DE69633973T2 - Antikörper gegen die alpha-kette von humanem interleukin 5 rezeptor - Google Patents

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Description

  • Fachgebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft monoclonale Antikörper und humanisierte Antikörper die, spezifisch an eine α-Kette von menschlichem Interleukin-5 Rezeptor binden und die daher für die Diagnose oder die Behandlung von Krankheiten wie zum Beispiel chronischem Bronchialastma nützlich sind. Die Erfindung betrifft auch Hybridome und Transformanten, welche die Antikörper erzeugen, ein Verfahren zum immunologischem Nachweis einer Interleukin-5 Rezeptor α-Kette mittels monoclonaler Antikörper und humanisierter Antikörper sowie ein Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten wie zum Beispiel chronischem Bronchialasthma mit Hilfe monoclonaler Antikörper und humanisierter Antikörper.
  • Stand der Technik
  • Interleukin-5 (nachstehend als „IL-5" bezeichnet) ist eine Art Lymphokin, das von T-Zellen, Mastzellen und anderen Zellen abgesondert wird. Mäuse-IL-5 fungiert bekanntlich als Differenzierungs- und Wachstumsfaktor für B-Zellen und Eosinophile. Menschliches IL-5 fungiert bekanntlich hauptsächlich als ein Differenzierungs- und Wachstumsfaktor für Eosinophile (Advances in Immunology, 57, 145 (1994); Blood, 79, 3101 (1992)). IL-5 zeigt seine Aktivität durch einen spezifischen Rezeptor (II-5 Rezeptor), der auf der Oberfläche einer Zelle wie zum Beispiel einer Eosinophile exprimiert wird. Es wurde gezeigt, dass menschliche und Mäuse-IL-5 Rezeptoren (nachstehend als „IL-5Rs") bezeichnet, beide aus zwei verschiedenen Arten von Proteinen zusammengesetzt sind, einer α-Kette (nachstehend als „IL-5R α" bezeichnet) und einer β-Kette (nachstehend als „IL-5R β" bezeichnet). Außerdem ist bekannt, dass die Bindung von IL-5 an IL-5R durch IL-5R α erfolgt und dass IL-5R β alleine nicht an IL-5 binden kann (EMBO J., 9, 4367 (1990) ibid.. Ο. 10, 2833 (1991); J. Exp. Med., 177, 1523 (1993); ibid., 175, 341 (1992); Cell, 66, 1175 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 7041 (1992)). Darüber hinaus ist IL-5R β als eine Komponente der Rezeptoren für Interleukin-3 (nachstehend als „IL-3" bezeichnet), Granulocyten-Makrophagen-koloniestimulierenden-Faktor und andere (nachstehend als „GM-CSF" bezeichnet) (Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 9655 (1990); Cell, 66,1165 (1991)) bekannt.
  • Es ist bekannt, dass Eosinophile in allergischen Erkrankungen, dargestellt durch chronisches Bronchialasthma, ansteigen. Eine signifikante Infiltration von Eosinophilen wird in Atemwegen eines Patienten mit chronischem Bronchialasthma beobachtet. Eosinophile enthalten cytotoxische granuläre Proteine, deren Ablagerung in den Atemwegsgeweben eines Patienten mit chronischem Bronchialasthma oder an Läsionsstellen eines Patienten mit atopischer Dermatitis beobachtet wird. Diese Fakten legen nahe, dass Eosinophile eine wichtige Rolle in der Pathogenese von allergischen Fehlsteuerungen wie zum Beispiel Bronchialasthma, atopischer Dermatitis und ähnlichem (Adv. Immunol., 39, 177 (1986); Immunol. Today, 13, 501 (1992)) spielen. Daher ist das Studium der Kinetik von Eosinophilen für die klinische Diagnose nützlich. Andererseits wirkt menschliches IL-5 spezifisch auf Eosinophile; es wird daher angenommen, dass IL-5R spezifisch auf Eosinophilen exprimiert wird und daher als ein spezifischer Marker für menschliche Eosinophile verwendet werden kann. Darüber hinaus ist IL-5 β ein Rezeptor für Cytokine wie zum Beispiel IL-3, GM-CSF und andere; es wird daher angenommen, dass IL-5R α ein für Eosinophile spezifischer Marker ist. Eosinophile können daher spezifisch durch Immunocyten-Färbung unter Verwendung eines Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette (nachstehend als „anti-hIL-5R α-Antikörper" bezeichnet) nachgewiesen werden. Zur Zeit ist jedoch kein anti-hIL-5R α-Antikörper bekannt, der zum spezifischen Nachweis von Eosinophilen in der Lage ist.
  • Signifikante Eosinophilie wurde in IL-5 transgenen Mäusen (J. Exp. Med., 172, 1425 (1990); ibid. 173, 429 (1991; Int. Immunol., 2, 965 (1990)) beobachtet. Die Infiltration von Eosinophilen in Gewebe wurde in Tiermodellen von Asthma durch die Verabreichung von einem anti-IL-5- Antikörper unterdrückt (Am. Rev. Resir., 147, 548 (1993); ibid., 148, 1623 (1993)). Diese Phänomene deuten darauf hin, dass IL-5 tatsächlich eine wichtige Rolle in Eosinophilie und der Infiltration von Eosinophilen in vivo spielt. Es wurde auch berichtet, dass IL-5 in den Schleimhäuten der Luftwege eines menschlichen Patienten mit chronischem Bronchialasthma und an Läsionsstellen eines Patienten mit atopischer Dermatitis exprimiert wird (J. Clin. Invest., 87, 1541 (1991); J. Exp. Med., 173, 775 (1991)). Weitere Untersuchungen zeigen, dass IL-5 in-vitro eine die Lebensfähigkeit steigernde Wirkung auf menschliche Eosinophile hat (J. Immunol., 143, 2311 (1989) und dass IL-5 ein gezielter Aktivator für Eosinophile ist (J. Exp. Med., 167, 219 (1988)).
  • Von Antikörpern, die an IL-5R binden und die biologische Aktivität von IL-5 hemmen können, wird daher erwartet, dass sie die Aktivität von Eosinophilen hemmen und demnach wertvoll für die Behandlung von allergischen Erkrankungen wie zum Beispiel chronischem Bronchialasthma sind. Unter Verwendung jener IL-5 abhängigen Zellen, die eine große Anzahl an Mäuse-IL-5R auf ihrer Oberfläche exprimieren, wurden anti-Maus-IL-5R α-Antikörper, welche die biologische Aktivität von IL-5 hemmen können, erzeugt (Kokai (Japanische veröffentlichte ungeprüfte Patentanmeldung) No. 108497/91; Int. Immunol., 2, 181 (1990)). Im Falle von Menschen sind jedoch keine Zellen bekannt, die eine große Anzahl an IL-5R exprimieren und die Expression von IL-5R ist in Eosinophilen, Berichten zufolge, sehr niedrig (Cell. Immunol., 133, 484 (1991)). Anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper, die vergleichbare Funktionen zu anti-Maus-IL-5R α-Antikörpern haben, sind mit Verfahren ähnlich derer zur Herstellung Letzterer schwierig zu erzeugen. Ein Antikörper, bezeichnet als „α 16", wird im EMBO J., 14, 3395 (1995) als ein Antikörper gegen menschlichen IL-5R α offenbart, aber dieser Antikörper hat keine neutralisierende Aktivität für IL-5R α.
  • Menschliches IL-5R α-Gen wurde durch die Herstellung einer cDNA-Bank von menschlichen Eosinophilen (J. Exp. Med., 175, 341 (1992)) oder einer menschlichen promyelocytischen HL-60 Zelle (Cell, 66, 1175 (1991); Kokai No. 78772/94) und Druchmusterung der Genbank unter Verwendung einer Oligo-DNA als Sonde erhalten, die anhand der cDNA von Mäuse-IL-5R α oder einer teilweisen Aminosäurensequenz von Mäuse-IL-5R α (Kokai No. 54690/94, EMBO J., 9, 4367 (1990)) synthetisiert wurde. Der Transfer der cDNA in die Wirtszelle resultierte in der Erzeugung einer Zelle, die hIL-5R α auf ihrer Oberfläche exprimierte, aber der Expressionsgrad von hIL-5R in dieser Zelle war sehr niedrig (≤ 104 Moleküle) (J. Exp. Med., 177, 1523 (1993)). Wenn jemand daher versucht unter Verwendung dieser Zelle als Immunogen anti-hIL-5R α-Antikörper herzustellen, wird er feststellen, dass die relative Menge an hIL-5R α, im Vergleich mit jenen von Proteinen der Wirtszelle, sehr klein ist und dass die absolute Proteinmenge von hIL-5R α auch sehr klein ist. Darüber hinaus wird eine etwa 80% Homologie zwischen Mäuse-IL-5R α und menschlichem IL-5R α auf einer Aminösäurenebene beobachtet und Mäuse-IL-5 kann mit hoher Affinität an menschliches IL-5R binden (J. Exp. Med., 175, 341 (1992)). Diese Tatsachen deuten darauf hin, dass menschlicher IL-5R α eine niedrigere Immunogenität für Mäuse und Ratten hat, die langläufig als Tiere für die Immunisierung verwendet werden. Tatsächlich sind fast alle unsere Versuche fehlgeschlagen unter Verwendung von hIL-5R α exprimierenden Zellen als Immunogen anti-hIL-5 5R α-Antikörper herzustellen.
  • In der Clonierung von IL-5R-cDNA von einer cDNA-Bank von menschlichen Eosinophilen wurde cDNA erhalten, die löslichen menschlichen IL-5R α (nachstehend als „shIL-5R α" bezeichnet) codiert und der N-terminalen Aminosäuresequenz (1-313) von IL-5R α entspricht, deren Transmembranregion und weitere Bereiche unvollständig sind (J. Exp. Med., 175, 341 (1992)). Wenn shIL-5R α als ein Immunogen verwendet wird, um einen anti-hIL-5R α-Antikörper zu erzeugen, sollte shIL-5R α die gleiche drei-dimensionale Konformation haben wie die von auf der Zelloberfläche exprimierten IL-5R α und es sollte einer sein, welcher von einer eukaryontischen Zelle abgesondert und hergestellt wird, um einen anti-hIL-5R α-Antikörper zu erhalten, der die biologische Aktivität von IL-5 hemmen kann. Außerdem wurde beobachtet, dass die Effizienz der Herstellung eines Proteins, abhängig vom Signalpeptid, erheblich variiert (Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 35, 2584 (1990)); es ist daher nötig ein geeignetes Signalpeptid für die Absonderung und Herstellung des Proteins auszuwählen.
  • Wie vorstehend erwähnt, wurde beobachtet, dass mRNA, von welcher angenommen wird, dass sie nur shIL-5R α codiert, in Eosinophilen exprimiert wird. Es wurde bestätigt, dass Mäuse-IL-5R nicht nur in Eosinophilen exprimiert wird, sondern auch in B-Zellen, und dass mRNA, von der angenommen wird, dass sie nur eine extrazelluläre Region von IL-5R α (nachstehend als „smIL-5R α" bezeichnet) codiert, in diesen Zellen sowie auch im Falle von Menschen exprimiert wird. Außerdem wurde berichtet, dass smIL-5R α im Blut von Mäusen nachgewiesen wurde bei denen eine IL-5R exprimierenden chronischen-B-Zellen-Leukämie-Zelllinie (BCL1) aus der Maus transplantiert wurde, oder von Modellmäusen von menschlichen Autoimmunerkrankungen (J. Immunol. Method, 167, 289 (1994)). Diese weisen auf die Möglichkeit hin, dass die Zunahme der Anzahl an IL-5R exprimierenden Zellen und deren Aktivierung durch die Menge an smIL-5-α widergespiegelt wird, die in das Blut abgesondert wird. Es wird angenommen, dass menschliches IL-5R in Eosinophilen in begrenzter Menge exprimiert wird und dass die Zunahme in der Zahl an Eosinophilen und deren Aktivierung möglicherweise in der Menge an shIL-5R α im Blut widergespiegelt sein könnte. Es wird daher erwartet, dass die quantitative Bestimmung von shIL-5R α in der klinischen Diagnose nützlich ist.
  • Jeder isolierte monoclonale Antikörper, der spezifisch an menschlichen IL-5R α bindet, ist vermutlich für die Diagnose und Behandlung von allergischen Erkrankungen wertvoll. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass, wenn ein nicht-menschlicher, von Tieren abgeleiteter monoclonaler Antikörper an Menschen verabreicht wird, er im Allgemeinen als Fremdkörper erkannt wird, sodass im menschlichen Körper ein Antikörper gegen den nicht-menschlichen, von Tieren abstammenden monoclonalen Antikörper hergestellt wird und eine Reaktion mit dem verabreichten nicht-menschlichen, von Tieren abstammenden monoclonalen Antikörper auftritt, um einen Nebeneffekt auszulösen (J. Clin. Oncol., 2, 881 (1984); Blood, 65, 1349 (1985); J. Natl. Cancer Inst., 80, 932 (1988); Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 1242 (1985)), vorzeitige Beseitigung des nicht-menschlichen, von Tieren abgeleiteten monoclonalen Antikörpers auftritt (J. Nucl. Med., 26, 1011 (1985); Blood, 65, 1349 (1985); J. Natl. Cancer Inst., 80, 937 (1988)) oder der therapeutische Effekt des monoclonalen Antikörpers vermindert ist (J. Immunol., 135, 1530 (1985); Cancer Res., 46, 6489 (1986)).
  • Um diese Probleme zu lösen, wurden Versuche unternommen, nicht-menschliche, von Tieren abgeleitete monoclonale Antikörper durch ein rekombinantes Gen-Verfahren in menschliche chimäre Antikörper oder menschliche CDR-grafted Antikörper umzuwandeln (rekonstituierte menschliche Antikörper). Ein menschlicher chimärer Antikörper ist ein Antikörper, dessen variable Region (nachstehend als „V-Region" bezeichnet) von einem nicht-menschlichen, tierischen Antikörper stammt und dessen konstante Region (nachstehend als „C-Region" bezeichnet) von einem menschlichen Antikörper stammt (Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851 (1984)). Es wurde berichtet, dass, wenn ein menschlicher chimärer Antikörper an Menschen verabreicht wird, kaum Antikörper gegen den nicht-menschlichen, von Tieren abgeleiteten monoclonalen Antikörper erzeugt werden und dass die Halbwertszeit im Blut um einen Faktor 6 erhöht ist (Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 4220 (1989)). Ein menschlicher CDR-grafted Antikörper ist ein menschlicher Antikörper, dessen CDR (Komplementarität bestimmende Region) mit einer CDR eines nicht-menschlichen, von Tieren stammenden Antikörpers ersetzt ist (Nature, 321, 522 (1986)). Es wurde mittels Experimenten an Affen berichtet, dass ein menschlicher CDR-grafted Antikörper, verglichen mit einem Mäuse-Antikörper eine niedrigere Immunogenität hat, wobei die Halbwertszeit im Blut um einen Faktor 4–5 erhöht ist (J. Immunol., 147, 1352 (1991)). Es gibt jedoch keinen Bericht, über humanisierte Antikörper gegen hIL-5R α.
  • Wenn ein humanisierter Antikörper, der speziell an menschlichen IL-5R α bindet, an einen Menschen verabreicht wird, wird erwartet, dass er keine Herstellung von einem Antikörper gegen einen nicht-menschlichen, von Tieren abstammenden monoclonalen Antikörper verursacht und dadurch die Nebenwirkung vermindert und die Halbwertszeit im Blut verlängert wird, was letztlich zu einer hohen therapeutischen Wirkung gegen allergische Erkrankungen wie zum Beispiel chronisches Bronchialasthma, atopische Dermatitis und ähnliches führt.
  • Als ein Ergebnis der neuesten Fortschritte in Protein- und Genmanipulation werden kleinere Antikörpermoleküle wie zum Beispiel einkettige Antikörper (Science, 242, 423 (1988)) und Disulfid-stabilisierte Antikörper (Molecular Immunology, 32, 249 (1995)) hergestellt. Da einkettige Antikörper und Disulfid-stabilisierte Antikörper kleinere Molekulargewichte als monoclonale und humanisierte Antikörper haben, sind sie beim Durchtritt in Gewebe und der Klärung aus dem Blut wirksam und sie werden zur Zeit in der Abbildungstechnologie und der Erzeugung von Toxinkomplexen verwendet, um ihre therapeutische Effizienz in Aussicht zu stellen (Cancer Research, 55, 318 (1995)). Wenn ein einkettiger Antikörper oder ein Disulfid-stabilisierter Antikörper hergestellt wird, der spezifisch an eine menschliche IL-5R α-Kette bindet, wird eine hohe diagnostische und therapeutische Wirkung gegen allergische Erkrankungen und ähnliches erwartet. Es gibt jedoch keinen Bericht über einen einkettigen Antikörper und einen Disulfid-stabilisierten Antikörper gegen eine menschliche IL-5R α-Kette.
  • FASEB J. Ba. 9 Nr. 6, S. A 1502 (D1) lehrt über die Expression von IL-5 Rezeptor auf menschlichen Eosinophilen und der Verwendung von monoclonalen Antikörpern zur Erkennung des exprimierten IL-5 Rezeptors. (D1) beschreibt, dass monoclonale Antikörper 7G8, 17A11 und 5G12 die verschiedenen Epitope des Rezeptors erkennen. Die Bewertung der Reaktivität des Antikörpers kann unter Verwendung einer löslichen extrazellulären Domäne der menschlichen IL-5R α-Kette durchgeführt werden. Jedoch wird von (D1) weder beschrieben noch angedeutet, dass die drei Antikörper eine biologische Aktivität haben, welche als ein unerlässliches technisches Merkmal des monoclonalen Antikörpers beschrieben wird, der in der vorliegenden Anmeldung beansprucht wird. Darüber hinaus beschreibt oder deutet (D1) kein Verfahren zum Erhalt des beanspruchten Antikörpers an.
  • Das Dokument Yamaguchi et. al., Int. Immunol. Ba. 2, Nr. 2, 1990, 181–187 (D2) beschreibt die Herstellung eines monoclonalen Antikörpers, der gegen den Mäuse-Interleukin-5 Rezeptor (mIL-5 receptor) gerichtet ist. Die hergestellten Antikörper sind durch die Hemmung der biologischen Aktivität von IL-5 gekennzeichnet. Gemäß dem in (D2) beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Antikörpern mit einer spezifischen Aktivität für mIL-5R wurden Ratten mit Membranpräparaten von T88-M-Zellen immunisiert. Die Mäusezelllinie T88-M ist dafür bekannt IL-5R in äußerst hohem Ausmaß auf der Zelloberfläche zu exprimieren. Es war auf dem Fachgebiet bekannt, dass die Effizienz der Immunisierung eines Tieres mit einem Antigen direkt von der Menge und der Qualität des für die Immunisierung verwendeten Antigens abhängig ist. Das gemäß dem Verfahren von (D2) verwendete Antigen, welches dem Tier verabreicht wird und welches aufgrund seiner Komplexität die Entwicklung spezifischer Antikörper fördert, muss als Antigen von hoher Qualität bewertet werden. Hybridome, die IL-5R spezifische monoklonale Antikörper herstellen, wurden durch Fusion von Mäuse-Myelomzellen mit Milzzellen der immunisierten Ratten hergestellt. Demnach wurde die Bereitstellung von monoclonalen Antikörpern mit Spezifität für den Mäuse-Interleukin-5 Rezeptor, welche in (D2) beschrieben sind, nur durch das Vorhandensein der T88-M-Zellen und der Expression von IL-5R auf der Zelloberfläche in äußerst hoher Dichte ermöglicht.
  • Die Dokumente EP-A 0 492 914 (D3) und EP-B1 475 746 (D4) beschreiben menschliche und Mäuse-IL-5Rs und eine rekombinante α-Kette des menschlichen Interlekin-5 Rezeptors oder Teile davon. Darüber hinaus beschreibt (D3) und (D4) die codierenden DNA-Sequenzen des Rezeptors oder der α-Kette und Wirtszellen, welche mit Vektoren transformiert sind, die diese Sequenzen umfassen. Die Änderung eines Vektors, wie sie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist und welche die benötigte hohe Expressionsdichte der IL-5R α-Kette auf transfizierten Zellen ermöglicht, wird in (D3) und (D4) weder beschreiben noch angedeutet.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die Erfinder beobachteten, dass Antikörper gegen eine hIL-5R α-Kette, die ein Epitop an Position 1-313 der N-terminalen Aminosäuresequenz der menschlichen IL-5R α-Kette erkennen, das mit einer extrazellulären Region, wobei die Transmembranregion und weitere Bereiche unvollständig sind, entspricht, nach Immunocyten-Färbung spezifisch mit einer menschlichen Interleukin-5-Rezeptor α-Kette reagieren und die biologische Aktivität von Interleukin-5 hemmen. Diese Antikörper können zur Diagnose und Behandlung der oben genannten allergischen Erkrankungen verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher Antikörper bereit, die spezifisch mit einer menschlichen IL-5R α-Kette reagieren. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung beinhalten monoclonale Antikörper, humanisierte Antikörper, einkettige Antikörper, Disulfid-stabilisierte Antikörper und ähnliche. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können von jeglicher Art sein, vorausgesetzt, dass sie spezifisch mit einer IL-5R α-Kette reagieren. Jene, die durch das nachstehend beschriebene Verfahren hergestellt werden, werden bevorzugt. Kurz gesagt wird hIL-5R α-Protein als ein Antigen erzeugt und angewandt, um Tiere wie zum Beispiel Mäuse, Ratten, Hamster, Kaninchen und ähnliche, die zur Herstellung von Hybridomen verwendet werden, zu immunisieren und um auf diese Weise Plasmazellen zu induzieren, die Antigenspezifität haben. Die Plasmazellen werden mit Myelomzellen fusioniert, um Hybridome herzustellen, die monoclonale Antikörper erzeugen können, und die Hybridome werden gezüchtet, um die gewünschten monoclonalen anti-IL-5R α-Antikörper zu erhalten. Ein beliebiger monoclonaler Antikörper kann verwendet werden, so lange er ein Epitop von Position 1-313 der N-terminalen Aminosäuren der menschlichen IL-5R α-Kette erkennt und bei der Immunocyten-Färbung spezifisch mit der menschlichen IL-5R α-Kette reagiert. Alternativ kann jeder monoclonale Antikörper verwendet werden, solange er ein Epitop von Position 1-313 der N-terminalen Aminosäuren der menschlichen IL-5R α-Kette erkennt und die biologische Aktivität von menschlichem IL-5 hemmt. Die erstgenannten monoclonalen Antikörper sind durch den monoclonalen Antikörper KM1257, der vom Hybridom KM1257 hergestellt wurde (FERM BP-5133), beispielhaft erläutert. Die letztgenannten monoclonalen Antikörper sind durch KM1259, hergestellt von Hybridom KM1259 (FERM BP-5134) und KM1486, hergestellt von Hybridom KM1486 (FERM BP-5651), beispielhaft erläutert.
  • Die monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung reagieren immunologisch mit einer menschlichen IL-5R α-Kette, einer Zelle, die eine menschliche IL-5R α-Kette auf der Oberfläche exprimiert, menschlichen Eosinophilen und ähnlichem. Die monoclonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung reagieren immunologisch mit einer löslichen menschlichen IL-5R α-Kette. Infolgedessen stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum immunologischen Nachweis und zur Bestimmung einer menschlichen IL-5R α-Kette, einer Zelle, die eine menschliche IL-5R α-Kette auf der Oberfläche exprimiert, humanen Eosinophilen und einer löslichen menschlichen IL-5R α-Kette bereit. Die Ergebnisse von Nachweis und Bestimmung können in Diagnose und Behandlung von allergischen Erkrankungen wie zum Beispiel chronischem Bronchialasthma, atopischer Dermatitis und ähnlichem verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch humanisierte Antikörper bereit, die weniger Nebenwirkungen wie mit einer verlängerten Halbwertszeit monoclonale Antikörper haben und die, als Arzneimittel, die biologische Aktivität von IL-5 auf eine wünschenswertere Art hemmen. Der in der vorliegenden Erfindung benützte Ausdruck „humanisierter Antikörper" ist ein allgemeingültiger Ausdruck für menschliche chimäre Antikörper und menschliche CDR-grafted Antikörper.
  • Der Ausdruck „menschlicher chimärer Antikörper" bedeutet einen Antikörper, der aus einer variablen Region in einer schweren Kette (nachstehend als „VH" bezeichnet) und aus einer variablen Region in einer leichten Kette (nachstehend als „VL" bezeichnet) von einem nicht-menschlichen, tierischem Antikörper sowie aus einer konstanten Region in einer schweren Kette (nachstehend als „CH" bezeichnet) und einer konstanten Region in einer leichten Kette (nachstehend als „CL" bezeichnet) von einem menschlichen Antikörper besteht. Der Ausdruck menschlicher CDR-grafted Antikörper bedeutet einen Antikörper, in dem CDR-Sequenzen von VH und VL eines menschlichen Antikörpers mit CDR-Sequenzen von VH bzw. VL eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers ersetzt sind. Ein menschlicher chimärer anti-hIL-5R α-Ketten Antikörper, der die biologische Aktivität von IL-5 hemmt, kann durch ein Verfahren exprimiert und hergestellt werden, welches die Schritte umfasst: Erhalt der cDNAs, die VH und VL codieren, von einem Hybridom, das einen Antikörper erzeugt, der die biologische Aktivität von IL-5 hemmen kann, Einbringen der jeweiligen cDNAs in einen Vektor zur Expression in tierischen Zellen, der ein Gen enthält, das menschlichen CH-Antikörper und menschlichen CL-Antikörper codiert, um dadurch einen menschlichen chimären Antikörper-Expressionsvektor zu konstruieren, und Transfektion des Expressionsvektors in eine tierische Zelle. Der menschliche chimäre Antikörper und menschliche CDR-grafted Antikörper der vorliegenden Erfindung können in jeder Immunoglobulin-(Ig)-Klasse vorliegen und sind vorzugsweise in einer Klasse von IgG. Außerdem kann jede C-Region der IgG-Subklassen der Immunoglobuline wie IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 verwendet werden.
  • Beispiele des menschlichen chimären Antikörpers der vorliegenden Erfindung schließen einen Antikörper ein, dessen VH die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 27 enthält, CH ein menschlicher IgG1-Antikörper ist, VL die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 29 enthält und CL menschlicher K-Antikörper ist. Ein bestimmtes Beispiel ist ein Antikörper, der als „KM1399" bezeichnet wird. Ein bestimmtes Beispiel des menschlichen chimären Antikörpers, dessen CH von menschlichem IgG4-Antikörper ist, ist ein Antikörper, der als „KM7399" bezeichnet wird. KM1399 kann zum Beispiel durch die Transformante KM1399 (FERM BP-5650) hergestellt werden. KM7399 kann zum Beispiel durch die Transformante KM7399 (FERM BP-5649) hergestellt werden.
  • Der menschliche CDR-grafted anti-hIL-5R α-Ketten-Antikörper, der die biologische Aktivität von IL-5 hemmt, kann durch ein Verfahren exprimiert und hergestellt werden, welches die Schritte umfasst: Konstruktion einer cDNA, die eine V-Region codiert, in welcher CDR-Sequenzen von VH und VL eines beliebigen menschlichen Antikörpers durch die CDR-Sequenzen von VH bzw. VL eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers ersetzt sind, der die biologische Aktivität von IL-5 hemmen kann, Einfügen der jeweiligen cDNAs in einen Vektor zur Expression in tierischen Zellen, der ein Gen enthält, das einen menschlichen CH-Antikörper und menschlichen CL-Antikörper codiert, um dadurch einen menschlichen CDR-grafted Antikörper-Expressionsvektor zu konstruieren, und die Transfektion des Expressionsvektors in eine tierische Zelle. Beispiele des menschlichen CDR-grafted Antikörpers der vorliegenden Erfindung schließen einen Antikörper ein, dessen VH die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 83 enthält, CH von menschlichem IgG1-Antikörper ist, VL die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 71 enthält und CL ein menschlicher K-Antikörper ist. Ein bestimmtes Beispiel ist ein Antikörper, der als „KM8399" bezeichnet wird. Ein bestimmtes Beispiel vom menschlichen CDR-grafted Antikörper, dessen CH von menschlichem IgG4-Antikörper ist, ist ein Antikörper, der als „KM9399" bezeichnet wird. KM8399 kann zum Beispiel durch Transformant KM8399 (FERM BP-5648) hergestellt werden. KM9399 kann zum Beispiel durch die Transformante KM9399 (FERM BP-5647) hergestellt werden.
  • Der humanisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung reagiert immunologisch mit einer menschlichen IL-5R α-Kette einer Zelle, die eine menschliche IL-5R α-Kette auf der Zelloberfläche exprimiert, einer menschlichen Eosinophilen und ähnlichem. Der humanisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung kann daher in der Diagnose und Behandlung von allergischen Erkrankungen wie zum Beispiel chronischem Bronchialasthma, atopischer Dermatitis und ähnlichem verwendet werden.
  • Außerdem stellt die vorliegende Erfindung einkettige Antikörper (einkettige Fv; nachstehend als „scFv" bezeichnet) und Disulfid-stabilisierte Antikörper (Disulfid stabilisierte Fv; nachstehend als „dsFv" bezeichnet) bereit, die die Fähigkeit aufweisen, an eine menschliche IL-5R α-Kette zu binden.
  • Der Ausdruck „einkettiger Antikörper (scFv)" bedeutet eine Polypeptidkette, dargestellt durch das Schema VH-L-VL- oder VL-L-VH, in welcher eine einzelne Kette von VH und eine einzelne Kette von VL durch einen passenden Peptidlinker (nachstehend als „L" bezeichnet) verbunden sind. Beliebige monoclonale Antikörper gegen die menschliche-IL-5R α-Kette oder menschliche CDR-grafted Antikörper können im scFv der vorliegenden Erfindung als VH und VL verwendet werden.
  • Der Ausdruck „Disulfid-stabilisierter Antikörper (dsFv)" bedeutet einen Antikörper, der durch Verbindung von zwei Polypeptiden mittels einer Disulfid-Bindung hergestellt wird, in welchem jeder der Aminosäurereste in VH und VL durch Cysteinreste ersetzt ist. Die Aminosäurereste, die durch Cysteinreste ersetzt werden sollen, können basierend auf der vermutlichen räumlichen Struktur des Antikörpers in Übereinstimmung mit dem Verfahren, das von Reiter et. al. beschrieben wurde (Protein Engineering, 7, 697 (1994)), ausgewählt werden. Es kann entweder ein monoclonaler Maus-Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette oder ein menschlicher CDR-grafted Antikörper als VH oder VL im Disulfid-stabilisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Der einkettige Antikörper, der die Fähigkeit hat an eine menschliche IL-5R α-Kette zu binden, kann durch ein Verfahren exprimiert und erzeugt werden, welches die Schritte umfasst: Erhalt der VH und VL codierenden cDNA von einem Hybridom, das einen Antikörper herstellt, der mit der menschlichen IL-5R α-Kette reagiert, Konstruktion eines einkettigen Antikörper-Expressionsvektors und Transfektion des Expressionsvektors in eine E. coli-, Hefe- oder tierische Zelle. Beispiele des vom monoclonalen Antikörper abgeleiteten einkettigen Antikörpers der vorliegenden Erfindung schließen einen Antikörper ein, dessen VH eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 27 enthält und VL die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 29 enthält. Beispiele des vom menschlichen CDR-grafted Antikörper abgeleiteten einkettigen Antikörpers der vorliegenden Erfindung schließen einen Antikörper ein, dessen VH die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 83 enthält und VL die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 71 enthält.
  • Der Disulfid-stabilisierte Antikörper, der die Fähigkeit hat an eine menschliche IL-5R α-Kette zu binden, kann durch ein Verfahren exprimiert und erzeugt werden, welches die Schritte umfasst: Erhalt der VH und VL codierenden cDNA von einem Hybridom, das einen Antikörper herstellt, der mit der menschlichen IL-5R α-Kette reagiert, Insertion der cDNA in einen geeigneten Expressionsvektor und Transfektion des Expressionsvektors in eine E. coli-, Hefe- oder tierische Zelle. Beispiele des vom monoclonalen Antikörper abgeleiteten einkettigen Antikörpers der vorliegenden Erfindung schließen einen Antikörper ein, dessen VH die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 27 enthält und VL die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 29 enthält. Beispiele des vom menschlichen CDR-grafted Antikörper abgeleiteten Disulfid-stabilisierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung schließen einen Antikörper ein, dessen VH die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 83 enthält und VL die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 71 enthält.
  • Ein Verfahren zur Herstellung eines monoclonalen Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette, der spezifisch mit einer menschlichen IL-5R α-Kette reagiert oder der die biologische Aktivität von menschlichem IL-5 hemmt, und ein Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette, eines einkettigen Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette und eines Disulfid-stabilisierten Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette, welche alle die biologische Aktivität von menschlichem IL-5 hemmen, sowie ein Verfahren zur Erkennung und Bestimmung einer menschlichen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette durch diese Antikörper wird jetzt im Detail beschrieben werden.
  • 1. Erzeugung eines monoclonalen Anti-mensch IL-5R α-Antikörpers
  • (1) Herstellung von Antigen
  • sEine Zelle, die hIL-5R α auf der Zelloberfläche exprimiert, oder eine Zellmembranfraktion davon oder eine hIL-5R α- exprimierende- CTLL-2 (h5 R)- Zelle oder eine Zellmembranfraktion davon kann als Antigen für die Erzeugung eines monoclonalen anti-hIL-5R α-Antikörpers verwendet werden. CTLL-2 (h5 R) ist eine hIL-5R α- exprimierende Zelle, die durch Insertion einer cDNA, welche die gesamte Länge der Sequenz eines vorher clonierten hIL-5R α codiert (J. Exp. Med., 175, 341 (1992)), in einen Expressionsvektor für tierische Zellen wie zum Beispiel pCAGGS (Gene, 108, 193 (1991)) und durch Transfektion des Expressionsvektors in die Mäuse T-Zelllinie CTLL-2 geschaffen wurde.
  • Zur Expression in einer prokaryontische Wirtszelle wie zum Beispiel E. coli kann ein Gesamtlängen- oder Teilfragment von cDNA, die hIL-5R α codiert, in einen Expressionsvektor wie zum Beispiel handelsübliche pGEX (Pharmacia), pET-System (Novagen), pMKex1, der in Abschnitt (11) von Beispiel 1 nachstehend beschrieben werden wird, oder ähnliche, inseriert werden und die gesamte hIL-5R α-Sequenz oder ein Teilfragment davon kann entweder als solches oder als Fusionsprotein exprimiert werden. Nach Aufschluss der Zelle kann, basierend auf der Beschaffenheit des Fusionsproteins, das von E. coli exprimierte Protein durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, Affinitätschromatographie oder ähnliches gereinigt werden.
  • Im Verfahren zur Expression der gesamten Länge der IL-5R α-Sequenz oder eines Teilfragments davon, entweder als solches) oder als ein Fusionsprotein, können eukaryontische Wirtszellen wie zum Beispiel Insektenzellen, Säugerzellen und ähnliche verwendet werden.
  • Im Falle der Verwendung einer Säugerzelle wird ein Gesamtlängen- oder Teilfragment der cDNA, die hIL-5R α codiert, in einen Vektor wie zum Beispiel pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103, (J. Biochem. 101, 1307 (1987)), pAGE210, der in Abschnitt (1) von Beispiel 1 nachstehend beschrieben wird, oder ähnliche inseriert, um dadurch einen Expressionsvektor für des Protein zu konstruieren. Um die gesamte Länge der hIL-5Ra-Sequenz oder ein Teilfragment davon effizient zu exprimieren, die/das durch die cDNA, entweder als solches) oder als Fusionsprotein codiert wird, wird die Nucleotidsequenz, die ein Signalpeptid in der cDNA codiert, vorzugsweise durch die Nucleotidsequenz ersetzt, die ein Signalpeptid eines Proteins codiert, welches in einer eukaryontischen Wirtszelle in hohem Masse exprimiert werden kann. Bekannte Signalpeptide von Proteinen, einschließlich jener des menschlichen Wachstumshormons, des chimären anti-Gangliosid-GD3-Antikörpers KM871 (Kokai Nr. 304989/93) und ähnliche, werden vorzugsweise verwendet.
  • Die auf diese Weise konstruierten Expresssionsvektoren können durch bekannte Verfahren wie zum Beispiel Elektroporation (Kokai Nr. 257891/90; Cytotechnology, 3, 133 (1990)), Lipofectin-Verfahren (Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7413 (1987)) oder ähnliche in Wirtszellen transfiziert werden. Die Züchtung der Zellen in einem geeigneten Medium kann zur Herstellung der gesamten Länge der hIL-5R α-Sequenz oder eines Teilfragments davon, entweder als solches) oder als Fusionsprotein, in der Zelle oder im Kulturüberstand führen. Vorzugsweise wird ein serumfreies Medium verwendet, weil es die Reinigung des Teilfragments oder Fusionsprotein von hIL-5R α, das im Kulturüberstand erzeugt wird, erleichtert.
  • Im Falle der Verwendung einer Insektenzelle wird ein Gesamtlängen- oder Teilfragment der cDNA, die hIL-5R α codiert, unter Verwendung eines Baculo Gold Starter Kit (Pharmigen) inseriert, um einen recombinanten Baculovirus zu erzeugen und Insektenzellen von Sf9, Sf21 (Pharmigen) oder ähnliche werden mit dem recombinanten Virus so infiziert, dass die Gesamtlänge n-hIL-5R α-Sequenz oder ein Teilfragment davon, entweder als solches) oder als ein Fusionsprotein, in der Zelle oder im Kulturüberstand erzeugt wird (Bio/Technology, 6, 47 (1988)).
  • Die hIL-5R α-Sequenz in gesamter Länge oder ein Teilfragment oder Fusionsprotein davon, welches) durch eine tierische oder Insektenzelle hergestellt wird, kann vom Kulturüberstand oder ähnlichem durch ein bekanntes Verfahren der Proteinreinigung wie zum Beispiel Aussalzen, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder ähnlichem gereinigt und als Antigen verwendet werden. Besonders wenn hIL-5R α als ein Fusionsprotein mit einer konstanten Region des Immunoglobulins hergestellt wird, wird es vorzugsweise unter Verwendung einer Affinitätssäule mit daran gebundenem Protein A, welches eine spezifische Affinität für die konstante Region des Immunoglobulins hat, gereinigt.
  • (2) Immunisierung der Tiere und Erzeugung von Zellen, die Antikörper erzeugen
  • Beliebige Tiere wie Mäuse, Ratten, Hamster, Kaninchen und ähnliche können als Tiere für die Immunisierung verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie zur Erzeugung von Hybridomen verwendet werden können. Eine Ausführungsform, in welcher Mäuse oder Ratten verwendet werden, wird hierin erklärt werden. 3–20 Wochen alte Mäuse und Ratten werden mit shIL-5R α oder CTLL-2, welche hIL-5R α auf der Oberfläche exprimieren (J. Exp. Med., 177, 1523 (1993)), als ein Antigen immunisiert und Zellen, die Antikörper herstellen, werden von Milz, Lymphknoten und peripherem Blut der Tiere gesammelt. Die Immunisierung wird durch Verabreichung von Antigen an die Tiere zusammen mit einem geeigneten Adjuvans wie zum Beispiel komplettes Freudsches Adjuvans oder eine Kombination von Aluminium-Hydroxid-Gel und Keuchhustenimpfstoff entweder subkutan, intravenös oder intraperitoneal durchgeführt. Das Antigen wird nach der ersten Verabreichung 5–10 Mal in Intervallen von 1–2 Wochen verabreicht. Blut wird von der Augennervenvene an Tag 3–7 nach jeder Verabreichung gesammelt und das Serum wird mittels enzymverbundenen Enzymadsorptionstest („Enzyme Immunoassay (ELISA)", veröffentlicht von Igakushoin, 1976) auf Reaktivität mit dem Antigen untersucht.
  • Eine Maus oder Ratte, deren Serum einen zufriedenstellenden Antikörpertiter für shIL-5R α zeigt, oder Zellen, die hIL-5R α auf der Oberfläche exprimieren und die zur Immunisierung verwendet werden, können als Bezugsquelle von Zellen, die Antikörper herstellen, verwendet werden.
  • Um eine Fusion von Milzzellen mit Myelomzellen durchzuführen, wird die Milz an Tag 3–7 nach der letzten Verabreichung der antigenen Substanz von der immunisierten Maus entfernt und die Milzzellen werden gesammelt. Die Milz wird im MEM-Medium (Nissui Pharmaceuticals) geschnitten und mit einer Pinzette auseinander gezogen. Nach dem Zentrifugieren (1.200 UpM, 5 min) wird der Überstand entfernt. Der Niederschlag wird für 1–2 Minuten mit Tris-Ammoniumchlorid-Puffer (pH-Wert 7,65) behandelt, um Erythrocyten zu entfernen, und mit MEM-Medium dreimal gewaschen, um Splenocyten zur Verwendung in der Zellfusion zu erzeugen.
  • (3) Herstellung der Myelomzellen
  • Eine etablierte Zelllinie von Mäusen oder Ratten wird als Myelomzelle verwendet. Beispiele beinhalten Myelomzelllinien P3-X63Ag8-U1 (P3-U1) (Curr. Topics Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978); Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)), SP2/0-Ag14 (SP-2) (Nature, 276, 269 (1978)), P3-X63-Ag8653 (653) (J. Immunol., 123, 1548 (1979)) und P3-X63-Ag8 (X63) (Nature, 256, 495 (1975)), die von 8-Azaguanintoleranten Mäusen (BALB/c) stammen. Diese Zelllinien können in 8-Azaguanin-Medium subkultiviert werden, das RPMI-1640 Medium ist, ergänzt mit Glutamin (1,5 mM), 2-Mercaptoethanol (5 × 10–9 M), Gentamicin (10 μg/ml) und fötalem Kälberserum (FCS) (CSL, 10%) (nachstehend als „normales Medium" bezeichnet), welches weiter mit 8-Azaguanine (15 μg/ml) ergänzt wird. Sie sollten in normalem Medium für 3–4 Tage vor der Zellfusion subkultiviert werden, um am Tag der Zellfusion eine Zellzahl von zumindest 2 × 107 Zellen sicherzustellen.
  • (4) Zellfusion
  • Die in 1 (2) beschriebenen Zellen, die Antikörper herstellen, und die Myelom-Zellen, die in 1 (3) beschrieben wurden, werden gründlich mit MEM-Medium oder PBS (1,83 g Dinatriumphosphat, 0,21 g Monokaliumphosphat, 7,65 g Natriumchlorid, 1 L destilliertes Wasser, pH-Wert 7,2) gewaschen. Diese Zellen werden so gemischt, dass das Zellzahlverhältnis der Zellen, die Antikörper herstellen, zu Myelom-Zellen 5–10 : 1 ist. Nach dem Zentrifugieren (1.200 UpM, 5 min) wird der Überstand entfernt. Die ausgefällten Zellen werden dispergiert und eine gemischte Lösung, bestehend aus Ethylenglycol-1000 (PEG-1000) (2 g), MEM (2 ml) und Dimethylsulfoxid (DMSO) (0,7 ml), wird dann unter Rühren in einer Menge von 0,2–1 ml/108 Antikörper-herstellenden Zellen, zu den Zellen hinzugefügt. MEM-Medium (1–2 ml) wird einige Male in Abständen von 1–2 Minuten hinzugefügt und zusätzliches MEM-Medium wird dann so hinzugefügt, dass das Gesamtvolumen 50 ml beträgt. Nach dem Zentrifugieren (900 UpM, 5 min) wird der Überstand entfernt. Die Zellen werden behutsam dispergiert und behutsam durch Ansaugen und Ablassen mit einer Pipette in 100 ml HAT-Medium suspendiert (einem normalen Medium, ergänzt mit 10–4 M Hypoxantin, 1,5 × 10–5 M Thymidin und 4 × 10–7 M Aminopterin).
  • Die Zellsuspension wird in einer Menge von 100 μl/Vertiefung, in eine Kulturplatte mit 96 Vertiefungen aufgeteilt und im 5% CO2-Inkubator bei 37°C für 7–14 Tage gezüchtet.
  • Nach der Züchtung wird ein Aliquot des Kulturüberstands durch enzymverbundenen Enzymadsorptionstest, der in 1 (5) beschrieben werden wird, untersucht, um eine Vertiefung auszuwählen, die speziell mit einem rekombinanten Protein wie zum Beispiel einem Fusionsprotein mit shIL-5R α oder hIL-5R α, in 1 (1) beschrieben, reagiert. Anschließend wird durch limitierende Verdünnung eine Clonierung zweimal wiederholt. HAT-Medium ohne Aminopterin wird in der ersten Clonierung verwendet und normales Medium in der zweiten Clonierung. Eine Zelle, die stabil einen hohen Antikörpertiter aufweist, wird als Hybridom-Zelllinie ausgewählt, die einen monoclonalen Maus- oder Ratten-anti-hIL-5R α-Antikörper hergestellt.
  • (5) Auswählen eines monoclonalen Maus- oder Ratten-anti-hIL-5R α-Antikörpers
  • Ein Hybridom, welches monoclonale Maus- oder Ratten-Antikörper gegen die hIL-5R α-Kette erzeugt, wird in Übereinstimmung mit einem Verfahren, wie in Antibodies, ein Laborhandbuch, Cold Spring Habor Laboratory, Kapitel 14 (1988) beschrieben, durch das nachstehend beschriebene Mess-Verfahren ausgewählt. Durch dieses Verfahren kann die Aktivität eines anti-hIL-5R α-Antikörpers im Kulturüberstand der Transformanten, die einen humanisierten anti-hIL-5R α-Antikörper, einen einkettigen Antikörper oder einen Disulfid-stabilisierten Antikörper erzeugen, die nachstehend beschrieben werden, oder die Aktivität von allen gereinigten anti-hIL-5R α- Antikörpern bestimmt werden.
  • Eine geeignete Platte wird mit shIL-5R α oder einem rekombinanten Protein wie zum Beispiel einem in 1 (1) beschriebenen Fusionsprotein mit hIL-5R α beschichtet. Die Platte wird mit einem primären Antikörper, welcher der Hybridom-Kulturüberstand ist, oder einem gereinigtem in 1 (6) erhaltenen Antikörper umgesetzt und mit einem sekundären Antikörper umgesetzt, der ein anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörper oder ein anti-Ratten-Immunoglobulin-Antikörper ist, der mit Biotin, einem Enzym, einer chemilumineszierenden Substanz oder einer radioaktiven Verbindung markiert ist. Danach wird, in Übereinstimmung mit der spezifischen Art der Markierung, eine Reaktion durchgeführt, wobei ein Hybridom, welches spezifisch mit hIL-5R α reagiert, als Hybridom ausgewählt wird, das einen monoclonalen Maus-anti-hIL-5R α-Antikörper erzeugt.
  • Wenn der Kulturüberstand der Transformanten, die einen humanisierten anti-hIL-5R α-Antikörper, einen einkettigen Antikörper oder einen Disulfid-stabilisierten Antikörper erzeugen, oder ein davon gereinigter Antikörper als primärer Antikörper umgesetzt wird, wird ein anti-humaner Immunoglobulin-Antikörper, der mit Biotin, einem Enzym, einer chemilumineszierende Substanz oder einer radioaktiven Verbindung markiert ist, als ein sekundärer Antikörper verwendet und eine Reaktion wird in Übereinstimmung mit der für den Nachweis verwendeten spezifischen Art der Markierung durchgeführt.
  • Eine geeignete Platte wird mit shIL-5R α oder einem rekombinanten Protein wie zum Beispiel einem in 1 (1) beschrieben Fusionsprotein mit einem rekombinanten Protein hIL-5R α beschichtet. Jeder einzelne Hybridom-Kulturüberstand, der Kulturüberstand der Transformanten, die einen humanisierten anti-hIL-5R α-Antikörper, einen einkettigen Antikörper oder einen Disulfid-stabilisierten Antikörper herstellen, oder ein davon gereinigter Antikörper, wird gemischt und mit menschlichem IL-5 umgesetzt, das mit Biotin, einem Enzym, einer chemilumineszierenden Substanz oder einer radioaktiven Verbindung markiert ist. Anschließend wird in Übereinstimmung mit der spezifischen Art der Markierung eine Reaktion durchgeführt, um die Aktivität der Hemmung der Bindung von menschlichem IL-5 an menschlichen IL-5R α zu bestimmen. Dieses Verfahren wird verwendet, um Hybridome zur Selektion nach einem Antikörper zu durchmustern, welcher eine hohe hemmende Aktivität gegen menschliches IL-5 hat.
  • (6) Erzeugung von monoclonalen Maus- oder Ratten-Antikörpern
  • Eine 8–10 Wochen alte Maus oder nackte Maus wird mit Pristan behandelt. Noch genauer ausgedrückt wird der Maus Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan, 0,5 ml) intraperitoneal verabreicht und sie wird für 2 Wochen gehalten. Der Maus werden monoclonale Maus- oder Ratten-anti-hIL-5R α-Antikörper erzeugende Hybridom-Zelllinien (wie in 1 (3) erhalten) in einer Menge von 2 × 107 – 5 × 106 Zellen/Maus intraperitoneal verabreicht. Das Hybridom verursachte 10–21 Tage nach Verabreichung einen Ascitestumor. Der Ascites wird von der Maus gewonnen und zentrifugiert (3.000 UpM, 5 min), um den festen Anteil zu entfernen. Der Niederschlag wird ausgesalzt und auf eine Säule für eine Caprylsäure-Ausfällung oder auf eine DEAE-Sepharose-Säule, eine Protein-A-Säule oder eine Cellulofin-GSL2000-Säule (Biomedical Industry) aufgetragen, um IgG- oder IgM-Fraktionen zu sammeln. Diese Fraktionen werden als gereinigte monoclonale Antikörper verwendet.
  • Die Subklasse der Antikörper wird unter Verwendung eines monoclonalen Maus- oder Ratten-Antikörper-Typisierungs-Kits bestimmt. Die Masse des Proteins wird durch das Lowry-Verfahren oder vom Absorptionsvermögen bei 280 nm berechnet.
  • 2. Herstellung eines humanisierten Antikörpers gegen menschliches IL-5R α
  • (1) Konstruktion eines humanisierten Antikörper-Expressionsvektors
  • Um einen humanisierten Antikörper von einem nicht-menschlichen tierischen Antikörper zu erzeugen, wurde ein humanisierter Antikörper-Expressionsvektor hergestellt. Der humanisierte Antikörper-Expressionsvektor ist ein Vektor zur Expression in tierischen Zellen, in welchen ein Gen transfiziert wurde, welches die C-Regionen eines menschlichen Antikörpers, CH und CL, codiert. Ein solcher Expressionsvektor wird durch Insertion von zwei Genen in einen Expressionsvektor für tierische Zellen konstruiert, von denen eines CH eines menschlichen Antikörpers codiert und das andere CL eines menschlichen Antikörpers codiert. Beliebige C-Regionen eines menschlichen Antikörpers wie zum Beispiel Cγ 1 und Cγ 4 einer menschlichen Antikörper H-Kette, CK einer menschlichen Antikörper L-Kette und ähnliche können verwendet werden. Eine chromosomale DNA, bestehend aus Exon(s) und Intron(s) oder cDNA kann als Gen, welches die C-Region eines menschlichen Antikörpers codiert, verwendet werden. Beliebige Expressionsvektoren können als Expressionsvektoren für tierische Zellen verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie ein Gen aufnehmen und exprimieren können, welches die C-Region eines menschlichen Antikörpers codiert. Beispiele sind pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), phSG274 (Gene, 27, 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 1527 (1981)) und pSG1 β d2-4 (Cytotechnology, 4, 173 (1990)). Ein Promotor und ein Enhancer, die bei der Erzeugung eines Expressionsvektors für tierische Zellen verwendet werden sollen, sind durch einen frühen SV40-Promotor und -Enhancer (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), einen Moloney-Maus-Leukämievirus-LTR-Promotor und – Enhancer (Biochem. Biophys. Res. Comun., 149, 960 (1987)), einen Immunoglobulin-H-Ketten- Promotor (Cell, 41, 479 (1985)) und Enhancer (Cell, 33, 717 (1983)) und ähnliche beispielhaft dargestellt.
  • Der humanisierte Antikörper-Expressionsvektor kann entweder von einer Art sein, in der ein Gen, das eine Antikörper H-Kette codiert und ein Gen, das eine Antikörper L-Kette codiert, auf getrennten Vektoren vorhanden sind, oder von der Art, in welcher beide Gene auf dem selben Vektor vorhanden sind (Tandem-Typ). Mit Blick auf die Leichtigkeit der Konstruktion eines humanisierten Antikörper-Expressionsvektors, Leichtigkeit der Einführung in tierische Zellen, Ausgewogenheit zwischen Expressionsmenge der Antikörper H- und L-Ketten in tierischen Zellen und aus anderen Gründen wird der Tandem-Typ des humanisierten Antikörper-Expressionsvektors mehr bevorzugt (J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)).
  • (2) Erzeugung von cDNA, die VH und VL eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers codiert
  • cDNA, die VH und VL eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers codiert wie zum Beispiel einen monoclonalen Maus-anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörper, wird zum Beispiel wie folgt erhalten:
  • mRNA wird aus einer Zelle extrahiert, welche einen monoclonalen Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette erzeugt, und verwendet, um cDNA zu synthetisieren. Die synthetisierte cDNA wird in einen Vektor wie zum Beispiel einen Phagen oder ein Plasmid inseriert, um einen cDNA Bank zu erzeugen. Von der Genbank werden, wobei ein Anteil in einer V- oder C-Region eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers wie zum Beispiel einem Maus-Antikörper als Sonde verwendet wird, ein rekombinanter Phage oder Plasmid, welches cDNA enthält, die VH codiert, und ein rekombinanter Phage oder Plasmid, welches cDNA enthält, die VL codiert, getrennt isoliert. Die gesamten Nucleotidsequenzen von VH und VL des beteiligten Antikörpers, die auf dem rekombinanten Phagen oder Plasmid vorliegen, werden bestimmt und die gesamten Aminosäuresequenzen von VH und VL werden von den Nucleotidsequenzen abgeleitet.
  • (3) Konstruktion eines menschlichen chimären Antikörper-Expressionsvektors
  • Ein menschlicher chimärer Antikörper-Expressionsvektor kann durch Insertion von cDNA, die VH und VL eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers codiert, in eine Region stromaufwärts von einem Gen, welches CH und CL eines menschlichen Antikörpers codiert, auf dem in 2 (1) konstruierten humanisierten Antikörper- Expressionsvektors konstruiert werden. Zum Beispiel wird eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle zur Clonierung von cDNA, welche VH und VL eines nicht-menschlichen tierischen Antikörpers codiert, vorbereitend in einer Region stromaufwärts eines Gens, welches CH und CL des menschlichen Antikörpers codiert, auf einem chimären Antikörper-Expressionsvektor geschaffen. An der Clonierungsstelle wird cDNA, die eine V-Region eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers codiert, durch eine synthetische DNA (siehe nachstehend) inseriert, um einen menschlichen chimären Antikörper-Expressionsvektor zu erzeugen. Die synthetische DNA besteht aus einer Nucleotidsequenz am 3'-Ende einer V-Region des nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers und einer Nucleotidsequenz am 5'-Ende einer C-Region des menschlichen Antikörpers und sie wird so von einem DNA-Synthesegerät hergestellt, sodass es entsprechende Restriktionsenzymstellen an beiden Enden gibt.
  • (4) Identifikation von CDR-Sequenzen von nicht-menschlichen, tierischen Antikörpern
  • VH und VL, die eine Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers bilden, bestehen aus 3 komplementaritäts bestimmenden Regionen (CDRs), die eine große Vielfalt an Sequenzen aufweisen, welche die VH und VL mit 4 Gerüstregionen (nachstehend als „FR-Regionen" bezeichnet) verbinden, die relativ konservierte Sequenzen aufweisen (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991). Die Aminosäuresequenz der jeweiligen CDR (CDR-Sequenz) kann durch Vergleich mit den Aminosäuresequenzen der V-Regionen von bekannten Antikörpern (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) identifiziert werden.
  • (5) Konstruktion von cDNA, welche die V-Region eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers codiert
  • cDNA, die VH und VL eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers codiert, kann wie folgend erhalten werden:
  • Im ersten Schritt wird jeweils für VH und VL die Aminosäuresequenz der FR in der V-Region eines menschlichen Antikörpers ausgewählt, an welche die CDR eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers von Interesse in einer V-Region verpflanzt („grafted") werden soll. Beliebige Aminosäurensequenzen von FRs in V-Regionen, die von menschlichen Antikörpern stammen, können als die Aminosäuresequenzen von FRs in V-Regionen von menschlichen Antikörpern verwendet werden. Zum Beispiel können die Aminosäuresequenzen von FRs in V-Regionen von menschlichen Antikörpern, die in der Protein-Datenbank aufgezeichnet sind, und Aminosäuresequenzen verwendet werden, die Untergruppen der FRs in V-Regionen von menschlichen Antikörpern gemeinsam sind (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991). Um einen menschlichen CDR-grafted Antikörper herzustellen, der vorzügliche Aktivität aufweist, ist eine Aminosäuresequenz erwünscht, die eine hohe Homologie mit der Aminosäuresequenz einer V-Region eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers aufweist. Im zweiten Schritt wird eine DNA-Sequenz, welche die ausgewählte Aminosäuresequenz der FR in einer V-Region eines menschlichen Antikörpers codiert, an eine DNA-Sequenz ligiert, welche die Aminosäuresequenz der CDR in einer V-Region eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers codiert und eine DNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenzen von VH und VL codiert, wird entworfen. Um eine DNA-Sequenz zu erhalten, die zur Konstruktion eines Gens der variablen-Region eines CDR-grafted Antikörpers entworfen wurde, werden verschiedene synthetische DNAs für jeden Strang entworfen, so dass die gesamte DNA-Sequenz abgedeckt ist. Unter Verwendung der synthetischen DNAs wird eine Polymerase-Kettenreaktion (nachstehend als „PCR" bezeichnet) durchgeführt. Im Hinblick auf die Reaktionseffizienz der PCR und die Länge an DNAs, die synthetisiert werden können, werden für jeden Strang vorzugsweise 6 synthetische DNAs entworfen. Nach der Reaktion werden die amplifizierten Fragmente in geeignete Vektoren subcloniert und ihre Nucleotidsequenzen bestimmt; dadurch wird ein Plasmid erhalten, das cDNA enthält, welche die Aminosäuresequenz einer V-Region von jedem Strang eines menschlichen „CDR-grafted" Antikörpers von Interesse codiert. Anderenfalls kann cDNA, welche die Aminosäuresequenz einer V-Region von jedem Strang eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers von Interesse codiert, durch Sythetisieren der vollständigen Sequenzen von Sense- und Antisense-Strang unter Verwendung von synthetischen DNAs, die aus etwa 100 Basen bestehen, und durch Annelierung und Ligierung konstruiert werden.
  • (6) Änderung der Aminosäuresequenz der V-Region eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers
  • Es ist bekannt, dass die Aktivität eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers niedriger ist als die des ursprünglichen nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers, wenn er durch einfaches Verpflanzen der CDR allein in einer V-Region eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers von Interesse zwischen FRs in einer V-Region eines menschlichen Antikörpers erzeugt wird (BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)). Unter den Aminosäuresequenzen einer FR in einer V-Region eines menschlichen Antikörpers wird daher ein Aminosäurerest, welcher an der direkten Bindung an ein Antigen beteiligt ist, ein Aminosäurerest, der mit einem Aminosäurerest in der CDR interagiert oder ein Aminosäurerest, der an der Aufrechterhaltung der räumlichen Struktur des Antikörpers beteiligt sein kann, in einen Aminosäurerest, der im ursprünglichen nicht-menschlichen, tierischen Antikörper vorkommt, geändert, so dass die Aktivität des menschlichen CDR-grafted Antikörpers erhöht wird. Zur effizienten Erkennung des Aminosäurerestes wird die räumliche Struktur eines Antikörpers konstruiert und durch Röntgen-Kristallographie, Computer-Modellierung oder ähnlichem analysiert. Es wurde jedoch bis jetzt noch kein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers etabliert, das für beliebige Antikörper angewendet werden kann, und daher müssen gegenwärtig verschiedenste Versuche auf einer Fall-für-Fall Grundlage gemacht werden.
  • Die Änderung der ausgewählten Aminosäuresequenzen der FR in einer V-Region eines menschlichen Antikörpers kann unter Verwendung verschiedener Primer für die Mutation durch PCR wie in 2 (5) beschrieben, bewerkstelligt werden. Die durch PCR erhaltenen amplifizierten Fragmente werden in entsprechende Vektoren subcloniert und ihre Nucleotidsequenzen bestimmt und dadurch wird ein Vektor erhalten, der cDNA enthält, in welche eine Mutation von Interesse eingeführt wurde (nachstehend als „Aminosäurensequenz-ersetzter Vektor" bezeichnet).
  • Anderenfalls kann die Veränderung einer Aminosäurensequenz in einer engen Region durch ein PCR-Mutagenese-Verfahren unter Verwendung von Primern für die Mutation, die aus 20–35 Basen bestehen, bewerkstelligt werden. Genauer gesagt werden ein Sense-Mutations-Primer und ein Antisense-Mutations-Primer synthetisiert, die aus 20–35 Basen bestehen und die DNA-Sequenzen enthalten, welche die zu verändernden Aminosäurereste codieren, und verwendet, um eine 2-Schritt-PCR unter Verwendung eines Plasmids als Matrize durchzuführen, welches cDNA enthält, welche die Aminosäuresequenz einer V-Region codiert, die verändert werden soll. Die schlussendlich amplifizierten Fragmente werden in entsprechende Vektoren subcloniert und ihre Nucleotidsequenzen werden bestimmt; dadurch wird ein Vektor mit veränderter Aminosäuresequenz erhalten, welcher cDNA enthält, in die eine Mutation von Interesse eingeführt wird.
  • (7) Konstruktion eines menschlichen CDR-grafted Antikörper-Expressionsvektors
  • Ein menschlicher CDR-grafted Antikörper-Expressionsvektor kann durch Insertion der in 2 (5) und 2 (6) erhaltenen cDNA, die VH und VL des menschlichen CDR-grafted Antikörpers codiert, in eine Region stromaufwärts des in 2 (1) beschriebenen Gens, das CH und CL des menschlichen Antikörpers in dem humanisierten Antikörper-Expressionsvektor codiert, konstruiert werden. Wenn beispielsweise Erkennungsstellen für entsprechende Enzyme während der PCR an den Enden der 5'- und 3'- terminalen synthetischen DNAs zur Konstruktion der cDNA, welche die Aminosäuresequenzen von VH und VL des menschlichen CDR-grafted Antikörpers codiert, eingeführt werden, kann die cDNA in eine Region stromaufwärts eines Gens eingefügt werden, welches eine C-Region eines erwünschten menschlichen Antikörpers codiert, so dass es in einer geeigneten Form exprimiert wird.
  • (8) Transiente Expression von humanisierten Antikörpern und Bewertung ihrer Aktivitäten
  • Um die Aktivitäten einer großen Vielfalt an humanisierten Antikörpern effizient zu bewerten, kann der in 2 (3) beschriebene menschliche chimäre Antikörper- Expressionsvektor und der in 2 (7) beschriebene menschliche CDR-grafted Antikörper-Expressionsvektor oder deren veränderte Vektorversionen in COS-7-Zellen (ATCC CRL1651) transfiziert werden und humanisierte Antikörper transient exprimiert werden (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, S. 283, 1991), worauf eine Bestimmung ihrer Aktivitäten folgt.
  • Beispiele des Verfahrens zur Transfektion des Expressionsvektors in eine COS-7-Zelle umfassen ein DEAE-Dextran-Verfahren (Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, S. 283, 1991), ein Lipofektions-Verfahren (Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7413 (1987)) und ähnliche.
  • Nach Transfektion des Vektors können die Aktivitäten der humanisierten Antikörper im Kulturüberstand durch den in 1 (5) beschriebenen enzymverbundenen Enzymadsorptionstest (ELISA) und ähnliche bestimmt werden.
  • (9) Stabile Expression von humanisierten Antikörpern und Bewertung ihrer Aktivitäten
  • Transformanten, die einen humanisierten Antikörper dauerhaft exprimieren, können durch Transfektion des in 2 (3) beschrieben menschlichen chimären Antikörper-Expressionsvektors und des in 2 (7) beschriebenen menschlichen CDR-grafted Antikörper-Expressionsvektors in entsprechende Wirtszellen erhalten werden.
  • Beispiele des Verfahrens zur Transfektion des Expressionsvektors in Wirtszellen umfassen Elektroporation (Kokai No. 257891/90, Cytotechnology, 3, 133 (1990)) und ähnliche.
  • Beliebige Zellen können als Wirtszellen verwendet werden, in welche der humanisierte Antikörper-Expressionsvektor transfiziert werden soll, vorausgesetzt dass sie humanisierte Antikörper exprimieren können. Beispiele sind die Maus-SP2/0-Ag14-Zelle (ATCC CRL1581), Maus-P3X63-Ag8.653-Zelle (ATCC CRL1580), CHO-Zellen, deren Dihydrofolat-Reduktase-Gen fehlerhaft ist (nachstehend als „DHFR" Gen bezeichnet) (Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4216 (1980)) und Ratten-YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20-Zelle (ATCC CRL1662, nachstehend als „YB2/0-Zelle" bezeichnet).
  • Nach Transfektion des Vektors werden Transformanten, die einen humanisierten Antikörper dauerhaft exprimieren, in Übereinstimmung mit dem in Kokai Nr. 257891/90 offenbarten Verfahren unter Verwendung eines RPM11640-Mediums, das G418 und FCS enthält, ausgewählt. Der humanisierte Antikörper kann erzeugt und durch Züchtung der ausgewählten Transformanten in einem Medium in einem Kulturmedium akkumuliert werden. Die Aktivität des humanisierten Antikörpers im Kulturmedium wird durch das in 1 (5) beschriebene Verfahren oder ähnliche bestimmt. Die Herstellung des humanisierten Antikörpers durch Transformanten kann durch das in Kokai Nr. 257891/90 beschriebene Verfahren durch Nutzung eines DHFR-Genamplifikations-Systems oder ähnlichem gesteigert werden.
  • Der humanisierte Antikörper kann unter Verwendung einer Protein-A-Säule (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Kapitel 8, 1988) vom Kulturüberstand gereinigt werden. Beliebige andere herkömmliche Verfahren zur Proteinreinigung können verwendet werden. Der humanisierte Antikörper kann zum Beispiel durch eine Kombination von Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromatographie, Ultrafiltration und ähnlichem, gereinigt werden. Das Molekulargewicht der H-Kette oder L-Kette des gereinigten humanisierten Antikörpers oder des Antikörpermoleküls als Ganzes wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (Nature, 227, 680 (1970)), Western-Blot-Verfahren (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Kapitel 12, 1988) und ähnlichem, bestimmt.
  • Die Reaktionsfähigkeit des gereinigten humanisierten Antikörpers und die Hemmung der Aktivität des humanisierten Antikörpers gegen IL-5 können durch das in 1 (5) beschriebene Verfahren bestimmt werden.
  • (10) Verfahren zur Verwendung des humanisierten Antikörpers
  • Der humanisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung kann spezifisch an eine menschliche IL-5R α-Kette binden und dadurch die biologische Aktivität von IL-5 hemmen. Von dem humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung wird daher erwartet, dass er die Funktion von Eosinophilen hemmt, die in Differenzierung und Wachstum durch IL-5 gesteuert werden. Folglich wird der humanisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung in der Behandlung von Erkrankungen nützlich sein, bei denen Eosinophile mit deren Pathogenese in Zusammenhang stehen. Nachdem fast alle Teile des humanisierten Antikörpers der vorliegenden Erfindung von Aminosäuresequenzen eines menschlichen Antikörpers stammen, wird nicht nur erwartet, dass er im menschlichen Körper Immunogenität aufweist, sondern auch seine Wirkung über eine lange Zeitspanne beibehält. Der humanisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung kann entweder alleine oder in Kombination mit zumindest einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff verwendet werden. Der humanisierte Antikörper wird zum Beispiel in physiologischer Salzlösung oder einer wässrigen Lösung von Glucose, Lactose, Mannit oder ähnlichem aufgelöst, um ein Arzneimittel zu erzeugen. Wahlweise wird der humanisierte Antikörper durch ein herkömmliches Verfahren lyophilisiert und Natriumchlorid wird hinzugefügt, um eine Injektion in Pulverform zu erzeugen. Das vorliegende Arzneimittel kann, falls nötig, jeden beliebigen Zusatzstoff enthalten, der im Bereich pharmazeutischer Präparate bekannt ist, wie zum Beispiel ein pharmazeutisch verträgliches Salz und ähnliches.
  • Das vorliegende Arzneimittel kann an Säuger, einschließlich Menschen, in einer Dosis von 0,1–20 mg/kg/Tag des humanisierten Antikörpers verabreicht werden, die abhängig vom Alter und Zustand des Patienten und ähnlichem variieren kann. Die Verabreichung erfolgt einmal täglich (Einzeldosis oder fortlaufende Verabreichung), ein- bis dreimal wöchentlich oder einmal alle 2–3 Wochen durch intravenöse Injektion.
  • 3. Herstellung des einkettigen anti-Mensch-IL-5R α -Antikörpers
  • (1) Konstruktion des einkettigen Antikörper-Expressionsvektors
  • Ein Vektor zur Expression eines einkettigen Antikörpers eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers oder eines einkettigen Antikörpers eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers kann durch Insertion der in 2 (2), 2 (5) und 2 (6) beschriebenen cDNAs, die VH und VL eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers oder eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers codieren, in einen einkettigen Antikörper-Expressionsvektor konstruiert werden. Beliebige Expressionsvektoren können als einkettige Antikörper-Expressionsvektoren verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie die cDNAs, die VH und VL eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers oder eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers aufnehmen und exprimieren können. Beispiele sind pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), phSG274 (Gene, 27, 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 1527 (1981)) und pSG1 β d2-4 (Cytotechnology, 4, 173 (1990)). Ein Wirt zur Verwendung bei der Expression eines einkettigen Antikörpers kann unter E. coli, Hefe und tierischen Zellen und ähnlichem ausgewählt werden. In diesem Fall sollte ein Expressionsvektor ausgewählt werden, der mit dem spezifischen Wirt kompatibel ist. Der einkettige Antikörper kann durch Insertion einer cDNA in den Expressionsvektor, die ein entsprechendes Signalpeptid codiert, aus der Zelle abgesondert werden und in die Periplasmaregion transportiert werden oder in der Zelle zurückbehalten werden.
  • Ein einkettiger Antikörper-Expressionsvektor, in welchen die cDNA inseriert wurde, die einen einkettigen Antikörper von Interesse codiert, kann durch Insertion der cDNA, welche einen einkettigen Antikörper, bestehend aus VH-L-VL oder VL-L-VH (wobei L ein Peptidlinker ist), codiert, in eine Region stromabwärts eines entsprechenden Promotors und Signalpeptids des ausgewählten Expressionsvektors konstruiert werden.
  • Die cDNA, die einen einkettigen Antikörper codiert, kann erhalten werden, indem eine cDNA, die VH codiert mit einer cDNA, die VL codiert, durch eine synthetische DNA verbunden wird, die einen Peptidlinker codiert, der an beiden Enden Erkennungsstellen für entsprechende Restriktionsenzyme hat. Es ist wichtig den Peptidlinker zu optimieren, so dass sein Zusatz die Bindung von VH und VL an das Antigen nicht stört. Der Linker, der von Pantoliano et. al. (Biochemistry, 30, 10117 (1991)) beschrieben wurde, sowie veränderte Versionen davon können zum Beispiel verwendet werden.
  • (2) Expression eines einkettigen Antikörpers und Bewertung seiner Aktivität
  • Eine Transformante, die einen einkettigen Antikörper von Interesse erzeugt, kann durch Transfektion mittels Elektroporation (Kokai Nr. 257891/90; Cytotechnology, 3, 133 (1990)) oder ähnliches eines in 3 (1) konstruierten einkettigen Antikörper-Expressionsvektors in eine entsprechende Wirtszelle erhalten werden. Nach der Transfektion des Expressionsvektors kann die Aktivität des einkettigen Antikörpers im Kulturüberstand durch ein in 1 (5) beschriebenes Verfahren oder ähnlichem bestimmt werden.
  • Die Sammlung und Reinigung des einkettigen Antikörpers der vorliegenden Erfindung kann durch eine Kombination aus bekannten Verfahren erreicht werden. Wenn zum Beispiel ein einkettiger Antikörper in ein Medium abgesondert wird, kann er durch Ultrafiltration konzentriert werden und seine Sammlung und Reinigung kann dann durch Antigen-Affinitätschromatographie oder Ionenaustausch-Chromatographie oder Gelfiltration durchgeführt werden. Wenn der einkettige Antikörper in die Periplasmaregion der Wirtzelle transportiert wird, kann er nach der Anwendung eines osmotischen Schocks durch Ultrafiltration konzentriert werden und seine Sammlung und Reinigung können dann durch Antigen-Affinitätschromatographie oder Ionenaustausch-Chromatographie oder Gelfiltration durchgeführt werden. Wenn der einkettige Antikörper unlöslich ist und als Körnchen (z. B.: Einschlusskörper) vorhanden ist, können seine Sammlung und Reinigung durch Lyse der Zelle, wiederholtes Zentrifugieren und Waschen zur Isolation der Körnchen, Löslichmachen mit Guanidin-HCl, einen Arbeitsgang, um die Struktur des einkettigen Antikörpers in eine aktive Struktur zurückzuführen, und anschließende Reinigung des aktiven Moleküls ausgeführt werden.
  • Die Aktivität des gereinigten einkettigen Antikörpers kann durch das in 1 (5) beschriebene Verfahren oder ähnliche bestimmt werden.
  • (3) Verfahren zur Verwendung eines einkettigen Antikörpers
  • Der einkettige Antikörper der vorliegenden Erfindung kann spezifisch an eine menschliche IL-5R α-Kette binden und die biologische Aktivität von IL-5 hemmen. Daher wird vom einkettigen Antikörper der vorliegenden Erfindung angenommen, dass er die Funktion von Eosinophilen, welche in Differenzierung und Wachstum von IL-5 kontrolliert werden, hemmt. Demgemäß wird der einkettige Antikörper der vorliegenden Erfindung in der Behandlung von Erkrankungen nützlich sein, in welchen Eosinophile mit der Pathogenese in Verbindung stehen. Der einkettige Antikörper der vorliegenden Erfindung kann entweder alleine oder in Kombination mit zumindest einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff verwendet werden. Der einkettige Antikörper wird zum Beispiel in physiologischer Salzlösung oder einer wässrigen Lösung aus Glucose, Lactose, Mannit oder ähnlichem aufgelöst, um ein Arzneimittel zu erzeugen. Wahlweise wird der einkettige Antikörper durch ein herkömmliches Verfahren lyophilisiert und Natriumchlorid wird hinzugefügt, um eine Injektion in Pulverform zu erzeugen. Das vorliegende Arzneimittel kann, falls nötig, jeden beliebigen Zusatzstoff enthalten, der im Bereich pharmazeutischer Präparate bekannt ist, wie zum Beispiel ein pharmazeutisch verträgliches Salz und ähnliches.
  • Das vorliegende Arzneimittel kann an Säuger, einschließlich Menschen, in einer Dosis von 0,1–20 mg/kg/Tag des einkettigen Antikörpers verabreicht werden, die abhängig vom Alter und Zustand des Patienten und ähnlichem variieren kann. Die Verabreichung erfolgt einmal täglich (Einzeldosis oder fortlaufende Verabreichung), ein- bis dreimal wöchentlich oder einmal alle 2–3 Wochen durch intravenöse Injektion.
  • 4. Herstellung eines gegen die α-Kette von humanem IL-5R gerichteten Disulfid-stabilisierten Antikörpers
  • (1) Herstellung von Disulfid-stabilisiertem Antikörper
  • Ein Disulfid-stabilisierter Antikörper kann durch ein Verfahren hergestellt werden, welches die Schritte umfasst: Bereitstellung der cDNAs, welche VH und VL eines nicht-menschlichen, tierischen Antikörpers codieren, oder cDNAs, welche VH und VL eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers codieren, Änderung der DNA-Sequenz, welche einem einzigen Aminosäurerest an einer entsprechenden Position in der jeweiligen cDNA entspricht, mit einer DNA-Sequenz, die einem Cysteinrest entspricht, Expression der geänderten cDNAs und Reinigung der daraus resultierenden Peptide und danach Bildung einer Disulfid-Bindung. Die Änderung eines Aminosäurerestes in einen Cysteinrest kann durch ein Mutagenese-Verfahren unter Verwendung der in 2 (5) beschriebenen PCR ausgeführt werden.
  • Ein Disulfid-stabilisierter Antikörper-H-Ketten-Expressionsvektor und ein Disulfid-stabilisierter Antikörper-L-Ketten-Expressionsvektor können durch Insertion der resultierenden cDNAs in entsprechende Expressionsvektoren konstruiert werden, welche geänderte VH und geänderte VL codieren. Beliebige Expressionsvektoren können als Disulfid-stabilisierte Antikörper-Expressionsvektoren verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie cDNAs, die eine geänderte VH und geänderte VL codieren, aufnehmen und exprimieren können. Zum Beispiel können pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)), phSG274 (Gene, 27, 223 (1984)), pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 1527 (1981)), pSG1 β d2-4 (Cytotechnology, 4, 173 (1990)) und ähnliche verwendet werden. Ein Wirt, der verwendet wird, um einen Disulfid-stabilisierten Antikörper-L-Ketten-Expressionsvektor und einen Disulfid-stabilisierten Antikörper-H-Ketten-Expressionsvektor zur Bildung eines Disulfid-stabilisierten Antikörpers zu exprimieren, kann unter E. coli, Hefe und tierischen Zellen und ähnlichen ausgewählt werden. In diesem Fall sollte ein Expressionsvektor ausgewählt werden, der mit dem spezifischen Wirt kompatibel ist. Der Disulfid-stabilisierte Antikörper kann durch Insertion einer cDNA in den Expressionsvektor, welche ein entsprechendes Signalpeptid codiert, aus der Zelle abgesondert werden und in die Periplasmaregion transportiert werden oder in der Zelle zurückbehalten werden.
  • (2) Expression des Disulfid-stabilisierten Antikörpers und Bewertung seiner Aktivität
  • Eine Transformante, die eine Disulfid-stabilisierte Antikörper-H-Kette oder eine Disulfid-stabilisierte Antikörper-L-Kette von Interesse erzeugt, kann durch Transfektion des in 4 (1) konstruierten Disulfid-stabilisierten Antikörper-H-Ketten-Expressionsvektors oder Disulfid-stabilisierten Antikörper-L-Ketten-Expressionsvektors in eine Wirtszelle mittels Elektroporation (Kokai Nr. 257891/90; Cytotechnology, 3, 133 (1990)) oder ähnlichem erhalten werden. Nach der Einführung des Expressionsvektors kann die Expression der Disulfid-stabilisierten Antikörper-H-Kette oder der Disulfid-stabilisierten Antikörper-L-Kette im Kulturüberstand oder ähnlichem durch das in 1 (5) beschriebene Verfahren bestätigt werden.
  • Die Sammlung und Reinigung der Disulfid-stabilisierten Antikörper-H-Kette oder Disulfid-stabilisierten Antikörper-L-Kette kann durch eine Kombination aus bekannten Verfahren erreicht werden. Wenn die H-Kette des Disulfid-stabilisierten Antikörpers oder die L-Kette des Disulfid-stabilisierten Antikörpers zum Beispiel in ein Medium abgesondert werden, können sie durch Ultrafiltration konzentriert werden und ihre Sammlung und Reinigung können dann durch verschiedene Arten der Chromatographie oder Gelfiltration durchgeführt werden. Wenn die H-Kette des Disulfid-stabilisierten Antikörpers oder die L-Kette des Disulfid-stabilisierten Antikörpers in die Periplasmaregion der Wirtzelle transportiert wird, können sie nach Anwendung eines osmotischen Schocks auf die Zelle, durch Ultrafiltration konzentriert werden und ihre Sammlung und Reinigung kann dann durch verschiedene Arten der Chromatographie oder Gelfiltration durchgeführt werden. Wenn eine H-Kette des Disulfid-stabilisierten Antikörpers oder eine L-Kette des Disulfid-stabilisierten Antikörpers nicht löslich ist und als Körnchen (z. B.: Einschlusskörper) vorliegt, kann ihre Sammlung und Reinigung durch Lyse der Zelle, wiederholtes Zentrifugieren und Waschen zur Isolation des Körnchens, Löslichmachen mit Guanidin-HCl und anschließender Durchführung verschiedenster Arten der Chromatographie oder Gelfiltration ausgeführt werden.
  • Die gereinigte H-Kette des Disulfid-stabilisierte Antikörpers und L-Kette des Disulfid-stabilisierten Antikörpers werden gemischt und einem Rückfaltungs-Verfahren unterzogen, um eine aktive Struktur zu erlangen (Molecular Immunology, 32, 249 (1995)), und dabei wird eine Disulfid-Bindung gebildet. Anschließend kann der aktive Disulfid-stabilisierte Antikörper durch Antigen-Affinitätschromatographie oder Ionenaustausch-Chromatographie oder Gelfiltration gereinigt werden. Die Aktivität des Disulfid-stabilisierten Antikörpers kann durch das in 1 (5) beschriebene Verfahren oder ähnlichen bestimmt werden.
  • (3) Verfahren zur Verwendung eines Disulfid-stabilisierten Antikörpers
  • Der Disulfid-stabilisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung kann spezifisch an die menschliche IL-5R α-Kette binden und dadurch die biologische Aktivität von IL-5 hemmen. Vom Disulfid-stabilisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung wird daher erwartet, dass er die Funktion von Eosinophilen hemmt, welche in Differenzierung und Wachstum von IL-5 kontrolliert werden. Demgemäß wird der Disulfid-stabilisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung in der Behandlung von Erkrankungen nützlich sein, in welchen Eosinophile mit der Pathogenese in Verbindung stehen. Der Disulfid-stabilisierte Antikörper der vorliegenden Erfindung kann entweder alleine oder in Kombination mit zumindest einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff verwendet werden. Der einkettige Antikörper oder Disulfid-stabilisierte Antikörper wird zum Beispiel in physiologischer Kochsalzlösung oder einer wässrigen Lösung aus Glucose, Lactose, Mannit oder ähnlichem aufgelöst, um ein Arzneimittel zu erzeugen. Wahlweise wird der Disulfid-stabilisierte Antikörper durch ein herkömmliches Verfahren lyophilisiert und Natriumchlorid wird hinzugefügt, um eine Injektion in Pulverform zu erzeugen. Das vorliegende Arzneimittel kann, falls nötig, jeden beliebigen Zusatzstoff enthalten, der im Bereich pharmazeutischer Präparate bekannt ist, wie zum Beispiel ein pharmazeutisch verträgliches Salz und ähnliches.
  • Das vorliegende Arzneimittel kann an Säuger, einschließlich Menschen, in einer Dosis von 0,1–20 mg/kg/Tag des Disulfid-stabilisierten Antikörpers verabreicht werden, welche abhängig vom Alter und Zustand des Patienten und ähnlichem variieren kann. Die Verabreichung wird einmal täglich (Einzeldosis oder fortlaufende Verabreichung), ein- bis dreimal wöchentlich oder einmal alle 2–3 Wochen durch intravenöse Injektion gegeben.
  • 5. Verfahren für Nachweis und Bestimmung der menschlichen Interleukin-5-Rezeptor α-Kette unter Verwendung eines Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette
  • (1) Immunocyten-Färbung unter Verwendung eines Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette
  • Wenn Immunocyten als suspendierte Zellen vorliegen, werden sie in der folgenden Behandlung als solche verwendet. Wenn Immunocyten als anhaftende Zellen vorliegen, werden sie mit Trypsin in EDTA losgelöst und dann im folgenden Verfahren verwendet. Die Immunocyten werden in einen Immunocyten-Färbepuffer (PBS, das 1% BSA, 0,02% EDTA und 0,05% Natriumazid enthält) oder ähnlichem suspendiert und in einer Menge von 1 × 105 – 2 × 106 Zellen verteilt. Der Kulturüberstand des in 1 (4) erhaltenen Hybridoms, welches monoclonale Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette erzeugt, der Kulturüberstand des in 2 (9) erhaltenen Transformante des humanisierten Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette oder des in 1 (6) oder 2 (9) erhaltenen, gereinigten Antikörpers oder das durch Markierung des gereinigten Antikörpers mit einem geeigneten Markierungsstoff (z. B.: Biotin) durch ein bekanntes Verfahren (KOUSOKOUTAIHOU (Methods for Enzymes and Antibodies), veröffentlicht von Gakusai Kikaku, 1985) und Verdünnung des markierten Antikörpers mit einem Immunocyten-Färbepuffer oder 10% tierischem Serum, das Immunocyten-Färbepuffer enthält auf eine Konzentration von 0,1–50 μg/ml erhaltene Produkt, wird in 20–500 μl-Anteilen verteilt und man lässt es auf Eis für 30 Minuten reagieren. Wenn der Kulturüberstand des in 1 (4) erhaltenen Hybridoms, welches monoclonale Maus-anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper erzeugt, der in 2 (9) erhaltenen Transformante des humanisierten Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette oder des in 1 (6) oder 2 (9) erhaltenen gereinigten Antikörpers reagiert hatte, werden die Zellen nach Beendigung der Reaktion mit einem Immunocyten-Färbepuffer gewaschen, der etwa 0,1–50 μg/ml eines anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörpers, anti-Ratten-Immunoglobulin-Antikörpers oder anti-Mensch-Immunoglobulin-Antikörpers enthält, welcher mit einem Fluorochrom wie zum Beispiel FITC oder Phycoerythrin markiert wurde, wird in 50–500 μl-Anteilen verteilt, gefolgt von 30 Minuten Umsetzung auf Eis im Dunklen. Sobald der Biotin markierte monoclonale Antikörper reagiert hatte, wurde Streptavidin, das mit einem Fluorochrom wie zum Beispiel FITC oder Phycoerythrin markiert war, in einer Menge von 50–500 μl verteilt und die Reaktion wird auf Eis für 30 Minuten im Dunklen durchgeführt. Sobald der mit einem Fluorochrom wie zum Beispiel FITC oder Phycoerythrin markierte monoclonale Antikörper reagiert hatte, wird ein Immunocyten-Färbepuffer, der etwa 0,1–50 μg/ml des monoclonalen Antikörpers enthielt, in einer Menge von 50–500 μl verteilt und die Reaktion wird für 30 Minuten auf Eis im Dunklen durchgeführt. In jedem dieser Fälle wird das Reaktionsgemisch nach der Reaktion, gründlich mit einem Immunocyten-Färbepuffer gewaschen und einer Analyse mit einem Zellsortierer unterzogen.
  • (2) Test zur Wachstumshemmung von menschlichen IL-5-abhängigen Zellen unter Verwendung eines Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette
  • Um die biologische Hemmungsaktivität des erhaltenen Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette zu zeigen, wurde die Auswirkung auf das Wachstum menschlicher IL-5-abhängiger Zellen unter Verwendung von menschlichen IL-5-abhängigen Zellen untersucht. Beispiele des Bewertungsverfahrens umfassen die Aufnahme von Thymidin in Zellen, welches mit Tritium markiert wurde, Farbentwicklungsverfahren unter Verwendung von Zell-Zähl-Kits und ähnliches. Ein Farbentwicklungsverfahren, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, wird jetzt erklärt werden.
  • CTLL-2 (h5R)-Zellen (1 × 104) werden in normalem Medium (50 μl) suspendiert und auf eine Kultur-Platte mit 96 Vertiefungen aufgeteilt. Zu der Platte werden 25 μl einer Lösung des in 1 (6) oder 2 (9) erhaltenen gereinigten Antikörpers (0,01–50 μg/ml) und ein normales Medium, welches 0,4–40 ng/ml von menschlichem IL-5 enthält, hinzugefügt und das Gemisch wird in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C für 24–72 Stunden gezüchtet. Anschließend wird eine Zell-Zähl-Kit-Lösung von 10 μl/Vertiefung hinzugefügt und die Züchtung in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C für 4 Stunden fortgesetzt. Nach Beendigung der Züchtung wird das Absorptionsvermögen bei 450 nm mit dem Plattenlesegerät Emax für Mikrovertiefungen (Molecular Device) bestimmt und die hemmende Aktivität des jeweiligen Antikörpers auf das Wachstum von CTLL-2 (h5R)-Zellen wird berechnet.
  • (3) Unterdrückung des Überlebens von menschlichen Eosinophilen durch Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette
  • Menschliche polymorphkernige Leukocytenfraktionen, die Eosinophile enthalten, werden von menschlichem peripherem Blut mit einem handelsüblichen Korpuskel-Trennungs-Medium wie zum Beispiel Polymorphprep (Nikomed) oder Percoll (Pharmacia) hergestellt. Die Fraktionen werden in normalem Medium suspendiert und die sich ergebenden Zellen werden in einer Menge von 1 × 106 – 1 × 107 Zellen/Vertiefung in eine Kulturplatte mit 96, 48 oder 24 Vertiefungen verteilt, gefolgt von der Zugabe von menschlichem IL-5 bis zu einer Endkonzentration von 0,001–10 ng/ml. Der Kulturüberstand des in 1 (4) erhaltenen Hybridoms, welches monoclonale Antikörper gegen die menschlichen IL-5R α-Kette erzeugt, oder der Kulturüberstand der in 2 (9) erhaltenen Transformante des humanisierten Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette oder der in 1 (6) oder 2 (9) erhaltene gereinigte Antikörper wird hinzugefügt und das Gemisch wird in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C für 2–5 Tage gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung wird eine Zellprobe von jeder Vertiefung hergestellt und durch das May-Grünwald-Giemsa-Färbeverfahren (SENSHOKUHOU NO SUBETE (Techniques for Staining, veröffentlicht von Ishiyaku Shuppan Cor., Ltd., 1988) oder ähnliche gefärbt und der Anteil an Eosinophilen, in Prozent, wird bestimmt. Das Nichtvorhandensein oder das Vorhandensein der Aktivität des monoclonalen Antikörpers bei der Unterdrückung der Erhöhung der Lebensfähigkeit der IL-5-abhängigen menschlichen Eosinophilen wird durch Vergleich des prozentualen Anteils an Eosinophilen in der Abwesenheit des anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers mit dem in der Anwesenheit des anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers bestätigt.
  • (4) Bestimmung von shIL-5R α unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers
  • Eine Platte wird mit 0,1–50 μg/ml des in 1 (6) erhaltenen, gereinigten Antikörpers als primärer Antikörper beschichtet. Die beschichtete Platte wird mit 0,1–10.000 ng/ml des gereinigten shIL-5R α, der in 1 (1) erhalten wurde, oder einer Probe wie zum Beispiel menschlichen Serum umgesetzt. Die Platte wird gründlich gewaschen und dann mit dem sekundären Antikörper reagieren lassen, der ein Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette ist und ein anderes Epitop als jenes erkennt, welches vom Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette erkannt wird, der von den gereinigten Antikörpern, die in 1 (6) und 2 (9) erhalten wurden, zur Verwendung als primärer Antikörper ausgewählt wurde. Der sekundäre Antikörper wurde mit Biotin, einem Enzym, einer chemilumineszierenden Substanz, einer radioaktiven Verbindung oder ähnlichem vor der Reaktion markiert. Anschließend wird in Übereinstimmung mit der Markierung eine Reaktion durchgeführt. Eine Kalibrierungskurve wird auf Basis der Reaktivität mit dem gereinigten shIL-5R erstellt und die Konzentration von shIL-5R in der Probe wird berechnet.
  • (5) Nachweis von shIL-5R α durch Western-Blot-Verfahren
  • Der in 1 (1) erhaltene, gereinigte shIL-5R α wird einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen und dann auf eine Polyvinyliden-Difluorid-Membran (nachstehend als „PVDF-Membran" bezeichnet, von Millipore) übertragen. Die PVDF-Membran wird in PBS, welches mit 1–10% Rinderserumalbumin (BSA) ergänzt ist, eingetaucht und über Nacht bei 4°C zur Blockierung stehen gelassen und anschließend gründlich mit PBS, welches 0,05% Tween enthält, gewaschen. Die PVDF-Membran wird in den Kulturüberstand des Hybridoms, das in 1 (5) erhaltenen wurde, oder in eine Lösung des in 1 (6) erhaltenen, gereinigten Antikörpers für 2 Stunden eingetaucht und gründlich mit PBS, das 0,05% Tween enthält, gewaschen. Die PVDF-Membran wird in eine Lösung des anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörpers oder anti-Ratten-Immunoglobulin-Antikörpers als sekundärer Antikörper bei Raumtemperatur für 1 Stunde eingetaucht und gründlich mit PBS, das 0,05% Tween enthält, gewaschen. Der sekundäre Antikörper wurde vorausgehend mit Biotin, einem Enzym, einer chemilumineszierenden Substanz, einer radioaktiven Verbindung oder ähnlichem markiert. Nach völliger Entfernung der Waschlösung wird in Übereinstimmung mit der Markierung des sekundären Antikörpers eine Reaktion durchgeführt und die Reaktivität wird mit einem Protein überprüft, welches im Molekulargewicht mit dem gereinigten shIL-5R α übereinstimmt.
  • (6) Immunpräzipitation von shIL-5R α
  • Ein anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörper oder anti-Ratten-Immunoglobulin-Antikörper wird 10–1000-fach mit PBS oder einem anderen Puffer verdünnt. Die Verdünnungen werden in eine ELISA-Plastikplatte mit 96 Vertiefungen zu 50–200 μl/Vertiefung aufgeteilt und bei 4°C über Nacht oder bei Raumtemperatur für zumindest 2 Stunden stehen gelassen, wodurch sie an die Platte adsorbiert werden. Die Platte wird mit PBS gewaschen. PBS, das 1–10% BSA und ähnliches enthielt, wird zu 300 μl/Vertiefung auf die Platte verteilt und bei 4°C über Nacht, oder bei Raumtemperatur für zumindest 30 Minuten stehen gelassen, um Blockierung zu erreichen. Die Platte wird mit PBS gewaschen. Der Kulturüberstand des in 1 (5) erhaltenen Hybridoms oder eine Lösung des in 1 (6) erhalten gereinigten Antikörpers (0,01–50 μg/ml) wird zu 50–200 μl/Vertiefung hinzugefügt und bei 4°C über Nacht stehen gelassen, um dadurch den Antikörper an die Platte zu adsorbieren. Nachdem die Platte gewaschen wurde, wird das in 1 (1) erhaltene shIL-5R α mit PBS oder ähnlichem, das 1% BSA enthält in einer Konzentration von 0,1–100 μg/ml, verdünnt und die Verdünnungen werden zu 50–200 ul/Vertiefung aufgeteilt und anschließend bei 4°C über Nacht umgesetzt. Nachdem die Platte mit PBS, das 0,05% Tween enthält, oder ähnlichem gewaschen wurde, wird ein 1 ×–5 × Probenpuffer für SDS-PAGE zu 50–200 μl/Vertiefung aufgeteilt und bei Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten geschüttelt. Nach der optionalen Verdünnung mit PBS wird die Lösung in einer Menge von 5–25 μl zu jeder Spur hinzugefügt und einer SDS-PAGE unterzogen und anschließend durch herkömmliche Verfahren auf eine PVDF-Membran oder ähnliches übertragen. Die PVDF-Membran wird einem, wie in 5 (5) beschrieben, Western-Blot-Verfahren unterzogen und shlL-5R α wird dadurch nachgewiesen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pAGE210.
  • 2 zeigt die Restriktionskarte von Plasmid pCAGGS-h5R.25.
  • 3 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pAI234.
  • 4 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pAI230.
  • 5 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pAI282.
  • 6 zeigt Schritte für die Konstruktion der Plasmide pAI283 und pAI285.
  • 7 zeigt Schritte für die Konstruktion der Plasmide pAI284 und pAI289.
  • 8 zeigt Schritte für die Konstruktion der Plasmide pAI294 und pAI295.
  • 9 zeigt Schritte für die Konstruktion der Plasmide pAI299 und pAI301.
  • 10 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pAI292.
  • 11 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pAI297.
  • 12 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pMKex1.
  • 13 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pAI263.
  • 14 zeigt die Bindungsreaktivität der monoclonalen anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1257 und KM1259 mit einem Fusionsprotein der menschlichen IL-5R α-Kette und der konstanten Region von menschlichem Immunoglobulin in einem Enzymimmuntest.
  • 15 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSA.
  • 16 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSAE.
  • 17 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSH-S.
  • 18 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSK-H.
  • 19 zeigt Schritte für die Konstruktion der Plasmide pBSH-SA und pBSK-HA.
  • 20 zeigt Schritte für die Konstruktion der Plasmide pBSH-SAE und pBSK-HAE.
  • 21 zeigt Schritte für die Konstruktion der Plasmide pBSH-SAEE und pBSK-HAEE.
  • 22 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSK-HAEESa1.
  • 23 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSX-S.
  • 24 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSX-SA.
  • 25 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSSC.
  • 26 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSMo.
  • 27 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSMoS.
  • 28 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pChiIgLA1S.
  • 29 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pMohCK.
  • 30 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSMoSal.
  • 31 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBSMoSalS.
  • 32 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBShCγ1.
  • 33 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pMohCγ1.
  • 34 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pMoγ 1SP.
  • 35 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pMo Kγ 1SP.
  • 36 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pKANTEX93.
  • 37 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pKANTEX1259H.
  • 38 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pKANTEX1259.
  • 39 zeigt SDS-PAGE- (auf einem 4–15% Gradientengel)
  • Elektrophoresemuster des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörpers KM1399. Der linke Teil der Figur zeigt das Muster der Elektrophorese unter nicht reduzierenden Bedingungen und der rechte Teil der Figur unter reduzierenden Bedingungen. Auf der linken Seite ist M eine Spur mit Markern von hohem Molekulargewicht und 1 ist eine Spur von KM1399. Auf der rechten Seite ist M eine Spur mit Markern von niedrigem Molekulargewicht und 1 ist eine Spur von KM 1399.
  • 40 zeigt die Hemmungsaktivitäten des anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Maus-Antikörpers KM1259 und des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörpers KM1399 auf die Bindung von menschlichem IL-5 an eine menschliche IL-5 α-Kette. Die vertikale Achse der graphischen Darstellungen stellt die Hemmungsaktivität dar und die horizontale Achse die Antikörperkonzentration. bezieht sich auf die Aktivität von KM1259 und o auf die Aktivität von KM1399.
  • 41 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pT1259.
  • 42 zeigt die Ergebnisse der Bewertung der Aktivität von menschlichem chimärem anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörper auf Basis der transienten Expression unter Verwendung von Plasmid pT1259. Die vertikale Achse der graphischen Darstellung stellt die hemmende Aktivität auf die Bindung von menschlichem IL-5 an eine menschliche IL-5R α-Kette dar und die horizontale Achse stellt den Verdünnungsfaktor für den Kulturüberstand der transienten Expression dar.
  • 43 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid phKM1259HV0.
  • 44 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid phKM1259LV0.
  • 45 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pKANTEX1259HV0.
  • 46 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pKANTEX1259HV0LV0.
  • 47 zeigt SDS-PAGE-Elektrophoresemuster (auf einem 4–15% Gradientengel) von menschlichem CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörper KM8397. Der linke Teil der Figur zeigt die Elektrophoresemuster unter nicht reduzierenden Bedingungen und der rechte Teil der Figur unter reduzierenden Bedingungen. M ist eine Spur von Molekulargewichtsmarkern und 1 ist eine Spur von KM8397.
  • 48 zeigt die Aktivitäten von menschlichem chimärem anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörper KM1399 und menschlichem CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörper KM8397 in der Bindung an eine menschliche IL-5R α-Kette. Die vertikale Achse der graphischen Darstellung stellt die Aktivität der Bindung an die menschliche IL-5 α-Kette dar und die horizontale Achse eine Antikörper-Konzentration. • bezieht sich auf die Aktivität von KM1399 und o auf die Aktivität von KM8397.
  • 49 zeigt die Ergebnisse der Bewertung der Aktivitäten von verschiedenen geänderten Ausführungen der menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörper in Kulturüberständen von transienter Expression bei der Hemmung der Bindung von IL-5 an eine menschliche IL-5R α-Kette. Die vertikale Achse der graphischen Darstellung stellt die Hemmungsaktivität dar und die horizontale Achse zeigt die Namen der Proben an. Die Hemmungsaktivität ist in relativer Form dargestellt, die Aktivität des chimären Antikörpers KM1399 wird als 100 angenommen.
  • 50 zeigt die Aktivitäten von verschiedenen geänderten Ausführungsformen von menschlichen CDR-grafted Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette in der Bindung an eine menschliche IL-5R α-Kette. Die vertikale Achse jeder graphischen Darstellung stellt die Aktivitäten der Bindung an eine menschliche IL-5R α-Kette dar und die horizontale Achse die Konzentration der Antikörper. In der oberen Darstellung bezieht sich • auf die Aktivität von KM1399; o auf HV.0LV.0;
    Figure 00420001
    auf HV.2LV.0; ☐ auf HV.0LV.3; und
    Figure 00420002
    auf HV.3LV.3. In der unteren Darstellung bezieht sich • auf die Aktivität von KM1399; o auf HV.0LV.0;
    Figure 00420003
    auf HV.3LV.0; ☐ auf HV.0LV γ.4;
    Figure 00420004
    HV.1 LV.4; Δ auf HV.2LV.4; und x auf HV.3LV.4.
  • 51 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pBShC 4.
  • 52 zeigt Schritte für die Konstruktion von Plasmid pKANTEX1259 γ 4 und pKANTEX1259HV3LV0 γ 4.
  • 53 zeigt SDS-PAGE- (auf 4–15% Gradientengel) Elektrophoresemuster des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörpers KM7399 der IgG4-Subklasse menschlicher Antikörper und des menschlichen CDR-grafted Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörpers KM9399 der IgG4-Subklasse menschlicher Antikörper. Der linke Teil der Figur zeigt Elektrophoresemuster unter nicht reduzierenden Bedingungen und der rechte Teil der Figur unter reduzierenden Bedingungen. Auf der linken Seite ist M die Spur mit Markern von hohem Molekulargewicht, 1 ist eine Spur von KM9399 und 2 ist eine Spur von KM7399. Auf der rechten Seite ist M eine Spur mit Markern von niedrigem Molekulargewicht, 1 ist eine Spur von KM9399 und 2 ist eine Spur von KM7399.
  • 54 zeigt die Aktivität des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörpers KM1399 der IgG1-Subklasse menschlicher Antikörper, des menschlichen chimären Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörpers KM7399 der IgG4-Subklasse menschlicher Antikörper, des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörpers KM8399 der IgG1-Subklasse menschlicher Antikörper und des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Ketten-Antikörpers KM9399 der IgG4-Subklasse menschlicher Antikörper bei der Bindung an eine menschliche IL-5R α-Kette. Die vertikale Achse der graphischen Darstellung stellt die Aktivität der Bindung an die menschliche IL-5R α-Kette dar und die horizontale Achse die Antikörperkonzentration. o bezieht sich auf die Aktivität von KM1399; • auf KM7399; ☐ auf KM8399 und
    Figure 00430001
    auf KM9399.
  • 55 zeigt die Ergebnisse der durchflusscytometrischen Analysen der Reaktionsfähigkeiten der monoclonalen anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1257, KM1259, KM1486, KM1399, KM7399, KM8399 und KM9399 mit einer CTLL-2-Zelle, die mit dem humanen IL-5R-Gen transfiziert ist.
  • 56 zeigt die Ergebnisse der Untersuchungen der hemmenden Aktivität der monoclonalen anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1257, KM1259, KM1486, KM1399, KM7399, KM8399 und KM9399 auf IL-5-abhängiges Wachstum einer CTLL-2 Zelle, die mit dem humanen IL-5R-Gen transfiziert ist.
  • 57 zeigt die Ergebnisse der durchflusscytometrischen Analysen der Reaktionsfähigkeiten des monoclonalen anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1259 mit menschlichen Eosinophilen.
  • 58 zeigt die Ergebnisse der Untersuchungen der hemmenden Aktivität der monoclonalen anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1257, KM1259, KM1486, KM1399, KM7399, KM839 und KM9399 auf das Überleben von menschlichen Eosinophilen.
  • 59 zeigt die Ergebnisse der Bewertung eines quantitativen Bestimmungssystems für löslichen menschlichen IL-5R α unter Verwendung des mit Biotin markierten monoclonalen anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1259.
  • 60 zeigt die Ergebnisse des Nachweises von shIL-5R α durch Western Blot-Analyse unter Verwendung der monoclonalen anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1257, KM1259 und KM1486.
  • 61 zeigt die Ergebnisse der Immunopräzipitation von shIL-5R α unter Verwendung der monoclonalen anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1257, KM1259 und KM1486.
  • Bestes Verfahren zur Durchführung der Erfindung
  • BEISPIEL 1
  • 1. Herstellung von Antigenen
  • (1) Konstruktion des Expressionsvektors pAGE210 für tierische Zellen
  • Der Expressionsvektor für tierische Zellen pAGE210 wurde, wie nachstehend beschrieben, unter Verwendung der Expressionsvektoren für tierische Zellen pAGE207 (Kokai Nr. 46841/94) und pAGE148 (Kokai Nr. 205694/94) konstruiert.
  • Drei μg von Plasmid pAGE207 und pAGE148 wurden in 30 μl eines Puffers aufgelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM Dithiothreit (nachstehend als „DTT" bezeichnet) enthielt. Zu dem sich daraus ergebenden Gemisch wurden jeweils 10 Einheiten von ClaI und KpnI (beide hergestellt von Takara Shuzo; sofern nicht anders angegeben waren die hier nachstehend angeführten verwendeten Restriktionsenzyme von Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Nachdem das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen worden war, wurden etwa 0,5 μg eines 4,7 kb DNA-Fragments von pAGE207 gewonnen, welches den frühen Promotor und Enhancer von SV40 (nachstehend als PSE'' bezeichnet), ein Hygromycin-Restistenzgen und ein Ampicillin-Resistenzgen enthielt, und etwa 0,5 μg eines 4,3 kb DNA-Fragments, welches ein Dihydrofolat-Reduktase-Gen (nachstehend als „dhfr" bezeichnet) enthielt, wurde von pAGE148 wiedergewonnen.
  • Das von pAGE207 (50 ng) gewonnene ClaI-KpnI-Fragment und das von pAGE148 (50 ng) gewonnene KpnI-ClaI-Fragment wurden in 20 μl T4DNA-Ligasepuffer [(ein Puffer, der 66 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 6,6 mM Magnesiumchlorid, 10 mM DTT und 0,1 mM Adenosin-Triphosphat (nachstehend als „ATP" bezeichnet)] aufgelöst. Zu dem sich daraus ergebenden Gemisch wurden 200 Einheiten T4DNA-Ligase (Takara Shuzo) hinzugefügt und die Ligierung wurde bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 1 gezeigte Plasmid pAGE210 zu erhalten.
  • (2) Einfügen von shIL-5R α-cDNA in eine Kassette zur Konstruktion eines shIL-5R α-Expressionsvektors
  • Um einen shIL-5R α-Expressionsvektor zu konstruieren, wurde eine Änderung der 5'- und 3'- nicht-translatierten Region von shIL-5R α-cDNA und die Einführung einer Restriktionsenzym-Erkennungssequenz unter Verwendung des PCR-Verfahrens [Maniatis et. al. (Herausgeber), Molecular Cloning, 14.2, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] in Übereinstimmung mit den nachstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt.
  • Das Plasmid pCAGGS-h5R.25 wird, wie in 2 gezeigt [J. Exp. Med., 175, 341 (1992)], durch Insertion der shIL-5R α-cDNA in das bekannte Plasmid pCAGGS [Gene, 108, 193 (1991)] erhalten. Drei μg dieses pCAGGS-h5R.25 wurden zu 30 μl Puffer hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt. Dann wurden dazu 10 Einheiten EcoRI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Nachdem das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen worden war, wurden etwa 0,3 μg eines 1,4 kb-DNA-Fragments gewonnen, das shIL-5R α-cDNA enthielt.
  • Dann wurde 1 ng des vorstehend erhaltenen DNA-Fragments in 50 μl PCR-Puffer aufgelöst [ein Puffer, der 50 mM Kaliumchlorid, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,2 mM Desoxyadenosin-Triphosphat (nachstehend als „dATP" bezeichnet), 0,2 mM Desoxyguanosin-Triphosphat (nachstehen als „dGTP" bezeichnet), 0,2 mM Desoxycytosin-Triphosphat (nachstehen als „dCTP" bezeichnet) und 0,2 mM Desoxythymidin-Triphosphat (nachstehen als „dTTP" bezeichnet) enthielt]. Zu dem sich daraus ergebenden Gemisch wurden jeweils 50 pMol von synthetischer DNA, welche die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Basensequenz hatte, und eine synthetische DNA, welche die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Basensequenz hatte [beide wurden mit einem automatischen DNA-Synthesegerät; Modell 380A (Applied Biosystems Co., Ltd.) erzeugt] und 1,6 Einheiten Vent DNA-Polymerase (New England BioLabs, Inc.) hinzugefügt und eine PCR wurde für 30 Zyklen gemäß einer Serie von Bedingungen von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten unter Verwendung eines Perkin Elmer DNA-Thermocyclers (dieser wurde auch für andere PCR-Reaktionen verwendet) durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurden 2 μl eines Puffers, der 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Magnesiumchlorid, 500 mM Natriumchlorid und 10 mM DTT enthielt, 8 μl destilliertes Wasser und 10 Einheiten HindIII zu 10 μl des Reaktionsgemischs hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Dann wurden die DNA-Fragmente vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation [Maniatis et. al. (Herausgeber), Molecular Cloning, E.10, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] gewonnen und wieder in 20 μl eines Puffers, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, aufgelöst. Zu dem sich daraus ergebenden Gemisch wurden 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Nachdem das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen worden war, wurden etwa 0,3 μg eines 1,0 kb-DNA-Fragments gewonnen.
  • In einem gesonderten Schritt wurden 3 μg des Plasmids pUC19 (Pharmacia Biotech) in 30 μl eines Puffers aufgelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten HindIII zugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Danach wurden die DNA-Fragmente vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und wieder in 30 μl eines Puffers aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt. Zu dem sich daraus ergebenden Gemisch wurden 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Danach wurde das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 0,5 μg des HindIII/BamHI-Fragments von pUC19 wurden wiedergewonnen.
  • 100 ng des HindIII/BamHI-Fragments von pUC19 und 50 ng des shIL-5R α-cDNA-Fragments wurden in 20 μl T4-DNA-Ligasepuffer aufgelöst, zu dem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Dann wurde die Ligierung bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 3 gezeigte Plasmid pAI234 zu erhalten.
  • (3) Konstruktion eines menschlichen löslichen IL-5R α-Expressionsvektors
  • Ein shIL-5R α-Expressionsvektor pAI230 wurde, wie nachstehend beschrieben, durch Ligierung des in Unterabschnitt (1) von Beispiel 1 erhaltenen HindIII-BamHI-Fragments von pAGE210 an das in Unterabschnitt (2) von Beispiel 1 erhaltene HindIII-BamHI-Fragment von pAI234, welches die cDNA von shIL-5R α enthielt, konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden 3 μg von pAGE210 zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten HindIII hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. DNA-Fragmente wurden von dem Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und wieder in 30 μl eines Puffers aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8.5), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Danach wurde das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und es wurden etwa 0,5 μg eines 9,0 kb-DNA-Fragments gewonnen.
  • Drei μg pAI234 wurden zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7.5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten HindIII hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. DNA-Fragmente wurden von das Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und in 30 μl eines Puffers wieder aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8.5), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Danach wurde das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 0,3 μg eines 1,0-kb DNA-Fragments wurden gewonnen.
  • Anschließend wurden 300 ng des HindIII-BamHI-Fragments von pAGE210 und 50 ng des HindIII-BamHI-Fragments von pAI234 in 20 μl T4-DNA-Ligasepuffer aufgelöst, zu dem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Dann wurde die Ligierung bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 4 gezeigte Plasmid pAI230 zu erhalten.
  • (4) Änderung der Signalsequenz
  • Um shIL-5R α effizient in tierischen Zellen herzustellen, wurde die Signalsequenz der für shIL-5R α codierenden cDNA in Übereinstimmung mit den nachstehend beschriebenen Verfahren durch Einführung einer EcoRV- Erkennungsstelle in die cDNA am 3'--Ende der Signalsequenz und anschließendem Austausch der ursprünglichen Signalsequenz mit einer Signalsequenz eines menschlichen Wachstumshormon [Science, 205, 602 (1979)] oder des chimären anti-Gangliosid-CD3 Antikörpers KM871 (Kokai Nr. Hei 5-304989) unter Verwendung von synthetischen DNAs geändert.
  • Kurz gesagt wurden 3 μg des im Unterabschnitt (2) von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pAI234 zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten HindIII hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und wieder in 30 μl eines Puffers aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8.5), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Danach wurde das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 0,3 μg eines 1,0 kb-DNA-Fragments wurden gewonnen.
  • In einem gesonderten Schritt wurden 3 μg des Plasmids pUC19 zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, dazu wurden 10 Einheiten HincII hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Danach wurden DNA-Fragmente vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und etwa 0,5 μg des HincII-Fragments von pUC19 wurden gewonnen.
  • Etwa 1 ng des vorstehend erhaltenen DNA-Fragments wurde in 50 μl PCR-Puffer aufgelöst, zu welchem jeweils 50 pMol einer synthetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Basensequenz hat, und einer sythetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 3 gezeigte Basensequenz, hat und 1,6 Einheiten von Vent-DNA-Polymerase hinzugefügt wurden. PCR wurde dann für 30 Zyklen gemäß einer Serie von Bedingungen von 94°C für 1 Minute, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und 0,5 μg eines etwa 0,9 kb-cDNA-Fragments wurde gewonnen, welches für einen Teil von hIL-5R α codiert. 50 ng dieser DNA und 100 ng des HincII-Fragments von pUC19 wurden in 20 μl T4-DNA-Ligasepuffer aufgelöst, zu dem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Die Ligierung wurde dann bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 5 gezeigte Plasmid pAI280 zu erhalten. Drei μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pAI280 wurden zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten Xbal hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und wieder in 30 μl eines Puffers aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8.5), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Danach wurde das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 0,8 μg eines 2,8 kb-DNA-Fragments wurden gewonnen.
  • In einem gesonderten Schritt wurden 3 μg des Plasmids pAI234 zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten Xbal hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und in 30 μl einer Puffers wieder aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Nachdem das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen worden war, wurden etwa 0,2 μg eines 0,8 kb-DNA-Fragments gewonnen.
  • Anschließend wurden 200 ng des Xbal-BamHI-Fragments von pAI280 und 50 ng des Xbal-BamHI-Fragments von pAI234 in 20 μl T4-Ligasepuffer aufgelöst, zu welchem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Die Ligierung wurde dann bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten Plasmid-DNA wurde der E. coli Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 5 gezeigte Plasmid pAI282 zu erhalten. Drei μg des Plasmids pAI282 wurden zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten EcoRV hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Die DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und in 30 μl eines Puffers wieder aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Nachdem das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen wurde, wurden etwa 0,3 μg eines 0,9 kb DNA-Fragments gewonnen.
  • Jeweils ein μg einer synthetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Basensequenz hat, und einer sythetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 5 gezeigte Basensequenz hat, wurden in 10 μl destilliertem Wasser aufgelöst. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde für 5 Minuten auf 95°C erhitzt und dann über 30 Minuten zur Annelierung, auf Raumtemperatur abgekühlt. 100 ng des in Unterabschnitt (2) von Beispiel 1 erhalten HindIII-BamHI-Fragments von pUC19, 50 ng des EcoRV-BamHI-Fragments von pAI282 und 50 ng der synthetischen DNAs, welche die in SEQ ID NO. 4 und 5 gezeigten Basensequenzen haben, die, wie vorstehend beschrieben, anneliert wurden, wurden in 20 μl T4-DNA-Ligasepuffer gelöst, zu welchem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Die Ligierung wurde dann bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli-Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 6 gezeigte Plasmid pAI283 zu erhalten.
  • Ein μg einer synthetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 6 gezeigte Basensequenz, hat und einer sythetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 9 gezeigte Basensequenz hat, wurden in 10 μl destilliertem Wasser aufgelöst. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde für 5 Minuten auf 95°C erhitzt und dann über 30 Minuten zur Annelierung auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 2,5 μl eines Puffers, der 500 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT und 1 mM EDTA enthielt, 2,5 μl einer 10 mM ATP-Lösung, 9 μl destilliertes Wasser und 5 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (Takara Shuzo) hinzugefügt und die Phosphorylierung wurde bei 37°C für 2 Stunden durchgeführt. Jeweils 1 μg einer synthetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 7 gezeigte Basensequenz hat, und einer synthetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 8 gezeigte Basensequenz hat, wurden gesondert in 10 μl destilliertem Wasser aufgelöst. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde für 5 Minuten auf 95°C erhitzt und dann über 30 Minuten zur Annelierung auf Raumtemperatur abgekühlt.
  • 100 ng des HindIII-BamHI-Fragments von pUC19, 50 ng des EcoRV-BamHI-Fragments von pAI282 und jeweils 50 ng der wie vorstehend erzeugten synthetischen DNAs wurden in 20 μl T4-DNA-Ligasepuffer aufgelöst, zu welchem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Die Ligierung wurde dann bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli-Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 6 gezeigte Plasmid pAI285 zu erhalten.
  • (5) Konstruktion von shIL-5R α-Expressionsvektoren, deren Signalsequenz verändert ist
  • Die Expressionsvektoren pAI284 und pAI289 für menschlichen löslichen IL-5R α wurden, wie nachstehend beschrieben, durch Ligierung des in Unterabschnitt (1) von Beispiel 1 erhaltenen HindIII-BamHI-Fragments von pAGE210 an das HindIII-BamHI-Fragment, welches erhaltene menschliche lösliche IL-5R α-cDNA von pAI283 und pAI285 enthielt, erhalten in Unterabschnitt (4) von Beispiel 1, konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden jeweils 3 μg pAI283 und pAI285 gesondert zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten HindIII hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Die DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und wieder in 30 μl eines Puffers aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Nachdem das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen worden war, wurden für jedes der verwendeten Plasmide etwa 0,3 μg eines 1,0 kb-DNA-Fragment gewonnen.
  • 300 ng des HindIII-BamHI-Fragments von pAGE210 und 50 ng des HindIII-BamHI-Fragments von pAI283 oder pAI285 wurden in 20 μl T4-DNA-Ligasepuffer aufgelöst, zu welchem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Die Ligierung wurde dann bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli-Stamm JM109 transformiert, um dadurch die in 7 gezeigten Plasmide pAI284 und pAI289 zu erhalten.
  • (6) Herstellung eines Fusionsproteins, bestehend aus menschlichem IL-5R α und der konstanten Region von menschlichem Immunglobulin
  • Ein Fusionsprotein, in dem die extrazelluläre Region von menschlichem IL-5R α mit der konstanten Region von menschlichem Immunglobulin (nachstehend als „Fc" bezeichnet) durch einen Linker verbunden war, der eine Aminosäuresequenz von (Gly-Ser-Gly)4 (nachstehen wird dieses Fusionsprotein als „hIL-5R α-Fc" bezeichnet) aufweist, wurde gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt.
  • Als eine cDNA, die für die konstante Region von menschlichem Immunoglobulin codiert, wurde der Anteil des menschlichen chimären Antikörper H-Ketten Expressionsvektor pChilgHB2 (Kokai Nr. Hei 5-304989) verwendet, der für die konstante Region von menschlichem IgG1 codiert. Zuerst wurde etwa 1 ng pChilgHB2 in 50 μl PCR-Puffer aufgelöst. Zu dieser Lösung wurden jeweils 50 pMol einer synthetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 10 gezeigte Basensequenz hat, und einer synthetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 11 gezeigte Basensequenz hat, und 1,6 Einheiten Vent-DNA-Polymerase hinzugefügt. PCR wurde dann für 30 Zyklen gemäß einer Serie von Bedingungen von 94°C für 1 Minute, 48°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurden 2,5 μl eines Puffer, der 200 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 100 mM Magnesiumchlorid, 1000 mM Kaliumchlorid und 10 mM enthielt, 2,5 μl destilliertes Wasser und 10 Einheiten BamHI zu 20 μl des Reaktionsgemischs hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 0,5 μg eines 0,7 kb-DNA-Fragments wurden gewonnen, welches die cDNA enthielt, die für die konstante Region des menschlichen IgG1 codiert.
  • Etwa 1 ng des in Unterabschnitt (4) von Beispiel 1 erhaltenen pAI283 wurde in 50 μl PCR-Puffer aufgelöst, zu welchem jeweils 50 pMol einer synthetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 12 gezeigte Basensequenz hat, und einer synthetischen DNA, welche die in SEQ ID NO: 13 gezeigte Basensequenz hat, und 1,6 Einheiten Vent-DNA-Polymerase hinzugefügt wurden. PCR wurde dann für 30 Zyklen gemäß einer Serie von Bedingungen von 94°C für 1 Minute, 48°C für 2 Minuten und 72°C für 3 Minuten durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurden 2,5 μl Puffer, der 100 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Magnesiumchlorid, 500 mM Natriumchlorid und 10 mM DTT enthielt, 2,5 μl destilliertes Wasser und 10 Einheiten HindIII zu 20 μl des Reaktionsgemischs hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Danach wurden etwa 0,5 μg eines 1,0 kb-DNA-Fragments gewonnen, das eine cDNA enthielt, die für die extrazelluläre Region von hIL-5R α codiert.
  • 50 ng des 0,7 kb-DNA-Fragments, welches die cDNA enthielt, die für die konstante Region des menschlichen IgG1 codiert, 50 ng des DNA-Fragments, welches die cDNA enthielt, die für die extrazelluläre Region von hIL-5R α codiert und 100 ng des HindIII-BamHI-Fragments von pUC19 wurden in 20 μl T4-DNA-Ligasepuffer aufgelöst, zu welchem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Die Ligierung wurde dann bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli-Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 8 gezeigte Plasmid pAI294 zu erhalten.
  • In einem gesonderten Schritt wurde die PCR-Reaktion unter ähnlichen Bedingungen wie denen, die vorstehend beschrieben wurden, unter Verwendung des in Unterabschnitt (4) von Beispiel 1 erhaltenen pAI285 als Matrize und auch unter Verwendung synthetischer DNAs als Primer, welche die in SEQ ID NO: 13 und 14 gezeigten Basensequenzen haben, ausgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Anschließend wurden etwa 0,5 μg eines 1,0 kb-Fragments gewonnen, welches die cDNA enthielt, die für die extrazelluläre Region des menschlichen IL-5R α codiert. 50 ng des auf diese Weise erhaltenen DNA-Fragments, 50 ng des 0,7 kb-DNA-Fragments, welches die cDNA enthielt, die für die konstante Region des menschlichen IgG1 codiert, und 100 ng des HindIII-BamHI-Fragments von pUC19 wurden in 20 μl T4-DNA-Ligasepuffer aufgelöst, zu welchem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Die Ligierung wurde dann bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli-Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 8 gezeigte Plasmid pAI295 zu erhalten.
  • (7) Konstruktion eines Fusionsprotein-Expressionsvektors
  • Ein hIL-5R α-Fc-Expressionsvektor, pAI299, wurde, wie nachstehend beschrieben, durch Ligierung des in Unterabschnitt (1) von Beispiel 1 erhaltenen HindIII-BamHI-Fragments von pAGE210 an das HindIII-BamHI-Fragment von pAI294, welches in Unterabschnitt (6) von Beispiel 1 erhalten wurde und die cDNA enthielt, die hIL-5R α-Fc codiert, konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden 3 μg des Plasmids pAI294 zu 30 μl eines Puffer hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten HindIII hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Die DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und in 30 μl eines Puffers wieder aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt. Zu dem sich daraus ergebenden Gemisch wurden 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Danach wurde das Reaktionsgemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 0,4 μg eines 1,7 kb-DNA-Fragments wurden gewonnen, das eine cDNA enthielt, die ein Fusionsprotein codiert, das aus menschlichem IL-5R α und der konstanten Region des menschlichen Immunglobulins besteht.
  • 100 ng des HindIII-BamHI-Fragments von pAGE210 und 50 ng des HindIII-BamHI-Fragments von pAI294 wurden in 20 μl T4-DNA-Ligasepuffer aufgelöst, zu welchem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Die Ligierung wurde dann bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli-Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 9 gezeigte Plasmid pAI299 zu erhalten.
  • Weiters wurde ein hIL-5R α-Fc-Expressionsvektor, pAI301, durch Ligierung des HindIII-BamHI-Fragments von pAGE210 an das HindIII-BamHI-Fragment von pAI295, welches in Unterabschnitt (6) von Beispiel 1 erhalten wurde und die cDNA enthielt, die hIL-5R α-Fc codiert, auf ähnliche Weise konstruiert.
  • (8) Erzeugung von rekombinantem Virus zur Expression von shIL-5R α in Insektenzellen
  • Für die Herstellung eines Proteins in Insektenzellen wird ein rekombinantes Virus erzeugt, in welchem ein Gen von Interesse inseriert ist. Die Erzeugung eines solchen Virus wird durch ein Verfahren, in welchem cDNA, die ein Gen von Interesse codiert, in ein spezielles Plasmid, das als „ein Transfervektor" bezeichnet wird, inkorporiert wird, und ein anschließendes Verfahren durchgeführt in dem ein Wildtyp-Virus und der Transfervektor in eine Insektenzelle co-transfiziert werden, um durch homologe Rekombination ein rekombinantes Virus zu erhalten. Die vorstehend beschriebenen Verfahren werden unter Verwendung eines BaculoGold Starter Kit (Kat. Nr. PM-21001K), hergestellt von Pharmigen, in Übereinstimmung mit dem Handbuch des Herstellers durchgeführt.
  • Kurz gesagt werden 3 μg des in Unterabschnitt (4) von Beispiel 1 erhaltenen pAI285 und des in Unterabschnitt (6) von Beispiel 1 erhalten pAI294 zu 30 μl einen Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten HindIII hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Die DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und in 20 μl DNA-Polymerase I-Puffer aufgelöst [ein Puffer, der 5 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM Magnesiumsulfat, 0,01 mM DTT, 5 μg/ml Rinderserumalbumin, 0,08 mM ATP, 0,08 mM GTP, 0,08 mM CTP und 0,08 mM TTP enthielt]. Zu dem sich daraus ergebenden Gemisch wurden 5 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 22°C für 30 Minuten umgesetzt, wobei die durch den Verdau mit HindIII erzeugten 5'-überhängenden Enden in glatte Enden umgewandelt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde weiters einer Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation, unterzogen. Zu dem Niederschlag wurden 30 μl eines Puffers, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, und 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 0,3 μg eines etwa 1,0 kb-DNA-Fragments, welches eine cDNA enthielt, die shIL-5R α codiert, und etwa 0,3 μg eines 1,7 kb-DNA-Fragments, welches eine cDNA enthielt, die ein Fusionsprotein codiert, das aus menschlichem IL-5R α und der konstanten Region des menschlichen Immunglobulins besteht, wurden gewonnen.
  • Anschließend wurden 3 μg des im BaculoGold Starter Kit (Pharmigen) enthalten Plasmids pVL1393 zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten EcoRI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Die DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und in 20 μl DNA-Polymerase I Puffer aufgelöst, zu welchem 5 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 22°C für 30 Minuten umgesetzt wurden, wobei die durch Verdau mit EcoRI erzeugten 5'-überhängenden Enden in glatte Enden umgewandelt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde weiters einer Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation, unterzogen. Zu dem Niederschlag wurden 30 μl eines Puffers, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enhielt, und 10 Einheiten BglII hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Das REaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 0,9 μg eines etwa 9,6 kb-DNA-Fragments wurden gewonnen.
  • Danach wurden 200 ng des auf diese Weise erhaltenen EcoRI (glatte Enden)-BglII-Fragments von pVL1393 und 50 ng des HindIII (glatte Enden)-BamHI-Fragments von pAI285 oder pAI294 in 20 μl T4-DNA-Ligasepuffer aufgelöst, zu welchem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Die Ligierung wurde dann bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli-Stamm JM109 transformiert, um dadurch die in 10 und 11 gezeigten Plasmide pAI292 bzw. pAI297 zu erhalten.
  • Die anschließende Erzeugung von rekombinantem Virus wurde, wie nachstehend beschrieben, durch Transfektion einer linearen Baculovirus-DNA (BaculoGold Baculovirus DNA; Pharmigen) und der erzeugten Transfervektor-DNA mittels des Lipofectin-Verfahrens [TANPAKUSHITSU, KAKUSAN, KOHSO, (Protein, Nucleic Acid, Enzyme), 37, 2701 (1992)] in eine Sf9-Insektenzelle (erhalten von Pharmigen) durchgeführt, die in TMN-FH-Medium (Pharmigen) gezüchtet wurde.
  • Kurz gesagt wurde 1 μg pAI292 oder pAI297 und 20 ng der linearen Baculovirus-DNA in 12 μl destilliertem Wasser aufgelöst, zu welchem ein Gemisch aus 6 μl Lipofectin und 6 μl destilliertem Wasser hinzugefügt wurde und bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehen gelassen wurde. In einem gesonderten Schritt wurden 1 × 105 Sf9-Zellen in 2 ml Sf900-II-Medium (Gibco) suspendiert und in eine Zellkulturschale aus Plastik mit 35 mm Durchmesser gegeben. Zu dieser Schale wurde ein Gesamtvolumen des vorstehend beschriebenen Gemischs von Plasmid- DNA, linearer Baculovirus-DNA und Lipofectin hinzugefügt und die Zellen wurden bei 27°C für 3 Tage gezüchtet. Danach wurde 1 ml des Kulturüberstands, der ein rekombinantes Virus enthielt, entnommen. Ein ml frisches Sf900-II-Medium wurde zu der Schale hinzugefügt und die Zellen wurden bei 27°C nochmals für 3 Tage gezüchtet. Dann wurden zusätzliche 1,5 ml des Kulturüberstands, der das rekombinante Virus enthielt, erhalten.
  • Anschließend wurde das auf diese Weise erhaltene Virus zwecks Verwendung in der Proteinexpression entsprechend den nachstehen beschriebenen Verfahren vermehrt.
  • Kurz gesagt wurden 2 × 107 Sf9-Zellen in 10 ml Sf900-II-Medium suspendiert, in eine 175 cm2-Flasche (Greiner) gegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde stehengelassen, um den Zellen zu ermöglichen an der Flasche anzuwachsen. Danach wurde der Überstand entfernt und 15 ml frisches TMN-FH-Insektenmedium und 1 ml des vorstehend erhaltenen Kulturüberstands, welcher das rekombinante Virus enthielt, wurden zu der Flasche hinzugefügt. Dann wurden die Zellen bei 27°C für 3 Tage gezüchtet. Nach der Züchtung wurde der Kulturüberstand bei 1.500 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Auf diese Weise wurde eine virale Lösung zu Verwendung in der Proteinexpression erhalten.
  • Was die auf diese Weise erhaltene Lösung von rekombinantem Virus betrifft, wurde der virale Titer mittels des nachstehend beschriebenen Verfahrens berechnet (BaculoGold Starter Kit-Handbuch; Pharmigen). Eine Anzahl (6 × 106) an Sf9-Zellen wurde in 4 ml Sf900-II-Medium suspendiert, in eine Zellkulturschale aus Plastik mit einem Durchmesser von 60 mm gegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde stehengelassen, um den Zellen zu ermöglichen, an der Flasche anzuwachsen. Nach der Entfernung des Überstands wurden 400 μl frisches Sf9-II-Medium und die vorstehend beschriebene rekombinante Viruslösung, welche 10.000-fach mit Sf9-II-Medium verdünnt war, zu der Schale hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde stehen gelassen. Das Medium wurde dann entfernt und 5 ml Medium, welches 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Agarplaque Agarose; Pharmigen) enthielt (ein Medium, das durch Mischen von 1 ml sterilisierter wässeriger 5% Agarplaqueplus-Agarose-Lösung mit 4 ml TMN-FH-Insektenmedium und durch Aufbewahren der Lösung auf 42°C erhalten werden kann), wurde in eine Schale gegossen. Danach wurde die Schale bei Raumtemperatur für 15 Minuten stehen gelassen, ein Vinylstreifen wurde um die Schale gewickelt, um Austrocknen zu vermeiden. Die Schale wurde dann in einen luftdichten Plastikbehälter gegeben und die Zellen wurden bei 27°C für 6 Tage gezüchtet. Danach wurde 1 ml PBS, welches 0,01% Neutralrot enthielt, zu der Schale hinzugefügt und die Zellen wurden für einen weiteren Tag gezüchtet; die Anzahl der entstandenen Plaques wurde gezählt. Von den vorstehend beschriebenen Arbeitsgängen wurde beobachtet, dass jede der rekombinanten Viruslösungen etwa 1 × 107 Plaque-bildende-Einheiten (PBE)/ml an Virus enthielt.
  • (9) Expression von shIL-5R α oder hIL-5R α-Fc in tierischen Zellen
  • Die Einführung eines Plasmids in tierische Zellen wurde entsprechend dem Verfahren von Miyaji et al. unter Verwendung von Elektroporation [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] durchgeführt.
  • Kurz gesagt wurden 4 μg des in Unterabschnitt (5) von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pAI289 oder des in Unterabschnitt (7) von Beispiel 1 erhaltenen Plasmids pAI301 in 4 × 106 CHO-Zellen transfiziert, denen das dhfr-Gen fehlte [Proc. Natl. Acad. Sci., 77, 4216 (1980)] und die dann in 40 ml RPMI1640-FCS (10) suspendiert wurden [RPMI1640-Medium enthielt 10% FCS, 1/40 Volumen 7,5% NaHCO3, 3% 200 mM L-Glutaminlösung (Gibco) und 0,5% Penicillin/Streptomycin-Lösung (Gibco; die 5000 Einheiten/ml Penicillin und 5000 μg/ml Streptomycin enthielt); hergestellt von Nissui Pharmaceuticals] und in eine Microtiterplatte mit 96 Vertiefungen (200 μl/Vertiefung) aufgeteilt wurden. Nachdem die Zellen in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 24 Stunden gezüchtet worden waren, wurde Hygromycin (Gibco) hinzugefügt, um eine Konzentration von 0,5 mg/ml zu ergeben. Die Zellen wurden dann für weitere 1–2 Wochen gezüchtet. Die Zellen wurden von jenen Vertiefungen gewonnen, welche mit dem Erscheinen von Kolonien des Transformante konfluent wurden, und in RPMI1640-FCS (10)-Medium suspendiert, welches 0,5 mg/ml Hygromycin und 50 nM Methotrexat (nachstehend als „MTX" bezeichnet) enthielt, um eine Zelldichte von 1–2 × 105 Zellen/ml zu ergeben. Die Zelllösung wurde in eine Platte mit 24 Vertiefungen (2 ml/Vertiefung) aufgeteilt und die Zellen wurden in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 1–2 Wochen gezüchtet, um dadurch Clone zu induzieren, die gegen 50 nM MTX resistent sind.
  • Die auf diese Weise erhaltenen gegen 50 nM MTX resistenten Clone wurden in RPMI1640-FCS(10)-Medium suspendiert, welches 0,5 mg/ml Hygromycin und 200 nM MTX enthielt, um eine Zelldichte von 1–2 × 105 Zellen/ml zu ergeben. Die Zelllösung wurde in eine Platte mit 24 Vertiefungen (2 ml/Vertiefung) aufgeteilt und die Zellen wurden in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 1–2 Wochen gezüchtet, um dadurch Clone zu induzieren, die gegen 200 nM MTX resistent sind.
  • Weiter wurden die auf diese Weise erhaltenen 200 nM MTX-resistenten Clone in RPMI1640-FCS(10)-Medium suspendiert, das 0,5 mg/ml Hygromycin und 500 nM MTX enthielt, um eine Zelldichte von 1–2 × 105 Zellen/ml zu ergeben. Die Zelllösung wurde in eine Platte mit 24 Vertiefungen (2 ml/Vertiefung) aufgeteilt und die Zellen wurden in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 1–2 Wochen gezüchtet, um dadurch Clone zu induzieren, die gegen 500 nM MTX resistent sind.
  • Die vorstehend erwähnten Transformanten wurden in einem serumfreien Medium für CHO-Zellen, CHO-S-SFMII-Medium (Gibco), suspendiert, um eine Zelldichte von 1–2 × 105 Zellen/ml zu ergeben und die Zellsuspension wurde in 225 cm2-Flaschen (Greiner) in einer Menge von 100 ml/Flasche aufgeteilt. Die Zellen wurden in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 5–7 Tage gezüchtet und das Kulturmedium wurde gewonnen, als Konfluenz erreicht war.
  • Die Reinigung von hIL-5R α vom Kulturüberstand wurde wie folgt durchgeführt. Zu 1 Liter Kulturmedium der von pAI289 abgeleiteten Transformante wurden 29,2 g Natriumchlorid und 20 ml 1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,4) hinzugefügt. Der pH-Wert des sich daraus ergebenden Gemisches wurde mit 1 N Natriumhydroxydlösung auf 7,4 eingestellt. Eine Säule wurde mit etwa 10 ml Concanavalin A-Sepharose-Gel (Pharmacia) bepackt und dann mit 50 ml Puffer mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min gewaschen, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) und 0,5 M Natriumchlorid enthielt. Nach dem Waschen wurde das, wie vorstehend beschrieben, hergestellte Gemisch, welches shIL-5R α enthielt, bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min auf eine Concanavalin A-Sepharose-Säule aufgetragen. Die Säule wurde dann mit 80 ml eines Puffers, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) und 0,5 M Natriumchlorid enthielt, bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min gewaschen. Danach wurde das an die Concanavalin A-Sepharose-Säule gebundene Protein eluiert und gleichzeitig wurde das Eluat mit 15 ml eines Puffers, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) und 0,5 M Natriumchlorid enthielt, und 15 ml eines Puffers, der 0,5 M α-Methylmannosid, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) und 0,5 M Natriumchlorid enthielt, durch lineare Veränderung der α-Methylmannosid Konzentration von 0 zu 0,5 M in 1 ml-Anteile fraktioniert (Anteile 1–30). Ferner wurden 20 ml eines Puffer, der 1 M α-Methylmannosid, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) und 0,5 M Natriumchlorid enthielt, auf die Säule aufgetragen und das Eluat wurde in 2 ml-Anteile fraktioniert (Anteile 31–40). Die Proteinkonzentration von jedem Anteil wurde unter Verwendung eines Proteinkonzentration-Messkits (Bio-Rad) gemessen und die Fraktionen 10–40, die eine hohe Proteinkonzentration hatten, wurden gewonnen. Die sich daraus ergebende Proteinlösung wurde unter Verwendung von Centricon-30 (Amicon) um etwa einen Faktor 10 konzentriert, in einen Dialyseschlauch gefüllt und gegen PBS dialysiert. Auf diese Weise wurde gereinigter shIL-5R α (Proteinkonzentration: 4 mg/ml; 3,5 ml) erhalten.
  • In einem gesonderten Schritt wurde hIL-5R α-Fc wie folgt gewonnen. Eine Säule wurde mit etwa 5 ml Protein A-Sepharosegel bepackt und dann mit 50 ml PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurde 1 Liter des vorstehend beschriebenen Kulturmediums der Transformanten, die von pAI301 abstammten, auf eine Protein A-Sepharose-Säule bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min aufgetragen. Die Säule wurde dann mit 50 ml PBS gewaschen. Danach wurden 20 ml 0,1 M Citratpuffer (pH-Wert 3,0) auf die Säule aufgetragen, um dadurch das an die Protein-A-Sepharose gebundene Protein zu eluieren und gleichzeitig das Eluat in 1 ml-Anteile zu fraktionieren. Zu jedem der Anteile wurden 0,15 ml 2 M Tris-HCl (pH-Wert 9,0) zur Einstellung des pH-Wertes hinzugefügt. Die Proteinkonzentration von jedem Anteil wurde unter Verwendung eines Proteinkonzentration-Messkits (Bio-Rad) gemessen und jene Fraktionen, die eine hohe Proteinkonzentration hatten, wurden gewonnen. Die sich daraus ergebende Proteinlösung wurde in einen Dialyseschlauch gefüllt und gegen PBS dialysiert. Auf diese Weise wurde ein gereinigtes hIL-5R α-Fc (Proteinkonzentration: 1,8 mg/ml; 5,5 ml) erhalten.
  • (10) Expression von shIL-5R α oder hIL-5R α-Fc in Insektenzellen
  • Die Expression von shIL-5R α oder hIL-5R α-Fc wurde in Übereinstimmung mit dem Handbuch, welches dem BaculoGold Starter Kit (Pharmigen) beigefügt ist, durch nachstehend beschriebene Verfahren durchgeführt.
  • Die Gewinnung von shIL-5R α oder hIL-5R α-Fc aus dem Kulturmedium wurde jeweils unter Verwendung von Concanavalin A-Sepharose und Diethylaminoethyl (DEAE)-Sepharose bzw. Protein A-Sepharose (alle hergestellt von Pharmacia Biotech).
  • shlL-5R α wurde wie folgt erhalten. Kurz gesagt wurden 6 × 106 Sf9-Zellen in 45 ml Graces-Insektenmedium (Gibco), welches 10% FCS enthielt, in einer 225 cm2-Flasche (Greiner) suspendiert und bei 27°C für 3–4 Tage gezüchtet. Nach der Entfernung des Kulturüberstands wurden 30 ml frisches Graces-Insektenmedium (Gibco), welches 10% FCS enthielt und 1 ml einer Lösung zugefügt, in welcher das vom Transfervektor pAI292 stammende rekombinante Virus, der in 1(8) von Beispiel 1 erhalten wurde, in einer Konzentration von etwa 1 × 107 PBE/ml enthalten war. Die Zellen wurden bei 27°C für einen weiteren Tag gezüchtet. Nach der Entfernung des Kulturüberstands wurden dann 45 ml frisches Sf900-II-Medium hinzugefügt und die Zellen wurden für 2–3 Tage gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung wurde der Kulturüberstand gewonnen und bei 1.500 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um dadurch einen Überstand zu erhalten. Zu dem daraus entstehenden Kulturmedium wurde Natriumchlorid hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 0,5 M zu ergeben. Dann wurden 1/50 Volumen an 1 M Tris-HCl (pH-Wert 7,4) hinzugefügt und der pH-Wert des sich daraus ergebenden Gemischs wurde mit 1 N Natriumhydroxidlösung auf 7,4 eingestellt.
  • Ein Säule wurde mit etwa 10 ml Concanavalin A-Sepharosegel bepackt und bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min mit 50 ml Puffer gewaschen, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) und 0,5 mM Natriumchlorid enthielt. Nach dem Waschen wurden bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min 500 ml des shIL-5R α enthaltenden Kulturmediums, welches, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurde, auf die Concanavalin-A-Sepharosesäule aufgetragen. Die Säule wurde dann bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min mit 80 ml eines Puffers gewaschen, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) und 0,5 mM Natriumchlorid enthielt. Danach wurden 60 ml eines Puffers, der 1 M α-Methylmannosid, 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) und 0,5 M Natriumchlorid enthielt, auf die Säule aufgetragen, um dadurch das an die Concanavalin A-Sepharose gebundene Protein zu eluieren und gleichzeitig das Eluat in 2 ml-Anteile zu fraktionieren. Die Proteinkonzentration von jedem Anteil wurde unter Verwendung eines Proteinkonzentrations-Messkits (Bio-Rad) gemessen. Die Fraktionen, die eine hohe Proteinkonzentration hatten, wurden in einer Gesamtmenge von 44 ml gewonnen und gegen 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) dialysiert. Ferner wurden ähnliche Arbeitsvorgänge an 900 ml des shIL-5R α enthaltenden Kulturmediums durchgeführt, welches, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurde, um auf diese Weise jene Anteile mit hoher Proteinkonzentration in einer Gesamtmenge von 40 ml zu gewinnen, welche gegen 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) dialysiert wurden.
  • Nach der Dialyse wurden die beiden Proteinlösungen vereinigt und auf eine mit 10 ml Dimethylaminoethyl (DEAE)-Sepharosegel bepackte Säule aufgetragen, um das Protein daran zu binden. Die Eluierung von shIL-5R α von der Säule wurde durch lineare Änderung der Natriumchloridkonzentration von 0 zu 0,5 M durchgeführt. Auf diese Weise wurden jene Anteile mit hoher Konzentration an shIL-5R α in einer Gesamtmenge von 4 ml gewonnen. Diese Proteinlösung wurde in einen Dialyseschlauch gefüllt und gegen PBS dialysiert. Auf diese Weise wurde gereinigter shIL-5R α (Proteinkonzentration: 400 μg/ml; 4,5 ml) erhalten.
  • In einem gesonderten Schritt wurde hIL-5R α-Fc wie folgt gewonnen. Kurz gesagt wurden 6 × 106 Sf9-Zellen in 45 ml Graces-Insektenmedium (Gibco), das 10% FCS enthielt, in einer 225 cm2-Flasche (Greiner) suspendiert und bei 27°C für 3–4 Tage gezüchtet. Nach der Entfernung des Kulturüberstands wurden 30 ml frisches Graces-Insektenmedium (Gibco), das 10% FCS enthielt und 1 ml einer Lösung hinzugefügt, in welcher das vom Transfervektor pAI297, der in 1(8) von Beispiel 1 erhalten wurde, stammende rekombinante Virus in einer Konzentration von etwa 1 × 107 PBE/ml enthalten war. Die Zellen wurden bei 27°C für einen weiteren Tag gezüchtet. Nach der Entfernung des Kulturüberstands wurden dann 45 ml frisches Sf900-II-Medium hinzugefügt und die Zellen wurden für 2–3 Tage gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung wurde der Kulturüberstand gewonnen und bei 1.500 × g für 10 Minuten zentrifugiert, um dadurch den Überstand zu erhalten.
  • Ein Säule wurde mit etwa 5 ml Protein A-Sepharosegel bepackt und mit 50 ml PBS gewaschen. Nach dem Waschen wurden bei einer Durchflussrate von 0,5 ml/min 450 ml des shIL-5R α-Fc enthaltenden Kulturmediums, wie vorstehend beschrieben, auf die Protein-A-Sepharosesäule aufgetragen. Dann wurde die Säule mit 50 ml PBS gewaschen. Danach wurden 20 ml 0,1 M Citratpuffer (pH-Wert 3,0) auf die Säule aufgetragen, um dadurch das an die Protein A-Sepharose gebundene Protein zu eluieren und gleichzeitig das Eluat in 1 ml-Anteile zu fraktionieren. Zu jedem der Anteile wurden, zur Einstellung des pH-Wertes, 0.15 ml 2 M Tris-HCl (pH-Wert 9,0) hinzugefügt. Die Proteinkonzentration von jedem Anteil wurde unter Verwendung eines Proteinkonzentrations-Messkits (Bio-Rad) gemessen und jene Fraktionen, welche eine hohe Proteinkonzentration hatten, wurden gewonnen. Die auf diese Weise erhaltene Proteinlösung wurde unter Verwendung von Centricon-30 (Amicon) um etwa einen Faktor 3 konzentriert, in einen Dialyseschlauch gefüllt und gegen PBS dialysiert. Auf diese Weise wurde gereinigtes shIL-5R α-Fc (Proteinkonzentration: 0,4 mg/ml; 1,8 ml) erhalten.
  • (11) Expression eines Teilfragments von shIL-5R α in E. coli
  • Die Expression eines Teilfragments von shIL-5R α in E. coli wurde durch Insertion eines DNA-Fragments, welches eine cDNA enthielt, die für ein Teilfragment von shIL-5R α codiert, in den E. coli-Expressionsvektor pMKex1, der nachstehend beschrieben wird, durchgeführt, um auf diese Weise pAI263 zu konstruieren und E. coli mit pAI263 zu transformieren.
  • Kurz gesagt wurden 3 μg des Plasmids pGHA2 (Kokai Nr. Sho 60-221091) zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten EcoRI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Die DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen. Zu diesen DNA-Fragmenten wurden 30 μl eines Puffers, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, und 10 Einheiten ClaI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 0,3 μg des EcoRI-ClaI-Fragments von pGHA2, welches die Promotorregion enthielt, wurden gewonnen.
  • Drei μg des Plasmids pTerm2 (Kokai Nr. 227075/90) wurden zu 30 μl eines Puffer hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten EcoRI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Die DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen. Zu diesen DNA-Fragmenten wurden 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,4), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt und 10 Einheiten NsiI wurden hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 0,8 μg des EcoRI-NsiI-Fragments von pTerm2 wurden gewonnen.
  • 50 ng des EcoRI/ClaI-Fragments von pGHA2, 100 ng des EcoRI/NsiI-Fragments von pTerm2 und 100 ng einer synthetischen DNA, die in SEQ ID NO: 15 gezeigt wird, wurden in 20 μl T4-DNA-Ligaselösung aufgelöst, zu welcher 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Die Ligierung wurde dann bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli-Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 12 gezeigte Plasmid pMKex1 zu erhalten.
  • In einem gesonderten Schritt wurden 3 μg des in 3 erhaltenen Plasmids pAI234 zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten PstI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Die DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und in 20 μl T4-DNA-Polymerase-I-Puffer aufgelöst [ein Puffer, der 33 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 66 mM Kaliumsulfat, 10 mM Magnesiumsulfat, 0,5 mM DTT und 0,01% Rinderserumalbumin enthielt]. Zu dem sich daraus ergebenden Gemisch wurden 5 Einheiten T4-DNA-Polymerase I (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 12°C für 15 Minuten umgesetzt, wobei die durch den Verdau mit PstI erzeugten 5'-überhängenden Enden in glatte Enden umgewandelt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation, unterzogen. Zu dem Niederschlag wurden 30 μl eines Puffers, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, und 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 0,3 μg eines etwa 0,7 kb-DNA-Fragments, welches eine cDNA enthielt, die ein shIL-5R α-Fragment codiert, wurden gewonnen.
  • 3 μg des in 12 erhaltenen Expressionsvektor für E. coli, pMKex1, wurden in 30 μl eines Puffers aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Kaliumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten BamHI hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Die DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen und in 30 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem und 10 Einheiten EcoRV hinzugefügt und bei 37°C für 4 Stunden umgesetzt wurden. Etwa 1,5 μg der DNA-Fragmente wurden vom Reaktionsgemisch durch Ethanolpräzipitation gewonnen.
  • 50 ng der auf diese Weise erhaltenen cDNA, die ein shIL-5R α-Fragment codiert, und 100 ng des auf diese Weise erhaltenen EcoRV/BamHI-Fragments von pMKex1 wurden in 20 μl T4-DNA-Ligasepuffer aufgelöst, zu welchem 200 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt wurden. Die Ligierung wurde dann bei 12°C für 16 Stunden durchgeführt. Unter Verwendung der auf diese Weise erzeugten rekombinanten Plasmid-DNA wurde der E. coli-Stamm JM109 transformiert, um dadurch das in 13 gezeigte Plasmid pAI263 zu erhalten.
  • Das vorstehend erwähnte Plasmid pAI263 wurde in E. coli transfiziert (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), welcher in 400 ml LB-Medium, das 200 μg/ml Ampicillin enthielt, bei 37°C für 4 Stunden gezüchtet wurde. 0,5 mM IPTG wurden dann hinzugefügt und die Zellen wurden bei 37°C für 2 weitere Stunden gezüchtet. 400 ml des Kulturmediums wurden bei 3.000 × g für 15 Minuten zentrifugiert. Der die Zellen von E. coli enthaltende Niederschlag wurde in 100 ml Puffer I [10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM Natriumchlorid] suspendiert. Nach nochmaligem Zentrifugieren wurde der Niederschlag in 7 ml Puffer I suspendiert und mit Ultraschall behandelt, um die Zellwände zu zerreißen. Die auf diese Weise entstandene Suspension wurde bei 10.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert und der Niederschlag wurde in 500 μl eines Probenpuffers für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese [6 mM Tris-HCl (pH-Wert 6,8), 2% SDS, 10% Glyzerin, 5% 2-Mercaptoethanol] aufgelöst und einer Polyacrylamid-Gelektrophorese unterzogen. Auf diese Weise wurde ein gereinigtes shIL-5R α-Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 27 kD erhalten.
  • (12) Herstellung einer Zellmembranfraktion von Zellen, welche die α-Kette von menschlichem IL-5R exprimieren
  • Die Herstellung eines Membranbestandteils aus CTLL-2-Zellen, die mit dem hIL-5R α-Gen transfiziert sind [J. Exp. Med., 177, 1523 (1993)] oder CTLL-2-Kontrollzellen [ATCC TIB 214] wurde, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt.
  • Kurz gesagt wurden die Zellen zentrifugiert (1.200 UpM, 5 Minuten), zweimal mit PBS gewaschen und dann in einem Zellspaltungspuffer [2,0 mM HEPES (pH-Wert 7,4), 1 mM DETA, 0,5 mM PMSF, 250 mM Saccharose] suspendiert und mit einem Homogenisiergerät aufgebrochen. Nach dem Aufbrechen wurden die Zellen bei 5.500 UpM für 15 Minuten zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen. Die Zellen wurden weiter bei 35.000 UpM zentrifugiert, um die Zellmembran-Fraktionen als einen Niederschlag zu erhalten.
  • 2. Immunisierung von Tieren und Herstellung von Antikörper erzeugenden Zellen
  • Jeweils 50 μg der in Unterabschnitt (9), (10), (11), oder (12) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen Antigene wurden unabhängig zusammen mit 2 mg Aluminiumgel und 1 × 109 Zellen des Keuchhustenimpfstoffs (Chiba Perfectural Serum Research Institute) an 5 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse oder weibliche SD-Ratten verabreicht. 2 Wochen nach der Verabreichung wurden einmal in der Woche, im Gesamten viermal, 50 μg Protein verabreicht. Blutproben wurden vom venösen Geflecht des Augenhintergrunds oder der Schwanzvene gesammelt und der Antikörpertiter des Serums davon wurde durch den nachstehend unter 3 beschriebenen Enzymimmuntest untersucht. Die Milzen wurden 3 Tage nach der letzten Immunisierung von jenen Mäusen oder Ratten entfernt, die einen ausreichenden Antikörpertiter gezeigt haben. In diesem Immunisierungsversuch wurde die in Unterabschnitt (12) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen Zellmembran-Fraktion als Antigen zur Immunisierung von 13 Mäusen und 5 Ratten verwendet. Es wurde in diesen Tieren jedoch kein bemerkenswerter Anstieg des Antikörpertiters beobachtet. Weiters wurde kein zufriedenstellender Anstieg des Antikörpertiters in den 5 Ratten bemerkt, die mit dem in Unterabschnitt (9) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen shIL-5R α immunisiert wurden, oder in den 10 Ratten, die mit dem in Unterabschnitt (10) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen shIL-5R α immunisiert wurden.
  • Die Milz wurde in MEM-Medium (Nissui Pharmaceuticals) in Stücke geschnitten, mit einer Pinzette aufgelockert und zentrifugiert (1.200 UpM, 5 Minuten). Der Überstand wurde dann verworfen und Rückstand wurde mit Tris-Ammoniumchlorid-Puffer (pH-Wert 7,65) für 1–2 Minuten behandelt, um die Erythrocyten zu entfernen, und dreimal mit MEM-Medium gewaschen. Die sich daraus ergebenden Splenocyten wurden für die Zellfusion verwendet.
  • 3. Enzymimmuntest
  • Die Messungen der Antiseren oder Kulturüberstände der Hybridomzellen, die von Mäusen oder Ratten stammen, die mit dem in Unterabschnitt (9) oder (10) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen shIL-5R α immunisiert worden waren, wurden gemäß den zwei nachstehend beschriebenen Verfahren unter Verwendung von hIL-5R α-Fc als ein Antigen hergestellt, welches, wie in Unterabschnitt (10) von Abschnitt 1, Beispiel 1 beschrieben, aus dem Kulturüberstand von Insektenzellen erhaltenen worden war.
    • (A) Auf eine EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (Greiner) wurden hIL-5R α-Fc, der mit PBS auf 1 μg/ml verdünnt war, und ein Kontrollantigen, chimärer anti-GD3 Antikörper KM871, der eine gewöhnliche menschliche konstante Ig-Region hat, gesondert in einer Menge von 50 μl/Vertiefung aufgeteilt und bei 4°C über Nacht stehen gelassen, damit sich die Proteine anlagern. Nach dem Waschen wurde PBS, das 1 Rinderserumalbumin (BSA) enthielt (nachstehend als 1% BSA-PBS bezeichnet), zu der Platte hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt, um dadurch die verbleibenden aktiven Gruppen zu blockieren. Nach Verwerfen des 1% BSA-PBS wurde ein von Maus oder Ratte stammendes Antiserum und Kulturüberstand eines Hybridoms in die Vertiefungen aufgeteilt (50 μl/Vertiefung) und für 2 Stunden umgesetzt. Nach dem Waschen mit Tween-PBS wurde mit Peroxidase markiertes Kaninchen-anti-Maus-Immunglobulin oder anti-Ratten-Immunglobulin (DAKO) zu der Platte hinzugefügt (50 μl/Vertiefung), für 1 Stunde umgesetzt und mit Tween-PBS gewaschen. Danach wurde dem sich daraus ergebenden Gemisch gestattet unter Verwendung von ABTS-Substrat-Lösung [eine Lösung, die durch Auflösen von 550 mg 2,2' Azinobis(3-Ethylbenzothiazolin-6-Sulfonsäure)diammoniumsalz in 1 l 0,1 M Citratpuffer (pH-Wert 4,2) und Hinzfügen von 1 μl/1 ml Wasserstoffperoxid unverzüglich vor der Verwendung erhalten wurde] eine Farbe zu entwickeln, um das Absoptionsvermögen bei OD415 nm (NJ2001; Japan Intermed) zu messen.
    • (B) Ferner wurde zum Zwecke der Selektion eines monoclonalen Antikörpers, der mit höherer Wahrscheinlichkeit eine neutralisierende Aktivität gegen IL-5 hat, eine Durchmusterung auf eine Aktivität, welche die Bindung an den IL-5-Rezeptor hemmt, mittels der folgenden Verfahren unter Verwendung von Biotin-markiertem menschlichem IL-5 und dem in Unterabschnitt (10) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 aus dem Kulturüberstand von Insektenzellen gewonnenen shIL-5R α-Fc durchgeführt. Der menschliche IL-5, der für die Biotinmarkierung verwendet wurde, wurde gemäß dem in Journal of Immunological Method, 125, 233 (1989) beschriebenen Verfahren hergestellt.
  • Die Biotinmarkierung von menschlichem IL-5 wurde gemäß dem Protokoll, welches dem Reagens zur Biotinmarkierung beigefügt ist (Biotin-LC-Hydrazide) (Pierce) durch folgendes Verfahren durchgeführt. Zuerst wurden 1,6 mg/ml menschliches IL-5, das in PBS aufgelöst war, auf eine PD10-Säule (Pharmacia) aufgetragen, mit Markierungspuffer zum Salzaustausch äquilibriert (100 mM Natriumacetat, 0,02% NaN3, pH-Wert 5,5) und 1 ml einer Fraktion mit hoher Proteinkonzentration wurde wiedergewonnen. Zu 0,5 ml dieser menschlichen IL-5-Lösung wurde 1 ml eines Markierungspuffers hinzugefügt, der 30 mM Metaperiodsäure enthielt und bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, für 30 Minuten umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch auf eine PD10-Säule aufgetragen, die mit Markierungspuffer äquilibriert war, um unverbrauchte Metaperiodsäure zu entfernen. Auf diese Weisen wurden 1,5 ml einer Fraktion mit einer hohen Proteinkonzentration gewonnen. Zu dieser Fraktion wurden 20 μl Markierungspuffer hinzugefügt, der, wie vorstehend beschrieben, 5 mM Biotin-Markierungs-Reagens enthielt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurden 50 μl Reaktions-Beendigungspuffer (0,1 M Tris, pH-Wert 7,5) hinzugefügt und das Reaktionsgemisch wurde dann auf eine PD10-Säule aufgetragen, die mit 0,05% NaN3 enthaltendem PBS äquilibriert war, um die Salze auszutauschen und gleichzeitig unverbrauchte Reagenzien zu entfernen. Das auf diese Weise erhaltene mit Biotin markierte IL-5 wurde bei 4°C gelagert.
  • Das in Unterabschnitt (10) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 aus dem Kulturüberstand von Insektenzellen gewonnene shIL-5R α-Fc wurde mit PBS zu einer Konzentration von 5 μg/ml verdünnt, in eine EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (Greiner) aufgeteilt (50 μl/Vertiefung) und bei 4°C über Nacht stehen gelassen, damit sich die Proteine anlagern. Nach dem Waschen mit PBS wurde PBS, das 1% Rinderserumalbumin (BSA) (1% BSA-PBS) enthielt, zu der Platte (100 μl/Vertiefung) hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt, um die verbleibenden aktiven Gruppen zu blockieren. Die Platte wurde dann mit Tween-PBS gewaschen. Danach wurden ein Antiserum, welches von immunisierter Maus oder Ratte stammte, und der Kulturüberstand des Hybridoms sowie der vorstehend beschriebe mit Biotin markierte IL-5 in einer Menge von je 50 μl/Vertiefung zu der Platte hinzugefügt und bei 4°C über Nacht umgesetzt. Am nächsten Tag wurde die Platte mit Tween-PBS gewaschen und dann wurden mit Peroxidase markiertes Avidin (Nippon Reizo), welches 4000-fach mit 1% BSA-PBS verdünnt wurde, zu 50 μl/Vertiefung hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt. Nach dem Waschen mit Tween-PBS wurden 50 μl/Vertiefung an ABTS-Substrat-Lösung hinzugefügt, um Farbentwicklung zu ermöglichen und das Absorptionsvermögen bei OD415 wurde gemessen.
  • In Bezug auf die Messungen der Antiseren und Kulturüberstände von Hybridomen, die von jenen Mäusen oder Ratten stammen, welche mit dem in Unterabschnitt (11) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen hIL-5R α-Fragment immunisiert waren, wurde das in Unterabschnitt (11) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 in E. coli erzeugte hIL-5R α-Fragment als Antigen verwendet. In ähnlicher Art und Weise zu der vorstehend beschriebenen wurden der von E. coli erzeugte shIL-5R α und ein E. coli Zellprotein (Kontrollantigen) gesondert an Platten adsorbiert. Unter Verwendung der auf diese Weise hergestellten Platten wurde die Reaktivität der Kulturüberstände der Hybridome und Antiseren von immunisierten Mäusen oder Ratten untersucht.
  • Ferner wurden in Bezug auf die Messung der Antiseren und Kulturüberstände von Hybridomen, die von jenen Mäusen oder Ratten stammten, welche mit den in Unterabschnitt (12) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen Zellmembran-Fraktionen von hIL-5R α-exprimierenden Zellen immunisiert worden waren, die in Unterabschnitt (12) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen Zellmembran-Fraktionen als Antigen verwendet. In ähnlicher Art und Weise zu der vorstehend beschriebenen wurden die Zellmembran-Fraktion von IL-5R α-exprimierenden Zellen und eine Zellmembran-Fraktion von Kontrollzellen gesondert an Platten adsorbiert. Unter Verwendung der auf diese Weise hergestellten Platten wurde die Reaktivität der Kulturüberstände der Hybridome und Antiseren von immunisierten Mäusen oder Ratten untersucht.
  • 4. Herstellung von Maus-Myelomzellen
  • Eine gegen 8-Azaguanin resistente Maus-Myelomzelllinie, P3-U1, wurde in einem normalem Medium gezüchtet und nicht weniger als 2 × 107 Zellen wurden sichergestellt und als Elternlinie einer Zellfusion unterzogen.
  • 5. Herstellung von Hybridomen
  • Die in Abschnitt 2 von Beispiel 1 erhaltenen Maus- oder Ratten-Splenocyten und die in Abschnitt 4 von Beispiel 1 erhaltenen Myelomzellen wurden in einem Verhältnis von 10 : 1 gemischt und das Gemisch wurde zentrifugiert (1.200 UpM, 5 Minuten). Dann wurde der Überstand verworfen und die präzipitierten Zellen wurden ausreichend aufgelockert. Zu den sich daraus ergebenden Zellen wurde eine gemischte Lösung, bestehend aus 2 g Polyethylenglycol 1000 (PEG-1000), 2 ml MEM-Medium und 0,7 ml DMSO, in einer Menge von 0,2 bis 1 ml pro 108 Maus-Splenocyten hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe von 1 bis 2 ml-Portionen an MEM-Medium in Intervallen von 1 bis 2 Minuten bei 37°C. Danach wurde MEM-Medium hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 50 ml zu ergeben. Nach dem Zentrifugieren (900 UpM, 5 Minuten) wurde der Überstand verworfen und die Zellen behutsam aufgelockert. Die Zellen wurden dann durch Aufsaugen und Auslassen mit einer Pipette behutsam in 100 ml HAT-Medium suspendiert.
  • Diese Zellsuspension wurde in eine 96-Vertiefungen aufweisende Kulturplatte (100 μl/Vertiefung) aufgeteilt und in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C für 10–14 Tage gezüchtet. Der sich daraus ergebende Kulturüberstand wurde durch den in Abschnitt 3 von Beispiel 1 beschriebenen Enzymimmuntest untersucht und jene Vertiefungen, die eine spezifische Reaktion mit dem von einem Kulturüberstand von Insektenzellen erzeugten hIL-5R α-Fc oder mit dem von E. coli erzeugten shIL-5R α zeigten, wurden ausgewählt. Ferner wurde das Medium mit HT-Medium und einem normalen Medium ersetzt und das Clonen wurde zweimal wiederholt. Als Folge wurden Hybridom-Zelllinien etabliert, die einen monoclonalen Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette erzeugten.
  • Infolge der Durchmusterung von etwa 4000 Hybridomclonen von 6 Mäusen oder 8 Ratten, welche mit dem in Unterabschnitt (11) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen hIL-5R α-Fragment immunisiert waren, wurde monoclonaler Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette erhalten und als KM1074 bezeichnet. Seine Reaktivität mit IL-5R α war äußerst schwach, verglichen mit den monoclonalen anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpern KM1257 und KM1259, die später beschrieben werden.
  • In einem gesonderten Schritt wurden Hybridome von 12 oder 6 Tieren erhalten, die einen hohen Antikörpertiter zeigten und die aus 15 oder 20 Mäusen ausgewählt wurden, die mit dem in Unterabschnitt (9) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen shIL-5R α oder dem in Unterabschnitt (10) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltenen shIL-5R α immunisiert worden waren. Infolge der Durchmusterung von mehr als 10000 Hybridomclonen wurden 81 Hybridomclone etabliert, die, wenn sie mit dem später in Abschnitt 1 von Beispiel 3 beschriebenen Verfahren getestet wurden, einen monoclonalen Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette erzeugten, der eine spezifische Reaktivität mit hIL-5R α-exprimierenden Zellen zeigte. Unter diesen war der monoclonale Antikörper, der im nachstehend in Abschnitt 1 von Beispiel 3 beschriebenen Immunocyten-Färbeverfahren die stärkste Reaktivität zeigte, KM1257. Hybridom KM1257 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1-3, Higashi 1-Chome, Tsukuba City, Ibaraki, Japan; nachstehend ist die Adresse für dieses Institut die gleiche) am 13. Juni 1995 unter der Zugangsnummer FERM BP-5133 hinterlegt. Von den 81 Clonen zeigten nur sechs Clone eine starke hemmende Aktivität gegen die biologische Aktivität von IL-5, welche später in Abschnitt 2 von Beispiel 3 beschrieben wird. Unter diesen sechs Clonen waren KM1259 und KM1486 die monoclonalen Antikörper, welche die stärkste hemmende Aktivität zeigten. Hybridom KM1259 wurde, am 13. Juni 1995 unter der Zugangsnummer FERM BP-5134 hinterlegt und Hybridom KM1486 wurde am 3. September 1996 unter der Zugangsnummer FERM BP-5651 hinterlegt, beide am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology.
  • Die Reaktivitäten der monoclonalen Antikörper KM1257, KM1259 und KM1486 werden in 14 gezeigt. Die Subklasse für jeden Antikörper wurde durch einen Enzymimmuntest unter Verwendung eines Subklassen- Typisierungskits bestimmt. Demzufolge waren die Antikörperklassen von KM1257, KM1259 und KM1486 alle IgG1.
  • 6. Reinigung der monoclonalen Antikörper
  • Die vorstehend unter 5 erhaltene Hybridom-Zelllinie wurde intraperitoneal an mit Pristan behandelte weibliche nackte Mäuse (Balb/c), die 8 Wochen alt waren, in einer Dosis von (5–20 × 106 Zellen/Maus) verabreicht. Das Hybridom verursachte 10 bis 21 Tage nach der Verabreichung Ascitestumor. Von jenen Mäusen, in denen sich Ascites ansammelte, wurde Ascites gewonnen (1–8 ml/Maus), zentrifugiert (3.000 UpM, 5 Minuten), um die Feststoffe zu entfernen und dann durch das Caprylsäure-Präzipitationsverfahren gereinigt (Antibodies – Ein Laborhandbuch, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), um gereinigten monoclonalen Antikörper zu erhalten.
  • BEISPIEL 2
  • Herstellung von humanisierten Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette
  • 1. Konstruktion des Tandem-Kassettentyp-Expressionsvektors für humaniserten Antikörper pKANTEX93
  • Ein Tandem-Kassettentyp-Expressionsvektor für humaniserten Antikörper, pKANTEX93, wurde, wie nachstehend beschrieben, basierend auf Plasmid pSE1UK1SEd1-3, das in Kokai Nr. 257891/90 offengelegt wurde, zur Expression eines humanisierten Antikörpers von einem menschlichen Antikörper des IgG1, K-Typus in tierischen Zellen konstruiert, in welchen eine cDNA, die eine humanisierte Antikörper VH codiert und eine cDNA, die eine humanisierte Antikörper VL codiert, stromaufwärts einer cDNA transfiziert wurden, die menschlichen Antikörper Cγ1 codiert, bzw. einer cDNA, die menschlichen Antikörper CK codiert. Der konstruierte Expressionsvektor für humanisierten Antikörper wurde für die Expression von menschlichen chimären Antikörpern und menschlichen CDR-grafted Antikörpern in tierischen Zellen verwendet.
  • (1) Änderung der ApaI- und EcoRI-Restriktions-Schnittstellen, die im Spleißsignal und Poly-(A)-Signal des Kaninchen-β-Globingens vorhanden sind
  • Die Änderung der ApaI- und EcoRI-Restriktions-Schnittstellen, die im Spleiß- und Poly-(A)-Signal des Kaninchen-β-Globingens von Plasmid pSE1UK1SEd1-3 vorhanden sind, wurde, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt, um die Konstruktion eines Expressionsvektors für menschlichen chimären Antikörper oder eines Expressionsvektors für menschlichen „CDR-grafted" Antikörper (=humanisierter Antikörper) durch Insertion der variablen Region eines menschlichen chimären Antikörpers oder eines menschlichen „CDR-grafted" Antikörpers in einer Kassette in einen humanisierten Antikörper-Expressionsvektor unter Verwendung eines NotI-ApaI-Fragments (VH) und eines EcoRI-SplI-Fragments (VL) zu ermöglichen.
  • Kurz gesagt werden 3 μg des Plasmids pBluescript SK(–) (Stratagene) zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und die durch den Verdau mit ApaI erzeugten 3'-überhängenden Enden wurden unter Verwendung eines DAN Blunting Kit (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen und die daraus entstanden DNA-Fragmente wurden unter Verwendung eines DANN Ligation Kit (Takara Shuzo) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 15. gezeigte Plasmid pBSA zu erhalten.
  • Ferner wurden 3 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pBSA zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und die durch den Verdau mit EcoRI erzeugten 5'- überhängenden Enden wurden unter Verwendung eines DNA-Blunting-Kit (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen und die daraus entstanden DNA-Fragmente wurden unter Verwendung eines DANN Ligations Kit (Takara Shuzo) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 16. gezeigte Plasmid pBSAE zu erhalten.
  • Anschließend wurden 3 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pBSAE zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 20 μl eines Puffers aufgelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde in zwei 10 μl-Anteile aufgeteilt. Zu einem Teil wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacII (Toyobo) hinzugefügt und zum anderen Teil wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) hinzugefügt. Dann wurden beide Gemische bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Beide Reaktionsgemische wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und ein etwa 2,96 kb-HindIII-SacII-Fragment und ein etwa 2,96 kb-KpnI-HindIII-Fragment, von jedem etwa 0,3 μg, wurden gewonnen.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pSE1UK1SEd1-3 zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacII (Toyobo) und 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 50 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt. Zu dem sich daraus ergebenden Gemisch wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und ein etwa 2,42 kb-HindIII-SacII-Fragment und ein etwa 1,98 kb-KpnI-HindIII-Fragment, von jedem etwa 0,2 μg, wurden gewonnen.
  • Dann wurden 0,1 μg des vorstehend erhaltenen HindIII-SacII-Fragments von Plasmid pSE1UK1SEd1-3 und 0,1 μg des vorstehend erhaltenen HindIII-SacII-Fragments von pBSAE in sterilisiertem Wasser aufgelöst, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 17 gezeigte Plasmid pBSH-S zu erhalten. Außerdem wurden 0,1 μg des vorstehend erhaltenen KpnI-HindIII-Fragments von Plasmid pSE1UK1SEd1-3 und 0,1 μg des vorstehend erhaltenen KpnI-HindIII-Fragments von pBSAE in sterilisiertem Wasser aufgelöst, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 18 gezeigte Plasmid pBSK-H zu erhalten.
  • Anschließend wurden 3 μg der auf diese Weise erhaltenen Plasmide pBSH-S und pBSK-H gesondert zu 10 μl eines Puffer hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Beide Reaktionsgemische wurden mit Ethanol präzipitiert und die durch den Verdau mit ApaI erzeugten 3'- überhängenden Enden, wurden unter Verwendung eines DAN Blunting Kit (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen und die daraus entstanden DNA-Fragmente wurden unter Verwendung eines DANN Ligation Kit (Takara Shuzo) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösungen wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 19 gezeigte Plasmid pBSH-SA und pBSK-HA zu erhalten.
  • Anschließend wurden jeweils 5 μg der auf diese Weise erhaltenen Plasmide pBSH-SA und pBSK-HA gesondert zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 10 Minuten umgesetzt wurden, sodass das Plasmid teilweise gespalten wurde. Dann wurden beide Reaktionsgemische mit Ethanol präzipitiert. Nachdem die durch den Verdau mit EcoRI erzeugten 5'-überhängenden Enden unter Verwendung eines DANN Blunting Kit (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen worden war, wurden beide Reaktionsgemische einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und ein etwa 5.38 kb-Fragment und ein etwa 4.94 kb-Fragment, von jedem etwa 0,5 μg, wurden gewonnen. Dann wurden 0,1 μg der auf diese Weise gewonnenen Fragmente gesondert in sterilisiertem Wasser aufgelöst, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösungen wurde E. coli HB101 transformiert, um die in 20 gezeigten Plasmide pBSH-SAE und pBSK-HAE zu erhalten.
  • Anschließend wurden jeweils 3 μg der auf diese Weise erhaltenen Plasmide pBSH-SAE und pBSK-HAE gesondert zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 100 mM Natriumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Beide Reaktionsgemische wurden mit Ethanol präzipitiert und die durch den Verdau mit EcoRI erzeugten 5'-überhängenden Enden wurden unter Verwendung eines DANN Blunting Kit (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen und die sich daraus ergebenden DNA-Fragmente wurden unter Verwendung eines DANN Ligations Kit (Takara Shuzo) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösungen wurde E. coli HB101 transformiert, um die in
  • 21 gezeigten Plasmide pBSH-SAEE und pBSK-HAEE zu erhalten. Jeweils 10 μg der auf diese Weise erhaltenen Plasmide wurden gesondert gemäß der dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beiliegenden Anleitung umgesetzt und dann mit einem A. L. F. DNA-Sequenziergerät (Pharmacia Biotech) einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Basensequenz zu bestimmen. Als Ergebnis davon wurde bestätigt, dass die ApaI- und EcoRI-Restriktions-Schnittstellen durch die vorstehend beschriebenen Änderungen beseitigt worden waren.
  • (2) Einführung einer SalI-Restriktions-Schnittstelle in den stromabwärts gelegenen Anteil, der aus dem Spleißsignal des Kaninchen-β-Globingens, Poly-(A)-Signal des Kaninchen-β-Globingens und Poly-(A)-Signal des frühen Gens von SV40 besteht
  • Um sicherzustellen, dass die Expressionspromotoren für die menschlichen Antikörper H- und L-Ketten in einem Expressionsvektor für humanisierten Antikörper mit jedem Promotor ausgetauscht werden können, wurde eine SalI-Restriktions-Schnittstelle wie nachstehend beschrieben, in den stromabwärts gelegenen Anteil transfiziert, welcher, aus einem Spleißsignal des Kaninchen-β-Globingens, Poly-(A)-Signal des Kaninchen-β-Globingens und Poly-(A)-Signal des frühen Gens von SV40 von Plasmid pSE1UK1Sed1-3, besteht.
  • Kurz gesagt wurden 3 μg des in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pBSK-HAEE zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms Nael (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und das Präzipitat in 20 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,0) und 1 mM Magnesiumchlorid enthielt, zu welchem 1 Einheit alkalischer Phosphatase hinzugefügt (E. coli C75, Takara Shuzo) und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurde, um die 5'-Enden zu dephosphorylieren. Dann wurde das Reaktionsgemisch einer Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation, unterzogen. Der Niederschlag wurde in 20 μl eines Puffers gelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0) und 1 mM Ethylendiamin-Tetraessigsäure saures-Dinatrium (nachstehend als „TE-Puffer" bezeichnet enthielt). 1 μl des Gemischs und 0,1 μg eines phosphorylierten Sall-Linkers (Takara Shuzo) wurden zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli Hb101 transformiert, um das in 22 gezeigte Plasmid pBSK.HAEESal zu erhalten. Jeweils 10 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids wurden gemäß der dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beiliegenden Anleitung umgesetzt und dann mit einem A. L. F. DNA-Sequenziergerät (Pharmacia Biotech) einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Basensequenz zu bestimmen. Als Ergebnis davon wurde bestätigt, dass eine SalI-Restriktions-Schnittstelle in den stromabwärts gelegenen Anteil transfiziert wurde, der aus einem Spleißsignal des Kaninchen-β-Globingens, Poly-(A)-Signal des Kaninchen-β-Globingens und Poly-(A)-Signal des frühen Gens von SV40 besteht.
  • (3) Änderung der ApaI-Restriktions-Schnittstelle, die im Poly-(A)-Signal des Thymidin-Kinasegens des Herpes Simplex-Virus (nachstehend als „HSVtk" bezeichnet) vorhanden ist
  • Die Änderung der im Poly-(A)-Signal des HSVtk-Gens vorhandenen ApaI-Restriktions-Schnittstelle, die im Plasmid pSE1UK1SEd1-3 stromabwärts vom Tn5-Kanamycin-Phosphotransferasegen liegt wurde, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt.
  • Kurz gesagt wurden 3 μg des in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pBSA zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacII (Toyobo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 1 μg eines etwa 2,96 kb-SacII-Xhol-Fragments wurde gewonnen.
  • Anschließend wurden 5 μg des Plasmids pSE1UK1SEd1-3 zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacII (Toyobo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und etwa 1 μg eines etwa 4,25 kb-SacII-XhoI-Fragments wurde gewonnen.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des vorstehend erhaltenen SacII-XhoI-Fragments von pBSA und des vorstehend erhaltenen SacII-XhoI-Fragments von pSE1UK1SEd1-3 zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 23 gezeigte Plasmid pBSX-S zu erhalten.
  • Anschließend wurden 3 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pBSX-X zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurden mit Ethanol präzipitiert und die durch den Verdau mit ApaI erzeugten 3'-überhängenden Enden wurden unter Verwendung eines DANN Blunting Kit (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen und die sich daraus ergebenden DNA-Fragmente wurden unter Verwendung eines DAN Ligations Kit (Takara Shuzo) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 24 gezeigte Plasmid pBSX-SA zu erhalten. 10 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids wurden gemäß der dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beiliegenden Anleitung umgesetzt und dann mit einem A. L. F-DNA-Sequenziergerät (Pharmacia Biotech) einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Basensequenz zu bestimmen. Als Ergebnis davon wurde bestätigt, dass die ApaI-Restriktions-Schnittstelle des HSVtk-Gen Poly-(A)-Signals beseitigt wurde.
  • (4) Konstruktion einer Expressionseinheit für humanisierte Antikörper-L-Ketten
  • Das Plasmid mMohCK, welches eine Expressionseinheit für humanisierte Antikörper-L-Ketten aufweist, in welcher eine cDNA, welche die konstante Region der menschlichen K-Typ-L-Kette (CK) codiert, stromabwärts des Promotors/Enhancers der endständig wiederholten Sequenz des Moloney-Maus-Leukämievirus lokalisiert war und in die eine cDNA, welche die VL eines menschlichen chimären Antikörpers oder eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers codiert, in einer Kassette inseriert werden könnte, wurde, wie nachstehen beschrieben, konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden 3 μg des Plasmids pBluescript SK(–) (Stratagene) zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ClaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und die durch den Verdau mit SacI und ClaI erzeugten überhängenden Enden wurden unter Verwendung eines DAN Blunting Kit (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 2,96 kb-DNA-Fragments zu gewinnen. Dann wurden 0,1 μg des gewonnen DNA-Fragments zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 25. gezeigte Plasmid pBSSC zu erhalten.
  • Anschließend wurden 3 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pBSSC zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 2,96 kb KpnI-XhoI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 5 μg des in Kokai Nr. 205694/94 offenbarten Plasmids pAGE147 zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,3 μg eines etwa 0,66 kb-KpnI-XhoI-Fragments zu gewinnen, welches den Promotor/Enhancer der endständig wiederholten Sequenz des Moloney-Maus-Leukämievirus enthielt.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des vorstehend erhaltenen KpnI-XhoI-Fragments von pBSSC und 0,1 μg des vorstehend erhaltenen KpnI-XhoI-Fragments von pAGE147 in sterilisiertem Wasser aufgelöst, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung der Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 26 gezeigte Plasmid pBSMo zu erhalten.
  • Anschließend wurden 3 μg des wie vorstehend erhaltenen Plasmids pBSMo zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 3,62 kb-KpnI-HindIII-Fragments zu-gewinnen.
  • Anschließend wurden zwei synthetische DNAs, die die in SEQ ID NOs: 16 bzw. 17 gezeigten Basensequenzen hatten, unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts (380; Applied Biosystems) synthetisiert. Dann wurden jeweils 0,3 μg der erhaltenen synthetischen DNAs zu 15 μl sterilisiertem Wasser hinzugefügt und bei 65°C für 5 Minuten erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen gelassen. Zu diesem Gemisch wurden 2 μl eines 10 × Puffers [500 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT] und 2 μl 10 mM ATP hinzugefügt. Ferner wurden 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 30 Minuten umgesetzt, um die 5'-Enden zu phosphorylieren. Dann wurden 0,1 μg des wie vorstehend erhaltenen KpnI-HindIII-Fragments (3,62 kb) von Plasmid pBSMo und 0,05 μg der phosphorylierten synthetischen DNAs zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Endvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 27 gezeigte Plasmid pBSMoS zu erhalten. 10 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids wurden gemäß der dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beiliegenden Anleitung umgesetzt und dann mit einem A. L. F.-DNA-Sequenziergerät (Pharmacia Biotech) einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Basensequenz zu bestimmen. Als Ergebnis davon wurde bestätigt, dass die synthetischen DNAs von Interesse transfiziert worden waren.
  • Anschließend wurden 3 μg des in Kokai Nr. 304989/93 offengelegten Plasmids pCHilgLA1 in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und EcoRV (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 9,70 kb-EcoRI-EcoRV-Fragments zu gewinnen. Anschließend wurden zwei synthetische DNAs, die die in SEQ ID NOs: 18 bzw. 19 gezeigten Basensequenzen hatten, unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts (380; Applied Biosystems) synthetisiert. Dann wurden jeweils 0,3 μg der erhaltenen synthetischen DNAs zu 15 μl sterilisiertem Wasser hinzugefügt und bei 65°C für 5 Minuten erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen gelassen. Zu dieser Lösung wurden 2 μl eines 10 × Puffers [500 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT] und 2 μl 10 mM ATP hinzugefügt. Ferner wurden 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 30 Minuten umgesetzt, um die 5'-Enden zu phosphorylieren. Dann wurden 0,1 μg des wie vorstehend erhaltenen EcoRI-EcoRV-Fragments (9,70 kb) von Plasmid pChilgLA1 und 0,05 μg der phosphorylierten synthetischen DNAs zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Endvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 28 gezeigte Plasmid pChilgLA1 S zu erhalten.
  • Anschließend wurden 3 μg des vorstehend erhaltenen Plasmids pBSMoS in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HpaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 3,66 kb-HapI-EcoRI-Fragments zu-gewinnen.
  • Anschließend wurden 10 μg des vorstehend erhaltenen Plasmids pChilgLA1S in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,9), 50 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT und 100 μg/μl Rinderserumalbumin enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NlaIV (New England Biolabs) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,3 μg eines etwa 0,41 kb-NlaIV-EcoRI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden jeweils 0,1 μg des wie vorstehend erhaltenen HpaI-EcoRI-Fragments von pBSMoS und NlaI-EcoRI-Fragments von pChilgLA1 S zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Endvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 29 gezeigte Plasmid pMohCK zu erhalten.
  • (5) Konstruktion einer Expressionseinheit für humanisierte Antikörper-H-Kette
  • Das Plasmid mMohCγ 1, welches eine Expressionseinheit für hat, in welcher eine cDNA, welche die konstante Region der menschlichen IgG1-Typ-H-Kette (Cγ 1) codiert, stromabwärts des Promotors/Enhancers der endständig wiederholten Sequenz des Moloney-Maus-Leukämievirus lokalisiert war und in welcher eine cDNA, die die VH eines menschlichen chimären Antikörpers oder eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers codiert, in eine Kassette eingesetzt werden könnte, wurde, wie nachstehend beschrieben, konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden 3 μg des in Unterabschnitt (4) von Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhalten Plasmids pBSMo zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7.5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 30 mM Natriumacetat (pH-Wert 5,0), 100 mM Natriumchlorid, 1 mM Zinkacetat und 10% Glyzerin enthielt, zu welchem 10 Einheiten Mungbohnen-Nuclease (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 10 Minuten umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol-Chloroformextraktion, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation unterzogen. Dann wurden die überhängenden Enden unter Verwendung eines DAN Blunting Kit (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen und die daraus resultierenden DNA-Fragmente wurden unter Verwendung eines DAN Ligations Kit (Takara Shuzo) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 30 gezeigte Plasmid pBSMoSal zu erhalten. Zehn μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids wurden gemäß der dem AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beiliegenden Anleitung umgesetzt und dann mit einem A. L. F.-DNA-Sequenziergerät (Pharmacia Biotech) einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Basensequenz zu bestimmen. Als Ergebnis davon wurde bestätigt, dass die XhoI Restriktions-Schnittstelle, die stromaufwärts des Promotors/Enhancers der endständig wiederholten Sequenz des Moloney-Maus-Leukämievirus gelegen war, beseitigt worden war.
  • Anschließend wurden 3 μg des wie vorstehend erhaltenen Plasmids pBSMoSal zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 3,66 kb-KpnI-HindIII-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden zwei synthetische DNAs, die die in SEQ ID NOs: 20 bzw. 21 gezeigten Basensequenzen hatten, unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegerät (380; Applied Biosystems) synthetisiert. Dann wurden jeweils 0,3 μg der erhaltenen synthetischen DNAs zu 15 μl sterilisiertem Wasser hinzugefügt und bei 65°C für 5 Minuten erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen gelassen. Zu dieser Lösung wurden 2 μl eines 10 × Puffers [500 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT] und 2 μl 10 mM ATP hinzugefügt. Ferner wurden 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 30 Minuten umgesetzt, um die 5'-Enden zu phosphorylieren. Dann wurden 0,1 μg des wie vorstehend erhaltenen KpnI-HindIII-Fragments (3,66 kb) von Plasmid pBSMoSal und 0,05 μg der phosphorylierten synthetischen DNAs zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Endvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 31 gezeigte Plasmid pBSMoSalS zu erhalten. 10 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids wurden gemäß der dem AutoRead-Sequencing-Kit (Pharmacia Biotech) beiliegenden Anleitung umgesetzt und dann mit einem A. L. F.-DNA-Sequenziergerät (Pharmacia Biotech) einer Elektrophorese unterzogen, um dadurch die Basensequenz zu bestimmen. Als Ergebnis davon wurde bestätigt, dass die synthetischen DNAs von Interesse transfiziert worden waren.
  • Anschließend wurden 10 μg des in Kokai Nr. 304989/93 offenbarten Plasmids pChilgHB2 in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7.5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms Eco521 (Toyobo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 30 mM Natriumacetat (pH-Wert 5,0), 100 mM Natriumchlorid, 1 mM Zinkacetat und 10% Glyzerin enthielt, zu welchem 10 Einheiten Mungbohnen-Nuclease (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 10 Minuten umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde einer Phenol-Chloroformextraktion, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation, unterzogen. Dann wurden die überhängenden Enden unter Verwendung eines DAN Blunting Kit (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen. Nach der Ethanolpräzipitation wurde der Niederschlag in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,7 μg eines etwa 0,99 kb-ApaI-Fragments mit glatten Enden zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pBluescript SK(–) (Stratagene) zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 33 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,9), 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,5 mM DTT und 10 μg/ml BSE enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SmaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 30°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 3,0 kb-ApaI-SmaI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des wie vorstehend erhaltenen ApaI-Fragments mit glatten Enden von Plasmid pChilgHB2 und 0,1 μg des ApaI-SmaI-Fragments von pBluescript SK(–) zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 32. gezeigte Plasmid pBShCγ 1 zu erhalten.
  • Anschließend wurden 5 μg des wie vorstehend erhaltenen Plasmids pBShCγ 1 zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SpeI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 1,0 kb-ApaI-SpeI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 3 μg des wie vorstehend erhaltenen Plasmids pBSMoSalS zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SpeI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 3,66 kb-ApaI-SpeI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden jeweils 0,1 μg des wie vorstehend erhaltenen ApaI-SpeI-Fragments von pBShC γ 1 und ApaI-SpeI-Fragments von pBSMoSalS zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und wurden unter Verwendung der Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 33. gezeigte Plasmid pMohCγ 1 zu erhalten.
  • (6) Konstruktion des Tandem-Kassettentyp Expressionsvektors für humanisierten Antikörper pKANTEX93
  • Ein Tandem-Kassettentyp Expressionsvektor für humanisierten Antikörper, pKANTEX93, wurde unter Verwendung der in Unterabschnitt (1)–(5) von Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhaltenen verschiedenen Plasmide wie folgt konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden 3 μg des in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhaltenen Plasmid pBSH-SAEE zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mm Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SalI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 5,42 kb-HindIII-SalI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 5 μg des in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pBSK-HAEE zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,8 μg eines etwa 1,98 kb-KpnI-HindIII-Fragments zu gewinnen, welches das Spleiß-Poly-(A)-Signal des Kaninchen-β-Globingens, das Poly-(A)-Signal des frühen Gens von SV40 und den Promotor des frühen Gens von SV40 enthielt.
  • Anschließend wurden 5 μg des in Unterabschnitt (5) von Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhalten Plasmids pMohCγ 1 zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SalI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,8 μg eines etwa 1,66 kb-KpnI-SalI-Fragments zu gewinnen, welches die Expressionseinheit für die humanisierte-Antikörper-H-Kette enthielt.
  • Anschließend wurden jeweils 0,1 μg des wie vorstehend erhaltenen HindIII-SalI-Fragments von pBSH-SAEE, KpnI-HindIII Fragments von pBSK-HAEE und KpnI-SalI-Fragments von pMohCγ 1 zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhalten rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 34 gezeigte Plasmid pMo γ 1 SP zu erhalten.
  • Anschließend wurden 3 μg des auf diese Weise erhalten Plasmids pMo γ 1SP zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem jeweils 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SalI (Takara Shuzo) und XhoI hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 9,06 kb-SalI-XhoI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 5 μg des in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pBSK-HAEESal zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SalI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,7 μg eines etwa 1,37 kb-KpnI-SalI-Fragments zu gewinnen, welches das Spleiß-Signal des Kaninchen-β-Globingens, das Spleiß-Poly-(A)-Signal des „frühen" Gens des Kaninchen-β-Globingens und das Poly-(A)-Signal des frühen Gens von SV40 enthielt.
  • Anschließend wurden 5 μg des in Unterabschnitt (4) von Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pMohCK zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms KpnI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,7 μg eines etwa 1,06 kb-KpnI-Xhol-Fragments zu gewinnen, welches die L-Ketten-Expressionseinheit eines humanisierten Antikörpers enthielt.
  • Anschließend wurden jeweils 0,1 μg des wie vorstehend erhaltenen SalI-XhoI-Fragments von pMo γ 1SP, KpnI-SalI-Fragments von pBSK-HAEESal und KnpI-XhoI-Fragments von pMohCK zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4- DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhalten rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 35 gezeigte Plasmid pMoK γ 1SP zu erhalten.
  • Anschließend wurden 3 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pMoK γ 1SP in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SacII (Toyobo) hinzugefügt und bei 37°C für 10 Minuten Stunde umgesetzt wurden, sodass die DNA-Fragmente teilweise gespalten wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,2 μg eines etwa 8,49 kb-SacII-XhoI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 3 μg des in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pBSX-SA zu 10 μl eines Puffers gegeben, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SaclI (Toyobo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 10 μl eines Puffers aufgelöst, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XhoI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 4,25 kb-SaclI-XhoI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden jeweils 0,1 μg des wie vorstehend erhaltenen SalI-XhoI-Fragments von pMoKγ 1SP und SaclI-XhoI Fragments von pBSX-SA zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhalten rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 36 gezeigte Plasmid pKANTEX93 zu erhalten.
  • 2. Isolierung und Analyse der cDNAs, die monoclonale Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette codieren
  • (1) Isolierung von mRNA von Hybridomen, welche monoclonale Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette erzeugen
  • Unter Verwendung von Fast-Track, eines mRNA-Extraktionskits, hergestellt von Invitrogen, wurde mRNA von jeweils 1 × 108 Zellen der die monoclonalen Maus-anti-Mensch-IL-5R-α Antikörper KM1257, KM1259 und KM1486 erzeugenden Hybridom-Zelllinien (die den Hybridomen FERM BP-5133, FERM BP-5134 bzw. FERM BP-5651 entsprechen) gemäß den dem Kit beigefügten Anleitungen isoliert.
  • (2) Herstellung von H- und L-Ketten-cDNA-Banken aus Hybridomen, welche monoclonole-Maus-Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette erzeugen
  • Unter Verwendung eines cDNA Synthesis Kit (Pharmacia Biotech) und gemäß den dem Kit beigefügten Anleitungen wurde von jeweils 5 μg der in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 2 von Beispiel 2 erhalten mRNAs von KM1257, KM1259 und KM1486 gesondert eine cDNA synthetisiert, die an beiden Enden einen EcoRI-Adapter hatte. Etwa 6 μg von jeder cDNA wurde in 10 μl sterilisiertem Wasser aufgelöst und einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch jeweils etwa 0,1 μg eines etwa 1,5 kb-cDNA-Fragments zu gewinnen, welches der cDNA entspricht, welche die H-Kette des IgG-Typ-Antikörpers codiert und eines etwa 1,0 kb Fragments, welches der L-Kette von Immunglobulinen entspricht. Dann wurden 0,1 μg des etwa 1,5 kb-cDNA-Fragments oder des etwa 1,0 kb-cDNA-Fragments und 1 μg des Lamda ZAPII-Vektors [nach der Spaltung mit EcoRI mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt; Stratagene) wurden in 11,5 μl T4-Ligasepuffer aufgelöst, zu welchem 175 Einheiten T4-DNA-Ligase hinzugefügt und bei 12°C für 24 Stunden umgesetzt wurden, gefolgt von einer Inkubation bei Raumtemperatur für weitere 2 Stunden. Unter Verwendung von jeweils 4 μl des Reaktionsgemischs wurden cDNAs unter Verwendung von Giga Pack Gold (Stratagene) durch herkömmliche Verfahren (Molekular Cloning, 2.95, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) in einen λ-Phagen verpackt. Der E. coli-Stamm XL1-Blue [Biotechniques, 5, 376 (1987)] wurde mit den sich daraus ergebenden λ-Phagen in Giga Pack Gold durch herkömmliche Verfahren (Molecular Cloning, 2.95-107, Gold Spring Harbor Laboratory, 1989) infiziert, um jeweils etwa 4000 Phagen-Clone für die H-Ketten- cDNA-Bank und die L-Ketten-cDNA-Bank von KM1257, KM1259 und KM1486 zu erhalten.
  • (3) Clonierung der cDNAs, welche die H- und L-Ketten von monoclonalen Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette produzierenden Hybridomen codieren
  • Die in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 2 von Beispiel 2 hergestellten rekombinanten Phagen wurden durch herkömmliche Verfahren (Molecular Cloning, 2.12, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) an Nitrocellulosefilter gebunden. Die cDNA, welche die C-Region von Maus-Ig codiert {die H-Kette war ein Fragment von Maus-Cγ 1-cDNA [Cell, 18, 559 (1979)] und die L-Kette war ein Fragment von Maus-CK-cDNA [Cell, 22, 197 (1980)]}, wurde unter Verwendung von direkten ECL-Nucleinsäure-Markierungs- und Nachweissystemen (Amersham) markiert. Unter Verwendung jener markierten cDNA als Sonden wurden rekombinante Phagen durchmustert. Anschließend wurden, gemäß den dem Lamda ZAPII-Vektor (Stratagene) beigefügten Instruktionen, die Phagen-Clone durch das Plasmid pBluescript SK(–) ersetzt. Schließlich wurden die folgenden Plasmide erhalten: rekombinantes Plasmid pKM1257H, das eine cDNA umfasst, welche die H-Kette von KM1257 codiert, und rekombinantes Plasmid pKM1259L, das eine cDNA umfasst, welche die L-Kette von KM1257 codiert; rekombinantes Plasmid pKM1259H, das eine cDNA umfasst, welche die H-Kette von KM1259 codiert, und rekombinantes Plasmid pKM1259L, das eine cDNA umfasst, welche die L-Kette von KM1259 codiert; und rekombinantes Plasmid pKM1486H, welches eine cDNA umfasst, welche die H-Kette von KM1486 codiert, und ein rekombinantes Plasmid pKM1486L, welches eine cDNA umfasst, welche die L-Kette von KM1486 codiert.
  • (4) Bestimmung der Basensequenzen für die V-Regionen der cDNAs, welche die H- und L-Ketten von monoclonalen Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette codieren
  • Die Basensequenz für die V-Region von jeder der in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 2 von Beispiel 2 erhaltenen cDNAs, welche die H- und L-Ketten von monoclonalen Maus-anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpern codieren, wurde durch Umsetzung von 10 μg des sich daraus ergebenden Plasmids gemäß dem der AutoRead Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) beigefügten Anleitung analysiert und dann mit dem A. L. F.-DNA-Sequenziergerät (Pharmacia Biotech) einer Elektrophorese unterzogen. Von der auf diese Weise bestimmten Basensequenz für jede der cDNAs wurde eine Aminosäuresequenz für die V-Regionen der L- und H-Ketten von KM1257, KM1259 und KM1486 bestimmt. SEQ ID NOs: 22 und 23 zeigen die Basensequenz und Aminosäuresequenz der V-Region der H-Kette von KM1257; SEQ ID NOs: 24 und 25 zeigen jene der L-Kette von KM1257; SEQ ID NOs: 26 und 27 zeigen jene der H-Kette von KM1259; SEQ ID NOs: 28 und 29 zeigen jene der L-Kette von KM1259; SEQ ID NOs: 30 und 31 zeigen jene der H-Kette von KM1486; SEQ ID NOs: 32 und 33 zeigen jene der L-Kette von KM1486.
  • (5) Identifizierung der CDR-Sequenzen für die H- und L-Ketten von monoclonalen Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette
  • CDR-Sequenzen für jede H-Kette und jene für jede L-Kette wurden von der Aminosäuresequenz für die V-Regionen der H- und L-Ketten von jedem der in Unterabschnitt (4) von Abschnitt 2 von Beispiel 2 bestimmten monoclonalen Maus-anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper durch Vergleich der vorstehend angeführten Aminosäuresequenzen mit der Aminosäuresequenz von V-Regionen von bekannten Antikörpern (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) identifiziert. SEQ ID NOs: 34, 35 und 36 zeigen die Aminosäuresequenz für CDR1, CDR2 bzw. CDR3 der H-Kette von KM1257. SEQ ID NOs: 37, 38 und 39 zeigen die Aminosäuresequenz für CDR1, CDR2 bzw. CDR3 der L-Kette von KM1257. SEQ ID NOs: 40, 41 und 42 zeigen die Aminosäuresequenz für CDR1, CDR2 bzw. CDR3 der H-Kette von KM1259. SEQ ID NOs: 43, 44 und 45 zeigen die Aminosäuresequenz für CDR1, CDR2 bzw. CDR3 der L-Kette von KM1259. SEQ ID NOs: 46, 47 und 48 zeigen die Aminosäuresequenz für CDR1, CDR2 bzw. CDR3 der H-Kette von KM1486. SEQ ID NOs: 49, 50 und 51 zeigen die Aminosäuresequenz für CDR1, CDR2 bzw. CDR3 der L-Kette von KM1486.
  • 3. Herstellung von menschlichem chimärem Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette
  • Ein menschlicher chimärer anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper, der vom monoclonalen anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1259 abstammt und eine Aktivität zur Hemmung der biologischen Aktivität von menschlichem IL-5 hat, wurde wie nachstehend beschrieben hergestellt.
  • (1) Konstruktion des Expressionsvektors pKANTEX1259 für den menschlichen chimären Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette
  • Ein Expressionsvektor, pKANTEX1259, für einen menschlichen chimären Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette wurde wie folgt unter Verwendung des in Abschnitt 1 von Beispiel 2 konstruierten Expressionsvektors für humanisierten chimären Antikörper pKANTEX93 und der in Abschnitt 2 von Beispiel 2 erhaltenen Plasmide pKM1259H und pKM1259L konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden 3 μg des Expressionsvektors für humanisierten Antikörper pKANTEX93 zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01% Triton X-100 enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 12,75 kb-ApaI-NotI-Fragments zu gewinnen. Anschließend wurden 5 μg des Plasmids pKM1259H zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BanI (Toyobo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01% Triton X-100 enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,5 μg eines etwa 0,41 kb-BanI-NotI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden zwei synthetische DNAs, die die in SEQ ID NOs: 52 bzw. 53 gezeigten Basensequenzen hatten, unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts (380; Applied Biosystems) synthetisiert. Dann wurden jeweils 0,3 μg der erhaltenen synthetischen DNAs zu 15 μl sterilisiertem Wasser hinzugefügt und bei 65°C für 5 Minuten erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen gelassen. Zu diesem Gemisch wurden 2 μl eines 10 × Puffers [500 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT] und 2 μl 10 mM ATP hinzugefügt. Ferner wurden 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 30 Minuten umgesetzt, um die 5'-Enden zu phosphorylieren.
  • Dann wurden 0,1 μg des wie vorstehend erhaltenen ApaI-NotI-Fragments vom Expressionsvektor für humanisierten Antikörper pKANTEX93, 0,1 μg des vorstehend erhaltenen BanI-NotI-Fragments von Plasmid pKM1259H und 0,05 μg der vorstehend erhaltenen phosphorylierten synthetischen DNAs zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Endvolumen von 20 μl zu ergeben und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 37 gezeigte Plasmid pKANTEX1259H zu erhalten.
  • Anschließend wurden 3 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pKANTEX1259H zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthielt, zu welchem 10 Einheiten der Restriktionsenzyme EcoRI (Takara Shuzo) und SplI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 13.20 kb-EcoRI-SplI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 5 μg des Plasmids pKM1259L zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms AvaII (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,5 μg eines etwa 0,38 kb-AvaII-EcoRI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden zwei synthetische DNAs, die die in SEQ ID NOs: 54 bzw. 55 gezeigten Basensequenzen hatten, unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts (380; Applied Biosystems) synthetisiert. Dann wurden jeweils 0,3 μg der erhaltenen synthetischen DNAs zu 15 μl sterilisiertem Wasser hinzugefügt und bei 65°C für 5 Minuten erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen gelassen. Zu diesem Gemisch wurden 2 μl eines 10 × Puffers [500 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), 100 mM Magnesiumchlorid, 50 mM DTT] und 2 μl 10 mM ATP hinzugefügt. Ferner wurden 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 30 Minuten umgesetzt, um die 5'-Enden zu phosphorylieren.
  • Dann wurden 0,1 μg des EcoRI-SplI-Fragments von Plasmid pKANTEX1259H und 0,1 μg des AvaII-EcoRI-Fragments von Plasmid pKM1259L und 0,05 μg der phosphorylierten synthetischen DNAs, wie vorstehend erhalten, zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um eine Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf dieser Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 38 gezeigte Plasmid pKANTEX1259 zu erhalten.
  • (2) Expression des menschlichen chimären Antikörpers gegen die menschliche IL-5 α-Kette in Ratten-YB2/0-Myelomzellen (ATCC CRL1581) unter Verwendung von pKANTEX1259
  • Die Transfektion des Expressionsvektors für menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5 α-Antikörper- pKANTEX1259 in YB2/0-Zellen wurde gemäß dem Verfahren von Miyaji et. al. mittels Elektroporation durchgeführt [Cytotechnology, 3, 133, (1990)].
  • Kurz gesagt wurden 4 μg des in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 erhaltenen pKANTEX1259 in 4 × 106 YB2/0-Zellen transfiziert. RPMI1640-FCS(10) wurde dann in eine Microtiterplatte mit 96 Vertiefungen (200 μl/Vertiefung) aufgeteilt. Die Zellen wurden in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C für 24 Stunden gezüchtet. Dann wurde Geneticin (nachstehend als „G418" bezeichnet; Gibco) hinzugefügt, um eine Konzentration von 0,5 mg/ml zu ergeben und die Zellen wurden für weitere 1–2 Wochen gezüchtet. Der Kulturüberstand wurde von jenen Vertiefungen gewonnen, die mit dem Auftreten von Transformanten-Kolonien, welche G418-Resistenz hatten, konfluent geworden waren. Die Aktivität eines menschlichen chimären Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette im Kulturüberstand wurde durch das nachstehend beschriebene ELISA-Verfahren 1 oder 2 bestimmt.
  • ELISA-Verfahren 1
  • Der vom Kulturüberstand der Insektenzellen in Unterabschnitt (10) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltene shIL-5R α-Fc wurde mit PBS zu einer Konzentration von 5 μg/ml oder weniger verdünnt. Die Verdünnung wurde in eine EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (Greiner) (50 μl/Vertiefung) aufgeteilt, welche bei 4°C über Nacht stehen gelassen wurde, um dem Protein die Anlagerung zu ermöglichen. Nach dem Waschen der Platte wurde PBS, welches 1% Rinderserumalbumin (BSA) (1% BSA-PBS) enthielt, zu der Platte in einer Menge von 100 μl/Vertiefung hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt, um dadurch die verbleibenden aktiven Gruppen zu blockieren. Nach dem Verwerfen von 1% BSA-PBS wurden die Kulturüberstände der Transformanten oder die verschiedenen gereinigten Antikörper gegen die menschliche IL-5 α-Kette mit einer Konzentration von 40 μg/ml in einer Menge von 25 μl/Vertiefung zu der Platte hinzugefügt. Weiters wurde in Abschnitt 3 von Beispiel 1 hergestelltes mit Biotin markiertes menschliches IL-5 (0,4 μg/ml) zu der Platte in einer Menge von 25 μl/Vertiefung hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 4 Stunden umgesetzt. Nach dem Waschen mit 0,05% Tween-PBS wurde 4000-fach mit 1% BSA-PBS verdünntes, mit Peroxydase markiertes Avidin D (Nippon Reizo) in einer Menge von 50 μl/Vertiefung zu der Platte hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt. Nach dem Waschen mit 0,05% Tween-PBS wurde eine ABTS-Substrat-Lösung [hergestellt durch Auflösen von 550 mg von 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)diammonium in 1 l 0,1 M Citratpuffer (pH-Wert 4,2) und Hinzufügen von 1 μl/ml an Wasserstoffperoxid unmittelbar vor der Verwendung] mit 50 μl/Vertiefung hinzugefügt, um Farbentwicklung zu ermöglichen. Dann wurde das Absorptionsvermögen (OD) bei 415 nm gemessen. Der Absorptionswert in Abwesenheit eines Antikörpers wurde als Null Prozent Hemmung angesehen und, um jede Probe auszuwerten, wurden der Prozentsatz an Hemmung der Antikörper gegen mit Biotin markiertem IL-5 mittels folgender Formel berechnet.
  • Figure 01000001
  • Worin
    A: OD-Wert in der Anwesenheit eines Antikörpers
    B: OD-Wert in der Abwesenheit eines Antikörpers
    C: OD-Wert in der Abwesenheit von mit Biotin markiertem menschlichem IL-5.
  • ELISA-Verfahren 2
  • Der vom Kulturüberstand der Insektenzellen in Unterabschnitt (10) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltene shIL-5R α wurde mit PBS zu einer Konzentration von 2 μg/ml oder weniger verdünnt. Die Verdünnung wurde in eine EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (Greiner) (50 μl/Vertiefung) aufgeteilt, welche bei 4°C über Nacht stehen gelassen wurde, um dem Protein die Anlagerung zu ermöglichen. Nach dem Waschen der Platte wurde PBS, welches 1% Rinderserumalbumin (BSA) (1% BSA-PBS) enthielt, in einer Menge von 100 μl/Vertiefung zu der Platte hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt, um dadurch die verbleibenden aktiven Gruppen zu blockieren. Nach dem Verwerfen von 1% BSA-PBS wurden die Kulturüberstände der Transformanten oder der verschiedenen gereinigten Antikörper gegen die menschliche IL-5 α-Kette mit einer Konzentration von 50 μg/ml in einer Menge von 50 μl/Vertiefung zu der Platte hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 2 Stunden umgesetzt. Nach dem Waschen mit 0,05% Tween-PBS wurde mit Peroxidase markierter anti-Mensch-IgG-Antikörper (American Qualex International, Inc.), 500-fach mit 1% BSA-PBS verdünnt, in einer Menge von 50 μl/Vertiefung zu der Platte hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt. Nach dem Waschen mit 0,05% Tween-PBS wurde eine ABTS-Substrat-Lösung [hergestellt durch Auflösen von 550 mg von 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)diammonium in 1 l 0,1 M Citratpuffer (pH-Wert 4,2) und Hinzufügen von 1 μl/ml an Wasserstoffperoxid unmittelbar vor der Verwendung] mit 50 μl/Vertiefung hinzugefügt, um Farbentwicklung zu ermöglichen. Dann wurde das Absorptionsvermögen (OD) bei 415 nm gemessen.
  • Jene Transformanten, in deren Kulturüberständen eine Aktivität der menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper beobachtet wurde, wurden in RPMI1640-FCS(10)-Medium, das 0,5 mg/ml G418 und 50 nM MTX (Stigma) enthielt, suspendiert und in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C für 1–2 Wochen gezüchtet, um dadurch Transformanten zu induzieren, die eine Resistenz gegen 50 nM MTX haben. Sobald die Transformanten in den Vertiefungen konfluent geworden waren, wurde die Aktivität des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers im Überstand durch eines der vorstehend beschriebenen ELISA-Verfahren gemessen. Jene Transformanten, in welchen die Aktivität beobachtet wurde, wurden in einer ähnlichen Weise zu der vorstehend beschriebenen mit einer auf 100 nM und 200 nM erhöhten Konzentration von MTX weiter gezüchtet. Dadurch wurde ein Transformant erhalten, der in RPMI1640-FCS(10)-Medium wachsen konnte, welches 0,5 mg/ml G418 und 200 nM MTX enthielt, und der einen menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper erzeugte. Die auf diese Weise erhaltenen Transformanten wurden durch Anwendung des limitierenden Verdünnungsverfahrens einer Clonierung unterzogen, um dadurch einen endgültigen Transformanten zu erhalten, der menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper erzeugt. Als ein spezifisches Beispiel eines Transformanten, der menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper erzeugt, kann KM1399 (FERM BP-5650) angeführt werden. Der von diesem Stamm erzeugte menschliche chimäre anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper wurde als KM1399 bezeichnet. Die Transformante KM1399 wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology am 3. September 1996 unter der Zugangsnummer FERM BP-5650 hinterlegt. Die Produktivität des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 im Transformanten-Clon KM1399 war etwa 5 μg/105 Zellen/24 Std.
  • (3) Reinigung des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 vom Kulturüberstand
  • Der in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 erhaltene menschliche chimäre anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1399 wurde in GIT-Medium (Nippon Pharmaceuticals) suspendiert, welches 0,5 mg/ml G418 und 200 nM MTX enthielt, um eine Konzentration von 1–2 × 105 Zellen/ml zu ergeben und in 200 ml-Anteilen in 175 cm2-Flaschen (Greiner) aufgeteilt. Die Zellen wurden in einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C für 5–7 Tage gezüchtet und der Kulturüberstand wurde gewonnen, sobald jede Flasche konfluent wurde. Von etwa 1 Liter des Kulturüberstands wurden unter Verwendung einer Procep-A-Säule (Bioprocessing) etwa 3 mg des gereinigten menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 erhalten. Etwa 4 μg des gereinigten menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 wurden, gemäß bekannter Verfahren [Nature, 227, 680 (1970)] einer Elektrophorese unterzogen, um Molekulargewichtsanalysen durchzuführen. Die Ergebnisse werden in 39 gezeigt. Wie aus 39 ersichtlich, war das Gewicht der Antikörper-H-Kette etwa 50 KDa und das der Antikörper-L-Kette etwa 25 KDa unter reduzierenden Bedingungen. Somit wurde die Expression der H- und L-Ketten mit richtigem Molekulargewicht bestätigt. Andererseits war, unter nicht reduzierenden Bedingungen das Molekulargewicht des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 etwa 140 KDa. Somit wurde die Expression eines menschlichen chimären Antikörpers mit richtigem Molekulargewicht, bestehend aus zwei H-Ketten und zwei L-Ketten, bestätigt. Ferner wurden die N-terminalen Aminosäuresequenzen für die H- und L-Ketten des gereinigten menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 mit einem Protein-Sequenziergerät (470A, Applied Biosystems) mittels automatischem Edman-Verfahren untersucht. Demzufolge wurden die erwarteten richtigen Aminosäuresequenzen erhalten.
  • (4) Reaktivität des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 mit menschlichem IL-5R α (ELISA-Verfahren 1)
  • Die Reaktivitäten des anti-Mensch-IL-5R α-Maus-Antikörpers KM1259 und des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 mit menschlichem IL-5R α wurden durch das ELISA-Verfahren 1, welches in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschrieben wurde, bestimmt. Die Ergebnisse werden in 40 gezeigt. Wie aus 40 ersichtlich ist, konnte belegt werden, dass der menschliche chimäre anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1399 eine starke Reaktivität mit menschlichem IL-5R α hat, welche mit der Reaktivität des anti-Mensch-IL-5R α-Maus-Antikörpers KM1259 vergleichbar war.
  • 4. Transiente Expression des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers in COS-7-Zellen (ATCC CRL1651)
  • Um die Aktivitäten der verschiedenen Versionen der menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette, die später beschrieben werden, schneller bestimmen zu können, wurde die transiente Expression eines menschlichen chimären Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette in COS-7-Zellen, wie folgt, unter Verwendung von pKANTEX1259 und einem davon geänderten Vektor durch das Lipofectamin-Verfahren untersucht.
  • (1) Konstruktion eines verbesserten Vektors von pKANTEX1259
  • Da die Effizienz der transienten Expression eines Gens in tierischen Zellen von der Anzahl der Kopien des Expressionsvektors abhängt, die dort hinein transfiziert worden sind, wurde angenommen, dass ein kleinerer Expressionsvektor zu einer besseren Expressionseffizienz führen würde. Daher wurde ein kleinerer Expressionsvektor für menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper, pT1259, wie folgt, durch Deletion einiger Regionen von pKANTEX1259, von denen angenommen wurde, dass sie die Expression eines Antikörpers nicht beeinflussen, konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden 3 μg des Plasmids pKANTEX1259 zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 50 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms HindIII (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms MluI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und die durch den Verdau mit dem Restriktionsenzym erzeugten 5'-überhängenden Enden wurden unter Verwendung eines DNA Blunting Kits (Takara Shuzo) mit glatten Enden versehen. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 9,60 kb-DNA-Fragments zu gewinnen. Dann wurden 0,1 μg des gewonnenen DNA-Fragments zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um das in 41 gezeigte Plasmid pT1259 zu erhalten.
  • (2) Transiente Expression des menschlichen chimären Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette unter Verwendung von pT1259
  • COS-7-Zellen wurden in einer Konzentration von 1 × 105 Zellen/ml in eine Platte mit 6 Vertiefungen (2 ml/Vertiefung) aufgeteilt und bei 37°C über Nacht gezüchtet. Zu 100 μl OPTI-MEM (Gibco) wurden 2 μl pT1259 hinzugefügt, gefolgt von der Zugabe einer Lösung, die durch Hinzufügen von 10 μl Lipofectamin-Reagens (Gibco) zu 100 μl OPTI-MEM-Medium (Gibco) erhalten wurde. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 40 Minuten umgesetzt, um dadurch einen DNA-Liposomen-Komplex zu bilden. Die vorstehend beschriebenen COS-7-Zellen wurden zweimal mit 2 ml OPTI-MEM-Medium (Gibco) gewaschen und die Lösung, die den DNA-Liposomen-Komplex enthielt, wurde dazu hinzugefügt. Die Zellen wurden dann bei 37°C für 7 Stunden gezüchtet. Nach dem Entfernen der Kulturflüssigkeit wurden 2 ml DMEM-Medium (Gibco), welches 10% FCS enthielt, hinzugefügt und die Zellen wurden bei 37°C gezüchtet. 72 Stunden nach Beginn der Züchtung wurde der Kulturüberstand gewonnen und die Aktivität des menschlichen chimären Antikörpers gegen die menschliche anti-Mensch-IL-5R α-Kette im Kulturüberstand wurde durch das in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebene ELISA-Verfahren 1 ausgewertet. Wie in 42 gezeigt, wurde im Kulturüberstand der COS-7-Zellen, in welche pT1259 transfiziert worden war, eine konzentrationsabhängige Aktivität beobachtet. Die Expression eines menschlichen chimären Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette wurde somit bestätigt. Durch diese Ergebnisse wurde gezeigt, dass es möglich ist die Aktivitäten eines humanisierten Antikörpers, der von verschiedenen Expressionsvektoren abstammt, in einem transienten Expressionssystem durch Herstellung eines verbesserten kleinen Vektors pKANTEX93, der dann in COS-7-Zellen transfiziert wird, auszuwerten. Ferner wurde, um die Aktivitäten der verschiedenen später beschriebenen menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette genau zu vergleichen, die Konzentration des durch die transiente Expression im Kulturüberstand gebildeten Antikörpers mittels des nachfolgend in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 4 beschrieben ELISA-Verfahrens bestimmt.
  • (3) Bestimmung der Konzentration des humanisierten Antikörpers im Kulturüberstand mit transienter Expression durch ELISA
  • Eine Lösung wurde in eine Microtiterplatte mit 96 Vertiefungen aufgeteilt, die durch 400-fache Verdünnung mit PBS von Ziege-anti-Mensch-IgG-(γ-Kette)-Antikörper (Institute of Medicine & Biology) erhalten wurde und bei 4°C über Nacht umgesetzt. Nach dem Entfernen der Antikörperlösung wurden 100 μl/Vertiefung an 1% BSA-PBS hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt, um dadurch die verbleibenden aktiven Gruppen zu blockieren. Nach dem Verwerfen von 1% BSA-PBS wurden 50 μl/Vertiefung vom Kulturüberstand mit transienter Expression oder des gereinigten menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde das Gemisch entfernt und die Platte mit 0,05% Tween-PBS gewaschen. Dann wurden 50 μl/Vertiefung einer Lösung zu der Platte hinzugefügt, die durch 500-fache Verdünnung von mit Peroxidase markiertem Maus-anti-Mensch-K-L-Ketten-Antikörper (Zymed) mit 1% BSA-PBS erhalten wurde, und bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt. Nach dem Waschen mit 0.05% Tween-PBS wurden 50 μl/Vertiefung an ABTS-Substrat-Lösung hinzugefügt [erhalten durch Auflösen von 550 mg an 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)diammonium in 1 Liter 0,1 M Citratpuffer (pH-Wert 4,2) und Hinzufügen von 1 μl/ml von Wasserstoffperoxid unmittelbar vor der Verwendung], um Farbentwicklung zu ermöglichen. Dann wurde das Absorptionsvermögen (OD) bei 415 nm gemessen.
  • 5. Herstellung eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette
  • Ein menschlicher "CDR-grafted" Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette wurde, wie nachstehend beschrieben, hergestellt; der Antikörper hatte eine vergleichbare Aktivität mit dem monoclonalen Maus-anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1259 und dem menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1399, von welchen beide eine Aktivität zur Hemmung der biologischen Aktivität von menschlichem IL-5 hatten.
  • (1) Konstruktion einer cDNA basierend auf der Konsensussequenz für die VH von bekannten menschlichen Antikörpern, welche die VH eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette codiert
  • Kabat et. al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) klassifizierte, basierend auf der Homologie der FR-Sequenz, verschiedene bekannte menschliche Antikörper-VH in Untergruppen 1–III (HSG I–III) und identifizierte die Konsensussequenz für jede Untergruppe. Die hier genannten Erfinder haben daher beschlossen, basierend auf diesen Konsensussequenzen, eine Aminosäuresequenz für eine menschliche CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper-VH zu entwerfen. Um eine Konsensussequenz auszuwählen, die als Basis verwendet werden kann, wurde zuerst die Homologie zwischen der FR-Sequenz für die VH des monoclonalen Maus-anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1259 und der FR-Sequenz der Konsensussequenz der menschlichen Antikörper-VH von jeder Untergruppe untersucht. (Tabelle 1).
  • Tabelle 1 Homologie (%) zwischen der FR-Sequenz für Maus-KM1259VH und der FR-Sequenz der Konsensussequenz von menschlichen Antikörper-VHs jeder Untergruppe
    Figure 01070001
  • Demzufolge wurde bestätigt, dass Maus-KM1259VH in der FR-Sequenz, die höchste Homologie zu Untergruppe I hat. Die Aminosäuresequenz für eine menschliche-CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper-VH wurde daher auf der Basis der Konsensussequenz von Untergruppe I entworfen und eine cDNA, welche die vorstehend angeführte Aminosäuresequenz codiert, wurde, wie nachstehend beschrieben, unter Verwendung von PCR konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden 6 synthetische DNAs, die die in SEQ ID NOs: 56 bis 61 gezeigten Basensequenzen hatten, unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts (380; Applied Biosystems) synthetisiert. Jede der synthetisierten DNAs wurde zu 50 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,001% Gelatine, 200 μM dNTP, 0,5 μM M13 Primer-RV (Takara Shuzo), 0,5 μM M13 Primer-M4 (Takara Shuzo) und 2 Einheiten TaKaRa Taq-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) enthielt, um eine Endkonzentration von 0,1 μM zu ergeben. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde mit 50 μl Mineralöl bedeckt und in einen DNA-Thermocycler (PJ480; Perkin Elmer) gegeben. PCR wurde dann für 30 Zyklen durchgeführt, jeder Zyklus bestehend aus 94°C für 2 Minuten, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 2 Minuten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 20 μl TE-Puffer aufgelöst. Danach wurde das Gemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,2 μg eines amplifizierten Fragments von etwa 0,48 kb zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 3 μg von Plasmid pBluescriptSK(–) (Stratagene) zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 33 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,9), 10 mM Magnesiumacetat, 66 mM Kaliumacetat, 0,5 mM DTT und 100 μg/ml BSA enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms SmaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 30°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 20 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,0) und 1 mM Magnesiumchlorid enthielt, zu welchem 1 Einheit alkalische Phosphatase (E. coli C75, Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurde, um dadurch die 5'-Enden zu dephosphorylieren. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanolpräzipitation, unterzogen. Der Niederschlag wurde in 20 μl TE-Puffer aufgelöst.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des durch PCR erhaltenen amplifizierten Fragments und 0,1 μg des SmaI-Fragments von pBluescriptSK(–) zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert. Von 10 Transformanten-Clonen wurde einzeln Plasmid-DNA hergestellt und die Basensequenz davon bestimmt. Als Ergebnis wurde das in 43 gezeigte Plasmid phKM1259HV0 erhalten, das eine cDNA umfasst, welche die Aminosäuresequenz für eine menschliche CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper-VH von Interesse codiert. Die Basensequenz und die Aminosäuresequenz für die menschliche CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper-VH, die in phKM1259HV0 (nachstehend als „HV.0" bezeichnet) enthalten sind, werden in SEQ ID NOs: 62 und 63 gezeigt.
  • (2) Konstruktion einer cDNA basierend auf der Konsensussequenz für die VL von bekannten menschlichen Antikörpern, die die VL eines menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers codiert
  • Kabat et. al. klassifizierte, basierend auf der Homologie der FR-Sequenz, verschiedene bekannte menschliche Antikörper-VL in Untergruppen I–IV (HSG I–IV) und identifizierte die Konsensussequenz für jede Untergruppe. Die vorliegenden Erfinder haben daher beschlossen, basierend auf diesen Konsensussequenzen, eine Aminosäuresequenz für eine menschliche-CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper-VL zu entwerfen. Um eine Konsensussequenz auszuwählen, die als Basis verwendet werden kann, wurde zuerst die Homologie zwischen der FR-Sequenz für die VL des monoclonalen Maus-anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1259 und der FR-Sequenz der Konsensussequenz der menschlichen Antikörper-VL von jeder Untergruppe untersucht (Tabelle 2).
  • Tabelle 2 Homologie (%) zwischen der FR-Sequenz für Maus-KM1259VL und der FR-Sequenz der Konsensussequenz von menschlichen Antikörper-VLs jeder Untergruppe
    Figure 01090001
  • Demzufolge wurde bestätigt, dass Maus-KM1259VL in der FR-Sequenz die höchste Homologie zu Untergruppe I hat. Die Aminosäuresequenz für eine menschliche-CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper-VL wurde daher auf der Basis der Konsensussequenz von Untergruppe I entworfen und eine cDNA, welche die vorstehend angeführte Aminosäuresequenz codiert, wurde, wie nachstehend beschrieben, unter Verwendung von PCR konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden 6 synthetische DNAs, die die in SEQ ID NOs: 64 bis 69 gezeigten Basensequenzen hatten, unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts (380; Applied Biosystems) synthetisiert. Jede der synthetisierten DNAs wurde zu 50 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3), 50 mM Kaliumchlorid, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 0,001% Gelatine, 200 μM dNTP, 0,5 μM M13-Primer RV (Takara Shuzo), 0,5 μM M13-Primer M4 (Takara Shuzo) und 2 Einheiten TaKaRa-Taq-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) enthielt, um eine Endkonzentration von 0,1 μM zu ergeben. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde mit 50 μl Mineralöl bedeckt und in einen DNA-Thermocycler (PCR-Gerät) (PJ480; Perkin Elmer) gegeben. PCR wurde dann für 30 Zyklen durchgeführt, jeder Zyklus bestehend aus 94°C für 2 Minuten, 55°C für 2 Minuten und 72°C für 2 Minuten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde in 20 μl TE-Puffer aufgelöst. Danach wurde die Lösung einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,2 μg eines amplifizierten Fragments von etwa 0,43 kb zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des vorstehend durch PCR erhaltenen amplifizierten Fragments und 0,1 μg des in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 erhaltenen SmaI-Fragments von pBluescriptSK(–) zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert. Von 10 Transformanten-Clonen wurde einzeln Plasmid-DNA hergestellt und die Basensequenz davon bestimmt. Als Ergebnis wurde das in 44 gezeigte Plasmid phKM1259LV0 erhalten, das eine cDNA umfasst, welche die Aminosäuresequenz für eine menschliche CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper-VL von Interesse codiert. Die Basensequenz und die Aminosäuresequenz für die menschliche CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper-VL, die in phKM1259LV0 (nachstehend als „LV.0" bezeichnet) enthalten sind, werden in SEQ ID NOs: 70 und 71 gezeigt.
  • (3) Konstruktion eines Expressionsvektors für menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper pKANTEX1259HV0LV0, basierend auf der Konsensussequenz der V-Regionen von bekannten menschlichen Antikörpern
  • Der Expressionsvektor für menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper pKANTEX1259HV0LV0 wurde, wie nachstehend beschrieben, unter Verwendung des in Abschnitt 1 von Beispiel 2 erhaltenen Expressionsvektors für humanisierten Antikörper pKANTEX93, des in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 erhaltenen Plasmids phKM1259HV0 und des in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 erhaltenen Plasmids phKM1259LV0 konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden 5 μg des Plasmids pKM1259HV0 zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 100 μg/ml BSA und 0,01% Triton X-100 enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms NotI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,5 μg eines etwa 0,44 kb-ApaI-NotI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments des in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 erhaltenen Expressionsvektors für humanisierten Antikörper pKANTEX93 und 0,1 μg des ApaI-NotI-Fragments von Plasmid phKM1259HV0, vorstehend erhalten, zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um dadurch das in 45 gezeigte Plasmid pKANTEX1259HV0 zu erhalten.
  • Anschließend wurden 3 μg des auf diese Weise erhaltenen Plasmids pKANTEX1259HV0 zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 M DTT und 100 μg/ml BSA enthielt, zu welchem je 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) und des Restriktionsenzyms SplI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 13,20 kb-EcoRI-SplI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 5 μg von Plasmid pKANTEX1259LV0 zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 1 M DTT und 100 μg/ml BSA enthielt, zu welchem je 10 Einheiten des Restriktionsenzyms EcoRI (Takara Shuzo) und des Restriktionsenzyms SplI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für eine Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,5 μg eines etwa 0,39 kb-EcoRI-SplI-Fragments zu gewinnen.
  • Dann wurden 0,1 μg des vorstehend erhaltenen EcoRI-SplI-Fragments von Plasmid pKANTEX1259HV0 und 0,1 μg des vorstehend erhaltenen EcoRI-SplI-Fragments von Plasmid pKANTEX1259LV0 zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde E. coli HB101 transformiert, um dadurch das in 46 gezeigte Plasmid pKANTEX1259HV0LV0 zu erhalten.
  • (4) Expression von menschlichen CDR-grafted Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette basierend auf der Konsensussequenz von bekannten menschlichen Antikörper-V-Regionen in Ratten-Myelom-YB2/0-Zellen (ATCC CRL1581) unter Verwendung von pKANTEX1259HV0LV0
  • Die Expression eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette, basierend auf der Konsensussequenz von bekannten menschlichen Antikörper-V-Regionen, in Ratten-Myelom-YB2/0-Zellen (ATCC CRL1581) wurde unter Verwendung von pKANTEX1259HV0LV0 gemäß dem in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
  • Als Ergebnis wurde KM8397 als eine Transformante erhalten, die einen menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette herstellt, basierend auf der Konsensussequenz von bekannten menschlichen Antikörper-V-Regionen. Der menschliche CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette, der von dem Stamm erzeugt wurde, wurde als KM8397 bezeichnet. Die Produktivität des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397 in der Transformante KM8397 war etwa 4 μg/106 Zellen/24 Std.
  • (5) Reinigung des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397 vom Kulturüberstand
  • Der in Unterabschnitt (4) von Abschnitt 5 von Beispiel 3 erhaltene Clon KM8397, der menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette produzierte, wurde gemäß dem in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren gezüchtet und gereinigt, um dadurch etwa 2 mg von KM8397 zu erhalten. Etwa 4 μg des gereinigten menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397 wurde gemäß dem in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren einer Elektrophorese unterzogen, um sein Molekulargewicht zu untersuchen. Die Ergebnisse werden in 47 gezeigt. Wie aus 47 ersichtlich, ist das Molekulargewicht der Antikörper H-Kette etwa 50 KDa und das der Antikörper L-Kette etwa 25 KDa unter reduzierenden Bedingungen. Folglich wurde die Expression der H- und L-Kette mit richtigem Molekulargewicht bestätigt. Andererseits ist das Molekulargewicht des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397 unter nichtreduzierenden Bedingungen etwa 140 KDa. Folglich wurde die Expression eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers der richtigen Größe, der aus zwei H-Ketten und zwei L-Ketten besteht, bestätigt. Ferner wurde die N-terminale Aminosäurensequenz für die H- und L-Ketten des gereinigten menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397 mit einem Protein-Sequenziergerät (470A, Applied Biosystems) durch das automatische Edman Verfahren analysiert. Demzufolge wurden die richtigen erwarteten Aminosäuresequenzen erhalten.
  • (6) Reaktivität des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397 mit menschlichem IL-5R α (ELISA-Verfahren 2)
  • Die Reaktivitäten des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 und des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397 mit menschlichem IL-5R α wurden durch das in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebenen ELISA-Verfahren 2 bestimmt. Die Ergebnisse werden in 48 gezeigt. Wie aus 48 ersichtlich, konnte gezeigt werden, dass die Reaktivität des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397 mit IL-5R α etwa die Hälfte der Reaktivität des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 ist.
  • 6. Steigerung der Aktivität des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397 durch Änderung der Aminosäuresequenz für die V-Region
  • Die Reaktivität des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397 mit menschlichem IL-5R α verminderte sich zu etwa der halben Reaktivität des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399. Daher wurde die Aktivität von KM8397 durch Änderung der Aminosäuresequenz für die V-Region durch nachstehend beschriebene Verfahren gesteigert.
  • (1) Änderung der Aminosäuresequenz für VH des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397
  • Durch Mutation der Aminosäuren der VH des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397, gezeigt in SEQ ID NO: 63, wurden verschiedene veränderte Versionen von VH des menschlichen CDR-grafted Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette hergestellt. Die Aminosäuren, die mutiert werden sollten, wurden willkürlich unter Bezugnahme auf ein computerisiertes dreidimensionales Strukturmodell für die V-Region des anti-Mensch-IL-5R α-Maus-Antikörpers KM1259 ausgewählt. Als Verfahren zur Transfektion einer Mutation wurde durch Durchführung der in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Primern für die Mutation ein Plasmid erhalten, welches die cDNA umfasst, die eine geänderte Version des VHs von Interesse des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers codiert.
  • Tatsächlich wurde ein Plasmid, pKM1259HV1, mittels Durchführung der in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der in SEQ ID NO: 72 gezeigten Sequenz als Primer für die Mutation und unter Verwendung der synthetischen DNAs, die die Basensequenzen der SEQ ID NOs: 56, 57, 58, 59, 72 bzw. 61 hatten, erhalten, wobei das Plasmid eine cDNA umfasst, welche die geänderte Version 1 von VH (nachstehend als „HV.1" bezeichnet) des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers codiert, die in SEQ ID NO: 74 gezeigt wird. In der Aminosäuresequenz von HV.1 wurden das in der FR der SEQ ID NO: 63 gelegene Trypsin in Position 95 und Alanin in Position 97 mit Leucin bzw. Gycin ersetzt, welches Aminosäuren sind, die in der V-Region der Maus-Antikörper-KM1259-H-Kette vorgefunden werden, um die Reaktivität mit menschlichem IL-5R α, welches vom Maus-Antikörper und dem menschlichen chimären Antikörper erkannt wird, beizubehalten.
  • Ferner wurde ein Plasmid, pKM1259HV2, mittels Durchführung der in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der in SEQ ID NOs: 72, 75 und 76 gezeigten Sequenzen als Primer für die Mutation und unter Verwendung der synthetischen DNAs, die die Basensequenzen der SEQ ID NOs: 56, 57, 75, 76, 72 bzw. 61 haben, erhalten, wobei das Plasmid eine cDNA umfasst, welche die geänderte Version 2 von VH (nachstehend als „HV.2" bezeichnet) des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers codiert, die in SEQ ID NO: 78 gezeigt wird. In der Aminosäuresequenz von HV.2 wurde die in der FR der SEQ ID NO: 63 gelegene Glutaminsäure in Position 46, Threonin in Position 74, Thyrosin in Position 95 und Alanin in Position 97 mit Alanin, Arginin, Leucin bzw. Glycin ersetzt, welches die Aminosäuren sind, die in der V-Region der Maus-Antikörper-KM1259-H-Kette vorgefunden werden, um die Reaktivität mit menschlichem IL-5R α, welches vom Maus-Antikörper und dem menschlichen chimären Antikörper erkannt wird, beizubehalten.
  • Ferner wurde ein Plasmid, pKM1259HV3, mittels Durchführung der in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der in SEQ ID NOs: 79, 80 und 81 gezeigten Sequenzen als Primer für die Mutation und unter Verwendung der synthetischen DNAs, die die Basensequenzen der SEQ ID NOs: 56, 57, 79, 80, 81 bzw. 61 haben, erhalten, wobei das Plasmid eine cDNA umfasst, welche die geänderte Version 3 von VH (nachstehend als „HV.3" bezeichnet) des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers codiert, die in SEQ ID NO: 83 gezeigt wird. In der Aminosäuresequenz von HV. 3 wurde das in der FR der SEQ ID NO: 63 gelegene Alanin in Position 40, Glutaminsäure in Position 46, Arginin in Position 67, Alanin in Position 72, Threonin in Position 74, Alanin in Position 79, Thyrosin in Position 95 und Alanin in Position 97 jeweils mit Arginin, Alanin, Lysin, Serin, Arginin, Valin, Leucin und Glycin ersetzt, welches die Aminosäuren sind, die in der V-Region der Maus-Antikörper-KM1259-H-Kette vorgefunden werden, um die Reaktivität mit menschlichem IL-5R α, welches vom Maus-Antikörper und dem menschlichen chimären Antikörper erkannt wird, beizubehalten.
  • Während die Versionen, eine nach der anderen, von HV.0 zu HV.4 fortschreiten, nimmt die Anzahl der von monoclonalen Antikörpern abstammenden Aminosäuren, die an den Änderungen beteiligt sind, mit zunehmender Versions-Nummer, von HV.0 zu HV.3, zu.
  • (2) Änderung der Aminosäurensequenz für VL des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397
  • Durch Mutation der Aminosäuren der VH des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397 gezeigt in SEQ ID NO: 71, wurden verschiedene veränderte Versionen der VL des menschlichen CDR-grafted Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette hergestellt. Die Aminosäuren, die mutiert werden sollten, wurden willkürlich unter Bezugnahme auf ein computerisiertes dreidimensionales Strukturmodell für die V-Region des anti-Mensch-IL-5R α-Maus-Antikörpers KM1259 ausgewählt. Als Verfahren zur Transfektion einer Mutation wurde, durch Durchführung der in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Primern für die Mutation, ein Plasmid erhalten, welches die cDNA umfasst, die eine geänderte Version des VLs von Interesse des menschlichen CDR-grafted Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette codiert.
  • Tatsächlich wurde ein Plasmid, pKM1259LV1, mittels Durchführung der in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der in SEQ ID NOs: 84, 85, und 86 gezeigten Sequenzen als Primer für die Mutation und unter Verwendung der synthetischen DNAs, die die Basensequenzen der SEQ ID NOs: 64, 65, 84, 85, 68 bzw. 86 haben, erhalten, wobei das Plasmid eine cDNA umfasst, welche die geänderte Version 1 von VL (nachstehend als „LV.1" bezeichnet) des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers codiert, die in SEQ ID NO: 88 gezeigt wird. In der Aminosäuresequenz von LV.1 wurde das in der FR der SEQ ID NO: 71 gelegene Glutamin in Position 37, Lysin in Position 45 und Phenylalanin in Position 98 durch Arginin, Glutamatsäure bzw. Valin ersetzt, welches die Aminosäuren sind, die in der V-Region der Maus-Antikörper-KM1259-L-Kette vorgefunden werden, um die Reaktivität mit menschlichem IL-5R α, welches von dem monoclonalen Antikörper und dem menschlichen chimären Antikörper erkannt wird, beizubehalten.
  • Ferner wurde ein Plasmid, pKM1259LV2, mittels Durchführung der in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der in SEQ ID NOs: 85, 86, 89 und 90 gezeigten Sequenzen als Primer für die Mutation und unter Verwendung der synthetischen DNAs, die die Basensequenzen der SEQ ID NOs: 64, 65, 89, 85, 90 bzw. 86 haben, erhalten, wobei das Plasmid eine cDNA umfasst, welche die geänderte Version 2 von VL (nachstehend als „LV.2" bezeichnet) des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers codiert, die in SEQ ID NO: 92 gezeigt wird.
  • In der Aminosäuresequenz von LV.2 wurde das in der FR der SEQ ID NO: 71 gelegene Threonin in Position 22, Glutamin in Position 37, Lysin in Position 45, Serin in Position 77 und Phenylalanin in Position 98 mit Glycin, Arginin, Glutaminsäure, Asparaginsäure bzw. Valin ersetzt, welches die Aminosäuren sind, die in der V-Region der monoclonalen Antikörper-KM1259-L-Kette vorgefunden werden, um die Reaktivität mit menschlichen IL-5R α, das von dem monoclonalen Antikörper und dem menschlichen chimären Antikörper erkannt wird, beizubehalten.
  • Ferner wurde ein Plasmid, pKM1259LV3, mittels Durchführung der in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der in SEQ ID NOs: 85, 93, 94, 95 und 96 gezeigten Sequenzen als Primer für die Mutation und unter Verwendung der synthetischen DNAs, die die Basensequenzen der SEQ ID NOs: 64, 93, 94, 85, 95 bzw. 96 haben, erhalten, wobei das Plasmid eine cDNA umfasst, welche die geänderte Version 3 von VL (nachstehend als „LV.3" bezeichnet) des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers codiert, die in SEQ ID NO: 98 gezeigt wird. In der Aminosäuresequenz von LV.3 wurde das in der FR der SEQ ID NO: 71 gelegene Serin in Position 7, Prolin in Position 8, Threonin in Position 22, Glutamin in Position 37, Glutamin in Position 38, Lysin in Position 45, Serin in Position 77, Tyrosin in Position 87 und Phenylalanin in Position 98 mit Alanin, Threonin, Glycin, Arginin, Lysin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Phenylalanin bzw. Valin ersetzt, welches die Aminosäuren sind, die in der V-Region der monoclonalen Antikörper-KM1259-L-Kette vorgefunden werden, um die Reaktivität mit menschlichem IL-5R α, das von dem monoclonalen Antikörper und dem menschlichen chimären Antikörper erkannt wird, beizubehalten.
  • Ferner wurde ein Plasmid, pKM1259LV4, mittels Durchführung der in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der in SEQ ID NOs: 93, 96, 99, 100 und 101 gezeigten Sequenzen als Primer für die Mutation und unter Verwendung der synthetischen DNAs, die die Basensequenzen der SEQ ID NOs: 64, 93, 99, 100, 101 bzw. 96 haben, erhalten, wobei das Plasmid eine cDNA umfasst, welche die geänderte Version 4 von VL (nachstehend als „LV.4" bezeichnet) des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers codiert, die in SEQ ID NO: 103 gezeigt wird. In der Aminosäuresequenz von LV.4 wurde das in der FR der SEQ ID NO: 71 gelegene Serin in Position 7, Prolin in Position 8, Threonin in Position 22, Glutamin in Position 37, Glutamin in Position 38, Prolin in Position 44, Lysin in Position 45, Phenylalanin in Position 71, Serin in Position 77, Tyrosin in Position 87 und Phenylalanin in Position 98 mit Alanin, Threonin, Glycin, Arginin, Lysin, Valin, Glutaminsäure, Tyrosin, Asparaginsäure, Phenylalanin bzw. Valin ersetzt, welches die Aminosäuren sind, die in der V-Region der Maus-Antikörper-KM1259-L-Kette vorgefunden werden, um die Reaktivität mit IL-5R α, das vom monoclonalen Antikörper und dem menschlichen chimären Antikörper erkannt wird, beizubehalten.
  • Während die Versionen, eine nach der anderen, von LV.0 zu LV.4 fortschreiten, nimmt als Ergebnis die Anzahl der von monoclonalen Antikörpern abstammenden Aminosäuren, die an der Änderung beteiligt sind, mit zunehmender Versions-Nummer von LV.0 zu LV.4 zu.
  • (3) Herstellung von menschlichen „CDR-grafted Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette, die verschiedene veränderte Versionen der V-Region haben
  • Unter Verwendung des in Abschnitt 1 von Beispiel 2 konstruierten Expressionsvektors für humanisierten Antikörper pKANTEX93 und verschiedenen Plasmiden, welche cDNAs umfassen, die verschiedene geänderte Versionen der V-Region der in Unterabschnitt (1) und (2) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 erhaltenen menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette codieren, wurden Vektoren zur Expression von menschlichen CDR-grafted Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette, die verschiedene geänderte Versionen der V-Region hatten, mittels der in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren konstruiert. Tabelle 3 zeigt Kombinationen von verschiedenen geänderten Versionen der V-Region, die in den konstruierten Expressionsvektoren verwendet wurden, und die Bezeichnung dieser Expressionsvektoren.
  • Tabelle 3
    Figure 01190001
  • Von diesen Expressionsvektoren wurde eine Gesamtanzahl an 13 Vektoren pKANTEX1259HV0LV0, pKANTEX1259HV1LV0, pKANTEX1259HV2LV0, pKANTEX1259HV0LV1, pKANTEX1259HV1LV1, pKANTEX1259HV2LV1, pKANTEX1259HV0LV2, pKANTEX1259HV1LV2, pKANTEX1259HV2LV2, pKANTEX1259HV0LV3, pKANTEX1259HV1LV3, pKANTEX1259HV2LV3 und pKANTEX1259HV3LV3 durch das in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 4 von Beispiel 2 beschriebene Verfahren in transiente Expressionsvektoren geändert. Unter Verwendung dieser transienten Expressionsvektoren und gemäß dem in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 4 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde die transiente Expression von menschlichen CDR-grafted Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette durchgeführt, die verschiedene veränderte Versionen der V-Region haben. Als eine Kontrolle wurde die transiente Expression des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 gleichzeitig durchgeführt. Die Bindungsaktivität eines Antikörpers im Kulturüberstand für menschlichen IL-5R α wurde durch das in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebene ELISA-Verfahren 1 bestimmt und die Antikörperkonzentration im Kulturüberstand wurde durch das in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 4 von Beispiel 2 beschriebene ELISA-Verfahren 2 bestimmt. Unter Verwendung von zwei ELISA-Verfahren werden die Aktivitäten der menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette, welche verschiedene geänderte Versionen der V-Regionen haben, in 49 als relative Werte gezeigt, in welchen die Aktivität des menschlichen chimären Antikörpers KM1399 als 100 genommen wird. In 49 sind verschiedene geänderte Versionen der menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette durch eine Kombination aus VH und VL dargestellt. Aus 49 ist eine Tendenz bei VH insofern erkennbar, als dass die Aktivität zunimmt, wenn die Änderung von HV.0 zu HV.3 fortschreitet. Im Hinblick auf VL ist eine Tendenz insofern erkennbar, als dass die Reaktivität in LV.0 und LV.3 hoch ist, in LV.1 und LV.2 aber niedrig. Eine genauere Bewertung der Aktivität von menschlichen CDR-grafted Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette, welche die Kombinationen von LV.0 und verschiedenen geänderten VH; LV.3 und HV.0; LV.3 und HV.3 und LV.4, welches eine weitere geänderte Version von LV.3 ist, und verschiedene geänderte VH umfasst, wurde unter Verwendung gereinigter Antikörper wie folgt durchgeführt.
  • Kurz gesagt wurden unter Verwendung der vorstehend beschriebenen 10 Expressionsvektoren für menschliche CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette, d. h. pKANTEX1259HV0LV0, pKANTEX1259HV1 LV0, pKANTEX1259HV2LV0, pKANTEX1259HV3LV0, pKANTEX1259HV0LV3, pKANTEX1259HV3LV3, pKANTEX1259HV0LV4, pKANTEX1259HV1LV4, pKANTEX1259HV2LV4, pKANTEX1259HV3LV4 und gemäß dem in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren die Antikörper von Interesse in YB2/0-Zellen exprimiert, um dadurch Transformanten zu erhalten, die verschiedene menschliche CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette auf einem Produktivitätsniveau von 2–4 μg/106 Zellen/24 Std erzeugten. Die Transformanten, die verschiedene menschliche CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette erzeugten, wurden mittels der in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren gezüchtet und gereinigt, um dadurch 1–2 mg von jedem der verschiedenen menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette zu erhalten. Etwa 4 μg von jedem der verschiedenen gereinigten menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette wurden mittels des in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens einer Elektrophorese unterzogen, um ihr Molekulargewicht zu messen. Unter reduzierenden Bedingungen ist das Molekulargewicht der Antikörper-H-Kette etwa 50 KDa und das der Antikörper-L-Kette etwa 25 KDa in jedem der menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette. Somit wurde die Expression von H- und L-Ketten mit dem richtigen Molekulargewicht bestätigt. Unter nicht reduzierenden Bedingungen ist das Molekulargewicht des Antikörpers in jedem der menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette etwa 140 KDa. Somit wurde die Expression von menschlichen CDR-grafted Antikörpern bestätigt, die jeder aus zwei H-Ketten und zwei L-Ketten der korrekten Größe bestehen. Ferner wurden die N-terminalen Aminosäuresequenzen für die H- und L-Ketten der verschiedenen gereinigten menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette mit einem Protein-Sequenziergerät (470A, Applied Biosystems) durch das automatische Edman-Verfahren analysiert. Demzufolge wurden in jedem dieser Antikörper die richtigen Aminosäuresequenzen, wie erwartet, erhalten.
  • Die Reaktivität mit menschlicher IL-5R α-Kette in den vorstehend erhaltenen verschiedenen gereinigten menschlichen CDR-grafted Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette wurde durch das in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebene ELISA-Verfahren 2 bestimmt und die Ergebnisse werden in 50 gezeigt. In 50 sind verschiedene geänderte Versionen der menschlichen CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette durch eine Kombination aus VH und VL dargestellt. Wie aus 50 ersichtlich ist, konnte von den 10 gereinigten menschlichen CDR-grafted Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette bei HV.3LV.0 und HV.3LV.4 eine Reaktivität mit menschlichem IL-5R α nachgewiesen werden, die so stark war wie die Reaktivität des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399.
  • Als die Aminosäuresequenzen für die menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper HV.3LV.0 und HV.3LV.4 verglichen wurden, welche eine Reaktivität mit menschlichem IL-5R α aufweisen, die so stark ist wie die Reaktivität des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399, hatten beide die gleiche Aminosäuresequenz für VH, welche als HV.3 gezeigt wird, aber sie hatten verschiedene Aminosäuresequenzen für VL, d. h. gezeigt als LV.0 und LV.4. Während LV.0 eine Sequenz ist, die durch einfaches Verpflanzen der CDR an die FR eines menschlichen Antikörpers erhalten wurde, ist LV.4 eine Sequenz, die durch Änderung von 11 Aminosäureresten innerhalb der FR eines menschlichen Antikörpers in jene Aminosäurereste erhalten wurde, die innerhalb des monoclonalen Antikörpers gefunden wurden, um die Aktivität zu erhöhen. Aber wie aus den Ergebnissen in 50 ersichtlich ist, beeinflusst die Änderung der Aminosäurereste den Anstieg der Aktivität eigentlich wenig. Basierend auf diesen Tatsachen wurde HV.3LV.0 als ein menschlicher CDR-grafted Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette ausgewählt, wobei HV.3LV0 eine Reaktivität mit menschlichem IL-5R α hat, die so stark ist wie die Reaktivität des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1399 und von welchem erwartet wird, dass er gegen Menschen weniger antigen ist, da weniger Aminosäuren ausgewechselt wurden, die vom monoclonalen Antikörper stammen. HV.3LV.0 wurde als KM8399 bezeichnet und die Transformante KM8399, die den menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM8399 erzeugt, wurde am National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology am 3. September 1996 unter der Zugangsnummer FERM BP-5648 hinterlegt.
  • Bei der Herstellung des menschlichen CDR-grafted Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette KM8399 wurden die folgenden Dinge berücksichtigt. Wie bei der Herstellung von anderen menschlichen CDR-grafted Antikörpern herausgefunden wurde, verminderte sich die Aktivität des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM8397, welcher nur durch einfaches „Grafting" der CDR des monoclonalen anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM1259 in die FR eines menschlichen Antikörpers erhalten wurde, zu etwa der Hälfte der Aktivität des monoclonalen Antikörpers KM1259. Infolgedessen wurden mehrere Aminosäuren innerhalb der FR der V-Regionen von H- und L-Ketten in Aminosäuren geändert, die im monoclonalen Antikörper KM1259 vorkommen und auf eine Steigerung der Aktivität untersucht. In Bezug auf VH stieg die Aktivität mit fortschreitender Veränderung an. Andererseits, in Bezug auf VL, führte die Änderung einer kleinen Anzahl an Aminosäuren zu einer Abnahme an Aktivität; obwohl die Aktivität durch Zunahme der Anzahl an modifizierten Aminosäuren erhöht werden kann, ist die Aktivität nur bis zur Höhe des nicht modifizierten VL angestiegen. Obwohl die Ursache für diese Tatsache, ohne eine detailliertere Analyse (z. B.: Röntgen-Kristallanalyse), nicht ganz geklärt werden kann, ist wahrscheinlich die Interaktion zwischen VH und VL eines Antikörpers daran beteiligt und die Ergebnisse einer solchen Interaktion würden, abhängig vom verwendeten Antikörper, variieren. Aufgrund solcher Probleme wurde bis jetzt noch kein effizientes Verfahren zur Herstellung eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers etabliert, welches für alle Antikörper anwendbar ist, und Versuche und Irrtümer, wie sie im vorliegenden Beispiel gemacht wurden, sind erforderlich. Mit der Anhäufung solcher Versuche und Irrtümer könnte ein effizienteres Verfahren zur Herstellung von menschlichen CDR-grafted Antikörpern etabliert werden. Das vorliegende Beispiel zeigt den ersten Fall einer erfolgreichen Herstellung eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers gegen die menschliche IL-5R α-Kette und liefert daher Vorschläge für die effiziente Erzeugung von menschlichen CDR-grafted Antikörpern.
  • 7. Herstellung von humanisierten anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpern der menschlichen Antikörper-IgG4-Subklasse
  • (1) Isolierung und Analyse von cDNA, welche die C-Region (Cγ 4) der menschlichen Antikörper-IgG4-Subklasse codiert
  • 1. 1 × 107 B-Zellen wurden von 200 ml peripherem Blut eines gesunden Freiwilligen unter Verwendung von Dynabeads (DYNABEADS M-450 Pan-B (CD19); Nippon Dyner) und DETACHaBEAD (Nippon Dyner), die mit anti-CD19-Antikörper überzogenen waren, in Übereinstimmung mit der beiliegenden Anleitung abgetrennt.
  • Dann wurde mRNA von den abgetrennten Zellen unter Verwendung von Quick Prep mRNA-Purification Kit (Pharmacia Biotech) in Übereinstimmung mit der beiliegenden Anleitung erhalten. Von sämtlicher erhaltenen mRNA wurde unter Verwendung des Time Saver cDNA Synthesis Kits (Pharmacia Biotech) in Übereinstimmung mit der beiliegenden Anleitung cDNA synthetisiert. Dann wurde unter Verwendung der gesamten vorstehend erhaltenen cDNA und unter Verwendung der in SEQ ID NOs: 104 und 105 gezeigten synthetischen DNAs als Primer, die zu den 5'- und 3'- Seiten einer cDNA homolog sind, die den menschlichen Antikörper Cγ 4 codiert [Nucleic Acids Research, 14, 1789 (1986)], wie in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 5 von Beispiel 2 beschrieben, eine PCR durchgeführt. Die in der PCR verwendeten 5'- und 3'-Primer wurden so entworfen, dass sie an ihren 5'-Enden Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme ApaI und BamHI hatten, sodass die erhaltenen cDNAs leicht in einen Expressionsvektor für humanisierten Antikörper inseriert werden konnten. Das Reaktionsgemisch wurde nach der PCR mit QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen) gereinigt und dann zu 30 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt. Zu dem sich daraus ergebenden Gemisch wurden 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 30°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 0,5 μg eines etwa 1,0 kb-ApaI-BamHI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden 3 μg des Plasmids pBlueskriptSK(–) (Stratagene) zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 100 mM Kaliumchlorid; 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 30°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 2 μg eines etwa 3,0 kb-ApaI-BamHI-Fragments zu gewinnen.
  • Dann wurden 0,1 μg des vorstehend erhaltenen PCR-amplifizierten ApaI-BamHI-Fragments und 0,1 μg des vorstehend erhaltenen ApaI-BamHI-Fragments von pBluescriptSK(–) zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und dann unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhalten rekombinanten Plasmid-DNA-Lösung wurde in E. coli HB101 transformiert. Jede Plasmid-DNA der 10 Transformanten-Clone wurde erzeugt und die Basensequenz davon bestimmt. Demzufolge wurde das in 51 gezeigte Plasmid pBShCγ 4 erhalten, welches eine cDNA von Interesse umfasst, die den menschlichen Antikörper Cγ 4 codiert.
  • (2) Konstruktion eines Expressionsvektors für humanisierte Antikörper der menschlichen Antikörper-IgG4-Subklasse gegen die menschliche IL-5R α-Kette
  • Ein Expressionsvektor für humanisierte anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper der menschlichen Antikörper-IgG4-Subklasse wurde, wie nachstehend beschrieben, unter Verwendung von Plasmid pBShCγ 4, welches eine cDNA umfasst, die den menschlichen Antikörper Cγ 4 codiert, erhalten in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 7 von Beispiel 2, des Expressionsvektors pKANTEX1259 für den menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM1399, erhalten in Unterabschnitt (1) von Abschnitt 3 von Beispiel 2, und des Expressionsvektors pKANTEX1259HV3LV0 für den menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM8399, erhalten in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 6 von Beispiel 2, konstruiert.
  • Kurz gesagt wurden 4 μg von Plasmid pBShCγ 4, welches eine cDNA umfasst, die den menschlichen Antikörper Cγ 4 codiert, zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und der Niederschlag wurde zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 30°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 1 μg eines etwa 1,0 kb-ApaI-BamHI-Fragments zu gewinnen.
  • Anschließend wurden jeweils 3 μg des Expressionsvektors pKANTEX1259 für den chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper von menschlichen Typ KM1399 und des Expressionsvektors pKANTEX1259HV3LV0 für den menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α- Antikörper KM8399 einzeln zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms ApaI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 37°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Beide Reaktionsgemische wurden mit Ethanol präzipitiert und die Niederschläge wurden einzeln zu 10 μl eines Puffers hinzugefügt, der 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5), 100 mM Kaliumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM DTT enthielt, zu welchem 10 Einheiten des Restriktionsenzyms BamHI (Takara Shuzo) hinzugefügt und bei 30°C für 1 Stunde umgesetzt wurden. Beide Reaktionsgemische wurden einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen, um dadurch etwa 2 μg eines etwa 12,59 kb-ApaI-BamHI-Fragments von jedem Reaktionsgemisch zu gewinnen.
  • Eine Kombination von 0,1 μg des ApaI-BamHI-Fragments von Plasmid pBShCγ 4 und 0,1 μg des ApaI-BamHI-Fragments von Plasmid pKANTEX1259 und eine andere Kombination von 0,1 μg des ApaI-BamHI-Fragments von pBShC γ 4 und 0,1 μg des ApaI-BamHI-Fragments von Plasmid pKANTEX1259HV3LV0 wurden einzeln zu sterilisiertem Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μl zu ergeben, und dann unter Verwendung von Ready-To-Go-T4-DNA-Ligase (Pharmacia Biotech) ligiert. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Plasmid-DNA-Lösungen wurde E. coli HB101 transformiert, um dadurch den in 52 gezeigten Expressionsvektor pKANTEX1259γ 4 für einen menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α- Antikörper der IgG4 Subklasse und den Expressionsvektor pKANTEX1259HV3LV0γ 4 für einen menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper der IgG4 Subklasse zu erhalten.
  • (3) Expression von humanisierten Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette in Ratten-Myelom-YB2/0-Zellen (ATCC CRL1581)
  • Die Expression von humanisierten Antikörpern gegen die menschliche IL-5R α-Kette in YB2/0-Zellen wurde durch das in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebene Verfahren unter Verwendung des Expressionsvektors pKANTEX1259γ 4 für einen menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper der IgG4 Subklasse und des Expressionsvektors pKANTEX1259HV3LV0γ 4 für einen menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper der IgG4 Subklasse durchgeführt, welche in Beispiel 2 von Unterabschnitt (2) von Abschnitt 7 erhalten wurden.
  • Als Ergebnis wurde KM7399 (FERM BP-5649) als eine Transformante erhalten, die einen menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper der IgG4 Subklasse herstellte und der von diesem Stamm erzeugte menschliche chimäre anti-Mensch-IL-5R α- Antikörper der IgG4 Subklasse, wurde als KM7399 bezeichnet. Die Transformante KM7399, der den menschlichen chimäre anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM7399 produzierte, wurde am 3. September 1996 unter der Zugangsnummer FERM BP-5649 beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt. Die Produktivität des menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM7399 in der Transformante KM7399 war etwa 3 μg/106 Zellen/24 Std.
  • Ferner wurde KM9399 (FERM BP-5647) als eine Transformante erhalten, die einen menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper der IgG4 Subklasse herstellte und der von diesem Stamm hergestellte menschliche CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper der IgG4 Subklasse, wurde als KM9399 bezeichnet. Die Produktivität des menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörpers KM9399 in der Transformante KM9399, war etwa 7 μg/106 Zellen/24 Std. Die Transformante KM9399, die den menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper KM9399 produzierte, wurde am 3. September 1996 unter der Zugangsnummer FERM BP-5647 beim National Institute of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt.
  • (4) Reinigung der humanisierten anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper der menschlichen Antikörper-IgG4-Subklasse vom Kulturüberstand
  • Die Transformante KM7399, die den menschlichen chimären anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper der IgG4-Subklasse herstellt, und die Transformante KM9399, die den menschlichen CDR-grafted anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper der IgG4-Subklasse herstellt, welche in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 7 von Beispiel 2 erhalten wurden, wurden gemäß dem in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren gezüchtet und gereinigt, um dadurch etwa 1 mg von KM7399 und etwa 5 mg von KM9399 zu erhalten. Jeweils etwa 4 μg der gereinigten humanisierten anti-Mensch-IL-5R α- Antikörper der IgG4 Subklasse, KM7399, und KM9399 wurden gemäß dem in Unterabschnitt (3) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebenen Verfahren einer Elektrophorese unterzogen, um ihr Molekulargewicht zu untersuchen. Die Ergebnisse werden in 53 gezeigt. Wie aus 53 ersichtlich ist, unter reduzierenden Bedingungen das Molekulargewicht der H-Kette von jedem Antikörper etwa 50 KDa und das der L-Kette von jedem Antikörper etwa 25 KDa. Somit wurde die Expression von H-Ketten und L-Ketten mit dem richtigen Molekulargewicht bestätigt. Unter nicht reduzierenden Bedingungen ist das Molekulargewicht jedes der humanisierten anti-Mensch-IL-5R α- Antikörper etwa 140 KDa. Somit wurde die Expression eines menschlichen CDR-grafted Antikörpers der richtigen Größe bestätigt, der sich aus zwei H-Ketten und aus zwei L-Ketten zusammensetzt. Ferner wurden die N-terminalen Aminosäuresequenzen für die Hund L-Ketten der gereinigten humanisierten anti-Mensch-IL-5R α- Antikörper der IgG4- Subklasse, KM7399 und KM9399, mit einem Proteinsequenziergerät (470A, Applied Biosystems) durch das automatische Edman-Verfahren analysiert. Demzufolge wurden, wie erwartet, die richtigen Aminosäuresequenzen erhalten.
  • (5) Reaktivitäten der humanisierten anti-Mensch-IL-5R α-Antikörper der menschlichen Antikörper-IgG4-Subklasse mit menschlichem IL-5R α (ELISA-Verfahren 2)
  • Die Reaktivitäten des menschlichen chimären Antikörpers gegen den menschlichen-IL-5R α der menschlichen Antikörper-IgG1-Subklasse, KM1399, des menschlichen CDR-grafted Antikörpers gegen den menschlichen IL-5R α der menschlichen Antikörper-IgG1-Subklasse, KM8399, des menschlichen chimären Antikörpers gegen den menschlichen IL-5R α der IgG4-Subklasse, KM7399, und des menschlichen CDR-grafted Antikörpers gegen den menschlichen IL-5R α der IgG4-Subklasse, KM9399, mit menschlichem IL- 5R α wurden durch das in Unterabschnitt (2) von Abschnitt 3 von Beispiel 2 beschriebene ELISA-Verfahren 2 bestimmt. Die Ergebnisse werden in 54 gezeigt. Wie aus 54 ersichtlich, konnte nachgewiesen werden, dass die humanisierten Antikörper gegen die menschlichen IL-5R α-Kette der menschlichen Antikörper-IgG4-Subklasse eine genauso starke Reaktivität mit menschlichem IL-5R α hatten, wie die humanisierten Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette der IgG1-Subklasse.
  • BEISPIEL 3
  • 1. Bestätigung der Spezifität der Antikörper gegen die hIL-5R α-Kette
  • Die Spezifität der monoclonalen anti-hIL-5R α- Antikörper und humanisierten anti-hIL-5R α- Antikörper wurde durch die folgenden Verfahren unter Verwendung von Immunocyten-Färbung bestätigt.
  • Kurz gesagt wurden 5 × 105 Zellen, die durch Transfektion eines menschlichen IL-5R Gens in CTLL-2-Zellen (ATCC TIB 214) [nachstehend als „CTLL-2(h5R)" bezeichnet] [J. Exp. Med., 177, 1523 (1993)] erhalten wurden, oder 5 × 105 CTLL-2-Zellen als Kontrolle in einem Immunocyten-Färbepuffer (PBS, das 1% BSA, 0,02% EDTA und 0,05% Natriumazid enthielt) suspendiert und in eine Platte mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden (100 μl/Vertiefung) aufgeteilt. Nach dem Zentrifugieren bei 350 × g für 1 Minute bei 4°C wurde der Überstand verworfen. Dann wurden 50 μl des Immunocyten-Färbepuffers, der 10 μg/ml eines hIL-5R α-Antikörpers enthielt, zu jeder Vertiefung hinzugefügt und bei 4°C für 30 Minuten umgesetzt. Nach der Umsetzung wurde der Immunocyten-Färbepuffer hinzugefügt (200 μl/Vertiefung) und bei 350 × g für 1 Minute bei 4°C zentrifugiert und dann wurde der Überstand entfernt, um die Zellen zu waschen. Der Waschvorgang wurde weitere zweimal wiederholt. Danach wurden 50 μl des Immunocyten-Färbepuffers, der mit FITC markierte anti-Maus-Immunglobulin Antikörper oder mit FITC markierte anti-Mensch-Immunglobulin-Antikörper (beide hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) enthielt und 30-fach mit Färbepuffer verdünnt war zu jeder Vertiefung hinzugefügt, und bei 4°C für 30 Minuten umgesetzt. Nach der Reaktion wurde ein ähnlicher Waschvorgang dreimal wiederholt. Die Zellen wurden dann mit einem Durchflußcytometer (Coulter) analysiert.
  • Die Ergebnisse werden in 55 gezeigt. Die monoclonalen Antikörper KM1257, KM1259 und KM1486 und die humanisierten Antikörper KM1399, KM7399, KM8399 und KM9399 haben nicht mit CTLL-2-Zellen reagiert, aber sie haben spezifisch mit CTLL-2(h5R) reagiert. Es ist somit klar geworden, dass die humanisierten Antikörper KM1399, KM7399, KM8399 und KM9399 hIL-5R α spezifisch erkennen.
  • 2. Wirksamkeit der anti-II-5R α-Antikörper, die biologische Aktivität von IL-5 zu hemmen
  • Nachdem CTLL-2(h5R)-Zellen eine Proliferationsantwort abhängig von menschlichem IL-5 aufweisen [J. Exp. Med., 177, 1523 (1993)], wurde der Effekt der anti- IL-5R α-Antikörper auf menschliche IL-5 abhängige Zellproliferation in CTLL-2(h5R)-Zellen untersucht. Die Zellproliferation wurde durch das Farbentwicklungs-Verfahren unter Verwendung eines Cell Counting Kit (Dojin Chemical Laboratory) ausgewertet.
  • Kurz gesagt wurden 1 × 104 CTLL-2(h5R)-Zellen in 50 μl eines normalen Mediums suspendiert und in eine Zellkultur-Platte mit 96 Vertiefungen aufgeteilt. Diese Zellen wurden mit verschiedenen anti-IL5R α- Antikörpern, die zu 40 μg/ml mit einem normalen Medium verdünnt waren, zu 25 μl/Vertiefung und mit normalem Medium zu 25 μl/Vertiefung, welches das, durch das in Abschnitt 3 von Beispiel 1 beschriebene Verfahren erzeugte menschliche IL-5 zu 0,4 ng/ml enthielt, gemischt und in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 44 Stunden gezüchtet. Dann wurden 10 μl/Vertiefung an Cell Counting Kit-Lösung zu der Platte hinzugefügt und die Zellen wurden unter einem 5% CO2-Inkubator bei 37°C für weitere 4 Stunden gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung wurde das Absorptionsvermögen bei 450 nm mit einem Microwell Plate Reader Emax (Molecular Device) gemessen. Die hemmende Aktivität jedes Antikörpers auf die Proliferation von CTLL-2(h5R)-Zellen wurde mittels der folgenden Formel berechnet.
  • Figure 01310001
  • Worin
    A: OD-Wert im Anwesenheit eines Antikörpers
    B: OD-Wert in Abwesenheit eines Antikörpers
    C: OD-Wert in Abwesenheit von menschlichem IL-5.
  • Die Ergebnisse werden in 56 gezeigt. Die monoclonalen Antikörper KM1259 uns KM1486 und die humanisierten Antikörper KM1399, KM7399, KM8399 und KM9399 haben die von menschlichem IL-5 abhängige Proliferation der CTLL-2(h5R)-Zellen gehemmt. Eine solche Aktivität wurde jedoch beim monoclonalen Antikörper KM1257 nicht erkannt.
  • 3. Immunocyten-Färbung in menschlichen Eosinophilen
  • Eine polymorphkernige Leukocytenfraktion wurde von normalem menschlichem Blut erzeugt und für 3 Tage in Anwesenheit von menschlichem IL-5 gezüchtet, um Eosinophile zu konzentrieren. Die Reaktivität der monoclonalen anti-hIL-5R α-Antikörper wurde dann mit einem Durchflußcytometer bestimmt.
  • Kurz gesagt wurde eine Polymorphprep (Nicomed) in acht 15-ml Zentrifügenröhrchen aus Polypropylen (4 ml/Röhrchen) verteilt und jedes mit 6 ml mit Heparin behandeltem, normalem menschlichem Blut überzogen. Die Röhrchen wurden dann bei 500 × g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um polymorphkernige Leukocyten abzutrennen und zu gewinnen. Die polymorphkernigen Leukocyten wurden in normalem Medium suspendiert, um eine Konzentration von 1,25 × 107 Zellen/10 ml zu ergeben und in 10 ml-Portionen in 4 Zellkulturschalen aufgeteilt. Dann wurde menschlicher IL-5 bei einer Endkonzentration von 2 ng/ml zu der Zellsuspension hinzugefügt und die Zellen wurden in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 3 Tage gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung wurden die Zellen zentrifugiert (1.200 UpM, 5 Minuten) und im Immunocyten-Färbepuffer suspendiert, um eine Konzentration von 5 × 106 Zellen/ml zu ergeben.
  • 5 × 105 Zellen wurden dann in eine Platte mit 96 Vertiefungen mit rundem Boden aufgeteilt. Nachdem die Platte bei 350 × g für 1 Minute bei 4°C zentrifugiert worden war, wurde der Überstand entfernt. Dann wurden 50 μl von 10% normalem Mausserum, welches Immunocyten-Färbepuffer enthielt, hinzugefügt und bei 4°C für 30 Minuten umgesetzt. Zu dem Puffer wurde in einer Konzentration von 10 μg/ml monoclonaler Antikörper KM1259, der durch herkömmliche Verfahren mit Biotin markiert war [„KOSO-KOTAI-HO" (Enzyme, Antibody, Method), Gakusai Kikaku Co., 1985], oder, als Kontrolle, mit Biotin markierter monoclonaler anti-Mensch-Granulocyten-kolonie-stimulierender Faktor Antikörper KM341 [Agr. Biol. Chem., 53, 1095 (1989)], hinzugefügt. Nach der Umsetzung wurden 200 μl des Immunocyten-Färbepuffers zu jeder Vertiefung hinzugefügt und bei 350 × g für 1 Minute bei 4°C zentrifugiert und dann wurde der Überstand entfernt und die Zellen wurden gewaschen. Der Waschvorgang wurde weitere zweimal wiederholt. Danach wurde mit Phycoerythrin markiertes Streptavidin (Becton Dickinson), welches 10-fach mit Immunocyten-Färbepuffer verdünnt war, hinzugefügt (50 μl/Vertiefung) und bei 4°C für 30 Minuten umgesetzt. Nach der Reaktion wurde ein ähnlicher Waschvorgang dreimal wiederholt. Dann wurde für jene Zellen, die als polymorhpkernige Leukocyten erkannt worden waren, durch Vorwärtsstreuung und 90° Streuung eine Analyse mit einem Durchflußcytometer (Coulter) durchgeführt. Ferner wurden die gleichen Zellen durch das May-Grunwald-Giemsa-Färbeverfahren [„SENSHOKUHOU NO SUBETE" (Review of staining methods), Ishiyaku Shuppan Co., 1988] gefärbt und als polymorphkernige Leukocyten vermerkt. Demzufolge wurde bestätigt, dass 75% der Zellen Eosinophile waren.
  • 57 zeigt das erhaltene Histogramm. Der monoclonale Antikörper KM1259 gegen die menschliche-IL-5R α-Kette zeigte eine eindeutige Reaktivität. Nachdem sich 75% der untersuchten Zellen als Eosinophile herausstellten, wurde bestätigt, dass der monoclonale Antikörper KM1259 gegen die menschliche IL-5R α-Kette eine Reaktivität mit Eosinophilen hat.
  • 4. Hemmung des Überlebens von menschlichen Eosinophilen mit Antikörpern gegen die IL-5R α-Kette
  • Polymorphkernige Leukocytenfraktionen wurden von normalem menschlichen Blut erzeugt und der Einfluss von Antikörpern gegen die IL-5R α-Kette auf das Überleben von Eosinophilen in der Anwesenheit von menschlichem IL-5 wurde untersucht.
  • Kurz gesagt wurde eine Polymorphprep (Nicomed) in 4 ml-Portionen in 15 15-ml Zentrifügenröhrchen aus Polypropylen verteilt und jedes mit 8 ml von mit Heparin behandeltem, normalen menschlichen Blut überzogen. Die Röhrchen wurden dann bei 500 × g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um polymorphkernige Leukocyten abzutrennen und zu gewinnen.
  • Percoll-Stammlösung wurde durch Zugabe von 1 Volumen sterilisierter 1,5 M NaCl-Lösung to 9 Volumina Percoll-Lösung (Pharmacia) erzeugt. Dann wurde eine 80% Percoll-Lösung durch Zugabe von 2 Volumina physiologischer Kochsalzlösung zu 8 Volumina Percoll-Stammlösung erzeugt und 60% Percoll-Lösung wurde durch Zugabe von 4 Volumina physiologischer Kochsalzlösung zu 6 Volumina Percoll-Stammlösung erzeugt. Zum Zwecke der Entfernung von begleitenden Monocyten wurden 5 ml einer 60% Percoll-Lösung in jedes von zwei 15 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen aufgeteilt, mit den in RPMI1640-Medium suspendierten, vorher erhaltenen polymorphkernigen Leukocyten überschichtet und bei 500 × g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um den Niederschlag an polymorphkernigen Leukocyten abzutrennen und zu gewinnen. Ferner wurden, zum Zweck der Entfernung begleitender Erythrocyten 5 ml 80% Percoll-Lösung in jedes von zwei 15 ml-Zentrifügenröhrchen aus Polypropylen aufgeteilt und mit den vorher erhaltenen polymorphkerningen Leukocyten, die in RPMI1640-Medium suspendiert waren, überschichtet und bei 500 × g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die polymorphkernigen Leukocyten, die in der Percollschicht suspendiert waren, abzutrennen und zu gewinnen.
  • Anschließend wurden die Zellen in eine Zellkulturplatte mit 48 Vertiefungen zu 2 × 106 Zellen/Vertiefung aufgeteilt und menschliches IL-5 wurde zu einer Endkonzentration von 0,1 ng/ml hinzugefügt. Weiters wurde jeder der verschiedenen Antikörper gegen die IL-5R α-Kette in einer Endkonzentration von 1 μg/ml hinzugefügt. Für jeden Antikörper wurde eine Züchtung in 2 Vertiefungen durchgeführt und die Lösung in jeder Vertiefung wurde auf ein Endvolumen von 1 ml eingestellt. Die Zellen wurden in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 3 Tage gezüchtet. Nach Beendigung der Züchtung wurde das gesamte Volumen der Zellsuspension von jeder Vertiefung gewonnen und zentrifugiert (3.000 UpM, 1 Minute), um die Zellen zu gewinnen. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen wurden in 100 μl PBS suspendiert. Unter Verwendung von 50 μl dieser Suspension wurden mit einem Zellproben-Herstellungsgerät, Cytospin3 (Shandon), Proben erzeugt. Nachdem die Proben durch das May-Grunwald-Giemsa-Färbeverfahren gefärbt worden waren, wurden 200 Zellen für jede Probe angeschaut und die Anzahl der Eosinophilen wurde gezählt.
  • Die Ergebnisse werden in 58 gezeigt. Bei allen monoclonalen Antikörpern, KM1259 und KM1486, und humanisierten Antikörpern, KM1399, KM7399, KM8399 und KM9399 wurde eine Aktivität zur Hemmung der durch IL-5 verlängerten Überlebenszeit der Eosinophilen beobachtet. Eine solche Aktivität wurde jedoch beim monoclonalen Antikörper KM1257 nicht bemerkt.
  • 5. Nachweis von shIL-5R α mit Antikörpern gegen die hIL-5R α-Kette
  • Der monoclonale Antikörper KM1257 gegen die menschliche IL-5R α-Kette wurde mit PBS zu einer Konzentration von 10 μg/ml verdünnt und in eine EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (Greiner) (50 μl/Vertiefung) aufgeteilt und bei 4°C über Nacht stehen gelassen, um die Adsorption des Antikörpers zu ermöglichen. Nach dem Waschen wurden 100 μl/Vertiefung an PBS, das 1% Rinderserumalbumin (BSA) (1% BSA-PBS) enthielt, hinzugefügt und die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde durchgeführt, um die verbleibenden aktiven Gruppen zu blockieren. Nach Verwerfung von 1% BSA-PBS wurde der in Unterabschnitt (9) von Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltene gereinigte shIL-5R α, der mit 1% BSA-PBS auf eine Konzentration von 1000–0,1 ng/ml verdünnt worden war, hinzugefügt und bei 4°C über Nacht umgesetzt. Nach dem Waschen mit Tween-PBS wurde der mit Biotin durch herkömmliche Verfahren [„KOSO-KOTAI-HO" (Enzyme Antibody Method), Gakusai Kikaku Co., 1985) markierte und mit 1% BSA-PBS auf eine Konzentration von 1 μg/ml verdünnte monoclonale Antikörper KM1259 hinzugefügt (50 μl/Vertiefung) und bei Raumtemperatur für 2 Stunden umgesetzt. Nach dem Waschen mit Tween-PBS wurde mit Avidin markierte Peroxidase (Nippon Reizo), die 4000-fach mit 1% BSA-PBS verdünnt war, hinzugefügt (50 μl/Vertiefung) und bei Raumtemperatur für 1 Stunde umgesetzt. Nach dem Waschen mit Tween-PBS wurde ABTS-Substrat-Lösung [2,2-Azinobis(3-ethylbenzothiazol-6-sulfonsäure)ammonium] hinzugefügt, um eine Farbentwicklung zu ermöglichen. Dann wurde das Absorptionsvermögen bei einer OD von 415 nm gemessen (NJ2001; Japan Intermed).
  • Die Ergebnisse werden in 59 gezeigt. Demzufolge ist klar geworden, dass shIL-5R α durch Verwendung des monoclonalen Antikörpers KM1257 gegen die menschliche IL-5R α-Kette und des mit Biotin markierten monoclonalen Antikörpers KM1259 gegen die menschliche IL-5R α-Kette gemessen werden kann.
  • 6. Nachweis von shIL-5R α durch Western-Blott-Verfahren
  • Der in Unterabschnitt (9) aus Abschnitt 1 aus Beispiel 1 beschriebene shIL-5R α wurde in SDS-PAGE-Probenpuffer, der 2-Mercaptoethanol enthielt, oder in SDS-PAGE-Probenpuffer, der kein 2-Mercaptoethanol enthielt, durch Hitze denaturiert. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde auf einem handelsüblichen SDS-PAGE-Grandientengel (Atto) einer Elektrophorese unterzogen und dann wurden die Proteine auf eine PVDF-Membran (Millipore) transferiert. Die PVDF-Membran wurde in PBS, das 10% BSA enthielt, eingeweicht und bei 4°C über Nacht zur Blockierung, stehen gelassen. Nach Beendigung der Blockierung wurde die Membran gründlich mit PBS das 0,05% Tween enthielt, gewaschen. Die Membran wurde dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden in einem Kulturüberstand des in Abschnitt 5 von Beispiel 1 erhalten Hybridoms eingeweicht und mit PBS das 0,05% Tween enthielt, gründlich gewaschen. Ferner wurde die PVDF-Membran bei Raumtemperatur für 1 Stunde in einer Lösung eingeweicht, die durch 1000-fache Verdünnung des mit Peroxidase markiertem anti-Maus-Immunglobulin-Antikörpers (Wako Pure Chemical Industries, Ldt.) mit 1% BSA-PBS erhalten wurde, und dann gründlich mit PBS das 0,05% Tween enthielt, gewaschen. Nachdem die Waschlösung gründlich entfernt worden war, wurde ECL-Reagens (Amersham) auf die PVDF-Membran aufgetragen und für 1 Minute umgesetzt. Nach Entfernung des überschüssigen Reagens wurde die Membran zwischen zwei Plastikfolien eingelegt und in eine Kassette zur Sensibilisierung des Röntgenfilms gelegt, um dadurch den ECL-Film zu sensibilisieren. Auf diese Weise wurde die Reaktivität der Antikörper bestätigt.
  • Die Ergebnisse werden in 60 gezeigt. KM1257 zeigte Reaktivität, aber KM 1259 und KM 1486 zeigten keine.
  • 7. Immunopräzipitation von shIL-5R α
  • Ein anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper (DAKO), der 50-fach mit PBS verdünnt war, wurde in eine EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (200 μl/Vertiefung) aufgeteilt und bei 4°C über Nacht stehen gelassen, um dem Antikörper die Adsorption zu ermöglichen. Nach dem Waschen mit PBS wurden 300 μl/Vertiefung an 1% BSA-PBS hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 1 Stunde stehen gelassen, um eine Blockierung durchzuführen. Nach dem Waschen mit PBS wurde jeder der Kulturüberstände von KM1257, KM1259 oder KM1486 (sie sind monoclonale Antikörper gegen die menschliche IL-5R α-Kette, welche in vorhergehenden Beispielen erhalten wurden) zu jeder Vertiefung zu je 200 μl hinzugefügt und bei 4°C über Nacht stehen gelassen, um dem Antikörper die Adsorption zu ermöglichen. Nach dem Waschen der Platte wurde der in Abschnitt 1 von Beispiel 1 erhaltene und mit PBS auf eine Konzentration von 10 μg/ml verdünnte shIL-5R α in einer Menge von 50 μl auf jede Vertiefung aufgeteilt und bei 4°C über Nacht umgesetzt. Nachdem die Platte mit PBS das 0,05% Tween enthielt, gewaschen worden war, wurde, der kein 2-Mercaptoethanol freier 5 × SDS-PAGE-Probenpuffer [0,31 M Tris (pH-Wert 6,8), 10% SDS, 50% Glycerin] oder 5 × SDS-PAGE-ProbenpufFer, der 2-Mercaptoethanol enthielt [0,31 M Tris (pH-Wert 6,8), 10% SDS, 50% Glycerin, 25% 2-Mercaptoethanol], hinzugefügt (50 μl/Vertiefung) und bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Schütteln stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde zu 200 μl PBS hinzugefügt und auf einem Heizblock erhitzt. Unter Verwendung eines SDS-PAGE-Gradientengels (Atto) wurden dann 25 μl des Reaktionsgemischs aufgetrennt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Protein auf eine PVDF-Membran (Millipore) transferiert. Die PVDF-Membran wurde gemäß dem in Abschnitt 6 von Beispiel 3 beschriebenen Verfahren unter Verwendung von KM1257, einer Western-Blotting-Analyse unterzogen, um dadurch shIL-5R α nachzuweisen.
  • Die Ergebnisse werden in 61 gezeigt. Es ist klar geworden, dass KM1257, KM1259 und KM1486 alle shIL-5R α immunpräzipitieren.
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die monoclonalen Antikörper KM1257, KM1259 und KM1486 bereitgestellt, welche spezifisch an die menschliche IL-5 Rezeptor α-Kette binden, von welcher angenommen wird, dass sie spezifisch auf menschlichen Eosinophilen exprimiert wird. Ferner werden die humanisierten Antikörper KM1399, KM8399, KM7399 und KM9399 bereitgestellt, welche spezifisch an die menschliche IL-5 Rezeptor α-Kette binden, von welcher angenommen wird, dass sie spezifisch auf menschlichen Eosinophilen exprimiert wird und welche die biologische Aktivität von menschlichem IL-5 hemmen können. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sind wertvoll für den immunologischen Nachweis von menschlichen Eosinophilen in der Immunocyten-Färbung und Diagnose oder Behandlung von allergischen Erkrankungen, die durch die Hemmung der biologischen Aktivität von IL-5 hervorgerufen werden. Es sollte besonders angemerkt werden, dass die Antigenität der humanisierten Antikörper der Erfindung niedriger ist als die der monoclonalen Antikörper und dass erwartet wird, dass sie ihre Wirkung für eine lange Zeit beibehalten.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (41)

  1. Monoklonaler Antikörper der spezifisch mit einer humanen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette reagiert, wobei der Antikörper an ein Epitop an den Positionen 1 bis 313 der N-terminalen Aminosäuresequenz einer humanen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette bindet und eine biologische Aktivität von humanem Interleukin-5 inhibiert.
  2. Antikörper nach Anspruch 1, der zur IgG1 Subklasse gehört, wobei die CDR Sequenzen in der variablen Region (V-Region) der schweren Kette (H-Kette) des Antikörpers die folgenden Aminosäuresequenzen sind: CDR1: Asp Tyr Gly Met Ala; CDR2: Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile His Phe Pro Asp Ser Leu Lys Gly; und CDR3: Arg Gly Phe Tyr Gly Asn Tyr Arg Ala Met Asp Tyr; und die CDR-Sequenzen in der V-Region der leichten Kette (L-Kette) die folgenden Aminosäuresequenzen sind: CDR1: Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp His Asn Gly Val Asn Phe Met Asn; CDR2: Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser; und CDR3: Gln Gln Ser Lys Asp Val Pro Trp Thr.
  3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, welcher der monoklonale Antikörper KM1257, hergestellt von Hybridom KM1257 (FERM BP-5133), ist.
  4. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der zur IgG1 Subklasse gehört, wobei die CDR-Sequenzen in der V-Region der H-Kette des Antikörpers die folgenden Aminosäuresequenzen sind: CDR1: Ser Tyr Val Ile His; CDR2: Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Lys Gly; und CDR3: Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr; und die CDR Sequenzen in der V-Region der L-Kette die folgenden Aminosäuresequenzen sind: CDR1: Gly Thr Ser Glu Asp Ile Ile Asn Tyr Leu Asn; CDR2: His Thr Ser Arg Leu Gln Ser; und CDR3: Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr Thr.
  5. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 4, welcher der monoklonale Antikörper KM1259, hergestellt von Hybridom KM1259 (FERM BP-5134), ist.
  6. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der zur IgG1 Subklasse gehört, wobei die CDR Sequenzen in der V-Region der H-Kette des Antikörpers die folgenden Aminosäuresequenzen sind: CDR1: Asp Thr Tyr Met His; CDR2: Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Ser Asp Pro Lys Phe Gln Ala; und CDR3: Gly Leu Arg Leu Arg Phe Phe Asp Tyr; und die CDR Sequenzen in der V-Region der L-Kette die folgenden Aminosäuresequenzen sind: CDR1: Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His; CDR2: Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser; und CDR3: Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Ile Thr.
  7. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 6, welcher der monoklonale Antikörper KM1486, hergestellt von Hybridom KM1486 (FERM BP-5651), ist.
  8. Hybridom KM1257 (FERM BP-5133), das den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2 produziert.
  9. Hybridom KM1259 (FERM BP-5134), das den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 4 produziert.
  10. Hybridom KM1486 (FERM BP-5651), das den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 6 produziert.
  11. Humanisierter Antikörper, der spezifisch mit einer humanen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette reagiert, wobei der Antikörper ein Epitop an den Positionen 1 bis 313 der N-terminalen Aminosäuresequenz einer humanen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette erkennt und eine biologische Aktivität des humanen Interleukin-5 inhibiert.
  12. Antikörper nach Anspruch 11, der zur humanen Antikörper IgG Klasse gehört.
  13. Antikörper nach Anspruch 11, der ein humaner chimärer Antikörper ist.
  14. Antikörper nach Anspruch 13, wobei der humane chimäre Antikörper ein chimärer Antikörper ist, umfassend die V-Region der H-Kette und die V-Region der L-Kette eines nicht-humanen tierischen Antikörpers und die konstante Region (C-Region) der H-Kette und die C-Region der L-Kette eines humanen Antikörpers.
  15. Antikörper nach Anspruch 14, wobei die V-Region der H-Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 27 umfasst und die V-Region der L-Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 29 umfasst.
  16. Antikörper nach Anspruch 14, wobei die V-Region der H-Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 31 umfasst und die V-Region der L-Kette des Antikörpers die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 33 umfasst.
  17. Antikörper nach Anspruch 15, welcher der Antikörper KM1399 ist, hergestellt von einer Transformanten KM1399 (FERM BP-5650), wobei die C-Region der H-Kette des Antikörpers in einer humanen Antikörper IgG1 Subklasse ist.
  18. Antikörper nach Anspruch 15, welcher der Antikörper KM7399 ist, hergestellt von einer Transformanten KM7399 (FERM BP-5649), wobei die C-Region der H-Kette des Antikörpers in einer humanen Antikörper IgG4 Subklasse ist.
  19. Transformante KM1399 (FERM BP-5650), die den Antikörper nach Anspruch 17 produziert.
  20. Transformante KM7399 (FERM BP-5649), die den Antikörper nach Anspruch 18 produziert.
  21. Antikörper nach Anspruch 11, wobei der humanisierte Antikörper ein humaner CDR-grafted Antikörper ist.
  22. Antikörper nach Anspruch 21, wobei der humane CDR-grafted Antikörper erhalten wird durch Ersetzen der CDR Sequenzen in der V-Region der H-Kette und der V-Region der L-Kette eines humanen Antikörpers mit CDR Sequenzen in der V-Region der H-Kette und der V-Region der L-Kette eines nichthumanen tierischen Antikörpers.
  23. Antikörper nach Anspruch 22, wobei eine CDR Sequenz in der V-Region der H-Kette des Antikörpers eine CDR Sequenz in der V-Region der H-Kette des Antikörpers nach Anspruch 4 umfasst und eine CDR Sequenz in der V-Region der L-Kette des Antikörpers eine CDR Sequenz in der V-Region der L-Kette des Antikörpers nach Anspruch 4 umfasst.
  24. Antikörper nach Anspruch 22, wobei eine CDR Sequenz in der V-Region der H-Kette des Antikörpers eine CDR Sequenz in der V-Region der H-Kette des Antikörpers nach Anspruch 6 umfasst und eine CDR Sequenz in der V-Region der L-Kette des Antikörpers eine CDR Sequenz in der V-Region der L-Kette des Antikörpers nach Anspruch 6 umfasst.
  25. Antikörper nach Anspruch 23, welcher der Antikörper KM8399 ist, hergestellt von einer Transformanten KM8399 (FERM BP-5648), wobei die C-Region der H-Kette des Antikörpers zur humanen Antikörper IgG1 Subklasse gehört.
  26. Antikörper nach Anspruch 23, welcher der Antikörper KM 9399 ist, hergestellt von einer Transformanten KM9399 (FERM BP-5647), wobei die C-Region der H-Kette des Antikörpers in einer humanen Antikörper IgG4 Subklasse ist.
  27. Transformante KM8399 (FERM BP-5648), die den Antikörper nach Anspruch 25 produziert.
  28. Transformante KM9399 (FERM BP-5647), die den Antikörper nach Anspruch 26 produziert.
  29. Einzelketten-Antikörper, der spezifisch mit einer humanen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette reagiert, wobei der Antikörper ein Epitop an den Positionen 1 bis 313 der N-terminalen Aminosäuresequenz der humanen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette erkennt und eine biologische Aktivität von humanem Interleukin-5 inhibiert.
  30. Antikörper nach Anspruch 29, wobei der Einzelketten Antikörper die V-Region der H-Kette und die V-Region der L-Kette eines humanisierten Antikörpers umfasst.
  31. Einzelketten-Antikörper nach Anspruch 29, wobei die CDR Sequenzen in der V-Region der H-Kette und der V-Region der L-Kette CDR Sequenzen in der V-Region der H-Kette und der V-Region der L-Kette des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 4 umfassen.
  32. Einzelketten-Antikörper nach Anspruch 29, wobei die CDR Sequenzen in der V-Region der H-Kette und V-Region der L-Kette CDR Sequenzen in der V-Region der H-Kette und der V-Region der L-Kette des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 5 umfassen.
  33. Disulfid-stabilisierter Antikörper, der spezifisch mit einer humanen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette reagiert, wobei der Antikörper ein Epitop an den Positionen 1 bis 313 der N-terminalen Aminosäuresequenz der humanen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette erkennt und eine biologische Funktion des humanen Interleukin-5 inhibiert.
  34. Disulfid-stabilisierter Antikörper nach Anspruch 33, der die V-Region der H-Kette und die V-Region der L-Kette eines humanisierten Antikörpers umfasst.
  35. Disulfid-stabilisierter Antikörper nach Anspruch 33, wobei CDR Sequenzen in der V-Region der H-Kette und der V-Region der L-Kette CDR Sequenzen in der V-Region der H-Kette und der V-Region der L-Kette des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 4 umfassen.
  36. Disulfid-stabilisierter Antikörper nach Anspruch 33, wobei CDR Sequenzen in der V-Region der H-Kette und der V-Region der L-Kette CDR Sequenzen in der V-Region der H-Kette und der V-Region der L-Kette des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 6 umfassen.
  37. Peptid, umfassend eine CDR Sequenz in der V-Region der H-Kette oder der V-Region der L-Kette des monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 2, 4 oder 6, das eine Reaktivität mit der humanen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette hat.
  38. Diagnostische Zusammensetzung umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 11 bis 18, 21 bis 26 oder 29 bis 36, gegebenenfalls in Verbindung mit geeigneten Mitteln zum Nachweis.
  39. In vitro Methode zum immunologischen Nachweis einer humanen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette oder einer Zelle, die den Rezeptor auf Ihrer Oberfläche exprimiert, oder zum Nachweisen humaner Eosinophiler oder zum Nachweisen und Bestimmen einer löslichen humanen Interleukin-5 Rezeptor α-Kette unter Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 11 bis 18, 21 bis 26 oder 29 bis 36.
  40. Arzneimittel umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 11 bis 18, 21 bis 26 oder 29 bis 36, gegebenenfalls in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  41. Verwendung eines Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7, 11 bis 18, 21 bis 26 oder 29 bis 36 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Vorbeugen von Eosinophilie und/oder zum Behandeln allergischer Krankheiten, vorzugsweise Bronchialasthma, zum Behandeln von Krankheiten, die Eosinophilie involvieren, oder zum Behandeln allergischer Krankheiten.
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