) sekvence krysího IgG2a zahrnující tri konstantní oblasti. Za účelem usnadnění klonování byla na 3' konec primeru přidána tři restrikční místa: Smál, EcoRI a Sall.

- 15CZ 290039 B6

Pro lehký řetězec byly 5' a 3' konce sekvence primeru odvozeny od publikované sekvence krysí kappa mRNA (Hellman a kol.). Primer A2064CC zahrnuje částečně 5' nepřepisovanou oblast a první dva nukleotidy translačního iniciačního kodonu. HindlII a BamHI místa byla přidána pro usnadnění klonování 3' koncový primer A2065CC byl založen na segmentu publikované sekvence 3' nepřepisované oblasti (3' UTR) lehkého řetězce krysího kappa immunoglobulinu. Tento segment zahrnuje poslední dva nukleotidy sto kodonu a 22 3' UTR nukleotidů následně za 3' koncem stop kodonu. EcoRl a Pstl místa byla přidána pro usnadnění klonování.

Reakční podmínky PCR

Celková cytoplazmatická RNA byla izolována z linie buněk hybridomu produkujícího protilátku JES1-39D10, viz Cathala a kol. (DNA 2, 329 (1983)). Syntéza prvního vlákna cDNA byla provedena izolací RNA jako templátu, viz Larrick a kol. (Bio/Technology 7, 939 (1989)). cDNA produkt byl podroben PCR v reakční směsi o objemu 50 μΐ s překrytím 50 μΐ parafínového oleje v 0,5 ml v eppendorf-zkumavce.

Reakční směs pro syntézu těžkého řetězce obsahovala: 26,5 μΐ FEO, 5 μ Taq (Thermus Aquaticus) DNA polymerázového pufru (finální koncentrace v reakci: lOmM tris. HC1 (pH=8,3), 50 mM KCi, 1,5 mM MgCl₂, 0,01 % (pevné látky v objemu želatiny), 5 μΐ 1,25 mM dNTP, 4 μΐ primeru B2051CC (60 pmol), 4 μΐ primeru B2031CC (60 pmol), 5 μΐ cDNA (obsahující polovinu prvního vlákna cDNA odvozené z 3-6 pg celkové RNA) a 0,5 μΐ Taq polymerázy (2,5 jednotek). Reakční směs pro syntézu lehkého řetězce byla podobná, ale jako primery byly použity A2064CC a A2065CC.

Reakce byla provedena v zařízení PHC-1 Thermocycler (Techne, princeton, NJ) při cyklech s nastavením: 1,5 mil 94 °C pro denaturaci, 2 min 50 °C pro anelaci, 3,5 min 72 °C pro syntézu, na konci cyklu byla reakční směs inkubována po dalších 9 min při teplotě 72 °C.

Reakční směs z PCR byla podrobena elektroforéze v 1% agaróza/Tris-borátovém gelu s 0,5 pg/ml etidiumbromidu. Fragmenty DNA o očekávaných velikostech (přibližně 1,5 kilobáze pro těžký řetězec, přibližně 0,7 kilobáze pro lehký řetězec) byly vyříznuty z gelu a purifíkovány elektroelucí.

Verifikace klonů cDNA

Sekvenace DNA

Po generaci z gelu, precipitaci etanolem a štěpení restrikční endonukleázou byly předpokládané těžké a lehké řetězce cDNA generované PCR klonovány do vhodného vektoru pro sekvenaci.

Předpokládané těžké a lehké řetězce cDNA byly klonovány do vektoru pUC19 v podobě HindlII/EcoRI a BamHI/Bstl fragmentů. Ligované plazmidy byly pak transformovány do E. coli kmene DH5-alfa za použití standardních metod. Kolonie transformantu byly izolovány a pro sekvenování byla izolována plazmidová DNA z alespoň dvou klonů pro každý těžký a lehký řetězec. Srovnání takto získaných sekvencí variabilních oblastí (definovaných pro těžký a lehký řetězec identifikačním č. sekvence: 1 a 2) s publikovanými sekvencemi imunoglobulinů ukázaly vysoký stupeň homologie v rámci a umístění předpokládaných CDR zjištěných způsobem podle Kabat a kol. viz výše. Dále N-koncová sekvence aminokyselin predikovaná ze sekvence cDNA lehkého řetězce souhlasila s experimentálně zjištěnou N-koncovou sekvencí lehkého řetězce protilátky JES1-39D10.

-16CZ 290039 B6

Konstrukce expresních plazmidů

Aby bylo potvrzeno, že izolované cDNA kódovaly proteiny, které mohou specificky vázat lidský IL-5, byly cDNA kódující v plném rozsahu předpokládaný těžký řetězec protilátky JES1-39D10 rekonstruovány PCR. Primery B2137CC (identifikační č. sekvence: 7) a B2108CC (identifikační č. sekvence: 8 byly navrženy pro modifikaci prvotně klonovaných vystřihnutých těžkých řetězců cDNA. Tyto primery určovaly sekvence kódující vedoucí peptid, 5 chybějících zbytků aminokyselin na N-konci variabilní oblasti a chybějící zbytky na C-konci konstantní oblasti.

Vertebrální iniciační translační konsenzus sekvence (Kozák, Nucleic Acids Res. 20, 8125 (1987)) byla přidána k 5' konci kódující cDNA pro zlepšení translace. Pro zlepšení klonování byla na 5' a 3' konce výsledné cDNA přidána Sall a EcoRI restrikční místa.

Předpokládaná cDNA lehkého řetězce byla připravena také použitím primerů B2101CC (identifikační č. sekvence: 9) a B1852CC (identifikační č. sekvence: 10). To bylo provedeno za účelem modifikování restrikčních míst na koncích expresního plazmidů. Do cDNA byla také vložena vertebrální iniciační translační konsenzus sekvence.

Byla provedena PCR a produkty DNA byly izolovány, jak je popsáno viz výše, a DNA byly štěpeny Sall a EcoRI. cDNA těžkých a lehkých řetězců byly pak separátně ligovány do expresního vektoru pSRS (ATCC 68234), který byl také podobně štěpen. Plazmid pSRS obsahuje promotor SR a SV40 origin replikace umožňující replikaci a expresi cDNA inzertů v COS buňkách.

Transfekce

Před transfekcí byly COS buňky propagovány v médiu DMEM/vysoký obsah glukózy, doplněném 10% FBS a 6 mM glutaminem. Exponenciálně rostoucí buňky byly trypsinovány, omyty čerstvým médiem a resuspendovány v čerstvém médiu při hustotě 2x10⁷ buněk/ml.

Elektroporace byla provedena na zařízení GENEPULSER^R (BioRad, Richmond, CA) podle instrukcí výrobce. Ve zkratce: 250 μΐ alikvoty suspenze COS buněk byly rozděleny do každé kyvety. Do každé zkyvet bylo přidáno 10 pg CIRCLEPREP^r (Bio 101, LaJolla, CA) purifikované plazmidoVO DNA v objemu menším než 50 μΐ a roztok byl smísen s buňkami. Použité vzorky DNA zahrnovaly pSRS s inzertem cDNA těžkého řetězce (pSRS-Η), pSRS s inzertem cDNA lehkého řetězce (pSRS-L), alikvotní směsi (1:1) pSRS-Η a pSRS-L a nemodifikovaný pSRS.

Bylo působeno 0,2 V elektrickými pulzy při 960 pF s kapacitním extenderem. Buňky byly poté rozetřeny na kultivační misky o průměru 60 mm s 5 ml čerstvého média a inkubovány při 37 °C a 5% CO₂. Po 16 hodinách bylo médium odsáto a nahrazeno médiem bez séra. Buňky byly inkubovány dalších 72 hodin, po kterých bylo médium odebráno.

Imunoblotovací analýza

Média bez séra z transfekovaných buněk byl lOx koncentrována centrifugací v kyvetách CENTRICON^R (Amicon, Danvers, MA), a pak podrobeny elektroforéze v 15% SDS polyakrylamidovém gelu (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MA) za neredukujících podmínek. Na tentýž gel byly naneseny dvě identické sady vzorů a dvě směsi markérů proteinů o identické molekulové hmotnosti (obsahující 97,4, 68,43,29, 18,4 a 14,3 kilodaltonové proteiny.

Po elektroforéze byly separované páry přeneseny na nitricelulózovou membránu za použití Semi-dry Electroblotteru (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MA). Membrána byla

-17CZ 290039 B6 inkubována při teplotě místnosti s 3% BSA v PBS, a pak rozstřižena na dva kusy. Každý kus obsahoval kompletní sadu vzorků.

Jeden kus membrány byl použit v první analýze k detekci exprese krysího IgG řetězce v kondicionovaném médiu. To bylo provedeno při teplotě místnosti střídavě: lx s 1:200 ředěným biotinylovaným králičím anti-krysím IgG vTBST pufru (10 mM Tris-HCl, pH=7,4, 150 mM NaCl a 0,05% TWEEN-20^R (monolaurát polyoxyetylensorbitanu)) s 3% BSA po dobu 45 min, 3x TBST pufrem samotným po dobu 15 min, lx s 1:10 000 zředěnou alkalickou fosfatázou konjugovanou se streptavidinem v TBST pufru po dobu 30 min, 3x s TBST pufrem samotným po dobu 15 min a lx se substrátem alkalické fosfatázy (44 μΐ NBT a 33 μΐ BC1P v 10 ml pufru pro alkalickou fosfatázu obsahujícím 10 mM Tris-HCl, pH=9, 100 mM NaCl, 5 mM MgCL) po dobu 10 až 30 min. Membrána pak byla testována na barevnou změnu po opláchnutí destilovanou vodou.

Druhý kus membrány byl použit ve druhé analýze ke stanovení, zda byl lidský IL-5 vazebný protein přítomen v některém kondicionovaném médiu. Na tento kus bylo postupně působeno: lx 1 pg/ml rekombinantním lidským IL-5 vTBST pufru po dobu 1 hodiny, 3x TBST pufrem samotným po dobu 15 min, lx s 1:3000 ředěným králičím antisérem proti rekombinantnímu lidskému IL-5 vTBST pufru po dobu 1 hodiny, 3x TBST pufrem samotným po dobu 15 min, lx s 1:200 ředěným biotinylovaným kozím anti-králičím IgG b TBST pufru po dobu 1 hodiny, 3x TBST pufrem samotným po dobu 15 min, lx s 1:10 000 zředěním alkalické fosfatázy konjugované se streptavidinem v TBST pufru po dobu 30 min, 3x TBST pufrem samotným po dobu 15 min a lx substrátem alkalické fosfatázy po dobu 30 min. Kus membrány byl poté testován na barevnou změnu.

Výsledky první analýzy ukázaly, že jen médium kondicionované transformantem kontrasfekovaným oběma plazmidy pSRS-H a pSRS-L poskytlo detekovatelné pásy. Rozmístění pásů bylo odpovídající pro imunoglobuliny. Zbarvení indukující buď nízká množství protienu nebo neschopnost protilátky, rozpoznat individuální těžké a lehké řetězce nebylo pozorováno u vzorků obsahujících kondicionované médium z buněk transfekovaných samotným těžkým nebo lehkým řetězcem. V kondicionovaném médiu nebyla očekávána přítomnost těžkého řetězce, protože obvykle není sekretován za absence lehkého řetězce (Bole a kol., J. Cell Biol. 102, 1558 (1986)).

V druhé analýze byla pozorována silná IL-5 vazebná aktivita ve vzorku z média kondicionovaného transformantem kotransfekovaným oběma plazmidy pSRS-H a pSRS-L. Toto bylo zaznamenáno jako hlavní barevný pás v neredukujícím SDS gelu migrující se zdánlivou molekulovou hmotností kolem 160 kDa, což je očekávaná velikost pro kompletní molekulu protilátky.

ELIS A test

K určení schopnosti rekombinantní monoklonální protilátky specificky vázat lidský IL-5 bylo na misky při imunoassay (EIA) s 96 jamkami naneseno po 50 μΐ alikvotech samotného 3 % BSA nebo rekombinantního lidského IL-5 (5 μg/ml, následně blokováno roztokem BSA). Všechny nanášení byla provedena při 4 °C o dobu 2 hodin. 50 μΙ alikvoty média kondicionovaného různými transformanty COS buněk popsaných výše nebo buněčnou linií hybridomu produkující protilátku JES1-39D10 byly pak přidány do jamek a misky byly inkubovány při 4 °C po dobu 2 hodin.

Po inkubaci bylo médium v jamkách postupně nahrazeno použitím 300 μΐ alikvotů při teplotě místnosti: 3 x TBST pufr samotný po dobu 15 min, lxbiotinylovaný králičí anti-krysí IgG po dobu 2 hodin, 3x TBST pufr samotný po dobu 15 min, lxalkalická fosfatáza konjugovaná se straptavidinem vTBST pufru po dobu 30min, 3x TBST pufr samotný po dobu 15 min a pak

-18CZ 290039 B6 vyvinuto pomocí BRL ELISA AMPLIFICATION SYSTÉM^R po dobu 5 až 15 min, všechna zředění reagencií byla jako viz výše.

Výsledky tohoto stanovení ukázaly, že obě protilátky, přírodní protilátka JES1-39D10 (z média kondicionovaného hybrodimem) a rekombinantní protilátka (z média kondicionovaného hybridomem) a rekombinantní protilátka (z média kondicionovaného transformantem kotransfekovaným oběma plazmidy pSRS-H a pSRS-L) byly zachovány v jamkách s IL-5, jak bylo zjištěno silným zbarvením. Žádné signifikantní zbarvení nebylo nalezeno u kontrolních experimentů (které neobsahovaly protilátku) za absence IL-5 nebo byly-li testované vzorky kondicionovaná média buněk transfekovaných samotnými vektory kódujícími těžké nebo lehké řetězce.

Humanizace protilátky

Modelování homologie

Použitím metod popsaných výše bylo zjištěno, že protilátky HIL a LAY byly optimálními kandidáty lidského rámce. Nejprve byly zkoumány páry těžkého a lehkého řetězce HIL a LAY a jejich kombinace.

Seznam potenciálních minimálních a maximálních JES1-39D10 reziduí, která byl mohla být vložena do rámců, byl určen výše popsanými metodami, jak je ukázáno v následující tabulce.

	Reziduaa)
Vh minimální výpis	21-27, 47-50, 66,93-101
VH maximální výpisb)	19, 28, 29, 30, 32, 40, 45, 46, 51, 52-60, 71, 89, 92
Vl minimální výpis	46-51,68, 70-72, 84,91, 109, 110-116
VL maximální výpisb)	44, 45, 52-54, 56, 66, 73-76, 88, 89, 117

^a) rezidua pro Vh a Vl odpovídají číslům reziduí v sekvencích s identifikačním č. sekvence: 1 a identifikačním č. sekvence: 2.

^b) maximální výpisy V_H a V_L zahrnují odpovídající minimální výpisy a další vyznačená rezidua.

Specifické konstrukty popsané níže zahrnovaly následující rezidua podle tabulky:

Humanizovaná protilátka	Rezidua
CMX5-1	VH HIL maximální; VL LAY maximální
CMX5-2	VH HIL maximální, VL LAY maximální (bez strukturální CDR smyčky H-l na N-konci)
CMX5-3	VH LAY maximální; VL LAY maximální
CMX5^l	VH HIL minimální; VL LAY minimální
CMX5-5	VH HIL jen Kabat CDR; VL LAY jen Kabat CDR

Protože zamýšleným použitím humanizovaných protilátek byla neutralizace biologické aktivity rozpustného lidského IL-5, byl vybrán 4 jako konstantní oblast pro humanizované protilátky, a to proto, že 4 je nejméně potentní ze 4 lidských imunoglobulinových izotopů v dosažení fixace komplementů. Lidský protějšek krysího χ izotopu byl vybrán pro konstantní oblast humanizovaných lehkých řetězců.

-19cz 290039 B6

Konstrukce humanizované protilátky CMX5-1

Syntetická CMX5-1 DNA byla konstruována za použití kombinace PCR a běžných klonovacích technik. V oblast byla rozdělena do tří segmentů, z nichž každý byl určen tak, aby obsahoval určitá restrikční místa na 5' a 3' koncích. Byly vybrány kodony s relativně vysokou hustotou výskytu v savčích genech. Palindromické a repatitivní sekvence byly odstraněny nebo nahrazeny „tichými“ změnami v navržených oligonukleotidech k minimalizaci tvorby neanticipovaných sekundárních struktur, které mohou způsobit změny uspořádání sekvence nebo delece.

Oligonukleotidy odpovídající úplné variabilní oblasti těžkého řetězce (V_H) CMX5-1 byly syntetizovány standardními metodami.

Určení těchto oligonukleotidů a odpovídající identifikační č. sekvence definující jejich sekvence jsou:

Oligonukleotid	Identifikační č. sekvence
B2474CC	11
B2419CC	12
B2420CC	13
B2475CC	14
B2477CC	15
B2479CC	16

Páry oligonukleotidů B2474CC a B2419CC, B2420CC a B2475CC, B2477CC a B2479CC byly tepelně denaturovány, anelovány a inkubovány s Taq polymerázou nebo Pfu (stratagene, LaJolla, CA). V PCR byly dva oligonukleotidy v každém páru komplementární ke každému ze 4 až 30 nukleotidů. Proto byl každý oligonukleotid templátem pro další.

PCR byly prováděny při 18 cyklech, po kterých byly tři výsledné DNA fragmenty odpovídající třem konsekutivním segmentům V_H označeným jako V_H1, V_H2 a V_H3 podrobeny elektroforéze v agarózovém gelu a purifikovány elektroelucí.

Relativní uspořádání tří V_HDNA fragmentů, restrikční místa pro klonování a mapa restrikčních míst pro multiklonování klonovacího vektoru pSV.Sport byla:

Fragment	Restrikční místa	PCR primery
vHi	EcoRI	Spěl	B2474CCaB2419CC
Vh2	Spěl	Xbal	B2420CC a B2475CC
Vh3	EcoRI/Xbal	Sall/Apal/Sstl	B2477CC a B2479CC

Multiklonovací místo pSV.Sport

Pstl/Kpnl/Rsrll/EcoRI/Smal/Sall/Sstl/Spel/Notl/Xbal/BamHI/HindlII/SnaBi/Mlul

Fragment VhI byl štěpen enzymy EcoRI a Spěl a klonován do vektoru pSV.Sport. Fragment VlI byl nato připojen kV_Hl v pSV.Sport přímou inzercí do míst Spěl a Xbal. Fragment V_H3 byl samostatně klonován do pSV.Sport jako ExoRI/Xbal-Sall/Apal/Sstl fragment. Tyto tři fragmenty byl verifikovány sekvenováním DNA. DMX5-1 V_H cDNA o plné délce byl vytvořen nejprve připojením V_H 3 ke genomové DNA 4 H-řetězce konstantní oblasti (C_H) a pak připojením Vh3-Ch fragmentu k V_H 1-V_H2. jak je popsáno dále.

-20CZ 290039 B6

CMX5-1 Vl cDNA byl vytvořen podobně za použití šesti syntetických oligonukleotidových primerů. Tyto oligonukleotidy a odpovídající identifikační č, sekvence definující jejich sekvence jsou:

Oligonukleotid	Identifikační č. sekvence
B2425RCC	17
B2426CC	18
B2427CC	19
B2458CC	20
B2459CC	21
B2460CC	22

Tři fragmenty označené V_L 1, V_L2 a V_L3 byly odvozeny z oligonukleotidových párů B2425RCC a B2426CC, B2427CC a B2458CC, B2459CC a B2460C. Tyto fragmenty DNA, které odpovídají třem konsekutivním segmentům V_L byly purifíkovány elektroforézou v agarózovém gelu a elektroelucí.

Relativní uspořádání tří V_LDNA fragmentů, restrikční místa pro klonování a maparestrikčních míst pro multiklonování klonovacího vektoru pSV.Sport byla

Fragment	Restrikční místa	PCR primery
vLi	Pstl BstEII/Xbal	B2425RCC a B242ÓCC
Vl2	Pstl/BstEII BamHI	B2427CC a B2458CC
Vl3	BamHI Sall	B2459CC a B2460CC

Multiklonovací místi pUC19

EcoRI/Sacl/KpnlSmál/BamHI/Xbal/Sall/Pstl/Sphl/HindlII

V_L1, V_l2 a V_l3 byly nejprve klonovány samostatně do vektoru pUC19 jako fragmenty Pstl-BstEII/Xbal, Pstl/BstEll-BamHI a BamHI-Sall. Identity těchto tří fragmentů byly verifikovány sekvenováním DNA. VJ a V_L2 byl pak spojeny dohromady v pUC19 inzercí Vi2 jako BstEll-BamHI fragment do vektoru již obsahujícího VlI.

Vytvoření Vl cDNA bylo provedeno nejprve připojením Vl3 ke konstantní oblasti lehkého řetězce (C_L), a pak připojením V_l1-Vl2 a V_L3-C_L fragmentů, jak je popsáno dále

K usnadnění syntézy a rekreace humanizovaných protilátek byl vedoucí peptid připojen kN-konci obou maturovaných H- a L-řetězců polypeptidů. Sekvence aminokyselin a polypeptidů tohoto vedoucího peptidu jsou totožné s vedoucím peptidem anti-CAMPATH-1 protilátek (Reichmann a kol, viz výše). Kódující sekvence vedoucí peptidu (Reichmann a kol., viz výše) byla inkorporována do obou fragmentů V_H1 a V_L1.

Ve snaze o konstrukci DNA kódující plné délky H-řetězce protilátky byl V_H syntetické cDNA kombinován s lidskou γ4 konstantní oblastí genomové DNA (ATCC 57413) za použití restrikčního Štěpení Apal a ligace. Tato procedura byla zahájena digescí plazmidu pSV.Sport obsahujícího Vh3 enzym Notl s následným působením Klenow DNA polymerázy (Boehringer Mannheim) za vzniku tupých konců. Výsledná DNA byla srážena etanolem, resuspendována a štěpena Apal. Tato štěpená plazmidová DNA byla ligována s restrikčním fragmentem Apal/Smal genomové γ4 konstantní oblasti.

-21 CZ 290039 B6

V_h3-C_h genomová DNA byla potom vyštěpena jako fragment Xbal/HindlII a vložena do pSV.Sport již obsahujícího V_H1-V_H2 a tím bylo ukončeno vytvoření DNA těžkého řetězce a plné délce.

Ve snaze o vytvoření řetězců protilátky byly plazmidy obsahující DNA H- a L-řetězce kotransfekovány do COS buněk. Sekretovaný imunoglobulin byl nedetekovatelný, ale následovala analýza kondicionovaného média ELISA testem nebo Western blotováním. Alternativně byla určena lidská γ4 konstantní oblast cDNA a konstruována za nahrazení genomové DNA.

Šest oligonukleotidových PCR primerů bylo syntetizováno za tímto účelem standardními způsoby. Určení těchto oligonukleotidů a odpovídající identifikační č. sekvence definující jejich sekvence jsou:

Oligonukleotid	Identifikační č. sekvence
B2491CC	23
B2498CC	24
B2499CC	25
B2597CC	26
B2598CC	27
B2656CC	28

Primery B2491CC, B2499CC a B2598CC odpovídají plus vláknu γ4 konstantní oblasti cDNA.

Primery B2498CC, B2597CCa B2656CC odpovídající minus vláknu. Použití lidské γ4 genomové DNA jako templátu byly pomocí PCR generovány tři konsekutivní fragmenty dvouvláknové DNA zahrnující úplnou γ4 konstantní oblast kódující cDNA.

Tři C_H DNA segmenty, restrikční místa pro klonování a použité primeiy byly:

Segment	Restrikční místa	PCR primery
CH A.	Sall	EcoRI	B2491CCaB2498CC
CH B.	EcoRI	Xhol/Sall	B2499CC a B2500CC
CHC.	Sall/Xhol	Notl	B2598CC a B2Ó56CC

Segment A byl klonován po pUC19 jako restrikční fragment Sall-EcoRI. Segment C jako restrikční fragment Sall/Xho-Notl byl klonován do pSV.Sport. Segment B jako fragment ExoRl-Xhol/Sall byl klonován do pSV.Sport již obsahujícího segment C. Všechny tři segmenty byl verifikovány sekvenováním DNA.

γ4 cDNA byla vytvořena vyštěpením segmentu A enzymy Pstl a EcoRI a klonováním tohoto fragmentu do pSV.Sport již obsahujícího segmenty B a C. Restrikční mapa lidské 4 C_H cDNA a její relativní pozice v muktiklonovacích místech pSV.Sport je:

ABC

Pstl/Sall----------EcoRI----------Xhol----------Notl/HIndlII/SnaBI/Mlul

-22CZ 290039 B6 γ4 Ch cDNA byla vyštěpena jako fragment Sal—Hindi 11 k výměně genomové 4 fragmentu v dříve popsaném konstruktu H-řetězce o plné délce. Finální produkt byl H-řetězec o plné délce kódující cDNA klonován do vektoru pSV.Sport.

Aby byla zajištěna stabilní transfekce, byl plazmid pSV.Sport obsahující cDNA těžkého řetězce o plné délce štěpen Knpl, a pak na něj bylo působeno T4 polymerázou za vzniku tupých konců a dále byl štěpen AnaBl. Výsledný fragment DNA byl izolován elektroforézou v agarozovém gelu a následnou purifikací za použití purifikačního kitu GENECLEAN^RDNA (Bio 101, LaJolla, CA) a ligací tupých konců do plazmidu pSRS nebo pDSRG štěpeného Smál. Finální konstrukty byly označeny jako pSRSMPA5H (obr. 1) a pDSRGMPA5H (obr. 2).

Bylo již popsáno, že N-konec těžkého (H) řetězce protilátky HIL byl chemicky blokován (Chiu a kol., Biochemistry 18, 554 (1977)). Glutaminový kodon byl považován za N-koncové reziduum a byl použit pro C rekombinantních protilátek CMX1, 2, 4 a 5. V H řetězci protilátky CMX5-3 byl následně po srovnání N-koncového zbytku H řetězce LAY s odpovídajícími zbytky dalších lidských sekvencí H řetězců v podskupině 111, které je H řetězec LAY členem, N-koncový alanin H řetězce LAX nahrazen zbytkem kyseliny glutanové.

Za účelem usnadnění konstrukce L-řetězců cDNA o plné délce byl kodon zbytku kyseliny glutamové 105 nahrazen kodonem kyseliny asparagové za vzniku Sall restrikčního místa v blízkosti spojení Vl a Cl· Tato modifikace umožňuje substituci Vl variant jako kazet v CMX5-1 L-řetězci expresního plazmidu založeném na pSV.Sport.

cDNA lidského kappa lehkého řetězce byla nejdříve konstruována na základě sekvenčních informací lidské protilátky REI (Epp a kol., Eur. J. Biochem. 45, 513 (1974)). Z tohoto důvodu bylo připraveno sedm syntetických oligonukleotidových primerů určených a odpovídajících identifikačním č. sekvence, viz dále:

Oligonukleotid	Identifikační č. sekvence
B2262CC	29
B2281CC	30
B2293CC	31
B2494CC	32
B2495CC	33
B2496CC	34
B2704CC	35

Čtyři z těchto primerů byly syntetizovány tak, aby obklopovaly cDNA kappa lehkého řetězce o plné délce. Tyto oligonukleotidy (B2262CC, B2281CC, B2293CC a B2294CC) byly smíseny a prodlouženy jednou PCR. Po PCR byl produkt purifikován elektroforézou na agarozovém gelu a elektroelucí, klonován do pUC19 a analyzován sekvenováním DNA. Všechny sekvenované klony obsahovaly chybně inkorporované báze.

PCR primery A2495CC a A2496CC byly pak syntetizovány pro přípravu správné konstantní oblasti lidského χ L-řetězce. Sekvence A2495CC obklopovala poslední čtyři aminokyselinové kodony lidské protilátky LAY V_L rámce a začátek lidské χ konstantní oblasti. Primer A2496CC odpovídal C-konci lidské konstantní oblasti.

PCR byla prováděna za použití aberantního klonu L-řetězce o plné délce a primerů A2495CC a A2496CC a PCR produkt byl klonován do vektoru pSV.Sport. Sekvenční analýza však ukázala, že konstrukt opět obsahoval chybně inkorporované báze. Tato nová chyba vyla korigována další PCR za použití oligonukleotidových primerů A2495CC a B2704CC. Takto získaný produkt byl klonován jako restrikční fragment Sall/Hindlll do pUC19, který již nesl V_L3 fragment. Takto byla získána správná cDNA χ konstantní oblasti lehkého řetězce.

-23CL 290039 B6

K vytvoření cDNA L řetězce o plné délce byly vyštěpeny V_l1-Vl2 jako fragment Hindlll/BamHI s tupými konci a vložen do pUC19 štěpeného Smal/BamHI a obsahujícího Vl3-Cl fragment. Fragment lehkého řetězce o plné délce byl vyštěpen jako fragment Pstl/EcoRI zpUC19 a samostatně klonován do expresního vektoru pDSRG a pSRS za vzniku plazmidů označených jako pDSRGMPA5L (obr. 3) a pSRSMPA5L (obr. 4).

Aminokyselinové sekvence lehkého a těžkého řetězce variabilních oblastí protilátky CMX5-1 jsou definovány ve výpisu sekvencí identifikačním č. sekvence: 36 a identifikačním č. sekvence: 37. Protože aminokyselinové zbytky 1-19 těchto sekvencí zahrnují sekvenční vedoucí sekvenci, která je štěpena během postranslační modifikace, jsou aktuální sekvence variabilní oblasti definovány sekvencemi o identifikačním č. sekvence: 26 a o identifikačním č. sekvence: 37, začínající zbytkem 20.

Konstrukce humanizované protilátky CMX5-2

Za účelem konstrukce humanizované protilátky CMX5-2 byly syntetizovány komplementární oligonukleotidy označené jako B3194CC a B3195CC (sekvence definované identifikačním č. sekvence: 38 a identifikačním č. sekvence: 39) a analovány za vzniku fragmentu Bglll/Spel pro nahrazení 42 bp fragmentu Bglll/Spel CMX5-1 těžkého řetězce v pSV.Sport. Nahrazená oblast byla verifikována sekvenováním DNA.

Aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce variabilních oblastí protilátky CMX5-2 jsou definovány ve výpisu sekvencí identifikačním č. sekvence: 40 a identifikačním č. sekvence: 41. Protože aminokyselinové zbytky 1-19 těchto sekvencí zahrnují sekreční vedoucí sekvenci, která je štěpena během postranslační modifikace, jsou aktuální sekvence variabilní oblasti definovány sekvencemi o identifikačním č. sekvence: 40 a identifikačním č. sekvence: 41, začínající zbytkem 20.

Konstrukce humanizované protilátky CMX5-3

Za účelem konstrukce humanizované protilátky CMX5-3 byly syntetizovány čtyři oligonukleotidy s aminokyselinovou sekvencí založenou na protilátce JES1-3910 CDR a lidských sekvencí LAY V_H rámce. Označení a odpovídající identifikační č. sekvence těchto oligonukletidů byly:

Oligonukleotid	Identifikační č. sekvence
B2784CC	42
B2785CC	43
B2786CC	44
B2921CC	45

PCR byly provedeny za použití sady oligonukleotidů B2784CC, B2785CC, B2786CC a B2921CC a produkty byly štěpeny za vzniku fragmentů Pstl/Spel a Xbal/Sall. Tyto fragmenty DNA byly použity pro nahrazení fragmentů V_H1 a V_H3 protilátky CMX5-1 cDNA H řetězce vpSV.Sport.

Aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce variabilních oblastí protilátky CMX5-3 jsou definovány ve výpisu sekvencí identifikačním č. sekvence: 46 a identifikačním č. sekvence: 47. Protože aminokyselinové zbytky 1-19 těchto sekvencí zahrnují sekreční vedoucí sekvenci, která je štěpena během postranslační modifikace, jsou aktuální sekvence variabilní oblasti definovány sekvencemi a identifikačním č. sekvence: 46 a o identifikačním č. sekvence: 47, začínající zbytkem 20.

-24CZ 290039 B6

Konstrukce humanizované protilátky CMX5-4

Protilátka CMX5-4 V_H byla konstruována analogickým zbytkem ke způsobu použitému ke konstrukci protilátky CMX5-1. Byly syntetizovány tři sady přesahujících oligonukleotidů, jejichž označení (identifikační č. sekvence) byly:

Oligonukleotid	Identifikační číslo sekvence
B2924CC	48
B2925CC	49
B2926CC	50
B2927CC	51
B2928CC	52
B2929CC	53

Použitím sady oligonukleotidů B2924CC a B2925CC, B2926CC a B2927CC, B2928CC a B2929CC byly syntetizovány PCR extenzními reakcemi tři odpovídající fragmenty DNA. Tyto tři fragmenty byly klonovány, sekvenovány a spojeny v pSV.Sport restrikčními štěpeními a ligacemi.

CMX5-4 V_L byl konstruován nejprve anelací oligonukleotidů označených jako B3094XYa B3094XY (definované identifikačním č. sekvence: 54 a identifikačním č. sekvence: 56), a pak prodloužením 3' konců každého z oligonukleotidů pomocí PCR. Produkt byl purifikován elektroforézou na agarózovém gelu, štěpen enzymem BstEll a Sall a dosazen do fragmentu BstEii/Sall v protilátce CMX5-1 L řetězce cDNA.

Aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce variabilních oblastí protilátky CMX5-4 jsou definovány ve výpisu sekvencí identifikačním č. sekvence: 56 a identifikačním č. sekvence: 57. Protože aminokyselinové zbytky 1-19 těchto sekvencí zahrnují sekreční vedoucí sekvenci, která je štěpena během postranslační modifikace, jsou aktuální sekvence variabilní oblasti definovány sekvencemi o identifikačním č. sekvence: 56 a o identifikačním č. sekvence. 57, začínající zbytkem 20.

Konstrukce humanizované protilátky CMX5-5

CMX5-5 VH DNA byl konstruován tak, že byly syntetizovány dva fragmenty DNA za použití párů oligonukleotidů označených jako B3136CC a B3137CC a B3138CC a B3202CC, jejich sekvence jsou definovány identifikačními č. sekvence a jsou definovány v následující tabulce:

Oligonukleotid	Identifikační č. sekvence
B3136CC	58
B3137CC	59
B3138CC	60
B3203CC	61

Výsledné PCR fragmenty byly purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu, štěpeny a dosazeny do fragmentů Spel/BamHI a BamHI/Sall v cDNA Vh řetězce protilátky CMX5-1.

CMX5-5 V_L DNA byl konstruován nahrazením V_L3 (fragment BamHI/Sall) protilátky CMX5-1 vpSRS fragmentem generovaným PCR za použití primerů označených B3142CC a B3143CC (sekvence definované identifikačním č. sekvence: 62 a identifikačním č. sekvence: 63) a templátu CMX5-1 L.

Aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce variabilních oblastí protilátky CMX5-5 jsou definovány ve výpisu sekvencí identifikačním č. sekvence: 64 a identifikačním č. sekvence:

-25CZ 290039 B6

65. Protože aminokyselinové zbytky 1-19 těchto sekvencí zahrnují sekreční vedoucí sekvenci, která je štěpena během postranslační modifikace, jsou aktuální sekvence variabilní oblasti definovány sekvencemi o identifikačním č. sekvence: 64 a o identifikačním č. sekvence: 65, začínající zbytkem 20.

Exprese a purifikace protilátky

K expresi humanizovaných protilátek bylo elektroporací kotransfekováno 5 až 10 pg každého plazmidu nesoucího L řetězec založeného na pSRS a plazmidu nesoucího H řetězec založeného na pSV.Sport do 5x10⁶ COS buněk. Buňky pak byly naneseny na kultivační misky o průměru 60 mm v přítomnosti kompletního média. Poté, co se buňky přichytily na misky (asi 6 hodin po transfekci a nanesení) bylo médium odsáto a nahrazeno médiem bez séra. Kondicionované médium bylo odebráno po 72 hodinách.

Koncentrace humanizovaných protilátek v kondicionovaném médiu byly určovány pomocí lidského IgG4 specifických ELISA testů. Nunc imunomisky byly pokryty při 4 °C po dobu 24 hodin myší anti-lidskou IgG4-Fc monoklonální protilátkou (CalBiochem, LaJolla, CA) při koncentraci 5 pg/ml v 50 mM bikarbonátovém pufru o pH=9,5. Misky pak byly blokovány při teplotě místnosti po dobu 90 minut preparátem BLOTTO (5% netučné sušené malého a 0,05% objem. Tween 20 v Dulbecco modifikovaném PBS.

Po odmytí nadbytečného blokujícího reagens byly postupně ředěné vzorky v objemu 100 μΐ naneseny do jamek misek. Misky byly inkubovány při 37 °C po dobu 2 hodin, po kterých byly vzorky odsáty a jamky byly třikrát promyty. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ peroxidázy konjugované s ovčím anti-lidským IgG (H+L) (The Binding Site, San Diego, CA) a misky byly inkubovány při 37 °C po dobu 2 hodin. Misky pak byly třikrát promyty a do každé jamky byly přidány 100 μΐ ABTS substrátu peroxidázy (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) za vzniku barevného zabarvení. Zabarvení bylo spektrofotometricky změřeno při 405 nm.

Kondicionovaná média pro všech pět humanizovaných protilátek byla pozitivní na lidský igG4. Opakované experimenty ukázaly, že koncentrace IgG4 byly podobné v médiu kondicionované po tři dny pro protilátky CMX5-1, CMX5-2 a CMX5-5 (zhruba 200 pg/ml). Koncentrace IgG4 v CMX5-4 kondicionovaném médiu byla obvykle 2 až 3x vyšší. Hladiny IgG4 měřené v kondicionovaném médiu obsahujícím protilátku CMX5-3, což zahrnuje V_H rámec z protilátky LAY namísto protilátky HIL, byly setrvale 5 až lOx nižší než hladiny měřené pro protilátky CMX5-l,2a5.

K získání větších množství purifikovaných humanizovaných protilátek byly rekombinantní CHO buněčné linie přizpůsobeny k produkci protilátky CMX5-1. Plazmidy pSRSMPA5H apDSRGMPA5L nesoucí CMX5-1H- a L-řetězci byly kontransfekovány v poměru 20:1 do CHO buněk a stabilní transfektanty byly selektovány na rezistenci k hypoxantinu a nedostatek tymidinu.

Ze 106 rezistentních klonů testovaných na sekreci lidského IgG4 před působením metotrexátu (MTX) bylo 65 testovaných klonů pozitivních. Když byly stabilní klony následně podrobeny působení MTX pro vznik amplifikace genu, ukázalo se tak, že většina klonů je MTX vysoce rezistentní, a ačkoli bylo na buňky působeno MTX v koncentracích 20, 60 a 200 nM, byla i při nejvyšší koncentraci MTX pozorována pouze slabá retardace růstu buněk.

Jeden z lépe produkujících klonů nazvaný CJA25 byl podroben kontinuálnímu působení MTX při postupném zvyšování koncentrace MTX až do finální koncentrace 1 mmol., při které byla stanovena úroveň exprese protilátky 15 pg/buňka/den. Stabilita této buněčné linie byla sledována kultivací buněk za absence MTX po dobu více než dvou měsíců, během které se hladina exprese nezměnila.

-26CZ 290039 B6

V paralelním experimentu byly CHO buňky opět kotransfekovány pDSRGMPA5H apSRSMPA5L, ale v poměru 1:20. Efektivita transfekce byla shledána 1 až lOOx nižší, ačkoli podmínky byly téměř identické s podmínkami viz výše. Testování 40 klonů ukázalo, že 10 klonů bylo pozitivních na sekreci rekombinantního lidského IgG4.

Hladiny protilátky JES1-39D10 byly měřeny podobným způsobem stím rozdílem, že kozí anti-krysí IgG Fc monoklonální protilátka (Pierce, Rockford, IL) byla použita jako záchytné reagens a ovčí anti-krysí IgG (H+L) konjugát peroxidázy (The Binding Site, San Diego, CA) byl použit jako reagens pro detekci.

Protilátky z kondicionovaného média byly purifikovány standardními způsoby za použití proteinu G nebo proteinu A/G (Pierce Chemical) při afinitní chromatografii, jak popisuje výrobce chromatografických materiálů. Purifikované protilátky měly čistotu vyšší než 99%, jak bylo zjištěno aminokyselinovou analýzou.

Protilátky v kondicionovaném médiu bez séra zJESl-39D10 hybridomu a klonu CJA25 byly také purifikovány afinitní chromatografii za použití kolon s imobilizovaným lidským IL-5, které byly připraveny připojením lidského IL-5 k pryskyřici AFFIGEL-15^R (BioRad, Richmond, CA).

Po nanesení kondicionovaného média zjednoho zdroje byla kolona následně promývána PBS a PBS s 0,5 M NaCl a reekv i libro vána PBS. Lidské IL-5-vazebné protilátky byly z kolony eluovány 0,2 M glycinem o pH=2,95 a eluovaný protein byl okamžitě neutralizován 1 M Tris-HCl, pH'8.

Koncentrace takto purifikovaných protilátek byla zjišťována UV absorpcí při 280 nm za použití zjištěných molárních extinkčních koeficientů. Purifikované proteiny byly koncentrovány, dialyzovány proti PBS (pH=7,2) a podrobeny elektroforéze v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS (SDS-PAGE; Laemmli, Nátuře 227, 680, (1970)) dvakrát v 10-20% gelu za redukujících podmínek. Po elektroforéze byl jeden gen barven použitím Coomassie modři pro vizualizaci proteinových pásů. Proteiny byly za účelem aminokyselinových analýz od N-konce regenerovány z gelů blotováním na IMMOBILON^R.

Tento jednokrokový purifikační způsob regenerace proteinů poskytl protein o čistotě větší než 99%, jak bylo zjištěno SDS-PAGE. Za redukujících podmínek byly pozorovány dva pásy o zdánlivé molekulové hmotnosti 50 a 23,2 kDa, což souhlasí se známými molekulovými hmotnostmi H a L řetězců imunoglobulinů.

Charakterizace protilátky

Afinitní konstanty

Ke zjištění, zda-li si humanizovaná protilátky zachovaly schopnost specificky vázat lidský IL-5, byly měřeny zdánlivé disociační konstanty komplexů protilátka/antigen. To bylo provedeno nanesením myšího anti-lidského IgG4-Fc (5 pg/ml, 100 μΐ/miska) na misky pro ELISA testy v 50 mM bikarbonátovém pufru o pH=9,5.

Misky byly blokovány preparátem BLOTTO při teplotě místnosti, 3x omyty a inkubovány při 37 °C po dobu 2 hodin sjednou zbuď ve formě purifikovaných humanizovaných protilátek (100 μΐ/miska do finální koncentrace 0,05 g/ml) nebo ve formě kondicionovaného média (100 μΐ/miska).

Molekuly rekombinantní protilátky z kondicionovaného média byly takto interakcemi mezi konstantními oblastmi a protilátkami, které byly naneseny na misky, imobilizovány na miskách

-27CZ 290039 B6 tak, že variabilní oblasti testovaných protilátek byly orientovány uniformním způsobem, což umožňuje přímé a maximální interakce s antigenem.

Za účelem provedení experimentu pro srovnání byla paralelně testována protilátka JES1-39D10 za použití kozího anti-krysího IgG Fc namísto myšího anti-lidského IgG4-Fc jako zachycovací protilátky.

Po trojnásobném omytí misek byly do misek aplikovány po 100μ1 (konečný objem) série zředěných roztoků lidského IL-5 značeného izotopem ^l25I v koncentracích od 4000 pM do 2 mP. Všechny pokusy byly proveden třikrát. Stanovení pozadí vazebné reakce bylo provedeno použitím 1000 molámího nadbytku neznačeného lidského IL-5 v kontrolních miskách. Reakce byly ponechány ekvilibrovat při teplotě místnosti po dobu dvou hodin, po kterých byly misky odsáty a 5x omyty TBST. Misky byly separovány a byl měřen obsah izotopu v miskách na přístroji Pharmacia LKB γ-čítač. Všechny kontrolní experimenty na nespecifické vazby byly provedeny dvakrát. Hodnoty získané pro vázaný lidský IL-5 byly podrobeny Scatchardově analýze (použitím Softwaru RADLIG) za získání hodnot disociačních konstant (kd).

Výsledky této analýzy ukázaly, že získané hodnoty kd humanizovaných protilátek CMX5-1, 2, 3 a 5 byly všechny vtamže rozsahu a blížily se hodnotě získané pro protilátku JES1-39D10. Zdánlivá hodnota kd pro CMX5-4 nemohla být stanovena, protože ve vzorku byla zjištěna velmi nízká radioaktivita a nebyla pozorována odpověď na dávku.

Testy kompetitivní vazby

Ke zjištění, jestli má humanizace za následek změny vazebné oblasti antigenu protilátky JES1-39D10 byl divoký typ protilátky značen biotinem za použití testu X-NHS-biotin kit (Calbiochem. Lajolla, CA) při finální koncentraci reagentu 20 mM. Produkt byl testován v přímém vazebném ELISA testu k lidskému IL-5 a použité koncentrace, které byly zhruba trojnásobkem 50%, byly použity v testech kompetivity. Tato koncentrace odpovídala zhruba 30 ng biotinylované protilátky JES1-39D10.

Test kompetivity byl prováděn tak, že byla měřena vázající biotinylovaná protilátka nanesená na misky s lidským IL-5 v přítomnosti neznačené protilátky JES1-39D10 nebo protilátky CMX5-1, CMX5-2 nebo CMX5-5, přičemž každá z nich byla purifikovaná protein A/G afinitní chromatografií.

EIA misky byl podrobeny působení 0,lM NaHCO₃ o pH=9,2 po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Pak bylo do každé jamky přidáno 100 pg lidského IL5 v TBS. Misky byly inkubovány přes noc při 4 °C, a poté blokovány 3% BSA-TBS ml po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Do každé jamky pak bylo přidáno 50 μΐ dvakrát postupně ředěným kompetitivních protilátek s vhodným množstvím biotinylované protilátky JES1-39D10 (také v objemu 50 μΐ) a misky byly inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti.

Misky pak byly 5x opláchnuty TBS-Tween-20, inkubovány s 1 pg/ml křenové peroxidázy (HRP) konjugované se streptavidinem po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, 5x opláchnuty TBS-Tween-20 a vyvinuty sTMB, substrátem HRP, Absorbance vzorků byla měřena spektrofotometricky při 450 nm.

Výsledky ukázaly, že zatímco neznačené protilátky JES1-39D10 kompletovala se svou biotinylovanou formou v poměru asi 1:1, tentýž stupeň kompetice protilátkami CMX5-1, 2 a 5 vyžadoval větší množství protilátek. Za předpokladu, že molámí poměr neznačené k biotinylované protilátce JES1-39D10 je 1, 0, jsou molámí poměry protilátek CMX5-1, 2 a 5 k biotinylované JES1-39D10, potřebné k získání téhož stupně vazebné inhibice 3,3, 1,4 a 1,4.

-28CZ 290039 B6

Inhibice receptoru vázajícího lidský IL-5

Při zkoumání schopnosti humanizovaných protilátek CMX5-1, 2 a 5 inhibovat vazbu značeného lidského IL-5 na α-řetězce receptoru rekombinantního lidského IL-5 transfekovaných COS buněk bylo zjištěno, že všechny tři protilátky blokují vazbu na receptor. Tato blokovací aktivita byla pozorována za použití jak kondicionovaného média, tak purifikovaných protilátek. S konstantní 0,5 nM koncentrací značeného IL-5, byly koncentrace protilátek CMX5-1, 2, a 5 potřebné pro 50% inhibici vazby na receptor (IC50) stanoveny jako 1,5-3,0, 0,35-0,7 a 0,5-1,1 nM pro jednotlivé protilátky. IC₅₀ Pro divoký typ protilátky JES1-39D10 byla stanovena jako 0,15-0,55 nM:

Modifikace lehkého řetězce protilátky CMX5-5

Všech pět humanizovaných protilátek obsahovalo zbytek asparagové kyseliny na pozici 105 lehkého řetězce následkem modifikací DNA, které byly provedeny za účelem usnadnění klonování. Pro obnovu nativní sekvence byl zbytek kyseliny asparagové na pozici 105 lehkého řetězce protilátky CMX5-5 nahrazen zbytkem kyseliny glutamové. To bylo provedeno použitím syntetického oligonukleotidu označeného B3289CC (identifikační č. sekvence: 66) s aminokyselinovou sekvencí odpovídající sekvenci spoje C-koncového peptidu Vl a N-koncového peptidu C_L se změnou kodonu GAC na GAG. Tato změna kodonu vytvořila Xhol restrikční místo na místě Sall.

Bylo provedena PCR s oligonukleotidovými primery B3289CC a A2496CC (identifikační č. sekvence: 34) za použití lehkého řetězce CMX5-5 jako templátu. Výsledný fragment byl purifikován elektroforeticky, štěpen a použit pro nahrazení Sall/EcoRI fragmentu v cDNA lehkého řetězce CMX5-5 založeném na pSRS. Modifikovaná cDNA lehkého řetězce CMX5-5 byla vyštěpena z pSRS a klonována do pDSRG pro stálou expresi. Nová varianta označená jako CMX5-OK1 sestává z těžkého řetězce CMX5-2 a modifikovaného lehkého řetězce CMX5-5. Další varianta označená jako CMX5-OK2 sestává z těžkého řetězce CMX5-5 a modifikovaného lehkého řetězce CMX5-5.

Biologické účinky

Inhibice IL-5 indukované exprese CD1 lb

Subklon HL-60 (ATCC CCL 240) byl uchováván v Iscoves' Modified Dulbecco's Medium (JRH BioScience) s 10% FBS, 2 mM glutaminem, penicilinem a streptomycinem. HL-60 je multipotentní lidská promyelocytická buněčná linie, která v přítomnosti burátu nebo lidské IL-5 produkuje buňky, které vykazují fenotypické charakteristiky eosinofilů (Tomonaga a kol., Blood 67, 1433 (1986), Fabian a kol., Blod 80, 788 (1992)). Na povrchu eosinofilů, které byly aktivovány a vneseny do plic alergických pacientů (Georas a kol., Am. J. Resp. Cell MO1. Biol. 7, 261 (1992)) bylo pozorováno zvýšení exprese adhezní molekuly buňky nazývané CDllb/CD18.

Před testem byly HL-60 buňky připraveny pro diferenciaci týdenním předpěstováním v alkalickém médiu (pH=7,6 - 7,8 upraveno bikarbonátem sodným). Po napěstování byly buňky přeneseny do 24-jamkových kultivačních misek v koncentraci 2x10⁵ buněk/ml. postupně ředěné testované protilátky byly preinkubovány s konstantním množstvím lidského IL-5 při teplotě 37 °C po dobu 1 hodiny, a poté přidány k buňkám. Finální koncentrace IL-5 v kultuře byla 150 pM.

Po 72 hodinách byly buňky centrifugovány a resuspendovány na výslednou koncentraci lxlO⁶ buněk/ml a 50 μΐ objemy (5xl0⁴ buněk) byly vneseny do jamek 96-jamkových mikrotitračních misek. Buňky byly v miskách sušeny a opláchnuty 70% etanolem, a poté roztokem TBS-Tween-20 a blokovány 10% nízkotučným sušeným mlékem a 5% BSA.

-29CZ 290039 B6

Byla přidána primární protilátka (myší anti-lidský CD1 lb; Becton-Dickinson, Braintree, MA). Po dvouhodinové inkubaci při 37 °C byly misky podrobeny postupného omytí roztoky 3x TBS-Tween-20, bylo ponecháno navázat sekundární protilátku proti primární protilátce (Jackson, ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) a 3x TBS-Tween-20. Specificky vázaná protilátka byla poté detekována za použití zařízení ELISA Amplification Systém (Gibco-BRL).

Bylo zjištěno, že humanizované protilátky CMX5-1, CMX5-2 a CMX5-5 jsou schopné blokovat CD1 lb indukci aktivity lidského IL-5. Byly zjištěny následující hodnoty IC₅₀:

Vzorek	IC50(pM)	Molámí poměr CMX5-IL-5	IC50 CMX5/IC5039D10
CMX5-1	1467	7,3:1	8,8
CMX5-2	467	2,3:1	2,8
CMX5-5	800	4:1	4,8
39D10	166	0,83:1	1

Jak je vidět z tabulky, humanizované protilátky CMX5-2 a CMX5-5 jsou mnohem potentnější než protilátka CMX5-1.

Inhibice eosinofilie myší inkubované alergenem

Za účelem stanovení, zda jsou humanizované protilátky schopné neutralizovat aktivitu IL-5 invivo, byly mladí samečci B6D2F1/J myší senzitizovány (8 mg na zvíře) albuminem precipitovaným kamencem. Po jednom týdnu byla podána druhá dávka. Kromě skupiny 5 nesenzitizovaných kontrolních myší obsahovaly všechny další skupiny 6 myší.

Po 1 týdnu od druhé dávky a zároveň před imunizací byla senzitizovaná zvířata instraperitoneálně injikována 0,5 ml roztoku testované protilátky. Každé skupině bylo podáno: 0,1 mg protilátky JES1-39D10 na kg živé váhy, 1 mg protilátky JES1-39D10 na kg živé váhy. Protilátka označená jako TRFK 5, krysí anti-myší IL-5 monoklonální protilátka (Schumache a kol., viz výše) byla použita jako pozitivní kontrola. Kontrolní senzitizovaným myším byl podán šalin.

Zvířata byla poté imunizována dvakrát aerosolem ovoalbuminu po dobu 1 hodiny. Po 24 hodinách byly odebrány vzorky bronchioalveolámích laváží, periferální krve a plicní tkáně, barveny eosinofil-specifickými barvivý, a poté byla pomocí mikroskopu určována distribuce eosinofilů.

U myší, kteiým byla podána protilátka CMX5-1 v množství 10 mg na kilogram tělesné hmotnosti, byl zjištěn značně redukovaný počet eosinofilů v tekutinách bronchioalveolámích laváží, zatímco u jiných buněčných typů bylo pozorováno méně kvantitativních změn. U myší, kterým byla podána protilátka JES1-39D10, byly hladiny eosinofilů také redukovány.

Uložení hybridomu

Buněčná linie hybridomu (JESl-39D10.il) produkující monoklonální protilátku JES1-39D10 byla uložena 8. ledna 1992 v Američan Type Culture Collection Accession (ATCC ) pod č. ATCC HB 10959. Tyto vzorky byly připraveny za podmínek požadovaných podle dohody ATCC pro Depozit kultur pro patentové účely (Culture Deposit for Patent Purposes), které zajišťují, že uložené linie budou přístupné US Commissioner of Patents and Tredemarks podle 35 USC 122 a 37 CFR 1.14 a budou přístupné veřejnosti vydáním US patentu, a které požadují, že depozit bude udržován. Přístupnost uložených kmenů není myšlena jako licence k provádění vynálezu v rozporu s právy garantovanými úřady jakékoli vlády v souhlasu s jejími patentovými zákony.

-30CZ 290039 B6

Lze provést mnoho modifikací a variant tohoto vynálezu aniž by opustily jeho podstatu a rámec předkládaného vynálezu, jak je zřejmé těm, kdož jsou obeznámeni s technikou. Specifické způsoby popsané zde jsou uvedeny pouze jako příklady a vynález je omezen jen na termíny uvedenými v patentových nárocích.

Výpis sekvencí

1) Obecné informace:

i) předkladatel: Chou, Chuan-Chu

Murgolo, Nicholas Abrams, John Jehn, Chung-Her Petro, Mary Silver, John

Thindall, Stephen

Windsor, Wiliam Zavodny, Paul ii) název vynálezu:

iii) počet sekvencí: 66 iv) adresa ke korespondenci:

a) adresa: Schering-Plough Corporation

b) One Giralda Farm

c) Město: Madison

d) Stát: New Jersey

e) Země: USA

f) PSČ: 07940-1000

v) Forma zpracování na počítači:

a) Typ média: Flopydisk

b) Počítač: Apple Macintosh

c) Operační systém: Macintosh 6.0.5

d) Software: Microsoft Word 4.00B vi) Obecná data žádosti:

a) Číslo žádosti:

b) Datum registrace:

c) Hodnocení:

vii) Předchozí data žádosti:

a) Číslo žádosti: 07/832, 842

d) Datum registrace: 06. 2. 1992

-31 CZ 290039 B6 viii) Zmocněnec/jednatel:

a) Jméno: Dulak, Norman C.

b) Registrační číslo: 31,608

c) Číslo odkazu/stručného výtahu: JB0233K.

ix) Telekomunikační informace:

a) Telefon: 201 822 7375

b) Telfax: 201 822 7039

c) Telex: 219165

2) Informace o sekvenci č. 1:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 333 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: dvouvlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: identifikační číslo sekvence: 1:

GAA TCT GGA GGA GGC TTG GTA

CAG CCA TCA CAG ACC CTG TCT CTC

ACC Thr ATT Ile

48 96

Glu TGC Cys

Ser ACT Thr

Gly GTC Val

Gly Gly Leu Val 5

Gin Pro Ser Gin 10 TTA ACC AGC AAT

Thr AGT Ser

Leu Ser Leu 15

TCT Ser 20

GGG TTA TCA

GTG AAC

TGG Trp

Gly Leu

Ser

Leu

Thr 25

Ser Asn

Val

Asn 30

CGG

CAG

CCT

CCA

GGA

AAG

GGT

CTG

GAG

TGG

ATG

GGA

CTA

ATA

TGG

AGT

144

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Leu

Ile

Trp

Ser

35

40

45

AAT

GGA

GAC

ACA

GAT

TAT

AAT

TCA

GCT

ATC

AAA

TCC

CGA

CTG

AGC

ATC

192

Asn

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

Ala

Ile

Lys

Ser

Arg

Leu

Ser

Ile

50

55

60

AGT

AGG

GAC

ACC

TCG

AAG

AGC

CAG

GTT

TTC

TTA

AAG

ATG

AAC

AGT

CTG

240

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Ser

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Met

Asn

Ser

Leu

65

70

75

60

CAA

AGT

GAA

GAC

ACA

GCC

ATG

TAC

TTC

TGT

GCC

AGA

GAG

TAC

TAC

GGC

28β

Gin

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Phe

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Gly

85

90

95

TAC

TTT

GAT

TAC

TGG

GGC

CAA

GGA

GTC

ATG

GTC

ACA

GTC

TCC

TCA

333

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Val

Met

Val

Thr

Val

Ser

Ser

100

105

110

-32CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 2:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 384 párů bází

b) Typ; nukleová kyselina

c) Vláknovost: dvouvlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 2:

ATG GCT

GTG CCC Val Pro

ACT CAG Thr Gin

CTC CTG GGG TTG TTG TTG CTG TGG

ATT Ile 15 CTG Leu

ACA Thr TCT Ser

48 96

Met GAT Asp

Ala GCC Ala

Leu CAG Gin

Leu Gly Leu Leu 10

Leu Leu

Trp TCC Ser 30

5 GAC Asp

ATC Ile

ATA Ile

TGT Cys 20

ATG ACA

CAG Gin

TCT Ser

CCA Pro

GCT Ala

Met

Thr 25

GCA

TCT

CTG

GGA

GAA

ACT

ATC

TCC

ATC

GAA

TGT

CTA

GCA

AGT

GAG

GGC

144

Ala

Ser

Leu

Gly

Glu

Thr

Ile

Ser

Ile

Glu

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

35

40

45

ATT

TCC

AGT

TAT

TTA

GCG

TGG

TAT

CAG

CAG

AAG

CCA

GGG

AAA

TCT

CCT

192

Ile

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ser

Pro

50

55

60

CAG

CTC

CTG

ATC

TAT

GGT

GCA

AAT

AGC

TTG

CAA

ACT

GGG

GTC

CCA

TCA

240

Gin

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

val

Pro

Ser

65

70

75

80

CGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGA

TCT

GCC

ACA

CAA

TAT

TCT

CTC

AAG

ATC

AGC

288

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

ile

Ser

85

90

95

AGC

ATG

CAA

CCT

GAA

GAT

GAA

GGG

GAT

TAT

*···/* Λ. A

q*/—>/r A

CAA

CAG

AGT

TAC

336

Ser

Met

Gin

Pro

Glu

Asp

Glu

Gly

Asp

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

100

105

110

AAG

TTT

CCG

AAC

ACG

TTT

GGA

GCT

GGG

ACC

AAG

CTG

GAA

CTG

AAA

CGG

384

Lys

Pne

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Leu

lys

Arg

115

120

125

2) Informace o sekvenci č. 3:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 39 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 3:

-33 CZ 290039 B6

AGTCTAGAAG CKGAATCTG GAGGAGGCTT GGTACAGCC 39

2) Informace o sekvenci č. 4:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 58 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 4:

CAGCCCGGGA ATTCGTCGAC TCACTGCCAT GTTTCTTTCT TTACATTGAG

CHGCTGT58

2) Informace o sekvenci č. 5:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 36 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 5:

GCAAGCnGG ATCCAGACAG GACACAGGCC AGACAT 36

2) Informace o sekvenci č. 6:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 38 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 6:

CACGAATTCT GCAGTGGCCAC CTCAGGACCT HGGGTCT 38

-34CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 7:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 114 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 7:

AGGCAGTCGA CGCCGCCACC ATGAAGTTGT GGCTGAACTG

GATTTTCCn KAACACTTT 60 TAAATGGTAT CCAGTGTGAG GTGAAACTGT

TGGAATCTGG AGGAGGCKG GTAC114

2) Informace o sekvenci č. 8:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 131 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 8:

ACTGAAITCT ATTTACCAGG AGAGTGGGAG AGACTCTTCT

CAGTATGGTG GTTGTGCAGG 60 CCCTCATGCA GCACAGAACA

CGTGAAAGTG TTTCCCTGCT GCCATGTTTC TTTCTTTACA 120 TTGAGCKGC T 131

2) Informace o sekvenci č. 9:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 66 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 9:

AGCTGTCGAC GCCGCCACCA TGCGTTGTGC CACTCAGCTC

CTGGGGTTGT TGTTGCTGTG 60 GATTAC óó

-35CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 10:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 48 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 10:

AGCTCTAGAA nCTGCAGTC AACACTCATT CCTGTTGAAG CTAnGAC 48

2) Informace o sekvenci č. 11:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 102 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 11:

GCTGAATTCG CCGCCACCAT GGGCTGGAGC TGTATCATCC TCTTCTTAGT AGCAACAGCT 60 ACAGGTGTCC ACTCCCAGGT CAAACTGGTA CAAGCTGGAG GT102

2) Informace o sekvenci č. 12:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 102 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 12:

GCGTACTAGT TAATGATAAC CCAGAGACGA TGCAACTCAG TCGCAGAGAT CTTCCTGGCT ÓO GTACGACGCC ACCTCCAGCT TGTACCAGTTTGACCTGGGAGT 102

-36CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 13:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 86 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 13:

GTCAGACTAG TAATAGTGTG AACTGGATAC GGCAAGCACC

TGGCAAGGGT CTGGAGTGGG ÓO

TGCACTAAT ATGGAGTAAT GGAGAC 86

2) Informace o sekvenci č. 14:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 73 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 14:

GTACTCTAGT GATTGTGAAT CGAGATTTGA TAGCTGAATT TATCTGTG

TCTCCATTAC Ó0 TCCATATTAGTGC 73

2) Informace o sekvenci č. 15:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 104 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 15:

GCAGAATTCT AGAGACAATT CGAAGAGCAC CCTATACATG

CAGATGAACA GTCTGAGAACA GTCTGAGAAC Ó0 TGAAGATACT

GCAGTCTACT TCTGTGCTCG TGAGTACTAT GGAT104

-37CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 16:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 99 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 16:

CTCGTCAGCT CGGGCCTTG GTCGACGCTG AGGAGACTGT

GACTAGGACA CCTTGACCCC 60 AATAGTCGAA ATATCCATAG

TAQTCACGAG CACAGAAGT 99

2) Informace o sekvenci č. 17:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 94 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 17:

AGAGCTGCAG CCGCCACCAT GGGATGGAGC TGTATCACC TCTTCTTGGT AGCAACAGCT 60 ACAGGTGTCC ACTCCGACAT CCAGATGACA CAGT 94

2) Informace o sekvenci č. 18:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 83 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 18:

AGCATCTAGA GGTGACCCTA TCTCCGACAG ATACAGACAG

CGAACTTGGA GACTGTGTCA 60 TCTGGATGTC GG AGTGGACA CCT 83

-38CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 19:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 101 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 19:

AGATCTGCAG GTCACCATCA CATGTCTAGC AAGTGAGGGC

ATCTCCAGTT ACHAGCGTG 60 GTACCAGCAG AAGCCCGGGC

TAGCTCCTAA GCTCCTGATC T101

2) Informace o sekvenci č. 20:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 84 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 20:

STGGCGGSTC CTGAGCCACT GAATCTTGAT GGTACTCCAG

TCTGCAAGCT ATTCGCACCA 60 TAGACAGA GCTTAGGAGC TAGC 84

2) Informace o sekvenci č. 21:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 81 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 21:

CTCAGGATCC GCTACAGACT TCACGCTCAC GATCTCCAGC

CTACAGCCTG AGATATCGA 60 GACGTAHAC TGTCAACAGT C 81

-39CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 22:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 76 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 22:

GCATGCCGTC GACCTTGGTG CCTTGACCGA

GAACKATAC GACTGTTGAC 60 AGTAATACGT CGCGAT 76

2) Informace o sekvenci č. 23:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 70 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 23:

GCATCGCGTC GACCAAAGGT CCATCTGTGT

GCCATGCTCC AGGAGCACCT 60 CCGAGAGCAC 70

2) Informace o sekvenci č. 24:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 79 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 24:

GACAGAATTC AGGTGCGGA CACGACGGAC

ATACTTCGAC TCAACTCCT 60 TGTCCACCTT GGTGTTGCT 79

ATGTGTTCGG

TTCCGCTGGC

ATGGAGGACC

-40CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 25:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 68 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 25:

ACTGGAATTC CTAGGTGGAC CATCAGTCn CCTGTTTCCG

CCTAAGCCCA AGGACACTCT CATGATCTÓ8

2) Informace o sekvenci č. 26:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 51 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 26:

CAGGCTGTCG ACTCGAGGCT GACCTTTGGC TTTGGAGATG

GTTnCTCGAT51

2) Informace o sekvenci č. 27:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 38 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 27:

GTAAGCGTCG ACTCGAGAGC CACAGGTGTA CACCCTGC 38

-41 CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 28:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 40 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 28:

CGCTAGCGGC CGCTCATKA CCCAGAGACA GGGAGAGGCT 40

2) Informace o sekvenci č. 29:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 196 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 29:

AGTGCGCTGC AGCCGCCACC ATGGGATGGA GCTGTATCAT CCTCTTCHG GTAGCACAG 60 CTACAGGGT CCACTCCGAC ATCCAGATGA CACAGTCTCC AAGHCCCTG TCTGCATCTG 120 TCGGAGATCG GGTCACAATC GAATGTCTAG CAAGTGAGGG CATTTCCAGT TATTTAGCGT 180 GGTATCAGCA GAAGCC 19ó

2) Informace o sekvenci č. 30:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 213 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 30:

-42CZ 290039 B6

ACCTTGGTAC CTTGTCCAAA CGTGHCGGA AACTGTAAC TCTGTTGACA

GTAATAATCT 60 CCTTCATCTT CAGGTGCAG GCTGGAGATC TTAAACGTGA

AATCAGTGCC GGATCCACTG 120 CCACTGAACC GTGATGGGAC

CCCAGTTTGC AAGCTATTTG CACCATAGAT CAGGAGTTTA 180 GGAGCTTTCC

CTGGCTTCTG CTGATCCAC GCT 213

2) Informace o sekvenci č. 31:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 190 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 31:

GAACACGTTT GGACAAGGTA CCAAGGTCGA CATCAAACGG

ACTGTGGCTG CACCATCTGT 60 CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGH

GAAATCTGGA AGTGCCTCTG TTGTGTGCCT 120 GCTGAATAAC TTCTATCCCA

GAGAGGCCAA AGTACAGTGG AAGGTGGAA ACGCCCTCCA 180

ATCGGGTAAC190

2) Informace o sekvenci č. 32:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 207 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 32:

GTCAGAATTC TAACACTCTC CCCTGTTGAA GCTCTTTGTG

ACGGGCGAGC TCAGGCCCTG 60 ATGGGTGACT TCGCAGGCGT

AGACTTTGTG TTTCTCGTAG TCTGCTTTGC TCAGCGTCAG 120 GGTGCTGCTG

AGGCTGTAGG TGCTGTCCTT GCTGTCCTGC TCTGTGACAC TCTCCTGGGA 180

GITACCCGATTGGAGGGCGT TATCCAC 207

-43CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 33:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 32 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 33:

GCATGCGTCG ACGTCAAACG GACTGTGGCT GC 32

2) Informace o sekvenci č. 34:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 111 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 34:

GATCAAGCH GAATTCTAAC ACTCTCCTCT GHGAAGCTC TTCGTGACTG GCGAGCTCAG 60 GCCTTGAGA GTGACTTCGA AGGCGTAGAC TTTGTGTTTC TCGTAGTCTG C111

2) Informace o sekvenci č. 35:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 117 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 35:

GAGTCAGTCC AAGCTTGAAT TCTAACACTC TCCTCTGTTG AAGCTCTTCG TGACTGGCGA 60 GCTCAGGCCT TGATGAGTGA CTTCGCAGGC GTAGACTTTG TGTTTCTCGT AGTCTGC117

-44CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 36:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 116 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

c) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 36:

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

Ile Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

•15

10

5

Val

His

Ser

Gin

Val

Lys

Leu Val

Gin

Ala

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

1

5

10

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu Ser

Cys

Ile

Val

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

15

20

25

Thr

Ser

Asn

Ser

Val

Asn

Trp Ile

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Val

Ala

Leu

Ile

Trp Ser

Asn

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

50

55

60

Ala

Ile

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Ser

Thr

65

70

75

Leu

Tyr

Met

Gin

Met

Asn

Ser Leu

Arg

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

80

85

90

Phe

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Tyr Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Val

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

110 115

2) Informace o sekvenci č. 37:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 108 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

c) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 37:

-45CZ 290039 B6

Met Gly Trp Ser Cys

Ile

Ile

Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

-15

-10

-5

Val

His

Ser

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

1

5

10

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

Ile

15

20

25

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

60

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

65

70

75

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Lys

80

85

90

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Val

Lys

Arg

95

100

105

2) Informace o sekvenci č. 38:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 42 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 38:

GATCTCTGCG ACTGAGHGC ATCGCATCTG GGTTCACATT CT 42

2) Informace o sekvenci č. 39:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 42 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 39:

CTAGAGAATG TGAACCCAGATGCGATGCAA CTCAGTCGCA GA 42

-46CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 40:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 116 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

c) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 40:

Met Gly Trp Ser Cys	Ile	ile	Leu	Phe	Leu	Val	Ala	Thr	Ala	Thr	Gly
-15					-10					5
Val His Ser Gin Val	Lys	Leu	Val	Gin	Ala	Gly	Gly	Gly	Val	Val	Gin
1			5					10
Pro Gly Arg Ser Leu	Arg	Leu	Ser	Cys	Ile	Ala	Ser	Gly	Phe	Thr	Phe
15		20					25
Ser Ser Asn Ser Val	Asn	Trp	ile	Arg	Gin	Ala	Pro	Gly	Lys	Gly	Leu
30	35					40					45
Glu Trp Val Ala Leu	Ile	Trp	Ser	Asn	Gly	Asp	Thr	Asp	Tyr	Asn	Ser
50					55					60
Ala Ile Lys Ser Arg	Phe	Thr	Ile	Ser	Arg	Asp	Asn	Ser	Lys	Ser	Thr
65				70					75
Leu Tyr Met Gin Met	Aen	Ser	Leu	Arg	Thr	Glu	Asp	Thr	Ala	Val	Tyr
80			85					90
Phe Cys Ala Arg Glu	Tyr	Tyr	Gly	Tyr	Phe	Asp	Tyr	Trp	Gly	Gin	Gly
95		100					105
Val Leu Val Thr Val	Ser	Ser
110	115
2) Informace o sekvenci č. 41:
i) Charakteristika sekvence:
a) Délka: 108 aminokyselin
b) Typ: aminokyselina c) Topologie: lineární
ii) Typ molekuply: protein
xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 41

-47CZ 290039 B6

Met

Gly

Trp

Ser Cys

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

-15

10

5

Val

His

Ser

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

1

5

10

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

Ile

15

20

25

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

60

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

65

70

75

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Lys

80

85

90

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Val

Lys

Arg

95

100

105

2) Informace o sekvenci č. 42:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 95 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 42:

GCAGCTGCAG CCGCCACCAT GGGCTGGAGC TGTATCATCC TCTTCTTAGT AGCAACAGCT ÓO ACAGGTGTCC CTCCGAGGT CCAGCTGCTA GAGTC95

2) Informace o sekvenci č. 43:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 108 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 43:

-48CZ 290039 B6

AGACGAATTC ACTAGTAAT GATAACCCAG AGACTGCGCA ACTCAGTCGC AGAGATCCTC 60 CTGGCTGTAC GAGGCCACCT CCAGACTCTA GCAGCTGGAC CTCGGAGT 108

2) Informace o sekvenci č. 44:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 103 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 44:

AAGCGATCTA GAAATGACTC GAAGAACACC CTATACCTAC AGATGAACGG TCTGCAGCT 60 GAAGTAAGTG CATCTACTT CTGTGCTCGT GAGTACTATGGAT103

2) Informace o sekvenci č. 45:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 93 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 45:

ACGAGAAGCT TCATGTCGAC GCTGAGGAGA CTGTGACTAG

CGTACCTTGA CCCCAATAGT ÓO CGAAATATCC ATAGTACTCA

CGAGCACAGA AGT 93

2) Informace o sekvenci č. 46:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 116 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

c) Topologie: lineární ii) Typ molekuply: protein xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 46:

-49CZ 290039 B6

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

lle

lle

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

15

10

-5

Val

His

Ser

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

1

5

10

Pro

Gly

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

15

20

25

Thr

Ser

Asn

Ser

Val

Asn

Trp

lle

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Val

Ala

Leu

lle

Trp

Ser

Asn

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

50

55

60

Ala

lle

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

lle

Ser

Arg

Asn

Asp

Ser

Lys

Α3Π

Thr

65

70

75

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Gly

Leu

Gin

Ala

Glu

Val

Ser

Ala

lle

Tyr

80

85

90

Phe

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

110 115

2) Informace o sekvenci č. 47:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 108 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

c) Topologie: lineární ii) Typ molekuply: protein xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 47:

-50CZ 290039 B6

Met

Gly

Trp Ser Cys -15

Ile

Ile Leu Phe Leu Val Ala -10

Thr

Ala Thr -5

Gly

Val

His

Ser

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

1

5

10

Sex

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

Ile

15

20

25

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

60

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

65

70

75

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Lys

80

85

90

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Val

Lys

Arg

100 105

2) Informace o sekvenci č. 48:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 97 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 48:

GCTGACTGCA GCCGCCACCA TGGGCTGGAC CTGTATCATC CTCTTC7TAG TAGCAACAGC ÓO TACAGGTGTC CACTCCCAGG TCAAACTGGT ACAAGCT97

2) Informace o sekvenci č. 49:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 108 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 49:

-51 CZ 290039 B6

CTAGAAGCTT ACTAGTTAAT

GATAACCCAG

ATGCGATGCA

ACTCAGTCGC AGAGATCTTC ÓO CTGGCTGTAC

GACGCCACCT

CCAGCnGTACCAGTTTGAC CTGGGAGT 108

2) Informace o sekvenci č. 50:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 90 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 50:

GGACGAATC ACTAGTAATG GTATGCACTG GGTACGGCAA

GCACCTGGCA AGGGTCTGGA 60 GTGGGTTGCA GTAATATGGA

GTAATGGATC90

2) Informace o sekvenci č. 51:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 85 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 51:

ACTGCTCTAG AGATTGTGAA TCGTCCTTG ACTGAGTCAC CATAGTATGT

TCGTGATCCA 60 TTACTCCATA TTACTGCAAC CCACT 85

2) Informace o sekvenci č. 52:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 95 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 52:

-52CZ 290039 B6

CGTACTCTAG AGACAATTCG AAGCGCACCC KACATGCA GATGAACAGT CTGAGAACTG 60 AAGATACTGC TGTCTACTAC TGTGCTCGTG AGTAC95

2) Informace o sekvenci č. 53:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 100 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 53:

ACGAGAAGCT TCATGTCGAC GCTGAGGAGA

GACACCTTGA CCCCAATAGT 60 CGAAATATCC

CTGTGACTAG

ATAGTACTCA

CGAGCACAGT AGTAGACAGC 100

2) Informace o sekvenci č. 54:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 153 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 54:

GCGATAGGTC ACCATCACAT GTCAAGCAAG TGAGGGCATC TCCAGTTACT TAAACTGGTA 60 TCGCAGAAG CCCGGGCTAG CTCCTAAGCT CCTGATCTAT GGTGCGAATA CCAGGGAGGC 120 TGGAGTACCA TCAAGATTCA GTGGCTCAGG CTC153

2) Informace o sekvenci č. 55:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 150 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární

-53CZ 290039 B6 xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 55:

ACAGTCGTCG ACCTTGGTGC CTTGACCGAA TGTGTTCGGG

AACTTATACG ACTGnGACA 60 GTAATACGTC GCGATATCH CAGGCTGTAG

GCTGGAGATC GTGAGCGTGA AGTCTGTACC 120 GGAGCCTGAG

CCACTGAATC TTGATGGTAC150

2) Informace o sekvenci č. 56:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 117 párů bází

b) Typ: aminokyselina

c) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 56:

Met

Gly Trp Ser Cys -15

Ile

Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

-10

-5

Val

His

Ser

Gin

Val

Lys

Leu

Val

Gin

Ala

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

1

5

10

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ile

Ala

Ser

Gly

Leu

Ser

Leu

15

20

25

Thr

Ser

Asn

Gly

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Val

Ala

Val

Ile

Trp

Ser

Asn

Gly

Ser

Arg

Thr

Tyr

Tyr

Gly

50

55

60

Asp

Ser

Val

LyS

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Arg

65

70

75

Thr

Leu

Tyr

Met

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

80

B5

90

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

95

100

105

Gly

Val

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

110 115

-54CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 57:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 108 párů bází

b) Typ: aminokyselina

c) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 57:

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

-15

-10

-5

Val

His

Ser

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

1

5

10

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Gin

Ala

Ser

Glu

Gly

Ile

15

20

25

Ser

Ser

Tyr

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Asn

Thr

Arg

Glu

Ala

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

60

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

65

70

75

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Lys

80

85

90

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Val

Lys

Arg

95

100

105

2) Informace o sekvenci č. 58:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 98 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 58:

GCATGACAGT AGATCTCTGC GACTGAGKG CATCGCATCT

GGGTTCACAT TCTCTAGTAA 60 TAGTGTGAAC TGGGTACGGC

AAGCACCTGG CAAGGGTC 98

-55CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 59:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 113 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 59:

ACGATCACTC TAGAGAKGT GAATCGAGAT TTGATAGCTG ΑΑΠΑΤΑΑΤΟ TGTGTCTCCA 60 nACTCCATA TTAGTGCAAC CCACTCCAGA CCCTTGCCAG GTGCTTGCCG TAC 113

2) Informace o sekvenci č. 60:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 91 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 60:

GCATGGACGT CTAGAGACAA TTCGAAGAGA ACCCTATACA TGCAGATGAA CAGTCTGAGA 60 ACTGAAGATA CTGCAGTCTA CTACTGTGCT C91

2) Informace o sekvenci č. 61:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 120 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 61:

CAAGTCGACG ACAAGCKGT CGACGCTGAG GAGACTGTGA CTAGGACACC UGACCCCAA 60 TAGTCGAAAT ATCCATAGTA CTCACGAGCA CAGTAGTAGA CTGCAGTATC TTCAGTTCTC 120

-56CZ 290039 B6

2) Informace o sekvenci č. 62:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 28 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 62:

ACAGTCCGTT TGACGTCGAC CTTGGTGC 28

2) Informace o sekvenci č. 63:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 63 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 63:

AGTGGCTCAG GATCCGGTAC CGACTTCACG

CCAGCCTACA GCCTGAAGAT 60 ATC 63

2) Informace o sekvenci č. 64:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 116 párů bází

b) Typ: aminokyselina

c) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 64:

TTCACGATCT

-57CZ 290039 B6

Met

Gly

Trp Ser Cys -15

Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala -10

Thr

Ala Thr -5

Gly

val

His

Ser

Gin

Val

Lys

Leu

Val

Gin

Ala

Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

1

5

10

Pro

Gly

Arg

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ile

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

15

20

25

Ser

Ser

Asn

Ser

Val

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Val

Ala

Leu

ile

Trp

Ser

Asn

Gly

Asp

Thr

Asp

Tyr

Asn

Ser

50

55

60

Ala

Ile

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg Asp

Asn

Ser

Lys

Arg

Thr

65

70

75

Leu

Tyr

Met

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Thr

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

80

85

90

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

Tyr

Tyr

Gly

Tyr

Phe

Aep

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

95

100

105

Val

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

110 115

2) Informace o sekvenci č. 65:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 108 párů bází

b) Typ: aminokyselina

c) Topologie: lineární o

ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 65:

-58CZ 290039 B6

Met Gly Trp Ser Cys

Ile

Ile

Leu

Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr

Gly

-15

-10

-5

Val

His

Ser

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Val

1

5

10

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Leu

Ala

Ser

Glu

Gly

Ile

15

20

25

Ser

Ser

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Leu

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Gly

Ala

Asn

Ser

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

60

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

65

70

75

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Lys

80

85

90

Phe

Pro

Asn

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Asp

Val

Lys

Arg

95

100

105

2) Informace o sekvenci č. 66:

i) Charakteristika sekvence:

a) Délka: 40 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Vláknovost: jedno vlákno

d) Topologie: lineární xi) Popis sekvence: Identifikační číslo sekvence: 66:

AGCGAGCGCT CGAGGTCAAA CGGACTGTGG CTGCACCATC 40

Průmyslová využitelnost

Farmaceutické prostředky zahrnující protilátky, vazebné prostředky nebo jednořetězcové vazebné proteiny podle předkládaného vynálezu nebo antiidiotypické protilátky proti monoklonálním protilátkám lze použít k výrobě léčiv.

Claims (21)

1. Monoklonální protilátka nebo její fragment, která se specificky váže na lidský interleukin-5, kde uvedená monoklonální protilátka obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce definovanou sekvencí číslo 1 a variabilní oblast lehkého řetězce definovanou sekvencí číslo 2.

2. Hybridom, vylučující monoklonální protilátku podle nároku 1, která se specificky váže na lidský interleukin-S, kde uvedená monoklonální protilátka obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce definovanou sekvencí čísla 1 a variabilní oblast lehkého řetězce definovanou sekvencí Čísla 1 a variabilní oblast lehkého řetězce definovaného sekvencí číslo 2, uložený pod číslem ATCC HB 10959.

3. Polypeptid obsahující variabilní oblast monoklonální protilátky podle nároku 1, která má aminokyselinovou sekvenci definovanou sekvencí číslo 1 nebo sekvencí číslo 2.

4. Izolovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci definovanou sekvencí číslo 1 nebo nukleotidovou sekvencí definovanou sekvencí číslo 2.

5. Izolovaná DNA, která obsahuje nukleotidové sekvence, která kóduji aminokyselinovou sekvenci definovanou sekvencí číslo 1 nebo sekvencí číslo 2.

6. Rekombinantní vektor, který obsahuje DNA podle nároku 4 nebo 5.

7. Hostitelská buňka, která obsahuje rekombinantní vektor podle nároku 6.

8. Způsob přípravy polypeptidu podle nároku 3, vy zn ač uj íc í se t í m , že se kultivuje hostitelská buňka podle nároku 7 za podmínek exprese DNA.

9. Humanizovaná monoklonální protilátka, nebo její fragment, která se specificky váže na lidský interleukin-5 a obsahuje CDR variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce monoklonální protilátky podle nároku 1, kde CDR obsahuje aminokyselinové zbytky 21 až 27, nebo 26 až 30, 47 až 50, 66 a 93 až 101 sekvence číslo 1 a aminokyselinové zbytky 46 až 51, 68, 70 až 72, 84, 91, 109 a 110 až 116 sekvence číslo 2.

10. Humanizovaná monoklonální protilátka podle nároku 1 obsahující variabilní oblast lehkého nebo těžkého řetězce, mající zralé aminokyselinové sekvence uvedené v sekvencích číslo 36, 37, 40,41,46,47, 56, 57, 64 nebo 65.

11. Humanizovaná monoklonální protilátka podle nároku 1 obsahující variabilní oblast těžkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 36 a variabilní oblast lehkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 37.

12. Humanizovaná monoklonální protilátka podle nároku 1 obsahující variabilní oblast těžkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 40 a variabilní oblast lehkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 41.

13. Humanizovaná monoklonální protilátka podle nároku 1 obsahující variabilní oblast těžkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 46 a variabilní oblast lehkého řetězce mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 47.

-60CZ 290039 B6

14. Humanizovaná monoklonální protilátka podle nároku 1 obsahující variabilní oblast těžkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 56 a variabilní oblast lehkého řetězce mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 57.

15. Humanizovaná monoklonální protilátka podle nároku 1 obsahující variabilní oblast těžkého řetězce, mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 64 a variabilní oblast lehkého řetězce mající zralou aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci číslo 65.

16. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje humanizovanou monoklonální protilátku podle nároku 1.

17. Polypeptid obsahující variabilní oblast humanizované monoklonální protilátky, která má zralé aminokyselinové sekvence uvedené v sekvencích číslo 36, 37, 40, 41, 46, 47, 56, 57, 64 nebo 65.

18. Izolovaná DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující zralé aminokyselinové sekvence uvedené v sekvencích číslo 36, 37,40, 41, 46, 47, 56, 57, 64 nebo 65.

19. Rekombinantní vektor, obsahující DNA podle nároku 18.

20. Hostitelská buňka obsahující rekombinantní vektor podle nároku 19.

21. Způsob přípravy polypeptidu podle nároku 3, vy z n a č uj í c í se t í m , že se kultivuje hostitelská buňka podle nároku 20 za podmínek exprese DNA.