JP6250395B2 - α2インテグリンに結合するペプチド又はペプチド複合体並びにそれに関与する方法及び使用 - Google Patents
α2インテグリンに結合するペプチド又はペプチド複合体並びにそれに関与する方法及び使用 Download PDFInfo
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Description
この発明は、処置、予防又は診断に使用するための、α2インテグリン抗体、抗原結合性フラグメント及び他の結合分子、この結合分子をコードする1つ又はそれより多い核酸、結合分子を作製する組み換え細胞、この結合分子を作製する方法、医薬として使用するためのこの結合分子又は核酸(複数を含む)を含んでなる医薬組成物、α2インテグリンを検出する方法及びスクリーニング方法に関する。
a)LCDR1[ここで、LDR1は、RASESVESYGNSFIY(配列番号6(SEQ ID NO:6))又はその機能的に活性な変異体である]、
b)LCDR2[ここで、LDR2は、LASNLAS(配列番号7)又はその機能的に活性な変異体である]、
c)LCDR3[ここで、LDR3は、QQNNEDPYT(配列番号8)又はその機能的に活性な変異体である]、
d)HCDR1[ここで、HDR1は、GYTFTSYWMN(配列番号3)又はその機能的に活性な変異体である]、
e)HCDR2[ここで、HDR2は、RIDPSDSETHYNQKFK(配列番号4)又はその機能的に活性な変異体である]、及び
f)HCDR3[ここで、HDR3は、VGRGYFDY(配列番号5)又はその機能的に活性な変異体である]
を含んでなるペプチド又はペプチド複合体であって、
そして上記において、1つ又はそれより多いコンポーネントa)〜f)は、ペプチド又はペプチド複合体のα2インテグリンへの結合を可能にするように配置されている、前記ペプチド又はペプチド複合体に関する。
その方法が、
a)α2インテグリンを含むサンプルを請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド又はペプチド複合体と接触させることと;及び
b)α2インテグリンの、このペプチド又はペプチド複合体への結合を検出することと;及び
c)工程b)の結合を参照と比較することを含んでなり、
上記において、参照と比較してサンプル中のα2インテグリンの結合の変化が、疾患の存在を示す、前記方法に関する。
a)包装材料、
b)請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド又はペプチド複合体又はその製薬学的に許容される塩、
c)ラベル又はパッケージインサート
を含んでなる製品であって、
前記インサートは前記包装材料の中に含まれ、
前記ペプチド又はペプチド複合体が疾患又は障害、特にα2インテグリン関連疾患・障害の処置に有効であることを表示している、前記製品に関する。
a)個体から取得したサンプルをこの発明のペプチド又はペプチド複合体と接触させることと;及び
b)α2インテグリンのペプチド又はペプチド複合体への結合を検出することと;及び
c)工程b)の結合を、1つ又はそれより多い参照サンプル中のα2インテグリンのペプチド又はペプチド複合体への結合と比較することを含んでなり、
上記において、1つ又はそれより多い参照サンプル中で検出された結合と比較して取得したサンプル中の結合の変化が、疾患を表すことを特徴とする、前記方法に関する。
定義
この発明を下記に詳細に述べる前に、この発明は、本明細書中に述べられている具体的な方法、プロトコル及び試薬に限定されることがない(こうしたものは変化しうるからである)ことが理解されるべきである。また、本明細書中で使用されている用語は、単に具体的な実施態様を述べることを目的にしているにすぎないものであり、そしてこの発明の範囲を制限することを意図しているものではなく、もっぱら添付した特許請求の範囲に限って制限されるであろうことが理解されるべきである。別途明記しない限り、本明細書中で使用されている技術的及び科学的用語はすべて、通例、この発明が属している技術分野における当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。
Piscataway, N.J.)を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度変化の検出により、リアルタイム生体特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を意味する。
性、好ましくは、血液血小板、血管内皮細胞、上皮細胞、活性化単球/マクロファージ、線維芽細胞、白血球、リンパ球、活性化好中球及び/又はマスト細胞(特に化学量論量で使用される際)上に存在するアルファ2インテグリンの活性を阻害する化合物を意味する。この発明の好ましいアルファ2アンタゴニストは、中和抗体である。
1)脂肪族側鎖:グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン;
2)脂肪族ヒドロキシル側鎖:セリン及びトレオニン;
3)アミド含有側鎖:アスパラギン及びグルタミン;
4)芳香族側鎖:フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン;
5)塩基性側鎖:リシン、アルギニン、及びヒスチジン;
6)酸性側鎖:アスパルギン酸(アスパルテート:aspartate)及びグルタミン酸(グルタメート:glutamate)、及び
7)硫黄含有側鎖:システイン及びメチオニン。
to be administered)”と同じ意味を有する。換言すれば、活性な化合物を“投与する(is for administration)”という記述は、前記の活性化合物を製剤化し、そして前記活性化合物が、その治療活性を発揮することができるような投与量に作り上げられるているというように理解されなければならない。
次にこの発明を更に述べることになる。下記の部分では、本発明の種々の局面をより詳細に明らかにする。こうして明らかにしたそれぞれの局面は、明らかにそうではないという指示がない限り、任意の他の局面又は他の複数の局面と組み合わせることができる。具体的には、好ましい、あるいは有利であると指摘されたどんな特性も、明らかにそうではないという指示がない限り、好ましい、あるいは有利であると指摘された任意の他の特性又は他の複数の特性と組み合わせることができる。
a)LCDR1[ここで、LCDR1は、RASESVESYGNSFIY(配列番号6)又はその機能的に活性な変異体である]、
b)LCDR2[ここで、LCDR2は、LASNLAS(配列番号7)又はその機能的に活性な変異体である]、
c)LCDR3[ここで、LCDR3は、QQNNEDPYT(配列番号8)又はその機能的に活性な変異体である]、
d)HCDR1[ここで、HCDR1は、GYTFTSYWMN(配列番号3)又はその機能的に活性な変異体である]、
e)HCDR2[ここで、HCDR2は、RIDPSDSETHYNQKFK(配列番号4)又はその機能的に活性な変異体である]、及び
f)HCDR3[ここで、HCDR3は、VGRGYFDY(配列番号5)又はその機能的に活性な変異体である]
を含んでなるペプチド又はペプチド複合体であって、
そして上記において、1つ又はそれより多いコンポーネントa)〜f)は、ペプチド又はペプチド複合体のα2インテグリン又はヘテロダイマーα2β1インテグリンへの結合を可能にするように配置されている、前記ペプチド又はペプチド複合体に関する。
(i)a)〜c)の1つ、2つ又は3つのコンポーネントが、軽鎖(VL)の可変ドメイン中に含まれ、
(ii)d)〜f)の1つ、2つ又は3つのコンポーネントが、重鎖(VH)の可変ドメイン中に含まれ、
(iii)ペプチド又はペプチド複合体は抗体であり、
(iv)ペプチド又はペプチド複合体は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド連結Fv、scFv、(scFv)2、二特異性抗体(bispecific antibody)、多特異性抗体(multispecific antibody)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はミニボディ、モノクローナル抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であり、
(v)ペプチド又はペプチド複合体は、ヒトIgM定常ドメイン、ヒトIgGl定常ドメイン、ヒトIgG2定常ドメイン、ヒトIgG3定常ドメイン、ドメイン、ヒトIgG4定常ドメイン、ヒトIgE定常ドメイン、及びヒトIgA定常ドメインから成る群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含んでなり、
(vi)機能的に活性な変異体は、配列番号3〜8のいずれかのアミノ酸配列の60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、あるいは99%以上から成る、機能的に活性なフラグメントであり、
(vii)機能的に活性な変異体は、配列番号3〜8のいずれかのアミノ酸配列に対して、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、あるいは99%以上の配列同一性を有する機能的に活性な変異体であり、特に、機能的に活性な変異体は、1つ又はそれより多い保存的アミノ酸置換によって配列番号3〜8のいずれかのアミノ酸配列から誘導され、
(viii)ペプチド又はペプチド複合体は、
−配列番号1、又はその機能的に活性な変異体、及び/又は
−配列番号2、又はその機能的に活性な変異体、及び/又は
−配列番号9、又はその機能的に活性な変異体、及び/又は
−配列番号10、又はその機能的に活性な変異体、及び/又は
−配列番号11、又はその機能的に活性な変異体、及び/又は、
のアミノ酸配列を含んでなり、
(ix)ペプチド又はペプチド複合体は、
−配列番号9、又はその機能的に活性な変異体、及び
−配列番号10、又はその機能的に活性な変異体、及び
−場合により、50個以下の付加アミノ酸残基(additional amino acid residue(s))、1〜40個、1〜30個、1〜25個、1〜15個、1〜10個、又は5個、4個、3個、2個、又は1個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成され、
(x)ペプチド又はペプチド複合体は、
−配列番号9、又はその機能的に活性な変異体、及び
−配列番号11、又はその機能的に活性な変異体、及び
−場合により、50個以下の付加アミノ酸残基、1〜40個、1〜30個、1〜25個、1〜15個、1〜10個、又は5個、4個、3個、2個、又は1個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成される。
to protease attack)、免疫系との相互作用、薬物動態、及び特異的な生物活性を含む、治療的糖タンパク質の有効性に関連する特性に有意に(肯定的に、あるいは否定的に)影響を及ぼしうる。グリコシル化タンパク質の発現の場合には、哺乳類宿主細胞が、当技術分野において一般的に使用されている(Cumming et al., 1991, Glycobiology 1: 115-130; Jenkins et al., 1996, Nature Biotechn. 14: 975-981)。こうした例としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、NSO−及びSP2/0−マウスミエローマ細胞が挙げられる。遺伝子導入動物に起源するグリコシル化タンパク質の作製もまた公表されている(Jenkins et al., 1996,上記参照)。更に、操作された組み換え宿主細胞の異種発現/過剰発現しているグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子も当技術分野において知られている(Bailey, 1991, Science 252: 1668-1675)。WO 9954342(A1)では、改善された機能を有すると報告されている分岐型GIcNAcを持つN結合型オリゴ糖(N-linked oligosaccharides)複合体を増加させる一連の糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼ活性を発現する宿主細胞を用いて、グリコシル化タンパク質の生成方法が開示されている。
32661中に以前に記載されている方法を用いてヒト化されているが、当技術分野において知られている任意の適切なヒト化方法を使用することができる。
−配列番号1、又はその機能的に活性な変異体、及び/又は
−配列番号2、又はその機能的に活性な変異体、及び/又は
−配列番号9、又はその機能的に活性な変異体、及び/又は
−配列番号10、又はその機能的に活性な変異体、及び/又は
−配列番号11、又はその機能的に活性な変異体
のアミノ酸配列を含んでなる。
−配列番号9、又はその機能的に活性な変異体、及び
−配列番号10、又はその機能的に活性な変異体、及び
−場合により、50個の付加アミノ酸残基、又は1〜40個、1〜30個、1〜25個、1〜15個、1〜10個、1個、又は2個、3個、4個、又は5個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成される。
−配列番号9、又はその機能的に活性な変異体、及び
−配列番号11、又はその機能的に活性な変異体、及び
−場合により、50個の付加アミノ酸残基、又は1〜40個、1〜30個、1〜25個、1〜15個、1〜10個、1個、又は2個、3個、4個、又は5個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成される。
リン酸化、及び硫酸化が含まれる。1つより多い更なるアミノ酸残基又は非相同アミノ酸残基がペプチドに存在する場合、これらのアミノ酸残基は同じでもよく、それとも互いに異なってもよい。
215: 403-410, 1990)が、シーケンス解析プログラム、blastp、 blastn、 blastx、 tblastn及びtblastxと接続して使用するために、国立生物工学情報センター(the National Center for Biotechnology Information)(NCBI, Bethesda, MD)を含めて、及びインターネットによって、いくつかの供給源から利用可能である。配列番号1〜8の配列のいずれかの変異体は通例、ギャップblastpをデフォルトパラメーターに設定して、NCBI Blast 2.0を用いて特徴付けられる。少なくとも30アミノ酸のアミノ酸配列の比較のために、Blast2配列機能が、デフォルトBLOSUM62マトリックスをデフォルトパラメーターに設定して用いて使用される(ギャップの存在はコスト11、及び残基ギャップ当たりはコスト1)。短いペプチド(約30アミノ酸よりも少ない)をアライメントするときには、アライメントは、PAM30マトリックスをデフォルトパラメーターに設定して使用して(オープンギャップ9、エクステンションギャップ1ペナルティー)、Blast2配列機能を用いて行なわれる。15アミノ酸以下のような短いウィンドウにわたる配列同一性を決定する方法は、国立生物工学情報センター(the National Center for Biotechnology Information) in Bethesda, Marylandにより維持されるウェブサイト中に記載されている。
どの標準的な手法によって導入することができる。当技術分野における当業者が保存的アミノ酸置換を達成する1つの具体的手段は、アラニンスキャニング変異導入法(alanine scanning mutagenesis)である。次いで変化したポリペプチドを、当技術分野において利用可能な、又は実施例に述べられている機能的アッセイを用いて機能が維持されているか、あるいはよりよくなっているかどうかを試験する。この発明のより好ましい実施態様では、配列番号1又は配列番号2又は配列番号9又は配列番号10又は配列番号20のいずれかの配列における保存的置換の数は、20、19、18、17、16、15、14、13、12又は11のように20以下、好ましくは、10、9、8、7又は6のように10以下、とりわけ、5、4、3のように5以下、特に2又は1である。
−上記において、LDR1の機能的に活性な変異体は、11位のアミノ酸での変異(mutation)、特に、11Asn→Glnを含んでなり;
−上記において、HDR2の機能的に活性な変異体は、6位のアミノ酸での変異、特に、6Asp→Gluを含んでなり;
−上記において、配列番号1の機能的に活性な変異体は、好ましくは、9Ala→Ser、12Ala→Ser、15Leu→Val、15Leu→Pro、22Ser→Thr、34Asn→Gln、46Gln→Lys、47Ala→Pro、80Asp→Asn、83Glu→Gln、85Asp→Glu、87Ala→Thr及び89Thr→Asnから成る群より選択される、9位、12位、15位、22位、34位、46位、47位、80位、83位、85位、87位及び/又は89位のアミノ酸での1つ又はそれより多い変異を含んでなり、
及び/又は
又は上記において、配列番号2の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり(HC4);すなわち、17Pro→Ser、又は93Val→Lys、又は116Ser→Val又は17Pro→Ser及び93Val→Lys、又は17Pro→Ser及び116Ser→Val、又は93Val→Lys及び116Ser→Val、又は表6に基づいて(HC4):17Pro→Ser及び93Val→Lys及び116Ser→Val、
又は上記において、配列番号2の機能的に活性な変異体は、下記の変異を含んでなり(HC5);すなわち、17Pro→Ser、又は55Asp→Glu、又は116Ser→Val又は17Pro→Ser及び55Asp→Glu、又は17Pro→Ser及び116Ser→Val、又は55Asp→Glu及び116Ser→Val、又は表6に基づいて(HC5):17Pro→Ser及び55Asp→Glu及び116Ser→Val、
又は上記において、配列番号2の機能的に活性な変異体は、以下の変異のうち、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個又は全てを含んでなる(HC6);5His→Val、7Pro→Ser、11Leu→Val、12Val→Lys、17Pro→Ser、20Leu→Val、38Lys→Arg、40Arg→Ala、43Arg→Gln、61Asn→Ala、65Lys→Gln、66Asp→Gly、67Lys→Arg、76Ser→Thr、81Ile→Met、82Gln→Glu、87Thr→Arg、91Ser→Thr、112Thr→Leu、113Leu→Val。
A)表11に提示されているデータに基づく速度論的結合定数(kinetic binding constants)(表面プラズモン共鳴によって決定される、例えば、Biacoreによって)、
B)以下のような軽鎖の分子の質量(molecular mass):23.73+/−0.05kDa又は23.73kDa(LC1)、又は23.74+/−0.05kDa又は23.7kDa(LC2)、又は23.75+/−0.05kDa又は23.8kDa(LC3)、又は23.77+/−0.05kDa又は23.77kDa(LC4)、又は23.79+/−0.05kDa又は23.79kDa(LC5)、50.31+/−0.05kDA
及び/又は以下のような重鎖の分子の質量:50.31kDa(HC1)、又は50.33+/−0.05kDA、又は50.33kDa(HC2)、又は50.30+/−0.05kDa又は50.30kDa(HC3)、又は50.33+/−0.05kDa又は50.33kDa(HC4)、又は50.32+/−0.05kDa又は50.32kDa(HC5)、又は50.35+/−0.05kDa又は50.35kDa(HC6)、又は50.19+/−0.05kDa又は50.19kDa(HC7)、C)静的状態下にて決定された、<0.1、<0.09、<0.08、<0.07、<0.06、<0.05、<0.04、<0.03、<0.02又は<0.01のIC50μg/ml値を有する洗浄したヒト血小板のコラーゲンへの結合の阻害、
D)静的状態下にて決定された、<0.3、<0.2、<0.1、<0.15、<0.14又は<0.13のIC50μg/ml値を有する多血小板血漿に由来するヒト血小板のコラーゲンへの結合の阻害、
E)<10、<9、<8、<7、<6、<5、<4、<3、<2.5、<2、<1.5、<1又は<0.5%のサイズ排除クロマトグラフィーによって決定される凝集パーセンテージ。
その方法が、
a)α2インテグリンを含む対象からのサンプルを、本発明のペプチド又はペプチド複合体と接触させることと;
b)α2インテグリンの、このペプチド又はペプチド複合体への結合を検出することと;及び
c)工程b)の結合を参照と比較することを含んでなり、
上記において、参照と比較してサンプル中のα2インテグリンの結合の変化が、疾患の存在を示す、前記方法に関する。この結合の変化は、工程bで参照サンプルと比較して検出し、例えば、シグナルの変化(すなわち、シグナルの増加又は減少)によって特定されうる。
その方法が、
a)個体の取得されたサンプルを、この発明のペプチド又はペプチド複合体と接触させることと;及び
b)α2インテグリンの、このペプチド又はペプチド複合体への結合を検出することと;及び
c)工程b)の結合を、1つ又はそれより多い参照サンプルにおけるペプチド又はペプチド複合体へのα2インテグリンの結合と比較することを含んでなり、
上記において、1つ又はそれより多い参照サンプルにおいて検出される結合と比較して、取得されたサンプルにおける結合の変化が、疾患を示す、前記方法に関する。
a)包装材料(例えば、ペプチド又はペプチド複合体のための1つ又はそれより多い容器、及びラベル又はパケージインサート)
b)この発明のペプチド又はペプチド複合体又はその製薬学的に許容される塩、
c)ラベル(例えば、書面情報及び/又はバーコード及び/又は他のあらゆる種類の情報を含む)、又はパケージインサート(すなわち、チップ、リーフレット、ブックレットなどのあらゆる種類のデータキャリア)
を含んでなる製品であって、
前記パーケージ材料の中に含まれている前記インサートは、本明細書中で定義されているように、前記ペプチド又はペプチド複合体が疾患又は障害、特にα2インテグリン関連疾患・障害の処置に有効であることを表示している、前記製品に関する。
その方法が、
a)個体の取得されたサンプルを、この発明のペプチド又はペプチド複合体と接触させることと;及び
b)α2インテグリンの、このペプチド又はペプチド複合体への結合を検出し、及び/又は定量化することと;及び
c)工程b)の結合を、1つ又はそれより多い参照サンプル中のα2インテグリンのペプチド又はペプチド複合体への結合と比較することを含んでなり、
上記において、1つ又はそれより多い参照サンプル中で検出される結合と比較して、取得されたサンプルにおける結合の変化が、疾患の存在を示す、前記方法に関する。この結合は、公知の方法を用いて親和性(例えば、KD、Koff、Kon比)の観点から、あるいは単に、例えば、参照サンプルのものと比較して、ペプチド/ペプチド複合体に対する標識抗体によってもたらされる、ペプチド/ペプチド−複合体−アルファ2インテグリン複合体のシグナル(強度)によって検出又は定量化されうる。
1.単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントは、ヒトα2インテグリンのI−ドメインに特異的に結合し、前記抗体又はフラグメントは、重鎖可変領域(VH)ドメイン及び軽鎖可変領域(VL)ドメインを含んでなり、前記抗体又はフラグメントは、非ヒト霊長類のα2インテグリンを交差反応するが、非霊長類のα2インテグリンとは交差反応しない、前記単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
2.単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体又はフラグメントは、ヒトα2インテグリンのI−ドメインに特異的に結合し、前記抗体は、重鎖可変領域(VH)ドメイン及び軽鎖可変領域(VL)ドメインを含んでなり、前記抗体又はフラグメントは、参照抗体のエピトープとの結合について参照抗体と競合し、前記参照抗体は、アクセッション番号 DSM23944にてDSMZに寄託されているプラスミドによってコードされる軽鎖、及び(i)アクセッション番号 DSM23946にてDSMZに寄託されているプラスミド、又は(ii)アクセッション番号DSM23945にてDSMZに寄託されているプラスミドのいずれかによってコードされている重鎖を含んでなる、前記単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
3.前記実施態様1又は2に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記抗体又はフラグメントは、ヒトα2インテグリンのI−ドメインにnMレベルの結合親和性で特異的に結合する、前記抗体、又はその抗原結合部分。
4.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記抗体又はフラグメントは、インビトロでヒトα2インテグリンのコラーゲンとの相互作用を阻害し、それによって、前記血小板と前記コラーゲンの粘着による血小板の活性を阻害する、前記抗体、又はその抗原結合部分。
5.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域ドメインは、配列番号5の重鎖HCDR3を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
6.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域ドメインは、配列番号3(HCDR1)、配列番号4(HCDR2)、及び配列番号5(HCDR3)の重鎖CDR、又はその機能的に活性な変異体を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
7.実施態様6に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、HCDR2の機能的に活性な変異体は、6位のアミノ酸でのAsp→Gluの変異を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
9.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域ドメインは、配列番号6(LCDR1)、配列番号7(LCDR2)、及び配列番号8(LCDR3)の軽鎖CDR、又はその機能的に活性な変異体を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
10.実施態様9に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、LCDR1の機能的に活性な変異体は、11位のアミノ酸でのAsn→Glnの変異を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
11.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域(VH)ドメインは、配列番号2のVH配列に対して、少なくとも90%、95%、97%又は99%の配列同一性を有している、前記抗体、又はその抗原結合部分。
12.実施態様11に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域(VH)ドメインは、配列番号2の配列又はその機能的に活性な変異体(functionally active thereof)を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
13.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域(VL)ドメインは、配列番号1のVL配列に対して、少なくとも90%、95%、97%又は99%の配列同一性を有する、前記抗体、又はその抗原結合部分。
14.実施態様13に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域(VL)ドメインは、配列番号1の配列又はその機能的に活性な変異体(functionally active thereof)を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
15.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域(VH)ドメインは、H5、H7、H11、H12、H17、H20、H38、H40、H43、H55、H61、H65、H66、H67、H76、H81、H82、H87、H91、H93、H112、H113及びH116から成る群より選択される位置における1つ又はそれより多いアミノ酸置換を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
16.実施態様15に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、1つ又はそれより多いアミノ酸置換は、5His→Val、7Pro→Ser、11Leu→Val、12Val→Lys、17Pro→Ser、20Leu→Val、38Lys→Arg、40Arg→Ala、43Arg→Gln、55Asp→Glu、61Asn→Ala、65Lys→Gln、66Asp→Gly、67Lys→Arg、76Ser→Thr、81Ile→Met、82Gln→Glu、87Thr→Arg、91Ser→Thr、93Val→Lys、112Thr→Leu、113Leu→Val及び116Ser→Valから成る群より選択される、前記抗体、又はその抗原結合部分。
18.実施態様17に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、1つ又はそれより多いアミノ酸置換は、9Ala→Ser、12Ala→Ser、15Leu→Val、15Leu→Pro、22Ser→Thr、34Asn→Gln、46Gln→Lys、47Ala→Pro、80Asp→Asn、83Glu→Gln、85Asp→Glu、87Ala→Thr及び89Thr→Asnから成る群より選択される、前記抗体、又はその抗原結合部分。
19.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域(VH)ドメインは、配列番号38(HC1)、配列番号39(HC2)、配列番号40(HC3)、配列番号41(HC4)、配列番号42(HC5)、配列番号43(HC6)、及び配列番号44(HC7)から成る群より選択されるVH配列に対して、少なくとも90%、95%、97%又は99%の配列同一性を有する、前記抗体、又はその抗原結合部分。
20.実施態様19に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記重鎖可変領域(VH)ドメインは、配列番号38(HC1)、配列番号39(HC2)、配列番号40(HC3)、配列番号41(HC4)、配列番号42(HC5)、配列番号43(HC6)、及び配列番号44(HC7)から成る群より選択されるVH配列を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
21.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域(VL)ドメインは、配列番号33(LC1)、配列番号34(LC2)、配列番号35(LC3)、配列番号36(LC4)、及び配列番号37(LC5)から成る群より選択されるVL配列に対して、少なくとも90%、95%、97%又は99%の配列同一性を有する、前記抗体、又はその抗原結合部分。
22.実施態様21に記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記軽鎖可変領域(VL)ドメインは、配列番号33(LC1)、配列番号34(LC2)、配列番号35(LC3)、配列番号36(LC4)、及び配列番号37(LC5)から成る群より選択されるVL配列を含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
23.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、前記抗体、又はその結合部分は、キメラ抗体又はヒト化抗体である、前記抗体、又はその抗原結合部分。
24.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、抗原結合部分は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィドにより連結されたFv、scFv、及び(scFv)2から成る群より選択される、前記抗体、又はその抗原結合部分。
26.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体又は結合部分は、ヒトIgM定常ドメイン、ヒトIgGl定常ドメイン、ヒトIgG2定常ドメイン、ヒトIgG3定常ドメイン、ドメイン、ヒトIgG4定常ドメイン、ヒトIgE定常ドメイン、及びヒトIgA定常ドメインから成る群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
27.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分であって、抗体又は結合部分は、ヒトIgG4定常ドメインを含んでなる、前記抗体、又はその抗原結合部分。
28.先行する実施態様のいずれか1つに記載の抗体又はその抗原結合部分のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
29.実施態様28に記載の核酸を含んでなる組み換え発現ベクター。
30.実施態様29に記載の組み換え発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
31.実施態様1〜26のいずれか1つに記載の抗体又は抗原結合性フラグメントを作製する方法であって、抗体が宿主細胞によって作製されるような条件下にて実施態様30に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる、前記方法。
32.実施態様1〜27のいずれか1つに記載の抗体、又はその抗原結合部分と、1つ又はそれより多い製薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
33.α2インテグリン関連障害若しくは疾患を処置し、予防し、又は診断する方法であって、その方法が、実施態様32に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、前記方法。
34.実施態様33に記載の方法であって、α2インテグリン関連疾患若しくは障害は、血栓症、血管疾患、血管新生及び転移を含む癌、炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患及び異常な又は増加した新脈管形成によって特徴付けられる疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症、レイノー症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、強皮症、心血管疾患、乾癬、及び炎症反応を誘発する感染症から成る群より選択される、前記方法。
35.実施態様33に記載の方法であって、α2インテグリン関連疾患若しくは障害は、急性冠動脈症候群、経皮的冠動脈インターベンション、虚血性脳卒中、頸動脈狭窄又は末梢動脈閉塞性疾患から成る群より選択される、前記方法。
その方法が、
a)α2インテグリンを含むサンプルを実施態様1〜27のいずれか1つに記載の、抗体又は抗原結合性フラグメントと接触させることと;
b)α2インテグリンの、この抗体又は抗原結合性フラグメントへの結合を検出することと;及び
c)工程b)の結合を参照と比較することを含んでなり、
上記において、参照と比較してサンプル中のα2インテグリンの結合の変化が、疾患の存在を示す、前記方法。
37.a)包装材料、
b)実施態様1〜27のいずれか1つに記載の抗体又は抗原結合性フラグメント、
c)ラベル又はパッケージインサート
を含んでなる製品であって、
このパーケージ材料内に含まれている前記インサートが、前記抗体又は抗原結合性フラグメントが、α2インテグリン関連疾患・障害の処置又は診断に有効であることを表示している、前記製品。
実施例1:機能的な抗α2インテグリンmAb及びFabの作製及び選択
A−α2インテグリンmABクローン細胞からのシーケンス単離
ハイブリドーマからのα2インテグリンmAbの作製及び精製
α2インテグリンmAB細胞バンクの2×106細胞を含む1つのクライオバイアルを37℃で急速解凍した。こうした細胞を、オービタルシェーカープラットフォームによって110rpmで回転させながら、大気中5%CO2の加湿雰囲気下にて37℃のインキュベーター中で、10%FBS、1X ITS(Gibco 41 400-045)、1X ピルビン酸ナトリウム(Gibco 11 360-039)、150μg/mLのオキサロ酢酸、2mMのグルタミン(Gibco 25030-024)及び100U/mlペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco 15070-063)を補充した、ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium(Gibco 31053-028))から成る新鮮な5mLの培地を含むT−25cm2フラスコに移した。
(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit; ref. MMT1)からの標準的な市販のアイソタイピングキットの使用によって行なわれ、mCk、mIgG2aアイソタイプが明らかにされた。
モノクローナル抗体の可変ドメインをコードするcDNAは次のように得られた:mRNAを、キアゲン社(Qiagen)からのオリゴテックスキット(Oligotex kit)を用いてハイブリドーマ細胞から抽出した。相当するcDNAを、Gene Racerキット(Invitrogen)、転写酵素(transcriptase SuperScript III)(55℃で)(Invitrogen)及び表1に述べられているプライマー(RACEMOG2a又はCKFOR)を使用するRACE法によるRT−PCRによって増幅した。このcDNAフラグメントは、55℃でポリメラーゼ Phusion(Finnzymes)を用いてPCRによって増幅し、プライマーはまた、表1に記載されている。
CDR領域の配列は、KABAT命名法を用いてタンパク質配列から推定された。
抗α2インテグリンmAbの可変重鎖及び軽鎖は、AccuPrimePfx SuperMix(Invitrogen; Cat. No.: 12344-040)、及び、それぞれ、抗α2インテグリンmAb重鎖及び軽鎖cDNA(cDNA作製については、上記参照)を用いて、PCRによって作製された。25μl PCR反応では、5サイクルが、プライマー α2mAB−VH FOR及びREV(重鎖)、又はプライマー α2mAB−VL FOR及びREV(軽鎖)プライマー(95℃,15秒;62℃、30秒;68℃,1分)を用いて行なわれた。リーダー配列を導入するには、0.5μlのそれぞれの第1PCRサンプルが、第1PCRに関する場合と同じPCR条件を用いて、リーダー FOR1−54及びα2mAB−VL(又は−VH)REVプライマーを持つ第2PCRのためのテンプレートとして使用された。最後に、最初の反応の場合と同じPCR条件を用いて、0.5μlの第2PCRを、リーダー FOR1−23及びα2インテグリンmAB−VL(又は−VH)REVプライマーを持つ第3PCR(25サイクルを行なう)のためのテンプレートとして使用した。第3PCRのPCR産物を、PCR精製キット(Qiagen,Cat.No.28104)を用い、そのキットプロトコルの記載の通り精製した。PCR産物を、販売者のマニュアル中の記載の通り、Invitrogen TOPO TAクローニングキット(Cat #450001)を用いて、pCR2.1−TOPO中にクローニングし、そしてこのクローニングキットに含まれているM13フォワードプライマー及びM13リバースプライマーを用いてシーケンシングした。
s Res. 30(2))、E9のNheI/HindIII部位に結合し、キメラα2抗体軽鎖の哺乳類発現プラスミド“pFF0033_pXLc-AscII-IGKC”(アクセッション番号DSM 23944のもとでDSMZに寄託されている)が作製された。
A−組み換え抗α2インテグリンmAB及びFabフラグメントの作製
キメラ抗α2インテグリンIgG4及び抗α2インテグリンFab分子の発現
抗体の重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドを、大腸菌DH5a中で増殖した。トランスフェクションのために使用されるプラスミドは、Qiagen EndoFree Plasmid Megaキットを用いて大腸菌から調製した。
IgG4タンパク質を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー(HiTrap Protein A HP Columns, GE Life Sciences)によって精製した。100mM酢酸バッファー、100mM NaCl pH3.5を用いて、カラムから溶出後、モノクローナル抗体を、HiPrep 26/10脱塩カラムを用いて脱塩し、1mg/mLの濃度でPBS中に混和し、0.22μmろ過した。
精製された抗体及び相当するFabフラグメントの詳細な速度論的キャラクタリゼーションのために、Biacore 3000(GE Healthcare)による表面プラズモン共鳴テクノロジー(Surface plasmon resonance technology)を用いた。リガンドとしての抗インテグリン抗体又はFabフラグメント、及びアナライトとしてのインテグリンα2β1 I−ドメインを用いて、直接結合アッセイが使用された。通例、抗体又はFabフラグメント(600RU)を、アミン反応カップリングによって研究グレードのCM5チップ上に固定化し、その結果、それぞれ、抗体及びFabフラグメントに結合したI−ドメインの場合、80及び140RUの最大結合レスポンス(Rmax)になった。結合速度を、4mM MgCl2(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、0.005% 界面活性剤P20)を用いて補充したHBS−Pバッファー中、30μl/分の流速で、0.4〜28nM I−ドメインの濃度範囲にわたって測定した。チップ表面を、10mM グリシンpH2.2を用いて再生した。速度論的パラメーターを、参照として固定化された抗インテグリン抗体又はFabフラグメントを含まないフローセル(flow cell)を用いて、BIAevaluation program package(バージョン 4.1)で解析し、算出した。質量移動(mass transfer)を有する1:1結合モデルが、抗体又はFabフラグメントの0.4〜28nMのアナライト濃度に相当する曲線データのグローバルフィッティングに適用された。
C12200, lot 6062203)を用いる細胞ベースアッセイが行なわれた。細胞を、PBS(10,000細胞/ウェル)中で高結合型プレート(Meso Scale Discovery (MSD), L15XB-3)上にコートし、そして室温で2時間インキュベートした。次いでこのプレートを空にし、PBSで2回洗浄し、そしてブロッキング溶液(MSD, R93BA-4)で90分間ブロッキングした。上記に述べられているように再びプレートを空にし、そして洗浄した後、抗α2−mAbの階段希釈液を加え、そして室温で1時間細胞と共にインキュベートした。上記のような洗浄工程の更なる1回の後、界面活性剤(Meso scale Discovery, R92TD-2)を加えないReadバッファーTを加えた。電気化学発光を適切なデバイス(Meso scale Discovery, Sector imager)で読み取った。スキャチャードプロット解析(Scatchard plot analysis)を試験mAbのKDを決定するために使用した(図1参照)。
抗α2インテグリンmAbを、血液サンプル又はヒト血小板を用いて、FACS実験によって、マカカ(macaca:オナガザル科;カニクイザル)及びヒトからの血小板と特異的に相互作用する能力があるかどうかを評価した。mAbをヒト血液、マカカ血液又はヒト血小板のサンプルと共に、そしてヤギ−抗マウス−IGgフィコエリトリン(PE)結合二次mAb(Beckman Coulter #731856)と共にインキュベートした。このサンプルを溶解液(Lysing Solution)(BD #349202)で処理し、そして血小板を遠沈させ、再懸濁し、FACSで解析した。
ヒト化
抗α2インテグリンmAB抗体のVL及びVH配列の3D相同モデル(3D homology models)を、MOE2008における抗体モデラーアプリケーション(antibody modeller application)を用いて構築した。いくつかのPDBテンプレートが、LC及びHCフレームワーク並びにCDRループを構築するために特定された。すべてのテンプレート(templates)は、H3ループに対するベストなテンプレート(56%同一性)以外は、VL及びVH抗α2インテグリンmAB配列に対して83%を超える同一性を有した。この結果生じたLC及びHCモデルは、その後、MOEにおいて実施された標準的な手順を用いてエネルギーが最小化された。その後、マウスVL/VHの最小化3D相同モデルの分子動力学(MD)算定がタンパク質バックボーンに関する、500K温度、一般化ボルン暗溶媒(Generalized Born implicit solvent)中、1.1ナノ秒間という拘束された状態で行なわれた。10の多様なコンフォメーションが、最後の1nsの間に100ps毎のこの最初のMD処理から抽出された。次いでこうした10の多様なコンフォメーションは、それぞれ、タンパク質バックボーンに関する、300K温度、一般化ボルン暗溶媒中、2.3ナノ秒間という拘束がない状態で、MDに提出された。次いで、それぞれの10MD処理の場合には、MD軌道からの最後の2,000のスナップショット(ピコ秒毎に1つ)が算出するために使用され、それぞれの抗α2インテグリンmABアミノ酸の場合には、その標準偏差(rmsd)を参照モノイドポジション(medoid position)と比較した。所与のアミノ酸の10の別々のMD処理における平均rmsdを、すべての抗α2インテグリンmABマウスアミノ酸の全平均rmsdと比較することによって、MDの間に理解されたように、アミノ酸がT細胞受容体と相互作用する可能性があり、免疫応答の活性化の原因であると考えられるのに十分フレキシブルであるかどうかが決定される。64個のアミノ酸は、最終的には、抗α2インテグリンmAB抗体においてフレキシブルであると認定され、そのうち34個は、CDR内に位置していないか、あるいはそれらのすぐ近くに位置していない(5Å)。“バーニア(Vernier)”領域に位置しているアミノ酸はまた、考慮されない(J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499)。
CDRを除いて、それらのそれぞれの正準な配列に対して低頻度に発生する軽鎖及び重鎖のアミノ酸は、本来、最も高頻度に見出されるアミノ酸に変異されることが提示されている(△△Gth> 0.5 kcal/mol; [E. Monsellier, H. Bedouelle. Improving the stability of an antibody variable fragment by a combination of knowledge-based approaches: validation and mechanisms. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593])。LC及びHCの場合のコンセンサス変異の最初のリストは、最も近縁なヒト生殖細胞系(すなわち、vk1−vh1b)中に見出されるアミノ酸、すなわち、LC中の4つの可能性のある変異及びHC中の3つの可能性のある変異に限定されている。こうした変異は、CDR中、そのすぐ近く(+5オングストローム)、あるいは“バーニア(Vernier)”領域には位置していない(J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499)。抗アルファ2インテグリン抗体を安定化する可能性のあるこうしたコンセンサス変異を検討する他のクライテリアが考慮される。こうしたクライテリアは、変異の表面での疎水性親水性指標(hydropathy)、あるいは分子力学ベースの予測される安定化の有利な変化である。
ヒト化は、最も近縁なヒト生殖細胞系を、それぞれ、抗α2インテグリンmAB軽鎖及び重鎖に特定化することによって開始される。これは、体系的に列挙されるすべてのヒト生殖細胞系に対してBLASTサーチを行なうことによってなされる(カッパ鎖及びラムダ鎖のV及びJドメイン;重鎖のV、D及びJドメインの全ての可能な組み合わせ)。このBLASTサーチは、インハウス・イントラネットアプリケーションを用いて行なわれた。
下記の配列モチーフが考えられる:Asp−Pro(酸に不安定な結合)、Asn−X−Ser/Thr(グリコシル化、X=任意のアミノ酸(Proは除く))、Asp−Gly/Ser/Thr(フレキシブル領域におけるスクシンイミド/iso−asp形成)、Asn−Gly/His/Ser/Ala/Cys(アミド分解サイトの露出)、Met(露出領域の酸化)。この結果生じるヒト化配列は、IEDBデータベースに対する配列類似性が破壊され(http://www.immuneepitope.org/home.do; version June 2009)、どの配列もいずれかの公知のB又はT細胞エピトープを含まないことが保証されている。
軽鎖についての5つのバージョン(軽鎖変異体、LC1、LC2、LC3、LC4、LC5)及び重鎖についての7つのバージョンが設計された(重鎖変異体、HC1、HC2、HC3、HC4、HC5、H6、H7)。LC1バージョンは、抗α2インテグリンmAB軽鎖の非CDRの最もフレキシブルなアミノ酸と、VK1ヒト生殖細胞系軽鎖の間の直接比較から誘導される4つの変異を示す。LC2バージョンは、CDR領域(N34Q)中のアミド分解サイトの可能性を除去するための1つの付加変異を含む。LC3バージョンは、抗α2インテグリンmAB軽鎖を最適に安定化させると予測されるヒト化及び安定化変異を含む。LC4バージョンは、アミド分解サイト(N34Q)の可能性を除去するための1つの付加変異を含む。LC5バージョンは、グラフティング方法から誘導される6つの変異を示す。
・LC1/HC1(ヒト化のみに対応する変異((mutations addressing humanization only))
・LC2/HC2(ヒト化及びLC/HCの可能性のある問題あるサイト[NS及びDS]に対応する変異)
・LC3/HC3(ヒト化及び安定化に対応する変異)
・LC3/HC4(ヒト化及び安定化及び抗凝集(anti-aggregation)に対応する変異)・LC4/HC5(ヒト化及び安定化及びLCの可能性のある問題あるサイト[NS]及びHCの可能性のある問題あるサイト[DS]に対応する変異)
・LC4/HC6(ヒト化、安定化、抗凝集及びLCの可能性のある問題あるサイト[NS]及びHCの可能性のある問題あるサイト[DS]に対応する変異)
・LC5/HC7(グラフティングによるヒト化に対応する変異)。
5つのバージョンの軽鎖変異体をクローニングした(LC1、LC2、LC3、LC4、LC5)。可変鎖の操作設計によって導入された変異は、ハイライトされているか、あるいは下線が引かれている。
固相アッセイのために、インテグリン(α2−I−ドメイン:α2−I−ドメイン GST aa 140−339(TBS/5mM Mn2+中),50μl/ウェル;)を、96ウェルプレート(Corning Costar, 3690)上で、室温で終夜固定化した。次いで25μl/ウェルのブロッキング溶液(5% BSA(クルード)(A7906),1×TBS)を加え、そして廃棄した。200μl/ウェルのブロッキング溶液を加え、3時間室温で放置した。洗浄工程(200μl/ウェル 結合バッファー(1×TBS及び0.1% BSA(A7638)及び2mM Mn2+;TBS:150mM NaCl,25mM Tris(Fluka 93371) pH7.4)で3回)の後、サンプルを、室温で3時間(静止)、下記の50μlと共にインキュベートした:
a)ビオチン化コラーゲンのみ−コントロール(10μl 結合バッファー及び40μlビオチン化コラーゲン)
b)10μl/ウェル化合物(compound)、40μl/ウェル ビオチン化コラーゲン
c)ブランク:50μl/ウェル 結合バッファー。
血管新生におけるインテグリン抗a2mabの活性を評価するために、HUVEC細胞を用いるインビトロアッセイを行なった。マトリゲル(Matrigel)(BD Biosciences, #3
54230)を、I型コラーゲン(BD Biosciences #35429)(matrigel 1/3.25, PBS 5× 1/5,コラーゲンI 1mg/ml,qsp水)と混和し、37℃、5%CO2で1時間インキュベートした。粘着したHUVEC細胞を、Acutase溶液を用いて培養フラスコから注意深く引き離し、遠心分離し、そして培養液培地(EBM,FCS 2%,EGFブレットキット(EGF bullet kit))中、1.2×105細胞/mlで再懸濁した。100μlの細胞懸濁液を、抗a2mab及びFGF2(Peptrotech,10ng/ml)の階段希釈液の存在下又は非存在下でマトリックスを含むウェルに加え、そして37℃、5%CO2で18時間インキュベートした。管腔形成の検出のために、クレシルバイオレット溶液を加え、そして37℃で30分間インキュベートした。管腔形成は、ウェル当たりの管腔長の合計を測定することによって決定された。算出は、Image Proand software(MediaCybernetics)を用いて、ネガティブコントロール(FGF2を含まない)及びポジティブコントロール(FGF2を含むが、抗a2mabを含まない)と対比して行なわれ、1つの条件で6回(6 replicats per condition)測定した。一致する結果が図2に示されている。抗アルファ2インテグリンmABでは、FGF2によって誘発される血管新生を用量依存的に阻害することが可能であった。
タンパク質−タンパク質相互作用検討のために、組み換えによって発現されたインテグリンα2β1インテグリン、又はインテグリン α2β1インテグリンのI−ドメインを、TBSバッファー中、4℃で終夜、96ウェルプレート(Corning Costar 3690)にコートした。過剰のタンパク質を洗い流した後、このプレートをBSA溶液(5% Sigma A7906)でブロッキングし、そして再び洗浄した。α2インテグリンMabの階段希釈液を、プレート及びビオチン化コラーゲン(ラット尾,Sigma C8897)に加えた。これは4%HSAの存在下又は非存在下で行なわれた。室温で2時間インキュベーションした後、このプレートを再び洗浄した。Extravidin Peroxidase溶液(Sigma E2886)を加え、そしてこのプレートを暗室で20分間インキュベートした。測定は、405nMでElisa reader(SpectraMax190 Molecular Devices)で行なわれた。阻害%及びIC50が知られている標準品と対比して算出された。
すべてのヒト化変異体及びコンパレーター(comparator)の凝集パーセンテージ(aggregation percentage)がどうかについて試験した。TSKgel SWXLガードカラム(TosohBioscience)と共に、TSKgel G3000SWXLカラム(7.8mm ID×30.0cm L,TosohBioscience)を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーをAEKTA explorer 10(GE Healthcare)によって行なった。30μlのサンプル(0.4〜1mg/ml)を注入し、そしてクロマトグラフィーをランニングバッファーとして100mM Na2SO4、100mM Na2HPO4、0.05% NaN3 pH 6.7を用い、1ml/分、そして280nmの検出波長で行なった。このカラムをゲルろ過分子量マーカー(gel filtration molecular weight markers (Sigma Aldrich))を用いてキャリブレートした。データ評価を、ユニコーンソフトウェア v5.11(Unicorn software v5.11)(GE Healthcare)を用いて行なった。
Biacore 3000(GE Healthcare)による表面プラズモン共鳴テクノロジーが精製ヒト化抗体の詳細な速度論的キャラクタリゼーションのために使用された。抗ヒトFc特異性抗体(MAB1302, Millipore)によってキャプチャーされた抗インテグリン抗体を用いて、キャプチャーアッセイ(capture assay)が使用され、そしてインテグリンα2I−ドメインがアナライトとして使用された。通例、120RUの抗インテグリン抗体が、固定化抗ヒトFc特異的抗体によってキャプチャーされ(研究グレードCM5)、その結果、この抗体に結合したI−ドメインの30RUのRmaxがもたらされた。4mM MgCl2(10mM HEPES pH 7.4,150mM NaCl,0.005% 界面活性剤P20)を補充したHBS−Pバッファー中、0.8〜25nM I−ドメインの濃度範囲にわたり、30μl/分の流速で結合カイネティクス(Binding kinetics)が測定された。チップ表面を10mM グリシン pH 2.5で再生した。参照として固定化抗ヒトFc特異的抗体を含むフローセル(flow cell)を用いて、速度論的パラメーターを解析し、そしてBIA評価プログラムパッケージ(BIAevaluation program package)(バージョン4.1)で算出した。質量移動を有する1:1結合モデルが、抗体又はの0.8〜25nMのアナライト濃度に相当する曲線データのグローバルフィッティングに適用された。
−組み合わせ LC1/HC1(ヒト化のみに対応する変異)
−組み合わせ LC3/HC3(ヒト化及び安定化に対応する変異)
−組み合わせ LC3/HC4(ヒト化及び安定化及び抗凝集に対応する変異)。
グラフティングによる変異体変異(variant mutation)は、非ヒト化mAbに近接していた。
非ヒト化抗アルファ2mAb、コンパレーターmAbのエピトープを検証するために、エピトープキャラクタリゼーションが表面プラズモン共鳴テクノロジーを用いてBiacore 3000(GE Healthcare)によって行なわれた。非ヒト化抗アルファ2mAbに相当するFabフラグメントをアミン反応性カップリングによって500RUでCM5チップ上に固定した。このインテグリンI−ドメインを10μl/分でFabフラグメントによってキャプチャーし、そして短時間の解離期間の後、抗体 TMC2206を、30μl/分でα2I−ドメインに結合させた。再生を10mM グリシンバッファー pH 2.0を用いて行なった。第二の実験では、コンパレーターmAb TMC2206を、抗ヒトFc特異的抗体(MAB1302 Millipore)の表面上にキャプチャーした。次いでこのインテグリンI−ドメイン、引き続いて非ヒト化Fabを結合させた。この結果は、図13及び図14から得ることができる。この結果によると、コンパレーター抗体 TMC2206が非ヒト化Fabによってプレバインディング(prebound)されたインテグリンI−ドメインに結合することが明瞭に示された。
α2β1インテグリンは血液血小板で発現され、それらのコラーゲンへの粘着において重要な役割を演じているので、こうした細胞を用いる血小板結合試験のためのインビトロアッセイシステムが使用された。血小板結合試験のために、プレート(Isoplate, Perkin
Elmer, F1450 571)をTBS中、室温で1時間、コラーゲン(Sigma C8897)でコートした。ウェルをTBSで繰り返し洗浄し、その後、抗α2インテグリンmAbの階段希釈液を加えた。ヒルジン、PGE1及びReoProで抗凝固され、そしてカルセインAM(CalceinAM)(C-3099 Molecular Probes)で標識された、新たに調製したヒト多血小板血漿、又は新たに単離されたヒト血小板を加え、そして光から保護して室温で90分間インキュベートした。洗浄後、プレートを492nM 励起、535nM 放出でM5リーダー(M5 reader)(Molecular Devices)で測定した。阻害%及びIC50を、アルファ2インテグリン又は非ヒト化アルファ2mABの小分子阻害剤を用いて作成された滴定曲線と対比して算出した。結果は表12から得ることができる。
−組み合わせ LC1/HC1(ヒト化のみに対応する変異)
−組み合わせ LC3/HC3(ヒト化及び安定化に対応する変異)
−組み合わせ LC3/HC4(ヒト化及び安定化及び抗凝集に対応する変異)
−組み合わせ LC5/HC7(グラフティングによるヒト化に対応する変異)
熱安定性に関する結果は、表14にまとめられている。この抗体は、コンパレーターと同等な、等しい又は良好な熱安定性を示す。熱安定性測定は、PCRサーモサイクラー(PCR thermocycler)(My−IQ−10〜90℃の温度範囲(1℃/分)で2回)を用いて行なわれた。PBSバッファー中に希釈された抗体の2マイクログラムが40Xサイプロオレンジ(40XSYPRO Orange)(Invitrogen)に補充された。
Claims (31)
- 下記のコンポーネントa)〜f):
a)LCDR1[ここで、LCDR1は、RASESVESYGNSFIY(配列番号6)である]、
b)LCDR2[ここで、LCDR2は、LASNLAS(配列番号7)である]、
c)LCDR3[ここで、LCDR3は、QQNNEDPYT(配列番号8)である]、
d)HCDR1[ここで、HCDR1は、GYTFTSYWMN(配列番号3)である]、
e)HCDR2[ここで、HCDR2は、RIDPSDSETHYNQKFK(配列番号4)である]、及び
f)HCDR3[ここで、HCDR3は、VGRGYFDY(配列番号5)である]
を含んでなる単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、
そして上記において、CDRは、以下のアミノ酸置換:
HCDR2における6Asp→GluおよびLCDR1における11Asn→Gln、または
HCDR2における12Asn→Alaおよび16Lys→Gln
を有していてもよく、コンポーネントa)〜f)は、単離されたモノクローナルモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントのα2インテグリンへの結合を可能にするように配置されている、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。 - 請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、
(i)単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントは、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジ
スルフィド連結Fv、scFv、(scFv)2、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多
特異性抗体、デュアル特異性抗体、アイソタイプ抗体、デュアル可変ドメイン抗体及び二特異性抗体であり;
及び/又は
(ii)単離されたモノクローナル抗体は、ヒトIgM定常ドメイン、ヒトIgGl定常ドメイン、ヒトIgG2定常ドメイン、ヒトIgG3定常ドメイン、ドメイン、ヒトIgG4定常ドメイン、ヒトIgE定常ドメイン、及びヒトIgA定常ドメインから成る群より選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含んでなり;
及び/又は
(iii)
−配列番号1、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有する配列、及び/又は
−配列番号2、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有する配列、及び/又は
−配列番号9、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有する配列、及び/又は
−配列番号10、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有する配列、及び/又は
−配列番号11、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有する配列
のアミノ酸配列を含んでなり、
又は
(iv)
−配列番号1、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有する配列、及び
−配列番号2、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有する配列、及び
−最大50個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成され、
又は
(v)
−配列番号9、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有する配列、及び
−配列番号10、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有する配列、及び
−最大50個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成され、
又は
(vi)
−配列番号9、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有する配列、及び
−配列番号11、又はそれに対して少なくとも90%の同一性を有する配列、及び
−最大50個の付加アミノ酸残基
よりなるアミノ酸配列で構成される、上記単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。 - 請求項2に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、
−配列番号1に対して少なくとも90%の同一性を有する配列は、9位、12位、15位、22位、34位、46位、47位、80位、83位、85位、87位及び/又は89位のアミノ酸での1つ又はそれより多い変異を含んでなり;及び/又は
−配列番号2に対して少なくとも90%の同一性を有する配列は、5位、7位、11位、12位、17位、20位、38位、40位、43位、55位、61位、65位、66位、67位、76位、81位、82位、87位、91位、93位、112位、113位及び/又は116位のアミノ酸での1つ又はそれより多い変異を含んでなる、上記単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。 - 前記抗体又はフラグメントが、ヒトα2−インテグリンのI−ドメインにnMレベルの結合親和性で特異的に結合する、請求項2又は3に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 前記単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントが、インビトロでヒトα2インテグリンのコラーゲンとの相互作用を阻害し、それによって、血小板と該コ
ラーゲンの粘着による該血小板の活性を阻害する、請求項2〜4のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。 - 重鎖可変領域(VH)ドメインが、配列番号2のVH配列に対して、少なくとも90%の配列同一性を有している、請求項2〜5のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 前記重鎖可変領域(VH)ドメインが、配列番号2の配列を含んでなる、請求項6に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 軽鎖可変領域(VL)ドメインが、配列番号1のVL配列に対して、少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項2〜7のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 前記軽鎖可変領域(VL)ドメインが、配列番号1の配列を含んでなる、請求項8に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 重鎖可変領域(VH)ドメインが、配列番号2の配列におけるH5、H7、H11、H12、H17、H20、H38、H40、H43、H55、H61、H65、H66、H67、H76、H81、H82、H87、H91、H93、H112、H113及びH116から成る群より選択される位置における1つ又はそれより多いアミノ酸置換を含んでなる、請求項2〜9のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 1つ又はそれより多いアミノ酸置換が、5His→Val、7Pro→Ser、11Leu→Val、12Val→Lys、17Pro→Ser、20Leu→Val、38Lys→Arg、40Arg→Ala、43Arg→Gln、55Asp→Glu、61Asn→Ala、65Lys→Gln、66Asp→Gly、67Lys→Arg、76Ser→Thr、81Ile→Met、82Gln→Glu、87Thr→Arg、91Ser→Thr、93Val→Lys、112Thr→Leu、113Leu→Val及び116Ser→Valから成る群より選択される、請求項10に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 軽鎖可変領域(VL)ドメインが、配列番号1の配列におけるL9、L12、L15、L22、L34、L46、L47、L80、L83、L85、L87、及びL89から成る群より選択される位置における1つ又はそれより多いアミノ酸置換を含んでなる、請求項2〜11のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 1つ又はそれより多いアミノ酸置換が、9Ala→Ser、12Ala→Ser、15Leu→Val、15Leu→Pro、22Ser→Thr、34Asn→Gln、46Gln→Lys、47Ala→Pro、80Asp→Asn、83Glu→Gln、85Asp→Glu、87Ala→Thr及び89Thr→Asnから成る群より選択される、請求項12に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 重鎖可変領域(VH)ドメインが、配列番号38(HC1)、配列番号39(HC2)、配列番号40(HC3)、配列番号41(HC4)、配列番号42(HC5)、配列番号43(HC6)、及び配列番号44(HC7)から成る群より選択されるVH配列に対して、少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項2〜13のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 前記重鎖可変領域(VH)ドメインが、配列番号38(HC1)、配列番号39(HC2)、配列番号40(HC3)、配列番号41(HC4)、配列番号42(HC5)、配列番号43(HC6)、及び配列番号44(HC7)から成る群より選択されるVH配列を含んでなる、請求項14に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 軽鎖可変領域(VL)ドメインが、配列番号33(LC1)、配列番号34(LC2)、配列番号35(LC3)、配列番号36(LC4)、及び配列番号37(LC5)から成る群より選択されるVL配列に対して、少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項2〜15のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 前記軽鎖可変領域(VL)ドメインが、配列番号33(LC1)、配列番号34(LC2)、配列番号35(LC3)、配列番号36(LC4)、及び配列番号37(LC5)から成る群より選択されるVL配列を含んでなる、請求項16に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 前記抗体又は結合部分が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項1〜17のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- ヒトIgG4定常ドメインを含んでなる、請求項1〜18のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする1つ又はそれより多い核酸。
- α2インテグリン関連障害若しくは疾患の処置、予防又は診断において使用するための請求項1〜19のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント。
- 核酸(複数を含む)がベクター内に位置している、請求項20に記載の核酸(複数を含む)。
- 請求項20又は22に記載の核酸の1つを異種発現する、細胞。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを生産する方法であって、請求項23に記載の細胞を該単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントの発現を可能にする条件のもとで培養する工程を含んでなる、上記方法。
- 医薬として使用するための、請求項1〜19のいずれか1項に記載の少なくとも1つの単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント、及び/又は請求項20又は22に記載の少なくとも1つの核酸を含んでなる、医薬組成物。
- α2インテグリン関連疾患又は障害を処置し又は予防する際に使用するための請求項25に記載の医薬組成物。
- α2インテグリン関連疾患又は障害が、血栓症、血管疾患、血管新生及び転移を含むがん、炎症、炎症性疾患、自己免疫疾患及び異常な又は増加した新脈管形成によって特徴付
けられる疾患、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、移植に対する反応、視神経炎、脊髄外傷、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症、レイノー症候群、実験的自己免疫性脳脊髄炎、シェーグレン症候群、強皮症、心血管疾患、乾癬、及び炎症反応を誘発する感染症から成る群より選択される、請求項26に記載の医薬組成物。 - 血管疾患及び/又は血栓症を処置し、又は予防する際に使用するための請求項26に記載の医薬組成物。
- 急性冠動脈症候群、経皮的冠動脈インターベンション、虚血性脳卒中、頸動脈狭窄又は末梢動脈閉塞性疾患の処置において使用するための請求項26に記載の医薬組成物。
- a)包装材料、
b)請求項1〜19若しくは21のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント、又はその製薬学的に許容される塩、又は請求項25〜29のいずれか1項に記載の医薬組成物を含んでなり、
c)該単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントがα2インテグリン関連疾患・障害の処置に有効であることを示している、ラベル又は該包装材料内に含まれるパッケージインサート、
を含んでなる物品。 - α2インテグリン関連障害若しくは疾患の診断のための診断キットであって、請求項1〜19のいずれか1項に記載の単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント、及び適切な包装、及び、α2インテグリンの検出する際に該単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを使用するための適切な使用説明書を含んでなる、上記キット。
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