KR20140008298A - α２ 인테그린에 결합하는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및 이와 관련된 방법 및 용도 - Google Patents

α２ 인테그린에 결합하는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및 이와 관련된 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 α2 인테그린에 결합하는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 당해 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들), 당해 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 생산하는 재조합체 세포, 당해 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 생산하는 방법, 당해 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 또는 핵산(들)을 포함하는, 의약으로서 사용하기 위한 약제학적 조성물, α2 인테그린의 검출 방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

α２ 인테그린에 결합하는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및 이와 관련된 방법 및 용도{PEPTIDE OR PEPTIDE COMPLEX BINDING TO α2 INTEGRIN AND METHODS AND USES INVOLVING THE SAME}
본 발명은 치료, 예방 또는 진단시 사용하기 위한 α2 인테그린에 결합하는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들), 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 생산하는 재조합 세포, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 생산하는 방법, 의약으로서 사용하기 위한 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 또는 핵산(들)을 포함하는 약제학적 조성물, α2 인테그린의 검출 방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.
인테그린은 인접한 세포 및/또는 세포외 기질(ECM)에서 부착 분자들 사이의 상호작용을 매개하는 막관통 단백질(transmembrane protein)이다. 인테그린은 발달 및 상처 치유 동안의 세포 이동, 세포 분화 및 세포자멸사(apoptosis)를 포함하는 몇몇의 생물학적 프로세스에서 다양한 역할을 담당한다. 이들의 활성은 또한 종양 세포의 전이 및 침입 가능성을 조절할 수 있다. 이들은 α 및 β 서브유닛으로 이루어진 이종이량체(heterodimer)로 존재한다. 일부 α 및 β 서브유닛은 서로에 대해 특이성을 나타내며 VLA[극 후기 항원(very late antigen)] 구성원으로서 설계될 수 있다. 이종이량체는 흔히 특정 세포 부착 분자, 또는 ECM의 구성성분에 우선적으로 결합한다. 이들은 촉매 활성(catalytic activity)을 가지고 있지 않지만, 인테그린은 국소 부착(focal adhesion)으로 공지된 다중분자 시그널링 복합체의 일부일 수 있다.
리간드에 결합시, 인테그린은 세포내 시그널을 아웃사이드-인 시그널링(outside-in signaling)으로 언급되는 이들 세포 부착 사건에 대한 반응시 세포 활성을 조절하는 세포골격에 대한 세포내 시그널을 유도한다. 이러한 시그널링은 또한 인사이드-아웃 시그널링(inside-out signaling)으로 언급되는, 동일한 세포에서 발현된 다른 인테그린 아형을 활성화시킬 수도 있다. 인사이드-아웃 시그널링은 α 및 β 서브유닛 사이의 클래스프(clasp)의 파괴와 같은 세포 세포질내에서 기원하는 조절 시그널을 통해 추가로 발생하고, 이는 이어서 수용체의 외부 리간드-결합 도메인으로 전송된다. 인테그린은 발달, 기관 형태발생, 생리학 및 병리학, 및 정상 조직 항상성, 및 면역 및 혈전 반응을 조절하는 세포 부착 사건에서 중요한 역할을 담당할 수 있고, 또한 이들은 세포에 대한 환경적 센서로서 작용한다.
인테그린 이종이량체 중 하나는 α2β1 인테그린이다. α2β1 인테그린은 내피 및 상피 세포, 섬유아세포, 림프구, 및 혈소판을 포함하는 몇몇의 상이한 세포 유형에서 발현된다. α2β1의 리간드 특이성은 세포 유형에 따라 변한다. 이것은 혈소판 및 섬유아세포에서 콜라겐 수용체로서 작용하지만, 이는 내피 및 상피 세포에서 콜라겐 및 라미닌 수용체 둘 다로서 작용할 수 있다.
α2β1 인테그린은 α 인테그린의 계열의 α2 인테그린 서브유닛, 및 β 인테그린의 계열 유래의 β1 인테그린의 서브유닛으로 구성된 분자이다. α2 및 β1 인테그린의 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Takada and Hemler J. Cell Biol. 109(1):397-407, 1989 및 Argraves, W.S, J. Cell. Biol. Sep 105(3): 1183-90 (1987)]에 공개되어 있다. 서열의 예는 도 9에 나타나 있으며, 추가의 서열은 National Centre for Biotechnology Information(NCBI) 데이터 베이스로부터, 예를 들면, 호모 사피엔스(homo sapiens) α2 및 β1 인테그린의 경우 NCBI 수탁번호 제NP_002194호, 제NM_002203호, 제NM_002211호, 제NP_002202호(β1 인테그린 이소형 1A)하에 검색될 수 있고, 또한 하기를 참조한다.
대안의 스플라이스 변이체(splice variant), 이소형뿐만 아니라 비-사람 기원(예를 들면, 설치류 - 마우스, 래트 등 - 유인원 또는 기타)의 서열도 당해 분야에 공지되어 있으며, 이들이 α2 또는 β1 인테그린의 공지된 기능들 중 적어도 하나를 나타내는 한 가능한 대안의 실시형태를 나타낸다.
α2 서브유닛은 I(또는 삽입된) 도메인으로서 흔히 언급된 아미노 말단 근처에 위치한 대략 200개의 아미노산 도메인을 함유하는 인테그린 α 서브유닛의 서브세트의 구성원이다. α2 및 인테그린 서브유닛 I 도메인을 포함하는 많은 I 도메인은 추가의 양이온 결합 부위인, 금속 이온-의존성 부착 부위(MIDAS) 모티프(motif)를 함유한다. α2 인테그린 I 도메인의 구조적 특징화는 예를 들면, 문헌[참조: Dickeson et. al., J. Biol. Chemistry, 272, 7661-7668 (1997)]에 공개되어 있다. I 도메인은 리간드 결합시 중요한 결정인자이다. 사람 α2 인테그린 I 도메인의 아미노산 서열은 α2 인테그린 서열(서열번호 20)에 표시된 바와 같이, 도 9로부터 획득될 수 있다.
α2β1 인테그린(극 후기 항원 2; VLA-2)은 혈소판, 혈관 내피 세포, 상피 세포, 활성화된 단핵구/대식세포, 섬유아세포, 백혈구, 림프구, 활성화된 호중구 및 비만 세포를 포함하는 각종 세포 유형에서 발현된다. α2β1에 대한 천연의 리간드는 콜라겐 및 라미닌을 포함하며, 이들 둘 다는 세포외 기질에서 발견된다. α2β1 인테그린은 콜라겐-유도된 혈소판 응집, 콜라겐상의 세포 이동, 콜라겐 섬유의 세포-의존적 재조직화뿐만 아니라 사이토킨 발현 및 증식에서 증가를 초래하는 콜라겐-의존성 세포 반응, T-세포, 비만 세포의 양상, 및 호중구 기능, 지연된 유형의 과민성(hypersensitivity) 접촉 과민증 및 콜라겐-유도된 관절염의 양상, 유선관 형태형성(mammary gland ductal morphogenesis), 표피 상처 치유, 및 VEGF-유도된 혈관형성과 관련된 공정을 포함하는 몇몇의 생물학적 및 병리학적 공정에 관여하여 왔다.
혈소판은 일반적으로 불활성 휴지기 상태에서 혈액내에 순환하지만, 이들은 상처 부위에서 광범위한 효능제에 대해 신속하게 반응하도록 준비되어 있다. 자극시, 이들은 형태 변화를 겪으며 피브리노겐 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor: vWf)와 같은 혈장 단백질, 기타 혈소판, 및 혈관 벽의 내피 라이닝(lining)과 고도로 반응성이 된다. 이들 상호작용은 모두 협동하여 지혈성 피브린 혈소판 플러그(plug)의 신속한 형성을 촉진한다(참조: Cramer, 2002 in Hemostasis and Thrombosis, 4th edition). 리간드에 결합시, 혈소판 수용체는 아웃사이드-인 시그널링 경로를 유도하며, 이는 궁극적으로, 혈소판 피브리노겐 수용체, αIIbβ3 인테그린과 같은 2차 수용체의 활성화를 초래하여, 혈소판이 응집되는 인사이드-아웃 시그널링을 개시한다. 혈소판의 약간의 활성화조차 혈소판 혈전 반응, 저혈소판증 및 출혈 합병증을 초래할 수 있다.
α2 인테그린은 혈소판에서 발현된 유일한 콜라겐-결합 인테그린이며 콜라겐에 대한 혈소판 부착 및 지혈에 있어 일부 역할을 하는 것으로 관련되어져 왔다[참조: Santoro et al., Thromb. Haemost. 74:813-821 (1995); Vanhoorelbeke et al., Curr Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3(2): 125-40 (2003); Sarratt et al., Blood 106(4): 1268-1277 (2005)]. 따라서, 알파 2 인테그린 기능의 불활성화는 혈소판 응집을 부정적으로 방해하도록 하기 위해 바람직할 수 있다. 하나의 이러한 종류의 억제는 예를 들면, 불활성 상태에서 인테그린을 잠그는(lock) 알로스테릭 억제(allosteric inhibition)일 수 있다.
인테그린/리간드 상호작용은 염증이 있는 조직내로 백혈구 유출을 촉진할 수 있으며[참조: Jackson et al., J. Med. Chem. 40:3359-3368 (1997); Gadek et al., Science 295(5557): 1086-9 (2002), Sircar et al., Bioorg. Med. Chem. 10:2051-2066 (2002)], 염증 부위에서 전-염증 세포의 이동, 재순환 및 활성화를 포함하는, 염증성 자극에 대한 반응시 조직내로의 순환으로부터 백혈구의 초기 유출을 수반하는 하류 현상(downstream event)에 역할을 담당한다[참조: Eble J. A., Curr Pharm Des. 11(7):867-880 (2005)].
α2 인테그린의 차단은 류마티스 관절염의 뮤린 모델 및 염증성 장 질환의 모델에서 지연된 과민성 반응 및 효능에 대한 영향을 보여주고[참조: Kriegelstein et al., J. Clin. Invest. 110(12): 1773-82 (2002); de Fougerolles et al., J. Clin. Invest. 105:721-720 (2000)], 시험관내에서 내피 세포 증식 및 이동을 약화시키는 것으로[참조: Senger et al., Am. J. Pathol. 160(1): 195-204 (2002)] 보고되어 왔으며, 이는, α2 인테그린의 차단이 각종 암에서 관찰되는 바와 같이 비정상이거나 정상보다 높은 혈관형성을 예방/억제할 수 있음을 제안한다. 또한, 래트 결장직장암 수술 모델에서 α2-인테그린 억제는 효과적인 항-전이성인 것으로 밝혀졌다[참조: van der Bji et al, Hepatology 47(2): 532-543 (2008)]. 결장직장 암 세포의 계통 관련성은 또한 악성 표현형으로부터 변화될 수 있다[참조: Kirkland et al J Biol Chem 283(41): 27612-27619 (2008)]. α2 인테그린은 췌장암에서 악성 표현형을 매개하는 것으로 밝혀졌으므로[참조: Grzesiak and Bouvet, Br J Cancer 94: 1311-1319 (2006)] 응집성 암의 당해 유형에 있어서 치료학적 접근에 대한 당해 표적을 입증한다. 또한, α2β1 인테그린은 전립선암의 진행시 당스핑고지질(glycospingolipid)과 상호작용하며, 이는 이러한 상호작용의 차단이 이러한 유형의 암에 대해 치료학적으로 사용될 것임을 제안한다[참조: van Slambrouck et al., Int J Onco 35: 693-699 (2009)]. 실험적 자가면역 뇌염(EAE), 다발성 경화증(MS)의 뮤린 모델에서, α2 인테그린은 질환, 억제된 임상적 징후 및 CNS의 염증의 발생 직후에 제공된, 항-α2 항체를 사용한 치료로서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다[참조: Tsunoda et al Brain Pathol 17:45-55 (2007)]. 항-α2 항체의 이러한 치료학적으로 유익한 작용의 메커니즘은 거의 α2β1 인테그린과 Clq 상보체 단백질의 상호작용의 억제에 기인한다. 이러한 상호작용은 비만 세포-탈과립화 및 비만-세포 활성화에서 제1 단계이며, 이는 MS, 전신 홍반성 루푸스, 사구체신염과 같은 자가면역 및 염증성 질환에 포함된다[참조: McCall-Culbreath et al Blood 111(3562-3570) 2008].
따라서, α2 인테그린은 흥미있는 의학적 표적이다. 인테그린은 특정 억제제의 개발을 위한 어려운 표적이므로, 많은 상이한 가능한 치료학적 징후(indication)의 관점에서, α2 인테그린에 결합하는 대안적 억제제, 특히, α2 인테그린-관련 장애의 치료시 사용될 수 있는, 존재하는 α2 인테그린 억제제와 비교하는 경우 어느 정도 상이한 특성을 나타내는 알파 2 인테그린의 억제제가 요구되고 있다.
본 발명은 치료, 예방 또는 진단에 사용하기 위한 α2 인테그린 항체, 항원 결합 단편 및 다른 결합 분자, 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들), 결합 분자를 생산하는 재조합체 세포, 결합 분자를 생산하는 방법, 의약으로서 사용하기 위한 결합 분자 또는 핵산(들)을 포함하는 약제학적 조성물, α2 인테그린의 검출 방법 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.
이를 위하여, α2 인테그린에 대한 모노클로날 항체가 생성되었고, 이의 특성에 대해 시험하였다. 이는 실시예에서 기술된 바와 같은 유리한 특성을 제공한다. 특히, 항-α2 인테그린 항체 및 이의 1가의 단편 또는 유도체는 결합 상수, 교차-반응성, 도메인 맵핑(domain mapping) 및 시험관내 기능적 데이터를 포함하는 실험 데이터의 세트로 특성화되어 왔다.
모노클로날 항체(mAb)는 α2-인테그린의 I-도메인에 nM 친화성으로 결합하는 것으로 밝혀졌으며, 여기서 결합은 알파 2 인테그린 I 도메인도 표적화하는 당해 분야의 상태의 비교인자 항체에 의해 결합된 에피토프와는 상이한 I 도메인내 에피토프에서 명백하게 발생한다. 본 발명에 따른 항체의 모든 가공된 분자(IgG4 mAb, Fab)는 바이아코어 실험(Biacore experiment)에서 비교가능한 온(on)- 및 오프(off)-속도를 나타낸다. 이들은 영장류 α2β1 인테그린에 대해 교차-반응성을 나타내고, 한편 관련된 종 유래의 혈소판을 이용하여 시험한 바로 마우스, 래트, 개, 기니아 피크, 돼지 또는 토끼 α2β1 인테그린에 대해 검출되어 왔다.
시험한 분자는 시험관내에서 재조합체 α2 인테그린과 콜라겐의 상호작용을 낮은 nM IC50 값으로 억제한다. 콜라겐의 억제 이외에, 항-α2β1 인테그린 mAB 또는 Fab 단편은 분리된 사람 혈소판 및 사람 혈소판이 풍부한 혈장 둘 다에서 정적 조건하에서 혈소판 부착을 억제할 수 있다. 또한, 이들은 콜라겐 피복된 표면에서 유동하에 혈전 형성을 억제할 수 있다. 콜라겐 결합을 차단함으로써 콜라겐에 대한 혈소판 부착을 차단하는 능력은 혈전 형성에 있어 최초 단계들 중 하나이다.
최종적으로, mAb 또는 Fab는, GPIIbIIIa 활성화 또는 P-셀렉틴 표면 발현에서의 증가가 mAb에 대한 약 30명의 공여자에서 관찰되지 않았으므로 혈소판 활성화를 유발하지 않았다. 따라서, 본 발명은 1가의 항체, 항체 단편 또는 유도체 및 하기에 열거된 것으로서 α2-인테그린 관련 장애의 치료를 위한 제조 연구, 진단 및 치료 제제에 대한 이들의 용도를 제공한다: 구체적인 실시예는 혈전, 다른 혈관 질환, 암 및 신생-혈관형성, 다발성 경화증과 같은 자가-염증성 질환의 병리학적 결과를 포함한다.
당해 분야의 숙련가에게 알려져 있는 바와 같이, 항체의 결합 특성은 가변 도메인에 의해 매개된다. 항원에 대한 결합을 위해, 중쇄 기원의 가변 도메인 및 경쇄 기원의 동시-작용성 가변 도메인이 일반적으로 항체에 존재하며, 동시-작용을 허용하도록 배열된다. 또한, 가변 도메인은 FV 영역으로 언급된다. 보다 구체적으로, 경(VL) 쇄 및 중(VH) 쇄 상의 각각 3개의 가변 루프는 항원에 대한 결합에 관여한다. 이들 루프는 상보성 결정 영역(CDR), 즉 VL의 경우 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 VH의 경우 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 언급된다. 중쇄 기원의 가변 도메인과 경쇄 기원의 동시-작용성 가변 도메인의 상이한 배열의 다양성은 당해 분야에 공지되어 있다. 따라서, 중쇄 기원의 하나 이상의 적합한 가변 도메인 및 경쇄 기원의 하나 이상의 동시-작용성 가변 도메인을 확인하는 것이 중요하였다. 서열 정렬에 의해, 경쇄와 중쇄의 CDR은 상기 명시된 α2 인테그린 항체에 대해 확인되어 왔다.
제1 양상에서, 본 발명은 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 바람직하게는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 특이적으로 결합하고, 상기 항체 또는 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하며, 여기서 상기 항체 또는 단편은 비-사람 영장류 α2-인테그린과 교차-반응하지만 비-영장류 α2-인테그린과는 교차-반응하지 않는다.
제2 양상에서, 본 발명은 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 바람직하게는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 특이적으로 결합하고, 상기 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하며, 여기서 상기 항체 또는 단편은 참조 항체의 에피토프에 결합하기 위해 참조 항체와 경쟁하고, 상기 참조 항체는 DSMZ에 수탁번호 제DSM 23944호하에 기탁된 플라스미드에 의해 암호화되는 경쇄 및 (i) DSMZ에 수탁번호 제DSM 23946호하에 기탁된 플라스미드 또는 (ii) DSMZ에 수탁번호 제DSM 23945호하에 기탁된 플라스미드에 의해 암호화되는 중쇄를 포함한다.
제3 양상에서, 본 발명은 다음 성분 a 내지 f 중 하나 이상을 포함하는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 관한 것이며:
(a) LCDR1[여기서, LDR1은
Figure pct00001
(서열번호 6) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다],
(b) LCDR2[여기서, LDR2는
Figure pct00002
(서열번호 7) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다],
(c) LCDR3[여기서, LDR3은
Figure pct00003
(서열번호 8) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다],
(d) HCDR1[여기서, HDR1은 (
Figure pct00004
, 서열번호 3) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다],
(e) HCDR2[여기서, HDR2는
Figure pct00005
(서열번호 4) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다], 및
(f) HCDR3[여기서, HDR3은
Figure pct00006
(서열번호 5) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다],
여기서, 성분 a) 내지 f) 중 하나 이상은 α2 인테그린에 대한 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 결합을 허용하도록 정렬된다.
제4 양상에서, 본 발명은 α2-인테그린-관련 장애 또는 질환의 치료, 예방 또는 진단시 사용하기 위한 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 관한 것이다.
제5 양상에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들)에 관한 것이다.
제6 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 중 하나를 이종으로 발현하는 세포에 관한 것이다.
제7 양상에서, 본 발명은 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 발현을 허용하는 조건하에서 본 발명에 따른 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포로부터 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 임의로 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
제8 양상에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및/또는 본 발명의 적어도 하나의 핵산을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제9 양상에서, 본 발명은 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법으로서,
a) α2 인테그린을 포함하는 샘플을 특허청구범위 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계;
b) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 대한 상기 α2 인테그린의 결합을 검출하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)의 결합을 참조물질(reference)과 비교하는 단계(여기서, 참조물질에 대해 상대적인 샘플내 변경된 α2 인테그린 결합은 질환의 지표이다)를 포함하는, 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
제10 양상에서, 본 발명은
a) 포장 재료(packaging material),
b) 특허청구범위 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및
c) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가 질환 또는 장애, 특히 α2 인테그린-관련된 질환 장애의 치료에 유효함을 나타내는, 상기 포장 재료 내에 함유된 포장 삽입물 또는 라벨(label)을 포함하는 제조 제품에 관한 것이다.
제11 양상에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및 적합한 포장, 및 가능하게는 α2 인테그린의 검출시 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 사용하기에 적합한 지침서를 포함하는 α2 인테그린 관련된 장애 또는 질환의 진단을 위한 진단 키트(diagnostic kit)에 관한 것이다.
제12 양상에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및/또는 본 발명의 하나 이상의 핵산 또는 본 발명의 약제학적 조성물 중 하나를 사용하여 α2 인테그린-관련된 장애 또는 질환을 치료 또는 진단하는 방법에 관한 것이다.
제13 양상에서, 본 발명은 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법으로서,
a) 채취된 개인의 샘플을 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 대한 α2 인테그린의 결합을 검출하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)의 결합을 하나 이상의 참조 샘플(reference sample) 중의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 대한 α2 인테그린의 결합과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서, 하나 이상의 참조 샘플에서 검출된 결합에 대해 상대적인 채취된 샘플내 변경된 결합이 질환의 지표인, 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이고, 여기서 상기 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 특이적으로 결합하고, 상기 항체 또는 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하며, 여기서, 상기 항체 또는 단편은 비-사람 영장류 α2-인테그린과 교차-반응하지만 비-영장류 α2-인테그린과는 교차-반응하지 않는다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서, 상기 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 특이적으로 결합하고, 상기 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하며, 여기서, 상기 항체 또는 단편은 참조 항체의 에피토프에 대한 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하며, 상기 참조 항체는 DSMZ에 수탁번호 제DSM 23944호 하에 기탁된 플라스미드에 의해 암호화되는 경쇄, 및 (i) DSMZ에 수탁번호 제DSM 23946호 하에 기탁된 플라스미드 또는 (ii) DSMZ에 수탁번호 제DSM 23945호 하에 기탁된 플라스미드에 의해 암호화되는 중쇄를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 상기 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 nM 결합 친화성으로 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 상기 항체 또는 단편은 시험관내에서 사람 α2-인테그린과 콜라겐의 상호작용을 억제함으로써, 상기 콜라겐에 대한 상기 혈소판의 부착으로 인하여 혈소판의 활성화를 억제한다.
하나의 실시형태에서, 상기 중쇄 가변 영역 도메인은 서열번호 5의 중쇄 HCDR3을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 중쇄 가변 영역 도메인은 서열번호 3 (HCDR1), 서열번호 4 (HCDR2), 및 서열번호 5 (HCDR3)의 중쇄 CDR, 또는 이의 기능적 활성 변이체를 포함한다. 하나의 실시형태에서, HCDR2의 기능적 활성 변이체는 6번 아미노산 위치에서 돌연변이 Asp→Glu를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 경쇄 가변 영역 도메인은 서열번호 8의 경쇄 LCDR3을 포함한다. 다른 실시형태에서, 경쇄 가변 영역 도메인은 서열번호 6(LCDR1), 서열번호 7(LCDR2), 및 서열번호 8(LCDR3)의 경쇄 CDR, 또는 이의 기능적 활성 변이체를 포함한다. 하나의 실시형태에서, LCDR1의 기능적 활성 변이체는 11번 아미노산 위치에서 돌연변이 Asn→Gln을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 중쇄 가변 영역(VH) 도메인은 서열번호 2의 VH 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 도메인은 서열번호 2의 서열 또는 이의 기능적 활성 변이체를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 경쇄 가변 영역(VL) 도메인은 서열번호 1의 VL 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 경쇄 가변 영역(VL) 도메인은 서열번호 1의 서열 또는 이의 기능적 활성 변이체를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 중쇄 가변 영역(VH) 도메인은 H5, H7, H11, H12, H17, H20, H38, H40, H43, H55, H61, H65, H66, H67, H76, H81, H82, H87, H91, H93, H112, H113 및 H116으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 5His→Val, 7Pro→Ser, 11Leu→Val, 12Val→Lys, 17Pro→Ser, 20Leu→Val, 38Lys→Arg, 40Arg→Ala, 43Arg→Gln, 55Asp→Glu, 61Asn→Ala, 65Lys→Gln, 66Asp→Gly, 67Lys→Arg, 76Ser→Thr, 81Ile→Met, 82Gln→Glu, 87Thr→Arg, 91Ser→Thr, 93Val→Lys, 112Thr→Leu, 113Leu→Val 및 116Ser→Val로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 경쇄 가변 영역(VL) 도메인은 L9, L12, L15, L22, L34, L46, L47, L80, L83, L85, L87, 및 L89로 이루어진 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 9Ala→Ser, 12Ala→Ser, 15Leu→Val, 15Leu→Pro, 22Ser→Thr, 34Asn→Gln, 46Gln→Lys, 47Ala→Pro, 80Asp→Asn, 83Glu→Gln, 85Asp→Glu, 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 실시형태에서, 중쇄 가변 영역(VH) 도메인은 서열번호 38(HC1), 서열번호 39(HC2), 서열번호 40(HC3), 서열번호 41(HC4), 서열번호 42(HC5), 서열번호 43(HC6), 및 서열번호 44(HC7)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 중쇄 가변 영역(VH) 도메인은 서열번호 38(HC1), 서열번호 39(HC2), 서열번호 40(HC3), 서열번호 41(HC4), 서열번호 42(HC5), 서열번호 43(HC6), 및 서열번호 44(HC7)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 경쇄 가변 영역(VL) 도메인은 서열번호 33(LC1), 서열번호 34(LC2), 서열번호 35(LC3), 서열번호 36(LC4), 및 서열번호 37(LC5)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다. 다른 실시형태에서, 경쇄 가변 영역(VL) 도메인은 서열번호 33(LC1), 서열번호 34(LC2), 서열번호 35(LC3), 서열번호 36(LC4), 및 서열번호 37(LC5)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL 서열을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 항체 또는 결합부는 키메라 항체 또는 사람화된 항체이다. 다른 실시형태에서, 항원 결합부는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화물 연결된 Fv, scFv, 및 (scFv)2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 결합부는 다중 특이적 항체, 이중 특이적 항체, 이소형 항체, 이중 가변 도메인 항체 및 이특이적인 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 결합부는 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgG1 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인, 및 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 항체 또는 결합부는 사람 IgG4 불변 도메인을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원 결합부의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은 재조합체 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은, 항체가 숙주 세포에 의해 생산되도록 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양함을 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 항체, 또는 항원 결합부 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 다른 양상에서, 본 발명은 α2-인테그린과 관련된 장애 또는 질환을 치료, 예방 또는 진단하는 것이 요구되는 대상체에게 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, α2-인테그린과 관련된 장애 또는 질환을 치료, 예방 또는 진단하는 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에서, α2 인테그린과 관련된 질환 또는 장애는 혈전증, 혈관 질환, 신생-혈관형성 및 전이를 포함하는 암, 염증, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 비정상적이거나 증가된 혈관형성을 특징으로 하는 질환, 염증성 장 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 이식에 대한 반응, 시신경염, 척수 외상, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창(SLE), 다발성 경화증, 레이노이드 증후군, 실험적 자가면역 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 강피증, 심혈관 질환, 건선, 및 염증 반응을 유도하는 감염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, α2 인테그린과 관련된 질환 또는 장애는 급성 관상 증후군, 경피적 관상동맥 중재술(percutaneous coronary intervention), 허혈성 뇌졸중, 경동맥 협착증 또는 말초 동맥 폐쇄성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
도면:
도 1a 및 도 1b는 HUVEC MesoScale Technology에서 하이브리도마 상청액으로부터 정제된 항-α2 인테그린 mAB의 결합을 나타낸다.
도 2는 HUVEC 혈관형성에 있어서 하이브리도마 상청액으로부터 정제된 항-α2 인테그린 mAb의 효과를 나타낸다. 항-α2 인테그린 mAb는 FGF2-유도된 혈관형성을 용량-의존적인 방식으로 억제할 수 있었다.
도 3은 항-α2 인테그린 mAB-Fab에 의한 유동하에 콜라겐에 대한 혈소판 부착의 억제를 나타낸다. 항-응집된 사람 혈액을 10분 동안 DiOC6(3) 염료 및 항-α2 인테그린 Fab의 일련의 희석액과 함께 37℃에서 항온처리한다. 이어서, 혈액을 3000s-l의 전단 속도로 콜라겐-피복된 모세관을 통해 유동시킨다. 피복된 부위의 대표적인 실시예로서 10장의 사진으로부터, 표면 피복률을 계산한다. 값은 항-α2 인테그린 Fab의 용량-의존성 효과로서 상기 표면 피복률의 억제 백분율(%)을 나타낸다.
도 4는 하이브리도마 상청액으로부터의 α2 mAb 및 마카카 원숭이(macaca)(도 4a 및 도 4b) 및 사람(도 4c 및 도 4d)으로부터의 혈액 샘플을 사용한 FACS 분석에 의해 수행된 종간 교차 반응성 연구를 나타내며, 도 4a 및 도 4c는 1차 항체를 사용하지 않고 2차 항체만을 사용한 음성 대조군을 나타낸다.
도 5: 도 5a는 하이브리도마에 의해 생산된 항-α2 인테그린 모노클로날 마우스 항체의 가변 경쇄의 아미노산 서열(서열번호 1) 및 암호화 서열(서열번호 12)을 나타낸다. 도 5b는 항-α2 인테그린 모노클로날 마우스 항체의 가변 중쇄의 아미노산 서열(서열번호 2) 및 암호화 서열(서열번호 13)을 나타낸다. 아미노산 서열에서, CDR은 굵은 글씨체로 밑줄쳐져 있다.
도 6: 항-α2 인테그린 모노클로날 마우스 항체의 상이한 CDR의 아미노산 서열을 나타내며, 여기서 도 6a는 중쇄 CDR를 나타내고, 도 6b는 서열번호 3의 HCDR1, 서열번호 4의 HCDR2, 서열번호 5의 HCDR3, 서열번호 6의 LCDR1, 서열번호 7의 LCDR2, 서열번호 8의 LCDR3을 갖는 경쇄 CDR을 나타낸다.
도 7은 상기 쥐 가변 경쇄 영역(서열번호 1) 또는 가변 중쇄 영역(서열번호 2)을 실시예에 기술된 바와 같이 사람 불변 영역(의 일부)에 커플링시켜 생성된 키메라 작제물의 서열을 나타낸다. 도 7a는 키메라 경쇄의 아미노산(서열번호 9) 및 암호화(서열번호 14) 서열을 나타내고, 도 7b는 키메라 중쇄의 아미노산(서열번호 10) 및 암호화(서열번호 15) 서열을 나타내며, 도 7c는 키메라 중쇄 Fab 단편의 아미노산(서열번호 11) 및 암호화(서열번호 16) 서열을 나타낸다. 아미노산 서열에서, CDR은 밑줄쳐져 있고, α2 가변 도메인을 나타내는 서열은 굵은 활자체이고 His tag는 이탤릭체이다.
도 8은 키메라 작제물의 생성에 사용된 상이한 사람 불변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다: 서열번호 17은 사람 IGKC 단백질, 서열번호 9에 따른 경쇄 키메라의 생성에 사용된 것으로서 Swiss-Prot 수탁번호 제Q502W4호에 따른 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열이고, 서열번호 18은 사람 돌연변이된 IGHG4, 서열번호 10에 따른 중쇄 키메라의 작제에 사용된 바와 같이 Swiss-Prot 수탁번호 제P01861.1호에 따른 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열이며(돌연변이된 아미노산은 굵은 활자체이다), 서열번호 19는 사람 IGHG1 단백질, 서열번호 11에 따른 중쇄 Fab 단편 키메라의 생성에 사용된 바와 같은 Swiss-Prot 수탁번호 제Q569F4호에 따른 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열이다.
도 9는 NP_002194.2에 따른 α2 인테그린 전구체 단백질의 아미노산 서열인 서열번호 20을 가진 사람 α2 및 β1 인테그린의 아미노산 및 암호화 서열을 나타낸다. 실험을 위해 사용되고 이. 콜라이에서 재조합적으로 발현된 I-도메인은 밑줄쳐진 굵은 활자체이다. 서열번호 21은 NCBI 수탁번호 제NM_002203.3호에 따른 α2 인테그린의 암호화 서열이고, 서열번호 22는 NCBI 수탁번호 제NP_002202.2호에 따른 β1 인테그린 이소형 1A 전구체 단백질의 아미노산 서열이며, 서열번호 23은 NCBI 수탁번호 제NM_002211.3호에 따른 β1 인테그린 이소형 1A의 암호화 서열이다.
도 10은 마우스 하이브리도마로부터 및 MS에 의해 입증된 원래의 뮤린 항-α2 인테그린 항체의 아미노산 및 암호화 서열을 나타내고: 서열번호 45(도 10a)는 항-α2 인테그린 mAB의 LC를 암호화하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열이며, 서열번호 46(도 10b)은 HC 항-α2 인테그린 mAB를 암호화하는 cDNA의 뉴클레오타이드 서열이며, 서열번호 47(도 10c)은 하이브리도마로부터 분비된 것으로서 항-α2 인테그린 mAB의 LC의 아미노산 서열이고, 서열번호 48(도 10d)은 하이브리도마로부터 분비된 것으로서 항-α2 인테그린 mAB의 LC의 아미노산 서열이다. 서열번호 53(도 10e)은 비교인자 mAb TMC2206의 LC의 아미노산 서열이고, 서열번호 54(도 10f)는 비교인자 mAb TMC2206의 HC의 아미노산 서열이다.
도 11은 바이아코어에 의해 측정된 것으로서 상이한 알파2 인테그린 항체의 해리 상수를 나타낸다. 당해 결과는 많은 경우에 mAb TMC2206보다 우수하거나 적어도 동일한 해리 상수를 나타낸다.
도 12는 바이아코어[초 단위의 시간(s)(x-축) 대 반응 단위(RU)에서의 차이(y-축)]를 사용하여 측정한 비-사람화된 Fab에 의해 예비-결합된 인테그린 α2 I 도메인에 대한 비교인자 mAb TMC2206의 결합을 나타낸다. 도 12로부터 획득될 수 있는 바와 같이, TMC2206은 비-사람화된 Fab에 의해 예비-결합된 인테그린 I 도메인에 결합한다.
도 13은 비교인자 mAb TMC2206[초 단위의 시간(x-축) 대 (RU) 반응 단위에 있어서의 반응 차이(y-축)]에 의해 예비-결합된 인테그린 α2 I 도메인에 대한 비-사람화된 Fab의 결합을 나타낸다. 도 13으로부터 획득될 수 있는 바와 같이, 비-사람화된 Fab는 비교인자 mAb TMC2206에 의해 예비-결합된 인테그린 α2 I 도메인에 결합한다.
도 14는 세척된 혈소판을 사용하는 정적 조건하에서 콜라겐에 대한 혈소판 부착의 억제를 나타낸다. 배치(batch) 660은 LC1/HC1에 상응하고, 배치 661은 LC2/HC2에 상응하며, 배치 662는 LC3/HC3에 상응하고, 배치 663은 LC3/HC4에 상응하며, 배치 664는 LC4/HC5에 상응하고, 배치 665는 LC4/HC6에 상응하며, 배치 666은 LC5/HC7에 상응하고, 배치 667은 비교인자이다. 당해 결과는 또한 표 12로부터 유도될 수 있다. 배치 번호 660, 662, 및 663은 mAb TMC2206과 같이 콜라겐에 대한 혈소판 부착의 적어도 동일한 또는 보다 우수한 억제를 나타낸다.
정의
본 발명을 하기에 상세히 설명하기 전에, 본 발명이 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜 및 시약들이 변할 수 있으므로 이들에 한정되지 않음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 전문용어가 특정 실시형태만을 설명할 목적으로 존재하는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는, 본 발명이 속하는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
바람직하게는, 본원에 사용된 용어는 문헌[참조: "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland]에 기술된 바와 같이 정의된다.
후술되는 당해 명세서 및 특허청구범위 전체에서, 내용이 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 기술된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 도입을 내포하나 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
몇몇의 문헌(예를 들면, 특허, 특허 출원, 과학적인 공보, 제조업자의 명세서, 지침서, GenBank 수탁번호 서열 제출 등)은 본 명세서의 내용 전체에서 인용되어 있다. 본원의 어느 것도 본 발명이 선행 발명으로 인하여 이러한 기재내용을 예상할 수 있음을 인정하는 것으로 고려되지 않아야 한다. 본원에 인용된 문헌들 중 일부는 "참조로 인용된"으로 특징화된다. 이러한 인용된 참조문헌의 정의 또는 교시와 본 명세서에 인용된 정의 또는 교시 사이의 충돌이 일어나는 경우, 본 명세서의 내용이 우선한다.
서열: 본원에 언급된 모든 서열은 이의 전체 내용 및 기재내용과 함께, 본 명세서의 일부인 첨부된 서열 목록에 기재되어 있다.
수치와 관련하여 사용된 경우 용어 "약"은 나타낸 수치보다 5% 더 작은 하한치를 갖고 나타낸 수치보다 5% 더 큰 상한치를 갖는 범위 내의 수치를 포함함을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "알파 2 인테그린" 또는 "α2 인테그린"은 당해 분야에 공지된 바와 같은 알파 2 인테그린, 바람직하게는 사람 알파 2 인테그린 및 특히 서열번호 21에 나타낸 핵산 서열 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는 사람 알파 2 인테그린, 또는 이의 생물학적 활성 단편을 말한다. 용어 "I 도메인"은 서열번호 20에서 밑줄 및 굵은 활자체로서의 알파 2 인테그린의 일부를 말한다.
용어 "특이적으로 결합하다", "특이적으로 결합하는" 등은, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 예를 들면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 생리학적 조건하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성함을 의미한다. 특이적인 결합은 적어도 약 1x10-6 M 이하(예를 들면, KD가 작을수록 결합이 강력함을 나타낸다)의 평형 해리 상수를 특징으로 할 수 있다. 2개 분자가 특이적으로 결합하는지를 측정하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 그러나, 알파 2 인테그린에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종으로부터 알파 2 인테그린 분자와 같은 다른 항원과 교차-반응을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 본 발명의 α2 인테그린-특이적인 항체는 비-특이적인 항원(예를 들면, 비-영장류 α2 인테그린)에 대한 이의 친화성보다 적어도 2배 더 큰 친화성으로 사람 및 비-사람 영장류 α2 인테그린 둘 다에 결합한다. 또한, 그럼에도 불구하고 알파 2 인테그린 및 하나 이상의 추가의 항원에 결합하는 다중-특이적 항체(예를 들면, 이특이적)는 본원에 사용된 바와 같이, 알파 2 인테그린에 "특이적으로 결합하는" 항체로 고려된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "KD"는 특정 펩타이드/펩타이드-복합체 - 표적 분자 또는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 나타내는 것으로 의도된다. 평형 해리 상수는 전형적으로 "몰/L"("M"로 약기)로 측정된다.
"느린 해리 속도(slow off rate)", "Koff" 또는 "kd"는 표면 플라스몬 공명, 예를 들면, BIACORE™으로 측정시, 알파 2 인테그린으로부터 1 x 10-3s-1 이하, 바람직하게 1 x 10-4s-1 이하의 속도 상수로 해리되는 펩타이드/펩타이드 복합체 또는 항체를 의미한다.
용어 "고 친화성" 항체는, 표면 플라스몬 공명, 예를 들면, BIACORE™ 또는 용액-친화성 ELISA로 측정시, 사람 알파 2 인테그린에 대한 결합 친화성이 적어도 10-10 M; 바람직하게 10-11 M; 더욱 더 바람직하게는 10-12 M인 mAb를 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표면 플라스몬 공명"은 예를 들면, BIACORE™ 시스템[제조원: Pharmacia Biosensor AB, 스웨덴 웁살라 및 뉴저지주 피스카타웨이 소재]을 사용하여 바이오센서 매트릭스(biosensor matrix)내에서의 단백질 농도의 변경을 검출함으로써 실시간 생체특이적인 상호작용의 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 말한다.
항원 결정인자로서도 공지되어 있는 "에피토프"는 면역계에 의해, 구체적으로는 항체, B 세포 또는 T 세포에 의해 인지된 항원의 영역이다. 본원에 사용된 바와 같이, "에피토프"는 본원에 기술된 바와 같이 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 결합할 수 있는 항원의 일부이다. 이와 관련하여, 용어 "결합"은 바람직하게는 본원에 정의된 바와 같은 "특이적 결합"에 관한 것이다. 에피토프는 일반적으로 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 그룹, 또는 설포닐 그룹과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 이루어지며, 특이적인 3차원 구조적 특징 및/또는 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 입체구조적 및 비-입체구조적 에피토프는 후자에 대한 결합이 아닌 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재하에서 손실된다는 점에서 구별될 수 있다.
"파라토프(paratope)"는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 일부이다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 4개의 폴리펩타이드 쇄(이황화물 결합에 의해 서로연결된 2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄)로 구성된 면역글로불린 분자를 말하는 것으로 의도된다. 용어 "항체"는 또한 항체, 특히 본원에 기술된 항체, 예를 들면, 원핵세포내에서 발현된 항체, 글리코실화되지 않은 항체, 및 하기 기술된 바와 같은 임의의 항원-결합 항체 단편 및 유도체의 모든 재조합체 형태를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역("HCVR" 또는 "VH") 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, CH2 및 CH3로 구성됨)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역("LCVR 또는 "VL") 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 골격 영역(FR)으로 명명된, 보다 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된, 고가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들면, 효과기 세포) 및 전통적인 보체 계통(classical complement system)의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 용어 알파2 항체, a2 항체, α2 항체, 알파2 인테그린 항체, a2 인테그린 항체, α2 인테그린 항체는 동의어로 사용되며 바람직하게는 억제성, 즉, 항-(알파2 항체, a2 항체, α2 항체, 알파2 인테그린 항체, a2 인테그린 항체, α2 인테그린 항체)를 말한다.
하나 이상의 CDR 잔기의 치환 또는 하나 이상의 CDR의 누락 또한 가능하다. 항체는 과학 문헌에 기술되어 왔으며, 여기서 1개 또는 2개의 CDR이 결합을 위해 생략될 수 있다. Padlan 등(참조: 1995 FASEB J. 9: 133-139)은 공개된 결정 구조를 기초로 항체와 이들의 항원 사이의 접촉 영역을 분석하였으며, 약 1/5 내지 1/3의 CDR 잔기만이 실제로 항원과 접촉한다고 결론지었다. Padlan은 또한 1개 또는 2개의 CDR이 항원과 접촉시 아미노산을 가지지 않는 다수의 항체를 발견하였다(또한, Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428 참조).
항원과 접촉하지 않은 CDR 잔기는 분자 모델링에 의해 및/또는 실험적으로 Chothia CDR 외부에 놓인 Kabat CDR의 영역으로부터 기존의 연구를 기초로 하여 확인될 수 있다(예를 들면, CDRH2내 잔기 H60 내지 H65는 흔히 요구되지 않는다). CDR 또는 이의 잔기(들)이 누락되는 경우, 이는 일반적으로 다른 사람 항체 서열 또는 이러한 서열의 콘센서스(consensus)내 상응하는 위치를 점유하는 아미노산으로 치환된다. CDR내 치환 위치 및 치환되는 아미노산은 또한 실험적으로 선택될 수 있다. 실험적 치환은 보존성 또는 비-보존성 치환일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 단편"(또는 단순히 "결합부")은 알파 2 인테그린에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장(full-length)의 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀져 왔다. 용어 항체의 "항원-결합 단편"내에 포함된 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편(VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 이루어진 1가 단편); (ii) F(ab')2 단편(힌지 영역에서 이황화물 브릿지(bridge)에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가의 단편); (iii) VH 및 CH 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편[참조: Ward et al., (1989) Nature 341 : 544-546]; (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR), 및 (vii) 합성 링커에 의해 임의로 결합될 수 있는 2개 이상의 분리된 CDR의 조합물을 포함한다. 또한, 비록 Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 암호화되어 있다고 해도, 이들은 이들을 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가의 분자[단일쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 참조: 예를 들면, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883]를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조되도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 단편"내에 포함되는 것으로 의도된다. 추가의 예는 (i) 면역글로불린 힌지 영역 폴리펩타이드에 융합된 결합 도메인 폴리펩타이드, (ii) 힌지 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역, 및 (iii) CH2 불변 영역에 융합된 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역을 포함하는 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질이다. 결합 도메인 폴리펩타이드는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역일 수 있다. 결합-도메인 면역글로불린 융합 단백질은 또한 US 2003/0118592 및 US 2003/0133939에 기재되어 있다. 이들 항체 단편은 당해 분야의 기술자에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되며, 단편들은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. "항원-결합 단편"의 추가의 예는 소위 마이크로항체이며, 이들은 단일 CDR로부터 유도된다. 예를 들면, Heap 등은 HIV-1의 gp120 엔벨로프 당단백질에 대해 지시된 항체의 중쇄 CDR3으로부터 유도된 17개 아미노산 잔기 마이크로항체를 기술하고 있다[참조: Heap CJ et al. (2005) J. Gen. Virol. 86: 1791-1800]. 다른 예는, 바람직하게는 동족(cognate) 골격 영역에 의해 서로 융합된 2개 이상의 CDR 영역을 포함하는 소 항체 모사체를 포함한다. 동족 VH FR2에 의해 연결된 VH CDR1 및 VL CDR3을 포함하는 이러한 소 항체 모사체는 Qiu 등의 문헌[참조: Qiu X-Q, et al. (2007) Nature biotechnology 25(8):921-929]에 기술되어 있다.
따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 또는 이의 항원-결합 단편"은 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉, 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원-결합 부위를 함유하는 분자를 말한다.
본 발명에서 사용가능한 항체 및 이의 항원-결합 단편은 조류 및 포유동물을 포함한 임의의 동물 기원일 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 단편은 사람, 침팬지, 설치류(예를 들면, 마우스, 래트, 기니아 피크 또는 토끼), 닭, 칠면조, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이, 또는 개 기원이다. 항체는 사람 또는 뮤린 기원인 것이 특히 바람직하다. 또한, 본 발명의 항체는 하나의 종, 바람직하게는 사람으로부터 유도된 항체 불변 영역이 다른 종, 예를 들면, 마우스로부터 유도된 항원 결합 부위와 결합된 키메라 분자도 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는, 비-사람 종으로부터(예를 들면, 마우스로부터) 유도된 항체의 항원 결합 부위가 사람 기원의 불변 및 골격 영역과 결합된 사람화된 분자를 포함한다.
본원에 예시된 바와 같이, 본 발명의 항체는 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 직접 수득될 수 있거나, 숙주 세포(예를 들면, CHO 세포, 또는 림프구 세포)내에서 클로닝되어 재조합적으로 발현될 수 있다. 숙주 세포의 추가의 예는 이. 콜라이(E. coli)와 같은 미생물, 및 효모와 같은 진균류이다. 대안으로, 이들은 형질전환 비-사람 동물 또는 식물내에서 재조합적으로 생산될 수 있다.
용어 "키메라 항체"는, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 각각의 일부분이 특정 종으로부터 유도되거나 특정 부류에 속하는 항체내 상응하는 서열과 상동이고, 한편, 쇄의 나머지 분절은 다른 종 또는 부류내 상응하는 서열과 상동 항체를 말한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 모사체 둘 다의 가변 영역은 하나의 종의 포유동물로부터 유도된 항체의 가변 영역을 모사하고, 한편 불변 부분은 다른 것으로부터 유도된 항체의 서열과 상동이다. 이러한 키메라 형태에 대한 하나의 명백한 이점은, 가변 영역이 예를 들면, 사람 세포 제제로부터 유도된 불변 영역과 함께 비-사람 숙주 유기체로부터의 하이브리도마 또는 용이하게 이용가능한 B-세포를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 편리하게 유도될 수 있다는 것이다. 가변 영역은 제제의 용이성의 이점을 갖고 공급원에 의해 특이성이 영향을 받는 것은 아니지만, 사람인 불변 영역은 항체가 주사되는 경우 비-사람 공급원으로부터의 불변 영역보다 사람 대상체로부터 면역 반응을 유발하는 경향이 보다 적다. 그러나, 이러한 정의는 당해 특정 실시예에 한정되지는 않는다.
용어 "사람화된 항체"는 실질적으로 비-사람 종으로부터의 면역글로불린으로부터 유도된 항원 결합 부위를 갖는 분자를 말하며, 여기서 분자의 나머지 면역글로불린 구조는 사람 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인 상에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 가변 도메인내의 적절한 골격 영역에 이식된 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 항원-결합 부위는 야생형일 수 있거나, 하나 이상의 아미노산 치환으로 변형될 수 있고, 예를 들면, 사람 면역글로불린에 보다 밀접하게 유사하도록 변형될 수 있다. 사람화된 항체의 일부 형태는 모든 CDR 서열(예를 들면, 마우스 항체로부터의 모든 6개의 CDR을 함유하는 사람화된 마우스 항체)을 보존한다. 다른 형태는 본래의 항체와 관련하여 변경된 하나 이상의 CDR을 갖는다.
항체를 사람화하기 위한 상이한 방법은 Almagro 및 Fransson에 의해 고찰된 바와 같이, 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 이의 내용은, 이의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있다[참조: Almagro JC and Fransson J (2008) Frontiers in Bioscience 13: 1619-1633]. Almagro 및 Fransson은 합리적 접근법과 실험적 접근법을 구별한다. 합리적 접근법은 가공된 항체의 변이체를 거의 생성시키지 않고 이들의 결합 또는 임의의 다른 흥미로운 특성을 평가함을 특징으로 한다. 설계된 변이체가 예측된 결과를 생성하지 않는 경우, 설계 및 결합 평가의 새로운 주기를 개시한다. 합리적 접근법은 CDR 이식, 재생(Resurfacing), 초사람화(Superhumanization), 및 사람 스트링 내용 최적화(Human String Content Optimization)를 포함한다. 대조적으로, 실험적 접근법은 사람화된 변이체의 거대 라이브러리의 생성 및 농축 기술 또는 고-배출 스크리닝(high-throughput screening)을 사용한 최고의 클론 선택을 기초로 한다. 따라서, 실험적 시도는 항체 변이체의 광대한 범위를 통하여 조사할 수 있는 신뢰가능한 선택 및/또는 스크리닝 시스템에 의존한다. 파지 디스플레이 및 리보솜 디스플레이와 같은 시험관내 디스플레이 기술은 이러한 요건을 충족하며 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 실험적 접근법은 FR 라이브러리, 안내된 선택, 골격-셔플링(Frame-shuffling), 및 휴머니어링(Humaneering)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람 항체"는 사람 배선 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 사람 mAb는 예를 들면, CDR 및 특히 CDR3내에 사람 배선 면역글로불린 서열(예를 들면, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적인 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람 항체"는, 다른 포유동물 종(예를 들면, 마우스)의 배선으로부터 유도된 CDR 서열이 사람 FR 서열에 이식된 mAb를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 사람 항체는 사람 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 사람 면역글로불린에 대한 형질전환 동물로부터 분리되고 예를 들면, Kucherlapati 및 Jakobovits에 의한 미국 특허 제5,939,598호에 기술된 바와 같이, 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 말한다. 모노클로날 항체는 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 하나의 실시형태에서, 모노클로날 항체는 무한증식 세포에 융합된 비-사람 동물, 예를 들면, 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "재조합 항체"는 (a) 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마와 관련하여 형질전환 또는 염색체삽입(transchromosomal)인 동물(예를 들면, 마우스)로부터 분리한 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들면, 이입세포(transfectoma)로부터 분리된 항체, (c) 재조합체, 조합성 항체 라이브러리로부터 분리한 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 대한 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱(splicing)을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 분리된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 제조하거나, 발현시키거나, 생성시키거나 분리한 모든 항체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "이입세포"는 CHO 세포, NS/0 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, 식물 세포, 또는 효모 세포를 포함한 진균류와 같은, 항체를 발현하는 재조합체 진핵 숙주 세포를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "이종 항체"는 이러한 항체를 생산하는 형질전환 유기체와 관련하여 정의된다. 당해 용어는 형질전환 유기체로 이루어지지 않고, 일반적으로 형질전환 유기체 이외의 다른 종으로부터 유도된 유기체에서 발견된 것에 상응하는 핵산 서열을 암호화하거나 아미노산 서열을 갖는 항체를 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 "이종하이브리드 항체"는 상이한 유기체 기원의 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 말한다. 예를 들어, 뮤린 경쇄와 관련된 사람 중쇄를 갖는 항체는 이종하이브리드 항체이다.
따라서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 "항체 및 이의 항원-결합 단편"은 폴리클로날, 모노클로날, 1가, 이특이적, 이종접합체, 다중 특이적, 재조합체, 이종, 이종하이브리드, 키메라, 사람화된(특히, CDR-이식된), 탈면역화된, 또는 사람 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, Fd, Fv, 이황화물-연결된 Fv(dsFv), 단일쇄 항체(예를 들면, scFv), 디아바디(diabody) 또는 테트라바디(tetrabody)[참조: Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14), 6444-6448], 나노바디(nanobody)(또한 단일 도메인 항체로 공지됨), 항-유전자형(항-Id) 항체(예를 들면, 본 발명의 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 상기 중 어느 하나의 에피토프-결합 단편을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
본원에 기술된 항체는 분리되는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같은 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 mAb를 실질적으로 포함하지 않는 항체(예를 들면, 알파 2 인테그린에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 알파 인테그린 이외에 다른 항원에 특이적으로 결합하는 mAb를 실질적으로 포함하지 않는다)를 언급하는 것으로 의도된다. 그러나, 알파 2 인테그린에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종으로부터 알파 2 인테그린 분자와 같은, 다른 항원에 대해 교차-반응성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "알파 2 인테그린의 생물학적 기능 또는 기능"은 유사하게 사용되며 베타1 인테그린에 대한 결합 및 이와의 복합체 형성, 콜라겐, 라미닌에 대한 결합과 같은 공지된 리간드 중 어느 하나에 대한 결합, 콜라겐-유도된 혈소판 응집, 혈전 반응의 유도, 저혈소판증, 콜라겐에서 세포 이동, 콜라겐 섬유의 세포-의존성 재구조화, 사이토킨 발현 및 증식을 증가시키는 콜라겐-의존성 세포 반응, T-세포, 비만 세포(mast cell) 또는 호중구 기능의 알파2 인테그린 또는 콜라겐-의존성 양상, 지연된 유형의 과민성의 알파 2 인테그린 또는 콜라겐-의존성 양상, 접촉성 민감성의 알파 2 인테그린 또는 콜라겐-의존성 양상, 콜라겐-유도된 관절염, 유선관 형태형성(mammary gland ductal morphogenesis), 상피 상처 치유, 및 VEGF-유도된 혈관형성과 관련된 공정과 같은, 그러나 이들에 한정되지 않는 알파 2 인테그린의 임의의 기능을 말한다.
본원에 사용된 바와 같은 "알파 2 인테그린 길항제"는, 특히 화학량론적 양으로 사용되는 경우, 알파 2 인테그린의 적어도 하나의 생물학적 활성, 바람직하게는 혈액 혈소판, 혈관 내피 세포, 상피 세포, 활성화된 단핵구/대식세포, 섬유아세포, 백혈구, 림프구, 활성화된 호중구 및/또는 비만 세포에 존재하는 알파 2 인테그린의 활성을 억제하는 화합물을 말한다. 본 발명의 바람직한 알파 2 길항제는 중화 항체이다.
본원에 사용된 바와 같은 "중화 항체"(또는 "알파 2 인테그린 활성을 중화하는 항체")는, 알파 2 인테그린에 대한 이의 결합이 알파 2 인테그린의 적어도 하나의 생물학적 활성의 억제, 바람직하게는 알파 2 인테그린의 활성을 활성화시키는 혈소판의 억제를 언급하는 것으로 의도된다. 알파 2 인테그린의 생물학적 활성의 억제는 당해 분야에 공지된 시험관내 또는 생체내 검정에서 몇몇의 표준 중 하나 이상에 의해 알파 2 인테그린 생물학적 활성의 하나 이상의 지표를 측정함으로써 평가할 수 있다. 이러한 검정의 예는 예를 들면, 본 발명의 실시예에 기술되어 있다.
알파 2 인테그린이 위에서 열거된 바와 같은 기능을 갖기 때문에, 알파 2 인테그린의 활성은 증가된 혈소판 활성과 관련된 것과 같은 몇몇의 질환에 영향을 갖는다. 따라서, 알파 2 인테그린을 표적화하거나 항-알파 2 인테그린 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 중화하는 억제성 펩타이드 또는 펩타이드 복합체와 같은, 알파 2 인테그린 길항제는 혈소판 활성과 같은 알파 2 인테그린의 효과를 감소시키거나 억제하는데 유용하다. 결과적으로, 알파 2 인테그린 길항제는 혈전증, 혈관 질환, 신생-혈관형성 및 전이를 포함하는 암, 염증, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 비정상적이거나 증가된 혈관형성을 특징으로 하는 질환, 염증성 장 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 이식체에 대한 반응, 시신경염, 척수 외상, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창(SLE), 다발성 경화증, 레이노이드 증후군, 실험적 자가면역 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 강피증, 심혈관 질환, 건선, 및 염증 반응을 유도하는 감염을 포함하나, 이들에 한정되지 않는, 몇몇의 이러한 질환을 완화시키거나, 개선시키거나, 억제하거나 예방하는데 유용하다.
구체적인 실시형태에서, 본원에 기술된 항-알파 2 인테그린 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세포독소, 화학치료 약물, 면역억제제 또는 방사선동위원소와 같은 치료학적 모이어티(moiety)에 접합될 수 있다("면역접합체").
"보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 그룹)를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 유사성 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존적 특성에 대해 상향으로 조절될 수 있다. 이러한 조절을 이루는 수단은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331]을 참조한다. 유사한 화학적 특성을 지닌 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹의 예는
1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신;
2) 방향족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌;
3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민;
4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 타이로신, 및 트립토판;
5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘;
6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및
7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다.
바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-타이로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안으로, 보존적 대체는 문헌[참조: Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-45]에 기술된 PAM250 log-유사 매트릭스(likelihood matrix)에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간 보존적" 대체는 PAM250 log-유사 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다. 공지된 유전 코드, 및 재조합 및 합성 DNA 기술이 제공됨으로써, 숙련된 과학자는 보존적 아미노산 변이체를 암호화하는 DNA를 용이하게 작제할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "비-보존적 치환" 또는 "비-보존적 아미노산 교환"은 상기에 나타낸 7개의 표준 아미노산 그룹 1) 내지 7) 중 상이한 그룹내에 열거된 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로 정의된다.
핵산 또는 이의 단편을 언급하는 경우, 용어 "실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실이 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)와 최적으로 정렬되는 경우, 하기 논의된 바와 같은, FASTA, BLAST 또는 GAP와 같은 서열 동일성의 임의의 잘-공지된 알고리즘으로 측정한 것으로서, 뉴클레오타이드 염기의 적어도 약 90%, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 뉴클레오타이드 서열 동일성이 존재함을 나타낸다.
폴리펩타이드에 적용되는 바와 같이, 용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은, 디폴트 갭 중량(default gap weight)을 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우, 2개의 펩타이드 서열이 적어도 90%의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다.
폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 전형적으로 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함한 각종 치환, 결실 및 다른 변형에 대해 지정된 유사성의 척도를 사용하여 유사한 서열을 부합시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 디폴트 매개변수를 사용하여 상이한 종의 유기체로부터 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인(mutein) 사이의 동종 폴리펩타이드와 같이 밀접하게 관련된 폴리펩타이드들 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정할 수 있는 GAP 및 BESTFIT와 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들면, GCG 버젼 6.1을 참조한다. 폴리펩타이드 서열은 또한 디폴트 또는 추천된 매개변수; GCG 버젼 6.1에서의 프로그램과 FASTA를 이용하여 비교할 수 있다. FASTA(예를 들면, FASTA2 및 FASTA3)는 질의와 조사 서열 사이의 가장 우수한 오버랩(overlap) 영역의 정렬 및 서열 동일성 퍼센트를 제공한다[참조: Pearson (2000) 상기 참조]. 본 발명의 서열을 상이한 유기체로부터의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 비교하는 경우 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 매개변수를 사용하는, 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들면, 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 및 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402]를 참조하고, 이들 각각은 본원에 참조로 인용된다.
서열 동일성의 퍼센트가 본 출원에서 언급되는 경우, 이들 퍼센트는, 구체적으로 달리 나타내지 않은 경우, 보다 긴 서열의 전장과 관련하여 계산된다. 보다 긴 서열의 전장과 관련된 이러한 계산은 핵산 서열 및 폴리펩타이드 서열 둘 다에 적용된다.
본원에 사용된 바와 같은 질환 또는 장애를 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 (a) 장애의 중증도 및/또는 기간의 감소; (b) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 진행의 제한 또는 예방; (c) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화 억제; (d) 장애(들)을 이미 가지고 있던 환자에서 장애(들)의 재발의 제한 또는 예방; 및 (e) 장애(들)에 대해 이미 증상이 있던 환자에서 증상의 재발의 제한 또는 예방 중 하나 이상을 달성함을 의미한다.
본원에 사용된 것으로서, 질환 또는 장애의 "예방하다", "예방하는", "예방", 또는 "예방학"은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 표현 "투여용이다" 및 "투여될"은 "투여하기 위해 제조된"과 동일한 의미를 갖는다. 즉, 활성 화합물이 "투여용이다"라는 기술은, 상기 활성 화합물이 제형화되어 용량으로 제조됨으로써 상기 활성 화합물이 이의 치료학적 활성을 발휘할 수 있는 상태로 되는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "치료학적 유효량" 또는 "치료량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 추구하고 있는 조직, 시스템, 동물 또는 사람의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발할 약물 또는 약제학적 제제의 양을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "예방학적 유효량"은, 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 조직, 시스템, 동물 또는 사람에서 예방하고자 하는 생물학적 또는 의학적 현상의 발생 위험을 예방하거나 감소시킬 약제학적 약물의 양을 의미하는 것으로 의도된다. 특히, 환자가 제공받는 용량은 혈전증, 혈관 질환, 신생-혈관형성 및 전이를 포함한 암, 염증, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 비정상적이거나 증가된 혈관형성을 특징으로 하는 질환, 염증성 장 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 이식에 대한 반응, 시신경염, 척수 외상, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창(SLE), 다발성 경화증, 레이노이드 증후군, 실험적 자가면역 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 강피증, 심혈관 질환, 건선, 및 염증 반응을 유도하는 감염으로 이루어진 그룹으로부터 바람직하게 선택된, α2 인테그린-관련 질환 또는 장애의 예방학적 또는 치유적 치료요법(예방, 개선 또는 치유)을 허용하기 위하여 알파2 인테그린 기능의 충분한 억제를 나타내는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 양을 달성하도록 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "환자"는 본원에 기술된 항체 및 이의 항원-결합 단편을 사용한 치료로부터 유리할 수 있는 임의의 포유동물 또는 조류를 의미한다. 바람직하게는, "환자"는 실험실 동물(예를 들면, 마우스 또는 래트), 가축(예를 들면, 기니아 피그, 토끼, 닭, 칠면조, 돼지, 양, 염소, 낙타, 소, 말, 당나귀, 고양이 또는 개), 또는 침팬지 및 사람을 포함한 영장류로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. "환자"는 사람인 것이 특히 바람직하다.
"약제학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 관리기관에 의해 승인되거나 미국 약전(U.S. Pharmacopeia)(United States Pharmacopeia-33/National Formulary-28 Reissue, published by United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville Md., publication date: April 2010) 또는 동물, 및 보다 특정하게는 사람에서 사용하기 위해 다른 일반적으로 인식된 약전에 열거됨을 의미한다.
본 발명의 치료 방법으로 치료가능한 구체적인 집단은 알파 2 인테그린-활성화 돌연변이(기능 돌연변이의 획득, "GOF")에 대해 나타낸 대상체, 바람직하게는 혈전증, 혈관 질환, 신생-혈관형성 및 전이를 포함하는 암, 염증, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 비정상적이거나 증가된 혈관형성을 특징으로 하는 질환, 염증성 장 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 이식에 대한 반응, 시신경염, 척수 외상, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창(SLE), 다발성 경화증, 레이노이드 증후군, 실험적 자가면역 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 강피증, 심혈관 질환, 건선, 및 염증 반응을 유도하는 감염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, α2 인테그린과 관련된 질환 또는 장애를 지닌 대상체를 포함한다.
본 발명의 실시형태
본 발명은 하기에 추가로 기술될 것이다. 하기 문단에서 본 발명의 상이한 양상이 보다 상세히 정의된다. 이렇게 정의된 각각의 양상은 달리 명확하게 나타내지 않는 한 임의의 다른 양상 또는 양상들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 나타난 임의의 특징도 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 바람직하거나 유리한 것으로 나타난 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1 양상은 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 바람직하게는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 특이적으로 결합하며, 상기 항체 또는 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하고, 여기서 상기 항체 또는 단편은 비-사람 영장류 α2-인테그린과 교차-반응하지만 비-영장류 α2-인테그린과 교차-반응하지 않는다.
본 발명의 제2 양상은 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 바람직하게 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 특이적으로 결합하고, 상기 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하며, 여기서 상기 항체 또는 단편은 참조 항체의 에피토프에 대해 결합하기 위해 참조 항체와 경쟁하며, 상기 참조 항체는 DSMZ에 수탁번호 제DSM 23944호하에 기탁된 플라스미드에 의해 암호화되는 경쇄 및 (i) DSMZ에 제DSM 23946호로 기탁된 플라스미드 또는 (ii) DSMZ에 수탁번호 제DSM 23945호로 기탁된 플라스미드에 의해 암호화되는 중쇄를 포함한다.
제3 양상에서, 본 발명은 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 관한 것이며, 여기서 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 하기 성분 a 내지 f:
LCDR1(여기서, LCDR1은
Figure pct00007
(서열번호 6) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다),
LCDR2(여기서, LCDR2는
Figure pct00008
(서열번호 7) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다),
LCDR3(여기서, LCDR3은
Figure pct00009
(서열번호 8) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다),
HCDR1(여기서, HCDR1은
Figure pct00010
(서열번호 3) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다),
HCDR2(여기서, HCDR2는
Figure pct00011
(서열번호 4) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다), 및
HCDR3(여기서, HCDR3은
Figure pct00012
(서열번호 5) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다) 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 하나 이상의 성분 a) 내지 f)는 α2 인테그린에 대한 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 결합을 허용하도록 또는 이종이량체성 α2β1 인테그린으로서 배열된다.
제4 양상에서, 본 발명은 α2-인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 치료, 예방 또는 진단에 사용하기 위한 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 관한 것이다.
서열번호 6 내지 8의 서열은 분석된 항체의 경쇄의 CDR이고 서열번호 3 내지 5의 서열은 분석된 항체의 중쇄의 CDR이다(서열 분석으로 측정됨). 본 발명에 따라서, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 상기 경쇄 CDR 또는 이의 기능적 활성 변이체 중 하나 및/또는 중쇄 CDR 또는 이의 기능적 활성 변이체 중 하나를 포함한다. 그 예는 1개 또는 2개 또는 3개의 상기 HCDR 및/또는 1개, 2개 또는 3개의 상기 LCDR을 임의의 허용가능한 조합으로 포함하는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시형태는 3개의 LCDR 및 3개의 HCDR(여기서, 이들 중 적어도 하나는 상기 CDR a 내지 f 중 하나이다)을 포함하는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체이다.
본 발명과 관련하여, 용어 LCDR 및 LDR은 동의어로 사용된다. 용어 HCDR 및 HDR에도 이와 동일하게 적용된다.
상기 CDR이 적합한 방식으로 배열된 경우, 당해 배열은 α2 인테그린에 대한 특이적인 결합을 허용한다. 항원의 결합을 허용하기 위한 CDR의 적합한 배열은 당해 분야에 공지되어 있다. 다양한 상이한 항체 양식 또는 결합 매개변수의 양식은 지금까지 개발되어 왔거나 확인되어 왔다. 이들 또는 임의의 다른 적합한 배열 중 어느 것도, 당해 양식 또는 배열이 α2 인테그린에 대한 특이적인 결합을 허용하는 한, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체에 대해 사용될 수 있다.
상기 서열번호에 의해 정의된 CDR 서열, 또는 이의 변이체는 하나의 (폴리)펩타이드-쇄내에 또는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체내에서 정렬될 수 있다. 이들이 하나의 (폴리)펩타이드-쇄내에 배열된 경우, 서열은 하나 이상의 링커 서열, 바람직하게 펩타이드 링커에 의해, 예를 들면, 융합 단백질로서 연결될 수 있다. 하나의 실시형태에 따라서, 이들은 당해 분야에 공지된 천연의 또는 인공의 항체 스캐폴드(antibody scaffold) 또는 골격내로 봉매(embedding)될 수 있다. 천연 항체의 경우, CDR은 보존된 골격 영역에 의해 가변 도메인내에서 지지된다. 골격은 하기에 보다 상세히 기술된, Fab, 단일쇄 항체 등과 같은 인공 항체를 수득하기 위해 변형될 수 있다.
CDR이 펩타이드 복합체내에 정렬되는 경우, 2개 이상의 (폴리)펩타이드는 수소 결합, 이온 결합, 반데르 발스 힘(Van der Waals force), 및 소수성 상호작용을 포함하는 비-공유 결합에 의해 서로 결합된다.
펩타이드는 직쇄내에 정렬된 2개 이상의 α-아미노산으로 이루어진 유기 화합물이다. 아미노산은 인접한 아미노산 잔기의 카복실 그룹과 아미노 그룹 사이의 펩타이드 결합에 의해 함께 결합된다. 일반적으로, 유전 암호는 20개의 표준 아미노산을 규정한다. 합성 후 또는 심지어 합성 동안, 단백질내 잔기들은 해독후 변형에 의해 화학적으로 변형될 수 있으며, 이는 물리적 및 화학적 특성, 폴딩(folding), 안정성, 활성을 변경시켜 궁극적으로 단백질의 기능을 변경시킬 수 있다. 본 발명의 상이한 양상에 따른 펩타이드는, 이들이 α2 인테그린에 결합할 수 있는 한 변형되거나 변형되지 않을 수 있다.
당해 분야에서, 용어 "폴리펩타이드"는, 선형 방식으로 펩타이드 결합에 의해 서로 커플링되어 폴리펩타이드 쇄를 형성하는 약 20개, 약 25개, 약 30개 이상의 아미노산을 포함하는 분자를 말한다. 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 이러한 종류의 보다 짧은 분자는 일반적으로 펩타이드로 언급된다. 용어 "단백질"은 일반적으로 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 분자를 말한다. 본 발명과 관련하여, 용어 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 동의어로 사용된다.
본 발명과 관련하여, 본 발명의 상이한 양상에 따른 용어 "펩타이드" 또는 "폴리펩타이드"는 상기에서 정의한 바와 같은 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 말하고, 용어 "펩타이드 복합체"는 상기에서 정의한 바와 같은 하나 이상의 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드를 포함하는 분자 복합체(예를 들면, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 및 다른 결합 분자)를 말한다.
본원에 정의된 바와 같은 펩타이드 및 이의 펩타이드 복합체는 α2 인테그린 항원을 선택적으로 인식하여 이에 특이적으로 결합한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "α2 인테그린에 대한 특이적인 결합"은 α2 인테그린에 또는 α2 인테그린 I 도메인에 또는 다른 인테그린 서브유닛과의 이종이량체 복합체에서와 같이 임의의 다른 폴리펩타이드와의 복합체내 α2 인테그린에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 능력을 말한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하거나, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어지거나 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 결합 특성을 기술하는데 사용된 경우, 본원에서 용어 "선택적인" 또는 "특이적인"의 사용은, 펩타이드/복합체가 α2 인테그린-특이적인 결합 부위(예를 들면, 분자가 2개의 기능에 결합하거나 발휘하도록 설계되고, 이 중 적어도 하나가 α2 인테그린에 특이적으로 결합하는 이특이적인 또는 이기능적인 분자에서와 같이)에 대해 추가의 명백한 특이성을 부여하도록 보충된 특이적인 예를 제외하고는, 기재된 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가 α2 인테그린 이외에 유의적인 결합을 나타내지 않는다는 사실을 말한다. 구체적인 실시형태에서, α2 인테그린-특이적인 펩타이드 또는 이의 복합체는 사람 α2 인테그린에 적어도 1.2 x 10-6의 KD로 결합한다. 구체적인 실시형태에서, α2 인테그린-특이적인 펩타이드 또는 이의 복합체는 사람 α2 인테그린에 5 x 10-7 이상, 2 x 10-7 이상, 또는 1 x 10-7 이상의 KD로 결합한다. 추가의 실시형태에서, α2 인테그린-특이적인 펩타이드 또는 이의 복합체는 사람 α2 인테그린에 1 x 10-8 이상의 KD로 결합한다. 다른 실시형태에서, α2 인테그린-특이적인 펩타이드 또는 이의 복합체는 사람 α2 인테그린에 5 x 10-9 이상 또는 1 x 10-9 이상의 KD로 결합한다. 추가의 실시형태에서, α2 인테그린-특이적인 펩타이드 또는 이의 복합체는 사람 α2 인테그린에 2 x 10-10 이상의 KD로 결합한다. 구체적인 실시형태에서, α2 인테그린-특이적인 펩타이드 또는 이의 복합체는 다른 단백질에 KD 초과로 결합하지 않는다. 다른 실시형태에서, α2 인테그린-특이적인 펩타이드 또는 이의 복합체는 α2 인테그린(예를 들면, 사람 및/또는 비-사람 영장류 α2 인테그린)에 비-특이적인 항원에 대한 이의 친화성보다 적어도 2배 큰 친화성으로 결합한다.
KD는 ka(특정 결합 분자-표적 단백질 상호작용의 결합 속도; 또한 kon으로서도 언급됨)에 대한 kd(특정 결합 분자-표적 단백질 상호작용의 해리 속도; 또한 koff로서도 언급됨)의 비로부터 수득된 해리 상수, 또는 몰 농도(M)로 표현된 kd/ka에 관한 것이다. KD 값은 당해 분야에 잘 확립된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 결합 분자의 KD를 측정하는 바람직한 방법은 실시예 1D에 기술되어 있다.
α2 인테그린-특이적인 펩타이드 또는 이의 복합체는 α2 인테그린/리간드 상호작용을 용량-의존적으로 억제하는 것으로 밝혀졌다(참조: 도 2 및 실시예). 따라서, α2 인테그린-특이적인 펩타이드 또는 이의 복합체는 α2 인테그린에 대한 콜라겐의 결합에 대응하는(counteract) 이들의 능력으로 특징화될 수 있다. 임의의 α2 인테그린-특이적인 펩타이드 또는 이의 복합체에 의한 억제 정도는 대조군에 대한 통계적 비교에서, 또는 당해 분야에서 이용가능한 임의의 대안적 방법을 통해 정량적으로 측정할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 억제율은 약 10% 억제 이상이다. 다른 실시형태에서, 억제율은 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이다.
또한, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 상기 서열의 기능적 활성 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 기능적 활성 변이체는 α2 인테그린에 결합하고, 임의로 α2 인테그린을 억제하는 능력을 포함한, 완전한 펩타이드에 의해 나타낸 것과 유사한 생물학적 활성을 가진 것을 특징으로 한다. 변이체는, 변이체의 활성(예를 들면, 임의로 KD로 표현된 결합 활성)이 서열 변경이 없는 펩타이드/복합체의 활성의 10% 이상, 25% 이상, 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상인 경우, 본 발명과 관련하여 기능적으로 활성이다. α2 인테그린에 대한 결합 활성을 측정하는 적합한 방법은 실시예에 제공된다. 기능적 활성 변이체는 제한된 수의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 다음 특징들 중 하나 이상에 의해 추가로 특징화된다:
(i) 1개, 2개 또는 3개의 성분 a) 내지 c)가 경쇄(VL)의 가변 도메인내에 포함되고,
(ii) 1개, 2개 또는 3개의 성분 d) 내지 f)가 중쇄(VH)의 가변 도메인내에 포함되며
(iii) 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 항체이고,
(iv) 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화물-연결된 Fv, scFv, (scFv)2, 이특이적 항체, 다중 특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 미니바디(minibody), 모노클로날 항체, 키메라 항체 또는 사람화된 항체이며,
(v) 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgG1 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인, 및 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하고,
(vi) 기능적 활성 변이체는 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상으로 이루어진 기능적 활성 단편이며,
(vii) 기능적 활성 변이체는 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 기능적 활성 변이체이며, 특히 여기서 기능적 활성 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로부터 유도되고,
(viii) 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는
- 서열번호 1, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및/또는
- 서열번호 2, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및/또는
- 서열번호 9, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및/또는
- 서열번호 10, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및/또는
- 서열번호 11, 또는 이의 기능적 활성 변이체의 아미노산 서열을 포함하고/하거나,
(ix) 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는
- 서열번호 9, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
- 서열번호 10, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
- 임의로 50개 이하의 추가의 아미노산 잔기(들), 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 추가의 아미노산 잔기(들)의 아미노산 서열로 이루어지고,
(x) 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는
- 서열번호 9, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
- 서열번호 11, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
- 임의로 50개 이하의 추가의 아미노산 잔기(들), 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 15, 1 내지 10, 또는 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 추가의 아미노산 잔기(들)의 아미노산 서열로 이루어진다.
서열번호 1 및 2는 도 5로부터 획득될 수 있고: 서열번호 1은 α2 인테그린 항체-가변 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열번호 2는 각각 가변 중쇄의 아미노산 서열이다.
서열번호 9, 10 및 11은 도 7로부터 획득될 수 있고: 서열번호 9는 IgG4 양식으로 생산된 항체의 키메라 경쇄의 아미노산 서열(밑줄친 CDR)이며, 서열번호 10은 IgG4 양식으로 생산된 항체의 키메라 중쇄(밑줄친 CDR)이고, 서열번호 11은 6개의 his 태그를 지닌 Fab 양식의 키메라 중쇄의 아미노산 서열이다. 불변 영역은 사람 서열 골격으로부터 유도되었다(참조: 실시예). 또한, 본 발명은 his 태그를 지니지 않은 항체 작제물 또는 단편, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체 중 어느 하나에 관한 것이다.
하나의 실시형태에 따라서, HC 및 LC의 가변 도메인은 각각의 불변 영역에 커플링되어 키메라 HC 또는 LC 작제물을 형성한다. 구체적인 실시형태는 IGKC 단백질의 불변 영역(예를 들면, 서열번호 9에서와 같음)에 융합된 키메라 α2 인테그린 항체 LC 가변 영역, IGHG4의 불변 영역(예를 들면, 서열번호 10에서와 같음)에 융합된 키메라 α2 인테그린 항체 HC 가변 영역 또는 IGHG1의 불변 영역 CH1 도메인(예를 들면, 서열번호 11에서와 같음)에 융합된 키메라 α2 인테그린 항체 HC 가변 영역이다.
상기에 상세히 설명한 바와 같이, 성분 a) 내지 c)(LC CDR) 및 d) 내지 f)(HC CDR)는, 생산되어 시험된 모노클로날 항체의 경쇄(VL)의 가변 도메인 및 중쇄(VH)의 가변 도메인 각각을 서열분석하여 수득하였다. 따라서, 이들은 동일하게 포함될 수 있다. 이는 임의의 천연 발생 VL 또는 VH 골격 또는 인공 VL 또는 VH 골격일 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 하나 이상의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)은 우세한 가변 도메인의 골격내, 즉, VL의 골격내 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 VH의 골격내 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3에 정렬된다. 이는, 상기에 기술된 임의의 적합한 방법에 의해 정의된 바와 같은 CDR(참조: 서열번호 1 및 2) 단독, 함께 또는 이의 임의의 조합이 나타내어진 이웃으로부터 제거되어 다른 (제2) 가변 도메인의 골격내로 이전함으로써 제2의 가변 도메인의 CDR을 치환시킬 수 있다. 다양한 가변 도메인 또는 항체 서열은 당해 분야에 공지되어 있으며 당해 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 목적한 CDR이 삽입된 가변 도메인은 임의의 배선으로부터 수득될 수 있거나 사람 가변 도메인으로 재배열될 수 있다. 가변 도메인은 또한 합성적으로 생산될 수 있다. CDR 영역은 재조합체 DNA 기술을 사용하여 각각의 가변 도메인내로 도입될 수 있다. 이것이 달성될 수 있는 하나의 수단은 문헌(참조: Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783)에 기술되어 있다. 가변 중쇄 도메인은 가변 경쇄 도메인과 쌍을 이루어 항원 결합 부위를 제공할 수 있다. 또한, 독립된 영역(예를 들면, 가변 중쇄 도메인 단독)을 사용하여 항원을 결합시킬 수 있다.
또한, 상기에 기술한 중쇄 또는 경쇄 키메라와 상기 단락에서 기술한 바와 같은 CDR 이식에 의해 생성된 인공적으로 생성된 경쇄 또는 중쇄의 조합은, 이들이 α2 인테그린 결합 특이성을 나타내는 한 허용가능하다.
본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드-복합체는 글리코실화될 수 있다. 단백질의 글리코실화 및 이의 생리학적 효과는 당해 분야에 공지되어 있다. 올리고사카라이드 성분은 물리적 안정성, 프로테아제 공격에 대한 내성, 면역계와의 상호작용, 약동학, 및 특이적인 생물학적 활성을 포함하는 치료학적 당단백질의 효능과 관련된 특성에 유의적으로(양성적 또는 음성적으로) 영향을 미칠 수 있다. 글리코실화된 단백질의 발현을 위해, 포유동물 숙주 세포가 당해 분야에서 일반적으로 사용된다[참조: Cumming et al., 1991, Glycobiology 1: 115-130; Jenkins et al., 1996, Nature Biotechn. 14: 975-981). 예는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, NSO- 및 SP2/0-마우스 골수종 세포를 포함한다. 형질전환 동물로부터의 글리코실화된 단백질의 생산이 또한 공개되었다(참조: Jenkins et al., 1996, 상기 참조). 또한, 글리코실 트랜스퍼라제 유전자를 이종으로 발현/과발현하는 가공된 재조합체 숙주 세포가 당해 분야에 공지되어 있다(참조: Bailey, 1991, Science 252: 1668-1675). WO 9954342(A1)는 개선된 기능을 갖는 것으로 보고된 2등분하는 GIcNAc를 수반하는 복합체 N-연결된 올리고사카라이드를 증가시키는 광범위한 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 활성을 발현하는 숙주 세포를 사용하여 글리코실화된 단백질을 생성하는 방법을 기재하고 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에 따라서, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체와 동일하지 않은 하나 이상의 분자(추가의 모이어티)에 커플링시킬 수 있으며, 전체 복합체는 "접합체"이다. 추가의 모이어티의 예는 예를 들면, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 핵산(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드, 또는 RNAi와 같은 RNA 분자) 또는 유기 (소)분자, 방사활성 모이어티와 같은 하나 이상의 추가의 생체분자를 포함한다. 이들 추가의 모이어티는 이들 자체의 기능, 예를 들면, 세포독성, 치료학적 활성, 면역억제 활성 등을 가지거나, 이들은 전체 접합체의 경우 다른 이유로(예를 들면, 접합체의 개선되거나 감소된 안정성 등) 유리할 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 추가의 모이어티에 접합된 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 포함한다. 항체, 이의 단편의 유도체인 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 경우에, 당해 접합체는 면역접합체이다. 면역접합체의 예는 당해 분야에 공지되어 있으며(참조: 예를 들면, WO05/103081), 예를 들면, 하나 이상의 화학치료 물질, 전구약물(prodrug), 세포독소, 방사선동위원소 또는 방사활성 뉴클레오타이드, 면역억제성 모이어티, 치료학적 올리고뉴클레오타이드, 억제성 RNA(RNAi)이다.
하나의 실시형태에 따라서, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 항체이다. 천연적으로 발생하는 항체는 기본 구조를 공유하는 면역글로불린으로서도 알려져 있는 구상형의 혈장 단백질(약 150kDa)이다. 이들은 아미노산 잔기에 첨가된 당 쇄를 가지므로, 이들은 당단백질이다. 각각의 항체의 기본적인 기능적 단위는 면역글로불린(Ig) 단량체(하나의 Ig 단위만을 함유)이며; 분비된 항체는 또한 IgA와 같이 2개의 Ig 단위를 갖는 이량체, 경골 어류 IgM과 같이 4개의 Ig 단위를 갖는 사량체, 또는 포유동물 IgM과 같이 5개의 Ig 단위를 갖는 오량체일 수 있다. 본 발명에서, 적합한 양식의 예는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 공지된 항체 이소형을 포함하는 천연적으로 발생하는 항체의 양식을 포함한다.
Ig 단량체는 4개의 폴리펩타이드 쇄: 시스테인 잔기들 사이에 이황화물 결합으로 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 이루어진 "Y"-유형 분자이다. 각각의 중쇄는 약 440개 아미노산 길이이고; 각각의 경쇄는 약 220개 아미노산 길이이다. 중쇄 및 경쇄 각각은 이들의 폴딩(folding)을 안정화시키는 쇄간 이황화물 결합을 함유한다. 각각의 쇄는 Ig 도메인으로 불리우는 구조적 도메인으로 구성된다. 이들 도메인은 약 70 내지 110개 아미노산을 함유하며 이들의 크기 및 기능에 따라 상이한 범주(예를 들면, 가변 또는 V, 및 불변 또는 C)로 분류된다. 이들은, 2개의 β 시트(sheet)가 "샌드위치" 형태를 생성하고, 보존된 시스테인과 다른 하전된 아미노산 사이의 상호작용에 의해 함께 유지된 특징적인 면역글로불린 폴드(fold)를 가진다.
α, δ, ε, γ, 및 μ로 나타낸 5개 유형의 포유동물 Ig 중쇄가 존재한다. 존재하는 중쇄의 유형은 항체의 이소형을 정의하며; 이들 쇄는 각각 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 항체에서 발견된다.
별도의 중쇄는 크기 및 조성에 있어서 상이하며; α 및 γ는 대략 450개의 아미노산을 함유하고 δ는 대략 500개의 아미노산을 함유하고, 한편, μ 및 ε는 대략 550개의 아미노산을 갖는다. 각각의 중쇄는 2개의 영역, 불변 영역(CH) 및 가변 영역(VH)을 갖는다. 하나의 종에서, 불변 영역은 동일한 이소형의 모든 항체에서 필수적으로 동일하지만, 상이한 이소형의 항체에서 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ는 3개의 탠덤(tandem) Ig 도메인으로 구성된 불변 영역, 및 가해진 유연성에 대한 힌지 영역을 가지며; 중쇄 μ 및 ε는 4개의 면역글로불린 도메인으로 구성된 불변 영역을 갖는다. 중쇄의 가변 영역은 상이한 B 세포에 의해 생산된 항체내에서 상이하지만, 단일 B 세포 또는 B 세포 클론에 의해 생산된 모든 항체의 경우 동일하다. 각각의 중쇄의 가변 영역은, 대략 110개 아미노산 길이이며 단일 Ig 도메인으로 구성된다.
포유동물에서, λ 및 κ로 나타낸 2개의 유형의 면역글로불린 경쇄가 존재한다. 경쇄는 2개의 연속적인 도메인: 1개의 불변 도메인(CL) 및 1개의 가변 도메인(VL)을 갖는다. 경쇄의 대략적인 길이는 211 내지 217개 아미노산이다. 각각의 항체는 항상 동일한 2개의 경쇄를 함유하며; 경쇄 중 단지 하나의 유형, κ 또는 λ가 포유동물에서 항체당 존재한다. 경쇄의 다른 유형, 예를 들어, ι 쇄는 연골어류 및 경골어류와 같은 하등 척추동물에서 발견된다.
천연적으로 발생하는 항체 이외에, 항체 단편을 포함하는 인공 항체 양식이 개발되어 왔다. 이들 중 일부는 이하에 기술되어 있다. 그러나, 상기 폴리펩타이드(들)를 포함하거나 이들로 이루어지고 α2 인테그린에 대해 특이적인 결합을 허용하는 임의의 다른 항체 양식 또한 본 발명에 포함된다.
비록 모든 항체의 일반적인 구조가 매우 유사하다고 해도, 제공된 항체의 고유의 특성은 상기에서 상세히 설명한 바와 같은 가변(V) 영역에 의해 측정된다. 보다 구체적으로, 가변 루프(loop), 즉 경(VL) 쇄 각각에서 3개 및 중(VH) 쇄에서 3개는 항원에 대한 결합, 즉, 이의 항원 특이성에 관여한다. 이들 루프는 상보성 결정 영역(CDR)으로 언급된다. VH 및 VL 도메인 둘 다로부터의 CDR은 항원-결합 부위에 기여하므로, 이는 최종 항원 특이성을 결정하는 단독이 아닌, 중쇄와 경쇄의 조합이다.
따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 천연적으로 발생하는 항체에 대해 구조적 유사성을 갖고 α2 인테그린에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드를 의미하고, 여기서, 결합 특이성은 서열번호 3 내지 8에서의 CDR에 의해 결정된다. 따라서, "항체"는 전장 또는 전체 항체, 항원 결합 단편(물리적으로 또는 개념상으로, 항체 구조로부터 유도된 단편), 상기 중 어느 하나의 유도체, 키메라 분자, 상기 중 어느 하나와 다른 폴리펩타이드의 융합체, 또는 α2 인테그린에 선택적으로 결합하고 α2 인테그린의 기능을 임의로 억제하는 임의의 다른 구조/조성물을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 α2 인테그린에 대해 특이적인 결합을 갖는 면역글로불린-유도된 구조에 관한 것이다. 항체는 적어도 하나의 항원 결합 단편을 포함하는 임의의 폴리펩타이드일 수 있다. 항원 결합 단편은, 도메인 둘 다가 함께 특이적인 항원에 결합할 수 있는 방식으로 정렬된, 적어도 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인으로 이루어진다.
"전장" 또는 "완전한" 항체는 이황화물 결합에 의해 상호연결된 2개의 중(H) 및 2개의 경(L) 쇄를 포함하는 단백질을 말하며, 이는 (1) 중쇄의 관점에서, 가변 영역 및 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 중쇄 불변 영역; 및 (2) 경쇄의 관점에서, 경쇄 가변 영역 및 하나의 도메인 CL을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 용어 "완전한 항체"와 관련하여, 임의의 항체가 각각의 도메인이, 전체 도메인 구조를 변화시키지 않는 돌연변이, 결실 또는 삽입과 같은 추가의 변형을 포함할 수 있다고 해도, 임의의 항체는 천연적으로 발생하는 항체(즉, 3개 또는 4개의 불변 도메인의 중쇄 및 하나의 불변 도메인의 경쇄 및 또한 각각의 가변 도메인을 포함)의 대표적인 전체 도메인 구조를 가짐을 의미한다.
"항체 단편"은 또한 상기에서 정의한 바와 같은 적어도 하나의 항원 결합 단편을 함유하며, 이의 단편이 유도되는 완전한 항체와 필수적으로 동일한 기능 및 특이성을 나타낸다. 파파인을 사용한 제한된 단백질분해적 분해는 Ig 원형(prototype)을 3개의 단편으로 절단한다. 각각 1개의 전체 L 쇄 및 약 1/2개의 H 쇄를 함유하는, 2개의 동일한 아미노 말단 단편은 항원 결합 단편(Fab)이다. 크기가 유사하지만 이들의 쇄간 이황화물 결합을 가진 중쇄 둘 다의 카복실 말단의 1/2을 함유하는 제3 단편은 결정화가능한 단편(Fc)이다. Fc는 탄수화물, 상보체-결합 및 FcR-결합 부위를 함유한다. 제한된 펩신 분해는 Fab 조각 및 H-H 쇄간 이황화물 결합을 포함하는 힌지 영역 둘 다를 함유하는 단일의 F(ab')2 단편을 수득한다. F(ab')2는 항원 결합에 대해 2가이다. F(ab')2의 이황화물 결합은 Fab'를 수득하기 위해 절단될 수 있다. 또한, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 함께 융합되어 단일쇄 가변 단편(scFv)을 형성할 수 있다.
완전한 크기의 항체의 제1 세대는 일부 문제점을 나타내었으므로, 많은 제2 세대 항체들은 항체의 단편만을 포함하였다. 가변 도메인(Fv)은 하나의 VL 및 하나의 VH로 이루어진 온전한 항원-결합 도메인을 지닌 가장 작은 단편이다. 결합 도메인만을 지닌 이러한 단편은 예를 들면, 세균 및 진핵 세포내에서 관련 유전자 단편의 효소적 접근 또는 발현에 의해 생성시킬 수 있다. 상이한 접근, 예를 들면, Fv 및 제1의 불변 도메인을 포함하는 "Y"의 상부 암 중 하나를 포함하는 'Fab'-단편 또는 Fv 단편 단독을 사용할 수 있다. 이들 단편은 일반적으로 단일쇄 Fv (scFv)의 생산을 초래하는 2개의 쇄 사이에 폴리펩타이드 연결을 도입시킴으로써 안정화된다. 대안으로, 이황화물-연결된 Fv(dsFv) 단편을 사용할 수 있다. 단편의 결합 도메인은 임의의 불변 도메인과 합하여 전장의 항체를 생산하거나 다른 단백질 및 폴리펩타이드와 융합시킬 수 있다.
재조합 항체 단편은 단일쇄 Fv(scFv) 단편이다. 일반적으로, 이는 이의 항원에 대해 고 친화성을 가지며 다양한 숙주내에서 발현될 수 있다. 이들 및 다른 특성은 scFv 단편을 의약에서 적용가능하게 할 뿐만 아니라 생명공학적 적용을 위한 가능성이 있도록 한다. 상기에서 상세히 설명한 바와 같이, scFv 단편에서 VH 및 VL 도메인은 친수성 및 유연성 펩타이드 링커와 결합되며, 이는 발현 및 폴딩 효능을 개선시킨다. 일반적으로 약 15개 아미노산의 링커가 사용되며, 이들 중 (Gly4Ser)3 링커가 가장 흔히 사용되어 왔다. scFv 분자는 사용된 링커에 따라 단백질분해적으로 용이하게 분해될 수 있다. 유전 공학 기술의 발달과 더불어, 이들 제한은 기능 및 안정성의 개선에 촛점맞춘 연구에 의해 실질적으로 극복될 수 있다. 예는 이황화물-안정화된(또는 이황화물-연결된) Fv 단편의 발생이며, 여기서 VH-VL 이량체는 쇄간 이황화물 결합에 의해 안정화된다. 시스테인은 VL 도메인과 VH 도메인 사이의 계면에 도입되어, 2개의 도메인을 함께 유지시키는 이황화물 브릿지를 형성한다.
scFv의 해리는 단량체 scFv를 생성하며, 이는 이량체(디아바디 또는 (scFv)2), 삼량체(트리아바디) 또는, TandAb 및 플렉시바디(Flexibody)와 같은 보다 큰 응집체로 복합체화될 수 있다.
2개의 결합 도메인을 가진 항체는 2개의 scFv와 단순한 폴리펩타이드 연결 (scFv)2을 통해 또는 2개의 단량체의 이량체화(디아바디)를 통해 생성될 수 있다. 가장 간단한 설계는 별도의 항원(이특이적인 디아바디)에 대해 동일하거나, 유사할 수 있거나(2가의 디아바디) 별도의 항원에 대해 특이성을 갖는(이특이적 디아바디) 2개의 기능적 항원-결합 도메인을 갖는 디아바디이다. 이들 이특이적 항체는 예를 들면, 표적 세포에 대한 신규 효과기 기능(예: 세포독성 T 세포)의 보충을 허용하며, 이러한 기능은 이들 항체가 의약에서의 적용에 매우 유용하도록 한다.
최근에, 중쇄의 4개의 가변 도메인 및 경쇄의 4개의 가변 도메인을 포함하는 항체 양식이 개발되었다. 이들의 예는 4가 이특이적 항체[TandAb 및 플렉시바디, 제조원: Affimed Therapeutics AG, 독일 하이델베르크 소재]를 포함한다. 이특이적 디아바디와는 대조적으로, 이특이적 TandAb는 단지 하나의 폴리펩타이드로 이루어진 단독이량체이다. 플렉시바디는 세포 표면에서 서로 상당히 명확하게 구별되는 2개의 분자를 결합시키기 위한 고도의 유연성을 갖는 다가 분자를 생성하는 디아바디 다량체 모티프를 지닌 scFv의 조합물이다. 2개 이상의 기능적 항원-결합 도메인이 존재하고 이들이 별도의 항원에 대해 특이성을 갖는 경우, 항체는 다중 특이적이다.
Fv, scFv, 디아바디 분자 또는 도메인 항체[Domantis]를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 특정의 항체 분자는 VH 및 VL 도메인에 이황화물 브릿지를 도입시킴으로써 안정화시킬 수 있다. 이특이적 항체는 종래 기술, 화학적 생산, 또는 하이브리드(하이브리도마)로부터의 생산을 포함하는 특정 방법, 및 BiTE™ 기술(펩타이드 링커와 상이한 특이성의 항원 결합 영역을 지닌 분자) 및 놉스-인투-홀스 가공(knobs-into-holes engineering)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 다른 기술을 사용하여 생산할 수 있다.
바람직하게는, 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화물-연결된 Fv, scFv, (scFv)2, 이특이적 항체, 다중 특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 또는 미니바디일 수 있다.
하나의 실시형태에서, 항체는 모노클로날 항체, 키메라 항체 또는 사람화된 항체이다. 모노클로날 항체는, 이들이 단일의 모 세포의 모든 클론인 면역 세포의 한가지 유형에 의해 생산되므로 동일한 일특이적인 항체이다. 키메라 항체는, 1개 종의 면역글로불린의 적어도 하나의 영역이 다른 종의 면역글로불린의 다른 영역에 유전적 가공에 의해 융합되어 이의 면역원성을 감소시킨 항체이다. 예를 들어, 뮤린 VL 및 VH 영역을 사람 면역글로불린의 나머지 부분에 융합시킬 수 있다. 키메라 항체의 특정 유형은 사람화된 항체이다. 사람화된 항체는, 비-사람 항체의 CDR을 암호화하는 DNA를 사람 항체-생산 DNA와 병합시켜(또는 역으로) 생산할 수 있다. 단순히 CDR은 비-사람이므로, 수득되는 DNA 작제물은 이후에 일반적으로 비-사람 모 항체 또는 키메라 항체와 같은 면역원성이 아닌 항체를 발현시키고 생산하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 상이한 양상의 하나의 실시형태에 따라서, 사람 또는 사람화된 항체 또는 이의 단편이 사용될 수 있다. 따라서, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgG1 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인, 및 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명과 관련하여, 항-α2-인테그린 항체는 WO2009/032661에 이미 기술된 방법을 사용하여 사람화되어 있지만, 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 사람화 방법도 사용할 수 있다.
상기에 상세히 설명한 바와 같이, CDR은 또한 특허청구범위에 명시된 CDR 중 어느 하나의 기능적 활성 변이체일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 기능적 활성 변이체는 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열의 90% 이상으로 이루어진 기능적 활성 단편이다. 대안으로, 기능적 활성 변이체는, 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 70% 이상, 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 기능적 활성 변이체이고, 특히 여기서 기능적 활성 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환의 수단에 의해 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로부터 유도된다(하기 참조).
본 발명의 상이한 양상의 하나의 실시형태에서, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는
- 서열번호 1, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및/또는
- 서열번호 2, 또는 이의 기능적 활성 변이체 및/또는
- 서열번호 9, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및/또는
- 서열번호 10, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및/또는
- 서열번호 11, 또는 이의 기능적 활성 변이체의 아미노산 서열을 포함한다.
대안으로, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는
- 서열번호 9, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
- 서열번호 10, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
- 임의로 50개의 추가의 아미노산 잔기(들), 또는 1 내지 40개, 1 내지 30개, 1 내지 25개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 또는 2, 3, 4 또는 5개의 추가의 아미노산 잔기(들)의 아미노산 서열로 이루어진다.
대안으로, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는
- 서열번호 9, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
- 서열번호 11, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
- 임의로 50개의 추가의 아미노산 잔기(들), 또는 1 내지 40개, 1 내지 30개, 1 내지 25개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 또는 2, 3, 4 또는 5개의 추가의 아미노산 잔기(들)의 아미노산 서열로 이루어진다.
기능적 활성 변이체는 하나 이상의 결실에 의한 서열번호 1 또는 2 또는 9 또는 10 또는 11의 서열 중 어느 하나로부터 유도됨을 특징으로 하는 단편일 수 있다. 결실(들)은 C-말단적, N-말단적 및/또는 내부적일 수 있다. 단편은 예를 들면, 10개 이하의 결실, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 또는 5개 이하, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개, 또는 3개 이하, 예를 들면, 1, 2 또는 3개, 또는 2개 이하, 예를 들면, 1 또는 2개, 또는 1개의 결실(들)에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 기능적 활성 단편은 α2 인테그린 및/또는 α2β1 인테그린에 결합하는 능력 및 임의로 α2 및/또는 α2β1 인테그린을 억제하는 능력을 포함하는, 완전한 단백질에 의해 나타난 것과 유사한 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 항원의 단편은, 단편의 활성이 서열 변경이 없이 아미노산 서열의 활성의 10% 이상, 바람직하게 25% 이상, 보다 바람직하게 50% 이상, 보다 바람직하게 70% 이상, 보다 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 보다 바람직하게 95% 이상, 가장 바람직하게 또는 99% 이상인 경우, 본 발명과 관련하여 기능적으로 활성이다. α2β1 인테그린에 대한 결합 활성을 측정하기에 적합한 방법은 실시예, 특히 실시예 1D에 제공된다.
변이체는 결실, 첨가 및/또는 치환을 포함하는 하나 이상의 아미노산 변형에 의한 서열번호 1 또는 2 또는 9 또는 10 또는 11 중 어느 하나로부터 유도됨을 특징으로 할 수 있다. 변형(들)은 C-말단적, N-말단적 및/또는 내부적일 수 있다. 단편은 10개 이하의 결실, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 또는 5개 이하, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5, 또는 3개 이하, 예를 들면, 1, 2 또는 3, 또는 2개 이하, 예를 들면, 1 또는 2개, 또는 1개의 결실(들)에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 기능적 활성 변이체는 α2 인테그린 및/또는 α2β1 인테그린에 결합하는 능력 및 임의로 α2 및/또는 α2β1 인테그린을 억제하는 능력을 포함하는, 완전한 단백질에 의해 나타난 것과 유사한 생물학적 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 변이체는, 변이체의 활성이 서열의 변경 없이 아미노산 서열의 활성의 10% 이상, 바람직하게 25% 이상, 보다 바람직하게 50% 이상, 더욱 보다 바람직하게 70% 이상, 더욱 더 바람직하게 80% 이상, 특히 90% 이상, 특히 95% 이상, 가장 바람직하게 99% 이상의 양인 경우, 본 발명과 관련하여 기능적으로 활성이다.
(ix, x 또는 xi)의 추가의 아미노산은 C-말단적으로, N-말단적으로 및/또는 내부적으로 위치할 수 있다. 하나의 실시형태에 따라서, 50개 이하의 첨가, 또는 40개 이하 또는 30개 이하 또는 20개 이하의 첨가 또는 10개 이하의 첨가, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 또는 5개 이하의 첨가, 예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개, 또는 3개 이하의 첨가, 예를 들면, 1, 2 또는 3개, 또는 2개 이하, 예를 들면, 1 또는 2개, 또는 단지 1개의 첨가(들)이 존재한다.
추가의 아미노산 잔기(들)은 임의의 아미노산일 수 있으며, 이는 천연적으로 발생하는 및 그렇지 않은 L-및/또는 D-아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 아미노산은 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 라이신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판 또는 타이로신과 같은 임의의 천연적으로 발생하는 아미노산이다.
아미노산은 또한 변형되거나 특정한 아미노산일 수 있다. 이들의 예는 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, β-알라닌, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵타노산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 2,4-디아미노부티르산, 데스모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리시넴 N-에틸아스파라긴, 하이드록시라이신, 알로-하이드록시라이신, 3-하이드록시프롤로인, 4-하이드록시프롤로인, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, 6-N-메틸라이신, N-메틸발린, 노르발린, 노르류신 또는 오르니틴이 있다. 추가로, 아미노산은 해독후 변형과 같은 변형에 적용할 수 있다. 변형의 예는 아세틸화, 아미드화, 차단, 포르밀화, γ-카르복시글루탐산 하이드록실화, 글리코실화, 메틸화, 포스포릴화 및 황산화를 포함한다. 하나 이상의 추가의 또는 이종 아미노 잔기가 펩타이드내에 존재하는 경우, 아미노산 잔기는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
서열 동일성의 퍼센트는 예를 들면, 서열 정렬에 의해 측정할 수 있다. 비교용 서열의 정렬 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 각종 프로그램 및 정렬 알고리즘이 예를 들면, 문헌[참조: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981 또는 Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988]에 기술되어 있다.
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(참조: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)가 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 관련하여 사용하기 위한 National Center for Biotechnology Information(NCBI, 메릴랜드주 베데스다 소재) 및 인터넷 상을 포함하는 다수의 공급원으로부터 이용가능하다. 서열번호 1 내지 8의 서열 중 어느 하나의 변이체도 전형적으로 디폴트 매개변수에 대해 설정된 blastp 갭화된(gapped) NCBI Blast 2.0을 사용하여 특징화된다. 적어도 30개 아미노산의 아미노산 서열의 비교를 위해, Blast 2 서열 기능을 디폴트 매개변수에 대해 설정된 디폴트 BLOSUM62 매트릭스, (11의 갭 존재 비용, 및 잔기당 1의 갭 비용)를 사용하여 이용한다. 짧은 펩타이드(대략 30개 보다 적은 아미노산)을 정렬하는 경우, 당해 정렬은 t 디폴트 매개변수(개방 갭 9, 연장 갭 1 패널티(penalty))로 설정된 PAM30 매트릭스를 사용하는 Blast 2 서열 기능을 사용하여 수행한다. 15개 이하의 아미노산과 같은 이러한 짧은 윈도우(window)에 걸쳐 서열 동일성을 측정하는 방법은 메릴랜드주 베데스다에 소재하는 National Center for Biotechnology Information에 의해 유지되는 웹사이트에 기술되어 있다.
본 발명의 상이한 양상의 다른 실시형태에서, 상기에 정의한 바와 같은 기능적 활성 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 상기 서열 중 어느 하나의 서열번호 1 또는 2 또는 9 또는 10 또는 11 중 어느 하나의 아미노산 서열로부터 유도된다.
당해 분야의 통상의 숙련가가 인식할 것인 바와 같이, 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기를 유사하거나 보다 우수한(의도된 목적을 위해) 기능적 및/또는 화학적 특성을 가진 것으로 대체하는 치환이다. 예를 들면, 보존적 아미노산 치환은 흔히, 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 계열은 당해 분야에 정의되어 있다. 이들 계열은 염기성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분기된 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산(예를 들면, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 이러한 변형은, 비록 이들이 이러한 특성을 개선시킬 수 있지만, 폴리펩타이드(복합체)의 결합 또는 기능적 억제 특성을 유의적으로 감소시키거나 변경하도록 설계되지 않는다. 치환을 실행하는 목적은 유의적이지 않으며 잔기를 분자의 구조, 분자의 전하 또는 소수성, 또는 분자의 크기를 유지하거나 향상시킬 수 있는 보다 우수한 것으로 대체하는 것을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들면, 덜 바람직한 잔기를 동일한 극성 또는 전하의 것으로 치환하는 것을 단순히 요구할 수 있다. 이러한 변형은 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발과 같이, 당해 분야에 공지된 표준 기술에 의해 도입시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가들이 보존적 아미노산 치환을 달성하는 하나의 구체적인 수단은 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이다. 이후에, 변경된 폴리펩타이드를 당해 분야에서 이용가능하거나 실시예에 기술된 기능적 검정을 사용하여 보유되거나 보다 우수한 기능에 대해 시험한다. 본 발명의 보다 바람직한 실시형태에서, 서열번호 1 또는 2 또는 9 또는 10 또는 20의 서열 중 어느 하나에서 보존적 치환의 수는 20 이하, 예를 들면, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 또는 11, 바람직하게는 10 이하, 예를 들면 10, 9, 8, 7 또는 6, 특히 5 이하, 예를 들면, 5, 4, 3, 특히 2 또는 1이다.
본 발명의 상이한 양상의 또 다른 실시형태에서, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 하나 이상의 기능적 활성 변이체를 포함하며,
- 여기서, LDR1의 기능적 활성 변이체는 11번 아미노산 위치에서의 돌연변이, 특히 11 Asn→Gln을 포함하고;
- 여기서, HDR2의 기능적 활성 변이체는 6번 아미노산 위치에서의 돌연변이, 특히 6 Asp→Glu를 포함하며;
- 여기서, 서열번호 1의 기능적 활성 변이체는, 바람직하게는 9Ala→Ser, 12Ala→Ser, (15Leu→Val, 15Leu→Pro, 22Ser→Thr, 34Asn→Gln, 46Gln→Lys, 47Ala→Pro, 80Asp→Asn, 83Glu→Gln, 85Asp→Glu, 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 9, 12, 15, 22, 34, 46, 47, 80, 83, 85, 87 및/또는 89번 아미노산 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하거나, 또는 여기서 서열번호 1의 기능적 활성 변이체는 이하 돌연변이(LC1), 즉, 9Ala→Ser 또는 15Leu→Val 또는 46Gln→Lys 또는 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 또는 9Ala→Ser 및 46Gln→Lys 또는 9Ala→Ser 및 83Glu→Gln 또는 15Leu→Val 및 46Gln→Lys 또는 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 46Gln→Lys 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 46Gln→Lys 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 46Gln→Lys 및 83Glu→Gln 또는 15Leu→Val 및 46Gln→Lys 및 83Glu→Gln 또는 표 5의 LC1: 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 46Gln→Lys 및 83Glu→Gln를 포함하거나, 여기서 서열번호 1의 기능적 활성 변이체는 이하 돌연변이(LC2), 즉, 9 Ala→Ser 또는 15Leu→Val 또는 34Asn→Gln 또는 46Gln→Lys 또는 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 또는 9Ala→Ser 및 34Asn→Gln 또는 9Ala→Ser 및 46Gln→Lys 또는 9Ala→Ser 및 83Glu→Gln 또는 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 또는 15Leu→Val 및 46Gln→Lys 또는 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 34Asn→Gln 및 46Gln→Lys 또는 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 46Gln→Lys 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 46Gln→Lys 또는 9Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 46Gln→Lys 및 83Glu→Gln 또는 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 46Gln→Lys 또는 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 15Leu→Val 및 46Gln→Lys 및 83Glu→Gln 또는 34Asn→Gln 및 46Gln→Lys 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 46Gln→Lys 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 46Gln→Lys 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 46Gln→Lys 및 83Glu→Gln 또는 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 46Gln→Lys 및 83Glu→Gln 또는 표 5의 LC2: 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 46Gln→Lys 및 83Glu→Gln를 포함하거나, 여기서 서열번호 1의 기능적 활성 변이체는 이하 돌연변이(LC3), 즉, 9Ala→Ser 또는 12Ala→Ser 또는 15Leu→Val 또는 83Glu→Gln 또는 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 또는 9Ala→Ser 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 또는 12Ala→Ser 및 83Glu→Gln 또는 12Ala→Ser 및 85Asp→Glu 또는 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 15Leu→Val 및 85Asp→Glu 또는 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 표 5에 따른 (LC3): 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu를 포함하거나, 여기서 서열번호 1의 기능적 활성 변이체는 이하 돌연변이(LC4), 즉, 9Ala→Ser 또는 12Ala→Ser 또는 15Leu→Val 또는 34Asn→Gln 또는 83Glu→Gln 또는 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 또는 9Ala→Ser 및 34Asn→Gln 또는 9Ala→Ser 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 또는 12Ala→Ser 및 34Asn→Gln 또는 12Ala→Ser 및 83Glu→Gln 또는 12Ala→Ser 및 85Asp→Glu 또는 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 또는 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 15Leu→Val 및 85Asp→Glu 또는 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 34Asn→Gln 및 85Asp→Glu 또는 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 34Asn→Gln 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 12Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 85Asp→Glu 또는 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 9Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu 또는 표 5에 따른 (LC4): 9Ala→Ser 및 12Ala→Ser 및 15Leu→Val 및 34Asn→Gln 및 83Glu→Gln 및 85Asp→Glu를 포함하거나, 여기서 서열번호 1의 기능적 활성 변이체는 이하 돌연변이(LC5), 즉, 15Leu→Pro, 22Ser→Thr, 47Ala→Pro, 80Asp→Asn, 87Ala→Thr, 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 또는 15Leu→Pro 및 47Ala→Pro 또는 15Leu→Pro 및 80Asp→Asn 또는 15Leu→Pro 및 87Ala→Thr 또는 15Leu→Pro 및 89Thr→Asn 또는 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 또는 22Ser→Thr 및 80Asp→Asn 또는 22Ser→Thr 및 87Ala→Thr 또는 22Ser→Thr 및 89Thr→Asn 또는 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 또는 47Ala→Pro 및 87Ala→Thr 또는 47Ala→Pro 및 89Thr→Asn 또는 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 또는 80Asp→Asn 및 89Thr→Asn 또는 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 80Asp→Asn 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 87Ala→Thr 또는 15 Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 또는 15Leu→Pro 및 47Ala→Pro 및 87Ala→Thr 또는 15Leu→Pro 및 47Ala→Pro 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 또는 15Leu→Pro 및 80Asp→Asn 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 또는 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 87Ala→Thr 또는 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 89Thr→Asn 또는 22Ser→Thr 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 또는 22Ser→Thr 및 80Asp→Asn 및 89Thr→Asn 또는 22Ser→Thr 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 또는 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 89Thr→Asn 또는 47Ala→Pro 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 87Ala→Thr 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 80Asp→Asn 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 또는 15Leu→Pro 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 47Ala→Pro 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 또는 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 89Thr→Asn 또는 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 22Ser→Thr 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 15Leu→Pro 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn 또는 표 5에 따른 (LC5): 15Leu→Pro 및 22Ser→Thr 및 47Ala→Pro 및 80Asp→Asn 및 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn를 포함하고/하거나, 여기서 서열번호 2의 기능적 활성 변이체는 특히 5His→Val, 7Pro→Ser, 11Leu→Val, 12Val→Lys, 17Pro→Ser, 20Leu→Val, 38Lys→Arg, 40Arg→Ala, 43Arg→Gln, 55Asp→Glu, 61Asn→Ala, 65Lys→Gln, 66Asp→Gly, 67Lys→Arg, 76Ser→Thr, 81Ile→Met, 82Gln→Glu, 87Thr→Arg, 91Ser→Thr, 93Val→Lys, 112Thr→Leu, 113Leu→Val 및 116Ser→Val으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 5, 7, 11, 12, 17, 20, 38, 40, 43, 55, 61, 65, 66, 67, 76, 81, 82, 87, 91, 93, 112, 113 및/또는 116번 아미노산 위치에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하거나, 여기서 서열번호 2의 기능적 활성 변이체는 이하 돌연변이(HC1), 즉, 43Arg→Gln 또는 67Lys→Arg 또는 116Ser→Val 또는 43Arg→Gln 및 67Lys→Arg 또는 43Arg→Gln 및 116Ser→Val 또는 67Lys→Arg 및 116Ser→Val 또는 표 6에 따른 (HC1): 43Arg→Gln 및 67Lys→Arg 및 116Ser→Val을 포함하거나, 여기서 서열번호 2의 기능적 활성 변이체는 이하 돌연변이(HC2), 즉, 43Arg→Gln 또는 55Asp→Glu 또는 67Lys→Arg 또는 116Ser→Val 또는 43Arg→Gln 및 55Asp→Glu 또는 43Arg→Gln 및 67Lys→Arg 또는 43Arg→Gln 및 116Ser→Val 또는 55Asp→Glu 및 67Lys→Arg 또는 55Asp→Glu 및 116Ser→Val 또는 67Lys→Arg 및 116Ser→Val 또는 43Arg→Gln 및 55Asp→Glu 및 67Lys→Arg 또는 43Arg→Gln 및 55Asp→Glu 및 116Ser→Val 또는 43Arg→Gln 및 67Lys→Arg 및 116Ser→Val 또는 55Asp→Glu 및 67Lys→Arg 및 116Ser→Val 또는 표 6에 따른 (HC2): 43Arg→Gln 및 55Asp→Glu 및 67Lys→Arg 및 116Ser→Val을 포함하거나, 여기서 서열번호 2의 기능적 활성 변이체는 이하 돌연변이(HC3), 즉, 17Pro→Ser 또는 116Ser→Val 또는 표 6에 따른 (HC3): 17Pro→Ser 및 116Ser→Val을 포함하거나, 여기서 서열번호 2의 기능적 활성 변이체는 이하 돌연변이(HC4), 즉, 17Pro→Ser 또는 93Val→Lys 또는 116Ser→Val 또는 17Pro→Ser 및 93Val→Lys 또는 17Pro→Ser 및 116Ser→Val 또는 93Val→Lys 및 116Ser→Val 또는 표 6에 따른 (HC4): 17Pro→Ser 및 93Val→Lys 및 116Ser→Val을 포함하거나, 여기서 서열번호 2의 기능적 활성 변이체는 이하 돌연변이(HC5), 즉: 17Pro→Ser 또는 55Asp→Glu 또는 116Ser→Val 또는 17Pro→Ser 및 55Asp→Glu 또는 17Pro→Ser 및 116Ser→Val 또는 55Asp→Glu 및 116Ser→Val 또는 표 6에 따른 (HC5): 17Pro→Ser 및 55Asp→Glu 및 116Ser→Val을 포함하거나, 여기서 서열번호 2의 기능적 활성 변이체는 이하 돌연변이(HC6), 즉: 12Val→Lys 또는 55Asp→Glu 또는 93Val→Lys 또는 116Ser→Val 또는 12Val→Lys 및 55Asp→Glu 또는 12Val→Lys 및 93Val→Lys 또는 12Val→Lys 및 116Ser→Val 또는 55Asp→Glu 및 93Val→Lys 또는 55Asp→Glu 및 116Ser→Val 또는 93Val→Lys 및 116Ser→Val 또는 12Val→Lys 및 55Asp→Glu 및 93Val→Lys 또는 12Val→Lys 및 55Asp→Glu 및 116Ser→Val 또는 12Val→Lys 및 93Val→Lys 및 116Ser→Val 또는 55Asp→Glu 및 93Val→Lys 및 116Ser→Val 또는 표 6에 따른 (HC6): 12Val→Lys 및 55Asp→Glu 및 93Val→Lys 및 116Ser→Val을 포함하거나, 여기서 서열번호 2의 기능적 활성 변이체는 이하의 돌연변이(HC6) 5His→Val, 7Pro→Ser, 11Leu→Val, 12Val→Lys, 17Pro→Ser, 20Leu→Val, 38Lys→Arg, 40Arg→Ala, 43Arg→Gln, 61Asn→Ala, 65Lys→Gln, 66Asp→Gly, 67Lys→Arg, 76Ser→Thr, 81Ile→Met, 82Gln 87Thr→Arg, 91Ser→Thr, 112Thr→Leu, 113Leu→Val 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19개 또는 모두를 포함한다.
위치 및 돌연변이는 표 4, 표 5 및 표 6과 관련하여 실시예에 기술된 고려사항을 기초로 도입되었다. 단지 1개의 돌연변이, 또는 돌연변이의 조합, 특히 표 4, 표 5 및 표 6에 제공된 조합 중 어느 하나가 존재할 수 있다. 또한, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 상기 열거된 바와 같은 변이체 중쇄 중 하나 이상과 함께 상기 열거된 변이체 경쇄 중 하나의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 예를 들면, 돌연변이체/기능성 변이체의 이하 조합들 중 하나를 포함하거나 이로 이루어진다: LC1 및 HC1, LC1 및 HC2, LC1 및 HC3, LC1 및 HC4, LC1 및 HC5, LC1 및 HC6, LC1 및 HC7, LC2 및 HC1, LC2 및 HC2, LC2 및 HC3, LC2 및 HC4, LC2 및 HC5, LC2 및 HC6, LC2 및 HC7, LC3 및 HC1, LC3 및 HC2, LC3 및 HC3, LC3 및 HC4, LC3 및 HC5, LC3 및 HC6, LC3 및 HC7, LC4 및 HC1, LC4 및 HC2, LC4 및 HC3, LC4 및 HC4, LC4 및 HC5, LC4 및 HC6, LC4 및 HC7, LC5 및 HC1, LC5 및 HC2, LC5 및 HC3, LC5 및 HC4, LC5 및 HC5, LC5 및 HC6, LC5 및 HC7.
추가로, 예를 들면, 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 검출 또는 정제를 위해 마커(marker)를 가하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 마커는 태그(tag)(예를 들면, 6 His(또는 HexaHis) 태그, 7 His, 8 His, GlyGlyGlyGlySer, (GlyGlyGlyGlySer)2 Strep 태그, HA 태그, c-myc 태그 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그), 형광성 마커(예를 들면, FITC, 플루오레세인, 로다민, Cy 염료 또는 알렉사(Alexa)), 효소 표지(예를 들면, 페니실리나제, 서양 고추냉이 퍼옥시다제 및 알칼린 포스파타제), 방사선 표지(예를 들면, 3H, 32P, 35S, 125I 또는 14C)를 포함하나, 이들에 제한되지 않는다. 또한, 폴리펩타이드(복합체)를 지지체, 특히 어레이(array), 비드(예를 들면, 유리 또는 자기), 섬유, 필름 등과 같은 고체 지지체에 가할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 포함하는 결합 분자 및 적합한 추가의 성분을 선택함으로써 의도된 용도에 성분을 적용시킬 수 있을 것이다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라서, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 이하 특징 A 내지 E(즉, A 또는 B 또는 C 또는 D 또는 E 또는 A 및 B 또는 A 및 C 또는 A 및 D 또는 A 및 E 또는 B 및 C 또는 B 및 D 또는 B 및 E 또는 C 및 D 또는 C 및 E 또는 A 및 B 및 C 또는 A 및 B 및 D 또는 A 및 B 및 D 또는 A 및 B 및 E 또는 A 및 C 및 D 또는 A 및 C 및 E 또는 A 및 D 및 E 또는 B 및 C 및 D 또는 B 및 C 및 E 또는 B 및 D 및 E 또는 A 및 B 및 C 및 D 또는 A 및 B 및 C 및 E 또는 A 및 C 및 D 및 E 또는 B 및 C 및 D 및 E 또는 A 및 B 및 C 및 E 중 하나를 나타낸다:
A) 표 11에 제공된 데이터에 따른 역학적 결합 상수(예를 들면, 바이아코어(Biacore)에 의한 표면 플라스몬 공명에 의해 측정).
B) 다음과 같은 경쇄용 분자량: 23.73+/-0.05 kDa 또는 23.73 kDa의 분자량(LC1) 또는 23.74 +/-0.05 kDa 또는 23.7 kDa의 분자량(LC2) 또는 23.75 +/-0.05 kDa 또는 23.8 kDa의 분자량(LC3) 또는 23.77 +/-0.05 kDa 또는 23.77 kDa의 분자량(LC4) 또는 23.79 +/-0.05 kDa 또는 23.79 kDa의 분자량(LC5) 또는 50.31 +/-0.05 kDA 및/또는 다음과 같은 중쇄에 대한 분자량: 50.31 kDa (HC1) 또는 50.33 +/-0.05 kDA 또는 50.33 kDa (HC2) 또는 50.30 +/- 0.05 kDa 또는 50.30 kDa (HC3) 또는 50.33 +/-0.05 kDa 또는 50.33 kDa (HC4) 또는 50.32 +/- 0.05 kDa 또는 50.32 kDa (HC5) 또는 50.35 +/-0.05 kDa 또는 50.35 kDa (HC6) 또는 50.19 +/- 0.05 kDa 또는 50.19 kDa (HC7).
C) 정적 조건하에서 측정시, <0.1, <0.09, <0.08, <0.07, <0.06, <0.05, <0.04, <0.03, <0.02 또는 <0.01의 IC50μg/ml 값으로 콜라겐에 대한 세척된 사람 혈소판의 결합의 억제.
D) 정적 조건하에 측정된 것으로서, <0.3, <0.2, <0.1, <0.15, <0.14 또는 <0.13의 IC50μg/ml으로 콜라겐에 대한 혈소판이 풍부한 혈장으로부터의 사람 혈소판의 결합의 억제.
E) <10, <9, <8, <7, <6, <5, <4, <3, <2.5, <2, <1.5, <1 또는 <0.5%의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된 응집 퍼센트.
제5 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들)에 관한 것이다.
본 발명의 핵산 분자는 예를 들면, 화학적 합성 기술 또는 이의 조합으로 생산되거나 클로닝에 의해 수득된 mRNA 또는 cRNA와 같은 RNA의 형태, 또는 예를 들면, cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 DNA의 형태로 존재할 수 있다. DNA는 삼중-가닥, 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 단일-가닥 DNA는 센스 가닥으로서도 공지된, 암호화 가닥일 수 있거나, 이는 또한 안티-센스 가닥으로 언급된 비-암호화 가닥일 수 있다. 본원에 사용된 것으로서 핵산 분자는 또한 다른 것들 중에서, 단일-가닥 및 이중-가닥 DNA, 단일-가닥과 이중-가닥 RNA의 혼합물인 DNA, 및 단일-가닥과 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로 이중-가닥, 또는 삼중-가닥일 수 있는 DNA와 RNA를 포함하는 하이브리드 분자, 또는 단일-가닥 및 이중-가닥 영역의 혼합물을 말한다. 또한, 본원에 사용된 것으로서 핵산 분자는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 말한다.
또한, 핵산은 하나 이상의 변형된 염기를 함유할 수 있다. 이러한 핵산은 또한 예를 들면, 리보스-포스페이트 골격내에 변형을 함유하여 생리학적 환경하에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시킬 수 있다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 변형된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA는, 이러한 특징이 본원에 의도되어 있는 바와 같은 "핵산 분자"이다. 또한, 2개의 예로만 알려진, 이노신과 같은 특정한 염기, 또는 트리틸화된 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA는 본 발명과 관련된 핵산 분자이다. 매우 다양한 변형이 당해 분야의 숙련가에게 공지된 많은 유용한 목적을 제공하는 DNA 및 RNA에 대해 이루어져 왔음을 인식할 것이다. 용어 핵산 분자는 본원에 사용된 바와 같이 핵산 분자의 이러한 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태, 및 또한 특히 단순한 세포 및 복잡한 세포를 포함하는 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특징의 화학적 형태를 포함한다. 예를 들어, 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 영향을 미치지 않는 뉴클레오타이드 치환이 이루어질 수 있으므로, 상기에 정의한 바와 같은 항원 또는 이의 단편 또는 기능적 활성 변이체를 암호화하는 임의의 핵산 분자도 본 발명에 포함된다.
또한, 이의 단편 또는 기능적 활성 변이체를 포함하는 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자 중 어느 하나도 표준 클로닝 기술과 같은 표준 기술을 사용하여 임의의 바람직한 조절 서열, 리더 서열, 이종 마커 서열 또는 이종 암호화 서열에 기능적으로 연결시켜 융합 단백질을 생성할 수 있다.
본 발명의 핵산은 시험관내에서 또는 배양물내 세포내에서, 일반적으로 핵산의 조작에 의해, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제에 의해 및/또는 폴리머라제 및/또는 리가제 및/또는 리컴비나제 또는 숙련가에게 공지된 다른 방법에 의해 원래 형성되어 핵산을 생산할 수 있다.
본 발명의 상이한 양상의 다른 실시형태에서, 핵산(들)은 벡터내에 위치한다. 벡터는 복제 기원, 하나 이상의 치료학적 유전자 및/또는 선택가능한 마커 유전자, 및 암호화된 단백질의 전사, 해독 및/또는 분비를 지시하는 조절 요소와 같이 당해 분야에 공지된 다른 유전적 요소와 같이, 숙주 세포내에서 복제하도록 허용하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환 또는 감염시킴으로써 세포가 세포에 대해 천연적인 것 이외에 핵산 및/또는 단백질을 발현하도록 할 수 있다. 벡터는 임의로 핵산의 세포내로의 도입을 달성하는데 도움을 주는 물질, 예를 들면, 바이러스 입자, 리포좀, 단백질 코팅 등을 포함한다. 다수 유형의 적절한 발현 벡터가 표준 분자 생물학 기술에 의해, 단백질 발현을 위해 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 벡터는 곤충, 예를 들면, 바큘로바이러스 발현, 또는 효모, 진균, 세균 또는 바이러스 발현 시스템을 포함하는 통상의 벡터 유형으로부터 선택된다. 또한, 다수 유형이 당해 분야에 공지되어 있는 다른 적절한 발현 벡터도 당해 목적을 위해 사용할 수 있다. 이러한 발현 벡터를 수득하는 방법은 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Sambrook et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)]. 하나의 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 및 아데노바이러스 벡터를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
이러한 방법에 의한 형질감염용으로 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 세균 세포를 포함한다. 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli)의 다양한 균주가 생명공학 분야에서 숙주 세포로서 잘 공지되어 있다. 비. 서브틸리스(B. subtilis), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 다른 바실러스 등의 각종 균주 또한 본 방법에 사용될 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 효모 세포의 많은 균주 또한 본 발명의 펩타이드의 발현을 위한 숙주 세포로서 이용가능하다. 다른 진균 세포 또는 스포도프테라 프루기페데라(Spodoptera frugipedera)(Sf9) 세포와 같은 곤충 세포 또한 발현 시스템으로서 사용될 수 있다. 대안으로, 사람 293 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), 원숭이 COS-1 세포주 또는 스위스(Swiss), BALB/c 또는 NIH 마우스로부터 유도된 뮤린 3T3 세포와 같은 포유동물 세포도 사용될 수 있다. 또 다른 적합한 숙주 세포, 및 또한 형질감염, 배양, 증식, 스크리닝, 생산, 및 정제 방법이 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 상이한 양상의 하나의 실시형태에서, 하이브리도마 세포주가 사용될 수 있으며, 하이브리도마 세포주는 잘 공지된 통상의 기술에 의해 생성된 바람직한 모노클로날 항체를 발현한다. 본 발명과 관련하여, 하이브리도마 세포는 α2 인테그린, 특히 α2β1 인테그린에 특이적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있다. 하이브리도마 세포는 정상-활성화된, 항체를 생산하는 B 세포를 골수종 세포와 융합시켜 생성시킬 수 있다. 특히, 하이브리도마 세포는 다음과 같이 생산할 수 있다: B-세포를 관련 항원으로 챌린지시킨(challenged) 동물의 비장으로부터 제거한다. 이후에, 이들 B-세포를 배양물 속에서 무한 성장할 수 있는 골수종 종양 세포와 융합시킨다. 당해 융합은 세포 막을 보다 침투가능하도록 함으로써 수행된다. 암 세포인 융합된 하이브리드 세포(하이브리도마로 불림)는 신속하게 및 무한적으로 증식하여 다량의 바람직한 항체를 생산할 것이다. 이들은 제한 희석에 의해 선택되고 후속적으로 클로닝되어야 한다. 인터류킨-6(예: 브리클론)을 함유하는 보충 배지가 일반적으로 당해 단계를 위해 필수적이다. 선택은 새롭게 융합된 1차 하이브리도마 세포를 선택-배지, 구체적으로 1 x 농도의 HAT를 함유하는 배지 속에서 대략 10 내지 14일 동안 배양함을 통해 발생한다. HAT를 사용한 후 HT를 함유하는 배지를 사용하는 것이 흔히 바람직하다. 클로닝은 양성의 원시 하이브리도마 세포의 확인 후 발생한다.
본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 적합한 숙주 세포내에서 본 발명의 핵산을 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 따라서, 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고 임의로 숙주 세포로부터 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 회수함을 포함하여, 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
이를 위해, 숙주 세포를 예를 들면, 본 발명의 핵산을 함유하는 적어도 하나의 발현 벡터를 사용하여 전기천공(electroporation)과 같은 통상의 수단에 의해 전사 조절 서열의 조절하에 형질감염시킬 수 있다. 이후에, 형질감염되거나 형질전환된 숙주 세포를 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 배양한다. 발현된 단백질은 세포(또는 세포외적으로 발현되는 경우 배양 배지)로부터 당해 분야의 숙련가에게 공지된 적절한 수단으로 회수하고, 분리하며, 임의로 정제한다. 예를 들면, 단백질은 세포 분해 후 가용성 형태로 분리되거나, 공지된 기술, 예를 들면, 염화구아니딘 속에서 추출한다. 목적하는 경우, 본 발명의 폴리펩타이드(들)는 융합 단백질로서 생산된다. 이러한 융합 단백질은 상기 기술된 것들이다. 대안으로, 예를 들면, 융합 단백질을 생산하여 선택된 숙주 세포내에서 단백질의 발현을 향상시키거나 정제를 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 분자는 또한 정상 상 또는 역 상과 같은 액체 크로마토그래피, HPLC, FPLC 등을 사용하는 액체 크로마토그래피; 친화성 크로마토그래피(예를 들면, 무기 리간드 또는 모노클로날 항체를 사용); 크기 배제 크로마토그래피; 고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피; 겔 전기영동 등을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 각종 통상의 방법 중 어느 하나를 사용하여 추가로 정제할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 영역으로부터 벗어남이 없이 가장 적절한 분리 및 정제 기술을 선택할 수 있다. 이러한 정제는 미생물의 다른 단백질성 및 비-단백질성 물질을 실질적으로 포함하지 않는 형태의 항원을 제공한다.
적합한 숙주 세포는 예를 들면, 다세포 유기체로부터 유도된 진핵 세포 또는 세포주(상기에 정의된 바와 같음, 예를 들면, CHO 세포 또는 BHK 세포), 효모[예를 들면, 에스, 폼베(s. pombe) 또는 에스. 세레비지아에(s. cerevisiae)]와 같은 진핵 단일 세포 유기체 또는 이. 콜라이와 같은 원핵 세포이다. 매우 다양한 적합한 숙주 세포가 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 상이한 양상의 하나의 실시형태는 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 생산하는 재조합체 세포에 관한 것이며, 여기서 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 상기 세포/숙주 세포에 의해 이종 발현된다. 펩타이드 또는 단백질(여기서, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체)의 이종 발현은, 재조합체 세포가 펩타이드 또는 단백질 또는 펩타이드 복합체를 천연적으로 발현하지 않고 변형되어(예를 들면, 형질감염 또는 형질전환되어) 이를 발현하는, 예를 들면, 상기 세포에 의해 항체 또는 이의 단편과 같은 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 발현을 허용하는 핵산[예를 들면, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 암호화하는 삽입체를 수반하는 인공 핵산 작제물(벡터)]을 수반하는 세포로부터 유도되는 것을 의미한다. 재조합체 세포는 진핵 세포 및 또한 원핵 세포를 포함하는, 상기에 정의한 바와 같은 임의의 세포, 세포주 또는 숙주 세포로부터 유도될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제6 양상은 본 발명의 핵산 중 하나를 이종 발현하는 세포에 관한 것이다.
제7 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 세포를 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고 숙주 세포로부터 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 임의로 회수함을 포함하는, 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제8 양상은 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 또는 본 발명에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 포함하는 접합체(conjugate) 및/또는 본 발명에 따른 적어도 하나의 핵산을 포함하는 접합체를 포함하는, 의약으로서 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 (약제학적) 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제는 통상적이며, 완충제, 안정화제, 희석제, 방부제, 및 가용화제를 포함할 수 있다. 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)]은 본원에 기재된 폴리펩타이드/핵산의 약제학적 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기술하고 있다. 약제학적 조성물내 활성 성분(폴리펩타이드 또는 핵산)의 함량은 치료 또는 예방에 유용한 경우 제한되지 않지만, 바람직하게는 총 조성물당 0.0000001 내지 10중량%를 함유한다.
일반적으로, 담체 또는 부형제의 특성은 사용되는 특정한 투여 방식에 의존할 것이다. 예를 들면, 비경구 제형은 일반적으로 물, 생리학적 염수, 균형잡힌 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약제학적으로 및 생리학적으로 허용되는 유액을 비히클(vehicle)로서 포함하는 주사가능한 유액을 포함한다. 고체 조성물(예를 들면, 산제, 환제, 정제 또는 캅셀제 형태)의 경우, 통상의 무-독성 고체 담체는 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분 또는 스테아르산마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체 이외에, 투여되는 약제학적 조성물은 미량의 무독성 보조 물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유화제, 방부제, 및 pH 완충제 등, 예를 들면, 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.
일반적으로, 적절한 양의 약제학적으로 허용되는 염이 담체 중에 사용되어 제형이 등장성이 되도록 한다. 담체의 예는 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 시트레이트, 포스페이트, 및 다른 유기산과 같은 완충제; 염-형성 카운터-이온(counter-ion), 예를 들면, 나트륨 및 칼륨; 저 분자량(>10개 아미노산 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 또는 젤라틴; 친수성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈; 히스티딘, 글루타민, 라이신, 아스파라긴, 아르기닌 또는 글리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물; 단당류, 이당류; 다른 당, 예를 들면, 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 킬레이트화제, 예를 들면, EDTA; 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 트윈(Tween), 플루로닉스(Pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜; 메티오닌, 아스코르브산 및 토코페롤을 포함하는 항산화제; 및/또는 방부제, 예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔을 포함하는, 허용되는 부형제, 담체, 또는 안정화제는 바람직하게는 사용된 용량 및 농도에서 무-독성이다.
약제학적 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 펩타이드, 펩타이드 복합체 또는 핵산을 포함하나; 이는 또한 본 발명의 하나 이상의 상이한 펩타이드 및/또는 펩타이드 복합체 및/또는 핵산을 함유하는 칵테일(cocktail)(즉, 단순한 혼합물)을 함유할 수 있다. 본 발명의 펩타이드(들) 또는 펩타이드 복합체(들)은 또한 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드와 함께 염을 형성할 수 있는 적합한 산 및 염기는 당해 분야의 숙련가들에게 잘 공지되어 있으며, 무기 및 유기 산과 염기를 포함한다.
바람직하게는, 약제학적 조성물은 α2 인테그린-관련된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 2 인테그린-관련된 질환 또는 장애는 α2-인테그린 기능 또는 활성 중 하나 이상을 포함하거나, 이에 의해 유발되거나, 이에 기여하거나 이에 의해 영향받는 신체의 임의의 원치않는 조건으로 이해될 수 있다. 예는 콜라겐-매개된 증가되거나 비정상적인 세포 증식 또는 사이토킨 분비와 같은 비정상적인 세포 반응을 매개하여 예를 들면, 신생-혈관형성, 염증 상태 또는 상처 치유 장애를 초래하는 α2 인테그린을 포함하는 시그널링 경로 또는 공정을 포함한다. 구체적인 예는 혈전증, 혈관 질환, 신생-혈관형성 및 전이, 췌장암, 결장암, 예를 들면, 결장암의 다른 기관(예: 폐 및 간)으로의 전이성 확산 및 흑색종을 포함하는 암, 염증, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 비정상적이거나 증가된 혈관형성을 특징으로 하는 질환, 염증성 장 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 이식에 대한 반응, 시신경염, 척수 외상, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창(SLE), 다발성 경화증, 레이노이드 증후군, 쇼그렌 증후군, 강피증, 심혈관 질환, 건선, 죽상경화증, 및 염증 반응을 유도하는 감염을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 혈관 질환 및/또는 혈전증의 치료 또는 예방, 특히 급성 관상 증후군, 경피적 관상동맥 중재술, 허혈성 뇌졸중, 경동맥 협착증 또는 말초 동맥 폐쇄성 질환과 같은 특정의 임상 징후의 치료시 사용될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 치료 또는 예방은 치료를 필요로 하는(즉, 질환 상태 또는 장애를 약화시키거나 근절시키기 위하여 또는 질환 상태 또는 장애를 아직 나타내지 않는 개인에서 질환 상태 또는 장애의 발병을 예방하거나 지연시키기 위하여) 임의의 동물(비-사람 또는 사람, 특히 사람, 농장 동물 또는 애완 동물과 같은 포유동물)에 영향을 미칠 수 있다.
α2β1 인테그린은 혈전증의 치료 또는 예방시 흥미로운 표적이다. α2β1 녹-아웃(knock-out) 마우스를 사용한 생체내 연구는 감소된 혈전 형성 및 동맥 혈전증 모델에서 폐쇄까지의 증가된 시간 및 또한 연장된 꼬리 방혈 시간을 나타내었다. α2 인테그린 결핍성 및 다형성과 관련된 임상 연구에서, 환자는 경증 내지 중증의 출혈 장애 및 혈소판의 결핍성 콜라겐 반응을 나타내었다. 다형성(polymorphism)은 α2β1의 발현을 증가시켜 < 62세의 개인에서 치명적이지 않은 심근 경색에 대한 독립적인 위험 인자, < 50세 환자에서 뇌졸증의 증가된 위험, 및 제II형 당뇨병에서 당뇨병성 망막병증의 발달에 대한 증가된 위험을 초래한다. 또한, 혈소판 및 α2 인테그린은 혈관형성, 종양 진행/전이에 포함된다. 따라서, 암은 또한 흥미로운 치료학적 분야이다. α2 인테그린의 억제는 시험관내에서 기질 종양 침입을 길항하는 것으로 발혀졌으며 인테그린-ECM/α2 인테그린-매개된 제I형 콜라겐 부착은 특히 시험관내에서 췌장암에 있어 악성 표현형의 촉진에 관여한다. 생체내에서, 항-α2 길항성 mAb는 래트 모델에서 간 전이의 수술-유도된 증강을 예방하고 다분화능 사람 결장직장암의 분화를 억제하며 사람 편평 세포 암종 이종이식체의 성장 및 혈관화를 억제한다.
결장직장 암의 경우, 원발성 결장직장 암종의 제거가 전이 발달의 위험성을 역설적으로 증가시킬 수 있음이 밝혀졌는데, 이는 축적되는 증거가, 수술적 외상이 종양 성장을 자극시킬 수 있다는 것을 제안하고 있기 때문이다. 수술 동안 원발성 종양의 조작은 복잡한 세포 변화의 필요성을 극복하는 종양 세포 탈착을 초래한다. 또한, 수술적 외상은 내피하 ECM의 노출을 유도함으로써 일반적으로 발현된 인테그린을 통한 결합을 촉진하여, 종양 세포 부착을 촉진한다. 동물 모델에서, 종양 세포에서 α2 인테그린의 차단은 수술-유도된 부착을 완전히 제거하며 복부 수술 후 간 전이의 향상된 외부성장을 완전히 복귀시킨다.
췌장암의 경우, 현재의 치료요법은 단지 4개월까지 생명을 연장시키므로 흔히 충분하지 않다. 인테그린-ECM 및 α2β1-인테그린 매개된 제I형 콜라겐 부착은 특히 시험관내에서 췌장암에서 악성 표현형의 촉진에 관여한다. mAb와 같은 α2β1 인테그린 기능의 억제제를 사용한 동물 모델에서의 연구는 췌장암의 치료시 치료학적 효능에 대해 보증되고 평가되어야 한다.
이러한 발견들을 기초로 하여, α2 및/또는 α2β1 인테그린의 기능적 차단은 특히 결장직장암 및 췌장암에 대해 흥미로운 치료학적 기회를 제공할 수 있다.
본 발명의 제9 양상은 변경된 α2 인테그린 발현과 관련된 질환을 진단하는 방법으로서,
a) α2 인테그린을 포함하는 대상체로부터의 샘플을 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계;
b) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 대한 α2 인테그린의 결합을 검출하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)의 결합을 참조물질과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 참조물질과 비교한 샘플내 변경된 α2 인테그린 결합이 질환의 지표인, 변경된 α2 인테그린 발현과 관련된 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 변경된 결합은 예를 들면, 참조 샘플과 비교시 단계 b에서 검출된 바와 같은 변경된 시그널(즉, 증가되거나 감소된 시그널)에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 펩타이드(복합체)는 또한 진단 검정을 위해 사용될 수 있다. 상기에 상세히 설명한 바와 같이 α2 인테그린의 변경된 발현 및/또는 이의 돌연변이체는 특정 질환과 관련될 수 있다. 따라서, 펩타이드(복합체)를 사용하여 α2 인테그린에 대한 결합을 측정할 수 있다. 대조군 또는 참조물질과 비교한 결합(정량적으로 또는 정성적으로)이 변하는 경우, 이는 질환의 지표일 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양상은 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법으로서,
a) 개인의 채취한 샘플을 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계;
b) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 대한 α2 인테그린의 결합을 검출하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)의 결합을 하나 이상의 참조 샘플내에서 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 대한 α2 인테그린의 결합과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 하나 이상의 참조 샘플내에서 검출된 결합과 비교한 채취한 샘플내 변경된 결합이 질환의 지표인, 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 대상체로부터 수득된 시험 샘플은 α2 인테그린과 특이적으로 결합하는 본 발명의 펩타이드(복합체)와 접촉할 수 있다. 임의로, 펩타이드(복합체)는 항체를 시험 샘플과 접촉시키기 전에 고체 지지체에 고정시켜 복합체의 세척 및 후속적인 분리를 촉진할 수 있다. 고체 지지체의 예는 예를 들면, 미세역가 플레이트, 유리 현미경 슬라이드 또는 커버 슬립, 스틱, 비드(bead), 또는 미세비드의 형태인 유리 또는 플라스틱을 포함한다.
샘플을 항체와 항온처리한 후, 혼합물을 세척하고 형성된 펩타이드(복합체)/α2 인테그린/복합체들을 검출할 수 있다. 이는 세척된 혼합물을 검출 시약과 항온처리하여 달성할 수 있다. 당해 검출 시약은 검출가능한 표지의 사용에 의한 것일 수 있다. 각종의 표지 및 검출 방법이 숙련가에게 공지되어 있다. 검출가능한 표지와 관련하여, 당해 분야에 공지된 어떠한 검출가능한 표지도 사용할 수 있다. 예를 들면, 검출가능한 표지는 방사활성 표지(예를 들면, 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, 및 33P), 효소 표지(예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 등), 화학발광성 표지(예를 들면, 아크리디늄 에스테르, 아크리디늄 티오에스테르, 아크리디늄 설폰아미드, 페난트리디늄 에스테르, 루미날, 이소루미놀 등), 형광성 표지(예를 들면, 플루오레세인(예를 들면, 5-플루오레세인, 6-카복시플루오레세인, 3,6-카복시플루오레세인, 5(6)-카복시플루오레세인, 6-헥사클로로-플루오레세인, 6-테트라클로로플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 등)), 로다민, 피코빌리단백질, R-피코에리트린, 양자점(quantum dot)(예를 들면, 황화아연-캡핑된 카드뮴 셀레나이드), 온도계 표지, 태그(상기 정의한 바와 같음) 또는 면역-폴리머라제 쇄 반응 표지일 수 있다.
검정 전체에서, 항온처리 및/또는 세척 단계가 시약의 각각의 조합 후 요구될 수 있다. 항온처리 단계는 약 5초 내지 수시간, 바람직하게는 약 5분 내지 약 24시간에서 변할 수 있다. 그러나, 항온처리 시간은 검정 양식, 바이오마커(항원), 용액 용적, 농도 등에 의존할 것이다. 일반적으로, 검정은 10℃ 내지 40℃와 같은 온도의 범위에 걸쳐서 수행될 수 있다고 해도, 주위 온도에서 수행될 것이다.
편의성의 문제로서, 펩타이드(복합체)가 예를 들면, 진단 검정을 수행하는 것을 포함하는, 지침서와 함께, 소정량의 시약의 포장된 조합과 같이, 키트내에 제공될 수 있다. 펩타이드(복합체)가 효소로 표지되는 경우, 키트는, 효소가 필요로 하는 기질 및 보조인자(예를 들면, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 안정화제, 완충제(예를 들면, 차단 완충제 또는 분해 완충제) 등과 같은 다른 첨가제가 키트내에 포함될 수 있다. 키트내에 제공된 각종 시약의 상대적인 양은 예를 들면, 검정의 민감성을 실질적으로 최적화시키는 시약의 용액내 농도를 제공하기 위해 광범위하게 변할 수 있다. 시약은 예를 들면, 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된 무수 분말로 제공될 수 있다.
참조물질은 건강한 대상체로부터의 샘플일 수 있거나 건강한 대상체의 그룹에서 측정될 수 있다: 대안으로, 이는 공지된 참조 값일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는, 2개의 값이 스튜던츠 t-시험(Student's t-test) 또는 카이-자승 검증(chi-square test)과 같이 서로 유의적으로 상이한지를 평가하기 위한 통계적 과정을 인지하고 있다. 또한, 숙련가는 적합한 대조군을 선택하는 방법을 인지하고 있다.
용어 "대상체로부터의 샘플" 및 "시험 샘플"은 어떠한 제공된 대상체, 특히 사람으로부터 분리된 모든 생물학적 유액, 배설물 및 조직에 관한 것이다. 본 발명과 관련하여, 이러한 샘플은 혈액, 혈액 혈청, 혈액 혈장, 유두 흡입액, 뇨, 정액(semen), 정장(seminal fluid), 정장 혈장, 전립선 분비액, 배설물, 눈물, 타액, 땀, 생검, 복수액, 뇌척수액, 우유, 림프, 기관지 및 다른 세척 샘플, 또는 조직 추출 샘플을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 전형적으로, 혈액 샘플이 본 발명과 관련하여 사용하기에 바람직한 시험 샘플이다.
제10 양상에서, 본 발명은
a) 포장재(예를 들면, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및 라벨 또는 포장 삽입물용의 하나 이상의 용기),
b) 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염,
c) 라벨(예를 들면, 서지 정보 및/또는 바 코드 및/또는 임의의 다른 종류의 정보) 또는 포장 삽입물(즉, 칩, 전단, 소책자 등과 같은 임의의 종류의 데이터 매개체)를 포함하는, 제조 제품에 관한 것이며, 상기 포장재 내에 함유된 삽입물은, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가 질환 또는 장애, 특히 본원에 정의된 바와 같은 α2 인테그린-관련된 질환 장애에 효과적임을 나타낸다.
제11 양상에서, 본 발명은 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및 적합한 포장, 및 가능하게는 α2 인테그린의 검출시 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 사용하기에 적합한 지침서를 포함하는 α2-인테그린 관련된 장애 또는 질환의 진단용 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제9 양상에 따른 진단 키트는, 바람직하게는 공간적으로 조립된 단위로 합해지고 α2-인테그린 관련된 장애 또는 질환의 진단시 사용하기 위해 의도된, 적어도 제 9 양상에서 정의된 바와 같은 성분 및 임의로 하나 이상의 추가의 성분[예를 들면, 샘플 중에서 알파 2 인테그린의 검출을 수행하기에 필수적이거나 적합한 완충제 및 다른 시약 또는 알파 2 인테그린을 검출하기 위한 추가의 수단 또는 제공된 질환의 다른 마커, 또는 음성/양성 표준물, 하나 이상의 적합한 용기내에 적합하게 함유된 알파 2 인테그린-(펩타이드/펩타이드 복합체) 복합체를 검출하고/하거나 가시화하고/하거나 정량화하기 위한 하나 이상의 2차 항체(적합하게는 표지됨)]을 포함하는 제조 제품이다.
제9 양상의 하나의 실시형태에 따라서, 키트는 본 발명의 제7 양상 또는 제11 양상 및 어느 하나의 이들 실시형태들에 따른 방법을 위한 지침서를 포함하는 데이터 매개체를 추가로 포함한다.
제12 양상에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및/또는 하나 이상의 핵산을 사용한 α2 인테그린-관련된 장애 또는 질환의 치료 또는 진단 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 양상은 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법으로서,
a) 개인의 채취한 샘플을 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계;
b) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 대한 α2 인테그린의 결합을 검출하고/하거나 정량화시키는 단계; 및
c) 상기 단계 b)의 결합을 하나 이상의 참조 샘플에서 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 대한 α2 인테그린의 결합과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 하나 이상의 참조 샘플에서 검출된 결합과 비교한 채취한 샘플내 변경된 결합이 질환의 지표인, 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 당해 결합은 예를 들면, 참조 샘플의 것과 비교하여 펩타이드/펩타이드 복합체에 대해 표지된 항체에 의해 유발된 펩타이드/펩타이드-복합체-알파 2 인테그린 복합체의 시그널(강도)을 이용하여 단순하게 또는 공지된 방법을 사용하여 친화성(예를 들면, KD, Koff, Kon 속도)의 관점에서 검출하거나 정량화할 수 있다.
특히, 본 발명과 관련하여 용어 "참조 개인", "참조 샘플" 또는 "참조 값"과 관련하여 용어 "참조"는 특정 (건강) 상태, 질환 등에 대해 특징적이거나 대표적인 표준 또는 비교를 말한다. 따라서, 참조 값은 특정 상태(예를 들면, 질환 상태 또는 건강 상태)에 대해 전형적인 특정 매개변수(예를 들면, 특정 지표/바이오마커 분자의 발현 수준)에 대한 표준 값이고, 참조 개인은 비교를 위해 선택되고 특정의 건강 상태 또는 질환을 가진 개인이며, 참조 샘플은 예를 들면, 참조 개인으로부터의 샘플 또는 질환 상태 또는 건강 상태에 대해 전형적인 특징적인 수준의 특정 지표 또는 바이오마커를 갖는 인공 샘플일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "참조 샘플"은, 목적한 샘플과 실질적으로 동일한 방식으로 분석되고 이의 정보가 목적한 샘플의 것과 비교되는 샘플을 말한다. 이에 의해 참조 샘플은 목적한 샘플로부터 수득된 정보를 평가하도록하는 표준을 제공한다.
참조 샘플은 건강하거나 정상인 조직, 기관 또는 개인으로터 기원함으로써, 조직, 기관 또는 개인의 건강한 상태의 표준을 제공한다. 정상 참조 샘플의 상태와 목적한 샘플의 상태 사이의 차이는 질환 발달의 위험 또는 이러한 질환 또는 장애의 존재 또는 추가의 진행의 지표일 수 있다.
참조 샘플은 비정상적이거나 질환이 있는 조직, 기관 또는 개인으로부터 기원함으로써 조직, 기관 또는 개인의 질환 상태의 표준을 제공할 수 있다. 비정상적인 참조 샘플의 상태와 목적한 샘플의 상태 사이의 차이는 질환 발달의 낮아진 위험 또는 이러한 질환 또는 장애의 부재 또는 호전의 지표일 수 있다.
참조 샘플은 또한, 목적한 샘플과 동일한 조직, 기관, 또는 개인으로부터 기원할 수 있지만 보다 앞선 시점에 채취할 수 있다. 조기에 채취된 참조 샘플의 상태와 목적한 샘플의 상태 사이의 차이는 질환의 진행, 즉, 시간에 따른 질환의 호전 또는 악화의 지표일 수 있다. 참조 샘플은, 기간이 참조 샘플을 취한 시간과 목적한 샘플을 취한 시간 사이에 경과된 경우에 초기 시점 또는 후기의 시점에서 취하였다. 이러한 기간은 수년(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 년), 수 개월(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월), 수 주(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주), 수 일(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 일), 수 시간(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 시간), 수 분(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 분), 또는 수 초(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 초)를 나타낼 수 있다.
통증의 상태 또는 단계를 나타내는 참조 샘플은 진단될 장애 또는 질환, 즉, 알파-2 인테그린 관련된 장애 또는 질환, 예를 들면, 본원에 정의된 바와 같은 장애 또는 질환으로 고생하는 것으로 알려진 대조군 대상체로부터 기원할 수 있다. 대조군 대상체는 사람, 설치류(예를 들면, 래트, 햄스터, 또는 마우스) 또는 원숭이와 같은 포유동물일 수 있거나, 조류와 같은 포유동물 이외의 다른 동물일 수 있다.
바람직하게는, 샘플 또는 값과 참조 샘플 또는 값 둘다는 동일한 종(예를 들면, 사람)의 대상체, 보다 바람직하게는 동일한 성별(예를 들면, 여성 또는 남성) 및/또는 유사한 연령 또는 생애기(예를 들면, 유아, 어린이, 청소년, 성인 또는 노인)의 대상체로부터 기원한다.
본 발명의 상이한 양상 및 실시형태에서 참조 또는 참조 샘플은 바람직하게는 건강한 개인, 질환이 있는 개인, 또는 목적한 샘플과 동일한 개인으로부터 기원한다. 참조(예를 들면, 참조 값) 또는 참조 샘플을 목적한 샘플과 같은 동일한 개인으로부터 취하는 경우, 참조(예를 들면, 참조 값) 또는 참조 샘플은 바람직하게는 초기의 시점 또는 후기의 시점에 취한 후 목적한 샘플을 취한다. 참조(예를 들면, 참조 값) 또는 참조 샘플을 취한 시기 또는 참조(예를 들면, 참조 값) 또는 목적한 샘플 또는 값을 취한 시기 사이에 경과된 기간은 바람직하게는 수년(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 년), 수 개월(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 개월), 수 주(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주), 수 일 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 일), 수 시간 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 시간), 수 분 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 분), 또는 수 초 (예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 초)를 나타낸다. 대안으로 또는 추가로, 참조 샘플은 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달한 위험의 증가 또는 감소를 나타내거나 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 존재 또는 부재를 나타내거나 건강한 개인을 나타내는 알파 2 인테그린의 수준을 가진 참조 샘플이다.
참조 또는 참조 샘플이 건강한 개인 또는 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달한 위험이 감소된 개인 또는 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 부재를 나타내는 알파 2 인테그린의 수준을 가진 개인으로부터 기원하는 실시형태에서, 참조 샘플 또는 값에서, 또는 당해 참조 값 또는 참조 샘플과 비교하여 목적한 샘플 또는 값에서 알파 2 인테그린의 상승된 수준은 (a) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 존재 및/또는 (b) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달할 위험의 증가 및/또는 (c) 개인에서 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 진행을 나타낸다. 참조가 질환이 있는 개인 또는 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달하는 위험이 증가된 개인 또는 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 존재를 나타내는 값으로부터 기원한 경우 알파 2 인테그린의 유사한 수준은 (a) 알파 2 인테그린 관련된 장애 또는 질환의 존재 및/또는 (b) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달할 위험의 증가 및/또는 (c) 개인에서 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 진행을 나타낸다.
참조(값) 또는 참조 샘플이 보다 초기 시점에서 목적한 개인과 동일한 개인으로부터 기원한 실시형태에서, 목적한 개인/값/샘플내 알파 2 인테그린의 상승된 수준은 (a) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 존재 및/또는 (b) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달할 위험의 증가 및/또는 (c) 개인에서 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 진행을 나타낸다. 참조(값) 또는 참조 샘플이 초기 시점에서 목적한 개인/샘플과 동일한 개인으로부터 기원한 실시형태에서, 목적한 샘플내 알파 2 인테그린의 저하된 수준은 (a) 알파 2 인테그린 관련된 장애 또는 질환의 변경 또는 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 개선 또는 부재 및/또는 (b) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달할 위험의 증가 및/또는 (c) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 진행의 감소를 나타낸다.
참조(값) 또는 참조 샘플이 보다 초기 시점에서 목적한 샘플/값과 동일한 개인으로부터 기원한 실시형태에서, 목적한 샘플내 알파 2 인테그린의 유사한 수준은 (a) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달하는 유사한 위험 및/또는 (b) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 진행에 있어서 정체 및/또는 (c) 개인에서 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 지속을 나타낸다.
참조(값) 또는 참조 샘플이 건강한 개인으로부터 또는 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달한 위험이 감소된 개인으로부터 기원하거나 건강한 개인 또는 질환-부재의 상태 또는 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달할 위험의 감소를 나타내는 알파 2 인테그린의 수준을 포함하는 실시형태에서, 알파 2 인테그린의 상승된 수준은 (a) 알파 2 인테그린 관련된 장애 또는 질환의 존재 및/또는 (b) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달할 위험의 증가 및/또는 (c) 개인에서 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 진행을 나타낸다.
참조(값) 또는 참조 샘플이, 질환이 있는 개인으로부터 또는 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달할 위험이 증가된 개인으로부터 기원하거나 질환이 있는 개인 또는 질환-존재의 상태 또는 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달할 위험의 증가를 나타내는 알파 2 인테그린의 수준 또는 양을 포함하는 실시형태에서, 알파 2 인테그린의 유사한 수준은 (a) 알파 2 인테그린 관련된 장애 또는 질환의 존재 및/또는 (b) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달한 위험의 증가 및/또는 (c) 개인에서 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 진행을 나타낸다.
참조(값) 또는 샘플이 목적한 샘플과 동일한 개인으로부터 기원하고 초기 시점에서 취한 실시형태에서, 목적한 샘플내 알파 2 인테그린의 상승된 수준은 (a) 알파 2 인테그린 관련된 장애 또는 질환의 존재 및/또는 (b) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달할 위험의 증가 및/또는 (c) 개인에서 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 진행을 나타낸다.
참조(값) 또는 참조 샘플이 목적한 샘플과 동일한 개인으로부터 기원하고 초기 시점에서 취한 실시형태에서, 목적한 샘플내 알파 2 인테그린의 감소된 수준은 (a) 알파 2 인테그린 관련된 장애 또는 질환의 변경 또는 알파 2 인테그린의 개선 또는 부재 및/또는 (b) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환으로 발달할 위험의 감소 및/또는 (c) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 진행의 쇠퇴를 나타낸다. 참조 샘플이 목적한 샘플과 동일한 개인으로부터 기원하고 초기 시점에서 취한 실시형태에서, 목적한 샘플내 알파 2 인테그린의 유사한 수준은 (a) 알파 2 인테그린 관련된 장애 또는 질환으로 발달할 유사한 위험 및/또는 (b) 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 진행시 부진 및/또는 (c) 개인에서 알파 2 인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 지속을 나타낸다.
본 발명의 상이한 양상의 바람직한 실시형태에 따라서, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하거나 이로 이루어진다. 다음에서, 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 관련된 일부 바람직한 실시형태는 다음과 같이 나열된다:
1. 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 여기서 상기 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 특이적으로 결합하고, 상기 항체 또는 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하며, 여기서 상기 항체 또는 단편은 비-사람 영장류 α2-인테그린과 교차-반응하지만 비-영장류 α2-인테그린과 교차-반응하지 않는다.
2. 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편(여기서, 상기 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 특이적으로 결합하며, 상기 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하고, 여기서 상기 항체 또는 단편은 참조 항체의 에피토프에 대한 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하며, 상기 참조 항체는 DSMZ에 수탁번호 제DSM 23944호로 기탁된 플라스미드에 의해 암호화되는 경쇄 및 (i) DSMZ에 수탁번호 제DSM 23946호로 기탁된 플라스미드 또는 (ii) DSMZ에 수탁번호 제DSM 23945호로 기탁된 플라스미드에 의해 암호화되는 중쇄를 포함한다).
3. 실시형태 1 또는 2의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 nM 결합 친화성으로 특이적으로 결합한다).
4. 앞서의 실시형태들 중의 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 항체 또는 단편은 시험관내에서 사람 α2-인테그린과 콜라겐의 상호작용을 억제함으로써 상기 콜라겐에 대한 상기 혈소판의 부착으로 인하여 혈소판의 활성화를 억제한다).
5. 앞서의 실시형태들 중의 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 중쇄 가변 영역 도메인은 서열번호 5의 중쇄 HCDR3를 포함한다).
6. 상기 중쇄 가변 영역 도메인이 서열번호 3의 중쇄 CDR(HCDR1), 서열번호 4의 중쇄 CDR(HCDR2), 및 서열번호 5의 중쇄 CDR(HCDR3), 또는 이의 기능적 활성 변이체를 포함하는, 앞서의 실시형태 중 어느 항체, 또는 이의 항원 결합 부위.
7. 실시형태 6의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, HCDR2의 기능적 활성 변이체는 6번 아미노산 위치에서 돌연변이 Asp→Glu를 포함한다).
8. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 경쇄 가변 영역 도메인은 서열번호 8의 경쇄 LCDR3을 포함한다).
9. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 경쇄 가변 영역 도메인은 서열번호 6의 경쇄 CDR(LCDR1), 서열번호 7의 경쇄 CDR(LCDR2), 및 서열번호 8의 경쇄 CDR(LCDR3), 또는 이의 기능적 활성 변이체를 포함한다).
10. 실시형태 9의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, LCDR1의 기능적 활성 변이체는 11번 아미노산 위치에서 돌연변이 Asn→Gln을 포함한다).
11. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 도메인은 서열번호 2의 VH 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다).
12. 실시형태 11의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 도메인은 서열번호 2의 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 단편을 포함한다).
13. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 경쇄 가변 영역(VL) 도메인은 서열번호 1의 VL 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다).
14. 실시형태 13의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 경쇄 가변 영역(VL) 도메인은 서열번호 1의 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 단편을 포함한다).
15. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서 상기 중쇄 가변 영역(VH) 도메인은 H5, H7, H11, H12, H17, H20, H38, H40, H43, H55, H61, H65, H66, H67, H76, H81, H82, H87, H91, H93, H112, H113 및 H116로 이루어진 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다).
16. 실시형태 15의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 하나 이상의 아미노산 치환은 5His→Val, 7Pro→Ser, 11Leu→Val, 12Val→Lys, 17Pro→Ser, 20Leu→Val, 38Lys→Arg, 40Arg→Ala, 43Arg→Gln, 55Asp→Glu, 61Asn→Ala, 65Lys→Gln, 66Asp→Gly, 67Lys→Arg, 76Ser→Thr, 81Ile→Met, 82Gln→Glu, 87Thr→Arg, 91Ser→Thr, 93Val→Lys, 112Thr→Leu, 113Leu→Val 및 116Ser→Val으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다).
17. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 경쇄 가변 영역(VL) 도메인은 L9, L12, LI 5, L22, L34, L46, L47, L80, L83, L85, L87, 및 L89로 이루어진 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다).
18. 실시형태 17의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 하나 이상의 아미노산 치환은 9Ala→Ser, 12Ala→Ser, 15Leu→Val, 15Leu→Pro, 22Ser→Thr, 34Asn→Gln, 46Gln→Lys, 47Ala→Pro, 80Asp→Asn, 83Glu→Gln, 85Asp→Glu, 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다).
19. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 도메인은 서열번호 38 (HC1), 서열번호 39 (HC2), 서열번호 40 (HC3), 서열번호 41 (HC4), 서열번호 42 (HC5), 서열번호 43 (HC6), 및 서열번호 44 (HC7)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다).
20. 실시형태 19의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 도메인은 서열번호 38 (HC1), 서열번호 39 (HC2), 서열번호 40 (HC3), 서열번호 41 (HC4), 서열번호 42 (HC5), 서열번호 43 (HC6), 및 서열번호 44 (HC7)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 서열을 포함한다).
21. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 경쇄 가변 영역(VL) 도메인은 서열번호 33 (LC1), 서열번호 34 (LC2), 서열번호 35 (LC3), 서열번호 36 (LC4), 및 서열번호 37 (LC5)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL 서열에 대해 적어도 90%, 95%, 97% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는다).
22. 실시형태 21의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 경쇄 가변 영역(VL) 도메인은 서열번호 33 (LC1), 서열번호 34 (LC2), 서열번호 35 (LC3), 서열번호 36 (LC4), 및 서열번호 37 (LC5)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL 서열을 포함한다).
23. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 상기 항체 또는 결합 부위는 키메라 항체 또는 사람화된 항체이다).
24. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위(여기서, 항원 결합 부위는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화물 연결된 Fv, scFv, 및 (scFv)2로 이루어진 그룹으로부터 선택된다).
25. 다중 특이적 항체, 이중특이적 항체, 이소형 항체, 이중 가변 도메인 항체 및 이특이적 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위.
26. 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgG1 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인, 및 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는, 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위.
27. 사람 IgG4 불변 도메인을 포함하는, 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위.
28. 앞서의 실시형태 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위의 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산.
29. 실시형태 28의 핵산을 포함하는 재조합체 발현 벡터.
30. 실시형태 29의 재조합체 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
31. 항체가 숙주 세포에 의해 생산되는 조건하에서 실시형태 30의 숙주 세포를 배양함을 포함하여, 실시형태 1 내지 26 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법.
32. 실시형태 1 내지 27 중 어느 하나의 항체, 또는 이의 항원 결합 부위 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
33. 실시형태 32의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하여, α2-인테그린-관련된 장애 또는 질환을 치료하거나, 예방하거나 진단하는 방법.
34. α2 인테그린-관련된 질환 또는 장애는 혈전증, 혈관 질환, 신생-혈관형성 및 전이를 포함하는 암, 염증, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 비정상적이거나 증가된 혈관형성을 특징으로 하는 질환, 염증성 장 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 이식에 대한 반응, 시신경염, 척수 외상, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창(SLE), 다발성 경화증, 레이노이드 증후군, 실험적 자가면역 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 강피증, 심혈관 질환, 건선, 및 염증 반응을 유도하는 감염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 실시형태 33의 방법.
35. α2 인테그린과 관련된 질환 또는 장애가 급성 관상 증후군, 경피적 관상동맥 중재술, 허혈성 뇌졸중, 경동맥 협착증 또는 말초 동맥 폐쇄성 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 실시형태 33의 방법.
36. a) α2 인테그린을 함유하는 샘플을 실시형태 1 내지 27 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
b) 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 α2 인테그린의 결합을 검출하는 단계; 및
c) 단계 b)의 결합을 참조물질과 비교하는 단계(여기서, 샘플 속의 변경된 α2 인테그린 결합은 질환의 지표이다)를 포함하는, 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법.
37. a) 포장재,
b) 실시형태 1 내지 27 중 어느 하나의 항체 또는 항원 결합 단편,
c) 상기 항체 또는 항원 결합 단편이 α2 인테그린과 관련된 질환 또는 장애의 치료 또는 진단에 효과적임을 나타내는, 라벨, 또는 상기 포장재 내에 함유된 포장 삽입물.
본 발명은, 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜, 및 시약이 변할 수 있으므로 이들에 한정되지 않는다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하기 위한 목적이며 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 의도하지는 않는다. 본원에 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 것으로서, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는, 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 유사하게, 단어 "포함하다", "함유하다" 및 "포괄하다"는 배타적으로 보다는 포괄적으로 해석되어야 한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 기술된 모든 기술적 및 과학적 용어 및 어떠한 두문자어(acronym)는 본 발명의 분야에서 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동일한 어떠한 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 및 물질이 본원에 기술되어 있다.
본 발명은, 실시예가 단지 설명의 목적으로 포함되고 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 본 발명의 영역을 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해될 것이라고 해도, 다음 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1: 기능적인 항-α2 인테그린 mAb 및 Fab의 생성 및 선택
A - α2 인테그린 mAB 클론 세포의 서열 분리
하이브리도마로부터 α2 인테그린 mAb의 생산 및 정제
α2 인테그린 mAB 세포 은행의 2x106개 세포를 함유하는 1개의 저온 유리병을 37℃에서 신속하게 해동시켰다. 세포를 110rpm으로 회전하는 오비탈 진탕기 플랫포옴(orbital shaker platform) 위에 공기 중 5% CO2의 습윤화된 대기 하에서 37℃ 항온처리기 속에서 10% FBS, 1X ITS[기브코(Gibco) 41 400-045), 1X 피루브산나트륨(기브코 11 360-039), 150 μg/mL의 옥살로아세트산, 2 mM의 글루타민(기브코 25030-024) 및 100 U/ml의 페니실린/스트렙토마이신(기브코 15070-063)으로 이루어진 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Gibco 31053-028)로 이루어진 5 mL의 신선한 배지내 T-25 cm2 플라스크로 이전시켰다.
하이브리도마로부터 정제된 mAb의 동기준표본(isotyping)을 mCk, mIgG2a 이소형을 나타낸 세로텍(Serotec)(마우스 모노클로날 항체 동기준표준 시험 키트; 참조번호 MMT1)으로부터의 표준의 시판되는 동기준표준 키트를 사용하여 수행하였다.
세포를 세포 증폭을 위해 매 2 내지 3일마다 아배양(subculturing)하였다. 생산을 위해, 세포를 1.8 x 105 C/mL에서 10% FBS, 1X ITS, 1X 피루브산나트륨, 150 μg/mL의 옥살로아세트산, 2 mM의 글루타민 및 100 U/ml의 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 이스코브 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's medium)[시그마(Sigma) 13390] 속에서 6개의 T500 플라스크(200 mL)내로 10일 동안 접종하였다.
정제를 위해, 항-α2 인테그린 mAb를 단백질 G 친화성 크로마토그래피[하이트랩(Hitrap) 단백질 G, 제조원: 지이 헬쓰케어GE Healthcare)] 상에서 상청액으로부터 직접 포획하고 0.1 M 아세트산으로 용출시켰다.
단백질을 SEC에 의해 슈퍼덱스(Superdex) 200(제조원: 지이 헬스케어)을 사용하여 폴리싱(polishing) 및 한외여과한 후 단백질을 나타낸 실험에 사용하였다.
α2 인테그린 mAb의 중쇄 및 경쇄의 서열의 측정
모노클로날 항체의 가변 도메인을 암호화하는 cDNA를 다음과 같이 수득하였다: mRNA를 하이브리도마 세포로부터 올리고텍스 키트(Oligotex kit)[제조원: 퀴아젠(Qiagen)]를 사용하여 추출하였다. 상응하는 cDNA를 RT-PCR에 의해 RACE 방법으로 유전자 레이서 키트(Gene Racer kit)[제조원: 인비트로겐(Invitrogen)], 55℃에서 트랜스크립타제 슈퍼스크립트 III(제조원: 인비트로젠) 및 표 1에 기술된 프라이머(RACEMOG2a 또는 CKFOR)를 사용하여 증폭시켰다. cDNA 단편을 PCR에 의해 55℃에서 폴리머라제 푸션(polymerase Phusion) 및 표 1에 또한 기술된 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.
Figure pct00013
중(VH) 및 경(VL) 쇄의 가변 영역을 암호화하는 증폭된 단편을 이. 콜라이내에서 증폭시킨 인비트로겐으로부터의 pCR4-Topo 플라스미드내로 클로닝하였다. 이후에 클로닝된 cDNA를 양쪽 쇄에 대해 서열분석하였다.
단백질 서열을, 서열을 암호화하는 플라스미드로부터 해독하여 중(HC) 및 경(LC) 쇄의 질량을 계산하였다(표 2). 수득된 값은 상응하는 하이브리도마의 배양물로부터 정제된 mAb의 제조로부터 수득된 질량 분광법 데이터와 완전히 일치하였다(참조: 표 2). HC 및 LC의 핵산 및 아미노산 서열은 다음과 같이 서열 목록에 보고되어 있다: 서열번호 46 및 48은 하이브리도마 상청액으로부터 정제된 α2-인테그린 mAb의 HC에 상응하고 서열번호 45 및 47은 하이브리도마 상청액으로부터 정제된 α2-인테그린 mAb의 LC에 상응한다.
Figure pct00014
B - 항-α2-인테그린 mAb의 서열의 측정
CDR 영역에 대한 서열은 KABAT 명명법을 사용하여 단백질 서열로부터 유추하였다.
HC의 경우, CDR1은 서열번호 3에 상응하고, CDR2는 서열번호 4에 상응하며, CDR3는 서열번호 5에 상응한다.
LC의 경우, CDR1은 서열번호 6에 상응하고 CDR2는 서열번호 7에 상응하며, CDR3은 서열번호 8에 상응한다.
C - 키메라 항-α2-인테그린 mAb 발현 플라스미드의 생성
항-α2-인테그린 mAb의 가변 중쇄 및 경쇄를 PCR에 의해, AccuPrimePfx SuperMix(제조원: 인비트로겐; 제품 번호: 12344-040) 및 항-α2-인테그린 mAb 중쇄 및 경쇄 cDNA 각각을 사용하여 생성하였다(cDNA 생성을 위해 상기 참조). 25 μL의 PCR 반응에서, 5회 주기를 프라이머 α2mAB-VH FOR 및 REV (중쇄) 또는 프라이머 α2mAB-VL FOR 및 REV (경쇄) 프라이머(95℃, 15초; 62℃, 30초; 68℃, 1분)를 사용하여 수행하였다. 리더 서열을 도입시키기 위하여, 0.5μl의 각각의 제1 PCR 샘플을 제2 PCR을 위한 주형으로서 리더 FOR1-54 및 α2mAB-VL(또는 -VH) REV 프라이머와 함께 제1의 PCR과 동일한 PCR 조건으로 사용하였다. 최종적으로, 0.5μl의 제2의 PCR을 제1 반응에서와 동일한 PCR 조건을 사용하는 리더 FOR1-23 및 α2 인테그린 mAB-VL(또는 -VH) REV 프라이머에 대한 주형으로서 사용하였다. 3번째 PCR의 PCR 생성물을 PCR 정제 키트(제조원: 퀴아젠, 제품 번호 28104)를 키트 프로토콜에 기술된 바와 같이 사용하여 정제하였다. PCR 생성물을 pCR2.1-TOPO내로 업자 매뉴얼에 기술된 바와 같은 인비트로겐 TOPO TA 클로닝 키트(제품 번호 450001)를 사용하여 클로닝하고 클로닝 키트에 포함된 M13 전방 및 Ml3 역방 프라이머를 사용하여 서열분석하였다.
쥐 α2 항체 가변 경쇄 및 중쇄의 서열을 도 5로부터 아미노산을 참조하는 서열번호 1 및 가변 경쇄 도메인의 암호화 서열을 참조하는 서열번호 12 및 아미노산 서열을 참조하는 서열번호 2 및 가변 중쇄 도메인의 암호화 서열을 참조하는 서열번호 13을 사용하여 획득할 수 있다.
가변 경쇄 도메인(서열번호 1에 따른)은 VL을 Nhel/BsiWI 및 IGKC BsiWI/HindIII로 분해함으로써 고정 경쇄 (IGKC, 스위스-프롯(Swiss-Prot): Q502W4)에 융합시켜 서열번호 9 및 14에 따른 α2 항체 VL-IGKC 경쇄 키메라를 생성시켰다. 당해 융합체를 에피소옴 발현 벡터 pXL[참조: Durocher et al. (2002), Nucl. Acids Res. 30(2)], E9의 NheI/HindIII 부위내로 연결시켜, DSMZ에 수탁번호 제DSM 23944호로 기탁된 키메라 α2 항체 경쇄 "pFF0033 JDXLC-ASCII-IGKC"의 포유동물 발현 플라스미드를 생성시켰다.
가변 중쇄 도메인(서열번호 2에 따른)을 사람 고정 중쇄(IGHG4, 스위스-프롯 P01861, S108P, L115E)의 돌연변이된 변이체에 융합시켜 서열 10/15에 따른 α2 인테그린 VH-IGHG4 고정 중쇄 키메라를 생성시키거나 Fab를 생성시키기 위하여, 사람 고정 IGHG1 (스위스-프롯: Q569F4)으로부터의 6x His 태그된 CH1 도메인에 융합시켜 서열 11/16에 따른α2 인테그린 VH-IGHGl 고정 중쇄 Fab 키메라를 생성시켰다. 당해 목적으로, VH를 NheI/ApaLI로 분해하고 ApaI/HindIII 분해된 IGHG4 또는 His 태그된 CH1 도메인에 각각 융합시켰다. 당해 융합체를 에피소옴 발현 벡터 pXL의 NheI/HindIII 부위 각각에 연결하여 DSMZ에 수탁번호 제DSM 23946호로 기탁된 키메라 α2 항체 중쇄-IgG4 "pFF0036_pXLc-AscII-IGHG4"의 포유동물 발현 플라스미드, 또는 DSMZ에 수탁번호 제DSM 23945호로 기탁된 키메라 α2 항체 중쇄-Fab "pFF0035_pXLc-AscII-CHl-Hi"의 포유동물 발현 플라스미드를 생성시켰다.
상이한 플라스미드를 독일 브라운슈바이크(Braunschweig)에 소재하는 도이치 삼믈룽 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ))에 다음의 수탁번호로 기탁하였다: DSM 23945(키메라 항-α2 항체 중쇄 Fab 단편의 진핵세포 발현용 플라스미드), DSM 23946(키메라 항 α2 항체 IgG4 중쇄의 발현용 플라스미드) 및 DSM 23944(키메라 항-α2 항체 IGKC 경쇄의 발현용 플라스미드).
위에서 사용된 프라이머의 서열
α2mAB-VL 전방:
CTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCAACATTGTGCTGACCCAATCTC 서열번호 27
α2mAB -VL 역방:
ACCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCC 서열번호 28
α2mAB mAB-VH 전방:
CTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTCCAACTGCATCAGCCTG 서열번호 29
α2mAB mAB-VH 역방:
TAGGGCCCTTGGTGCTGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGG 서열번호 30
1-54에 대한 리더:
GCTAGCACCATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACC 서열번호 31
1-23에 대한 리더:
CAAGCTAGCACCATGGGCTGGTCCTG 서열번호 32
실시예 2: 항 α2-인테그린 mAb 및 Fab의 특성
A - 재조합체 항 α2 인테그린 mAB 및 Fab 단편의 생산
키메라 항 α2인테그린-IgG4 및 항 α2-인테그린-Fab 분자
항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 플라스미드를 이. 콜라이 DH5a에서 증식시켰다. 형질감염에 사용된 플라스미드는 퀴아젠 엔도프리 플라스미드 메가 키트(Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kit)를 사용하여 이. 콜라이로부터 제조하였다.
프리스타일 배지(Freestyle Medium)(제조원: 인비트로겐) 속에서 성장하는 HEK 293-FS 세포를 나타낸 LC 및 HC 플라스미드로 후겐(Fugene)[제조원: 로슈(Roche)] 형질감염 시약을 사용하여 형질감염시켰다. 7일 후 세포를 원심분리로 제거하고 상청액을 0.22μm 여과기를 통과시켜 입자를 제거하였다.
키메라 항 α2-인테그린-IgG4 및 항 α2-인테그린-Fab 분자의 정제
IgG4 단백질을 단백질 A[하이트랩(HiTrap) 단백질 HP 컬럼, 제조원: 지이 라이프 사이언시즈] 상에서 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 컬럼으로부터 pH 3.5의 100 mM NaCl이 들어있는 100 mM 아세테이트 완충액을 사용하여 용출시킨 후, 모노클로날 항체를 HiPrep 26/10 탈염 컬럼을 사용하여 탈염시키고 PBS 속에서 1 mg/mL의 농도로 제형화하고 0.22 μm로 여과하였다.
Fab 단백질을 IMAC로 하이트랩(HiTrap) IMAC HP 컬럼(제조원: 지이 라이프 사이언시즈) 위에서 정제하였다. 컬럼으로부터 선형 구배(용출 완충액: 20 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, 50 내지 500 mM 이미다졸, pH 7.4)로 용출시킨 후, 단백질 함유 분획을 혼주(pooling)시키고 하이프랩(HiPrep) 26/10 탈염 컬럼을 사용하여 탈염시키고, PBS 속에서 1 mg/mL의 농도로 제형화하고 0.22 μm 여과하였다.
단백질 농도는 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 측정하였다. 각각의 배치를 단백질 200 플러스 랩칩 키트(Plus LabChip kit)를 사용하여 아질런트(Agilent) 2100 생분석기 위에서 환원 및 비-환원 조건하에 분석하여 순도 및 각각의 서브유닛과 단량체의 분자량을 측정하였다.
B - 항-α2 인테그린 mAb 또는 Fab의 결합 특성
바이아코어 3000(제조원: 지이 헬쓰케어) 위에서 표면 플라스몬 공면 기술을 정제된 항체 및 상응하는 Fab 단편의 상세한 역학적 특성화를 위해 사용하였다. 직접적인 결합 검정을 항-인테그린 항체 또는 Fab 단편을 리간드로서 및 인테그린 2β1 I-도메인을 분석물로서 사용하였다. 전형적으로, 600 RU의 항체 또는 Fab 단편을 조사 등급 CM5 칩 위에서 아민 반응성 커플링으로 고정시켜 항체에 결합된 I 도메인에 대해 각각 80의 Rmax 및 140 RU를 생성시켰다. 결합 역학을 4 mM의 MgCl2 (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% 계면활성제 P20)가 보충된 HBS-P 완충액 속에서 30 μm/분의 유동 속도에서 0.4 내지 28 nM I-도메인 사이의 농도 범위에 걸쳐 측정하였다. 칩 표면을 10 mM 글리신 pH 2.2로 재생시켰다. 역학적 매개변수를 분석하고 BIA평가 프로그램 패키지(버젼 4.1) 속에서 참조물로서의 고정화된 항-인테그린 항체 또는 Fab 단편의 부재하에 유동 세포를 사용하여 계산하였다. 질량 전달과의 1:1 결합 모델을 항체 또는 Fab 단편의 0.4 내지 28 nM의 분석물 농도에 상응하는 곡선에 대한 데이터의 전체적인 적합도(global fit)에 대해 적용시켰다.
Figure pct00015
차단 mAb 및 Fab는 사람 α2β1-도메인에 대해 나노몰 범위의 친화성을 나타내었다(표 3).
항-α2 인테그린 mAb의 결합 특성을 추가로 평가하기 위해, HUVEC 세포(promocell C 12200, lot 6062203)을 사용한 세포계 검정을 수행하였다. 세포를 PBS 속에서 고 결합 플레이트(Meso Scale Discovery (MSD), L15XB-3) 위에 피복시키고(10,000개 세포/웰) 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 이후에, 플레이트를 비우고, PBS로 2회 세척하고 차단 용액(MSD, R93BA-4)으로 90분 동안 차단시켰다. 위에서 기술한 바와 같이 플레이트를 다시 비우고 세척한 후, 항-α2-mAb의 일련 희석물을 가하고 세포와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 위에서와 같이 다른 세척 단계 후 계면활성제가 들어있지 않은 판독 완충액(Read buffer)(Meso scale Discovery, R92TD-2)를 가하였다. 전기화학발광성을 적합한 장치(Meso scale Discovery, Sector imager) 속에서 판독하였다. 스캐차드 플롯 분석(Scatchard plot analysis)을 사용하여 시험한 mAb의 KD를 측정하였다(참조: 도 1).
C - 항-α2-인테그린 mAb의 교차-반응성 특성
항-α2 인테그린 mAb를 원숭이 및 남성으로부터의 혈소판과 특이적으로 상호작용하는 이의 능력에 대해 혈액 샘플 또는 사람 혈소판을 사용하는 FACS 실험을 이용하여 평가하였다. mAb를 사람 혈액, 원숭이 혈액 또는 사람 혈소판의 샘플 및 염소-항-마우스-IGg 피코에리트린(Phycoerithrin)(PE) 커플링된 제2의 mAb[제조원: 벡크만 코울터(Beckman Coulter) #731856)]과 함께 항온처리하였다. 샘플을 용해 용액(Lysing solution)(BD #349202)으로 처리하고 혈소판을 회전시키고, 재현탁시키며 FACS로 분석하였다.
항-α2 인테그린 mAb는 사람 전혈 샘플(>98% 양성, 도 4d)과 같이 필리핀 원숭이(macaca fascicularis)의 혈액 샘플과 유사한 반응성을 나타낸 반면(97.3% 양성, 도 4b), 마우스, 래트, 개, 기니아 피그, 돼지 또는 토끼 α2β1 인테그린에 대해서는 이들 종으로부터의 전혈을 사용하여 시험한 바와 같이 반응성이 검출되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, FACS 분석에 따라서, 원숭이 혈액으로부터의 혈소판에 있어서 영장류 α2β1 인테그린과 항체의 종간 교차반응성이 존재하는 것으로 여겨지는 반면, 마우스, 래트, 개, 기니아 피그, 돼지 또는 토끼 α2β1 인테그린에 대해서는 이들 종으로부터의 전혈로 시험한 바와 같이 교차-반응성이 검출되지 않았다.
실시예 3 - 항-α2 IgG 및 Fab의 Fv 도메인의 사람화 및 가공
사람화
항-α2 인테그린 mAB 항체의 VL 및 VH 서열의 3D 상동성 모델을 MOE 2008에서 항체 모델러 적용(antibody modeller application)을 사용하여 제조하였다. 몇가지 PDB 주형을 확인하여 LC 및 HC 골격 및 CDR 루프를 작제하였다. 모든 주형은 H3 루프에 대해 가장 우수한 주형(56% 동질성)을 제외하고는, VL 및 VH 항-α2 인테그린 mAB 서열에 대해 83% 초과의 동질성을 가졌다. 수득되는 LC 및 HC 모델을 후속적으로 MOE내에서 시행된 표준 과정을 사용하여 에너지 최소화시켰다. 쥐 VL/VH의 최소화된 3D 상동성 모델의 분자 역학(MD) 계산을 단백질 골격에 있어서의 제약을 사용하여 및 500K 온도에서 1.1 나노초 동안 일반화된 보른 내재화 용매(Generalized Borm implicit solvent) 속에서 후속적으로 수행하였다. 10개의 다양한 구조를 당해 최초 MD 수행으로부터 마지막 1ns에 대해 매 100 ps로 추출하였다. 이후에, 이들 10개의 다양한 구조를 단백질 골격에 있어서 제약없이 300K 온도에서 2.3 나노초 동안 일반화된 보른 내재화 용매 속에서 MD에 제출하였다. 10회의 MD 수행 각각에 대해, MD 궤도로부터 매 1 피코초당 마지막 2,000개의 스냅샷(snapshot)을 사용하여 각각의 항-α2 인테그린 mAB 아미노산, 참조 메도이드 위치(medoid position)와 비교하여 이의 제곱근 평균 편차(root mean square deviation: rmsd)에 대해 계산하였다. 제공된 아미노산의 10개의 별도의 MD 수행에 있어서 평균 rmsd를 모든 항-α2 인테그린 mAB 쥐 아미노산의 전체 평균 rmsd와 비교함으로써, MD 동안 관찰된 것으로서, 아미노산이 충분히 유연성인 경우, T-세포 수용체와 상호작용하며 면역 반응의 활성화에 관여하는 것으로 고려된 것으로 결정한다. 64개의 아미노산이 항-α2 인테그린 mAB 항체에서 유연성인 것으로 최종적으로 확인되었고, 이들 중 34개는 CDR 또는 이들의 인접지(immediate vicinity)(5Å)내에 위치하지 않았다. "베르니어(Vernier)" 영역내에 위치한 아미노산은 또한 고려되지 않는다(참조: J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499).
20ns(10x2ns) 동안 대부분의 34개 유연성 항-α2 인테그린 mAB 아미노산(CDR+5 A 영역 제외)의 운동을 이후에 이의 각각에 대해 10x2ns MD 모의시험을 수행한 49개의 사람 배선 상동성 모델의 상응하는 유연성 아미노산의 운동과 비교하였다. 49개의 사람 배선 모델을 7개의 가장 일반적인 사람 배선 경쇄(vk1, vk2, vk3, vk4, v람다1, v람다2, v람다3) 및 7개의 가장 일반적인 사람 배선 중쇄(vhla, vhlb, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6)를 체계적으로 조합하여 제조하였다. vkl-vhlb 사람 배선 항체는 항-α2 인테그린 mAB의 유연성 아미노산과 비교하여 이의 유연성 아미노산의 62% 4D 동질성을 나타내었고; 따라서 vkl-vhlb 배선 항체를 사용하여 유연성 아미노산을 중심으로 한 항-α2 인테그린 mAB 항체를 사람화하였다. 항-α2 인테그린 mAB와 vkl-vhlb 아미노산 사이의 쌍을 이룬 아미노산 연합을 위해, 2개 서열을 2개의 상응하는 상동성 모델의 α 탄소의 최적 3D 중첩을 기준으로 정렬하였다.
안정화
발생 빈도가 낮은 경쇄 및 중쇄의 아미노산 대 CDR을 제외한 이들 각각의 원형 서열이 가장 흔히 발견된 아미노산으로 돌연변이되어야 함이 원래 제안되어 있다(△△Gth > 0.5 kcal/몰; [참조: E. Monsellier, H. Bedouelle. Improving stability of an antibody variable fragment by combination of knowledge-based approaches: validation and mechanisms. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593]). LC 및 HC에 대한 콘센서스 돌연변이의 제1 목록은 가장 근접한 사람 배선(즉, vkl-vhlb)에서 발견된 아미노산, 즉, LC에서 4개의 잠재적인 돌연변이 및 HC에서 3개로 제한되어 왔다. 이들 돌연변이 중 어느 것도 CDR, 이의 인접지(+5 Å) 또는 "베르니어" 영역내에 위치하지 않는다(참조: J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499). 다른 기준을 항-알파2 인테그린 항체를 잠재적으로 안정화하기 위한 이들 콘센서스 돌연변이를 고려하기 위해 참작한다. 이들 기준은 돌연변이체의 예측된 안정화를 기초로 한 분자 역학 또는 표면에서 수치요법(hydropathy)의 양호한 변화이다.
이식에 의한 사람화
사람화는 항-α2 인테그린 mAB 경쇄 및 중쇄에 대해 각각 가장 근접한 사람 배선을 확인함으로써 개시한다. 이는 체계적으로 열거된 사람 배선 모두에 대해 BLAST 조사를 수행하여 달성한다(카파 및 람다 쇄에 대한 V 및 J 도메인의 모든 가능한 조합; 중쇄에 대한 V, D 및 J 도메인). BLAST 조사를 가정내 인트라넷 애플리케이션(in-house intranet application)을 사용하여 수행하였다.
다음의 가장 근접한 사람 배선은 항-α2 인테그린 경쇄 및 중쇄에 대해 각각 77% 및 68% 동질성으로 확인되었다:
Figure pct00016
IGLKV79_IGLKJ2는 서열번호 49에 상응한다. IGHV11_IGHD33_IGHJ8은 서열번호 50에 상응한다.
사람화 돌연변이는 CDR(카바트 번호매김) 및 베르니어 영역 잔기를 제외하고, 2개의 정렬된 서열의 쌍별 비교를 수행하여 수득한다.
원치않는 서열 모티프(motif)의 돌연변이
다음의 서열 모티프를 고려하였다: Asp-Pro(산 불안정성 결합), Asn-X-Ser/Thr(글리코실화, X=어떠한 아미노산 그러나 Pro 제외), Asp-Gly/Ser/Thr (석신이미드/유연성 부위내 이소-asp 형성), Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys(노출된 탈아미드화 부위), Met(노출된 부위에서 산화). 수득되는 사람화된 서열을 IEDB 데이터베이스(http://www.immuneepitope.org/home.do; 2009년 6월 버젼)에 대해 서열 동일성에 대해 블라스팅(blasting)하여 서열이 어떠한 공지된 B- 또는 T-세포 에피토프를 함유하지 않도록 하였다.
1. 항-α2β1 인테그린 가변 도메인의 원래의 서열
a. 경쇄(
Figure pct00017
는 강조되어 있고, CDR 영역에서 1개의 NS 잠재적인 문제성 모티프는 밑줄쳐져 있다)
Figure pct00018
b. 중쇄 (
Figure pct00019
는 강조되어 있고, CDR 영역내 1개의 문제있는 부위[
Figure pct00020
석신이미드 및 이소-Asp 형성 부위]는 밑줄쳐져 있다)
Figure pct00021
가공된 서열
경쇄에 대한 5개의 버젼(경쇄 변이체 LC1, LC2, LC3, LC4, LC5) 및 중쇄에 대한 7개의 버젼을 설계하였다(중쇄 변이체 HC1, HC2, HC3, HC4, HC5, H6, H7). LC1 버젼은 항-α2 인테그린 mAB 경쇄 및 VK1 사람 배선 경쇄의 비-CDR의 가장 유연성인 아미노산들 사이의 직접적인 비교로부터 기원하는 4개의 돌연변이를 나타낸다. LC2 버젼은 1개의 추가의 돌연변이를 포함함으로써 CDR 영역(N34Q)내 잠재적인 탈아미드화 부위를 제거한다. LC3 버젼은 예측된 사람화 및 안정화 돌연변이를 포함함으로써 항-α2 인테그린 mAB 경쇄를 최적으로 안정화시킨다. LC4 버젼은 1개의 추가의 돌연변이를 포함함으로써 잠재적으로 (N34Q) 탈아미드화 부위를 제거한다. LC5 버젼은 이식 방법으로부터 기원하는 6개 돌연변이를 나타낸다.
HC1 버젼은 항-α2 인테그린 mAB 중쇄 및 VHlb 사람 배선의 비-CDR의 가장 유연성인 아미노산들 사이의 직접적인 비교로부터 기원하는, 3개의 돌연변이를 나타낸다. HC2 버젼은 다른 추가의 돌연변이를 포함함으로써 CDR 영역(D55E)내 잠재적으로 문제있는 석신이미드 이소-Asp 형성 부위를 제거한다. HC3 버젼은 예측된 사람화 및 안정화 돌연변이를 포함함으로써 항-α2 인테그린 mAB 중쇄를 최적으로 안정화시킨다. HC4 버젼은 잠재적인 응집 문제에 촛점을 맞춘 추가의 돌연변이를 포함한다. HC5 버젼은 HC3 돌연변이 및 추가의 돌연변이를 포함함으로써 CDR 영역(D55E)내에서 잠재적으로 문제있는 석신이미드 이소-Asp 형성 부위를 제거한다. HC6 버젼은 잠재적인 응집 문제에 촛점을 맞춘 추가의 돌연변이를 포함한다. HC7 버젼은 이식 방법으로부터 기원하는 20개의 돌연변이를 나타낸다.
총 7개의 조합을 제조하였다:
o LC1/HC1(사람화에만 촛점맞춘 돌연변이)
o LC2/HC2(사람화 및 LC/HC 잠재적으로 문제있는 부위[NS 및 DS]에 촛점을 맞춘 돌연변이)
o LC3/HC3(사람화 및 안정화에 촛점을 맞춘 돌연변이)
o LC3/HC4(사람화 및 안정화 및 항-응집에 촛점을 맞춘 돌연변이)
o LC4/HC5(사람화 및 안정화 및 LC 잠재적으로 문제있는 부위[NS] 및 HC 잠재적으로 문제있는 부위[DS]에 촛점을 맞춘 돌연변이)
o LC4/HC6(사람화, 안정화, 항-응집 및 LC 잠재적으로 문제있는 부위[NS] 및 HC 잠재적으로 문제있는 부위 [DS]에 촛점을 맞춘 돌연변이)
o LC5/HC7(이식에 의한 사람화에 촛점을 맞춘 돌연변이)
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
사람화된 가변 서열을 유전자 합성으로 생성하고 실시예 1C에 기술된 바와 같이 상응하는 중쇄 및 경쇄 발현 벡터내로 클로닝하였다.
가공된 경쇄 서열
5개 버젼의 경쇄 변이체를 클로닝하였다(LC1, LC2, LC3, LC4, LC5). 가변 쇄의 가공을 통해 도입된 돌연변이를 강조하거나 밑줄쳤다.
LC1(사람화 돌연변이는 굵은 활자체로 밑줄쳐져 있다):
Figure pct00025
LC2(사람화 돌연변이는 강조되어 있고, CDR NS 부위에 대한 돌연변이는 굵은 활자체로 밑줄쳐져 있다):
Figure pct00026
LC3(사람화 및 안정화 돌연변이는 강조되어 있다):
Figure pct00027
LC4 (사람화 및 안정화 돌연변이는 강조되어 있고 CDR NS 부위에 대한 돌연변이는 밑줄쳐져 있다):
Figure pct00028
LC5(이식된 돌연변이는 강조되어 있다):
Figure pct00029
하기는 LC 항-α2β1 인테그린 대 VK1-Vhlb 사람 배선의 정렬이다:
Figure pct00030
가공된 중쇄 서열
중쇄 변이체의 7개 버젼(HC1, HC2, HC3, HC4, HC5, HC6, HC7)이 클로닝되었다. 가변 쇄의 가공을 통해 도입된 돌연변이는 강조되어 있다.
HC1(사람화된 돌연변이는 강조되어 있다):
Figure pct00031
HC2(사람화 돌연변이는 강조된, 잠재적으로 문제있는 모티프[CDR DS 부위]이다):
Figure pct00032
HC3 (사람화 및 안정화 돌연변이는 강조되어 있다):
Figure pct00033
HC4 (사람화 및 안정화 돌연변이는 강조된, 항-응집 돌연변이이다):
Figure pct00034
HC5 (사람화 및 안정화 돌연변이는 강조된, 잠재적인 문제있는 모티프[CDR DS 부위]이다):
Figure pct00035
HC6 (사람화 및 안정화 돌연변이는 강조된, 잠재적인 문제있는 모티프[CDR DS 부위], 항-응집 돌연변이이다):
Figure pct00036
HC7 (이식된 돌연변이가 강조되어 있다):
Figure pct00037
하기는 HC 항-α21 인테그린 mAb 대 HC Vkl_Vhlb 사람 배선의 정렬이다:
Figure pct00038
각각의 항-인테그린 α2 mAb 변이체의 가변 중쇄 및 경쇄(5개의 상이한 경쇄: VL1-VL5 및 7개의 상이한 중쇄: VH1-VH7)를 5'UTR-서열 (5'-GTGCACAGC-3')과 ApaLI 및 3'UTR (5'-GCTTCCACCAAGGGCCC-3')과 ApaI(중쇄) 또는 BsiWI(경쇄)를 포함하는 유전자 합성으로 생성하였다. 가변 중쇄 도메인을 사람 고정 중쇄의 돌연변이된 변이체(IGHG4, 스위스-프롯 P01861, S108P, L115E)를 함유하는 변형된 pXL 발현 벡터의 ApaLI/ApaI 부위내로 연결하여 항-인테그린 α2 VH-IGHG4 고정 중쇄 mAb를 생성시켰다.
가변 경쇄 도메인을 사람 고정 경쇄(IGKC, 스위스-프롯: Q502W4)를 함유하는 변형된 pXL 발현 벡터의 ApaLI/BsiWI 부위내로 연결하여 항-인테그린 α2 VL-IGKC 고정 경쇄 mAb를 생성시켰다. 유전자 합성, 클로닝 및 DNA 생산의 완전한 공정은 상업적 판매회사[게네마르트 아게(Geneart AG)]에 의해 실현되었다.
비교를 위해, 당해 분야에 공지된 사람화된 hIgG4 항-알파 2 인테그린 항체(TMC2206)를 사용하였다("비교인자"). 비교인자 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 본원에 도 10e에서 서열번호 53 및 54로 나열한다.
Figure pct00039
서열을 입증하기 위하여, mAb를 질량 분광 분석법을 사용하여 분석하였다. 완전한 질량 측정을 위해, 샘플을 20분 동안 트랩(trap)시키고 모놀리식 트랩 컬럼 위에서 2% 아세토니트릴/0.1% TFA (v/v)를 사용하여, 15%의 용출액(H20/0.05% TFA) 내지 50% 용출액 B(아세토니트릴/0.05% TFA) 범위의 구배로 용출시키기 전에 20 μl/분으로 탈염시켰다.
샘플을 나노유동(300 nl/분)으로 모놀리식 컬럼(PS-DVB; 100μm I.D. x 5 cm) 위에서 37℃의 온도로 작동시켜 분리하였다. 샘플의 도입은 외부 직경이 365μm이고, 내부 직경이 75 μm이며 말단 팁 직경이 15μm인 새로운 목절물로부터의 전기분무 침(electrospray needle) 및 차폐 가스(sheath gas)를 사용하여 수행하였다. 획득 후 스펙트럼을 상응하는 시간 범위에 걸쳐 합하고 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)/엠디에스 씨엑스(MDS Sciex)로부터의 생분석(BioAnalyst)을 사용하여 전달된 단백질 재작제 도구를 사용하여 디콘볼루션(deconvolution)하였다,
단백질 서열을 플라스미드 암호화 서열로부터 해독하고 HC 및 LC의 질량을 계산하였다(표 8).
Figure pct00040
관찰된 값은 계산된 질량과 양호하게 일치하였으며 클로닝된 작제물을 입증하였다.
실시예 4
시험관내에서 생화학 및 세포-계 검정에서 α2 인테그린 mAB의 평가
고체 상 검정을 위해, 인테그린(α2-I-도메인: TBS/5mM Mn2+ 중 α2-I-도메인 GST aa 140-339, 50μL/웰)을 96-웰 플레이트[제조원: 코닝 코스타(Corning Costar), 3690] 위에서 실온으로 밤새 고정화시켰다. 이후에, 25μl/웰의 차단 용액(5% BSA (조) (A7906), 1xTBS)을 가하고 폐기하였다. 200μl/웰의 차단 용액을 가하고 3시간 동안 실온에 두었다. 세척 단계[200μl/웰의 결합 완충액으로 3회: 1xTBS 및 0.1% BSA (A7638) 및 2mM Mn2+; TBS: 150mM NaCl, 25mM 트리스[플루카(Fluka) 93371 pH7.4] 후, 샘플을 실온에서 3시간의 정지상(stationary) 동안 50μl의:
a) 바이오티닐화된 콜라겐 단독 - 대조군(10μl의 결합 완충액 및 40μl의 바이오티닐화된 콜라겐)
b) 10μl/웰의 화합물, 40μl/웰의 바이오티닐화된 콜라겐
c) 블랭크(blank): 50μl/웰의 결합 완충액과 함께 항온처리하였다.
세척 단계(200μl/웰의 결합 완충액으로 3회) 후, 샘플을 50μl/웰의 엑스트르아비딘 퍼옥시다제(ExtrAvidin Peroxidase)(퍼옥시다제 접합체, 시그마 E2886; 결합 완충액 중 1:500)와 함께 30분 동안 실온에서 항온처리하고 200μl/웰의 결합 완충액으로 4회 다시 세척하였다. 50μl/웰의 퍼옥시다제 기질(ABTS 용액; 2,2'-아지노-비스 3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산), 시그마(Sigma) A-1888; 275μ1(0.5ml의 dH20 속에 용해된 11mg ABTS; 및 5.5ml의 0.1M 아세트산나트륨(시그마 S-3272)/0.05M NaH2P04[라이델 데 핸(Riedel de Haen 04270) pH 5.0; 및 55μl의 H202 시그마 H-1009(10μl(= 30%) 및 1045μ1 dH20)을 10 내지 30분 동안 실온에서 정지상으로(녹색 염색이 수득될 때까지) 가하고, 50μl/웰의 2% SDS를 첨가하고, 흡광도를 405 nm(SpectraMax 190)에서 판독하였다. 억제%는 블랭크를 감한 후 100-((평균 값 화합물 * 100)/평균 값 콜라겐 양성 대조군)으로 계산한다.
Figure pct00041
요약하면, α2 인테그린 mAB는 α1β1/콜라겐 상호작용(고체 상 검정), α5β1/피브로넥틴 상호작용(고체 상 검정), aIIbb3(GPIIbIIIa) 활성화(FACS-검정), hu plt(FACS-검정)에서 P-셀렉틴 발현, 전혈 단독에서 사람 혈소판 응집 또는 ADP, TRAP, 콜라겐, LDH-, TNFα-, 또는 IL1β-방출을 사용한 자극 후 효과가 없음을 나타내었다.
Huvec 세관 길이 형성
혈관형성에 있어서 인테그린 항-α2 mab의 활성을 평가하기 위하여 HUVEC 세포를 사용한 시험관내 검정을 수행하였다. 마트리겔(Matrigel)[제조원: 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), #354230]을 콜라겐 제I형(제조원: 비디 바이오사이언시즈 #35429)(마트리겔 1/3.25, PBS 5x 1/5, 콜라겐 I 1mg/ml, 적량의 물)과 혼합하고 37℃, 5% C02에서 1시간 동안 항온처리하였다. 부착된 HUVEC 세포를 배양 플라스크로부터 아쿠타제 용액(Acutase solution)을 사용하여 조심스럽게 탈착하고, 원심분리하며 배양 배지(EBM, FCS 2%, EGF 불렛 키트(bullet kit)) 속에서 1.2x105 세포/ml로 재현탁시켰다. 100μl의 세포 현탁액을 매트릭스가 들어있는 웰에 항-α2 mab 및 FGF2[제조원: 펩트로테크(Peptrotech), 10ng/ml]의 일련 희석액의 존재 또는 부재하에서 가하고 18시간 동안 37℃, 5% C02에서 항온처리하였다. 세관 형성을 검출하기 위해, 크레실 바이올렛 용액을 가하고 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 세관 형성을 웰 당 세관 길이의 합을 측정하여 측정하였다. 계산은 음성 대조군(FGF2 부재) 및 양성 대조군(항-α2 mab의 부재하에 인접한 FGF2의 존재)에 대하여 이미지 프로 및 소프트웨어(Image Pro and software)[제조원: 메디아사이버네틱스(MediaCybernetics)]를 사용하여, 조건당 6개의 반복물을 측정하여 수행하였다. 상응하는 결과를 도 2에 나타낸다. 항-알파2-인테그린 mAB는 FGF2-유도된 혈관형성을 투여량 의존적 방식으로 억제할 수 있었다.
실시예 5 - 유동 및 정적 조건하에서 항-α2 인테그린 mAB-Fab에 의한 콜라겐에 대한 혈소판 부착의 억제
단백질-단백질 상호작용 연구를 위해, 재조합적으로 발현된 인테그린 α2β1 인테그린 또는 인테그린 α2β1 인테그린의 I-도메인을 96-웰 플레이트[제조원: 코닝 코스타(Corning Costar) 3690)]에 TBS 완충액 속에서 밤새 4℃로 피복하였다. 과도한 단백질을 세척 제거한 후, 플레이트를 BSA 용액(5% 시그마 A7906)으로 차단시키고 다시 세척하였다. α2 인테그린 Mab의 일련 희석물을 플레이트 및 바이오티닐화된 콜라겐(래트 꼬리, 시그마 C8897)에 가하였다. 이는 4% HSA의 존재 또는 부재하에서 수행하였다. 실온에서 2시간 항온처리한 후, 플레이트를 다시 세척하였다. 엑스트라비딘 퍼옥시다제 용액(시그마 E2886)을 가하고 플레이트를 20분 동안 암실에서 항온처리하였다. 측정을 엘리자 판독기(Elisa reader)(SpectraMax190 Molecular Devices) 속에서 405nM로 수행하였다. 억제 퍼센트 및 IC50을 공지된 표준물에 대해 계산하였다.
콜라겐에 대한 혈소판 결합 연구를 위해, 플레이트(Isoplate, 제조원: 퍼킨 엘머(Perkin Elmer), F1450 571)를 TBS 중 콜라겐(시그마 C8897)으로 1시간 동안 실온에서 피복하였다. 웰을 TBS로 반복적으로 세척한 후 항-α2 인테그린 MAb의 일련 희석물을 가하였다. 새로이 제조된 사람 혈소판이 풍부한 혈장 또는, 히루딘, PGE1 및 ReoPro와 함께 항응고시키고 CalceinAM(C-3099) 분자 프로브를 가하고 90분 동안 실온에서 광으로부터 보호하면서 항온처리하였다. 세척 후, 플레이트를 M5 판독기(제조원: 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices) 속에서 492 nM EX, 535 nM EM으로 측정하였다. 억제 퍼센트 및 IC50을 공지된 표준물에 대해 계산하였다.
전단(shear)하 실험에서, 항-α2 인테그린 mAB를 유동하에 콜라겐에 대한 혈소판 부착을 억제하는 이의 능력에 대해 분석하였다. 유리 모세관을 콜라겐으로 밤새 4℃에서 피복시켰다. BSA로 세척 및 차단한 후, 이들을 유동 장치 속에 설치하였다. 자원자로부터의 새로이 수거한 항-응집된 사람 혈액을 DiOC6(3)으로 표지하고 10분 동안 항-α2 인테그린 mAB의 일련 희석물과 함께 37℃에서 항온처리하였다. 샘플을 모세관을 통해 3000s-1 모의 동맥 유동(mimicking arterial flow)의 전단 속도에서 유동시켰다. 모세관을 세정한 후, 유동하는 혈액과 접촉시 모세관의 표면을 나타내는 10개 사진을 촬영하였다. 이미지 소프트웨어를 사용하여, 표면 도포율(surface coverage)을 측정하고 억제 퍼센트 및 IC50을 공지된 표준물에 대해 계산하였다.
혈소판 부착 검정을 위해, 혈소판을 다음과 같이 농축시켰다: 히루딘[20μg/ml; 레플루단(제조원: 파르미온(Pharmion))] 및 혈액을 150g에서 20분 동안 원심분리하여 항응고된 사람 혈액을 생산하였다. 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)을 수집하고 다시 원심분리하고 위에서와 같이 수집하였다. 혈소판이 거의 없는 혈장을 나머지 혈액으로부터 1940g에서 10분 동안(2회) 원심분리하여 수득하였다. PPP를 희석된 세포(2mM Mg)에 가하고 세포의 농도를 2 x 105/μ1로 조절하였다. 세포를 0.5시간 동안 두고 5xl04/μl로 희석시켰다. 이후에, 세포를 3μg/ml의 레오프로(ReoPro)[2.5㎍/ml; 제조원: 센토코르 비.베(Centocor B.V.), 네덜란드 라이덴 소재](10분, 실온)와 접촉시키고, 6mM MnCl2x4H20 (5mM)를 가하였다(10분 동안 항온처리).
플레이트를 다음과 같이 제조하였다: 플레이트(제조원: 퍼킨 엘머, IsoPlate, 1450-571)를 100μl/웰의 콜라겐 제I형 10㎍/ml(아세트산 중 0.01M로서 래트 꼬리 C8897 시그마 스톡 200μg/ml으로부터 제I형)과 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이후에, 이들을 200μ1/웰의 TBS (50mM 트리스-HCl pH 7.4, 120mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.05mM CaCl2, 2mM MgCl2 x 6 H20, 0.1 % BSA)로 3회 세척하였다. 이후에, 10μl/웰의 화합물 및 레오프로(ReoPro)- 및 Mn-처리된 혈소판(5x104개 세포/μl, 50μl/웰)을 가하였다. 세포를 1.5시간(암실) 동안 항온처리하고 200μ1/웰의 TBS로 3회 세척하였다. 2.5μΜ의 칼세인 AM(50μ1/웰, C-3099, 제조원: 몰레큘러 프로브스(Molecular Probes), MW 994.87, 30분, 실온)을 가한 후 세척 단계를 수행하였다. 판독 단계를 스펙트라막스(SpectraMax) M5: 플루오레스젠즈(Fluoreszenz) EX 492 EM 535 컷오프(Cutoff): 세포의 부재하에서 530 자동)으로 수행하였다. 억제%는 블랭크를 감한 후 100-((평균 값 화합물 * 100)/평균 값 대조군)으로 계산하였다.
도 3으로부터 수득될 수 있는 바와 같이, 항-α2 인테그린 mAB 투여량은 전단 응력하에서 혈소판 부착을 나노몰 IC50으로 독립적으로 억제한다.
실시예 6 - 크기 배제 크로마토그래피로 측정한 항-α2-인테그린 mAb의 응집 거동
모든 사람화된 변이체 및 비교인자를 응집 퍼센트에 대해 시험하였다. 크기 배제 크로마토그래피를 AKTA 익스플로어러(explorer) 10[제조원: 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)] 위에서 TSKgel G3000SWXL 컬럼(7.8mm ID x 30.0 cm L, 제조원: 토쇼바이오사이언스(TosohBioscience)과 TSKgel SWXL 가아드 컬럼(제조원: 도쇼바이오사이언스)을 사용하여 수행하였다. 30μ1의 샘플을 0.4 내지 1mg/ml에서 주사하고 크로마토그래피를 1ml/분에서 100 mM Na2S04, 100 mM Na2HP04, 0.05% NaN3 pH 6.7을 작동 완충액(running buffer)으로서 및 280nm의 검출 파장을 사용하여 수행하였다. 컬럼을 겔 여과 분자량 마커(제조원: 시그마 알드리히)를 사용하여 교정하였다. 데이터 평가는 유니콘 소프트웨어(Unicorn software) v5.11(제조원: 지이 헬쓰케어)를 사용하여 수행하였다.
Figure pct00042
표 10으로부터 수득될 수 있는 바와 같이, 알파-2 인테그린 mAb의 모든 시험한 변이체는 낮은 퍼센트의 응집체를 갖는다. 비교인자의 응집 거동과 비교하는 경우, 모든 시험한 알파-2 인테그린 항체는 비교인자보다 더 낮은 응집 퍼센트 값을 나타내었다.
실시예 7 - 바이아코어에 의해 측정된 항-α2-인테그린 mAb의 역학적 결합 데이터
바이아코어 3000(제조원: 지이 헬쓰케어) 위에서 표면 플라스몬 공명 기술을 정제된 사람화된 항체의 상세한 역학적 특성을 위해 사용하였다. 포획 검정을 항-사람 Fc 특이적인 항체(MAB 1302, 제조원: 밀리포어)로 포획된 항-인테그린 항체와 함께 사용하고 인테그린 α2 I 도메인을 분석물로서 사용하였다. 전형적으로, 120 RU의 항-인테그린 항체를 조사 등급 CM5에서 고정된 항-사람 Fc 특이적인 항체로 포획하여 항체에 결합된 I 도메인에 대해 30 RU의 Rmax를 생성시켰다. 결합 역학을 4 mM MgCl2(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% 계면활성제 P20)이 보충된 HBS-P 완충액 속에서 0.8 내지 25 nM 사이의 I 도메인 농도 범위에 걸쳐 30 μl/분의 유동 속도로 측정하였다. 칩 표면을 10 mM 글리신 pH 2.5로 재생시켰다. 역학적 매개변수를 분석하고 비아평가 프로그램 패키지(BIAevaluation program package)(버젼 4.1) 속에서 유동 세포와 참조물로서 고정된 항-사람 Fc 특이적인 항체를 사용하여 계산하였다. 1:1의 결합 모델과 질량 전달을 0.8 내지 25 nM의 항체의 분석 농도에 상응하는 곡선에 대한 데이터의 전체적인 적합도를 위해 적용하였다.
Figure pct00043
이식에 의한 변이체 돌연변이는 비-사람화된 mAb에 근접한다.
실시예 8 - 항-알파 2 인테그린 항체의 에피토프 측정
비교인자 mAb를 사용하여 비-사람화된 항-알파 2 mAb의 에피토프를 입증하기 위하여, 에피토프 특성화를 바이아코어 3000(제조원: 지이 헬쓰케어) 위에서 표면 플라스몬 공명 기술을 사용하여 수행하였다. 비-사람화된 항-알파 2 mAb에 상응하는 Fab 단편을 CM5 칩 상에 아민 반응성 커플링에 의해 500 RU에서 고정시켰다. 인테그린 I 도메인을 Fab 단편에 의해 10μl/분에서 포획하고 짧은 해리 기간 후, 항체 TMC2206이 30μl/분에서 α2I 도메인에 결합하도록 하였다. 재생을 10mM 글리신 완충액 pH 2.0으로 수행하였다. 제2 실험에서 비교인자 mAb TMC2206을 항-사람 Fc 특이적인 항체(MAB 1302 밀리포어)의 표면 위에서 포획하였다. 이후에, 인테그린 I 도메인을 비-사람화된 Fab에 결합시켰다. 결과를 도 13 및 14로부터 수득할 수 있다. 당해 결과는, 비교인자 항체, TMC2206이 비-사람화된 Fab에 의해 예비결합된 인테그린 I 도메인에 결합함을 명확히 나타낸다.
따라서, 비-사람화된 Fab는 비교인자 mAb TMC2206에 의해 예비-결합된 인테그린 I 도메인에 결합한다. 비-사람화된 Fab 및 비교인자 mAb의 인테그린 α2 I 도메인에 대한 동시 결합은, Fab와 비교인자 mAb 둘다의 에피토프가 동일하지 않음을 나타낸다. 이는, 본 발명의 항 알파 2 항체 및 비교인자 항체가 알파 2 인테그린내에서 상이한 에피토프에 결합함을 의미한다.
실시예 9 - 콜라겐-피복된 플레이트 및 세척된 혈소판 또는 혈소판이 풍부한 혈장을 사용한 정적 조건하에서 혈소판 결합 검정
α2β1 인테그린은 혈액 혈소판 위에서 발현되어, 콜라겐에 대한 이들의 부착에 있어 중요한 역할을 하므로, 이들 세포를 사용한 혈소판 결합 연구에 대한 시험관내 검정 시스템을 사용하였다. 혈소판 결합 연구를 위해, 혈소판(Isoplate, 제조원: 퍼킨 엘머, F1450 571)을 TBS중 콜라겐(시그마 C8897)으로 1시간 동안 실온에서 피복시켰다. 웰을 TBS로 반복 세척한 후 항-α2 인테그린 mAb의 일련 희석물을 가하였다. 히루딘, PGE1 및 ReoPro로 항응고되고 칼세인(Calcein)AM (C-3099 제조원: 몰레큘러 프로브스)로 표지된 새로이 제조된 사람 혈소판이 풍부한 혈장 또는 새로이 분리한 사람 혈소판을 가하고 90분 동안 실온에서 광으로부터 보호하면서 항온처리하였다. 세척 후, 플레이트를 M5 판독기(제조원: 몰레큘러 디바이시즈) 속에서 492 nM 여기(Exitation), 535 nM 방출(Emission)로 측정하였다. 억제 퍼센트 및 IC50을 알파-2-인테그린 또는 비-사람화된 알파-2 mAB의 소 분자 억제제를 사용하여 제조된 적정 곡선에 대해 계산한다. 결과는 표 12로부터 수득할 수 있다.
Figure pct00044
표 12에 나타낸 결과로부터 수득될 수 있는 바와 같이, 세척된 혈소판을 사용하는 정적 조건하에서 상이한 항 알파 2 항체 변이체에 의해 나타난 혈소판 억제를 비교인자 항체와 비교 가능하며 일부 변이체(LC3/HC3 또는 LC3/HC4)의 경우 훨씬 유의적으로 또는 약간(LC1/HC1) 더 강력하였다.
Figure pct00045
표 13에 나타낸 결과로부터 수득될 수 있는 바와 같이, 혈소판이 풍부한 혈장을 사용하는 정적 조건하에서 상이한 항 알파 2 항체 변이체, 변이체 LC1/HC1, LC3/HC3, LC3/HC4 및 LC5/HC7에 의해 나타난 혈소판 억제는 비교인자 항체의 혈소판 억제와 비교가능하다.
정적 혈소판 결합 검정으로부터 결론지어질 수 있는 바와 같이, 항-α2-인테그린 항체의 사람화된 형태는 혈액 혈장의 존재 또는 부재하에서 새로이 분리한 사람 혈소판의 부착을 농도 의존적 방식으로 차단한다. 변이체중 4개는 비-사람화된 mAb와 같이 생검정에서 유사한 억제 활성을 나타낸다:
- 조합 LC1/HC1(사람화 만에 촛점을 맞춘 돌연변이)
- 조합 LC3/HC3(사람화 및 안정화에 촛점을 맞춘 돌연변이)
- 조합 LC3/HC4(사람화 및 안정화 및 항-응집에 촛점을 맞춘 돌연변이)
- 조합 LC5/HC7(이식에 의한 사람화에 촛점을 맞춘 돌연변이)
문제있는 부위(NS; DS), LC2/HC2, LC4/HC5 및 LC4/HC6에 촛점을 맞추고 상기 혈소판 결합 실험에서 보다 낮은 혈소판 억제를 나타내는 3개의 변이체는 실시예 7의 상기 바이아코어 실험에서 비-사람화된 항-알파 2 인테그린 항체보다 더 약한 α2 I 도메인 결합 활성을 나타내는 변이체와 동일하였다(참조: 표 11). 따라서, 혈소판 결합 검정의 결과는 바이아코어 평가로부터의 친화성 데이터와 완전히 일치한다.
실시예 10 - 상이한 항 알파 2 항체 변이체의 열 안정성
열 안정성과 관련한 결과를 표 14에 요약해서 나타낸다. 항체는 비교인자와 비교가능하거나, 동등하거나 보다 우수한 열 안정성을 나타낸다. 열안정성 측정은 PCR 유전자증폭기(thermocycler)(My-IQ - 10 내지 90℃ 사이의 온도 범위내에서 1℃/분으로 2회)를 사용하여 수행한다. PBS 완충액 속에 희석된 항체 2 마이크로그램을 40XSYPRO 오렌지(제조원: 인비트로겐)로 보충하였다.
Figure pct00046
도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 DSM23944 20100825 도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 DSM23945 20100825 도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하 DSM23946 20100825
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> PEPTIDE OR PEPTIDE COMPLEX BINDING TO α2 INTEGRIN AND METHODS AND USES INVOLVING THE SAME <130> DE2010/156 <150> EP 10305929.1 <151> 2010-08-31 <160> 54 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb <400> 1 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb <400> 2 Gln Val Gln Leu His Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Pro Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of the heavy chain variable domain <400> 3 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of the heavy chain variable domain <400> 4 Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of the heavy chain variable domain <400> 5 Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 of the light chain variable domain <400> 6 Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2 of the light chain variable domain <400> 7 Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3 of the light chain variable domain <400> 8 Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric (anti-alpha2-VL-IGKC-CL) light chain <400> 9 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 10 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric (anti-alpha2-VH-IGHG4-CH1) mAb <400> 10 Gln Val Gln Leu His Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Pro Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 11 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric (anti-alpha2-VH-IGHG1-CH1) heavy chain Fab fragment <400> 11 Gln Val Gln Leu His Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Pro Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val 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actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atccaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaaggtggga 300 cgggggtact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351 <210> 14 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric (anti-alpha2-VL-IGKC-CL) light chain <400> 14 aacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atatcctgca gagccagtga aagtgttgag agttatggca acagttttat ttactggtac 120 cagcagaaac caggacaggc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagcatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 240 cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaaataatga ggatccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgtacgg tggccgctcc ttccgtgttc 360 atcttccctc cctccgacga gcagctgaag tccggcaccg cctccgtggt gtgtctgctg 420 aacaacttct accctcggga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagtcc 480 ggcaactccc aggagtccgt caccgagcag gactccaagg acagcaccta ctccctgtcc 540 tccaccctga ccctgtccaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgtgaggtg 600 acccaccagg gcctgtccag ccctgtgacc aagtccttca accggggcga gtgc 654 <210> 15 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric (anti-alpha2-VH-IGHG4-CH1) mAb <400> 15 caggtccaac tgcatcagcc tggggctgaa cttgtgaagc ctggggctcc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggacgag gcctcgagtg gattggcagg attgatcctt ccgatagtga aactcactac 180 aatcaaaagt tcaaggacaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atccaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaaggtggga 300 cgggggtact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccagcacc 360 aagggccctt ccgtgttccc tctggcccct tgctcccggt ccacctccga gtccaccgcc 420 gctctgggct gcctggtgaa ggactacttc cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480 ggcgccctga cctccggcgt gcacaccttc cctgccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac 540 tccctgtcct ccgtggtgac cgtgccttcc tcctccctgg gcaccaagac ctacacctgt 600 aacgtggacc acaagccttc caacaccaag gtggacaagc gggtggagtc caagtacggc 660 cctccttgcc ctccctgccc tgcccctgag ttcgagggcg gacctagcgt gttcctgttc 720 cctcctaagc ctaaggacac cctgatgatc tcccggaccc ctgaggtgac ctgtgtggtg 780 gtggacgtgt cccaggagga ccctgaggtc cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 840 gtgcacaacg ccaagaccaa gcctcgggag gagcagttca attccaccta ccgggtggtg 900 tctgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aagaatacaa gtgtaaggtc 960 tccaacaagg gcctgccctc ctccatcgag aaaaccatct ccaaggccaa gggccagcct 1020 agggagcctc aggtgtacac cctgcctcct agccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg 1080 tccctgacct gtctggtgaa gggcttctac ccttccgaca tcgccgtgga gtgggagtcc 1140 aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc acccctcctg tgctggactc cgacggctcc 1200 ttcttcctgt actccaggct gaccgtggac aagtcccggt ggcaggaggg caacgtcttt 1260 tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg 1320 tctctgggc 1329 <210> 16 <211> 693 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric (anti-alpha2-VH-IGHG1-CH1) heavy chain Fab fragment <400> 16 caggtccaac tgcatcagcc tggggctgaa cttgtgaagc ctggggctcc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggacgag gcctcgagtg gattggcagg attgatcctt ccgatagtga aactcactac 180 aatcaaaagt tcaaggacaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240 atccaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaaggtggga 300 cgggggtact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agccagcacc 360 aagggcccat ccgtgttccc tctggcccct tcctccaagt ccacctccgg cggcaccgcc 420 gctctgggct gcctggtgaa ggactacttc cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc cctgccgtgc tgcagtcctc cggcctgtac 540 tccctgtcct ccgtggtgac cgtgccttcc tcctccctgg gcacccagac ctacatctgt 600 aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc taagtcctgt 660 gacaagaccc acacccatca ccatcaccat cac 693 <210> 17 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IGKC protein (Swiss-Prot: Q502W4) <400> 17 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IGHG1 protein (Swiss-Prot: Q569F4) <400> 19 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 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cgtgcacagc aacattgtgc tgacccaatc tc 52 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha2mAB-VL REV: primer for amplifying the light chain of anti-alpha2-integrin mAb <400> 28 accgtacgtt ttatttccag cttggtcccc 30 <210> 29 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha2mAB mAB-VH FOR: primer for amplifying the heavy chain of anti-alpha2-integrin mAb <400> 29 ctggtggcca ccgccaccgg cgtgcacagc caggtccaac tgcatcagcc tg 52 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha2mAB mAB-VH REV: primer for amplifying the heavy chain of anti-alpha2-integrin mAb <400> 30 tagggccctt ggtgctggct gaggagactg tgagagtgg 39 <210> 31 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader FOR1-54: primer for introducing leader sequence into the variable chains of anti-alpha2-integrin mAb <400> 31 gctagcacca tgggctggtc ctgcatcatc ctgtttctgg tggccaccgc cacc 54 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader FOR1-23: primer for introducing leader sequence into the variable chains of anti-alpha2-integrin mAb <400> 32 caagctagca ccatgggctg gtcctg 26 <210> 33 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC1: Light chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb with humanizing mutations <400> 33 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Gln Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 34 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC2: Light chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb with humanizing mutations <400> 34 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr 20 25 30 Gly Gln Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Gln Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 35 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC3: Light chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb with humanizing and stabilizing mutations <400> 35 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 36 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC4: Light chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb with humanizing and stabilizing mutations <400> 36 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr 20 25 30 Gly Gln Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 37 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC5: Light chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb with grafted mutations <400> 37 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 38 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC1: Heavy chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb with humanizing mutations <400> 38 Gln Val Gln Leu His Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Pro Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Val Ser 115 <210> 39 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC2: Heavy chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb with humanizing mutations <400> 39 Gln Val Gln Leu His Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Pro Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ser Glu Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Val Ser 115 <210> 40 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC3: Heavy chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb with humanizing and stabilizing mutations <400> 40 Gln Val Gln Leu His Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Val Ser 115 <210> 41 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC4: Heavy chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb with humanizing and stabilizing mutations <400> 41 Gln Val Gln Leu His Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 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Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Val Ser 115 <210> 43 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC6: Heavy chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb with humanizing and stabilizing mutations <400> 43 Gln Val Gln Leu His Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ser Glu Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Val Ser 115 <210> 44 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC7: Heavy chain variable domain of anti-alpha2-integrin mAb with grafted mutations <400> 44 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 717 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 45 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60 aacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120 atatcctgca gagccagtga aagtgttgag agttatggca acagttttat ttactggtac 180 cagcagaaac caggacaggc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagcatct 240 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattgat 300 cctgtggagg ctgatgatgc tgcaacctat tactgtcagc aaaataatga ggatccgtac 360 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgctag 717 <210> 46 <211> 1401 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 46 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ccacaggtgt ccactcccag 60 gtccaactgc atcagcctgg ggctgaactt gtgaagcctg gggctccagt gaagctgtcc 120 tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactggatga actgggtgaa gcagaggcct 180 ggacgaggcc tcgagtggat tggcaggatt gatccttccg atagtgaaac tcactacaat 240 caaaagttca aggacaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatc 300 caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaaa ggtgggacgg 360 gggtactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctcagc taaaacaaca 420 gccccatcgg tctatccact ggcccctgtg tgtggagata caactggctc ctcggtgact 480 ctaggatgcc tggtcaaggg ttatttccct gagccagtga ccttgacctg gaactctgga 540 tccctgtcca gtggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacaccctc 600 agcagctcag tgactgtaac ctcgagcacc tggcccagcc agtccatcac ctgcaatgtg 660 gcccacccgg caagcagcac caaggtggac aagaaaattg agcccagagg gcccacaatc 720 aagccctgtc ctccatgcaa atgcccagca cctaacctct tgggtggacc atccgtcttc 780 atcttccctc caaagatcaa ggatgtactc atgatctccc tgagccccat agtcacatgt 840 gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca gatgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac 900 gtggaagtac acacagctca gacacaaacc catagagagg attacaacag tactctccgg 960 gtggtcagtg ccctccccat ccagcaccag gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc 1020 aaggtcaaca acaaagacct cccagcgccc atcgagagaa ccatctcaaa acccaaaggg 1080 tcagtaagag ctccacaggt atatgtcttg cctccaccag aagaagagat gactaagaaa 1140 caggtcactc tgacctgcat ggtcacagac ttcatgcctg aagacattta cgtggagtgg 1200 accaacaacg ggaaaacaga gctaaactac aagaacactg aaccagtcct ggactctgat 1260 ggttcttact tcatgtacag caagctgaga gtggaaaaga agaactgggt ggaaagaaat 1320 agctactcct gttcagtggt ccacgagggt ctgcacaatc accacacgac taagagcttc 1380 tcccggactc ccgggaagtg a 1401 <210> 47 <211> 218 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 115 120 125 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 145 150 155 160 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp 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Gly Glu Cys 210 <210> 54 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable domain of anti-integrin 2 mAb <400> 54 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Arg Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Asn Asp Gly Val Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445

Claims (44)

  1. 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 바람직하게는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 항체 또는 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하고, 여기서 상기 항체 또는 단편은 비-사람 영장류 α2-인테그린과 교차-반응하지만 비-영장류 α2-인테그린과는 교차-반응하지 않는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 바람직하게는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 바람직하게는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    여기서 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 항체 또는 단편은 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 특이적으로 결합하고, 상기 항체는 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하며, 여기서 상기 항체 또는 단편은 참조 항체(reference antibody)의 에피토프에 결합하기 위해 참조 항체와 경쟁하고, 상기 참조 항체는 DSMZ에 수탁번호 제DSM 23944호하에 기탁된 플라스미드에 의해 암호화되는 경쇄 및 (i) DSMZ에 수탁번호 제DSM 23946호하에 기탁된 플라스미드 또는 (ii) DSMZ에 수탁번호 제DSM 23945호하에 기탁된 플라스미드에 의해 암호화되는 중쇄를 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드복합체, 바람직하게는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 바람직하게는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    하기 성분 (a) 내지 (f):
    (a) LCDR1[여기서, LDR1은
    Figure pct00047
    (서열번호 6) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다],
    (b) LCDR2[여기서, LDR2는
    Figure pct00048
    (서열번호 7) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다],
    (c) LCDR3[여기서, LDR3은
    Figure pct00049
    (서열번호 8) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다],
    (d) HCDR1[여기서, HDR1은 (
    Figure pct00050
    , 서열번호 3) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다],
    (e) HCDR2[여기서, HDR2는
    Figure pct00051
    (서열번호 4) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다], 및
    (f) HCDR3[여기서, HDR3은
    Figure pct00052
    (서열번호 5) 또는 이의 기능적 활성 변이체이다]
    중 하나 이상을 포함하고,
    여기서 상기 성분 (a) 내지 (f) 중 하나 이상은 α2 인테그린에 대한 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 결합을 허용하도록 정렬되는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체, 바람직하게는 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 성분 (a) 내지 (c)가 경쇄(VL)의 가변 도메인내에 포함되고/되거나;
    (ii) 상기 성분 (d) 내지 (f)가 중쇄(VH)의 가변 도메인내에 포함되고/되거나;
    (iii) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가 항체이고/이거나;
    (iv) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람화된 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화물-연결된 Fv, scFv, (scFv)2, 단일 도메인 항체, 디아바디(diabody), 다중 특이적 항체, 이중 특이적 항체, 이소형 항체, 이중 가변 도메인 항체 및 이특이적 항체이고/이거나;
    (v) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgG1 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인, 및 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하고/하거나;
    (vi) 상기 기능적 활성 변이체가 서열번호 3 내지 8의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대해 90% 이상의 서열 동일성으로 이루어진 기능적 활성 단편이고/이거나;
    (vii) 상기 기능적 활성 변이체가 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 기능적 활성 변이체이며, 특히 여기서 기능적 활성 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 서열번호 3 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로부터 유도되고/되거나;
    (viii) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가
    - 서열번호 1, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및/또는
    - 서열번호 2, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및/또는
    - 서열번호 9, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및/또는
    - 서열번호 10, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및/또는
    - 서열번호 11, 또는 이의 기능적 활성 변이체의 아미노산 서열을 포함하거나,
    (ix) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가
    - 서열번호 1, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
    - 서열번호 2, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
    - 임의로 50개의 추가의 아미노산 잔기(들), 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 30개, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 25개 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1 내지 10개 이하, 가장 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가의 아미노산 잔기(들)의 아미노산 서열로 이루어지거나;
    (x) - 서열번호 9, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
    - 서열번호 10, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
    - 임의로 50개의 추가의 아미노산 잔기(들), 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 30개, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 25개 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1 내지 10개 이하, 가장 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가의 아미노산 잔기(들)
    의 아미노산 서열로 이루어지거나;
    (xi) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가
    - 서열번호 9, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
    - 서열번호 11, 또는 이의 기능적 활성 변이체, 및
    - 임의로 50개의 추가의 아미노산 잔기(들), 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 30개, 더욱 더 바람직하게는 최대 1 내지 25개 이하, 더욱 보다 바람직하게는 최대 1 내지 10개 이하, 가장 바람직하게는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가의 아미노산 잔기(들)
    의 아미노산 서열로 이루어진,
    펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    - LCDR1의 기능적 활성 변이체가 11번 아미노산 위치에서 돌연변이, 구체적으로 11Asn→Gln을 포함하고/하거나;
    - HDR2의 기능적 활성 변이체가 6번 아미노산 위치에서 돌연변이, 구체적으로 6Asp→Glu를 포함하고/하거나;
    - 서열번호 1의 기능적 활성 변이체가, 9, 12, 15, 22, 34, 46, 47, 80, 83, 85, 87 및/또는 89번 아미노산 위치에서, 특히 9Ala→Ser, 12Ala→Ser, 15Leu→Val, 15Leu→Pro, 22Ser→Thr, 34Asn→Gln, 46Gln→Lys, 47Ala→Pro, 80Asp→Asn, 83Glu→Gln, 85Asp→Glu, 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하고/하거나;
    - 서열번호 2의 기능적 활성 변이체가, 5, 7, 11, 12, 17, 20, 38, 40, 43, 55, 61, 65, 66, 67, 76, 81, 82, 87, 91, 93, 112, 113 및/또는 116의 아미노산 위치에서, 특히 5His→Val, 7Pro→Ser, 11Leu→Val, 12Val→Lys, 17Pro→Ser, 20Leu→Val, 38Lys→Arg, 40Arg→Ala, 43Arg→Gln, 55Asp→Glu, 61Asn→Ala, 65Lys→Gln, 66Asp→Gly, 67Lys→Arg, 76Ser→Thr, 81Ile→Met, 82Gln→Glu, 87Thr→Arg, 91Ser→Thr, 93Val→Lys, 112Thr→Leu, 113Leu→Val 및 116Ser→Val로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는,
    펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 단편이 사람 α2-인테그린의 I-도메인에 nM 결합 친화성으로 특이적으로 결합하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가 시험관내에서 사람 α2-인테그린과 콜라겐의 상호작용을 억제함으로써, 상기 콜라겐에 대한 상기 혈소판의 부착으로 인한 혈소판의 활성화를 억제하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 도메인이 서열번호 5의 중쇄 HCDR3을 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역 도메인이 서열번호 3의 중쇄 CDR(HCDR1), 서열번호 4의 중쇄 CDR(HCDR2), 및 서열번호 5의 중쇄 CDR(HCDR3), 또는 이들의 기능적 활성 변이체를 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 HCDR2의 기능적 활성 변이체가 6번 아미노산 위치에서 돌연변이 Asp→Glu를 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역 도메인이 서열번호 8의 경쇄 LCDR3을 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역 도메인이 서열번호 6의 경쇄 CDR(LCDR1), 서열번호 7의 경쇄 CDR(LCDR2), 및 서열번호 8의 경쇄 CDR(LCDR3), 또는 이들의 기능적 활성 변이체를 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 LCDR1의 기능적 활성 변이체가 11번 아미노산 위치에서 돌연변이 Asn→Gln을 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 도메인이 서열번호 2의 VH 서열에 대해 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 도메인이 서열번호 2의 서열 또는 이의 기능적으로 활성인 단편을 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역(VL) 도메인이 서열번호 1의 VL 서열에 대해 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역(VL) 도메인이 서열번호 1의 서열 또는 이의 기능적 활성 단편을 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 도메인이 H5, H7, H11, H12, H17, H20, H38, H40, H43, H55, H61, H65, H66, H67, H76, H81, H82, H87, H91, H93, H112, H113 및 H116으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 5His→Val, 7Pro→Ser, 11Leu→Val, 12Val→Lys, 17Pro→Ser, 20Leu→Val, 38Lys→Arg, 40Arg→Ala, 43Arg→Gln, 55Asp→Glu, 61Asn→Ala, 65Lys→Gln, 66Asp→Gly, 67Lys→Arg, 76Ser→Thr, 81Ile→Met, 82Gln→Glu, 87Thr→Arg, 91Ser→Thr, 93Val→Lys, 112Thr→Leu, 113Leu→Val 및 116Ser→Val으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역(VL) 도메인이 L9, L12, L15, L22, L34, L46, L47, L80, L83, L85, L87, 및 L89로 이루어진 그룹으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 치환이 9Ala→Ser, 12Ala→Ser, 15Leu→Val, 15Leu→Pro, 22Ser→Thr, 34Asn→Gln, 46Gln→Lys, 47Ala→Pro, 80Asp→Asn, 83Glu→Gln, 85Asp→Glu, 87Ala→Thr 및 89Thr→Asn으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 도메인이 서열번호 38(HC1), 서열번호 39(HC2), 서열번호 40(HC3), 서열번호 41(HC4), 서열번호 42(HC5), 서열번호 43(HC6), 및 서열번호 44(HC7)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 서열에 대해 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 중쇄 가변 영역(VH) 도메인이 서열번호 38(HC1), 서열번호 39(HC2), 서열번호 40(HC3), 서열번호 41(HC4), 서열번호 42(HC5), 서열번호 43(HC6), 및 서열번호 44(HC7)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VH 서열을 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역(VL) 도메인이 서열번호 33(LC1), 서열번호 34(LC2), 서열번호 35(LC3), 서열번호 36(LC4), 및 서열번호 37(LC5)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL 서열에 대해 90%, 95%, 97% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 경쇄 가변 영역(VL) 도메인이 서열번호 33(LC1), 서열번호 34(LC2), 서열번호 35(LC3), 서열번호 36(LC4), 및 서열번호 37(LC5)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 VL 서열을 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 결합부가 키메라 항체 또는 사람화된 항체인, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합부가 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화물 연결된 Fv, scFv, 및 (scFv)2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 다중 특이적 항체, 이중 특이적 항체, 이소형 항체, 이중 가변 도메인 항체 및 이특이적 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgG1 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인, 및 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 IgG4 불변 도메인을 포함하는, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가 분리된 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하거나 이로 이루어진, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 암호화하는 하나 이상의 핵산(들).
  33. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, α2-인테그린-관련 장애 또는 질환의 치료, 예방 또는 진단에 사용하기 위한, 펩타이드 또는 펩타이드 복합체.
  34. 제32항에 있어서, 상기 핵산(들)이 벡터내에 위치하는, 핵산(들).
  35. 제32항 또는 제34항에 따른 핵산 중 하나를 이종 발현하는 세포.
  36. 펩타이드 또는 펩타이드 복합체의 발현을 허용하는 조건하에서 제35항에 따른 세포를 배양하는 단계 및 임의로 숙주 세포로부터 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 생산하는 방법.
  37. 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및/또는 제32항 또는 제34항에 따른 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 의약으로서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 바람직하게는 혈전증, 혈관 질환, 신생-혈관형성 및 전이를 포함하는 암, 염증, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 비정상적이거나 증가된 혈관형성을 특징으로 하는 질환, 염증성 장 질환, 크론 질환, 궤양성 대장염, 이식에 대한 반응, 시신경염, 척수 외상, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창(SLE), 다발성 경화증, 레이노이드 증후군(Reynaud's syndrome), 실험적 자가면역 뇌척수염, 쇼그렌 증후군(Sjorgen's syndrome), 강피증, 심혈관 질환, 건선, 및 염증 반응을 유도하는 감염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, α2 인테그린과 관련된 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 혈관 질환 및/또는 혈전증의 치료 또는 예방, 특히 급성 관상 증후군, 경피적 관상동맥 중재술(percutaneous coronary intervention), 허혈성 뇌졸중, 경동맥 협착증 또는 말초 동맥 폐쇄성 질환의 치료시 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  40. 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법으로서,
    a) α2 인테그린을 함유하는 샘플을 제1항 내지 제31항 중의 어느 하나의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계;
    b) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 대한 α2 인테그린의 결합을 검출하는 단계; 및
    c) 상기 단계 b)의 결합을 참조물질과 비교하는 단계(여기서, 샘플 속의 변경된 α2 인테그린 결합은 상기 질환의 지표이다)를 포함하는, 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법.
  41. 제조 제품(article of manufacture)으로서,
    a) 포장재,
    b) 제1항 내지 제31항 또는 제33항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 제36항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물,
    c) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체가 질환 또는 장애, 특히 α2 인테그린과 관련된 질환 또는 장애의 치료에 효과적임을 나타내는, 라벨, 또는 상기 포장재 내에 포함된 삽입물인 포장 삽입물을 포함하는, 제조 제품.
  42. 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및 적합한 포장, 및 가능하게는 α2 인테그린의 검출시 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체를 사용하기 위한 적합한 지침서를 포함하는, α2-인테그린과 관련된 장애 또는 질환의 진단용 진단 키트.
  43. 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 펩타이드 또는 펩타이드 복합체 및/또는 제32항 또는 제34항에 따른 하나 이상의 핵산 또는 제36항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물 중의 하나를 사용하여, α2-인테그린과 관련된 장애 또는 질환을 치료 또는 진단하는 방법.
  44. 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법으로서,
    a) 개인으로부터 채취한 샘플을 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따른 펩타이드 또는 펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계;
    b) 상기 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 대한 α2 인테그린의 결합을 검출하는 단계; 및
    c) 단계 b)의 결합을 하나 이상의 참조 샘플내 펩타이드 또는 펩타이드 복합체에 대한 α2 인테그린의 결합과 비교하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 참조 샘플에서 검출된 결합과 비교한 상기 채취한 샘플내에서의 변경된 결합은 상기 질환의 지표이다)를 포함하는, 변경된 α2 인테그린과 관련된 질환을 진단하는 방법.
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