KR20100113589A - 폰 빌레브란트 인자에 특이적인 인간화 항체 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 인간 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 그들의 제조방법 및 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법을 포함한, 용도에 관한 것이다.

Description

폰 빌레브란트 인자에 특이적인 인간화 항체{Humanized antibodies specific for von willebrand factor}
본 개시는 일반적으로 폰 빌레브란트 인자(von willebrand factor)에 특이적인 인간화 항체 또는 그 결합 단편에 관한 것이다. 더 구체적으로, 상기 개시는 일반적으로 쥐과(murine) 항체 NMC-4에 존재하는 CDR들(complementarity determining regions)과 상응하는 CDR들로 구성된 것을 포함하는, 폰 빌레브란트 인자에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편에 관한 것이다.
혈관 손상 부위에 일어나는 혈소판 부착의 조절은 여러 가지 단백질의 잘 편성된 상호작용을 포함하고, 지혈 및 혈전증 모두에 중요한 역할을 수행한다. 혈소판 부착에 기여하는 하나의 그러한 단백질로 혈액 혈장내 존재하는 큰 다량체 당단백질인, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor, vWF)가 있다. VWF는 그 A1 도메인을 통해 혈소판 수용체인 GPIb-α와 상호작용하고 그로 인해 혈소판의 롤링(rolling) 및 부착을 촉진한다는 가설이 알려져 있다(Moake et al. (1986) J. Clin. Invest. 78:1456-61). 혈소판의 롤링(rolling)및 부착 후에, 혈소판/피브린(fibrin) 응괴(plug)가 출혈이 중지된 결과로서 형성될 수 있다. 하지만, 과도한 혈소판 및/또는 응고 반응은 병적인 혈전성 조건을 유도할 수 있다.
그 현재의 치료법은 출혈 합병증과 연관되는 혈소판 활성[예를 들면, GPIIbIIIa, ADP 수용체, 싸이클로 옥시제나제(cyclo-oxygenase) 또는 포스포디에스터라제 길항체(phosphodiesterase antagonists)] 또는 응고[예를 들면, 트롬빈(thrombin) 및 인자 Xa 저해제(Factor Xa inhibitors)] 저해를 통한 방향으로 이루어지고 있고, 대체로 지혈을 크게 방해하지 않고 혈전증을 저해할 수 있는 약물 개발에 대한 필요성이 존재한다.
도 1은 리스토세틴(ristocetin)에 의해 유도된 vWF에 의해 매개되는 혈소판 응집 분석에서, 원래 NMC-4 단일클론 항체 및 다른 항-vWF 항체인 AJW200과 비교한 NMC-4 키메라 항체의 저해 활성을 나타낸다.
도 2A 및 B는 비표지 NMC-4 키메라 항체(상동 경합) 및 AJW200, 단독 및 조합(도 2A)에 의한 EU-표지된 NMC-4 결합의 경합을 나타낸다. 비표지 NMC-4 단일클론 항체, 동종형 대조군 IgG, AJW200 및 H9, L9로 지정되는 가변 부위를 갖는 NMC-4 항체의 인간화 유도체에 의한 EU-표지된 NMC-4 키메라 항체의 경합(도 2A). 20 nM AJW200의 유무에 따른 NMC-4 경합의 힐 플롯(Hill plot)(도 2B).
도 3A 내지 E는 HUVEC 세포에 부착된 혈소판의 현미경사진을 포함하여, 전단 흐름 조건하에서 내피 vWF에서 혈소판 부착을 막는 NMC-4의 활성을 나타낸다. HUVEC 세포 단층에 10 ug/ml 항-vWF 항체, NMC-4(도 C), 18 ug/ml 항-GPIbα 항체, AK2(도 D), 또는 18 ug/ml 마우스 IgG(도 E)가 추가된 PBS(도 A) 또는 25 uM 히스타민(histamine)(도 B-E)을 처리하였다. 또한 상기 다양한 항체는 관류 바로 전에 단층을 통과하는 혈소판 부유액에 해당되어 포함되었다.
도 4A 내지 C는 동맥 혈전증의 랫트 염화철 모델에서 AJW200(도 4C)와 비교한 NMC-4 키메라(도 4A) 및 H4, L10으로 지정되는 가변 부위를 갖는 인간화 항체(도 4B)의 활성을 나타낸다. 상기 세 가지 항체는 양에 대한 반응 연구와 비교하였다.
도 5는 개코 원숭이에서 순환 전자 흐름(CFR)에서 GBR600의 양(0.03 - 10 mg/kg) 증가에 따른 효과를 나타낸다.
도 6은 개코 원숭이에서 순환 전자 흐름(CFR)에서 GBR600의 양(0.01 - 10 mg/kg) 증가에 따른 효과를 나타낸다.
도 7은 개코 원숭이에서 순환 전자 흐름에서 GBR600의 누적 복용량(0.005 - 0.07 mg/kg)에 따른 효과를 나타낸다.
도 8은 개코 원숭이에서 순환 전자 흐름에서 GBR600의 누적 복용량의 양 반응 곡선을 나타낸다.
도 9는 개코 원숭이에서 클로피도그렐(clopidogrel)의 양(1 - 10 mg/kg) 증가에 따른 효과를 나타낸다.
도 10은 절개부 출혈 시험에서 GBR600 및 클로피도그렐(clopidogrel)의 양 증가에 따른 주입 효과의 비교를 나타낸다. 양은 효과적인 양(예를 들면, CFR을 0으로 감소시키는 누적 복용량)의 배수로 표현하였다.
도 11은 다양한 주사 열량계에 따른 인간화 NMC-4 변이체의 열안정성을 나타낸다.
개시
본 개시는 일반적으로 인간 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편, 그들의 제조 방법 및 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법을 포함한, 용도에 관한 것이다. 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 비-인간 항체(예를 들면, 마우스 CDR들) 및 인간 구조형성 영역(Framework region; FR)의 상보성 결정 부위들(CDRs)을 포함할 수 있다.
본 개시는 서열번호: 19에 명시된 중쇄 가변 부위 서열 및 서열번호: 28에 명시된 경쇄 가변 부위 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 서열번호: 237에 명시된 중쇄 서열 및 서열번호: 238에 명시된 경쇄 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 (a) 쥐과 항체 NMC-4(각각, 서열번호: 1 및 2)의 중쇄 및 경쇄 가변 부위에 존재하는 CDR들에 상응하는 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 부위 (CDR들); 및 (b) 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)과 같은 인간 항체로부터 유래된 VH 4-59의 가변 부위에 존재하는 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 및/또는 인간 항체 AAK94808(VL 018)(서열번호: 6)의 가변 부위에 존재하는 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 하기의 중쇄 CDR들: HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및/또는 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9)을 하나 이상 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 또한 본 개시는 HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALD (서열번호: 9)를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 인간 항체 AAC18165.1 (서열번호: 4)의 가변 부위에서 유래한 중쇄 구조형성 영역을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 개시는 하기의 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및/또는 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12)를 하나 이상 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 하기의 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12)을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시는 또한 중쇄 CDR들, HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9); 및 경쇄 CDR들, LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12)을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역 및/또는 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시는 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나 이상을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나 이상을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체를 제공한다.
또한, 본 개시는 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나 이상; 및 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나 이상을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
예를 들면, 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 L5(서열번호: 23) 및 H2(서열번호: 13); L5(서열번호: 23) 및 H4(서열번호: 14); L5(서열번호: 23) 및 H5(서열번호: 15); L5(서열번호: 23) 및 H6(서열번호: 16); L5(서열번호: 23) 및 H7(서열번호: 17); L5(서열번호: 23) 및 H8(서열번호: 18); L4(서열번호: 24) 및 H2(서열번호: 13); L6(서열번호: 25) 및 H2(서열번호: 13); L11(서열번호: 30) 및 H2(서열번호: 13); L7(서열번호: 26) 및 H2(서열번호: 13); L9(서열번호: 28) 및 H9(서열번호: 19); L8(서열번호: 27) 및 H9(서열번호: 19); L7(서열번호: 26) 및 H9(서열번호: 19); L6(서열번호: 25) 및 H9(서열번호: 19); L4(서열번호: 24) 및 H9(서열번호: 19); L5(서열번호: 23) 및 H9(서열번호: 19); L10(서열번호:29) 및 H9(서열번호: 19); L9(서열번호: 28) 및 H9(서열번호:19); L9(서열번호: 28) 및 H12(서열번호: 20); L9(서열번호: 28) 및 H13(서열번호: 21); L9(서열번호: 28) 및 H14(서열번호: 22); L11(서열번호: 30) 및 H9(서열번호: 19); 또는 L11(서열번호: 30) 및 H14(서열번호: 22)를 포함할 수 있다.
또한 본 개시는 하기의 중쇄 CDR들: HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및/또는 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 중 하나 이상; 및 하기의 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및/또는 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 중 하나 이상을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역 및/또는 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시는 10 nM 이하, 바람직하게는 5nM 이하, 더욱 바람직하게는 1nM 이하, 가장 바람직하게는 적어도 약 0.2 nM 에서 약 0.4 nM의 친화도(Kd)를 갖고 vWF에 결합하는 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 또한, 본 개시는 100 nM이하, 바람직하게는 50 nM이하, 더욱 바람직하게는 10 nM이하, 가장 바람직하게는 적어도 약 0.2 nM에서 약 5.0 nM의 친화도(Ki)를 갖고 vWF의 결합과 경합하는 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 개시는 10 nM 이하, 바람직하게는 5 nM이하, 더욱 바람직하게는 1 nM이하, 가장 바람직하게는 적어도 약 0.2 nM 에서 약 0.4 nM의 친화도(Kd)를 갖고 vWF의 A1 도메인에 결합하는 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 또한, 본 개시는 100 nM이하, 바람직하게는 50 nM이하, 더욱 바람직하게는 10 nM이하, 가장 바람직하게는 적어도 약 0.2 nM에서 약 5.0 nM의 친화도(Ki)를 갖고 vWF의 A1 도메인의 결합과 경합하는 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 개시는 열안정성 온도가 65℃ 이상인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 HCDR1(GFSLTDYGVD; 서열번호: 7), HCDR2(MIWGDGSTDYNSALKS; 서열번호: 8), HCDR3(DPADYGNYDYALDY; 서열번호: 9) 및 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 LCDR3(QQYEKLPWT; 서열번호: 12)을 포함하되, 단 적어도 하나의 LCDR1 및/또는 LCDR2가 각각 SASQDINKYLN(서열번호: 10) 또는 YTSSLHS(서열번호: 11)이 아닌, vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 개시는 HCDR1(GFSLTDYGVD; 서열번호: 7), HCDR2(MIWGDGSTDYNSALKS; 서열번호: 8), HCDR3(DPADYGNYDYALDY; 서열번호: 9), LCDR1(SASQDINKYLN; 서열번호: 10), LCDR2(YTSSLHS; 서열번호: 11) 및 LCDR3(QQYEKLPWT; 서열번호: 12); 인간 항체 생식 세포 패밀리 VH4의 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3; 및 인간 항체 생식세포 패밀리 VK1의 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 경쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 개시는 일반적으로 본 발명에 공개된 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체를 코딩하는 분리된 핵산에 관한 것이다. 일부 실시태양에 있어서, 벡터는 현재 공개된 핵산을 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 숙주 세포는 공개된 핵산을 포함할 수 있다.
또한, 본 개시는 일반적으로 핵산을 발현하고 항체를 생산하는 본 개시의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 방법은 숙주 세포 배양액으로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서 있어서, 상기 항체는 숙주 세포 배지로부터 회수된다. 일부 실시태양에 있어서, 배양 전, 상기 숙주 세포에 중쇄 가변 부위를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 경쇄 가변 부위를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 공동형질전환한다.
본 개시는 일반적으로 vWF에 특이적인 인간화 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
또한, 조성물은 본 명세서에 기재된 일차 인간화 항체 또는 그의 결합 단편 및 vWF의 A1 도메인에 결합하는 이차 항체를 포함하는 것으로 제공된다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 이차 항체는 AJW-200이다.
또한, 본 개시는 일반적으로 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 단편을 치료학적으로 유용한 양으로 개체에 투여함으로써, 개체 내(예를 들면, 환자) vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애(예를 들면, 혈정성 질환 또는 장애)를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 개체는 인간이다. 일부 실시태양에 있어서, 치료학적으로 유용한 양은 혈소판 응집을 저해하는데 충분하나, 출혈의 현저한 임상적 징후를 유발하기에는 불충분하다.
또한, 본 개시는 약제로서 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 이용하는 용도를 제공한다. 또한, 본 개시는 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 약제 제조에 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 이용하는 용도를 제공한다. 일부 실시태양에 있어서, 치료학적으로 유용한 양은 혈소판 응집을 저해하는데 충분하나, 출혈의 현저한 임상적 징후를 유발하기에는 불충분하다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애는 혈전성 질환 또는 장애이다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 혈전성 장애는 심장 혈관 질환 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 뇌혈관 질환이다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 심장 혈관 질환은 동맥경화증, 재협착, 협심증, 급성 심근 경색, 급성 관상동맥 증후군 또는 당뇨병과 연관된 심장혈관계 장애이다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 혈전성 질환 또는 장애는 혈관 염증, 정맥 혈전증, 겸상적혈구 질환, 이종 이식 거부, 말초 혈관 질환, 혈전성 혈소판 감소성 자반증, 낭포성 섬유증, 혈관성 치매, 레이노병, 류마티스 관절염 또는 당뇨병이다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 혈관성 치매, 허혈성 뇌졸중, 또는 재발성 뇌졸중의 예방이다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 효과기 기능이 부족하다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 IgG4로부터 유래된 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 폰 빌레브란트 인자의 A1 도메인에 결합한다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 vWF에 특이적인 항체 결합 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2 또는 디아바디(diabody)이다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 vWF에 특이적인 항체 결합 단편은 Fab가 아니다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 vWF에 특이적인 인간화 항체는 전장 길이의 항체이다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 HCDR1에서, 예를 들면, F27G, L29I, T30S 및/또는 V34W 치환과 같은 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 HCDR2에서, 예를 들면, S61P 및/또는 A62S 치환과 같은 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 LCDR1에서, 예를 들면, S24Q, N30S 및/또는 K31N 치환과 같은 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 LCDR2에서, 예를 들면, Y50D, T51A, S53N, H55E 및/또는 S56T 치환과 같은 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 HCDR1에서 예를 들면, F27G, L29I, T30S 및/또는 V34W 치환과 같은 하나 이상의 치환; HCDR2에서 예를 들면, S61P 및/또는 A62S 치환과 같은 하나 이상의 치환; LCDR1에서 예를 들면, S24Q, N30S 및/또는 K31N 치환과 같은 하나 이상의 치환; 및 LCDR2에서 예를 들면, Y50D, T51A, S53N, H55E 및/또는 S56T 치환과 같은 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
상세한 설명
본 개시는 쥐과 항체 NMC-4에 존재하는 CDR들 또는 CDR들의 일부 중 하나 이상에 상응하는 CDR 영역을 포함하는 것으로 구성된, 인간 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 상기 NMC-4 항체는 vWF의 A1 도메인의 Gp1b-a 결합 부위에 결합한다(예를 들면, Fujimura et al 혈액, 77:113-20, 1991; Shima et al, J Nara Med Assoc., 36:662, 1985 참조). 상기 본 개시의 인간화 항체는 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위에서 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 및 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위에서 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역과 같은, 변형된 또는 비변형된 인간 구조형성 영역을 추가로 포함할 수 있다. 쥐과 NMC-4 중쇄 및 경쇄 영역에 있는 서브패밀리와 높은 상동성이 확인된 것들을 포함한 수많은 종류의 인간 구조형성 영역은 NMC-4 CDR을 위한 잠재적 수용체 분자로 여겨졌다. 매우 놀랍게도, 중쇄 가변 부위 인간 구조형성에서 선택된 어느 하나 및 추가 변형(예를 들면, 쥐과 잔기에 인간 구조형성 잔기를 돌연변이하는 것)없는 경쇄 가변 부위 인간 구조형성에서 선택된 어느 하나에 NMC-4 CDR들을 이식하는 것은 vWF에 의해 매개되는 혈소판 반응을 저해하는 인간화 항체의 효력을 유지하는데 충분하다.
용어 "키메라 항체"는 가변 부위 서열은 마우스 항체로부터 유래하고, 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래한 것과 같이, 하나의 종으로부터 유래한 가변 부위 서열 및 또다른 종으로부터 유래한 불변 영역 서열인 항체를 포함한다.
용어 "인간화 항체"는 마우스와 같은 또다른 포유류 종의 생식세포로부터 유래한 CDR 서열인 항체를 포함하고, 인간 구조형성 서열에 융합되었다. 추가 구조형성 영역의 변형은 또다른 포유류 종의 생식세포로부터 유래한 CDR 서열내에서 뿐만 아니라, 인간 구조형성 서열 내에서도 만들어질 수 있다.
용어 "인간 항체"는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래한 구조형성 및 CDR 영역 둘다의 가변 부위를 갖는 항체를 포함한다. 게다가, 상기 항체가 불변 영역을 포함할 경우, 상기 불변 영역 또한 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래한다. 본 발명의 상기 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들면, 시험관 내 무작위 또는 특이자리 돌연변이 또는 생체 내 체세포 변이에 의해 도입된 돌연변이). 하지만, 본 명세서에 사용되는, 마우스와 같은 또다른 포유류 종의 생식세포로부터 유래한 CDR 서열이 있는 항체를 포함하지 않는 상기 용어 "인간 항체"는 인간 구조형성 서열에 융합하였다.
본 명세서에 사용된 것처럼, 항체의 가변 부위가 인간 생식세포 면역글로불린 유전자를 이용하는 시스템으로부터 얻어지는 경우, 인간 항체는 특정 생식세포 서열 "로부터 유래"한 중쇄 또는 경쇄 가변 부위를 포함한다. 이런 시스템은 관심 항원과 함께 인간 면역글로불린 유전자가 들어있는 형질전환 마우스의 면역화 또는 관심 항원과 함께 파아지(phage)에 디스플레이(display)된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리(library)의 스크리닝을 포함한다. 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린의 아미노산 서열에 상기 인간 항체의 아미노산 서열을 비교하고, 상기 인간 생식세포 면역글로불린 서열이 인간 항체의 서열에 가장 가까운 서열(즉, 최대 % 동일성)을 선택하는 것에 의해 확인될 수 있는 인간 생식세포 면역글로불린 서열 "로부터 유래"한다. 특정 인간 생식세포 면역글로불린 서열 "로부터 유래"하는 인간 항체는 예를 들면, 자연적으로 일어나는 체세포 돌연변이 또는 특정부위 돌연변이의 계획적인 도입으로 인한, 생식세포 서열과 비교하여 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 하지만, 선택된 인간 항체 또는 그의 단편은 일반적으로 인간 생식세포 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열이고, 다른 종(예를 들면, 쥐과 생식세포 서열)의 생식세포 면역글로불린 아미노산 서열과 비교했을 때, 인간으로서 인간 항체에 동일한 아미노산 잔기를 포함한다. 어떤 경우에는, 인간 항체는 적어도 90%, 또는 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 100%를 포함하는 생식세포 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 심지어 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열일 수 있다.
본 개시는 서열번호: 19에 명시된 중쇄 가변 부위 서열; 및 서열번호: 28에 명시된 경쇄 가변 부위 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편(예를 들면, Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, a 디아바디(diabody) 또는 단쇄 항체)을 제공한다. 본 개시는 또한 서열번호:237에 명시된 중쇄 서열 및 서열번호:238에 명시된 경쇄 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 중쇄 CDR들: HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및/또는 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 중 하나 이상; 및 하기의 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및/또는 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 중 하나 이상을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 중쇄 CDR들: HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및/또는 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 중 하나 이상; 또는 하기의 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및/또는 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12)중 하나 이상을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 중쇄 CDR들, HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9); 및 경쇄 CDR들, LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12)를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 중쇄 CDR들, HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9); 또는 경쇄 CDR들, LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT (서열번호: 12)를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 인간 VH4 패밀리로부터 유래한 항체에 존재하는 하나 이상(예를 들면, 한 개, 두 개, 세 개 및/또는 네 개)의 중쇄 구조형성 서열(예를 들면, 구조형성 1(FW1), 구조형성 2(FW2), 구조형성 3(FW3) 및/또는 구조형성 4(FW4))을 포함하는 중쇄 가변 부위 구조형성 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 인간 VK1 패밀리로부터 유래한 항체에 존재하는 하나 이상(예를 들면, 한 개, 두 개, 세 개 및/또는 네 개)의 경쇄 구조형성 서열(예를 들면, 구조형성 1(FW1), 구조형성 2(FW2), 구조형성 3(FW3) 및/또는 구조형성 4(FW4))을 포함하는 경쇄 가변 부위 구조형성 영역을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 인간 VH4 패밀리로부터 유래한 항체에 존재하는 하나 이상(예를 들면, 한 개, 두 개, 세 개 및/또는 네 개)의 중쇄 구조형성 서열(예를 들면, 구조형성 1(FW1), 구조형성 2(FW2), 구조형성 3(FW3) 및 인간 VK1 패밀리로부터 유래한 항체에 존재하는 하나 이상(예를 들면, 한 개, 두 개, 세 개 및/또는 네 개)의 경쇄 구조형성 서열(예를 들면, 구조형성 1(FW1), 구조형성 2(FW2), 구조형성 3(FW3) 및/또는 구조형성 4(FW4))을 포함할 수 있다.
VH4 패밀리의 멤버(member) 및 그 각각의 중쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3은 4-04(각각, 서열번호: 147, 148 및 149), 4-28(각각, 서열번호: 150, 151 및 152), 4-30.1 (각각, 서열번호: 153, 154 및 155), 4-30.2(각각, 서열번호: 156, 157 및 158), 4-30.4(각각, 서열번호: 159, 160 및 161), 4-31(각각, 서열번호: 162, 163 및 164), 4-34(각각, 서열번호: 165, 166 및 167), 4-39(각각, 서열번호: 168, 169 및 170), 4-59(각각, 서열번호: 171, 172 및 173), 4-61(각각, 서열번호: 174, 175 및 176) 및 4-b(각각, 서열번호: 177, 178 및 179)를 포함한다.
VK1 패밀리의 멤버(member) 및 그 각각의 경쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3은 012(각각, 서열번호: 180, 181 및 182), 02(각각, 서열번호: 183, 184 및 185), 018(각각, 서열번호: 186, 187 및 188), 08(각각, 서열번호: 189, 190 및 191), A20(각각, 서열번호: 192, 193 및 194), A30(각각, 서열번호: 195, 196 및 197), L14(각각, 서열번호: 198, 199 및 200), L1(각각, 서열번호: 201, 202 및 203), L15(각각, 서열번호: 204, 205 및 206), L4(각각, 서열번호: 207, 208 및 209), L18(각각, 서열번호: 210, 211 및 212), L5(각각, 서열번호: 213, 214 및 215), L19(각각, 서열번호: 216, 217 및 218), L8(각각, 서열번호: 219, 220, 및 221), L23(각각, 서열번호: 222, 223 및 224), L9(각각, 서열번호: 225, 226 및 227), L24(각각, 서열번호: 228, 229 및 230), L11(각각, 서열번호: 231, 232 및 233) 및 L12(각각, 서열번호: 234, 235 및 236)를 포함한다.
본 개시는 하기의 중쇄 CDR들: HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및/또는 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9)을 하나 이상 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 하기의 중쇄 CDR들: HCDR1: GFSLTDYGVD (서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (서열번호: 8) 및/또는 HCDR3: DPADYGNYDYALDY (서열번호: 9) 및 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 하나 이상 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 하기의 중쇄 CDR들: HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및/또는 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 및 쥐과 잔기를 하나 이상 포함하지 않는 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 하나 이상 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 하기의 중쇄 CDR들: HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및/또는 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 및 쥐과 잔기를 하나 이상 추가로 포함하는 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 하나 이상 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9)를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 및 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 및 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 및 쥐과 잔기를 하나 이상 추가로 포함하는 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및/또는 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12)을 하나 이상 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및/또는 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 및 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및/또는 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 및 쥐과 잔기를 하나 이상 포함하지 않는 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 하나 이상 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및/또는 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 및 쥐과 잔기를 하나 이상 추가로 포함하는 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 하나 이상 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 경쇄 CDR들 LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12)을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 경쇄 CDR들 LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 및 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWR에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 경쇄 CDR들 LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 및 쥐과 잔기를 하나 이상 포함하지 않는 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 경쇄 CDR들 LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 및 쥐과 잔기를 하나 이상 추가로 포함하는 인간 항체 AAk94808(서열번호: 6)로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 중쇄 CDR들: HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9); 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12); 및 선택적으로 인간 항체 AAk94808(서열번호: 6)의 가변 부위로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역 및/또는 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편의 아미노산 서열 변이체를 제공한다. 보통, 상기 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편의 아미노산 서열 변이체는 상기 중쇄 및/또는 경쇄 구조형성 영역의 아미노산 서열을 가질 것이고, 예를 들면, 각각 서열번호: 19 또는 서열번호: 28인 중쇄 및 경쇄 가변 부위 서열의 중쇄 또는 경쇄 중 원래 인간화 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 구조형성 영역의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하다(적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는).
상기 중쇄 및/또는 경쇄 구조형성 영역 서열의 아미노산 서열 동일성은 적어도 85%인 것이 바람직하고, 적어도 90%인 것이 더욱 바람직하고, 적어도 95%인 것이 가장 바람직하고, 예를 들면, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 100%를 포함하는 구체적으로 96%, 더 구체적으로 97%, 더더욱 구체적으로, 98%, 가장 구체적으로는 99%인 것이 바람직하다.
서열 상동성을 최대 퍼센트로 올리기 위해, 필요하다면, 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, vWF 잔기에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편과 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 퍼센트로 본 명세서에 정의되었다. 그러므로, 서열 동일성은 일반적으로 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 위치의 유사도를 비교하는 데 사용되는 표준 방법에 의해 측정될 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 두 개의 폴리펩티드는 그 각각 아미노산의 최적 매칭을 위해 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장 길이에 따라, 또는 하나 또는 두 서열의 미리-정해진 부분에 따라). 상기 프로그램은 디폴트(dafault) 오프닝 벌점 및 디폴트(default) 공백 벌점, 및 컴퓨터 프로그램과 결합하여 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스: Dayhoff et al., 단백질 서열 및 구조의 아틀라스, vol 5, supp. 3 (1978) 참조)과 같은 스코링(scoring) 매트릭스(matrix)를 제공한다. 예를 들면, 상기 퍼센트 동일성은 동일하게 매치된 전체 수에 100을 곱한 다음, 매칭된 스팬(span) 및 갭(gap)수에서 더 긴 서열의 길이의 합계로 나누어 계산될 수 있고, 두 서열을 정렬하기 위해 더 긴 서열내로 도입될 수 있다.
따라서 본 개시는 서열번호: 19의 상기 구조형성 영역과 적어도 80% 동일한 구조형성 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위 서열 및/또는 서열번호: 28의 상기 구조형성 영역과 적어도 80% 동일한 구조형성 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 뿐만 아니라 본 개시는 서열번호: 237의 상기 구조형성 영역과 적어도 80% 동일한 구조형성 영역을 포함한 중쇄 가변 부위 서열 및/또는 서열번호: 238의 상기 구조형성 영역과 적어도 80% 동일한 구조형성 영역을 포함한 경쇄 가변 부위 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
선택적으로, 상기 인간화 항체는 HCDR1에서, 예를 들면, F27G, L29I, T30S 및/또는 V34W 치환과 같은, 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 HCDR2에서, 예를 들면, S61P 및/또는 A62S 치환과 같은, 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 LCDR1에서, 예를 들면, S24Q, N30S 및/또는 K31N 치환과 같은, 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 LCDR2에서, 예를 들면, Y50D, T51A, S53N, H55E 및/또는 S56T 치환과 같은, 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 예를 들면, HCDR1에서, F27G, L29I, T30S 및/또는 V34W 치환; HCDR2에서, S61P 및/또는 A62S 치환을 포함하는, 하나 이상의 치환; LCDR1에서, S24Q, N30S 및/또는 K31N 치환을 포함하는, 하나 이상의 치환; LCDR2에서, 예를 들면, Y50D, T51A, S53N, H55E 및/또는 S56T와 같은, 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
본 개시는 또한 하기 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146)중 하나를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다(상기 언급된 중쇄 가변 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각, 서열번호: 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135 ,136, 137, 138 및 139에서 제공된다).
본 개시는 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다(상기 언급된 경쇄 가변 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각, 서열번호: 120, 121, 122, 123, 124 ,125, 126 및 127에 의해 제공된다).
본 개시는 또한 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나; 및 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 L5(서열번호: 23) 및 H2(서열번호: 13); L5(서열번호: 23) 및 H4(서열번호: 14); L5(서열번호: 23) 및 H5 (서열번호: 15); L5 (서열번호: 23) 및 H6(서열번호: 16); L5(서열번호: 23) 및 H7(서열번호: 17); L5(서열번호: 23) 및 H8(서열번호: 18); L4(서열번호: 24) 및 H2(서열번호: 13); L6(서열번호: 25) 및 H2(서열번호: 13); L11(서열번호: 30) 및 H2(서열번호: 13); L7(서열번호: 26) 및 H2(서열번호: 13); L9(서열번호: 28) 및 H9(서열번호: 19); L8(서열번호: 27) 및 H9(서열번호: 19); L7(서열번호: 26) 및 H9(서열번호: 19); L6(서열번호: 25) 및 H9(서열번호: 19); L4(서열번호: 24) 및 H9(서열번호: 19); L5(서열번호: 23) 및 H9(서열번호: 19); L10(서열번호:29) 및 H9(서열번호: 19); L9(서열번호: 28) 및 H9(서열번호:19); L9(서열번호: 28) 및 H12(서열번호: 20); L9(서열번호: 28) 및 H13(서열번호: 21); L9(서열번호: 28) 및 H14(서열번호: 22); L11(서열번호: 30) 및 H9(서열번호: 19); 또는 L11(서열번호: 30) 및 H14(서열번호: 22)를 포함하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 10 nM이하, 바람직하게는 5 nM이하, 더 바람직하게는 1 nM이하, 가장 바람직하게는 적어도 0.2 내지 약 0.4 nM(예를 들면, 약 0.21, 0.28 또는 0.34부터 약 0.25, 0.32 또는 0.38 nM까지)의 친화도(Kd)를 갖고 vWF와 결합하는, 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 본 개시는 또한 100 nM이하, 바람직하게는 50 nM이하, 더 바람직하게는 10 nM 이하, 가장 바람직하게는 적어도 약 0.2 nM 내지 약 5.0 nM(예를 들면, 0.22, 0.28 또는 0.34 내지 약 2.3, 3.5 또는 4.7 nM)의 친화도(Ki)를 갖는 vWF에 결합과 경합하는, 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 10 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 더 바람직하게는 1 nM 이하, 가장 바람직하게는 적어도 0.2 내지 약 0.4 nM(예를 들면, 약 0.21, 0.28 또는 0.34부터 약 0.25, 0.32 또는 0.38 nM까지)의 친화도(Kd)를 갖는 vWF의 A1 도메인에 결합하는, 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 본 개시는 또한 100 nM 이하, 바람직하게는 50 nM 이하, 더 바람직하게는 10nM 이하, 가장 바람직하게는 적어도 약 0.2 nM 내지 약 5.0 nM(예를 들면, 0.22, 0.28 또는 0.34 내지 약 2.3, 3.5 또는 4.7 nM)의 친화도(Ki)를 갖는 vWF의 A1 도메인에 결합과 경합하는, 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 FAB 단편의 열안정성 온도가 65℃ 이상, 바람직하게는 70℃ 이상, 더 바람직하게는 75℃ 이상, 가장 바람직하게는 80℃ 이상인 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. FAB 단편의 열안정성 분화 주사 열량계 측정의 분석을 위해 전장 IgG의 컨텍스트(context)에서 FAB 단편의 녹는 온도의 중간점을 사용하였다. 이런 종류의 열량계 측정은 숙련된 사람에게 알려져 있고, 예를 들면, Garber 및 Demarest (2007), BBRC 355:751-7에 따라 수행될 수 있다. 놀랍게도, 상기 본 발명의 인간화 항체는 모(parent) 비-인간화 항체보다 더 높은 FAB 단편 열안정성 온도를 갖는다. 상기 모(patent) 비-인간화 항체는 일반적으로 쥐과 항체이고, 특히 쥐과 항체 NMC-4이다. 따라서, 본 개시는 또한 상기 모 비-인간화 항체보다 높은 FAB 단편 열안정성 온도를 갖는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 LCDR1 및/또는 LCDR2 중 적어도 하나가 각각 SASQDINKYLN(서열번호: 10) 또는 YTSSLHS(서열번호: 11)이 아닌 단서를 갖는, 하기의 초가변 부위 아미노산 서열: HCDR1(GFSLTDYGVD; 서열번호: 7), HCDR2(MIWGDGSTDYNSALKS; 서열번호: 8), HCDR3(DPADYGNYDYALDY; 서열번호: 9) 및 LCDR3(QQYEKLPWT; 서열번호: 12)을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 놀랍게도, NMC-4 LCDR1 및/또는 LCDR2가 부족한 인간화 NMC-4 항체는 vWF에 나노몰라(nanomolar) 결합 친화도를 유지한다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 인간 항체 중쇄 구조형성 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 중쇄 구조형성 영역은 인간 항체에서 파생된 4-59에 존재하는 중쇄 구조형성 영역에 상응한다. 일부 실시태양에 있어서, 인간 항체에서 파생된 4-59에 존재하는 상기 중쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에 있어서, 인간 항체에서 파생된 4-59에 존재하는 상기 중쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 인간 항체 경쇄 구조형성 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 경쇄 구조형성 영역은 인간 항체에서 파생된 018에 존재하는 경쇄 구조형성 영역에 상응한다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간 항체에서 파생된 018에 존재하는 경쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 인간 항체에서 파생된 018에 존재하는 상기 경쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는다.
LCDR1 및/또는 LCDR2는 인간 소스(source)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, LCDR1 및/또는 LCDR2는 같은 항체로부터 유래될 수 있다(예를 들면, 하나의 인간 항체). 다른 실시태양에 있어서, LCDR1 및/또는 LCDR2는 다양한 항체로부터 유래될 수 있다. LCDR2가 인간 소스(source)로부터 유래한다면, 그것은 DASNLET(서열번호: 118)인 것이 바람직하다.
본 개시는 또한 HCDR1(GFSLTDYGVD; 서열번호: 7), HCDR2(MIWGDGSTDYNSALKS; 서열번호: 8), HCDR3(DPADYGNYDYALDY; 서열번호: 9), LCDR1(SASQDINKYLN; 서열번호: 10), LCDR2(YTSSLHS; 서열번호: 11) 및 LCDR3(QQYEKLPWT; 서열번호: 12); 중쇄 구조형성 영역 1은 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS(서열번호: 171); 중쇄 구조형성 영역 2는 WIRQPPGKGLEWIG(서열번호: 172); 및 중쇄 구조형성 영역 3은RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 173)인 인간 항체 중쇄 생식세포 서열 4-59에 존재하는 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3; 및 경쇄 구조형성 영역 1은 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 186); 경쇄 구조형성 영역 2는 WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 187); 및 경쇄 구조형성 영역 3은GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC(서열번호: 188)인 인간 항체 경쇄 생식세포 서열 018에 존재하는 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 HCDR1(GFSLTDYGVD; 서열번호: 7), HCDR2(MIWGDGSTDYNSALKS; 서열번호: 8), HCDR3(DPADYGNYDYALDY; 서열번호: 9) ), LCDR1(SASQDINKYLN; 서열번호: 10), LCDR2(YTSSLHS; 서열번호: 11) 및 LCDR3(QQYEKLPWT; 서열번호: 12); 및 중쇄 구조형성 영역 1은 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY(서열번호:165); 중쇄 구조형성 영역 2는 WIRQPPGKGLEWIG(서열번호: 166) 및 중쇄 구조형성 영역 3은 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 167)인 인간 항체 중쇄 생색세포 서열 4-34에 존재하는 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3; 및 경쇄 구조형성 영역 1은 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 186); 경쇄 구조형성 영역 2는 WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 187); 및 경쇄 구조형성 영역 3은 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC(서열번호: 188)인 인간 항체 경쇄 생식세포 서열 018에 존재하는 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 HCDR1(GFSLTDYGVD; 서열번호: 7), HCDR2(MIWGDGSTDYNSALKS; 서열번호: 8), HCDR3(DPADYGNYDYALD; 서열번호: 9), LCDR1(SASQDINKYLN; 서열번호: 10), LCDR2(YTSSLHS; 서열번호: 11) 및 LCDR3(QQYEKLPWT; 서열번호: 12); 인간 항체 생식세포 패밀리 VH4로부터 유래한 항체에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3; 및 인간 항체 생식세포 패밀리 VK1으로부터 유래한 항체에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 경쇄 구조 형성 영역 1, 2 및 3을 포함하는 vWF이 A1 도메인에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 중쇄 가변 생식세포 서열 4-04에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVS(서열번호: 147), FW2: WVRQPPGKGLEWIG(서열번호: 148) 및 FW3: RVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 149).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 중쇄 가변 생식세포 서열 4-28에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVS(서열번호: 150), FW2: WIRQPPGKGLEWIG(서열번호: 151) 및 FW3: RVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCAR (서열번호: 152).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 중쇄 가변 생식세포 서열 4-30.1에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS(서열번호: 153), FW2: WIRQHPGKGLEWIG(서열번호: 154) 및 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 155).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 중쇄 가변 생식세포 서열 4-30.2에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVS(서열번호: 156), FW2: WIRQPPGKGLEWIG(서열번호: 157) 및 FW3: RVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 158).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 중쇄 가변 생식세포 서열 4-30.4에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS(서열번호: 159), FW2: WIRQPPGKGLEWIG(서열번호: 160) 및 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 161).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 중쇄 가변 생식세포 서열 4-31에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS(서열번호: 162), FW2: WIRQHPGKGLEWIG(서열번호: 163) 및 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 164).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 중쇄 가변 생식세포 서열 4-34에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY(서열번호: 165), FW2: WIRQPPGKGLEWIG(서열번호: 166) 및 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 167).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 중쇄 가변 생식세포 서열 4-39에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS(서열번호: 168), FW2: WIRQPPGKGLEWIG(서열번호: 169) 및 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 170).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 중쇄 가변 생식세포 서열 4-59에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (서열번호: 171), 예를 들면, FW2: WIRQPPGKGLEWIG (서열번호: 172) 및 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (서열번호: 173).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 중쇄 가변 생식세포 서열 4-61에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS(서열번호: 174), FW2: WIRQPPGKGLEWIG(서열번호: 175) 및 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 176).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 중쇄 가변 생식세포 서열 4-b에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVS(서열번호: 177), FW2: WIRQPPGKGLEWIG(서열번호: 178) 및 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 179).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 012에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 180), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 181) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 182).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 02에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 183), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 184) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 185).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 018에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 186), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 187) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC(서열번호: 188).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 08에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 189), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 190) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC(서열번호: 191).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 A20에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 192), FW2: WYQQKPGKVPKLLIY(서열번호: 193) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(서열번호: 194).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 A30에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 195), FW2: WYQQKPGKAPKRLIY (서열번호: 196) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 197).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L14에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITC(서열번호: 198), FW2: WFQQKPGKVPKHLIY(서열번호: 199) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 200).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L1에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 201), FW2: WFQQKPGKAPKSLIY(서열번호: 202) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 203).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L15에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 204), FW2: WYQQKPEKAPKSLIY(서열번호: 205) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 206).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L4에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 207), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 208) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 209).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L18에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 210), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 211) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 212).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L5에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC(서열번호: 213), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 214) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 215).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L19에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC(서열번호: 216), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 217) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 218).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L8에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC(서열번호: 219), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 220) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 221).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L23에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITC(서열번호: 222), FW2: WYQQKPAKAPKLFIY(서열번호: 223) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 224).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L9에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: AIRMTQSPSSFSASTGDRVTITC(서열번호: 225), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 226) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYC(서열번호: 227).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L24에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: VIWMTQSPSLLSASTGDRVTISC(서열번호: 228), FW2: WYQQKPGKAPELLIY(서열번호: 229) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYC(서열번호: 230).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L11에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 231), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 232) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(서열번호: 233).
상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 카파 사슬 가변 생식세포 서열 L12에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함할 수 있다(예를 들면, FW1: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC(서열번호: 234), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 235) 및 FW3: GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC(서열번호: 236).
본 개시는 또한 HCDR1(GFSLTDYGVD; 서열번호: 7), HCDR2(MIWGDGSTDYNSALKS; 서열번호: 8), HCDR3(DPADYGNYDYALDY; 서열번호: 9), LCDR1(SASQDINKYLN; 서열번호: 10), LCDR2(YTSSLHS; 서열번호: 11) 및 LCDR3(QQYEKLPWT; 서열번호: 12); 인간 항체 4-04(각각, 서열번호: 147, 148 및 149), 4-28(각각, 서열번호: 150, 151 및 152), 4-30.1(각각, 서열번호: 153, 154 및 155), 4-30.2(각각, 서열번호: 156, 157 및 158), 4-30.4(각각, 서열번호: 159, 160 및 161), 4-31(각각, 서열번호: 162, 163 및 164), 4-34(각각, 서열번호: 165, 166 및 167), 4-39(각각, 서열번호: 168, 169 및 170), 4-59(각각, 서열번호: 171, 172 및 173), 4-61(각각, 서열번호: 174, 175 및 176) 또는 4-b(각각, 서열번호: 177, 178 및 179)에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3; 인간 항체 012(각각, 서열번호: 180, 181 및 182), 02(각각, 서열번호: 183, 184 및 185), 018(각각, 서열번호: 186, 187 및 188), 08(각각, 서열번호: 189, 190 및 191), A20(각각, 서열번호: 192, 193 및 194), A30(각각, 서열번호: 195, 196 및 197), L14(각각, 서열번호: 198, 199 및 200), L1(각각, 서열번호: 201, 202 및 203), L15(각각, 서열번호: 204, 205 및 206), L4(각각, 서열번호: 207, 208 및 209), L18(각각, 서열번호: 210, 211 및 212), L5(각각, 서열번호: 213, 214 및 215), L19(각각, 서열번호: 216, 217 및 218), L8(각각, 서열번호: 219, 220, 및 221), L23(각각, 서열번호: 222, 223 및 224), L9(각각, 서열번호: 225, 226 및 227), L24(각각, 서열번호: 228, 229 및 230), L11(각각, 서열번호: 231, 232 및 233) 또는 L12(각각 서열번호: 234, 235 및 236)에 존재하는 구조형성 영역 1, 2 및 3에 상응하는 경쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3을 포함하는 vWF의 A1 도메인에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 또한 모 비-인간화 항체 또는 모 비-인간화 항체 및 인간 Fc 영역으로부터 유래한 가변 부위를 포함하는 키메라 항체와 같은 활성을 유지하는 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 상기 모 비-인간화 항체는 일반적으로 쥐과 항체이고, 특히 쥐과 항체 NMC-4이다. 상기 모 비-인간화로부터 유래한 가변 부위를 포함하는 상기 키메라 항체는 일반적으로 쥐과 항체, 특히 쥐과 항체 NMC-4 및 인간 Fc 영역으로부터 유래한 가변 부위를 포함한 항체이다. 인간 Fc 영역으로는 본 명세서에 기재된 인간 Fc 영역을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 모 비-인간화 항체 및 키메라 항체의 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편의 활성은 실시예 1에 기재된 EC50 활성의 측정에 의한 리스토세틴(ristocetin)에 의해 유도된 혈소판 응집 활성으로 측정할 수 있다. 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 본 명세서에 기재된 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편의 EC50 활성이 EC50 활성과 동일하거나, 또는 모 비-인간화 항체 또는 키메라 항체의 EC50 활성과 최대 50%, 바람직하게는 최대 30%, 바람직하게는 최대 20% 차이(예를 들면, 높거나 낮은)가 날 때, 상기 모 비-인간화 항체 또는 상기 키메라 항체와 같은 효과를 갖는 것으로 간주될 수 있다.
본 개시의 바람직한 실시태양에서 본 명세서에 기재된 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않은 인간 항체로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 추가로 포함한다.
본 개시의 추가로 바람직한 실시태양에서 본 명세서에 기재된 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 인간 항체로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 추가로 포함한다.
"하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 인간 중쇄 구조형성 영역" 또는 "하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 인간 경쇄 구조형성 영역"은 쥐과에만 존재하는 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 인간 중쇄 또는 경쇄 구조형성 영역을 나타내고, 예를 들면, 쥐과에만 존재하고, 인간에는 존재하지 않는 잔기의 역돌연변이를 포함하지 않는다. 쥐과에도 존재하는 인간 잔기를 포함하는 인간 중쇄 또는 경쇄 구조형성 영역은 이러한 정의해 한정되지 않는다. 뿐만 아니라 인간에서 일반적으로 돌연변이화된 잔기를 가진 인간 중쇄 또는 경쇄 구조형성 영역, 예를 들면 쥐과에도 존재하지만, 대부분 인간 구조형성 영역에서 일반적인 잔기는 이러한 정의에 한정되지 않는다.
본 개시의 실시태양의 경우에서 하나 이상의 쥐과 잔기를 추가로 포함하는 인간 항체로부터 유래한 경쇄 또는 중쇄 구조형성 영역은 보통 10 또는 그 이하를 포함하고, 9 또는 그 이하인 것이 바람직하고, 8 또는 그 이하인 것이 더 바람직하고, 7 또는 그 이하인 것이 더 더욱 바람직하고, 6 또는 그 이하인 것이 가장 바람직하며, 특별히 5 또는 그 이하, 더 특별하게는 4 또는 그 이하, 더 더욱 특별하게는 3 또는 그 이하, 가장 특별하게는 2 또는 그 이하, 가장 특별하게 바람직하게는 1 쥐과 잔기를 포함하는 것이다.
본 개시는 서열번호: 19에 명시된 중쇄 가변 부위 서열 및 서열번호: 28에 명시된 경쇄 가변 부위 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 개시는 서열번호: 237에 명시도니 중쇄 서열 및 서열번호: 238에 명시된 경쇄 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 개시는 또한 쥐과 항체 NMC-4에 존재하는 CDR들에 상응하는 CDR 영역, 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위에 존재하는 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역, 인간 항체 AAk94808(서열번호: 6)의 가변 부위에 존재하는 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 개시는 또한 HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 및 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 전형적인 인간 중쇄 구조형성 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 116에 기재된다.
본 개시는 또한 경쇄 CDR들 LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 및 인간 항체 AAk94808(서열번호: 6)의 가변 부위로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 전형적인 인간 경쇄 구조형성 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 117에 기재된다.
본 개시는 또한 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나를 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나를 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나 및 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나를 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 개시는 또한 등록번호 DSM 21059를 갖는 2008년 1월 23일에 DSMZ의 미생물로 기탁된 상기 벡터 GS264의 핵산 서열을 코딩하는 상기 경쇄를 포함하는 분리된 핵산을 제공한다.
본 개시는 또한 등록번호 DSM 21060을 갖는 2008년 1월 23일에 DSMZ의 미생물로 기탁된 상기 벡터 GS265의 핵산 서열을 코딩하는 상기 중쇄를 포함하는 분리된 핵산을 제공한다.
따라서 본 개시는 또한 상기 벡터 GS264의 핵산 서열을 코딩하는 상기 경쇄 또는 상기 벡터 GS265의 핵산 서열을 코딩하는 상기 중쇄에 의해 코딩되는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다.
본 개시는 서열번호: 19에 명시된 중쇄 가변 부위 서열 및 서열번호: 28에 명시된 경쇄 가변 부위 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 서열번호: 237에 명시된 중쇄 서열 및 서열번호: 238에 명시된 경쇄 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 쥐과 항체 NMC-4안에 존재하는 CDR들에 상응하는 CDR 영역, 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위에 있는 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 및 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위에 있는 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 및 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 경쇄 CDR: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 및 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6) 의 가변 부위로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나를 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나를 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나 및 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나를 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 등록번호 DSM 21059를 갖는 2008년 1월 23일에 DSMZ의 미생물로 기탁된 상기 벡터 GS264의 핵산 서열을 코딩하는 상기 경쇄를 포함하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 또한 등록번호 DSM 21060을 갖는 2008년 1월 23일에 DSMZ의 미생물로 기탁된 상기 벡터 GS265의 핵산 서열을 코딩하는 상기 중쇄를 포함하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 서열번호: 19에 명시된 중쇄 가변 부위 서열 및 서열번호: 28에 명시된 경쇄 가변 부위 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시는 서열번호: 237에 명시된 중쇄 서열 및 서열번호: 238에 명시된 경쇄 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 쥐과 항체 NMC-4안에 존재하는 CDR들에 상응하는 CDR 영역, 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위에 있는 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 및 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위에 있는 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 및 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 경쇄 CDR: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 및 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나를 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나를 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나 및 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나를 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 등록번호 DSM 21059를 갖는 2008년 1월 23일에 DSMZ의 미생물로 기탁된 상기 벡터 GS264의 핵산 서열을 코딩하는 상기 경쇄를 포함하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 등록번호 DSM 21060을 갖는 2008년 1월 23일에 DSMZ의 미생물로 기탁된 상기 벡터 GS265의 핵산 서열을 코딩하는 상기 중쇄를 포함하는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 개시는 또한 상기 핵산을 발현하고 항체를 생산하는 본 개시의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 본 개시의 상기 인간화 vWF 항체 또는 그의 결합단편을 생산하는 방법은 상기 숙주 세포 배양으로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 항체는 상기 숙제 세포의 배지로부터 회수될 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 배양 전, 상기 숙주 세포에 중쇄 가변 부위를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 경쇄 가변 부위를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 공동-형질도입할 수 있다.
본 개시는 서열번호: 19에 명시된 중쇄 가변 부위 서열 및 서열번호: 28에 명시된 경쇄 가변 부위 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 서열번호 : 19에 명시된 중쇄 가변 부위 서열 및 서열번호: 28에 명시된 경쇄 가변 부위 서열 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 서열번호: 237에 명시된 중쇄 서열 및 서열번호: 238에 명시된 경쇄 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 서열번호: 237에 명시된 중쇄 서열 및 서열번호: 238에 명시된 경쇄 서열 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 쥐과 항체 NMC-4에 존재하는 CDR들에 상응하는 CDR 영역, 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위에 있는 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 및 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위에 있는 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 인간 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9), 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 경쇄 CDR: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12), 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 중쇄 CDR: HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9); 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12); 선택적으로, 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역 및/또는 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역 및 a 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나; 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
또한 조성물은 본 명세서에 따른 일차 인간화 항체 또는 그의 결합 단편 및 vWF의 A1 도메인에 결합하는 이차 항체를 포함하여 제공된다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 이차 항체는 AJW-200이다.
본 개시는 또한 서열번호: 19에 명시된 중쇄 가변 부위 서열 및 서열번호: 28에 명시된 경쇄 가변 부위 서열을 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체(예를 들면, 인간) 내 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애(예를 들면, 혈전성 질환 또는 장애)를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한, 서열번호: 237에 명시된 중쇄 서열 및 서열번호: 238에 명시된 경쇄 서열을 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체(예를 들면, 인간) 내 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애(예를 들면, 혈전성 질환 또는 장애)를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한, 쥐과 항체 NMC-4 안에 존재하는 CDR에 상응하는 CDR 영역, 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위에 있는 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 및 인간 항체 AAk94808(서열번호: 6)의 가변 부위에 있는 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 인간 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체(예를 들면, 인간) 내 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애(예를 들면, 혈전성 질환 또는 장애)를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한 HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 및 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체(예를 들면, 인간) 내 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애(예를 들면, 혈전성 질환 또는 장애)를 치료하는 방법을 제공한다.
상기 혈전성 질환 또는 장애는 심장 혈관 질환 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 뇌혈관 장애일 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 심장 혈관 질환은 동맥경화증, 재협착, 협심증, 급성 심근 경색, 급성 관상동맥 증후군 또는 당뇨병과 연관된 심장혈관계 장애이다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 혈전성 질환은 혈관 염증, 정맥 혈전증, 겸상적혈구 질환, 이종 이식 거부, 말초 혈관질환, 혈전성 혈소판 감소성 자반증, 낭포성 섬유증, 혈관성 치매, 레이노병, 류마티스 관절염 또는 당뇨병이다. 일부 실시태양에 있어서, 뇌혈관 장애는 소규모 열공성 경색뿐 아니라, 대뇌 동맥 경색, 및 혈관성 치매의 결과인 허혈성 뇌줄중을 포함할 수 있다. 인간화 vWF 항체는 또한 재발성 뇌졸중의 예방 또는 뇌혈관 염증에 의해 유발된 초기 뇌졸중에 사용될 수도 있다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 혈전성 질환 또는 장애는 암을 포함할 수 있다.
본 개시는 경쇄 CDR들 LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12) 및 인간 항체 AAk94808(서열번호: 6)의 가변 부위로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체(예를 들면, 인간) 내 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애(예를 들면, 혈전성 질환 또는 장애)를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한 하기 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체(예를 들면, 인간) 내 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애(예를 들면, 혈전성 질환 또는 장애)를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30)을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체(예를 들면, 인간) 내 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애(예를 들면, 혈전성 질환 또는 장애)를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한 하기의 중쇄 가변 부위: H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146) 중 하나; 및 하기의 경쇄 가변 부위: L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30) 중 하나를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 개체에 투여하는 것을 포함하는 개체(예를 들면, 인간) 내 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애(예를 들면, 혈전성 질환 또는 장애)를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 효과기 기능이 부족하다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 IgG4로부터 유래한 Fc 영역을 포함한다.
본 개시는 출혈의 현저한 임상적 징후를 유발하지 않는 약 1 내지 약 250배의 ED100이 치료학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있는 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 특이적인 인간 항체 또는 그의 결합 단편을 제공한다. 상기 인간 항체 또는 그의 결합 단편은 인간 vWF의 A1 도메인에 특이적인 것이 바람직하다. 상기 vWF에 특이적인 인간 항체 또는 그의 결합 단편은 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편인 것이 더욱 바람직하다.
본 개시는 또한 개체에, 바람직하게는 인간에, 본 명세서에 기재된 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 약 0.001 내지 약 100 mg/kg을 투여함으로써 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 약 0.002 내지 약 20 mg/kg을 투여하는 것이 바람직하고, 약 0.002 내지 약 10 mg/kg을 투여하는 것이 더욱 바람직하고, 약 0.002 내지 0.4 mg/kg을 투여하는 것이 더욱 바람직하고, 약 0.005 내지 0.2 mg/kg을 투여하는 것이 더욱 바람직하며, 약 0.01 내지 약 0.1 mg/kg 투여하는 것이 가장 바람직하다.
본 개시는 또한 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 치료학적으로 효과적인 양인 약 1 내지 약 250배의 ED100을 필요로 하는 개체에 투여함으로써, vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 약 1 내지 약 200배의 ED100인 것이 바람직하고, 약 1 내지 약 100배의 ED100인 것이 더욱 바람직하다.
본 개시는 또한 상기 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 단회 또는 다회 하위 복용량으로 이러한 치료를 필요로 하는 개체에 투여함으로써, vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한 명세서에 기재된 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 이러한 치료를 필요로 하는 개체에 파하에 투여함으로써, vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한 명세서에 기재된 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 이러한 치료를 필요로 하는 개체에 정맥내로 투여함으로써, vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한 명세서에 기재된 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 효과적인 양으로 순차적으로 또는 방사선 치료(예를 들면, 조사 또는 UICC (Ed.), Klinische Onkologie, Springer-Verlag (1982)에 기재된 것과 같은- 방사성 물질의 도입)와 병행하여 이러한 치료를 필요로 하는 개체에 정맥내로 투여함으로써, vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동일한 어떠한 방법 및 재료가 본 개시의 실험 또는 테스트에 사용될 수 있음에도 불구하고, 바람직한 방법 및 재료가 설명되었다.
인간화 폰 빌레브란트 인자 항체의 생산
인간화 폰 빌레브란트 인자(vWF) 항체(예를 들면, 쥐과 NMC_4) 또는 그의 결합 단편의 생산을 위한 방법이 제공된다. vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 하나 이상의 CDR 또는 비-인간 동물(예를 들면, 마우스)로부터 유래한 VH 및/또는 VL 영역부터 인간 VH 및/또는 VL 영역으로부터 유래한 하나 이상의 구조형성 영역까지에서 일부를 도입함으로써 생산될 수 있다. 선택적으로, 상기 VH 및/또는 VL 영역에 존재하는 인간 구조형성 잔기는 결합 친화도를 유지할 필요가 있거나 요구될 때 비-인간(예를 들면, 마우스) 잔기에 상응하는 것과 대체될 수 있다. 선택적으로, 상기 CDR에 존재하는 비-인간 아미노산 잔기는 인간 잔기로 대체될 수 있다.
본 명세서에 기재된(HFR1 및 HCDR1을 제외) 구조형성 및 CDR의 분류는 카밧(Kabat) 번호 매기기 시스템에 기초하였다. 이 정의에서, 상기 중쇄 CDR들은 잔기 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) 및 95-102 (HCDR3)를 포함하고; 상기 경쇄의 CDR들은 잔기 24-34(LCDR1), 50-56(LCDR2) 및 89-97(LCDR3)로 구성되는 것에 의해 정의된다. VH(예를 들면, 중쇄 구조형성 영역 1(HFR1), 중쇄 구조형성 영역 2(HFR2), 중쇄 구조형성 영역 3(HFR3) 및/또는 중쇄 구조형성 영역 4(HFR4))에서 상기 구조형성 영역은 잔기 1-30(HFR1), 36-49(HFR2), 66-94(HFR3); 및 103-113(HFR4)로 구성되는 것에 의해 정의되고, VL에서 구조형성 영역은 잔기 1-23(LFR1), 35-49(LFR2), 57-88(LFR3) 및 98-107(LFR4) (Wu 및 Kabat, 1970 J. Exp. Med. 132:211)를 포함한다. 하지만, CDR의 구조에 따라, Chothia는 잔기 26-32를 포함하는 상기 CDR1-H를 정의하였다(Chothia et al., 1992 J. Mol. Biol. 227: 799).
상기 AbM(항체 모델링)의 정의는 상기 잔기 26-35를 포함하는 CDR1-H를 갖는 Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어에 사용되는 두 가지 사이를 절충한 것이다. 이것은 NMC-4를 사용하는 명세서에 기재된 상기 인간화 방법에 사용된 개념이다.
폰 빌레브란트 인자(vWF)에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 NMC-4로부터 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위에서 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역으로 중쇄 상보성 결정 부위(CDR들)를 도입하거나; NMC-4로부터 인간 항체 AAk94808(서열번호: 6)의 가변 부위에서 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역으로 경쇄 CDR들을 도입함으로써 생산될 수 있다.
vWF에 특이적인 인간화 항체는 또한 쥐과 NMC-4로부터 인간 구조형성 영역(예를 들면, AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위로부터)으로 하나 이상의 중쇄 CDR들(예를 들면, HCDR1: GFSLTDYGVD (서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY (서열번호: 9))을 도입함으로써 생산될 수 있다.
vWF에 특이적인 인간화 항체는 또한 하나 이상의 경쇄 CDR들(예를 들면, LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12))을 인간 구조형성 영역(예를 들면, AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위로부터)으로 도입함으로써 생산될 수 있다.
vWF에 특이적인 인간화 항체는 쥐과 NMC-4로부터 인간 구조형성 영역(예를 들면, ACC18165.1.1(서열번호: 4)의 가변 부위)으로 하나 이상의 중쇄 CDR들(예를 들면, HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9))을 도입하거나, 인간 구조형성 영역(예를 들면, AAK93808(서열번호: 6)의 가변 부위로부터)으로 하나 이상의 경쇄 CDR들(예를 들면, LCDR1: SASQDINKYLN (서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS (서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT (서열번호: 12))을 도입함으로써 생산될 수 있다.
vWF에 특이적인 인간화 항체는 NMC-4 및 인간 구조형성 영역(예를 들면, H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146))에 존재하는 CDR을 포함하는 변형된 중쇄 가변 부위를 인간 불변 영역으로 도입함으로써 생산될 수 있다.
vWF에 특이적인 인간화 항체는 또한 NMC-4 및 인간 구조형성 영역(예를 들면, L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30)에 존재하는 CDR을 포함하는 변형된 경쇄 가변 부위를 인간 불변 영역으로 도입함으로써 생산될 수 있다.
vWF에 특이적인 인간화 항체는 NMC-4 및 인간 구조형성 영역(예를 들면, H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146))에 존재하는 CDR을 포함하는 변형된 중쇄 가변 부위를 인간 불변 영역으로 도입하거나; NMC-4 및 인간 구조형성 영역(예를 들면, L5 (서열번호: 23), L4 (서열번호: 24), L6 (서열번호: 25), L7 (서열번호: 26), L8 (서열번호: 27), L9 (서열번호: 28), L10 (서열번호: 29) 또는 L11 (서열번호: 30))에 존재하는 CDR을 포함하는 변형된 경쇄 가변 부위를 인간 불변 영역으로 도입함으로써 생산될 수 있다.
인간화 항체의 항원성을 추가로 감소시키기 위한 시도로, 상기 CDR들(예를 들면, 쥐과 잔기)의 잔기는 인간 아미노산 잔기로 바뀔 수 있다(예를 들면, 치환). 예를 들면, 상기 인간화 항체는 HCDR1에서 F27G, L29I, T30S 및/또는 V34W 치환을 하나 이상 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 HCDR2에서 S61P 및/또는 A62S 치환을 하나 이상 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 LCDR1에서 S24Q, N30S 및/또는 K31N 치환을 하나 이상 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 LCDR2에서, 예를 들면, Y50D, T51A, S53N, H55E 및/또는 S56T 치환과 같은 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 상기 인간화 항체는 HCDR1에서 F27G, L29I, T30S 및/또는 V34W 치환을 하나 이상; HCDR2에서 S61P 및/또는 A62S 치환을 하나 이상; LCDR1에서 S24Q, N30S 및/또는 K31N 치환을 하나 이상; 및 LCDR2에서 Y50D, T51A, S53N, H55E 및/또는 S56T 치환을 하나 이상 포함할 수 있다.
상기 인간화 항체의 다양한 형태가 고안되었다. 예를 들면, 상기 인간화 항체는 Fab와 같은 항체 단편일 수 있고, 이것은 선택적으로 면역접합체를 생성하기 위해 하나 이상의 세포독성 약물(들)로 접합될 수 있다. 또한, 상기 인간화 항체 또는 친화성이 성숙된 항체는 비손상 IgG1 항체와 같은, 비손상 항체일 수 있다.
다양한 기술이 인간화 항체의 항체 단편을 생산하기 위해 개발되었다. 전통적으로, 이러한 단편들은 비손상 항체의 단백질 분해 효소 처리를 통해 유래되었다(예를 들면, Morimoto et al., Journal of Biochemical 및 Biophysical Methods, 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985) 참조). 하지만, 이러한 단편들은 이제 재조합 숙주 세포에서 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체 단편들은 상기 언급된 항체 파지(phage) 라이브러리(libraries)로부터 분리될 수 있다. 또한, Fab'-SH 단편은 E.coli로부터 직접적으로 회수되거나, 화학적으로 F(ab')2 단편의 형태로 결합될 수 있다(Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). 다른 접근방식에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 다른 기술들은 숙련된 전문가에게 자명할 것이다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 선택된 항체는 단쇄 Fv 항체(scFv)이다. WO 1993/16185; U.S. Pat. No. 5,571,894; 및 U.S. Pat. No. 5,587,458을 참조한다. 상기 항체 단편은 또한 예를 들면, U.S. Patent No. 5,641,870에 기재된 "선형 항체"일 수 있다.
다른 접근방식에 따르면, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체-가변 도메인(항원-항체 결합 부위)은 면역글로불린 불변-도메인 서열에 융합될 수 있다. 상기 융합은 힌지(hinge), CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 가지는 것이 바람직하다. 적어도 하나의 융합에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는, 첫번째 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 상기 면역글로불린 중쇄 융합을 코딩하는 DNA 및, 상기 면역글로불린 경쇄는 원하는 경우, 분리된 발현 벡터안으로 삽입되거나, 적절한 숙주 생물에 공동-형질도입된다. 이것은 상기 구조에서 사용된 세 개의 폴리펩티드 사슬의 동일하지 않은 비율(ratio)이 최적화된 양을 제공할 때, 실시태양에서 세 개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는 유연성을 제공한다. 하지만, 동일한 비율에서 적어도 두 개의 폴리펩티드 사슬이 높은 양으로 발현될 때 또는 상기 비율이 특별히 중요한 의미가 아닐 때, 한 개의 발현 벡터 내 두 개 또는 세 개의 폴리펩티드 사슬의 코딩 서열이 삽입될 수 있다.
상기 개시는 또한 화학요법제, 독소(예를 들면, 단편 및/또는 그의 변이체를 포함하는 소-분자 독소 또는 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 원료의 효소 활성 독소) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성접합체)와 같은 세포살상제에 접합되는 항체를 포함하는 면역접합제와 관련된다.
본 개시는 항체와 핵자간의 활성(nucleolytic activoty)을 갖는 화합물 사이에 형성되는 면역접합체를 추가로 고려한다(예를 들면, 리보뉴클레이즈 또는 디옥시리보뉴클레이즈;DNase와 같은 DNA 엔도뉴클레이즈).
다양한 방사성 동위원소를 방사성접합된 인간화 vWF 항체의 생산에 이용한다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다.
상기 항체 및 세포살상제의 접합은 엔-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트[N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol) propionate(SPDP)], 숙시니미딜-4-(엔-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카복시레이트[succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate], 이미노티올란[iminothiolane (IT)], 이미도에스테르(imidoesters)의 두 가지 기능의 유도체(디메틸 아디피미데이트 HCL(dimethyl adipimidate HCl)과 같은), 활성 에스테르(디숙시니미딜 수버레이트(disuccinimidyl suberate)와 같은), 알데하이드(aldehydes) (글루타르엘데하이드(glutareldehyde)와 같은), 비스 아지도(bis-azido) 화합물[비스(피-아지도벤조일) 헥산디아민(bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine], 비스-디아조니움(bis-diazonium) 유도체[비스-(피-디아조니움벤조일)-에틸렌디아민(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine)과 같은], 디이소시아네이트(diisocyanates)[토일렌 2,6-디이소시아네이트(tolyene 2,6-diisocyanate)와 같은], 및 비스-활성 플루오린(bis-active fluorine) 화합물[1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene)과 같은]와 같은 다양한 종류의 두 가지 기능을 가진 단백질 결합제를 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 리신(ricin) 면역독소는 Vitetta et al. Science, 238: 1098 (1987)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아미네펜다아세트산(1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid (MX-DTPA))은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합하는 전형적인 킬레이트제(chelating agent)이다. WO 1994/11026을 참조한다. 상기 링커(llinker)는 세포 내 세포살상제의 방출을 조장하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산성(acid)에 불안정한 링커, 펩티데이즈에 민감한 링커, 디메틸(dimethyl)링커, 또는 이황화물을 포함한 링커(Chari et al. Cancer Research, 52: 127-131 (1992))가 사용될 수 있다.
또한, 상기 인간화 vWF 항체 및 세포살상제를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들면 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다.
또다른 실시태양에 있어서, 상기 인간화 vWF 항체는 종양 예비 표적화에 사용되는 "수용체"(스트렙타비딘(streptavidin)과 같은)에 접합될 수 있고, 상기 항체-수용체 접합체는 환자에 투여되고, 세척제를 사용한 순환에 의한 결합하지 않은 접합제를 제거한 다음, 이후 세포살상제(예를 들면, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드(ligand)"(예를 들면 아비딘(Avidin))가 투여된다. 본 개시의 상기 항체들은 또한 전구약물(예를 들면, 펩티딜 화학요법제, WO1981/01145 참조)을 활성 항암제(예를 들면, WO 1988/07378 및 미국특허번호 4,975,278 참조)로 변환하는 전구약물-활성화 효소에 상기 인간화 vWF 항체의 접합에 의한 ADEPT에서 사용될 수 있다.
ADEPT에 사용되는 면역접합체의 상기 효소 구성요소는 더 활성화되고, 독성화된 형태로 변화하는 이러한 방법에서 전구약물을 활성화할 수 있는 어떠한 효소를 포함한다.
사용되는 효소들은 인산을 포함하는 전구약물을 프리(free) 드러그(drug)로 변환하는 데 이용하는 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase); 황산을 포함하는 전구약물을 프리(free) 드러그(drug)로 변환하는 데 이용하는 아릴설파타제(arylsulfatase); 비-독성 5-플루오로사이토신(5-fluorocytosine)을 항암제, ５-플루오로우라실(5-fluorouracil)로 변환하는데 이용하는 시토신 디아미네이즈 (cytosine deaminase); 펩티드를 포함하는 전구약물을 프리(free) 드러그(drug)로 변환하는데 이용하는 세라티아(serratia) 단백질 분해 효소, 테르몰리신(thermolysin), 서브틸리신(subtilisin), 카르복시펩티다아제(carboxypeptidases) 및 카뎁신(cathepsin)(카뎁신 B 및 L과 같은)과 같은, 단백질 분해 효소; β아미노산 치환기를 포함하는 전구약물을 변환하는데 이용하는, D-알라닐카복시펩티데이즈(D-alanylcarboxypeptidases); 당화된 전구약물을 프리(free) 드러그(frug)로 변환하는데 이용하는 베타-갈락토시다제(β-galactosidase) 및 뉴라미니다제(neuraminidase)와 같은 탄수화물 절단 효소(carbohydrate cleaving enzyme); β-락탐 유도체를 합성하는 드러그(drug)를 프리(free) 드러그(frug)로 변환하는데 이용하는 β-락타마제 (β-lactamase); 및 페옥시아세틸(phenoxyacetyl)기 또는 페닐아세틸(phenylacetyl)기를 가지는 그 아민기 질소 유도체를 합성하는 드러그(drug)를, 각각, 프리(free) 드러그(drug)로 변환하는데 이용하는 페니실린(penicillin) V 아미다제(amidase) 또는 페니실린(penicillin) G 아미다제(amidase)와 같은 페니실린(penicillin) 아미다제(amidase)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 당업계에서 "abzymes(항체효소)"으로 알려진 효소활성을 가지는 항체는 본 개시의 전구약물을 프리(free) 액티브(active) 드러그(drug)로 변환하는데 이용될 수 있다. 항체-효소 접합체는 항체효소(abzyme)를 종양 세포 집단에 전달하기 위해 본 명세서에 기재된 것가 같이 제조될 수 있다.
효소는 상기 논의된 헤테로 이작용성(heterobifunctional) 가교성(crosslinking) 반응물질(reagent)의 사용과 같이 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 상기 인간화 vWF 항체에 공유결합적으로 결합될 수 있다. 또한, 최소한 적절한 효소의 기능적으로 활성화된 부분이 연결된 본 개시의 항체의 항원-결합 영역을 최소한 포함하는 융합 단백질은 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성될 수 있다(예를 들면, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984) 참조).
여기에서 항체의 다양한 변형이 고려된다. 예를 들면, 항체는 다양한 비단백질 폴리머, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 폴리옥시알킬렌(polyoxyalkylenes), 또는 폴리에틸렌 글리콜((polyethylene glycol) 및 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol)의 공중합체(copolymer) 중 하나에 연결될 수 있다. 또한 상기 항체는 콜로이드성 약물-전달 시스템(예를 들면, 리포좀(리포좀), 알부민(albumin) 마이크로스피어(microsphere), 마이크로에멀전(microemulsion), 나노-파티클(nano-particle) 및 나노캡슐(nanocapsule)), 또는 메크로에멀전(macroemulsion)에서 예를 들면, 코아세르베이션(코아세르베이션) 기술 또는 계면 중합 방법(interfacial polymerization)에 의해 제조된 마이크로캡슐(microcapsule)(예를 들면, 각각, 하이드록시메틸셀룰로오스(hydroxymethylcellulose) 또는 젤라틴(gelatin)-마이크로캡슐 및 폴리-(메타크릴산 메틸)(poly-(methylmethacylate)) 마이크로 캡슐)안에 포함될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's 약학적 Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)에 기재되어 있다.
또한 본 명세서에 기재된 상기 인간화 vWF 항체는 면역리포좀(immuno리포좀)으로 만들어질 수 있다. 상기 항체를 포함하는 리포좀은 Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 미국 특허번호 4,485,045 및 4,544,545; 및 1997년 10월 3일에 발표된 WO 1997/38731에 기재된 바와 같은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 순환 시간이 증가된 리포좀은 미국 특허번호 5,013,556에 기재되어 있다.
특별히 사용된 리포좀은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 콜레스테롤(cholesterol) 및 PEG에서 합성된 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)(PEG-PE)을 포함하는 액상 조성물을 이용한 역상 증발 방법(reverse-phase evaporation method)에 의해 만들어 질 수 있다. 리포좀은 원하는 직경의 리포좀을 얻기 위해, 정해진 기공 크기의 필터를 통하여 밀어낸다. 본 개시의 상기 항체의 Fab' 단편은 디설피드-교환 반응(disulfide-interchange reaction)을 통한 Martin et al. J. Biol. Chem., 257: 286-288(1982)에 기재된 것과 같은 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제는 선택적으로 리포좀 안에 포함된다. Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)을 참조한다.
벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법
본 개시는 vWF에 특이적인 인간화 항체 및 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산, 상기 핵산, 및 항체 또는 그의 결합 단편을 생산하기 위한 재조합 기술을 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
항체의 재조합 생산을 위해, 이를 코딩하는 상기 핵산은 분리될 수 있고, 추가적인 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 단일클론 항체를 코딩하는 DNA는 종래 방법(예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 결합 특이성을 부여하는 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용에 의해)을 이용하여 분리되고 염기서열분석될 수 있다. 많은 벡터가 이용된다. 벡터 구성요소는 일반적으로, 하기: 신호 서열, 복제 개시점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서(enhancer) 소자, 프로모터, 및 전사-종결 서열 중 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
(i) 신호 서열 구성요소
명세서에 기재된 인간화 vWF 항체는 직접적일 뿐 아니라, 외래 폴리펩티드와 융합 폴리펩티드로써 재조합하여 생산될 수 있고, 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드는 상기 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 것이 바람직하다. 외래 신호 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인지되고 진행되는 것(즉, 신호 펩티데이즈에 의해 절단)일 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 원래 형태의 인간화 vWF 항체의 신호 서열은 인지되고 진행될 수 없으므로, 상기 신호 서열은 예를 들면, 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase), 페니실리네이즈(penicillinase), lpp, 또는 열에 안정한 엔테로독소(enterotoxin) II 리더(leader)로 이루어진 군으로부터 선택된 원핵 신호 서열에 의해 치환될 수 있다. 효모에서 분비를 위한 원래 형태의 신호 서열은 예를 들면, 효모 자당 분해 효소 리더(leader), 알파-팩터(α-factor) 리더(leader)(Saccharomyces 및 Kluyveromyces α-factor 리더를 포함), 산 포스파타아제(acid-phosphatase) 리더, C. albicans 글루코아밀라제(glucoamylase)리더, 또는 WO 1990/13646에 기재된 신호에 의해 치환될 수 있다. 포유류 세포 발현에서, 포유류 신호 서열뿐 아니라 바이러스 분비 리더로는 예를 들면, 허피스 심플렉스(herpes simplex) gD 신호가 이용된다.
이러한 전구체 영역을 위한 DNA는 인간화 vWF 항체를 코딩하는 DNA의 리딩 프레임(reading frame)에 연결될 수 있다.
(ii) 복제 개시점 구성 요소
발현 및 클로닝(cloning) 벡터 모두에는 하나 이상의 선택한 숙주 세포에서 벡터가 복제될 수 있도록 해주는 핵산 서열이 포함되어 있다. 일반적으로, 벡터 복제에서 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있도록 해주는 서열로, 여기에는 복제 기점 또는 자체 서열 복제가 포함될 수 있다. 해당 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에서 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기점은 대다수 그람 음성(gram-negative) 박테리아에 적합가고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하며, 여러 바이러스 기점(SV40, polyoma, adenovirus, VSV 또는 BPV)은 포유류 세포에서 벡터를 복제하는 데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 구성요소는 포유류 발현 벡터에서 필요하지 않는다(SC40 기점은 초기 프로모터를 포함하고 있기 때문에 보통 사용될 수 있음).
(iii) 유전자 구성 요소의 선별
발현 및 복제 벡터에는 선택 가능 표식이라고도 하는 선택 유전자가 포함될 수 있다. 일반적인 선택 유전자는 (a) 항생 물질이나 다른 독소, 예를 들면, 암피실린(ampicillin), 네오마이신(neomycin), 메토트랙세이트(methotrexate), 또는 테스라싸이클린(tetracycline)에 대한 내성을 제공하는 단백질, (b) 영양요구성 결핍을 보충하는 단백질, 또는 (c) 복합 배지에서는 사용할 수 없는 필요하거나 요구되는 영양분을 공급하는 단백질, 예를 들면, Bacilli용 D-알라닌(alanine) 라세미화 효소(racemase)를 암호화하는 유전자를 암호화한다.
선택 체계 중 한 가지 예에서는 숙주세포의 성장을 억제하는 약제를 사용한다. 이종성 유전자로 성공적으로 변형된 해당 세포들은 약제 내성을 주는 단백질을 생성하고 선택 섭생보다 오래 생존한다. 그러한 우세한 선택의 예에서는 네오마이신(neomycin), 미코페놀산(mycophenolic acid)및 하이그로마이신(hygromycin)과 같은 약제를 사용한다.
포유류 세포에 적합한 선택 가능 표식의 다른 예로는 DHFR, thymidine kinase, metallothionein-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 metallothionein 유전자, 아데노신 디아미나제(aderosine deaminase), 오르니친 데카르복실라제(ornithine decarboxylase), 등과 같은 인간화 vWF 항체를 코딩하는 핵산을 선택하는 능력이 있는 세포를 식별하도록 해주는 표식이 있다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 DHFR의 경합 길항제인 methotrexate(Mtx)를 함유한 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 가장 먼저 식별된다. 야생형(wild-type) DHFR을 사용할 경우 적절한 숙주세포는 DHFR 작용이 결핍되어 있는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다.
또는, 인간화 vWF 항체를 암호화하는 DNA 서열, 야생형 DHFR 단백질 및 aminoglycoside 3'-phosphotransferase (APH)와 같은 다른 선택 가능 표식으로 변형되거나 공동 변형된 숙주세포(특히 내인성 DHFR을 함유한 야생형 숙주세포)를 aminoglycosidic 항생제, 예를 들면, 카나마이신(kanamycine), 네오마이신(neomycin), 또는 G418과 같은 선택 가능 표식용 선택 약제가 있는 배지에서 세포를 배양시켜 선택할 수 있다(예를 들면, 미국 특허번호 4,965,199 참조).
효모에서 사용하기에 적합한 한 가지 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다(Stinchcomb et al., Nature , 282:39 (1979). 상기 trp1 유전자는 트립토판(tryptophan), 예를 들면, ATCC No. 44076 또는 PEP4- 1. Jones, 유전자tics , 85:12 (1977)에서 성장할 능력이 부족한 돌연변이 효모 균주를 위한 선택 마커를 제공한다. 효모 숙주세포 게놈에 trp1 병변이 있으면 트립토판이 존재하는 가운데 성장함으로써 형질전환을 감지하기에 효과적인 환경을 제공하게 된다. 유사하게, Leu2 유전자 결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 보유한 공지된 플라스미드를 통해 보충될 수 있다.
또한, 1.6-um 원형 플라스미드 pKD1에서 유래된 벡터는 Kluyveromyces 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 또는, 재조합 송아지 키모신(chymosin)의 대량 생성을 위한 발현체계가 K. lactis. Van den Berg, Bio / Technology , 8:135 (1990)에 보고된 바 있다. 산업용 Kluyveromyces 균주를 통한 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위한 안정된 다중 복사 발현 벡터도 알려져 있다. Fleer et al., Bio/Technolog, 9: 968-975 (1991) 참조.
(iv) 프로모터 구성요소
발현 및 복제 벡터에는 보통 숙주 유기체에서 인식할 수 있는 프로모터를 포함하고 있고, 상기 인간화 vWF 항체를 암호화하는 핵산에 연결될 수 있다. 원핵 숙주로 사용하기에 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, β-lactamse 및 락토오즈(lactose) 프로모터 체계, 알칼리성 인산분해효소, 트립토판(trp) 프로모터 체계, 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터가 포함되어 있다. 그러나, 알려져 있는 다른 박테리아 프로모터도 적합할 수 있다. 또한 박테리아 체계에서 사용할 수 있는 프로모터에는 인간화 vWF 항체를 암호화하는 DNA에 연결된 Shine-Dalgarno (S.D.) 서열을 포함할 수 있다.
프로모터 서열은 진핵세포에서 알려져 있다. 진핵 유전자에는 전사가 시작되는 부위에서 약 25-30개 기저부 상부에 위치한 AT-rich 부위가 있다. 전사 시작부터 70-80개 기저부 상부에 있는 또 다른 서열은 CNCAAT(서열번호: 31) 부위이고, 여기서 N은 모든 뉴클레오티드가 될 수 있다. 대부분의 진핵 유전자의 3' 말단은 암호화 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리를 추가하기 위한 신호가 될 수 있는 AAATAA(서열번호: 32) 서열이다. 이러한 서열은 진핵 발현 벡터에 적절하게 삽입될 수 있다. 효모 숙주세포에서 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나아제(3-phosphoglycerate kinase) 또는 에놀라제(enolase)와 같은 기타 당분해 효소용 프로모터, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 헥소키나아제(hexokinase), 피루베이트 디카르복실라제(pyruvate decarboxylase), 포스포프럭토키나아제(phosphofructokinase), 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제(glucose-6-phosphate isomerase), 3-포스포글리세레이트 뮤타아제(3-phosphoglycerate mutase), 피루베이트 키나아제(pyruvate kinase), 트리오세포스페이트 아이소머라아제(triosephosphate isomerase), 포스포글루코스 아이소머라제(phosphoglucose isomerase) 및 글루코키나아제(glucokinase) 등이 있다.
성장 조건을 통해 제어되는 전사의 추가 이점을 지닌 유도 가능 프로모터가 되는 다른 효모 프로모터로는 알코올 디하이드로게나아제 2(alcohol dehydrogenase 2), 아이소시토크롬 C(Isocytochrome C), 에시드 포스파타아제(Acid Phosphatase), 질소 대사와 관련된 축퇴성 효소, 메탈로시오네인(metallothionein), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), 및 말토오즈 및 갈락토오스 활용을 담당하는 효소를 위한 프로모터 부위가 될 수 있다. 효모 발현에서 사용하기에 적절한 벡터와 프로모터는 예를 들면, 유럽특허번호 73,657에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 효과적으로 사용된다.
포유류 숙주세포에서 벡터의 인간화 vWF 항체 전사는 예를 들면, 폴리오마(polyoma) 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(Adenovirus 2와 같은), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포 바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스에 의해, 가장 바람직하게는 시미언 바이러스 40(simian virus 40), 예를 들면, 액틴(actin) 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터와 같은 이종성 포유류 프로모터, 및 열 충격 프로모터에 의해 제어될 수 있고, 이러한 제공된 프로모터는 상기 숙주 세포 체계와 호환된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점 또한 포함하고 있는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 확보될 수 있다. 인간 거대세포바이러스의 현재 초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 확보된다. 벡터로서 소 유두종 바이러스를 사용하는 포유류 숙주세포에서 DNA를 발현하기 위한 체계는 예를 들면, 미국 특허번호 4,419,446에 나와 있다. 이러한 체계의 변형은 예를 들면, 미국 특허번호 4,601,978에 기재되어 있다. Reyes et al ., Nature , 297:598-601 (1982)에는 단순 허피스(herpes) 바이러스로부터 유래한 티미딘(thymidine) 키나제(kinase) 프로모터의 제어 하에서 인간 β인터페론(interferon) cDNA의 마우스 세포 내 발현에 대해 기재되어 있다. 또는, 라우스 육종 바이러스 LTR(long-terminal repeat)를 프로모터로서 사용할 수도 있다.
(v) 인핸서(enhancer) 요소 구성 요소
고등 진핵세포에 의한 본 개시의 인간화 vWF 항체를 암호화하는 DNA의 전사는 인핸서(enhancer) 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수도 있다. 현재 다양한 인핸서 서열은 포유류 유전자(글로빈(globin), 엘라스타제(elastase), 알부민, α-태아 단백질, 인슐린)에서 알려져 있다. 그러나, 흔히 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서 서열이 사용될 수도 있다. 그 예로는 복제 기점(bp 100-270)의 만기(late side) 측에 있는 SV40 인핸서, 거대세포바이러스 초기-프로모터 인핸서, 복제 기점의 만기 측에 있는 폴리오마(polyoma) 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, Yaniv, Nature , 297:17-18 (1982)에서 진핵 프로모터 활성화를 위한 강화 요소에 대해서 기재되어 있다. 인핸서는 인간화 vWF 항체를 암호화하는 서열에 대해 위치 5' 또는 3'에서 벡터에 접합될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터의 부위 5'에 있다.
(vi) 전사 종결 구성 요소
진핵 숙주세포(효모, 균류, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 기타 다세포 유기체의 유핵세포)에서 사용되는 발현 벡터에도 전사를 종결하고 mRNA를 안정화하는 데 필요한 서열이 포함될 수 있다. 그러한 서열은 진핵세포 또는 바이러스 DNA나 cDNA의 UTR(untranslated region, 비해독 부위)인 5' 말단, 선택적으로 3' 말단에서 일반적으로 사용할 수 있다. 이러한 부위는 인간화 vWF 항체를 암호화하는 mRNA의 UTR에 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 조각을 함유하고 있다. 유용한 한 가지 전사 종결 구성요소는 소 성장호르몬 폴리아데닐화 부위이다(예를 들면, WO94/11026와 이 문서에 설명된 발현 벡터 참조)
(vii) 숙주 세포의 선별 및 형질전환
벡터에서 DNA를 복제 및 발현하기에 적절한 숙주세포는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵세포에는 그람 음성(gram-negative) 또는 그람 양성(gram-positive) 유기체를 포함한 진정세균, 대장균 속과 같은 Enterobacteriaceae(예: E.coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르비니아균속, 클레프시엘라균, 프로테우스균, 살모넬라균(예: Salmonella typhimurium ), 세라티아속(예: Serratia marcescans) 및 시겔라뿐만 아니라 B. subtilis 및 B. licheniformis와 같은 바실루스, P. aeruginosa와 같은 슈도모나스균, 스트렙토미세스가 있다. 적합한 E.coli 복제 숙주에는 E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), 및 E. coli W3110 (ATCC 27,325)가 있다.
원핵세포에 추가하여, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 인간화 vWF 항체를 암호화하는 벡터에 적합한 복제 또는 발현 숙주이다. Saccharomyces cerevisiae 또는 일반적인 빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중에서도 가장 흔히 사용된다. 또한, 다양한 수의 기타 속(유전자ra), 종(species), 및 계통을 흔히 사용할 수 있고, 유용할 수 있는데, 그러한 예로는 Schizosaccharomyces pombe ; K. lactis , K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, 및 K. marxianus ; yarrowia (EP 402,226)와 같은 Kluyveromyces 속 균주; Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa ; Schwanniomyces occidentalis와 같은 Schwanniomyces 속; 및 예로, Neurospora , Penicillium , Tolypocladium와 같은 사상 진균류(filamentous fungi), 및 A. nidulans 및 A. niger와 같은 Aspergillus 숙주세포가 있다.
글루코실화된 인간화 vWF 항체의 발현에 적절한 숙주세포는 다세포 유기체에서 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물, 곤충 및 척추동물 세포를 포함한다. 많은 베큘로바이러스 균주와 변이체 및 Spodoptera frugiperda (쐐기벌레), Aedes aegypti (모기), Aedes albopictus (모기), Drosophila melanogaster (광대파리), 및 Bombyx mori와 같은 숙주세포의 해당 감수성 곤충 숙주세포가 동정되었다. Autographa californica NPV의 L1 변이체 및 Bombyx mori NPV의 Bm-5 균주를 비롯하여 형질도입을 위해 다양한 바이러스 균주를 공개적으로 사용할 수 있으며, 그러한 바이러스는 본 개시에 따른 본 명세서에 기재된 바이러스를 특별히 Spodoptera frugiperda 세포의 형질전환용으로 사용할 수 있다.
목화, 옥수수, 감자, 콩, 피튜니아 토마토 및 담배의 식물 세포 배양도 숙주세포로서 활용할 수도 있다.
그러나, 그 동안 척추동물 세포가 가장 큰 관심 대상이었고, 다양한 포유류 세포를 포함한 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주세포주의 예로는ChK2 세포(Chromos Molecular Systems Inc.); SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포(현탁 배양에서 성장하도록 하위 복제된 인간 배아 신장 라인 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol ., 36:59 (1977)); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 인간 배아 신장(HEK) 293 세포(Simmons, 1990 Exp Physiol. 75:309); SP2 비장-골수종 융합 세포(Haas 및 Wabl, 1984, PNAS 81:7185); DHFR이 부족한 중국 햄스터 난소 세포(CHO, Urlaub et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 77:4216 (1980), DG44(Urlaub et al., Som . Cell 및 Mol . Gen., 12: 555-566 (1986) 및 DP12 세포주를 포함); 마우스 sertoli 세포(TM4, Mather, Biol . Reprod., 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al ., Annals N.Y. Acad . Sci ., 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 라인(Hep G2)이 있다. 숙주세포는 인간화 vWF 항체 생성을 위한 위에서 설명한 발현 또는 복제 벡터로 형질전환되고 프로모터를 유도하기에 적절하게 변형된 기존 영양 배지에서 배양되어 형질전환체를 선별하거나 원하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시킨다.
항체의 높은 수준의 발현에 적합한 세포주가 본 개시의 인간화 항체의 생산에도 사용될 수 있다. 예를 들면, 다양한 부위-특이적, 재조합 수용체 부위를 포함하도록 설계된 쥐과 인공 염색체 발현(ACE) 플랫품(platform)에 기초한 높은 수율을 갖는 포유동물 단백질 발현 체계는 표적화된 셔틀(shuttle) 벡터를 포함한 재조합에서 돌연변이 람다(lambda) 인테그라제(integrase)(예를 들면, ACE 인테그라제)를 사용하여 비상동 유전자 서열로 로딩(loading)될 수 있다(Lindenbaum et al, (Nucl . Acid Res. 32 (21):e172 (2004); 미국 공개특허번호: 2003/0119104A1 및 2006/0246586 A1). 이러한 체계는 선별된 인간화 변이체 및 상기 NMC-4 키메라의 발현을 위한 안정적인 세포주 확립에 응용될 수 있다.
(viii) 숙주 세포 배양
인간화 vWF 항체를 생산하는 데 사용되는 숙주세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma)과 같은 시판 중인 배지는 숙주세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 예를 들면, Ham et al ., Meth . Enz . 58:44 (1979); Barnes et al ., Anal . Biochem ., 102:255 (1980); 미국 특허번호. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 1990/03430; WO 1987/00195; 또는 미국 특허번호. 30,985에 설명된 모든 배지는 숙주세포의 배지로 사용될 수 있다. 이러한 모든 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자(예를 들면, insulin, transferrin, 또는 epidermal growth factor), 염(예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제(예를 들면, HEPES), 뉴클레오티드(예를 들면, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들면, GENTAMYCINTM 약제), 미량원소(마이크로몰 범위에서 대개 최종농도에 존재하는 무기화합물로 정의) 및 포도당 또는 이에 준하는 에너지원이 보충될 수 있다. 기타 모든 필요한 보충물도 당업자에게 잘 알려져 있는 적절한 농도에서 포함시킬 수 있다. 온도, pH 등과 같은 다양한 배양 조건이 발현을 위해 선택한 숙주세포에서 사용될 수 있다.
(ix) 인간화 vWF 항체의 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포 내 또는 세포질형 공간, 또는 배지 내로 직접적으로 분비되어 생산될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되는 경우, 첫 번째 단계로, 미세입자, 숙주 세포 또는 용해된 단편 모두는 예를 들면, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거될 수 있다. Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)은 E.coli의 세포질형 공간에서 분비되는 항체를 분리하는 방법에 대해 기재하고 있다. 구체적으로, 세포 페이스트(paste)를 아세트산 나트륨(pH 3.5), EDTA, 및 phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)에 30분 이상 녹인다. 세포 찌꺼기는 원심분리를 통해 제거될 수 있다. 항체가 배지내로 분비되는 경우, 이러한 발현 체계로부터 얻어진 상등액은 일반적으로 처음에 예를 들면, AMICONTM 또는 MILLIPORE PELLICONTM 한외여과 유닛의 시중에서 구매할 수 있는 단백질 농축 필터를 사용하여 원심분리한다. phenylmethylsulphonyl fluoride(PMSF)와 같은 단백질 분해 효소 저해제가 이전의 모든 단계에 단백질 분해 저해를 위해 포함될 수 있고, 항생제는 우발적인 오염물질에 의한 성장을 방지하기 위해 포함될 수 있다.
세포로부터 준비된 항체 조성물은 예를 들면, 수산화아파타이트(hydroxylapatite) 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피, 선호되는 정제 기술인 친화성 크로마토그래피를 함께 이용하여 정제될 수 있다. 친화력 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 있는 모든 면역글로불린 Fc 영역의 동종형과 종에 따라 달라진다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ3 중쇄에 기반해 있는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 마우스 동종형과 인간 γ3에 유용하다(Guss et al., EMBO J., 5:15671575 (1986)). 친화력 리간드가 연결된 기질은 가장 흔히 아가로즈이지만, 다른 기질이 사용할 수 있다. 다공성 유리(CPG) 또는 폴리(스티렌디비닐) 벤젠과 같이 역학적으로 안정적인 기질에서는 아가로즈로 확보할 수 있는 것보다 빠른 유속이 가능하고 처리 시간이 단축된다. 항체가 CH3 영역을 포함하는 경우, BAKERBOND ABX 레진(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용할 수 있다. 이온교환 칼럼의 분획법, 에탄올 침전법, 역상 HPLC, 실리카의 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSETM의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환수지의 크로마토그래피(예: 폴리 아스파르트산 칼럼), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법과 같은 단백질 정제를 위한 기타 방법들이 회수된 항체에 따라 이용될 수도 있다.
약학적 제형
vWF에 특이적인 인간화 항체를 포함하는 약학적 제형이 제공된다. 인간화 vWF 항체의 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 항체를 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 또는 안정제(Remington's 약학적 Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 동결 건조된 제형이나 수용성 용액 형태로 보관 가능하도록 제조할 수 있다. 허용 가능한 담체, 부형체 또는 안정제는 사용한 농도와 투약량에서 수용자에세 무독성이며, 여기에는 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산과 메티오닌(methionine)을 포함하는 산화방지제; 보존제(예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 염화(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride); 헥사메토니움 클로라이드(hexamethonium chloride); 벤잘코니움 클로라이드(benzalkonium chloride), 벤제호니움 클로라이드(benzethonium chloride); 페놀(phenol), 부틸기 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤(paraben)과 같은 알킬 파라벤(paraben); 카테콜(catechol); 레조시놀(resorcinol); 시클로헥사놀(cyclohexanol); 3-펜타놀(3-pentanol); 및 엠-크로솔(m-cresol)); 낮은 분자량(약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)과 같은 친수성 폴리머; 글리신(glycine), 글루타민(glutamine), 아스파라긴(asparagine), 히스티딘(histidine), 알지닌(arginine), 또는 라이신(lysine)과 같은 아미노산; 글루코스(glucose), 만노스(mannose) 또는 덱스트린(dextrin)을 포함하는 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트 화합물 약제; 자당, 만니톨(mannitol), 트레할로즈(trehalose) 또는 솔비톨(sorbitol)과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대이온; 금속 복합체(예를 들면 Zn-단백질 복합체); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol (PEG))과 같은 비이온 계면활성제를 포함한다. 동결건조된 인간화 vWF 제형은 WO 1997/04801에 기재되어 있는 것이 바람직하고, 인용문헌에 의해 본 명세서에 참조로 통합된다.
항체 제형은 치료 중인 특정 증상을 위해 1개 이상의 활성 화합물을 함유할 수도 있고, 바람직하게는 서로에게 나쁜 영향을 미치지 않는 보체 활성화를 갖는 화합물이다. 또한, 추가적으로, 상기 조성물은 화합요법제, 세포살상제, 싸이토카인, 성장 저해제, 항호르몬제, 인간화 vWF 약물, 항알러지제, 및/또는 심장보호제가 추가로 포함될 수 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 효과적인 분량으로 결합하여 적절히 존재한다.
또한 콜로이드 약제전달체계(예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어(microspheres), 마이크로에멀전(microemulsions), 나노입자 또는 나노캡슐)에서나 매크로에멀전(macroemulsion)에서 코아세르베이션(coacervation) 기법이나 계면 중합, 예를 들면, 각각, 하이드록시메틸셀룰로스(hydroxymethylcellulose)나 젤라틴-마이크로캡슐(gelatin-microcapsules)과 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로 캡슐(poly-(methylmethacylate) microcapsules)을 통해 활성 성분을 준비한 마이크로캡슐에 넣을 수 있다. 해당 기법은 Remington's 약학적 Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다.
서방형(Sustained-release) 제조품을 제조할 수 있다. 서방형 제조품의 적절한 예로는 항체를 함유한 고체 소수성 폴리머의 반투성 기질을 포함하고, 이러한 기질은 예를 들면, 엷은 막이나 마이크로캡슐과 같은 모양을 갖춘 품목 형태이다. 서방형 기질의 예로는 폴리에스테르(polyester), 히드로겔(hydrogel)[예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate)) 또는 폴리(비닐알콜)(poly(vinylalcohol))], 폴리락타이드(polylactide)(미국 특허번호 3,773,919), L-글루탐산(L-glutamic acid)과 γ에틸-L-글루타메이트(ethyl-L-glutamate)의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(EVA)(ethylene-vinyl acetate), Lupron DepotTM(젖산-글리콜산(glycolic acid) 공중합체와 류프롤라이드 아세테이트(leuprolide acetate)를 포함하는 주사 가능한 마이크로스피어)와 같은 분해성 젖산-클리콜릭산(lactic acid-glycolic acid) 공중합체, 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid)이 있다.
생체 내 투여에 사용되는 제형은 멸균되어야만 한다. 이것은 멸균 여과막 등을 통한 여과로 쉽게 수행할 수 있다.
인간화 vWF 항체 치료제
인간화 vWF 항체 또는 이의 결합 단편은 vWF에 의해 매개된 다양한 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다. 일반적인 상태 또는 장애는 혈전성 질환 또는 장애를 포함한다. 혈전성 질환 또는 장애는 심장 혈관 질환 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 뇌혈관 장애를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 심장 혈관 질환은 동맥경화증, 재협착, 협심증, 급성 심근 경색, 급성 관상동맥 증후군 또는 당뇨병과 연관된 심장혈관계 장애일 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 혈전성 질환은 혈관 염증, 정맥 혈전증, 겸상적혈구 질환, 이종 이식 거부, 말초 혈관질환, 혈전성 혈소판 감소성 자반증, 낭포성 섬유증, 혈관성 치매, 레이노병, 류마티스 관절염 또는 당뇨병일 수 있다. 일부 실시태양에 있어서, 뇌혈관 장애는 작은 열공성 경색뿐 아니라 대뇌 동맥 경색의 결과인 허혈성 뇌졸중, 및 혈관성 치매를 포함한다. 인간화 vWF 항체는 재발성 뇌졸중 또는 뇌혈관 염증에 의해 일어나는 초기 뇌졸중의 예방에도 사용될 수 있다. 급성 관상동맥 증후군의 경우에, 상기 인간화 vWF 항체 또는 그의 결합 단편은 특히 환자의 ST-세그먼트(segment)로 진단된 환자의 치료에 적합하다. 상기 인간화 vWF 항체 또는 그의 결합 단편은 혈전 형성을 막기 위한 수술후 치료에도 사용될 수 있다.
더구나, vWF 과발현 또는 증폭은, 예를 들면 검출될 수 있는 분자에 결합하거나 검출할 수 있는 표지(예를 들면 방사성 동위원소)가 태깅(tagging)된 분자(항체와 같은)의 투여 및 표지의 위치화를 위한 환자의 외부 스캐닝(scanning)에 의한 생체 내 진단 분석법을 사용하여 평가될 수 있다.
특정 실시태양에 있어서, 세포살상제가 접합된 인간화 vWF 항체를 포함하는 면역접합체는 환자에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 세포에 의해 결합하고, 내부화되는 면역접합체 및/또는 인간화 vWF 항체는 그것이 결합하여 암 세포를 죽이는 면역접합체의 치료 효과를 증가시킨다. 바람직한 실시태양에 있어서, 세포살상제[예를 들면, 메이탄시노이드 (maytansinoid), 칼리키아미신(calicheamicin), 리보뉴클리아제(ribonuclease), 및 DNA 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 포함하는)는 암 세포에서 핵산을 표적화하고 간섭한다. 또다른 실시태양에 있어서, 세포살상제[예를 들면, 탁산(taxan) 또는 에포싸일론(Epothilone)]는 암세포에서 미소관(Microtubule) 및 미소관(Microtubule) 의존적인 세포분열을 표적화하고 간섭할 수 있다.
인간화 vWF 항체 또는 면역접합체는 정맥내 투여와 같은, 예를 들면, 볼루스(bolus)로 또는 시간 간격에 따른 연속된 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 수강내, 구강내, 국소, 또는 흡입 경로에 의해 알려진 방법에 따라 인간 환자에 투여될 수 있다. 상기 항체는 정맥내, 복강내, 또는 피하로 투여하는 것이 바람직하고, 피하 또는 복강내 경로가 더욱 바람직하다. 바람직한 투여 일정은 치료받는 특정 포유류, 항체의 종류, 및 당업자에게 잘 알려진 다양한 인자에 따라, 급성 장애일 경우 단회, 또는 만성 장애일 경우 약 3-4주에 한번씩 투여될 수 있다. 하지만, 다양한 투여 일정이 실행될 수 있다.
다양한 치료에 대한 처방이 상기 인간화 vWF 항체의 투여와 함께 조합될 수 있다. 조합된 투여는 분리된 제형 또는 단일 약학적 제형, 및 일정 순서에 따른 연속 투여를 이용한, 공동투여를 포함하고, 바람직하게는 그 생물학적 활성을 나타내는 동시에 활성을 나타내는 약제 둘다(또는 전부)가 가능한 기간의 시간일 수 있다.
하나의 실시태양에 있어서, 상기 치료는 심근경색 또는 뇌경색 또는 다른 뇌혈관 장애에 의해 매개되는 허혈의 치료를 위해 인간화 항-vWF 항체가 알테플라제(alteplase), 데스모테플라제(Desmoteplase) 또는 마이크로플라스민(microplasmin)과 같은 섬유소 용해제 및/또는 아스피린(aspirin), 디피리다몰 (dipyridamol) 또는 클로피도그렐(clopidogrel)과 같은 항혈소판제와 함께 병용 투여되는 것을 포함할 수 있다.
인간화 vWF 항체 또는 다른 종양에 연관된 항원에 대해 직접적으로 항체가 투여되는 항체들은 병용 투여되는 것도 바람직할 수도 있다.
하나의 실시태양에 있어서, 본 개시의 치료는 다양한 화학요법제 칵테일(cocktail)의 공동투여를 포함하여, 화합요법제 또는 성장저해제뿐 아니라, 인간화 vWF 항체(또는 항체들) 및 싸이토카인(cytokine)과 같은, 하나 이상의 포유류의 면역기능 조절제의 병용 투여를 포함한다. 바람직한 화학요법제는 탁신(taxanes)[파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)] 및/또는 안트라사이클린(anthracycline) 항생제를 포함한다. 이러한 화학요법제의 준비 및 투여 일정은 제조사의 지시 또는 숙련된 전공자에 의해 경험적으로 결정된 것을 이용할 수 있다. 또한, 이러한 화학치료(chemotherapy)의 준비 및 투여 일정은 Chemotherapy Service, Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992)에 기재되어 있다.
인간화 vWF 항체는 항호르몬 화합물, 예를 들면, 타목시펜(tamoxifen)과 같은 항에스트로겐 화합물 또는 아나스트로졸(anastrozole)과 같은 아로마타제(aromatase) 저해제; 오나프리스톤(onapristone)과 같은 항-프로게스테론(progesterone)(EP 616 812 참조); 또는 플루타마이드 (Flutamide)와 같은 항-안드로겐(androgen)과 이러한 분자에 대해 알려진 양으로 조합될 수 있다. 치료하고자 하는 암이 호르몬 비의존적인 암이고, 환자가 이전에 항-호르몬 치료를 받은 후에, 호르몬 비의존적인 암이 된 경우에, 상기 인간화 vWF 항체(및 본 명세서에 기재된 선택적인 다른 약물)가 환자에 투여될 수 있다.
질환의 예방이나 치료의 경우, 항체의 적절한 투여량은 위에서 정의한 바와 같이, 치료되는 질환 유형, 질병의 심각도와 진행 상태, 치료 목적으로 혹은 예방 목적으로 항체를 투여하는지의 여부, 이전 치료법, 대상자의 임상 기록과 항체 반응, 주치의의 판단에 따라 달라진다. 대상자에게 항체를 한번 또는 일련의 치료동안 적절하게 투여한다. 질환의 유형과 심각도에 따라 한번 이상 각각 투여하거나 지속적으로 투여함으로써 대상자에게 투여하기 위해서는, 약 1 ug/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면 0.1-20 mg/kg의 항체가 초기 투여량이다. 전형적인 일일 복용량은 상기 언급한 요인에 따라 약 1 ug/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위이다. 수일 이상 반복적으로 투여하는 경우에는 상태에 따라 나타나는 질환 증상이 원하는 만큼 억제될 때까지 치료를 계속한다.
인간화 vWF 항체의 바람직한 복용량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 수 있다. 따라서, 약 .3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 그의 조합)의 하나 이상의 복용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 복용은 예를 들면, 매주, 매 2주, 매 3주 또는 매 4주(예를 들면 인간화 vWF 항체를 6번 복용하는 예를 들면 약 2번 내지 약 20번 받는 환자와 같이)와 같이 간헐적으로 투여될 수 있다. 한번 이상의 낮은 복용량에 이어, 초기에 높은 로딩(loading) 복용량이 투여될 수 있다. 일반적인 복용 처방 계획은 인간화 vWF 항체 또는 그의 결합 단편을 약 2 mg/kg의 매주 지속적으로 복용하는데 이어, 약 4 mg/kg의 초기 로딩(loading) 복용량을 투여하는 것을 포함한다. 하지만, 다른 복용 처방 계획이 사용될 수 있다. 이러한 치료 과정은 전통적인 기술 및 분석법에 의해 손쉽게 모니터링될 수 있다.
개코 원숭이에서 본 문서에 기재된 인간화 vWF 항체 또는 그의 결합 단편의 효능 및 안정성을 평가하기 위한 연구에서, 놀랍게도 이러한 인간화 항체가 예를 들면, vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료에 있어 기대되지 않고 전례가 없는 결과인 낮은 ug/kg 범위의 매우 낮은 농도에서 생체 내에서 혈소판 저해를 예방(예를 들면, 줄거나, 감소하거나 또는 경감되는)하는 데 효과적임이 밝혀졌다. 작은 상처로부터 증가되는 출혈을 제외한, 출혈의 임상적 징후(예를 들면, 절개부 출혈 시험에서 측정된 주형 출혈 시간 및/또는 출혈양의 연장)는 이러한 농도에서 관찰되지 않았다. 더욱 놀랍게도, 작은 상처로부터 출혈이 관찰됨에도 불구하고, 약 1 내지 약 250배의 ED100 복용에서, 출혈의 현저한 임상적 징후가 관찰되지 않았다. 결과적으로, 본 명세서에 기재된 인간화 vWF 항체 또는 그의 결합 단편은 인간에서 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료에 효과를 나타내었다.
본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 따라서 개체에 투여될 수 있고, 바람직하게는 인간에, 약 0.001 내지 약 100 mg/kg의 범위의 약학적으로 유용한 양으로 투여된다. 바람직하게, 약 0.002 내지 약 20 mg/kg의 범위에서 치료학적으로 효과적인 양으로, 더욱 바람직하게는 약 0.002 내지 약 10 mg/kg 범의 치료학적으로 효과적인 양으로, 구체적으로는 약 0.002 내지 약 0.4 mg/kg, 더욱 구체적으로는 약 0.005 내지 약 0.2 mg/kg, 가장 구체적으로는 약 0.01 내지 약 0.1 mg/kg으로 개체, 바람직하게는 인간에 투여된다. 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편의 치료학적으로 효과적인 양은 한 번 이상의 치료학적으로 효과적인 양으로 개체에 투여될 수 있다. 치료학적으로 효과적인 양의 투여는 보통 출혈의 현저한 임상적 징후를 야기하는데 불충분하지만, 혈소판 응집을 저해하는데 충분하고, 즉 치료학적으로 효과적인 양은 출혈의 현저한 임상적 징후를 야기하지 않고 투여될 수 있다(예를 들면, 작은 상처로 인해 증가된 출혈을 제외하고 출혈의 임상적 징후를 야기하지 않는).
본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 약 0.002 내지 약 0.4 mg/kg의 범위에서 치료학적으로 효과적인 양 또는 구체적으로는 약 0.005 내지 약 0.2 mg/kg, 더 구체적으로는 약 0.01 내지 약 0.1 mg/kg으로 개체내 치료적 효과(예를 들면, 혈전 형성의 감소)가 나타나도록 개체, 바람직하게는 인간에 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 출혈의 현저한 임상적 징후가 야기되지 않는(예를 들면, 작은 상처로부터 증가되는 출혈을 제외한 출혈의 임상적 징후가 야기되지 않는) 약 1 내지 250배 사이의 범위인 ED100 , 바람직하게는 약 1 내지 약 200배 사이의 ED100, 더 바람직하게는약 1 내지 약 100배 사이의 ED100에서 치료학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 인간화 항체 또는 그의 결합 단편의 치료학적으로 효과적인 양은 단회 또는 다회 써브-도스(sub-복용량)로 개체에 투여될 수 있다. 상기 위에서 치료학적으로 효과적인 양은 정맥내로 투여되는 것이 바람직하다. 피하 경로를 통한 투여에서, 투여에 바람직한 전체 양은 정맥내 경로를 통해 투여되는 양을 약 1 내지 3 배의 범위, 바람직하게는 약 2 배일 수 있다.
출혈의 임상적 징후는 Serebruany 및 Atar (American Journal of Cardiology, 2007, Volume 99, Issue 2, 15 January 2007, Pages 288-290)에 기재되어 있고, 동물 모델에 적용하는 BleedScore 분류법을 참조할 수 있다. 상기 BleedScore는 항혈소판 치료로 특징지어지는 출혈의 종류를 점수화하기 위해 특별히 고안되었다. 상기 BleedScore는 출혈의 심각도에 따른 임상적 징후에 대해 부여되는 점수를 기본으로 한다. 확인된 전체 결과의 모든 점수를 추가함으로써, 결과 점수가 정해진다. 상기 출혈 증상은 심각도 증가의 세 가지 카테고리로 분류된다: 1) 표면 출혈(사건당 1점의 점수) 2) 내부 출혈(사건당 3점의 점수) 3) 심각한 출혈, 또는 이들의 조합(사건당 6점의 점수). 이러한 접근은 가장 심한 출혈 합병증에 대한 설명뿐 아니라, 현대 항혈소판 및 항혈전성 치료와 관계되는 가벼운 출혈에서 중증 출혈에 대한 결정 및 보고에서 특히 유용하다. 표면 출혈은 하기의 기준을 포함한다: 가벼운 멍, 작은 상처로 인한 출혈(예를 들어, 장기 출혈 시간 템플릿) 점상 출혈, 반상 출혈. 내부 출혈은 하기의 기준을 포함한다: 혈종, 코피, 입, 질, 혈변, 눈 출혈,혈뇨, 토혈로부터의 실혈. 심각한 출혈은 하기의 기준을 포함한다: 수혈이 필요하거나, 머리가 다치거나, 생명에 위협이 있는 출혈.
혈소판 응집의 저해(혈소판 응집 저해 또는 혈소판 응집을 저해하는데 충분한)는 약학적으로 효과적인 양의 투여가 동맥 혈류의 모니터링에 의해 측정되는 아테리얼(artherial) 손상 동물 모델에서 인위적으로 손상된 동맥내 가려진 혈전의 형성을 저해하기에 충분하다는 것을 가리킬 수 있다. 정량적 방법으로 혈소판 응집의 생체 내 저해를 측정할 수 있는 한 가지 접근법은 동맥 손상 모델에서 순환 전자 흐름(CFRs)의 측정을 통한 것이다. 따라서, 예를 들면, 혈소판 응집의 저해는 투여된 치료학적으로 효과적인 양이 동물내 CFRs의 수를 감소시키는 데 충분하다는 것을 나타낼 수 있다.
치료학적으로 효과적인 양 또는 효과적인 양은 증상을 개선하거나 예방하고, 치료받는 개체의 생존을 연장시키는데 효과적인 양이라는 것을 가리킬 수 있다. 치료학적으로 효과적인 양의 측정은, 특히 본 문서에서 제공되는 상세한 개시에 비추어, 당업계의 기술적 범위 내에 잘 알려져 있다.
본 명세서에 기재된 치료학적으로 효과적인 양은 개체내 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 vWF 항체의 양을 포함한다. vWF 항체의 치료학적으로 효과적인 양은 혈소판 응집을 치료하거나 저해하는데 필요한 양을 포함한다(예를 들면, 대동맥, 말초 동맥, 소동맥 또는 정맥 내 혈전증이 일어나는 동안).
치료학적으로 효과적인 복용량 또는 효과적인 복용량은 증상을 개선하고 예방하거나, 치료받는 개체의 생존을 연장시키는데 효과적인 양을 가리킬 수 있다. 본 명세서에 기재된 치료학적으로 효과적인 양은 개체내 vWF에 의해 매개된 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 vWF 항체의 복용량을 포함한다. 본 명세서에 기재된 치료학적으로 효과적인 복용량은 혈소판 응집을 저해하는 복용량을 포함한다(예를 들면, 대동맥, 말초 동맥, 소동맥 또는 정맥 내 혈전증이 일어나는 동안). 치료학적으로 효과적인 양은 혈관 내 혈류 감소에 의해 측정되는 혈전 형성을 100%로 하여 감소시키는데 충분히 효과적인 복용량인 ED100을 포함한다. 본 명세서에 기재된 ED100은 30분동안 혈류 감소의 수를 0으로 줄이기에 충분한 vWF 항체의 양을 포함한다. 치료학적으로 효과적인 양은 예를 들면, 적어도 약 15%, 바람직하게는 적어도 30%, 더 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 80%, 구체적으로는 혈관내 혈류 감소 또는 혈소한 응집의 감소를 측정하는 적절한 생체 외(ex vivo) 테스트에 의해 측정되는 혈전 형성의 약 100%를 감소시키기에 충분한 복용량으로 혈전 형성을 감소시키는 양을 포함한다.
또는, 인간화 vWF 항체는 연속적으로 또는 방사성물질의 처리의 조합(예를 들면, 방사선 조사 또는 UICC (Ed.), Klinische Onkologie, Springer-Verlag (1982)를 참조하는 방사성 물질의 도입)하여 적절히 투여될 수 있다.
따라서, 본 개시는 출혈의 현저한 임상적 징후없이 ED100 이 1회 내지 약 250회의 범위인 치료학적으로 효과적인 양으로 투여될수 있는, 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 특이적인 인간 항체 또는 그의 결합 단편을 추가로 제공한다. 인간 항체 또는 그의 결합 단편은 인간 vWF의 A1 도메인에 특이적인 것이 바람직하다. vWF에 특이적인 인간 항체 또는 그의 결합 단편은 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편인 것이 바람직하다.
제조품
본 개시의 또다른 실시태양에 있어서, 위에서 설명한 장애의 치료에 유용한 재료(예를 들면, 인간화 vWF 항체)를 포함하는 제조품이 공급된다. 이러한 제조품에는 용기와 표지, 또는 용기에 삽입하거나 연관되는 패키지를 포함할 수 있다. 적합한 용기로는 예를 들면, 병, 바이얼, 또는 주사기를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라시틱과 같은 다양한 재료로 만들 수 있다. 이 용기에는 질병 치료에 효과적인 조성물이 들어 있고 멸균 엑세스 포트가 있을 수 있다(예를 들면, 용기는 정맥주사 용액 주머니거나 피하 주사바늘이 꽂혀 있는 마개가 달린 바이얼일 수 있음). 조성물내 적어도 하나의 활성제는 본 명세서에 기재된 인간화 vWF 항체일 수 있다. 표지 또는 패키지 삽입은 암과 같은 선택 조건을 치료하는데 이용될 수 있는 조성물을 가리킬 수 있다. 하나의 실시태양에 있어서, 표지 또는 패키지 삽입은 vWF에 의해 매개된 장애를 치료하는데 사용할 수 있는 인간화 vWF 항체를 포함하는 조성물을 가리킬 수 있다.
게다가, 상기 제조품은 (a) 상기 인간화 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 첫번째 용기, 및 (b) 상기 인간화 항체와는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 포함하는 두번 째 용기를 포함할 수 있다. 본 개시의 이러한 실시태양에서 제조품은 vWF에 의해 매개된 질환 또는 장애의 치료에 조합하여 사용할 수 있는 첫번째 및 두번째 조성물을 가리키는 패키지 삽입을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 치료제는 상기 섹션(section)에 기재된 부속요법의 하나일 수 있다(예를 들면, 혈전용해제, 항혈소판제, 화학요법제, 항혈관형성제, 항호르몬 화합물, 카디오프로텍턴트(cardioprotectant), 및/또는 싸이토카인을 포함한, 포유류 내 면역 기능 조절제). 혹은, 또는 추가적으로, 상기 제조품은 정균처리한 주사용수(BWFI), 인산완충식염수, Ringer's 용액 및 포도당 용액과 같은, 약학적으로 허용가능한 완충용액을 포함하는 두 번째(또는 세 번째) 용기가 추가로 포함될 수 있다. 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기를 포함하는 상용 및 사용자 관점의 기타 물질이 추가로 포함될 수 있다.
인간화 vWF 항체의 비-치료 용도
인간화 vWF 항체 또는 이의 결합 단편은 추가로 비-치료적인 용도를 갖는다. 예를 들면, 상기 항체는 친화력 정화제로 사용될 수 있다. 이러한 과정에서 항체는 이 분야에서 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 세파덱스(sephadex) 합성수지나 필터 용지와 같은 고상에서 고정화된다. 고정화 항체는 인간화 vWF 단백질(또는 단편) 함유 샘플과 접촉하여 정제된 후 샘플에서 고정화 항체에 결합되어 있는 인간화 vWF 단백질 이외에 실제로 모든 물질을 제거하는 적절한 용제로 지지체를 세척한다. 마지막으로, 이 지지체는 pH 5.0에서 글리신 완충제와 같은 다른 적절한 용제로 세척되고, 이는 항체로부터 인간화 vWF 단백질을 방출한다.
또한, 인간화 vWF 항체는 예를 들면, 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 발현을 감지하는 것과 같은 인간 vWF 단백질에 대한 진단 분석법에서 유용할 수 있다. 진단 응용의 경우, 항체는 일반적으로 감지 가능한 잔기로 표시될 수 있다. 일반적으로 하기 카테고리로 분류할 수 있는 다양한 표지가 이용될 수 있다:
(a) 35S, 14C, 125I, 3H, 및 131I과 같은, 방사성 동위원소. 상기 항체는 Current Protocols in Immunology, Volumes 1 및 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991)에 기재된 기법을 사용하여 방사성 동위원소로 표지될 수 있고, 예를 들면, 섬광계수기를 사용하여 방사능을 측정할 수 있다.
(b) 희토 킬레이트 화합물(유로피움 chelates) 또는 플루오레세인(fluorescein)과 그 유도체, 로다민(rhodamine)과 그 유도체, 단실(dansyl), 리사민(Lissamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 텍사스 레드(Texas Red)와 같은 형광 표지도 유용하다. 형광 표지는 예를 들면, Current Protocols in Immunology, supra에 설명된 기법을 사용하여 항체에 접합할 수 있다. 형광분석기 등을 사용하여 형광성을 정량할 수 있다.
(c) 다양한 효소-기질 표지도 유용하다(예를 들면, 미국 특허번호 4,275,149 참조). 일반적으로 효소는 다양한 기법을 사용하여 측정될 수 있는 색소체 기질의 화학적 변화에서 촉매 작용을 수행한다. 예를 들면, 효소는 분광특광학적 방법으로 측정될 수 있는 기질의 색상 변화에서 촉매 작용을 수행할 수 있다. 또한, 효소는 기질의 형광이나 화학발광을 바꿀 수 있다. 형광 변화를 정량화하는 기법은 위에 설명되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응을 통해 전자적으로 여기 상태가 되고 나서 측정 가능한 빛을 방출(예를 들면, 화학발광 분석기 사용)하거나 에너지를 형광 수용체에 제공한다. 효소 표지의 예로는 발광효소(예를 들면, 개똥벌레 발광효소와 박테리아 발광효소; 미국 특허번호 4,737,456), 루시페린(luciferin), 2,3-디하이드로프탈아지네디온(2,3-dihydrophthalazinediones), 말레이트 디하이드로게나제(malate dehydrogenase), 유레이즈(urease), 호스라디시 페록시다제(horseradish peroxidase, HRP)와 같은 과산화효소, 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 글루코아밀라제(glucoamylase), 라이소자임(lysozyme), 단당류 산화효소(saccharide oxidases)[예를 들면, 글루코스 산화효소(glucose oxidase),갈락토스 산화효소(galactose oxidase), 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase)], 헤테로사이딕 산화효소(heterocyclic oxidases)[예를 들면, 유리카제(uricase) 및 잔틴 옥시다제(xanthine oxidase)], 락토퍼록시다제(lactoperoxidase) 및 마이크로퍼옥시다제(microperoxidase)를 포함한다. 효소를 항체에 접합하는 기법은 O'Sullivan et al, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym.Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981)에 기재되어 있다.
효소-기질 결합의 예로는, 예를 들면;
(i) 호스라디쉬 퍼록시다제(Horseradish peroxidase, HRP)와 하이드로겐 퍼록시다제(hydrogen peroxidase)(기질), 상기 하이드로겐 퍼록시다제(hydrogen peroxidase)는 염료 전구물질(예를 들면, 오소페닐렌 다이아민(orthophenylene diamine, OPD) 또는 3,3',5,5'-tetramethyl benzidine hydrochloride (TMB))을 산화시킨다;
(ii) 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase, AP)와 색소체 기질(파라-니트로페닐 포스페이트(para-nitrophenyl phosphate)); 및
(iii) β-D-갈락토시다제(β-D-galactosidase (β-D-Gal))와 색소체 기질(예를 들면, p-nitrophenyl-β-D-galactosidase) 또는 형광 기질 4-methylumbelliferyl-p-β-galactosidase를 포함한다.
기타 많은 효소-기질 결합도 당업자들이 사용할 수 있다(예를 들면, 미국 특허번호 4,275,149 및 4,318,980 참조).
때때로, 표지는 간접적으로 항체와 접합될 수 있다. 당업자라면 이것을 수행하는 다양한 기법을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴(biotin)과 접합될 수 있고 상기 언급한 세 가지 광범위한 범주 모두는 아비딘(avidin)에 접합되거나 그 반대가 될 수도 있다. 비오틴은 선택적으로 아비딘에 결합되고 표지는 이러한 간접적인 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또는, 표지와 항체를 간접적으로 접합하기 위해 항체를 작은 합텐(hapten)(예를 들면, digoxin)에 접합할 수 있고 상기 언급한 각기 다른 유형의 표지 중 하나를 항 합텐 항체(예를 들면, 항 digoxin 항체)와 접합할 수 있다. 따라서 이러한 방식으로 표지와 항체를 간접적으로 접합할 수도 있다.
본 개시의 또다른 실시태양에서, 상기 인간화 vWf 항체는 표지될 필요가 없으며, 상기 인간화 vWF 항체에 결합된 표지 항체를 사용하여 그 존재를 감지할 수 있다.
본 개시의 항체는 경합 결합 분석법, 직접 및 간접 경합 샌드위치 분석법 및 면역침강법과 같이 알려져 있는 모든 분석법에서 사용할 수 있다(예로서, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)).
면역조직화학염색법의 경우에는 종양을 포함한 조직 샘플을 새로 입수하거나 동결시키거나 파라핀에 넣어서 예를 들면, 포르말린과 같은 방부제로 고정시킬 수 있다.
상기 항체는 생체내 진단 분석법에서 사용될 수도 있다. 일반적으로, 항체는 방사성핵종(111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P 또는 35S와 같은)으로 표지되어 면역신티그라피(immunoscintiography)를 사용하여 조직, 예를 들면 종양을 국소화시킬 수 있다.
편의상, 본 개시의 항체를 키트에 제공할 수 있다(예를 들면, 진단 분석법을 수행할 수 있도록 지침과 함께 미리 결정된 분량의 시약과 지침이 포장된 조합품) 항체가 효소로 표지되는 경우, 이 키트에는 효소에서 필요한 공동 인자와 기질이 포함될 것이다(예: 감지 가능한 발색단이나 형광 발색단을 제공하는 기질 전구물질). 추가로, 안정제, 완충제(예를 들면, 차단 완충제 또는 세포 용해 완충제) 등과 같은 다른 첨가제를 이 키트에 포함시킬 수 있다. 키트에 제공된 다양한 시약의 상대적인 양은 분석법의 민감도를 가장 최적화하는 시약의 용액 농도를 제공하기 위해 크게 달라질 수 있다. 특히, 이 시약은 부형제를 포함하여 건조 파우더(대개 동결 건조됨)로 제공될 수 있어, 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약액을 제공한다.
상기 인간화 vWF 항체는 표지된 항체가 숙주에 투여되었을 경우, 생체 내 이미징에 유용할 수 있고, 혈류에서, 숙주내 표지된 항체의 존재 및 위치를 분석하는 것이 바람직하다. 이러한 이미징 기법은 혈관 엠볼리(emboli) 부위 또는 신생물의 염색 및 치료에 적절히 사용될 수 있다. 상기 항체는 예를 들면, 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance), 또는 당업계에 알려진 수단에 의해, 예를 들면, 비-방사성 지표를 검출하는 것을 포함하여, 숙주 내에서 검출되는 어떠한 부분에 적절히 표지될 수 있다. 하지만, 바람직하게, 상기 라벨은 요오드를 포함한 방사능표지일 수 있고, 예를 들면, 125I 및 131I, 셀레늄, 이작용기성 킬레이트, 동, 예를 들면, 67Cu, 테크네튬(technetium), 예를 들면, 99mTc, 및 레늄(rhenium), 예를 들면, 186Re 및 188Re이다. 상기 방사성 동위원소는 예를 들면, 요오드화를 위한 금속-킬레이팅 약물 또는 락토페록시다제(lactoperoxidase), 또는 이오도겐(iodogen) 기술을 포함하는 어떠한 방법에 의해 단백질에 접합될 수 있다.
재료의 기탁:
하기의 재료들은 독일, 브룬스빅(Braunschweig)의 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstr. 7 B, 38124에 기탁되었다:
GS264 벡터를 포함하는 등록번호 DSM 21059를 갖는, 2008년 1월 23일에 DSMZ에 기탁된 미생물(E.coli)은 인간화 NMC-4 변이체 H9L9IgG4의 핵산 서열을 암호화하는 경쇄를 포함하는 분리된 핵산을 포함한다. GS265 벡터를 포함하는 등록번호 DSM 21060을 갖는, 2008년 1월 23일에 DSMZ에 기탁된 미생물(E.coli)은 인간화 NMC-4 변이체 H9L9IgG4의 핵산 서열을 암호화하는 중쇄를 포함하는 분리된 핵산을 포함한다. 이러한 기탁은 특허절차상 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약의 규칙(the provisions of the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure) 및 그 이하 규정하에 이루어졌다(부다페스트 조약).
추가적 설명없이, 선행된 설명 및 하기에 설명하는 실시예를 이용한, 당업계에서 일반적인 기술 중 하나가 본 개시의 약제를 만들고 이용하고, 청구된 방법을 실행할 수 있다고 생각된다. 하기 설명하는 실시예는 본 개시의 내용을 용이하게 제공하지만, 본 개시의 내용으로 한정하여 해석하지 않는다.
실시예
실시예 1: 키메라 항체의 제조
NMC-4-인간 Fc 키메라의 생성 : 마우스 항체 NMC-4 및 인간 Fc 영역으로부터의 가변 부위를 포함한 키메라 항체는 하기와 같이 제조되었다. 전형적인 방법에서, 상기 항-vWF 항체, NMC-4(예를 들면, IgG1κ는 가변 부위 아미노산 서열과 함께 공개되었다)는 NMC-4의 VH 및 VL 영역의 합성 유전자 서열을 생성하기 위한 주형으로 사용되었다(Celikel et al., 1997, 혈구, 분자 및 질환 23:123-134). 예를 들면, NMC-4 VH 및 VL의 합성 유전자 서열은 Celikel et al.에 기재된 아미노산 서열을 취하고, 벡터 NTI 소프트웨어를 이용하여 상응하는 뉴클레오티드 서열을 생성하는 것에 의해 생성된다.
NMC-4 키메라 발현 플라스미드의 생성에 사용된 프라이머
정방향
프라이머		 서열 역방향
프라이머		 서열
중쇄
NMC-VH-EcoRI-F 5'-GACGCGAATTCGCAGGTGCAG
CTGAAGGAGAGC-3'
(서열번호: 34)		 NMC-VH-IgG1-R 5'-CGGATGGGCCCTTGGTGGAAG
CGCTGCTCACGGTCACGCTGGT-3'
(서열번호: 35)
hIgG-F 5'-GCTTCCACCAAGGGCC
CATCCG-3'
(서열번호: 36)		 hIgG-R 5'-CCAGAGACAGGGAGAGGC
TCTTCTG-3'
(서열번호: 37)
IgG1-BamHI-R 5'-ATTAGGATCCTTATCATTTACC
CAGAGACAGGGAGAGGCT-3'
(서열번호: 38)
hFc-L235E-F
 5'-CTCGAGGGGGGACCGTCAGTCT
TCCTCTT-3'
(서열번호: 39)		 hFc-L235E-R 5'-AAGAGGAAGACTGACGGTCCCCC
CTCGAG-3'
(서열번호: 40)
CH2-C1q(-)-F 5'-GGCGTACGCGTGCGCGGTCT
CCAACAAAGC-3'
(서열번호: 41)		 CH2-C1q(-)-R 5'-CCGCGCACGCGTACGCCTTGC
CATTCAGCCA-3'
(서열번호: 42)
4-59 리더-HindIII- NMC-4 5'-ATTAAGCTTGCCGCCACCATGAAA
CATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGGTGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGAAGGAGAGC-3'
(서열번호: 43)		 IgG1-BamHI-R 5'-TAAGGATCCTTATCATTTAC
CCGGAGACAGGGAGAG-3'
(서열번호: 44)
경쇄
NMC-VL-EcoRI-F 5'-GACGCGAATTCGGACATCCA
GATGACCCAGAGCC-3'
(서열번호: 45)		 NMC-VL-Kappa-R 5'-GAAGACAGATGGTGCAGCCACAGT
TCGCTTCACCTCCAGCTTGGTGCC-3'
(서열번호: 46)
Kappa-F 5'-CGAACTGTGGCTGCACCAT
CTGTCTT-3'
(서열번호: 47)		 Kappa-BamHI-R 5'-AATTCGGATCCTTACTAACACT
CTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3'
(서열번호: 48)
전형적인 방법에서, PCR 반응은 Accuprime PFX DNA POLYMERSE KIT(Invitrogen)를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 50ul 반응 혼합액은 1×PFX 완충용액, 0.2 uM dNTP 혼합액, 1 unit의 PFX 폴리머라제(polymerase), 1 uM 정방향 프라이머, 1 uM 역방향 프라이머 및 100 ng DNA 주형(들)을 포함하여 만든다. 표준 PCR 프로그램은 94℃에서 1분동안 초기 변성(denaturation)하고, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 1분인 주기(cycle)로 30 주기 수행하고, 68℃에서 10분동안 마지막 증폭(extension)하는 단계로 구성된다. PCR 산물은 0.8% TAE 젤에서 아가로즈(agarose) 젤 전기영동에 의해 정제하고, 원하는 크기의 하나 이상의 밴드(band)를 자르고 Qiagen GEL EXTRACTION KIT로 정제하였다. DNA 단편은 1 X T4 라이게이즈(ligase) 완충용액(NEB), 0.5ul T4 DNA 라이게이즈(ligase)(NEB) 및 100ng의 각 DNA를 포함한 10 ul 부피에서 상온에서 30분동안 라이게이션하였다. 다음으로, 라이게이션(ligation) 반응액 1 ul를 JM109 E.coli 세포의 형질전환에 사용하였고, 상기 PCR에서 생성된 인서트(insert)는 Beckman CEQ 8000 DNA ANALYZER를 사용한 염기서열분석에 의해 확인하였다.
쥐과 항체 NMC-4 및 인간 FC로부터 VH 및/또는 VL을 포함하는 이러한 키메라 항체들은 당업계에서 잘 알려진 표준 방법에 따라 PCR에 의해 합성되었다. 전형적인 방법에서, NMC-4로부터 유래한 VH 및/또는 VL은 NMC-4에 특이적인 프라이머 및 인간 Fc에 특이적인 프라이머로 PCR을 수행하여 인간 FC에 융합되었다.
선택적으로, 아미노산 치환(예를 들면, 돌연변이)이 야생형 γ1 Fc 불변 영역에 의해 중재되는 것으로 알려져 있는 세포독성을 제거하는 Fc 및 보체 결합 부위를 없애기 위해 IgG1 Fc 영역에 도입되었다(예를 들면, 서열번호:143 참조). 예를 들면, I.M.A.G.E. cDNA clone #4764579 (ATCC) (서열번호: 33)으로부터 유래한 인간 IgG1 불변 영역(예를 들면, Fc)은 hIgG-F (서열번호: 36) 및 hIgG-R (서열번호: 37) 프라이머를 사용하여 증폭되었다(표 1). 아미노산 치환(예를 들면, L235E(상기 FcR 결합 부위) 및 E318A, K320A, K332A (상기 C1q 보체 결합 부위에)는 예를 들면, 특정 부위 돌연변이화(부위 directed muta유전자sis)의 수행에 의해 IgG1 Fc 영역에 도입되었다(Duncan 및 Winter; Nature. 332(6166):738-40 (1988)). 예를 들면, 상기 L235E 돌연변이는 hFc-L235E-F (서열번호: 39) 및 hFc-L235E-R (서열번호: 40)의 프라이머 쌍을 이용하여 상기 불변 영역에 도입되었고, 상기 보체 부위 돌연변이는 CH2-C1q(-)-F(서열번호: 41) 및 CH2-C1q(-)-R)(서열번호: 42)의 프라이머 쌍을 이용하여 도입되었다(표 1). 상기 결과물인 네 개의 돌연변이를 포함한 PCR 산물은 변형된 IgG1 Fc 영역(IgG1(dm)라 부름)을 코딩하는 PCR 산물을 얻기 위해 hIgG-F (서열번호: 36) 및 IgG1-BamHI-R (서열번호: 38)의 두 개의 바깥 프라이머를 사용하여 연결되었다.
전형적인 방법에서, NMC-4의 상기 중쇄 가변 부위는 당업계에 잘 알려진 재조합 기술에 의해 변형된 IgG1 Fc 영역(예를 들면, IgG1(dm))에 융합되었다. 예를 들면, 상기 NMC-4의 중쇄 가변 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)은 NMC-VH의 N-말단의 상류에 EcoRI 클로닝 부위를 도입할 수 있는 NMC-VH-EcoRI-F (서열번호: 34) 및 NMC-VH-IgG1-R (서열번호: 35) 프라이머로 증폭되었다. 구체적으로, 상기 PCR 산물은 첫번째로 NMC-VH-EcoRI-F (서열번호: 34) 및 hIgG-R (서열번호: 37) 프라이머 쌍을 사용하고, 다음으로 NMC-VH-EcoRI-F (서열번호: 34) 및 IgG1-BamHI-R (서열번호: 38) 프라이머쌍을 사용한 PCR 반응의 두 가지 단계의 재조합 PCR에 의해, 중쇄 불변 영역과 연결되었다. 상기 최종 PCR 산물은 EcoRI 및 BamHI 으로 절단되고, XhoI 및 EcoRI 부위안에 클론된 Igk 리더 서열(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD) (서열번호: 107) (서열번호: 140의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는)을 포함하도록 변형된 pIRES2-EGFP-Igκ벡터 (Clontech, Palo Alto, CA)의 EcoR1 및 BamH1 부위에 클로닝되었다.
전형적인 방법에서, NMC-4의 경쇄 가변 부위는 하기에 기재된 바와 같은 재조합 기술에 의해 변형된 IgG1 Fc 영역(예를 들면, IgG1(dm))에 융합되었다. 예를 들면, 상기 Igκ 경쇄 불변 영역(예를 들면, κC1(서열번호: 141))은 Igκ경쇄 불변 영역의 3' 말단에 BamH1 제한효소 부위를 추가로 도입하는 Kappa-F (서열번호: 47) 및 Kappa-BamHI-R (서열번호: 48) 프라이머를 이용한 I.M.A.G.E clone #4704496 (ATCC)(서열번호: 108)에 의해 만들어진 DNA로부터 증폭되었다. 유사하게, 상기 경쇄 가변 부위는 5' 말단에 EcoR1 부위를 도입하는 NMC-VL-EcoRI-F(서열번호: 45) 및 NMC-VL-Kappa-R(서열번호: 46) (표 1) 프라이머를 이용한 합성된 VL 유전자로부터 증폭되었다. 다음으로, 상기 NMC-4 가변 부위 및 κC1 단편은 NMC-VL-EcoRI-F (서열번호: 45) 및 Kappa-BamHI-R (서열번호: 48) 프라이머를 이용한 재조합 PCR에 의해 연결되었다. 최종 PCR 산물은 EcoRI 및 BamHI으로 절단하고, pIRES2-DsRed2-Igκ벡터의 같은 부위안에 클로닝되었다.
pIRES2-EGFP 벡터의 중쇄의 발현 수준은 같은 Igκ 리더 서열이 경쇄 및 중쇄 둘다에서 사용되었음에도 불구하고, pIRES-DsRed 플라스미드에서 발현되는 경쇄 마우스-인간 키메라에 비교하여 낮을 수 있다. 따라서, 중쇄의 발현 수준을 향상시키기 위하여, 상기 Igκ 리더 서열은 pIRES2-EGFP-NMC4-IgG(mut) 벡터를 주형으로 4-59 leader-HindIII-NMC-4 (서열번호: 43) 및 IgG1-BamHI-R (서열번호: 38) 프라이머 쌍을 이용하여 인간 생식세포 4-59 VH(MKHLWFFLLLVAAPRWVLS)(서열번호: 109)로부터 유래한 리더 서열로 대체하였다. 상기 단편은 HindIII 및 PmeI 으로 절단되고, pcDNA6-cMyc-A 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 HindIII 및 PmeI 부위에 써브클로닝(subcloning)되었다.
AJW200 참조 항체의 제조: AJW200은 GPIbα을 갖는 vWF A1 도메인의 상호작용을 차단하는 능력을 갖는, vWF의 A1 도메인에 대해 매개되는 또다른 항체이다. AJW200 참조 항체는 예를 들면, 발현 향상을 위해 추가적으로 기능성 코작(Kozak) 서열을 포함하는 U.S. Patent No. 6,228,360에 기재된 VH 및 VL 서열의 엔지니어링(engineering)에 의해 생성된다. 예를 들면, 상기 합성 AJW200 VH 유전자는 Hind III-Ko-AJW-F (서열번호: 49) 및 HuFab-H-R (서열번호: 50)(표 2)의 프라이머를 사용하여 증폭되었고, 인간 IgG1(dm) 중쇄 불변 영역을 포함하는 HindIII-ApaI으로 절단된 pcDNA6-cMyc-A 벡터의 HindIII 및 ApaI 부위에 클로닝되었다(이를 NMC-4 VH로 대체). 상기 AJW200 VL은 XhoI-Ko-AJW-F(서열번호: 51) 및 Kappa- BamHI-R(서열번호: 48)의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되었고, 상기 NMC 경쇄 키메라를 갖는 pIRES-DsRed 벡터의 XhoI 및 BamH1 부위 안으로 써브클로닝하였다(이를 NMC4의 VL로 대체).
AJW200 발현 플라스미드의 생성에 사용된 프라미어
정방향
프라이머		 서열 역방향
프라이머		 서열
Hind III-Ko-AJW-F 5'-GTTAAGCTTGCCGCCACCATGGA
TTTTGGGCTGATTTTTTTTATTGTT-3'
(서열번호: 49)		 HuFab-H-R 5'-GAATGGGCCCTTGGTGGAAGCGG
AGGAAACGGTCACGAGGGTA-3'
(서열번호: 50)
XhoI-Ko-AJW-F 5'-AATCTCGAGGCCGCCACCATGA
GTGTGCCCACTCAGGTCCTGG-3'
(서열번호: 51)		 Kappa- BamHI-R 5'-AATTCGGATCCTTACTAACACT
CTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3'
(서열번호: 48)
항체 생산 : 키메라 항체는 당업계에 잘 알려진 어떠한 방법에 의해서도 생산될 수 있다. 전형적인 방법에서, HEK293F 세포는 120rpm의 쉐이커 플라스크에서 37℃, 8% CO2 조건하에서 Freestyle 293 expression 배지(Invitrogen)에서 배양되었다. 상기 세포는 100×g에서 펠렛(pellet)화되었고, 30ml의 FREESTYLE 293 EXPRESSION 배지에서 재부유하고, 단세포 현탁액을 얻기 위하여 20초동안 볼텍스(vortex)하였다. 상기 세포의 수를 세고, 2L 쉐이커 플라스크(shaker flask)에 전체 부피 330ml의 FREESTYLE 293 배지에 3.3×106 세포가 되도록 분주하였다. 상기 형질도입 혼합액은 동일 부분의 DNA/OptiMEM(예를 들면, 총 부피 11ml에 165 ug HC 발현 플라스미드, 165 ug LC 발현 플라스미드, 및 상온의 OptiMEM(Invitrogen)) 및 293fectin/OptiMEM (예를 들면, 총 부피 11ml에 433ml의 293fectin(Invitrogen) 및 상온의 OptiMEM (Invitrogen))으로 구성되어 있다. 상기 DNA 혼합액을 293fectin 혼합액에 첨가한 다음, 혼합하고, 상온에서 20분간 배양하고, 293F 세포가 포함된 기존 배지에 첨가하였다. 상기 세포는 120rpm에서 흔들어주면서, 37℃, 8% CO2 조건에서 배양하였다. 형질도입 후 72시간에, 세포를 펠렛(pellet)화하기 위해 상기 현탁액을 100×g에서 5분 동안 원심분리하고, 상기 Mab가 포함된 상등액은 0.2 um 필터를 통해 걸러내고, Protein-A 친화성 컬럼을 이용하여 정제하였다.
HEK-293F 세포에 일시적으로 형질도입된 조절 배지(CM) 소량을 PBS로 평형화되어 있는 0.3 ml Protein A SEPHAROSE drip 컬럼에 적용하였다. 상기 컬럼은 10 ml PBS로 씻어내고, 단백질은 0.1 M 글리신(Glycine), pH2.7으로 용출하였다. 1 ml 분획물은 첫번째 두 개의 용출된 분획물에서 용출된 항체의 대다수를 갖는 0.1 ml 1M Tris-HCl, pH 8.0내로 수집하였다. 이러한 두 개의 분획물은 모두 모으고, 예를 들면, Vivaspin 0.5 ml 원심 장치를 사용하여, 최종 부피(예를 들면, 0.2-0.3 ml)가 되도록 농축하였다. 이러한 농축 단계 동안에, PBS로의 중간 희석은 트리스-글리신(Tris-Glycine)에서 PBS로 완충용액을 교환함으로써 수행하였다. 상기 최종 농축액은, 예를 들면, 0.2um 주사기 필터를 통한 여과법에 의해 멸균되었고, 항체가 포함된 샘플의 단백질 농도는 Lowry 단백질 시험법(BioRad DC Protein Assay)을 사용하여 측정하였다.
대규모 정제를 위하여, 일시적으로 형질도입된 부착 세포(예를 들면, HEK-293T)로부터 얻은 조절 배지(CM) 2L를 부피가 ~200m로 감소할 때까지 중공사 카트리지(예를 들면, Amersham Biosciences 30,000 NMWC/290 cm2 중공사 컬럼 UFP-30-C-3X2MA)로 한외여과를 수행하여 농축하였다. 더 작은 형질도입을 위한, 이러한 농축된 재료 또는, 스트레이트(straight) CM은 0.1M Tris-HCl, pH8.0으로 평형화된 12ml 단백질 A SEPHAROSE 컬럼 위로 펌프되었다. 상기 컬럼은 UV280 리딩(reading)이 기준점을 유지할 때까지 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0로 씻어내었다. 상기 항체는 0.1 M Glycine, pH2.7로 용출하고, 3 ml 분획물을 수집하였다. 피크(peak) 단백질을 포함하는 분획물의 pH는 최종 농도 0.1M이 되도록 Tris-HCl pH 8.0의 추가에 의해 조절하였다. 피크(peak) 분획물을 모두 모으고, 한외여과(예를 들면, Amicon Ultra 15ml 원심 장치)를 통해 7 ml보다 적은 부피로 농축한 다음, PD-10 컬럼(Amersham Biosciences/GE-Healthcare)을 두 개 이용하여 PBS로 제염하였다.
배양 상등액으로부터 얻어진 단백질은 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서도 정량되고 분석된다(예를 들면, Lowry 단백질 시험법(BioRad DC Protein Assay)). 전형적인 방법에 있어서, 배양 상등액은 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 구체적으로, 단백질은 니크로셀룰로스(nitrocellulose) 멤브레인(membrane)에 트랜스퍼(tranfer)하고, 상온에서 1 시간동안 5% 우유/PBS로 블락킹하고, HRP 접합된 마우스 항-인간 IgG(예를 들면, γ-사슬 특이적, 1:10,000) 및 마우스 항-인간 카파(예를 들면, κ-사슬 특이적, 1:1,000)(Southern Biotech, Cat# 9042-05 및 #9220-05, Birmingham, AL)와 반응하고, ECL 키트(kit)로 신호를 검출하였다.
리스토세틴(ristocetin)으로 유도된 혈소판 응집 시험에서 시험관 내(in vitro) 저해 활성 : 일반적인 방법에서, 예를 들면, vWF에 대한 결합 특이성을 포함한, 키메라 NMC-4 인간 Fc 항체의 활성을 측정하였다. 예를 들면, 혈소판 응집 시험은 동결건조된 인간 혈소판(Bio/Data, Horsham PA)을 사용한 표준 응집측정기(Bio/Data, model PAP-4)로 수행되었다. 구체적으로, 50 ul의 리스토세틴(ristocetin)(예를 들면, 스탁(stock) 농도=15 mg/mL) (Bio/Data) 및 48.5 ml의 TBS 또는 시험 항체를 400 ul 부피에 1×108의 동결건조된 혈소판이 포함된 튜브에 첨가하였다. 기준점 읽기는 1.5 ml의 정제된 vWF(예를 들면, 최종 농도가 1.5 ug/ml)를 응집을 시작하기 위해 튜브내로 첨가되기 10초 전에 기록되었다. 상기 시험 항체의 EC50 값은 혈소판 응집의 50%가 저해되는 농도로 평가되었다. 모(parent) 단일클론 항체와 비교하여, 상기 키메라는 모체의 쥐과 NMC4 항체의 것과 동일한 효능을 보였다.
추가로, EC50 값을 더욱 정확하게 확인하기 위하여, 키메라 항체는 예를 들면, 마이크로플레이트 방법에서 적응된 플레이트(plate) 리더(reader) 방법을 사용하여 분석되었다. 일반적인 방법에서, 150ul TBS(pH 7.5)에 들어있는 파라포름알데하이드로 고정된 혈소판을 96-웰 COSTAR 3603 플레이트를 이용하여 웰당 4.5×107 첨가하고, 정제된 인간 vWF(Calbiochem, San Diego, CA)는 웰당 최종 농도가 1.5ug/ml이 되도록 첨가하였다. 시험 항체의 연속적인 농도는 읽혀지는 싸이클(cycle) 사이에 20초동안 흔들어주는 과정에 37℃에서 6분 동안 진행되도록 셋팅된 SPECTRAMAX PLUS PLATE READER(Molecular Devices)를 이용한 응집 및 탁도(예를 들면, 흡광도 405nm)의 모니터링을 위해 최종 농도가 웰당 1.5 mg/mL이 되도록 리스토세틴(ristocetin)을 추가함에 따라 첨가되었다. 저해 화합물 또는 참조 MAb(예를 들면, AVW-3)가 첨가(예를 들면, 20 ul/웰)하고, 그 혼합물을 2분 동안 반응시키고 모니터링하였다. 최종적으로, 리스토세틴(ristocetin) 또는 보트로세틴(botrocetin)(20 ul/웰)을 첨가하고, 그 혼합물을 40분 동안 반응시키고 모니터링하였다. 상기 응집 신호는 흡광도 감소의 정도로 모니터링하였다(예를 들면, -Δ흡광도).
상기 NMC-4 인간 Fc 키메라는 클론된 AJW200 항체뿐 아니라, 원래의 NMC-4 단일클론 항체와 비교하였다. 도 1에서 보는 바와 같이, 리스토세틴에 의해 유도된 혈소판 응집 분석법에서, 각각, EC50 값은 0.1, 0.17 및 0.27 nM로, 상기 NMC-4 키메라는 원래 NMC-4 mAb의 활성과 유사하였고, AJW200에 비해서는 약간 더 높았다.
실시예 2: 인간화 항체의 제조
인간 수용체 구조형성의 선별 : 데이터베이스(예를 들면, 인간 생식세포 데이터베이스, V 염기, 또는 Kabat 데이터베이스) 또는 공개(예를 들면, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1992)는 쥐과 중쇄 및 경쇄 V 영역에 속해있는 써브패밀리의 확인 및 수용체 분자로 사용하기 위해 가장 적합한 인간 생식세포 구조형성의 측정에 사용될 수 있다. 수용체 서열에 사용될 수 있는 이러한 써브패밀리 내의 VH 및 VL 서열의 선별은 접합 후에 6개 CDR의 적절히 상대적인 제시를 유지하기 위해 CDR1 및 CDR2 영역의 서열 상동성 및/또는 정규 구조의 매치에 기초할 수 있다.
예를 들면, V 염기의 용도는 NMC-4의 κ경쇄가 NMC-4 VL 구조형성 및 κ 써브패밀리 1(VK1)의 일부 사이에서 확인되는 훌륭한 상동성이 주어지는 카파(kappa) 1 써브패밀리임을 가리킨다. 가장 높은 상동성 및 CDR 고리의 정규 구조가 제일 잘 보존된 것은 CDR3의 전체 서열과 78% 서열 동일성, 상기 구조형성 영역과 84% 서열 동일성을 갖는 생식세포 서열 018(서열번호: 5)에서 관찰되었다. NMC-4 경쇄 및 인간 경쇄 018(서열번호: 5) 및 AAk94808(이 영역에서 NMC-4와 비교하여 LCDR3 및 구조형성 4 서열을 제공하기 위해 사용되는, 018로부터 유래한 성숙 항체)(서열번호: 6)의 얼라인먼트(alignment)는 표 3에서 나타내어지고, 상기 NMC 및 인간 항체 간 차이는 굵은 글씨로 나타내었다(kabat 수의 체계(Kabat, 1978)에 기초한 번호).
유사하게, 구조형성 3을 통한 VH 서열을 가리키는 V 염기의 용도는 VH 써브패밀리(subfamily) IV에 들어간다. 인간 VH IV 써브패밀리내에서, 상기 NMC-4 VH는 CDR3를 통한 전체 VH에서 쥐과 VH에 56% 서열 동일성 및 상기 단독 구조형성 영역에 67% 동일성을 나타내는 4-59 생식세포 서열(서열번호: 3)과 가장 높은 서열 상동성을 나타낸다(표 4). 본 개시의 이론에 따라 결합되어 지지 않는, AAC18165.1(서열번호: 4)은 구조형성 1 내지 3 및 인간 생식세포 4-59 VH의 HCDR1 및 HCDR2(서열번호: 3)에서 동일한 아미노산 서열을 공유하기 때문에 HCDR3 및 구조형성 4 비교 서열을 제공하기 위해 선택된다. HCDR3 및 구조형성 4 영역은 HCDR3 영역이 매우 다르고, FW4가 유전자 산물의 분리로부터 유래한 별개의 도메인(J)임이 주어진, V 염기 데이터베이스에서 상기 VH 생식세포 서열을 포함하지 않는다. 표 4에서 NMC-4 및 AAC18165.1(서열번호: 4) 서열 간 아미노산 차이는 굵게 강조하고, 그 위치는 별표로 표시하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
마우스 항체로부터 인간 항체 구조형성으로 CDR을 바로 이식하는 것은 항원 결합 능력이 소실되는 결과로 나타난다는 가설이 있고(Foote 및 Winter J. Mol. Biol. 224: 487-499 (1992); Xiang et al. J Mol Biol. 253:385-90 (1995); Homes et al, J. Immunol. 167:296-301 (2001)), 역-돌연변이라 불리는 과정인, 이러한 위치의 마우스 잔기에 구조형성의 특정 잔기를 다시 돌연변이하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 표 5는 상기 잔기가 CDR의 구조에 영향을 줄 수 있고, 이것이 쥐과 잔기의 역 돌연변이를 위한 잠재적 후보물질일 수 있음을 보여준다(예를 들면, 그 위치가 이탤릭체의 굵은 글씨로 강조되어 있는 NMC-4 및 인간 구조형성 간 아미노산 차이).
CDR들의 형태에 영향을 주는 구조형성 잔기; NMC-4 및 인간 수용체 가변 부위의 비교
VL VH
Kabat 위치 NMC-4 O18 FW Kabat 위치 NMC-4 4-59 FW
2 I I 2 V V
4 M M 47-49 W, L , G W, I , G
35-36 W, Y W, Y 67 L V
46-49 L, L, I, F L, L, I, Y 69 I I
64 G G 71 K V
66 G G 73 N T
68-69 G, T G, T 78 V F
71 Y F 93-94 V , R A , R
98 F F 103 W W
아미노산 잔기들은 확인되어진 CDR((Holmes et al, J Immunol. 167:296-301 (2001))의 제시를 조직화하는 중쇄 및 경쇄의 페어링(pairing)에 영향을 줄 수 있고, 역 돌연변이를 위한 후보가 될 수 있다. 본 개시의 이론에 따라 결합되지 않는, VL 영역내, 44, 96 및 98 잔기는 34, 36, 38, 46, 87, 89 및 91 잔기의 추가적인 기여와 함께, 중요할 것으로 생각된다. 이러한 잔기들 중에서, VL 영역에서 NMC-4와 수용체 018 사이에 현저히 차이나는 유일한 하나는 NMC-4 VL에서는 발린(valine)이고, 인간 018 구조형성에서는 프롤린(proline)인, 44번째 잔기이다. 본 개시의 이론에 따라 결합되지 않는, VH의, 45, 및 103번째 잔기는 VL과 함께 VH의 패킹을 경계하는 데도 기여하는 35, 37, 39, 47, 91, 93, 및 95 잔기와 함께 중요하다. NMC-4 VH 및 수용체 4-59 수용체 구조형성의 이러한 경계 잔기에서 단 하나의 차이는 4-59의 알라닌(alanine)과 비교하여 NMC-4의 발린(valine)의 차이가 보존되어지는, 93번째 잔기이다(표 5).
쥐과 구조형성 영역과 인간 생식세포 4-59 VH 서열의 비교는 추가적으로 구조형성 2의 37 및 48 잔기의 차이와 함께, CDR 제시 및 구조형성 3(잔기 67, 71, 73, 78, 93)로 클러스터(cluster)된 경계 패킹(packing)에 중요하다고 가설이 세워진 잔기내에서 많은 차이를 나타낸다. 이러한 잔기들은 프로토타입(prototype) 인간화 서열내 역-돌연변이를 위한 잠정 후보들이다. 하지만, 두 개의 구조형성 2 잔기들(37V vs 37I 및 48L vs 48I)의 차이가 보존된다; 이를 위해 첫번째 프로토타입(prototype) VH 서열은 구조형성 3과의 차이에 초점을 두고, 인간에서 마우스로 하기의 역-돌연변이: V67L, V71K, T73N, F78V 및 A93V가 수행될 수 있다(표 6). 합성된 유전자는 Retrogen(San Diego CA)에 의해 관습적으로 합성되고, H2가 고안되고, 박테리아 벡터 pRSFDuet(Novagen, Madison WI)의 Nhe1 및 Xho1 위치에 클론되고, 4-59-huNMC-F(서열번호: 54) 및 hu-VH-R(서열번호: 55) 프라이머를 이용하여 인써트(insert)를 증폭하여 주형으로 사용하였다(표 7 및 9). 상기 결과의 단편은 ApaI으로 절단하였다. 실시예 1에서 제조된 NMC-4 키메라 중쇄를 포함하는 플라스미드 pcDNA6-NMC-HC는 HindIII 및 Apa1으로 절단하고, pcDNA-IgG1dm 단편을 포함하는 DNA 단편은 NTP가 있는 하에서 클레노우(Klenow) 단편으로 블런트(blunt) 말단화시켰다. VH를 포함하는 상기 PCR 산물을 블런트(blunt) 말단화된 pcDNA-IgG1dm 단편과 라이게이션(ligation)하였다. 다음으로 상기 플라스미드(plasmid) DNA를 E.coli 숙주 균주인 JM109에 형질전화하는데 이용하였다. 각각의 클론들은 클론이 정방향으로 인써트(insert)를 발현하는지, 맞는 서열(클론 pcDNA-huVH-IgG1dm)을 갖는지 확인하기 위하여 Beckman CEQ 8000 DNA sequencer를 이용하여 염기서열분석하였다. 이런 벡터는 인간 잔기에 대해 개별적으로 역으로 돌아간 각 잔기의 효과를 측정하기 위해 고안된 H4, H5, H6, H7 및 H8 변이체를 주형으로 사용하였다. 이러한 변이체는 표 7에서 나타내는 프라이머쌍을 사용하여 제작되었다(상응하는 서열은 표 9에서 나타낸다).
다양한 VL 및 VH 변이체를 위한 생식세포 4-59 및 018 생식세포 수용체 서열에 통합된 구조형성 잔기 돌연변이.

VH 		역돌연변이
(인간에서 쥐과로)
VL 		역돌연변이
(인간에서 쥐과로) 		(인간에서 일반적 인간으로)
H2 V67L, V71K, T73N, F78V, A93V L5 P44V, Y49F, F71Y F73L, G100Q
H4 V67L, V71K, T73N, F78V L4 Y49F, F71Y F73L, G100Q
H5 V71K, T73N, F78V, A93V L6 P44V, F71Y F73L, G100Q
H6 V67L, T73N, F78V, A93V L7 P44V, Y49F F73L, G100Q
H7 V67L, V71K, F78V, A93V L8 역돌연변이 일어나지 않음. F73L, G100Q
H8 V67L, V71K, T73N, A93V L9 역돌연변이 일어나지 않음. F73L, I83F, G100Q
H9 역돌연변이 일어나지 않음.
인간화 중쇄 변이체를 제조하기 위해 사용한 주형 및 프라이머의 요약.
VH
변이체
주형		 단편-1 PCR 프라이머 단편-2 PCR 프라이머 최종 VH PCR 프라이머
벡터		 클로닝 부위

H2		 레트로젠(Retrogen) 유래 합성 DNA 4-59-huNMC-F 및
hu-VH-R		 pcDNA6- IgG1(dm) HindIII
ApaI

H4		 pcDNA6-IgG1(dm)의 H2 pcDNA6-F
및
VH-V93A-Rev		 VH-V93A-For
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6- IgG1(dm) HindIII
ApaI

H5		 pcDNA6-IgG1(dm)의 H2 pcDNA6-F
및
HC-L67V-R		 HC-L67V-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6- IgG1(dm) HindIII
ApaI

H6		 pcDNA6-IgG1(dm)의 H2 pcDNA6-F
및
HC-K71V-R		 HC-K71V-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6- IgG1(dm) HindIII
ApaI

H7		 pcDNA6-IgG1(dm)의 H2 pcDNA6-F
및
HC-N73T-R		 HC-N73T-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6- IgG1(dm) HindIII
ApaI

H8		 pcDNA6-IgG1(dm)의 H2 pcDNA6-F
및
HC-V78F-R		 HC-V78F-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6- IgG1(dm) HindIII
ApaI

H9		 레트로젠(Retrogen) 유래 합성 DNA 4-59-huNMC-F 및
hu-VH-R		 pcDNA6- IgG1(dm) HindIII
ApaI
정규 구조 및 경계 패킹(packing)의 영향을 위해 가설화된 잔기들을 비교해보면 NMC-4 VL 및 018 인간 VL 수용체 구조형성(예를 들면, 44, 49 및 71 잔기) 간 세 가지 차이가 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 프로토타입(prototype) 인간화 변이체는 쥐과 잔기에 비해 세 개의 역-돌연변이(예를 들면, P44V, Y49F 및 F71Y)를 수반하는, L5를 고안할 수 있다(표 6). 추가로, 이러한 변이체는 루신이 인간 항체 레퍼토리(repertoire)에서 이 위치에 더 일반적인 잔기임으로부터, 페닐알라닌(phenylalanine)에서 루신(leucine)으로 변경된 73번째 잔기를 가지도록 고안되었다. 구조형성 변경(예를 들면, Y49F, F71Y 및 F73V)을 수반하는, VL4로 고안되는, 이러한 변이체, 변이체를 제조는, 일반적으로 합성되거나, 표 8에서 나타내는 프라이머 쌍을 이용하여 pETDuet 벡터내로 클로닝된다. 상기 결과인 L4-pETFuet 벡터는 표 8의 프라이머 쌍을 이용하여 L5의 P44V 돌연변이를 도입하기 위한 주형으로 사용하였다. 이후 L5 변이체는 쥐과 NMC-4 VL 대신에 pIRES DsRed2의 EcoR1 및 BamH1 위치내로 써브클론하였다. L5-pIRES DsRed 벡터는 표 8에 표시되는 프라이머를 사용하여 L6 및 L7 벡터를 제조하기 위한 주형으로 사용되었다.
인간화 경쇄 변이체 제조에 사용된 주형 및 프라이머 요약
VL
변이체
주형		 단편-1 PCR
프라이머		 단편-2 PCR
프라이머		 최종 VL PCR 프라이머
벡터		 클로닝 부위

L4		 레트로젠(Retrogen) 유래 합성 DNA NMC4-VL-EcoRI-F
및
Kappa-BamHI-R
pIRES-DsRed2-Igk
EcoRI
BamHI

L5		 pETDuet-1의 L4 Fab-L-For
및
LC-P44V-R		 LC-P44V-F
및
Fab-L-Rev		 Fab-L-for 및
Fab-L-Rev
pETDuet-1		 NdeI
XhoI

L5		 pETDuet-1의 L5 NMC4-VL-EcoRI-F
및
Kappa-BamHI-R
pIRES-DsRed2-Igk
EcoRI
BamHI

L6		 pIRES-DsRed2-Igk의 L5 NMC4-VL-EcoRI-F
및
LC-F49Y-R		 LC-F49Y-F
및
Kappa-BamHI-R		 NMC4-VL-EcoRI-F
및
Kappa-BamHI-R
pIRES-DsRed2-Igk
EcoRI
BamHI

L7		 pIRES-DsRed2-Igk의 L5 NMC4-VL-EcoRI-F
및
LC-Y71F-R		 LC-Y71F-F
및
Kappa-BamHI-R		 NMC4-VL-EcoRI-F
및
Kappa-BamHI-R
pIRES-DsRed2-Igk
EcoRI
BamHI

L8		 pIRES-DsRed2-Igk의 L7 5'IRES
및
HuLC-V44P-F49Y-R		 HuLC-V44PF49Y-F
및
3'IRES		 5'IRES
및
3'IRES
pIRES-DsRed2-Igk
EcoRI
BamHI

L9		 레트로젠(Retrogen) 유래 합성 DNA NMC4-VL-EcoRI-F
및
Kappa-BamHI-R
pIRES-DsRed2-Igk
EcoRI
BamHI
다양한 가변 부위의 제조에 사용된 프라이머 서열
정방향
프라이머		 서열 역방향
프라이머		 서열
4-59-huNMC-F 5'-GTTAAGCTTGCCGCCACCATGAA
ACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGGTGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAATCCGG-3'
(서열번호: 54)		 Hu-VH-R 5'-GGATGGGCCCTTGGTGGAAGC
GGAGGAAACGGTCACGAGGGTA-3'
(서열번호: 55)
pcDNA6-F 5'-CACTGCTTACTGGCTTATCG
AAATTA-3'
(서열번호: 56)		 hFc-L235E-R 5'-AAGAGGAAGACTGACGGTCCCCC
CTCGAG-3'
(서열번호: 40)
VH-93A-For 5'-GACACCGCTGTTTACTACT
GCGCTCGTGACCCGGCTGACT-3'
(서열번호: 57)		 VH-V93A-Rev 5'-AGTCAGCCGGGTCACGACCGCA
GTAGTAAACAGCGGTGTC-3'
(서열번호: 58)
HC-L67V-F

 5'-CTGAAATCCCGTGTTACCATC
TCCAAAGAC-3'
(서열번호: 59)		 HC-L67V-R

 5'-GTCTTTGGAGATGGTAACACGGG
ATTTCAG-3'
(서열번호: 60)
HC-N73T-F 5'-ACCATCTCCAAAGACACCTCC
AAAAAC-3'
(서열번호: 61)		 HC-N73T-R 5'-GTTTTTGGAGGTGTCTTTGGA
GATGGT-3'
(서열번호: 62)
HC-V78F-F 5'-AACTCCAAAAACCAGTTCT
CCCTGAAAC-3'
(서열번호: 63)		 HC-V78F-R 5'-GTTTCAGGGAGAACTGGTTTTT
GGAGTT-3'
(서열번호: 64)
HC-K71V-F 5'-CTTACCATCTCCGTAGACAA
CTCCAAAAAC-3'
(서열번호: 65)		 HC-K71V-R 5'-GTTTTTGGAGTTGTCTACGGA
GATGGTAAG-3'
(서열번호: 66)
hu-VH-K71V-F (H9) 5'-CGTGTTACCATCTCCGTAGA
CACCTCCAAA-3'
(서열번호: 67)		 hu-VH-K71V-R (H9) 5'-TTTGGAGGTGTCTACGGAGAT
GGTAACACG-3'
(서열번호: 68)

Fab-L-For		 5'-ATACATATGGACATCCAGATG
ACCCAGAGC-3'
(서열번호: 69)		 Fab-L-Rev 5'-AGACTCGAGTTATCAACACTCTCC
CCTGTTGAAGCT-3'
(서열번호: 70)
NMC4-VL-EcoRI-F 5'-GACGCGAATTCGGACATCCA
GATGACCCAGAGCC-3'
(서열번호: 71)		 Fab-L-Rev 5'-AGACTCGAGTTATCAACACTCTCC
CCTGTTGAAGCT-3'
(서열번호: 70)
5'IRES 5'-AGCTGGTTTAGTGA-3'
(서열번호: 72)		 3'IRES 5'-CAAGCGGCTTCGGCCAG-3'
(서열번호: 73)
LC-Y49F-F 5'-CCAAGCTGCTGATCTTCTAC
ACCA-3'
(서열번호: 74)		 LC-Y49F-R 5'-TGGTGTAGAAGATCAGCAG
CTTGG-3'
(서열번호: 75)
LC-F83I-F 5'-CAGCCCGAGGACATCGCCAC
CTACTACTGC-3'
(서열번호: 76)		 LC-F83I-R 5'-GCAGTAGTAGGTGGCGATGTCCT
CGGGCTG-3'
(서열번호: 77)
LC-P44V-F 5'-AAGCCCGGCAAGGCCGTC
AAGCTGCTGATC-3'
(서열번호: 78)		 LC-P44V-R 5'-GATCAGCAGCTTGACGGCCTTGC
CGGGCTT-3'
(서열번호: 79)
LC-F49Y-F 5'-GCCGTCAAGCTGCTGATCTA
CTACACCAG-3'
(서열번호: 80)		 LC-F49Y-R 5'-CTGGTGTAGTAGATCAGCAGCT
TGACGGC-3'
(서열번호: 81)
LC-Y71F-F 5'-GGCAGCGGCACCGACTTCA
CCCTGACCATC-3'
(서열번호: 82)		 LC-Y71F-R 5'-GATGGTCAGGGTGAAGTCGGTG
CCGCTGCC-3'
(서열번호: 83)
HuLC-V44P, F49Y-F 5'-GGCAAGGCCCCCAAGCTGCT
GATCTACTACACCAG-3'
(서열번호: 84)		 HuLC-V44P, F49Y-R 5'-CTGGTGTAGTAGATCAGCAGC
TTGGGGGCCTTGCC-3'
(서열번호: 85)
이러한 첫 번째 변이체 세트(set)의 클로닝과 동시에, 상기 4-59 수용체 생식세포 서열의 컴퓨터로 만들어진 3차원 모델은 BLAST 검색에서 HCDR3를 통한 전체 서열과 가장 높은 서열 상동성(88%)을 갖고, 구조형성 영역에서 89%의 서열 동일성을 갖는 것이 확인된 1DNO.pdb 구조(예를 들면, 2.3 Å 옹스트롱(angstrom) 해상도)를 이용하여 만들어진다. 상기 구조 1AOK.pdb는 81% 서열 동일성을 가진 인간화 VH 서열을 주형으로 하여 선택된다. 쥐과 NMC-4 Fv의 2 개의 결정학적 구조가 이용될 수 있다: 항원에 결합(Celikel et al, Nat. Struct. Biol. 5:189-194 (1998))하고, 또한 프로토타입(prototype) 인간화 변이체의 VH 도메인과 가장 적합하도록 선택된 1OAK.pdb(예를 들면, 2.2 Å 해상도), 및 돌연변이 항원에 결합하는 1FNS.pdb (2.0 Å 해상도). 1OAK.pdb 및 1FNS.pdb 모두 사실상 동일한 VH/VL 경계 각도를 가지고, 그래서 1OAK.pdb는 인간 수용체 및 인간화 VH 및 VL 서열의 모델 중첩을 위해 사용된다.
NMC-4 VH와 4-59의 백본(backbone) 구조를 중첩해 보았을 때, 세 영역에 차이가 관찰될 수 있다. 첫 번째, 차이는 HCDR1의 부분을 포함하는 H27 내지 H33 잔기에 존재한다. 본 개시의 이론에 따라 결합되지 않는, 이러한 잔기들은 HCDR2와 HCDR3에 접촉하고, 함께 항원 결합 부위의 부분을 형성한다. 쥐과 NMC-4에서는 발린(Val)이고, 4-59 서열에서는 트립토판(Trp)인, 34번째 잔기는 H27-33 고리의 변형된 구조를 잠재적으로 야기하고, 이를 통해 역-돌연변이의 후보가 될 수 있음이 예상된다. 두 번째, 차이는, CDR3 고리 부분을 형성하는, H52 내지 H55 잔기에 존재한다. 구조형성 잔기 71(마우스에서는 라이신(Lys), 4-59에서는 발린(Val))은 이런 차이에서 잠재적인 역할을 수행하고, 이를 통해 역-돌연변이의 후보가 될 수 있는 것으로 여겨진다. 3개의 추가적 잔기가 잠재적 항원 결합 저해능을 갖는 4-59 구조에서 확인되었다. 마우스에서 발린(Val)과 비교하여 이소루신(Ile)으로 보존적으로 변형된 H37; H73(마우스에서 아스파르트산(Asp)와 비교하여 4-59에서 트레오닌(Thr)인, 일반적 변형을 나타내는), 및 큰 변형을 나타내는 H78(마우스에서 발린(Val)과 비교하여 4-59에서 페닐알라닌(Phe)인). 세 번째, 차이는 다양성이 예상되는 CDR3에 존재한다.
생식세포 018과 프로토타입(prototype) 인간화 VL 도메인의 모델링을 위한, 상기 1IGM.pdb 구조(예를 들면, 2.3 Å해상도)는 018과 L34, L45, L47 및 L92 잔기에 4 개의 차이가 나는, 매우 높은 서열 동일성(예를 들면, 95%)을 가진다. 01BJ1.pdb 구조(예를 들면, 2.4 Å 해상도)는 97/107 잔기와 매치됨에 따른(예를 들면, 91% 서열 동일성), 프로토타입(prototype) 인간화 VL을 주형으로 선별되었다.
NMC-4 및 018 VL 구조의 VL 백본(backbone)의 훌륭한 적합은 서열 동일성과 일치한다. 유일하게 현저한 구조적 차이는 VH와 접촉하고, 이를 통해 패킹(packing)과 턴(turn), 결합 주머니에 영향을 주는, L39-L45 잔기를 포함하는 고리(loop)이다. 본 개시의 이론에 따라 결합되지 않는, 44번째 잔기(예를 들면, 마우스에서 발린(Val), 4-59에서 프롤린(Pro))는 이러한 차이의 원인이 될 수 있고, 이를 통해 컴퓨터 모델을 기초로 한 역-돌연변이의 후보가 될 수 있다.
리스토세틴(ristocetin)으로 유도된 혈소판 응집 분석법에서 시험관 내(In vitro) 저해 활성: 컴퓨터 모델링 예상이 활성의 효과를 정확히 예측하는지의 여부를 조사하기 위하여, VH2 프로토타입(prototype) 변이체는 VL 변이체(예를 들면, L4, 5, 6 및 7)와 대응되고, 프로토타입 L5는 VH 변이체(예를 들면, H2, H4, H5, H6, H7 및 H8)와 조합된다. 상기 항체 변이체는 HEK293T 세포에 일시적 형질전환에 의해 제조되고, 실시예 1의 NMC-4 키메라 항체에 기재되어 있는 필터링된 세포 상등액으로부터 정제되었다.
리스토세틴으로 유도된 혈소판 응집 분석법은 실시예 1에 기재된 동결건조된 혈소판을 사용하여 수행하였다. 흡광도 변화(예를 들면, 탁도)는 Spectromax 플레이트 리더((Molecular Devices)를 사용한 듀플리케이트(duplicate)로 항체의 연속 희석을 통해 측정하였고, 결과는 다양항 정제된 항체 변이체의 EC50 값을 측정하는 Prism 소프트웨어를 이용하여 분석하였다(예를 들면, 표 9 참조).
H2 및 L5를 포함하는, 상기 인간화 항체의 첫 번째 버전(version)은, 모체의 키메라(예를 들면, EC50이 0.18nM)와 동일한 활성(예를 들면, EC50이 0.13)을 나타낸다(표 10). 다음으로 인간 구조형성 잔기에 역으로 연속적인 점 돌연변이를 갖는 중쇄 변이체가 테스트되었다(예를 들면, H2 내지 H6 변이체). 상기 변이체는 L5-L8 변이체가 1.5배 낮은 EC50을 나타내는 것을 제외하고, 매우 유사한 활성을 나타내었다(표 9). 흥미롭게도, 이런 변이체의 수율은 낮았고(예를 들면, 다른 변이체의 1/10) 이것은 상기 인간화 중쇄 및 경쇄 간 상호작용이 항체의 안정성이 중쇄 및 경쇄의 올바른 조립에 의존적이므로, 이러한 조합의 돌연변이와 반대의 효과를 가진다는 것을 제시한다. 유사하게 L5 변이체 항체가 만들어지고, 테스트되었으며, 인간에 역으로 유사하게 변경되지 않은 것은, 놀랍게도, 구조형성의 변화를 필요로 하지 않다는 것을 제시하는 활성의 효과를 나타내었다. 수용체 구조형성과 문제가 되는 것이 예측되는 NMC-4 가변 부위 구조형성 사이에 차이가 없다는 것을 가리키는 이러한 결과는 그 능력에 영향을 주지 않고, 그 차이는 컴퓨터 모델링에 의해 관찰되는 구조적 차이에 기초한다고 생각되는 가장 표시되는 차이를 포함하고, 가장 큰 구조적 차이(예를 들면, VH의 V71K 및 T73N,VL의 P44V)를 포함하여 표시되는 차이를 포함한다. 이러한 결과에 따라, 완벽하게 인간 구조형성을 수반하는 중쇄 변이체가 제조되었고(예를 들면, H9), 단순하게 CDR이 융합된 VH를 제시하였다. 다음으로 이런 변이체는 완벽한 인간 구조형성에서 단순 CDR 융합을 제시하는 추가적 변이체, L9뿐만 아니라, 경쇄 변이체와의 조합을 테스트하였다. 놀랍게도, 바로 CDR이 융합된 항체는 모든 활성을 보유하였다(EC50이 0.08nM; 표 10). 이러한 결과는, 비록 상기 공개된 결정학적 결과가 다양한 CDR이 항원 결합에 기여한다는 것을 나타내고(Celikel et al, 혈구s Mol Dis.23:123; Celikel et al., Nat. Struct Biol 5:189 ), 이를 통해 상기 6개 CDR의 상대적 제시에서 어떠한 작은 변화가 치화도에 영향을 줄것으로 예측됨에도 불구하고, 예상치 않게, 쥐과 항체로부터 선택된 인간 구조형성으로 CDR을 스트레이트(straight)로 융합하는 것이 원래 쥐과 항체의 전체 활성을 보유한다는 것을 증명하였다.
리스토세틴(ristocetin)에 의해 유도된 vWF에 의해 매개되는 혈소판 응집 시험에서 인간화 변이체와 모체 NMC-4 키메라의 비교를 위한 EC50 값의 비교.
항체
(1st set)		 EC50
(nM)		 항체
(2nd set)		 EC50
(nM)
NMC4 키메라 0.18±0.03 (n=9) H9, L4 0.11
L5, H2 0.13 (n=2) H9, L5 0.14
L5, H4 0.15 H9, L6 0.13
L5, H5 0.18 H9, L7 0.11
L5, H6 0.18 H9, L8 0.08
L5, H7 0.16 H9, L9 0.12 (n=2)
L5, H8 0.28
L4, H2 0.14
L6, H2 0.14
L7, H2 0.15
CDR 영역의 인간화: 경쇄 및 중쇄의 CDR1을 인간화하도록 고안된, 추가적 변화를 제시하는 분자적 모델링은 NMC-4 LCDR1(예를 들면, 24, 30 및 31 잔기) 및 NMC-4 HCDR1(예를 들면, 27, 29, 30 및 34 잔기)에 취급될 수 있다. 추가적으로, HCDR2 서열의 두 개의 잔기(예를 들면, 61 및 62)는, 취급될 수 있는 변형(예를 들면, 61 잔기의 세린(Ser)을 프롤린(Pro)으로 및 62 잔기의 알라닌(Ala)을 세린(Ser)으로)의 제시를 위해서도 고려될 수 있다. 따라서, 일명 "슈퍼(Super) 인간화" 변이체(Tan et al, 2002 J Immunol. 169:1119-1125)라 불리는 시리즈(series)는 표 12에 기재되어 있는 주형 및 프라이머 쌍으로부터 제조되었다(예를 들면, 전체 인간 LCDR1을 갖는 변이체를 제시하는 L10; 부분적으로 인간화 HCDR1 영역을 제시하는 H12 및 H13)(표 11).
쥐과 CDR 잔기에서 그들의 4-59에 대응되는 부분이 변화된 돌연변이

VH 		슈퍼(Super)-인간화
(쥐과에서 인간으로)
VL 		슈퍼(Super)-인간화
(쥐과에서 인간으로)
H12 F27G, L29I, T30S L10 S24Q, N30S, K31N
H13 F27G, L29I, T30S, V34W L11 S24Q, N30S, K31N, Y50D, T51A, S53N, H55E, S56T
H14 F27G, L29I, T30S, V34W,
S61P, A62S
H15 F27G, L29I, T30S, D31S, G33Y V34W, G35S, S61P, A62S,
H16 F27G, L29I, T30S, V34W,
M50Y, W52Y, G53Y, D54S, D58N
S61P, A62S
전형적인 방법에서, 컴퓨터 모델링 예측은 상기 인간화 항체의 활성을 측정할 수 있는 하나 이상의 분석법의 수행에 의해 테스트되었다. 예를 들면, L11 변이체는 H9에 공동-형질전환되었고, 상기 항체는 리스토세틴으로 유도된 혈소판 응집 분석법으로 테스트되었다. 표 14에서 보는 바와 같이, LCDR1을 018에 전체가 되게 변환하는 상기 세 개 돌연변이의 도입은 내성화 되고 그 능력에 있어 현저하 소실을 야기하지 않는다. H12, 13 및 14 변이체가 L9과 조합되었을 때, H12-L9 변이체 항체는 그 능력을 약간 소실하지만, 추가적인 V34W 돌연변이는 전체 능력을 보유하고, S61P 및 A62S 돌연변이의 추가는 능력에서 약간 영향을 주는 것으로 나타났고, 이것은 이러한 잔기들이 활성에 영향을 미치지 않고, 4-59 서열로 변환될 수 있음을 가리킨다. 다음으로, vWF 저해 활성을 유지하는 LCDR2의 중요도는 표 11 및 12에서 가리키는 주형 및 프라이머 쌍으로부터 상기 VL 변이체 L10을 암호화하는 플라스미드를 사용하여 전체 LCDR2 (YTSSLHS)(서열번호: 11)가 인간 생식세포 018 LCDR2(DASNLET)(서열번호: 118)로 교체된 L10 사슬의 변이체의 제조에 의해 평가된다. 다음으로 이러한 새롭게 제조된 변이체(L11)는 항체 변이체 L11-H14를 만들기 위해 H14와 쌍을 이룬다. 여전히 나노몰(nanomolar)의 효능을 나타내는 동안, 이런 변이체는 혈소판 응집 분석에서 키메라와 비교하여 10배 낮은 농도(EC50이 1.63nM)를 나타내고, 이것은 LCDR2가 상기 인간화 항체의 적절한 활성에 필요할 수 있음을 제시한다.
"슈퍼(Super)-인간화" 변이체가 어떻게 제조되는지에 대한 요약
변이체 주형 단편-1 PCR
프라이머 		단편-2 PCR
프라이머 		최종 VL
PCR 프라이머 		벡터 클로닝
부위
H12 PCDNA6-IgG1(dm)의 H9 pcDNA 6-F
및
huH12-R		 huH12-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6-F
및
hFc-L253E-R		 pcDNA6-
IgG1(dm)		 HindIII
ApaI
H13 pcDNA6-IgG(dm)의 H9 pcDNA6-F
및
hyH13-R		 huH13-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6-F
및
hFc-L253E-R		 pcDNA6-
IgG1(dm)		 HindIIIApaI
H14 pcDNA6-IgG1(dm)의 H13 pcDNA6-F
및
hyH14-R		 huH14-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6-F
및
hFc-L253E-R		 pcDNA6-
IgG1(dm)		 HindIII
ApaI
H15 pcDNA6-IgG1(dm)의 H14 pcDNA6-F
및
hyH15-R		 huH15-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6-F
및
hFc-L253E-R		 pcDNA6-
IgG1(dm)		 HindIII
ApaI
H16 pcDNA6-IgG1(dm)의 H15 pcDNA6-F
및
hyH16-R		 huH16-F
및
hFc-L235E-R		 pcDNA6-F
및
hFc-L253E-R		 pcDNA6-
IgG1(dm)		 HindIII
ApaI
L9 pETDuet-1의 L1 NMC-4-VL-EcoRI-F 및
LC-Y71F-R		 LC-Y71F-F
및
Kappa-BamHI-R		 NMC-4-VL-EcoRI-F 및
Kappa-BamHI-R		 pIRES-
DsRed2-
Igκ		 EcoRI
BamHI
L10 pIRES-DsRed2-Igk의 L9 5'IRES
및
huL10-R		 huL10-F
및
3'IRES		 5'IRES
및
3'IRES		 pIRES-
DsRed2-
Igκ		 EcoRI
BamHI
L11 pIRES-DsRed2-Igk의 L10 5'IRES
및
huL11-R		 hul11-F
및
3'IRES		 5'IRES
및
3'IRES		 pIRES-
DsRed2-
Igκ		 EcoRI
BamHI
인간화 CDR 변이체를 제작하기 위해 사용된 프라이머
정방향
프라이머		 서열 역방향
프라이머		 서열
5'IRES 5'-AGCTGGTTTAGTGA-3'
(서열번호: 72)		 3'IRES 5'-CAAGCGGCTTCGGCCAG-3'
(서열번호: 73)
huL10-F 5'-ACCATCACCTGCCAAGCCAGCCAG
GACATCAGCAACTACCTGAACTGG-3'
(서열번호: 86)		 huL10-R 5'-CCAGTTCAGGTAGTTGCTGATGT
CCTGGCTGGCTTGGCAGGTGATGGT-3'
(서열번호: 87)
huL11-F 5'-CCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCA
GCAACCTGGAAACCGGCGTGCCC-3'
(서열번호: 88)		 huL11-R 5'-GGGCACGCCGGTTTCCAGGTTGCTGG
CGTCGTAGATCAGCAGCTTGGG-3'
(서열번호: 89)
pcDNA6-F 5'-CACTGCTTACTGGCTTATCG
AAATTA-3'
(서열번호: 56)		 hFc-L235E-R 5'-AAGAGGAAGACTGACGGTCCCCC
CTCGAG-3'
(서열번호: 40)
huH12-F 5'-GTTTCCGGTGGCTCCATCTC
CGACTACGGTGTTGACTGGA-3'
(서열번호: 90)		 huH12-R 5'-TCCAGTCAACACCGTAGTCGGAG
ATGGAGCCACCGGAAAC-3'
(서열번호: 91)
huH13-F 5'-GTTTCCGGTGGCTCCATCTCCGAT
ACGGTTGGGACTGGATCCGTCAG-3'
(서열번호: 92)		 huH13-R 5'-CTGCAGGATCCAGTCCCAACCGT
AGTCGGAGATGGAGCCACCGGAAAC-3'
(서열번호: 93)
huH14-F 5'-GTTCCACCGACTACAACCCC
TCTCTGAAATCCCGT-3'
(서열번호: 94)		 huH14-R 5'-ACGGGATTTCAGAGAGGGGTT
GTAGTCGGTGGAAC-3'
(서열번호: 95)
huH15-F 5'GTTTCCGGTGGCTCCATCTCCTCCTACTATTGGTCCTGGATCCGTCAG-3'
(서열번호: 96)		 huH15-R 5'-CTGACGGATCCAGGACCAATAGTA GGAGGAGATGGAGCCACCGGAAAC-3'
(서열번호: 97)
huH16-F 5'-GAATGGATCGGTTATATCTATTATTC
CGGTTCCACCAACTACAACCCCTCT-3'
(서열번호: 98)		 huH16-R 5'-AGAGGGGTTGTAGTTGGTGGAACCG
GAATAATAGATATAACCGATCCATTC-3'(서열번호: 99)
다음으로 변이체 H14내 인간화 HCDR1에서 남아있는 쥐과 잔기(예를 들면, H31, H33 및 H35)의 중요성은 상기 VH 생식세포 4-59 서열내 그 인간 부분에 대응되는 이러한 잔기로의 변경(예를 들면, D31S, G33Y 및 D35S 변경)을 통해 실시되었다. 상기 결과로 나온 구조, H15는 H14내 GGSISDYGWD (서열번호: 111)의 부분적 인간화 서열과 비교하여 HCDR1의 GGSISSYYWS (서열번호: 110) 서열을 갖는다. 결과적으로, H15의 전체 HCDR2는 인간 HCDR1 및 HCDR2를 완벽하게 가지는, 또다른 변이체, H16을 만들기 위해, VH4-59 내 그 인간 부분에 대응되도록 변환하였다(MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8)로부터 YIYYSGSTNYNPSLKS(서열번호: 119)으로, 총 7 잔기 차이). 변이체 H15 및 H16은 각각, 항체 변이체 H15-L10 및 H16-L10을 만들기 위해 개별적으로 경쇄 변이체 L10과 짝을 이룬다.
이러한 변이체들은 그 활성 측정을 위해 혈소판 응집 분석법으로 평가되었다. 표 14에서 나타내는 결과는 항-vWF 활성이 없는 인간 서열 내 전체 HCDR1의 대체를 제시한다. 이것은 HCDR1에 남아있는 세 개의 잔기(예를 들면, H31의 D 위치, H33의 G 위치, H35의 D 위치)가 비록 이러한 잔기들이 Celikel, et al (Nat. Struct Biol 5:189)에 보고되어 있는 결정 구조에 의한 제안에 따라, 항원에 직접적으로 접촉하지 않는다고 할지라도, 활성을 유지하는 데 중요하다는 것을 의미한다. 인간 4-59 HCDR2를 전체적으로 갖는 대체 HCDR2는 HCDR2내 3개의 잔기(예를 들면, H53, H54, 및 H58)가 vWF 항원에 직접적으로 상호작용한다는 것을 의미하는, Celikel et al.의 결정학적 연구로부터 지시된 바와 일치하게, H15의 잃어버린 활성을 회복할 수 없다.
"슈퍼인간화(superhumanized)" 변이체의 EC50 값
항체 EC50 (nM)
NMC-4 키메라 0.18±0.03 (n=9)
H9, L9(CDR-이식) 0.12 (n=2)
H12, L9 0.29
H13, L9 0.16 (n=2)
H14, L9 0.13 (n=2)
H13, L10 0.20
H14, L10 0.22±0.05 (n=5)
H14, L11 1.63
H15, L10 ND
H16, L10 ND
실시예 3: 항체의 재포맷팅(reformatting) 동종형
일반적인 방법에서, IgG1은 보체 활성화 및 효과기 반응의 유도에 기여하는 활성형 동종형인 반면, IgG4는 상대적으로 비활성화되어 있으므로, 돌연변이화된 IgG1 포맷(format)으로부터 IgG4 포맷(format)으로 VH 변이체를 재포맷(reformat)하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 후보 VH 변이체들은 개발을 위해 후보들을 제조하기 위하여 돌연변이화된 IgG1 포맷(format)으로부터 IgG4 포맷(format)으로 변환되었다. 추가로, 경쇄 및 중쇄의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 발현 벡터 pST0518의 다중 클로닝 부위(multiple cloning 부위)에 써브클로닝(subcloning)을 용이하게 하기 위하여, 5'(예를 들면, XhoI 및 HindIII 부위) 및 3'(예를 들면, BamHI 및 NotI 부위) 말단에 제한효소 절단 부위가 끼워들어가도록 다시 디자인하였다(표 15).
예를 들면, 인간화 VH 변이체의 두 가지, H9 및 H14는 IgG1 불변 영역을 IgG4 불변 영역으로 대체하거나, 중쇄 발현 카세트(cassette)의 5' 말단의 XhoI 및 BamHI 부위 및 3' 말단의 HindIII 및 NotI 부위에 도입함으로써, IgG4 포맷(format)으로 변환하였다. IgG1 및 IgG4 모두는 가변 및 불변 영역의 정션(junction) 근처에 자연적으로 만들어지는 ApaI 부위를 포함한다. 이 부위는 IgG1 대신에 IgG4 클론을 위해 이용된다. BamHI 및 NotI 제한효소 부위는 나중에 pST0518 벡터내로의 써브클로닝(subcloning)을 용이하게 하기 위해 서열의 3' 말단에 위치한다. ApaI 부위로부터 종결 코돈으로, BamHI 및 NotI 부위가 추가된, 상기 인트론(intron)이 제거된 IgG4 불변 영역 서열은 Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA)에 의해 일반적으로 합성되었다. 추가로, pST0518 벡터 내 신호 서열은 중쇄 가변 부위의 5' 말단에 있는 XhoI 및 HindIII 부위에 끼워들어가고, Igκ신호 서열이 인써트(insert) 되도록 디자인된 프라이머를 갖는 전달 오버래핑(overlapping) PCR에 의해 Igκ 리더(leader) 서열로 변경되었다.
H9 및 H14 중쇄 서열은 상기 프라이머 영역과 동일하고, 이를 통해 같은 프라이머와 클로닝(cloning) 전략(strategy)이 둘다에 사용되었다. 두 개의 분리된 PCR 산물은 huNMC4-H9(및 huNMC4-H14) 중쇄 가변 부위에 필요한 변형이 각각 하나씩 끼어들어감으로써, 만들어진다. 정방향 프라이머에 XhoI 및 HindIII 제한효소 부위가 끼어들어가고 Igκ신호 펩티드가 증폭되는 PCR 반응은 pIRESdsRed-HUL10을 주형으로 하고, IgKLF(서열번호: 100) 및 IgKHnmcR(서열번호: 101) 프라이머를 사용하여 수행되었다(표 15a 및 표 15b 참조). 이것은 pCDNA6-H9(또는 pCDNA6-H14)을 주형으로 하고, 14VHF(서열번호: 102) 및 14VHR(서열번호: 103) 프라이머를 이용하고 첫 번째 PCR 반응의 30 뉴클레오티드(nucleotide)에 오버랩(overlap)되는 두 번째 반응 단계를 따른다. 상기 PCR 산물은 ApaI 부위를 통한 IgG1 불변 영역의 최초 5개 아미노산뿐만 아니라 H9(또는 H14) 가변 부위를 포함한다. 상기 불변 영역의 최초 5개 아미노산은 IgG1 및 IgG4 사이와 차이가 없다. 또한 상기 반응은 IgG4 불변 영역의 삽입 이전에 가변 부위의 클로닝(cloning)을 용이하게 하기 위하여 NotI 부위 다음에 ApaI 부위를 추가하였다. 상기 카파(kappa) 리더(leader)는 정방향 프라이머는 첫 번째 반응의 것(IgKLF)이고, 역방향 프라이머는 두 번째 반응의 것(14VHR)으로 하고 처음 두 단계의 반응 산물을 주형으로 사용한 세 번째 PCR 단계에 의해 업스트림(upstream)에 추가되었다. 이 반응으로부터 얻은 산물은 XhoI/NotI으로 절단하고, 유사하게 잘려진 플라스미드 백본(backbone) pCIneo 내로 삽입하였다. 이러한 라이게이션(ligation)은 Igκ 리더 및 NMC4-H9(또는 H14)의 가변 부위를 포함하는, 클로닝 중간체 pCI-NMC4-VH9var 또는 (pCI-NMC4-VH14var)을 만들었다. de novo 합성된 IgG4 불변 영역을 포함하는, Blue Heron Biotechnology로부터 얻은 플라스미드는 ApaI 및 NotI으로 절단하고, 상기 1kb IgG4 불변 영역 단편을 겔-정제하고, ApaI/NotI로 절단된 pCI-NMC4-VH9var 또는 (pCI-NMC4-VH14var)내로 라이게이션(ligation)하였다. 이것으로 플라스미드 pCI-NMC4-VH9 및 pCI-NMC4-VH14를 제조하였다. DH5α 세포 내로 형질전환 후에, 개별 클론으로부터 얻은 플라스미드 인써트(insert)는 그것이 정확한지 확인하기 위해 염기서열을 분석하였다.
Figure pct00003
L9 및 L10 경쇄의 변경은 PCR에 의해 수행되었다. L9 및 L10 경쇄가 상기 프라이머 영역과 동일하므로, 상기 같은 프라이머와 같은 전략이 두 가지에 사용되었다. 두 개의 분리된 PCR 주형이 각 경쇄를 위해 제조되었다. 첫 번째 PCR 단계는 5' 말단에 XhoI 및 HindIII 제한효소 부위를 끼워넣는다. 두 번째 PCR 단계는 첫 번째 30 뉴클레오티드에 오버랩(overlap)하고, 단편의 3' 말단에 BamHI 및 NotI 부위를 끼워넣는다. 이러한 두 개의 분리된 오버래핑(overlapping) PCR 산물은 첫 번째 PCR 단계의 정방향 프라이머 및 두 번째 단계의 역방향 프라이머를 사용한 증폭에 의해 이러한 변경들이 끼워들어간, 최종 오버래핑(overlapping) PCR 산물을 제조하기 위하여 세 번째 PCR 반응에서 주형으로 사용되었다. 세 번째 PCR 반응으로부터 얻은 산물은 XhoI/NotI으로 절단하고, 플라스미드 pCI-NMC4-VL9 및 pCI-NMC4-VL10을 생산하도록, 유사하게 절단된 플라스미드 pCI-noe(Invitrogen)내로 삽입하였다(경쇄 구조에 이용된 전형적인 프라이머 및 전략을 나타내는 표 16a 및 표 16b 참조).
Figure pct00004
H9-L9 및 H14-L10의 IgG4 동정형은 상기 실시예 1에서 기재한 바와 같이, HEK293T 세포로부터 생산되고 단백질 A 친화도 크로마토그래피(chromatography)에 의해 정제되었다. 다음으로 상기 정제된 항체는 상대적 능력을 측정하기 위하여 vWF에 의해 매개된 혈소판 응집 분석법을 수행하였다. 표 17에서 보는 바와 같이, IgG4 동종형으로의 전환은 그 능력에 영향을 주지 않았다.
리드(lead) 항-vWF IgG1 및 IgG4 변이체의 리스토세틴(ristocetin)에 의해 매개되는 혈소판 응집 활성의 비교.
항체 변이체 이소형
(동종형) 		혈소판 응집
EC 50 평균 값 (2 번의 개별 실험으로부터)
NMC-4 키메라 IgG1 키메라 1.25 nM (1.3nM, 1.2nM)
H9-L9 IgG1 1.30 nM (1.3nM, 1.3nM)
H9-L9 IgG4 1.40 nM (1.3nM, 1.5nM)
H14-L10 IgG1 1.20 nM (1.1nM, 1.3nM)
H14-L10 IgG4 2.15 nM (2.3nM, 2.0nM)
실시예 4: vWF 또는 A1 도메인에 대한 항체의 결합.
His 태깅된 A1 도메인 항원의 클로닝: 본 개시의 이론에 따라 결합되지 않는, NMC-4는 vWF가 활성화되었을 때만 정상적으로 접근할 수 있는, vWF의 A1 도메인에 결합한다는 가설이 있다. 또 다른 접근으로 완전히 활성화된 vWF와 동일한 능력을 갖고 GP1ba에 결합하는 것이 보고되어 있는(Celikel et al, 1997), vWF의 분리된 A1 도메인을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 그러므로, 상기 A1 도메인은 마이크로웰(micro웰) 반응 연구를 위한 기질로 제공하기 위해 클로닝되었다. 전장 인간 vWF cDNA를 포함하는 플라스미드 클론은 ATCC(Cat#67122)로부터 구입하였다. vWF A1 도메인(예를 들면, 499-729 잔기)은 vWF-A1-for(5'-CCCAGGAATTCCTCGGAACCGCGTTGCAC-3'(서열번호: 112)) 및 vWF-A1-Rev(5'- CCGATGCGGCCGCTCACCTCTTGGGCCCCAG-3'(서열번호: 113)) 프라이머를 가지고 상기 클론으로부터 증폭되었다. 상기 PCR 산물은 겔 정제되고, EcoRI 및 NotI으로 절단되고, pETDuet-1 벡터내로 클로닝되었다. 상기 라이게이션된 산물은 A1 도메인의 산화된 형태를 제조하기 위하여 DH5α 내로 형질전환되었다.
랫트 A1 도메인을 발현시키는 플라스미드를 구성하기 위하여, 랫트 지노믹(genomic) DNA는 랫트 간으로부터 제조사의 방법(Molecular Research Center, Inc., Cat# DN127, Cincinnati, Ohio)에 따라 DNAzol 용액으로 분리되었다. 상기 지노믹(genomic) DNA는 프라이머 (랫트-vWF-A1-F (5'-AGCGAATTCCCCCGAACCCCCCCTGCACAACTTC-3'(서열번호: 114) 및 랫트-vWF-A1-R (5'-AGTGCGGCCGCTTATCACCTTTTGGGTCCTGGTGATGAAACC-3'(서열번호: 115)로 한 PCR 반응에 이용하였다. 상기 PCR 산물은 EcoRI 및 NotI으로 절단되었고, pETDuct-1 벡터의 같은 부위에 클로닝되었다. 상기 라이게이션(ligation)된 산물은 DH5α 반응능 세포로 형질전환되었다.
항생제, 카베니실린(Carbenicillin), 카나마이신(Kanamycin), 및 테트라싸이클린(Tetracycline)이 포함된 박테리아 배양 배지 1 리터에 하룻밤동안 배양된 박테리아 배양액 25 ml을 접종하였다(예를 들면, p35 [pET-Duet-랫트-A1] 또는 p36 [pET-Duet-human-A1] 플라스미드를 수반하는 균주 Origami B). 상기 배양액은 37℃ 쉐이커(shaker)에서 OD600에서 0.6-0.8이 되도록 성장시켰다. 재조합 단백질의 발현은 최종 농도 1 mM이 되도록 IPTG를 추가함에 의해 유도하였고, 배양액의 성장은 박테리아를 JA-10 로터(Beckman)로 6,000 rpm에서 원심분리를 통하여 수확하기 전까지 추가로 37℃에서 4-5시간동안 연속하였다. 상기 세포 펠렛(pellet)은 -80℃에서 얼리거나, 완벽한 단백질 분해효소 저해제(Roche) 타블렛(tablet) 2개가 녹아있는 것을 포함한 20ml의 PBS에 펠렛을 재부유하는 과정을 즉시 거치고, 결과로 얻어진 세포 부유액을 세포 파괴에 2번 2분 싸이클(cycle)을 얼음에서 수행하였다(예를 들면, 일정한 듀티(duty) 싸이클 셋팅 및 1-2의 아웃풋(output) 콘트롤 셋팅된 마이크로 팁(micro-tip)으로 고정된 Branson Sonifier 250 ). 상기 세포 용해물은 JA-20 로터(Beckman)에서 16,000 rpm으로 4℃에서 30분동안 원심분리하였다. 상기 상등액은 결합 완충용액(5 mM 이미다졸(imidazole), 0.3 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 평형화된 His-Select HF 니켈 친화도 겔 (Sigma)이 충진된 2ml 컬럼(column)에 적용하기 전에 0.45 uM 주사기 필터를 통해 필터링하였다. 상기 크로마토그래피는 유속이 1 ml/분이 되게 조절하는 주사기 펌프(pump)를 사용하여 수행되었다. 상기 컬럼은 20 ml 결합 완충용액으로 세척한 후, 단백질을 250 mM 이미다졸(imidazole), 0.3 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0으로 용출하고, 1 ml씩 분획물을 수집하였다. 주요 단백질이 용출액의 처음 4개 분획물 내에 용출되었다. 단백질의 크기(~28 kD) 및 보전성은 쿠마시(coomassie)로 염색된 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)로 모니터링하였다. 피크(peak) 분획물을 모두 모으고, 필요하다면 2.5 ml로 농축하고, PD-10 컬럼(Amersham/GE-Healthcare)을 이용하여 PBS로 제염하였다. 단백질의 농도는 라우리(Lowry) 단백질 분석법(BioRad DC Protein Assay)을 이용하여 측정하였다.
결합 반응속도(kinetics): Kon, Koff 및 Kd 값을 측정하기 위하여, 유로피움 (N1 킬레이트) 항체 접합체를 합성하고 정제하는, 민감도 분석을 수행하였다. 이러한 Eu 표지된 NMC-4 키메라와 A1 항원이 고정된 동종형 대조군 항체의 결합은 분리-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay(DELFIA)를 이용하여 측정되었다.
예를 들면, 대조군 항체(예를 들면, 동종형 대조군 MOPC-21, 인간 골수종 혈장의 IgG1/κ; Sigma-Aldrich, St Louis MO) 및 NMC-4 키메라가 Eu 표지되었다. 구체적으로, 항체는 멸균 필터링된 인산나트륨 완충용액(96 mM, pH 7.4)을 추가하고, 낮은 분자량의 1차 아민(amine)을 제거하기 위하여 인산 완충 용액(PBS; 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, pH 7.4, 138 mM NaCl 및 2.67 mM KCl)내로 광범위하게 투석하였다. 투석된 항체는 세척된 MicroSep concentrator로 JA-20 로터(rotor)로 9500 RPM(7000×g)에서 4℃에서 20분 동안 농축하였다. 항체는 최종 농도가 100 mM NaHCO3, pH 9.3이 되도록 포함된 PBS로 4.0 mg/ml이 되도록 조정하였다. 상기 mAb/중탄산염 혼합물(0.250 ml)은 Eu3+ (Eu-N1-ITC; Perkin Elmer Life Sciences, Waltham MA)로 킬레이트화된 0.2 mg N 1-(p-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriamine-N 1,N 2,N 3,N 3-tetraacetic acid를 포함한 바이알을 약하게 위 아래로 파이펫팅(pipetting)함으로써 혼합하였다. 항체 혼합액과 아민-반응 킬레이트는 스터링(stirring) 없이 4℃에서 하룻밤 동안 반응하도록 놔두었다.
표지된 항체 혼합액은 PBS로 미리 평형화된 NAP-10 컬럼(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)에서 분리하기 위해 적용하였다. 분획물(예를 들면, 0.5 ml)은 컬럼 완충 용액으로 PBS를 이용하여 수집하였다. 샘플(sample)은 SpectraMax 384 흡광도 플레이트 리더(absorbance plate reader)를 이용하여 전체 단백질(예를 들면, Bradford reagent; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)을 분석하였고, DELFIA 강화 용액(Enhancement Solution, Perkin-Elmer)으로 1: 10,000 희석한 후에, Victor2 다표지 플레이트 리더(multi-label plate reader, Perkin-Elmer)를 이용한 시분해 형광(time-resolved fluorescence, TRF)을 통하여, Eu를 분석하였다. 단백질과 Eu 표지 모두에서 양성인 분획물을 모두 합치고 런닝(running) 완충용액(50 mM Tris, pH 7.4 및 138 mM NaCl)으로 전-평형화된 새로운 NAP-10 컬럼에 적용하였다. 단백질과 Eu 표지 모두에서 양성인 이러한 컬럼의 분획물을 모두 합치고, 런닝 완충용액으로 전-평형화된 PD-10 컬럼에 적용시키고, 단백질 및 Eu 표지에 양성인 분획물을 모두 모으고 전체 단백질 및 함유된 Eu는 유로피움 표준 용액(유로피움 Standard solution, Perkin-Elmer)에 대해 계산된 TRF에 의해 분석하였다. 다음으로 상기 플루오르(fluor): 단백질 비율을 측정하였다.
Immulon-4 플레이트(plate)의 웰은 인간 vWF의 His-A1 도메인(예를 들면, 30 mM Tris, pH 7.4 및 300 mM NaCl 또는 2가 양이온이 없는 PBS에 100 ml/웰안에 들어있는 25 ng) 또는 랫트(예를 들면, 50 ng/웰) 를 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킴으로써 코팅하였다. 상기 플레이트는 세척 완충용액(예를 들면, 50 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% Tween-20)으로 세 번 세척하고, 300 ml/웰 블락킹 완충용액(Blocking Buffer, 예를 들면, 3.0 mg/ml IgG가 없는 BSA 및 0.1% sodium azide가 포함된 세척 완충용액)으로 상온에서 1시간동안 블락킹(blocking)하고, 사용전에 세척 완충용액으로 5 번 세척하였다.
평형화 결합 분석을 하기와 같이 수행하였다. Eu-항체는 결합 완충용액(예를 들면, 100mg/ml IgG가 없는 BSA 및 0.1% sodium azide가 포함된 세척 완충용액)으로 미리 희석하고, 96 웰 플레이트의 웰(예를 들면, 10ml/웰)에 적용하고, 상기 플레이트는 SEALPLATE 필름(film)으로 봉하였다. 상기 플레이트는 흔들어주고(예를 들면, 타이터 플레이트 쉐이커(Titer Plate Shaker) 스피드 4로 셋팅하고 상온에서 ≥15 초 또는 60초 동안), 적은 종이 타월이 포함된 날진(nal유전자) 박스에 높은 다음, 박스를 닫고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 프리(free) 표지를 측정하기 위해, 상등액 샘플(sample, 4.0 ml)은 결합 혼합액을 포함한 웰로부터 DELFIA 강화 용액(Enhancement Solution, 100 ul/웰)이 포함된 패럴(parallel)한 세트(set)의 웰로 이동시켰다. 결합 항체를 측정하기 위하여, 남아있는 결합 혼합액이 들어있는 상기 A1이 코팅된 웰은 세척 완충용액으로 5번 세척하고, 종이 타월로 쳐서 말리고, 결합된 표지를 측정하기 위하여 빈 웰에 DELFIA 강화 용액(Enhancement Solution, 100 ul/웰)을 추가하였다. 분석 칼리브레이션(calibration)을 위하여, DELFIA 강화 용액(Enhancement Solution, 100 ul/웰)을 사용하지 않은 웰에 추가하였고, 유로피움 표준(유로피움 Standard, 1.0 ul/웰)을 추가하였다. 상기 플레이트는 흔들어주고(예를 들면, 타이터 플레이트 쉐이커(Titer Plate Shaker) 스피드 5로 셋팅하고 상온에서 10분 동안), 시분해 형광(time-resolved fluorescent, TRF) 강도는 Victor2 다표지 플레이트 리더(multi-label plate reader, Perkin-Elmer Wallac, Boston, MA)를 이용하여 측정하였다. 결합은 대표적 항체의 플루오르(fluor):단백질 비율 (F:P)에 의한 Eu-킬레이트 함유량으로 노말라이즈(normalize)하였다. 특이적 결합은 전체 결합(예를 들면, Eu-NMC-4에 의한 결합)에서 비특이적 결합(예를 들면, Eu 표지된 동종형 대조군에 의한 평균 결합)을 빼고 계산되었다. 결합 부위의 수 및 상기 K d 값은 Scatchard(1949)의 방법에 의하여 계산되었다. 힐 플롯(Hill plot)은 log(
Figure pct00005
/(n-
Figure pct00006
)) 대 프리(free) Eu-NMC-4 농도에 대한 log의 플로팅(plotting) 에 의한, 결합을 측정하기 위해 만들어졌고, 여기서 n=높은 친화도를 갖는 결합 부위의 수/웰,
Figure pct00007
=특이적으로 결합하는 Eu-NMC-4 mAb의 평균 수/웰이고, 프리(free) Eu-NMC-4 키메라는 상기 용액 위상에서 측정되는 TRF 리딩(reading)에 의해 계산되었다.
이러한 분석으로 결합 부위를 K d 가 0.37 nM인 높은 친화도 부위 및 K d 가 5 nM인 낮은 친화도 부위로 하여 두 개의 클래스(class)를 나타내었다. 유사하게, 항-His mAb에 의해 캡쳐(capture)되는 랫트 vWF로부터 His-rA1의 결합또한 0.19 및 3.4 nM의 K d 값을 갖는, 두 개의 결합 부위 클래스(clss)로 나타내었다(표 17).
결합 반응 속도(kinetics)는, 세척 완충용액(buffer)이 제시된 농도(100ul/웰)에서 다양한 시간 포인트에서 유로피움 표지화된 항체로 대체되는 것을 제외하고, 같은 프로토콜(protocol)을 이용하여 측정하였다. 상기 플레이트(plate)는 즉시 봉하고, 흔들고(예를 들면, 타이터 플레이트 쉐이커(Titer Plate Shaker) 스피드 4로 셋팅하고 상온에서 15초 동안), 37℃에서 표시된 시간동안 반응시켰다. 결합 혼합액을 포함한 상기 플레이트(plate)는 세척 완충용액으로 5번 세척하고, 종이 타월에 쳐서 말리고, 각 플레이트의 세척 시간을 기록하였다. DELFIA 강화 용액(Enhancement Solution, 100 ul/웰)을 상기 기재되어 있는 바에 따른 결합된 표지의 측정을 위해 비어 있는 웰에 추가하였다. 명백한 on-rate인, k on,app 는, 각 항체 농도를 Prism software(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)를 이용하여 핏팅(fitting)된 특이적 결합 vs. 하기 방정식의 시간에 따라 측정하였다.
Figure pct00008
명백한 연관 속도(k on,app )는 Eu-mAb 농도에 대해 플랏팅(plotting)되었다. 상기 결과는 선형 방정식
Figure pct00009
으로 고정되었고, on-rate 불변 k on 은 기울기에 핏(fit) 되고, [mAb]는 Eu-NMC-4의 농도이고, 분리 속도 k off 는 인터셉트(intercept)에 핏(fit)된다.
인간 또는 랫트 vWF로부터 유래한 His-A1에 결합하는 NMC-4 키메라의 분리를 위한 반감기의 측정은 하기의 방정식에 의해 계산되었다:
Figure pct00010
인간 및 랫트 vWF의 His-A1에 대한 Eu-NMC-4의 특이적 결합은 표지된 항체의 각 농도에서 결합 kon,app (예를 들면, 평활 결합 커브 핏으로부터 일정한 k)의 명백한 속도가 얻어지는 것을 통해, 단순 평활(single-exponential) 결합 방정식을 고정한다. 두 항체의 명백한 결합의 속도는 kon,app vs. Eu-NMC-4 농도의 플롯(plot)에서 보여주는 바와 같이 복용량에 의존적이다. 상기 결과는 표 17에서 요약하였고, NMC-4 키메라가 인간 A1 도메인에서 0.32±0.07 nM이고, 랫트 A1 도메인에서 0.28±0.01 nM의 K d 를 갖는다는 것이 확인되었다. 두 경우에서 이러한 결과들은 평형 결합에 의해 측정되는 K d 값과 가깝게 일치한다. 또한 상기 결과들은 항원-항체 복합체가 시험관 내(in vitro) 분리 반감기가 인간 및 랫트 항원에서 각각 44분 및 69분으로 , A1 종 모두에서 길게 남아있다.
37℃에서 인간 및 랫트 vWF로부터 유래한 His-A1 도메인에 Eu-NMC-4 키메라의 반응 속도 및 평형 결합.
His-A1 (인간) His-A1 (랫트)
Kinetic 불변s
k on (M-1 min-1) 4.1×107 1.4×107
k off (M-1) 1.6×10-2 1.0×10-2
분리 half-life(min) 44 69
k on / k off 0.39 nM 0.70 nM
평형 결합 ( K d )
His-A1
0.316±0.068 nM††
(n = 10)		 0.276 ±0.011 nM††
(n = 5)
상동 경합 ( K i )
His-A1 0.275±0.064 nM
(n = 4)		 0.297±0.128 nM
(n = 3)
†k on,apparent 의 복용량에 의존적인 인터셉트(Intercept)
††직접적으로 코팅된 항원(인간 vs. 랫트)에 Eu-NMC-4 결합이 t 테스트 유의성(p = 0.6892)에 의해 통계학적으로 유의하지 않은 K d .
에러(error)는 SEM으로 나타내었다.
경합 결합 연구가 Ki 값을 측정하기 위해 수행될 수 있다(예를 들면, 항원의 상대적 친화도 측정). 분석은 80 ul/웰의 결합 완충용액(예를 들면, 100 mg/ml IgG-free BSA, 0.1% sodium azide를 포함한 세척 완충용액)에 Eu-NMC-4 또는 Eu 비표지된 경합자를 각 10ul/웰 및 비표지된 경합자 항체 10ul/웰이 적용된 것과 같은, 이러한 경우를 제외하고 상기 결합 반응 속도에서 기재된 바와 같이 10-12M 내지 10-7M의 시리즈 범위에서 중복(duplicate)으로 연속 희석하여 수행하였다. 유로피움 표지화된 항체의 최종 농도는 100 nM이다. 비특이적인 백그운드(background) 결합의 수준은 킬레이팅제 DTPA(1 mM)가 존재할때 현저히 감소하였고, 이것은 경합 결합 분석법을 포함한다. 추가로, 웰의 코팅은 단백질 제조에서 어떤 감소된 A1을 제거하기 위해 이오도아세틸(iodoacetyl) 겔을 이용하여 분리된 His-A1의 이용에 의해 최적화되었다. 혼합액은 전체 평형에 도달하기 위한 반응을 허락하기 위해 3.75 시간동안 반응시키고, 세척하고, 상기 기재된 TRF에 의해 측정되는 표지화된 항체와 결합한다. 상기 저해 곡선은 IC 50 값을 구하기 위해 Prism software(GraphPad, Inc.)를 이용한 "한 부위 경합" 모델로 고정되었고, 평형 결합 실험의 Scatchard 분석에 의해 측정된 K d 값을 이용한 Cheng 및 Prusoff (1973 Biochem Pharm. 22:3099)의 방정식을 사용하여 K i 를 계산하였다.
경합 결합 분석의 표준화는 항원과 Eu-NMC-4의 결합으로 측정되는 친화도(K d )를 갖는 비표지화된 NMC-4 키메라에 의한 상동 경합으로부터 얻어진 K i 값을 비교함으로써 설명하였다. 인간 His-A1의 상동 경합에 있어서, NMC-4 키메라는 관찰된 K d 가 0.32 ±0.07 nM와 일치하는, 0.28±0.06 nM의 K i (표 19)를 갖는 Eu-NMC-4 결합의 강력한 저해제이다. 유사하게, 랫트 His-A1의 상동 경합에 있어서, NMC-4 키메라는 K d 가 0.276 ±0.011 nM과 일치하는, 0.297 ±0.128 nM의 K i (표 18)를 갖는다. 반대로, 비표지된 동종형 대조군, 인간 골수종 플라스마로부터 유래한 IgG1/k는, A1 항원에 결합하는 Eu-NMC-4에서 저해 효과를 나타내지 않았다.
선별된 인간화 NMC 변이체의 결합 활성(경합 시험에 의한 Ki)의 비교
항체 변이체 동종형 Ki (평균±SEM)
NMC-4 mAb mIgG1 0.60 ± 0.13 nM (n=3)
NMC-4 키메라 IgG1 키메라 0.28 ± 0.06 nM (n=4)
IgGk 대조군 IgG1 감지되지 않음.
H2-L5 IgG1 0.96 ±0.27 nM (n=3)
H9-L9 IgG1 3.51 ±1.21 nM (n=4)
H9-L9 IgG4 3.53 nM (n=1)
다음으로 경합 결합 분석은 인간화 NMC-4 변이체 H9L9 IgG1 alc 4의 활성을 측정하기 위해 이용되었다. 상기 두개의 CDR-이식된 H9L9 변이체의 동종형은 상동 NMC-4 키메라보다 덜 강력함에도 불구하고, 동일한 nM 활성을 나타내었다(표 19).
상기 AJW-200 항체는 경합 결합 분석에서 실험하였다. His-A1에 대해 Eu-NMC-4와 경합하는, 인간화 NMC-4 변이체와 반대로, His-A1에 대한 Eu-NMC-4 결합은 EC 50 이 210 pM로 AJW200에 의해 강화되었다(도 2). His-A1에 대한 Eu-NMC-4 결합의 힐 플롯(hill plot)은 협동하지 않고 결합 부위의 단독 클래스에 결합과 일치하는, 유니티(unity)(n H = 0.984 및 0.957) 근처의 힐(hill) 기울기를 나타내었다. 반대로, 각각 1.8 nM 또는 20 nM AJW200의 존재(각각, 도 2C 및 2D)하에 His-A1에 결합하는 Eu-NMC-4의 힐 플롯(hill plot)은 양성 협력성을 나타내는 하나(n H = 1.548 및 1.201)보다 더 큰 힐(hill) 기울기를 나타내었다. AJW200에 의해 매개되는 양성 협력성은 이틀로 나누어 수행된 두 번의 개별 실험에 의해 관찰되었다. 이러한 결과는 NMC-4가 결합 부위와 동시에 vWF의 A1 도메인의 AJW200을 분리하기 위해 결합한다는 것을 확인할 수 있을 뿐 아니라, 최소한 분리된 A1 단편에서, AJW200이 GP1ba 결합 부위에 NMC-4의 결합을 가능하게 한다는 것을 가리킨다.
실시예 5: 혈소판 부착을 저해하는 항체의 효능
항체가 vWF에서 GP1b 수용체 결합 부위를 저해하는 지에 대한 확인은 원래 혈류 조건하에서 vWF-GPIb 상호작용에 길항작용하는 그 자체의 능력을 통해 수행하였다. Moake 및 colleagues (1986, J Clin Invest. 78:1456-61)에서 개발되어진 한 가지 접근으로 내피 세포가 히스타민(histamine)을 활성화시켰을 때, A1 도메인이 오픈(예를 들면, 활성)구조가 되는 곳에서, vWF의 울트라-대형(ultra-large) 형태(ULvWF)가 분비된다는 사실을 확인하였다. 이것들은 ADAMS13에 의해 매개되는 ULvWF의 절단을 통해, 플라스마에 도입되면서 빠르게 파괴된다(Dong et al., 2002 혈액 100:4033-9).
전형적인 방법에서, 첫 번째 패씨지(passage, P1)의 HUVECs가 1×106 세포/디쉬의 농도로 35 mm 디쉬에 나누어 파종하고, 7일 동안 배양하고, 7일에 사용하였다(세포가 100% 가득 찬(confluent) 후에 2-3일). CFSE 표지된 인간 혈소판은 1.2ml/분의 유속으로 HUVECs에 빠르게 부착한다(도 3A). 세포에 25nM 히스타민(histamine)을 상온에서 10분동안 전처리하였을 때, 더 많은 혈소판들이 HUVEC에 접착하였다(도 3B). 이러한 혈소판 부착은 10 ug/ml의 농도에서, 혈소판이 NMC-4를 포함한 완충용액의 단층위로 관류되었을 때, 완벽히 저해되었고(도 3C), 18 ug/ml의 농도에서, 혈소판이 항-GPIba 항체(예를 들면, AK2)의 존재하에 관류되었을 때, 부분적으로 저해되었다(도 3D). 반면에, 18 ug/ml의 농도에서 마우스 대조군 IgG는 vWF 폴리머에 혈소판 부착을 예방하지 않고(도 3E), 이것은 HUVECs에서 혈소판의 부착이 사실상 내피에서 유래된 vWF 및 혈소판 GPIba간 상호작용에 의해 매개된다는 것을 나타낸다. 실험 당 20개의 캡쳐된 이미지를 통해 혈소판에 의해 커버된 지역을 콤픽스(Compix) 소프트웨어를 사용하여 측정하고 정량하였을 때, NMC-4는 대조군 항체의 무시할만한 효과와 비교하여 >95% 혈소판 부착이 감소하였다.
실시예 6: 혈관 폐색을 예방하는 항체의 효능
동맥 혈전증의 염화철 모델은 AJW200과 비교하여 NMC-4 키메라 및 상기 인간화 유도체(예를 들면, H14, L10)의 항-혈전성 활성을 측정하기 위해 사용되었다. 대측성 경동맥은 절개된 두개골 부위에 지방 조직을 수반하는 침샘의 재배치를 통해 분리되었다. 상기 경동맥을 드러내고, 상기 경동맥을 부드럽게 잡기 위해 접어서 잘려진 필터 종이(예를 들면, 4 mm × 5 mm)에 놓고, 염화철(7.5%) 용액에 표면을 제공하였다. 염화제이철 용액에 적용한지 4분 후에, 혈류 프로브(probe)는 경동맥 주위에 놓고, 혈류는 폐색되는 시간(일반적으로 대조군 랫트에서 10분) 또는 45분 동안 Transonic Systems Inc. flow system (Ithaca, NY)을 사용하여 측정하였다. 4개의 랫트(식염수에서 n=6)군은 예를 들면, 각각 NMC-4 키메라, V14, L10, AJW200 또는 대조군 IgG의 5 내지 0.01 mg/kg을 랫트 몸무게g당 1 ul의 부피의 범위로 하여 IV 복용량으로 투여하였다. 항체 제제는 필터로 멸균하였고, 동물 실험에 적용하기 전 HPLC 분석에 의한 단일-분산성의 측정뿐 아니라, 낮은 엔도톡신(endotoxin) 콘텐트(content)를 확보하기 위해 제조사의 방법에 따라 LIMULUS AMOEBOCYTE ASSAY KIT (BioWhittaker)를 이용하여 테스트하였다.
도 4에서 보는 바와 같이, NMC-4 및 AJW200 모두는 혈관 폐색을 현저하게 저해하였다. NMC4는 복용량 0.03 및 0.1 mg/kg에서 AJW200과 유사한 ED50을 나타내었다. 또한, 인간화 유도체, H14, L10의 ED50 또한 0.03 및 0.1 mg/kg 복용량 사이로 유사한 활성을 나타내었다(도 4B).
실시예 7: 출혈 시간 및 실혈에서 항체의 효과
실혈(blood loss)은 때때로 항혈소판제(예를 들면, 항-vWF 항체)와 연관된 부작용으로 부정적일 수 있다. 따라서, 인간화 NMC-4 항체가 출혈 합병증에 원인이 될 수 있는지에 대한 그 가능성을 평가하는 것이 필요할 수 있다. 이를 위해, 항체 대조군, NMC-4 키메라 또는 AJW200을 꼬리 절단을 수행하기 30분 전에 투여함으로써, 표준 출혈 시간 분석법을 수행하였다. 꼬리 절개는 꼬리 말단(예를 들면, 0.5 mm)을 자르고, 상기 꼬리를 따뜻한 식염수에 적당한 부피에 넣은 다음 출혈이 멈출 때까지 필요한 시간을 측정하였다. 또한, 실혈은 출혈 시간을 평가하는 동안 식염수에 모여진 혈구의 헤모글로빈(hemoglobin) 콘텐트(content) 평가에 의해 측정되었다. 이를 위해, 적혈구를 낮은 속도로 원심분리하여 펠렛화(pellet)화하였고, 최종 부피가 5 ml이 되도록 조정하여, 1% Triton ×100이 포함된 식염수에 재부유하였고, 용액의 헤모글로빈(hemoglobin) 농도를 420nm의 흡광도에서 결정함으로써 측정하였다.
NMC-4 키메라는 인간화 유도체 H14-L10에서 출혈 시간이 현저히 증가된 0.09 mg/kg 복용량으로 같은 ED50을 나타내었다. 동맥 혈전증의 염화제이철 모델에서 이러한 두 개 항체의 효과와 연관되어 있는 0.03 mg/kg 복용량에서는, 현저한 출혈 연장이나 실혈의 증가가 나타나지 않았다. NMC-4 및 그 인간화 유도체는 증가된 출혈을 나타내는 랫트의 ED50 복용량이 항혈전성 활성을 나타내는 ED50에 더 가까운, AJW200보다 약간 증가된 ED50 복용량 반응을 나타내었고, 이것은 NMC-4가 AJW200과 비교하여 증가된 치료학적 범위를 제공한다는 것을 의미한다.
랫트에서 출혈 시간 및 혈액 손실을 AJW200과 비교한, NMC-4 키메라 및 그 인간화 유도체, H14, L10의 효과
항체 출혈 시간 (분)
평균±SEM (n)		 혈액 손실(mL)
평균±SEM (n)
식염수 3.1 ± 0.3 (16) 0.287 ± 0.088 (9)
NMC-4 (키메라)
0.01 mg/kg
0.03 mg/kg
0.10 mg/kg
0.30 mg/kg
3.00 mg/kg		 ED50 = 0.09 mg/kg
2.7 ± 0.3 (2)
4.1 ± 0.2 (4)
19.7 ± 0.9 (2)
32.7 ± 4.4 (3)
32.3 ± 2.3 (2)
0.059 ± 0.009 (2)
0.076 ± 0.014 (4)
1.503 ± 0.485 (2)
1.501 ± 0.213 (3)
1.106 ± 0.243 (4)
H14, L10 (인간화)
0.03 mg/kg
0.10 mg/kg
0.30 mg/kg		 ED50 = 0.09 mg/kg
2.03 ± 0.35 (3)
15.30 ± 1.70 (4)
26.45 ± 3.09 (4)
0.094 ± 0.035 (3)
0.630 ± 0.294 (4)
1.883 ± 0.312 (4)
AJW200
0.01 mg/kg
0.03 mg/kg
0.10 mg/kg
0.30 mg/kg
3.00 mg/kg		 ED50 = 0.05 mg/kg
2.8 ± 0.25 (2)
8.2 ± 1.56 (7)
25.1 ± 0.4 (5)
29.2 ± 0.72 (5)
30.9 ± 0.62 (3)
0.177 ± 0.059 (2)
0.250 ± 0.059 (4)
1.943 ± 0.420 (2)
2.074 ± 0.521 (3)
2.912 ± 0.243 (4)
지혈에서 이러한 항체들의 부정적인 부작용의 또다른 파라메타(parameter)는 출혈 시간을 측정하는 동안 수집되는 혈에서 분석되는, 실혈이다. 다시 말해, 0.1 mg/kg보다 높은 복용량에서, 이러한 항체들은 현저한 실혈을 유도하였다. 하지만, 이러한 차이가 3보다는 n=4일 때 유일하게 3.0 mg/kg 군에서 통계학적인 차이에 접근했음에도 불구하고, 0.3 및 3 mg/kg 복용량에서, AJW200은 같은 복용량에서, NMC-4 키메라보다 현저하게 더 높은 실혈을 유발하였다(표 20). H14, L10 항체 변이체는 모 NMC-4 키메라에 현저한 차이를 나타내지 않았다.
실시예 8: 순환 혈소판 및 백혈구 수에서 항체의 효과
일부 항-혈소판제가 혈소판 감소증을 유발할 수 있는 같은 시간 동안에 혈전증 형성을 저해한다는 보고가 있다(Hansen et al., J Pharmacol Exp Ther. 298:165-71 (2001)). 치료 동물에서 순환하는 백혈구(WBC) 및 혈소판의 수에 있어서 NMC-4의 효과를 측정하기 위하여, 230-260g 무게의 5 마리 랫트로 이루어진 군에 1 mg/ml의 NMC-4를 주사(예를 들면, 정맥내 주사)하고, 3 마리 랫트로 이루어진 대조군은 비피클(vehicle) 대조군(예를 들면, 수술 등급의 PBS)을 주사하였다. 주사 전에, 꼬리 출혈은, 예를 들면, HEMAVET HEMATOLOGY ANALYZERTM(Drew Scientific)를 이용한 기준점 혈구 수를 측정하기 위해 사용되었다. 혈액 샘플은 캐필러리(capillary) 파이펫을 이용한 레트로-오비탈 드로우(retro-orbital draw)를 통해 랫트를 비마취하고, 항체 또는 식염수를 주사한 후에 최대 48시간까지 미리 정해놓은 시간 포인트(예를 들면, 30분, 2, 4, 24 및 48 시간)에 수집되었다. 약 40 ul의 혈액을 산성화 구연산 덱스트로스 항응고제 용액(ACD) 5 ml이 포함된 튜브(tube)에 넣고, 혈소판과 백혈구의 수를 측정하기 위해 HEMAVET 세포 개수기에서 즉시 샘플화하였다. 각 혈액 드로우(draw)에서, 샘플은 얼터네이팅(alternating)된 눈에서 채취하였다.
NMC-4는 분석된 다른 어떠한 시간 포인트에 혈소판 수에서 거의 효과가 없었다. 백혈구의 수가 37.5%(p=0.016)으로 일시적으로 감소하는 것이 주사한 후 30분에 관찰되었지만, 유사한 감소가 PBS 비히클(vehicle)의 주입에서도 관찰되었다. 백혈구 농도는 NMC-4 및 대조군 비히클(vehicle)을 처리한 군 모두에서 주사한지 2 및 4 시간 사이에 기준점으로 돌아왔다.
실시예 9: 항체를 발현하는 세포주의 확립
높은 수율의, 포유류 단백질 발현 체계는 다수의 부위-특이성, 표적화된 셔틀 벡터와의 조합에서 돌연변이 람다(lambda) 인테그라제(integrase)(예를 들면, ACE 인테그라제)를 이용한 이종 유전자 서열이 들어갈 수 있는 재조합 수용체 부위를 포함하도록 고안된 쥐과 인공 염색체 발현(Artificial Chromosome Expression, ACE) 플랫폼(platform)을 기본으로 하여 개발될 수 있다(Lindenbaum et al, (Nucl. Acid Res. 32 (21):e172 (2004); 미국 특허 공개번호: 2003/0119104A1 및 2006/0246586 A1). 이런 체계는 선별된 인간화 변이체 및 NMC-4 키메라를 발현하는 안정적인 세포주를 제조하는데 사용된다.
플라스미드 pCI-NMC4-VL10 및 pCI-NMC4-VH14의 인써트(insert)는 Not 1과HindIII (경쇄 벡터) 또는 Xho1 및 BamH1 (중쇄 벡터)으로 절단하고, pST0518 벡터의 MCS 1(경쇄) 및 MCS 2(중쇄) 내로 순차적으로 클로닝하였다. 상기 중쇄 및 경쇄 인써트(insert)를 함께 수반하는 pST0518 벡터는 Lindenbaum et al, (Nucl. Acid Res. 32 (21):e172 (2004); 미국 특허 공개 번호: 2003/0119104A1 및 2006/0246586 A1)에 기재되어 있는 표적화 벡터로부터 유래한, 다양한 저항성 유전자를 갖는 ACE 표적화 벡터(Targeting Vectors)(ATVs)내로 도입하기 위한 셔틀 (shuttle) 벡터로 주어졌다. 중쇄 및 경쇄 항체를 모두 포함하는 카세트(cassette)를 ATVs로 도입하기 위하여, pSTO518-VH14, VL10 벡터는 I-CeuI 및 PI-SceI 호밍 내부절단효소(homing endonucleases)(New England Biolabs, MA)로 절단하였다. 상기 VH14와 VL10을 더한 단편은 겔-정제하였고, 같은 I-Ceu1 및 PI-SceI 내부절단효소로 미리 절단한 pZeo 및 pHygro-ATV의 동일한 부위내로 클로닝하였다. 이를 통해 플라스미드 pNHT605-H14L10-IgG4 (hygR 유전자) 및 pNHT607- H14L10-IgG4 (p zeoR 유전자)를 제조하였다.
유사하게, NMC-4 IgG4 키메라를 수반하는 pST0518 표적화 벡터가 제조되었고, 탠덤(tandem) 인써트(insert)는 pZeo 및 pHygro ATV 벡터 내로 써브클로닝(subcloning)하여, 플라스미드 pNHT623(hygR 유전자가 더해진 인간 IgG4 키메라) 및 pNHT624 (the zeoR 유전자가 더해진 인간 IgG4 키메라)를 제조하였다.
플랫폼(platform) ACE 내로 인테그레이션(integration)을 표적화하기 위하여, 숙주 ChK2 ACE 플랫폼 세포는 웰당 0.4 ×105 세포의 농도로 6 웰 배양 플레이트에 씨딩(seeding)하였고, 하룻밤동안 배양하였다. 형질도입하기 3시간 전에, 상기 배양 배지는 무혈청 배지로 교체해 주고, 3시간 후에 LipofectAMINE PLUS reagent(Invitrogen)이 혼합된 1mg의 벡터 및 1mg의 ACE 인테그라제(Integrase) 발현 벡터를 제조사의 지시에 따라 형질도입하였다. 24시간 후에, 세포를 15cm 배양 디쉬로 확장시키고, 하기의 날짜에, 각각 3.0 ug/ml의 제오마이신(zeomycin) 또는 하이그로마이신(hygromycin)(사용된 벡터에 따라)을 배양 배지에 추가하였다. 선별한지 14일 후에, 약물 저항성 콜로니를 클로닝 링(ring)을 사용하여 분리하였고, 개별 클론들은 항체 생산의 분석을 위해 증폭하였다.
실시예 10: NMC-4 항체의 생체 내( In vivo ) 효능 및 안정성
인간화 NMC-4 항체의 효능 및 안정성은 생체 내(in vivo) 동물(예를 들면, 개코 원숭이) 모델을 이용하여 수행하였다.
일반적인 방법에서, 개코 원숭이는 케타민 하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride)(Premier Pharmaceutical Company로부터 구입한 Anaket-VTM)(10mg/kg IM/30분 또는 일반적으로 마취를 유지시키는 것이 필요할 때) 로 마취시키고, 그 체온을 보온하여 37℃로 유지하였다. 다음으로, 대퇴관의 4-5 cm 단편을 주위 조직으로부터 천천히 절개하여 분리하였다. 대퇴 동맥 및 대퇴 정맥 내 모든 가까운 브랜치(branch)들을 동여매었다. 작은 절개를 대퇴 동맥 및 대퇴 정맥 내에 만든 다음, 베셀(vessel) 팁(tip)을 삽입하고, 의료용 실크로 단단히 매었다. 다음으로 실리콘(silicone) 튜브는 대퇴 정맥내로 동맥혈을 션트(shunt)하기 위해 베셀(vessel) 팁(tip)에 접착시켰다. 모세혈관을 우회하는 동안 동맥에서 정맥 순환으로의 직접적인 션팅(shunting)은 혈류를 약 150-300 ml/분으로 증가시킨다. 튜브-형태의 초음파 유량 프로브(Transonic Systems Inc, Maastricht, The Netherlands)는 실리콘 튜브에 접촉시키고, 혈류는 20분 동안 안정화되도록 하였다. 평균 및 페이직(phasic) 혈류는 혈액 샘플링(sampling)뿐 아니라, 약물 투여에 사용되는 션트(shunt)를 갖고 실험하는 동안 연속적으로 측정되었다.
다음으로, 대퇴 동맥의 내피는 마틴 니들 홀더(Martin needle holder, Hegar-Baumgartner TC Gold 14cm, Product code 20.634.14)로 내피를 최대 힘으로 10초간 세게 누름으로써, 베셀(vessel) tip(팁)에 근접하게 상처내었다. 두 개의 오버래핑(overlaaping)된 상처들이 만들어지고, 조절 가능한 플라스틱 수축기를 혈류를 기준점(기준점) 값의 10 내지 20%로 감소시키기 위하여 손상 부위위에 놓았다. 혈류의 점진적 감소는 혈전 형성때문에 관찰된다. 혈류가 ≤5 ml/분으로 감소하였을 때, 상기 수축기는 혈소판이 풍부한 혈전을 제거하기 위하여 오픈하였다. 다음으로, 외부 협착이 다시 적용되었고 혈전 형성 과정이 다시 시작되었다. 기계적 복원에 따른 이러한 혈류 감소의 반복적 패턴(pattern)을 순환 전자 흐름(CFRs)라고 부른다. 시간 기능에서 CFRs의 수를 측정하였다. 순환 전자 흐름(CFRs)의 기준점은 30분에 측정하였다. 식염수를 주입하고, CFRs은 추가로 30분동안 모니터링하였다. 실시예 3에서 기재된 바와 같은 상기 인간화 NMC-4 변이체 H9L9 IgG4(GBR 600으로 여기에 추가로 언급)가 이용되었다.
약물 투여동안 두 가지 방법이 출혈을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 첫 번째 방법에서, 피부 템플릿(템플릿(template)) 출혈 시간은 팔뚝의 표면에서 측정하였다. 상처는 Surgicut device(ITC, Edison, NJ)로 유도한 후에, 혈압 가압대를 팔 주위에 두르고 40 mm Hg로 부풀렸다. 피부 출혈 시간은 상처의 도입되고 출혈이 시각적으로 중지된 사이의 시간으로 정의하였다. 혈액은 상처를 만지지 않고, 매 15초마다 종이 필터를 조심스럽게 가볍게 대었다. 피부 출혈 시간이 900초(예를 들면, 15분)를 초과하였을 때 측정을 멈추고 900초로 간주하였다.
두 번째 방법에서, 절개를 통한 혈액 소실은 토끼 경동맥 손상 모델에서 재조합 아넥신(annexin) V에 의해 의해 측정되었다(예를 들면, P. Thiagarajan et al. (1997) Circulation 96(7):2339-47 참조). 2 cm × 0.8 cm 절개를 샅에 만들고, 미리-무게를 측정한 거즈 약솜을 삽입하고, 복용량 주입 동안에 각 30분 끝에 또는 혈액이 포화되었을 때에 교체하였다. 모든 거즈는 혈액 소실의 양을 확인하기 위해 연구의 끝에 무게를 측정하였다. 각 복용량의 값은 식염수 대조군 페이스(phase) 거즈의 비율로 표현하였다. 심장 박동 및 혈압은 전체 연구동안 10분 간격으로 계속적으로 모니터링하였다.
각 복용량 기간의 끝에 EDTA 혈액 1ml, 및 구연산화된 혈액 10 ml을 뽑고, FBC 혈소판 수, 프로트롬빈 시간, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 인자 VIII 및 vWF를 측정하였다. 300 ul씩 두 개의 분취액은 필요하다면 추가 시험관 내(in vitro) 실험실 테스트를 하는 조사자에게 운반하기 위해 -80℃에서 얼린다. 유사하게, 흐름 연구가 끝난 후에 0.5, 1, 2, 8, 24 및 48 시간에 혈액을 뽑았다. 마지막 복용량의 끝에, 시험 샘플 및 대조군 샘플로 혈소판 응집 테스트를 수행하였다.
누적 복용량(예를 들면, CFRs의 완벽한 저해가 관찰되었을 때), 에피네프린(Epinephrine)(Intramed)이 2.2 ug/kg/분의 복용량에 20분 동안 주입된 후에, CDR들을 다시 측정하였다. 에피네프린(Epinephrine) 단독은 개코 원숭이에서 혈소판 응집을 유도하지 않았지만, 다른 혈소판 응집 인자를 강화시킴으로써, 파괴된 주기적 흐름 변화를 회복시킬 수 있다(예를 들면, G. Anfossi et al. (1996) Eur J Clin Invest. 26:353-370 참조).
GBR600의 효능 및 안정성 연구: 하기에 기재된, 연구 1 내지 4는 GBR600의 효능 및 안정성을 측정하기 위해 수행되었다.
연구 1: GBR600의 증가된 양에 따른 복용량 반응 커브(복용량 response curve)를 만들고, CFRs의 최대 저해를 나타내는 효과적인 복용량을 확인하기 위하여 n=1 동물로 파일럿(pilot) 연구를 수행하였다. 템플릿(템플릿(template)) 출혈 및 절개로 인한 출혈은 테스트된 모든 복용량에서 결정되었다. 혈액 샘플은 가장 높은 복용량에서 항체의 약물동력학(pharmacokinetics)을 확립하기 위해 48시간에 채취하였다.
GBR 600은 하기의 상승하는 복용량으로 30분 간격으로 주입하었고, 혈류는 연구 기간동안 측정되었다: 복용량 1, 0.03 mg/kg; 복용량 2, 0.1 mg/kg; 복용량 3, 0.3 mg/kg; 복용량 4, 1 mg/kg; 및 복용량 5, 10 mg/kg. 다음으로 출혈 시험은 각 복용량이 주입된 후에 10분 동안 수행하였다.
도 5 및 표 21에서 CFRs에서 GBR600의 복용량 증가에 따른 효과를 기재하였다. 상기 동맥은 CFRs이 안정적으로 나타나지 않는 30분 기준점 페이스(phase)의 끝 부근에 재손상을 가하였다. 0.03 mg/kg GBR 600에서 식염수 페이스(phase)의 8/30 분과 비교하여 5/30 분에 CFRs의 수가 감소하였다. 추가적으로 0.01 mg/kg의 주입은 CFRs을 완벽히 저해하였다. 이것은 동맥의 재손상이 CFRs의 복귀를 야기하지 않았다는 사실에 의해 확인되었다. 상기 저해는 하기의 모든 증가된 복용량에서 관찰되었다. GBR 600(10 mg/kg)을 가장 높은 복용량으로 주입한 후에 혈소판 침전의 저해를 강하게 또는 약하게 만드는지의 여부를 확인하기 위하여 에피네프린을 2.2 ug/kg/분의 속도로 주입하였다. 에피네프린의 주입은 그 혈압에 대한 효과로 인해 혈류를 일시적으로 증가시켰지만, CFRs의 저해를 역으로하지는 않았다.
CFRs에서 GBR 600의 복용량 증가에 따른 효과(0.03 - 10 mg/kg)
복용량 (mg/kg) 누적 복용량 (mg/kg) CFRs의 수
기준점 0 8
식염수 0 8
0.03 0.03 5
0.1 0.13 0
0.3 0.43 0
1 1.43 0
10 11.43 0
연구 2: 연구 2는 연구 1에서 0.03 mg/kg 복용량에서 CFRs의 부분적 저해가 나타남에 따라, 0.03 mg/kg 복용량 이전에 복용량 상승을 시작하는데 0.01 mg/kg 복용량이 포함된다는 것을 제외하고, 연구 1과 유사한 방법으로 수행되었다.
연구 2(예를 들면, 도 6 및 표 22 참조)에서, 0.01 mg/kg GBR 600(식염수의 9CFRS/30분과 비교하여 7CFRs/30분)에 의한 CFRs의 효과가 관찰되었다. 하지만, 추가적으로 0.03 mg/kg(누적 복용량=0.04 mg/kg)을 주입하면 CFRs의 완벽한 저해를 야기하였다. 따라서 GBR 600의 ED100 은 0.04 mg/kg이다. 상기 동맥의 재손상은 CFRs의 저해를 역으로 할 수 없고, 이는 진정한 저해를 가리킨다. 상기 저해 효과는 최대 복용량 10 mg/kg에 이르기까지 높은 복용량에서도 유지되었다. 에피네프린의 주입은 그 혈압에 대한 효과로 인해 혈류를 일시적으로 증가시켰지만, CFRs의 저해를 역으로하지는 않았다.
CFRs에서 GBR 600의 복용량 증가에 따른 효과(0.01- 10 mg/kg)
복용량 (mg/kg) 누적 복용량 (mg/kg) CFRs의 수
기준점 0 9
식염수 0 9
0.01 0.01 7
0.03 0.04 0
0.1 0.14 0
0.3 0.44 0
1 1.44 0
10 11.44 0
연구 3: 연구 3은 0.005 mg/kg의 시작 복용량에 또다른 0.005 mg/kg(누적 복용량=0.01 mg/kg) 복용량이 이어서 투여되고, 0.01 mg/kg이 6번 증분되어 증가한다는 것을 제외하고, 연구 1과 유사한 방법으로 수행되었다.
연구 3(예를 들면, 도 7 참조)에서, 0.005 mg/kg GBR 600의 주입에 의한 CFRs의 효과(8 CFRs/30분이 7 CFRs 로 감소)가 관찰되었다. CFRs은 GBR 600의 복용량 증가와 함께 직선 형태로 감소하였다. 복용량 기간당 CFRs의 수는 표 23 및 도 8에서 나타내었다. 도 8은 GBR 600의 복용량 증가와 연관된 CFRs 수의 직선 감소를 보여준다. 상기 CFRs의 수와 GBR 600의 복용량 간 상관관계는 하기의 식에 의해 나타내었다. 상기 결과는 R2= 0.9901로 이 식에 적합하다.
CFRs의 수/복용량 기간 = -109 X GBR 600 복용량 (mg/kg) +7.4517.
누적 복용량 0.04 mg/kg으로 인한 연구 2에서의 완벽한 저해와 비교하여 연구 3에서, ED100 은 0.07 mg/kg이다. 증가된 복용량 사이의 시간은 연구 3에서 30분이다. ED100에서 관찰되는 이러한 모순은 약물이 초기에 제거되는 결과로 인해 혈액 내에서 GBR 600 농도의 감소에 의해 야기될 수 있다. 에피네프린의 주입은 CFRs의 저해를 역으로한다. 이것은 0.07 mg/kg 누적 복용량에서 CFR 곡선의 형태와 관련이 있을 수도 있다. 상기 저해는 0.07 mg/kg 누적 복용량에서 천천히 되돌아 가고, 이것은 혈전이 자라나는 것을 가리킨다. 이런 특정한 조건하에서, 에피네프린은 CFR을 역으로 돌릴 수 있는 것으로 보인다.
CFRs에서 GBR 600의 누적 복용량의 효과(0.005 - 0.07 mg/kg)
복용량 (mg/kg) 누적 복용량 (mg/kg) CFRs의 수
기준점 0 8
식염수 0 8
0.005 0.005 7
0.005 0.01 6
0.01 0.02 5
0.01 0.03 4
0.01 0.04 3
0.01 0.05 2
0.01 0.06 1
0.01 0.07 0
연구 4: 연구 4는 클로피도그렐(clopidogrel) 1, 1.5, 2.5, 5 및 10 mg/kg의 농도에서 GBR 600의 효능 및 출혈 경향성 비교를 위해 클로피도그렐(clopidogrel)이 3 마리 개코 원숭이에서 양성 대조군으로 사용되었다는 것을 제외하고, 연구 1과 유사한 방법으로 수행되었다.
연구 4에서, 표 24에서 개코 원숭이 3의 결과를 설명하는 표 24 및 도 9에서 보는 바와 같이 클로피도그렐(clopidogrel)은 개코 원숭이 1에서 누적 복용량 10 mg/kg, 및 개코 원숭이 2&3에서 5 mg/kg에서 CFRs을 완벽히 저해하였다. 에피네프린의 주입은 CFRs의 저해를 역으로하였다.
개코 원숭이에서 클로피도그렐(clopidogrel)의 복용량(1 - 10 mg/kg) 증가에 따른 효과.
복용량 (mg/kg) 누적 복용량 (mg/kg) CFRs의 수
개코 원숭이 1		 CFRs의 수
개코 원숭이 2		 CFRs의 수
개코 원숭이 3
기준점 0 13 8 6
식염수 0 13 7 8
1 1 8 8 7
1.5 2.5 5 2 2
2.5 5 2 0 0
5 10 0 0 0
10 20 0 0 0
템플릿 ( template ) 출혈 시간: 연구 1 및 2에서 템플릿(template) 출혈 시간은 0.04 mg/kg보다 높은 모든 복용량에서 15분보다 길었다. 클로피도그렐(clopidogrel) (Bristol-Myers Squibb/Sanofi Pharmaceuticals)을 양성 대조군으로 하는 연구에서 상기 템플릿(template) 출혈 시간은 2.5 mg/kg보다 큰 누적 복용량에서 같은 범위로 연장되었다. 연구 3에서 상기 템플릿(template) 출혈 시간은 15분 이상 연장되지 않았다. 템플릿(template) 출혈 시간은 그 기준점이 높은 가변성을 나타냄으로 출혈 경향성이 매우 정확하게 측정되지 않았다(예를 들면, 클로피도그렐(clopidogrel) 개코 원숭이 1,2,3에서 기준점 값 참조). 이를테면, 템플릿(template) 출혈 시간은 수술전 셋팅에서와 같이, 임상과 연관된 출혈을 예측하는 것으로 간주되지 않는다(예를 들면, Lind et al. Platelets, second edition, p485-493, Michelson AD ed., Academic Press. 참조). 상기 절개부 출혈 시험은 상기 절개를 통한 혈액 손실의 실제적 양의 정량에서 낮은 변동력을 나타내고, 높은 역동적 범위를 갖는다. 따라서, 상기 절개부 출혈 시험은 템플릿(template) 출혈 테스트에 추가로 실행된다. 이러한 결과는 표 25 및 26에 요약하였다.
GBR600 템플릿(template) 출혈 시간[분]
복용량 (mg/kg) 누적 복용량 (mg/kg) 연구 1 연구 2 연구 3
기준점 0 5.5 6.25 2
식염수 0 2.5 7 4.45
0.005 0.005 n.a. n.a. 5.25
0.005 0.01 n.a. n.a. 5.25
0.01 0.02 n.a. n.a. 6
0.01 0.03 n.a. n.a. 7.45
0.01 0.04 n.a. n.a. 2.5
0.01 0.05 n.a. n.a. 3.5
0.01 0.06 n.a. n.a. 7.45
0.01 0.07 n.a. n.a. 5.45
0.01 0.01 n.a. 2.45 n.a.
0.03 0.03/0.04 5.25 >15 n.a.
0.1 0.13/0.14 >15 >15 n.a.
0.3 0.43/0.44 >15 >15 n.a.
1 0.143/1.44 >15 >15 n.a.
10 11.43/11.44 >15 >15 n.a.
클로피도그렐(clopidogrel) 템플릿(template) 출혈 시간[분]
복용량 (mg/kg) 누적 복용량 (mg/kg) 개코 원숭이 1 개코 원숭이 2 개코 원숭이 3
기준점 0 >15 5.5 13
식염수 0 n.d. n.d. n.d.
1 1 3.5 n.d. 7
1.5 2.5 >15 >15 >15
2.5 5 >15 >15 >15
5 10 >15 >15 >15
10 20 >15 >15 >15
도 27 및 28은 클로피도그렐(clopidogrel) 및 GBR 600에서 절개부 출혈 시험으로 얻어진 결과를 보여준다. 거즈에 의해 흡수된 혈액의 양은 복용량에 따라 처음으로 복용량에 따라 증가하였고, 높은 복용량에 스스로 제한된다. 모든 연구에서 가장 높은 출혈은 거즈에 흡수된 혈액양이 감소한 후에 4번째 복용량에서 관찰되었고, 상처의 치유가 일어나는 것으로 보였다. 연구 1 및 2에서 최대 출혈은 클로피도그렐(clopidogrel)이 ED100이 2-4 배수이고, GBR 600이 최대 250배수로 테스트되었음에도 불구하고, 클로피도그렐(clopidogrel)과 유사하다. 연구 3에서 주입된 모든 복용량에서 무시해도 좋은 출혈이 보였다.
GBR 600 절개부 출혈 시험 [식염수 값의 배수]
복용량 (mg/kg) 누적 복용량 (mg/kg) 연구 1 연구 2 연구 3
기준점 0 n.a. n.a. n.a.
식염수 0 1 1 1
0.005 0.005 n.a. n.a. 0.13
0.005 0.01 n.a. n.a. 0.08
0.01 0.02 n.a. n.a. 0.05
0.01 0.03 n.a. n.a. 0.05
0.01 0.04 n.a. n.a. 0.02
0.01 0.05 n.a. n.a. 0.03
0.01 0.06 n.a. n.a. n.d.
0.01 0.07 n.a. n.a. n.d.
0.01 0.01 n.a. 2.5 n.a.
0.03 0.03/0.04 0.125 0.5 n.a.
0.1 0.13/0.14 0.625 4.75 n.a.
0.3 0.43/0.44 3.125 7.75 n.a.
1 0.143/1.44 7.625 5.75 n.a.
10 11.43/11.44 4 1.75 n.a.
클로피도그렐(clopidogrel) 절개부 출혈 시험 [식염수 값의 배수]
복용량 (mg/kg) 누적 복용량 (mg/kg) 개코 원숭이 1 개코 원숭이 2 개코 원숭이 3
기준점 0 n.a n.a. n.a
식염수 0 1 1 1
1 1 1.59 1.21 1.28
1.5 2.5 1.06 1 1.1
2.5 5 1.41 6.64 3.32
5 10 5.82 13.64 0.95
10 20 9.12 2.64 0.92
GBR600의 치료학적 범위 및 블리드점수(Bleedscore): 도 10에서, 연구 1 및 2의 절개 출혈의 결과와 세 가지 클로피도그렐(clopidogrel) 연구는 GBR 600과 클로피도그렐(clopidogrel)의 복용향에 대해 플롯(plot)화하였다(복용량은 그 ED100s의 배수로 나타내었고, 로그 스케일로 플롯화하였다.
GBR 600은, 그 ED100이 100배이상 높은 복용량에서 조차, 그 ED100이 4배인 클로피도그렐(clopidogrel)에서 나타난 수준의 출혈을 유도하였다. 뜻밖에도, GBR 600은 출혈 위험에 관한 안정성의 새로운 치료학적 범위를 갖는다.
이러한 연구에서 관찰된 출혈에서 유일하게 임상적으로 관련성이 높은 증가는 템플릿(template) 출혈과 절개 출혈 방법에 의해 측정되는 표면 절개로 인한 자기 제어 출혈의 증가이다. 동물은 수술 후에 48시간 동안 면밀히 관찰되고, 가벼운 멍, 점상 출혈 또는 반상 출혈과 같은 표면 출혈의 추가적 징후가 확인되지 않았다. 혈종, 코피 ,입, 질, 혈변, 눈 출혈,혈뇨, 토혈로부터의 실혈, 등과 같은 내부 출혈의 징후가 없는 것이 더 중요하다. 수술 상처가 출혈이 일어나지 않고 정상적으로 치료되었다.
클로피도그렐(clopidogrel) 및 GBR 600 둘 다는 표 20에서 보여지는 바와 같은, BleedScore 점수 분류법에서 1 점을 갖는다. 표면 상처에서 출혈의 증가와는 별개로, 실험하는 동안 또는 연구의 결론에 이은 48시간 관찰 기간동안에 동물에서 다른 증상은 나타나지 않았다.
클로피도그렐(clopidogrel) 및 GBR 600의 BleedScore 결정
BleedScore 결정
Bleed 심각성 증상 점수 클로피도그렐
(clopidogrel) 		GBR600
표면 출혈 가벼운 멍 1 0 0
작은 상처에 의한 출혈 1 1 1
점상 출혈 1 0 0
반상 출혈 1 0 0
내부 출혈 혈종 3 0 0
코피 3 0 0
입, 질의 실혈 3 0
혈변 3 0 0
눈 출혈 3 0 0
혈뇨 3 0 0
토혈 3 0 0
심각한 출혈 수혈이 필요함 6 0 0
머리가 다침 6 0 0
생명에 위협이 있는 출혈 6 0 0
BleedScore 1 1
효능 및 안정성 연구 결과: 표 30-32는 연구 1 내지 3에서 vWF 농도, 인자 VIII 농도, 백혈구 수, 헤모글로빈 농도(Hb), 혈소판 수(Plt) 및 프로트롬빈 시간(PT) 및 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간(aPTT)에서 GBR 600의 효과를 나타내었다.
연구 1 내지 3에서 얻어진 폰 빌레브란트 농도에 있어서 연구 1에서는 어떠한 패턴(pattern)이 관찰되지 않았으나, 연구 2 및 3에서는 폰 빌레브란트 농도가 현저히 감소되었음을 관찰하였다. 연구 2에서, 가장 높은 복용량이 사용된 곳에서, 상대적으로 낮은 복용량이 사용된 연구 3에서 보다 그 효과가 더 드러났다. vWF에 결합하지 않는 인간화 단일클론 IgG4 항체를 대조군으로 이용한 연구에서 폰 빌레브란트 농도에 영향을 미치지 않는 것이 관찰되었다. 이러한 효과 및 그 영향은 이후 연구에 신중하게 모니터링될 수 있다. GBR 600은 모든 연구에서 인자 VIII 농도에 현저한 효과를 가지지 않았다.
백혈구의 증가가 관찰됨에도 불구하고, 이것은 침윤 과정에 효과가 알려져 있고, vWF와 지금까지 이 모델에서 테스트된 모든 다른 약물에 결합하지 않는 대조군 단일클론 IgG4 항체에 의해 관찰되는 결과와 잘 연관되어 있다. GBR 600의 주입에 의해 야기되는 헤모글로빈 농도에 현저한 효과가 없다는 것이 관찰될 수 있다. 혈소판 수에서 GBR 600의 주입 효과로서, 혈소판 침전이 CFRs 동안에 동맥 폐색에 원인이 되므로 이 기간동안에 혈소판이 소모되었다. 따라서 CFRs의 효과적인 저해는 소모되는 혈소판의 양을 감소할 수 있다. 이는 vWF에 결합하지 않는 대조군 인간화 단일클론 IgG4 항체에서 높은 혈소판 소모를 보이고, CFRs의 저해는 관찰되지 않는 것을 설명한다.
응고 단백질의 인테그리티(integrity)의 표식인, PT 및 aPTT에서 GBR 600의 현저한 효과가 보이지 않았다. 유사한 결과가 vWF에 결합하지 않는 대조군 인간화 단일클론 IgG4 항체에서 관찰되었다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
GBR 600은 동맥 혈전증 동안에 혈소판 침전의 강력한 저해제가 될 수 있는 것으로 보인다. 에피네프린(Epinephrine)은 클로피도그렐(clopidogrel)과 함께 함으로써, 저해를 역으로 할 수 없다. 상기 약물이 최대 250배 효과적인 복용량의 복용량에서 현재 보이는 것에서 주입되었을 때 조차, 심각하게 부정적인 출혈이 GBR 600에서 보이지 않았다. 절개 출혈 모델에서 측정되는 이러한 출혈 복용량은 클로피도그렐(clopidogrel)이 4-5시간에 효과적인 복용량으로 주입된 결과와 유사하게 나타났다. GBR 600은 PT 및 aPTT 결과에 의해 나타나는 응고 단백질에 효과를 주지 않았다. 하지만, 폰 빌레브란트 인자 농도는 감소하였다. 하지만, 인자 VIII 농도에서는 윤곽이 뚜렷한 효과는 보이지 않았다. 이것은 응고 단백질에 의존적인 기능적 비타민 K의 감소된 순환 농도에 의해 와파린(warfarin)이 응고 체계를 저해함으로써 문제가 될 필요가 없다. 전체 혈액 수 파라메타(WBC, Hb 및 Plt)에서 예상치 못했던 효과가 본 연구에서 관찰되지 않았다.
실시예 11: 인간화 NMC-4 변이체의 열안정성
쥐과 NMC-4 FAB 단편 및 키메라 NMC-4-IgG1의 인간화 NMC-4 변이체의 열 안정성은 열량 측정을 사용하여 비교하였다. 단일클론 항체의 녹는 프로필(profile)은 그 동종형이 특징이 된다(Garber 및 Demarest (2007), BBRC 355:751-7); 하지만 FAB 단편의 중간점 녹는 온도는 전장 IgG의 콘텍스트(context)에서 조차 쉽게 확인될 수 있다. 이러한 FAB 일부의 중간 녹는 점은 인간화 후보의 단일클론 안정성을 모니터링하는 데 사용되었다.
열량학적인 측정은 VP-DSC 시차주사열량계(differential scanning microcalorimeter)(MicroCal, Northampton, UK)에서 수행되었다. 세포 부피는 0.128 ml이고; 승온 속도는 1℃/분이고; 및 최대 압력은 64 p.s.i을 유지하였다. 모든 단백질 단편은 PBS(pH 7.4)에서 1-0.5 mg/ml(74 uM)의 농도에서 이용되었다. 각 단백질의 몰라(molar) 열 용량은 제거된 단백질로부터 동일한 완충 용액을 포함하는 중복된(duplicate) 샘플과 비교에 의해 평가되었다. 부분적 몰라(molar) 열 용량 및 녹는점 커브는 표준 방법을 이용하여 분석하였다. 온도기록도(Thermogram)는 기준점을 정하고 농도는 software Origin v7.0에서 Non-Two State 모델을 이용한 추가 분석 전에 노말라이즈(normalize)하였다. 실시예 3에서 기재된 H14L10-IgG4에서 얻어진 상기 결과의 실시예는 도 11에서 나타내었다. H14L10-IgG4 FAB 단편 전이는 81.1℃에서 나타난 반면, 쥐과 NMC-4 FAB 단편은 74.7℃에서 단일 전이를 나타내고, 이것은 안정성(6.4℃)에서 현저한 차이가 나는 것을 의미한다. 인간 FAB 불변 도메인의 효과를 시험하기 위해, 인간 IgG1(가장 안정적인 인간 동종형; Garber 및 Demarest (2007), BBRC 355:751-7)에 이식된 쥐과 NMC-4 가변 도메인을 포함하는 키메라를 제조하였다. H14L10-IgG4 및 키메라 NMC-4-IgG1(79.1℃)의 명백한 FAB Tm값은 H14-L10 FAB(delta Tm>1oC)의 안정성에서 여전히 현저한 증가를 나타내었다.
실시예 12: GBR600 중쇄(VH9) 및 경쇄(VL9)를 암호화하는 유전자의 클로닝
GBR600을 암호화하는 유전자의 클로닝에 사용된 재료 및 방법은 하기와 같다:
PfuUltra (Stratagene, Cat.-No.: 600380)
SpeI (NEB, Cat.-No.: R0133)
HindIII (NEB, Cat.-No.: R0104)
CIP (NEB, Cat.-No.:M0290)
pCR-blunt (Invitrogen, Cat.-No.: 44-0302)
프라이머: Operon, Cologne, Germany
GLNPR107: TAACTAGTCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC
GLNPR108: AAGCTTACGGCTAGCTCACGACACCTGAAATGGAAG
GLNPR139: CCTCAGACAGTGGTTCAAAG
GLNPR 176 GCTAGCGCCACCATGGAGACAGACACAC
GLNPR 177 TAAGCTTCTATCATTTACCCAGAGACAGGG
GLNPR 178 TAAGCTTCTATCAACACTCTCCCCTGTTG
BGHREV: fasteris에서 공급
TMC 벡터 pCI-NMC4-VL9(p156) 및 pCI-NMC4-VH9(p158) Chromos에서 공급.
Qiaquick Gel extraction kit(Qiagen, Cat.-No.: 28706)
1kb+ ladder(Fermentas, Cat.-No.:R0491)
pcDNA3.1(-)(Invitrogen, Cat.-No.: V795-20)
pEF-Dest51[CD19](RZPD, Cat.-No.: RZPDo839G0167-pEF-DEST51)
Sequencing: Fasteris SA (geneva, Switzerland)
Gigaprep kit(Macherey-Nagel, Cat.-No.: Nucleobond PC10000)
pEFcDNA3.1 발현 벡터의 클로닝
발현 벡터 pEFcDNA는 pCDNA3.1(-)(Invitrogen)의 CMV 프로모터를 pEF-DEST51의 EF1-알파(alpha) 프로모터로 대체하여 제조하였다. 이러한 목적을 위하여, 상기 EF1-알파 프로모터는 프라이머 GLNPR107과 108을 이용하고 PfuUltra(Stratagene, 어닐링(anneling) 시간 55℃, 30 싸이클)를 이용하여 증폭하였다. 상기 프라이머들은 완벽한 EFlalpha 프로모터를 증폭하고, 증폭된 단편의 5' 말단에 SpeI 부위 및 3' 말단에 HindIII 부위가 접합된다. 상기 PCR 엠플리콘(amplicon)은 pCR-blunt(Invitrogen)에 클로닝하고, 상기 클론들은 SpeI/HindIII 절단으로 분석하였다. 클론 #4로부터 SpeI/HindIII 단편을 잘라서 같은 효소 조합 및 CIPed를 사용하여 절단된 pcDNA3.1(-) 백본(backbone)으로 클로닝되었다. 상기 클론들은 SpeI 및 HindIII를 사용하여 분석하였고, 클론 #2는 양성으로 나타났다. 백본(backbone)과 인써트(insert)의 두 번째 절단으로 프로모터 단편의 정확한 크기를 추가로 확인하였다.
pEFcDNA내로 GBR600의 클로닝
GBR600 VH9는 PfuUltra (표준 조건, 어닐링(annealing) 온도 55℃, 30 싸이클) 및 프라이머 GLNPR176 및 177를 사용하여 증폭되었다. 주형은 TMC 벡터 p156이었다. GBR600 VL9는 중쇄에서 기재되는 프라이머 GLNPR176 및 178을 사용하여 증폭되었다. 사용된 주형은 TMC 벡터 p158이었다. 상기 프라이머들은 각 엠플리콘(amplicon)에 NheI 제한효소 부위 5' 및 HindIII 제한효소 부위 3'을 추가하였다. 얻어진 PCR 단편은 pCR-blunt내에 클로닝되었고, NheI 및 HindIII를 이용한 제한적 절단으로 분석하였다. 경쇄를 위한 클론 #1 및 중쇄를 위한 클론 #3을 자르고, 효소 NheI 및 HindIII 및 CIPed을 이용하여 열려진 pEFcDNA 내로 클로닝하였다. 상기 제한적 절단은 경쇄를 위한 클론 #1 및 경쇄를 위한 클론 #6이 정확한 크기의 단편을 포함한다는 것을 보여주었다. 이러한 두 개의 클론들은 샘플 GS256 및 GS257로 대조 염기서열분석을 하기 위해 Fasteris에 보냈다. 염기서열분석 파일은 참조 서열과 함께 정렬되었다. 중쇄 서열 GS257은 miniprep DNA의 양이 좋지 않음으로인해 100% 확인될 수 없었다. GBR600 중쇄 VH9(GS257) 및 GBR600 경쇄 VL9(GS256)을 암호화하는 플라스미드는 Gigapreps을 준비하여 사용하였다. 상기 플라스미드 프렙(prep)을 서열 확인을 위해 fasteris에 다시 보냈다. 이 시점에서 샘플 이름은 GBR600 중쇄 VH9는 GS265이고, GBR600 경쇄 VL9는 GS264였다. 더 나은 DNA 질로 인해, 참고 서열과의 서열 동일성은 중쇄 및 경쇄에서 확인될 수 있었다.
본 개시가 참조에 따라 다양하고 특이적인 재료, 방법 및 실시예가 본 문서에서 기재되고 설명되었다고 할지라도, 본 개시는 그 목적을 위해 선택된 재료 및 방법의 특정 조합으로 한정되지 않는 것으로 이해된다. 이러한 디테일(detail)의 다양한 변이는 당업계의 기술에 의해 인지될 수 있는 것을 의미할 수 있다. 일반적으로 고려되는 명세서 및 실시예는, 유일하게, 본 개시의 진정한 범위 및 정신과 함께 하기의 청구항에 따라 나타내어진다. 본 명세서에 언급되어 있는 모든 참고문헌, 특허, 및 공개 특허는 그 전체가 본 문헌에 참조로 통합된다.
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135 140 Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His 195 200 205 Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 <210> 2 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NMC-4 (light chain of the murine mAb) <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 <210> 3 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Human germline VH, 4-59 <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser 65 <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Human antibody AAC18165.1 <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Tyr Arg Pro Gly Val Ala Ala His Ser Pro Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Human germline VL, 018 <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Human antibody AAK94808 <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HDCDR1 <400> 7 Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Asp 1 5 10 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HCDR2 <400> 8 Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> HCDR3 <400> 9 Asp Pro Ala Asp Tyr Gly Asn 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<213> Artificial sequence <220> <223> HC-N73T-R <220> <221> HC-N73T-R <222> (1)..(27) <400> 62 gtttttggag gtgtctttgg agatggt 27 <210> 63 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> HC-V78F-F <400> 63 aactccaaaa accagttctc cctgaaac 28 <210> 64 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> HC-V78F-R <400> 64 gtttcaggga gaactggttt ttggagtt 28 <210> 65 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> HC-K71V-F(H9) <400> 65 cttaccatct ccgtagacaa ctccaaaaac 30 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> HC-K71V-R <400> 66 gtttttggag ttgtctacgg agatggtaag 30 <210> 67 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> hu-VH-K71V-F(H9) <400> 67 cgtgttacca tctccgtaga cacctccaaa 30 <210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> hu-VH-K71V-R(H9) <400> 68 tttggaggtg tctacggaga tggtaacacg 30 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Fab-L-For <400> 69 atacatatgg acatccagat gacccagagc 30 <210> 70 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<213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L8, framework region 1) <400> 219 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 220 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L8 ,framework region 2) <400> 220 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 221 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L8 , framework region 3) <400> 221 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 222 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L23, framework region 1) <400> 222 Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 223 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L12 ,framework region 2) <400> 223 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile Tyr 1 5 10 15 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228 Val Ile Trp Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 229 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L24 ,framework region 2) <400> 229 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 230 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L24 , framework region 3) <400> 230 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Cys Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 231 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L11, framework region 1) <400> 231 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 232 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L11 ,framework region 2) <400> 232 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 233 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L11 , framework region 3) <400> 233 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 234 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L12, framework region 1) <400> 234 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 235 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L12 ,framework region n2) <400> 235 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 236 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VK1 (L12 , framework region 3) <400> 236 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 237 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H9IgG4 (heavy chain) <400> 237 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Asp Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Pro Ala Asp Tyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys <210> 238 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> L9IgG4 (light chain) <400> 238 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (118)

  1. (a) 서열번호: 19에 명시된 중쇄 가변 부위 서열; 및
    (b) 서열번호: 28에 명시된 경쇄 가변 부위 서열을 포함하는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor; vWF)에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  2. (a) 서열번호: 237에 명시된 중쇄 서열; 및
    (b) 서열번호: 238에 명시된 경쇄 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  3. (a) 쥐과(murine) 항체 NMC-4(각각, 서열번호: 1 및 2)의 중쇄 및 경쇄 가변 부위에 존재하는 CDR들에 상응하는 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 부위들(complementarity determining regions, CDR들); 및
    (b) 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)의 가변 부위에 존재하는 구조형성 영역(Framework region;FR)에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 및/또는 인간 항체 AAK94808(서열번호: 6)의 가변 부위에 존재하는 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  4. HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR 및/또는 LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT(서열번호: 12)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  5. 중쇄 CDR들: HCDR1: GFSLTDYGVD(서열번호: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8) 및 HCDR3: DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 및/또는 경쇄 CDR들: LCDR1: SASQDINKYLN(서열번호: 10), LCDR2: YTSSLHS(서열번호: 11) 및 LCDR3: QQYEKLPWT (서열번호: 12)을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  6. 인간 항체 AAC18165.1(서열번호: 4)로부터의 중쇄 구조형성 영역 및/또는 인간 항체 AAK94808(서열번호:6)로부터의 경쇄 구조형성 영역을 추가로 포함하는 청구항 4 또는 5항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 중쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 중쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 경쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 경쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  11. 제 4항 또는 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146)로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 부위를 포함하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  12. 제 4항 또는 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7(서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30)로 구성된 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  13. 제 4항 또는 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 H2(서열번호: 13), H4(서열번호: 14), H5(서열번호: 15), H6(서열번호: 16), H7(서열번호: 17), H8(서열번호: 18), H9(서열번호: 19), H12(서열번호: 20), H13(서열번호: 21), H14(서열번호: 22), H15(서열번호: 145) 또는 H16(서열번호: 146)로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 부위; 및 L5(서열번호: 23), L4(서열번호: 24), L6(서열번호: 25), L7 (서열번호: 26), L8(서열번호: 27), L9(서열번호: 28), L10(서열번호: 29) 또는 L11(서열번호: 30)로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  14. 제 5항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 서열번호: 19의 구조형성 영역과 적어도 80% 동일한 구조형성 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위 서열 및/또는 서열번호: 28의 구조형성 영역과 적어도 80% 동일한 구조형성 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  15. 인간 항체 패밀리(family) VH4의 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역; 및 인간 항체 패밀리(family) VK1의 구조형성 영역에 상응하는 경쇄 구조형성 영역을 추가로 포함하는 제 5항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  16. 중쇄 구조형성 영역 1은 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS(서열번호: 171); 중쇄 구조형성 영역 2는 WIRQPPGKGLEWIG(서열번호: 172); 및 중쇄 구조형성 영역 3은 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 173)인 인간 항체 중쇄 생식세포 서열 4-59에 존재하는 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3; 및 경쇄 구조형성 영역 1은 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(서열번호: 186); 경쇄 구조형성 영역 2는 WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 187); 및 경쇄 구조형성 영역 3은 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC(서열번호: 188)인 인간 항체 경쇄 생식세포 서열 018에 상응하는 경쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3을 추가로 포함하는 제 5항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  17. 중쇄 구조형성 영역 1은 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY(서열번호:165); 중쇄 구조형성 영역 2는 WIRQPPGKGLEWIG(서열번호: 166) 및 중쇄 구조형성 영역 3은 RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR(서열번호: 167)인 인간 항체 중쇄 생식세포 서열 4-34에 존재하는 구조형성 영역에 상응하는 중쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3; 및 경쇄 구조형성 영역 1은 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (서열번호: 186); 경쇄 구조형성 영역 2는 WYQQKPGKAPKLLIY(서열번호: 187); 및 경쇄 구조형성 영역 3은 GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC(서열번호: 188)인 인간 항체 경쇄 생식세포 서열 018에 존재하는 경쇄 구조형성 영역 1, 2 및 3을 추가로 포함하는 제 5항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  18. 제 1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 10nM 이하의 친화도(Kd)를 가지고 vWF에 결합하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  19. 제 1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 100nM 이하의 친화도(Ki)를 가지고 vWF에 결합을 위해 경합하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  20. 제 1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 10nM 이하의 친화도(Kd)를 갖는 A1 도메인과 결합하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  21. 제 1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 100nM 이하의 친화도(Ki)를 가지고 vWF의 A1 도메인에 결합을 위해 경합하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  22. 제 1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 열안정성 온도가 65℃ 이상인 FAB 단편을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  23. 제 1항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 열안정성 온도가 모 비-인간화 항체에 비해 높은 FAB 단편을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  24. 중쇄 CDR1이 GFSLTDYGVD(서열번호: 7), 중쇄 CDR2는 MIWGDGSTDYNSALKS(서열번호: 8), 중쇄 CDR3은 DPADYGNYDYALDY(서열번호: 9) 및 경쇄 CDR1은 SASQDINKYLN(서열번호: 10) 및/또는 경쇄 CDR2는 YTSSLHS(서열번호: 11)가 아닌 단서가 붙는, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3은 QQYEKLPWT(서열번호: 12)인 인간화 항체를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  25. 인간 항체 중쇄 구조형성 영역 및/또는 인간 항체 경쇄 구조형성 영역을 추가로 포함하는 제 24항의 인간화 항체 또는 그의 결합단편.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 중쇄 구조형성 영역은 인간 항체에서 유래된 4-59에 존재하는 중쇄 구조형성 영역에 상응하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 인간 항체로부터 유래된 4-59에 존재하는 중쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  28. 제 26항에 있어서, 상기 인간 항체로부터 유래된 4-59에 존재하는 중쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  29. 제 25항에 있어서, 상기 경쇄 구조형성 영역은 인간 항체로부터 유래된 018에 존재하는 경쇄 구조형성 영역과 상응하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 인간 항체로부터 유래된 018에 존재하는 경쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  31. 제 29항에 있어서, 상기 인간 항체로부터 유래된 018에 존재하는 경쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  32. 제 26항에 있어서, 상기 인간 항체로부터 유래한 4-59는 AAC18165.1인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  33. 제 29항에 있어서, 상기 인간 항체로부터 유래한 018은 AAK94808인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  34. 제 24항에 있어서, LCDR1 및/또는 LCDR2는 인간 항체에서 유래한 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  35. 제 34항에 있어서, LCDR2는 DASNLET(서열번호: 118)인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  36. 제 1항 내지 17항, 및 24항 중 어느 한 항에 있어서, HCDR1은 F27G, L29I, T30S 및 V34W로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  37. 제 1항 내지 17항, 및 24항에 있어서, HCDR2는 S61P 및 A62S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  38. 제 1항 내지 17항, 및 24항에 있어서, LCDR1은 S24Q, N30S 및 K31N으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  39. 제 1항 내지 17항, 및 24항 중 어느 한 항에 있어서, HCDR1은 F27G, L29I, T30S 및 V34W로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, HCDR2는 S61P 및 A62S로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 및 LCDR1은 S24Q, N30S 및 K31N으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  40. 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 인간 항체로부터 유래한 중쇄 구조형성 영역을 추가로 포함하는 제 4항 또는 5항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  41. 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 인간 항체로부터 유래한 경쇄 구조형성 영역을 추가로 포함하는 제 4항 또는 5항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  42. 제 15항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  43. 제 15항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 구조형성 영역은 하나 이상의 쥐과 잔기를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  44. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 상기 모 비-인간화 항체, 또는 상기 모 비-인간화 항체 및 인간 Fc 부위로부터 유래하는 가변 부위를 포함하는 키메라 항체와 동일한 활성을 유지하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 활성은 리스토세틴(ristocetin)에 의해 유도된 혈소판 응집 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  46. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 효과기 기능이 부족한 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  47. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 IgG4로부터 유래된 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  48. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 인간 vWF의 A1 도메인에 특이적인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  49. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체는 전장 항체인 것을 특징으로 하는 인간화 항체.
  50. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, 및 디아바디(diabody)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 항체 단편인 것을 특징으로 하는 결합 단편.
  51. 제 50항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab가 아닌 것을 특징으로 하는 결합 단편.
  52. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산.
  53. DSMZ 등록번호 DSM 21059로 기탁된 미생물에 도입된 벡터 GS264의 핵산 서열을 코딩하는 경쇄를 포함하는 분리된 핵산.
  54. DSMZ 등록번호 DSM 21060으로 기탁된 미생물에 도입된 벡터 GS265의 핵산 서열을 코딩하는 중쇄를 포함하는 분리된 핵산.
  55. 서열번호: 19로 명시된 중쇄 가변 부위 서열 및 서열번호: 28로 명시된 경쇄 가변 부위를 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산.
  56. 서열번호:237에 명시된 중쇄 서열 및 서열번호: 238에 명시된 경쇄 서열을 포함하는 vWF에 특이적인 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 분리된 핵산.
  57. 제 52항 내지 56항 중 어느 한 항의 분리된 핵산을 포함하는 벡터.
  58. 제 52항 내지 56항 중 어느 한 항의 분리된 핵산 또는 57항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  59. 핵산이 발현되고 항체가 생산되도록 제 58항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 생산하는 방법.
  60. 숙주 세포 배양액으로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제 59항의 방법.
  61. 제 59항에 있어서, 상기 항체는 숙주 세포 배지로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 59항에 있어서, 배양하기 전, 중쇄 가변 부위를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 및 경쇄 가변 부위를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 숙주 세포에 공동-형질도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  64. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 일차 인간화 항체 또는 그의 결합 단편 및 vWF의 A1 도메인에 결합하는 이차 항체를 포함하는 조성물.
  65. 제 64항에 있어서, 상기 이차 항체는 AJW-200인 것을 특징으로 하는 조성물.
  66. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 유용한 양으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체내 vWF에 의해 매개된 질환 또는 장애의 치료 방법.
  67. 제 66항에 있어서, 상기 개체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 66항에 있어서, 상기 vWF에 의해 매개된 장애는 혈전성 질환 또는 장애인것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 68항에 있어서, 상기 혈전성 질환 또는 장애는 심장혈관 질환 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 뇌혈관 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 69항에 있어서, 상기 심장 혈관 질환은 동맥경화증, 재협착, 협심증, 급성 심근 경색, 급성 관상동맥 증후군 또는 당뇨병과 관계되는 심장혈관계 장애인 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 68항에 있어서, 상기 혈전성 질환 또는 장애는 혈관 염증, 정맥 혈전증, 겸상적혈구 질환, 이종 이식 거부, 말초 혈관 질환, 혈전성 혈소판 감소성 자반증, 낭포성 섬유증, 혈관성 치매, 레이노병, 류마티스 관절염 또는 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 재 69항에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 혈관성 치매, 허혈성 뇌졸중, 또는 재발성 뇌줄중의 예방인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 66 내지 72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 약 0.001 내지 약 100 mg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 73항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 약 0.002 내지 약 20 mg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 73항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 약 0.002 내지 약 10 mg/kg인 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 66항 내지 75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 유용한 양으로 단회 또는 다회 하위 복용량으로 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 66항 내지 75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 혈소판 응집을 저해하는 데에는 충분하지만, 출혈의 현저한 임상적 징후를 유발하기에는 불충분한 양임을 특징으로 하는 방법.
  78. 제 66항 내지 72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 출혈의 현저한 임상적 징후를 유발하지 않는 약 1 내지 약 250배의 ED100인 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 유용한 양으로 투여하는 것을 포함하는 약제에 이용하는 용도.
  80. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 유용한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 vWF에 의해 매개된 질환 또는 장애의 치료용 약제의 제조에 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 이용하는 용도.
  81. 제 79항에 있어서, 상기 약제는 vWF에 의해 매개된 질환 또는 장애의 치료에 사용하는 것을 특징으로 하는 용도.
  82. 제 80항 또는 81항에 있어서, 상기 vWF에 의해 매개된 장애는 혈전성 질환 또는 장애인 것을 특징으로 하는 용도.
  83. 제 82항에 있어서, 상기 혈전성 장애는 심장 혈관 질환 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 뇌혈관 질환인 것을 특징으로 하는 용도.
  84. 제 83항에 있어서, 상기 심장 혈관 질환은 동맥경화증, 재협착, 협심증, 급성 심근 경색, 급성 관상동맥 증후군 또는 당뇨병과 관계있는 심장혈관계 장애인 것을 특징으로 하는 용도.
  85. 제 82항에 있어서, 상기 혈전성 질환은 혈관 염증, 정맥 혈전증, 겸상적혈구 질호나, 이종 이식 거부, 말초 혈관 질환, 혈전성 혈소판 감소성 자반증, 낭포성 섬유증, 혈관성 치매, 레이노병, 류마티스 관절염 또는 당뇨병을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  86. 제 83항에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 혈관성 치매, 허혈성 뇌졸중 또는 재발성 뇌줄중의 예방인 것을 특징으로 하는 용도.
  87. 제 79항 내지 86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 약 0.001 내지 약 100 mg/kg인 것을 특징으로 하는 용도.
  88. 제 87항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 약 0.002 내지 약 20 mg/kg인 것을 특징으로 하는 용도.
  89. 제 87항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 약 0.002 내지 약 10 mg/kg인 것을 특징으로 하는 용도.
  90. 제 79항 내지 89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 유용한 양으로 단회 또는 다회 하위 복용량으로 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 용도.
  91. 제 79항 내지 89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 혈소판 응집을 저해하는 데에는 충분하지만, 출혈의 현저한 임상적 징후를 유발하기에는 불충분한 양임을 특징으로 하는 용도.
  92. 제 79항 내지 86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 출혈의 현저한 임상적 징후를 유발하지 않는 약 1 내지 약 250배의 ED100이 치료학적으로 유용한 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
  93. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 유용한 양으로 투여하는 것을 포함하는 약제로서 이용하는 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  94. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 유용한 양으로 투여하는 것을 포함하는 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법에 이용하는 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  95. 제 93항에 있어서, 상기 약제는 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료에 이용되는 것임을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  96. 제 94항 또는 95항에 있어서, 상기 vWF에 의해 매개되는 장애는 혈전성 질환 또는 장애인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  97. 제 96항에 있어서, 상기 혈전성 장애는 심장 혈관 질환 또는 허혈성 뇌졸중과 같은 뇌혈관 질환인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  98. 제 97항에 있어서, 상기 심장 혈관 질환은 동맥경화증, 재협착, 협심증, 급성 심근 경색, 급성 관상동맥 증후군 또는 당뇨병과 연관된 심장 혈관계 장애인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  99. 제 96항에 있어서, 상기 혈전성 질환은 혈관 염증, 정맥 혈전증, 겸상적혈구 질환, 이종 이식 거부, 말초 혈관 질환, 혈전성 혈소판 감소성 자반증, 낭포성 섬유증, 혈관성 치매, 레이노병, 류마티스 관절염 또는 당뇨병을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  100. 제 97항에 있어서, 상기 뇌혈관 질환은 혈관성 치매, 허혈성 뇌졸중, 또는 재발성 뇌졸중의 예방인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  101. 제 93항 내지 100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 약 0.001 내지 약 100 mg/kg인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  102. 제 101항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 약 0.002 내지 약 20 mg/kg인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  103. 제 101항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 약 0.002 내지 약 10 mg/kg인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  104. 제 93항 내지 103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 유용한 양으로 단회 또는 다회 하위 복용량으로 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  105. 제 93항 내지 103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적으로 유용한 양은 혈소판 응집을 저해하는 데에는 충분하지만, 출혈의 현저한 임상적 징후를 유발하기에는 불충분한 양인 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  106. 제 93항 내지 100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 출혈의 현저한 임상적 징후를 유발하지 않는 약 1 내지 약 250배의 ED100의 치료학적으로 유용한 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 인간화 항체 또는 그의 결합 단편.
  107. 출혈의 현저한 임상적 징후를 유발하지 않는 1 내지 250배의 ED100의 치료학적으로 유용한 양으로 투여될 수 있는 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 특이적인 인간 항체 또는 그의 결합 단편.
  108. 제 107항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 결합 단편은 인간 vWF의 A1 도메인에 특이적인 것을 특징으로 하는 인간 항체 또는 그의 결합 단편.
  109. 출혈의 현저한 임상적 징후 없이 혈소판 응집 저해에 충분하도록 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 치료학적으로 유용한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 개체에 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 투여하는 방법.
  110. 제 66항 내지 109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 피하로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  111. 제 66항 내지 109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 정맥내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  112. 제 66항 내지 109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 방사선 치료와 병행하여 정맥내로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  113. 제 66항 내지 109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편의 치료학적으로 유용한 양은 약 1 내지 약 250배의 ED100인 것을 특징으로 하는 방법.
  114. 제 79항에 있어서, 상기 인간화 항체 또는 그의 결합 단편은 약 1 내지 약 250배의 ED100의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
  115. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료용 제조품.
  116. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 vWF에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료용 키트.
  117. 제 1항 내지 43항 중 어느 한 항의 인간화 항체 또는 그의 결합 단편을 비 치료적 적용에 이용하는 용도.
  118. 제 117항에 있어서, 상기 비치료적 적용은 진단 검사인 것을 특징으로 하는 용도.
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