ES2495092T3 - Anticuerpos humanizados específicos para el factor von Willebrand - Google Patents

Anticuerpos humanizados específicos para el factor von Willebrand Download PDF

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ES2495092T3 ES09703856.6T ES09703856T ES2495092T3 ES 2495092 T3 ES2495092 T3 ES 2495092T3 ES 09703856 T ES09703856 T ES 09703856T ES 2495092 T3 ES2495092 T3 ES 2495092T3
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Samuel Hou
Harald Mottl
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Abstract

Un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo comprende (a) una secuencia de región variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 19; y (b) una secuencia de región variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 28.

Description

Anticuerpos humanizados específicos para el factor von Willebrand
Campo
La presente descripción se refiere en general a anticuerpos humanizados o fragmentos de fijación de los mismos
5 específicos para el factor von Willebrand. Más específicamente, la descripción se refiere en general a anticuerpos humanizados o fragmentos de fijación de los mismos específicos para el factor von Willebrand, que incluyen los que comprenden CDRs correspondientes a las CDRs presentes en el anticuerpo murino NMC-4.
Antecedentes
La regulación de la adhesión de las plaquetas a sitios de lesión vascular implica una interacción bien orquestada de
10 varias proteínas y juega un papel importante a la vez en la hemostasis y la trombosis. Una proteína de este tipo que contribuye a la adhesión de las plaquetas es el Factor von Willebrand (vWF), una glicoproteína multímera de gran tamaño presente en el plasma sanguíneo. Se supone que vWF interacciona con el receptor de las plaquetas GPIb-α a través de su dominio A1 promoviendo con ello el enrollamiento y la adhesión de las plaquetas (Moake et al. (1986)
J. Clin. Invest. 78: 1456-61). Subsiguientemente al enrollamiento y la adhesión de las plaquetas, puede formarse un
15 tapón plaquetas/fibrina que da como resultado la cesación de la hemorragia. Sin embargo, una respuesta excesiva de las plaquetas y/o de la coagulación puede conducir a condiciones trombóticas patológicas. Variantes de moléculas de fijación anti-vWF se describen en WO 2006/046935 que comprenden regiones variables heterómeras optimizadas por injerto de CDR.
Dado que las terapias actuales dirigidas hacia la inhibición de la activación plaquetaria (v.g., GPIIbIIIa, el receptor
20 ADP, antagonistas de ciclooxigenasa o fosfodiesterasa) o la coagulación (v.g., inhibidores de trombina y factor Xa) están asociadas con complicaciones hemorrágicas, existe necesidad de desarrollar agentes que sean capaces de inhibir sustancialmente la trombosis sin deteriorar significativamente la hemostasis.
Sumario
La presente descripción se refiere en general a anticuerpos humanizados o fragmentos de fijación de los mismos
25 específicos para el factor von Willebrand (vWF) humano, métodos para su preparación y uso, que incluyen métodos para tratamiento de enfermedades o trastornos mediados por vWF. Los anticuerpos humanizados o fragmentos de fijación de los mismos específicos para vWF humano pueden comprender regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de un anticuerpo no humano (v.g., CDRs murinas) y regiones marco humanas.
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para
30 vWF que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada como se expone en SEQ ID NO: 19 y una secuencia de región variable de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 28.
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de cadena pesada como se expone en SEQ ID NO: 237 y una secuencia de cadena ligera como se expone en SEQ ID NO: 238.
35 La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende (a) regiones determinantes de la complementariedad de cadenas pesada y ligera (CDRs) correspondientes a las CDRs presentes en las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo murino NMC-4 (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente; y (b) una región marco de cadena pesada correspondiente a la región marco presente en la región variable de anticuerpos humanos derivados de VH 4-59, tales como el anticuerpo
40 AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4) y/o una región marco de cadena ligera correspondiente a la región marco presente en la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (VL 018) (SEQ ID NO: 6).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una o más de las CDRs de cadena pesada siguientes: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y/o HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9).
45 La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9). En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender además una región marco de cadena pesada de la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4).
50 La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una o más de las CDRs de cadena ligera siguientes: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y/o LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende las CDRs de cadena ligera siguientes: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2:
YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12). En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender además una región marco de cadena ligera de la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo
5 específico para vWF que comprende: CDRs de cadena pesada, HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9); y CDRs de cadena ligera, LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12). En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender además una región marco de cadena ligera de la región variable del anticuerpo humano AAK94808
10 (SEQ ID NO: 6) y/o una región marco de cadena pesada de la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una o más de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID
15 NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado específico para vWF que comprende una o más de las regiones variables de cadena ligera siguientes: L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30).
20 La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una o más de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146); y una o más de las regiones variables de cadena ligera siguientes: L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ
25 ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30).
Por ejemplo, anticuerpos humanizados o fragmentos de fijación de los mismos pueden comprender L5 (SEQ ID NO: 23) y H2 (SEQ ID NO: 13); L5 (SEQ ID NO: 23) y H4 (SEQ ID NO: 14); L5 (SEQ ID NO: 23) y H5 (SEQ ID NO: 15); L5 (SEQ ID NO: 23) y H6 (SEQ ID NO: 16); L5 (SEQ ID NO: 23) y H7 (SEQ ID NO: 17); L5 (SEQ ID NO: 23) y H8 30 (SEQ ID NO: 18); L4 (SEQ ID NO: 24) y H2 (SEQ ID NO: 13); L6 (SEQ ID NO: 25) y H2 (SEQ ID NO: 13); L11 (SEQ ID NO: 30) y H2 (SEQ ID NO: 13); L7 (SEQ ID NO: 26) y H2 (SEQ ID NO: 13); L9 (SEQ ID NO: 28) y H9 (SEQ ID NO: 19); L8 (SEQ ID NO: 27) y H9 (SEQ ID NO: 19); L7 (SEQ ID NO: 26) y H9 (SEQ ID NO: 19); L6 (SEQ ID NO: 25) y H9 (SEQ ID NO: 19); L4 (SEQ ID NO: 24) y H9 (SEQ ID NO: 19); L5 (SEQ ID NO: 23) y H9 (SEQ ID NO: 19); L10 (SEQ ID NO:29) y H9 (SEQ ID NO: 19); L9 (SEQ ID NO: 28) y H9 (SEQ ID NO:19); L9 (SEQ ID NO: 28) y H12
35 (SEQ ID NO: 20); L9 (SEQ ID NO: 28) y H13 (SEQ ID NO: 21); L9 (SEQ ID NO: 28) y H14 (SEQ ID NO: 22); L11 (SEQ 10 NO: 30) y H9 (SEQ ID NO: 19); o L11 (SEQ ID NO: 30) y H14 (SEQ ID NO: 22).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una o más de las CDRs de cadena pesada siguientes: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y/o HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO:
40 9); y una o más de las CDRs de cadena ligera siguientes: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y/o LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12). En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender adicionalmente una región marco de cadena ligera de la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6) y/o una región marco de cadena pesada de la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4).
45 La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación como se describe en esta memoria, que se fija a vWF con una afinidad (Kd) de 10 nM o menos, preferiblemente 5 nM o menos, más preferiblemente 1 nM o menos, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 0,2 nM a aproximadamente 0,4 nM. La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación como se describe en esta memoria que compite para la fijación a vWF con una afinidad (Ki) de 100 nM o menos,
50 preferiblemente 50 nM o menos, más preferiblemente 10 nM o menos, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 0,2 nM a aproximadamente 5,0 nM.
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo que se fija al dominio A1 de vWF con una afinidad (Kd) de 10 nM o menos, preferiblemente 5 nM o menos, más preferiblemente 1 nM o menos, de modo muy preferible al menos aproximadamente 0,2 nM a aproximadamente 0,4
55 nM. La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo que compite respecto a la fijación al dominio A1 de vWF con una afinidad (Ki) de 100 nM o menos, preferiblemente 50 nM o menos, más preferiblemente 10 nM o menos, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 0,2 nM a aproximadamente 5,0 nM.
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo que tiene una temperatura de termoestabilidad del fragmento FAB mayor que 65ºC.
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende: HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7), HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8),
5 HCDR3 (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9) y una cadena ligera CDR1, una cadena ligera CDR2 y LCDR3 (QQYEKLPWT; SEQ ID NO: 12), con la salvedad de que al menos una de LCDR1 y/o LCDR2 no es SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10) o YTSSLHS (SEQ ID NO: 11), respectivamente.
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende, HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7), HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS;
10 SEQ ID NO: 8), HCDR3 (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9), LCDR1 (SASQDINKYLN; SEQ ID NO: 10), LCDR2 (YTSSLHS; SEQ ID NO: 11) y LCDR3 (QQYEKLPWT; SEQ ID NO: 12); las regiones marco de cadena pesada 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 en la familia VH4 de la línea germinal de anticuerpos humanos; y regiones marco de cadena ligera 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 en la familia VK1 de la línea germinal de anticuerpos humanos.
15 La presente descripción se refiere también en general a ácidos nucleicos aislados que codifican los presentes anticuerpos humanizados descritos en esta memoria específicos para vWF humano. En algunas realizaciones, un vector puede comprender los ácidos nucleicos descritos en esta memoria. En otra realización, una célula hospedadora puede comprender los ácidos nucleicos descritos.
La presente descripción se refiere también en general a métodos de producción de un anticuerpo humanizado
20 específico para vWF que comprenden cultivar la célula hospedadora de la presente descripción de tal modo que el ácido nucleico se exprese y el anticuerpo se produzca. En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente recuperar el anticuerpo del cultivo de la célula hospedadora. En algunas realizaciones, el anticuerpo se recuera del medio de la célula hospedara. En algunas realizaciones, antes del cultivo, la célula hospedadora se co-transfecta con un vector que comprende ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada y con
25 un vector que comprende ácido nucleico que codifica una región de cadena ligera.
La presente descripción se refiere en general a composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado específico para vWF y un portador farmacéuticamente aceptable.
Se proporciona n también composiciones que comprenden un primer anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria y un segundo anticuerpo que se fija al dominio A1 de vWF. En
30 algunas realizaciones, el segundo anticuerpo es AJW-200.
La presente descripción se refiere también en general a métodos para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF (v.g., una enfermedad o trastorno trombótico) en un individuo (v.g., un paciente) por administración al individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo específico para vWF. En algunas realizaciones, el individuo es un humano. En algunas realizaciones, una
35 cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para inhibir la agregación de las plaquetas pero insuficiente para causar signos clínicos significativos de hemorragia.
La presente descripción proporciona también usos de anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria como medicamento. La presente descripción proporciona también usos de un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria en la preparación de
40 un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para inhibir la agregación plaquetaria, pero insuficiente para causar signos clínicos significativos de hemorragia.
En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno mediado por vWF es una enfermedad o trastorno trombótico. En algunas realizaciones, el trastorno trombótico es enfermedad cardiovascular o enfermedad cerebrovascular tal 45 como ataque isquémico. En algunas realizaciones, la enfermedad cardiovascular es ateroesclerosis, restenosis, angina, infarto agudo de miocardio, síndrome coronario agudo o trastornos cardiovasculares asociados con diabetes. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno trombótico es inflamación vascular, trombosis venosa, enfermedad de células falciformes, rechazo de xenoinjertos, enfermedad vascular periférica, purpura trombocitopénica trombótica, fibrosis quística, demencia vascular, enfermedad de Raynaud, artritis reumatoide o
50 diabetes. En algunas realizaciones, la enfermedad cerebrovascular es demencia vascular, ataque isquémico, o prevención de ataques recurrentes.
En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF carece de función efectora. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado comprende una región Fc derivada de IgG4.
55 En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF se fija al dominio A1 del factor von Willebrand.
En algunas realizaciones, el fragmento de fijación de anticuerpo específico para vWF es un Fab, Fab’, Fab’-SH, Fv, scFv, F(ab’)2 o un diacuerpo.
En algunas realizaciones, el fragmento de fijación de anticuerpo específico para vWF no es un Fab.
En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado específico para vWF es un anticuerpo de longitud total.
5 En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones, por ejemplo sustituciones F27G, L29I, T30S y/o V34W en HCDR1. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones S61P y/o A62S en HCDR2. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones S24Q, N30S y/o K31N en LCDR1. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender una o
10 más sustituciones, por ejemplo, Y50D, T51A, S53N, H55E y/o S56T en LCDR2. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones F27G, L291, T30S y/o V34W en HCDR1; una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones S61P y/o A62S en HCDR2; una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones S24Q, N30S y/o K31N en LCDR1; y una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones Y50D, T51A, S53N, H55E y/o S56T en LCDR2.
15 Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la actividad inhibidora de un anticuerpo quimérico NMC-4 comparado con el anticuerpo monoclonal NMC-4 original y un anticuerpo anti-vWF diferente, AJW200, en un ensayo de aglutinación plaquetaria mediada por vWF inducida por ristocetina.
La Figura 2A-B muestra la competición para la fijación de NMC-4 marcado con Eu por un anticuerpo quimérico
20 NMC-4 sin marcar (competición homóloga) y AJW200, solos y en combinación (Figura 2A). La competición de un anticuerpo quimérico NMC4 marcado con Eu por el anticuerpo monoclonal NMC-4 sin marcar IgG de control isotipo AJW200 y un derivado humanizado del anticuerpo NMC4 con regiones variables designadas como H9, L9 (Figura 2A). Gráfica de Hill de competición de NMC-4 en presencia o ausencia de AJW200 20 nM (Figura 2B).
La Figura 3 A-E muestra la capacidad de NMC-4 para bloquear la adhesión plaquetaria al vWF endotelial en
25 condiciones de flujo de cizalladura, con inclusión de fotomicrografías de plaquetas adherentes a células HUVEC. Se trataron monocapas de células HUVEC con PBS (Figura A) o histamina 25 µM (Figuras B-E), más 10 µg/ml de anticuerpo anti-vWF, NMC-4 (Figura C), 18 µg/ml de anticuerpo anti-GPIbα, AK2 (Figura D), o 18 µg/ml de IgG de ratón (Figura E). Los diferentes anticuerpos se incluían también en las suspensiones de plaquetas correspondientes inmediatamente antes de la perfusión a través de las monocapas.
30 La Figura 4 A-C muestra la actividad de la quimera NMC-4 (Figura 4A) y un anticuerpo humanizado con regiones variables designadas como H14, L10 (Figura 4B) en el modelo de trombosis arterial por cloruro férrico de la rata comparada con AJW200 (Figura 4C). Los tres anticuerpos se compararon en un estudio de respuesta a la dosis.
La Figura 5 muestra el efecto de dosis crecientes (0,03-10 mg/kg) de GBR600 sobre las reducciones cíclicas de flujo (CFRs) en los babuinos.
35 La Figura 6 muestra el efecto de dosis crecientes (0,01-10 mg/kg) de GBR600 sobre las CFRs en los babuinos.
La Figura 7 muestra el efecto de dosis acumuladas (0,005-0,07 mg/kg) de GBR600 sobre las CFRs en los babuinos.
La Figura 8 muestra la curva de respuesta a la dosis de dosis acumuladas de GBR600 sobre las CFRs en los babuinos.
La Figura 9 muestra el efecto de dosis crecientes (1-10 mg/kg) de clopidogrel en los babuinos.
40 La Figura 10 muestra una comparación del efecto de infusión de dosis crecientes de GBR600 y clopidogrel en el test de hemorragia por incisión. Las dosis se han expresado como múltiplos de la dosis eficaz (v.g., la dosis acumulada, a la cual las CFRs se reducen a cero).
La Figura 11 muestra la estabilidad térmica de variantes humanizadas de NMC-4 por calorimetría de barrido diferencial.
45 Descripción detallada
La presente descripción proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de fijación de los mismos específicos para el factor von Willebrand (vWF) humano, que incluyen aquéllos que comprenden regiones CDR correspondientes a una o más las CDRs o porciones de las CDRs presentes en el anticuerpo murino NMC-4. El anticuerpo NMC-4 se fija al sitio de fijación en GP1b-α en el dominio A1 de vWF (véase, v.g., Fujimura et al Blood, 50 77: 113-20, 1999, Shima et al, J Nara Med Assoc. 36:162, 1985). Los anticuerpos humanizados de la presente descripción pueden comprender adicionalmente regiones marco humanas modificadas o no modificadas, tales como una región marco de cadena pesada correspondiente a la región marco en la región variable del anticuerpo humano
AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4) y una región marco de cadena ligera correspondiente a la región marco en la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6). Una gran diversidad de regiones marco humanas, con inclusión de aquéllas que han demostrado alta homología con las subfamilias a las que pertenecían las regiones de cadena pesada y ligera de NMC-4 murino, se han considerado como moléculas aceptoras potenciales para las
5 CDRs de NMC-4. Muy sorprendentemente, el injerto de CDRs de NMC-4 en uno de los marcos humanos de región variable de cadena pesada seleccionados y uno de los marcos humanos de región variable de cadena ligera seleccionados sin cambios adicionales (v.g., residuos marco mutantes humanos a residuos murinos), es suficiente para retener la potencia del anticuerpo humanizado en el bloqueo de las respuestas a las plaquetas mediadas por vWF.
10 El término “anticuerpo quimérico” incluye anticuerpos en los cuales las secuencias de región variable se derivan de una especie y las secuencias de región constante se derivan de otra especie, tales como un anticuerpo en el cual las secuencias de región variable se derivan de un anticuerpo murino y las secuencias de región constante se derivan de un anticuerpo humano.
El término “anticuerpo humanizado” incluye anticuerpos en los cuales secuencias CDR derivadas de la línea
15 germinal de otras especies de mamífero, tales como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas. Modificaciones de la región marco adicionales pueden hacerse dentro de las secuencias marco humanas así como dentro de las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero.
El término “anticuerpo humano” incluye anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales tanto las regiones marco como las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Adicionalmente, si 20 el anticuerpo contiene una región constante, la región constante se deriva también de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (v.g., mutaciones introducidas por mutagénesis en vitro aleatoria o específica del sitio o por mutación somática en vivo). Sin embargo, el término “anticuerpo humano”, como se utiliza en esta memoria, no pretende incluir anticuerpos en los cuales las
25 secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
Como se utiliza en esta memoria, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que se “deriva de” una secuencia de la línea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Tales sistemas incluyen inmuniza30 ción de un ratón transgénico que es portador de genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o cribado de una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana presentada en fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que se “deriva de” una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana puede identificarse como tal por comparación de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulinas de la línea germinal humana y selección de la secuencia de inmunoglobulinas de 35 la línea germinal humana que está más próxima en secuencia (es decir, % de identidad máximo) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que se “deriva de” una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de la línea germinal, debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas existentes naturalmente o a introducción intencionada de mutación orientada. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado o fragmento del mismo tiene típicamente una 40 identidad de 80% como mínimo en secuencia de aminoácidos respecto a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican como humano el anticuerpo humano cuando se compara con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (v.g., secuencias de la línea germinal murina). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 90%, o incluso al menos 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% idéntico en secuencia de ami
45 noácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal que incluye, por ejemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100%.
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo (v.g., Fab, Fab’, Fab’-SH, Fv, scFv, F(ab’)2, un diacuerpo o un anticuerpo monocatenario) específico para vWF que comprende una
50 secuencia de región variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 19 y una secuencia de región variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 28. La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF, que comprende una secuencia de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 237 y una secuencia de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 238.
55 La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una o más de las CDRs de cadena pesada siguientes: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y/o HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9); y una o más de las CDRs de cadena ligera siguientes: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y/o LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una o más de las CDRs de cadena pesada siguientes: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y/o HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9); o una o más de las CDRs de cadena ligera siguientes: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS
5 (SEQ ID NO: 11) y/o LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende: CDRs de cadena pesada, HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9); y cadena ligera CDRs, LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID
10 NO: 12).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende: CDRs de cadena pesada, HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9); o cadena ligera CDRs, LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID
15 NO: 12).
En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender una región marco de región variable de cadena pesada en donde la región marco comprende una o más (v.g., una, dos, tres, y/o cuatro) secuencias marco de cadena pesada (v.g., marco 1 (FW1), marco 2 (FW2), marco 3 (FW3) y/o marco 4 (FW4)) presentes en un anticuerpo de la familia VH4 humana.
20 En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender una región marco de región variable de cadena ligera en donde la región marco comprende una o más (v.g., una, dos, tres, y/o cuatro) secuencias marco de cadena ligera (v.g., marco 1 (FW1), marco 2 (FW2), marco 3 (FW3) y/o marco 4 (FW4)) presentes en un anticuerpo de la familia VK1 humana.
En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender una o
25 más (v.g., una, dos, tres, y/o cuatro) secuencias de región marco de cadena pesada (v.g., marco 1 (FW1), marco 2 (FW2), marco 3 (FW3) y/o marco 4 (FW4)) presentes en un anticuerpo de la familia VH4 humana y una o más (v.g., una, dos, tres, y/o cuatro) secuencias de región marco de cadena ligera (v.g., marco 1 (FW1), marco 2 (FW2), marco 3 (FW3) y/o marco 4 (FW4)) presentes en un anticuerpo de la familia VK1 humana.
Miembros de la familia VH4 y sus regiones marco de cadena pesada 1, 2 y 3 respectivas incluyen: 4-04 (SEQ ID
30 NO: 147, 148 y 149, respectivamente), 4-28 (SEQ ID NO: 150, 151 y 152, respectivamente), 4-30.1 (SEQ ID NO: 153, 154 y 155, respectivamente), 4-30.2 (SEQ ID NO: 156, 157 y 158, respectivamente), 4-30.4 (SEQ ID NO: 159, 160 y 161, respectivamente), 4-31 (SEQ ID NO: 162, 163 y 164, respectivamente), 4-34 (SEQ ID NO: 165, 166 y 167, respectivamente), 4-39 (SEQ ID NO: 168, 169 y 170, respectivamente), 4-59 (SEQ ID NO: 171, 172 y 173, respectivamente), 4-61 (SEQ ID NO: 174, 175 y 176, respectivamente) y 4-b (SEQ ID NO: 177, 178 y 179, respecti
35 vamente).
Miembros de la familia VK1 y sus regiones marco de cadena ligera 1, 2 y 3 respectivas incluyen: 012 (SEQ ID NO: 180, 181 y 182, respectivamente), 02 (SEQ ID NO: 183, 184 y 185, respectivamente), 018 (SEQ ID NO: 186, 187 y 188, respectivamente), 08 (SEQ ID NO: 189, 190 y 191, respectivamente), A20 (SEQ ID NO: 192, 193 y 194, respectivamente), A30 (SEQ ID NO: 195, 196 y 197, respectivamente), L14 (SEQ ID NO: 198, 199 y 200, respectivamente), 40 L1 (SEQ ID NO: 201, 202 y 203, respectivamente), L15 (SEQ ID NO: 204, 205 y 206, respectivamente), L4 (SEQ ID NO: 207, 208 y 209, respectivamente), L18 (SEQ ID NO: 210, 211 y 212, respectivamente), L5 (SEQ ID NO: 213, 214 y 215, respectivamente), L19 (SEQ ID NO: 216, 217 y 218, respectivamente), L8 (SEQ ID NO: 219, 220, y 221, respectivamente), L23 (SEQ ID NO: 222, 223 y 224, respectivamente), L9 (SEQ ID NO: 225, 226 y 227, respectivamente), L24 (SEQ ID NO: 228, 229 y 230, respectivamente), L11 (SEQ ID NO: 231, 232 y 233, respectivamente) y
45 L12 (SEQ ID NO: 234, 235 y 236, respectivamente).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una o más de las CDRs de cadena pesada siguientes: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y/o HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para
50 vWF que comprende una o más de las CDRs de cadena pesada siguientes: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y/o HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9) y una región marco de cadena pesada del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una o más de las CDRs de cadena pesada siguientes: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO:
55 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y/o HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9) y una región marco de cadena pesada del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4), en donde la región marco de cadena pesada no comprende uno o más residuos murinos.
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una o más de las CDRs de cadena pesada siguientes: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y/o HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9) y una región marco de cadena pesada del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4), en donde la región marco de
5 cadena pesada comprende adicionalmente uno o más residuos murinos.
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específi
10 co para vWF que comprende HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9) y una región marco de cadena pesada del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS
15 (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9) y una región marco de cadena pesada del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4), en donde la región marco de cadena pesada no comprende uno o más residuos murinos.
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS
20 (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9) y una región marco de cadena pesada del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4), en donde la región marco de cadena pesada comprende además uno o más residuos murinos.
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmentos de fijación del mismo específicos para vWF que comprenden una o más de las CDRs de cadena ligera siguientes: LCDR1: SASQDINKYLN
25 (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y/o LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmentos de fijación del mismo específicos para vWF que comprenden una o más de las CDRs de cadena ligera siguientes: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y/o LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12) y una región marco de cadena ligera del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6).
30 La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmentos de fijación del mismo específicos para vWF que comprenden una o más de las CDRs de cadena ligera siguientes: CDRs: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y/o LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12) y una región marco de cadena ligera del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6), en donde la región marco de cadena ligera no comprende uno o más residuos murinos.
35 La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmentos de fijación del mismo específicos para vWF que comprenden una o más de las CDRs de cadena ligera siguientes: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y/o LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12) y una región marco de cadena ligera del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6), en donde la región marco de cadena ligera comprende adicionalmente uno o más residuos murinos.
40 La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende, las CDRs de cadena ligera LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende, las CDRs de cadena ligera LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS
45 (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12), y una región marco de cadena ligera del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende las CDRs de cadena ligera: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12), y una región marco de cadena ligera del anticuerpo
50 humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6), en donde la región marco de cadena ligera no comprende uno o más residuos murinos.
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende las CDRs de cadena ligera: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12) y una región marco de cadena ligera del anticuerpo
55 humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6), en donde la región marco de cadena ligera comprende adicionalmente uno o más residuos murinos.
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende las CDRs de cadena pesada: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9); cadena ligera CDRs: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID
5 NO: 12); y opcionalmente una región marco de cadena ligera de la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6) y/o una región marco de cadena pesada de la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4).
La presente descripción proporciona también variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano o fragmento de fijación del mismo específicas para vWF. Usualmente, las variantes de secuencia de aminoácidos de 10 un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF tendrán una secuencia de aminoácidos de la región marco de cadena pesada y/o ligera, que es idéntica al menos en un 80% (teniendo al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos) a la secuencia de aminoácidos de la región marco de cadena pesada y/o ligera del anticuerpo humanizado original de la cadena pesada o la cadena ligera, v.g., de las secuencias de la región variable pesada y/o ligera como en SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 28, respectivamente. De 15 manera preferible, la identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de la región marco de cadena pesada y/o ligera es al menos 8%%, más preferiblemente al menos 90%, y muy preferiblemente al menos 95%, en particular 96%, más particularmente 97%, de modo aún más particular 98%, y muy particularmente 99%, incluyendo por ejemplo, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y 100%. La identidad u homología con respecto a esta secuencia se define en esta memoria como el 20 porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidato que son idénticos al anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para residuos vWF, después de alineación de las secuencias e introducción de lagunas, en caso necesario, para alcanzar la identidad porcentual máxima de secuencia. Así, la identidad de secuencia puede determinarse por métodos estándar que se utilizan comúnmente para comparar la semejanza en posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. La utilización de un programa de computadora tal 25 como BLAST o FASTA, dos polipéptidos se alinean para coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (sea a lo largo de la longitud total de una o ambas secuencias o a lo largo de una porción predeterminada de una o más secuencias). Los programas proporcionan una penalidad de apertura por defecto y una penalidad de laguna por defecto, y puede utilizarse una matriz de registro tal como PAM250 (una matriz de registro estándar; véase Dayhoff et al., en Atlas of Protein Secuencia and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978), en conjunción con el programa de
30 computadora. Por ejemplo, la identidad porcentual puede calcularse como: el número total de coincidencias idénticas multiplicado por 100 y dividido luego por la suma de la longitud de la secuencia más larga dentro del intervalo de coincidencias y el número de lagunas introducidas en las secuencias más largas a fin de alinear las dos secuencias.
Así pues, la presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo
35 específico para vWF, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende una región marco que es idéntica al menos en un 80% a la región marco de SEQ ID NO: 19 y/o una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende una región marco que es idéntica al menos en un 80% a la región marco de SEQ ID NO: 28. La presente descripción proporciona además un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF, en donde el
40 anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo comprende una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende una región marco que es idéntica al menos en un 80% a la región marco de SEQ ID NO: 237 y/o una secuencia de la región variable de cadena ligera que comprende una región marco que es idéntica al menos en un 80% a la región marco de SEQ ID NO: 238.
Opcionalmente, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones
45 F27G, L29I, T30S y/o V34W, en HCDR1. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones S61P y/o A62S, en HCDR2. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones S24Q, N30S y/o K31N en LCDR1. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones Y50D, T51A, S53N, H55E y/o S56T en LCDR2. En algunas realizaciones, el anticuerpo
50 humanizado puede comprender una o más sustituciones, por ejemplo, sustituciones F27G, L291, T30S y/o V34W en HCDR1; una o más sustituciones, con inclusión de sustituciones S61P y/o A62S en HCDR2; una o más sustituciones, con inclusión de sustituciones S24Q, N30S y/o K31N en LCDR1; una o más sustituciones, por ejemplo, Y50D, T51A, S53N, H55E y/o S65T en LCDR2.
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo
55 específico para vWF que comprende una o más de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146) (los polinucleótidos que codifican las regiones variables de cadena pesada arriba mencionadas se proporcionan por SEQ ID NOs: 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138 y 139,
60 respectivamente).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena ligera siguientes: L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID
NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29)
o L11 (SEQ ID NO: 30) (los polinucleótidos que codifican las regiones variables de cadena ligera arriba mencionadas son proporcionadas por SEQ ID NO: 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 y 127, respectivamente).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específi
5 co para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146); y una de las regiones variables de cadena ligera siguientes: L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ
10 ID NO: 30).
La presente descripción proporciona anticuerpos humanizados o fragmentos de fijación de los mismos específicos para vWF que comprenden L5 (SEQ ID NO: 23) y H2 (SEQ ID NO: 13); L5 (SEQ ID NO: 23) y H4 (SEQ ID NO: 14); L5 (SEQ ID NO: 23) y H5 (SEQ ID NO: 15); L5 (SEQ ID NO: 23) y H6 (SEQ ID NO: 16); L5 (SEQ ID NO: 23) y H7 (SEQ ID NO: 17); L5 (SEQ ID NO: 23) y H8 (SEQ ID NO: 18); L4 (SEQ ID NO: 24) y H2 (SEQ ID NO: 13); L6 (SEQ 15 ID NO: 25) y H2 (SEQ ID NO: 13); L11 (SEQ ID NO: 30) y H2 (SEQ ID NO: 13); L7 (SEQ ID NO: 26) y H2 (SEQ ID NO: 13); L9 (SEQ ID NO: 28) y H9 (SEQ ID NO: 19); L8 (SEQ ID NO: 27) y H9 (SEQ ID NO: 19); L7 (SEQ ID NO: 26) y H9 (SEQ ID NO: 19); L6 (SEQ ID NO: 25) y H9 (SEQ ID NO: 19); L4 (SEQ ID NO: 24) y H9 (SEQ ID NO: 19); L5 (SEQ ID NO: 23) y H9 (SEQ ID NO: 19); L10 (SEQ ID NO:29) y H9 (SEQ ID NO: 19); L9 (SEQ ID NO: 28) y H9 (SEQ ID NO:19); L9 (SEQ ID NO: 28) y H12 (SEQ ID NO: 20); L9 (SEQ ID NO: 28) y H13 (SEQ ID NO: 21); L9 (SEQ
20 ID NO: 28) y H14 (SEQ ID NO: 22); L11 (SEQ ID NO: 30) y H9 (SEQ ID NO: 19); o L11 (SEQ ID NO: 30) y H14 (SEQ ID NO: 22).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria, que se fija a vWF con una afinidad (Kd) de 10 nM o menos, preferiblemente 5 nM o menos, más preferiblemente 1 nM o menos, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,4
25 nM (v.g., desde aproximadamente 0,21, 0,28 ó 0,34 a aproximadamente 0,25, 0,32 ó 0,38 nM). La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación como se describe en esta memoria, que compite en cuanto a fijación a vWF con una afinidad (Ki) de 100 nM o menos, preferiblemente 50 nM o menos, más preferiblemente 10 nM o menos, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 0,2 nM a aproximadamente 5,0 nM (v.g., 0,22, 0,28 ó 0,34 a aproximadamente 2,3, 3,5 ó 4,7 nM).
30 La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria, que se fija al dominio A1 de vWF con una afinidad (Kd) de 10 nM o menos, preferiblemente 5 nM o menos, más preferiblemente 1 nM o menos, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,4 nM (v.g., desde aproximadamente 0,21, 0,28 ó 0,34 a aproximadamente 0,25, 0,32 ó 0,38 nM). La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o
35 fragmento de fijación del mismo que compite respecto a la fijación al dominio A1 de vWF con una afinidad (Ki) de 100 nM o menos, preferiblemente 50 nM o menos, más preferiblemente 10 nM o menos, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 0,2 nM a aproximadamente 5,0 nM (v.g., 0,22, 0,28 ó 0,34 a aproximadamente 2,3, 3,5 ó 4,7 nM).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo
40 específico para vWF que tiene una temperatura de termoestabilidad del fragmento FAB mayor que 65ºC, preferiblemente mayor que 70ºC, más preferiblemente mayor que 75ºC, y muy preferiblemente mayor que 80ºC. Para análisis de la estabilidad térmica del fragmento FAB se utilizan medidas por calorimetría de barrido diferencial, en donde se identifica una temperatura de fusión de punto medio del fragmento FAB en el contexto de una IgG de longitud total. Esta clase de medidas calorimétricas son conocidas por las personas expertas y pueden llevarse a
45 cabo conforme a, v.g. Garber y Demarest (2007) BBRC 355:751-7. Sorprendentemente, se ha encontrado que el anticuerpo humanizado de la presente invención tiene una temperatura de termoestabilidad del fragmento FAB mayor que el anticuerpo no humanizado paterno. El anticuerpo humanizado paterno es usualmente un anticuerpo murino, en particular un anticuerpo murino NMC-4. Así, la presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que tiene una temperatura de termoestabilidad
50 del fragmento FAB mayor que el anticuerpo paterno no humanizado.
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende las secuencias de aminoácidos de la región hipervariable siguientes: HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7), HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8), HCDR3 (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9) y LCDR3 (QQYEKLPWT; SEQ ID NO: 12), con la salvedad de que al menos una de LCDR1 y/o LCDR2 no es
55 SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10) o YTSSLHS (SEQ ID NO: 11), respectivamente. Sorprendentemente, los anticuerpos NMC-4 humanizados que carecen de LCDR1 y/o LCDR2 de NMC-4 retienen afinidad de fijación nanomolar para vWF.
En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender además regiones marco de cadena pesada de anticuerpos humanos. En algunas realizaciones, las regiones marco de cadena pesada corresponden a regiones 60 marco de cadena pesada presentes en un anticuerpo humano derivado de 4-59. En algunas realizaciones, las
regiones marco de cadena pesada presentes en un anticuerpo humano derivado de 4-59 comprenden además uno o más residuos murinos. En algunas realizaciones, las regiones marco de cadena pesada presentes en un anticuerpo humano derivado de 4-59 no comprenden uno o más residuos murinos.
En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender adicionalmente regiones marco de cadena
5 ligera de anticuerpo humano. En algunas realizaciones, las regiones marco de cadena ligera corresponden a las regiones marco de cadena ligera presentes en un anticuerpo humano derivado de 018. En algunas realizaciones, las regiones marco de cadena ligera presentes en un anticuerpo humano derivado de 018 comprenden además uno o más residuos murinos. En algunas realizaciones, las regiones marco de cadena ligera presentes en un anticuerpo humano derivado de 018 no comprenden uno o más residuos murinos.
10 LCDR1 y/o LCDR2 pueden obtenerse a partir de una fuente humana. En algunas realizaciones, LCDR1 y/o LCDR2 pueden obtenerse a partir del mismo anticuerpo (v.g., un solo anticuerpo humano). En otras realizaciones, el CDR1 y/o el CDR2 pueden obtenerse a partir de anticuerpos diferentes (v.g., dos anticuerpos humanos). Si el CDR2 se obtiene de una fuente humana, ésta es preferiblemente DASNLET (SEQ ID NO: 118).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específi
15 co para vWF que comprende: HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7), HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8), HCDR3 (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9), LCDR1 (SASQDINKYLN; SEQ ID NO: 10), LCDR2 (YTSSLHS; SEQ ID NO: 11) y LCDR3 (QQYEKLPWT; SEQ ID NO: 12); las regiones marco de cadena pesada 1,2 y 3 correspondientes a las regiones marco presentes en la secuencia 4-59 de la línea germinal de cadena pesada de anticuerpo humano, en donde la región marco 1 de cadena pesada es QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ
20 ID NO: 171); la región marco de cadena pesada 2 es WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 172); y la región marco de cadena pesada 3 es RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 173); y la región marco de cadena ligera 1, 2 y 3 correspondiente a regiones marco presentes en la secuencia 018 de la línea germinal de cadena ligera de anticuerpo humano, en donde la región marco 1 de cadena ligera es DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 186); la región marco de cadena ligera 2 es WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 187); y la región marco de
25 cadena ligera 3 es GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 188).
La presente descripción proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende: HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7), HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8), HCDR3 (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9)), LCDR1 (SASQDINKYLN; SEQ ID NO: 10), LCDR2 (YTSSLHS; SEQ ID NO: 11) y LCDR3 (QQYEKLPWT; SEQ ID NO: 12); y la región marco de cadena pesada 1, 2 y 3 correspon30 diente a regiones marco presentes en la secuencia 4-34 de la línea germinal de la cadena pesada de anticuerpo humano, en donde la región marco 1 de cadena pesada es QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY (SEQ ID NO:165); la región marco de cadena pesada 2 es WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 166) y la región marco de cadena pesada 3 es RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 167); y la región marco de cadena ligera 1, 2 y 3 correspondiente a regiones marco presentes en la secuencia 018 de la línea germinal de la cadena ligera del anti
35 cuerpo humano, en donde la región marco 1 de cadena ligera es DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 186); la región marco de cadena ligera 2 es WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 187); y la región marco de cadena ligera 3 es GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 188).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para el dominio A1 en vWF que comprende, HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7), HCDR2 40 (MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8), HCDR3 (DPADYGNYDYALD; SEQ ID NO: 9), LCDR1 (SASQDINKYLN; SEQ ID NO: 10), LCDR2 (YTSSLHS; SEQ ID NO: 11) y LCDR3 (QQYEKLPWT; SEQ ID NO: 12); regiones marco 1, 2 y 3 de cadena pesada correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en un anticuerpo de la familia VH4 de la línea germinal de anticuerpos humanos; y regiones marco de cadena ligera 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en un anticuerpo de la familia VK1 de la línea germinal de anticuerpos
45 humanos.
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 4-04 de la línea germinal variable de cadena pesada (v.g., FW1: QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVS (SEQ ID NO: 147), FW2: WVRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 148) y FW3: RVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 149).
50 El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 4-28 de la línea germinal variable de cadena pesada (v.g., FW1: QVQLQESGPGLVKPSDTLSLTCAVS (SEQ ID NO: 150), FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 151) y FW3: RVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 152).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender las regiones marco 1, 2 y 3 corres
55 pondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 4-30.1 de la secuencia de la línea germinal variable de cadena pesada (v.g., FW1: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS (SEQ ID NO: 153), FW2: WIRQHPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 154) y FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 155).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 4-30.2 de la línea germinal variable de cadena pesada (v.g., FW1: QLQLQESGSGLVKPSQTLSLTCAVS (SEQ ID NO: 156), FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 157) y FW3: RVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 158).
5 El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 4-30.4 de la línea germinal variable de cadena pesada (v.g., FW1: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS (SEQ ID NO: 159), FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 160) y FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO:161).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspon
10 dientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 4-31 de la línea germinal variable de cadena pesada (v.g., FW1: QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVS (SEQ ID NO: 162), FW2: WIRQHPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 163) y FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 164).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 4-34 de la línea germinal variable de cadena pesada
15 (v.g., FW1: QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVY (SEQ ID NO: 165), FW2: VIIIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 166) y FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 167).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 4-39 de la línea germinal variable de cadena pesada (v.g., FW1: QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO: 168), FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 169) y
20 FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 170).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 4-59 de la línea germinal variable de cadena pesada (v.g., FW1: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO: 171), v.g., FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 172) y FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 173).
25 El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 4-61 de la línea germinal variable de cadena pesada (v.g., FW1: QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS (SEQ ID NO: 174), FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 175) y FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 176).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspon
30 dientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 4-b de la línea germinal variable de cadena pesada (v.g., FW1: QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVS (SEQ ID NO: 177), FW2: WIRQPPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 178) y FW3: RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR (SEQ ID NO: 179).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 012 de la línea germinal variable de cadena kappa
35 (v.g., FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 180), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 181) y FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 182).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 02 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., (v.g., FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 183), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:
40 184) y FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 185).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 018 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 186), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 187) y FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 188).
45 El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia 08 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 189), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 190) y FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 191).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspon
50 dientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia A20 de la línea germinal de cadena kappa (v.g., FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 192), FW2: WYQQKPGKVPKLLIY (SEQ ID NO: 193) y FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC (SEQ ID NO: 194).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia A30 de la línea germinal variable de cadena kappa
(v.g., FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 195), FW2: WYQQKPGKAPKRLIY (SEQ ID NO: 196) y FW3: GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 197).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L1 de la línea germinal variable de cadena kappa 5(v.g., FW1: NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 198), FW2: WFQQKPGKVPKHLIY (SEQ ID NO: 199) y FW3: GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 200).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L14 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 201), FW2: WFQQKPGKAPKSLIY (SEQ ID NO: 202) y
10 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 203).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L15 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 204), FW2: WYQQKPEKAPKSLIY (SEQ ID NO: 205) y FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 206).
15 El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L4 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 207), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 208) y FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 209).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspon
20 dientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L18 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 210), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 211) y FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 212).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L5 de la línea germinal variable de cadena kappa
25 (v.g., FW1: DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 213), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 214) nd FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 215).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L19 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 216), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 217) y
30 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 218).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L8 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 219), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 220) y FW3: GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 221).
35 El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L23 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 222), FW2: WYQQKPAKAPKLFIY (SEQ ID NO: 223) y FW3: GVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 224).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspon
40 dientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L9 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: AIRMTQSPSSFSASTGDRVTITC (SEQ ID NO: 225), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 226) y FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYC (SEQ ID NO: 227).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L24 de la línea germinal variable de cadena kappa
45 (v.g., FW1: VIWMTQSPSLLSASTGDRVTISC (SEQ ID NO: 228), FW2: WYQQKPGKAPELLIY (SEQ ID NO: 229) y FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISCLQSEDFATYYC (SEQ ID NO: 230).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L11 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 231), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 232) y
50 FW3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 233).
El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede comprender regiones marco 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en la secuencia L12 de la línea germinal variable de cadena kappa (v.g., FW1: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 234), FW2: WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 235) y FW3: GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC (SEQ ID NO: 236).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para el dominio A1 en vWF que comprende: HCDR1 (GFSLTDYGVD; SEQ ID NO: 7), HCDR2 (MIWGDGSTDYNSALKS; SEQ ID NO: 8), HCDR3 (DPADYGNYDYALDY; SEQ ID NO: 9), LCDR1 (SASQDINKYLN; SEQ ID NO: 10), LCDR2 (YTSSLHS; SEQ ID NO: 11) y LCDR3 (QQYEKLPWT; SEQ ID NO: 12); regiones marco de 5 cadena pesada 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en el anticuerpo humano 4-04 (SEQ ID NO: 147, 148 y 149, respectivamente), 4-28 (SEQ ID NO: 150, 151 y 152, respectivamente), 4-30.1 (SEQ ID NO: 153, 154 y 155, respectivamente), 4-30.2 (SEQ ID NO: 156, 157 y 158, respectivamente), 4-30.4 (SEQ ID NO: 159, 160 y 161, respectivamente), 4-31 (SEQ ID NO: 162, 163 y 164, respectivamente), 4-34 (SEQ ID NO: 165, 166 y 167, respectivamente), 4-39 (SEQ ID NO: 168, 169 y 170, respectivamente), 4-59 (SEQ ID NO: 171, 172 y 173, respectivamente), 4-61 (SEQ ID NO: 174, 175 y 176, respectivamente) o 4-b (SEQ ID NO: 177, 178 y 179, respectivamente); y regiones marco de cadena ligera 1, 2 y 3 correspondientes a las regiones marco 1, 2 y 3 presentes en el anticuerpo humano 012 (SEQ ID NO: 180, 181 y 182, respectivamente), 02 (SEQ ID NO: 183, 184 y 185, respectivamente), 018 (SEQ ID NO: 186, 187 y 188, respectivamente), 08 (SEQ ID NO: 189, 190 y 191, respectivamente), A20 (SEQ ID NO: 192, 193 y 194, respectivamente), A30 (SEQ ID NO: 195, 196 y 197, respectivamente),
15 L14 (SEQ ID NO: 198, 199 y 200, respectivamente), L1 (SEQ ID NO: 201, 202 y 203, respectivamente), L15 (SEQ ID NO: 204, 205 y 206, respectivamente), L4 (SEQ ID NO: 207, 208 y 209, respectivamente), L18 (SEQ ID NO: 210, 211 y 212, respectivamente), L5 (SEQ ID NO: 213, 214 y 215, respectivamente), L19 (SEQ ID NO: 216, 217 y 218, respectivamente), L8 (SEQ ID NO: 219, 220, y 221, respectivamente), L23 (SEQ ID NO: 222, 223 y 224, respectivamente), L9 (SEQ ID NO: 225, 226 y 227, respectivamente), L24 (SEQ ID NO: 228, 229 y 230, respectivamente), L11 (SEQ ID NO: 231, 232 y 233, respectivamente) o L12 (SEQ ID NO: 234, 235 y 236, respectivamente).
La presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria que retiene la misma actividad que el anticuerpo no humanizado paterno o como un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables del anticuerpo no humanizado paterno y una región Fc humana. El anticuerpo no humanizado paterno es usualmente un anticuerpo murino, en particular un anticuerpo
25 murino NMC-4. El anticuerpo quimérico que comprende regiones variables del progenitor no humanizado es usualmente un anticuerpo que comprende regiones variables de un anticuerpo murino, en particular de un anticuerpo murino NMC-4 y una región Fc humana. Como región Fc humana se utilizan preferiblemente las regiones Fc humanas que se describen en la presente solicitud.
La actividad del anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria, del anticuerpo no humanizado paterno y del anticuerpo quimérico puede medirse como actividad de aglutinación de las plaquetas inducida por ristocetina por determinación de la actividad CE50 como se describe en el Ejemplo 1. Un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria puede considerarse que retiene la misma actividad del anticuerpo paterno no humanizado o del anticuerpo quimérico cuando la actividad CE50 del anticuerpo humanizado o fragmento del mismo como se describe en esta memoria es idéntica a la actividad
35 CE50 o es diferente (v.g., mayor o menor) de la actividad CE50 del anticuerpo no humanizado paterno o del anticuerpo quimérico.
En una realización preferida de la presente descripción, el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria comprende adicionalmente una región marco de cadena pesada de un anticuerpo humano, en donde la región marco de cadena pesada humana no comprende uno o más residuos murinos.
En una realización preferida adicional de la presente descripción, el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria comprende adicionalmente una región marco de cadena ligera de un anticuerpo humano, en donde la región marco de cadena ligera humana no comprende uno o más residuos murinos.
Una “región marco de cadena pesada humana que no comprende uno o más residuos murinos” o “una región marco
45 de cadena ligera humana que no comprende uno o más residuos murinos” se refiere a una región marco de cadena pesada o ligera humana que no comprende uno o más residuos murinos que existen únicamente en los murinos,
v.g. no comprende retromutaciones a residuos que existen únicamente en murinos y que no existen en humanos. Regiones marco de cadena pesada o ligera humana que contienen residuos humanos que existen también en murinos no están excluidas por esta definición. Asimismo, una región marco de cadena pesada o ligera humana de la cual un residuo se ha mutado a un residuo humano común, v.g. a un residuo común a la mayoría de las regiones marco humanas pero que existe también en murinos no está excluida por esta definición.
En el caso de las realizaciones de la presente descripción en las que regiones marco de cadena ligera o pesada de anticuerpos humanos comprenden adicionalmente uno o más residuos murinos, las mismas comprenden usualmente 10 o menos, preferiblemente 9 o menos, más preferiblemente 8 o menos, aún más preferiblemente 7 o
55 menos, muy preferiblemente 6 o menos, en particular 5 o menos, de modo más particular 4 o menos, aún más particularmente 3 o menos, muy particularmente 2 o menos, y del modo más particularmente preferido 1 solo residuo murino.
La presente descripción proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humano o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 19 y una secuencia de región variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 28.
La presente descripción proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 237 y una secuencia de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 238.
La presente descripción proporciona también un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o
5 fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende regiones CDR correspondientes a las CDRs presentes en el anticuerpo murino NMC-4, una región marco de cadena pesada correspondiente a la región marco presente en la región variable del anticuerpo humano AAC8165.1 (SEQ ID NO: 4) y una región marco de cadena ligera correspondiente a la región marco presente en la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6).
10 La presente descripción proporciona también un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo específico para vWF humano que comprende: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9) y una región marco de cadena pesada de la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4). Una secuencia de nucleótidos de una región marco de cadena pesada humana ilustrativa se indica en SEQ ID NO: 116.
15 La presente descripción proporciona también un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende las CDRs de cadena ligera LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12) y una región marco de cadena ligera de la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6). Una secuencia de nucleótidos de una región marco de cadena ligera humana ilustrativa se indica en SEQ ID NO: 117.
20 La presente descripción proporciona también un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146).
25 La presente descripción proporciona también un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena ligera siguientes: L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30).
La presente descripción proporciona también un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o
30 fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146) y una de las regiones variables de cadena ligera siguientes : L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID
35 NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30).
La presente descripción proporciona también un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de ácido nucleico codificante de cadena ligera del vector GS264 tal como fue depositada en un microorganismo con DSMZ en fecha 23 de enero de 2008, que tiene el No. de acceso DSM 21059.
La presente descripción proporciona también un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de ácido
40 nucleico codificante de cadena pesada del vector GS265 como fue depositada en un microorganismo con DSMZ en fecha 23 de enero de 2008, que tiene el No. de acceso DSM21060.
Así pues, la presente descripción proporciona también un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF codificado por la secuencia de ácido nucleico codificante de cadena ligera del vector GS264 y por la secuencia de ácido nucleico codificante de cadena pesada del vector GS265.
45 La presente descripción proporciona un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 19 y una secuencia de región variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 28.
La presente descripción proporciona un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo
50 humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 237 y una secuencia de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 238.
La presente descripción proporciona también un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF humano que comprende regiones CDR correspondientes a las CDRs presentes en el anticuerpo murino NMC-4, una región marco de cadena pesada 55 correspondiente a la región marco en la región variable del anticuerpo humano AAC18165-1 (SEQ ID NO: 4) y una
región marco de cadena ligera correspondiente a la región marco en la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6).
La presente descripción proporciona también un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo humano o fragmento de fijación del mismo específico para vWF humano que comprende: HCDR1: GFSLTDYGVD 5 (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9) y una región marco de cadena pesada de la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO 4).
La presente descripción proporciona también un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF humano que comprende: las CDRs de cadena ligera LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT
10 (SEQ ID NO: 12) y una región marco de cadena ligera de la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6).
La presente descripción proporciona también un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF humano que comprende una de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID
15 NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146).
La presente descripción proporciona también un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF humano que comprende una de las regiones variables de cadena ligera siguientes: L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID
20 NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30).
La presente descripción proporciona también un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14
25 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146) y una de las regiones variables de cadena ligera siguientes : L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30).
La presente descripción proporciona también un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena ligera del vector GS264 como está depositado en un
30 microorganismo con DSMZ en fecha 23 de enero de 2008, que tiene el número de acceso DSM 21059.
La presente descripción proporciona también un vector que comprende un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena pesada del vector GS265 como está depositado en un microorganismo con DSMZ en fecha 23 de enero de 2008, que tiene el número de acceso NO DSM 21060.
La presente descripción proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica un
35 anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 19 y una secuencia de región variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 28.
La presente descripción proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de
40 cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 237 y una secuencia de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 238.
La presente descripción proporciona también una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende regiones CDR correspondientes a las CDRs presentes en el anticuerpo murino NMC-4, una región marco de cadena pesada
45 que corresponde a la región marco en la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4) y una región marco de cadena ligera correspondiente a la región marco en la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6).
La presente descripción proporciona también una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende: HCDR1:
50 GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9) y una región marco de cadena pesada de la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4).
La presente descripción proporciona también una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF humano que comprende: 55 cadena ligera CDRs LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3:
QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12) y una la región marco de cadena ligera de la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6).
La presente descripción proporciona también una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF humano que comprende
5 una de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146).
La presente descripción proporciona también una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una de
10 las regiones variables de cadena ligera siguientes: L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30).
La presente descripción proporciona también una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF humano que comprende una de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID
15 NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SECT ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146) y una de las regiones variables de cadena ligera siguientes : L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30).
La presente descripción proporciona también una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado que
20 comprende la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena ligera del vector GS264 como está depositado en un microorganismo con DSMZ en fecha 23 de enero de 2008, teniendo el número de acceso DSM 21059.
La presente descripción proporciona también una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena pesada del vector GS265 como está depositada en un microorganismo con DSMZ en fecha 23 de enero de 2008, teniendo el número de acceso DSM 21060.
25 La presente descripción proporciona también métodos para producir un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende cultivar las células hospedadoras de la presente descripción de tal manera que el ácido nucleico se exprese y se produzca el anticuerpo. Métodos para producir el anticuerpo vWF humanizado o fragmento de fijación del mismo de la presente descripción pueden comprender adicionalmente recuperar el anticuerpo del cultivo de células hospedadoras. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede
30 recuperarse del medio de células hospedadoras. En algunas realizaciones, antes del cultivo, la célula hospedadora puede someterse a co-transfección con un vector que comprende ácido nucleico codificante de una región variable de cadena pesada y con un vector que comprende ácido nucleico codificante de una región variable de cadena ligera.
La presente descripción proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de
35 fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de la región variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 19, y una secuencia de la región variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO:
28.
La presente descripción proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada como
40 se indica en SEQ ID NO: 19, y una secuencia de región variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 28 y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente descripción proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 237, y una secuencia de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 238.
45 La presente descripción proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 237, y una secuencia de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 238 y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente descripción proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de
50 fijación del mismo específico para el factor von Willebrand humano (vWF) que comprende regiones CDR correspondientes a las CDRs presentes en el anticuerpo murino NMC-4, una región marco de cadena pesada correspondiente a la región marco en la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4) y una región marco de cadena ligera correspondiente a la región marco en la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6) y un portador farmacéuticamente aceptable.
55 La presente descripción proporciona también composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7),
HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9), una región marco de cadena pesada de la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4) y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente descripción proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de
5 fijación del mismo específicos para vWF que comprenden las CDRs de cadena ligera, LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12), una región marco de cadena ligera de la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6) y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente descripción proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de
10 fijación del mismo específico para vWF que comprende: CDRs de cadena pesada: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9); cadena ligera CDRs: LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12); opcionalmente una región marco de cadena ligera de la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6) y/o una región marco de cadena pesada de la región variable del
15 anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4) y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente descripción proporciona también composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22),
20 H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146) y un portador farmacéuticamente aceptable.
La presente descripción proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena ligera siguientes: L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30) y un portador farmacéuticamente aceptable.
25 La presente descripción proporciona también composiciones que comprenden un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146); una de las regiones variables de cadena ligera siguientes : L5
30 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30) y un portador farmacéuticamente aceptable.
Se proporcionan también composiciones que comprenden un primer anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria y un segundo anticuerpo que se fija al dominio A1 de vWF. En algunas realizaciones, el segundo anticuerpo es AJW-200.
35 La presente descripción proporciona también métodos para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF (v.g., una enfermedad o trastorno trombótico) en un individuo (v.g., un humano), comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF humano que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 19 y una secuencia de la región variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO:
40 28.
La presente descripción proporciona también métodos para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF (v.g., una enfermedad o trastorno trombótico) en un individuo (v.g., un humano), comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO:
45 237 y una secuencia de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 238.
La presente descripción proporciona también métodos para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF (v.g., una enfermedad o trastorno trombótico) en un individuo (v.g., un humano), comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende regiones CDR correspondientes a las CDRs presentes en el
50 anticuerpo murino NMC-4, una región marco de cadena pesada correspondiente a la región marco en la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4) y una región marco de cadena ligera correspondiente a la región marco en la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6).
La presente descripción proporciona también métodos para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF (v.g., una enfermedad o trastorno trombótico) en un individuo (v.g., un humano), que comprende administrar al
55 individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende: HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9) y una región marco de cadena pesada de la región variable del anticuerpo humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4).
La enfermedad o trastorno trombótico puede ser una enfermedad cardiovascular o trastornos cerebrovasculares tales como ataque isquémico. En algunas realizaciones, la enfermedad cardiovascular es ateroesclerosis, restenosis, angina, infarto agudo de miocardio, síndrome coronario agudo o trastornos cardiovasculares asociados con diabetes. En algunas realizaciones, la enfermedad trombótica es inflamación vascular, trombosis venosa,
5 enfermedad de células falciformes, rechazo de xenoinjertos, enfermedad vascular periférica, púrpura trombocitopénica trombótica, fibrosis quística, demencia vascular, enfermedad de Raynaud, artritis reumatoide o diabetes. En algunas realizaciones, los trastornos cerebrovasculares pueden incluir ataque isquémico, resultante de infartos en las arterias cerebrales así como infartos lacunares pequeños, y demencia vascular. Los anticuerpos vWF humanizados pueden utilizarse también para prevención de ataques recurrentes o iniciación de ataques desencadenados por inflamación cerebrovascular.
En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno trombótico puede incluir cáncer.
La presente descripción proporciona métodos para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF (v.g., una enfermedad o trastorno trombótico) en un individuo (v.g., un humano), que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo especí
15 fico para vWF que comprende las CDRs de cadena ligera LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12) y una la región marco de cadena ligera de la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6) y una región marco de cadena ligera de la región variable del anticuerpo humano AAK94808 (SEQ ID NO: 6).
La presente descripción proporciona también métodos para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF (v.g., una enfermedad o trastorno trombótico) en un individuo (v.g., un humano), que comprende: administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo específico para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena pesada siguientes: H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO:
25 146).
La presente descripción proporciona métodos para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF (v.g., una enfermedad o trastorno trombótico) en un individuo (v.g., un humano), que comprende: administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena ligera siguientes: L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ 10 NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30).
La presente descripción proporciona también métodos para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF (v.g., una enfermedad o trastorno trombótico) en un individuo (v.g., un humano), que comprende: administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo, específico
35 para vWF que comprende una de las regiones variables de cadena pesada siguientes H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ 10 NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146); y una de las regiones variables de cadena ligera siguientes : L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30).
En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado carece de función efectora. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado comprende una región Fc derivada de IgG 4.
La presente descripción proporciona un anticuerpo humano o fragmento de fijación del mismo específico descrito para el factor von Willebrand (vWF), que puede administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz desde
45 aproximadamente 1 a aproximadamente 250 veces el valor DE100 sin causar signos clínicos significativos de hemorragia. Preferiblemente, el anticuerpo humano o fragmento de fijación del mismo es específico para el dominio A1 de vWF humano. Más preferiblemente, el anticuerpo humano o fragmento de fijación del mismo específico para vWF es un anticuerpo humanizado o un fragmento de fijación del mismo específico para vWF.
La presente descripción proporciona también un método para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF por administración a un individuo, preferiblemente un humano, de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria desde aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg, con preferencia desde aproximadamente 0,002 a aproximadamente 20 mg/kg, de modo más preferible desde aproximadamente 0,002 a aproximadamente 10 mg/kg, de modo más preferible desde aproximadamente 0,002 a aproximadamente 0,4 mg/kg, de modo más preferible
55 desde aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,2 mg/kg, y de modo muy preferible desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 mg/kg.
La presente descripción proporciona también un método para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF por administración a un individuo que se encuentra en necesidad de ello, de una cantidad terapéuticamente
eficaz del anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo descrito en esta memoria de una cantidad que oscila desde aproximadamente 1 a aproximadamente 250 veces el valor DE100, con preferencia desde aproximadamente 1 a aproximadamente 200 veces el DE100, y de modo más preferible desde aproximadamente 1 a aproximadamente 100 veces el DE100.
5 La presente descripción proporciona también un método para tratar una enfermedad o trastorno mediado por vWF por administración de una o múltiples sub-dosis de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo humanizado
o fragmento de fijación del mismo descrito en esta memoria a un individuo que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento.
La presente descripción proporciona también un método para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado
10 por vWF por administración subcutánea de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo descrito en esta memoria a un individuo que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento.
La presente descripción proporciona también un método para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF por administración intravenosa de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo humanizado o
15 fragmento de fijación del mismo descrito en esta memoria a un individuo que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento.
La presente descripción proporciona también un método para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF por administración intravenosa de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo descrito en esta memoria en serie o en combinación con tratamientos radiológicos
20 (v.g., irradiación o introducción de sustancias radiactivas - tales como aquéllas a las que se hace referencia en UICC (Ed.), Klinische Onkologie, Springer-Verlag (1982)) a un individuo que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento.
Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria pueden utilizarse en la práctica o los ensayos de la presente descripción, se describen los métodos y materiales preferidos.
25 Producción de Anticuerpos del Factor von Willebrand Humanizados
Se proporcionan métodos para producir un anticuerpo del factor von Willebrand (vWF) humanizado (v.g., NMC-4 murino) o fragmento de fijación del mismo. Un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF puede producirse por transferencia de una o más CDRs o porciones de las mismas de las regiones VH y/o VL de un animal no humano (v.g., ratón) a una o más regiones marco de regiones VH y/o VL humanas.
30 Opcionalmente, los residuos marco humanos así presentes en las regiones VH y/o VL pueden reemplazarse por residuos no humanos (v.g., de ratón) correspondientes cuando se necesitan o se desean para mantener afinidad de fijación. Opcionalmente, los residuos de aminoácidos no humanos presentes en las CDRs pueden reemplazarse con residuos humanos.
Las clasificaciones de marcos y CDRs que se describen en esta memoria (excepto HFR1 y HCDR1) están basadas
35 en el sistema de numeración de Kabat. En esta definición, las CDRs de la cadena pesada contienen los residuos 3135 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3); las de la cadena ligera se definen como constituidas por los residuos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3). Las regiones marco en VH (v.g., región marco 1 de cadena pesada (HFR1), región marco 2 de cadena pesada (HFR2), región marco 3 de cadena pesada (HFR3) y/o región marco 4 de cadena pesada (HFR4)) se definen estando constituidas por los residuos 1-30 (HFR1), 36-49
40 (HFR2), 66-94 (HFR3); y 103-113 (HFR4); las que se encuentran en VL contienen los residuos 1-23 (LFR1), 35-49 (LFR2), 57-88 (LFR3) y 98-107 (LFR4) (Wu y Kabat, 1970 J. Exp. Med. 132: 211). Sin embargo, basándose en la estructura de las CDRs, Chothia definió la CDR1-H indicando que comprendía los residuos 26-32 (Chothia et al., 1992 J. Mol. Biol. 227: 799). La definición de AbM (modelización de anticuerpo) es un compromiso entre las dos utilizadas por el software de modelización de anticuerpos AbM de Oxford Molecular, en el cual la CDR1-H contiene
45 los residuos 26-35. Esta es la definición utilizada para los métodos de humanización descritos en esta memoria que utilizan NMC-4.
Un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para el factor von Willebrand (vWF) puede producirse por transferencia de regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de la cadena pesada de NMC-4 a una región marco de cadena pesada correspondiente a la región marco en la región variable del anticuerpo
50 humano AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4); y transferencia las CDRs de la cadena ligera de NMC-4 a una región marco de cadena ligera correspondiente a la región marco en la región variable del anticuerpo humano AAK24808 (SEQ ID NO: 6).
Un anticuerpo humanizado específico para vWF puede producirse también por transferencia de una o más CDRs de cadena pesada (v.g., HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y
55 HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9)) desde la NMC-4 murina a una región marco humana (v.g., de la región variable de AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4).
Un anticuerpo humanizado específico para vWF puede producirse también por transferencia de una o más CDRs de cadena ligera (v.g., LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO:10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO:11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO:12) a una región marco humana (v.g., de la región variable de AAK94808 (SEQ ID NO: 6)).
5 Un anticuerpo humanizado específico para vWF puede producirse también por transferencia de una o más CDRs de cadena pesada (v.g., HCDR1: GFSLTDYGVD (SEQ ID NO: 7), HCDR2: MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) y HCDR3: DPADYGNYDYALDY (SEQ ID NO: 9)) de NMC-4 murino a una región marco humana (v.g., la región variable de ACC18165.1.1 (SEQ ID NO: 4)), y transferencia de una o más CDRs de cadena ligera (v.g., LCDR1: SASQDINKYLN (SEQ ID NO: 10), LCDR2: YTSSLHS (SEQ ID NO: 11) y LCDR3: QQYEKLPWT (SEQ ID NO: 12)) a
10 una región marco humana (v.g., de la región variable de AAK93808 ( SEQ ID NO: 6)).
Un anticuerpo humanizado específico para vWF puede producirse por transferencia de una región variable de cadena pesada modificada que comprende CDR’s presentes en NMC-4 y regiones marco humanas (v.g., (v.g., H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO:
15 145) o H16 (SEQ ID NO: 146)) a una región constante humana.
Un anticuerpo humanizado específico para vWF puede producirse también por transferencia de una región variable de cadena ligera modificada que comprende las CDR’s presentes en NMC-4 y regiones marco humanas (v.g., L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30) a una región constante humana.
20 Un anticuerpo humanizado específico para vWF puede producirse por transferencia de una región variable de cadena pesada modificada que comprende CDRs presentes en NMC-4 y regiones marco humanas (v.g., H2 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 17), H8 (SEQ ID NO: 18), H9 (SEQ ID NO: 19), H12 (SEQ ID NO: 20), H13 (SEQ ID NO: 21), H14 (SEQ ID NO: 22), H15 (SEQ ID NO: 145) o H16 (SEQ ID NO: 146) a una región constante humana; y una región variable de cadena ligera modificada que compren
25 de CDR’s presentes en NMC-4 y regiones marco humanas (v.g., L5 (SEQ ID NO: 23), L4 (SEQ ID NO: 24), L6 (SEQ ID NO: 25), L7 (SEQ ID NO: 26), L8 (SEQ ID NO: 27), L9 (SEQ ID NO: 28), L10 (SEQ ID NO: 29) o L11 (SEQ ID NO: 30) a una región constante humana.
En un intento para reducir adicionalmente la antigenicidad de los anticuerpos humanizados, pueden cambiarse (v.g., sustituirse) los residuos en las CDRs (v.g., residuos murinos) en lugar de un residuo de aminoácido humano. Por 30 ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones F27G, L29I, T30S y/o V34W en HCDR1. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones S61P y/o A62S en HCDR2. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones S24Q, N30S y/o K31N en LCDR1. En algunas realizaciones, el anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones, por ejemplo Y50D, T51A, S53N, H55E y/o S56T, en LCDR2. En algunas realizaciones, el
35 anticuerpo humanizado puede comprender una o más sustituciones F27G, L29I, T30S y/o V24W en HCDR1; una o más sustituciones E61P y/o A62S en HCDR2; una o más sustituciones S24Q, N30S y/o K31N en LCDR1; y una o más sustituciones Y50D, T51A, S53N, H55E y/o S56T, en LCDR2.
Se contemplan diversas formas del anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que está conjugado opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos a
40 fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado o anticuerpo madurado por afinidad puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgG1 intacto.
Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo de anticuerpos humanizados. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase, v.g., Morimoto et al., Journal of Biochemical y Biophysical Methods, 24: 107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 45 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ser producidos ahora directamente por células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de las bibliotecas de fago de anticuerpos expuestas anteriormente. Alternativamente, pueden recuperarse directamente fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, pueden aislarse fragmentos F(ab')2 directamente a partir de cultivo de células
50 hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el técnico experto. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véase WO 1993/16185; Patente U.S. No 5.571.894; y Patente U.S. No 5.587.458. El fragmento de anticuerpo puede ser también un "anticuerpo lineal", v.g., como se describe en la Patente U.S. No 5.641.870, por ejemplo.
De acuerdo con un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de fijación deseadas
55 (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a las secuencias de dominio constante de inmunoglobulinas. La fusión tiene lugar preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la fijación de la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y,
en caso deseado, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan a un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones en las que ratios desiguales de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción proporcionan rendimientos optimizados. No obstante, es posible insertar
5 las secuencias codificantes para las dos o tres cadenas polipeptídicas en un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en ratios iguales da como resultado rendimientos altos o cuando las ratios no tienen significación particular alguna.
La descripción se refiere también a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (v.g., una toxina de molécula pequeña o una toxina
10 enzimáticamente activa de procedencia bacteriana, fúngica, vegetal o animal, con inclusión de fragmentos y/o variantes de las mismas), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado).
La presente descripción contempla adicionalmente un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (v.g., una ribonucleasa o una DNA-endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa; DNasa).
15 Están disponibles una diversidad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos de vWF humanizados radioconjugados. Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu.
Conjugados del anticuerpo y un agente citotóxico pueden producirse utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridiltitiol)-propionato (SPDP), succinimidil-4(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de iminoésteres (tales como 20 adipimidato de dimetilo HCl), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como aldehído glutárico), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)-hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tales como tolileno-2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil
25 3-metildietileno-triaminapentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ilustrativo para conjugación de un radionucleido al anticuerpo (véase WO 1994/11026). El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, pueden utilizarse un enlazador lábil en medio ácido, enlazador sensible a peptidasas, enlazador dimetílico, o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al. Cancer Research, 52:127-131 (1992)).
30 Alternativamente, puede producirse una proteína de fusión que comprende el anticuerpo vWF humanizado y agente citotóxico, v.g., por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos.
En otra realización adicional, el anticuerpo vWF humanizado puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en pre direccionamiento a tumores, en donde se administra al paciente el conjugado anticuerpo-receptor, seguido por retirada de la circulación del conjugado no fijado utilizando un agente de
35 aclaramiento, y seguido después por administración de un "ligando" (v.g., avidina) que está conjugado a un agente citotóxico (v.g., un radionucleótido).
Los anticuerpos de la presente descripción pueden utilizarse también en ADEPT por conjugación del anticuerpo vWF humanizado a una enzima activadora de profármacos que convierte un profármaco (v.g., un agente quimioterapéutico peptidílico, véase WO 1981/01145) en un fármaco anti-cáncer activo (véase v.g., WO 1988/07378
40 y la Patente U.S. No 4.975.278).
El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de tal manera que convierta el mismo en su forma citotóxica, más activa.
Enzimas que son útiles incluyen, pero sin carácter limitante, fosfatasas alcalina útiles para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasas útiles para convertir profármacos que contienen sulfato en 45 fármacos libres; citosina-desaminasas útiles para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticáncer, 5fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como las catepsinas D y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de β-aminoácidos; enzimas que escinden carbohidratos tales como β-galactosidasa y neuroaminidasa útiles para convertir profármacos 50 glicosilados en fármacos libres; β-lactamasas útiles para convertir fármacos derivatizados con β-lactamas en fármacos libres; y penicilin-amidasas, tales como penicilin-amidasa V o penicilin-amidasa G, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos amínicos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos con actividad enzimática, conocidos también en la técnica como "abzimas", para convertir los profármacos de la descripción en fármacos activos libres (véase, v.g.,
55 Massey, Nature, 328: 457-458 (1987)). Conjugados anticuerpo-abzima pueden prepararse como se describe en esta memoria para suministro de la abzima a una población de células tumorales.
Las enzimas pueden unirse covalente a los anticuerpos vWF humanizados por métodos bien conocidos en la técnica tales como el uso de los reactivos de reticulación heterobifuncionales arriba expuestos. Alternativamente, pueden
construirse proteínas de fusión que comprenden al menos la región de fijación de antígeno de un anticuerpo de la descripción enlazado a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima adecuada utilizando métodos de DNA recombinante bien conocidos en la técnica (véase, v.g., Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)).
Otras modificaciones de los anticuerpos se contemplan en esta memoria. Por ejemplo, un anticuerpo puede
5 enlazarse a uno de una diversidad de polímeros no proteináceos, v.g., polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo puede atraparse también en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente), en sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina,
10 microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 16ª, Oslo, A., Ed., (1980).
Los anticuerpos de vWF humanizados descritos en esta memoria pueden formularse también como inmunoliposomas. Liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci.
15 USA, 77:4030 (1980); Patentes de EE.UU. Núms. 4,485,045 and4,544,545; y WO 1997/38731 publicado en 23 de octubre 1997. Liposomas con tiempo circulación mejorado se dan a conocer en la Patente U.S. No 5.013.556.
Liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el
20 diámetro deseado. Fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente descripción pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al. J. Biol. Chem., 237: 286-288 (1982) por una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está contenido opcionalmente en el liposoma. Véase Gabizon et al., J. National Cancer Inst., (1 (19):1484 (1989).
Vectores, Células Hospedadoras y Métodos Recombinantes
25 La presente descripción proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican anticuerpos humanizados específicos para vWF y fragmentos de fijación de los mismos, vectores y células hospedadoras que comprenden el ácido nucleico, y técnicas recombinantes para la producción de un anticuerpo o fragmento de fijación del mismo.
Para la producción recombinante de un anticuerpo, el ácido nucleico que codifica el mismo puede aislarse e insertarse en un vector replicable para clonación ulterior (amplificación del DNA) o para expresión. DNA que codifica 30 un anticuerpo monoclonal puede aislarse y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales (v.g., por utilización de sondas oligonucleotídicas que son capaces de fijarse específicamente a genes que codifican cadenas pesada y ligera de un anticuerpo). Están disponibles muchos vectores. Componentes de los vectores incluyen generalmente, pero sin carácter limitante, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia de terminación
35 de la transcripción.
(i) Componente de Secuencia Señal
Anticuerpos vWF humanizados como se describe en esta memoria pueden producirse recombinantemente no sólo de modo directo, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el término N de la proteína o 40 polipéptido maduro. Una secuencia señal heteróloga puede ser preferiblemente una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. Para células hospedadoras procariotas que no reconocen y procesan la secuencia señal del anticuerpo vWF humanizado nativa, la secuencia señal puede sustituirse por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp, o conductores termoestables de enterotoxina II. Para secreción de levadura, una secuencia señal
45 nativa puede sustituirse por, v.g., un conductor de invertasa de levadura, un conductor de factor α (con inclusión de conductores del factor α de Saccharomyces y Kluyveromyces), un conductor de fosfatasa ácida, un conductor de glucoamilasa de C. albicans, o una señal descrita en WO 1990/13646. En la expresión de células de mamífero, están disponibles secuencias señal de mamífero así como conductores secretorios virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.
50 El DNA para dicha región precursora puede ligarse en marco de lectura a DNA codificante de un anticuerpos vWF humanizado.
(ii) Componente Origen de Replicación
Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que hace posible que el vector se replique en una o más células hospedadoras seleccionadas. Generalmente, en los vectores de 55 clonación esta secuencia puede hacer posible que el vector se replique con independencia del DNA cromosómico del hospedador, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Tales secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es
adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2μ es adecuado para levadura, y diversos orígenes de replicación (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el componente origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamífero (el origen de replicación de SV40 puede utilizarse sólo típicamente debido a que contiene el
5 promotor precoz).
(iii) Componente del Gen de Selección
Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, denominado también marcador seleccionable. Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, v.g., ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c)
10 suministran nutrientes necesarios o deseados no disponibles de medios complejos, v.g., el gen codificante de Dalanina-racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Aquellas células que son transformadas con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a los fármacos y sobreviven por tanto al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante
15 utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son aquéllos que hacen posible la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico codificante del anticuerpo vWF humanizado, tal como DHFR, timidina-quinasa, metalotioneína-I y -II, preferiblemente genes de metalotioneína de primate, adenosina-desamidasa, ornitina-descarboxilasa, etc.
20 Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primeramente por cultivo de transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula hospedadora apropiada cuando se emplea DHFR de tipo salvaje es la línea de células de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de DHFR.
Alternativamente, células hospedadoras (particularmente hospedadores de tipo salvaje que contienen DHFR
25 endógena) transformadas o co-transformadas con secuencias de DNA que codifican un anticuerpo vWF humanizado, proteína DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionable tal como aminoglicosido-3'fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse por crecimiento de las células en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, v.g., kanamicina, neomicina, o G418 (véase, v.g., la patente U.S. No 4.965.199).
30 Un gen de selección adecuado para uso en levadura puede ser el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics 85: 12 (1977). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona luego un ambiente eficaz para detección de la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.
35 Análogamente, cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 ó 38…626) pueden complementarse por plásmidos conocidos portadores del gen Leu2.
Adicionalmente, vectores derivados del plásmido circular de 1,6 μm pKD1 pueden utilizarse para transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, un sistema de expresión para producción en gran escala de quimosina recombinante de ternero ha sido consignado para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Vectores
40 de expresión multi-copia estables para secreción de seroalbúmina humana recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces han sido descritos también. Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991).
(iv) Componente Promotor
Los vectores de expresión y clonación contienen usualmente un promotor que puede ser reconocido por el organismo hospedador y puede estar enlazado operativamente al ácido nucleico codificante de anticuerpos de vWF
45 humanizados. Promotores adecuados para uso con hospedadores procariotas incluyen un promotor phoA, sistemas promotores de β-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp), y promotores híbridos tales como un promotor lac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para uso en sistemas bacterianos pueden contener también una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada operativamente al DNA codificante de un anticuerpo vWF humanizado.
50 Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases aguas arriba del sitio en el que puede iniciarse la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases aguas arriba del comienzo de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT (SEQ ID NO: 31) donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas se encuentra una secuencia AATAAA (SEQ ID NO: 32) que puede ser la señal para adición de la cola poli-A al extremo
55 3' de la secuencia codificante. Estas secuencias pueden insertarse convenientemente en vectores de expresión eucariotas. Ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso como hospedadores de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato-quinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato-descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, 3fosfoglicerato-mutasa, piruvato-quinasa, triosafosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa, y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, pueden ser las regiones promotoras para alcohol-deshidrogenasa, 2
5 isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levadura se describen ulteriormente (véase, v.g., la Patente Europea 73.657). Se utilizan también ventajosamente intensificadores de levadura con promotores de levadura.
La transcripción de anticuerpos vWF humanizados a partir de vectores en células hospedadoras de mamífero puede
10 ser controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tales como Adenovirus 2), virus del papiloma de los bovinos, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y muy preferiblemente el Virus 40 de los Simios (SV40), promotores heterólogos de mamífero, v.g., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y promotores del choque térmico, con tal que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula hospedadora.
15 Los promotores precoz y tardío del virus SV40 pueden obtenerse convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que contiene también el origen de replicación viral de SV40. El promotor inmediato precoz del megalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIIIE. Un sistema para expresión de DNA en hospedadores de mamífero que utiliza el virus del papiloma de los bovinos como vector (véase, v.g., la Patente U.S. No 4.419.446). Una modificación de este sistema se describe, por ejemplo, en la
20 Patente U.S. No 4.601.978. Reyes et al., Nature, 297: 598-601 (1982) describe la expresión de cDNA del interferón β humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina-quinasa del virus del herpes simplex. Alternativamente, puede utilizarse como promotor la repetición del terminal largo del virus del sarcoma de Rous.
(v) Componente del Elemento Intensificador
La transcripción de un DNA que codifica los anticuerpos vWF humanizados de esta descripción por eucariotas
25 superiores puede aumentarse por inserción de una secuencia intensificadora en el vector. Se conocen ahora secuencias intensificadoras útiles de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, α-fetoproteína, e insulina). Típicamente, son útiles también, sin embargo, y pueden utilizarse secuencias intensificadoras de un virus de célula eucariota. Ejemplos incluyen el intensificador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pares de bases 100-270), el intensificador del promotor precoz del citomegalovirus, el intensificador de polioma en el lado tardío del
30 origen de replicación, e intensificadores de adenovirus. Yaniv, Nature 197: 17-18 (1982) describe también elementos intensificadores para activación de promotores eucariotas. Un intensificador puede remodelarse en el vector en una posición 5' o 3' respecto a la secuencia codificante del anticuerpo vWF humanizado, si bien está localizado preferiblemente en el sitio 5' respecto del promotor.
(vi) Comprenden de Terminación de la Transcripción
35 Los vectores de expresión utilizados en células hospedadoras eucariotas (por ejemplo, levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros seres vivos multicelulares) pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilización del mRNA. Tales secuencias están disponibles comúnmente del extremo 5', ocasionalmente del extremo 3', de regiones no traducidas de DNAs o cDNAs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos
40 poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica el anticuerpo vWF humanizado. Un componente útil de terminación de la transcripción es una región de poliadenilación de la hormona del crecimiento de los bovinos (véase, v.g., WO 1994/11026 y los vectores de expresión descritos en dicho lugar).
(vii) Selección y Transformación de Células Hospedadoras
Células hospedadoras adecuadas para clonación o expresión del DNA en vectores incluyen diversas células proca
45 riotas, de levadura, o de eucariotas superiores. Procariotas adecuados para este propósito incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriáceas tales como Escherichia,
v.g. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, v.g., Salmonella typhimurium, Serratia, v.g., Serratia marcescens, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis, pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Hospedadores de clonación de E. coli incluyen E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E.
50 coli X1776 (ATCC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325).
Además de procariotas, microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son hospedadores adecuados de clonación o expresión para vectores codificantes de anticuerpos de vWF humanizados. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de los panaderos, es útil para expresión. Adicionalmente, numerosos otros géneros, especies y cepas están disponibles comúnmente y pueden ser útiles, tales como Schizosaccharomyces pombe; 55 hospedadores de Kluyveromyces tales como, v.g., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos
tales como, v.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y hospedadores de Aspergillus tales como A. nidulans y
A. niger.
Células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo vWF humanizado glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células eucariotas incluyen células de plantas, insectos y vertebrados. 5 Numerosas cepas y variantes de baculovirus y células hospedadoras permisivas correspondientes de insectos tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de los frutos), y Bombyx mori han sido identificadas. Una diversidad de células virales para transfección están disponibles públicamente, v.g., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus pueden utilizarse en esta memoria como el virus conforme a la presente descripción,
10 particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda.
Cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate, y tabaco pueden utilizarse también como hospedadores.
Sin embargo, el interés máximo se ha puesto en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas de células 15 hospedadoras de mamífero útiles incluyen células ChK2 (Chromos Molecular Systems, Inc.); la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón de embrión humano (células 293 ó 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células 293 de riñón de embrión humano (HEK) (Simmons, 1990 Exp Physiol. 75:309); células de fusión b SP2 (Haas y Wabl, 1984, PNAS 81:7185); células de ovario de hámster chino/20 DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980), con inclusión de las líneas de células DG44 (Urlaub et al., Som. Cell y Mol. Gen., 12: 555-566 (1986)) y DP12); células Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón 25 humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonación arriba descritos para producción de anticuerpos vWF humanizados y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados como apropiados para inducción de promotores, selección de
30 transformantes, o amplificación de los genes que codifican las secuencias deseadas.
Líneas de células estables que expresan niveles altos de anticuerpo pueden utilizarse también para producir el anticuerpo humanizado de la presente descripción. Por ejemplo, un sistema de expresión de proteínas de mamífero de alta producción que está basado en una plataforma murina de Expresión de Cromosomas Artificiales (ACE) que ha sido modificado por ingeniería a fin de contener sitios aceptores de recombinación múltiples específicos del sitio
35 puede cargarse con secuencias de genes heterólogos utilizando una integrasa lambda mutante (v.g., integrasa ACE en combinación con un vector lanzadera de direccionamiento (Lindenbaum et al, (Nucl. Acid Res. 32 (21):e172 (2004); Solicitudes de Patente de EE.UU. Núms. 2003/0119104A1 y 2006/0246586 A1). Este sistema puede utilizarse para generar líneas de células estables para expresión de variantes humanizadas seleccionadas y la quimera NMC-4.
40 (viii) Cultivo de las Células Hospedadoras
Células hospedadoras útiles para producir un anticuerpo vWF humanizado pueden cultivarse en una diversidad de medios. Medios disponibles comercialmente tales como Ham's F10 (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Adicionalmente, cualquiera de los medios descritos, por ejemplo, en Ham et al., 45 Meth. Enz. 58:44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980); Patentes de EE.UU. Núms. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 1990/03430; WO 1987/00195; o Patente U.S. Re. 30,985 puede utilizarse como medio de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede suplementarse en caso necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (v.g., insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (v.g., cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), tampones (v.g., HEPES),
50 nucleótidos (v.g., adenosina y timidina), antibióticos (v.g., el fármaco GENTAMICINA™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes usualmente a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios pueden incluirse también a concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Una diversidad de condiciones de cultivo, tales como temperatura y pH, pueden utilizarse con la célula hospedadora seleccionada para expresión.
55 (ix) Purificación del Anticuerpo vWF Humanizado
Cuando se utilizan técnicas recombinantes, un anticuerpo puede producirse intracelularmente o en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si un anticuerpo se produce intracelularmente, como primer paso, los residuos particulados, se trate de células hospedadoras o fragmentos lisados, pueden separarse, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. (Carter et al., BiolTechnology, 10: 163-167 (1992)) describe un
procedimiento para aislamiento de anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Resumidamente, se descongela una pasta de células en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los residuos de células pueden separarse por centrifugación. Cuando se secreta un anticuerpo en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión se
5 concentran primeramente por regla general, con inclusión de la utilización de un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración AMICON™ o MILLIPORE PELLICON™. Puede incluirse un inhibidor de proteasas tal como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) en cualquiera de los pasos anteriores a fin de inhibir la proteólisis, y pueden incluirse antibióticos a fin de prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.
10 Una composición de anticuerpos preparada a partir de células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía con hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que están basados en las cadenas pesadas humanas γ1, γ2 o γ4
15 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62: 1-13 (1083)). Puede utilizarse proteína G para isotipos de ratón y para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). La matriz a la que se fija un ligando de afinidad puede ser agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más breves que los que pueden conseguirse con agarosa. Donde un anticuerpo comprende un dominio CH3, puede
20 utilizarse para purificación la resina BAKERBOND ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, L.J.). Otras técnicas para purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina-SEPHAROSE™, cromatografía sobre una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, y precipitación con sulfato de amonio están disponibles también dependiendo del
25 anticuerpo a recuperar.
Formulaciones Farmacéuticas
Se proporcionan formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo humanizado específico para vWF. Las formulaciones de anticuerpos vWF humanizados pueden prepararse para almacenamiento por mezcla de un anticuerpo que tenga el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores opcionales 30 farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 16ª, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes con inclusión de ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil-amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de 35 bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil-parabenes tales como metil-o propil-parabén; catecol, resorcinol, ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de peso molecular bajo (menor que aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina; glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos con inclusión de glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes
40 tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; iones de carga opuesta formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (v.g. complejos Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Formulaciones de vWF humanizado liofilizadas preferidas se describen en WO 1997/04801, que se incorpora expresamente en esta memoria por referencia.
La formulación de esta memoria puede contener también más de un compuesto activo en caso necesario para la
45 indicación particular de que se trate, preferiblemente aquéllas con actividades complementarias que no afectan desfavorablemente unas a otras. Alternativa o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor del crecimiento, agente antihormonal, fármaco de vWG humanizado, agente antiangiogénico, y/o cardioprotector. Tales moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito deseado.
50 Los ingredientes activos pueden estar atrapados también en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se exponen en Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 16ª, Osol, A. Ed.
55 (1980).
Pueden fabricarse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que se encuentran en forma de artículos conformados, v.g. films, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (v.g., poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), o poli(alcohol vinílico)), 60 polilactidas (Patente U.S. No 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, etileno-acrilato de vinilo no degradable, copolímeros degradables ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPROL DEPO™
(microesferas inyectables compuestas de copolímero ácido láctico-ácido glicólico y acetato de neuprolida), y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Las formulaciones a utilizar para administración en vivo tienen que ser estériles. Esto puede realizarse por filtración a través de membranas de filtración estériles.
5 Tratamiento con Anticuerpos vWF Humanizados
Los anticuerpos vWF humanizados o fragmentos de fijación de los mismos pueden utilizarse para tratar diversas enfermedades o trastornos relacionados con vWF. Afecciones o trastornos ilustrativos incluyen enfermedades o trastornos trombóticos. Las enfermedades o trastornos trombóticos pueden incluir enfermedad cardiovascular o trastornos cerebrovasculares tales como ataque isquémico. En algunas realizaciones, una enfermedad 10 cardiovascular puede ser ateroesclerosis, restenosis, angina, infarto agudo de miocardio, síndrome coronario agudo
o trastornos cardiovasculares asociados con diabetes. En algunas realizaciones, una enfermedad trombótica puede ser inflamación vascular, trombosis venosa, enfermedad de células falciformes, rechazo de xenoinjertos, enfermedad vascular periférica, púrpura trombocitopénica trombótica, fibrosis quística, demencia vascular, enfermedad de Raynaud, artritis reumatoide o diabetes. En algunas realizaciones, los trastornos cerebrovasculares 15 incluyen ataque isquémico, resultante de infartos de las arterias cerebrales así como infartos lacunares pequeños, y demencia vascular. Los anticuerpos vWF humanizados pueden utilizarse también para prevención de ataques recurrentes o iniciación de ataques desencadenados por inflamación cerebrovascular. En el caso del síndrome coronario agudo, los anticuerpos vWF humanizados o fragmentos de fijación de los mismos son particularmente adecuados para el tratamiento de individuos diagnosticados del segmento ST. Los anticuerpos vWF humanizados o
20 fragmento de fijación de los mismos pueden utilizarse también para tratamiento post-quirúrgico a fin de evitar formación de coágulos.
Además, la sobreexpresión o amplificación de vWF puede evaluarse utilizando un ensayo de diagnóstico en vivo,
v.g. por administración de una molécula (tal como un anticuerpo) que fija la molécula a detectar y está marcado con una etiqueta detectable (v.g. un isótopo radiactivo) y escaneo externo del paciente para localización del marcador.
25 En ciertas realizaciones, puede administrarse al paciente un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo vWF humanizado conjugado con un agente citotóxico. Preferiblemente, un inmunoconjugado y/o anticuerpo vWF humanizado al que está fijado aquél es/son internalizado(s) por la célula, dando como resultado una eficacia terapéutica incrementada del inmunoconjugado en la destrucción de la célula cancerosa a la que se fija el mismo. En una realización preferida, un agente citotóxico (incluyendo por ejemplo, maitansinoides, calicheamicinas,
30 ribonucleasas, y DNA-endonucleasas) se direcciona a o interfiere con ácido nucleico en la célula de cáncer. En otra realización, un agente citotóxico (v.g. taxanos o epotilonas) puede estar direccionado a o interferir con los microtúbulos y la mitosis dependiente de microtúbulos en la célula de cáncer.
Los anticuerpos o inmunoconjugados de vWF humanizados se pueden administrar a un paciente humano de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, v.g., como un bolo o por infusión continua a 35 lo largo de un periodo de tiempo, por rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o de inhalación. Se prefiere la administración intravenosa, intraperitoneal o subcutánea del anticuerpo, siendo particularmente preferidas las rutas subcutánea o intraperitoneal. Un protocolo de administración preferido puede ser una sola dosis para un trastorno agudo o aproximadamente una vez cada 3 a 4 semanas para un trastorno crónico, dependiendo del mamífero particular que se esté tratando, el tipo
40 de anticuerpo, y otros factores bien conocidos por el especialista. Sin embargo, son operativos en esta invención otros protocolos de administración.
Otros regímenes terapéuticos pueden combinarse con la administración de anticuerpo vWF humanizado. Una administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferiblemente puede existir cierto periodo
45 de tiempo mientras ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.
En una realización, el tratamiento puede implicar la administración combinada de un anticuerpo anti-vWF humanizado con agentes fibrinolíticos tales como alteplasa, desmoteplasa o microplasmina y/o agentes antiplaquetarios tales como aspirina, dipiridamol o clopidogrel para el tratamiento de la isquemia inducida por infarto de miocardio o infarto cerebral u otros trastornos cerebrovasculares.
50 Puede ser deseable también combinar la administración de un anticuerpo o anticuerpos vWF humanizados con administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno asociado con tumores.
En una realización, el tratamiento de la presente descripción implica la administración combinada de un anticuerpo (o anticuerpos) vWF humanizado(s) y uno o más reguladores de la función inmune en un mamífero, tales como citocinas, así como agentes quimioterapéuticos o agentes inhibidores del crecimiento, que incluyen la 55 coadministración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Agentes quimioterapéuticos preferidos incluyen taxanos (tales como paclitaxel y docetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. Los programas de preparación y dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden utilizarse de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes o como sea determinado empíricamente por el técnico experto. Protocolos de preparación y dosificación
para dicha quimioterapia se describen también en Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992).
Un anticuerpo vWF humanizado puede combinarse con un compuesto anti-hormonal, v.g. un compuesto antiestrógenos tal como tamoxifeno o un inhibidor de las aromatasas tal como anastrozol; una anti-progesterona tal
5 como onapristona (véase, EP 616812); o un anti-andrógeno tal como flutamida, en dosis conocidas para tales moléculas. En el caso en que el cáncer a tratar es un cáncer independiente de hormonas, un paciente puede haber sido sometido previamente a terapia anti-hormonal y, después que el cáncer se hace independiente de las hormonas, el anticuerpo vWF humanizado (y opcionalmente otros agentes como se describen en esta memoria) puede administrarse al paciente.
10 Para la prevención o tratamiento de una enfermedad, la dosis apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se define anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el anticuerpo puede administrarse para propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico encargado del caso. El anticuerpo puede administrarse adecuadamente al paciente en una sola vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y
15 gravedad de la enfermedad, así como de la tasa de aclaramiento del anticuerpo, aproximadamente 1 μg/kg a 15 mg/kg (v.g. 0,1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosis candidato inicial para administración al paciente, sea, por ejemplo por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosis diaria típica podría estar comprendida entre aproximadamente 1 μg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores arriba mencionados. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o más, dependiendo de la afección, el tratamiento puede
20 prolongarse hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad.
Una dosis preferida de un anticuerpo vWF humanizado puede estar comprendida en el intervalo que va desde aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Así, pueden administrarse al paciente una o más dosis de aproximadamente 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas). Tales dosis pueden administrarse intermitentemente, v.g., cada semana, cada dos semanas, cada tres 25 semanas o cada cuatro semanas (v.g. tal que el paciente reciba desde aproximadamente 2 a aproximadamente 20,
v.g. aproximadamente 6 dosis, del anticuerpo vWF humanizado). Puede administrarse una dosis de carga inicial mayor, seguida por una o más dosis menores,. Un régimen de dosificación ilustrativo comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg de un anticuerpo vWF humanizado o fragmento de fijación del mismo. Sin embargo,
30 pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia puede ser monitorizado fácilmente por técnicas y ensayos convencionales.
En estudios para evaluar la eficacia y seguridad de un anticuerpo vWF humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria en los babuinos, se ha encontrado, sorprendentemente, que un anticuerpo humanizado de esta clase es eficaz en la prevención (v.g., reducción, disminución o mejora) de la 35 agregación plaquetaria en vivo a una dosis muy baja, v.g. en el intervalo de pocos μg/kg, lo cual es un resultado inesperado y sin precedentes para tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF. Signos clínicos de hemorragia, con la excepción de un aumento hemorrágico por pequeños cortes (v.g. prolongación del tiempo de sangrado del modelo y/o volumen de hemorragia tal como se mide en el ensayo de sangrado incisional), no se observan a estas concentraciones. Aún más sorprendentemente, a dosis de aproximadamente 1 a
40 aproximadamente 250 veces la DE100, no se observan signos clínicos significativos de hemorragia, aunque se observa un aumento de las hemorragias producidas por cortes pequeños. Por consiguiente, un anticuerpo vWF humanizado o un fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria parece ser eficaz para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF en humanos.
Un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria puede
45 administrarse por tanto a un individuo, preferiblemente un humano, en una cantidad terapéuticamente eficaz que oscila desde aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg/kg. Preferiblemente, una cantidad terapéuticamente eficaz que oscila desde aproximadamente 0,002 a aproximadamente 20 mg/kg, más preferiblemente una cantidad terapéuticamente eficaz que oscila desde aproximadamente 0,002 a aproximadamente 10 mg/kg, y en particular desde aproximadamente 0,002 a aproximadamente 0,4 mg/kg, de modo más particular
50 desde aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,2 mg/kg, y de modo muy particular desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 mg/kg se administra a un individuo, preferiblemente un humano. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo puede administrarse a un individuo en una o más dosis terapéuticamente eficaces. Una cantidad terapéuticamente eficaz administrada es usualmente insuficiente para causar signos clínicos significativos de hemorragia, pero suficiente para inhibir la
55 agregación plaquetaria, es decir puede administrarse una cantidad terapéuticamente eficaz sin causar signos clínicos significativos de hemorragia (v.g. sin causar signos clínicos de hemorragia excepto por un sangrado incrementado por cortes pequeños).
Un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria puede administrarse a un individuo, preferiblemente un humano, en una dosis terapéuticamente eficaz que oscila desde 60 aproximadamente 0,002 a aproximadamente 0,4 mg/kg o en particular desde aproximadamente 0,005 a
aproximadamente 0,2 mg/kg, de modo más particular desde aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 mg/kg para producir un efecto terapéutico (v.g., una reducción en la formación de trombos) en un individuo.
Un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria puede administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz que oscila entre aproximadamente 1 y aproximadamente 250 5 veces la DE100, con preferencia entre aproximadamente 1 y aproximadamente 200 veces la DE100, y de modo más preferible entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 veces la DE100 sin causar signos clínicos significativos de hemorragia (v.g., sin causar signos clínicos de hemorragia excepto por un pequeño aumento de hemorragia por cortes pequeños). Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo como se describe en esta memoria puede administrarse como una sola subdosis o múltiples subdosis al
10 individuo. Las dosis terapéuticamente eficaces anteriores se prefieren para administración intravenosa. En la administración por la ruta subcutánea, la cantidad total administrada preferida puede estar comprendida en el intervalo de aproximadamente 1 a 3 veces la cantidad administrada por la ruta intravenosa, con preferencia aproximadamente 2 veces.
Signos clínicos de hemorragia pueden referirse a la clasificación BleedScore como se describe por Serebruany y
15 Atar (American Journal of Cardiology, 2007, Volumen 99, Número 2, 15 de enero 2007, páginas 288-290) y aplicarse a modelos animales. El BleedScore ha sido desarrollado específicamente para registrar el tipo de hemorragia que es característico para las terapias antiplaquetarias. El BleedScore está basado en la asignación de puntos a hallazgos clínicos que dependen de la gravedad de la hemorragia. Por suma de los puntos de todos los hallazgos, se obtiene un registro resultante. Los síntomas de hemorragia se dividen en tres categorías de gravedad creciente: 1)
20 hemorragia superficial (un punto de registro por suceso), 2) hemorragia interna (3 puntos de registro por suceso), 3) hemorragia alarmante, o una combinación de éstas (6 puntos de registro por evento). Este enfoque es particularmente útil en la determinación e información de eventos hemorrágicos leves a moderados asociados con las modernas terapias antiplaquetarias y antitrombóticas, si bien tiene en cuenta asimismo las complicaciones hemorrágicas más graves. La hemorragia superficial comprende los criterios siguientes: contusión natural,
25 hemorragia por pequeños cortes (v.g. tiempo de hemorragia prolongado del modelo), petequia, equimosis. La Hemorragia Interna comprende los siguientes criterios: hematoma, epistaxis, pérdida de sangre por boca, vagina, melena, hemorragia oftálmica, hematuria, hematemesis. La hemorragia alarmante comprende los criterios siguientes: necesidad de transfusión, intracraneal, y amenazante para la vida.
La inhibición de la agregación plaquetaria (que inhibe la agregación de las plaquetas o que es suficiente para inhibir
30 la agregación de las plaquetas) puede indicar que la cantidad terapéuticamente eficaz administrada es suficiente para inhibir la formación de un trombo oclusivo en una arteria lesionada artificialmente en un modelo animal de tensión arterial como se mide por la monitorización del flujo de sangre a través de la arteria. Un enfoque para determinar la inhibición en vivo de la agregación plaquetaria de una manera cuantitativa es por la medida de reducciones cíclicas de flujo (CFRs) en un modelo de lesión arterial. Así, por ejemplo, la inhibición de la agregación
35 plaquetaria puede indicar que la cantidad terapéuticamente eficaz administrada es suficiente para reducir el número de CFRs en un animal.
Cantidad terapéuticamente eficaz o cantidad eficaz pueden hacer referencia a una cantidad eficaz para mejorar o prevenir los síntomas, o prolongar la supervivencia del individuo que se esté tratando. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está perfectamente dentro de la capacidad de los expertos en la técnica,
40 especialmente en vista de la descripción detallada proporcionada en esta memoria. Una cantidad terapéuticamente eficaz como se describe en esta memoria incluye una cantidad de un anticuerpo vWF eficaz para tratar una enfermedad o trastorno mediado por vWF en un individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo vWF incluye una cantidad necesaria para tratar o inhibir la agregación plaquetaria (v.g. durante trombosis en arterias principales, arterias periféricas, arteriolas o venas).
45 Dosis terapéuticamente eficaz o dosis eficaz puede hacer referencia a una dosis que es eficaz para mejorar o prevenir los síntomas o prolongar la supervivencia de un individuo objeto de tratamiento. Una dosis terapéuticamente eficaz como se describe en esta memoria incluye una dosis de un anticuerpo vWF eficaz para tratar una enfermedad o trastorno mediado por vWF en un individuo. Una dosis terapéuticamente eficaz como se describe en esta memoria incluye una dosis que inhibe la agregación de las plaquetas (v.g. durante trombosis en
50 arterias principales, arterias periféricas, arteriolas o venas). Una dosis terapéuticamente eficaz incluye una DE100 que es la dosis eficaz suficiente para reducir en un 100% la formación de un trombo como se mide por la reducción del flujo de sangre en un vaso sanguíneo. La DE100 como se describe en esta memoria incluye una cantidad de anticuerpo vWF suficiente para reducir a 0 el número de reducciones de flujo a lo largo de un periodo de 30 minutos. Dosis terapéuticamente eficaces incluyen aquellas dosis que producen una reducción en la formación de trombos,
55 por ejemplo, una dosis suficiente para reducir al menos en aproximadamente un 15%, preferiblemente al menos en un 30%, más preferiblemente en al menos 50%, muy preferiblemente en al menos 80%, en particular en al menos 100% la formación de un trombo como se mide por la reducción del flujo sanguíneo en un vaso sanguíneo o por tests ex vivo adecuados que miden la reducción de la agregación plaquetaria.
Alternativamente, un anticuerpo vWF humanizado puede administrarse convenientemente en serie o en combinación
60 con tratamientos radiológicos (v.g., irradiación o introducción de sustancias radiactivas tales como las que se consignan en UICC (Ed.), Klinische Onkologie, Springer-Verlag (1982)).
La presente descripción proporciona por tanto un anticuerpo humano o fragmento de fijación del mismo específico para el factor von Willebrand (vWF), que puede administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz comprendida entre 1 vez y aproximadamente 250 veces la DE100 sin causar signos clínicos significativos de hemorragia. Preferiblemente, el anticuerpo humano o fragmento de fijación del mismo es específico para el dominio A1 de vWF
5 humano. Con preferencia, el anticuerpo humano o fragmento de fijación del mismo específico para vWF es un anticuerpo humanizado o un fragmento de fijación del mismo específico para vWF.
Artículos de Fabricación
En otra realización de la descripción, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos arriba descritos (v.g. un anticuerpo vWF humanizado). El artículo de fabricación puede 10 comprender un recipiente y una etiqueta o prospecto en el paquete o asociado con el recipiente. Recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales o jeringuillas. Los recipientes pueden estar hechos de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que puede ser eficaz para tratar la afección y puede tener una abertura de acceso estéril (v.g., el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un
15 agente activo en la composición puede ser el anticuerpo vWF humanizado descrito en esta memoria. La etiqueta o prospecto en el paquete puede indicar que la composición puede utilizarse para el tratamiento de la afección de elección, tal como cáncer. En una realización, la etiqueta o prospecto en el paquete puede indicar que la composición que comprende el anticuerpo humanizado vWF puede ser utilizada para tratar un trastorno relacionado con vWF.
20 Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en él, en donde la composición comprende el anticuerpo humanizado de esta invención, y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en él, en donde la composición comprende un agente terapéutico distinto del anticuerpo humanizado. El artículo de fabricación en esta realización de la descripción puede comprender adicionalmente un prospecto en el paquete que indique que las composiciones primera y segunda pueden utilizarse en combinación
25 para tratar una enfermedad o trastorno relacionada con vWF. Dicho agente terapéutico puede ser cualquiera de las terapias adjuntas descritas en la sección que antecede (v.g. un agente trombolítico, un agente antiplaquetario, un agente quimioterapéutico, un agente anti-angiogénico, un compuesto anti-hormonal, un cardioprotector, y/o un regulador de la función inmune en un mamífero, con inclusión de una citocina. Alternativa o adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón
30 farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. El mismo puede contener además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, con inclusión de otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, y jeringuillas.
Usos no Terapéuticos para el Anticuerpo vWF Humanizado
35 Los anticuerpos vWF humanizados o fragmentos de fijación de los mismos tienen adicionalmente aplicaciones no terapéuticas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden utilizarse como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, los anticuerpos pueden estar inmovilizados sobre una fase sólida tal como por ejemplo, una resina SEPHADEX™ o papel de filtro, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado puede estar en contacto con una muestra que contiene la proteína vWF humanizada (o fragmento de la misma) a purificar,
40 y después de ello el soporte puede lavarse con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente la totalidad del material en la muestra excepto la proteína vWF humanizada, que puede fijarse al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte puede lavarse con otro disolvente adecuado, tal como tampón de glicina, pH 5,0, que liberará la proteína vWF humanizada del anticuerpo.
Los anticuerpos vWF humanizados pueden ser útiles también en ensayos de diagnóstico para la proteína vWF
45 humana, v.g. detectando su expresión en células, tejidos o suero específicos. Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo puede estar marcado con un resto detectable. Están disponibles numerosos marcadores que pueden agruparse generalmente en las categorías siguientes:
(a) Radioisótopos, tales como 35S, 14C, 125I, 3H y 131I. El anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo utilizando las
técnicas descritas en Current Protocols en Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, 50 Nueva York, N.Y., Pubs. (1991), por ejemplo, y la radiactividad puede medirse utilizando recuento de centelleo.
(b) Están disponibles marcadores fluorescentes tales como quelatos de tierras raras (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, lissamina, ficoeritrina y Rojo Texas. Los marcadores fluorescentes pueden estar conjugados al anticuerpo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols en Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse utilizando un fluorímetro.
55 (c) Están disponibles diversos marcadores enzima-sustrato (véase, v.g., la Patente U.S. No 4.275.149). Estas enzimas catalizan generalmente una alteración química del sustrato cromógeno que puede medirse utilizando diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotométricamente. Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Téc
nicas para cuantificar un cambio de fluorescencia se han descrito anteriormente. El sustrato quimioluminiscente llega a excitarse electrónicamente por una reacción química y puede emitir luego luz que puede medirse (v.g., utilizando un quimioluminómetro) o cede energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (v.g., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente U.S. No 4.737.456), luciferina, 2,35 dihidroftalazinadionas, malato-deshidrogenasa, ureasa, peroxidasas tales como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido-oxidasas (v.g. glucosa-oxidasa, galactosa-oxidasa, y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (v.g. uricasa y xantina-oxidasa), lactoperoxidasa y microperoxidasa. Técnicas para conjugación de enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan et al, "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use en Enzyme Immunoassay," en Methods en
10 Enzym. (Ed., J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, Nueva York, 73:147-166 (1981).
Ejemplos de combinaciones enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:
(i)
peroxidasa de rábano picante (HRP) con hidrogeno-peroxidasa como sustrato, en donde la hidrogeno-peroxidasa oxida un precursor de tinte (v.g., ortofenileno-diamina (OPD) o hidrocloruro de 3,3',5,5'-tetrametil-bencidina (TMB));
(ii)
fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-nitrofenilo como sustrato cromógeno; y
15 (iii) β-D-galactosidasa (β-D-Gal) con un sustrato cromógeno (v.g., p-nitrofenil-β-D-galactosidasa) o el sustrato fluorógeno 4-metilumbeliferil-p-β-galactosidasa.
Numerosas otras combinaciones enzima-sustrato están disponibles para los expertos en la técnica (véanse, v.g., Patentes U.S. Núms. 4.275.149 y 4.318.980).
A veces, el marcador puede estar conjugado indirectamente con el anticuerpo. El profesional experto será
20 conocedor de diversas técnicas para conseguir esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede estar conjugado con biotina, y cualquiera de las tres categorías amplias de marcadores arriba mencionados puede estar conjugada con avidina, o viceversa. La biotina se fija selectivamente a avidina, y por tanto, el marcador puede conjugarse con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para conseguir la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, el anticuerpo puede conjugarse con un pequeño hapteno (v.g., digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores
25 arriba mencionados puede conjugarse con un anticuerpo anti-hapteno (v.g., anticuerpo anti-digoxina). Así, puede conseguirse una conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.
En otra realización de la descripción, el anticuerpo vWF humanizado no precisa estar marcado, y la presencia del mismo puede detectarse utilizando un anticuerpo marcado que se fije al anticuerpo vWF humanizado.
Los anticuerpos de la presente descripción pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como 30 ensayos de fijación competitiva, ensayos sándwich directos o indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
Para inmunohistoquímica, la muestra de tumor puede ser reciente o estar congelada o puede incrustarse en parafina y fijarse con un conservante tal como formalina, por ejemplo.
Los anticuerpos pueden utilizarse también para ensayos de diagnóstico en vivo. Generalmente, el anticuerpo puede 35 estar marcado con un radionucleido (tal como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P o 35S), de tal modo que, por ejemplo, un tumor puede localizarse utilizando inmunoescintigrafía.
Por razones de conveniencia, los anticuerpos de la presente descripción pueden proporcionarse en un kit (v.g., una combinación empaquetada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realización del ensayo de diagnóstico). Si el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit puede incluir sustratos y cofactores 40 requeridos por la enzima (v.g., un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Adicionalmente, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, tampones (v.g., un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y análogos. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden modificarse ampliamente a fin de proporcionar las concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, usualmente liofilizados, con
45 inclusión de excipientes que al disolverse proporcionarán una solución de reactivos que tenga la concentración apropiada.
Los anticuerpos vWF humanizados pueden ser útiles también para obtención de imágenes en vivo, donde el anticuerpo marcado puede administrarse a un hospedador, preferiblemente el torrente sanguíneo, y la presencia y localización del anticuerpo marcado en el hospedador puede ensayarse. Esta técnica de obtención de imágenes 50 puede utilizarse convenientemente en la localización de émbolos vasculares o la estadificación y el tratamiento de neoplasmas. El anticuerpo puede marcarse convenientemente con cualquier resto que sea detectable en un hospedador, con inclusión, por ejemplo, de indicadores no radiactivos detectables por, v.g., resonancia magnética nuclear, u otros medios conocidos en la técnica. Preferiblemente, sin embargo, el marcador puede ser un radiomarcador, con inclusión de yodo, v.g. 125I, 131I, selenio, quelatos bifuncionales, cobre, v.g. 67Cu, tecnecio (v.g., 55 99mTc y renio (v.g., 186Re y 188Re). El radioisótopo puede estar conjugado con la proteína por cualquier medio,
incluyendo por ejemplo compuestos formadores de quelatos con metales o lactoperoxidasa, o técnicas Iodogen para yodación.
Depósito del Material:
Los materiales siguientes han sido depositados con la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen 5 GmbH (DSMZ), Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Alemania:
Un microorganismo (E. coli) depositado con DSMZ en fecha 23 de enero 2008, que tiene el No. de acceso DSM 21059), comprendiendo el vector GS264 que comprende ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena ligera de la variante H9L9IgG4 de NMC-4 humanizado. Un microorganismo
(E. coli) depositado con DSMZ en fecha 23 de enero de 2008, que tiene el No. de acceso DSM 21060, que
10 comprende el vector GS265 que comprende ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena pesada de NMC-4, variante H9L9IgG4. Estos depósitos se prepararon conforme a las estipulaciones del Tratado de Budapest acerca del Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimiento de Patentes y las Regulaciones Incluidas en el mismo (Tratado de Budapest).
Sin descripción adicional, se cree que una persona con experiencia ordinaria en la técnica puede, utilizando la
15 descripción que antecede y los ejemplos ilustrativos que siguen, producir y utilizar los agentes de la presente descripción y practicar los métodos reivindicados. Los ejemplos prácticos siguientes se proporcionan a fin de facilitar la práctica de la presente descripción, y no deben interpretarse como limitantes del resto de la descripción en modo alguno.
EJEMPLOS
20 Ejemplo 1: Construcción de Anticuerpos Quiméricos
Generación de una quimera NMC-4-Fc Humana: Se construye un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables del anticuerpo de ratón NMC-4 y una región Fc humana como se describe a continuación. En un método ilustrativo, el anticuerpo anti-vWF, NMC-4 (v.g., una IgG1κ con secuencias de aminoácidos de la región variable que han sido publicadas) se utiliza como modelo para generar secuencias génicas sintéticas para las regiones VH y VL
25 de NMC-4 (Celikel et al., 1997, Blood Cells, Molecules and Diseases 23: 123-134). Por ejemplo, secuencias de genes sintéticos para VH y VL de NMC-4 se generan por captura de las secuencias de aminoácidos descritas en Celikel et al., y generación de una secuencia de nucleótidos correspondiente utilizando el software VECTOR NTI.
Tabla 1. Cebadores utilizados para generar los plásmidos de expresión de la quimera NMC-4
Cebador Directo
Secuencia Cebador Inverso Secuencia
Cadena Pesada
NMC-VH-EcoRl-F hlgG-F
NMC-VH-IgG1-R hlgG-R
IgG1-BamHI-R
hFc-L235E-F
hFc-L235E-R
CH2-C1q(-)-F
CH2-C1q(-)-R
4-59 conductora-HindIII-NMC-4
IgG1-BamHI-R
Cadena Ligera
NMC-VL-EcoRI-F
NMC-VL-Kappa-R
Kappa-F
Kappa-BamHI-R
En un método ilustrativo, pueden llevarse a cabo reacciones PCR utilizando el KIT PFX DNA POLYMERASE de Accuprime (Invitrogen). Por ejemplo, se ensambla una mezcla de reacción de 50 μl que incluye: 1xPFX tampón, 0,2 μm de mezcla dNTP, 1 unidad de PFX polimerasa, 1 μM de cebador directo, 1 μM de cebador inverso y 100 ng de 5 modelo(s) de DNA. Un programa PCR estándar consiste en la desnaturalización inicial a 94ºC durante 1 minuto, seguido por 30 ciclos, teniendo cada ciclo 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 68ºC durante 1 minuto y un paso de extensión final a 68ºC durante 10 minutos. Los productos PCR se purifican por electroforesis en gel de garosa sobre un gel de 0,8% TAE y una o más bandas del tamaño deseado se escinden y se purifican con un KIT de EXTRACCIÓN de GEL Qiagen. Los fragmentos de DNA se ligan durante 30 minutos a la temperatura
10 ambiente en un volumen de 10 μl que incluye 1xtampón de ligasa T4-DNA (NEB), 0,5 μl de NDA-ligasa T4 (NEB) y 100 ng de cada DNA. A continuación, se utiliza 1 μl de la reacción de ligación para transformar células E. coli JM109 y los insertos generados por la PCR se comprueban por secuenciación utilizando un Analizador de DNA Beckman CEQ 8000.
Tales anticuerpos quiméricos que comprenden una VH y una VL del anticuerpo murino NMC-4 y una Fc humana se
15 sintetizan por PCR de acuerdo con protocolos estándar conocidos en la técnica. En un método ilustrativo, una VH y/o una VL de NMC-4 se fusiona a una Fc humana por realización de la PCR con un cebador específico para NMC-4 y un cebador específico para Fc humana.
Opcionalmente, se introducen sustituciones (v.g., mutaciones) de aminoácidos en la región Fc de IgG1 para anular la Fc y complementar los sitios de fijación para eliminar la citotoxicidad que se supone está mediada por la región 20 constante Fc de tipo salvaje γ1 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 143). Por ejemplo, una región constante de IgG1 humana (v.g., Fc) derivada del clon de cDNA I.M.A.G.E. #4764579 (ATCC) (SEQ ID NO: 33), se amplifica utilizando los cebadores hlgG-F (SEQ ID NO: 36) y hlgG-R (SEQ ID NO: 37) (Tabla 1). Las sustituciones de aminoácidos (v.g. L235E (el sitio de fijación de FcR), y E318A, K320A, K332A (en el sitio de fijación del complemento C1q)) se introducen en la región Fc de IgG1 realizando, por ejemplo, mutagénesis orientada (Duncan y Winter; Nature, 332 25 (6166): 738-40 (1988). Por ejemplo, la mutación L235E se introduce en la región constante utilizando el par de cebadores hFc-L235E-F (SEQ ID NO: 39) y hFc-L325E-R 46 (SEQ ID NO: 40); y las mutaciones del sitio de complemento se introducen utilizando el par de cebadores CH2-C1q(-)-F (SEQ ID NO: 41) y CH2-C1q(-)-R) (SEQ ID NO: 42) (Tabla 1). Los productos PCR resultantes que comprenden las cuatro mutaciones se enlazan utilizando dos cebadores externos, hlgG-F (SEQ ID NO: 36) e IgG1-BamHI-R (SEQ ID NO: 38) para obtener un producto PCR que
30 codifica una región Fc de IgG1 modificada (denominada IgG1 (dm)).
En un método ilustrativo, la región variable de la cadena pesada de NMC-4 se fusiona a una región Fc de IgG1 modificada (v.g. IgG1(dm)) por métodos recombinantes conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada de NMC-4 (SEQ ID NO: 1) se amplifica con los cebadores NMC-VH-EcoRI-F (SEQ ID NO: 34) y NMC-VH-IgG1-R (SEQ ID NO: 35) que introducen un sitio de 35 clonación EcoRI aguas arriba del término N de NMC-VH. Resumidamente, el producto PCR se enlaza con una región constante de cadena pesada (v.g., IgG1(dm)), por PCR recombinante en dos pasos, utilizando primeramente el par de cebadores NMC-VH-EcoRI-F (SEQ ID NO: 34) e hIgG-R (SEQ ID NO: 37) seguido por una reacción PCR que utiliza el par de cebadores NMC-VH-EcoRI-F (SEQ ID NO: 34) e IgG1-BamHI-R (SEQ ID NO: 38). El producto PCR final se digiere con EcoRI y BamHI y se somete a clonación en los sitios EcoR1 y BamH1 del vector pIRES2
40 EGFP-Igκ (Clontech, Palo Alto, California), que está modificado para comprender una secuencia conductora de Igκ (METDTLLLWVLLLWVPGSTGD) (SEQ ID NO: 107) codificada por el polinucleótido de SEQ ID NO: 140) clonado en los sitios XhoI y EcoRI.
En un método ilustrativo, la región variable de la cadena ligera de NMC-4 se fusiona a una región Fc de IgG1 modificada (v.g., IgG1(dm)) por técnicas recombinantes como se describe más adelante. Por ejemplo, la región 45 constante de cadena ligera Igκ (v.g., κC1 (SEQ ID NO: 141) se amplifica a partir del DNA producido a partir del clon
I.M.A.G.E. #4704496 (ATCC (SEQ ID NO: 108) utilizando cebadores, Kappa-F (SEQ ID NO: 47) y Kappa-BamHI-R (SEQ ID NO: 48), lo que induce ulteriormente un sitio de restricción BamHI en el extremo 3' de la región constante de la cadena ligera de Igk. Análogamente, la región variable de la cadena ligera se amplifica a partir del gen VL sintetizado con los cebadores NMR-VL-EcoRI-F (SEQ ID NO: 45) y NMC-VL-Kappa-R (SEQ ID NO: 46) (Tabla 1) lo
50 que introduce un sitio EcoRI en el extremo 5'. A continuación, la región variable NMC-4 y fragmentos de κC1 se enlazan por PCR recombinante utilizando cebadores NMC-VL-EcoRI-F (SEQ ID NO: 45) y Kappa-BamHI-R (SEQ ID
NO: 48). El producto PCR final se digiere con EcoRI y BamHI y se clona en el vector pIRES-DsRed2-lgk en los mismos sitios.
El nivel de expresión de la cadena pesada en el vector pIRES2EGFP puede ser bajo en comparación con el plásmido pIRES-DsRed que expresa la quimera de cadena ligera ratón-humana, a pesar del hecho de que se utiliza 5 la misma secuencia conductora Igκ para ambas cadenas ligera y pesada. De acuerdo con ello, a fin de mejorar el nivel de expresión de la cadena pesada, la secuencia Igκ conductora se reemplaza por la secuencia conductora de la línea germinal humana 4-59 VH (MKHLWFFLLLVAAPRWVLS) (SEQ ID NO: 109) utilizando el par de cebadores conductora 4-59 HindIII-NMC-4 (SEQ ID NO: 43) e IgG1-BamHI-R (SEQ ID NO: 38) con el vector pIRES2-EGFP-NMC-4-IgG (mut) que sirve como el modelo (Tabla 1). El fragmento se digiere con HindIII y PmeI y se subclona en
10 los sitios HindIII y PmeI del vector pcDNA6-cMyC-A (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Construcción de un Anticuerpo de Referencia AJW200. AJW200 es otro anticuerpo dirigido contra el dominio A1 de vWF, con capacidad para bloquear la interacción del dominio A1 de vWF con GPIbα. Se genera un anticuerpo AJW200 de referencia por modificación mediante ingeniería de la secuencias VH y VL descritas en la Patente U.S. No 6.228.360 para comprender, por ejemplo, una secuencia Kozak funcional adicional para expresión mejorada. Por 15 ejemplo, el gen VH sintético de AJW200 se amplifica utilizando los cebadores HindIII-Ko-AJW-F (SEQ ID NO: 49) y HuFab-H-R (SEQ ID NO: 50) (Tabla 2) y se clona en el sitio HindIII y ApaI del vector pcDNA6-cMyc-A digerido con HindIII-ApaI que comprende la región constante de la cadena pesada de IgG1 humana (dm) (reemplazando por tanto la VH de NMC-4). La VL de AJW200 se amplifica utilizando el par de cebadores XhoI-Ko-AJW-F (SEQ ID NO: 51) y Kappa-BamHI-R (SEQ ID NO: 48) y se subclona en los sitios XhoI y BamHI del vector pIRES-DsRed portador
20 de la quimera de cadena ligera NMC (reemplazando con ello la VL de la NMC-4).
Tabla 2. Cebadores Utilizados para Generar los Plásmidos de Expresión AJV200
Cebador Directo
Secuencia Cebador Inverso Secuencia
Hind III-Ko-AJW-F
HuFab-H-R
XhoI-Ko-AJW-F
Kappa-BamHI-R
Producción de anticuerpos: Pueden producirse anticuerpos quiméricos por cualesquiera métodos conocidos en la técnica. En un método ilustrativo, se cultivan células HEK293F en medio de expresión Freestyle 293 (Invitrogen) en 25 matraces de sacudidas a 120 rpm, 37ºC, 8% CO2. Las células se reducen a un sedimento a 100xg, se resuspendenen 30 ml de MEDIO DE EXPRESIÓN FREESTYLE 293, y se agitan vorticialmente durante 20 segundos para alcanzar una suspensión de células simples. Las células se someten a recuento y se siembra un matraz de sacudidas de 2 l con 3,3x108 células en un volumen total de 330 ml de MEDIO FREESTYLE 293. La mezcla de transfección se compone de partes iguales de DNA/OptiMEM (v.g., 165 μg de plásmido de expresión HC, 165 μg de 30 plásmido de expresión LC, y OptiMEM (Invitrogen) a la temperatura ambiente hasta un volumen total de 11 ml) y 293fectin/OptiMEM (v.g., 433 μl de 293fectin (Invitrogen) y OptiMEM (Invitrogen) a la temperatura ambiente hasta un volumen total de 11 ml). La mezcla de DNA se añade a la mezcla de 293fectin, se mezcla luego y se incuba durante 20 minutos a la temperatura ambiente, después de lo cual se añade al medio existente que contiene las células 293F. Las células se incuban a 37ºC, 8% CO2 con sacudidas a 120 rpm. Al cabo de 72 horas después de la
35 transfección, la suspensión se centrifuga durante 5 minutos a 100xg para reducción de las células a un sedimento y el sobrenadante que contiene Mab se filtra a través de un filtro de 0,2 μm y se purifica utilizando una columna de afinidad de Proteína-A.
Volúmenes pequeños de medio acondicionado (CM) de células HEK-293F transfectadas transitoriamente se aplican a una columna de goteo con 0,3 ml de Proteína A SEPHAROSE que se ha equilibrado con PBS. La columna se lava 40 con 10 ml de PBS y las proteínas se eluyen con glicina 0,1 M, pH 2,7. Se recogen fracciones de 1 mililitro en 0,1 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0, eluyéndose la mayor parte del anticuerpo en las dos primeras fracciones de eluato. Estas dos fracciones se agrupan y se concentran a un volumen final (v.g. 0,2-0,3 ml) utilizando, por ejemplo, un dispositivo centrífugo Vivaspin de 0,5 ml. Durante este paso de concentración, se realizan diluciones intermedias con PBS para intercambiar el tampón de Tris-glicina a PBS. El concentrado final se esteriliza por filtración a través, por ejemplo, de
45 un filtro de jeringuilla de 0,2 μm y la concentración de proteínas de la muestra que contiene el anticuerpo se determina utilizando un ensayo de proteínas Lowry (BioRad DC Protein Assay).
Para purificación en gran escala, se concentran 2 litros de medio acondicionado (CM) procedente de células adherentes transfectadas transitoriamente (v.g. HEK-293T) por ultrafiltración en un cartucho de fibra hueca (v.g., Amersham Biosciences 30.000 NMWC/290 cm2, columna de fibra hueca USP-30-C-3X2MA) hasta que el volumen
se reduce a ~ 200 ml. Este material concentrado o, para transfecciones más pequeñas, CM simple se bombea a una columna de 12 ml de Proteína A SEPHAROSE que se ha equilibrado con Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0. La columna se lava con Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, hasta que la lectura UV280 ha establecido una línea base. El anticuerpo se eluye con glicina 0,1 M, pH 2,7 y se recogen fracciones de 3 ml. El pH de las fracciones que contienen la proteína pico se
5 ajusta por adición de Tris-HCl de pH 8,0 a una concentración final de 0,1 M. Las fracciones pico se agrupan, se concentran a un volumen inferior a 7 ml por ultrafiltración (v.g., en un dispositivo de centrifugación Amicon Ultra de 15 ml), y se desalan luego en PBS utilizando dos operaciones separadas en una columna PD-10 (Amersham Biosciences/GE-Healthcare).
Las proteínas obtenidas de los sobrenadantes de cultivo se cuantifican y analizan por cualquier método conocido en
10 la técnica (v.g., el ensayo de proteínas Lowry (BioRad DC Protein Assay). En un método ilustrativo, se analizan sobrenadantes de cultivo por SDS-PAGE. Resumidamente, las proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa, se bloquean con 5% leche/PBS durante 1 hora a la temperatura ambiente, y se incuban con IgG antihumana de ratón conjugada con HRP (v.g., específica de cadena γ, 1:10.000) y kappa antihumana de ratón (v.g., específica de cadena kappa, 1:1000) (Southern Biotech, Cat #9042-05 y #9220-05, Birmingham, AL) y las señales
15 se detectan con un kit ECL.
Actividad inhibidora en vitro en el ensayo de aglutinación de las plaquetas inducida por ristocetina: En un método ilustrativo, se ensayan anticuerpos Fc humanos NMC-4 quiméricos respecto a actividad, incluyendo por ejemplo, la fijación específica para vWF. Por ejemplo, se realizan ensayos de aglutinación de plaquetas con un agregómetro estándar (Bio/Data, modelo PAP-4) utilizando plaquetas humanas liofilizadas (Bio/Data, Horsham, PA). 20 Resumidamente, se añaden 50 μl de ristocetina (v.g., concentración stock = 15 mg/ml) (Bio/Data) y 48,5 μl de TBS o anticuerpo de test a un tubo que contiene 1x108 plaquetas liofilizadas en un volumen de 400 μl. La lectura de la línea base se registra durante 10 segundos antes de añadir 1,5 μl de vWF purificado (v.g., concentración final de 1,5 μg/ml) al tubo para iniciar la aglutinación. El valor CE50 del anticuerpo de test se estima como la concentración que inhibe el 50% de la aglutinación plaquetaria. En una comparación con el anticuerpo monoclonal paterno, la quimera
25 demostró una potencia equivalente a la del anticuerpo NMC4 paterno de murino.
Adicionalmente, para determinar más exactamente los valores CE50, se ensayan anticuerpos quiméricos utilizando, por ejemplo, un método de lector de placas adaptado del método de microplacas. En un método ilustrativo, se añaden 4,5x107 plaquetas fijadas con paraformaldehído en 150 μl de TBS (pH 7,5) por pocillo utilizando una placa COSTAR 3603 de 96 pocillos y se añade vWF humano purificado (Calbiochem, San Diego, CA) a una concentración 30 final de 1,5 μg/ml por pocillo. Se añaden concentraciones seriadas de anticuerpos de test seguido por la adición de ristocetina a una concentración final de 1,5 μg/ml por pocillo para iniciar la aglutinación y se monitoriza la turbidez (v.g., absorbancia a 405 nm) utilizando un Lector de Placas SPECTRAMAX PLUS (Molecular Devices) ajustado a 37ºC durante 6 minutos con 20 segundos de agitación en situ entre los ciclos de lectura. Se añade el compuesto inhibidor (v.g., 20 μl/pocillo) o el MAb de referencia (v.g., AVW-3) y las mezclas se incuban y se monitorizan durante
35 2 minutos. Finalmente, se añade ristocetina o botrocetina (20 μl/pocillo) y las mezclas se incuban y se monitorizan durante 40 minutos. La señal de aglutinación se monitoriza como la magnitud de la disminución de absorbancia (v.g., -Δ absorbancia).
La quimera Fc NMC-4-humanoa se compara con el anticuerpo monoclonal NMC-4 original y con el anticuerpo AJW200 clonado. Como se muestra en la Figura 1, la quimera NMC-4 es similar en actividad al mAb NMC-4 original
40 y ligeramente más potente que AJW200 en el seno de aglutinación de las plaquetas inducido por ristomicina, con valores CE50 de 0,1, 0,17 y 0,27 nM, respectivamente.
Ejemplo 2: Construcción de Anticuerpos Humanizados
Selección de marcos aceptores humanos: Bases de datos (v.g., una base de datos de línea germinal humana, base V, o la base de datos Kabat) o publicaciones (v.g., Kabat et al., Secuencias of Proteins of Immunological 45 Interest, 1992) pueden utilizarse para identificar las subfamilias a las que pertenecen las regiones V de cadena pesada y ligera murinas, y determinar el marco de línea germinal humana más adecuado para utilización como molécula aceptora. La selección de las secuencias VH y VL que pueden utilizarse dentro de estas subfamilias como secuencias aceptoras puede basarse en homología de secuencia y/o en un apareamiento de la estructura canónica de las regiones CDR1 y CDR2 para ayudar a preservar la presentación relativa apropiada de las 6 CDRs después
50 de injerto.
Por ejemplo, el uso de la base V indica que la cadena ligera κ de NMC-4 es de la subfamilia kappa 1, dado que se identifica una buena homología entre el marco VL de NMC-4 y los miembros de la subfamilia κ 1 (VK1). La homología máxima y la preservación óptima de las estructuras canónicas de los bucles CDR se observa para la secuencia 018 de la línea germinal (SEQ ID NO: 5), que tienen una identidad de secuencia de 78% para la
55 secuencia entera hasta CDR3 y una identidad de secuencia de 84% para las regiones marco. La alineación de la cadena ligera de NMC-4 y la cadena ligera humana 018 (SEQ ID NO: 5) y AAK94808 (un anticuerpo maduro derivado de 018, utilizado para proporcionar una LCDR3 y secuencia marco 4 para comparación con NMC-4 en esta región) (SEQ ID NO: 6) se muestra en la Tabla 3, indicándose las diferencias entre la NMC y el anticuerpo humano como letras en negrita (con numeración basada en el esquema de numeración de Kabat (Kabat, 1978)).
Análogamente, el uso de la base V indica que la secuencia VH hasta el marco 3 cae dentro de la subfamilia IV de VH. Dentro de la subfamilia IV de VH humana, la VH de NMC-4 muestra la homología máxima de secuencia con la secuencia de la línea germinal 4-59 (SEQ ID NO: 3) que exhibe una identidad de secuencia de 56% con la VH murina para la VH entera hasta CDR3, y 67% de identidad para las regiones marco solas (Tabla 4). Sin quedar 5 ligados por una teoría de la descripción, se selecciona AAC18165.1 (SEQ ID NO: 4) para proporcionar una secuencia comparadora de HCDR3 y el marco 4 dado que comparte secuencias de aminoácidos idénticas en los marcos 1 a 3 y HCDR1 y HCDR2 con VH 4-59 de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 3). HCDR3 y las 4 regiones marco no se incluyen en las secuencias de la línea germinal VH en la base de datos V base, dado que las regiones HCDR3 son sumamente divergentes y FW4 es un dominio distinto derivado de un producto génico
10 separado (J). Las diferencias de aminoácidos entre la VH de NMC-4 y las secuencias AAC18156.1 (SEQ ID NO: 4) están resaltadas en negrita y sus posiciones por los asteriscos en la Tabla 4.
Tabla 3. Alineación de la VL de NMC-4 con el anticuerpo humano AAK94808 que tiene secuencias marco de aminoácidos y CDR1 y CDR2 idénticas a la VL de la línea germinal humana, 018.
15 Tabla 4. Alineación de la VL de NMC-4 con el anticuerpo humano, AAC18165.1, que tiene secuencias marco de aminoácidos y CDR1 y CDR2 idénticas a la línea germinal humana 4-59.
Dado que se supone que el injerto directo de CDRs de un anticuerpo de ratón a marcos de anticuerpo humano da como resultado pérdida de afinidad para la fijación de antígeno (Foote y Winter J. Mol. Biol. 224: 487-499 20 (1992); Xiang et al. J Mol Biol. 253:385-90 (1995); Homes et al, J. Immunol. 167:296-301 (2001)), puede ser deseable mutar de nuevo ciertos residuos en los marcos a los residuos de ratón en dichas posiciones, un proceso denominado retromutación. Por ejemplo, la Tabla 5 muestra los residuos que pueden afectar a las conformaciones de CDRs y que pueden ser candidatos potenciales para retromutación al residuo murino (v.g., las diferencias de aminoácidos entre la NMC-4 y los marcos humanos en estas posiciones se han resaltado en letras negritas
25 cursivas).
Tabla 5.Residuos marco que afectan a la confirmación de las CDRs; comparación de NMC-4 y las regiones variables de aceptores humanos
VL
VH
Posición Kabat
NMC-4 O18 FW Posición Kabat NMC-4 4-5 FW
2
I I 2 V V
4
M M 47-49 W, L, G W, I, G
35-36
W, Y W, Y 67 L V
46-49
L, L, I, F L, L, I, Y 69 I I
64
G G 71 K V
66
G G 73 N T
68-69
G, T G, T 78 V F
71
Y F 93-94 V, R A, R
98
F F 103 W W
Los residuos de aminoácidos que pueden estar implicados en el apareamiento de las cadenas pesada y ligera para
5 coordinar la presentación de CDRs han sido identificados (Holmes et al., J. Immunol. 167: 296-301 (2001)) y pueden ser candidatos para retromutación. Sin quedar ligados por una teoría de la descripción, dentro de la región VL, se consideran importantes los residuos 44, 96 y 98, con contribuciones adicionales de los residuos 34, 36, 38, 46, 87, 89 y 91. De estos residuos, el único que difiere acusadamente entre NMC-4 y el aceptor 018 para la región VL es el residuo 44, que es una valina en NMC-4 VL y una prolina en el marco humano 018. Sin quedar ligados por una
10 teoría de la descripción, para la VH, son importantes los residuos 45 y 103, contribuyendo también los residuos 35, 37, 39, 47, 91, 93 y 95 al empaquetamiento de la interfaz de la VH con la VL. Las únicas diferencias en estos residuos de interfaz para NMC-4 VH y los marcos aceptores 4-59 se encuentran en el residuo 93, en el que existe una diferencia conservadora de una valina en NMC-4 comparada con alanina en 4-59 (Tabla 5).
La comparación de las secuencias marco de la secuencia murina y la secuencia VH 4-59 de la línea germinal
15 humana revela que muchas de las diferencias en los residuos que se suponen importantes para la presentación de CDR y el empaquetamiento de interfaz están agrupadas en el marco 3 (residuos 67, 71, 73, 78, 93), con diferencias adicionales en los residuos 37 y 48 en el marco 2. Estos residuos son candidatos supuestos para retromutación en la secuencia humanizada prototipo. Sin embargo, las diferencias para los dos residuos marco 2 (37V frente a 371 y 48L frente a 481) son conservadoras; por tanto la primera secuencia VH prototipo puede enfocarse en las
20 diferencias en la región marco 3 y llevar las retromutaciones siguientes de humano a ratón: V67L, V71K, T73N, F78V y A93V (Tabla 6). El gen sintético es sintetizado habitualmente por Retrogen (San Diego, CA) y designado H2, y está clonado en los sitios Nhe1 y Xho1 del vector bacteriano pRSFDuet (Novagen, Madison, WI) y utilizado como modelo para amplificar la inserción utilizando los cebadores 4-59-huNMC-F (SEQ ID NO: 54) y hu-VH-R (SEQ ID NO: 55) (Tablas 7 y 9). El fragmento resultante se digiere con Apa1. El plásmido pcDNA6-NMC-HC, que contiene la
25 cadena pesada quimérica de NMC-4 generada en el Ejemplo 1, se digiere con HindIII y Apa1 y el fragmento de DNA que contiene el fragmento pcDNA-IgG1dm se termina en extremos romos con fragmento Klenow en presencia de NTPs. El producto PCR que contiene el VH se ligera al fragmento de extremos romos pcDNA-IgG1dm. El DNA plasmídico se utiliza luego para transformar la cepa hospedadora E. coli, JM109. Los clones individuales se secuencian utilizando un secuenciador de DNA Beckman CEQ 8000 para identificar un clon que expresa la inserción
30 en la orientación correcta y con la secuencia correcta (clon pcDNA-huVH-IgG1dm). Este vector se utiliza como modelo para las variantes H4, H5, H6, H7 y H8 que están diseñadas para evaluar el efecto de invertir individualmente cada residuo al residuo humano (resumido en la Tabla 6). Estas variantes se construyen utilizando los pares de cebadores indicados en la Tabla 7 (las secuencias correspondientes se muestran en la Tabla 9).
Tabla 6.Mutaciones de residuos marco incorporadas en las secuencias aceptoras de la línea germinal 4-59 y 018 para las diferentes variantes de VL y VH.
VH
Retromutaciones (Humana a Murina) VL Retromutaciones (Humana a Murina) (Humana a humana común)
H2
V67L, V71K, T73N, F78V, A93V L5 P44V, Y49F, F71Y F73L, G100Q
H4
V67L, V71K, T73N, F78V L4 Y49F, F71Y F73L, G100Q
H5
V71K, T73N, F78V, A93V L6 P44V, F71Y F73L, G100Q
H6
V67L, T73N, F78V, A93V L7 P44V, Y49F F73L, G100Q
H7
V67L, V71K, F78V, A93V L8 Sin retromutaciones F73L, G100Q
H8
V67L, V71K, T73N, A93V L9 Sin retromutaciones F73L, I83F, G100Q
H9
Sin retromutaciones
Tabla 7. Sumario de modelos y cebadores utilizados para construir las variantes humanizadas de cadena pesada.
Variantes de VH
Modelo Cebadores PCR del Fragmento 1 Cebadores PCR del Fragmento 2 Cebadores PCR de VH Finales Vector Sitios de clonación
H2
DNA Sintetizado de Retrogen 4-59-huNMC-F y hu-VH-R pcDNA6IgG1(dm) HindIII Apal
H4
H2 en pcDNA6IgG1(dm) pcDNA6-F y VHV93A-Rev VH-V93A-For y hFc-L235E-R pcDNA6-F y hFcL235E-R pcDNA6IgG1(dm) Hindlll Apal
H5
H2 en pcDNA6IgG1(dm) pcDNA6-F y HCL67V-R HC-L67V-F y hFcL235E-R pcDNA6-F y hFcL235E-R pcDNA6IgG1(dm) HindIII Apal
H6
H2 en pcDNA6IgG1(dm) pcDNA6-F y HCK71V-R HC-K71V-F y hFcL235E-R pcDNA6-F y hFcL235E-R pcDNA6IgG1(dm) HindIII ApaI
H7
H2 en pcDNA6IgG1(dm) pcDNA6-F y HCN73T-R HC-N73T-F y hFcL235E-R pcDNA6-F y hFcL235E-R pcDNA6IgG1(dm) Hindlll ApaI
H8
H2 en pcDNA6IgG1(dm) pcDNA6-F y HCV78F-R HC-V78F-F y hFcL235E-R pcDNA6-F y hFcL235E-R pcDNA6IgG1(dm) HindIII ApaI
H9
DNA Sintetizado de Retrogen 4-59-huNMC-F y hu-VH-R pcDNA6IgG1(dm) HindIII Apal
Se supuso que la comparación de residuos afectaba la estructura canónica, y el empaquetamiento de la interfaz indica que existen tres diferencias entre la NMC-4 VL y el marco aceptor VL humano 018 (v.g., residuos 44, 49 y 71). Por tanto, puede diseñarse una variante humanizada prototipo, L5, que lleva 3 retromutaciones en el residuo murino (v.g., P44V, Y49F y F71Y) (Tabla 6). Adicionalmente, esta variante está diseñada de modo que tiene el residuo 73 10 cambiado de fenilalanina a leucina, dado que la leucina es un residuo más común en esta posición en el repertorio de anticuerpos humanos. Para generar esta variante, una variante designada VL4, que lleva cambios de marco (v.g., Y49F, F71Y y F73V), se sintetiza habitualmente (Retrogen) y se clona en el vector pETDuet utilizando los pares de cebadores indicados en la Tabla 8. El vector L4-pETDuet resultante se utiliza como modelo para introducir la mutación p44V de L5 utilizando los pares de cebadores enumerados en la Tabla 8. La variante L5 se somete luego a
15 subclonación en los sitios EcoR1 y BamH1 del vector pIRES DsRed2 en lugar del NMC-4 VL murino. El vector L5pIRES DsRed se utiliza luego como modelo para generar los vectores L6 y L7 utilizando los cebadores indicados en la Tabla 8.
Tabla 8. Sumario de modelos y cebadores utilizados para construir las variantes de cadena ligera humanizadas
Variantes de VL
Modelo Cebadores PCR del Fragmento 1 Cebadores PCR del Fragmento 2 Cebadores PCR de VL Finales Vector Sitios de clonación
L4
DNA Sintetizado de Retrogen NMC4-VL-EcoRI-F y Kappa-BamHI-R pIRESDsRed2-Igk EcoRI BamHI
L5
L4 en pETDuet1 Fab-L-For y LCP44V-R LC-P44V-F y FabL-Rev Fab-L-For y Fab-L-Rev pETDuet-1 Ndel Xhol
L5
L5 en pETDuet1 NMC4-VL-EcoRI-F y Kappa-BamHI-R pIRESDsRed2-Igk EcoRI BamHI
L6
L5 en pIRESDsRed2-Igk NMC4-VL-EcoRI-F y LC-F49Y-R LC-F49Y-F y Kappa-BamHI-R NMC4-VL-EcoRI-F y Kappa-BamHI-R pIRESDsRed2-Igk EcoRI BamHI
L7
L5 en pIRESDsRed2-Igk NMC4-VL-EcoRI-F y LC-Y71F-R LC-Y71F-F y Kappa-BamHI-R NMC4-VL-EcoRI-F y Kappa-BamHI-R pIRESDsRed2-Igk EcoRI BamHI
L8
L7 en pIRESDsRed2-Igk 5'IRES y HuLCV44P-F49Y-R HuLC-V44PF49Y-F y 3'IRES 5'IRES y 3'IRES pIRESDsRed2-Igk EcoRI BamHI
L9
DNA Sintetizado de Retrogen NMC4-VL-EcoRI-F y Kappa-BamHI-R pIRESDsRed2-Igk EcoRI BamHI
Tabla 9. Secuencias de los cebadores utilizados para construir las diversas regiones variables.
Cebador Directo
Secuencia Cebador Inverso Secuencia
4-59-huNMC-F
Hu-VH-R
pcDNA6-F
hFc-L235E-R
VH-93A-For
VH-V93A-Rev
HC-L67V-F
HC-L67V-R
HC-N73T-F
HC-N73T-R
HC-V78F-F
HC-V78F-R
HC-K71V-F
HC-K71V-R
hu-VH-K71V-F (H9)
hu-VH-K71V-R (H9)
Fab-L-For
Fab-L-Rev
NMC4-VL-EcoRI-F
Fab-L-Rev
5'-IRES
5'-AGCTGGTTTAGTGA -3' (SEQ ID NO: 72) 3'-IRES 5'-CAAGCGGCTTCGGCCAG -3' (SEQ ID NO: 73)
LC-Y49F-F
LC-Y49F-R
LC-F83I-F
LC-F83I-R
LC-P44V-F
LC-P44V-R
LC-F49Y-F
LC-F49Y-R
LC-Y71F-F
LC-Y71F-R
HuLC-V44P, F49Y-F
HuLC-V44P, F49Y-R
En paralelo con la clonación de estos primeros conjuntos de variantes, un modelo tridimensional generado por computadora de la secuencia de la línea germinal aceptora 4-59 se genera utilizando la estructura 1DN0.pdb (v.g., con resolución de 2,3 Ǻ (Angstrom)) identificada en una búsqueda BLAST por tener la identidad de secuencia 5 máxima (88%) para la secuencia entera hasta HCDR3 y una identidad de secuencia de 89% para las regiones marco. La estructura 1AOK.pdb se selecciona como el modelo para la secuencia humanizada VH con una identidad de secuencia de 81%. Están disponibles dos estructuras cristalográficas de la NMC-4 Fv murina: 1OAK.pd (v.g., con resolución de 2,2 Ǻ) que tiene un antígeno fijado (Cellikel et al., Nat. Struct. Biol. 5: 189-194 (1988)) y se selecciona también como el ajuste óptimo en el dominio VH para la variante humanizada prototipo, y 1FNS.pdb (resolución de
10 2,0 Ǻ), que tiene un antígeno mutante unido. Tanto 1OAK.pdb como 1 FNS.pdb tienen ángulos de interfaz VH/VL virtualmente idénticos, por lo que se utiliza 1OAK.pdb para superposición de los modelos del aceptor humano y las secuencias VH y VL humanizadas.
Cuando las estructuras de cadena principal de NMC-4 VH y 4-59 se superponen, pueden observarse 3 áreas de diferencia. En primer lugar, existen diferencias entre los residuos H27 y H33, que incluyen parte de la HCDR1. Sin 15 quedar ligados por una teoría de la descripción, estos residuos ponen en contacto HCDR2 y HCDR3, los cuales forman parte juntos del sitio de fijación de antígeno. El residuo 34, Val en la NMC-4 VH murina y Trp en la secuencia 4-59, se predice que es potencialmente responsable de la conformación alterada del bucle H27-33 y por tanto un candidato para retromutación. En segundo lugar, existen diferencias entre los residuos H52 y H55, que forman parte del bucle CDR2. El residuo marco 71 (Lys en el ratón, Val en 4-59) se considera que juega posiblemente un papel 20 en esta diferencia y por tanto es candidato para retromutación. Tres residuos adicionales se identifican en la
estructura 4-59 por tener el potencial para impedir la fijación de antígeno. H37, que es un cambio conservador de Ile comparado con Val en el ratón; H73 (que representaba un cambio moderado Thr en
4-59 comparado con Asp en el ratón) y H78, que representaba un cambio grande (Phe en 4-59 comparado con Val en el ratón). En tercer lugar, existen diferencias en CDR3, donde se espera diversidad.
5 Para modelización de la línea germinal 018 y los dominios VL humanizados prototipo, la estructura 1IGM.pdb (v.g., resolución de 2,3 Ǻ) tiene una identidad de secuencia excelente (v.g., 95%) con 018, con 4 diferencias en los residuos L34, L45, L47 y L92. La estructura 01BJ1.p (v.g., resolución de 2,4 Ǻ) se selecciona como el modelo para el prototipo humanizado VL, dado que la misma coincide en los residuos 97/107 (v.g., identidad de secuencia de 91%).
El ajuste satisfactorio de las cadenas principales VL de las estructuras NMC-4 y 018 VL es coherente con la
10 identidad de secuencia. La única diferencia estructural significativa se encuentra en el bucle comprendido por los residuos L39-L45, que ponen en contacto la VH y podrían influir por tanto en el empaquetamiento y a su vez en la forma de la bolsa de fijación. Sin quedar ligados por una teoría de la descripción, el residuo 44 (v.g. Val en el ratón, Pro en 4-59) es probablemente responsable de esta diferencia y es por tanto un candidato probable para retromutación basado en modelización por computadora.
15 Actividad inhibidora en vitro en el ensayo de aglutinación de las plaquetas inducida por ristocetina: Para ensayar si las predicciones de modelización por computadora podrían predecir exactamente los efectos sobre la actividad, la variante prototipo VH2 se aparea con una variante VL, (v.g., L4, 5, 6 y 7) y el prototipo L5 se combina con una variante VH (v.g., H2, H4, H5, H6, H7 y H8). Las variantes de anticuerpos se producen por transfección transitoria de células HEK293T y se purifican a partir del sobrenadante de cultivo filtrado como se describe para el
20 anticuerpo quimérico NMC-4 en el Ejemplo 1.
Se realizan los ensayos de aglutinación de plaquetas inducida por ristocetina utilizando plaquetas liofilizadas como se describe en el Ejemplo 1. El cambio en absorbancia (v.g. turbidez) se mide para diluciones seriadas del anticuerpo por duplicado utilizando un lector de placas Spectromax (Molecular Devices) y los datos se analizan utilizando software Prism a fin de detectar los valores CE50 para las diversas variantes de anticuerpos purificadas
25 (véase, v.g., Tabla 9).
La primera versión del anticuerpo humanizado, constituido por H2 y L5, exhibía una actividad equivalente (v.g., CE50 de 0,13) a la quimera paterno ((v.g., CE50 de 0,18 nM) (Tabla 10). Las variantes de cadena pesada con retromutaciones puntuales sucesivas a los residuos marco humanos se ensayaron luego (v.g., variantes H2 hasta H6). Las variantes exhibían actividad muy similar, excepto para la variante L5-H8, que exhibía una CE50 1,5 veces 30 menor (Tabla 9). Es interesante que el rendimiento de esta variante era bajo (v.g., 1/10 de otras variantes), lo que sugiere que la interacción entre la cadenas pesada y ligera humanizadas podría haberse visto afectada desfavorablemente por esta combinación de mutaciones, dado que la estabilidad del anticuerpo depende del ensamblaje correcto de las cadenas pesada y ligera. Análogamente, se generaron y se ensayaron los anticuerpos de la variante L5, y análogamente, ninguno de los cambios de retroceso a los humanos parecía afectar a la 35 actividad, lo que sugería que, sorprendentemente, no era necesario cambio de marco alguno. Estos resultados indicaban que ninguna de las diferencias entre los marcos aceptores y los marcos de la región variable NMC-4 que se preveía serían problemáticas, tenía efecto alguno sobre la potencia, incluyendo las diferencias más acusadas que se creía eran subyacentes a las diferencias estructurales observadas por modificación en computadora, incluyendo las diferencias señalizadas como inductoras de las diferencias de conformación máximas (v.g., V71K y T73N de la 40 VH y P44V de la VL). Dados estos resultados, se construyó una variante de cadena pesada que era portadora de un marco completamente humano (v.g., H9), que representaba una VH simple injertada en CDR. Esta variante se testó luego en combinación con las variantes de cadena ligera así como una variante adicional, L9, que representaba injerto simple de CDR en un marco completamente humano. Sorprendentemente, el anticuerpo injertado directamente en la CDR retenía actividad plena (CE50 de 0,08 nM; Tabla 10). Estos datos demostraban que,
45 inesperadamente, el injerto directo de las CDRs del anticuerpo murino en los marcos humanos seleccionados conservaba la actividad plena del anticuerpo murino original aun cuando los datos cristalográficos publicados indican que CDRs múltiples contribuyen a la fijación de antígeno (Celikel et al., Blood Cells Vol Dis. 23: 123; Celikel et al., Nat. Struct Biol 5:189) y por tanto podía anticiparse que cualquier perturbación en la presentación relativa de las 6 CDRs afectaría a la afinidad.
Tabla 10: Comparación de los valores CE50 para la quimera NMC-4 paterno comparada con las variantes humanizadas en el ensayo de aglutinación de las plaquetas mediado por vWF inducida por ristocetina
Anticuerpo (Conjunto 1º)
CE50 (nM) Anticuerpo (Conjunto 2º) CE50 (nM)
NMC4 quimera
0,18±0,03 (n=9) H9, L4 0,11
L5, H2
0,13 (n=2) H9, L5 0,14
L5, H4
0,15 H9, L6 0,13
L5, H5
0,18 H9, L7 0,11
L5, H6
0,18 H9, L8 0,08
L5, H7
0,16 H9, L9 0,12 (n=2)
L5, H8
0,28
L4, H2
0,14
L6, H2
0,14
L7, H2
0,15
Humanización de las regiones CDR: La modelización molecular sugería que cambios adicionales, diseñados para
5 humanizar CDR1 de la cadena ligera y pesada pueden ser tolerados en LCDR1 de NMC-4 (v.g., residuos 24, 30 y 31) y HCDR1 de NMC-4 (v.g. residuos 27, 29, 30 y 34). Adicionalmente, se considera también que dos residuos en la secuencia HCDR2 (v.g., 61 y 62), representan cambios que pueden ser tolerados (v.g., Ser a Pro para el residuo 61 y Ala a Ser para el residuo 62). Por ello, se han construido una serie de variantes denominadas "superhumanizadas" (Tan et al., 2002 J. Immunol. 169: 1119-1125) a partir de los modelos y pares de cebadores
10 indicados en la Tabla 12 (v.g., L10, que representa la variante con una LCDR1 enteramente humana; H12 y H13 que representan regiones HCDR1 parcialmente humanizadas (Tabla 11).

Tabla 11. Mutaciones que cambian los residuos CDR murinos a sus contrapartidas 4-59
VH
Super-humanizadas (murino a humano) VL Super-humanizadas (murino a humano)
H12
F27G, L29I, T30S L10 S24Q, N30S, K31N
H13
F27G, L29I, T30S, V34W L11 S24Q, N30S, K31N, Y50D, T51A, S53N, H55E, S56T
H14
F27G, L29I, T30S, V34W, S61P, A62S
H15
F27G, L29I, T30S, D3 1 S, G33Y V34W, G35S, S61P, A62S,
H16
F27G, L29I, T30S, V34W, M50Y, W52Y, G53Y, D54S, D58N S61P, A62S
En un método ilustrativo, las predicciones de modelización por computadora se testan por realización de uno o más
15 ensayos para determinar la actividad del anticuerpo humanizado. Por ejemplo, la variante L11 se somete a cotransfección con H9, y el anticuerpo se testa en el ensayo de aglutinación de las plaquetas inducida por ristocetina. Como se muestra en la Tabla 14, la introducción de las tres mutaciones para convertir la LCDR1 enteramente en la de 018 está tolerada y no causaba pérdida significativa alguna de potencia. Cuando las variantes H12, 13 y 14 se combinan con L9, el anticuerpo variante H12-L9 exhibía una pérdida ligera de potencia, pero la mutación V34W
20 adicional restablecía la potencia total y la adición de las mutaciones S61P y A62S tenía poco efecto sobre la potencia, lo que indicaba que estos residuos podrían convertirse en la secuencia 4-59 sin impactar en la actividad. A continuación, se evalúa la importancia de LCDR2 en el mantenimiento de la actividad de bloqueo de vWF por construcción de una variante de la cadena L10 donde la LCDR2 entera (YTSSLHS) (SEQ ID NO: 11) está reemplazada con la LCDR2 018 de la línea germinal humana (DASNLT) (SEQ ID NO: 118) utilizando el plásmido
25 codificante de la variante L10 de VL como modelo y los pares de cebadores indicados en las Tablas 11 y 12. Esta variante recién construida (L11) se aparea luego con H14 para producir la variante de anticuerpo L11-H14. Si bien exhibe todavía potencia nanomolar, esta variante demostraba una actividad 10 veces menor comparada con la
quimera en el ensayo de aglutinación plaquetaria (CE50 1,63 mB), lo que sugería que LCDR2 puede ser necesaria para actividad óptima del anticuerpo humanizado.

Tabla 12. Sumario del modo en que se construyeron las variantes "super-humanizadas"
Variantes
Modelo Cebadores PCR del Fragmento 1 Cebadores PCR del Fragmento 2 Cebadores PCR de VH Finales Vector Sitios de clonación
H12
H9 en pcDNA6IgG1(dm) pcDNA6-F y huH12-R huH12-F y hFcL235E-R pcDNA6-F y hFcL235E-R pcDNA6IgG1(dm) HindIII Apal
H13
H9 en pcDNA6IgG1(dm) pcDNA6-F y huH13-R huH13-F y hFcL235E-R pcDNA6-F y hFcL235E-R pcDNA6IgG1(dm) HindIII ApaI
H14
H13 en pcDNA6IgG1(dm) pcDNA6-F y huH14-R huH14-F y hFcL235E-R pcDNA6-F y hFcL235E-R pcDNA6IgG1(dm) HindIII-Apal
H15
H14 en pcDNA6IgG1(dm) pcDNA6-F y huH15-R huH15-F And hFcL235E-R pcDNA6-F y hFcL235E-R pcDNA6IgG1(dm) HindIII Apal
H16
H15 en pcDNA6IgG1(dm) pcDNA6-F y huH16-R huH16-F And hFcL235E-R pcDNA6-F y hFcL235E-R pcDNA6IgG1(dm) HindIII ApaI
L9
L1 en pETDuet1 NMC4-VL-EcoRI-F y LC-Y71F-R LC-Y71F-F y Kappa-BamHI-R NMC4-VL-EcoRI-F y Kappa-BamHI-R pIRESDsRed2-Igκ EcoRI BamHI
L10
L9 en pIRESDsRed2-Igk 5'IRES y huL10-R huL10-F y 3'IRES 5'IRES y 3'IRES pIRESDsRed2-Igκ EcoRI BamHI
L11
L10 en pIRESDsRed2-Igk) 5'-IRES y huL11-R huL11-F y 3'IRES 5'-IRES y 3'IRES pIRESDsRed2-Igκ EcoRI BamHI
Tabla 13. Cebadores utilizados para construir las variantes CDR humanizadas
Cebador Directo
Secuencia Cebador Inverso Secuencia
5'-IRES
5'-AGCTGGTTTAGTGA -3' (SEQ ID NO: 72) 3'-IRES 5'-CAAGCGGCTTCGGCCAG -3' (SEQ ID NO: 73)
huL10-F
huL10-R
huL11-F
huL11-R
pcDNA6-F
hFc-L235E-R
huH12-F
huH12-R
huH13-F
huH13-R
huH14-F
huH14-R
huH15-F
huH15-R
huH16-F
huH16-R
A continuación se examina la importancia de los residuos murinos restantes (v.g., H31, H33, y H35) en la HCDR1 humanizada en la variante H14, cambiando estos residuos por sus contrapartidas humanas en la secuencia VH de la línea germinal 4-59 (v.g., un cambio D31S, G33Y y D35S). El constructo resultante, H15, tiene una secuencia de 5 GGSISSYYVS (SEQ ID NO: 110) para HCDR1 comparada con la secuencia parcialmente humanizada de GGSISDYGWD (SEQ ID NO: 111) en H14. Finalmente, la HCDR2 entera de H15 se convierte en su contrapartida humana en VH4-59 (desde MIWGDGSTDYNSALKS (SEQ ID NO: 8) a YIYYSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 119), un total de 7 diferencias de residuos) para crear otra variante, H16, que tiene una HCDR1 y HCDR2 completamente humanas. Las variantes H15 y H16 se aparean individualmente con la variante de cadena ligera L10 para producir
10 las variantes de anticuerpos H15-L10 y H16-L10, respectivamente.
Estas variantes se valúan en un ensayo de aglutinación plaquetaria para determinar sus actividades. Los datos presentados en la Tabla 14 sugieren que el reemplazamiento de la HCDR1 entera con secuencia humana anula la actividad anti-vWF. Esto sugiere que los tres residuos remanentes en la HCDR1 (v.g., D en la posición H31, G en la posición H33 y D en H35) son importantes para la retención de actividad, aun cuando estos residuos pueden no
15 estar en contacto directamente con el antígeno, como es sugerido por la estructura cristalina consignada por Celikel, et al (Nat. Struct. Biol. 5:189). El reemplazamiento de HCDR2 enteramente con la HCDR2 humana 4-59 no restablecía la actividad perdida de H15, coherentemente con las indicaciones de los estudios cristalográficos de Celikel et al., que sugieren que tres de los residuos en HCDR2 (v.g., H53, H54, y H58) interaccionan directamente con el antígeno de vWF.
20 Tabla 14: Valores CE50 de las variantes "super-humanizadas"
Anticuerpo
CE50 (nM)
Quimera NMC-4
0,18±0,03 (n=9)
H9, L9 (Injertado en CDR)
0,12 (n=2)
H12, L9
0,29
H13, L9
0,16 (n=2)
H14, L9
0,13 (n=2)
H13, L10
0,20
H14, L10
0,22±0,05 (n=5)
H14, L11
1,63
H15, L10
ND
H16, L10
ND
Ejemplo 3: Reformateado de Isotipos de anticuerpos
En un método ilustrativo, puede ser deseable reformatear variantes de VH a partir del formato mutado IgG1 a un formato IgG4, dado que IgG1 es un isotipo activo con respecto a la activación del complemento y suscitación de 25 respuestas efectoras, en tanto que IgG4 es relativamente inactivo. Por ejemplo, variantes de VH candidato se convierten del formato IgG1 mutado a un formato IgG4 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 144) para generar candidatos para desarrollo. Adicionalmente, los marcos de lectura abiertos de cadenas ligera y pesada se rediseñan para incorporar sitios de escisión por endonucleasas de restricción en los extremos 5' (v.g., sitios XhoI y HindIII) y 3'
(v.g., sitios BamHI y NotI), a fin de facilitar la subclonación en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pSTO518 para desarrollo de líneas de células aguas abajo y producción de anticuerpos en gran escala (Tabla 15).
Por ejemplo, dos de las variantes VH humanizadas, H9 y H14 se convierten a un formato IgG4 por reemplazamiento de la región constante de IgG1 con una región constante de IgG4 e introducción de sitios XhoI y BamHI en el 5 extremo 5' y sitios HindIII y NotI en el extremo 3' de la casete de expresión de la cadena pesada. Tanto IgG1 como IgG4 contienen un sitio ApaI existente naturalmente cerca de la unión de las regiones variable y constante. Este sitio se utiliza para clonación en la IgG4 en lugar de la IgG1. Los sitios de restricción BamHI y NotI se sitúan en el extremo 3' de la secuencia a fin de facilitar la subclonación posterior en el vector pSTO518. La secuencia de región constante de IgG4 delecionada de intrones desde el sitio ApaI al codón de terminación, con los sitios BamHI y NotI
10 añadidos, es sintetizada habitualmente por Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA). Adicionalmente, la secuencia señal en el vector pSTO518 se cambia a una secuencia conductora Igκ por realización de una PCR solapante con cebadores que están diseñados para incorporar sitios XhoI y HindIII en el extremo 5' de las regiones variables de cadena pesada y para insertar la secuencia señal Igκ.
Las secuencias de la cadena pesada H9 y H14 son idénticas en las regiones cebadoras, por lo que se utilizan para
15 ambas los mismos cebadores y estrategia de clonación. Se obtienen dos productos PCR separados, cada uno de los cuales incorpora uno de los cambios requeridos en la región variable de la cadena pesada huNMC4-H9 (y huNMC-4-H14). Una reacción PCR que incorpora los sitios de restricción XhoI y HindIII en el cebador directo y amplifica el péptido de señal Igκ se realiza utilizando pIRESdsRED-HUL10 como el modelo y los cebadores IgKLF (SEQ ID NO: 100) e IgKHnmcR (SEQ ID NO: 101) (véase, Tabla 15a y Tabla 15b). Esto va seguido por un segundo
20 paso de reacción que utiliza pCDNA6-H9 (o pCDNA6-H14) como el modelo y los cebadores 14 VHF (SEQ ID NO: 102) y 14 VHR (SEQ ID NO: 103) y se solapa con la primera reacción PCR en 30 nucleótidos. El producto PCR contiene la región variable H9 (o H14) así como los 5 primeros aminoácidos de la región constante de IgG1 hasta el sitio ApaI. Los 5 primeros aminoácidos de la región constante no difieren entre IgG1 e IgG4. La reacción añade también un sitio NotI después del sitio ApaI a fin de facilitar la clonación de la región variable antes de la inserción de
25 la región constante IgG4. El conductor kappa es añadido aguas arriba por el tercer paso PCR que utiliza los productos de reacción de los dos primeros pasos como modelo, siendo el cebador directo de la primera reacción (IgKLF) y el cebador inverso de la segunda reacción (14VHR). El producto de esta reacción se digiere con XhoI/NotI y se inserta en la cadena principal del plásmido digerido análogamente pCIneo. Esta ligación produjo el compuesto intermedio de clonación pCI-NMC4-VH9var o (pCI-NMC4-VH14var), que contiene el conductor de Igκ y la región
30 variable de NMC4-H9 (o H14). El plásmido de Blue Heron Biotechnology, que contiene la región constante de IgG4 sintetizada de novo, se digiere con ApaI y NotI, el fragmento de región constante de IgG4 de 1 kb se purifica en gel y se ligera al pCI-NMC4-VH9var o (pCI-NMC4-VH14var) digerido con ApaI/NotI. Esto produjo los plásmidos pCINMC4-VH9 y pCI-NMC4-VH14. Después de transformación en células DH5α, las inserciones plasmídicas de los clones individuales se secuencian a fin de verificar que las mismas son correctas.
35 Tabla 15a. Cebadores utilizados en las reacciones PCR de la cadena pesada
Nombre
Secuencia
IgKLF
5'CCTATCTCGAGAAGCTTCCACCATGGAGACAGACACACTCCT (SEQ ID NO: 100)
IgKHnmcR
5'ACCCGGACCGGATTCCTGCAGCTGCACCTGTCCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGC (SEQ ID NO: 101)
14VHF
5'CAGGTGCAGCTGCAGGAATCCGGTCCG (SEQ ID NO: 102)
14VHR
5'CCTATGCGGCCGCGGGCCCTTGGTGGAAGCGGAGGAAACGGT (SEQ ID NO: 103)
Tabla 15b. Reacciones PCR utilizadas para la construcción de la cadena pesada
PCR
Cebador Directo Cebador Inverso Modelo Producto
1ª
IgKLF IgKHnmcR pIRESdsRed-huL10 XhoI, HindIII, péptido señal IgK
2ª
14VHF 14VHR pCDNA6-huH9, (o pCDNA6huH14) región variable hu-H9 , ApaI, NotI (o región variable hu-H14, ApaI, NotI)
3ª
IgKLF 14VHR Productos de las dos reacciones PCR anteriores región variable Hu-VH9 (o VH14)
Los cambios en las cadenas ligera L9 y L10 se realizan por PCR. Dado que las cadenas ligeras L9 y L10 son idénticas en las regiones cebadoras, se utilizaron para ambas los mismos cebadores y la misma estrategia. Se producen dos modelos PCR separados para cada cadena ligera. El primer paso PCR incorpora sitios de restricción XhoI y HindIII en el extremo 5'. El segundo paso PCR se solapa por los 30 primeros nucleótidos e incorpora sitios 5 BamHI y NotI en el extremo 3' del fragmento. Estos dos productos PCR solapantes separados se utilizan como modelos en la tercera reacción PCR para obtener un producto PCR solapante final que incorpora estos cambios por amplificación de los mismos utilizando el cebador directo del primer paso PCR y el cebador inverso del segundo paso. El producto de la tercera reacción PCR se digiere con XhoI/NotI y se inserta en el plásmido pCI-neo análogamente (Invitrogen), produciendo los plásmidos pCI-NMC4-VL9 y pCI-NMC4-VL10 (véanse la Tabla 16a y la
10 Tabla 16b para cebadores ilustrativos y la estrategia utilizada para construcción de la cadena ligera).
Tabla 16a. Cebadores utilizados en las reacciones PCR de la cadena ligera
Nombre
Secuencia
IgKLF
5'CCTATCTCGAGAAGCTTCCACCATGGAGACAGACACACTCCT (SEQ ID NO: 100)
IgKLNMCR
5'GCTGCTGGGGCTCTGGGTCATCTGGATGTCTCCAGTGGAACCTGGAACCCAGAGC (SEQ ID NO: 104)
10VLF
5'GACATCCAGATGACCCAGAGCC (SEQ ID NO: 105)
hKcR
5'CCTATGCGGCCGCGGATCCTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCT (SEQ ID NO: 106)
Tabla 16b. Reacciones PCR para la construcción de la cadena ligera
PCR
Cebador Directo Cebador Inverso Modelo Producto
1ª
1 2 pIRESdsRED-huL10 XhoI, HindIII, péptido señal
2ª
3 4 pIRESdsRED-huL9 pIRESdsRED-huL10 o región variable huL9 o huL10 y región constante hIgκ , BamH1, Notl
3ª
1 4 Productos de la 1ª y 2ª PCR Casetes de secuencia NMC4-VL9 o NMC4-VL10 IgG4
15 Los isotipos IgG4 de H9-L9 y H14-L10 se generan a partir de células HEK293T como se ha descrito arriba en el Ejemplo 1 y se purifican por cromatografía de afinidad de Proteína A. Los anticuerpos purificados se testan luego en el ensayo se aglutinación plaquetaria mediada por vWF a fin de determinar su potencia relativa. Como se muestra en la Tabla 17, la conversión en el isotipo IgG4 no tenía efecto alguno sobre la potencia.
Tabla 17. Comparación de la actividad de aglutinación plaquetaria inducida por ristocetina de las variantes 20 conductoras anti-vWF IgG1 e IgG4
Variante de anticuerpo
Isotipo Valor medio de aglutinación de las plaquetas CE50 (de 2 experimentos independientes)
Quimera NMC-4
Quimera IgG1 1,25 nM (1,3nM, 1,2nM)
H9-L9
IgG1 1,30 nM (1,3nM, 1,3nM)
H9-L9
IgG4 1,40 nM (1,3nM, 1,5nM)
H14-L10
IgG1 1,20 nM (1,1nM, 1,3nM)
H14-L10
IgG4 2,15 nM (2,3nM, 2,0nM)
Ejemplo 4: Fijación de Anticuerpos a vWF o al Dominio A1
Clonación del antígeno del dominio A1 marcado con His: Sin quedar ligados por una teoría de la descripción, se supone que NMC-4 se fija al dominio A1 de vWF, que normalmente está accesible sólo cuando se activa vWF (v.g. en condiciones de alta cizalladura). Como enfoque alternativo, puede ser deseable expresar el dominio A1 aislado 5 de vWF, que según se ha informado se fija a GP1bα con potencia equivalente a la del vWF intacto activado (Celikel et al, 1997). Para ello, el dominio A1 se clona a fin de servir como sustrato para estudios de fijación en micropocillos. Un clon plasmídico que contiene el cDNA de vWF humano de longitud total se adquiere de ATCC (Cat #67122). El dominio A1 de vWF (v.g., residuos 499-729) y amplifica a partir de este clon con los cebadores vWF-A1-For(5'-CCCAGGAATTCCTCGGAACCGCGTTGCAC-3') (SEQ ID NO: 112) y vWF-A1-Rev (5'
10 CCGATGCGGCCGCTCACCTCTTGGGCCCCAG-3') (SEQ ID NO: 113). El producto PCR se purifica en gel, se digiere con EcoRI y NotI, y se clona en el vector pETDuet-1. El producto ligado se transforma en células competentes DH5α a fin de producir la forma oxidada del dominio A1.
Para construir un plásmido que expresa el dominio A1 de rata, se aísla DNA genómico de rata a partir de hígado de rata con el reactivo DNAzol siguiendo el protocolo del fabricante (Molecular Research Center, Inc., Cat #DN127,
15 Cincinnati, Ohio). El DNA genómico se utiliza luego para una reacción PCR con los cebadores (Rat-vWF-A1-F (5'-AGCGAATTCCCCCGAACCCCCCCTGCACAACTTC-3') (SEQ ID NO: 114) y Rat-vWF-A1-R (5'-AGTGCGGCCGCTTATCACCTTTTGGGTCCTGGTGATGAAACC-3') (SEQ ID NO: 115). El producto PCR se digiere con EcoRI y NotI y se clona en los mismos sitios del vector pETDuct-1. Los productos ligados se transforman en células competentes DH5α.
20 Un litro de medio de cultivo bacteriano (LB o 2xYT) que contiene los antibióticos carbenicilina, kanamicina, y tetraciclina se inocula con un cultivo bacteriano nocturno de 25 ml (v.g., la cepa Origami B que lleva los plásmidos p35 [pET-Duet-Rat-A1] o p36 [pET-Duet-Human-A1]). El cultivo se deja crecer a 37ºC en una máquina de sacudidas hasta una DO600 de 0,6-0,8. La expresión de las proteínas recombinantes se induce por adición de IPTG hasta una concentración final de 1 mM y el crecimiento del cultivo se continúa luego a 37ºC durante 4-5 horas más antes de
25 cosechar las bacterias por centrifugación a 6000 rpm en un rotor JA-10 (Beckman). El sedimento de células se congela a -80ºC o se procesa inmediatamente por resuspensión del sedimento en 20 ml de PBS que contiene dos tabletas disueltas de Inhibidores Protease completos (Roche), sometiendo la suspensión de células resultante a dos ciclos de dos minutos de disrupción celular (v.g., Branson Sonifier 250 provisto de una micro-boquilla en un ajuste de ciclos de servicio constante y ajuste de control de salida de 1-2) mientras se encuentra en hielo. El lisado de células
30 se centrifuga a 16.000 rpm en un rotor JA-20 (Beckman) durante 30 minutos a 4ºC. El sobrenadante se filtra a través de un filtro de jeringuilla de 0,45 μm antes de la aplicación a una columna de 2 ml compactada con gel His-Select HF Nickel Affinity (Sigma) que se ha equilibrado en tampón de fijación (imidazol 5 mM, NaCl 0,3 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0). La cromatografía se realiza utilizando una bomba de jeringa que regula el caudal a 1 ml/min. Después de lavar la columna con 20 ml de tampón de fijación, se eluyen las proteínas con imidazol 250 mM, NaCl 0,3 M, Tris-HCl 50
35 mM, pH 8,0, y se recogen fracciones de 1 ml. La mayor parte de la proteína se eluye dentro de las 4 primeras fracciones de la elución. El tamaño (-28 kD) y la integridad de las proteínas se monitorizan en un gel de SDSpoliacrilamida teñido con Coomassie. Se agrupan las fracciones pico, se concentran a 2,5 ml en caso necesario, y se desalan en PBS utilizando una columna PD-10 (Amersham/GE-Healthcare). La concentración de proteínas se determina utilizando un ensayo de proteínas Lowry (BioRad DC Protein Assay).
40 Cinética de fijación: Para evaluar los valores Kon, Koff y Kd, se realizan ensayos de sensibilidad por los cuales se sintetizan y purifican conjugados de anticuerpo europio (quelato N1). La fijación de estos anticuerpos de control quiméricos NMC-4 marcados con Eu e isotipo al antígeno A1 inmovilizado se mide utilizando un fluoroinmunoensayo de lantánidos potenciado por disociación (DELFIA).
Por ejemplo, un anticuerpo de control (v.g. MOPC-21 control isotipo, un IgG1/κ de plasma de mieloma humano;
45 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y la quimera NMC-4 se marcan con Eu. Resumidamente, el anticuerpo se añade a tampón de fosfato de sodio filtrado en condiciones estériles (96 mM, pH 7,4) y se dializa extensamente en Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS; KH2PO4 1,47 mM, Na2HPO4 8,1 mM, pH 7,4, NaCl 138 mM y KCl 2,67 mM) para eliminar las aminas primarias de peso molecular bajo. Los anticuerpos dializados se concentran en un concentrador MicroSep lavado a 9500 rpm (7000xg) en un rotor JA-20 durante 20 minutos a 4ºC. Se ajusta el
50 anticuerpo a 4,0 mg/ml con PBS que contiene una concentración final de NaHCO3 100 mM, pH 9,3. La mixtura mAb/bicarbonato (0,250 ml) se mezcla en un vial que contiene 0,2 mg de ácido N1-(b-isotiocianatobencil)-dietilenotriamina-N1 ,N2,N3,N3-tetraacético quelado con Eu3+ (Eu-N1-ITC; Perkin Elmer Life Sciences, Waltham, MA) por pipeteado alternativo moderado. La mezcla de anticuerpo y quelato reactivo con amina se deja reaccionar durante una noche a 4ºC sin agitar.
55 Se aplica una mixtura de anticuerpo marcado a una columna NAP-10 separada (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) pre-equilibrada con PBS. Se recogen fracciones (v.g., 0,5 ml) utilizando PBS para el tampón de la columna. Las muestras se ensayan respecto a proteína total (v.g., reactivo Bradford; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) utilizando un lector de placas de absorbancia SpectraMax 384 y se ensayan respecto a Eu, después de dilución 1:10.000 en Solución Intensificadora DELFIA (Perkin-Elmer), por fluorescencia resuelta en tiempo (TRF)
60 utilizando un lector de placas multi-etiqueta Victor 2 (Perkin-Elmer). Las fracciones que son positivas a la vez para proteína y etiqueta Eu se agrupan y se aplican a nuevas columnas NAP-10 pre-equilibradas con Tampón de
Ejecución (Tris 50 mM, pH 7,4 y NaCl 138 mM). Las fracciones de estas columnas que son positivas a la vez para proteína y etiqueta Eu se agrupan y se aplican a columnas PD-10 pre-equilibradas con Tampón de Ejecución, y las fracciones positivas para proteína y etiqueta Eu se agrupan y ensayan respecto a proteína total y respecto al contenido de Eu por TRF calibrada contra una solución estándar de europio (Perkin-Elmer). Finalmente se calcula la
5 ratio agente fluorescente:proteína.
Pocillos de placas Immulon-4 se recubren con el dominio His-A1 de vWF humano (v.g., 25 ng en 100 μl/pocillo en Tris 30 mM, pH 7,4 y NaCl 300 mM o PBS exenta de cationes divalentes) o de rata (v.g. 50 ng/pocillo) por incubación durante una noche a 4ºC. Se lavan las placas 3 veces con Tampón de Lavado (v.g., HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween-20), bloqueado con 300 μl/pocillo de Tampón de Bloqueo (v.g., Tampón de Lavado que
10 contiene 3,0 mg/ml de BSA exento de IgG y 0,1% de acida de sodio) durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavan 5 veces con Tampón de Lavado antes de su utilización.
Los ensayos de fijación en equilibrio se realizan como sigue. Se diluye Eu-anticuerpo en Tampón de Fijación (v.g. Tampón de Lavado que contiene 100 μg/ml de BAS exento de IgG y 0,1% de acida de sodio) y se aplica a los pocillos (v.g., 10 μl/pocillo) de una placa de 96 pocillos, y las placas se sellan con film SEALPLATE. Se agitan las 15 placas mediante sacudidas (v.g. Titer Plate Shaker con ajuste de velocidad de 4 durante ≥ 15 s o 60 s a la temperatura ambiente), se colocan en cajas Nalgene que contienen toallitas de papel húmedas, y se incuban en las cajas cerradas durante 2 horas a 37ºC. Para la medida de la etiqueta libre, se transfieren muestras del sobrenadante 4,0 μl) de los pocillos que contienen las mezclas de fijación a un conjunto paralelo de pocillos que contienen Solución de Intensificación DELFIA (100 μl/pocillo). Para evaluar el anticuerpo fijado, los pocillos recubiertos de A1 20 con las mezclas de fijación remanentes se lavan 5 veces con Tampón de Lavado, se vacían sobre toallitas de papel y se añade Solución de Intensificación DELFIA (100 μl/pocillo) a pocillos vacíos para la medida de la etiqueta fijada. Para calibración del ensayo, se añade Solución de Intensificación DELFIA (100 μl/pocillo) a pocillos no usados y se añade europio estándar (1,0 μl/pocillo). Las placas se agitan mediante sacudidas (v.g., Titer Plate Shaker con velocidad de ajuste durante 10 minutos a la temperatura ambiente), y se leen las intensidades de fluorescencia 25 resueltas en tiempo (TRF), utilizando un lector de placas multi-etiqueta Victor2 (Perkin-Elmer Wallac, Boston, MA). La fijación de normaliza para el contenido de quelato de europio por la ratio flúor:proteína (F:P) para los anticuerpos respectivos. La fijación específica se calcula deduciendo la fijación inespecífica (v.g., fijación media por el control isotipo marcado con Eu) de la fijación total (v.g., fijación por Eu-NMC-4). El número de sitios de fijación y los valores Kd se calcula por el método de Scatchard (1949). Se construyen gráficas de Hill para evaluar la fijación,
30 representando gráficamente log(v/(n-v)) frente al log de la concentración de Eu-NMC-4 libre, donde n = el número de sitios de fijación de afinidad alta/pocillo, v = el número medio de Eu-NMC-4 mAb/pocillo fijado específicamente, y la quimera Eu-NMC-4 libre se calcula a partir de las lecturas TRF medidas en la fase de solución.
Este análisis reveló dos clases de sitios de fijación, un sitio de afinidad alta de Kd 0,37 nM y un sitio de afinidad baja de Kd 5 nM. Análogamente, la fijación a His-rA1 de vWF de rata capturado por mAb anti-His exhibía también dos
35 clases de sitio de fijación, con valores Kd de 0,19 y 3,nM (Tabla 17).
Las cinéticas de asociación se determinan utilizando el mismo protocolo, excepto que se reemplaza el tampón de lavado en momentos diferentes con anticuerpo marcado con europio a las concentraciones indicadas (100 μl/pocillo). Las placas se sellan inmediatamente, se agitan mediante sacudidas (v.g. Titer Plate Shaker con ajuste de velocidad de 4 durante 15 segundos a la temperatura ambiente), y se incuban durante los tiempos indicados a 37ºC.
40 Las placas que contienen mezclas de fijación se lavan 5 veces con Tampón de Lavado, se vacían en seco sobre toallitas de papel, y se registra el tiempo de lavado para cada placa. Se añade Solución de Intensificación DELFIA (100 μl/pocillo) a los pocillos vacíos para la medida del marcador fijado como se ha descrito arriba. La tasa de asociación aparente, Kon.app, para cada concentración de anticuerpo se mide por ajuste de la fijación específica frente al tiempo con la ecuación siguiente utilizando software Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA):
La tasa de asociación aparente (Kon app) se representa gráficamente frente a la concentración de Eu-mAb. Los datos se ajustan a la ecuación lineal
donde la constante de tasa de asociación Kon es la pendiente ajustada, [mAb] es la concentración de Eu-NMC-4, y la 50 tasa de disociación Koff es la ordenada en el origen ajustada.
La semivida calculada para la disociación de la quimera NMC-4 fijada a His-A1 de vWF humano o de rata se calcula por la ecuación siguiente:
La fijación específica de Eu-NMC-4 a His-A1 de vWF humano y de rata se ajusta a una ecuación exponencial simple de asociación, a partir de la cual se obtienen las tasas aparentes de asociación Kon, app (v.g., la constante k de ajuste de la curva de asociación exponencial) para cada concentración de anticuerpo marcado. Las tasas de asociación aparente para ambos antígenos son dependientes de la dosis como se muestra en las gráficas de Kon, app frente a 5 concentración de Eu-NMC-4. Los resultados se resumen en la Tabla 17 y revelan que la quimera NMC-4 tenía un valor Kd de 0,32 ± 0,07 nM para el dominio A humano, y 0,28 ± 0,01 nM para el dominio A1 de rata. En ambos casos, estos resultados están en estrecha concordancia con los valores Kd deteriorados por la fijación de equilibrio. Los resultados sugieren también que el complejo antígeno-anticuerpo tiene una vida larga para ambas especies A1, con semividas en vitro para disociación de 44 minutos y 69 minutos para los antígenos humano y de rata,
10 respectivamente.
Pueden realizarse estudios de fijación competitivos para determinar los valores Ki (v.g. una medida de afinidad relativa para el antígeno). Los ensayos se realizan como se ha descrito arriba para la cinética de asociación, excepto que en este caso se aplican 8 μl/pocillo de Tampón de Fijación (v.g., Tampón de Lavado que contiene 100 μg/ml de 20 BSA exenta de IgG, 0,1% acida de sodio), seguido por 10 μl/pocillo de Eu-NMC-4 o competidor no marcado con Eu y 10 μl/pocillo de anticuerpo competidor sin marcar en una serie de diluciones seriadas duplicadas que va desde 1012 M a 10-7 M. La concentración final de anticuerpo marcado con europio es 100 pM. El nivel de fijación inespecífica de fondo disminuye significativamente en presencia del agente quelante DTPA (1 μM) por lo que éste se incluye en los ensayos de fijación competitivos. Adicionalmente, se optimiza el recubrimiento de los pocillos utilizando His-A1 25 que se ha purificado utilizando gel de yodoacetilo para eliminar cualquier A1 reducido de la preparación de proteína. La mezcla se incuba durante 3,75 horas a fin de permitir que la reacción alcance el equilibrio pleno, se lava y se determina por TRF el anticuerpo marcado fijado como se ha descrito arriba. Las curvas de inhibición se ajustan con el modelo "competición por un solo sitio" utilizando software Prism (GraphPad, Inc.) para obtener valores CI50 y calcular la ki utilizando las ecuaciones de Cheng y Prusoff (1973 Biochem Pharm, 29:3099) utilizando los valores Kd
30 medidos por análisis Scatchard del experimento de fijación de equilibrio.
La estandarización del ensayo de fijación competitiva se demuestra por comparación del valor Ki obtenido de la competición homóloga por la quimera NMC-4 sin marcar con la afinidad (Kd) medida para fijación de Eu-NMC-4 al antígeno. Para competición homóloga con His-A1 humano, la quimera NMC-4 es un inhibidor potente de la fijación de Eu-NMC-4 con un valor Ki de 0,28 ± 0,06 mM (Tabla 19), lo cual es coherente con el valor Kd observado de 0,32
35 ± 0,07 nM. Análogamente, para competición homóloga con His-A1 de rata, la quimera NMC-4 tenía un valor Ki de 0,297 ± 0,128 nM (Tabla 18), que es coherente con el valor Kd de 0,276 ± 0,011 nM. En contraste, el control isotipo sin marcar, IgG1/κ de plasma de mieloma humano) no tenía efecto inhibidor alguno sobre la fijación de Eu-NMC-4 al antígeno A1.
Tabla 19. Comparación de la actividad de fijación (Ki por ensayo de competición) de variantes humanizadas 40 seleccionadas de NMC
Variante de anticuerpo
Isotipo Ki (Valor medio ± SEM)
NMC-4 mAb
mIgG1 0,60 ± 0,13 nM (n=3)
Quimera NMC-4
Quimera IgG1 0,28 ± 0,06 nM (n=4)
Control IgGκ
IgG1 no detectable
H2-L5
IgG1 0,96 ± 0,27 nM (n=3)
H9-L9
IgG1 3,51 ± 1,21 nM (n=4)
H9-L9
IgG4 3,53 nM (n=1)
Se utiliza luego el ensayo de fijación competitiva para testar la potencia de las variantes humanizadas de NMC-4 H9L9 IgG1 y 4. Los dos isotipos de la variante H9L9 injertada en CDR exhibían actividad nM idéntica, aunque menos potente que la quimera NMC-4 homóloga (Tabla 19).
5 El anticuerpo AJW-200 se ensaya en el ensayo de fijación competitiva. En contraste, con las variantes NMC-4 humanizadas, que competían por la fijación de Eu-NMC-4 a His-A1, la fijación de Eu-NMC-4 a His-A1 es intensificada por AJW200 con un valor CE50 de 210 pM (Figura 2). Las gráficas Hill de la fijación de Eu-NMC-4 a His-A1 muestran pendientes de Hill próximas a la unidad (nH = 0,984 y 0,957), coherentes con la fijación a una sola clase de sitios de fijación sin cooperatividad. En contraste, las gráficas de Hill de la fijación de Eu-NMC-4 a His-A1 en
10 presencia de AJW200 1,8 nM o 20 nM (Figuras 2C y 2D, respectivamente) exhiben pendientes de Hill mayores que 1 (nH = 1,548 y 1,201), que indican cooperatividad positiva. La cooperatividad positiva mediada por AJW200 se observa en dos experimentos independientes realizados en dos días distintos. Estos resultados no sólo confirmaban que NMC-4 se fija a un sitio de fijación separado que AJW200 en el dominio A1 de vWF, sino que indican también que, al menos para el fragmento A1 aislado, AJW200 potencia la fijación de NMC-4 al sitio de fijación GP1ba.
15 Ejemplo 5: Capacidad de los Anticuerpos para Bloquear la Adhesión Plaquetaria
Una confirmación de que un anticuerpo bloquea el sitio de fijación del receptor GP1bα en vWF es su capacidad para antagonizar las interacciones vWF-GP1b en condiciones naturales de flujo. Un enfoque que ha sido desarrollado por Moake y colegas (1986, J Clin Invest. 78:1456-61) aprovecha el hecho de que cuando las células endoteliales son activadas con histamina, secretan una forma ultra-larga de vWF (ULvWF), donde el dominio A1 está en
20 conformación abierta (v.g. activa). Éstas se rompen rápidamente después de introducción de plasma, debido a escisión de la ULvWF mediada por ADAMS13 (Dong et al., 2002 Blood 100: 4033-9).
En un método ilustrativo, HUVECs de primer paso (P1) se dividen y se siembran en cápsulas de 35 mm a una densidad de 1x105 células/cápsula, se cultivan durante 7 días, y se utilizan el día 7 (2-3 días después que las mismas alcanzan 100% de confluencia). Las plaquetas humanas marcadas con CFSE se adhieren rápidamente a 25 las HUVECs a una tasa de flujo de 1,2 ml/min (Figura 3A). Un número mucho mayor de plaquetas se fijan a HUVECs cuando las células se tratan previamente con histamina 25 μM durante 10 minutos a la temperatura ambiente (Figura 3B). Esta adhesión de las plaquetas se inhibía completamente cuando las plaquetas se sometían a perfusión sobre la monocapa en tampón que contenía NMC-4, a una concentración de 10 μg/ml (Figura 3C) y se bloqueaban parcialmente cuando las plaquetas se perfundían en presencia de un anticuerpo anti-GP1bα (v.g., AK2), 30 a una concentración de 18 μg/ml (Figura 3D). En contraste, IgG de ratón de control a una concentración de 18 μg/ml no impedía la adhesión plaquetaria a los polímeros vWF (Figura 3E) lo que sugería que la adhesión de las plaquetas a las HUVECs está mediada de hecho por la interacción entre vWF derivado de endotelio y GP1bα plaquetaria. Cuando el área cubierta por las plaquetas de las 20 imágenes capturadas por operación se midió y se cuantificó utilizando software Compix, NMC-4 reducía la adhesión plaquetaria en proporción > 95% comparada con un efecto
35 insignificante por el anticuerpo de control.
Ejemplo 6: Capacidad de los Anticuerpos para Prevenir la Oclusión Vascular
El modelo de trombosis arterial por cloruro férrico se utiliza para evaluar la actividad anti-trombótica de la quimera NMC-4 y el derivado humanizado (v.g., H14, L10) comparado con AJW200. La arteria carotidea contra-lateral se aísla por la reubicación de la glándula salivar y tejido adiposo acompañante al lado craneal de la incisión. La arteria 40 carótida se deja al descubierto y se coloca sobre una pieza de papel de filtro (v.g., 4 mmx5 mm) que se pliega para abrazar la arteria carótida y proporcionar una superficie para la solución de cloruro férrico (7,5%). Después de aplicar la solución de FCl3 durante 4 minutos, se coloca una sonda de flujo alrededor de la arteria carótida y se mide el flujo utilizando un sistema de flujo Transonic Systems Inc. (Ithaka, NY) hasta el tiempo de oclusión (típicamente 10 minutos en ratas de control) o hasta 45 minutos. Se administran a grupos de 4 ratas (n = 6 para solución salina) 45 dosis IV que van desde, por ejemplo, 5 a 0,01 mg/kg de quimera NMC.4, V14, L10, AJW200 o IgG de control en un volumen de 1 μl/g de peso corporal de la rata. Las preparaciones de anticuerpos se filtran en condiciones estériles y se ensayan para asegurar un contenido bajo de endotoxina utilizando el LIMULUS AMOEBOCYTE ASSAY KIT
(BioWhittaker) siguiendo el protocolo del fabricante, y se evalúan respecto a mono-dispersidad por análisis HPLC antes de ser utilizadas para estudios en animales.
Como se muestra en la Figura 4, tanto NMC-4 como AJW200 inhibían significativamente la oclusión del vaso. NMC4 exhibía una DE50 a una dosis de 0,03 y 0,1 mg/kg similar a AJW200. El derivado humanizado, H14, L10, exhibía 5 también actividad similar con un valor DE50 comprendido también entre 0,03 y 0,1 mg/kg dosis (Figura 4B).
Ejemplo 7: Efecto de los Anticuerpos Sobre el Tiempo de Hemorragia y la Pérdida de Sangre
La pérdida de sangre puede a veces ser un efecto colateral adverso asociado con los agentes antiplaquetarios (v.g., anticuerpos anti-vWF). De acuerdo con ello, puede ser necesario evaluar los anticuerpos humanizados NMC-4 en cuanto a su potencial de contribución a complicaciones hemorrágicas. Para ello, se realiza un ensayo estándar en 10 tiempo de hemorragia, en el que se administra anticuerpo de control, quimera NMC-4 o AJW200 30 minutos antes de realizar una transfección en la cola. Para la transfección en la cola se corta el extremo (v.g. 0,5 mm) de la cola y se pone la cola en un volumen conocido de solución salina caliente, midiéndose el tiempo requerido para que cese la hemorragia. Se mide también la pérdida de sangre por evaluación del contenido de hemoglobina de las células de la sangre recogidas en solución salina durante la evaluación del tiempo de hemorragia. Para esto, se reducen los
15 glóbulos rojos a un sedimento por centrifugación a baja velocidad, se resuspenden en solución salina que contiene 1% de Triton X-100, que se ajusta a un volumen final de 5 ml, y se mide la concentración de hemoglobina de la solución por determinación de la absorbancia a 420 nm.
La quimera NMC-4 exhibía la misma dosis DE50 de 0,09 mg/kg para un aumento significativo en el tiempo de hemorragia que el derivado humanizado H14-L10. A la dosis de 0,03 mg/kg asociada con la eficacia para estos dos 20 anticuerpos en el modelo de FeCl3 de trombosis arterial, no había prolongación significativa alguna de la hemorragia
o pérdida incrementada de sangre. NMC-4 y su derivado humanizado exhiben una respuesta DE50 ligeramente mejorada a la dosis que AJW200, cuya dosis DE50 en la rata para hemorragia incrementada estaba mucho más próxima a su dosis DE50 para actividad antitrombótica, lo que sugiere que NMC-4 ofrece una ventana terapéutica mejorada comparado con AJW200.
25 Tabla 20. Efecto de la quimera NMC-4 y su derivado humanizado, H14, L10, comparado con AJW200 sobre el tiempo de hemorragia y la pérdida de sangre en la rata.
Anticuerpo
Tiempo de hemorragia (min) Valor medio ± SEM (n) Pérdida de sangre (ml) Valor medio ± SEM (n)
Solución salina
3,1 ± 0,3 (16) 0,287 ± 0,088 (9)
NMC-4 (quimera)
DE50 = 0,09 mg/kg
0,01 mg/kg
2,7 ± 0,3 (2) 0,059 ± 0,009 (2)
0,03 mg/kg
4,1 ± 0,2 (4) 0,076 ± 0,014 (4)
0,10 mg/kg
19,7 ± 0,9 (2) 1,503 ± 0,485 (2)
0,30 mg/kg
32,7 ± 4,4 (3) 1,501 ± 0,213 (3)
3,00 mg/kg
32,3 ± 2,3 (2) 1,106 ± 0,243 (4)
H14, L10 (humanizado)
DE50 = 0,09 mg/kg
0,03 mg/kg
2,03 ± 0,35 (3) 0,094 ± 0,035 (3)
0,10 mg/kg
15,30 ± 1,70 (4) 0,630 ± 0,294 (4)
0,30 mg/kg
26,45 ± 3,09 (4) 1,883 ± 0,312 (4)
AJW200
DE50 = 0,05 mg/kg
0,01 mg/kg
2,8 ± 0,25 (2) 0,177 ± 0,059 (2)
0,03 mg/kg
8,2 ± 1,56 (7) 0,250 ± 0,059 (4)
0,10 mg/kg
25,1 ± 0,4 (5) 1,943 ± 0,420 (2)
0,30 mg/kg
29,2 ± 0,72 (5) 2,074 ± 0,521 (3)
3,00 mg/kg
30,9 ± 0,62 (3) 2,912 ± 0,243 (4)
Otro parámetro de efectos secundarios adversos de estos anticuerpos sobre la hemostasis es la pérdida de sangre, que se ensaya sobre la sangre recogida mientras se determinan los tiempos de hemorragia. Una vez más, a dosis mayores que 0,1 mg/kg, estos anticuerpos inducían una pérdida de sangre significativa. Sin embargo, a dosis de 0,3
5 y 3 mg/kg, AJW200 causaba una pérdida de sangre notablemente mayor que la quimera NMC-4 a las mismas dosis, aunque estas diferencias se aproximaban sólo a significación estadística para los grupos de 3,0 mg/kg, donde n = 4 en lugar de 3 (Tabla 20). La variante del anticuerpo H14, L10 no exhibía diferencia significativa alguna con respecto a la quimera paterna NMC-4.
Ejemplo 8: Efecto de los Anticuerpos Sobre el Recuento Circulante de Plaquetas y Glóbulos blancos
10 Se supone que algunos agentes anti-plaquetarios inhiben la formación de trombosis mientras que pueden causar al mismo tiempo trombocitopenia (Hansen et al., J Pharmacol Exp Ther. 298: 165-71 (2001)). Para determinar el efecto de NMC-4 sobre los números de glóbulos blancos (WBC) y plaquetas circulantes en los animales tratados, se inyectan un grupo de 5 ratas con un peso de 230-260 g (v.g., por vía intravenosa) con NMC-4 a 1 mg/ml y se inyecta un grupo de control de 3 ratas con un control de vehículo (v.g. PBS de grado quirúrgico). Antes de la inyección, se
15 utiliza una hemorragia en la cola para medir los recuentos base de células de la sangre utilizando, por ejemplo, el HEMAVET HEMATOLOGY ANALYZER™ (Drew Scientific). Se recogen muestras de sangre en momentos previamente especificados hasta 48 horas (v.g., 30 minutos, 2, 4, 24 y 48 horas) después de la inyección de anticuerpo o solución salina de ratas no anestesiadas por extracción retro-orbital utilizando una pipeta capilar. Se transfieren luego aproximadamente 40 μl de sangre a un tubo que contiene 5 μl de solución anticoagulante citrato
20 dextrosa acidificada (ACD) y se muestrean inmediatamente en un contador de células HEMAVET a fin de determinar el número de plaquetas y glóbulos blancos. Para cada extracción de sangre, se toman muestras de ojos alternantes.
NMC-4 tenía poco efecto sobre el recuento de plaquetas en cualquiera de los puntos analizados. Se observó una disminución temporal en el recuento de glóbulos blancos de 37,5% (p = 0,016) a los 30 minutos después de la inyección, pero se observó también una disminución similar después de la inyección del vehículo PBS. Los niveles
25 de glóbulos blancos volvían a la línea base entre 2 y 4 horas después de la inyección, tanto en el grupo tratado con NMC-4 como en el tratado con vehículo de control.
Ejemplo 9: Establecimiento de Líneas de Células para Expresión de Anticuerpos
Puede desarrollarse un sistema de expresión de proteínas de mamífero de alto rendimiento que está basado en una plataforma de Expresión de Cromosomas Artificiales (ACE) murinos, que ha sido modificado por ingeniería genética
30 para contener sitios aceptores de recombinación múltiples de acción específica, que pueden cargarse con secuencias de genes heterólogos utilizando una integrasa lambda mutante (v.g., la integrasa ACE) en combinación con un vector lanzadera de direccionamiento (Lindenbaum et al. (Nucl. Acids. Res. 332 (21): e 172 (2004); Solicitudes de Patente U.S. Núms.: 2003/0119104A1 y 2006/0246586A1). Este sistema se utiliza para generar líneas de células estables para expresión de variantes humanizadas seleccionadas y la quimera NMC-4.
35 Las inserciones de los plásmidos pCI-NMC4-VL10 y pCI-NMC4-VH14 se digieren con NotI más HindIII (vector de cadena ligera) o XhoI y BamHI (vector de cadena pesada) y se clonan secuencialmente en la MCS1 (cadena ligera) y MCS2 (cadena pesada) del vector pST0518. El vector pST0518 que lleva las inserciones de las cadenas pesada y ligera en tándem sirve como el vector lanzadera para transferencia a los Vectores de Direccionamiento ACE (ATVs) con genes de resistencia diferentes, derivados de los vectores de direccionamiento descritos por Lindenbaum et al.
40 (Nucl. Acid Res. 32 (21):e172 (2004); Solicitudes de Patente U.S. Núms: 2003/0119104A1 y 2006/0246586 A1). Para transferir la casete que contiene ambas cadenas pesada y ligera de los anticuerpos en los ATVs, el vector pST0518-VH14, VL10 se digiere con las endonucleasas ‘homing’ I-Ceul y PI-SceI (New England Biolabs, MA). El fragmento VH14 más VL10 se purifica en gel y se clona en los sitios equivalentes del pZeo y pHygro-ATV predigerido con las mismas endonucleasas I.ceuI y PI-SceI. Esto produce los plásmidos pNHT605-H14L10-IgG4
45 (gen hygR) y pNHT607-H14L10-IgG4 (gen p zeoR).
Análogamente, se construyen vectores de direccionamiento pST0518 portadores de la quimera NMC-4 IgG4, y la inserción en tándem se subclona en los vectores pZeo y pHygro ATV que proporciona los plásmidos pNHT623 (quimera IgG4 humana más el gen hygR) y pNHT624 (quimera IgG4 humana más el gen ZeoR).
Para integración direccionada en la plataforma ACE, se siembran células de la plataforma hospedadora ChK2 ACE a
50 una densidad de 0,4x105 células por pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos y se cultivan durante una noche. Tres horas antes de la transfección, el medio de cultivo se reemplaza con medio exento de suero y se transfecta tres horas después con 1 μg del vector y 1 μg del vector de expresión de integrasa ACE complejado con reactivo LipofectAMINE PLUS (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas más tarde, las células se expanden en cápsulas de cultivo de 15 cm, y al día siguiente, se añaden al medio de cultivo 3,0 μg/ml de
55 zeomicina o higromicina (dependiendo del vector utilizado). Después de 14 días de selección, se aíslan las colonias resistentes a los fármacos utilizando anillos de clonación y los clones individuales se amplifican para análisis de la producción de anticuerpos.
Ejemplo 10: Eficacia y Seguridad en vivo del Anticuerpo NMC-4
La eficacia y seguridad del anticuerpo NMC-4 humanizado se ensaya en un modelo animal en vivo (v.g. babuino).
En un método ilustrativo, se anestesian babuinos con hidrocloruro de quetamina (Anaket-V™ de la Premier Pharmaceutical Company) (10 mg/kg IM/30 minutos o cuando se necesita `para mantener la anestesia general) y se mantiene su temperatura corporal a 37ºC con una tablilla de calentamiento. A continuación, se diseca suavemente 5 un segmento de 4-5 cm de los vasos femorales exentos de tejido circundante. Se ligan todas las ramas próximas en la arteria femoral y la vena femoral. Se practica luego una pequeña incisión en la arteria femoral y la vena femoral y los extremos de los vasos se insertan y se fijan con seda quirúrgica. Se fija luego tubo de silicona a los extremos de los vasos para desviar la sangre arterial a la vena femoral. La desviación directa de la circulación arterial a la venosa mientras se salvan en derivación los capilares aumenta el flujo sanguíneo hasta aproximadamente 150-300
10 ml/minuto. Se fija una sonda de flujo ultrasónico de tipo tubo (Transonic Systems Inc., Maastricht, Países Bajos) al tubo de silicona y se deja que se estabilice el flujo sanguíneo durante aproximadamente 20 minutos. El flujo sanguíneo medio y fásico se mide continuamente a todo lo largo del experimento utilizándose la desviación para administración de fármaco así como para la toma de muestras de sangre.
A continuación, se lesiona el endotelio de la arteria femoral en un punto próximo al extremo del vaso con un porta
15 agujas Martin (Hegar-Baumgartner TC Gold de 14 cm, código de producto 20.634.14) por prensado fuerte en el endotelio durante 10 segundos a depresión máxima. Se practican dos lesiones solapantes y se coloca un constrictor ajustable de plástico sobre el sitio de la lesión a fin de reducir el flujo sanguíneo a 10 hasta 20% del valor de la línea base. Se observa una disminución gradual en el flujo sanguíneo debido a la formación de trombo. Cuando el flujo sanguíneo se reduce a ≤ 5 ml/min, se abre el constrictor a fin de desalojar el trombo rico en plaquetas. A
20 continuación, se aplica de nuevo la estenosis externa y se reinicia el proceso de formación de trombo. Este patrón repetitivo de disminución del flujo sanguíneo subsiguiente a restauración mecánica se conoce como reducciones cíclicas de flujo (CFRs). Se midió el número de CFRs en función del tiempo. Las reducciones cíclicas de flujo de la línea base (CFRs) se registran durante 30 minutos. Se inyecta solución salina y se monitorizan las CFRs durante 30 minutos más. Se utiliza la variante humanizada de NMC-4 H9L9 IgG4 como se describe en el Ejemplo 3 (a la que se
25 hace referencia ulteriormente en esta memoria como GBR600).
Pueden utilizarse dos métodos para evaluar la hemorragia después de administración del fármaco. En un primer método, se determina el tiempo de hemorragia en el modelo de piel en la superficie del antebrazo. Se aplica un manguito de presión alrededor del brazo y se infla a 40 mm Hg, después de lo cual se induce una herida con el dispositivo Surgicut (ITC, Edison, NJ). El tiempo de hemorragia de la piel se define como el tiempo entre la inducción
30 de la herida y la cesación visual de hemorragia. La sangre se toca levemente cada 15 segundos con papel de filtro, si bien no se toca la herida. Las medidas se detienen cuando el tiempo de hemorragia en la piel excede de 900 segundos (es decir, 15 minutos) y se consideran como 900 segundos.
En el segundo método, se evalúa la pérdida de sangre de una incisión por una anexina V recombinante en un modelo de lesión de la arteria carótida del conejo (véase, v.g., P. Thiagarajan et al. (1997), Circulation 96 (7): 2339
35 47). Se realiza una incisión de 2 cm x 0,8 cm en la ingle y se insertan torundas de gasa previamente pesadas, que se reemplazan al final de cada periodo de infusión de la dosis de 30 minutos o cuando las mismas están saturadas con sangre. Todas las gasas se pesan al final del estudio para obtener la pérdida de sangre total. El valor para cada dosis se expresa como una ratio de la gasa en la fase de control salino. El ritmo cardiaco y la presión sanguínea se monitorizan continuamente durante todo el estudio a intervalos de 10 minutos.
40 Al final de cada periodo de dosificación, se extrae 1 ml de sangre con EDTA, y 10 ml de sangre con citrato, y se determinan el recuento de plaquetas FBC, tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial activada, Factor VIII y vWF. Dos partes alícuotas de 300 μl cada una se congelan a -80ºC para envío a los investigadores para ensayos adicionales de laboratorio en vitro en caso necesario. Análogamente, se aspira sangre 0,5, 1, 2, 8, 24 y 48 horas después del final de los estudios de flujo. Al final de la última dosis, se realizan tests de agregación plaquetaria
45 con muestras de test y de control.
Después de la dosis acumulativa (v.g., cuando se observa la inhibición completa de las CFRs), se infunde epinefrina (Intramed) a una dosis de 2,2 μg/kg/min durante 20 minutos y se miden de nuevo las CFRs. La epinefrina sola no causa agregación plaquetaria en los babuinos, pero puede restablecer las variaciones cíclicas de flujo anuladas por mejora de otros factores de la agregación plaquetaria (véase, v.g., (G. Anfossi et al (1996) Eur J Clin Invest. 26: 353
50 370).
Estudios de Eficacia y Seguridad de GBR600: Los Estudios 1 a 4, descritos más adelante, se realizan para determinar la eficacia y la seguridad de GBR600.
Estudio 1: Se realiza un estudio piloto con n = 1 animal para establecer una curva de respuesta a la dosis con cantidades crecientes de GBR600 y a fin de identificar la dosis eficaz para la cual se observa la inhibición máxima de
5 las CFRs. Se determinan la hemorragia del modelo y la hemorragia de la incisión para todas las dosis testadas. Se toman muestras de sangre hasta las 48 horas a fin de establecer la farmacocinética del anticuerpo a la dosis máxima.
Se inyectan las dosis crecientes siguientes de GBR600 a intervalos de 30 minutos y se registra el flujo durante toda la duración del estudio: dosis 1, 0,03 mg/kg; dosis 2, 0,1 mg/kg; dosis 3, 0,3 mg/kg; dosis 4, 1 mg/kg; y dosis 5, 10
10 mg/kg. Se realizan luego tests de hemorragia a los 10 minutos después de la inyección de cada dosis.
La Figura 5 y la Tabla 21 describen el efecto de dosis crecientes de GBR600 sobre las CFRs. La arteria se lesiona de nuevo cerca del final de la fase basal de 30 minutos, dado que las CFRs no parecían ser estables. 0,03 mg/kg de GBR600 disminuía el número de CFRs a 5/30 minutos comparado con 8/30 minutos para la fase de solución salina. La infusión de 0,1 mg/kg adicionales inhibía por completo las CFRs. Esto se confirma por el hecho de que una lesión
15 repetida de la arteria no causaba un retorno de las CFRs. La inhibición se observa para todas las dosis crecientes que siguen. Después de la infusión la dosis máxima de GBR600 (10 mg/kg) se infunde epinefrina a una tasa de 2,2 μg/kg/minuto a fin de establecer si se consigue una inhibición fuerte o débil de la deposición de plaquetas. La infusión de epinefrina conducía a un aumento temporal del flujo sanguíneo debido a su efecto sobre la presión sanguínea, pero no invertía la inhibición de las CFRs.
20 Tabla 21. Efecto de dosis crecientes de GBR600 sobre las CFRs (0,03-10 mg/kg)
Dosis (mg/kg)
Dosis Acumulada (mg/kg) Número de CFRs
Línea base
0 8
Solución salina
0 8
0,03
0,03
5
0,1
0,13 0
0,3
0,43 0
1
1,43 0
10
11,43 0
Estudio 2: El Estudio 2 se lleva a cabo de una manera similar al Estudio 1, excepto que se incluye una dosis de 0,01 mg/kg al comienzo de la escalada de la dosis, antes de la dosis de 0,03 mg/kg, dado que se ha visto en el Estudio 1 una inhibición parcial de las CFRs a una dosis de 0,03 mg/kg.
25 En el Estudio 2 (véanse, v.g., Figura 6 y Tabla 22), se observa un efecto sobre las CFRs por 0,01 mg/kg de GBR600 (7CFRs/30 minutos comparado con 9 CFRs/30 minutos para solución salina). Sin embargo, la infusión de una dosis adicional de 0,03 mg/kg (dosis acumulada: 0,04 mg/kg) causaba la inhibición completa de las CFRs. La DE100 de GBR600 es por consiguiente 0,04 mg/kg. La lesión repetida de la arteria no invertía la inhibición de CFRs, lo que indicaba una inhibición verdadera. El efecto inhibidor se mantiene a las dosis mayores hasta la dosis máxima de 10
30 mg/kg. La infusión de epinefrina conducía a un aumento temporal del flujo sanguíneo debido a su efecto sobre la presión sanguínea, pero no invertía la inhibición de las CFRs.

Tabla 22. Efecto de dosis crecientes de GBR600 sobre las CFRs (0,01-10 mg/kg)
Dosis (mg/kg)
Dosis Acumulada (mg/kg) Número de CFRs
Línea base
0 9
Solución salina
0 9
0,01
0,01
7
0,03
0,04 0
0,1
0,14 0
0,3
0,44 0
1
1,44 0
10
11,44 0
Estudio 3: El Estudio 3 se lleva a cabo de una manera similar al Estudio 1, con la excepción de que se administra una dosis inicial de 0,005 mg/kg seguida por otra dosis de 0,005 mg/kg (dosis acumulada = 0,01 mg/kg) y se 5 aumenta luego en 6 incrementos de 0,01 mg/kg.
En el Estudio 3 (véase, v.g., la Figura 7), se observa un efecto sobre las CFRs (reducción de 8 CFRs/30 min a 8 CFRs) por infusión de 0,005 mg/kg de GBR600. Las CFRs disminuían de manera lineal con las dosis crecientes de GBR600. El número de CFRs por periodo de dosificación se muestra en la Tabla 23 y la Figura 8. La Figura 8 representa la disminución lineal en el número de CFRs asociada con dosis crecientes de GBR600. La relación entre
10 el número de CFRs y la dosis de GBR600 se expresa por la ecuación siguiente: los datos se ajustan a esta ecuación con R2 = 0,9901.
En el Estudio 3, la DE100 es 0,07 mg/kg comparada con la inhibición completa en el Estudio 2 causada por una dosis acumulada de 0,04 mg/kg. El tiempo entre dosis crecientes es 30 minutos en el Estudio 3. Esta discrepancia en los valores observados de DE100 puede estar causada por una reducción de la concentración de GBR600 en sangre
15 como resultado del aclaramiento inicial del fármaco. La infusión de epinefrina invierte la inhibición de las CFRs. Esto podría estar relacionado con la forma de la curva de CFR a la dosis acumulada de 0,07 mg/kg. La inhibición se invierte lentamente para 0,07 mg/kg de dosis acumulada, lo cual es indicativo de un trombo creciente. En estas condiciones particulares, la epinefrina parece ser capaz de invertir la CFR.

Tabla 23. Efecto de las dosis acumuladas de GBR600 sobre las CFRs (0,005-0,07 mg/kg)
Dosis (mg/kg)
Dosis Acumulada (mg/kg) Número de CFRs
Línea base
0 8
Solución salina
0 8
0,005
0,005
7
0,005
0,01 6
0,01
0,02 5
0,01
0,03 4
0,01
0,04 3
0,01
0,05 2
0,01
0,06 1
0,01
0,07 0
Estudio 4: El Estudio 4 se lleva a cabo de manera similar al Estudio 1, con la excepción de que se utiliza clopidogrel como control positivo en tres babuinos para comparar la eficacia y tendencia a hemorragia de GBR600 dosificado a 1, 1,5, 2,5, 5 y 10 mg/kg contra clopidogrel.
En el Estudio 4, clopidogrel inhibía completamente las CFRs a una dosis acumulada de 10 mg/kg en el Babuino 1 y 5 mg/kg en los Babuinos 2 y 3 como se muestra en la Tabla 24 y la Figura 9, que ilustra los resultados del Babuino 3 en la Tabla 24. La infusión de epinefrina invertía la inhibición de las CFRs.

Tabla 24. Efecto de las dosis crecientes (1-10 mg/kg) de clopidogrel en los babuinos.
Dosis (mg/kg)
Dosis (mg/kg)
Acumulada Número de CFRs Babuino 1 Número de CFRs Babuino 2 Número de CFRs Babuino 3
Línea base
0 13 8 6
Solución salina
0 13 7 8
1
1
8 8 7
1,5
2,5 5 2 2
2,5
5 2 0 0
5
10 0 0 0
10
20 0 0 0
Tiempos de Hemorragia del Modelo: En los Estudios 1 y 2, los tiempos de hemorragia del modelo son mayores que 15 minutos para todas las dosis mayores que 0,04 mg/kg. En el estudio de control positivo con clopidogrel (Bristol-Myers Squibb/Sanofi Pharmaceuticals) los tiempos de hemorragia del modelo se prolongan en la misma proporción que las dosis acumuladas mayores que 2,5 mg/kg. En el Estudio 3, los tiempos de hemorragia del 10 modelo no se prolongan nunca más de 15 minutos. Los tiempos de hemorragia del modelo no son una medida muy precisa de la tendencia a la hemorragia, dado que exhiben una gran variabilidad en la línea base (véanse, v.g. los valores basales en los Babuinos 1, 2, 3 con clopidogrel). Como tales, los tiempos de hemorragia del modelo no se consideran muy predictivos para hemorragia clínicamente relevante, tal como en un escenario preoperatorio (véase, v.g., Lind et al. Platelets, 2ª edición, p 485-493, Michelson AD ed., Academic Press.). El test de hemorragia incisional
15 exhibe menos variación, dado que cuantifica la cantidad real de pérdida de sangre a través de la incisión y tiene un intervalo dinámico mayor. Por tanto, se realiza el test de hemorragia incisional además del test de hemorragia del modelo. Estos datos se resumen en las Tablas 25 y 26.

Tabla 25. Tiempo de Hemorragia del Modelo GBR600 [minutos]
Dosis (mg/kg)
Dosis Acumulada (mg/kg) Estudio 1 Estudio 2 Estudio 3
Línea base
0 5,5 6,25 2
Solución salina
0 2,5 7 4,45
0,005
0,005
n.a. n.a. 5,25
0,005
0,01 n.a. n.a. 5,25
0,01
0,02 n.a. n.a. 6
0,01
0,03 n.a. n.a. 7,45
0,01
0,04 n.a. n.a. 2,5
0,01
0,05 n.a. n.a. 3,5
0,01
0,06 n.a. n.a. 7,45
0,01
0,07 n.a. n.a. 5,45
0,01
0,01
n.a. 2,45 n.a.
0,03
0,03/0,04 5,25 >15 n.a.
0,1
0,13/0,14 >15 >15 n.a.
0,3
0,43/0,44 >15 >15 n.a.
1
0,143/1,44 >15 >15 n.a.
10
11,43/11,44 >15 >15 n.a.

Tabla 26. Tiempo de Hemorragia del Modelo con Clopidogrel [minutos]
Dosis (mg/kg)
Dosis Acumulada (mg/kg) Babuino 1 Babuino 2 Babuino 3
Línea base
0 >15 5,5 13
Solución salina
0 n.d. n.d. n.d.
1
1
3,5 n.d. 7
1,5
2,5 >15 >15 >15
2,5
5 >15 >15 >15
5
10 >15 >15 >15
10
20 >15 >15 >15
Las Tablas 27 y 28 presentan los resultados obtenidos con el test de hemorragia incisional para clopidogrel y
5 GBR600. La cantidad de sangre absorbida por la gasa aumentaba inicialmente con la dosis y es auto-limitante a dosis altas. En todos los estudios la mayor hemorragia observada corresponde a la 4ª dosis, después de lo cual el volumen de sangre absorbido por la gasa disminuye y parece tener lugar la curación de la herida. En los Estudios 1 y 2, la hemorragia máxima es similar a la de clopidogrel, aunque el clopidogrel se ensaya en una DE100 múltiplo de 2-4 y GBR600 en un múltiplo hasta 250. En el Estudio 3, se observa una hemorragia insignificante con todas las
10 dosis inyectadas.

Tabla 27. Test de Hemorragia Incisional con GBR600 [múltiplos del valor de la solución salina]
Dosis (mg/kg)
Dosis Acumulada (mg/kg) Estudio 1 Estudio 2 Estudio 3
Línea base
0 n.a. n.a. n.a.
Solución salina
0 1 1 1
0,005
0,005
n.a. n.a. 0,13
0,005
0,01 n.a. n.a. 0,08
0,01
0,02 n.a. n.a. 0,05
0,01
0,03 n.a. n.a. 0,05
0,01
0,04 n.a. n.a. 0,02
0,01
0,05 n.a. n.a. 0,03
0,01
0,06 n.a. n.a. n.d.
0,01
0,07 n.a. n.a. n.d.
0,01
0,01
n.a. 2,5 n.a.
0,03
0,03/0,04 0,125 0,5 n.a.
0,1
0,13/0,14 0,625 4,75 n.a.
0,3
0,43/0,44 3,125 7,75 n.a.
1
0,143/1,44 7,625 5,75 n.a.
10
11,43/11,44 4 1,75 n.a.

Tabla 28. Test de Hemorragia Incisional con Clopidogrel [múltiplos del valor de la solución salina]
Dosis (mg/kg)
Dosis Acumulada (mg/kg) Babuino 1 Babuino 2 Babuino 3
Línea base
0 n.a. n.a. n.a.
Solución salina
0 1 1 1
1
1
1,59 1,21 1,28
1,5
2,5 1,06 1 1,1
2,5
5 1,41 6,64 3,32
5
10 5,82 13,64 0,95
10
20 9,12 2,64 0,92
Ventana Terapéutica y Clasificación BleedScore de GBR600: En la Figura 10, los resultados del test de
5 hemorragia por incisión del Estudio 1 y 2 y los tres estudios de clopidogrel se representan gráficamente contra las dosis de GBR600 y clopidogrel (las dosis se expresan como múltiplos de sus valores DE100 y se representan gráficamente en escala logarítmica).
GBR600, incluso a dosis mayores que 100 veces su valor DE100, causa hemorragia a un nivel observado en clopidogrel sólo hasta 4 veces su DE100. Inesperadamente, GBR600 tiene una ventana terapéutica de seguridad sin
10 precedentes en términos de riesgo de hemorragia.
El único aumento clínicamente relevante en hemorragia observado en este estudio es un aumento en la hemorragia auto-limitante de cortes superficiales como se determina por los métodos de hemorragia del modelo y hemorragia incisional. Los animales se observan cuidadosamente durante un periodo de 48 horas después de la operación quirúrgica y no se detecta signo adicional alguno de hemorragia superficial tal como amoratamiento fácil, petequia o
15 equimosis. Más importante es la ausencia de signos de hemorragia interna tales como hematoma, epistaxis, pérdida de sangre por boca, vagina, melena, hemorragia oftálmica, hematuria y hematemesis. La herida por operación no sangraba y se curaba normalmente.
Tanto clopidogrel como GBR600 tienen un registro de 1 en el esquema de registro BleedScore, como se muestra en la Tabla 29. Aparte de la hemorragia incrementada en las heridas superficiales, no se detecta ningún otro síntoma
20 en los animales durante el experimento o durante un periodo de observación de 48 horas después de la conclusión de los estudios.

Tabla 29. Determinación BleedScore para Clopidogrel y GBR600
Determinación de BleedScore
Gravedad de la Hemorragia
Síntomas Registro Clopidogrel GBR600
Hemorragia Superficial
Amoratamiento fácil 1 0 0
Hemorragia por pequeños cortes
1 1 1
Petequia
1 0 0
Equimosis
1 0 0
Hemorragia Interna
Hematoma 3 0 0
Epistaxis
3 0 0
Pérdida de sangre por boca, melena
3 0
Melena
3 0 0
Hemorragia oftálmica
3 0 0
Hematuria
3 0 0
Hematemesis
3 0 0
Hemorragia Alarmante
Necesidad de Transfusión 6 0 0
Intracraneal
6 0 0
Amenazante para la vida
6 0 0
BleedScore
1 1
Hallazgos de los Estudios de Eficacia y Seguridad: Las Tablas 30-32 muestran el efecto de GBR600 sobre los niveles de vWF, niveles de Factor VIII, recuento de Glóbulos Blancos, concentración de Hemoglobina (Hb), recuento 5 de Plaquetas (Plt), tiempo de Protrombina (PT) y Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (aPTT) en los estudios 1 a 3.
Con relación a los niveles de von Willebrand obtenidos en los Estudios 1 a 3, no se observa patrón alguno en el Estudio 1, pero en los Estudios 2 y 3 se observa una disminución clara en los niveles de von Willebrand. En el Estudio 2, en el que se utilizan dosis mucho mayores, el efecto es más pronunciado que en el Estudio 3, en el que
10 se utilizan dosis relativamente bajas. En el estudio con un anticuerpo IgG4 monoclonal humanizado de control que no se fijaba a vWF, no se observa efecto alguno de los niveles von Willebrand. Este efecto y las implicaciones del mismo deberían monitorizarse cuidadosamente en estudios futuros. GBR600 no tenía un efecto acusado sobre los niveles de Factor VIII en todos los estudios.
Aunque se observa un aumento en WBC, este es un efecto conocido del procedimiento invasivo y está bien
15 correlacionado con los resultados observados para el anticuerpo IgG4 monoclonal de control que no se fija a vWF y todos los restantes fármacos testados hasta ahora en este modelo. No puede observarse efecto acusado alguno sobre la concentración de hemoglobina causado por la infusión de GBR600. Como efecto de la infusión de GBR600 sobre el recuento de plaquetas, durante estos procedimientos las plaquetas se consumen dado que la deposición de las plaquetas es responsable de la oclusión de la arteria durante las CFRs. La inhibición eficaz de las CFRs
20 disminuirá por tanto la cantidad de consumo de plaquetas. Esto explica el mayor consumo de plaquetas observado con el anticuerpo IgG4 monoclonal humanizado de control, que no se fija a vWF, donde no se observa inhibición alguna de CFRs.
Parece no haber efecto acusado alguno de GBR600 sobre PT y aPTT, que son indicadores de la integridad de las proteínas de la coagulación. Se observan resultados similares para el anticuerpo monoclonal IgG4 humanizado de
25 control que no se fija a vWF.

Tabla 30. Estudio 1
Línea base Solución salina 0,03mg/kg 0,1mg/kg 0,3mglkg 1,0mg/kg 10mg/kg
WBC x 109/l
7,48 6,92 7,89 9,32 11,57 12,29 11,52
RBC x 1012/l
5,7 5,88 5,75 5,86 5,83 5,79 5,8
Hemoglobina g/dl
13,4 14,3 14,1 14,1 14,4 14 14
Hematocrito l/l
40,5 43,5 42,5 43,5 43,4 0,4 41,4
MCV fl
71,1 74,0 73,9 74,2 74,4 74,6 71,4
MCH pg
23,5 24,3 24,5 24,1 24,7 24,2 24,1
MCMC g/dl
33,1 32,9 33,2 32,4 33,2 32,4 33,8
plt x 109/l
306 249 234 236 245 257 262
neut x 109/l
3,46 3,32 4,35 5,92 8,16 8,89 8,44
lymph x 109/l
3,62 3,21 3,04 2,80 2,75 2,88 2,32
monocitos x 109/l
0,36 0,36 0,46 0,58 0,61 0,50 0,73
eosinófilos x 109/l
0,03 0,02 0,04 0,03 0,03 0,01 0,02
basófilos x 109/l
0,01 0,01 0,01 0,00 0,01 0,01 0,01
PT
9 10 10 10,00 10 10 10
aPTT
42 42 44 43 42 42 45
F VIII
107 89 83 88 80 78 78
concentración de vWF
25 46 39 15 26 48 17
agregación, %
no no no no no no no
Tabla 31. Estudio 2
Línea base Solución salina 0,01mg/kg 0,03mgl/kg 0,1mg/kg 0,3mg/kg 1,0mg/kg 10mg/kg
WBC x 109/l
11,98 12,42 12,49 11,89 11,14 10,91 11,01 13,92
RBC x 1012/l
5,24 5,36 5,34 5,34 5,42 5,57 5,57 5,54
Hemoglobina g/dl
12,2 12,7 12,8 12,8 12,9 13,2 13,4 13,2
Hematocrito l/l
34,1 34,9 34,8 34,7 35,1 36,1 36,1 36,1
MCV fl
65,1 65,1 65,2 65,0 64,8 64,8 64,8 65,2
MCH pg
23,3 23,7 24,0 24,0 23,8 23,7 24,1 23,8
MCMC g/dl
35,8 36,4 36,8 36,9 36,8 36,6 37,1 36,6
plt x 109/l
313 281 276 281 287 283 283 268
neut x 109/l
9,37 9,44 9,12 8,60 8,03 7,98 8,15 11,33
lymph x 109/l
2,20 2,55 2,84 2,82 2,68 2,51 2,46 2,10
monocitos x 109/l
0,38 0,40 0,47 0,42 0,37 0,36 0,32 0,38
eosinófilos x 109/l
0,01 0,02 0,05 0,04 0,04 0,05 0,08 0,10
basófilos x 109/l
0,01 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01
PT
9 9 9 9 9 9 9 9
aPTT
55 ?>120 53 60 61 55 55 58
F VIII
49 56 48 54 54 56 58 68
concentración de vWF
34 31 28 21 16 14 14 10
agregación, %
no no no no no no no

Tabla 32. Estudio 3
Línea base Solución salina 0,005mg/kg 0,01mg/kg 0,02mg/kg 0,03mg/kg 0,04mg/kg 0,05mg/kg 0,06mg/kg 0,07mg/kg
WBC x 109/l
4,97 5,63 5,10 6,36 7,22 8,8 11,56 13,5 14,06 14,38
RBC x 1012/l
6,13 6,25 6,2 6,1 6,22 6,19 6,27 6,17 6,16 5,65
Hemoglobinag/dl
14,0 14,6 14,8 14,7 14,5 14,4 14,7 14,7 14,8 13,5
Hematocrito l/l
44,1 45,2 46,4 45,8 45,1 44,7 45,2 46,6 46,5 42,7
MCV fl
71,9 72,3 74,8 75,1 72,5 72,2 72,1 75,5 75,5 75,6
MCH pg
22,8 23,4 23,9 24,1 23,3 23,3 23,4 23,8 24,0 23,9
MCMC g/dl
31,7 32,3 31,9 32,1 32,2 32,2 32,5 31,5 31,8 31,6
plt x 109/l
373 331 327 342 342 334 360 321 318 286
neut x 109/l
3,21 3,83 3,11 4,13 5,26 6,85 9,73 11,80 12,36 12,80
lymph x 109/l
1,59 1,54 1,73 1,97 1,60 1,56 1,45 1,38 1,34 1,14
monocitos x 109/l
0,15 0,23 0,20 0,25 0,34 0,36 0,36 0,31 0,37 0,42
eosinófilos x 109/l
0,01 0,01 0,05 0,00 0,01 0,02 0,01 0,00 0,00 0,01
basófilos x 109/l
0,01 0,01 0,00 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 0,00 0,01
PT
9 9 8 8 9 9 9 9 9 10
aPTT
39 41 40 40 39 39 39 38 41 42
F VIII
84 79 80 88 80 85 82 80 85 81
concentración de vWF
53 50 48 51 46 44 42 35 36 35
agregación, %
no no no no no no no
GBR600 parece ser un inhibidor potente de la deposición de las plaquetas durante la trombosis arterial. La epinefrina no invertía la inhibición, como lo hace con clopidogrel. No se observa hemorragia adversa grave alguna con GBR600, aun cuando el fármaco se infunde a lo que realmente parece ser una dosis de hasta 250 veces la dosis eficaz. A estas dosis, la hemorragia medida por el modelo de hemorragia incisional producía resultados similares a clopidogrel infundido a 4 hasta 8 veces la dosis eficaz. GBR600 no tenía efecto alguno sobre las proteínas de la coagulación, como se muestra en los resultados de PT y aPTT. Sin embargo, existe una disminución en los niveles de Factor von Willebrand. No se observa efecto claro alguno sobre los niveles de Factor VIII, sin embargo. Esto no precisa ser un problema, dado que la warfarina inhibe el sistema de coagulación por disminución de los niveles circulantes de las proteínas de la coagulación funcionales dependientes de la vitamina K. No se observó efecto inesperado alguno sobre los parámetros de Recuento Total de Glóbulos (WBC, Hb y Plt) en este estudio.
Ejemplo 11: Estabilidad térmica de las variantes humanizadas de NMC-4
La estabilidad térmica de las variantes humanizadas de NMC-4, del fragmento FAB de NMC-4 murino y de una NMC4-IgG1 quimérica se comparó utilizando medidas calorimétricas. Los perfiles de fusión de los anticuerpos monoclonales son característicos de sus isotipos (Garber y Demarest (2007), BBRC 355: 751-7); sin embargo, la temperatura de fusión en el punto medio del fragmento FAB puede identificarse fácilmente incluso en el contexto de una IgG de longitud total. Dicha fusión en el punto medio de la porción FAB se utilizó para monitorizar la estabilidad monoclonal de los candidatos humanizados.
Se llevaron a cabo medidas calorimétricas en un microcalorímetro de barrido diferencial VP-DSC (MicroCal, Northampton, Reino Unido). El volumen de células era 0,128 ml; la tasa de calentamiento era 1ºC/min; y el exceso de presión se mantuvo a 64 psi. (441,3 kPa). Todos los fragmentos de proteínas se utilizaron a una concentración de 1-0,5 mg/ml (74 μM) en PBS (pH 7,4). La capacidad calorífica molar de cada proteína se estimó por comparación con muestras duplicadas que contenían el mismo tampón del que se había omitido la proteína. Las capacidades térmicas molares parciales y curvas de fusión se analizaron utilizando procedimientos estándar. Los termogramas se corrigieron por la línea base y la concentración se normalizó antes de ser analizada ulteriormente utilizando un modelo Non-Two State en el software Origin v7.0. Un ejemplo de los datos obtenidos para H14L10-IgG4 como se describe en el Ejemplo 3 se muestra en la Figura 12. El fragmento FAB murino de NMC-4 exhibe una sola transición a 74,7ºC, mientras que la transición del fragmento FAB H14L10-IgG4 aparece a 81,1ºC, lo que corresponde a una diferencia de estabilidad significativa (6,4ºC). Para determinar la influencia de los dominios constantes de FAB humano, se preparó una quimera consistente en los dominios variables de NMC-4 murino injertados en la IgG1 humana (el isotipo humano más estable; Garber y Demarest (2007), BBRC 355:751-7). Los valores Tm de FAB aparentes para H14L10-IgG4 y NMC4-IgG1 quimérico (79,1ºC) exhiben todavía un aumento significativo de estabilidad para H14-L10 FAB (delta Tm > 1ºC).
Ejemplo 12: Clonación de los genes codificantes de la cadena pesada (VH9) y la cadena ligera (VL9) de GBR600
Los materiales y métodos utilizados para clonación de los genes codificantes de GBR600 eran los siguientes:
PfuUltra (Stratagene, Cat.-No.: 600380)
Spel (NEB, Cat.-No.: R0133)
Hindlll (NEB, Cat.-No.: R0104)
CIP (NEB, Cat.-No.:M0290)
pCR-romo (Invitrogen, Cat.-No.: 44-0302)
Cebadores: Operon, Colonia, Alemania
GLNPR107: TAACTAGTCGTGAGGCTCCGGTGCCCGTC
GLNPR108: AAGCTTACGGCTAGCTCACGACACCTGAAATGGAAG
GLNPR139: CCTCAGACAGTGGTTCAAAG
GLNPR 176 GCTAGCGCCACCATGGAGACAGACACAC
GLNPR 177 TAAGCTTCTATCATTTACCCAGAGACAGGG
GLNPR 178 TAAGCTTCTATCAACACTCTCCCCTGTTG
BGHREV: Proporcionado por Fasteris
Vectores TMC pCl-NMC4-VL9 (p156) y pCl-NMC4-VH9 (p158) proporcionados por Chromos. Qiaquick Gel extraction kit (Qiagen, Cat.-No.: 28706)
Escalera 1kb+ (Fermentas, Cat.-No.:R0491)
pcDNA3.1(-) (Invitrogen, Cat.-No.: V795-20)
pEF-Dest51[CD19] (RZPD, Cat.-No.: RZPDo839G0167-pEF-DEST51) Secuenciación : Fasteris SA (Ginebra, Suiza)
Kit Gigaprep (Macherey-Nagel, Cat.-No.: Nucleobond PC10000)
Clonación del vector de expresión pEFcDNA3.1
El vector de expresión pEFcDNA se creó por reemplazamiento del promotor CMV de pcDNA 3.1(-) (Invitrogen) con el promotor EF1-alfa de pEF-DEST51. Para este propósito, el promotor EF1-alfa se amplificó utilizando los cebadores GLNPR107 y 108 utilizando PfuUltra (Stratagene, temperatura de reasociación 55ºC, 30 ciclos). Los cebadores amplifican el promotor EF1-alfa completo y fijan un lado SpeI en el extremo 5' y un lado HindIII en el extremo 3' del fragmento amplificado. El amplicón PCR se clonó en pCR-romo (Invitrogen) y los clones se analizaron por una digestión con SpeI/HindIII. El fragmento SpeII/HindIII del clon #4 se cortó y se clonó en la cadena principal de pcDNA 3.1(-) que se digirió utilizando la misma combinación de enzimas y CIPed. Los clones se analizaron utilizando SpeI y HindIII y el clon #2 parecía ser positivo. Una segunda digestión con la cadena principal y la inserción confirmó ulteriormente el tamaño correcto del fragmento promotor.
Clonación de GBR600 en pEFcDNA
Se amplificó GBR600 VH9 utilizando Pfu Ultra (condiciones estándar, temperatura de reasociación 55ºC, 30 ciclos) y los cebadores GLNPR176 y 177. El modelo era el vector de TMC p156. Se amplificó GBR600 VL9 utilizando los cebadores GLNPR176 y 178 como se describe para la cadena pesada. El modelo utilizado era el vector de TMC p158. Los cebadores añaden un sitio de restricción NheI 5' y un sitio de restricción HindIII 3' al amplicón respectivo. Los fragmentos PCR obtenidos se clonaron en pCR-romo y se analizaron por digestión de restricción utilizando NheI y HindIII. El clon #1 para la cadena ligera y el clon #3 para la cadena pesada se cortaron y se clonaron en pEFcDNA que se abrió utilizando las enzimas NheI y HindIII y CIPed. La digestión de restricción demostró que el clon #1 para la cadena ligera y el clon #6 para la cadena ligera contenían fragmentos del tamaño correcto. Estos dos clones se enviaron a Fasteris para control de la secuenciación como muestras GS256 y GS257. Los archivos de secuenciación se alinearon con secuencias de referencia. Debido a la mala calidad del DNA miniprep, la secuencia de la cadena pesada GS257 no pudo confirmarse al 100%. Los plásmidos que codificaban la cadena pesada VH9 de GBR600 (GS257) y la cadena ligera de GBR600 VL9 (GS256) se utilizaron para la preparación de Gigapreps. Las preparaciones plasmídicas se enviaron de nuevo para confirmación de la secuencia a Fasteris. Los nombres de las muestras esta vez eran GS265 para VH9 de la cadena pesada de GBR600 y GS264 para VL9 de la cadena ligera de GBR600. Debido a la mejor calidad del DNA, la identidad de la secuencia respecto a la secuencia de referencia pudo confirmarse para las cadenas pesada y ligera.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Glenmark Pharmaceuticals, S.A. 5 <120> Anticuerpos humanizados específicos para el factor von Willebrand.
<130> 16708/PCT
<160> 238 10
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 218 15 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> NMC-4 (cadena pesada del mAb murino) 20
<400> 1
<210> 2
<211> 208
<212> PRT 5 <213> artificial
<220>
<223> NMC-4 (cadena ligera del mAb murino)
10 <400> 2
15 <210> 3
<211> 65
<212> PRT
<213> artificial
20 <220>
<223> VH de línea germinal humana, 4-59
<400> 3
<210> 4
<211> 122 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Anticuerpo Humano AAC18165.1 10
<400> 4 <210> 6
15
<210> 5
<211> 88
<212> PRT
<213> artificial
20
<220>
<223> VL de la línea germinal humana, 018
<400> 5
25
<211> 107 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223>Anticuerpo Humano AAK94808 10
<400> 6
15
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
20
<220>
<223> HDCDR1
<400> 7
25
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HCDR2
<400> 8
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HCDR3
<400> 9
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LCDR1
<400> 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LCDR2
<400> 11
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> LCDR3
<400> 12
<210> 13
<211> 122
<212> PRT
<213> artificial
5
<220>
<223> H2
<400> 13
10
<210> 14
<211> 122 15 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> H4 20
<400> 14
<210> 15
<211> 122 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> H5 10
<400> 15
<210> 16
<211> 122
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> H6
<400> 16
10 <210> 17
<211> 122
<212> PRT
<213> artificial
15 <220>
<223> H7
<400> 17
<210> 18
<211> 122 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> H8 10
<400> 18
<210> 19
<211> 122
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> H9
<400> 19
<210> 20 10 <211> 122
<212> PRT
<213> artificial
<220> 15 <223> H12
<400> 20
<210> 21
<211> 122 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> H13 10
<400> 21
15 <210> 22
<211> 122
<212> PRT
<213> humano
20 <220>
<221> H14
<222> (1)..(122)
<400> 22 25
<210> 23
<211> 107 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> L5 10
<400> 23
15
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
20
<220>
<223> L4
<400> 24
<210> 25
<211> 107
<212> PRT 10 <213> artificial
<220>
<223> L6
15 <400> 25
20 <210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> L7
<400> 26
<210> 27
<211> 107 10 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> L8 15
<400> 27
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> L9
<400> 28
<210> 29 10 <211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220> 15 <223> L10
<400> 29
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> L11
<400> 30
<210> 31
<211> 6
<212> DNA
<213> artificial 15
<220>
<223> Elemento de transcripción
<220> 20 <221> característica mixta
<222> (2)..(2)
<223> n es a, c, g, o t
<400> 31
25 cncaat 6
<210> 32
<211> 6 30 <212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Elemento de transcripción 1 35
<400> 32
aataaa 6
40 <210> 33
<211> 1602
<212> DNA
<213> artificial
45 <220>
<223> Clon IMAGE #4764579
<400>
33
<400>
35 cggatgggcc cttggtggaa gcgctgctca cggtcacgct ggt 43
5 10
<210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> artificial <220> <223> NMC-VH-coRI-F
15
<400> 34 gacgcgaatt cgcaggtgca gctgaaggag agc 33
20
<210> 35 <211> 43 <212> DNA <213> artificial
<220> <223> NMC-VH-gG4lgG1-R
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> hlgG-F
<400> 36 gcttccacca agggcccatc cg 22
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> hlgG-R
<400> 37 cagagacagg gagaggctct tctg 24
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> hlgG BamH1-R
<400> 38 attaggatcc ttatcattta cccagagaca gggagaggct 40
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> hFc-L235E-F
<400> 39 ctcgaggggg gaccgtcagt cttcctctt 29
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> lgG1-L235E-R
<400> 40 aagaggaaga ctgacggtcc cccctcgag 29
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CH2-C1q(-)-F
<400> 41
ggcgtacgcg tgcgcggtct ccaacaaagc 30
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> CH2-C1q(-)-R
<400> 42
ccgcgcacgc gtacgccttg ccattcagcc a 31
<210> 43
<211> 96
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 4-59 conductora-Hindlll-NMC-4
<400> 43 <220>
<210> 44 <211> 36 <212> DNA <213> artificial
<220> <223> lgG1-BamHl-R
<400> 44
taaggatcct tatcatttac ccggagacag ggagag
36
<210> 45 <211> 34 <212> DNA <213> artificial
<220> <223> NMC-VL-EcoRl-F
<400> 45
gacgcgaatt cggacatcca gatgacccag agcc
34
<210> 46 <211> 48 <212> DNA <213> artificial
<223> NMC-VL-Kappa-R
<400> 46 gaagacagat ggtgcagcca cagttcgctt cacctccagc ttggtgcc 48
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Kappa-F
<400> 47 cgaactgtgg ctgcaccatc tgtctt 26
<210> 48
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Kappa-BamHl-R
<400> 48 aattcggatc cttactaaca ctctcccctg ttgaagctct t 41
<210> 49
<211> 48
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Hind lll-Ko-AJW-F
<400> 49 gttaagcttg ccgccaccat ggattttggg ctgatttttt ttattgtt 48
<210> 50
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HuFab-H-R
<400> 50 gaatgggccc ttggtggaag cggaggaaac ggtcacgagg gta 43
<210> 51
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Xhol-Ko-AJW-F
<400> 51 aatctcgagg ccgccaccat gagtgtgccc actcaggtcc tgg 43
<210> 52
<211> 56
<212> PRT 5 <213> artificial
<220>
<223> NMC-4 VL
10 <400> 52
15 <210> 53
<211> 65
<212> PRT
<213> artificial
20 <220>
<223> NMC-4 VH
<400> 53
<210> 54
<211> 98
<212> DNA 30 <213> artificial
<220>
<223> 4-59 huNMC-F
35 <400> 54 <210> 55
<211> 43
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Hu-VH-R
<400> 55
ggatgggccc ttggtggaag cggaggaaac ggtcacgagg gta 43
<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> pcDNA6-F
<400> 56
cactgcttac tggcttatcg aaatta 26
<210> 57
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> VH-93A-For
<400> 57
gacaccgctg tttactactg cgctcgtgac ccggctgact 40
<210> 58
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> VH-V93A-Rev
<400> 58
agtcagccgg gtcacgaccg cagtagtaaa cagcggtgtc 40
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HC-L67V-F
<400> 59
ctgaaatccc gtgttaccat ctccaaagac 30
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HC-L67V-R
<400> 60
gtctttggag atggtaacac gggatttcag 30
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HC-N73T-F
<400> 61
accatctcca aagacacctc caaaaac 27
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HC-N73T-R
<220>
<221> HC-N73T-R
<222> (1)..(27)
<400> 62
gtttttggag gtgtctttgg agatggt 27
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HC-V78F-F
<400> 63
aactccaaaa accagttctc cctgaaac 28
<210> 64
<211> 28
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HC-V78F-R
<400> 64
gtttcaggga gaactggttt ttggagtt 28
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HC-K71V-F(H9)
<400> 65
cttaccatct ccgtagacaa ctccaaaaac 30
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HC-K71V-R
<400> 66 gtttttggag ttgtctacgg agatggtaag 30
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> hu-VH-K71V-F(H9)
<400> 67 cgtgttacca tctccgtaga cacctccaaa 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> hu-VH-K71V-R(H9)
<400> 68 tttggaggtg tctacggaga tggtaacacg 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Fab-L-For
<400> 69 atacatatgg acatccagat gacccagagc 30
<210> 70
<211> 36
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Fab-L-Rev
<400> 70 agactcgagt tatcaacact ctcccctgtt gaagct 36
<210> 71
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> NMC4-VL-EcoRl-F
<400> 71
gacgcgaatt cggacatcca gatgacccag agcc 34
<210> 72
<211> 14
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 5'-IRES
<400> 72
agctggttta gtga 14
<210> 73
<211> 17
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 3'-IRES
<400> 73
caagcggctt cggccag 17
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> LC-Y49F-F
<400> 74
ccaagctgct gatcttctac acca 24
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> LC-Y49F-R
<400> 75
tggtgtagaa gatcagcagc ttgg 24
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> LC-F83l-F
<400> 76
cagcccgagg acatcgccac ctactactgc
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> LC-F83l-R
<400> 77 gcagtagtag gtggcgatgt cctcgggctg
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> LC-P44V-F
<400> 78 aagcccggca aggccgtcaa gctgctgatc
<210> 79
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> LC-P44V-R
<400> 79 gatcagcagc ttgacggcct tgccgggctt
<210> 80
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> LC-F49Y-F
<400> 80 gccgtcaagc tgctgatcta ctacaccag
<210> 81
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> LC-F49Y-R
<400> 81 ctggtgtagt agatcagcag cttgacggc
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> LC-Y71F-F
<400> 82
ggcagcggca ccgacttcac cctgaccatc 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> LC-Y71F-R
<400> 83
gatggtcagg gtgaagtcgg tgccgctgcc 30
<210> 84
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HuLC-V44P, F49Y-F
<400> 84
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactac accag 35
<210> 85
<211> 35
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> HuLC-V44P, F49Y-R
<400> 85
ctggtgtagt agatcagcag cttgggggcc ttgcc 35
<210> 86
<211> 48
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> huL10-F
<400> 86
accatcacct gccaagccag ccaggacatc agcaactacc tgaactgg 48
<210> 87
<211> 48
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> huL10-R
<400> 87
ccagttcagg tagttgctga tgtcctggct ggcttggcag gtgatggt 48
<210> 88
<211> 48
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> huL11-F
<400> 88 cccaagctgc tgatctacga cgccagcaac ctggaaaccg gcgtgccc 48
<210> 89
<211> 48
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> huL11-R
<400> 89 gggcacgccg gtttccaggt tgctggcgtc gtagatcagc agcttggg 48
<210> 90
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> huH12-F
<400> 90 gtttccggtg gctccatctc cgactacggt gttgactgga 40
<210> 91
<211> 40
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> huH12-R
<400> 91 tccagtcaac accgtagtcg gagatggagc caccggaaac 40
<210> 92
<211> 47
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> huH13-F
<400> 92 gtttccggtg gctccatctc cgatacggtt gggactggat ccgtcag 47
<210> 93
<211> 48
<212> DNA <213> artificial
<220> <223> huH13-R
<400> 93
ctgcaggatc cagtcccaac cgtagtcgga gatggagcca ccggaaac
48
<210> 94 <211> 35 <212> DNA <213> artificial
<220> <223> huH14-F
<400> 94
gttccaccga ctacaacccc tctctgaaat cccgt
35
<210> 95 <211> 35 <212> DNA <213> artificial
<220> <223> huH14-R
<400> 95
acgggatttc agagaggggt tgtagtcggt ggaac
35
<210> 96 <211> 48 <212> DNA <213> artificial
<220> <223> huH15-F
<400> 96
gtttccggtg gctccatctc ctcctactat tggtcctgga tccgtcag
48
<210> 97 <211> 48 <212> DNA <213> artificial
<220> <223> huH15-R
<400> 97
ctgacggatc caggaccaat agtaggagga gatggagcca ccggaaac
48
<210> 98 <211> 51 <212> DNA <213> artificial
<220> <223> huH16-F
<400> 98 gaatggatcg gttatatcta ttattccggt tccaccaact acaacccctc t 51
<210> 99
<211> 51
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> huH16-R
<400> 99 agaggggttg tagttggtgg aaccggaata atagatataa ccgatccatt c 51
<210> 100
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> lgKLF
<400> 100 cctatctcga gaagcttcca ccatggagac agacacactc ct 42
<210> 101
<211> 55
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> lgKHnmcR
<400> 101 acccggaccg gattcctgca gctgcacctg tccagtggaa cctggaaccc agagc 55
<210> 102
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 14VHF
<400> 102 caggtgcagc tgcaggaatc cggtccg 27
<210> 103
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 14VHR
<400> 103 cctatgcggc cgcgggccct tggtggaagc ggaggaaacg gt 42
<210> 104
<211> 55
<212> DNA <213> artificial
5
<220> <223> lgKLNMCR
<400> 104
gctgctgggg ctctgggtca tctggatgtc tccagtggaa cctggaaccc agagc
55
15
<210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> artificial <220> <223> 10VLF
<400> 105
gacatccaga tgacccagag cc
22
25
<210> 106 <211> 47 <212> DNA <213> artificial
<220> <223> hKcR
<400> 106
cctatgcggc cgcggatcct atcaacactc tcccctgttg aagctct
47
35
<210> 107 <211> 21 <212> PRT <213> artificial
<220> <223> Secuencia lg conductora
<400> 107
<210> 108
<211> 973
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Clon I.M.A.G.E ar#4704496
55 <400> 108 <210> 109
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Secuencia conductora de la línea germinal humana 4-59 VH
<400> 109
<210> 110
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> H15 CDRH1
<400> 110
<210> 111
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> H14 CDRH1
<400> 111 <210> 112
<211> 29
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> VWf-A1-For
<400> 112
cccaggaatt cctcggaacc gcgttgcac 29
<210> 113
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> VWF-A1-Rev
<400> 113
ccgatgcggc cgctcacctc ttgggcccca g 31
<210> 114
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Rat-VWF-Al-F
<400> 114
agcgaattcc cccgaacccc ccctgcacaa cttc 34
<210> 115
<211> 42
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Rat-VWPVWF-Al-R
<400> 115
agtgcggccg cttatcacct tttgggtcct ggtgatgaaa cc 42
<210> 116
<211> 426
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Anticuerpo Humano AAC18165.1 (número de acceso de mRNA AF062129.1)
<400> 116
<210> 117
<211> 322 5 <212> DNA
<213> artificial
<220>
<223>Anticuerpo Humano AAK94808 (mRNA) 10
<400> 117
15 <210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial
20 <220>
<223> línea germinal humana 018 CDR-L2
<400> 118
<210> 119
<211> 16
<212> PRT 30 <213> artificial
<220>
<223> VH4-59 CDR H2
35 <400> 119
<210> 120 40 <211> 321
<212> DNA
<213> artificial
<220> 45 <223> L5 DNA
<400> 120
5
<210> 121
<211> 321
<212> DNA
<213> artificial
10
<220>
<223> L4 (DNA)
<400> 121
15
<210> 122
<211> 321 20 <212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> L6 (DNA) 25
<400> 122
30 <210> 123
<211> 321
<212> DNA
<213> artificial
35 <220>
<223> L7 (DNA)
<400> 123
<210> 124
<211> 321 5 <212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> L8 (DNA) 10
<400> 124
15 <210> 125
<211> 321
<212> DNA
<213> artificial
20 <220>
<223> L9 (DNA)
<400> 125
<210> 126
<211> 321
<212> DNA 30 <213> artificial
<220>
<223> L10 (DNA)
35 <400> 126
<210> 127
<211> 321 5 <212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> L11 (DNA) 10
<400> 127
15 <210> 128
<211> 369
<212> DNA
<213> artificial
20 <220>
<223> H2 (DNA)
<400> 128
<210> 129
<211> 369
<212> DNA 30 <213> artificial
<220>
<223> H4 (DNA)
35 <400> 129
<210> 130
<211> 369 5 <212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> H5 (DNA) 10
<400> 130
15 <210> 131
<211> 369
<212> DNA
<213> artificial
20 <220>
<223> H6 (DNA)
<400> 131
<210> 132
<211> 369
<212> DNA 30 <213> artificial
<220>
<223> H7 (DNA)
35 <400> 132 <212> DNA
<213> artificial
<220> 10 <223> H8 (DNA)
<400> 133
<210> 134
<211> 369
<212> DNA 20 <213> artificial
<220>
<223> H9 (DNA)
25 <400> 134
<210> 135 30 <211> 369
<212> DNA
<213> artificial
<220> 35 <223> H12 (DNA)
<400> 135
<210> 136
<211> 369 5 <212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> H13 (DNA) 10
<400> 136
15
<210> 137
<211> 369
<212> DNA
<213> artificial
20
<220>
<223> H14 (DNA)
<400> 137
25
<210> 138
<211> 369 30 <212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> H15 (DNA) 35
<400> 138
<210> 139
<211> 369 5 <212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> H16 (DNA) 10
<400> 139 <210> 143
15 20
<210> 140 <211> 60 <212> DNA <213> artificial <220> <223> VL-conductora (DNA)
25
<400> 140 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactgga 60
30
<210> 141 <211> 321 <212> DNA <213> artificial
35
<220> <223> Región constante kappa (DNA) <400> 141
<210> 142
<211> 78
<212> DNA
<213> artificial
5
<220>
<223> VH-conductora (DNA)
<400> 142
10
<211> 993 15 <212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Región constante de lgG1(DNA) 20
<400> 143
25 <210> 144
<211> 997
<212> DNA
<213> artificial
30 <220>
<223> Región constante de lgG4 (DNA)
<220>
<221> Región constante de lgG4 (DNA) 35 <222> (1)..(997)
<400> 144
5 <210> 145
<211> 122
<212> PRT
<213> artificial
10 <220>
<223> H15
<400> 145
<210> 146
<211> 122
<212> PRT
<213> artificial
5
<220>
<223> H16
<400> 146
10
<210> 147
<211> 25 15 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-04, región marco 1) 20
<400> 147
25 <210> 148
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
30 <220>
<223> VH4 (4-04, región marco 2
<400> 148
<210> 149
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-04, región marco 3)
<400> 149
<210> 150
<211> 25
<212> PRT 15 <213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-28, región marco 1)
<400> 150
<210> 151 25 <211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-28, región marco 2)
<400> 151
35
<210> 152 <211> 32 <212> PRT <213> artificial
<220> <223> VH4 (4-28, región marco 3)
45
<400> 152
<210> 153
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-30.1, región marco 1)
<400> 153
<210> 154
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-30.1, región marco 2)
<400> 154
<210> 155
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
25 <220>
<223> VH4 (4-30.1, región marco 3)
<400> 155
<210> 156
<211> 25
<212> PRT 35 <213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-30.2, región marco 1)
<400> 156
<210> 157 45 <211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-30.2, región marco 2)
<400> 157
<210> 158
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-30.2, región marco 3)
<400> 158
15
<210> 159 <211> 25 <212> PRT <213> artificial
<220> <223> VH4 (4-30.4, región marco 1)
25
<400> 159
<210> 160
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-30.4, región marco 2)
<400> 160
<210> 161
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
45 <220>
<223> VH4 (4-30.4, región marco 3)
<400> 161
<210> 162
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-31, región marco 1)
<400> 162
<210> 163
<211> 14 15 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-31, región marco 2)
<400> 163
25 <210> 164
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-31, región marco 3)
<400> 164
<210> 165
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-34, región marco 1)
45 <400> 165
<210> 166
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-34, región marco 2)
<400> 166
<210> 167
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-34, región marco 3)
<400> 167
<210> 168
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-39, región marco 1)
<400> 168
<210> 169
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-39, región marco 2)
<400> 169
<210> 170
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-39, región marco 3)
<400> 170
<210> 171
<211> 25 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-59, región marco 1) 10
<400> 171
15 <210> 172
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
20 <220>
<223> VH4 (4-59, región marco 2)
<400> 172
<210> 173
<211> 32
<212> PRT 30 <213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-59, región marco 3)
35 <400> 173
40 <210> 174
<211> 25
<212> PRT
<213> artificial
45 <220>
<223> VH4 (4-61, región marco 1)
<400> 174
<210> 175
<211> 14 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-61, región marco 2) 10
<400> 175
15 <210> 176
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
20 <220>
<223> VH4 (4-61, región marco 3)
<400> 176
<210> 177
<211> 25
<212> PRT 30 <213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-b, región marco 1)
35 <400> 177
< 210> 178 40 <211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220> 45 <223> VH4 (4-b, región marco 2)
<400> 178 <210> 179
<211> 32 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VH4 (4-b, región marco 3) 10
<400> 179
15 <210> 180
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
20 <220>
<223> VK1 (012, región marco 1)
<400> 180
<210> 181
<211> 15
<212> PRT 30 <213> artificial
<220>
<223> VK1 (012, región marco 2)
35 <400> 181
<210> 182 40 <211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220> 45 <223> VK1 (012 , región marco 3)
<400> 182 <210> 183
<211> 23 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (02, región marco 1) 10
<400> 183
15 <210> 184
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
20 <220>
<223> VK1 (02, región marco 2)
<400> 184
<210> 185
<211> 32
<212> PRT 30 <213> artificial
<220>
<223> VK1 (02 , región marco 3)
35 <400> 185
40 <210> 186
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
45 <220>
<223> VK1 (AnticuerpoAAK94808 derivado de 018 , región marco 1)
<400> 186 <210> 187
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (AnticuerpoAAK94808 derivado de 018 , región marco 2)
<400> 187
15 <210> 188
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (AnticuerpoAAK94808 derivado de 018 , región marco 3)
<400> 188
<210> 189
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (08, región marco 1)
35 <400> 189
<210> 190
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
45 <220>
<223> VK1 (08, región marco 2)
<400> 190
<210> 191
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (08 , región marco 3)
<400> 191
<210> 192
<211> 23 15 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (A20, región marco 1)
<400> 192
25 <210> 193
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (A20, región marco 2)
<400> 193
<210> 194
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (A20, región marco 3)
45 <400> 194
<210> 195
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (A30, región marco 1)
<400> 195
<210> 196
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220> 15 <223> VK1 (A30, región marco 2)
<400> 196
<210> 197
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (A30, región marco 3)
<400> 197
<210> 198
<211> 23 35 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L14, región marco 1)
<400> 198
45 <210> 199
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L14, región marco 2)
<400> 199
<210> 200
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L14, región marco 3)
<400> 200
<210> 201
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L1, región marco 1)
25 <400> 201
<210> 202
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220> 35 <223> VK1 (L1, región marco 2)
<400> 202
<210> 203
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L1, región marco 3)
<400> 203
<210> 204
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L15, región marco 1)
<400> 204
<210> 205 15 <211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L15,región marco 2)
<400> 205
25
<210> 206 <211> 32 <212> PRT <213> artificial
<220> <223> VK1 (L15, región marco 3)
35
<400> 206
<210> 207
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L4, región marco 1)
<400> 207
<210> 208
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L4, región marco 2)
<400> 208
<210> 209
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
15 <220>
<223> VK1 (L4 , región marco 3)
<400> 209
<210> 210
<211> 23
<212> PRT 25 <213> artificial
<220>
<223> VK1 (L18, región marco 1)
<400> 210
<210> 211 35 <211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L18, región marco 2)
<400> 211 <210> 213
45
<210> 212 <211> 32 <212> PRT <213> artificial
<220> <223> VK1 (L18, región marco 3)
55
<400> 212
<211> 23 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L5, región marco 1) 10
<400> 213
15 <210> 214
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
20 <220>
<223> VK1 (L5, región marco 2)
<400> 214
<210> 215
<211> 32
<212> PRT 30 <213> artificial
<220>
<223> VK1 (L5, región marco 3)
35 <400> 215
<210> 216 40 <211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220> 45 <223> VK1 (L19, región marco 1)
<400> 216
<210> 217
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L19, región marco 2)
<400> 217
15 <210> 218
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L19 , región marco 3)
<400> 218
<210> 219
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L8, región marco 1)
35 <400> 219
<210> 220
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220> 45 <223> VK1 (L8, región marco 2)
<400> 220
<210> 221
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L8, región marco 3)
<400> 221
<210> 222
<211> 23
<212> PRT 15 <213> artificial
<220>
<223> VK1 (L23, región marco 1)
<400> 222
<210> 223 25 <211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L12, región marco 2)
<400> 223
35
<210> 224 <211> 32 <212> PRT <213> artificial
<220> <223> VK1 (L23 , región marco 3)
45
<400> 224
<210> 225
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L9, región marco 1)
<400> 225
<210> 226
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L9, región marco 2)
<400> 226
<210> 227
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
25 <220>
<223> VK1 (L9, región marco 3)
<400> 227
<210> 228
<211> 23
<212> PRT 35 <213> artificial
<220>
<223> VK1 (L24, región marco 1)
<400> 228
<210> 229 45 <211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L24, región marco 2)
<400> 229
<210> 230
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L24, región marco 3)
<400> 230
<210> 231
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L11, región marco 1)
25 <400> 231
<210> 232
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial
<220> 35 <223> VK1 (L11, región marco 2)
<400> 232
<210> 233
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L11, región marco 3)
<400> 233
<210> 234
<211> 23
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L12, región marco 1)
<400> 234
<210> 235
<211> 15 15 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VK1 (L12 ,región marco n2) 20
<400> 235
25 <210> 236
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
30 <220>
<223> VK1 (L12, región marco 3)
<400> 236
<210> 237
<211> 449
<212> PRT 40 <213> artificial
<220>
<223> H9IgG4 (Cadena Pesada)
45 <400> 237
<210> 238
<211> 214 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> L9IgG4 (cadena ligera) 10
<400> 238

Claims (39)

  1. REIVINDICACIONES
    1.Un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo comprende
    (a)
    una secuencia de región variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 19; y
    (b)
    una secuencia de región variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 28.
  2. 2.Un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo comprende
    (a)
    una secuencia de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 237; y
    (b)
    una secuencia de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 238.
  3. 3.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo humanizado se fija a vWF con una afinidad (Kd) de 10 nM o menos.
  4. 4.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo humanizado compite para fijación a vWF con una afinidad (Ki) de 100 nM o menos.
  5. 5.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo humanizado se fija al dominio A1 de vWF con una afinidad (Kd) de 10 nM o menos.
  6. 6.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo humanizado compite para fijación al dominio A1 de vWF con una afinidad (Ki) de 100 nM o menos.
  7. 7.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo humanizado tiene una temperatura de termoestabilidad del fragmento FAB mayor que 65ºC.
  8. 8.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo humanizado tiene una temperatura de termoestabilidad del fragmento FAB mayor que el anticuerpo no humanizado paterno.
  9. 9.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo humanizado retiene la misma actividad que el anticuerpo no humanizado paterno o que un anticuerpo quimérico que comprende las regiones variables del anticuerpo no humanizado paterno y una región Fc humana.
  10. 10.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de la reivindicación 9, en donde la actividad se mide como actividad de aglutinación de las plaquetas inducida por ristocetina.
  11. 11.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo humanizado carece de función efectora.
  12. 12.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo humanizado comprende una región Fc derivada de IgG4.
  13. 13.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo humanizado es específico para el dominio A1 de vWF humano.
  14. 14.El anticuerpo humanizado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo humanizado es un anticuerpo de longitud total.
  15. 15.El fragmento de fijación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el fragmento de fijación es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo constituido por Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv, F(ab')2, y un diacuerpo.
  16. 16.Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de la reivindicación 2, que comprende la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena ligera del vector GS264 como se ha depositado en un microorganismo con DSMZ que tiene el No. de acceso DSM 21059 y la secuencia de ácido nucleico codificante de la cadena pesada del vector GS265 como se ha depositado en un microorganismo con DSMZ que tiene el No. de acceso DSM 21060.
  17. 17.Un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de la región variable de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 19 y una secuencia de la región variable de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 28.
  18. 18.Un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo específico para vWF que comprende una secuencia de cadena pesada como se indica en SEQ ID NO: 237 y una secuencia de cadena ligera como se indica en SEQ ID NO: 238.
  19. 19.Un vector que comprende el ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.
  20. 20.Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 o el vector de la reivindicación 19.
  21. 21.Un método de producción de un anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 20 de tal modo que el ácido nucleico se expresa y se produce el anticuerpo.
  22. 22.Una composición que comprende el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un portador farmacéuticamente aceptable.
  23. 23.Una composición que comprende un primer anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un segundo anticuerpo que se fija al dominio A1 de vWF.
  24. 24.La composición de la reivindicación 23, en donde el segundo anticuerpo es AJW-200.
  25. 25.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso como un medicamento que comprende administrar el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo en una cantidad terapéuticamente eficaz.
  26. 26.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en un método para tratar una enfermedad o trastorno mediado por vWF que comprende administrar el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo en una cantidad terapéuticamente eficaz.
  27. 27.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo para el uso de la reivindicación 25, en donde el medicamento se utiliza para tratar una enfermedad o trastorno mediado por vWF.
  28. 28.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo para el uso de la reivindicación 26 ó 27, en donde el trastorno mediado por vWF es una enfermedad o trastorno trombótico.
  29. 29.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo para el uso de la reivindicación 28, en donde el trastorno trombótico es una enfermedad cardiovascular o enfermedad cerebrovascular tal como ataque isquémico.
  30. 30.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo para el uso de la reivindicación 29, en donde la enfermedad cardiovascular es ateroesclerosis, restenosis, angina, infarto agudo de miocardio, síndrome coronario agudo o trastornos cardiovasculares asociados con diabetes.
  31. 31.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo para el uso de la reivindicación 28, en donde la enfermedad trombótica comprende inflamación vascular, trombosis venosa, enfermedad de células falciformes, rechazo de xenoinjerto, trastorno vascular periférico, púrpura trombocitopénica trombótica, fibrosis quística, demencia vascular, enfermedad de Raynaud, artritis reumatoide o diabetes.
  32. 32.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo para el uso de la reivindicación 29, en donde la enfermedad cerebrovascular es demencia vascular, ataque isquémico, o predicción de ataques recurrentes.
  33. 33.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para inhibir la agregación plaquetaria, pero insuficiente para causar signos clínicos significativos de hemorragia.
  34. 34.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz que oscila desde aproximadamente 1 a aproximadamente 250 veces la DE100 sin causar signos clínicos de hemorragia.
  35. 35.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo se administra por vía subcutánea.
  36. 36.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo se administra por vía intravenosa.
  37. 37.El anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, en donde el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo se administra por vía intravenosa en combinación con tratamientos radiológicos.
  38. 38.Un artículo de fabricación que comprende el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF.
  39. 39.Un kit que comprende el anticuerpo humanizado o fragmento de fijación del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por vWF.
    Figura 3
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