DE69729209T2 - Humanisierte anti-koerper gegen cd11a - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen humanisierte Anti-CD11a-Antikörper.
  • Beschreibung der verwandten Gebiete
  • Das Lymphozyten-funktionsassoziierte Antigen 1 (LFA-1; CD11a/CD18) ist an der Leukozytenadhäsion während der für immunologische Reaktionen und Entzündung essentiellen Zellwechselwirkungen beteiligt (Larson et al., Immunol. Rev. 114, 181–217 (1990)). LFA-1 ist ein Element der β2-Integrinfamilie und besteht aus einer einzigartigen α-Untereinheit, CD11a, und einer β-Untereinheit, CD18, die sie mit anderen β2-Integrinrezeptoren Mac-1 und p150.95 gemeinsam hat. Die Liganden von LFA-1 umfassen das intrazelluläre Adhäsionsmolekül 1, ICAM-1, das an Leukozyten, Endothel und Hautfibroblasten exprimiert wird (Dustin et al., J. Immunol. 137, 245–254 (1986)), ICAM-2, das an ruhendem Endothel und Lymphozyten exprimiert wird (de Fougerolles et al., J. Exp. Med. 174, 253–267 (1991)), und ICAM-3, das an Monozyten und ruhenden Lymphozyten exprimiert wird (de Fougerolles et al., J. Exp. Med. 179, 619–629 (1994)).
  • Von monoklonalen Antikörpern (MAbs) gegen LFA-1 und die ICAMs ist gezeigt worden, dass sie in vitro mehrere T-Zellen-abhängige Immunfunktionen, einschließlich der T-Zellenaktivierung (Kuypers et al., Res. Immunol. 140, 461 (1989)), T-Zellen-abhängigen B-Zellenvermehrung (Fischer et al., J. Immunol. 136, 3198–3203 (1986)), Target-Zelllyse (Krensky et al., J. Immunol. 131, 611–616 (1983)) und Adhäsion von T-Zellen an Gefäßendothel (Lo et al., J. Immunol. 143, 3325–3329 (1989)), hemmen. In Mäusen lösen Anti-CD11a-MAbs Toleranz gegen Proteinantigene aus (Tanaka et al., Eur. J. Immunol. 25, 1555–1558 (1995)) und verlängern das Überleben von Herz- (Cavazzana-Calvo et al., Transplantation 59, 1576–1582 (1995); Nakamura et al., Transplantation 55, 412–417 (1993)), Knochenmark- (Cavazzana-Calvo et al., Transplantation 59, 1576–1582 (1995); van Dijken et al., Transplantation 49, 882–886 (1990)), Hornhaut- (He et al., Invest. Opthamol. Vis. Sci. 35, 3218–3225 (1994)), In selzellen- (Nishihara et al., Transplantation Proc. 27, 372 (1995)) und Schilddrüsen- (Talento et al., Transplantation 55, 418–422 (1993)) Allotransplantaten.
  • Im Menschen verhindern Anti-CD11a-MAbs Transplantatversagen nach Rückenmarktransplantation (Fischer et al., Blood 77, 249–256 (1991); Stoppa et al., Transplant Intl. 4, 3–7 (1991)), und vorläufige klinische Studien von prophylaktisch mit Anti-CD11a-MAbs zusätzlich zu Corticosteroiden und Azathioprin behandelten Nieren-Allotransplantaten sind viel versprechend (Hourmant et al., Transplantation 58, 377–380 (1994)). Gegenwärtige Therapien gegen Transplantatabstoßung umfassen die Verwendung von OKT3, ein Maus-Anti-Human-CD3-MAb, und Cyclosporin A. OKT3-Therapie ist wirksam, hat jedoch mehrere unerwünschte Nebenwirkungen; seine Verwendung resultiert in der Freisetzung zahlreicher Cytokine, einschließlich Tumornekrosefaktor-α, Interferon-γ, Interleukin-2 und Interleukin-6, was in Fieber, Frösteln und Magen-Darm-Belastung resultiert (für einen Überblick siehe Parlevliet et al., Transplant Intl. 5, 234–246 (1992); Dantal et al., Curr. Opin. Immunol. 3, 740–747 (1991)). Cyclosporin A ist wirksam, hat jedoch ebenfalls erhebliche Nebenwirkungen (für einen Überblick siehe Barry, Drugs 44, 554–566 (1992)).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt humanisierte Anti-CD11a-Antikörper bereit. Bevorzugte Antikörper binden an die I-Domäne von menschlichem CD11a (z. B. an hierin definiertes „Epitop MHM24") und/oder binden CD11a mit einer Affinität von ungefähr 1 × 10–8 M oder stärker. In bevorzugten Ausführungsformen weist der Antikörper einen IC50- (nM) Wert von nicht mehr als ungefähr 1 nM zur Verhinderung der Adhäsion von Jurkat-Zellen an normale menschliche, epidermale, ICAM-1 exprimierende Keratinozyten auf. Bevorzugte humanisierte Antikörper sind jene, die einen IC50- (nM) Wert von nicht mehr als ungefähr 1 nM im gemischten Lymphozytenreaktions- (MLR-) Test aufweisen. Diese IC50 für einen humanisierten Antikörper im MLR-Test ist signifikant besser als die für Maus-MAb-25.3, der vorher in vivo getestet worden ist (Fischer et al., Blood 77, 249–256 (1991); Stoppa et al., Transplant Intl. 4, 3–7 (1991); Hourmant et al., Transplantation 58, 377–380 (1994)).
  • Der humanisierte Anti-CD11a-Antikörper kann eine variable Region der Schwerkette, welche die Aminosäuresequenz von CDR1 (GYSFTGHWMN; Seq.-ID Nr. 10) und/oder CDR2 (MIHPSDSETRYNQKFKD; Seq.-ID Nr. 11) und/oder CDR3 (GIYFYGTTYFDY; Seq.-ID Nr. 12) des humanisierten Antikörpers MHM24-F(ab)-8 in 1 umfasst, und/oder eine variable Region der Leichtkette aufweisen, welche die Aminosäuresequenz von CDR1 (RASKTISKYLA; Seq.-ID Nr. 13) und/oder CDR2 (SGSTLQS; Seq.-ID Nr. 14) und/oder CDR3 (QQHNEYPLT; Seq.-ID Nr. 15) des humanisierten Antikörpers MHM24-F(ab)-8 in 1 umfasst. In anderen Ausführungsformen umfasst der Antikörper eine Aminosäuresequenzvariante einer oder mehrerer CDRs des humanisierten MHM24-Antikörpers F(ab)-8, wobei diese Variante eine oder mehrere Aminosäureinsertion(en) im oder nahe dem CDR-Rest und/oder Deletion(en) im oder nahe dem CDR-Rest und/oder Substitutionen) von einem oder mehreren CDR-Resten) umfasst (wobei Substitutionen) die bevorzugte Art der Aminosäureveränderung zur Erzeugung solcher Varianten ist). Solche Varianten werden normalerweise eine Bindungsaffinität für menschliches CD11a aufweisen, die nicht mehr als ungefähr 1 × 10–8 M beträgt.
  • In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der humanisierte Antikörper eine variable Region der Leichtkette, welche die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst, und/oder eine variable Region der Leichtkette, welche die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 5 des humanisierten Antikörpers MHM24-F(ab)-8 in 1 und/oder Aminosäuresequenzvarianten davon umfasst.
  • Wie hierin beschrieben wird, ist es möglich gewesen, einen humanisierten Antikörper, der CD11a-Antigen, nicht jedoch an Rhesus-CD11a-Antigen band, derart neu zu konstruieren, dass eine Fähigkeit zur Bindung an Rhesus-CD11a (d. h. „rhesusierter" Antikörper) verliehen wurde. In dieser Ausführungsform kann der an Rhesus-CD11a bindende Antikörper beispielsweise die CDR2-Aminosäuresequenz in Seq.-ID Nr. 23 umfassen. Die anderen CDRs können dieselben wie jene für den humanisierten MHM24-Antikörper F(ab)-8 sein. Folglich kann der Antikörper die Aminosäuresequenz der „rhesusierten" Schwerkette in Seq.-ID Nr. 24, gegebenenfalls kombiniert mit einer die Aminosäuresequenz in Seq.-ID Nr. 2 umfassenden Leichtkette, umfassen.
  • Verschiedene Formen des Antikörpers sind hierin vorgesehen. Beispielsweise kann der Anti-CD11a-Antikörper ein Antikörper voller Länge (z. B. eine menschliche konstante Immunglobulinregion aufweisend) oder ein Antikörperfragment (z. B. ein F(ab')2) sein. Darüber hinaus kann der Antikörper mit einem detektierbaren Marker markiert, an einer festen Phase immobilisiert und/oder mit einer heterologen Verbindung (wie z. B. einem zytotoxischen Mittel) konjugiert sein.
  • Es sind diagnostische und therapeutische Verwendungen für den Antikörper vorgesehen. In einer der diagnostischen Anwendungen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens von CD11a-Protein bereit und umfasst das Exportieren einer Probe, von der vermutet wird, dass sie CD11a-Protein enthält, gegenüber einem Anti-CD11a-Antikörper und die Bestimmung der Bindung des Antikörpers an die Probe. Für diese Verwendung stellt die Erfindung ein Set bereit, das den Antikörper und Anleitungen zur Verwendung des Antikörpers zum Detektieren des CD11a-Proteins umfasst.
  • Die Erfindung stellt weiters Folgendes bereit: Für den Antikörper kodierende Nucleinsäure; einen diese Nucleinsäure umfassenden Vektor, der gegebenenfalls operativ an Kontrollsequenzen gebunden ist, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden; eine diesen Vektor umfassende Wirtszelle; ein Verfahren zur Herstellung des Antikörpers, welches das Kultivieren der Wirtszelle in der Art umfasst, dass die Nucleinsäure exprimiert wird, und gegebenenfalls das Gewinnen des Antikörpers aus der Wirtszellkultur (z. B. aus dem Wirtszellkulturmedium). Die Erfindung stellt weiters eine Zusammensetzung bereit, die den humanisierten Anti-CD11a-Antikörper und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünner umfasst. Diese Zusammensetzung zur therapeutischen Verwendung ist steril und kann lyophilisiert werden. Die Erfindung umfasst weiters ein Verfahren zum Behandeln eines Säugetiers, das an einer LFA-1-vermittelten Störung leidet, umfassend das Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen Menge des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers an das Säugetier. Für solche therapeutischen Verwendungen können andere immunsuppressive Mittel oder Adhäsionsmolekül-Antagonisten (z. B. ein weiterer LFA-1-Antagonist oder ein VLA-4-Antagonist) entweder vor, nach oder gleichzeitig mit dem humanisierten Anti-CD11a-Antikörper mitverabreicht werden.
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • 1A stellt die Aminosäuresequenzen der Leichtkette von Maus-MHM24 (Seq.-ID Nr. 1), der humanisierten MHM24-F(ab)-8-Leichtkette (Seq.-ID Nr. 5), der menschlichen Consensussequenzen der Leichtketten-Untergruppe κI (humκI) (Seq.-ID Nr. 3) dar.
  • 1B stellt die Aminosäuresequenzen der Maus-MHM24-Schwerkette (Seq.-ID Nr. 4), humanisierten MHM24-F(ab)-8-Schwerkette (Seq.-ID Nr. 5), menschlichen Consensussequenzen der Schwerketten-Untergruppe III (humIII) (Seq.-ID Nr. 6) und Schwerkette der „rhesusierten" Antikörpermutante des Beispiels (Seq.-ID Nr. 24) dar.
  • In 1A und 1B sind hypervariable Regionen auf Basis von Sequenzhypervariabilität (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) in Klammern eingeschlossen, und hypervariable Schleifen auf Basis der Struktur von F(ab)-Antigen-komplexen (Chothia et al., Nature 342, 8767 (1989)) sind kursiv dargestellt. Die Restenummerierung erfolgte gemäß Kabat et al., wobei Insertionen als a, b und c dargestellt sind.
  • 2 stellt die Sequenzen der menschlichen CD11a-I-Domäne (Seq.-ID Nr. 7) und Rhesus-CD11a-I-Domäne (Seq.-ID Nr. 8) dar. β-Stränge und α-Helices sind unter strichen und gemäß Qu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10277–10281 (1995), markiert. Die Rhesus-I-Domänensequenz (rhCD11a) zeigt nur die vier Unterschiede zur menschlichen I-Domäne. Das Bindungsepitop für den MHM24-MAb (Seq.-ID Nr. 9) ist fett gedruckt dargestellt (Champe et al., J. Biol. Chem. 270, 1388–1394 (1995)).
  • 3 stellt die Hemmung von menschlichen Jurkat-T-Zellen an normale Keratinozyten durch Maus-MHM24 (volle Kreise), chimäres MHM24 (offene Dreiecke), humanisiertes MHM24 (HuIgG1) (volle Quadrate) und eine menschliche IgG1-Isotyp-Kontrolle (+) dar. Prozentuelle Bindung, gemessen mittels Fluoreszenz von markierten Jurkat-Zellen.
  • 4A–4C stellen die Hemmung der Bindung von Rhesus-Lymphozyten an normale menschliche Keratinozyten (4A), von Rhesus-Lymphozyten an rekombinantes, an Platten beschichtetes menschliches ICAM-1 (4B) und von Rhesus-/Human-CD11a-Chimären-transfizierten 293-Zellen an normale menschliche Keratinozyten (4C) dar. Hemmung durch Rhesus-bindendes MHM24 (RhIgG1) (volle Quadrate), Anti-CD18-MHM23 (volle Kreise), durch eine menschliche IgG1-Isotyp-Kontrolle (+) (4A und 4C) und eine Maus-IgG1-Isotyp-Kontrolle (+) (4B). Prozentuelle Bindung, gemessen mittels Fluoreszenz von markierten Lymphozyten (4A und B) oder markierter 293-Zellen (4C).
  • 5 zeigt, dass der menschliche gemischte Lymphozyten-Reaktionstest (MLR) durch Maus-MHM24 (volle Kreise), humanisiertes MHM24 (HuIgG1) (volle Quadrate) und humanisierte Isotyp-IgG1-Kontrolle (volle Rauten) blockiert wird. Der prozentuelle Stimulationsindex (% SI) ist das Verhältnis der Reaktion bei einer vorgegebenen MAb-Konzentration zur maximalen Reaktion ohne MAb. Die Daten sind für mehrere Tests unter Verwendung von zumindest zwei verschiedenen Stimulator/Reaktions-Paaren repräsentativ.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • I. Definitionen
  • Wenn nicht anders angegeben, bezieht sich der Ausdruck „CD11a" bei Verwendung hierin auf die Alpha-Untereinheit von LFA-1 aus irgendeinem Säugetier, jedoch vorzugsweise aus einem Menschen. Die CD11a kann aus einer natürlichen Quelle des Moleküls isoliert werden oder kann durch synthetische Mittel produziert werden (z. B. unter Verwendung DNA-Rekombinationstechnologie). Die Aminosäuresequenz für menschliches CD11a wird beispielsweise in EP 362.536B1 beschrieben.
  • Der Ausdruck „I-Domäne" von CD11a bezieht sich auf eine Region dieses Moleküls, die in Champe et al., J. Biol. Chem. 270, 1388–1394 (1995), und/oder Qu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10277–10281 (1995), beschrieben ist. Die Aminosäuresequenzen der menschlichen CD11a-I-Domäne (Seq.-ID Nr. 7) und Rhesus-CD11a-I-Domäne (Seq.-ID Nr. 8) sind hierin in 2 dargestellt.
  • Wenn nicht anders angegeben, bezieht sich der Ausdruck „Epitop-MHM24" bei Verwendung hierin auf diejenige Region in der I-Domäne von menschlichem CD11a, an die der MHM24-Antikörper (siehe untenstehendes Beispiel) bindet. Dieses Epitop umfasst die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 9 und gegebenenfalls andere Aminosäurereste von CD11a und/oder CD18.
  • Der Ausdruck „LFA-1-vermittelte Störung" bezieht sich auf einen pathologischen Zustand, der durch Zelladhäsionswechselwirkungen verursacht wird, die den LFA-1-Rezeptor an Lymphozyten umfassen. Beispiele solcher Störungen umfassen T-Zellen-Entzündungsreaktionen, wie z. B. entzündliche Hauterkrankungen, einschließlich Psoriasis; mit entzündlicher Darmerkrankung (wie z. B. Crohn-Krankheit und ulzeröse Kolitis) verbundene Reaktionen; Atemnotsyndrom beim Erwachsenen; Dermatitis; Meningitis; Enzephalitis; Uveitis; allergische Konditionen, wie z. B. Ekzem und Asthma; Infiltration von T-Zellen und chronische Entzündungsreaktionen umfassende Konditionen; Hauthypersensibilitätsreaktionen (einschließlich Efeusumach und Amerikanischer Lacksumach); Atherosklerose; Leukozytenadhäsionsmangel; Autoimmunerkrankungen, wie z. B. Rheumatoidarthritis; systemische Lupus erythematodes (SLE), Diabetes mellitus, multiple Sklerose, Reynaud-Syndrom, Autoimmunthyreoiditis, experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis, Sjorgen-Syndrom, juveniler Diabetes und Immunreaktionen, die mit verzögerter Hyperempfindlichkeit verbunden sind, wobei die Hyperempfindlichkeit durch Zytokine und T-Lymphozyten vermittelt wird, die sich typischerweise bei Tuberkulose, Sarkoidose, Polymyositis, Granulomatose und Vasculitis finden; perniziöse Anämie, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung (COPD); Bronchitis; Insulinitis; Rhinitis; Urtikaria; Glomerulonephrose, mit Leukozyten-Diapedese verbundene Krankheiten; ZNS-Entzündungsstörung; Multiorganverletzungssyndrom untergeordnete/s Blutvergiftung oder Trauma; hämolytische Autoimmunanämie; Myethemia Gravis; Antigen-Antikörper-Komplex-vermittelte Krankheiten; nephrotisches Syndrom; Malignitäten (z. B. B-Zellen-Malignitäten, wie z. B. chronische Lymphozytenleukämie oder Haarzell-Leukämie); alle Arten von Transplantationen, einschließlich Transplantat-Wirt- oder Wirt-Transplantat-Erkrankung; HIV- oder Rhinovirusinfektion, Lungenfibrose; Invasion von Tumorzellen in Sekundärorgane usw.
  • Der Ausdruck „immunsuppressives Mittel", wie er hierin für die begleitende Therapie verwendet wird, bezieht sich auf Substanzen, die dahingehend wirken, dass sie das Immunsystem des Wirts maskieren, in den das Transplantat transplantiert wird. Dies umfasst üblicherweise Substanzen, welche die Zytokinproduktion unterdrücken, die Selbst-Antigen-Expression down-regulieren oder unterdrücken oder MHC-Antigene maskieren. Beispiele solcher Mittel umfassen 2-Amino-6-aryl-5-substituierte Pyrimidine (siehe US-Patent Nr. 4.665.077), Azathioprin (oder Cyclophosphamid, falls eine schädliche Reaktion gegen Azathioprin auftritt); Bromcryptin; Glutaraldehyd (das die MHC-Antigene wie im US-Patent Nr. 4.120.649 beschrieben maskiert); Anti-idiotypische Antikörper für MHC-Antigene und MHC-Fragmente; Cyclosporin A; Steroide, wie z. B. Glucocorticosteroide; z. B. Prednison, Methylprednisolon und Dexamethason; Zytokin- oder Zytokinrezeptor-Antagonisten, einschließlich Anti-Interferon-γ-, -β- oder -α-Antikörper; Anti-Tumornekrosefaktor-α-Antikörper; Anti-Tumornekrosefaktor-β-Antikörper; Anti-Interleukin-2-Antikörper und Anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper; Anti-L3T4-Antikörper; heterologes Anti-Lymphozyten-Globulin; pan-T-Antikörper, vorzugsweise Anti-CD3- oder Anti-CD4/CD4a-Antikörper; lösliches Peptid, das eine LFA-3-Bindungsdomäne enthält (WO 90/08187, veröffentlicht am 26. Juli 1990); Streptokinase; TGF-β; Streptodornase; RNA oder DNA vom Wirt; FK506; RS-61443; Desoxyspergualin; Rapamycin; T-Zellen-Rezeptor (US-Patent Nr. 5.114.721); T-Zellen-Rezeptorfragmente (Offner et al., Science 251, 430–432 (1991); WO 90/11294; und WO 91/01133); und T-Zellen-Rezeptorantikörper ( EP 340.109 ), wie z. B. T10B9. Diese Mittel werden gleichzeitig mit dem CD11a-Antikörper oder zu verschiedenen Zeiten verabreicht und werden in denselben Dosierungen wie die auf dem Gebiet der Erfindung dargelegten oder in geringeren Dosierungen verwendet. Das bevorzugte begleitende immunsuppressive Mittel wird von zahlreichen Faktoren abhängen, einschließlich der Art der behandelten Störung, der Art der durchgeführten Transplantation sowie der Krankengeschichte des Patienten, jedoch wird es im Allgemeinen bevorzugt, dass das Mittel aus Cyclosporin A, einem Glucocorticosteroid (insbesondere bevorzugt Prednison oder Methylprednisolon), monoklonalem OKT-3-Antikörper, Azathioprin, Bromcryptin, heterologem Anti-Lymphozyten-Globulin oder einem Gemisch davon ausgewählt wird.
  • „Behandlung" bezieht sich sowohl auf therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, bei denen die Störung bereits vorliegt, sowie jene, bei denen die Störung zu verhindern ist.
  • „Säugetier" bezieht sich zum Zwecke der Erfindung auf jedes Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere, sowie Zoo- und Sporttiere, wie z. B. Hunde, Pferde, Katzen, Rinder usw. Vorzugsweise ist das Säugetier der Mensch.
  • Der Ausdruck „Transplantat" bezieht sich bei Verwendung hierin auf von einem Spender stammendes biologisches Material für die Transplantation in einen Empfänger. Transplantate umfassen solch verschiedenartige Materialien, wie z. B. isolierte Zellen, z. B. Inselzellen und von Neuronen stammende Zellen (z. B. Schwannsche Zellen), Gewebe, wie z. B. die Amnionmembran eines Neugeborenen, Knochenmark, hämatopoetische Vorläuferzellen und Organe, wie z. B. Haut, Herz, Leber, Milz, Pankreas, Schilddrüsenlappen, Lunge, Niere, röhrenförmige Organe, (z. B. Darm, Blutgefäße oder Speiseröhre) usw. Die röhrenförmigen Organe können verwendet werden, um geschädigte Abschnitte der Speiseröhre, Blutgefäße oder des Gallengangs zu ersetzen. Die Hauttransplantate können nicht nur für Verbrennungen verwendet werden, sondern auch als Verband für geschädigten Darm oder um gewisse Defekte, wie z. B. Zwerchfellbruch, zu verschließen. Das Transplantat stammt aus irgendeiner Säugetierquelle, einschließlich des Menschen, ob aus Leichen oder lebenden Spendern. Vorzugsweise ist das Transplantat Knochenmark oder ein Organ, wie z. B. ein Herz, und der Spender des Transplantats und der Wirt werden hinsichtlich der NLA-Klasse-II-Antigene aufeinander abgestimmt.
  • Der Ausdruck „Spender" bezieht sich bei Verwendung hierin auf die lebende oder tote Säugetierspezies, aus der das Transplantat stammt. Vorzugsweise ist der Spender ein Mensch. Menschliche Spender sind vorzugsweise freiwillige blutsverwandte Spender, die bei physischer Untersuchung normal sind und dieselbe ABO-Hauptblutgruppe aufweisen, da das Überschreiten der Hauptblutgruppenbarrieren möglicherweise das Überleben des Allotransplantats beeinträchtigt. Es ist jedoch möglich, beispielsweise eine Niere eines Typ-O-Spenders in einen A-, B- oder AB-Empfänger zu transplantieren.
  • Der Ausdruck „Transplantieren" und Variationen davon beziehen sich auf die Einführung eines Transplantats in einen Wirt, ob die Transplantation syngenetisch (wobei Spender und Empfänger genetisch identisch sind), allogenetisch (wobei Spender und Empfänger verschiedenen genetischen Ursprungs, jedoch von derselben Spezies sind) oder xenogenetisch erfolgt (wobei Spender und Empfänger verschiedener Spezies sind). Daher ist in einem typischen Szenario der Wirt ein Mensch und das Transplantat ein Isotransplantat, das von einem Menschen desselben oder verschiedenen genetischen Ursprungs stammt. In einem weiteren Szenario stammt das Transplantat aus einer Spezies, die von derjenigen verschieden ist, in die es transplantiert wird, wie z. B. ein in einen menschlichen Empfängerwirt transplantiertes Pavianherz. Dies umfasst Tiere von phylogenetisch weit auseinander liegenden Spezies, beispielsweise eine Schweineherzklappe oder tierische Beta-Inselzellen oder Neuronenzellen, die in einen menschlichen Wirt transplantiert werden.
  • „Erhöhen der Toleranz eines transplantierten Transplantats" in Bezug auf einen Wirt bezieht sich auf die Verlängerung der Überlebenszeit eines Transplantats in einem Wirt, in den es transplantiert wird, d. h. das Unterdrücken des Immunsystems des Wirts, so dass er ein fremdes Transplantat besser toleriert.
  • „Intermittierende" oder „periodische" Dosierung ist eine Dosierung, die für einen bestimmten Zeitraum kontinuierlich und in regelmäßigen Abständen erfolgt, die vorzugsweise durch mehr als einen Tag voneinander getrennt sind.
  • „Selektive Toleranz" der Störung bezieht sich auf eine Toleranz des Immunsystems des Wirts für das spezielle, die Störung verursachende Mittel, wobei jedoch die Fähigkeit des Wirts, ein zweites allogenetisches oder xenogenetisches Transplantat abzustoßen, erhalten bleibt. Vorzugsweise ist die Toleranz derart, dass das Immunsystem anderweitig intakt bleibt.
  • Der Ausdruck „LFA-1-Antagonist" bezieht sich auf ein Molekül, das als kompetitiver Inhibitor der LFA-1-Wechselwirkung mit ICAM-1 wirkt. Beispiele solcher Moleküle umfassen Antikörper, die entweder gegen CD11a (z. B. die hierin beschriebenen humanisierten Anti-CD11a-Antikörper) oder CD18 oder beide gerichtet sind, Antikörper gegen ICAM-1 und andere Moleküle, wie z. B. Peptide (z. B. peptidomimetische Antagonisten).
  • Der Ausdruck „VLA-4-Antagonist" bezieht sich auf ein Molekül, das als kompetitiver Inhibitor der VLA-4-Wechselwirkung mit VCAM wirkt. Beispiele solcher Moleküle umfassen Antikörper, die entweder gegen VLA-4 oder VCAM und gegen andere Moleküle (z. B. peptidomimetische Antagonisten) gerichtet sind.
  • Der Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst im Speziellen monoklonale Antikörper (einschließlich monoklonaler Antikörper voller Länge), polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z. B. bispezifische Antikörper) und Antikörperfragmente, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen.
  • „Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines Antikörpers voller Länge, im Allgemeinen die Antigenbindungsstelle oder die variable Region davon. Beispiele von Antikörperfragmenten umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')2- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper; Einzelketten-Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, die aus Antikörperfragmenten gebildet werden.
  • Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich wie hierin verwendet auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde, d. h. die die Population umfassenden einzelnen Antikörper sind identisch mit der Ausnahme möglicher natürlich auftretender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und richten sich gegen eine einzige antigene Stelle. Darüber hinaus richtet sich jeder monoklonale Antikörper im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise verschiedene, gegen unterschiedliche Determinanten (Epitope) gerichtete Antikörper umfassen, gegen eine einzige Determinante am Antigen. Der Modifikator „monoklonal" kennzeichnet den Charakter des Antikörpers dahingehend, dass er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wurde und ist nicht dahingehend auszulegen, dass die Produktion des Antikörpers irgendein bestimmtes Verfahren erfordert. Beispielsweise können die gemäß der Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper mit dem erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Hybridomverfahren hergestellt werden oder können mit DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (siehe z. B. US-Patent Nr. 4.816.567). Die „monoklonalen Antikörper" können auch aus Phagenantikörperbibliotheken isoliert werden, und zwar unter Verwendung der beispielsweise in Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschriebenen Techniken.
  • Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen speziell „chimäre" Antikörper (Immunglobuline), bei denen ein Abschnitt der Schwer- und/oder Leichtkette identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern sind, die sich von einer bestimmten Spezies herleiten oder einer bestimmten Antikörperklasse oder -unterklasse angehören, während der verbleibende Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die sich von einer anderen Spezies herleiten oder einer anderen Antikörperklasse oder -unterklasse angehören, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen (US-Patent Nr. 4.816.567; und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984)).
  • Der Ausdruck „hypervariable Region" bezieht sich bei Verwendung hierin auf diejenigen Aminosäurereste eines Antikörpers, die für die Antigenbindung verantwortlich sind. Die hypervariable Region umfasst Aminosäurereste aus einer „Complementary-Determining-Region" oder „CDR" (d. h. Reste 24–34 (L1), 50–56 (L2) und 89–97 (L3) in der variablen Domäne der Leichtkette und 31–35 (H1), 50–65 (H2) und 95–102 (H3) in der variablen Domäne der Schwerkette; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) und/oder jene Reste aus einer „hypervariablen Schleife" (d. h. Reste 26–32 (L1), 50–52 (L2) und 91–96 (L3) in der variablen Domäne der Leichtkette und 26–32 (H1), 53–55 (H2) und 96–101 (H3) in der variablen Domäne der Schwerkette; Chothia und Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)). „Gerüst"- oder „FR"-Reste sind jene Reste der variablen Domäne, die nicht die hierin definierten Reste der hypervariablen Region sind.
  • „Humanisierte" Formen nicht menschlicher (z. B. Maus-) Antikörper sind chimäre Antikörper, die eine minimale von nicht humanem Immunglobulin stammende Sequenz enthalten. Größtenteils sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), in denen die Reste der hypervariablen Region des Empfängers durch Reste der hypervariablen Region aus einer nicht menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z. B. Maus, Ratte, Kaninchen oder aus einem nicht menschlichen Primaten, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen sind die Reste der Fv-Gerüstregion (FR) des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht menschliche Reste ersetzt. Darüber hinaus können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die sich im Empfängerantikörper oder im Spenderantikörper nicht finden. Diese Modifizierungen werden angebracht, um die Leistungsfähigkeit des Antikörpers weiter zu verfeinern. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen umfassen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der hypervariablen Schleifen denen eines nicht menschlichen Immunglobulins entsprechen, wobei alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird gegebenenfalls auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins, umfassen. Für weitere Einzelheiten siehe Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992).
  • „Einzelketten-Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die VH- und VL-Domänen des Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorliegen. Im Allgemeinen umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den VH- und VL-Domänen, der es dem sFv ermöglicht, die gewünschte Struktur zur Antigenbindung auszubilden. Für einen Überblick über Fv siehe Pluckthun in: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, S. 269–315 (1994).
  • Der Ausdruck „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigenbindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable Domäne der Schwerkette (VH) umfassen, die mit einer variablen Domäne der Leichtkette (VL) in derselben Polypeptidkette verbunden ist (VH-VL). Durch Verwenden eines Linkers, der zu kurz ist, um die Paarung zwischen den beiden Domänen an derselben Kette zu erlauben, werden die Domänen dazu gezwungen, sich mit den komplementären Domänen einer anderen Kette zu paaren, um zwei Antigenbindungsstellen zu erzeugen. Diabodies werden ausführlicher beispielsweise in EP 404.097 ; WO 93/11161; und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben.
  • Der Ausdruck „lineare Antikörper" bezieht sich bei Verwendung in dieser Anmeldung durchwegs auf die in Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057–1062 (1995), beschriebenen Antikörper. Zusammenfassend umfassen diese Antikörper ein Paar von Tandem-Fd-Segmenten (VH-CH1-VH-CH1), die ein Paar von Antigenbindungsregionen bilden. Lineare Antikörper können bispezifisch oder monospezifisch sein.
  • Ein „isolierter" Antikörper ist einer, der aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert und getrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, welche die diagnostischen und therapeutischen Verwendungen für den Antikörper stören würden und umfassen Enzyme, Hormone und andere proteinartige und nicht proteinartige Gelöststoffe. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) auf ein mittels Lowry-Verfahren gemessenes Ausmaß von mehr als 95 Gew.-% Antikörper und insbesondere bevorzugt auf ein Ausmaß von mehr als 99 Gew.-%, (2) auf ein Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz mittels Verwendung eines Zentrifugenbecher-Sequenzierers zu erhalten, oder (3) zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung gereinigt. Ein isolierter Antikörper umfasst den Antikörper in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden sein wird. Für gewöhnlich wird der isolierte Antikörper jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
  • Der Ausdruck „Epitop-markiert" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen an einen „Epitop-Marker" fusionierten Anti-CD11a-Antikörper. Das Epitop-Marker-Polypeptid weist eine ausreichende Anzahl von Resten auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen den ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch ausreichend kurz, so dass es die Aktivität des CD11a-Antikörpers nicht stört. Der Epitop-Marker ist vorzugsweise ausreichend einzigartig, so dass der Antikörper dagegen nicht wesentlich mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Marker-Polypeptide weisen in Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste und üblicherweise ungefähr 8 bis 50 Aminosäurereste auf (vorzugsweise ungefähr 9 bis 30 Reste). Beispiele umfassen das Grippe-HA-Marker-Polypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); den c-myc-Marker und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 dagegen (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12), 3610–3616 (1985)); und den Herpes-simplex-Virusglykoprotein-D- (gD-) Marker und seinen Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)). In gewissen Ausführungsformen ist der Epitop-Marker ein „Salvage-Rezeptorbindungsepitop".
  • Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck „Salvage-Rezeptorbindungsepitop" auf ein Epitop der Fc-Region eines IgG-Moleküls (z. B. IgG, IgG2, IgG3 oder IgG4), das für die Erhöhung der Serumhalbwertszeit des IgG-Moleküls verantwortlich ist.
  • Der Ausdruck „zytotoxisches Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Substanz, welche die Funktion von Zellen hemmt oder verhindert und/oder die Zerstörung von Zellen bewirkt. Der Ausdruck umfasst radioaktive Isotope (z. B. I131, I125, Y90 und Re186), chemotherapeutische Mittel und Toxine, wie z. B. enzymatisch aktive Toxine bakterieller, pilzlicher, pflanzlicher oder tierischer Herkunft, oder Fragmente davon.
  • Ein „chemotherapeutisches Mittel" ist eine zur Behandlung von Krebs zweckdienliche chemische Verbindung. Beispiel chemotherapeutischer Mittel umfassen Adriamycin, Doxorubicin, 5-Fluoruracil, Cytosin-Arabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Taxotere (Docetaxel), Busulfan, Cytoxin, Taxol, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin C, Mitoxantron, Vincreistin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187), Melpha-lan und andere verwandte Stickstoff-Loste.
  • Der Ausdruck „Promedikament" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Vorläufer oder ein Derivat einer pharmazeutisch aktiven Substanz, die für Tumorzellen im Vergleich zum elterlichen Medikament weniger toxisch und fähig ist, enzymatisch aktiviert oder zur aktiveren elterlichen Form umgesetzt zu werden. Siehe z. B. Wilman, „Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions 14, 615th Meeting Belfast, S. 375–382 (1986), und Stella et al., „Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (Hrsg.), Humana Press, S. 247–267 (1985). Die Promedikamente dieser Erfindung umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Phosphat enthaltende Promedikamente, Thiophosphat enthaltende Promedikamente, Sulfat enthaltende Promedikamente, Peptid enthaltende Promedikamente, D-Aminosäure-modifizierte Promedikamente, glykosylierte Promedikamente, β-Lactam enthaltende Promedikamente, gegebenenfalls substituierte, Phenoxyacetamid enthaltende Promedikamente oder gegebenenfalls substituierte, Phenylacetamid enthaltende Promedikamente, 5-Fluorcytosin- und andere 5-Fluoruridin-Promedikamente, die zum aktiveren zytotoxischen freien Medikament umgesetzt werden können. Beispiele zytotoxischer Medikamente, die zu einer Promedikament-Form zur Verwendung in dieser Erfindung derivatisiert werden können, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die oben beschriebenen chemotherapeutischen Mittel.
  • Der Ausdruck „Marker" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt mit dem Antikörper kon jugiert ist. Der Marker selbst kann an sich nachweisbar sein (z. B. Radioisotopmarker oder Fluoreszenzmarker) oder kann im Falle eines enzymatischen Markers eine chemische Veränderung einer Substratverbindung oder Zusammensetzung katalysieren, die nachweisbar ist.
  • Unter „Festphase" wird eine nichtwässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele von hierin vorgesehenen Festphasen umfassen jene, die teilweise oder vollständig aus Glas (z. B. Controlled-pore-Glas), Polysacchariden (z. B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikonen bestehen. In gewissen Ausführungsformen in Abhängigkeit vom Kontext kann die Festphase den Napf einer Testplatte umfassen; in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z. B. eine Affinitätschromatographiesäule). Dieser Ausdruck umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase einzelner Teilchen, wie z. B. jene, die im US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben sind.
  • Ein „Liposom" ist ein kleines Vesikel, das aus verschieden Arten von Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensid zusammengesetzt ist, das zur Abgabe eines Medikaments (z. B. der hierin offenbarten Anti-CD11a-Antikörper und gegebenenfalls eines chemotherapeutischen Mittels) an ein Säugetier zweckdienlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise ähnlich der Lipidanordnung biologischer Membranen in einer Doppelschichtstruktur angeordnet.
  • Ein „isoliertes" Nucleinsäuremolekül ist eine Nucleinsäure, die identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül abgetrennt ist, mit dem es für gewöhnlich in der natürliche Quelle der Antikörper-Nucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder in einem anderen Milieu vor, in der/dem es sich in der Natur findet. Isolierte Nucleinsäuremoleküle unterscheiden sich daher vom Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen vorkommt. Jedoch umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül ein Nucleinsäuremolekül, das in Zellen enthalten ist, die für gewöhnlich den Antikörper exprimieren, wo das Nucleinsäuremolekül sich an einer Chromosomenstelle befindet, die sich von der natürlicher Zellen unterscheidet.
  • Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operativ gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die beispielsweise für Prokaryoten geeigneten Kontrollsequenzen umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz und eine Ribosombindungsstelle. Eukaryotische Zellen setzen bekannterweise Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer ein.
  • Eine Nucleinsäure ist „operativ gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung zu einer anderen Nucleinsäure gesetzt wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operativ an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operativ an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation gefördert wird. Im Allgemeinen bedeutet „operativ gebunden", dass die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Falle eines Sekretionsleaders zusammenhängend sind und sich im Leseraster befinden. Jedoch müssen Enhancer nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an zweckdienlichen Restriktionsstellen erzielt. Falls solche Stellen nicht vorhanden sind, werden synthetische Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
  • Wie hierin verwendet, werden die Ausdrücke „Zelle", Zelllinie" und „Zellkultur" wechselseitig verwendet, und alle derartigen Bezeichnungen umfassen die Nachkommenschaft. Folglich umfassen die Ausdrücke „Transformanten" und „transformierte Zellen" die primäre gegenständliche Zelle und davon hergeleitete Kulturen ohne Berücksichtigung der Transferanzahl. Es versteht sich weiters, dass aufgrund beabsichtigter und unbeabsichtigter Mutationen nicht alle Nachkommen hinsichtlich des DNA-Ge halts identisch sein müssen. Es sind mutierte Nachkommen umfasst, welche dieselbe Funktion oder biologische Aktivität aufweisen, auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent worden ist. Wo unterscheidende Bezeichnungen beabsichtigt sind, werden sie aus dem Kontext deutlich.
  • II. Ausführungsweisen der Erfindung
  • A. Antikörperherstellung
  • Ein Verfahren zur Humanisierung eines nicht menschlichen CD11a-Antikörpers ist im untenstehenden Beispiel beschrieben. Um einen Anti-CD11a-Antikörper zu humanisieren, wird ein nicht menschliches Antikörper-Ausgangsmaterial hergestellt. Beispielhafte Techniken zur Erzeugung solcher Antikörper werden in den folgenden Abschnitten beschrieben.
  • (i) Antigenherstellung
  • Das zur Produktion von Antikörpern zu verwendende CD11a-Antigen kann z. B. eine lösliche Form der extrazellulären Domäne von CD11a oder ein Fragment von CD11a sein (z. B. ein CD11a-Fragment, welches das „MHM24-Epitop" umfasst, wie z. B. CD11a-I-Domänenfragment). Alternativ dazu können Zellen, die CD11a an ihrer Zelloberfläche exprimieren, zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Solche Zellen können transformiert werden, um CD11a und gegebenenfalls CD18 zu exprimieren, oder können andere natürlich auftretende Zellen (z. B. menschliche lymphoblastenartige Zellen, siehe Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13, 202–208 (1983)) oder Jurkat-Zellen (siehe untenstehendes Beispiel) sein. Andere Formen von CD11a, die zur Erzeugung von Antikörpern zweckdienlich sind, sind dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung üblicherweise bekannt.
  • (ii) Polyklonale Antikörper
  • Polyklonale Antikörper werden vorzugsweise in Tieren durch mehrfache subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des maßgeblichen Antigens und eines Adjuvans hergestellt. Es kann zweckdienlich sein, das maßgebliche Antigen an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z. B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor, und zwar unter Verwendung bifunktioneller oder derivatisierender Mittel, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl2 oder R1N=C=NR, wobei R und R1 unterschiedliche Alkylgruppen sind.
  • Tiere werden gegen Antigen, immunogene Konjugate oder Derivate durch Kombinieren von z. B. 100 μg oder 5 μg des Proteins oder Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit drei Volumenanteilen Freundschem komplettem Adjuvans und intradermale Injektion der Lösung an mehreren Stellen immunisiert. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 oder 1/10 der ursprünglichen Menge Peptid oder Konjugat in Freundschem komplettem Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet. Sieben bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen und das Serum auf Antikörpertiter getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer sein Plateau erreicht. Vorzugsweise wird das Tier mit dem Konjugat desselben Antigens geboostet, das jedoch an ein anderes Protein und/oder durch ein anderes Vernetzungsmittel konjugiert ist. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Außerdem werden aggregierende Mittel, wie z. B. Alaun, geeigneterweise verwendet, um die Immunantwort zu verstärken.
  • (iii) Monoklonale Antikörper
  • Monoklonale Antikörper können unter Verwendung des erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Hybridomverfahrens hergestellt werden oder können durch DNA-Rekombinationsverfahren (US-Patent Nr. 4.816.567) hergestellt werden.
  • Beim Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z. B. ein Hamster oder Makake-Affe, wie hierin oben beschrieben immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder zur Produktion von Antikörpern fähig sind, die spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Lymphozyten werden dann unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z. B. Polyethylenglykol, mit Myelomzellen fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59–103 (1986)).
  • Die so hergestellten Hybridomzellen werden in ein geeignetes Medium gesät und darin gezüchtet, wobei das Medium vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben nicht fusionierter elterlicher Myelomzellen hemmt. Wenn den elterlichen Myelomzellen beispielsweise das Enzym Hypoxanthin-Guanidin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Medium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) umfassen, wobei diese Substanzen das Wachstum HGPRT-defekter Zellen verhindert.
  • Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die effizient fusionieren, stabile Antikörperproduktion in hohem Ausmaß durch die selektierten Antikörper-produzierenden Zellen fördern und gegen ein Medium, wie z. B. HAT-Medium, empfindlich sind. Bevorzugte Myelomzelllinien unter diesen sind Maus-Myelomlinien, wie z. B. jene, die sich von MOP-21- und M. C.-11-Maustumoren herleiten, die vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, erhältlich sind, sowie SP-2- oder X63-Ag8-653-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Menschliche Myelom- und Maus-Human-Heteromyelomzelllinien sind zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper ebenfalls beschrieben worden (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New York, S. 51–63 (1987)).
  • Kulturmedium, in dem Hybridomzellen wachsen, wird auf Produktion von gegen das Antigen gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die von Hybridomzellen produziert werden, mittels Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z. B. dem Radioimmuntest (RIA) oder Enzyme-linked-immunoabsorbent-assay (ELISA), bestimmt.
  • Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise mit der Scatchard-Analyse von Munson et al., Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
  • Nach der Identifizierung von Hybridomzellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59–103 (1986)). Geeignete Zellkulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise DMEM- oder RPMI-1640-Medium. Außerdem können die Hybridomzellen in vivo als Aszites-Tumore in einem Tier gezüchtet werden.
  • Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper werden in geeigneter Weise vom Kulturmedium, der Aszites-Flüssigkeit oder dem Serum durch geeignete Immunglobulinreinigungsverfahren, wie z. B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, getrennt.
  • Für die monoklonalen Antikörper kodierende DNA kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z. B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die zur spezifischen Bindung an Gene fähig sind, die für die Schwer- und Leichtketten mo noklonaler Antikörper kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden. Die Hybridomzellen dienen als eine bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn einmal isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren eingebaut werden, die dann in Wirtszellen wie z. B. E.-coli-Zellen, Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, transfiziert werden, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erlangen. Die rekombinante Produktion von Antikörpern wird unten ausführlicher beschrieben.
  • (iv) Humanisierung und Aminosäuresequenzvarianten
  • Das untenstehende Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Humanisierung eines Anti-CD11a-Antikörpers. In gewissen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, Aminosäuresequenzvarianten des humanisierten Antikörpers zu erzeugen, insbesondere wo diese die Bindungsaffinität oder andere biologische Eigenschaften des humanisierten Antikörpers verbessern.
  • Aminosäuresequenzvarianten des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers werden durch Einführen geeigneter Nucleotidveränderungen in die DNA des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers oder durch Peptidsynthese hergestellt. Solche Varianten umfassen beispielsweise Deletionen von und/oder Insertionen in und/oder Substitutionen von Reste(n) in den für humanisiertes Anti-CD11a-F(ab)-8 gezeigten Sequenzen (z. B. Seq.-ID Nr. 2 und 4). Jegliche Kombination von Deletion, Insertion und Substitution wird durchgeführt, um zum endgültigen Konstrukt zu gelangen unter der Voraussetzung, dass das endgültige Konstrukt die gewünschten Eigenschaften besitzt. Die Aminosäureänderungen können auch posttranslationelle Vorgänge des humanisierten Anti-CD11a-Antikörper verändern, wie z. B. die Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen.
  • Ein zweckdienliches Verfahren zur Identifizierung gewisser Reste oder Regionen des humanisierten Anti-CD11a-Antikörperpolypeptids, die bevorzugte Mutageneseorte sind, wird „Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt, wie von Cunningham und Wells, Science 244, 1081–1085 (1989), beschrieben wird. Hierbei wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert (z. B. geladene Reste, wie z. B. Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (insbesondere bevorzugt Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit CD11a-Antigen zu bewirken. Jene Aminosäurestellen, die eine funktionelle Empfindlichkeit auf die Substitutionen zeigen, werden dann durch Einführen weiterer oder anderer Varianten an den oder gegen die Stellen der Substitution weiter verfeinert. Folglich muss die Beschaffenheit der Mutation an sich nicht vorgegeben sein, während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation vorgegeben ist. Um beispielsweise die Leistungsfähigkeit einer Mutation an einer gegebenen Stelle zu analysieren, wird Ala-Scanning oder Zufallsmutagenese am Zielcodon oder an der Zielregion durchgeführt, und die exprimierten Anti-CD11a-Antikörpervarianten werden auf die gewünschte Aktivität gescreent.
  • Aminosäuresequenzinsertionen umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen, die hinsichtlich der Länge von einem Rest bis zu Polypeptiden reichen, die hundert oder mehr Reste enthalten, sowie Intrasequenzinsertionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste. Beispiele terminaler Insertionen umfassen den humanisierten Anti-CD11a-Antikörper mit einem N-terminalen Methionylrest oder den an einen Epitopmarker fusionierten Antikörper. Andere Insertionsvarianten des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpermoleküls umfassen die Fusion eines Enzyms oder Polypeptids, das die Serumhalbwertszeit des Antikörpers erhöht (siehe unten), an den N- oder C-Terminus des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers.
  • Eine andere Art von Variante ist eine Aminosäuresubstitutionsvariante. Bei diesen Varianten ist zumindest ein Aminosäurerest im humanisierten Anti-CD11a-Antikörpermolekül entfernt und stattdessen ein anderer Rest insertiert. Die Stellen höchsten Interesses für die Substitutionsmutagense umfassen die Reste der hypervariablen Schleifenregionen, jedoch sind FR-Änderungen ebenfalls vorgesehen. Tabelle IV im unten stehenden Beispiel stellt einen Leitfaden über hypervariable Regionen bereit, die verändert werden können. An der Antigenbindung beteiligte Reste oder FR-Reste werden im Allgemeinen auf eine relativ konservative Weise substituiert. Derartige konservative Substitutionen sind in Tabelle I unter dem Titel „bevorzugte Substitutionen" dargestellt. Falls solche Substitutionen in einer Veränderung der biologischen Aktivität resultieren, dann werden substantiellere Änderungen, die in Tabelle I als „beispielhafte Substitutionen" bezeichnet sind, oder wie sie unten in Bezug auf Aminosäureklassen ausführlicher beschrieben sind, eingeführt und die Produkte gescreent.
  • Tabelle I
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  • Substantielle Modifizierungen der biologischen Eigenschaften des Antikörpers werden durch Auswählen von Substitutionen erzielt, die sich in ihrer Wirkung auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich auftretende Reste werden auf Basis gemeinsamer Seitenketten-Eigenschaften unterteilt:
    • (1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile
    • (2) neutral-hydrophil: Cys, Ser, Thr,
    • (3) sauer: Asp, Glu
    • (4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg
    • (5) Reste, welche die Kettenorientierung beeinflussen: Gly, Pro; und
    • (6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe
  • Nicht konservative Substitutionen bedingen das Austauschen eines Elements einer dieser drei Klassen durch eine andere Klasse. Jeglicher Cysteinrest, der nicht an der Erhaltung der richtigen Konformation des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers beteiligt ist, kann ebenfalls, im Allgemeinen durch Serin, substituiert werden, um die oxidative Stabilität des Moleküls zu verbessern und anomale Vernetzung zu verhindern. Im Gegensatz dazu können dem Antikörper Cysteinbindung(en) hinzugefügt werden, um seine Stabilität zu erhöhen (insbesondere wo der Antikörper ein Antikörperfragment, wie z. B. ein Fv-Fragment, ist).
  • Eine weitere Art von Aminosäurevariante des Antikörpers verändert das ursprüngliche Glykosylierungsmuster des Antikörpers. Unter Verändern wird das Deletieren einer oder mehrerer Kohlenhydratgruppen verstanden, die im Antikörper vorliegen, und oder das Hinzufügen einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Antikörper nicht vorhanden sind.
  • Die Glykosylierung von Antikörpern ist typischerweise N-verknüpft oder O-verknüpft. N-verknüpft bezieht sich auf die Anbindung einer Kohlenhydratgruppierung an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin ist, sind Erkennungssequenzen für die enzymatische Anbindung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparaginseitenkette. Folglich erzeugt die Gegenwart irgendeiner dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine mögliche Glykosylierungsstelle. O-verknüpfte Glykosylierung bezieht sich auf die Anbindung von einem der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxyaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, obgleich 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxyserin ebenfalls verwendet werden können.
  • Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen an den Antikörper wird zweckdienlicherweise durch Verändern der Aminosäuresequenz in der Weise erzielt, dass sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen enthält (für O-verknüpfte Glykosylierungsstellen).
  • Für Aminosäuresequenzvarianten des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers kodierende Nucleinsäuremoleküle werden durch eine Vielzahl von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren hergestellt. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Isolierung aus einer natürlichen Quelle (im Falle von natürlich auftretenden Aminosäuresequenzvarianten) oder die Herstellung mittels Oligonucleotid-vermittelter (oder ortsgerichteter) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer früher hergestellten Varianten- oder Nicht-Variantenversion des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers.
  • Für gewöhnlich werden Aminosäuresequenzvarianten des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zumindest 75% Aminosäuresequenzidentität, bevorzugter zumindest ungefähr 80%, bevorzugter zumindest ungefähr 85%, bevorzugter zumindest ungefähr 90% und insbesondere bevorzugt zumindest ungefähr 95%, mit den Aminosäuresequenzen der Schwer- oder der Leichtkette (z. B. wie in Seq. 2 oder 5) des ursprünglichen humanisierten Antikörpers aufweist. Identität oder Homologie bezüglich dieser Sequenz ist hierin als der prozentuelle Anteil von Aminosäureresten in der Kandidat-Sequenz definiert, die mit den humanisierten CD11a-Resten identisch sind, erforderlichenfalls nach Angleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken zur Erzielung der maximalen Sequenzidentität, wobei jegliche konservative Substitutionen (wie in obiger Tabelle I definiert) als Teil der Sequenzidentität nicht berücksichtigt werden. Keine der N-terminalen, C-terminalen oder internen Extensionen, Deletionen oder Insertionen in der Antikörpersequenz sind dahingehend auszulegen, dass sie die Sequenzidentität oder Homologie beeinträchtigen.
  • (v) Screening auf biologische Eigenschaften
  • Es wird auf Antikörper gescreent, welche die in einem humanisierten Anti-CD11a-Antikörper hierin als wünschenswert definierten Eigenschaften aufweisen.
  • Um auf Antikörper zu screenen, die an das von einem Antikörper von Interesse gebundene Epitop am CD11a binden (z. B. jene, welche die Bindung des MHM24-Antikörpers an CD11a blockieren), kann ein routinemäßiger Cross-blocking-Test durchgeführt werden, wie z. B. jener, der in Ed Harlow und David Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), beschrieben ist. Alternativ dazu kann Epitop-Kartierung, wie sie z. B. in Champe et al., J. Biol. Chem. 270, 1388–1394 (1995), beschrieben wird, durchgeführt werden, um zu ermitteln, ob der Antikörper an ein Epitop von Interesse bindet.
  • Antikörperaffinitäten (z. B. für menschliches CD11a oder Rhesus-CD11a) können durch Sättigungsbindung bestimmt werden, indem entweder einkernige Peripherblutzellen oder Rhesus-Leukozyten wie in den untenstehenden Beispielen beschrieben verwendet werden. Nach diesem Verfahren zur Bestimmung der Antikörperaffinität werden Lymphozyten oder Rhesus-Leukozyten den Platten in einem Volumen von 170 μl pro Napf zugegeben und die Platten 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen geerntet und 10-mal gewaschen. Die Proben werden dann gezählt. Die Daten werden von Counts pro Minute auf Nanomolarität umgerechnet und dann einer Vierparameter-Kurvenanpassung der Sättigungsgrafiken (gebunden gegenüber gesamt) unterzogen, um Kd- (scheinbar) Werte zu bestimmen. Bevorzugte humanisierte Antikörper sind jene, die menschliches CD11a mit einem Kd-Wert von nicht mehr als ungefähr 1 × 10–7, vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 1 × 10–8, bevorzugter nicht mehr als ungefähr 1 × 10–9 und insbesondere bevorzugt nicht mehr als ungefähr 2 × 10–10, binden.
  • Es ist außerdem wünschenswert, humanisierte Antikörper auszuwählen, die vorteilhafte Anti-Adhäsionseigenschaften im „Keratinozyten-Monoschicht-Adhäsionstest" aufweisen. Bevorzugte Antikörper sind jene, die einen IC50-Wert (nM) von nicht mehr als ungefähr 250 nM, vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 100 nM, bevorzugter nicht mehr als ungefähr 1 nM und insbesondere bevorzugt nicht mehr als ungefähr 0,5 nM, aufweisen, um die Adhäsion von Jurkat-Zellen an normale menschliche, ICAM-1-exprimierende Epidermiskeratinozyten zu verhindern. Gemäß diesem Test werden normale menschliche Epidermiskeratinozyten aus Kulturflaschen entfernt und in einer Konzentration von 5 × 105 lebenden Zellen/ml in Lymphozyten-Testmedium resuspendiert. Aliquoten von 0,1 ml/Napf werden dann über Nacht in 96-Napf-Platten mit flachem Boden kultiviert; geeignete Näpfe werden durch Zugabe von 100 Einheiten/Napf Interferon-Gamma stimuliert. Zellen des Jurkat-Klons E6-1 werden markiert, gewaschen, auf 1 × 106 Zellen/ml resuspendiert und mit 2fachen Reihenverdünnungen beginnend bei 500 ng/ml Antikörper bei 4°C 20 Minuten lang inkubiert. Nach Entfernung des Mediums von der Keratinozyten-Monoschicht werden 0,1 ml/Napf markierte Zellen zugegeben und bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert. Die Näp fe werden gewaschen, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen, worauf die Fluoreszenz gemessen wird.
  • Erwünschte humanisierte Anti-CD11a-Antikörper sind jene, die einen IC50-Wert (nM) von nicht mehr als ungefähr 100 nM, vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 50 nM, bevorzugter nicht mehr als ungefähr 5 nM und insbesondere nicht mehr als ungefähr 1 nM, im gemischten Lymphozyten-Reaktions- (MLR-) Test unter Verwendung menschlicher Lymphozyten aufweisen. Für den menschlichen sowie Rhesus-MLR werden Peripherblut-Lymphozyten von zwei nicht verwandten Spendern aus heparinisiertem Vollblut isoliert und auf eine Konzentration von 3 × 106 Zellen/ml in RMPI 1640 (GIBCO) mit Zusätzen resuspendiert, die im untenstehenden Beispiel beschrieben ist. Die Stimulatorzellen werden mittels Bestrahlung unreaktiv gemacht. Antwortzellen in einer Konzentration von 1,5 × 105 Zellen pro Napf werden gemeinsam mit einer gleichen Anzahl von Stimulatorzellen in 96-Napf-Platten mit flachem Boden kultiviert. Zweifach-Reihenverdünnungen von Antikörper beginnend bei einer Konzentration von 10 nM werden den Kulturen zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 200 μl/Napf zu liefern. Die Kulturen werden bei 37°C in 5% CO2 5 Tage lang kultiviert und dann mit 1 μCi/Napf [3H]Thymidin 16 Stunden lang gepulst, worauf die [3H]-Thymidin-Inkorporation gemessen wird.
  • (vi) Antikörperfragmente
  • In gewissen Ausführungsformen ist der humanisierte CD11a-Antikörper ein Antikörperfragment. Verschiedene Techniken sind zur Produktion von Antikörperfragmenten entwickelt worden. Herkömmlicherweise wurden diese Fragmente über proteolytischen Verdau intakter Antikörper hergeleitet (siehe z. B. Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 107–117 (1992), und Brennan et al., Science 229, 81 (1985)). Jedoch können diese Fragmente nunmehr direkt durch rekombinante Wirtszellen produziert werden. Beispielsweise können Fab'-SH-Fragmente direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gekoppelt werden, um F(ab')2-Fragmente zu bilden (Carter et al., Bio/Technology 10, 163–167 (1992)). Nach einem anderen Ansatz können F(ab')2-Fragmente direkt aus rekombinanter Zellkultur isoliert werden. Andere Techniken für die Herstellung von Antikörperfragmenten werden dem geübten Fachmann offensichtlich sein.
  • (vii) Multispezifische Antikörper
  • In manchen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, multispezifische (z. B. bispezifische) humanisierte CD11a-Antikörper zu erzeugen, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Epitope aufweisen. Beispielhafte bispezifische Antikörper können zwei verschiedene Epitope des CD11a-Proteins binden. Alternativ dazu kann ein Anti-CD11a-Arm mit einem Arm kombiniert werden, der an ein Trigger-Molekül an einem Leukozyten bindet, wie z. B. an ein T-Zellen-Rezeptormolekül (z. B. CD2 oder CD3) oder an Fc-Rezeptoren für IgG (FcγR), wie z. B. FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16), so dass die Zellabwehrmechanismen auf die CD11a exprimierende Zelle konzentriert werden. Bispezifische Antikörper können auch verwendet werden, um zytotoxische Mittel gegen CD11a exprimierende Zellen zu lokalisieren. Diese Antikörper besitzen einen CD11a-Bindungsarm und einen Arm, der das zytotoxische Mittel bindet (z. B. Saporin, Anti-Interferon-α, Vinca-Alkaloid, Ricin-A-Ketten, Methotrexat oder Radioisotop-Hapten). Bispezifische Antikörper können als Antikörper voller Länge oder als Antikörperfragmente (z. B. bispezifische F(ab')2-Antikörper) hergestellt werden.
  • Nach einem anderen Ansatz zum Herstellen bispezifischer Antikörper kann die Schnittstelle zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen gentechnisch so verändert werden, das der prozentuelle Anteil an Heterodimeren, die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden, maximiert wird. Die bevorzugte Schnittstelle umfasst zumindest einen Teil der CH3-Domäne einer konstanten Antikörperdomäne. Bei diesem Verfahren werden eine oder mehrere kleine Aminosäureseitenketten aus der Schnittstelle des ersten Antikörpermoleküls durch größere Seitenketten (z. B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Ausgleichende „Vertiefungen" identischer oder ähnlicher Größe wie die große(n) Seitenkette(n) werden an der Schnittstelle des zweiten Anti körpermolekül durch Ersetzen der großen Aminosäureseitenketten durch kleinere (z. B. Alanin oder Threonin) erzeugt. Dies stellt einen Mechanismus zum Erhöhen der Ausbeute des Heterodimers gegenüber anderen unerwünschten Endprodukten, wie z. B. Homodimeren, bereit. Siehe WO 96/27011, veröffentlicht am 6. September 1996.
  • Bispezifische Antikörper umfassen vernetzte oder „Heterokonjugat"-Antikörper. Beispielsweise kann einer der Antikörper im Heterokonjugat an Avidin, der andere an Biotin gekoppelt sein. Geeignete Vernetzungsmittel sind auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt und sind im US-Patent Nr. 4.676.980 gemeinsam mit einer Reihe von Vernetzungstechniken offenbart.
  • Techniken zum Erzeugen bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten sind in der Literatur ebenfalls beschrieben worden. Beispielsweise können bispezifische Antikörper mittels chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch gespalten werden, um F(ab')2-Fragmente zu erzeugen. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-komplexierenden Mittels Natriumarsenit reduziert, um benachbarte Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare Disulfidbildung zu verhindern. Die erzeugten Fab'-Fragmente werden dann zu Thionitrobenzoat- (TNB-) Derivaten umgesetzt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann durch Reduktion mit Mercaptoethylamin wieder zurück zum Fab'-Thiol umgesetzt und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats gemischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die produzierten bispezifischen Antikörper können als Mittel zur selektiven Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
  • Neuere Fortschritte haben die direkte Gewinnung von Fab'-SH-Fragmenten aus E. coli erleichtert, die chemisch gekoppelt werden können, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten bispezifischen Antikörper-F(ab')2-Moleküls. Beide Fab'-Fragmente wurden gesondert aus E. coli sekretiert und direkter chemischer Kopplung in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper auszubilden. Der so gebildete bispezifische Antikörper war fähig, an HER2-Rezeptor exprimierende Zellen und an normale menschliche T-Zellen zu binden, sowie die lytische Aktivität menschlicher zytotoxischer Lymphozyten gegen menschliche Brusttumorziele auszulösen.
  • Verschiedene Techniken zum Herstellen und Isolieren bispezifischer Antikörperfragmente direkt aus rekombinanter Zellkultur sind ebenfalls beschrieben worden. Beispielsweise sind bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucin-Zippern hergestellt worden. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547–1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden mittels Genfusion an die Fab'-Abschnitte zweier verschiedener Antikörper gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenkregion reduziert, um Monomere zu bilden, die dann wieder oxidiert wurden, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Produktion von Antikörper-Homodimeren eingesetzt werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschriebene „Diabody"-Technik hat einen alternativen Mechanismus zum Herstellen bispezifischer Antikörperfragmente bereitgestellt. Die Fragmente umfassen eine variable Domäne der Schwerkette (VH), die mit einer variablen Domäne der Leichtkette (VL) durch einen Linker verbunden ist, der zu kurz ist, um die Paarung zwischen den beiden Domänen an derselben Kette zu erlauben. Demgemäß sind die VH- und VL-Domänen des einen Fragments gezwungen, sich mit den komplementären VL- und VH-Domänen eines anderen Fragments zu paaren, wodurch zwei Antigenbindungsstellen gebildet werden. Eine weitere Strategie zum Herstellen bispezifischer Antikörperfragmente durch Verwendung von Einzelketten-Fv- (sFv-) Dimeren ist ebenfalls beschrieben worden. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994). Alternativ dazu kann der bispezifische Antikörper ein „linearer Antikörper" sein, der wie von Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057–1062 (1995), beschrieben produziert wird.
  • Antikörper mit mehr als zwei Wertigkeiten sind vorgesehen. Beispielsweise können trispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
  • (viii) Andere Modifizierungen
  • Andere Modifizierungen des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers sind vorgesehen. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung bezüglich der Effektorfunktion so zu modifizieren, dass beispielsweise die Wirksamkeit des Antikörpers bei der Krebsbehandlung erhöht wird. Beispielsweise können Cysteinrest(e) in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Interketten-Disulfidbindungsbildung in dieser Region ermöglicht wird. Die so erzeugten homodimeren Antikörper können verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder erhöhten Komplement-vermittelte Zellabtötungsfähigkeit und Antikörper-abhängige Zelltoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992), und B. Shopes et al., J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Antikörper mit erhöhter Anti-Tumoraktivität können unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993), beschrieben hergestellt werden. Alternativ dazu kann ein Antikörper konstruiert werden, der doppelte Fc-Regionen aufweist und dadurch erhöhte Komplement-Lyse- und ADCC-Fähigkeiten aufweisen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989).
  • Die Erfindung betrifft weiters Immunkonjugate, welche den hierin beschriebenen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel, wie z. B. an ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z. B. ein enzymatisch aktives Toxin bakterieller, pilzlicher oder tierischer Herkunft oder ein Fragment davon) oder ein radioaktives Isotop (d. h. ein Radiokonjugat) konjugiert ist.
  • Zur Erzeugung solcher Immunkonjugate zweckdienliche chemotherapeutische Mittel sind oben beschrieben worden. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen die Diphtherie-A-Kette, nicht bindende aktive Fragmente des Diphtherie-Toxins, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, Alpha-Sarcin, Aleurites-fordii- Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAPS), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Eine Vielzahl von Radionukliden sind zur Produktion radiokonjugierter Anti-CD11a-Antikörper verfügbar. Beispiele umfassen 212Bi, 131I, 131In, 90Y und 186Re.
  • Konjugate von Antikörper und zytotoxischem Mittel werden unter Verwendung einer Vielzahl bifunktioneller Proteinkopplungsmittel hergestellt, wie z. B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionelle Derivate von Imidoestern (wie z. B. Dimethyladipimidat HCl), aktive Ester (wie z. B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyde (wie z. B. Glutaraldehyd), Bis-azido-Verbindungen (wie z. B. Bis-(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bis-Diazonium-Derivate (wie z. B. Bis-(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanate (wie z. B. Tolyen-2,6-diisocyanat) und Bis-aktive Fluorverbindungen (wie z. B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol). Beispielsweise kann ein Ricin-Immuntoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. Kohlenstoff-14-markierte 1-Isothiocyanatbenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhaftes chelatisierendes Mittel zur Konjugation von Radionucleotiden an den Antikörper. Siehe WO 94/11026.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann der Antikörper an einen „Rezeptor" (wie z. B. Streptavidin) zum Einsatz im Tumor-Pretargeting konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat an den Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung von ungebundenem Konjugat aus dem Kreislauf unter Verwendung eines Clearing-Mittels und anschließender Verabreichung eines „Liganden" (z. B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z. B. ein Radionuklid) konjugiert ist.
  • Die hierin offenbarten Anti-CD11a-Antikörper können auch als Immunliposomen formuliert werden. Den Antikörper enthaltende Liposomen werden mit auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren hergestellt, wie sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben sind. Liposomen mit erhöhter Zirkulationszeit sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
  • Besonders zweckdienliche Liposomen können mittels Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung erzeugt werden, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst. Liposomen werden durch Filter definierter Porengröße extrudiert, um Liposomen mit dem gewünschten Durchmesser zu liefern. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982), beschrieben über eine Disulfidaustauschreaktion konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie z. B. Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
  • Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann auch im ADEPT verwendet werden, indem der Antikörper an ein Promedikament-aktivierendes Enzym konjugiert wird, das ein Promedikament (z. B. ein chemotherapeutisches Peptidyl-Mittel, siehe WO 81/01145) zu einem aktiven Anti-Krebsmedikament umsetzt. Siehe beispielsweise WO 88/07378 und US-Patent Nr. 4.975.278.
  • Die Enzymkomponente des für ADEPT zweckdienlichen Immunkonjugats umfasst jegliches Enzym, das fähig ist, auf ein Promedikament auf eine solche Weise zu wirken, dass es zu seiner aktiveren zytotoxischen Form umgesetzt wird.
  • Enzyme, die im Verfahren dieser Erfindung zweckdienlich sind, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Alkalische Phosphatase, die zur Umsetzung Phosphatenthaltender Promedikamente zu freien Medikamenten zweckdienlich ist; Arylsulfatase, die zur Umsetzung Sulfat-enthaltender Promedikamente zu freien Medikamenten zweckdienlich ist; Cytosindeaminase, die zur Umsetzung von nicht toxischem 5-Fluorcytosin zum Anti-Krebsmedikament 5-Fluoruracil zweckdienlich ist; Proteasen, wie z. B. Serratia-Protease, Thermolysin, Subtilisin, Carboxypeptidasen und Cathepsine (wie z. B. Cathepsine B und L), die zur Umsetzung Peptid-enthaltender Promedikamente zu freien Medikamenten zweckdienlich sind; D-Alanylcarboxypeptidasen, zweckdienlich zur Umsetzung von Promedikamenten, die D-Aminosäuresubstituenten enthalten; Kohlenhydrat-spaltende Enzyme, wie z. B. β-Galactosidase und Neuraminidase, die zur Umsetzung glykosylierter Promedikamente zu freien Medikamenten zweckdienlich sind; β-Lactamase, die zur Umsetzung von mit β-Lactamen derivatisierten Medikamenten zu freien Medikamenten zweckdienlich ist; und Penicillinamidasen, wie z. B. Penicillin-V-Amidase oder Penicillin-G-Amidase, die zur Umsetzung von Medikamenten, die an ihren Aminstickstoffen mit Phenoxyacetyl- bzw. Phenylacetylgruppen derivatisiert sind, zu freien Medikamenten zweckdienlich sind. Alternativ dazu können Antikörper mit enzymatischer Aktivität, die auf dem Gebiet der Erfindung auch als „Abzyme" bekannt sind, verwendet werden, um die Promedikamente der Erfindung zu freien aktiven Medikamenten umzusetzen (siehe z. B. Massey, Nature 328, 457–458 (1987)). Antikörper-Abzym-Konjugate können wie hierin beschrieben zur Abgabe des Abzyms an eine Tumorzellpopulation hergestellt werden.
  • Die Enzyme dieser Erfindung können kovalent an die Anti-CD11a-Antikörper gebunden werden, und zwar durch Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind, wie z. B. die Verwendung der oben beschriebenen heterobifunktionellen Vernetzungsmittel. Alternativ dazu können Fusionsproteine, die zumindest eine Antigenbindungsregion eines Antikörpers der Erfindung umfassen, die an zumindest einen funktionell aktiven Abschnitt eines Enzyms der Erfindung gebunden ist, unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannten DNA-Rekombinationstechniken konstruiert werden (siehe z. B. Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (1984)).
  • In gewissen Ausführungsformen der Erfindung kann es wünschenswert sein, ein Antikörperfragment und nicht einen intakten Antikörper zu verwenden, um beispielsweise die Tumorpenetration zu erhöhen. In diesem Fall kann es wünschenswert sein, das Antikörperfragment zu modifizieren, um seine Serumhalbwertszeit zu erhöhen. Dies kann beispielsweise durch Inkorporation eines Salvage-Rezeptorbindungsepi tops in das Antikörperfragment erzielt werden (z. B. durch Mutation der geeigneten Region im Antikörperfragment oder durch Inkorporieren des Epitops in einen Peptidmarker, der dann an das Antikörperfragment an eines der Enden oder in der Mitte, z. B. durch DNA- oder Peptidsynthese, fusioniert wird). Siehe WO 96/32478, veröffentlicht am 17. Oktober 1996.
  • Das Salvage-Rezeptorbindungsepitop stellt im Allgemeinen eine Region dar, worin eine beliebige oder mehrere Aminosäurereste aus einer oder zwei Schleifen einer Fc-Domäne auf eine analoge Position des Antikörperfragments übertragen werden. Noch bevorzugter werden drei oder mehr Reste aus einer oder zwei Schleifen der Fc-Domäne übertragen. Noch bevorzugter wird das Epitop der CH2-Domäne der Fc-Region (z. B. eines IgG) entnommen und auf die CH1-, CH3- oder VH-Region oder mehr als eine solche Region des Antikörpers übertragen. Alternativ dazu wird das Epitop der CH2-Domäne der Fc-Region entnommen und auf die CL-Region oder VL-Region oder beide Regionen des Antikörperfragments übertragen.
  • In einer der insbesondere bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Salvage-Rezeptorbindungsepitop die Sequenz (5'→3') PKNSSMISNTP (Seq.-ID Nr. 16) und umfasst gegebenenfalls außerdem eine Sequenz, die aus der aus HQSLGTQ (Seq.-ID Nr. 17), HQNLSDGK (Seq.-ID Nr. 18), HQNISDGK (Seq.-ID Nr. 19) oder VISSHLGQ (Seq.-ID Nr. 20) bestehenden Gruppe gewählt ist, insbesondere wo das Antikörperfragment ein Fab oder F(ab')2 ist. In einer weiteren insbesondere bevorzugten Ausführungsform ist das Salvage-Rezeptorbindungsepitop ein Polypeptid, das die Sequenzen) (5'→3') HQNLSDGK (Seq.-ID Nr. 18), HQNISDGK (Seq.-ID Nr. 19) oder VISSHLGQ (Seq.-ID Nr. 20) und die Sequenz PKNSSMISNTP (Seq.-ID Nr. 16) enthält.
  • Kovalente Modifizierungen des humanisierten CD11a-Antikörpers sind im Schutzumfang dieser Erfindung ebenfalls enthalten. Sie können bei Anwendbarkeit durch chemische Synthese oder durch enzymatische oder chemische Spaltung des Antikörpers vorgenommen werden. Andere Arten von kovalenten Modifizierungen des Anti körpers werden in das Molekül eingeführt, indem die Aminosäuren des Antikörpers, auf die abgezielt wird, mit einem organischen Derivatisierungsmittel zu Reaktion gebracht werden, das fähig ist, mit den gewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten zu reagieren.
  • Cysteinylreste werden am häufigsten mit α-Haloacetaten (und entsprechenden Aminen), wie z. B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, zur Reaktion gebracht, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu liefern. Cysteinylreste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
  • Histidinylreste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5–7,0 zur Reaktion gebracht, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidinylseitenkette ist. Para-Bromphenacylbromid ist ebenfalls zweckdienlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
  • Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden zur Reaktion gebracht. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung der Umkehrung der Ladung der Lysinylreste. Andere geeignete Reagenzien zum Derivatisieren von α-Amino-enthaltenden Resten umfassen Imidoester, wie z. B. Methylpicolinimidat, Pyridoxalphosphat, Pyridoxal, Chlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure, O-Methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
  • Arginylreste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, unter ihnen Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cylcohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass die Reaktion wegen des hohen pKa der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie mit der Arginin-Epsilon-Aminogruppe reagieren.
  • Die spezifische Modifizierung von Tyrosylresten kann durchgeführt werden, wobei besonderes Interesse an der Einführung spektraler Marker in Tyrosylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan besteht. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosyl-Spezies bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von 125I oder 131I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung im Radioimmuntest herzustellen.
  • Carboxyseitenketten (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Reaktion mit Carbodiimiden (R-N=C=N-R') modifiziert, wobei R und R' verschiedene Alkylgruppen sind, wie z. B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-demethylpentyl)carbodiimid. Darüber hinaus werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgesetzt.
  • Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten desamidiert. Diese Reste werden unter neutralen oder basischen Bedingungen desamidiert. Die desamidierte Form dieser Reste liegt im Schutzumfang der Erfindung.
  • Andere Modifizierungen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)), die Acetylierung des N-terminalen Amins und die Amidierung jeglicher C-terminalen Carboxygruppe.
  • Eine weitere Art der kovalenten Modifizierung umfasst das chemische oder enzymatische Koppeln von Glykosiden an den Antikörper. Diese Verfahren sind insofern vorteilhaft, als dass sie nicht die Produktion des Antikörpers in einer Wirtszelle erfordern, welche Glykosylierungsfähigkeiten zur N- oder O-verknüpften Glykosylierung aufweist. In Abhängigkeit von der verwendeten Kopplungsart kann/können der/die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxygruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie z. B. jene von Cystein, (d) freie Hydroxygruppen, wie z. B. jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie z. B. jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Diese Verfahren sind in WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259–306 (1981), beschrieben.
  • Die Entfernung jeglicher am Antikörper vorhandener Kohlenhydratgruppierungen kann chemisch oder enzymatisch erzielt werden. Die chemische Deglykosylierung erfordert die Exposition des Antikörpers gegenüber der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung. Diese Behandlung resultiert in der Spaltung der meisten oder aller Zucker mit Ausnahme des verbindenden Zuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin), während der Antikörper intakt verbleibt. Die chemische Deglykosylierung wird von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Antikörpern kann durch Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exo-Glykosidasen wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben erzielt werden.
  • Eine weitere Art der kovalenten Modifizierung des Antikörpers umfasst das Binden des Antikörpers an eines von zahlreichen nichtproteinartigen Polymeren, wie z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, in der Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.377 dargelegt ist.
  • B. Vektoren, Wirtszellen und rekombinante Verfahren
  • Die Erfindung stellt auch eine isolierte, für den humanisierten Anti-CD11a-Antikörper kodierende Nucleinsäure, die Nucleinsäure enthaltende Vektoren und Wirtszellen und rekombinante Techniken für die Produktion des Antikörpers bereit.
  • Für die rekombinante Produktion des Antikörpers wird die dafür kodierende Nucleinsäure isoliert und in einen replizierbaren Vektor für die weitere Klonierung (Amplifikation der DNA) oder Expression insertiert. Für den monoklonalen Antikörper kodierende DNA kann unter Anwendung herkömmlicher Verfahren leicht isoliert und sequenziert werden (z. B. durch Verwenden von Oligonucleotidsonden, die fähig sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten des Antikörpers kodieren). Es sind zahlreiche Vektoren verfügbar. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine oder mehrere der folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • (i) Signalsequenzkomponente
  • Der Anti-CD11a-Antikörper dieser Erfindung kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid produziert werden, das vorzugsweise eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid ist, das eine spezifische Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids aufweist. Die gewählte heterologe Signalsequenz ist vorzugsweise eine, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d. h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird. Für prokaryotische Zellen, welche die native Anti-CD11a-Antikörpersignalsequenz nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz substituiert, die beispielsweise aus der Gruppe der Alkalischen-Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabilen Enterotoxin-11-Leader gewählt ist. Für die Hefesekretion kann die native Signalsequenz beispielsweise durch den Hefe-Invertase-Leader, α-Faktor-Leader (einschließlich α-Faktor-Leader aus Saccharomy ces und Kluyveromyces) oder Saure-Phosphatase-Leader, den Glucoamylase-Leader aus C. albicans oder das in WO 90/13646 beschriebene Signal substituiert werden. Bei der Säugetier-Zellexpression sind Säugetier-Signalsequenzen, beispielsweise das Herpes-simplex-gD-Signal, verfügbar.
  • Die DNA für eine solche Vorläuferregion wird im Leseraster an für den Anti-CD11a-Antikörper kodierende DNA ligiert.
  • (ii) Herkunft der Replikationskomponente
  • Sowohl Expressions- als auch Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren eine, die es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und umfasst Replikationsstartpunkte oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren wohl bekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2 μ-Startpunkt ist für Hefe geeignet, und verschiedene Virusstartpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen geeignet. Im Allgemeinen wird die Replikationskomponente für Säugetier-Expressionsvektoren nicht benötigt (der SV40-Startpunkt wird typischerweise nur deshalb verwendet, da er den frühen Promotor enthält).
  • (iii) Selektionsgenkomponente
  • Expressions- und Klonierungsvektoren können ein Selektionsgen enthalten, das auch selektierbarer Marker genannt wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Defekte ergänzen oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z. B. das für D-Alanin-Racemase kodierende Gen für Bacilli.
  • Eines der Beispiele eines Selektionsschemas setzt ein Arzneimittel ein, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert sind, produzieren ein Protein, das Arzneimittelresistenz verleiht und überleben folglich das Selektionsregime. Beispiele einer derartigen dominanten Selektion verwenden die Arzneimittel Neomycin, Mycophenolsäure und Hygromycin.
  • Weitere Beispiele geeigneter selektierbarer Marker für Säugetierzellen sind jene, welche die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die zur Aufnahme der Anti-CD11a-Antikörper-Nucleinsäure kompetent sind, wie z. B. DHFR, Thymidinkinase, Metallothionein-I und -II, vorzugsweise Primaten-Metallothionein-Gene, Adenosindeaminase, Ornithindecarboxylase usw.
  • Beispielsweise werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zunächst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat (Mtx), einem kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält. Eine geeignete Wirtszelle bei Einsatz von DHFR der Wildform ist die hinsichtlich DHFR-Aktivität defekte Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zelllinie.
  • Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wirte der Wildform, die endogenes DHFR enthalten), die mit DNA-Sequenzen transformiert oder cotransformiert sind, die für Anti-CD11a-Antikörper, DHFR-Protein der Wildform und einen weiteren selektierbaren Marker, wie z. B. Aminoglycosid-3'-phosphotransferase (APH), kodieren, durch Zellwachstum in Medium selektiert werden, das ein Selektionsmittel für den selektierbaren Marker, wie z. B. ein Aminoglycosid-Antibiotikum, z. B. Kanamycin, Neomycin oder G418, enthält. Siehe US-Patent Nr. 4.965.199.
  • Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorhandene trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe bereit, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1. Jones, Genetics 85, 12 (1977). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefe-Wirtszellen-Genom stellt dann eine effektive Umgebung zur Detektion der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit. Gleichermaßen werden Leu2-defekte Hefestämme (ATCC 20,622 oder 38,626) durch bekannte, das Leu2-Gen beherbergende Plasmide komplementiert.
  • Außerdem können vom zirkulären 1,6-μm-Plasmid pKD1 hergeleitete Vektoren für die Transformation von Kluyveromyces-Hefen verwendet werden. Alternativ dazu wurde ein Expressionssystem für die Produktion von rekombinantem Kälber-Chymosin in großem Maßstab für K. lactis beschrieben. Van den Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile Mehrfachkopie-Expressionsvektoren zur Sekretion von reifem rekombinantem menschlichem Serumalbumin durch industrielle Stämme von Kluyveromyces sind ebenfalls offenbart worden. Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991).
  • (iv) Promotorkomponente
  • Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operativ an die Anti-CD11a-Antikörpernucleinsäure gebunden ist. Zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen den phoA-Promotor, β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme, Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem und Hybridpromotoren, wie z. B. den tac-Promotor. Jedoch sind andere bekannte bakterielle Promotoren geeignet. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden auch eine Shine-Dalgarno- (S. D.-) Sequenz enthalten, die operativ an die für den Anti-CD11a-Antikörper kodierende DNA gebunden ist.
  • Promotorsequenzen für Eukaryoten sind bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die ungefähr 25 bis 30 Basen stromauf derjenigen Stelle lokalisiert ist, an der die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz, die sich 70 bis 80 Basen stromauf des Transkriptionsstarts vieler Gene findet, ist eine CNCAAT-Region, wobei N jegliches Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein kann. Alle diese Sequenzen werden in geeigneter Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert.
  • Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, wie z. B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
  • Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziierte Abbauenzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortliche Enzyme. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden in EP 73.657 ausführlicher beschrieben. Hefeenhancer werden mit Hefepromotoren ebenfalls vorteilhaft verwendet.
  • Die Transkription des Anti-CD11a-Antikörpers aus Vektoren in Säugetierwirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren kontrolliert, die aus den Genomen von Viren, wie z. B. aus Polyomavirus, Geflügelpockenvirus, Adenovirus (wie z. B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Cytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und insbesondere bevorzugt Simian-Virus 40 (SV40), aus heterolo gen Säugetierpromotoren, z. B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, aus Hitzeschock-Promotoren unter der Voraussetzung entnommen sind, dass solche Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
  • Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden zweckdienlicherweise als ein SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den SV40-Virus-Replikationsstartpunkt enthält. Der unmittelbar frühe Promotor des menschlichen Cytomegalie-Virus wird zweckdienlicherweise als ein HindIII-E-Restriktionsfragment erhalten. Ein System zum Exprimieren von DNA in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor ist im US-Patent Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifizierung dieses Systems ist im US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Reyes et al., Nature 297, 598–601 (1982), über die Expression von menschlicher β-Interferon-cDNA in Mauszellen unter Kontrolle eines Thymidinkinase-Promotors für den Herpes-simplex-Virus. Alternativ dazu kann die lange terminate Wiederholung des Rous-Sarkom-Virus als Promotor verwendet werden.
  • (v) Enhancerelementkomponente
  • Die Transkription einer für den Anti-CD11a-Antikörper dieser Erfindung kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird häufig durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert. Viele Enhancersequenzen sind nunmehr für Säugetiergene bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100–270), den frühen Promotor-Enhancer von Cytomegalie-Virus, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), über Enhancerelemente für die Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Der Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' der für den Anti-CD11a-Antikörper kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors.
  • (vi) Transkriptionsterminationskomponente
  • In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekt, Pflanze, Tier, Mensch oder kernhältige Zellen anderer mehrzelliger Organismen) verwendete Expressionsvektoren werden auch Sequenzen enthalten, die für die Termination der Transkription und zum Stabilisieren der mRNA benötigt werden. Solche Sequenzen aus den untranslatierten 5'- und gelegentlich 3'-Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs sind allgemein verfügbar. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für Anti-CD11a-Antikörper kodierenden mRNA transkribiert werden. Eine der zweckdienlichen Transkriptionsterminationskomponenten ist die Polyadenylierungsregion des Rinder-Wachstumshormons. Siehe WO 94/11026 und den darin offenbarten Expressionsvektor.
  • (vii) Selektion und Transformation von Wirtszellen
  • Geeignete Wirtszellen zum Klonieren und Exprimieren der DNA in den Vektoren hierin sind die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren eukaryotischen Zellen. Geeignete Prokaryoten für diesen Zweck umfassen Eubakterien, wie z. B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z. B. Escherichia, z. B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z. B. Salmonella typhimurium, Serratia, z. B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli, wie z. B. B. subtilis und B. licheniformis (z. B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710, veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z. B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Einer der bevorzugten E.-coli-Wirte ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obgleich andere Stämme, wie z. B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325), geeignet sind. Diese Beispiele sind illustrativ und nicht einschränkend.
  • Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroorganismen, wie z. B. Fadenpilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für Anti-CD11a-Antikörperkodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Bäckerhefe wird unter den eukaryotischen Wirtsmikroorganismen am häufigsten verwendet. Jedoch ist eine Reihe anderer Gattungen, Spezies und Stämme allgemein verfügbar und hierin zweckdienlich, wie z. B. Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces-Wirte, wie z. B. K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045); K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa; Schwanniomyces, wie z. B. Schwanniomyces occidentalis; und Fadenpilze, wie z. B. Neurospora-, Penicillium-, Tolypocladium- und Aspergillus-Wirte, wie z. B. A. nidulans und A. niger.
  • Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem Anti-CD11a-Antikörper werden von mehrzelligen Mikroorganismen hergeleitet. Beispiele von Invertebratenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und –Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen, wie z. B. Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori sind identifiziert worden. Eine Vielzahl von Virusstämmen zur Transfektion sind öffentlich verfügbar, z. B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und derartige Viren können als Virus hierin gemäß der vorliegenden Erfindung insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen verwendet werden.
  • Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können ebenfalls als Wirte eingesetzt werden.
  • Jedoch hat größtes Interesse an Vertebratenzellen bestanden, und die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ist zu einem Routineverfahren geworden. Beispiele zweckdienlicher Säugetier-Wirtszelllinien sind die durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, zum Wachstum in Suspensionskultur subklo niert, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70); Grüne-Meerkatzen-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervikalkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
  • Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- und Klonierungsvektoren für die Anti-CD11a-Antikörperproduktion transformiert und in herkömmlichen Nährmedien gezüchtet, die in geeigneter Weise zum Induzieren der Promotoren, Selektieren von Transformanten oder Amplifizieren der für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene modifiziert sind.
  • (viii) Kultivieren der Wirtszellen
  • Die zur Produktion des Anti-CD11a-Antikörpers dieser Erfindung verwendeten Wirtszellen können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie z. B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RMPI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma), sind zum Kultivieren der Wirtszellen geeignet. Außerdem kann jedes der in Ham et al., Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US-Patenten Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; oder 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; oder US-Patent Re. 30.985 beschriebenen Medien als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann wie erforderlich mit Hormonen und/oder Wachstumsfaktoren (wie z. B. Insulin, Transferrin oder Epidermiswachstumsfaktor), Salzen (wie z. B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z. B. HEPES), Nucleotiden (wie z. B. Adenosin und Thymi din), Antibiotika (wie z. B. GENTAMYCINTM-Medikament), Spurenelementen (als anorganische Verbindungen definiert, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorliegen) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Jegliche anderen notwendigen Ergänzungen können in geeigneten Konzentrationen aufgenommen werden, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie z. B. Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die früher mit der zur Expression gewählten Wirtszelle verwendet worden sind und sind dem gewöhnlich Fachkundigen offensichtlich.
  • (ix) Reinigung des Anti-CD11a-Antikörpers
  • Bei Verwendung rekombinanter Techniken kann der Antikörper intrazellulär, im periplasmatischen Raum produziert oder direkt ins Medium sekretiert werden. Falls der Antikörper intrazellulär produziert wird, werden im ersten Schritt die Trümmerteilchen, entweder Wirtzellen oder lysierte Fragmente, beispielsweise mittels Zentrifugation oder Ultrafiltration entfernt. Carter et al., Bio/Technology 10, 163–167 (1992), beschreiben ein Verfahren zum Isolieren von Antikörpern, die in den periplasmatischen Raum von E. coli sekretiert werden. Zusammenfassend wird Zellpaste in Gegenwart von Natriumacetat (pH 3,5), EDTA und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) über ungefähr 30 Minuten aufgetaut. Zelltrümmer können mittels Zentrifugation entfernt werden. Wo der Antikörper ins Medium sekretiert wird, werden Überstände aus solchen Expressionssystemen im Allgemeinen zuerst unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, wie z. B. einer Ultrafiltrationseinheit von Amicon oder Millipore Pellicon, konzentriert. Ein Proteaseinhibitor, wie z. B. PMSF, kann in jeden der vorangegangenen Schritte aufgenommen werden, um Proteolyse zu hemmen, und es können Antibiotika aufgenommen werden, um das Wachstum hinzugekommener Kontaminanten zu verhindern.
  • Die aus den Zellen hergestellte Antikörperzusammensetzung kann beispielsweise unter Verwendung von Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse und Affinitätschromatographie gereinigt werden, wobei die Affinitätschromatographie die bevorzugte Reinigungstechnik ist. Die Eignung von Protein A als Affinitätsligand hängt von der Spezies und vom Isotyp jeglicher im Antikörper vorhandenen Immunglobulin-Fc-Domäne ab. Protein A kann verwendet werden, um Antikörper zu reinigen, die auf menschlichen γ1-, γ2- oder γ4-Schwerketten basieren (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 (1983)). Protein G wird für alle Maus-Isotypen und für menschliches γ3 empfohlen (Guss et al., EMBO J. 5, 1567–1575 (1986)). Die Matrix, an die der Affinitätsligand gebunden wird, ist am häufigsten Agarose, jedoch sind andere Matrices verfügbar. Mechanisch stabile Matrices, wie z. B. Controlled-pore-Glas oder Poly(styroldivinyl)benzol ermöglichen höhere Flussraten und kürzere Verarbeitungszeiten als sie mit Agarose erzielt werden können. Wo der Antikörper eine CH3-Domäne umfasst, ist das Bakerbond-ABXTM-Harz (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) zur Reinigung geeignet. Andere Techniken zur Proteinreinigung, wie z. B. Fraktionierung an einer Ionentauschersäule, Ethanolpräzipitation, Umkehrphasen-HPLC, Chromatographie an Silika, Chromatographie an Heparin-SEPHAROSETM, Chromatographie an einem Anionen- oder Kationentauscherharz (wie z. B. Polyasparaginsäure-Säule), Chromatofokussierung, SDS-PAGE und Ammonsulfatpräzipitation, sind in Abhängigkeit vom zu gewinnenden Antikörper ebenfalls verfügbar.
  • Im Anschluss an jegliche(n) Vorreinigungsschritt(e) kann das den Antikörper von Interesse und Verunreinigungen umfassende Gemisch der Hydrophob-Chromatographie bei niedrigem pH unter Verwendung eines Elutionspuffers bei einem pH zwischen ungefähr 2,5 und 4,5 unterzogen werden und wird vorzugsweise bei niedrigen Salzkonzentrationen (z. B. von ungefähr 0 bis 0,25 M Salz) durchgeführt.
  • C. Pharmazeutische Formulierungen
  • Therapeutische Formulierungen des Antikörpers werden zur Lagerung durch Mischen des Antikörpers mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausg., A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Empfänger in den eingesetzten Konzentrationen und Dosierungen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure und Methionin; Konservierungsstoffe (wie z. B. Octadecyldimethylbenzylammoniumchlorid; Hexamethoniumchlorid; Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid; Phenol, Butyl- oder Benzylalkohol; Alkylparabene, wie z. B. Methyl- oder Propylparaben; Catechol; Resorcinol; Cyclohexanol; 3-Pentanol; und m-Kresol); niedermolekulare (weniger als ungefähr 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrinen; chelatisierende Mittel, wie z. B. EDTA; Zucker, wie z. B. Saccharose, Mannit, Trehalose oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; Metallkomplexe (z. B. Zink-Proteinkomplexe); und/oder nichtionische Tenside, wie z. B. TWEENTM, PLURONICSTM oder Polyethylenglykol (PEG).
  • Die Formulierung hierin kann wie für die speziell zu behandelnde Indikation erforderlich auch mehr als eine aktive Verbindung enthalten, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich nicht gegenseitig nachteilig beeinflussen. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, auch ein immunsuppressives Mittel bereitzustellen. Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination in Mengen vorhanden, die für den beabsichtigten Zweck wirksam sind.
  • Die aktiven Bestandteile können auch in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose- bzw. Gelatine-Mirkokapseln und Poly-(methylmethacrylat)-Kapseln, in kolloidalen Abgabesystemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen sein. Solche Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausg., A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
  • Die zur In-vivo-Verabreichung verwendeten Formulierungen müssen steril sein. Dies wird leicht mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen erzielt.
  • Es können Retard-Präparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele von Retard-Präparaten umfassen semipermeable Matrices fester hydrophiler Polymere, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrices in Form von Formteilen, z. B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele von Retard-Matrices umfassen Polyester, Hydrogele (zum Beispiel Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z. B. das Lupron DepotTM (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat zusammengesetzt sind), und Po-ly-D-(–)-3-Hydroxybuttersäure. Während Polymere, wie z. B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für über 100 Tage ermöglichen, setzen gewisse Hydrogele Proteine über kürzere Zeiträume frei. Wenn eingekapselte Antikörper für lange Zeit im Körper verbleiben, können sie als Folge der Exposition mit Feuchte bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was in einem Verlust an biologischer Aktivität und in möglichen Veränderungen der Immunogenität resultiert. Zweckmäßige Strategien können zur Stabilisierung in Abhängigkeit von beteiligtem Mechanismus ausgearbeitet werden. Wenn beispielsweise der Aggregationsmechanismus als intermolekulare S-S-Bindungsbildung über Thio-Disulfid-Austausch erkannt wird, kann eine Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Kontrollieren des Feuchtegehalts, Verwenden geeigneter Zusätze und Entwickeln spezieller Polymer-Matrix-Zusammensetzungen erzielt werden.
  • D. Nichttherapeutische Verwendungen für den Antikörper
  • Die Antikörper der Erfindung können als Affinitätsreinigungsmittel verwendet werden. In diesem Verfahren werden die Antikörper an einer festen Phase, wie z. B. einem Sephadex-Harz oder Filterpapier, unter Anwendung von Verfahren immobilisiert, die auf dem Gebiet der Erfindung wohl bekannt sind. Der immobilisierte Antikörper wird mit einer Probe kontaktiert, die das zu reinigende CD11a-Protein (oder ein Fragment davon) enthält, und anschließend wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe mit Ausnahme des an den immobilisierten Antikörper gebundenen CD11a-Proteins entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Glycinpuffer, pH 5,0, gewaschen, der das CD11a-Protein vom Antikörper ablöst.
  • Anti-CD11a-Antikörper können auch in diagnostischen Tests für ein CD11a-Protein verwendet werden, z. B. zum Nachweisen seiner Expression in speziellen Zellen, Geweben oder Serum.
  • Für diagnostische Anwendungen ist der Antikörper typischerweise mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert. Es sind zahlreiche Marker verfügbar, die allgemein in die folgenden Kategorien unterteilt werden können:
    • (a) Radioisotope, wie z. B. 35S, 14C, 125I, 3H und 131I. Der Antikörper kann unter Verwendung der beispielsweise in Current Protocols in Immunology, Bd. 1 und 2, Coligen et al. (Hrsg.), Wiley-Interscience, New York, New York Pubs. (1991), beschriebenen Techniken mit dem Radioisotop markiert werden, und die Radioaktivität kann mittels Szintillationszählung gemessen werden.
    • (b) Fluoreszenzmarker wie z. B. Chelate seltener Erden (Europium-Chelate) oder Fluorescein und seine Derivate, Rhodamin und seine Derivate, Dansyl, Lissamin, Phycoerythrin und Texasrot sind verfügbar. Die Fluoreszenzmarker können beispielsweise unter Verwendung der in Current Protocols in Immunology, s. o., offenbarten Techniken an den Antikörper konjugiert werden.
    • (c) Verschiedene Enzym-Substrat-Marker sind verfügbar, und US-Patent Nr. 4.275.149 stellt einen Überblick einiger davon bereit. Das Enzym katalysiert im Allgemeinen eine chemische Veränderung des chromogenen Substrats, die unter Ver- wendung verschiedener Techniken gemessen werden kann. Beispielsweise kann das Enzym eine Farbveränderung in einem Substrat katalysieren, die spektrophotometrisch gemessen werden kann. Alternativ dazu kann das Enzym die Fluoreszenz oder Chemilumineszenz des Substrats ändern. Techniken zur Quantifizierung einer Änderung der Fluoreszenz sind oben beschrieben. Das chemilumineszierende Substrat wird durch eine chemische Reaktion elektronisch angeregt und kann dann Licht emittieren, das gemessen werden kann (beispielsweise unter Verwendung eines Chemiluminometers), oder überträgt Energie auf einen fluoreszierenden Akzeptor. Beispiele enzymatischer Marker umfassen Luciferase (z. B. Leuchtkäfer-Luciferase und bakterielle Luciferase; US-Patent Nr. 4.737.456), Luciferin, 2,3-Dihydrophthalazindione, Malatdehydrogenase, Urease, Peroxidase, wie z. B. Meerrettich-Peroxidase (HRPO), Alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Glucoamylase, Lysozym, Saccharidoxidasen (z. B. Glucoseoxidase, Galactoseoxidase und Glucose-6-phosphatdehydrogenase), heterozyklische Oxidasen (wie z. B. Uricase und Xanthinoxidase), Lactoperoxidase, Microperoxidase und dergleichen. Techniken zum Konjugieren von Enzymen an Antikörper sind in O'Sullivan et al., Methods für the Preparation of Enzym-Antibody-Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in: Methods in Enzym., J. Langone und H. Van Vunakis (Hrsg.), Academic Press, New York, Bd. 73, 147–166 (1981), beschrieben.
  • Beispiele von Enzym-Substrat-Kombinationen umfassen beispielsweise:
    • (i) Meerrettich-Peroxidase (HRPO) mit Wasserstoffperoxidase als Substrat, worin die Wasserstoffperoxidase einen Farbstoffvorläufer oxidiert (z. B. Orthophenylendiamin (OPD) oder 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-Hydrochlorid (TMB));
    • (ii) Alkalische Phosphatase (AP) mit para-Nitrophenylphosphat als chromogenes Substrat; und
    • (iii) β-D-Galactosidase (β-D-Gal) mit einem chromogenen Substrat (z. B. p-Nitrophenyl-β-D-galactosidase) oder dem fluorogenen Substrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-Galactosidase.
  • Zahlreiche andere Enzym-Substrat-Kombinationen sind dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung verfügbar. Für einen allgemeinen Überblick dazu siehe US-Patente Nr. 4.275.149 und 4.318.980.
  • Manchmal wird der Marker indirekt mit dem Antikörper konjugiert. Der Fachkundige kennt üblicherweise die verschiedenen Techniken, um dies zustande zu bringen. Beispielsweise kann der Antikörper mit Biotin konjugiert werden, und beliebige der drei umfassenden Kategorien der oben erwähnten Marker können mit Avidin konjugiert werden oder umgekehrt. Biotin bindet selektiv an Avidin, und folglich kann der Marker mit dem Antikörper auf diese indirekte Weise konjugiert werden. Alternativ dazu kann zur Erzielung der indirekten Konjugation des Markers mit dem Antikörper der Antikörper mit einem kleinen Hapten (z. B. Digoxin) konjugiert werden, und einer der verschiedenen oben erwähnten Markertypen wird mit einem Anti-Hapten-Antikörper (z. B. Anti-Digoxin-Antikörper) konjugiert. Folglich kann die indirekte Konjugation des Markers mit dem Antikörper erzielt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung muss der Anti-CD11a-Antikörper nicht markiert sein, und die Gegenwart desselben kann unter Verwendung eines markierten Antikörpers nachgewiesen werden, der an den CD11a-Antikörper bindet.
  • Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in jeglichem bekannten Testverfahren eingesetzt werden, wie z. B. in kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunpräzipitationstests. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press Inc., S. 147–158 (1987).
  • Kompetitive Bindungstests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Testprobenanalyten mit einer begrenzten Antikörpermenge um die Bindung zu konkurrieren. Die Menge an CD11a-Protein in der Testprobe ist umgekehrt proportional der Menge an Standard, welche an die Antikörper gebunden wird. Um das Bestimmen der gebundenen Menge an Standard zu erleichtern, werden die Antikörper im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenzreaktion insolubilisiert, so dass an die Antikörper gebundener Standard sowie Analyt leicht vom ungebunden verbliebenen Standard sowie Analyten getrennt werden können.
  • Sandwichtests umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, wobei jeder davon fähig ist, an einen anderen immunogenen Abschnitt oder an ein anderes Epitop des nachzuweisenden Proteins zu binden. In einem Sandwichtest wird der Testprobenanalyt von einem ersten Antikörper gebunden, der an einen festen Träger immobilisiert ist, und danach bindet ein zweiter Antikörper an den Analyten, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper selbst kann mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein (direkter Sandwichtest) oder kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwichtest). Beispielsweise ist ein ELISA-Test eine Art von Sandwichtest, bei dem die nachweisbare Gruppierung ein Enzym ist.
  • Für die Immunhistochemie kann die Tumorprobe frisch oder gefroren sein oder kann beispielsweise in Paraffin eingebettet und mit einem Konservierungsmittel, wie z. B. Formalin, fixiert sein.
  • Die Antikörper können weiters für diagnostische In-vivo-Tests verwendet werden. Im Allgemeinen ist der Antikörper mit einem Radionuklid markiert (wie z. B. 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P oder 35S), so dass der Tumor mittels Immunszintigraphie lokalisiert werden kann.
  • E. Diagnosesets
  • Der Zweckdienlichkeit halber kann der Antikörper der vorliegenden Erfindung in einem Set, d. h. in einer verpackten Kombination von Reagenzien in vorgegebenen Mengen mit Anleitungen zum Durchführen des diagnostischen Tests, bereitgestellt werden. Wo der Antikörper mit einem Enzym markiert ist, wird das Set vom Enzym benötigte Substrate und Cofaktoren enthalten (z. B. einen Substratvorläufer, der ein nachweisbares Chromophor oder Fluorophor bereitstellt). Außerdem können andere Zusätze, wie z. B. Stabilisatoren, Puffer (z. B. ein Blockpuffer oder Lysepufter) und dergleichen, enthalten sein. Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien können weithin variiert werden, um Konzentrationen der Reagenzien in Lösung bereitzustellen, die im Wesentlichen die Empfindlichkeit des Tests optimieren. Insbesondere können die Reagenzien als üblicherweise lyophilisierte trockene Pulver bereitgestellt werden, die auch Exzipienten umfassen, die bei Auflösung eine Reagenslösung mit der geeigneten Konzentration bereitstellen.
  • F. Therapeutische Verwendungen für den Antikörper
  • Es ist vorgesehen, dass der Anti-CD11a-Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um die verschiedenen, hierin beschriebenen LFA-1-vermittelten Störungen zu behandeln.
  • Der Anti-CD11a-Antikörper wird über irgendeinen geeigneten Weg verabreicht, einschließlich durch parenterale, subkutane, intraperitoneale, intrapulmonale und intranasale Verabreichung, sowie, falls für lokale immunsuppressive Behandlung erwünscht, durch intraläsionale Verabreichung (einschließlich Perfusion oder anderweitige Kontaktierung des Transplantats mit dem Antikörper vor der Transplantation). Parenterale Infusionen umfassen intramuskuläre, intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale oder subkutane Verabreichung. Außerdem wird der Anti-CD11a-Antikörper geeigneterweise mittels Pulsinfusion verabreicht, insbesondere mit abnehmenden Dosierungen des Antikörpers. Vorzugsweise wird die Dosierung durch Injektionen verabreicht, insbesondere bevorzugt durch intravenöse oder subkutane Injektionen, was teilweise davon abhängt, ob die Verabreichung kurzzeitig oder andauernd erfolgt.
  • Zur Prävention oder Behandlung einer Erkrankung wird die geeignete Dosierung des Antikörpers von folgenden Faktoren abhängen: der oben definierten Art der zu behandelnden Krankheit, der Schwere und vom Verlauf der Krankheit, ob der Antikörper für präventive oder therapeutische Zwecke verabreicht wird, von der vorangehenden Therapie, der Krankengeschichte des Patienten und der Reaktion auf den Antikörper und dem Ermessen des behandelnden Arztes. Der Antikörper wird dem Patienten geeigneterweise auf ein Mal oder über eine Reihe von Behandlungen verabreicht.
  • In Abhängigkeit von der Art und Schwere der Erkrankung sind ungefähr 1 μg/kg bis 15 mg/kg (z. B. 0,1–20 mg/kg) eine Kandidat-Anfangsdosis für die Verabreichung an den Patienten, ob sie beispielsweise durch eine oder mehrere gesonderte Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion verabreicht wird. Eine übliche Tagesdosis könnte in Abhängigkeit von den oben erwähnten Faktoren im Bereich von ungefähr 1 μg/kg bis 100 mg/kg oder mehr liegen. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder länger wird die Behandlung in Abhängigkeit vom Zustand aufrechterhalten, bis die gewünschte Unterdrückung der Krankheitssymptome auftritt. Jedoch können andere Dosisregime zweckdienlich sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann durch herkömmliche Techniken und Tests leicht verfolgt werden. Ein beispielhaftes Dosierungsregime ist in WO 94/04188 offenbart.
  • Die Antikörperformulierung wird auf eine Weise formuliert, dosiert und verabreicht, die mit guter medizinischer Praxis vereinbar ist. In diesem Zusammenhang zu berücksichtigende Faktoren umfassen die speziell behandelte Krankheit, das speziell behandelte Säugetier, den klinischen Zustand des einzelnen Patienten, die Ursache der Störung, die Verabreichungsstelle des Mittels, das Verabreichungsverfahren, das Verabreichungsschema und andere Faktoren, die den praktischen Ärzten bekannt sind. Die „therapeutisch wirksame Menge" des zu verabreichenden Antikörpers wird von derartigen Betrachtungen bestimmt und stellt die minimal notwendige Menge dar, um die LFA-1-vermittelte Störung zu verhindern, zu lindern oder zu behandeln, einschließlich beim Behandeln von Rheumatoidarthritis, Vermindern entzündlicher Reaktionen, Auslösen der Toleranz von Immunstimulantien, Verhindern einer Immunantwort, welche in der Abstoßung des Transplantats durch einen Wirt oder umgekehrt resultieren würde, oder Verlängern der Überlebenszeit eines transplantierten Transplantats. Eine solche Menge liegt vorzugsweise unter derjenigen Menge, die für den Wirt toxisch ist oder den Wirt für Infektionen signifikant anfälliger macht.
  • Der Antikörper muss nicht, kann aber gegebenenfalls mit einem oder mehreren Mitteln formuliert werden, die gegenwärtig zur Prävention oder Behandlung der fraglichen Störung verwendet werden. Beispielsweise kann der Antikörper bei Rheumatoidarthritis zusammen mit einem Glucocorticosteroid verabreicht werden. Außerdem ist die T-Zellen-Rezeptorpeptid-Therapie eine geeignete Begleittherapie zur Prävention klinischer Anzeichen einer Autoimmunenzephalomyelitis. Für Transplantate kann der Antikörper gleichzeitig mit oder getrennt von einem hierin definierten immunsuppressiven Mittel, z. B. Cyclosporin A, verabreicht werden, um die immunsupprimierende Wirkung zu modulieren. Alternativ dazu oder zusätzlich können VLA-4-Antagonisten oder andere LFA-1-Antagonisten dem Säugetier, das an einer LFA-1-vermittelten Störung leidet, verabreicht werden. Die wirksame Menge solcher anderer Mittel hängt von der in der Formulierung vorhandenen Menge an Anti-CD11a-Antikörper, der Art der Störung oder Behandlung und weiteren oben erörterten Faktoren ab. Diese Mittel werden im Allgemeinen in denselben Dosierungen und mit den Verabreichungswegen verwendet, die oben erwähnt sind, oder etwa mit 1 bis 99% der vordem eingesetzten Dosierungen.
  • G. Fertigartikel
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Fertigartikel bereitgestellt, der die zur Behandlung der oben beschriebenen Störungen zweckdienlichen Mate rialien enthält. Der Fertigartikel umfasst einen Behälter und ein Etikett. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Fläschchen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behälter können aus einer Vielzahl von Materialien, wie z. B. Glas oder Kunststoff, bestehen. Der Behälter beinhaltet eine Zusammensetzung, die zur Behandlung des Leidens wirksam ist und kann eine sterile Füllöffnung aufweisen (beispielsweise kann der Behälter ein Beutel für eine intravenöse Lösung sein oder ein Fläschchen mit einem von einer Subkutaninjektionsnadel durchstechbaren Stopfen). Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist der Anti-CD11a-Antikörper. Das Etikett, das sich am Behälter befindet oder ihm zugeordnet ist, weist darauf hin, dass die Zusammensetzung zur Behandlung des Leidens der Wahl verwendet wird. Der Fertigartikel kann weiters einen zweiten Behälter umfassen, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer wie z. B. phosphatgepufferte Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextroselösung umfasst. Er kann weiters andere vom Standpunkt des Handels und Anwenders erwünschte Materialien umfassen, einschließlich Puffer, Verdünner, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Anleitungen zur Verwendung.
  • Beispiel
  • Herstellung humanisierter Anti-CD11a-Antikörper
  • Dieses Beispiel beschreibt die Humanisierung und biologische In-vitro-Wirksamkeit eines monoklonalen Maus-Anti-Human-CD11a-Antikörpers, MHM24 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13, 202–208 (1983)). Frühere Untersuchungen über den Maus-MHM24 haben gezeigt, dass er wie andere Anti-CD11a-Antikörper die T-Zellen-Funktion hemmen kann (Hildreth et al., J. Immunol. 134, 3272–3280 (1985); Dougherty et al., Eur. J. Immunol. 17, 943–947 (1987)). Maus- sowie humanisierte MAbs verhindern wirksam die Adhäsion menschlicher T-Zellen an menschliche Keratinozyten und die Vermehrung von T-Zellen als Reaktion auf nicht-autologe Leukozyten in der gemischten Lymphozytenreaktion (MLR), einem Modell für die Reaktivität auf MHC-Klasse-II-Antigene (McCabe et al., Cellular Immunol. 150, 364–375 (1993)). Jedoch kreuzreagierten sowohl Maus- (Reimann et al., Cytometry 17, 102–108 (1994)) als auch humanisierte MAbs nicht mit nichtmenschlichem Primaten-CD11a, das nicht Schimpansen-CD11a ist. Um einen humanisierten MAb für vorklinische Studien in Rhesus zur Verfügung zu haben, wurde der humanisierte MAb neu konstruiert, um an Rhesus-CD11a zu binden, indem vier Reste in einer der Complementary-determining-regions, CDR-H2, in der schweren variablen Domäne verändert wurden. Die Klonierung und molekulare Modellierung der Rhesus-CD11a-I-Domäne legte nahe, dass eine Änderung eines Lysinrests in der menschlichen CD11a-I-Domäne auf Glutaminsäure in der Rhesus-CD11a-I-Domäne der Grund dafür war, dass Maus- und humanisierte MAbs Rhesus-CD11a nicht binden.
  • Materialien und Verfahren
  • (a) Konstruktion humanisierter F(ab')s
  • Der Maus-Anti-Human-CD11a-MAb MHM24 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13, 202–208 (1983); Hildreth et al., J. Immunol. 134, 3272–3280 (1985)) wurde kloniert und sequenziert. Um ein Plasmid zu erlangen, das für die Mutagenese sowie Expression von F(ab)s in E. coli brauchbar ist, wurde das Phagemid pEMX1 konstruiert. Auf Basis des Phagemids pb0720 enthält ein Derivat von pB0475 (Cunningham et al., Science 234, 1330–1336 (1989)), pEMX1, ein DNA-Fragment, das für eine humanisierte Leichtkette der κ-Untergruppe I und eine humanisierte Schwerkette der Untergruppe III (VH-CH1) kodiert, und einen Alkalische-Phosphatase-Promotor und eine Shine-Dalgarno-Sequenz, wobei sich beide von einem anderen vorher beschriebenen pUC119-basierten Plasmid, pAK2, herleiten (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992)). Eine einzigartige Spel-Restriktionsstelle wurde ebenfalls zwischen die für die F(ab)-Leicht- und -Schwerkette kodierende DNA eingeführt.
  • Um die erste F(ab)-Variante des humanisierten MHM24 zu konstruieren, wurde ortsgerichtete Mutagenese (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488 (1985)) an einem Desoxyuridin-Templat von pEMX1 durchgeführt; alle sechs CDRs wurden zur MHM24-Sequenz abgeändert. Alle anderen F(ab)-Varianten wurden aus einem Templat von F(ab)-1 konstruiert. Plasmide wurden in E.-coli-Stamm XL-1 Blue (Stratagene, San Diego, CA) zur Herstellung doppel- und einzelsträngiger DNA transformiert. Für jede Variante wurden die Leicht- sowie Schwerketten unter Verwendung des Didesoxynucleotidverfahrens (Sequenase, U. S. Biochemical Corp.) vollständig sequenziert. Die Plasmide wurden in den E.-coli-Stamm 16C9, einem Abkömmling von MM294, transformiert, auf 5 μg/ml Carbenicillin enthaltenden LB-Platten ausplattiert, und es wurde eine Einzelkolonie zur Proteinexpression selektiert. Die Einzelkolonie wurde in 5 ml LB-100 μg/ml Carbenicillin 5–8 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Die 5-ml-Kultur wurde zu 500 ml AP5-100 μg/ml Carbenicillin zugegeben und 16 Stunden lang in einem 4-l-Schüttelkolben mit Strombrechern bei 37°C gezüchtet. APS-Medium besteht aus: 1,5 g Glucose, 11,0 Hycase SF, 0,6 g Hefeextrakt (zertifiziert), 0,19 g MgSO4 (wasserfrei), 1,07 g NH4Cl, 3,73 g KCl, 1,2 g NaCl, 120 ml 1 M Triethanolamin, pH 7,4, auf 1 l Wasser, über 0,1-μm-Sealkeen-Filter sterilfiltriert.
  • Die Zellen wurden durch Zentrifugation in einem 1-I-Zentrifugenbecher (Nalgene) bei 3.000 × g geerntet und der Überstand entfernt. Nach Einfrieren für 1 Stunde wurde das Pellet in 25 ml kaltem 10 mM MES-10 mM EDTA, pH 5,0, (Puffer A) resuspendiert. 250 μl 0,1 M PMSF (Sigma) wurden zugegeben, um Proteolyse zu hemmen, und es wurden 2,5 ml einer 10-mg/ml-Stammlösung von Hühnereiweiß-Lysozym (Sigma) zugegeben, um die Lyse der Bakterienzellwand zu fördern. Nach sanftem Schütteln auf Eis für 1 Stunde wurde die Probe bei 40.000 × g 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Puffer A auf 50 ml gebracht und auf eine mit Puffer A äquilibrierte 2-ml-DEAE-Säule aufgegeben. Das Eluat wurde dann auf eine mit Puffer A äquilibrierte Protein-G-Sepharose-CL-4B- (Pharmacia) Säule (0,5 ml Bettvolumen) aufgegeben. Die Säule wurde mit 10 ml Puffer A gewaschen und mit 3 ml 0,3 M Glycin, pH 3,0 in 1,25 ml 1 M Tris, pH 8,0, eluiert. Der Puffer des F(ab)-Eluats wurde dann unter Verwendung eines Centricon-30 (Amicon) gegen PBS ausgetauscht und auf ein Endvolumen von 0,5 ml konzentriert. SDS-PAGE-Gele aller F(ab)s wurden hergestellt, um die Reinheit zu ermitteln, und das Molekulargewicht jeder Variante wurde mittels Elektrospray-Massenspektrometrie verifiziert.
  • (b) Konstruktion von chimärem und humanisiertem IgG
  • Zur Erzeugung menschlicher IgG1-Varianten von chimärem (chIgG1) und humanisiertem (HuIgI1) MHM24 wurden die geeigneten Maus- und humanisierten variablen leichten und variablen schweren (F(ab)-8, Tabelle II) Domänen in getrennte, vorher beschriebene pRK-Vektoren (Gorman et al., DNA Protein Eng. Tech. 2, 3 (1990)) subkloniert. Alanin-Scanning-Varianten wurden mittels ortsgerichteter Mutagenese (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488 (1985)) der HuIgG1-Leicht- und Schwerkettenplasmide konstruiert. Die DNA-Sequenz jeder Variante wurde mittels Didesoxynucleotidsequenzierung verifiziert.
  • Schwer- und Leichtkettenplasmide wurden in eine Adenovirus-transformierte menschliche Urnierenzelllinie, 293 (Graham et al., J. gen. Virol. 36, 59 (1977)), unter Verwendung eines hocheffizienten Verfahrens (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977); Gorman et al., Science 221, 551 (1983)) cotransfiziert. Das Medium wurde gegen serumfreies Medium ausgetauscht und täglich für bis zu 5 Tage geerntet. Antikörper wurden aus den vereinigten Überständen unter Verwendung von Protein-A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) gereinigt. Der Puffer im Antikörper-Eluat wurde unter Verwendung eines Centricon-30 (Amicon) gegen PBS ausgetauscht, auf 0,5 ml konzentriert, unter Verwendung eines Millex-GV (Millipore) sterilfiltriert und bei 4°C gelagert.
  • Die Konzentration des Antikörpers wurde mittels Gesamt-Ig-Bindungs-ELISA bestimmt. Die Konzentration der Referenz, Anti-p185HERIgG1 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992)), wurde mittels Analyse der Aminosäurezusammensetzung bestimmt. Jeder Napf einer 96-Napf-Platte wurde mit 1 μg/ml Ziege-Anti-Human-IgG-F(ab')2 (Cappel Laboratories, Westchester, PA) 24 Stunden lang bei 4°C beschichtet. Gereinigte Antikörper wurden verdünnt und in doppelter Ausführung den beschichteten Platten zugegeben. Nach Inkubation für 1,5 Stunden wurden die Platten gewaschen, und es wurden 0,1 ml 0,2 mg/ml o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid- 0,01% Wasserstoffperoxid-PBS zugegeben. Nach 10 Minuten wurde die Reaktion mit 2 M Schwefelsäure gestoppt und die optische Dichte bei 490 nm gemessen.
  • (c) Klonierung der Rhesus-CD11a-I-Domäne
  • Die DNA-Sequenz der Rhesus-I-Domäne wurde mittels RT-PCR und mit von der menschlichen CD11a-DNA-Sequenz hergeleiteten Primern erhalten. Zusammenfassend wurde mRNA aus ∼107 Rhesus-Leukozyten unter Verwendung des Fast-Track-mRNA-Reinigungssets (Invitrogen) isoliert. 10 μg mRNA wurden unter Verwendung der reversen Transkriptase MuLV revers transkribiert. Die Erststrang-cDNA wurde dann durch 40 PCR-Zyklen unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
    5'-CACTTTGGATACCGCGTCCTGCAGGT-3' (vorwärts) (Seq.-ID Nr. 21) und
    5'-CATCCTGCAGGTCTGCCTTCAGGTCA-3' (rückwärts) (Seq.-ID Nr. 22).
  • Eine einzelne Bande der vorhergesagten Größe wurde aus der PCR-Reaktion mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt. Das PCR-Produkt wurde mit dem Restriktionsenzym Sse8387I (Takara) verdaut und an ein mit demselben Restriktionsenzym verdautes menschliches, CD11a-enthaltendes Plasmid ligiert. Es befinden sich zwei Sse8387I-Stellen in der menschlichen CD11a-Sequenz, eine an jeder Seite der I-Domäne. Das resultierende Plasmid kodierte für eine Chimäre, die aus menschlichem CD11a besteht, in der die menschliche I-Domäne durch eine Rhesus-I-Domäne substituiert ist. Die DNA-Sequenzanalyse offenbarte fünf Aminosäureunterschiede zwischen Mensch und Rhesus. Ein Unterschied befand sich in der Region N-terminal zur I-Domäne (Thr59Ser), und die anderen vier Unterschiede befanden sich in der I-Domäne selbst: Val133Ile, Arg189Gln, Lys197Glu und Val308Ala (2).
  • (d) FACScan-Analyse von F(ab)- und IgG-Bindung an Jurkat-Zellen
  • Aliquoten von 106 Jurkat-T-Zellen wurden mit Reihenverdünnungen von menschlichen Antikörpern und Kontrollantikörpern in PBS-0,1% BSA-10 mM Natriumazid 45 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und dann in Fluorescein-konjugiertem Ziege-Anti-Human-F(ab')2 (Organon Teknika, Westchester, PA) 45 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und an einem FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) analysiert. 8 × 103 Zellen wurden mittels List-Modus erfasst und mittels Vorwärts-Lichtstreuung gegen Seiten-Lichtstreuung durchgelassen, wodurch abgestorbene Zellen und Trümmer ausgeschlossen wurden.
  • (e) Sättigungsbindung zur Bestimmung der scheinbaren Kds
  • Radioaktiv markierte Antikörper wurden unter Verwendung von Iodo-Gen (Pierce, Rockford, IL) nach den Anleitungen des Herstellers hergestellt. 50 μg Antikörper und 1 mCi 125I (DuPont, Wilmington, DE) wurde jedem Röhrchen zugegeben und 15 Minuten lang bei 25°C inkubiert. Die radioaktiv markierten Proteine wurden unter Verwendung von PD-10-Säulen (Pharmacia), die mit 0,2% Gelatine enthaltender, balancierter Hank-Salzlösung (HBSS, Life Technologies, Grand Island, NY) äquilibriert waren, vom verbleibenden freien 125I befreit.
  • Einkernige Zellen wurden aus heparinisiertem menschlichem Peripherblut, das zwei Spendern abgenommen worden war, unter Verwendung von Lymphocyte Separation Medium (LSM, Organon Teknika, Durham, NC) nach den Anleitungen des Herstellers gereinigt. Das Blut wurde bei 400 × g 40 Minuten lang bei 25°C ohne Bremsen zentrifugiert. Die Zellen an der Grenzfläche von LSM und Plasma wurden gesammelt und dann in HBSS-0,2% Gelatine resuspendiert.
  • Leukozyten wurden aus heparinisiertem Rhesusaffen-Peripherblut aus zwei Individuen mittels Dextransedimentation gereinigt. Das Blut wurde mit einem gleichen Volumen 3% Dextran T500 (Pharmacia) in PBS verdünnt und bei 25°C 30 Minuten lang ungestört sedimentieren gelassen. Nach der Sedimentation wurden die in Suspension verbliebenen Zellen geerntet und mittels 5-minütiger Zentrifugation bei 400 × g pelletiert. Verbleibende Erythrozyten wurden durch zwei Zyklen hypotonischer Lyse unter Verwendung von destilliertem Wasser und 2 × HBSS entfernt. Nach der Enthrozytenlyse wurden die Zellen in PBS gewaschen und dann in HBSS-0,2% Gelatine resuspendiert.
  • Antikörperaffinitäten wurden durch Sättigungsbindung unter Verwendung von entweder einkernigen Peripherblutzellen (Maus-MHM24 und HuIgG1) oder Rhesus-Leukozyten (MHM23, RhIgG1) gemessen. In jedem Test wurde ein radioaktiv markierter Antikörper in vierfacher Ausführung in HBSS-0,2% Gelatine reihenverdünnt. Unspezifische Bindung wurde durch Zugabe von homologem unmarkiertem Antikörper in einer Endkonzentration von 500 nM in doppelter Ausführung für die gesamte Reihenverdünnung bestimmt. Menschliche Lymphozyten oder Rhesus-Leukozyten wurden den Platten in einem Volumen von 170 μl pro Napf zugegeben. Die Platten wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Platten-Kreisschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen unter Verwendung eines SKATRONTM-Zellerntegeräts (Lier, Norwegen) geerntet und 10-mal mit 0,25% Gelatine und 0,1% Natriumazid enthaltendem PBS gewaschen. Die Proben wurden dann 1 Minute lang an einem LKB-Wallac-GammaMaster-Gammazähler (Gaithersburg, MD) gezählt. Die Daten wurden von Counts pro Minute auf Nanomolarität umgerechnet, und anschließend wurde eine Vierparameter-Kurvenanpassung von Sättigungskurven (gebunden gegenüber gesamt) durchgeführt, um Kd- (scheinbar) Werte zu bestimmen.
  • (f) Keratinozyten-Monoschicht-Adhäsionstest
  • Normale menschliche Epidermis-Keratinozyten (Clonetics, San Diego, CA) wurden aus Kulturkolben mit Trypsin-EDTA entfernt, zentrifugiert und in Lymphozyten-Testmedium (RMPI 1640 (GIBCO)-10% Fötales Kälberserum-1% Penicillin/Streptomycin) in einer Konzentration von 5 × 105 lebenden Zellen/ml resuspendiert. Aliquoten von 0,1 ml/Napf wurden dann über Nacht in 96-Napf-Platten mit flachem Boden kultiviert; geeignete Näpfe wurden durch Zugabe von Interferon-Gamma (Genentech, South San Francisco, CA) zu 100 Einheiten/ml stimuliert.
  • Jurkat-Klon-E6-1-Zellen (ATCC, Rockville, MD) oder gereinigte Rhesus-Lymphozyten (siehe MLR-Verfahren) wurden mit 20 μg/ml Calcein AM (Molecular Probes, Eugene, OR) bei 37°C 45 Minuten lang markiert. Nach dreimaligem Waschen mit Lymphozyten-Testmedium wurden Jurkat- oder Rhesus-Lymphozytenzellen auf 1 × 106 Zellen/ml resuspendiert und mit reihenverdünntem Antikörper bei 4°C 30 Minuten lang inkubiert. Nach der Entfernung des Mediums aus der Keratinozyten-Monoschicht wurden 0,1 ml/Napf an markierten Zellen zugegeben und bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert. Die Näpfe wurden fünf Mal mit 0,2 ml/Napf/Waschvorgang Lymphozytenmedium mit 37°C gewaschen, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Die Fluoreszenz wurde mit einem Cytofluor 2300 (Millipore, Bedford, MA) gemessen.
  • Ein chimäres Rhesus-Human-CD11a (Rh/HuCD11a), das menschliches CD11a mit einer Rhesus-I-Domäne umfasste, wurde mittels ortsgerichteter Mutagenese (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488 (1985)) an einem Desoxyuridin enthaltenden, für menschliches CD11a kodierenden Templat-Plasmid konstruiert. Vier Reste wurden geändert: Val133Ile, Arg189Gln, Lys197Glu und Val308Ala (2). Für Rh/HuCD11a und menschliches CD11b ( EP 364.690 ) kodierende Plasmide wurden in eine Adenovirus-transformierte menschliche Urnieren-Zelllinie, 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)), unter Verwendung eines hocheffizienten Verfahrens (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977); Gorman, Science 221, 551 (1983)) cotransfiziert. Rh/HuCD11a-transfizierte 293-Zellen wurden mit 20 μg/ml Calcein AM bei 37°C 45 Minuten lang markiert. Nach dreimaligem Waschen mit Lymphozyten-Testmedium wurden Rh/HuCD11a-transfizierte 293-Zellen auf 1 × 106 Zellen/ml resuspendiert und mit reihenverdünntem Antikörper bei 4°C 30 Minuten lang inkubiert. Nach Entfernung des Mediums aus der Keratinozyten-Monoschicht wurden 0,1 ml/Napf markierte 293-Zellen zugegeben und bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert. Die Näpfe wurden fünf Mal mit 0,2 ml/Napf/Waschvorgang Lymphozytenmedium mit 37°C gewaschen, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Die Fluoreszenz wurde mit einem Cytofluor 2300 gemessen.
  • (g) ICAM-Adhäsionstest
  • Maxisorp- (Nunc) 96-Napf-Testplatten wurden mit 0,1 ml/Napf von 1 μg/ml Ziege-Anti-Human-IgG-Fc (Caltag) 1 Stunde lang bei 37°C beschichtet. Nach 3-maligem Waschen der Platten mit PBS wurden die Platten mit 0,1% BSA-PBS 1 Stunde lang bei 25°C geblockt. Die Platten wurden dann drei Mal mit PBS gewaschen, und es wurden 0,1 ml/Napf von 50 ng/ml rekombinantem Human-ICAM-IgG zugegeben und über Nacht inkubiert.
  • Das ICAM-IgG bestand aus fünf extrazellulären Domänen von an Human-IgG-Fc fusioniertem Human-ICAM. Ein Plasmid für die Expression eines pRK.5dICAMGaIg genannten Human-ICAM-1- (Simmons et al., Cell 331, 624–627 (1988), und Staunton et al., Cell 52, 925–933 (1988)) Immunadhäsins wurde konstruiert. Es enthält die fünf IgG-ähnlichen Domänen von ICAM-1, eine von einer H64A-Variante von Subtilisin BPN' erkannte Spaltstelle von sechs Aminosäuren, Genenase I (Carter et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 6, 240–248 (1989)) und die Fc-Region aus menschlichem IgG1 (Ellison et al., Nucleic Acids Research 10, 4071–4079 (1982)) im pRK5-Vektor (Eaton et al., Biochemistry 25, 8343–8347 (1986)). Menschliche Urnieren-293-Zellen (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)) wurden stabil mit pRK.5dICAMGaIg und dem RSV-neo-Plasmid (Gorman et al., Science 221, 551–553 (1983)) transfiziert, um eine das Fünfdomänen-ICAM-Ig (5dICAMIg) exprimierende Zelllinie zu erzeugen. Es wurde mittels Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA) ein Klon selektiert, der 20 μg/ml sekretiertes 5dICAMIg exprimierte, und zwar unter Verwendung von Antikörpern gegen Human-IgG-Fc (Caltag, Burlingame, CA) und ICAM-1 (BBIG-I1; R & D Systems, Minneapolis, MN). Zellkulturüberstände von dieser Zelllinie wurden auf eine Protein-A-Säule (ProsepA, Bioprocessing Ltd., Durham, England) geladen, die mit 0,01 M Hepes-Puffer (pH 7,0), 0,15 M NaCl (HBS) äquilibriert war, und die Säule wurde mit HBS, gefolgt von 0,01 M Hepes-Puffer (pH 7,0), 0,5 M NaCl, 0,5 M TMAC (Tetramethylammoniumchlorid) gewaschen, um unspezifisch gebundenes Material zu entfernen. Der TMAC-Puffer wurde mit HBS gründlich aus der Säule gewaschen und das 5dICAMIg mit 0,01 M Hepes-Puf fer (pH 7,0), 3,5 M MgCl2 und 10% (Gew./Vol.) Glycerin eluiert. Der Protein-A-Pool wurde gegen HBS eingehend dialysiert und konzentriert.
  • Gereinigte Rhesus-Lymphozyten (siehe MLR-Verfahren) wurden mit 20 μg/ml Calcein AM (Molecular Probes, Eugene, OR) bei 37°C 45 Minuten lang markiert. Nach dreimaligem Waschen mit Lymphozyten-Testmedium wurden die Rhesus-Lymphozytenzellen zu 1 × 106 Zellen/ml resuspendiert und mit reihenverdünntem Antikörper bei 4°C 30 Minuten lang inkubiert. Nach Entfernung des Mediums aus ICAM-IgG-beschichteten Platten wurden 0,1 ml/Napf markierte Zellen zugegeben und bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert. Die Näpfe wurden fünf Mal mit 0,2 ml/Napf/Waschvorgang Lymphozytenmedium mit 37°C gewaschen, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Die Fluoreszenz wurde mit einem Cytofluor 2300 (Millipore, Bedford, MA) gemessen.
  • (h) Einweg-gemischte Lymphozytenreaktion (MLR)
  • Für menschliche sowie Rhesus-MLR wurden Peripherblut-Lymphozyten aus zwei nicht verwandten Spendern aus heparinisiertem Vollblut unter Verwendung von Lymphocyte Separation Medium (Organon Teknika, Durham, NC) isoliert. Die Lymphozyten wurden auf eine Konzentration von 3 × 106 Zellen/ml in RPMI 1640 (GIBCO)-10% menschliches AB-Serum-1% Glutamin-1% Penicillin/Streptomycin-1% nichtessentielle Aminosäuren-1% Pyruvat-5 × 10–5 M 2-β-Mercaptoethanol-50 μg/ml Gentamycin-5 μg/ml Polymyxin B resuspendiert. Die Stimulatorzellen wurden durch Bestrahlung mit 3.000 rad in einem Cäsiumbestrahler unreaktiv gemacht. Antwortzellen in einer Konzentration von 1,5 × 105 Zellen pro Napf wurden gemeinsam mit einer gleichen Anzahl Stimulatorzellen in 96-Napf-Platten mit flachem Boden kultiviert. Zweifach-Reihenverdünnungen von jedem Antikörper wurden den Kulturen zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 200 μl/Napf zu liefern. Die Kulturen wurden bei 37°C in 5% CO2 5 Tage lang inkubiert und dann mit 1 μCi/Napf [3H]Thymidin 16 Stunden lang gepulst. Die [3H]Thymidin-Inkorporation wurde mit einem Beckman-Szintillationszähler gemessen. Die Tests wurden in dreifacher Ausführung durchge führt. Ein humanisierter Anti-Human-p185HER2-MAb (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992)) wurde als Isotypkontrolle für HuIgG1 und RhIgG1 verwendet. Ein Maus-Anti-Hamster-tPA-MAb (Genentech) wurde als Isotypkontrolle (Maus-IgG1) für den MAb MHM23 verwendet. MAb 25.3 wurde von Immunotech Inc. (Westbrook, ME) erworben.
  • (i) Computergrafikmodelle von Maus- und humanisiertem MHM24
  • Sequenzen der VL- und VH-Domänen (1A und 1B) wurden verwendet, um ein Computergrafikmodell der VL-VH-Domänen von Maus-MHM24 zu konstruieren. Dieses Modell wurde verwendet, um zu ermitteln, welche Gerüstreste in den humanisierten Antikörper inkorporiert werden sollten. Ein Modell von F(ab)-8 wurde ebenfalls konstruiert, um die korrekte Wahl von Maus-Gerüstregionen zu verifizieren. Die Konstruktion der Modelle wurde wie vorher beschrieben durchgeführt (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Eigenbrot et al., J. Mol. Biol. 229, 969 (1993)).
  • Ergebnisse
  • (a) Humanisierung
  • Die Consensussequenzen für die menschliche Schwerkette der Untergruppe III und der Leichtkettenuntergruppe κI wurden als das Gerüst für die Humanisierung verwendet (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Ausg., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) (1A und 1B). Dieses Gerüst ist bei der Humanisierung anderer Maus-Antikörper erfolgreich verwendet worden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623–2632 (1993); Eigenbrot et al., Proteins 18, 49–62 (1994)). Alle humanisierten Varianten wurden anfänglich als in E. coli exprimierte F(ab)s hergestellt und auf Bindung gescreent. Typische Ausbeuten aus 500-ml- Schüttelkolben betrugen 0,2–0,5 mg F(ab). Die Massenspektrometrie verifizierte die Masse von jedem F(ab) auf 5 Masseneinheiten genau.
  • CDR-H1 umfasste die Reste H28–H35, die alle exponierten Reste von Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Ausg., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), und Chothia et al., Nature 342, 877–883 (1989), umfassen. Die anderen hypervariablen Schleifen wurden gemäß Chothia et al. (1989) definiert. Leichtketten-Restenummern sind mit L vorbestimmt; Schwerketten-Restenummern sind mit H vorbestimmt.
  • Tabelle II Bindung humanisierter MHM24-Varianten an menschliches CD11a auf Jurkat-Zellen
    Figure 00750001
  • In der anfänglichen Variante F(ab)-1 wurden die CDR-Reste vom Maus-Antikörper auf das menschliche Gerüst übertragen. Außerdem wurde Rest H71 vom menschlichen Arg zum Maus-Val geändert, da von diesem Rest gezeigt worden ist, das er die Konformationen von CDR-H1 und CDR-H2 beeinflusst (Chothia et al., Nature 342, 877–883 (1989); Tramontano, J. Mol. Biol. 215, 175 (1990)). Dieses F(ab) zeigte keine nachweisbare Bindung. Im F(ab)-2 war die CDR-H2 erweitert und umfasste die sequenzbasierte Definition (d. h. Reste H60–H65 umfassend). Der EC50-Wert für die F(ab)-2-Bindung an menschliches CD11a betrug 771 +/– 320 ng/ml und war um das 148fache schwächer als der EC50-Wert des chimären IgG1 (5,2 +/– 3,0 ng/ml).
  • Bei vorhergehenden Humanisierungen ist gefunden worden, dass Reste in einer CDR-H1 und CDR-H2 benachbarten Gerüstschleife (FR-3) die Bindung beeinflussen können (Eigenbrot et al., Proteins 18, 49–62 (1994)). In F(ab)-5 wurden drei Reste in dieser Schleife auf ihr Maus-Gegenstück geändert, und diese Varianten zeigten eine 23fache Verbesserung der Bindung (Tabelle II). Die Abänderung von menschlichen Resten an Positionen L53 und L55 auf Maus (d. h. SerL53Thr und GluL55Gln) ver besserte die Bindung nochmals um das 4fache (F(ab)-6, Tabelle II); diese wandelte CDR-L2 wirksam von der strukturbasierten Definition (Reste L50–L52) in die sequenzbasierte Definition (Reste L50–L56) um. Die anschließende Abänderung von PheH27 auf Maus-Tyr in CDR-H1 resultierte in einer zusätzlichen 3fachen Verbesserung (F(ab)-7; Tabelle II). Schließlich wurden auf Basis der Modelle von Maus- und humanisiertem MHM24 zwei dieser drei Maus-Reste (H75 und H76) in FR-3 auf menschliche Reste zurückgesetzt, und es wurde gefunden, dass diese beiden Reste keine Wirkung auf die Bindung hatten (vgl. F(ab)-7 und F(ab)-8 in Tabelle II). Der durchschnittliche EC50-Wert für F(ab)-8 war etwas besser als derjenige des chimären IgG1 (Tabelle II). Nicht alle Änderungen von Mensch auf Maus resultierten in verbesserter Bindung. PheH67 wurde auf Maus-Ala geändert, da sich von dieser Position früher erwiesen hat, dass sie die Bindung beeinflusst (Presta et al., J. Immunol. 151, 2623–1632 (1993)), jedoch war keine Wirkung nachzuweisen (F(ab)-3, Tabelle II). Die Änderung von ValH71 zurück zum menschlichen Arg bewirkte eine 3fache Verminderung der Bindung (F(ab)-4, Tabelle II), was die Einbeziehung von ValH71 in F(ab)-1 unterstützt.
  • Die VL- und VH-Domänen aus F(ab)-8 wurden auf menschliche konstante IgG1-Domänen übertragen. Der intakte Antikörper voller Länge, HuIgG1, zeigte einen zu F(ab)-8 äquivalenten EC50-Wert und war im Vergleich zum chimären IgG1 voller Länge verbessert (Tabelle II). Wenn die Daten für alle Tests von HuIgG1 berücksichtigt werden, einschließlich seiner Verwendung als Standard für Alanin-Scan und MLR-Tests (siehe unten), betrug der EC50-Wert für HuIgG1 gegenüber menschlichem CD11a 0,042 +/– 0,072 nM (N = 15). Eine Sättigungsbindungsanalyse wurde ebenfalls durchgeführt, um die scheinbaren Dissoziationskonstanten, Kd (scheinbar), zu bestimmen: 0,15 +/– 0,02 nM für Maus-MHM24 und 0,15 +/– 0,04 nM für HuIgG1 (Tabelle III).
  • Tabelle III Scheinbare Kd mittels Sättigungsbindung an menschliche Lymphozyten und Rhesus-Leukozyten
    Figure 00780001
  • (b) Alanin-Scan von CDR-Resten
  • Um zu ermitteln, welche CDR-Reste an der Bindung an menschliches CD11a beteiligt waren, wurde ein Alanin-Scan (Cunningham et al., Science 244, 1081 (1989)) an den CDR-Resten von HuIgG1 durchgeführt. Jede Variante wurde auf Bindung an CD11a an Jurkat-Zellen getestet. In der Leichtkette trägt nur CDR-L3 zur Bindung bei. HisL91 hatte eine starke Wirkung (Tabelle IV) und ist wahrscheinlich an der Konformation beteiligt, da diese Kette teilweise verborgen sein sollte. Die Reste AsnL92 und TyrL94 zeigten bescheidenere Wirkungen und verminderten die Bindung um das 3fache bzw. 12fache. Man beachte jedoch, dass die gleichzeitige Abänderung dieser beiden Reste auf Alanin (sowie GluL93Ala) keine additive Wirkung auf die Bindung hatte (Variante L3, Tabelle IV).
  • Tabelle IV Alanin-Scan humanisierter MHM24-CDR-Reste
    Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • In der Schwerkette tragen CDR-H2 und CDR-H3 markant zur Bindung bei. Der CDR-H1-Rest TrpH33Ala hatte eine große Wirkung, jedoch ist diese wahrscheinlich auf eine Konformationsänderung zurückzuführen, da TrpH33 teilweise verborgen sein sollte. Der wichtigste einzelne Rest, der zur Bindung beiträgt, ist AspH54 in CDR-H2; die Abänderung dieses Rests auf Alanin bewirkte eine 147fache Verminderung der Bindung (Tabelle IV). Andere an der Bindung beteiligte Reste in CDR-H2 umfassen GluH56, GlnH61 und LysH64 (Tabelle IV). In CDR-H3 verminderte TyrH97Ala die Bindung um das 11fache und TyrH100cALA um das 8fache. Wie in CDR-L3 bewirkte die gleichzeitige Abänderung mehrerer CDR-H3-Reste auf Alanin eine nicht-additive, starke Verminderung der Bindung (vgl. Variante H3 gegenüber TyrH97Ala und TyrH99Ala, Tabelle IV). Außerdem zeigte der in der Humanisierung umfasste FR-3-Rest LysH73 ebenfalls eine 5fache Verminderung der Bindung, wenn er auf Alanin oder Arginin abgeändert wurde (Tabelle IV).
  • (c) Neukonstruktion von HuIgG1, um an Rhesus-CD11a zu binden
  • Maus-MHM24 sowie HuIgG1 zeigten eine ungefähr 100fache Verminderung der Bindung an Rhesus-CD11a; HuIgG1 wies einen EC50-Wert gegen CD11a von 45,6 +/– 40,4 nM (N = 16) im Vergleich zu einem EC50-Wert von 0,042 +/– 0,072 nM gegen menschliches CD11a auf. Da ein Primatenmodell bei der Evaluierung der Biologie, Toxizität und Wirksamkeit von MHM24 wichtig ist, wurde die Bindung von HuIgG1 an Rhesus-CD11a als vorteilhaft erachtet. Anfänglich wurden die MAb-Reste der hypervariablen Region ermittelt, die bei der Bindung an menschliches CD11a und Rhesus-CD11a von Bedeutung waren, so dass jene geändert werden konnten, die für Rhesus, nicht jedoch für menschliches CD11a von Bedeutung waren. Demgemäß wurden die Alanin-Scan-Varianten auch gegen Rhesus-CD11a an Peripherblut-Lympho zyten getestet. Der wichtigste Befund war, dass einer dieser Mehrfach-Alanin-Mutationsvarianten, Variante H2, um 18-mal besser an Rhesus-CD11a als an HuIgG1 band (Tabelle IV). Einzelne Mutationen an den drei in der Variante H2 umfassten Resten zeigten jedoch eine minimale Bindungsverbesserung: HisH52Ala, 0,7-mal besser, SerH53Ala, 0,7-mal besser, und SerH55Ala, 1,3-mal schlechter (Tabelle IV). Eine Reihe von Doppelmutationen an diesen drei Resten zeigte, dass die Kombination HisH52Ala-SerH53Ala am besten war und für eine 77fache Verbesserung der Bindung im Vergleich zu HuIgG1 sorgte (vgl. Varianten H2A1, H2A2 und H2A3, Tabelle IV). Außerdem bewirkten die AspH54Ala- und Glu56Ala-Varianten ebenfalls eine 3fache Verbesserung gegenüber HuIgG1 (Tabelle IV), obwohl AspH54 bezüglich menschlichem CD11a der wichtigste Bindungsrest in HuIgG1 ist.
  • Im Bestreben, eine einzelne Substitution an Position H54 zu finden, welche die Bindung an Rhesus-CD11a verbessert, jedoch die Bindung an menschliches CD11a nicht vermindert, wurde Position H54 durch eine Vielzahl von Aminosäuren substituiert. Alle Substitutionen verminderten die Bindung um mehr als eine Größenordnung, wogegen die Substitution AspH54Asn die Rhesus-Bindung um das 10fache verbesserte (Tabelle V).
  • Tabelle V Aminosäuresubstitutionen am AspH54
    Figure 00820001
  • Da nicht-additive Wirkungen für Änderungen an den Positionen H52–H53 beobachtet wurden, wurden diese mit einer Vielzahl von Änderungen an den Positionen H54 und H56 kombiniert (Tabelle IV). Für alle Varianten waren H52 und H53 Alanin. In einer Reihe war Position H54 Asn und Position H56 Glu (ursprünglicher Rest), Ala, Asn oder Gln. Keine dieser Varianten verbesserte die Rhesus-CD11a-Bindung gegenüber der H2A1-Variante (Tabelle IV). In einer anderen Reihe war Position H54 Ala und Position H56 Glu (ursprünglicher Rest), Ala, Ser oder Asn und wiederum waren alle schlechter als Variante H2A1. In der dritten Reihe war Position H54 Ser und Position H56 Glu (ursprünglicher Rest), Ala, Ser oder Asn. Zwei dieser Varianten zeigten verbesserte Bindung an Rhesus-CD11a im Vergleich zur H2A1-Variante (H2C11 und H2C12, Tabelle VI). Der Rhesus-CD11a-EC50-Wert für diese beiden Varianten betrug 0,11 +/– 0,11 nM (N = 9) für H2C11 und 0,19 +/– 0,08 nM (N = 7) für H2C12. Diese Werte sind 3- bis 5-mal schwächer als der EC50-Wert von HuIgG1 für menschliches CD11a (0,042 nM), sind jedoch 240- bis 415-mal besser gegenüber dem EC50-Wert von HuIgG1 für Rhesus-CD11a (45,6 nM). H2C12 wird hiernach als RhIgG1 bezeichnet. Scheinbare Kd-Werte aus Sättigungsbindungsexperimenten zeigten, dass RhIgG1 genauso gut an Rhesus-CD11a wie Maus-MHM24 an Rhesus-CD18 band (Tabelle III).
  • Tabelle VI Bindung von CDR-H2-Varianten an menschliches und Rhesus-CD11a
    Figure 00840001
  • Für die Wechselwirkung von HuIgG1 mit menschlichem CD11a war AspH54 der wichtigste Rest (Tabelle IV); eine Abänderung dieses Rests auf andere Aminosäuren verminderte signifikant die Bindung, wobei die geringste Verminderung für Abänderungen auf Glu, Asn und Gln auftrat. Jedoch war AspH54 für die Wechselwirkung zwischen HuIgG1 und Rhesus-CD11a nachteilig, da die Abänderung dieses Rests auf Ala oder Asn die Bindung verbesserte (Tabelle V). Um diesen Unterschied zwischen der Bindung an menschliches und Rhesus-CD11a zu verstehen, wurde letzteres aus einer Rhesus-PBL-Bibliothek kloniert. 2 zeigt, dass die Rhesus-CD11a-I-Domäne sich von der menschlichen CD11a-I-Domäne an nur vier Positionen unterscheidet: 133, 189, 197, 308. Vorher wurde das menschliche CD11a-Epitop von MHM24 auf der Karte bei den Resten 197–203 gezeigt (Champe et al., J. Biol. Chem. 270, 1388–1394 (1995)), welche die menschliche Lys197→Rhesus-Glu197-Änderung in Rhesus umfasst.
  • (d) Keratinozyten-Zelladhäsionstest
  • Maus-MHM24, chimäres IgG1 und HuIgG1 wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeiten verglichen, die Adhäsion von Jurkat-Zellen (LFA-1 exprimierende menschliche T-Zellen) an normale, ICAM-1 exprimierende Epidermis-Keratinozyten zu verhindern. Alle drei Antikörper leisteten ähnliches (3) mit ähnlichen EC50-Werten (Tabelle VII).
  • Tabelle VII Blockierung der Zelladhäsion durch MHM24-Varianten
    Figure 00850001
  • Weder Maus- noch humanisiertes MHM24 blockierte die Adhäsion von Rhesus- oder Cynomolgus-Lymphozyten an menschliche Keratinozyten. Wenn RhIgG1 mit dem Maus-Anti-Human-CD11a-Antikörper MHM24 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13, 202–208 (1983); Hildreth et al., J. Immunol. 134, 3272–3280 (1985)) hinsichtlich der Blockierung der Adhäsion von Rhesus-Lymphozyten an menschliche Keratinozyten verglichen wurde, war RhIgG1 74-mal weniger wirksam als MHM23 (4A, Tabelle VII). Wenn jedoch rekombinantes menschliches ICAM-1 auf Platten beschichtet wurde (anstelle menschlicher Keratinozyten), war RhIgG1 nur 4-mal weniger wirksam als MHM23 (4B, Tabelle VII). Eine chimäres CD11a, das menschliches CD11a umfasste, in dem die I-Domäne zu Rhesus mutiert war (Val133Ile, Arg189Gln, Lys197Glu, Val308Ala), wurde in menschliche Urnieren-293-Zellen transfiziert. Wiederum war RhIgG1 nur 4-mal schlechter als MHM23 hinsichtlich der Blockierung der Adhäsion dieser Rh/HuCD11a-293-Zellen an menschliche Keratinozyten (4C, Tabelle VII).
  • Isotyp-Kontrollantikörper für RhIgG1 (humanisierter Anti-p185HER2-Antikörper; Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992)) und MHM23 (Maus-MAb 354, ein Maus-IgG1-Anti-Hamster-tPA) blockierten nicht die Bindung von Rhesus-Lymphozyten an menschliche Keratinozyten oder rekombinantes ICAM-1 (4A, 4B) oder von Rh/HuCD11a an menschliche Keratinozyten (4C). Dies impliziert, dass die verminderte Leistungsfähigkeit von RhIgG1 im Vergleich zu Maus-MHM23 im Rhesus-Lymphozyten : Human-Keratinozyten-Test nicht auf irgendeine unerwartete Wechselwirkung des menschlichen Fc von HuIgG1 (verglichen mit dem Maus-Fc von MHM23) mit den Rhesus-Lymphozyten zurückzuführen war, welche die zur Bindung an Rhesus-CD11a verfügbare Konzentration von RhIgG1 vermindern könnte. Die Daten für rekombinantes menschliches ICAM-1 zeigen, dass RhIgG1 an die Rhesus-Lymphozyten bindet und die, Adhäsion nahezu genauso gut wie Maus-MHM23 verhindert (4B, Tabelle VII). Die Daten für Rh/HuCD11a-293 (4C, Tabelle VII) zeigen, dass RhIgG1 nicht an Ziele an menschlichen Keratinozyten bindet (verglichen mit HuIgG1), was die zur Bindung an Rhesus-CD11a verfügbare Konzentration an RhIgG1 vermindern könnte. Außerdem war die Kd (scheinbar) von RhIgG1 gegen Rhesus-Leukozyten mit (Rhesus-Spender 3) und ohne (Rhesus-Spender 1) Zugabe von 1 mg/ml menschlichem IgG ähnlich (Tabelle III). Dies zeigt, dass die Bindung von RhIgG1 spezifisch für Rhesus-CD11a ist.
  • (e) Gemischter Lymphozyten-Reaktionstest
  • Im MLR wies HuIgG1 einen IC50-Wert auf, der 2-mal schwächer als der von Maus-MHM24 war (Tabelle VIII, 5).
  • Tabelle VIII Ergebnisse des gemischten Lymphozyten-Reaktionstests
    Figure 00870001
  • Maus- sowie humanisierte MAbs waren 10- bis 20-mal besser als MAb 25.3, der vorher in vivo getestet worden ist (Fischer et al., Blood 77, 249–256 (1991); Stoppa et al., Transplant Intl. 4, 3–7 (1991); Hourmant et al., Transplantation 58, 377–380 (1994)). Die Rhesus-bindende Variante RhIgG1 wies einen EC50-Wert auf, der etwas besser als der von Maus-MHM23 war (Tabelle VIII). Verschiedene Responder : Stimulator-Blutspender wurden in unabhängigen Tests verwendet, und die Variation der Ergebnisse war nicht signifikant. Die Kd von RhIgG1 für Rhesus-CD11a ist ungefähr 26-mal niedriger als die Kd von HuIgG1 für menschliches CD11a (Tabelle III), und dies zeigt sich bei den aus den MLR-Tests stammenden IC50-Werten (Tabelle VIII).
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • Figure 00910001
  • Figure 00920001
  • Figure 00930001
  • Figure 00940001
  • Figure 00950001
  • Figure 00960001
  • Figure 00970001
  • Figure 00980001

Claims (31)

  1. Humanisierter Anti-CD11a-Antikörper, der eine variable Domäne mit in eine variable Domäne eines menschlichen Antikörpers inkorporierten Aminosäuren von einem nichtmenschlichen Spenderantikörper enthält, der an das Epitop in der I-Domäne von menschlichem CD11a bindet, das die Sequenz KHVKHML umfasst; und der an einer oder mehreren Stellen, ausgewählt aus 27, 28, 30, 49, 71 und 73 in der variablen Domäne der Schwerkette, einen Spenderantikörper-Aminosäurerest und/oder an Position 59 in der variablen Domäne der Schwerkette einen menschlichen Rest umfasst (bei Kabat-Nummerierung der Reste).
  2. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, der an einer oder mehreren der Positionen 49, 71 und 73 in der variablen Domäne der Schwerkette einen Spenderantikörper-Aminosäurerest umfasst.
  3. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 2, der an allen drei der Positionen 49, 71 und 73 Spenderantikörperreste umfasst.
  4. Humanisierter Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der an einer oder mehreren der Positionen 27, 28 und 30 in der variablen Domäne der Schwerkette Spenderantikörperreste umfasst.
  5. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 4, der an allen drei der Positionen 27, 28 und 30 in der variablen Domäne der Schwerkette Spenderantikörperreste umfasst.
  6. Humanisierter Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der an der Stelle 59 in der variablen Domäne der Schwerkette einen menschlichen Rest umfasst.
  7. Humanisierter Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die nichtmenschlichen Spenderreste von Seq.-ID Nr. 1 und Seq.-ID Nr. 4 abgeleitet sind.
  8. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 7, der eine variable Region der Schwerkette aufweist, die zumindest die folgenden Reste der Aminosäuresequenz von CDR1 (Seq.-ID Nr. 10), CDR2 (Seq.-ID Nr. 11) und CDR3 (Seq.-ID-Nr. 12) eines humanisierten Antikörpers, der hierin und in 1B als F(ab)-8 bezeichnet wird, umfasst: Trp33 in CDR1, Asp54, Glu56, Gln61 und Lys64 in CDR2 und Tyr97 und Tyr100c in CDR3.
  9. Humanisierter Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die menschlichen Reste der Schwerkette von einer VH-Untergruppe-III-Consensus-Sequenz stammen.
  10. Humanisierter Anti-CD11a-Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der eine variable Region der Schwerkette aufweist, welche die Aminosäuresequenz von (a) CDR2 (Seq.-ID Nr. 11) oder (b) CDR1 (Seq.-ID Nr. 10), CDR2 (Seq.-ID Nr. 11) und CDR3 (Seq.-ID Nr. 12) oder (c) Seq.-ID Nr. 5 des hierin und in 1B als F(ab)-8 bezeichneten humanisierten Antikörpers; oder eine Variante davon, die durch Aminosäureinsertion und/oder -deletion in oder neben einem CDR-Rest und/oder Substitution eines CDR-Rests oder durch Deletion und/oder Insertion und/oder Substitution von Resten innerhalb der für die variablen Regionen von F(ab)-8 (Seq.-ID Nr. 2 und 5) dargestellten Aminosäuresequenzen erhalten wird, umfasst.
  11. Humanisierter Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die menschlichen Reste der Leichtkette von einer menschlichen Kappa-1-Consensus-Sequenz stammen.
  12. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 11, der alle Gerüstreste von menschlichen Kappa-1-Consensus-Leichtketten aufweist.
  13. Humanisierter Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der eine variable Region der Leichtkette aufweist, die zumindest die folgenden Reste der Aminosäuresequenz des hierin und in 1A als F(ab)-8 bezeichneten humanisierten Antikörpers aufweist: His91, Asn92 und Tyr94 in CDR3 (Seq.-ID Nr. 15).
  14. Humanisierter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12, der eine variable Region der Leichtkette aufweist, welche die Aminosäuresequenz von CDR1 (Seq.-ID Nr. 13), CDR2 (Seq.-ID Nr. 14) und CDR3 (Seq.-ID Nr. 15) des hierin und in 1A als F(ab)-8 bezeichneten humanisierten Antikörpers umfasst.
  15. Humanisierter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12, der die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 für die variable Region der Leichtkette umfasst.
  16. Humanisierter Antikörper nach Anspruch 15, der die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 5 als variable Region der Schwerkette umfasst.
  17. Humanisierter Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der ein Antikörper voller Länge ist.
  18. Humanisierter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 16, der ein Antikörperfragment ist.
  19. Humanisierter Anti-CD11a-Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der zumindest eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) er bindet mit einem Kd-Wert von nicht mehr als etwa 1 × 10–8, M, (b) er weist einen IC50-Wert (nM) von nicht mehr als 1 nM auf, um zu verhindern, dass Jurkat-Zellen an normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten haften, die ICAM-1 exprimieren, (c) er weist bei einem gemischten Lymphozytenreaktionsassay einen IC50-Wert (nM) von nicht mehr als etwa 1 nM auf.
  20. Humanisierter Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der an eine detektierbare Markierung gebunden ist.
  21. Humanisierter Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der auf einer Festphase immobilisiert ist.
  22. Konjugat, das den humanisierten Anti-CD11a-Antikörper nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfasst, der an einen zytotoxischen Wirkstoff gebunden ist.
  23. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines CD11a-Proteins, umfassend das Aussetzen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie das CD11a-Protein umfasst, gegenüber einem humanisierten CD11a-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 21 und Bestimmen der Bindung dieses Antikörpers an die Probe.
  24. Set, umfassend einen humanisierten Anti-CD11a-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 21 und Anleitungen zur Verwendung des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers zum Detektieren des CD11a-Proteins.
  25. Isolierte Nucleinsäure, die für einen humanisierten Anti-CD11a-Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 19 kodiert.
  26. Vektor, der eine Nucleinsäure nach Anspruch 25 umfasst.
  27. Wirtszelle, welche Nucleinsäure nach Anspruch 25 oder einen Vektor nach Anspruch 26 umfasst.
  28. Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers, umfassend das Züchten einer Wirtszelle nach Anspruch 27, so dass die Nucleinsäure exprimiert wird; und die Gewinnung des humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers aus der Wirtszelle.
  29. Verwendung eines humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 19 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines durch LFA-1 ausgelösten Leidens eines Patienten.
  30. Verwendung eines humanisierten Anti-CD11a-Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 19 bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung einer T-Zellen-abhängigen Immunfunktion.
  31. Verwendung nach Anspruch 29, worin die Störung aus Asthma, primärchronischer Polyarthritis, Transplantat-Wirt-Abstoßung bei Transplantationen, Multipler Sklerose, Psoriasis, Lupus erythematodes, Dermatitis, Morbus Crohn und ulzeröser Kolitis ausgewählt ist.
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