MX2013002313A - Peptido o complejo peptidico que se une a integrina ?2 y metodos y usos que implican a los mismos. - Google Patents

Peptido o complejo peptidico que se une a integrina ?2 y metodos y usos que implican a los mismos.

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Abstract

La presente invención se refiere a un péptido o complejo peptídico que se unen a integrina a2, a uno o más ácidos nucleicos que codifican el péptido o complejo peptídico, a una célula recombinante que produce el péptido o complejo peptídico, a un método para la producción del péptido o complejo peptídico, a una composición farmacéutica que comprende el péptido o complejo peptídico o el ácido o ácidos nucleicos para su uso como un medicamento, a un método para la detección de integrina a2 y a un método de cribado.

Description

PÉPTIDO O COMPLEJO PEPTÍDICO QUE SE UNE A INTEGRINA oc2 Y MÉTODOS Y USOS QUE IMPLICAN A LOS MISMOS La presente invención está relacionada con un péptido o complejo peptídico que se une a ¡ntegrina a2 para su uso en el tratamiento, profilaxis o diagnóstico, a uno o más ácidos nucleicos que codifican el péptido o complejo peptídico, una célula recombinante que produce el péptido o complejo peptídico, un método para producir el péptido o complejo peptídico, una composición farmacéutica que comprende el péptido o complejo peptídico o el ácido nucleico o los ácidos nucleicos para su uso como un medicamento, un método para detectar ¡ntegrina a2 y un método de exploración.
Antecedentes de la invención Las integrinas son proteínas transmembrana que median interacciones entre moléculas de adhesión en células adyacentes y/o la matriz extracelular (ECM). Las integrinas desempeñan diversos papeles en varios procesos biológicos incluyendo migración celular durante el desarrollo y curación de heridas, diferenciación celular y apoptosis. Sus actividades también pueden regular el potencial metastásico e invasivo de células tumorales. Existen como heterodímeros que consisten en subunidades y ß. Algunas subunidades a y ß muestran especificidad entre sí y pueden designarse como un miembro de VLA (antígeno muy tardío). Los heterod ¡meros se unen preferentemente a ciertas moléculas de adhesión celular o constituyentes de la ECM. Aunque no tienen actividad catalítica, las ¡ntegrinas pueden ser parte de complejos de señalización multimolecular conocidos como adhesiones focales. 5 Tras unirse a los ligandos, las ¡ntegrinas transducen señales intracelulares al citoesqueleto que modifican la actividad celular en I respuesta a estos acontecimientos de adhesión celular, denominadas señalización de fuera a dentro. Dicha señalización también puede activar otros subtipos de integrina expresados en la misma célula, denominada 10 señalización de dentro a fuera. La señalización de dentro a fuera se produce además mediante señales reguladoras que se originan dentro del citoplasma celular tales como una interrupción de la unión entre una subunidad a y ß, que se transmite después al dominio de unión a ligando | externo del receptor. Las ¡ntegrinas pueden desempeñar papeles 15 importantes en los acontecimientos de adhesión celular que controlan el desarrollo, morfogénesis de órganos, fisiología y patología así como homeostasis tisular normal y respuestas inmunes y trombóticas y además actúan como sensores ambientales para la célula.
* Uno de los heterodímeros de integrina es integrina a2ß1. La integrina a2ß1 20 se expresa en varios tipos celulares diferentes, incluyendo células endoteliales y epiteliales, fibroblastos, linfocitos y plaquetas. La especificidad de ligando de a2ß1 varía con el tipo celular. Aunque actúa como un receptor de colágeno en plaquetas y fibroblastos, puede actuar como un receptor tanto de laminina como de colágeno en células endoteliales y epiteliales.
La integrina a2ß1 es una molécula compuesta de una subunidad de integrina a2 de la familia de las integrinas a y una subunidad de integrina ß1 de la familia de la integrinas ß. Las secuencias de integrina a2 y ß1 se conocen en la técnica y están publicadas, por ejemplo, en Takada y Hemler J. Cell. 109 (1): 397-407, 1989 y Argraves, W.S, J. Cell. Biol. Sep. 105 (3): 1183-90 (1987). Se indican secuencias de ejemplo en la Figura 9, y secuencias adicionales pueden obtenerse de la base de datos del Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI), por ejemplo con los números de acceso de NCBI NP_002194 NM_002203, NM_00221 1 , NP_002202 (isoforma de integrina ß1 1A) para integrina a2 y ß1 de homo sapiens, véase también posteriormente.
Se conocen en la técnica variantes de corte y empalme alternativo, isoformas, así como secuencias de origen no humano (tal como roedor (ratón, rata, etc.), simio u otros) y representan posibles modalidades alternativas siempre que muestren al menos una de las funciones conocidas de la integrina a2 o ß1.
La subunidad a2 es un miembro de un subconjunto de subunidades de integrina a que contienen un dominio de aproximadamente 200 aminoácidos localizado cerca del extremo amino terminal denominado con frecuencia el dominio I (o insertado). Muchos dominios I, incluyendo el dominio I de la subunidad de integrina y a2 contienen un sitio de unión a cationes adicional, el motivo de sitio de adhesión dependiente de iones metálicos (MIDAS). La caracterización estructural del dominio I de integrina a2 está publicado, por ejemplo, en Dickeson et al., J. Biol. Chemistry, 272, 7661-7668 (1997). Los dominios I son determinantes importantes en la unión del ligando. La secuencia de aminoácidos de un dominio I de integrina ct2 humana puede obtenerse de la Figura 9 a, como está marcado en la secuencia de integrina a2 (SEC ID 20).
La integrina a2ß1 (antígeno muy tardío 2; VLA-2) se expresa en una diversidad de tipos celulares incluyendo plaquetas, células endoteliales vasculares, células epiteliales, monocitos/macrófagos activados, fibroblastos, leucocitos, linfocitos, neutrófilos activados y mastocitos. Los ligandos naturales para a2ß1 incluyen colágeno y laminina, ambos de los cuales se encuentran en la matriz extracelular. La integrina a2ß1 se ha implicado en varios procesos biológicos y patológicos incluyendo agregación plaquetaria inducida por colágeno, migración celular en colágeno, reorganización dependiente de célula de fibras de colágeno así como respuestas celulares dependientes de colágeno que dan como resultado aumentos de la expresión y proliferación de citocinas, aspectos de la función de neutrófilos, mastocitos y linfocitos T, aspectos de hipersensibilidad de tipo retardado, hipersensibilidad de contacto y artritis inducida por colágeno, morfogénesis ductal de glándula mamaria, curación de heridas epidérmica y procesos asociados con angiogénesis inducida por VEGF.
Las plaquetas circulan habitualmente en la sangre en un estado de reposo inactivo, sin embargo, se estimulan para responder rápidamente en sitios de lesión a una amplia diversidad de agonistas. Tras la estimulación, experimentan cambios de forma y se vuelven altamente reactivas con proteínas de plasma, tales como fibrinógeno y factor de von Willebrand (vWf), otras plaquetas y el revestimiento endotelial de la pared vascular. 5 Estas interacciones cooperan todas para facilitar la formación rápida de un tapón plaquetario de fibrina hemostático (Cramer, 2002 en Hemostasis and Thrombosis, 4a edición). Tras unirse a ligando, los receptores de plaquetas transducen rutas de señalización de fuera a dentro que, a su vez, desencadenan señalización de dentro a fuera que da como resultado la 10 activación de receptores secundarios tales como el receptor de fibrinógeno plaquetario, integrina ctllbp3, que conduce a agregación plaquetaria. Incluso la activación menor de plaquetas puede dar como resultado respuestas i trombóticas plaquetarias, trombocitopenia y complicaciones de hemorragia.
¡ La integrina a2 es la única integrina de unión a colágeno expresada 15 en plaquetas y se ha implicado que desempeña algún papel en la adhesión de plaquetas a colágeno y hemostasis (Santoro et al., Thromb Haemost 74: 813-821 (1995); Vanhoorelbeke et al., Curr Drug Targets Cardiovasc. Haematol Disord 3(2): 125-40 (2003); Sarratt et al., Blood 106 (4): 1268- 1277 (2005)). Por lo tanto, la inactivación de la función de integrina alfa 2 20 sería deseable para interferir de forma negativa con la agregación plaquetaria. Una inhibición de este tipo sería, por ejemplo, una inhibición alostérica que bloquee la integrina en el estado inactivo.
Las interacciones integrina/ligando pueden facilitar las extravasaciones de leucocitos en tejidos inflamados (Jackson et al., J. Med Chem 40: 3359-3368 (1997); Gadek et al., Science 295 (5557): 1086-9 (2002), Sircar et al. Bioorg. Med. Chem. 10: 2051-2066 (2002)), y desempeñan un papel en acontecimientos corriente abajo después de las extravasaciones iniciales de leucocitos de la circulación a tejidos en respuesta a estímulos inflamatorios, incluyendo migración, reclutamiento y activación de células proinflamatorias en el sitio de inflamación (Eble J. A., Curr Pharm Des. 11(7): 867-880 (2005)).
Se indicó que el bloqueo de integrina a2 muestra impacto en respuestas de hipersensibilidad retardada y eficacia en un modelo murino de artritis reumatoide y un modelo de enfermedad inflamatoria del intestino (Kriegelstein er a/., J. Clin Invest. 1 10 (12): 1773-82 (2002); de Fougerolles ef al., J. Clin Invest. 105:721-720 (2000)) y se indicó que atenuaban la proliferación y migración de células endoteliales in vitro (Senger et al., Am J Pathol 160(1): 195-204 (2002)), lo que sugiere que el bloqueo de integrina a2 podría prevenir/inhibir la angiogénesis anómala o mayor de lo normal, como se observa en diversos cánceres. Además, en un modelo de cirugía de cáncer colorrectal de rata se mostró que la inhibición de la integrina a2 era un antimetastásico eficaz (van der Bji et al., Hepatology 47 (2): 532-543 (2008)). El compromiso de linaje de células de cáncer colorrectal también podría alejarse del fenotipo maligno (Kirkland et al. J Biol Chem 283 (41): 27612-27619 (2008)). Se mostró que la integrina a2 mediaba el fenotipo maligno en cáncer pancreático (Grzesiak y Bouvet, Br J Cáncer 94: 131 1- 1319 (2006) validando esta diana para un enfoque terapéutico en este tipo de cáncer agresivo. Además, la integrina a2ß1 está interaccionando con glucoesfingolípidos en la progresión de cáncer prostático lo que sugiere que el bloqueo de esta interacción sería de uso terapéutico para este tipo de cáncer (van Slambrouck et al., Int J Onco 35: 693-699 (2009)). En encefalitis autoinmune experimental (EAE), un modelo murino de esclerosis múltiple (MS), la integrina a2 parece desempeñar un papel importante puesto que el tratamiento con un anticuerpo anti-a2, proporcionado inmediatamente después de la aparición de la enfermedad, suprimió señales clínicas e inflamación del SNC (Tsunoda et al. Brain Pathol 17: 45-55 (2007)). El mecanismo de esta acción terapéuticamente beneficiosa del anticuerpo anti-a2 se debe más probablemente a la inhibición de la interacción de integrina a2ß1 con la proteína de complemento C1q. Esta interacción es una primera etapa en desgranulación de mastocitos y activación de mastocitos, que está c. implicada en enfermedades autoinmunes e inflamatorias, como MS, lupus eritematoso sistémico, glomerulonefritis (McCall-Culbreath et al. Blood 1 1 1 (3562-3570) 2008).
Por lo tanto, la integrina a2 es una diana médica interesante. Puesto que las integrinas son dianas difíciles para el desarrollo de inhibidores específicos, y a la vista de los muchos indicios terapéuticos posibles diferentes, existe una necesidad de inhibidores alternativos que se unan a integrina ct2, especialmente inhibidores de integrina alfa 2 que muestren propiedades algo diferentes en comparación con inhibidores de integrina a2 existentes, que pueden usarse en el tratamiento de trastornos asociados con ¡ntegrina ot2.
De forma bastante sorprendente, los inventores de la presente invención fueron capaces de identificar un inhibidor tal de ¡ntegrina alfa 2. Para este fin, se ha generado un anticuerpo monoclonal contra ¡ntegrina a2 y se ha ensayado con respecto a sus características. Proporciona las características ventajosas como se describe en los ejemplos. Particularmente, el anticuerpo anti-integrina oc2 y fragmentos monovalentes o derivados del mismo se han caracterizado por un conjunto de datos experimentales que incluyen constantes de unión, reactividad cruzada, mapeo de dominio y datos funcionales in vitro.
Se ha descubierto que el anticuerpo monoclonal (mAb) se une al dominio I de ¡ntegrina a2 con afinidades nM, produciéndose la unión obviamente en un epítopo dentro del dominio I que es diferente del epítopo unido por un anticuerpo comparador del estado de la técnica que también se dirige al dominio I de ¡ntegrina alfa 2. Todas las moléculas obtenidas por ingeniería genética del anticuerpo de acuerdo con la presente invención (mAb lgG4, Fab) muestran tasas de asociación y disociación comparables en experimentos de Biacore. Presentan reactividad cruzada con ¡ntegrina a2ß1 de primate, mientras que no se ha detectado reactividad cruzada contra integrina a2ß1 de ratón, rata, perro, cobaya, cerdo o conejo según se ensayó con plaquetas de las especies relevantes.
Las moléculas ensayadas inhiben la interacción de integrina a2 recombinante con colágeno in vitro con valores de Cl50 nM bajos. Además de la inhibición del colágeno, el mAb anti-integrina a2ß1 o fragmentos Fab son capaces de inhibir la adhesión de plaquetas a colágeno tanto en plaquetas humanas aisladas como en plasma rico en plaquetas humanas en condiciones estáticas. También son capaces de inhibir la formación de trombos en flujo en una superficie recubierta de colágeno. La capacidad de bloquear la unión del colágeno y prevenir de este modo la adhesión de plaquetas a colágeno es una de las etapas más tempranas en la formación de trombos.
Finalmente, el mAb o Fab no provocaron activación de plaquetas puesto que no se observó aumento en la activación de GPlIbllla o expresión en superficie de selectina P en aproximadamente 30 donantes para el mAb. En consecuencia, la presente invención proporciona anticuerpos monovalentes, fragmentos de anticuerpo o derivados y sus usos para preparar agentes de investigación, diagnóstico y terapéuticos para el tratamiento de trastornos relacionados con integrina a2 como se enumera posteriormente; los ejemplos específicos incluyen trombosis, otras enfermedades vasculares, cáncer y consecuencias patológicas de neo-angiogénesis, enfermedades auto-inflamatorias tales como esclerosis múltiple.
Como se conoce por el experto en la materia, las características de unión de anticuerpos están mediadas por los dominios variables. Para unión a un antígeno, un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable que actúa conjuntamente de la cadena ligera están habitualmente presentes en anticuerpos y se disponen en orden para permitir la acción conjunta. El dominio variable también se denomina la región FV. Más específicamente, bucles variables, tres en cada uno de la cadena ligera (VL) y pesada (VH), son responsables de unión al antígeno. Estos bucles se denominan las regiones determinantes de complementariedad (CDR), LCDR1 , LCDR2 y LCDR3 para la VL y HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 para VH. Se conoce en la técnica una diversidad de disposiciones diferentes de dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de acción conjunta de la cadena ligera. Por lo tanto, fue importante identificar uno o más dominios variables adecuados de la cadena pesada y uno o más dominios variables de acción conjunta de la cadena ligera. Por alineamiento de secuencia, las CDR de las cadenas pesadas y ligeras se han identificado para el anticuerpo de integrina a2 especificado anteriormente.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y otras moléculas de unión a integrina a2 para su uso en tratamiento, profilaxis o diagnóstico, a uno o más ácidos nucleicos que codifican la molécula de unión, una célula recombinante que produce la molécula de unión, un método para la producción de la molécula de unión, a una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión o el ácido o ácidos nucleicos para su uso como un medicamento, a un método para la detección de integrina a2 y a un método de cribado.
Para este fin, se ha generado un anticuerpo monoclonal frente a la integrina a2 y se han ensayado sus características. Este proporciona las características ventajosas que se describen en los ejemplos. En particular, el anticuerpo anti-integrina a2 y los fragmentos monovalentes o derivados del mismo se caracterizan por un conjunto de datos experimentales que incluyen constantes de unión, reactividad cruzada, mapa de dominio y datos funcionales in vitro.
Se ha descubierto que el anticuerpo monoclonal (mAb) se une al dominio I de la integrina a2 con una afinidad de orden nM, en el que la unión se produce obviamente en un epítopo dentro del dominio I que es diferente al építopo al que se une un anticuerpo de comparación del estado de la técnica que también se dirige al dominio I de la integrina alfa 2. Todas las moléculas modificadas por ingeniería del anticuerpo de acuerdo con la presente invención (mAb lgG4, Fab) muestran velocidades de asociación y de disociación comparables en experimentos de Biacore. Muestran reactividad cruzada con la integrina a2ß1 de primate, mientras que no se ha detectado reactividad cruzada frente a la integrina a2ß1 de ratón, rata, perro, cobaya, cerdo o conejo, según se ha ensayado con plaquetas de las especies pertinentes.
Las moléculas ensayadas inhiben la interacción de la integrina a2 recombinante con el colágeno ¡n vitro con valores de CI50 de orden nM bajo.
Además de la inhibición del colágeno, el mAB o los fragmentos Fab anti-integrina a2ß1 son capaces de inhibir la adhesión de plaquetas al colágeno tanto en plaquetas humanas aisladas como en plasma humano rico en plaquetas en condiciones estáticas. También son capaces de inhibir la formación de trombos bajo flujo en una superficie revestida de colágeno. La capacidad de bloquear la unión al colágeno y por lo tanto prevenir la adhesión de plaquetas al colágeno es una de las primeras etapas en la formación de trombos.
Finalmente, el mAb o los fragmentos Fab no causaron la activación de las plaquetas ya que no se observó aumento en la activación de GPlIbllla o en la expresión superficial de selectina P en ~30 donantes para el mAb. Por lo tanto, la presente invención proporciona anticuerpos monovalentes, fragmentos o derivados del anticuerpo y sus usos para manufacturar agentes terapéuticos, de investigación, y de diagnóstico para el tratamiento de los trastornos relacionados con la integrina a2 que se enumeran posteriormente; los ejemplos específicos incluyen trombosis, otras enfermedades vasculares, cáncer y consecuencias patológicas de neo-angiogénesis, y enfermedades autoinflamatorias tales como esclerosis múltiple.
Como conoce el experto en la materia, las características de unión de los anticuerpos están mediadas por los dominios variables. Para unirse a un antígeno, en los anticuerpos están habitualmente presentes un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable coactuante de la cadena ligera y se disponen para permitir la coactuación. El dominio variable también se denomina región FV. De forma más específica, los bucles variables, tres de cada uno de ellos en la cadena ligera (VL) y en la pesada (VH), son los responsables de la unión al antígeno. Estos bucles se denominan Regiones Determinantes de Complementariedad (CDRs), LCDR1 , LCDR2 y LCDR3 para VL y HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 para VH. Se conocen en la técnica una diversidad de disposiciones diferentes del dominio variable de la cadena pesada y del dominio variable coactuante de la cadena ligera. Por lo tanto, fue importante identificar uno o más dominios variables adecuados de la cadena pesada y uno o más dominios variables coactuantes de la cadena ligera. Las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDRs) de las cadenas pesada y ligera para el anticuerpo frente a la ¡ntegrina al especificado anteriormente se han identificado por alineamiento de secuencia.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido o complejo peptídico, preferentemente un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que dicho péptido o complejo peptídico, anticuerpo o fragmento se une específicamente al dominio I de la ¡ntegrina a2 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento un dominio de región variable de la cadena pesada (VH) y un dominio de región variable de la cadena ligera (VL), en el que dicho anticuerpo o fragmento presenta reactividad cruzada con ¡ntegrina al no humana de primate pero no presenta reactividad cruzada la ¡ntegrina a2 que no sea de primate.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un péptido o complejo peptídico, preferentemente un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que dicho péptido o complejo peptídico, anticuerpo o fragmento se une específicamente al dominio I de la integrina a2 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento un dominio de región variable de la cadena pesada (VH) y un dominio de región variable de la cadena ligera (VL), en el que dicho anticuerpo o fragmento compite con un anticuerpo de referencia por la unión con el epítopo del anticuerpo de referencia, comprendiendo dicho anticuerpo de referencia una cadena ligera codificada por el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de adhesión DSM 23944 y la cadena pesada codificada por (i) el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de adhesión DSM 23946 o bien (ii) el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de adhesión DSM 23945.
En un tercer aspecto la presente invención se refiere a un péptido o complejo peptídico que comprende uno o más de los siguientes componentes a) a f): (a) LCDR1 , en el que LDR1 es RASESVESYGNSFIY (SEC ID N° 6) o una variante funcionalmente activa de la misma, (b) LCDR2, en el que LDR2 es LASNLAS (SEC ID N° 7) o una variante funcionalmente activa de la misma, (c) LCDR3, en el que LDR3 es QQNNEDPYT (SEC ID N° 8) o una variante funcional activa de la misma, (d) HCDR1, en el que HDR1 es (G YTFTSYWM N , SEC ID N° 3) o una variante funcionalmente activa de la misma, (e) HCDR2, en el que HDR2 es RIDPSDSETHYNQKFK (SEC ID N° 4) o una variante funcionalmente activa de la misma, y (f) HCDR3, en el que HDR3 es VGRGYFDY (SEC ID N° 5) o una variante funcional activa de la misma, y en el que el uno o más de los componentes a) a f) se disponen para permitir la unión del péptido o complejo peptídico a la integrina a2. En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al péptido o complejo peptídico anterior para su uso en el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con la integrina a2.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a uno o más ácidos nucleicos que codifican el péptido o complejo peptídico de la presente invención.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere a una célula que expresa de forma heterologa uno de los ácidos nucleicos de la presente invención.
En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de un péptido o complejo peptídico de la presente invención que comprende el cultivo de la célula de acuerdo con la presente invención en condiciones que permitan la expresión del péptido o complejo peptídico y opcionalmente la recuperación del péptido o complejo peptídico de la célula anfitriona.
En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido o complejo peptídico de la presente invención y/o al menos un ácido nucleico de la presente invención para su uso como un medicamento.
En un noveno aspecto, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de una enfermedad asociada con integrina a2 alterada, comprendiendo el método: a) poner en contacto una muestra que comprende integrina a2 con el péptido o complejo peptídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y b) detectar la unión de la integrina a2 al péptido o complejo peptídico; y c) comparar la unión de la etapa b) con una referencia, en el que una unión de integrina a2 alterada en la muestra con respecto a la referencia es indicativa de la enfermedad.
En un décimo aspecto, la presente invención se refiere a un artículo de manufactura que comprende: a) un material de envasado, b) un péptido o complejo peptídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, c) una etiqueta o un prospecto, estando contenido el prospecto dentro de dicho material de envasado, que indica que dicho péptido o complejo peptídico es eficaz para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, especialmente para una enfermedad o trastorno relacionado con la integrina a2.
En un undécimo aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con la integrina a2 que comprende un péptido o complejo peptídico de la presente invención y un envasado adecuado, y posiblemente instrucciones adecuadas para el uso de dicho péptido o complejo peptídico en la detección de la integrina a2.
En un duodécimo aspecto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con la integrina a2 que usa uno o más péptidos o complejos de péptidos de la presente invención y/o uno o más ácidos nucleicos de la presente invención o una de las composiciones farmacéuticas de la presente invención.
En un decimotercer aspecto, la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de una enfermedad asociada con integrina a2 alterada, comprendiendo el método: a) poner en contacto una muestra tomada de un individuo con el péptido o complejo peptídico de la presente invención; y b) detectar la unión de integrina a2 al péptido o complejo peptídico; y c) comparar la unión de la etapa b) con la unión de integrina a2 al péptido o complejo peptídico en una o más muestras de referencia, en el que una unión alterada en la muestra tomada con respecto a la unión detectada en las una o más muestras de referencia es indicativa de la enfermedad.
En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en las que dicho anticuerpo o fragmento se une específicamente al dominio I de la integrina a2 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento un dominio de región variable de la cadena pesada (VH) y un dominio de región variable de la cadena ligera (VL), en las que dicho anticuerpo o fragmento presenta reactividad cruzada con integrina a2 no humana de primate pero no presenta reactividad cruzada con integrina a2 que no sea de primate.
En otras modalidades, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en las que dicho anticuerpo o fragmento se une específicamente al dominio I de la integrina a2 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento un dominio de región variable de la cadena pesada (VH) y un dominio de región variable de la cadena ligera (VL), en las que dicho anticuerpo o fragmento compite con un anticuerpo de referencia por la unión al epítopo del anticuerpo de referencia, comprendiendo dicho anticuerpo de referencia una cadena ligera codificada por el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de acceso DSM 23944 y una cadena pesada codificada por (i) el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de acceso DSM 23946 o bien (ii) el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de acceso DSM 23945.
En una modalidad, dicho anticuerpo o fragmento se une específicamente al dominio I de la integrina a2 humana con una afinidad de unión de orden nM. En otra modalidad, dicho anticuerpo o fragmento inhibe la interacción de la integrina a2 humana con el colágeno in vitro, inhibiendo de ese modo la activación de las plaquetas debida a la adhesión de dichas plaquetas a dicho colágeno.
En una modalidad, dicho dominio de región variable de la cadena pesada comprende la cadena pesada HCDR3 de SEC ID N° 5. En otra modalidad, dicho dominio de región variable de la cadena pesada comprende las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDRs) de la cadena pesada de SEC ID N° 3 (HCDR1), SEC ID N° 4 (HCDR2), y SEC ID N° 5 (HCDR3), o variantes funcionalmente activas de las mismas. En una modalidad, la variante funcionalmente activa de HCDR2 comprende la mutación Asp-»Glu en el aminoácido en la posición 6.
En una modalidad, el dominio de región variable de la cadena ligera comprende la cadena ligera LCDR3 de SEC ID N° 8. En otra modalidad, el dominio de región variable de la cadena ligera comprende las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDRs) de la cadena ligera de SEC ID N° 6 (LCDR1), SEC ID N° 7 (LCDR2), y SEC ID N° 8 (LCDR3), o variantes funcionalmente activas de las mismas. En una modalidad, la variante funcionalmente activa de LCDR1 comprende la mutación Asn-»Gln en el aminoácido en la posición 11.
En una modalidad, el dominio de región variable de la cadena pesada (VH) tiene al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de VH de SEC ID N° 2. En otra modalidad, dicho dominio de región variable de la cadena pesada (VH) comprende la secuencia de SEC ID N° 2 o una vanante funcionalmente activa de la misma.
En una modalidad, el dominio de región variable de la cadena ligera (VL) tiene al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de VL de SEC ID N° 1. En otra modalidad, dicho dominio de región variable de la cadena ligera (VL) comprende la secuencia de SEC ID N° 1 o una variante funcionalmente activa de la misma.
En una modalidad, el dominio de región variable de la cadena pesada (VH) comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones seleccionadas entre el grupo que consiste en H5, H7, H11 , H12, H17, H20, H38, H40, H43, H55, H61 , H65, H66, H67, H76, H81 , H82, H87, H91 , H93, H112, H113 y H116. En una modalidad, las una o más sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre el grupo que consiste en 5H¡s?Val, 7Pro?Ser, 11 Leu?Val, 12Val?Lys, 17Pro?Ser, 20Leu?Val, 38Lys?Arg, 40Arg- Ala, 43Arg?Gln, 55Asp- Glu, 61Asn?Ala, 65Lys?Gln, 66Asp?Gly, 67Lys?Arg, 76Ser?Thr, 81 lle?Met, 82Gln?Glu, 87Thr- Arg, 91Ser?Thr, 93Val?Lys, 112Thr?Leu, 113Leu?Val y 116Ser?Val.
En una modalidad, el dominio de región variable de la cadena ligera (VL) comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones seleccionadas entre el grupo que consiste en L9, L12, L15, L22, L34, L46, L47, L80, L83, L85, L87, y L89. En una modalidad, las una o más sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre el grupo que consiste en 9Ala?Ser, 12Ala?Ser, 15Leu- Val, 15Leu?Pro, 22Ser?Thr, 34Asn?Gln, 46Gln?Lys, 47Ala->Pro, 80Asp?-Asn, 83Glu?Gln, 85Asp?Glu, 87Ala?Thr y 89Thr?Asn.
En una modalidad, el dominio de región variable de la cadena pesada (VH) tiene al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de VH seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 38 (HC1), SEC ID N° 39 (HC2), SEC ID N° 40 (HC3), SEC ID N° 41 (HC4), SEC ID N° 42 (HC5), SEC ID N° 43 (HC6), y SEC ID N° 44 (HC7). En otra modalidad, el dominio de región variable de la cadena pesada (VH) comprende una secuencia de VH seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 38 (HC1), SEC ID N° 39 (HC2), SEC ID N° 40 (HC3), SEC ID N° 41 (HC4), SEC ID N° 42 (HC5), SEC ID N° 43 (HC6), y SEC ID N° 44 (HC7).
En una modalidad, el dominio de región variable de la cadena ligera (VL) tiene al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de VL seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 33 (LC1), SEC ID N° 34 (LC2), SEC ID N° 35 (LC3), SEC ID N° 36 (LC4), y SEC ID N° 37 (LC5). En otra modalidad, el dominio de región variable de la cadena ligera (VL) comprende una secuencia de VL seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 33 (LC1), SEC ID N° 34 (LC2), SEC ID N° 35 (LC3), SEC ID N° 36 (LC4), y SEC ID N° 37 (LC5).
En una modalidad, el anticuerpo o la porción de unión es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. En otra modalidad, la porción de unión a antígeno se selecciona entre el grupo que consiste en un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv unido por puente disulfuro, un scFv, y un (scFv)2. En otra modalidad, el anticuerpo o porción de unión se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo específico doble, un anticuerpo de isotipo, un anticuerpo de dominio variable doble y un anticuerpo biespecífico. En otra modalidad, el anticuerpo o la porción de unión comprende un dominio constante de inmunoglobulina de la cadena pesada seleccionado entre el grupo que consiste en: un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgGI humana, un dominio constante de lgG2 humana, un dominio constante de lgG3 humana, un dominio constante de lgG4 humana, un dominio constante de IgE humana, y un dominio constante de IgA humana. En una modalidad, el anticuerpo o porción de unión comprende un dominio constante de lgG4 humana.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o de la porción de unión a antígeno de la presente invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico. En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula anfitriona que comprende el vector de expresión recombinante. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la producción del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno que comprende el cultivo de la célula anfitriona en condiciones tales que la célula anfitriona produzca un anticuerpo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o la parte de unión a antígeno y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento, prevención o diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con la ¡ntegrina a2, comprendiendo dicho método la administración de la composición farmacéutica a un sujeto con necesidad de la misma. En una modalidad, la enfermedad o el trastorno relacionado con la ¡ntegrina a2 se selecciona entre el grupo que consiste en trombosis, una enfermedad vascular, cáncer, incluyendo neo-angiogénesis y metástasis, inflamación, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune y una enfermedad caracterizada por una angiogénesis anormal o aumentada, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reacciones a transplantes, neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, encefalomielitis autoinmune experimental, síndrome de Sjorgen, esclerodermia, enfermedad cardiovascular, psoriasis, e infecciones que provocan una respuesta inflamatoria. En otra modalidad, la enfermedad o el trastorno relacionado con la integrina ct2 se selecciona entre el grupo que consiste en síndrome coronario agudo, intervención coronaria percutánea, apoplejía isquémica, estenosis de la arteria carótida o enfermedad oclusiva arterial periférica.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Antes de que se describa la presente invención en detalle posteriormente, debe entenderse que la presente invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente memoria puesto que éstos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente memoria es para el fin de describir modalidades particulares solamente y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que se limitaría solamente por las reivindicaciones adjuntas. A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen los mismos significados que se entienden habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.
Preferentemente, los términos usados en la presente memoria se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kólbl, H. eds. (1995), Helvética Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza).
A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones que la siguen, a no ser que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprender" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un número entero indicado o la etapa o grupo de números enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de etapa o número entero.
Varios documentos (por ejemplo: patentes, solicitudes de patente, publicaciones científicas, memorias descriptivas del fabricante, instrucciones, entregas de secuencia con número de acceso de GenBank, etc) se citan a lo largo del texto de la presente memoria descriptiva. Nada en la presente memoria debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a antedatar dicha descripción en virtud de invención previa. Algunos de los documentos citados en la presente memoria se caracterizan por estar "incorporados por referencia". En el caso de un conflicto entre las definiciones o enseñanzas de tales referencias incorporadas y las definiciones o enseñanzas indicadas en la presente memoria descriptiva, el texto de la presente memoria descriptiva tiene precedencia.
Secuencias: todas las secuencias a las que se hace referencia en la presente memoria se describen en el listado de secuencias adjunto que, con su contenido y descripción completa, es una parte de la presente memoria descriptiva.
El término "aproximadamente" cuando se usa en relación con un valor numérico pretende abarcar valores numéricos dentro de un intervalo que tiene un límite inferior que es 5 % más pequeño que el valor numérico indicado y que tienen un límite superior que es 5 % mayor que el valor numérico indicado.
La expresión "integrina alfa 2" o "integrina a2" como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a integrina alfa 2 como se conoce en la técnica, preferentemente integrina alfa 2 humana y especialmente integrina alfa 2 humana que tiene la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEC ID N° 21 y la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° 20 o un fragmento biológicamente activo de las mismas. La expresión "dominio I" se refiere a la parte de integrina alfa 2 como está subrayada y en negrita en SEC ID N° 20.
Las expresiones "se une específicamente", "que se une específicamente" o similares, significan que el péptido o complejo peptídico, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica puede caracterizarse por una constante de disociación en equilibrio de al menos aproximadamente 1x10"6 M o menos (por ejemplo, una KD menor indica una unión más estrecha). Se conocen bien en la técnica métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente e incluyen, por ejemplo, diálisis de equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a integrina alfa 2 puede, sin embargo, mostrar reactividad cruzada con otros antígenos tales como moléculas de integrina alfa 2 de otras especies. Además, los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) que se unen a integrina alfa 2 y uno o más antígenos adicionales se consideran no obstante anticuerpos que "se unen específicamente" a integrina alfa 2, como se usa en la presente memoria.
El término "KD", como se usa en la presente memoria, pretende referirse a la constante de disociación en equilibrio de un péptido/complejo peptídico particular, molécula diana o interacción anticuerpo-antígeno. La constante de disociación en equilibrio se mide típicamente en "mol/I" (abreviado como "M").
Por la expresión "tasa de disociación lenta", "Koff' o "kd" se entiende un péptido/complejo peptídico o anticuerpo que se disocia de integrina alfa 2 con una constante de velocidad de 1 x 1fJ3 s"1 o menos, preferentemente 1 x 10"4 s" o menos, según se determina por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™.
La expresión anticuerpo de "alta afinidad" se refiere a los mAb que tienen una afinidad de unión a integrina alfa 2 humana de al menos 10~10 M, preferentemente 10"11 M, incluso más preferentemente 10"12 M, según se mide por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™ o ELISA de afinidad de solución.
La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en la presente memoria, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biosensora, por ejemplo usando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.).
Un "epítopo", también conocido como determinante antigénico, es la región de un antígeno que se reconoce por el sistema inmune, específicamente por anticuerpos, linfocitos B o linfocitos T. Como se usa en la presente memoria, un "epítopo" es la parte de un antígeno capaz de unirse a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en la presente memoria. En este contexto, el término "unión" preferentemente se refiere a una "unión específica", como se define en la presente memoria. Los epítopos habitualmente consisten en agrupaciones químicamente tensioactivas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales pueden distinguirse en tanto que la unión al primero pero no al segundo se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.
Un "parátopo" es la parte de un anticuerpo que se une específicamente al epítopo.
El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, pretende referirse a moléculas de ¡nmunoglobulina comprendidas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) inter-conectadas por enlaces disulfuro. El término "anticuerpo" también incluye todas las formas recombinantes de anticuerpos, en particular de los anticuerpos descritos en la presente memoria, por ejemplo, anticuerpos expresados en procariotas, anticuerpos no glucosilados y cualquier fragmento de anticuerpo de unión a antígeno y derivados como se describen posteriormente. Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada ("HCVR" o "VH") y una región constante de cadena pesada (comprendida por dominios CH1 , CH2 y CH3). Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de cadena ligera ("LCVR" o "VL") y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones flanqueantes (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas de extremo amino terminal a carboxi terminal en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la ¡nmunoglobulina a factores o tejidos hospedadores, incluyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema de complemento clásico.
Con respecto a la presente invención, las expresiones anticuerpo alfa2, anticuerpos a2, anticuerpo a2, anticuerpo de integrina alfa 2, anticuerpo de integrina a2, anticuerpo de integrina o 2 se usan de forma sinónima y se refieren preferentemente a un inhibidor, es decir, anticuerpo anti alfa 2, anticuerpo anti a2, anticuerpo anti a2, anticuerpos anti integrina alfa 2, anticuerpos anti integrina a2, anticuerpo anti integrina a2.
La sustitución de uno o más restos de CDR u omisión de una o más CDR también es posible. Se han descrito anticuerpos en la bibliografía científica en los que puede prescindirse de una o dos CDR para la unión. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9: 133^139) analizaron las regiones de contacto entre anticuerpos y sus antígenos, basándose en estructuras cristalinas publicadas y concluyeron que solamente aproximadamente de un quinto a un tercio de los restos de CDR entran en contacto de hecho con el antígeno. Padlan también descubrió muchos anticuerpos en los que una o dos CDR no tenía aminoácidos en contacto con un antígeno (véase también, Vajdos et al. 2002 J. Mol Biol. 320: 415-428).
Los restos de CDR que no entran en contacto con el antígeno pueden identificarse basándose en estudios previos (por ejemplo los restos H60-H65 en CDRH2 con frecuencia no se requieren), de regiones de CDR de Kabat que quedan fuera de CDR de Chothia, por formación de modelos moleculares y/o de forma empírica. Si una CDR, o resto o restos de la misma, se omite, habitualmente se sustituye con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humano o un consenso de tales secuencias. Las posiciones para sustitución dentro de CDR y aminoácidos para sustituir también pueden seleccionarse empíricamente. Las sustituciones empíricas pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas.
La expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "parte de unión"), como se usa en la presente memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a integrina alfa 2. Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes consistentes en los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra, (iii) fragmentos Fd que consisten en los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten en los dominios VL y VH de una rama sencilla de un anticuerpo, (v) fragmentos dAb (Ward ef al., (1989). Nature 341 : 544-546), que consisten en un dominio VH; (vi) regiones determinantes de complementariedad (CDR) aisladas, y (vii) combinaciones de dos o más CDR aisladas que pueden unirse opcionalmente por un enlazador sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permita prepararse como una cadena proteica sencilla en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv), véase, por ejemplo, Bird et al (1988) Science 242: 423-426, y Huston ef a/ (1988) Proc Nati Acad Sci. USA 85: 5879-5883). Tales anticuerpos de cadena sencilla también pretenden abarcarse dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo. Un ejemplo adicional es una proteína de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión que comprende (i) un polipéptido de dominio de unión que se fusiona con un polipéptido de región bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región bisagra, y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada con la región constante CH2. El polipéptido de dominio de unión puede ser una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de dominio de unión se describen adicionalmente en los documentos US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se exploran con respecto a utilidad de la misma manera que anticuerpos intactos. Son ejemplos adicionales de "fragmentos de unión a antígeno" los denominados microanticuerpos, que se derivan de CDR sencillas. Por ejemplo, Heap et al. describen un microanticuerpo de 17 restos aminoacídicos derivado de la CDR3 de cadena pesada de un anticuerpo dirigido contra la glucoproteína de envoltura gp120 de VIH-1 (Heap CJ et al. (2005) J. Gen. Virol. 86: 1791-1800). Otros ejemplos incluyen miméticos de anticuerpos pequeños que comprenden dos o más regiones CDR que se fusionan entre sí, preferentemente por regiones flanqueantes afines. Un mimético de anticuerpo pequeño tal que comprende VH CDR1 y VL CDR3 ligadas por la VH FR2 afín se han descrito por Qiu eí al. (Qiu XQ, et al. (2007) Nature Biotechnology 25 (8): 921-929).
Por lo tanto, la expresión "anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo", como se usa en la presente memoria, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y partes ¡nmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno.
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos utilizables en la invención pueden ser de cualquier origen animal incluyendo aves y mamíferos. Preferentemente, los anticuerpos o fragmentos son de origen humano, de chimpancé, roedor (por ejemplo, ratón, rata, cobaya o conejo) pollo, pavo, cerdo, oveja, cabra, camello, vaca, caballo, burro, gato o perro. Se prefiere particularmente que los anticuerpos sean de origen humano o murino. Los anticuerpos de la invención también incluyen moléculas quiméricas en las que una región constante de anticuerpo derivado de una especie, preferentemente ser humano, se combina con el sitio de unión a antígeno derivado de otra especie, por ejemplo, ratón. Además, los anticuerpos de la invención incluyen moléculas humanizadas en las que los sitios de unión a antígeno de un anticuerpo derivado de una especie no humana (por ejemplo, de ratón) se combinan con regiones flanqueantes y constantes de origen humano.
Como se ejemplifica en la presente memoria, los anticuerpos de la invención pueden obtenerse directamente de hibridomas que expresan el anticuerpo o pueden clonarse y expresarse de forma recombinante en una célula hospedadora (por ejemplo, una célula CHO, o una célula linfocítica). Son ejemplos adicionales de células hospedadoras microorganismos, tales como E. coli y hongos, tales como levadura. Como alternativa, pueden producirse de forma recombinante en una planta o animal no humano transgénico.
La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a los anticuerpos en los que una parte de cada una de las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y ligeras es homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase particular, mientras que el segmento restante de la cadena es homólogo a las secuencias correspondientes en otra especie o clase. Típicamente la región variable de las cadenas tanto pesadas como ligeras imita las regiones variables de anticuerpos derivados de una especie de mamífero, mientras que las partes constantes son homologas a las secuencias de anticuerpos derivadas de otra. Una ventaja clara de tales formas quiméricas es que la región variable puede derivarse convenientemente de fuentes actualmente conocidas usando linfocitos B fácilmente disponibles o hibridomas de organismos hospedadores no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones celulares humanas. Mientras que la región variable tiene la ventaja de facilidad de preparación y la especificidad no se ve afectada pór la fuente, la región constante que es humana inducirá con menos probabilidad una respuesta inmune de un sujeto humano cuando los anticuerpos se inyectan que la región constante de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no está limitada a este ejemplo particular.
La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno que se derivada sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, basándose la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula en la estructura y/o la secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión a antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados en dominios constantes o solamente las regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas en regiones flanqueantes apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a antígeno pueden ser de tipo silvestre o modificados por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, modificados para asemejarse a inmunoglobulinas humanas de forma más cercana. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen uno o más CDR que se alteran con respecto al anticuerpo original.
Se conocen diferentes métodos para humanizar anticuerpos por el experto en la materia, como se revisa en Almagro y Fransson, el contenido de la cual se incorpora en la presente memoria por referencia en su totalidad (Almagro JC y Fransson J (2008) Frontiers in Bioscience 13: 1619-1633). Almagro y Fransson distinguen entre enfoques racionales y enfoques empíricos. Los enfoques racionales se caracterizan por generar pocas variantes del anticuerpo obtenido por ingeniería genética y evaluar su unión o cualquier otra propiedad de interés. Si las variantes diseñadas no producen los resultados esperados, se inicia un nuevo ciclo de diseño y evaluación de unión. Los enfoques racionales incluyen injerto de CDR, modificación de la superficie, superhumanización y optimización del contenido en serie humano. Por el contrario, los enfoques empíricos se basan en la generación de grandes bibliotecas de variantes humanizadas y selección de los mejores clones usando tecnologías de enriquecimiento o exploración de alto rendimiento. En consecuencia, los enfoques empíricos dependen de una selección fiable y/o sistema de exploración que es capaz de buscar a través de un vasto espacio de variantes de anticuerpo. Las tecnologías de presentación in vitro, tales como presentación de fagos y presentación de ribosomas cumplen estos requisitos y se conocen bien por el experto en la materia. Los enfoques empíricos incluyen bibliotecas de FR, selección guiada, redistribución de armazones e ingeniería humana.
La expresión "anticuerpo humano", como se usa en la presente memoria pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los mAb humanos de la invención pueden incluir restos aminoacídicos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, no se pretende que la expresión "anticuerpo humano", como se usa en la presente memoria, incluya mAb en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal u otra especie de mamífero (por ejemplo, ratón), se han injertado en secuencias FR humanas. Los anticuerpos humanos de la invención incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o de animales transgénicos para una o más ¡nmunoglobulinas humanas y que no expresan ¡nmunoglobulinas endógenas, como se ha descrito por ejemplo en la Patente de Estados Unidos N° 5.939.598 de Kucherlapati y Jakobovits.
La expresión "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente memoria se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular sencilla. Un anticuerpo monoclonal presenta una especificidad y afinidad de unión sencilla por un epítopo particular. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales se producen por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal no humano, por ejemplo, ratón, fusionado con una célula inmortalizada.
La expresión "anticuerpo recombinante", como se usa en la presente memoria, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o j 5 aislan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un i animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma preparado a partir de los mismos, (b) anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo de un transfectoma, 10 (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatoria i recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina a otras secuencias de ADN.
El término "transfectoma", como se usa en la presente memoria, 15 incluye células hospedadoras eucarióticas recombinantes que expresan un anticuerpo, tales como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetales u hongos, incluyendo células de levadura.
Como se usa en la presente memoria, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con un organismo transgénico que produce dicho 20 anticuerpo. Esta expresión se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico codificante correspondiente a la hallada en un organismo que no consiste en el organismo transgénico y derivada generalmente de una especie distinta del organismo transgénico.
Como se usa en la presente memoria, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene cadenas ligeras y pesadas de diferentes orígenes de organismo. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera murina es un anticuerpo ! 5 heterohíbrido.
! Por lo tanto, los "anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos", adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación, anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, recombinantes, 10 heterólogos, heterohíbridos, quiméricos, humanizados (en particular injertados con CDR), desinmunizados o humanos, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, Fd, Fv, Fv enlazados por disulfuro (dsFv), anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, scFv), diacuerpos o 15 tetracuerpos (Holliger P. et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(14), 6444-6448), nanocuerpos (también conocidos como anticuerpos de dominio sencillo), anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-ld para anticuerpos de la invención) y fragmentos de unión I a epítopo de cualquiera de los anteriores. 20 Los anticuerpos descritos en la presente memoria están preferentemente aislados. Se pretende que un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente memoria, se refiera a un anticuerpo que está sustancialmente sin otros mAb que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a integrina alfa 2 está sustancialmente sin mAb que se unen específicamente a antígenos distintos de integrina alfa). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a integrina alfa 2 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de integrina alfa 2 de otra especie.
Las expresiones "función biológica o función de integrina alfa 2" como se usan en la presente memoria, se usan de forma sinónima y se refieren a cualquier función de integrina alfa 2 tal como, pero sin limitación: unión a y formación de un complejo con integrina beta 1, unión a cualquiera de los ligandos conocidos tal como unión a colágeno, laminina, agregación plaquetaria inducida por colágeno, inducción de respuestas trombóticas, trombocitopenia, migración celular en colágeno, reorganización dependiente de células de fibras de colágeno, respuestas celulares dependientes de colágeno resultantes en aumentos en la expresión y proliferación de citocinas, aspectos dependientes de colágeno o integrina alfa 2 de la función de linfocitos T, mastocitos o neutrófilos, aspectos dependientes de colágeno o integrina alfa 2 de hipersensibilidad de tipo retardado, aspectos dependientes de colágeno o integrina alfa 2 de hipersensibilidad de contacto, artritis inducida por colágeno, morfogénesis ductal de glándula mamaria, curación de heridas epidérmicas y procesos asociados con angiogénesis inducida por VEGF.
Como se usa en la presente memoria, un "antagonista de integrina alfa 2" indica un compuesto que inhibe al menos una actividad biológica de integrina alfa 2, preferentemente una actividad de integrina alfa 2 presente en plaquetas sanguíneas, células endoteliales vasculares, células epiteliales, monocitos/macrófagos activados, fibroblastos, leucocitos, linfocitos, neutrófilos activados y/o mastocitos especialmente cuando se usan en cantidades estequiométricas. Los antagonistas de alfa 2 preferidos de la presente invención son anticuerpos neutralizadores.
Se pretende que un "anticuerpo neutralizador", como se usa en la presente memoria (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad de integrina alfa 2"), se refiera a un anticuerpo cuya unión a integrina alfa 2 da como resultado la inhibición de al menos una actividad biológica de integrina alfa 2, preferentemente inhibición de la actividad activadora de plaquetas de integrina alfa 2. Esta inhibición de la actividad biológica de integrina alfa 2 puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de actividad biológica de integrina alfa 2 por uno o más de varios ensayos convencionales in vitro o ¡n vivo conocidos en la técnica. Los ejemplos de tales ensayos se describen por ejemplo en los ejemplos de la presente invención.
Puesto que la integrina alfa 2 tiene funciones tales como las enumeradas anteriormente, la actividad de la integrina alfa 2 tiene un efecto en varias enfermedades tales como las asociadas con actividad plaquetaria aumentada. En consecuencia, los antagonistas de integrina alfa 2, tales como péptidos o complejos peptídicos inhibidores que se dirigen a integrina alfa 2 o anticuerpos neutralizadores anti-integrina alfa 2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, son útiles para reducir o inhibir los efectos de integrina alfa 2, tales como actividad plaquetaria. En consecuencia, los antagonistas de integrina alfa 2 son útiles para aliviar, mejorar, inhibir o prevenir varias de tales enfermedades, incluyendo sin limitación trombosis, una enfermedad vascular, cáncer, incluyendo neo-angiogénesis y metástasis, inflamación, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune y una enfermedad caracterizada por angiogénesis anómala o aumentada, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reacciones a trasplante, neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, encefalomielitis autoinmune experimental, síndrome de Sjorgen, esclerodermia, enfermedad cardiovascular, psoriasis e infecciones que inducen una respuesta inflamatoria.
En modalidades específicas, los anticuerpos anti-integrina alfa 2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en la presente memoria pueden conjugarse con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo.
Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que un resto aminoacídico se sustituye por otro resto aminoacídico que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieran entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje o grado de similitud puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Se conocen bien medios para realizar este ajuste por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales alifáticas-hidroxilo: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginína e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina.
Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 descrita en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un reemplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250. Dado el código genético conocido y técnicas de ADN sintético y recombinante, el científico experto puede construir fácilmente ADN que codifiquen variantes de aminoácidos conservativas.
Como se usan en la presente memoria, "sustituciones no conservativas" o "intercambios de aminoácidos no conservativos" se definen como intercambios de un aminoácido por otro aminoácido enumerado en un grupo diferente de los siete grupos de aminoácidos convencionales 1) a 7) mostrados anteriormente.
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea óptimamente con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de la secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente 90 %, y más preferentemente en al menos aproximadamente 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tales como FASTA, BLAST o GAP, como se analiza posteriormente.
Como se aplica a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean óptimamente, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de hueco por defecto, comparten al menos 90 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas.
La similitud de secuencia para polipéptidos se mide típicamente usando software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar homología de secuencia o identidad de secuencias entre polipéptidos cercanamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA con parámetros recomendados o por defecto; un programa en GCG versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos e identidad de secuencia porcentual de las regiones del mejor solapamiento entre la secuencia de búsqueda y de consulta (Pearson (2000) mencionado anteriormente). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, AltschuI et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 y (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria por referencia.
Cuando se hace referencia a porcentajes de identidad de secuencia en la presente solicitud, estos porcentajes se calculan en relación a la longitud completa de la secuencia más larga, si no se indica específicamente de otro modo. Este cálculo en relación a la longitud completa de la secuencia más larga se aplica tanto a secuencias de ácido nucleico como a secuencias polipeptídicas.
Como se usa en la presente memoria, "tratar", "tratando" o "tratamiento" de una enfermedad o trastorno significa conseguir uno o más de los siguientes: (a) reducir la gravedad y/o duración del trastorno; (b) limitar o prevenir el desarrollo de síntomas característicos del trastorno o trastornos a tratar; (c) inhibir el empeoramiento de síntomas característicos del trastorno o los trastornos a tratar; (d) limitar o prevenir la reaparición del trastorno o trastornos en pacientes que han tenido previamente el trastorno o trastornos; y (e) limitar o prevenir la reaparición de síntomas en pacientes que han sido previamente sintomáticos para el trastorno o trastornos.
Como se usa en la presente memoria, "prevenir", "previniendo", "prevención" o "profilaxis" de una enfermedad o trastorno significa prevenir que un trastorno suceda en el sujeto.
Como se usa en la presente memoria, las expresiones "es para administración" y "es para administrarse" tienen el mismo significado que "se prepara para administrarse". En otras palabras, la afirmación de que un compuesto activo "es para administración" debe entenderse en tanto que dicho compuesto activo se ha formulado y compuesto en dosis de modo que dicho compuesto activo está en un estado capaz de ejercer su actividad terapéutica.
Se pretende que las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad terapéutica" signifiquen la cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que inducirá la respuesta biológica o médica de un tejido, un sistema, animal o ser humano que se busca por un investigador, veterinario, doctor en medicina u otro especialista clínico. Se pretende que la expresión "cantidad profilácticamente eficaz" signifique la cantidad de un fármaco que prevendrá o reducirá el riesgo de aparición del acontecimiento médico o biológico que se busca prevenir en un tejido, un sistema, animal o ser humano por un investigador, veterinario, doctor en medicina u otro especialista clínico. Particularmente, la dosificación que recibe un paciente puede seleccionarse para conseguir la cantidad de péptido o complejo peptídico para mostrar suficiente inhibición de función de integrina alfa 2 para permitir la terapia profiláctica o curativa (prevención, mejora o curación) de una enfermedad o trastorno relacionado con integrina a2, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en trombosis, una enfermedad vascular, cáncer, incluyendo neoangiogénesis y metástasis, inflamación, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune y una enfermedad caracterizada por angiogénesis anómala o aumentada, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reacciones a trasplante, neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple, síndrome de Raynaud, encefalomielitis autoinmune experimental, síndrome de Sjorgen, esclerodermia, enfermedad cardiovascular, psoriasis e infecciones que inducen una respuesta inflamatoria.
Como se usa en la presente memoria, un "paciente" significa cualquier mamífero o ave que pueda beneficiarse de un tratamiento con los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en la presente memoria. Preferentemente, un "paciente" se selecciona del grupo que consiste en animales de laboratorio (por ejemplo, ratón o rata) animales domésticos (incluyendo por ejemplo, cobaya, conejo, pollo, pavo, cerdo, oveja, cabra, camello, vaca, caballo, burro, gato o perro) o primates incluyendo chimpancés y seres humanos. Se prefiere particularmente que el "paciente" sea un ser humano.
¡ "Farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerada en la Farmacopea de Estados Unidos (United States Pharmacopeia-33/National Formulary-28 Reissue, publicada por la United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville Md, fecha de publicación: abril de 2010) u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y más particularmente en seres humanos.
Las poblaciones específicas tratables por los métodos terapéuticos de la invención incluyen sujetos indicados para mutaciones activadoras de integrina alfa 2 (mutaciones de ganancia de función, "GOF"), sujetos con enfermedad o trastorno relacionado con integrina a2, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en trombosis, una enfermedad vascular, cáncer, incluyendo neoangiogénesis y metástasis, inflamación, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune y una enfermedad caracterizada por angiogénesis anómala o aumentada, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reacciones a trasplante, neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, encefalomielitis autoinmune experimental, síndrome de Sjorgen, esclerodermia, enfermedad cardiovascular, psoriasis e infecciones que inducen una respuesta inflamatoria.
Modalidades de la Invención La presente invención se describirá a continuación de forma adicional. En los siguientes pasajes se definen con más detalle diferentes aspectos de la presente invención. Cada aspecto así definido se puede combinar con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferente o ventajosa se puede combinar con cualquier otra característica o características indicada como preferente o ventajosa, a menos que se indique claramente lo contrario.
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un péptido o complejo peptídico, preferentemente un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que dicho péptido o complejo peptídico, anticuerpo o fragmento se une específicamente al dominio I de la integrina a2 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento un dominio de región variable de la cadena pesada (VH) y un dominio de régión variable de la cadena ligera (VL), en el que dicho anticuerpo o fragmento presenta reactividad cruzada con integrina a2 no humana de primate pero no presenta reactividad cruzada con integrina a2 que no sea de primate.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un péptido o complejo peptídico, preferentemente un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que dicho péptido o complejo peptídico, anticuerpo o fragmento se une específicamente al dominio I de la integrina a2 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento un dominio de región variable de la cadena pesada (VH) y un dominio de región variable de la cadena ligera (VL), en el que dicho I 5 anticuerpo o fragmento compite con un anticuerpo de referencia por la unión al epítopo del anticuerpo de referencia, comprendiendo dicho anticuerpo de referencia una cadena ligera codificada por el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de adhesión DSM 23944 y una cadena pesada codificada por (i) el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de j 10 adhesión DSM 23946 o bien (¡i) el plásmido que está depositado en la I ; DSMZ con el N° de adhesión DSM 23945.
¡ En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido o i ¡ complejo peptídico, en el que el péptido o complejo peptídico comprende i uno o más de los siguientes componentes a) a f): 15 LCDR1 , en el que LCDR1 es RASESVESYGNSFIY (SEC ID N° 6) o una variante funcionalmente activa de la misma, LCDR2, en el que LCDR2 es LAS LAS (SEC ID N° 7) o una variante funcionalmente activa de la misma, LCDR3, en el que LCDR3 es QQNNEDPYT (SEC ID N° 8) o una variante 20 funcional activa de la misma, HCDR1 , en el que HCDR1 es GYTFTSYWMN (SEC ID N° 3) o una variante funcionalmente activa de la misma, HCDR2, en el que HCDR2 es RIDPSDSETHYNQKFK (SEC ID N° 4) o una variante funcionalmente activa de la misma, y HCDR3, en el que HCDR3 es VGRGYFDY (SEC ID N° 5) o una variante funcional activa de la misma, y en el que el uno o más componentes a) a f) se disponen para permitir la unión del péptido o complejo peptídico a la integrina a2 o como integrina a2ß1 heterodimérica.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere al péptido o complejo peptídico anterior para su uso en el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con la integrina a2.
Las secuencias de SEC ID N° 6 a 8 son CDR de cadenas ligeras y las de SEC ID N° 3 a 5 son las CDR de cadenas pesadas del anticuerpo analizado (según se determina por análisis de secuencia). De acuerdo con la presente invención, el péptido o complejo peptídico, comprende una de las anteriores CDR de cadena ligera o una variante funcionalmente activa de las mismas y/o una de las CDR de cadena pesada o una variante funcionalmente activa de las mismas. Los ejemplos incluyen un péptido o complejo peptídico que comprende uno, dos o tres de las anteriores HCDRS y/o una, dos o tres de las anteriores LCDR en cualquiera de las combinaciones concebibles. Una modalidad de la presente invención es un péptido o complejo peptídico que comprende 3 LCDR y 3 HCDR, en el que al menos una de ellas es una de las anteriores CDR de a a f.
En el contexto de la presente invención, los términos LCDR y LDR se usan de forma sinónima. Lo mismo se aplica para los términos HCDR y HDR.
Si las anteriores CDR se disponen de una manera adecuada, la disposición permite la unión específica a integrina al. La disposición adecuada de CDR para permitir la unión de un antígeno se conoce en la técnica. Se ha desarrollado o identificado hasta el momento una diversidad de diferentes formatos de anticuerpo o formatos de parámetros de unión. Cualquiera de estas o cualquier otra disposición adecuada puede usarse para el polipéptido o complejo polipeptídico de la presente invención, siempre que el formato o disposición permita la unión específica a integrina a2.
Las secuencias CDR, como se han definido por las anteriores SEC ID N° o variantes de las mismas, pueden disponerse en una cadena (poli) peptídica o en un polipéptido o complejo peptídico. Si se disponen dentro de una cadena (poli) peptídica, las secuencias pueden conectarse por una o más secuencias enlazadoras, preferentemente un enlazador peptídico, por ejemplo, como una proteína de fusión. De acuerdo con una modalidad, pueden incluirse en un armazón o soporte de anticuerpo artificial o natural, como se conoce en la técnica. Para anticuerpos naturales, las CDR se soportan dentro de los dominios variables por regiones flanqueantes conservadas. El armazón puede modificarse para obtener anticuerpos artificiales, tales como Fab, anticuerpos de cadena sencilla, etc., que se describen posteriormente en más detalle.
Si se disponen las CDR en un complejo peptídico, se unen dos o más (poli) péptidos entre sí por enlaces no covalentes incluyendo enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrófobas.
Un péptido es un compuesto orgánico compuesto de 2 o más aminoácidos a dispuestos en una cadena lineal. Los aminoácidos se unen entre sí por enlaces peptídicos entre los grupos carboxilo y amino de restos aminoacídicos adyacentes. En general, el código genético especifica 20 aminoácidos convencionales. Después o incluso durante la síntesis, los restos en una proteína pueden modificarse químicamente por modificación post-traduccional, que altera las propiedades físicas y químicas, el plegamiento, estabilidad, actividad y, en última instancia, la función de las proteínas. Los péptidos de acuerdo con los diferentes aspectos de la presente invención pueden modificarse o no modificarse siempre que sean capaces de unirse a la ¡ntegrina a2.
En la técnica, el término "polipéptido" se refiere a una molécula que comprende aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30 o más aminoácidos acoplados entre sí por enlaces peptídicos de una manera lineal para formar una cadena polipeptídica. Moléculas más cortas de este tipo que comprenden al menos dos aminoácidos se denominan generalmente péptidos. El término "proteína" habitualmente se refiere a moléculas que comprenden una o más cadenas polipeptídicas. En el contexto de la presente invención, los términos péptido, polipéptido y proteína se usan de forma sinónima.
En el contexto de la presente invención, el término "péptido" o "polipéptido" de acuerdo con los diferentes aspectos de la presente invención se refiere a péptidos o polipéptidos como se ha definido anteriormente y la expresión "complejo peptídico" se refiere a complejos moleculares que comprenden uno o más péptidos y/o polipéptidos como se han definido anteriormente (por ejemplo los anticuerpos, fragmentos de unión a antígenos y otras moléculas de unión de la invención).
Los péptidos y complejos peptídicos de los mismos como se han definido en la presente memoria reconocen selectivamente y se unen específicamente a un antígeno de integrina a2. En el contexto de la presente invención, la expresión "unión específica a integrina a.2" se refiere a la capacidad del péptido o complejo peptídico de acuerdo con la invención de unirse específicamente a integrina oc2 o al dominio I de integrina a2 o a integrina a2 en el complejo con cualquier otro polipéptido tal como en el complejo heterodimérico con otra subunidad de integrina, por ejemplo, el complejo de integrina a2ß1. En una modalidad preferida, el péptidos o los complejos peptídicos de la presente invención comprenden o consisten en o es un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
El uso de los términos "selectivo" o "específico" en la presente memoria, cuando se usan para describir las características de unión del péptido o complejo peptídico de acuerdo con la invención, se refiere al hecho de que los péptidos o complejos peptídicos descritos no muestran unión significativa a otra integrina distinta de a2, excepto en los casos específicos en los que el péptido/complejo se complementa para conferir una especificidad adicional distinta de la parte de unión especifica a integrina al (como, por ejemplo, en moléculas biespecíficas o bifuncionales en las que la molécula se diseña para unirse o efectuar dos funciones, al menos una de las cuales es unirse específicamente a integrina al). En modalidades específicas, los péptidos específicos de integrina al o complejos de los mismos se unen a integrina al humana con una KD de al menos 1 ,2 x 1 CT6 En modalidades específicas, los péptidos específicos de integrina al o complejos de los mismos se unen a integrina al humana con una KD de 5 x 10"7 o más o de 2 x 7"10 o más, o de 1 x 10"7 o más. En modalidades adicionales, los péptidos específicos de integrina al o complejos de los mismos se unen a integrina al humana con una KD de 1 x 10~8 o más. En otras modalidades, los péptidos específicos de integrina al o complejos de los mismos se unen a integrina al humana con una KD de 5 x 10"9 o más o de 1 x 10"9 o más. En modalidades adicionales, los péptidos específicos de integrina al o complejos de los mismos se unen a integrina al humana con una KD de 2 x 10"10 o más. En modalidades específicas, los péptidos específicos de integrina al o complejos de los mismos no se unen a otras proteínas a las KD anteriores. En otras modalidades, los péptidos específicos de integrina al o complejos de los mismos se unen a una integrina al (por ejemplo, integrina al humana y/o de primate no humana) con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por un antígeno no específico.
KD se refiere a la constante de disociación obtenida de la relación de kd (la tasa de disociación de una interacción de proteína diana-molécula de unión particular; también denominada k0ff) y ka (la tasa de asociación de la interacción proteína diana-molécula de unión particular; también denominada kon), o kd/ka que se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD puede determinarse usando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar la KD de una molécula de unión se describe en el Ejemplo 1 D.
Se ha mostrado que los péptidos específicos de integrina oc2 o complejos de los mismos inhiben de forma dependiente de dosis la interacción ligando/integrina o÷2 (véase Figura 2 y Ejemplos). En consecuencia, los péptidos específicos de integrina a2 o complejos de los mismos pueden caracterizarse por su capacidad para contrarrestar la unión de colágeno a integrina a2. El alcance de la inhibición por cualquier péptido específico de integrina al o complejo del mismo puede medirse de forma cuantitativa en comparación estadística con un control o mediante cualquier método alternativo disponible en la técnica. En modalidades específicas, la inhibición es aproximadamente 10 % de inhibición o más. En otras modalidades, la inhibición es 20 % o más, 30 % o más, 40 % o más, 50 % o más, 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más o 95 % o más.
El péptido o complejo peptídico también puede comprender una variante funcionalmente activa de las secuencias anteriores. Una variante funcionalmente activa de los péptidos o complejos peptídicos de la invención se caracteriza porque tiene una actividad biológica similar a la presentada por el péptido completo, incluyendo la capacidad de unirse a ¡ntegrina al y opcionalmente inhibir integrina al. La variante es funcionalmente activa en el contexto de la presente invención, si la actividad (por ejemplo actividad de unión, expresada opcionalmente como KD) de la variante equivale a 10 % o más, 25 % o más, 50 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más o 99 % o más de la actividad del péptido/complejo sin alteración de secuencia. Se proporcionan métodos adecuados para determinar la actividad de unión a integrina al en los ejemplos. Puede obtenerse una variante funcionalmente activa por un número limitado de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.
En modalidades preferidas de la presente invención el péptido o complejo peptídico de la invención se caracteriza adicionalmente por una o más de las siguientes características: (i) uno, dos o tres componentes a) a c) están comprendidos en un dominio variable de una cadena ligera (VL) (ii) uno, dos o tres componentes d) a f) están comprendidos en un dominio variable de una cadena pesada (VH) (iii) el péptido o complejo peptídico es un anticuerpo (iv) el péptido o complejo peptídico es Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv con enlace disulfuro, un scFv, un (scFv)2, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo multiespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo o un minicuerpo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado (v) el péptido o complejo peptídico comprende un dominio constante de ¡nmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en: un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de lgG1 humana, un dominio constante de lgG2 humana, un dominio constante de lgG3 humana, un dominio constante de lgG4 humana, un dominio constante de IgE humana y un dominio constante de IgA humana (vi) la variante funcionalmente activa es un fragmento funcionalmente activo que consiste en 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, o 99 % o más de una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID N° 3 a 8; (vii) la variante funcionalmente activa es una variante funcionalmente activa que tiene 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más, 90 % o más, 95 % o más, o 99 % o más identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID N° 3 a 8, particularmente derivando la variante funcionalmente activa de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID N° 3 a 8 por una o más sustituciones de aminoácidos conservativas (viii) el péptido o complejo peptídico comprende la secuencia de aminoácidos de - SEC ID N° 1 o una variante funcionalmente activa de la misma, - SEC ID N° 2, o una variante funcionalmente activa de la misma, - SEC ID N° 9, o una variante funcionalmente activa de la misma, - SEC ID N° 10, o una variante funcionalmente activa de la misma, y/o - SEC ID N° 11, o una variante funcionalmente activa de la misma, (ix) el péptido o complejo peptídico consiste en la secuencia de aminoácidos de - SEC ID N° 9, o una variante funcionalmente activa de la misma, - SEC ID N° 10, o una variante funcionalmente activa de la misma, y - opcionalmente 50 o menos restos aminoacídicos adicionales, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 15, 1 a 10 ó 5, 4, 3, 2 o 1 resto aminoacídico adicional (x) el péptido o complejo peptídico consiste en la secuencia de aminoácidos de - SEC ID N° 9, o una variante funcionalmente activa de la misma, - SEC ID N° 11, o una variante funcionalmente activa de la misma, y - opcionalmente 50 o menos restos aminoacídicos adicionales, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 15, 1 a 10 ó 5, 4, 3, 2 o 1 resto aminoacídico adicional.
SEC ID N° 1 y 2 pueden obtenerse de la Figura N° 5: SEC ID N° 1 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable de anticuerpo de integrina a2. SEC ID N° 2 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable, respectivamente.
SEC ID N° 9, 10 y 11 pueden obtenerse de la Figura 7: SEC ID N° 9 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera quimérica del anticuerpo producido como un formato lgG4 (CDR subrayadas), SEC ID N° 10 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada quimérica del anticuerpo producido como un formato lgG4 (CDR subrayadas) y SEC ID N° 11 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada quimérica en formato Fab con un marcador 6xhis. Las regiones constantes derivaron de cadenas principales de secuencia humana (véase ejemplos). La invención también está relacionada con cualquiera de las construcciones de anticuerpo o fragmentos, péptido o complejos peptídicos sin el marcador his.
De acuerdo con una modalidad, los dominios variables de la HC y LC se acoplan a regiones constantes respectivas y forman construcciones de HC o LC quiméricas. Son modalidades específicas una región variable LC de anticuerpo de integrina a2 quimérico fusionada con la región constante de proteína IGKC (tal como por ejemplo en SEC ID N° 9), una región variable HC de anticuerpo de integrina a2 quimérico fusionada con la región constante de IGHG4 (tal como por ejemplo, en SEC ID N° 10) o una región variable HC de anticuerpo de integrina a2 quimérico fusionada con el dominio CH1 de región constante de IGHG1 (tal como por ejemplo en SEC ID N° 11).
Como se ha detallado anteriormente, los componentes a) a c) (LC CDR) y d) a f) (HC CDR) se obtuvieron por secuenciación del dominio variable de una cadena ligera (VL) y dominio variable de una cadena pesada (VH), respectivamente, del anticuerpo monoclonal producido y ensayado. En consecuencia, pueden comprenderse en el mismo. Puede ser cualquier armazón VH o VL de origen natural o un armazón VH o VL artificial. En una modalidad de la presente invención, una o más de las CDR (LCDR1 , LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 y HCDR3) se disponen en el armazón del dominio variable prevalente, es decir, LCDR1 , LCDR2 y LCDR3 en el armazón de VL y HCDR1 , HCDR2 y HCDR3 en el armazón de VH. Esto significa que las CDR, como se identifican por cualquier método adecuado descrito anteriormente (consúltese SEC ID N° 1 y 2) solas, juntas o en cualquier combinación de las mismas pueden retirarse del ambiente mostrado y transferirse al armazón de otro (segundo) dominio variable, sustituyendo de este modo las CDR del segundo dominio variable. Se conoce en la técnica una diversidad de dominios variables o secuencias de anticuerpo y pueden usarse para este fin. Por ejemplo, pueden obtenerse dominios variables, en los que se insertan CDR de interés, de cualquier línea germinal o dominio variable humano reordenado. Los dominios variables también pueden producirse de forma sintética. Las regiones CDR pueden introducirse en los dominios variables respectivos usando tecnología de ADN recombinante. Un medio por el que se consigue esto se describe en Marks ef al., 1992, Bio/Technology 10: 779-783. Puede emparejarse un dominio variable pesado con un dominio variable ligero para proporcionar un sitio de unión a antígeno. Además, pueden usarse regiones independientes (por ejemplo, un dominio pesado variable solo), para unirse al antígeno.
También son concebibles combinaciones de las quimeras de cadena ligera o pesada anteriormente descritas con cadenas ligeras o pesadas generadas artificialmente por injerto de CDR como se ha descrito en el párrafo anterior siempre que muestren especificidad de unión a integrina a2.
Los péptidos o complejos peptídicos de la presente invención pueden glucosilarse. La glucosilación de proteínas y su efecto fisiológico se conoce en la técnica. El componente oligosacárido puede afectar significativamente (positiva o negativamente) a las propiedades relevantes para la eficacia de una glucoproteína terapéutica incluyendo estabilidad física, resistencia a ataque de proteasas, interacciones con el sistema inmune, farmacocinética y actividad biológica específica. Para la expresión de proteínas glucosiladas, se usan en la técnica habitualmente células hospedadoras de mamífero (Cumming et al., 1991 , Glycobiology V. 115-130, Jenkins et al., 1996, Nature Biotechn 14: 975-981). Los ejemplos incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñon de hámster recién nacido (BHK), células de mieloma de ratón NSO y SP2/0. La producción de proteínas glucosiladas de animales transgénicos también se ha publicado (Jenkins et al., 1996, mencionado anteriormente). Además, se conocen en la técnica células hospedadoras recombinantes obtenidas por ingeniería genética que expresan de forma heteróloga/ sobreexpresan genes de glucosil transferasa (Bailey, 1991 , Science 252: 1668-1675). El documento WO 9954342 (A1) describe métodos para la generación de proteínas glucosiladas usando células hospedadoras que expresan un intervalo de actividad de glucosil transferasa modificadora de glucoproteínas que aumenta los oligosacáridos ligados a N del complejo que portan GIcNAc divisores que se ha indicado que tienen función mejorada.
De acuerdo con una modalidad de la presente invención, el péptido o complejo peptídico puede acoplarse a una o más moléculas que no son idénticas al péptido o complejo peptídico de acuerdo con la presente invención (restos adicionales), siendo el complejo completo un "conjugado".
Los ejemplos de restos adicionales comprenden, por ejemplo, una o más biomoléculas adicionales, como péptidos o complejos peptídicos, ácidos nucleicos (por ejemplo, oligonucleótidos o moléculas de ARN, tales como un ARNi) o moléculas orgánicas (pequeñas), restos radiactivos. Estos restos adicionales pueden tener su propia función, por ejemplo, citotoxicidad, actividad terapéutica, actividad inmunosupresora, etc. o pueden ser beneficiosos para el conjugado completo por otra razón (por ejemplo, estabilidad mejorada o reducida del conjugado, etc.). La presente invención abarca péptidos o complejos peptídicos conjugados con uno o más restos adicionales. En el caso de que el péptido o complejo peptídico sea un anticuerpo, derivado de fragmento del mismo, este conjugado es un inmunoconjugado. Se conocen en la técnica ejemplos de inmunoconjugados (véase, por ejemplo el documento WO05/103081), por ejemplo, una o más sustancias quimioterapéuticas, profármacos, citotoxinas, radioisótopos o nucleótidos radiactivos, restos inmunosupresores, oligonucleótidos terapéuticos, ARN inhibidor (ARNi).
De acuerdo con una modalidad, el péptido o complejo peptídico es un anticuerpo. Los anticuerpos de origen natural son proteínas de plasma globulares (~ 150 kDa) que también se conocen como inmunoglobulinas que comparten una estructura básica. Puesto que tienen cadenas de azúcares añadidas a restos aminoacídicos son glucoproteínas. La unidad funcional básica de cada anticuerpo es un monómero de inmunoglobulina (Ig) (que contiene solamente una unidad Ig); los anticuerpos secretados también pueden ser diméricos con dos unidades de Ig como con IgA, tetraméricos con cuatro unidades de Ig como IgM de pez teleósteo o pentaméricos con cinco unidades de Ig, como IgM de mamífero. En la presente invención, los ejemplos de formatos adecuados incluyen el formato de anticuerpos de origen natural incluyendo isotipos de anticuerpo conocidos como IgA, IgD, IgE, IgG e lgM.
El monómero de Ig es una molécula con forma de "Y" que consiste en cuatro cadenas peptídicas; dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas conectadas por enlaces disulfuro entre restos de cisteína. Cada cadena pesada es de aproximadamente 440 aminoácidos de largo; cada cadena ligera es de aproximadamente 220 aminoácidos de largo. Las cadenas pesadas y ligeras contienen cada una enlaces disulfuro intracatenarios que estabilizan su plegamiento. Cada cadena está compuesta de dominios estructurales llamados dominios Ig. Estos dominios contienen aproximadamente 70-110 aminoácidos y se clasifican en diferentes categorías (por ejemplo, variable o V y constante o C) de acuerdo con su tamaño y función. Tienen un plegamiento de inmunoglobulína característico en el que dos láminas ß crean una forma de tipo "sándwich", que se mantiene unida por interacciones entre cisteinas conservadas y otros aminoácidos cargados.
Existen cinco tipos de cadenas pesadas de Ig de mamífero denominadas , d, e, ? y µ. El tipo de cadena pesada presente define el isotipo del anticuerpo, estas cadenas se encuentran en anticuerpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente.
Las cadenas pesadas distintas difieren en tamaño y composición; a y ? contienen aproximadamente 450 aminoácidos y d aproximadamente 500 aminoácidos, mientras que µ y e tienen aproximadamente 550 aminoácidos. Cada cadena pesada tiene dos regiones, la región constante (CH) y la región variable (VH). En una especie, la región constante es esencialmente idéntica en todos los anticuerpos del mismo isotipo, pero difiere en anticuerpos de diferentes ¡sotipos. Las cadenas pesadas ?, a y d tienen una región constante compuesta de tres dominios Ig en tándem y una región bisagra para añadir flexibilidad; las cadenas pesadas µ y e tienen una región constante compuesta de cuatro dominios de inmunoglobulina. La región variable de la cadena pesada difiere en anticuerpos producidos por diferentes linfocitos B, pero es la misma para todos los anticuerpos producidos por un linfocito B sencillo o clon de linfocito B. La región variable de cada cadena pesada es de aproximadamente 110 aminoácidos de largo y se compone de un dominio Ig sencillo.
En mamíferos, existen dos tipos de cadena ligera de inmunoglobulina indicadas por ? y ?. Una cadena ligera tiene dos dominios sucesivos: un dominio constante (CL) y un dominio variable (VL). La longitud aproximada de una cadena ligera es de 211 a 217 aminoácidos. Cada anticuerpo contiene dos cadenas ligeras que son siempre idénticas; solamente un tipo de cadena ligera, ? o ?, está presente por anticuerpo en mamíferos. Otros tipos de cadenas ligeras, tales como la cadena i, se encuentran en vertebrados inferiores como condrictios y teleósteos.
Además de anticuerpos de origen natural, se han desarrollado formatos de anticuerpo artificiales incluyendo fragmentos de anticuerpo. Algunos de ellos se describen a continuación. Sin embargo, cualquier otro formato de anticuerpo que comprenda o consista en el polipéptido o polipéptidos anteriores y permita la unión específica a integrinas a2 está abarcado también por la presente invención.
Aunque la estructura general de todos los anticuerpos es muy similar, la propiedad única de un anticuerpo dado se determina por las regiones variables (V), como se ha detallado anteriormente. Más específicamente, los bucles variables, tres en cada una de la cadena ligera (VL) y tres en la pesada (VH) son responsables de unión al antígeno, es decir, de su especificidad de antígeno. Estos bucles se denominan regiones determinantes de complementariedad (CDR). Debido a que las CDR de los dominios tanto VH como VL contribuyen al sitio de unión a antígeno, es la combinación de las cadenas pesada y ligera, y no cada una por sí sola, lo que determina la especificidad de antígeno final.
En consecuencia, el término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, significa cualquier polipéptido que tenga similitud estructural con un anticuerpo de origen natural y sea capaz de unirse específicamente a integrina a2, determinándose la especificidad de unión por las CDR de SEC ID N° 3 a 8. Por lo tanto, se pretende que "anticuerpo" se refiera a una estructura derivada de ¡nmunoglobulina con unión específica a integrina a2 incluyendo, pero sin limitación, un anticuerpo completo o de longitud completa, un fragmento de unión a antígeno (un fragmento derivado, física o conceptualmente, de una estructura de anticuerpo), un derivado de cualquiera de los anteriores, una molécula quimérica, una fusión de cualquiera de los anteriores con otro polipéptido o cualquier 5 estructura/composición alternativa que se una selectivamente a integrina a2 y opcionalmente inhiba la función de integrina a2. El anticuerpo puede ser cualquier polipéptido que comprenda al menos un fragmento de unión a antígeno. Los fragmentos de unión a antígeno consisten en al menos el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena 10 ligera, dispuestos de manera que ambos dominios juntos son capaces de unirse al antígeno específico.
: Los anticuerpos de "longitud completa" o "completos" se refieren a proteínas que comprenden dos cadenas pesadas (H) y dos ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro que comprenden: (1) por lo que 15 respecta a las cadenas pesadas, una región variable y una región constante de cadena pesada que comprende tres dominios, CH1 , CH2 y CH3; y (2) por lo que respecta a las cadenas ligeras, una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera que comprende un dominio CL. Con : respecto al término "anticuerpo completo", se entiende cualquier anticuerpo 20 que tenga una estructura de dominio global típica de un anticuerpo de origen natural (es decir que comprende una cadena pesada de tres o cuatro dominios constantes y una cadena ligera de un dominio constante así como los dominios variables respectivos), incluso aunque cada dominio puede comprender modificaciones adicionales, tales como mutaciones, deleciones o inserciones, que no cambian la estructura de dominio global.
Un "fragmento de anticuerpo" también contiene al menos un fragmento de unión a antígeno como se ha definido anteriormente y muestra esencialmente la misma función y especificidad que el anticuerpo completo del que deriva el fragmento. La digestión proteolítica limitada con papaína escinde el prototipo de Ig en tres fragmentos. Dos fragmentos amino terminales idénticos, conteniendo cada uno una cadena L completa y aproximadamente media cadena H, son los fragmentos de unión a antígeno (Fab). El tercer fragmento, similar en tamaño pero que contiene la mitad carboxi terminal de ambas cadenas pesadas con su enlace disulfuro intercatenario, es el fragmento cristalizable (Fe). El Fe contiene carbohidratos, sitios de unión a complemento y de unión a FcR. La digestión con pepsina limitada produce un fragmento F(ab')2 sencillo que contiene ambos trozos de Fab y la región bisagra, incluyendo el enlace disulfuro intercatenario H-H. F(ab')2 es divalente para unión a antígenos. El enlace disulfuro de F(ab')2 puede escindirse para obtener Fab'. Además, las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras pueden fusionarse juntas para formar un fragmento variable de cadena sencilla (scFv).
Como la primera generación de anticuerpos de tamaño completo presentó algunos problemas, muchos de los anticuerpos de segunda generación han comprendido solamente fragmentos del anticuerpo. Los dominios variables (Fv) son los fragmentos más pequeños con un dominio de unión a antígeno intacto consistente en una VL y una VH. Tales fragmentos, solamente con los dominios de unión, pueden generarse por enfoques enzimáticos o expresión de los fragmentos génicos relevantes, por ejemplo, en células bacterianas y eucariotas. Pueden usarse diferentes enfoques, por ejemplo, el fragmento Fv solo o los fragmentos Fab' que comprenden una de las ramas superiores de la "Y" que incluye el Fv más los primeros dominios constantes. Estos fragmentos se estabilizan habitualmente introduciendo un enlace polipeptídico entre las dos cadenas que da como resultado la producción de un Fv de cadena sencilla (scFv). Como alternativa, pueden usarse fragmentos Fv enlazados por disulfuro (dsFv). Los dominios de unión de fragmentos pueden combinarse con cualquier dominio constante para producir anticuerpos de longitud completa o pueden fusionarse con otras proteínas y polipéptidos.
Un fragmento de anticuerpo recombinante es el fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). En general, tiene alta afinidad por su antígeno y puede expresarse en una diversidad de hospedadores. Estas y otras propiedades hacen a los fragmentos scFv no solamente aplicables en medicina, sino también con potencial para aplicaciones biotecnológicas. Como se ha detallado anteriormente, en el fragmento scFv los dominios VH y VL se unen con un enlazador peptídico flexible e hidrófilo, que mejora la expresión y la eficacia de plegamiento. Habitualmente se usan enlazadores de aproximadamente 15 aminoácidos, de los que el enlazador (Gly4Ser)3 se ha usado más frecuentemente. Las moléculas scFv podrían degradarse proteolíticamente fácilmente, dependiendo del enlazador usado. Con el desarrollo de las técnicas de ingeniería genética estas limitaciones podrían prácticamente superarse mediante investigación centrada en la mejora de función y estabilidad. Un ejemplo es la generación de fragmentos Fv estabilizados por disulfuro (o enlazados por disulfuro) en los que el dímero VH-VL se estabiliza mediante un enlace disulfuro intercatenario. Se introducen cisteínas en la ¡nterfaz entre los dominios VL y VH, formando un puente disulfuro, que mantiene los dos dominios juntos.
La disociación de scFv da como resultado scFv monoméricos, que puede formar complejos en dímeros (diacuerpos o (scFv^), trímeros (triacuerpos) o agregados mayores tales como TandAb y flexicuerpos.
Pueden crearse anticuerpos con dos dominios de unión a través de la unión de dos scFv con un enlace peptídico simple (scFv)2 o a través de la dimerización de dos monómeros (diacuerpos). Los diseños más simples son diacuerpos que tienen dos dominios de unión a antígeno funcionales que pueden ser los mismos, similares (diacuerpos bivalentes) o tener especificidad para distintos antígenos (diacuerpos biespecíficos). Estos anticuerpos biespecíficos permiten, por ejemplo, el reclutamiento de nuevas funciones efectoras (tales como linfocitos T citotóxicos) a las células diana, lo que los hace muy útiles para aplicaciones en medicina.
Recientemente, se han desarrollado formatos de anticuerpo que comprenden cuatro dominios variables de cadenas pesadas y cuatro dominios variables de cadenas ligeras. Los ejemplos de éstos incluyen anticuerpos biespecíficos tetravalentes (TandAbs y Flexibodies, Affimed Therapeutics AG, Heídelberg. Alemania). A diferencia de un diacuerpo biespecífico, un TandAb biespecífico es un homodímero que consiste en solamente un polipéptido. Los flexicuerpos son una combinación de scFv con un motivo multimérico de diacuerpo que da como resultado una molécula multivalente con un alto grado de flexibilidad para unir dos moléculas que están bastante distantes entre sí en la superficie celular. Si están presentes más de dos dominios de unión a antígeno funcionales y si tienen especificidad para distintos antígenos, el anticuerpo es multiespecífico.
Ciertas moléculas de anticuerpo incluyendo, pero sin limitación, Fv, scFv, moléculas de diacuerpo o anticuerpos de dominio (Domantis) pueden estabilizarse incorporando puentes disulfuro para unir los dominios VH y VL. Pueden producirse anticuerpos biespecíficos usando tecnologías convencionales, métodos específicos de las cuales incluyen producción química o a partir de hibridomas híbridos) y otras tecnologías incluyendo, pero sin limitación, la tecnología BiTE™ (moléculas que poseen regiones de unión a antígeno de diferente especificidad con un enlazador peptídico) e ingeniería genética botón en ojal.
Preferentemente, el anticuerpo puede ser un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv con enlace disulfuro, un scFv, un (scFv)2, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo multiespecífico, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo o un minicuerpo.
En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos monoespecíficos que son idénticos debido a que se producen por un tipo de célula inmune que son todas clones de una célula parental sencilla. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo en el que al menos una región de una inmunoglobulina de una especie está fusionada con otra región de una inmunoglobulina de otra especie por ingeniería genética para reducir su inmunogenicidad. Por ejemplo pueden fusionarse regiones VL y VH murinas con la parte restante de una inmunoglobulina humana. Un tipo particular de anticuerpos quiméricos es un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos humanizados se producen uniendo el ADN que codifica las CDR de un anticuerpo no humano con ADN que produce anticuerpos humanos (o viceversa). La construcción de ADN resultante puede usarse después para expresar y producir anticuerpos que habitualmente no son tan inmunogénicos como el anticuerpo parenteral no humano o como un anticuerpo quimérico, puesto que solamente las CDR son no humanas.
De acuerdo con una modalidad de los diferentes aspectos de las presentes invenciones, pueden usarse anticuerpos humanos o humanizados o fragmentos de los mismos. En consecuencia, el péptido o complejo peptídico puede comprender un dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en: un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de lgG1 humana, un dominio constante de lgG2 humana, un dominio constante de lgG3 humana, un dominio constante de lgG4 humana, un dominio constante de IgE humana y un dominio constante de IgA humana. En el contexto de la invención, el anticuerpo anti-integrina a2 se ha humanizado usando un método previamente descrito en el documento WO2009/032661 , pero puede usarse cualquier método de humanización adecuado conocido en la técnica.
Como se ha detallado anteriormente, la CDR también puede ser una variante funcionalmente activa de cualquiera de las CDR especificadas en las reivindicaciones. En una modalidad la variante funcionalmente activa es un fragmento funcionalmente activo que consiste en 90 % o más de una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID N° 3 a 8. Como alternativa, la variante funcionalmente activa es una variante funcionalmente activa que tiene 70 % o más, preferentemente 80 % o más, más preferentemente 90 % o 95 % o más identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID N° 3 a 8, particularmente cuando la variante funcionalmente activa deriva de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID N° 3 a 8 por medio de una o más sustituciones de aminoácidos conservativas (véase posteriormente).
En una modalidad de los diferentes aspectos de la presente invención, el péptido o complejo peptídico comprende la secuencia de aminoácidos de: - SEC ID N° 1 , o una variante funcionalmente activa de la misma, - SEC ID N° 2 o una variante funcionalmente activa de la misma, - SEC ID N° 9, o una variante funcionalmente activa de la misma, - SEC ID N° 10, o una variante funcionalmente activa de la misma, y/o - SEC ID N° 11 , o una variante funcionalmente activa de la misma. Como alternativa, el péptido o complejo peptídico consiste en la secuencia de aminoácidos de: - SEC ID N° 9, o una variante funcionalmente activa de la misma, - SEC ID N° 10, o una variante funcionalmente activa de la misma, y - opcionalmente 50 restos aminoacídicos adicionales o de 1 a 40, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 15, 1 a 10, 1 ó 2, 3, 4 ó 5 restos aminoacídicos adicionales.
Como alternativa, el péptido o complejo peptídico consiste en la secuencia de aminoácidos de: - SEC ID N° 9, o una variante funcionalmente activa de la misma, - SEC ID N° 11, o una variante funcionalmente activa de la misma, y - opcionalmente 50 restos aminoacídicos adicionales o de 1 a 40, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 15, 1 a 10, 1 ó 2, 3, 4 ó 5 restos aminoacídicos adicionales La variante funcionalmente activa puede ser un fragmento caracterizado por estar derivado de cualquiera de las secuencias de SEC ID N° 1 , 2, 9, 10 u 11 por una o más deleciones. La deleción o deleciones pueden ser C-terminales, N-terminales y/o internas. El fragmento puede, por ejemplo, obtenerse por 10 o menos deleciones, tales como 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, o por 5 o menos, tales como 1 , 2, 3, 4 ó 5, por 3 o menos, tales como 1 , 2 ó 3, por dos o menos, tales como 1 ó 2 o por una deleción. El fragmento funcionalmente activo de la invención se caracteriza porque tiene una actividad biológica similar a la presentada por la proteína completa, incluyendo la capacidad de unirse a integrina cc2 y/o integrina a2ß1 y opcionalmente inhibir integrina a2 y/o a2ß1. El fragmento de un antígeno es funcionalmente activo en el contexto de la presente invención si la actividad del fragmento equivale a 10 % o más, preferentemente 25 % o más, más preferentemente 50 % o más, más preferentemente 70 % o más, más preferentemente 80 % o más, más preferentemente 90 % o más, más preferentemente 95 % o más, más preferentemente 99 % o más de la actividad de la secuencia de aminoácidos sin alteración de la secuencia. Se proporcionan métodos adecuados para determinar la actividad de unión a integrina a2ß1 en los ejemplos, particularmente Ejemplo 1 D.
La variante puede caracterizarse por estar derivada de cualquiera de las secuencias de SEC ID N° 1 , 2, 9, 10 u 1 1 por una o más modificaciones de aminoácidos incluyendo deleciones, adiciones y/o sustituciones. La modificación o modificaciones pueden ser C-terminales, N-terminales y/o internas. El fragmento puede obtenerse por 10 o menos deleciones, tal como 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, por 5 o menos, tal como 1 , 2, 3, 4 ó 5, por tres o menos, tal como 1 , 2 ó 3, por dos o menos, tal como 1 ó 2 o por una deleción. La variante funcionalmente activa de la invención se caracteriza porque tiene una actividad biológica similar a la presentada por la proteína completa, incluyendo la capacidad para unirse a integrina al y/o integrina a2ß1 y opcionalmente inhibir a2 y/o integrina a2ß1. La variante es funcionalmente activa en el contexto de la presente invención si la actividad de la variante equivale a 10 % o más, más preferentemente 25 % o más, más preferentemente 50 % o más, incluso más preferentemente 70 % o más, aún más preferentemente 80 % o más, especialmente el 90 % o más, particularmente 95 % o más, más preferentemente 99 % o más de la actividad de la secuencia de aminoácidos sin alteración de la secuencia.
Los aminoácidos adicionales de (ix, x u xi) pueden localizarse en C-terminal, N-terminal y/o de forma interna. De acuerdo con una modalidad, hay 50 o menos adiciones, 40 o menos, 30 o menos, 20 o menos adiciones o 10 o menos adiciones tales como 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, 5 o menos adiciones, tales como 1 , 2, 3, 4 ó 5, 3 o menos adiciones, tales como 1, 2 ó 3, 2 o menos, tales como 1 ó 2, o solamente una adición.
El resto o restos aminoacídicos adicionales puede ser cualquier aminoácido, que puede ser un aminoácido L y/o D, de origen natural y distinto. Preferentemente, el aminoácido es cualquier aminoácido de origen natural tal como alanina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, fenilalanina, glicina, histidina, ¡soleucina, lisina, leucina, metionina, asparagina, prolina, glutamina, arginina, serina, treonina, valina, triptófano o tirosina.
El aminoácido puede ser también un aminoácido modificado o poco habitual. Los ejemplos de éstos son ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, ß-alanina, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicinem N-etilasparagina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, 6-N-metil lisina, N-metilvalina, norvalina, norleucina u omitiría. Adicionalmente, el aminoácido puede estar sujeto a modificaciones tales como modificaciones postraduccionales. Los ejemplos de modificaciones incluyen acetilación, amidación, bloqueo, formilación, hidroxilación de ácido ?-carboxiglutámico, glucosilación, metilación, fosforilación y sulfatación. Si está presente más de un resto aminoacídico heterólogo o adicional en el péptido, los restos aminoacídicos pueden ser los mismos o diferentes entre sí.
El porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse por ejemplo por alineamiento de secuencia. Se conocen bien en la técnica métodos de alineamiento de secuencias para comparación. Se han descrito diversos programas y algoritmos de alineamiento por ejemplo, en Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981 o Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. US. A. 85: 2444, 1988.
La herramienta de búsqueda de alineamiento local básica de NCBI (BLAST) (Altschul ef al., J. Mol Biol. 215: 403-410, 1990) está disponible de varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet, para su uso en relación con los programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Las variantes de cualquiera de las secuencias de SEC ID N° 1 a 8 se caracterizan típicamente usando el NCBI Blast 2.0, blastp con huecos ajustado a parámetros por defecto. Para comparaciones de secuencias de aminoácidos de al menos 30 aminoácidos, se emplea la función de 2 secuencias de Blast usando la matriz por defecto BLOSUM62 ajustada a parámetros por defecto (coste de existencia de hueco de 1 1 y un coste de hueco por resto de 1). Cuando se alinean péptidos cortos (menos de aproximadamente 30 aminoácidos), el alineamiento se realiza usando la función de dos secuencias de Blast, empleando la matriz PAM30 ajustada a parámetros por defecto (hueco abierto 9, penalizaciones de extensión de hueco 1). Se describen métodos para determinar la identidad de secuencia sobre ventanas tan cortas como 15 aminoácidos o menos en el sitio web que se mantiene por el Centro Nacional para la Información Biotecnológica en Bethesda, Maryland.
En otra modalidad de los diferentes aspectos de la presente invención, la variante funcionalmente activa como se ha definido anteriormente, deriva de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID N° 1 , 2, 9, 10 u 11 de cualquiera de dichas secuencias por una o más sustituciones de aminoácidos conservativas.
Las sustituciones de aminoácidos conservativas, como apreciará un experto habitual en la materia, son sustituciones que reemplazan un resto aminoacídico con uno que transmite características funcionales y/o químicas similares o mejores (para el fin pretendido). Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos conservativas son con frecuencia unas en las que el resto aminoacídico se remplaza con un resto aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de restos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas ß (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Tales modificaciones no se diseñan para reducir significativamente o alterar la unión de características de inhibición funcionales del poíipéptido (complejo), aunque pueden mejorar tales propiedades. El fin para realizar una sustitución no es significativo y puede incluir, pero no está limitado de ningún modo a, reemplazar un resto con uno mejor capaz de mantener o potenciar la estructura de la molécula, la carga o hidrofobicidad de la molécula o el tamaño de la molécula. Por ejemplo, puede desearse simplemente sustituir un resto menos deseado con uno de la misma polaridad o carga. Tales modificaciones pueden introducirse por técnicas convencionales conocidas en la materia, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Un medio específico por el que los expertos en la materia consiguen sustituciones de aminoácidos conservativas es mutagénesis de exploración de alanina. Los polipéptidos alterados se ensayan después con respecto a actuación conservada o mejorada usando ensayos funcionales disponibles en la técnica o descritos en los ejemplos. En una modalidad más preferida de la presente invención, el número de sustituciones conservativas en cualquiera de las secuencias de SEC ID N° 1 , 2, 9, 10 ó 20 es de 20 o menos tal como, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 u 11 , preferentemente 10 o menos, tal como 10, 9, 8, 7 ó 6, especialmente 5 o menos, tal como 5, 4, 3 particularmente 2 ó 1.
En otra modalidad más de los diferentes aspectos de la presente invención, el péptido o complejo peptídico comprende una o más variantes funcionalmente activas, - en las que la variante funcionalmente activa de LDR1 comprende la mutación en la posición de aminoácido 11 , particularmente 11Asn? Gln; en las que la variante funcionalmente activa de HDR2 comprende la mutación en la posición de aminoácido 6, particularmente 6Asp -» Glu; en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 1 comprende una o más mutaciones en las posiciones de aminoácidos 9, 12, 15, 22, 34, 46, 47, 80, 83, 85, 87 y/o 89, seleccionada preferentemente del grupo que consiste en 9Ala?Ser, 12Ala->Ser, 15Leu-»Val, 15Leu-»Pro, 22Ser?Thr, 34Asn?Gln, 46Gln?Lys, 47Ala?Pro, 80Asp?Asn, 83Glu?Gln, 85Asp-»Glu, 87Ala?Thr y 89Thr?Asn o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 1 comprende las siguientes mutaciones (LC1), es decir, 9Ala?Ser o 15Leu?Val o 46Gln?Lys o 83Glu?Gln o 9Ala- Ser y 15Leu?Val o 9Ala?Ser y 46Gln?Lys o 9Ala-»Ser y 83Glu?Gln o 15Leu?Val y 46Gln?Lys o 15Leu?Val y 83Glu?Gln o 46Gln?Lys y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 15Leu->Val y 46Gln?Lys o 9Ala->Ser y 15Leu?Val y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 46Gln?Lys y 83Glu?Gln o 15Leu?Val y 46Gln- Lys y 83Glu?Gln o LC1 de tabla 5: 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 46Gln?Lys y 83Glu?Gln, o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 1 comprende las siguientes mutaciones (LC2), es decir, 9Ala?Ser o 15Leu?Val o 34Asn-»Gln o 46Gln?Lys o 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 15Leu?Val o 9Ala->Ser y 34Asn?Gln o 9Ala?Ser y 46Gln?Lys o 9Ala?Ser y 83Glu?Gln o 15Leu?Val y 34Asn?Gln o 15Leu-»Val y 46Gln?Lys o 15Leu?Val y 83Glu?Gln o 34Asn?Gln y 46Gln?Lys o 34Asn?Gln y 83Glu?Gln o 9Ala->Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln o 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 46Gln?Lys o 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 34Asn?Gln y 46Gln?Lys o 9Ala?Ser y 34Asn?Gln y 83Glu-»Gln o 9Ala?Ser y 46Gln?l_ys y 83Glu?Gln o 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 46Gln?Lys o 15Leu- Val y 34Asn?Gln y 83Glu?Gln o 15Leu?Val y 46Gln- Lys y 83Glu?Gln o 34Asn?Gln y 46Gln?Lys y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 46Gln?Lys o 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 15Leu-A/al y 46Gln?Lys y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 34Asn?Gln y 46Gln?Lys y 83Glu?Gln o 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 46Gln- Lys y 83Glu?Gln o LC2 of table 5: 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 46Gln?Lys y 83Glu?Gln, o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 1 comprende las siguientes mutaciones (LC3), es decir, 9Ala-»Ser o 12Ala?Ser o 15Leu?Val o 83Glu?Gln o 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser o 9Ala?Ser y 15Leu?Val o 9Ala?Ser y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 85Asp?Glu o 12Ala?Ser y 15l_eu?Val o 12Ala?Ser y 83Glu?Gln o 12Ala?Ser y 85Asp?Glu o 15Leu?Val y 83Glu?Gln o 15l_eu?Val y 85Asp?Glu o 83Glu- Gln y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 15Leu?Val o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 15Leu->Val y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 12Ala->Ser y 15Leu?Val y 83Glu?Gln o 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 85Asp?Glu o 12Ala?Ser y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 15l_eu?Val y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 83Glu?Gln o 9Ala-»Ser y 12Ala?Ser y 15Leu- al y 85Asp->Glu o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o (LC3) de acuerdo con la Tabla 5: 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 1 comprende las siguientes mutaciones (LC4), es decir, 9Ala?Ser o 12Ala?Ser o 15Leu?Val o 34Asn?Gln o 83Glu?Gln o 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser o 9Ala?Ser y 15Leu?Val o 9Ala?Ser y 34Asn?Gln o 9Ala?Ser y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 85Asp?Glu o 12Ala-»Ser y 15Leu?Val o 12Ala?Ser y 34Asn?Gln o 12Ala?Ser y 83Glu->Gln o 12Ala-»Ser y 85Asp?Glu o 15Leu?Val y 34Asn?Gln o 15Leu?Val y 83Glu?Gln o 15l_eu?Val y 85Asp?Glu o 34Asn?Gln y 83Glu?Gln o 34Asn?Gln y 85Asp?Glu o 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 15Leu?Val o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 34Asn?Gln o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Glri o 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 34Asn?Gln y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 34Asn?Gln y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 12Ala->Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln o 12Ala-?-Ser y 15Leu?Val y 83Glu?Gln o 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 85Asp?Glu o 12Ala?Ser y 34Asn?Gln y 83Glu?Gln o 12Ala?Ser y 34Asn?Gln y 85Asp?Glu o 12Ala- Ser y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 15l_eu- /al y 34Asn-»Gln y 83Glu?Gln o 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 85Asp?Glu o 15Leu?Val y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 34Asn?Gln y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 9Ala->Ser y 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln o 9Ala?Ser y 12Ala- Ser y 15Leu-»Val y 83Glu-»Gln o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 34Asn- Gln y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 34Asn?Gln y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 9Ala-»Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 85Asp- Glu o 9Ala?Ser y 15Leu->Val y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 34Asn?Gln y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 83Glu?Gln o 12Ala->Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 85Asp?-Glu o 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 12Ala?Ser y 34Asn?Gln y 83Glu?Gln y 85Asp->Glu o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 83Glu?Gln o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 15l_eu?Val y 34Asn-»Gln y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 34Asn->Gln y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 9Ala?Ser y 15Leu-»Val y 34Asn- Gln y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 83Glu?Gln y 85Asp?Glu o (LC4) de acuerdo con la Tabla 5: 9Ala?Ser y 12Ala?Ser y 15Leu?Val y 34Asn?Gln y 83Glu?Gln y 85Asp-»Glu, o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N°1 comprende las siguientes mutaciones (LC5), es decir, 15Leu?Pro, 22Ser-*Thr, 47Ala?Pro, 80Asp?Asn, 87Ala- Thr, 89Thr- Asn o 15Leu?Pro y 22Ser?Thr o 15Leu->Pro y 47Ala?Pro o 15Leu-»Pro y 80Asp?Asn o 15Leu?Pro y 87Ala?Thr o 15Leu?Pro y 89Thr-»Asn o 22Ser?Thr y 47Ala?Pro o 22Ser->Thr y 80Asp?Asn o 22Ser?Thr y 87Ala- Thr o 22Ser?Thr y 89Thr?Asn o 47Ala?Pro y 80Asp?Asn o 47Ala?Pro y 87Ala?Thr o 47Ala?Pro y 89Thr?Asn o 80Asp?Asn y 87Ala?Thr o 80Asp?Asn y 89Thr?Asn o 87Ala?Thr y 89Thr?Asn o 15Leu- Pro y 22Ser->Thr y 47Ala?Pro o 15Leu?Pro y 22Ser?Thr y 80Asp?Asn o 15Leu?Pro y 22Ser?Thr y 87Ala?Thr o 15 Leu?Pro y 22Ser- Thr y 89Thr?Asn o 15Leu?Pro y 47Ala?Pro y 80Asp?Asn o 15Leu?Pro y 47Ala?Pro y 87Ala?Thr o 15Leu?Pro y 47Ala?Pro y 89Thr-»Asn o 15Leu?Pro y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr o 15Leu?Pro y 80Asp-»Asn y 89Thr?Asn o 15Leu?Pro y 87Ala->Thr y 89Thr?Asn o 22Ser?Thr y 47Ala?Pro y 80Asp?Asn o 22Ser?Thr y 47Ala?Pro y 87Ala?Thr o 22Ser?-Thr y 47Ala?Pro y 89Thr?Asn o 22Ser?Thr y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr o 22Ser->Thr y 80Asp?Asn y 89Thr?Asn o 22Ser?Thr y 87Ala?Thr y 89Thr?Asn o 47Ala?Pro y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr o 47Ala?Pro y 80Asp?Asn y 89Thr?Asn o 47Ala?Pro y 87Ala?Thr y 89Thr->Asn o 80Asp?Asn y 87Ala?Thr y 89Thr?Asn o 15Leu?Pro y 22Ser? hr y 47Ala?Pro y 80Asp?Asn o 15Leu?Pro y 22Ser?Thr y 47Ala?Pro y 87Ala?Thr o 15Leu?Pro y 22Ser?Thr y 47Ala- Pro y 89Thr?Asn o 15l_eu?Pro y 22Ser?Thr y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr o 15Leu?Pro y 22Ser?Thr y 80Asp?Asn y 89Thr->Asn o 15Leu?Pro y 22Ser?Thr y 87Ala->Thr y 89Thr?Asn o 15Leu->Pro y 47Ala?Pro y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr o 15Leu?Pro y 47Ala- Pro y 80Asp?Asn y 89Thr?Asn o 15Leu- Pro y 47Ala- Pro y 87Ala?Thr y 89Thr-»Asn o 15Leu?Pro y 80Asp?Asn y 87Ala? hr y 89Thr?Asn o 22Ser?Thr y 47Ala?Pro y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr o 22Ser?Thr y 47Ala- Pro y 80Asp?Asn y 89Thr?Asn o 22Ser?Thr y 47Ala->Pro y 87Ala? hr y 89Thr?Asn o 22Ser?Thr y 80Asp?Asn y 87Ala->Thr y 89Thr?Asn o 47Ala?Pro y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr y 89Thr?Asn o 15Leu?Pro y 22Ser?Thr y 47Ala?Pro y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr o 15Leu?Pro y 22Ser?Thr y 47Ala?Pro y 80Asp?Asn y 89Thr?Asn o 15Leu?Pro y 22Ser?Thr y 47Ala?Pro y 87Ala-»Thr y 89Thr?Asn o 15Leu?Pro y 22Ser?Thr y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr y 89Thr?Asn o 15Leu?Pro y 47Ala-»Pro y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr y 89Thr->Asn o 22Ser?Thr y 47Ala?Pro y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr y 89Thr?Asn o (LC5) de acuerdo con la Tabla 5: 15Leu?Pro y 22Ser?Thr y 47Ala?Pro y 80Asp?Asn y 87Ala?Thr y 89Thr- Asn y/o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 2 comprende una o más mutaciones en las posiciones de aminoácidos 5, 7, 11 , 12, 17, 20, 38, 40, 43, 55, 61 , 65, 66, 67, 76, 81 , 82, 87, 91 , 93, 112, 113 y/o 116, seleccionadas particularmente del grupo que consiste en 5His?Val, 7Pro?Ser, 11 Leu?Val, 12Val?Lys, 17Pro?Ser, 20l_eu?Val, 38Lys?Arg, 40Arg?Ala, 43Arg?Gln, 55Asp?Glu, 61Asn?Ala, 65Lys?Gln, 66Asp?Gly, 67Lys?Arg, 76Ser?Thr, 81lle?Met, 82Gln?Glu, 87Thr?Arg, 91Ser?Thr, 93Val?Lys, 112Thr?Leu, 113Leu?Val y 116Ser?Val o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 2 comprende las siguientes mutaciones (HC1), es decir, 43Arg-»Gln o 67Lys?Arg o 116Ser?Val o 43Arg?Gln y 67Lys?Arg o 43Arg?Gln y 116Ser?Val o 67Lys?Arg y 116Ser?Val o (HC1) de acuerdo con la tabla 6: 43Arg?Gln y 67Lys?Arg y 116Ser- Val, o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 2 comprende las siguientes mutaciones (HC2), es decir, 43Arg?Gln o 55Asp?Glu o 67Lys?Arg o 116Ser->Val o 43Arg?Gln y 55Asp?Glu o 43Arg->Gln y 67Lys?Arg o 43Arg?Gln y 116Ser?Val o 55Asp?Glu y 67Lys?Arg o 55Asp?Glu y 116Ser?Val o 67Lys- Arg y 116Ser?Val o 43Arg?Gln y 55Asp?Glu y 67Lys?Arg o 43Arg?Gln y 55Asp?Glu y 116Ser?-Val o 43Arg-»Gln y 67Lys?Arg y 116Ser?Val o 55Asp?Glu y 67Lys?Arg y 116Ser?Val o (HC2) de acuerdo con la Tabla 6: 43Arg?Gln y 55Asp?Glu y 67l_ys?Arg y 116Ser?Val o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 2 comprende las siguientes mutaciones (HC3), es decir, 17Pro?Ser o 116Ser->Val o (HC3) de acuerdo con la Tabla 6: 17Pro?Ser y 116Ser->Val, o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 2 comprende las siguientes mutaciones (HC4), es decir: 17Pro?Ser o 93Val?Lys o 116Ser?Val o 17Pro?Ser y 93Val?Lys o 17Pro?Ser y 116Ser->Val o 93Val?Lys y 116Ser?Val o (HC4) de acuerdo con la Tabla 6: 17Pro?Ser y 93Val?Lys y 116Ser?Val o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 2 comprende las siguientes mutaciones (HC5), es decir: 17Pro?Ser o 55Asp?Glu o 116Ser?Val o 17Pro?Ser y 55Asp?Glu o 17Pro?Ser y 116Ser?Val o 55Asp?Glu y 116Ser?Val o (HC5) de acuerdo con la Tabla 6: 17Pro?Ser y 55Asp- Glu y 116Ser-»Val o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 2 comprende las siguientes mutaciones (HC6), es decir: 12Val?Lys o 55Asp?Glu o 93Val?Lys o 116Ser?Val o 12Val?Lys y 55Asp?Glu o 12Val?l_ys y 93Val?Lys o 12Val?Lys y 116Ser?Val o 55Asp- Glu y 93Val?Lys o 55Asp?Glu y 116Ser?Val o 93Val- Lys y 116Ser?Val o 12Val?Lys y 55Asp?Glu y 93Val?Lys o 12Val?Lys y 55Asp?Glu y 116Ser?Val o 12Val- Lys y 93Val?Lys y 116Ser?Val o 55Asp?Glu y 93Val?Lys y 116Ser?Val o (HC6) de acuerdo con la Tabla 6: 12Val?Lys y 55Asp?Glu y 93Val?Lys y 116Ser?-Val o en las que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 2 comprende 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o todas de las siguientes mutaciones (HC6) 5His?Val, 7Pro?Ser, 11 Leu?Val, 12Val?Lys, 17Pro?Ser, 20l_eu?Val, 38Lys?Arg, 40Arg?Ala, 43Arg?Gln, 61Asn?Ala, 65Lys?Gln, 66Asp?Gly, 67Lys?Arg, 76Ser- Thr, 81 lle?Met, 82Gln?Glu, 87Thr?Arg, 91Ser?Thr, 112Thr?l_eu, 113Leu?Val.
Las posiciones y mutaciones se han introducido basándose en la consideración descrita en los ejemplos en el contexto de las Tablas 4, 5 y 6. Puede haber solamente una mutación o una combinación de mutaciones, particularmente cualquiera de las combinaciones dadas en las Tablas 4, 5 y 6. Además, el péptido o complejo peptídico puede comprender una o más de las mutaciones de una de las cadenas ligeras variantes como se ha enumerado anteriormente junto con una o más de las cadenas pesadas variantes como se ha numerado anteriormente, por ejemplo, comprenden o consisten en una de las siguientes combinaciones de mutaciones/variantes funcionales: LC1 y HC1 , HC2 y LC1 , LC1 y HC3, LC1 y HC4, HC5 y LC1 y, LC1 y HC6, LC1 y HC7, LC2 y HC1 , LC2 y HC2, LC2 y HC3, LC2 y HC4, LC2 y HC5, LC2 y HC6, LC2 y HC7, LC3 y HC1 , HC2 LC3 y, LC3 y HC3, LC3 y HC4, LC3 y HC5, LC3 y HC6, LC3 y HC7, LC4 y HC1 , HC2 y LC4, LC4 y HC3, LC4 y HC4, LC4 y HC5, LC4 y HC6, LC4 y HC7, LC5 y HC1 , HC2 y LC5, LC5 y HC3, HC4 y LC5, y LC5 y HC5, LC5 y HC6, LC5 y HC7.
Adicionalmente, puede ser deseable, añadir un marcador por ejemplo para la detección o purificación del péptido o complejo peptídico de la invención. Los marcadores adecuados incluyen sin limitación una etiqueta (por ejemplo, etiqueta 6 His (o HexaHis), 7 His, 8 His, GlyGlyGlyGlySer, etiqueta (GlyGlyGlyGlySer)2 Strep, etiqueta HA, etiqueta c-myc o etiqueta de glutatión S-transferasa (GST)), marcador de fluorescencia (por ejemplo, FITC, fluoresceína, rodamina, colorantes de Cy o Alexa), marca enzimática (por ejemplo, penicilinasa, peroxidasa de rábano rusticano y fosfatasa alcalina), un radiomarcador (por ejemplo, 3H, 32P, 35S, 125l o 14C). Adicionalmente, el polipéptido (complejo) puede añadirse a un soporte, particularmente un soporte sólido tal como un serie, perla (por ejemplo, de vidrio o magnética), una fibra, una película, etc. El experto en la materia podrá adaptar la molécula de unión que comprende el polipéptido o complejo polipeptídico de la presente invención y un componente adicional al uso pretendido seleccionando un componente adicional adecuado.
De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, el péptido o complejo peptídico muestra una o más de las siguientes características A-E (es decir, A, BoCoDoEoAyBoA, CyDoAyAyEoByCoByDo ByEoCyDoCyEoAyByCoAyByDoAyByDoAyByEyAyC yDAyCyEoAyDyEoByCyDoByCyEoByDyEoCAyByCy DoAyByCyEoAyyaDyEoByCyDyEoAyByCyE: A) constantes de unión cinética (según se determine por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, por Biacore) de acuerdo con los datos proporcionados en la Tabla 11.
B) una masa molecular para la cadena ligera como sigue: 23,73 + / -0,05 kDa o 23,73 kDa (LC1) o de 23,74 + / -0,05 kDa o 23,7 kDa (LC2) o 23,75 + / -0,05 kDa o 23,8 kDa (LC3 ) o de 23,77 + / -0,05 kDa o de 23,77 kDa (LC4), o de 23,79 + / -0,05 kDa o 23,79 kDa (LC5) de 50,31 + / -0,05 kDa y/o una masa molecular para la cadena pesada como sigue: 50,31 kDa (HC1) o de 50,33 + / -0,05 kDa o de 50,33 kDa (HC2) o de 50,30 + / - 0,05 kDa o de 50,30 kDa (HC3) o de 50,33 + / - 0,05 kDa o de 50,33 kDa (HC4) o de 50,32 + / - 0,05 kDa o de 50,32 kDa (HC5) o de 50,35 + / - 0,05 kDa o de 50,35 kDa (HC6) o de 50,19 + / - 0,05 kDa o de 50,19 kDa (HC7), C) inhibición de unión de plaquetas humanas lavadas a colágeno con un valor de CI50 en µg/ml de <0,1 , <0,09, <0,08, <0,07, <0,06, <0,05, <0,04, <0,03, <0,02 o <0,01 según se determina en condiciones estáticas, D) inhibición de la unión de plaquetas humanas de plasma rico en plaquetas a colágeno con una CI50 en µg ml de <0,3, <0,2, <0,1 , <0,15, <0,14 o <0,13 según se determina en condiciones estáticas, E) un porcentaje de agregación según se determina por cromatografía de exclusión por tamaño de <10, <9, <8, <7, <6, <5, <4, <3, <2,5, <2, <1 ,5, <1 o <0,5 %.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a uno o más ácidos nucleicos que codifican el péptido o complejo peptídico de acuerdo con la presente invención.
Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm o ARNc, o en forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc y ADN genómico, por ejemplo obtenido por clonación o producido por técnicas de síntesis química o por una combinación de las mismas. El ADN puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario. El ADN monocatenario puede ser la hebra codificante, también conocida como la hebra sentido, o puede ser la hebra no codificante, también denominada la hebra anti-sentido. La molécula de ácido nucleico como se usa en la presente memoria también se refiere a, entre otros, ADN mono y bicatenario, ADN que es una mezcla de ARN mono y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más típicamente, bicatenarias o tricatenarias o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, la molécula de ácido nucleico como se usa en la presente memoria se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN.
Adicionalmente, el ácido nucleico puede contener una o más bases modificadas. Tales ácidos nucleicos pueden también contener modificaciones por ejemplo, en la cadena principal de ribosa-fosfato para aumentar la estabilidad y semivida de tales moléculas en ambientes fisiológicos. Por lo tanto, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas para estabilidad o por otras razones son "molécula de ácido nucleico" como se pretende ese elemento en la presente memoria. Además, los ADN o ARN que comprenden bases poco habituales, tales como inosina o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por nombrar sólo dos ejemplos, son moléculas de ácido nucleico dentro del contexto de la presente invención. Se apreciará se ha realizado una gran diversidad de modificaciones a ADN y ARN que sirven muchos fines útiles conocidos por los expertos en la materia. La expresión molécula de ácido nucleico como se emplea en la presente memoria abarca tales formas modificadas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente de la molécula de ácido nucleico, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células sencillas y complejas, entre otros. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleótidos que no afecten al polipéptido codificado por el ácido nucleico y de este modo cualquier molécula de ácido nucleico que codifique un antígeno o fragmento o variante funcionalmente activa del mismo como se ha definido anteriormente está abarcada por la presente invención.
Además, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico que codifican uno o más polipéptidos de la invención incluyendo fragmentos o variantes funcionalmente activas de los mismos puede ligarse funcionalmente, usando técnicas convencionales tales como técnicas de clonación convencionales, con cualquier secuencia reguladora deseada, secuencia líder, secuencia de marcador heteróloga o una secuencia codificante heteróloga para crear una proteína de fusión.
El ácido nucleico de la invención puede formarse originalmente in vitro o en una célula en cultivo, en general, por la manipulación de ácidos nucleicos por endonucleasas, exonucleasas, polimerasas, ligasas y/o recombinasas u otros métodos conocidos por el facultativo experto en la materia para producir los ácidos nucleicos.
En otra modalidad de los diferentes aspectos de la presente invención, el ácido nucleico o los ácidos nucleicos se localizan en un vector. Un vector puede incluir adicionalmente secuencias de ácidos nucleico que le permiten replicar en la célula hospedadora, tal como un origen de replicación, uno o más genes terapéuticos y/o genes marcadores seleccionares y otros elementos genéticos conocidos en la técnica tales como elementos reguladores que dirigen la transcripción, traducción y/o secreción de la proteína codificada. El vector puede usarse para transducir, transformar o infectar una célula, causando de este modo que la célula exprese ácidos nucleicos y/o proteínas distintas de las nativas a la célula. El vector opcionalmente incluye materiales para ayudar a conseguir la entrada del ácido nucleico en la célula, tales como una partícula viral, liposoma, recubrimiento de proteína o similares. Se conocen en la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados para expresión proteica, por técnicas de biología molecular convencionales. Tales vectores se seleccionan entre tipos de vector convencionales incluyendo insectos, por ejemplo, expresión por baculovirus, o levaduras, sistemas de expresión fúngicos, bacterianos o virales. Otros vectores de expresión apropiados de los que se conocen numerosos tipos en la técnica, también pueden usarse para este fin. Se conocen bien métodos para obtener tales vectores de expresión (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (1989)). En una modalidad, el vector es un vector viral. Los vectores virales incluyen, pero sin limitación, vectores retrovirales y adenovirales.
Las células o líneas celulares hospedadoras adecuadas para la transfección por este método incluyen células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli se conocen bien como células hospedadoras en el campo de la biotecnología. También pueden emplearse diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces y otros bacilos y similares en el presente método. También están disponibles muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la materia como células hospedadoras para expresión de los péptidos de la presente invención. También pueden emplearse otras células fungicas o células de insecto tales como Spodoptera frugipedera (Sf9) como sistemas de expresión. Como alternativa, pueden usarse células de mamífero, tales como células 293 humanas, células de ovario de hámster chino (CHO), la línea celular COS-1 de mono o las células 3T3 murinas derivadas de ratones Swiss, BALB/c o NIH. Se conocen en la técnica otras células hospedadoras adecuadas más, así como métodos para transfección, cultivo, amplificación, exploración, producción y purificación.
En una modalidad de los diferentes aspectos de la presente invención, puede usarse una línea celular de hibridoma, expresando la línea celular de hibridoma anticuerpos monoclonales deseables generados por técnicas convencionales bien conocidas. En el contexto de la presente invención la célula de hibridoma es capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a integrina cc2, particularmente a integrina a2ß1. La célula de hibridoma puede generarse fusionando un linfocito B productor de anticuerpos activado normal con una célula de mieloma. En particular, la célula de hibridoma puede producirse como sigue: se retiran linfocitos B del bazo de un animal al que se ha presentado el antígeno relevante. Estos linfocitos B se fusionan después con células tumorales de mieloma que pueden crecer indefinidamente en cultivo. Esta fusión se realiza haciendo a las membranas celulares más permeables. Las células híbridas fusionadas (denominadas hibridomas), siendo células cancerosas, se multiplicarán rápidamente e indefinidamente y producirán grandes cantidades de los anticuerpos deseados. Tienen que seleccionarse y clonarse posteriormente por dilución limitante. Habitualmente son esenciales los medios complementarios que contienen interleucina 6 (tales como briclone) para esta etapa. La selección se realiza mediante el cultivo de las células de hibridoma primario recién fusionadas en medio selectivo, especialmente en medio que contiene HAT concentración 1 x durante aproximadamente 10-14 días. Después de usar HAT es deseable con frecuencia usar medio que contiene HT. La clonación se realiza después de la identificación de las células de hibridoma primario positivas.
Un péptido o complejo peptídico de la invención puede producirse expresando un ácido nucleico de la invención en una célula hospedadora adecuada. En consecuencia, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir un péptido o complejo peptídico de acuerdo con la invención que comprende cultivar la célula hospedadora que comprende el ácido nucleico o los ácidos nucleicos de la invención en condiciones que permiten la expresión del anticuerpo y opcionalmente recuperar el péptido o complejo peptídico de la célula hospedadora.
Para esto, las células hospedadoras pueden transfectarse, por ejemplo por medios convencionales tales como electroporación con al menos un vector de expresión que contiene un ácido nucleico de la invención bajo control de una secuencia reguladora transcripcional. La célula hospedadora transfectada o transformada se cultiva después en condiciones que permiten la expresión de la proteína. La proteína expresada se recupera, se aisla y opcionalmente se purifica de la célula (o del medio de cultivo, si se expresa extracelularmente) por medios apropiados conocidos por un experto en la materia. Por ejemplo, las proteínas se aislan en forma soluble después de lisis celular o se extraen usando técnicas conocidas, por ejemplo en cloruro de guanidina. Si se desea, el polipéptido o polipéptidos de la invención se producen como una proteína de fusión. Tales proteínas de fusión son las descritas anteriormente. Como alternativa, por ejemplo, puede ser deseable producir proteínas de fusión para potenciar la expresión de la proteína en una célula hospedadora seleccionada o para mejorar la purificación. Las moléculas que comprenden los polipéptidos de la presente invención pueden purificarse adicionalmente usando cualquiera de una diversidad de métodos convencionales que incluyen, pero sin limitación, cromatografía líquida tal como normal o de fase inversa, usando HPLC, FPLC y similares; cromatografía de afinidad (tal como con ligandos inorgánicos o anticuerpos monoclonales); cromatografía de exclusión por tamaño; cromatografía de quelado metálico inmovilizado; electroforesis en gel y similares. Un experto en la materia puede seleccionar las técnicas de aislamiento y purificación más apropiadas sin alejarse del alcance de la presente invención. Dicha purificación proporciona el antígeno en una forma sustancialmente sin otros materiales proteínicos y no proteínicos del microorganismo.
Son células hospedadoras adecuadas por ejemplo células eucariotas o líneas celulares derivadas de organismos multicelulares (tal como se ha definido anteriormente, por ejemplo células CHO o células BHK), organismos unicelulares eucariotas tales como levadura (por ejemplo S. pombe o S. cerevisiaé) o células procariotas tales como E. coli. Se conoce una gran diversidad de células hospedadoras en la técnica.
Una modalidad de los diferentes aspectos de la presente invención está relacionado con una célula recombinante que produce el péptido o complejo peptídico, en la que el péptido o complejo peptídico se expresa de forma heteróloga por dicha célula/célula hospedadora. La expresión heteróloga de un péptido o proteína (en el presente documento: péptido o complejo peptídico) significa que la célula recombinante deriva de una célula que no expresa de forma natural el péptido o proteína o complejo peptídico y que se ha modificado (por ejemplo transfectado o transformado) para expresarlo; por ejemplo portando un ácido nucleico (tal como una construcción de ácido nucleico artificial (un vector) que porta un inserto que codifica el péptido o complejo peptídico) permitiendo la expresión de dicho péptido o complejo peptídico, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, por dicha célula. La célula recombinante puede derivar de cualquier célula, línea celular o células hospedadoras como se ha definido anteriormente, incluyendo células eucariotas así como procariotas.
En consecuencia, un sexto aspecto de la presente invención está relacionado con una célula que expresa de forma heteróloga uno de los ácidos nucleicos de la presente invención.
En un séptimo aspecto, la presente invención está relacionado con un método para producir un péptido o complejo peptídico de la presente invención que comprende cultivar la célula de acuerdo con la presente invención en condiciones que permite la expresión del péptido o complejo peptídico y opcionalmente recuperar el péptido o complejo peptídico de la célula hospedadora.
Un octavo aspecto de la presente invención está relacionado con una composición que comprende al menos un péptido o complejo peptídico o un conjugado que comprende el péptido o complejo peptídico de acuerdo con la invención y/o al menos un ácido nucleico de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento.
La composición (farmacéutica) de la presente invención puede abarcar adicionalmente vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables útiles en la presente invención son convencionales y pueden incluir tampones, estabilizadores, diluyentes, conservantes y solubilizadores. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a Edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para el suministro farmacéutico de los polipéptidos/ácidos nucleicos descritos en la presente memoria. El contenido del principio activo (polipéptido o ácido nucleico) en la composición farmacéutica no está limitado en tanto que sea útil para tratar o prevenir, pero preferentemente contiene 0,0000001-10 % en peso por composición total.
En general, la naturaleza del vehículo o excipientes dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales habitualmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como un vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo formas de polvo, pildora, comprimido o cápsula), los vehículos sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, usos farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de vehículos biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponantes de pH y similares, por ejemplo acetato sódico o sorbitán monolaurato.
Generalmente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en el vehículo para hacer a la formulación isotónica. Los ejemplos del vehículo incluyen pero sin limitación solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. Preferentemente, los excipientes, vehículos o estabilizadores aceptables son preferentemente no tóxicos a las dosificaciones y concentraciones empleadas, incluyendo tampones tales como citrato, fosfato y otros ácidos orgánicos; contraiones formadores de sales, por ejemplo sodio y potasio; polipéptidos de bajo peso molecular (> 10 restos aminoacídicos); proteínas, por ejemplo albúmina de suero o gelatina; polímeros hidrófilos, por ejemplo polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como histidina, glutamina, lisina, asparagina, arginina o glicina; carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; monosacáridos; disacáridos; otros azúcares, por ejemplo sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; agentes quelantes, por ejemplo EDTA; tensioactivos no iónicos, por ejemplo Tween, Pluronics o polietilenglicol; antioxidantes incluyendo metionina, ácido ascórbico y tocoferol y/o conservantes, por ejemplo, cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico o bencílico; parabenos de alquilo, por ejemplo metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol).
La composición farmacéutica abarca al menos un péptido, complejo peptídico o ácido nucleico de la invención; sin embargo también pueden contener un cóctel (es decir una mezcla simple) que contiene uno o más péptidos y/o complejos peptídicos diferentes y/o ácidos nucleicos de la invención. El péptido o péptidos o el complejo o complejos peptídicos de la presente invención también pueden usarse en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los ácidos y bases adecuados que son capaces de formar sales con los péptidos de la presente invención se conocen bien por los expertos en la materia e incluyen ácidos y bases orgánicas e inorgánicas.
Preferentemente, la composición farmacéutica puede usarse para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno relacionado con integrina a2. En el contexto de la presente invención, una enfermedad o trastorno relacionado con integrina a2 puede entenderse como cualquier afección no deseada del cuerpo que implica, está causada, contribuye a o se ve afectada por una o más de las funciones o actividades de integrina a2. Los ejemplos incluyen rutas de señalización o procesos que implican integrina cc2 que median reacciones celulares aberrantes tales como proliferación celular aberrante o aumentada mediada por colágeno o secreción de citocinas, dando como resultado por ejemplo neo-angiogénesis, afecciones inflamatorias o trastornos de la curación de heridas. Los ejemplos específicos comprenden (pero sin limitación): Trombosis, enfermedad vascular, cáncer, incluyendo neoangiogénesis y metástasis, cáncer pancreático, cáncer de colon, por ejemplo expansión metastásica del cáncer de colon a otros órganos (por ejemplo pulmón e hígado) y melanoma, inflamación, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune y una enfermedad caracterizada por angiogénesis anómala o aumentada, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reacciones a trasplante, neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen, esclerodermia, enfermedad cardiovascular, psoriasis, aterosclerosis e infecciones que inducen una respuesta inflamatoria.
En una modalidad de la presente invención, la composición farmacéutica puede usarse para tratar o prevenir una enfermedad vascular y/o trombosis, particularmente en el tratamiento de ciertos indicios clínicos, como por ejemplo síndrome coronario agudo, intervención coronaria percutánea, apoplejía isquémica, estenosis de la arteria carótida o enfermedad oclusiva arterial periférica.
En el contexto de la presente invención, el tratamiento o prevención puede afectar a cualquier animal (humano o no humano, especialmente mamíferos tales como seres humanos, animales de granja o mascotas) que necesite tratamiento (es decir para atenuar o eliminar la patología o trastorno o para prevenir o retardar la aparición de la patología o trastorno en individuos que no presentan aún la patología o trastorno).
La integrina a2ß1 es una diana interesante en el tratamiento o prevención de trombosis. Estudios in vivo con ratones knock-out a2ß1 mostraron reducción en la formación de trombos y aumento del tiempo hasta oclusión en modelos de trombosis arterial así como tiempos de hemorragia de la cola prolongados. En estudios clínicos relacionados con deficiencia y polimorfismos de integrina cc2, los pacientes mostraron trastorno hemorrágico de suave a grave y respuesta de colágeno defectiva de las plaquetas. El polimorfismo conduce a aumento de la expresión de a2ß1 , dando como resultado un factor de riesgo independiente para infarto de miocardio no letal en individuos de edad < 62, riesgo aumentado de apoplejía en pacientes de edad < 50 y riesgo aumentado de desarrollo de retinopatía diabética en diabéticos de tipo II. Además, las plaquetas y la integrina a2 están implicadas en la angiogénesis, progresión/metástasis tumoral. En consecuencia, el cáncer es un campo terapéutico interesante adicional. Se ha mostrado que la inhibición de integrina a2 antagoniza la invasión tumoral del estroma in vitro y la adhesión de colágeno de tipo I mediada por integrina a2/integrina-ECM en particular está implicada en la promoción del fenotipo maligno en cáncer pancreático in vitro. In vivo, los mAb antagonistas anti-a2 evitan el aumento inducido por operación de metástasis de hígado en un modelo de rata, inhiben la diferenciación de células cancerosas colorrectales humanas multipotentes y suprimen el crecimiento y vascularización de xenotrasplantes de carcinoma de células escamosas humanas.
Para cáncer colorrectal se ha mostrado que la retirada del carcinoma colorrectal primario puede aumentar paradójicamente el riesgo de desarrollo de metástasis, debido a que las pruebas acumuladas sugieren que el traumatismo quirúrgico puede estimular el crecimiento tumoral. La manipulación del tumor primario durante la cirugía da como resultado separación de las células tumorales que supera la necesidad de cambios celulares complejos. Además, el traumatismo de operación induce la exposición de ECM subendoteliales y de este modo facilita la unión a través de integrinas expresadas habitualmente, promoviendo la adherencia de células tumorales. En un modelo animal, el bloqueo de la integrina a2 en células tumorales anuló completamente la adhesión inducida por operación y revirtió completamente el crecimiento potenciado de metástasis de hígado después de cirugía abdominal.
Para cáncer pancreático, la terapia actual es con frecuencia insuficiente, debido a que alarga la vida solamente 4 meses. La adhesión de colágeno de tipo I mediada por integrina a2ß1 e ¡ntegrina-ECM en particular están implicadas en la promoción del fenotipo maligno en cáncer pancreático in vitro. Los estudios en modelos animales usando inhibidores de función de integrina a2ß1 tales como mAb están garantizados y deberían evaluarse con respecto a eficacia terapéutica en el tratamiento de cáncer pancreático.
Basándose en estos hallazgos, un bloqueo funcional de integrina a2 y/o a2ß1 puede proporcionar una oportunidad terapéutica interesante, en particular para cáncer colorrectal y pancreático.
Un séptimo aspecto de la presente invención está relacionado con un método para diagnosticar una enfermedad asociada con expresión de integrina a2 alterada, comprendiendo el método a) poner en contacto una muestra de un sujeto que comprende integrina a2 con el péptido o complejo peptídico de la invención; b) detectar la unión de la integrina o 2 con el péptido o complejo peptídico; y c) comparar la unión de la etapa b) con una referencia, en el que una unión alterada de integrina a2 en la muestra en relación con la referencia es indicativa de la enfermedad. La unión alterada puede por ejemplo identificarse por una señal alterada (es decir una señal aumentada o reducida) como se detecta en la etapa b en comparación con una muestra de referencia.
El péptido (complejo) de la presente invención también puede usarse para ensayos de diagnóstico. Como se ha detallado anteriormente la expresión alterada de integrina a2 y/o mutaciones de la misma puede asociarse con enfermedades particulares. En consecuencia, el péptido (complejo) puede usarse para determinar la unión a integrina a2. Si la unión (cuantitativamente o cualitativamente) en relación con un control o referencia cambia, esto puede ser indicativo de una enfermedad.
En consecuencia, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad asociada con integrina oc2 alterada, comprendiendo el método a) poner en contacto una muestra tomada de un individuo con el péptido o complejo peptídico de la presente invención; y b) detectar la unión de integrina 2 con el péptido o complejo peptídico; y c) comparar la unión de la etapa b) con la unión de integrina a2 con el péptido o complejo peptídico en una o más muestras de referencia, en el que una unión alterada en la muestra tomada en relación con la unión detectada en la o las muestras de referencia es indicativo de la enfermedad.
Generalmente, una muestra de ensayo obtenida de un sujeto puede ponerse en contacto con el péptido (complejo) de la invención que se une específicamente a integrina a2. Opcionalmente, el péptido (complejo) puede fijarse en un soporte sólido antes de poner en contacto el anticuerpo con una muestra de ensayo para facilitar el lavado y aislamiento posterior del complejo. Los ejemplos de soportes sólidos incluyen vidrio o plástico en forma de, por ejemplo, una placa de microtitulación, un cubreobjetos o portaobjetos de microscopio de vidrio, una varilla, . una perla o una microperla.
Después de incubar la muestra con anticuerpos, la muestra se lava y pueden detectarse los complejos de péptido (complejo)/integrina a2 formados. Esto puede conseguir incubando la mezcla lavada con un reactivo de detección. El reactivo de detección puede ser mediante el uso de un marcador detectable. Se conocen una diversidad de marcadores y métodos de detección por el experto en la materia. Por lo que respecta al marcador detectable, puede usarse cualquier marcador detectable conocido en la técnica. Por ejemplo, el marcador detectable puede ser un marcador radioactivo (tal como, por ejemplo, 3H, 25l, 35S, 1 C, 32P y 33P), un marcador enzimático (tal como, por ejemplo, peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa y similares), un marcador quimioluminiscente (tal como, por ejemplo, ésteres de acridinio, tioésteres de acridinio, sulfonamidas de acridinio, ésteres de fenantridinio, luminal, isoluminol y similares), un marcador de fluorescencia (tal como, por ejemplo, fluoresceína (por ejemplo, 5-fluoresceína, 6-carboxifluoresceína, 3'6-carboxifluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, 6-hexaclorofluoresceína, 6-tetraclorofluoresceína, isotiocianato de fluoresceína y similares)), rodamina, ficobiliproteínas, R-ficoeritrina, puntos cuánticos, (por ejemplo, seleniuro de cadmio cubierto con sulfuro de cinc), un marcador termométrico, una etiqueta, (como se ha definido anteriormente) o un marcador de reacción en cadena de inmunopolimerasa.
A lo largo de los ensayos, pueden requerirse etapas de incubación y/o lavado después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos a varias horas, preferentemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato de ensayo, biomarcador (antígeno), volumen de solución, concentraciones y similares. Habitualmente los ensayos se llevarán a cabo a temperatura ambiente, aunque pueden realizarse sobre un intervalo de temperaturas, tal como de 10 °C a 40 °C.
Por conveniencia, el péptido (complejo) puede proporcionarse en un kit, tal como una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones, incluyendo para realizar un ensayo de diagnóstico. Cuando el péptido (complejo) está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable).
Otros aditivos pueden incluirse en el kit tales como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos proporcionados en el kit pueden variarse ampliamente, por ejemplo, para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes, por ejemplo, que en disolución proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.
La referencia puede ser una muestra de un sujeto sano o determinarse en un grupo de sujetos sanos. Como alternativa, puede ser un valor de referencia conocido. El experto en la materia conoce procedimientos estadísticos para evaluar si dos valores son significativamente diferentes entre sí tales como ensayo de t de Student o ensayos de chi cuadrada. Además, el experto en la materia sabe cómo seleccionar un control adecuado.
Las expresiones "muestra de un sujeto" y "muestra de ensayo" se refieren a todos los fluidos biológicos, excreciones y tejidos aislados de cualquier sujeto dado, particularmente un ser humano. En el contexto de la presente invención tales muestras incluyen, pero sin limitación, sangre, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, aspirado del pezón, orina, semen, fluido seminal, plasma seminal, fluido prostático, excrementos, lágrimas, saliva, sudor, biopsia, líquido ascítico, fluido cerebroespinal, leche, linfa, lavado bronquial y otras muestras de lavado o muestras de extracción de tejido.
Típicamente, las muestras sanguíneas son muestras de ensayo preferidas para su uso en el contexto de la presente invención.
En un octavo aspecto, la presente invención está relacionada con un artículo de manufactura que comprende a) un material de envasado (por ejemplo uno o más recipientes para el péptido o complejo peptídico y la etiqueta o prospecto) b) un péptido o complejo peptídico de la presente invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, c) una etiqueta (por ejemplo que comprende información escrita y/o un código de barras y/o cualquier otro tipo de información) o un prospecto (es decir cualquier tipo de soporte de datos tal como una microplaca, un folleto, un librito, etc.), indicando el inserto contenido dentro de dicho material de envasado que dicho péptido o complejo peptídico es eficaz para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, especialmente una enfermedad o trastorno relacionada con integrina a2, tal como se ha definido en la presente memoria.
En un noveno aspecto, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico para el diagnóstico de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina a2 que comprende un péptido o complejo peptídico de la presente invención y un envase adecuado e instrucciones posiblemente adecuadas para usar dicho péptido o complejo peptídico en la detección de integrina a2.
Un kit de diagnóstico de acuerdo con el noveno aspecto de la presente invención es un artículo de manufactura que comprende al menos los componentes como se han definido en el noveno aspecto y opcionalmente uno o más componentes adicionales (por ejemplo tampones y otros reactivos necesarios o adecuados para llevar a cabo la detección de integrina alfa 2 en la muestra o medios adicionales para detectar integrina alfa 2 u otros marcadores de una enfermedad dada, o patrones negativos/positivos, uno o más anticuerpos secundarios (marcados de forma adecuada) para detectar, visualizar y/o cuantificar el complejo de integrina alfa 2-(péptido/complejo peptídico) contenido de forma adecuada dentro de uno o más recipientes adecuados) que se combinan preferentemente en una unidad ensamblada de forma espacial y que se pretende para su uso en el diagnóstico de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina a2.
De acuerdo con una modalidad del noveno aspecto, el kit comprende adicionalmente un soporte de datos que comprende instrucciones para un método de acuerdo con el séptimo o décimo primer aspecto de la presente invención y una cualquiera de sus modalidades.
En un décimo aspecto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento o diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con integrina a2 usando uno o más péptidos o complejos peptídicos de la presente invención y/o uno o más ácidos nucleicos.
En consecuencia, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad asociada con integrina a2 alterada, comprendiendo el método a) poner en contacto una muestra tomada de un individuo con el péptido o complejo peptídico de la presente invención; b) detectar y/o cuantificar la unión de integrina a2 con el péptido o complejo peptídico; y c) comparar la unión de la etapa b) con la unión de la integrina á2 con el péptido o complejo peptídico en una o más muestras de referencia, en el que una unión alterada en la muestra tomada en relación con la unión detectada en la o las muestras de referencia es indicativa de la enfermedad.
La unión puede detectarse o cuantificarse en términos de la afinidad (por ejemplo, tasa KD, Koff, Kon) usando métodos conocidos o simplemente por medio de la señal (intensidad) del complejo péptido/complejo peptídico -integrina alfa 2 causada por ejemplo por un anticuerpo marcado contra el péptido/complejo peptídico en comparación con la de la muestra de referencia.
El término "referencia", especialmente en el contexto de "referencia individual", "muestra de referencia" o "valor de referencia" en el contexto de la presente invención se refiere a una comparación o patrón que es característico o representativo para un cierto estado (de salud), enfermedad, etc. Por lo tanto, un valor de referencia es un valor convencional para un cierto parámetro (por ejemplo nivel de expresión de una cierta molécula biomarcadora/indicadora) que es típico para un cierto estado (por ejemplo un estado de enfermedad o estado de salud), un individuo de referencia es un individuo que se ha seleccionado para comparación y tiene un cierto estado de salud o enfermedad, una muestra de referencia puede por ejemplo ser una muestra de un individuo de referencia o una muestra artificial con un nivel característico de un cierto indicador o biomarcador típico para una patología o estado de salud.
La expresión "muestra de referencia" como se usa en la presente memoria, se refiere a una muestra que se analiza de una manera sustancialmente idéntica a la muestra de interés y cuya información se compara con la de la muestra de interés. Una muestra de referencia proporciona de este modo un patrón que permite la evaluación de la información obtenida de la muestra de interés.
Una muestra de referencia puede derivar de un tejido, órgano o individuo normal o sano, proporcionando de este modo un patrón de un estado de salud de un tejido, órgano o individuo. Las diferencias entre el estado de la muestra de referencia normal y el estado de la muestra de interés pueden ser indicativas del riesgo de desarrollo de enfermedad o la presencia o progresión adicional de dicha enfermedad o trastorno.
Una muestra de referencia puede derivar de un tejido, órgano o individuo enfermo o anómalo, proporcionando de este modo un patrón de un estado de enfermedad de un tejido, órgano o individuo. Las diferencias entre el estado de la muestra de referencia anómala y el estado de la muestra de interés pueden ser indicativas de un riesgo reducido de desarrollo de enfermedad o la ausencia o mejora de dicha enfermedad o trastorno.
Una muestra de referencia también puede derivar del mismo tejido, órgano o individuo que la muestra de interés pero se ha tomado en un punto más temprano en el tiempo. Las diferencias entre el estado de la muestra de referencia tomada más temprano y el estado de la muestra de interés pueden ser indicativas de la progresión de la enfermedad, es decir una mejoría o empeoramiento de la enfermedad a lo largo del tiempo. Una muestra de referencia se toma en un punto temporal más temprano o más tardío en caso de que haya pasado un periodo de tiempo entre la toma de la muestra de referencia y la toma de la muestra de interés. Dicho periodo de tiempo puede representar años (por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 años), meses (1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 meses), semanas (por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas), días (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 días), horas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 horas), minutos (por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 minutos), o segundos (por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 segundos).
La muestra de referencia representativa para un estado o etapa de dolor puede ser de un sujeto control que se sabe que padece el trastorno o enfermedad a diagnosticar, es decir una enfermedad o trastorno relacionado con integrina alfa 2, por ejemplo tal como se ha definido en la presente memoria. El sujeto de control puede ser un mamífero, tal como un ser humano, roedor (por ejemplo, rata, hámster, ratón) o mono, o puede ser otro animal distinto de un mamífero tal como un ave.
Preferentemente, tanto el valor o muestra como el valor o muestra de referencia son de sujetos de la misma especie (por ejemplo ser humano), más preferentemente del mismo género (por ejemplo hombre o mujer) y/o de una edad o fase dé vida similar (por ejemplo recién nacido, niño, juvenil, adulto o anciano).
La referencia o muestra de referencia en los diferentes aspectos y modalidades de la presente invención deriva preferentemente de un individuo sano, un individuo enfermo o del mismo individuo que la muestra de interés. Cuando la referencia (por ejemplo valor de referencia) o muestra de referencia se tomó del mismo individuo que la muestra de interés, la referencia (por ejemplo valor de referencia) o muestra de referencia se tomó preferentemente en un punto temporal más temprano o más tardío que la muestra de interés. El periodo de tiempo que ha pasado entre la toma de la referencia (por ejemplo valor de referencia) o muestra de referencia y la toma de la referencia (por ejemplo valor de referencia) o muestra o valor de interés preferentemente representa años (por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 años), meses (1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 meses), semanas (por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 semanas), días (por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 días), horas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12 horas), minutos (por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 minutos), o segundos (por ejemplo 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 segundos). Como alternativa o adicionalmente, la muestra de referencia es una muestra de referencia con un nivel de integrina alfa 2 representativo de un individuo sano o representativo de la presencia o ausencia de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 o representativo de un riesgo reducido o aumentado de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2.
En modalidades en las que la referencia o muestra de referencia deriva de un individuo sano o un individuo con un riesgo reducido de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 o con un nivel de integrina alfa 2 representativo de la ausencia de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, un nivel elevado de integrina alfa 2 en la muestra o valor de referencia o en la muestra o valor de interés en comparación con dicho valor de referencia o muestra de referencia indica (a) la presencia de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, (b) un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 y/o (c) la progresión de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 en el individuo. En modalidades en las que la referencia deriva de un individuo enfermo o un individuo con un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 o un valor representativo de la presencia de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, un nivel similar de integrina alfa 2 indica (a) la presencia de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, (b) un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 y/o (c) la progresión de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 en el individuo.
En modalidades en las que la referencia (valor) o muestra de referencia es (de) el mismo individuo que el individuo de interés es en un punto temporal más temprano, un nivel elevado de integrina alfa 2 en el individuo/valor/muestra de interés indica (a) la presencia de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, (b) un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 y/o (c) la progresión de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 en el individuo. En modalidades en las que la referencia (valor) o muestra de referencia es (de) el mismo individuo que el individuo/muestra de interés en un punto temporal anterior, un nivel reducido de integrina alfa 2 en la muestra de interés indica (a) una alteración del trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 o una mejora o ausencia del trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, (b) un riesgo reducido de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 y/o (c) una progresión reducida del trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 en el individuo.
En modalidades en las que la referencia (valor) o muestra de referencia es (de) el mismo individuo que el individuo/muestra de interés en un punto temporal anterior, un nivel similar de integrina alfa 2 en la muestra de interés indica (a) un riesgo similar de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, (b) una paralización de la progresión de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 y/o (c) una persistencia del trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 en el individuo.
En modalidades en las que la referencia (valor) o muestra de referencia derivan de un individuo sano o de un individuo con un riesgo reducido de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 o comprende un nivel de integrina alfa 2 representativo de un individuo sano o de un estado de ausencia de enfermedad o de un riesgo reducido de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionada con integrina alfa 2, un nivel elevado de integrina alfa 2 indica (a) la presencia de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, (b) un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 y/o (c) la progresión de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 en el individuo.
En modalidades en las que la referencia (valor) o muestra de referencia deriva de un individuo enfermo o de un individuo con un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno de enfermedad relacionado con integrina alfa 2 o comprende un nivel o cantidad de integrina de alfa 2 representativa de un individuo enfermo, de un estado de presencia de enfermedad o de un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionada con integrina alfa 2, un nivel similar de integrina alfa 2 indica (a) la presencia de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, (b) un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 y/o (c) la progresión de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 en el individuo.
En modalidades en las que la referencia (valor) o muestra deriva del mismo individuo que la muestra de interés y se tomó en un punto temporal anterior, un nivel elevado de integrina alfa 2 en la muestra de interés indica (a) la presencia de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, (b) un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 y/o (c) la progresión de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 en el individuo.
En modalidades en las que la referencia (valor) o muestra de referencia deriva del mismo individuo que la muestra de interés y se tomó en un punto temporal anterior, un nivel reducido de integrina alfa 2 en la muestra de interés indica (a) una alteración del trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 o una mejora o ausencia de un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, (b) un riesgo reducido de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 y/o (c) una progresión reducida del trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2. En modalidades en las que la muestra de referencia deriva del mismo individuo que la muestra de interés y se tomó en un punto temporal anterior, un nivel similar de integrina alfa 2 en la muestra de interés indica (a) un riesgo similar de desarrollar un trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2, (b) una paralización en la progresión del trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 y/o (c) una persistencia del trastorno o enfermedad relacionado con integrina alfa 2 en el individuo.
De acuerdo con una modalidad preferente de los diferentes aspectos de la presente invención, el péptido o complejo peptídico comprende o consiste en (es) un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo. A continuación, se enumeran algunas modalidades preferentes que se refieren a un anticuerpo monoclonal o a un fragmento de unión a antígeno del mismo: 1. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une específicamente al dominio I de la integrina a2 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento un dominio de región variable de la cadena pesada (VH) y un dominio de región variable de la cadena ligera (VL), en el que dicho anticuerpo o fragmento presenta reactividad cruzada con integrina o2 no humana de primate pero no presenta reactividad cruzada con integrina a2 que no sea de primate. 2. Anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une específicamente al dominio I de la integrina a2 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento un dominio de región variable de la cadena pesada (VH) y un dominio de región variable de la cadena ligera (VL), en el que dicho anticuerpo o fragmento compite con un anticuerpo de referencia por la unión al epítopo del anticuerpo de referencia, comprendiendo dicho anticuerpo de referencia una cadena ligera codificada por el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de adhesión DSM 23944 y una cadena pesada codificada por (i) el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de adhesión DSM 23946 o bien (ii) el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de adhesión DSM 23945. 3. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la modalidad 1 o 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une específicamente al dominio I de la integrina a2 humana con una afinidad de unión de orden nM. 4. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, en el que dicho anticuerpo o fragmento inhibe la interacción de la integrina a2 humana con el colágeno in vitro, inhibiendo de esa manera la activación de las plaquetas debida a la adhesión de dichas plaquetas a dicho colágeno. 5. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena pesada la cadena pesada HCDR3 de SEC ID N° 5. 6. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena pesada las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDRs) de la cadena pesada de SEC ID N° 3 (HCDR1), SEC ID N° 4 (HCDR2), y SEC ID N° 5 (HCDR3), o variantes funcionalmente activas de las mismas. 7. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la modalidad 6, en el que la variante funcionalmente activa de HCDR2 comprende la mutación Asp?Glu en el aminoácido en la posición 6. 8. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena ligera la cadena ligera LCDR3 de SEC ID N° 8. 9. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena ligera las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDRs) de la cadena ligera de SEC ID N° 6 (LCDR1), SEC ID N° 7 (LCDR2), y SEC ID N° 8 (LCDR3), o variantes funcionalmente activas de las mismas. 10. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la modalidad 9, en el que la variante funcionalmente activa de LCDR1 comprende la mutación Asn?Gln en el aminoácido en la posición 11. 11. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, teniendo dicho dominio de región variable de la cadena pesada (VH) al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de VH de SEC ID N° 2. 12. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la modalidad 11 , en el que dicho dominio de región variable de la cadena pesada (VH) comprende la secuencia de SEC ID N° 2 o una variante funcionalmente activa de la misma. 13. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, teniendo dicho dominio de región variable de la cadena ligera (VL) al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de VL de SEC ID N° 1. 14. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la modalidad 13, en el que dicho dominio de región variable de la cadena ligera (VL) comprende la secuencia de SEC ID N° 1 o una variante funcionalmente activa de la misma. 15. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, en el que dicho dominio de región variable de la cadena pesada (VH) comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones seleccionadas entre el grupo que consiste en H5, H7, H11 , H12, H17, H20, H38, H40, H43, H55, H61, H65, H66, H67, H76, H81 , H82, H87, H91 , H93, H112, H113 y H116. 16. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la modalidad 15, en el que las una o más sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre el grupo que consiste en 5His?Val, 7Pro?Ser, 11Leu- Val, 12Val?Lys, 17Pro?Ser, 20Leu?Val, 38Lys?Arg, 40Arg?Ala, 43Arg?Gln, 55Asp?Glu, 61Asn?Ala, 65Lys?Gln, 66Asp?Gly, 67Lys->Arg, 76Ser?Thr, 81 lle->Met, 82Gln?Glu, 87Thr- Arg, 91Ser?Thr, 93Val?l_ys, 112Thr?Leu, 113Leu?Val y 116Ser?Val . 17. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, en el que dicho dominio de región variable de la cadena ligera (VL) comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones seleccionadas entre el grupo que consiste en L9, L12, L15, L22, L34, L46, L47, L80, L83, L85, L87, y L89. 18. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la modalidad 17, en el que las una o más sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre el grupo que consiste en 9Ala?Ser, 12Ala->Ser, 15l_eu->Val, 15l_eu?Pro, 22Ser?Thr, 34Asn?Gln, 46Gln?Lys, 47Ala?Pro, 80Asp?Asn, 83Glu?Gln, 85Asp-»Glu, 87Ala?Thr y 89Thr?Asn. 19. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, teniendo dicho dominio de región variable de la cadena pesada (VH) al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de VH seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 38 (HC1), SEC ID N° 39 (HC2), SEC ID N° 40 (HC3), SEC ID N° 41 (HC4), SEC ID N° 42 (HC5), SEC ID N° 43 (HC6), y SEC ID N° 44 (HC7). 20. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la modalidad 19, comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena pesada (VH) una secuencia de VH seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 38 (HC1), SEC ID N° 39 (HC2), SEC ID N° 40 (HC3), SEC ID N° 41 (HC4), SEC ID N° 42 (HC5), SEC ID N° 43 (HC6), y SEC ID N° 44 (HC7). 21. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, teniendo dicho dominio de región variable de la cadena ligera (VL) al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de VL seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 33 (LC1), SEC ID N° 34 (LC2), SEC ID N° 35 (LC3), SEC ID N° 36 (LC4), y SEC ID N° 37 (LC5). 22. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la modalidad 21 , comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena ligera (VL) una secuencia de VL seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 33 (LC1), SEC ID N° 34 (LC2), SEC ID N° 35 (LC3), SEC ID N° 36 (LC4), y SEC ID N° 37 (LC5). 23. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, en el que dicho anticuerpo o porción de unión es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. 24. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, en el que la porción de unión a antígeno se seleccionan entre el grupo que consiste en un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv unido por puente disulfuro, un scFv, y un (scFv)2. 25. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, que se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo específico doble, un anticuerpo de isotipo, un anticuerpo de dominio variable doble y un anticuerpo biespecífico. 26. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, que comprende un dominio constante de inmunoglobulina de la cadena pesada seleccionado entre el grupo que consiste en: un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgGI humana, un dominio constante de lgG2 humana, un dominio constante de lgG3 humana, un dominio constante de lgG4 humana, un dominio constante de IgE humana, y un dominio constante de IgA humana. 27. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades previas, que comprende un dominio constante de lgG4 humana. 28. Un ácido nucleico aislado que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo, o de la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades precedentes. 29. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la modalidad 28. 30. Una célula anfitriona que comprende el vector de expresión recombinante de la modalidad 29. 31. Un método para la producción de un anticuerpo o de una fracción de unión a antígeno de una cualquiera de las modalidades 1-26, que comprende el cultivo de la célula anfitriona de la modalidad 30 en condiciones tales que la célula anfitriona produzca un anticuerpo. 32. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las modalidades 1-27 y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. 33. Un método para el tratamiento, prevención o diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con la integrina a2, comprendiendo dicho método la administración de la composición farmacéutica de la modalidad 32 a un sujeto con necesidad de la misma. 34. El método de la modalidad 33, en el que la enfermedad o el trastorno relacionado con la integrina a2 se selecciona entre el grupo que consiste en trombosis, una enfermedad vascular, cáncer, incluyendo neo-angiogénesis y metástasis, inflamación, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune y una enfermedad caracterizada por una angiogénesis anormal o aumentada, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reacciones a trasplantes, neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, encefalomielitis autoinmune experimental, síndrome de Sjorgen, esclerodermia, enfermedad cardiovascular, psoriasis, e infecciones que provocan una respuesta inflamatoria. 35. El método de la modalidad 33, en el que la enfermedad o el trastorno relacionado con la integrina a2 se selecciona entre el grupo que consiste en síndrome coronario agudo, intervención coronaria percutánea, apoplejía isquémica, estenosis de la arteria carótida o enfermedad oclusiva arterial periférica. 36. Un método para el diagnóstico de una enfermedad asociada con integrina a2 alterada, comprendiendo el método: a) poner en contacto una muestra que contiene integrina a2 con el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las modalidades 1-27; b) detectar la unión de la integrina a2 al anticuerpo o al fragmento de unión a antígeno; y c) comparar la unión de la etapa b) con una referencia, en el que una unión de integrina a2 alterada en la muestra con respecto a la referencia es indicativa de la enfermedad. 37. Un artículo de manufactura que comprende: a) un material de envasado, b) el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las modalidades 1-27, c) una etiqueta o un prospecto, estando contenido el prospecto dentro de dicho material de envasado, que indica que dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es eficaz para el tratamiento o diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con la integrina a2.
La invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente memoria debido a que pueden variar. Además, la terminología usada en la presente memoria es para el fin de describir modalidades particulares solamente y no se pretende que limite el alcance de la presente invención. Como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un" y "el" incluyen referencias plurales a no ser que el contexto claramente dicte otra cosa. De forma similar, las palabras "comprender", "contener" y "abarcar" deben interpretarse de forma inclusiva en lugar de exclusiva.
A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos y cualquier acrónimo usado en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la materia y en el campo de la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria pueden usarse en la práctica de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen en la presente memoria.
La invención se ilustra adicionalmente por el siguiente ejemplo, aunque se entenderá que los ejemplos se incluyen meramente para fines de ilustración y no se pretende que limiten el alcance de la invención a no ser que se indique específicamente de otro modo.
FIGURAS: La Figura 1 A y B muestra unión de mAb anti integrina a2 purificado de sobrenadante de hibridoma en Tecnología HUVEC MesoScale.
La Figura 2 muestra el efecto de mAb anti integrina a2 purificado de sobrenadar de hibridoma en angiogénesis HUVEC. El mAb anti integrina a2 fue capaz de inhibir la angiogénesis inducida por FGF2 de una manera dependiente de dosis.
La Figura 3 muestra inhibición de adhesión de plaquetas a colágeno en flujo por Fab-mAb anti integrina oc2. Se incubó sangre humana anti coagulada durante 10 minutos con colorante DiOC6(3) y diluciones seriadas de Fab anti integrina a2 a 37 °C. Después se hace fluir la muestra a través de capilares recubiertos con colágeno a una tasa de cizallamiento de 3000 s-1. A partir de 10 figuras como ejemplos representativos del área cubierta se calcula la cobertura de superficie. Los valores muestran el porcentaje de inhibición de dicha cobertura de superficie como un efecto dependiente de dosis de Fab anti integrina a2.
La Figura 4 muestra estudios de reactividad cruzada entre especies realizados por análisis de FACS usando un mAb de a2 de sobrenadante de hibridoma y muestras sanguíneas de macaco (Figura 4a y b) y ser humano (Figura 4c y d). Las Figuras 4a y 4c representan controles negativos que usan solamente el anticuerpo secundario sin usar el anticuerpo primario.
Figura 5: La Figura 5a) muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID N°:1) y secuencia codificante (SEC ID N°:12) de la cadena ligera variable del anticuerpo de ratón monoclonal anti integrina cc2 producido por hibridoma. La Figura 5b) muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID N°:2) y secuencia codificante (SEC ID N°:13) de la cadena pesada variable del anticuerpo de ratón monoclonal anti integrina a2. En las secuencias de aminoácidos, las CDR se marcan en negrita y subrayadas.
La Figura 6 muestra las secuencias de aminoácidos de las diferentes CDR del anticuerpo de ratón monoclonal anti integrina a2, en la que la Figura 6a muestra las CDR de cadena pesada y la Figura 6b muestra las CDR de cadena ligera siendo HCDR1 SEC ID N°:3, siendo HCDR2 SEC ID N°:4, siendo HCDR3 SEC ID N°:5, siendo LCDR1 SEC ID N°:6, siendo LCDR2 SEC ID N°:7, siendo LCDR3 SEC ID N°:8.
La Figura 7 muestra las secuencias de las construcciones quiméricas generadas por acoplamiento de la región de cadena ligera variable murina anterior (SEC ID N°: 1) o regiones variables de cadena pesada (SEC ID N°: 2) a (partes de) una región constante humana como se detalla en los Ejemplos. La Figura 7a muestra las secuencias de aminoácidos (SEC ID N°: 9) y codificante (SEC ID N°: 14) de la cadena ligera quimérica, la Figura 7b muestra las secuencias de aminoácidos (SEC ID N°: 10) y codificante (SEC ID N°: 15) de la cadena pesada quimérica, la Figura 7c muestra las secuencias de aminoácidos (SEC ID N°: 11) y codificante (SEC ID N°: 16) del fragmento Fab de cadena pesada quimérico. En las secuencias de aminoácidos, las CDR se han subrayado, la secuencia que representa los dominios variables de a2 se han marcado en negrita y el marcador His está escrito en cursiva.
La Figura 8 muestra las secuencias de aminoácidos de diferentes regiones constantes humanas usadas para generación de las construcciones quiméricas: SEC ID N°:17 es la secuencia de aminoácidos de la proteína IGKC humana, la región constante de cadena ligera de acuerdo con el número de acceso de Swiss-Prot Q502W4 como se usa para la generación de la quimera de cadena ligera de acuerdo con SEC ID N°:9, SEC ID N°:18 es la secuencia de aminoácidos de IGHG4 mutada humana, la región constante de cadena pesada de acuerdo con el número de acceso Swiss-prot P0 861.1 como se usa para la construcción de la quimera de cadena pesada de acuerdo con SEC ID N°:10 (los aminoácidos mutados están marcados en negrita), SEC ID N°:19 es la secuencia de aminoácidos de proteína IGHG1 humana, la región constante de cadena pesada de acuerdo con el número de acceso de Swiss-Prot Q569F4 como se usa para la generación de la quimera del fragmento Fab de cadena pesada de acuerdo con SEC ID N°:11.
La Figura 9 muestra las secuencias de aminoácidos y codificante de integrina cc2 y ß1 humana siendo SEC ID N°: 20 la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora de integrina a2 de acuerdo con NP_002194.2. El dominio I, que se usó para experimentos y se expresó de forma recombinante en E. coli, está subrayado y en negrita. SEC ID N°: 21 es la secuencia codificante de integrina a2 de acuerdo con el número de acceso de NCBI: NM_002203.3, SEC ID N°: 22 es la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora de isoforma 1A de integrina ß1 de acuerdo con el número de acceso de NCBI: NP_002202.2 y SEC ID N°: 23 es la secuencia codificante de la isoforma 1A de integrina ß1 de acuerdo con el número de acceso de NCBI: NM_002211.3.
La Figura 10 muestra las secuencias de aminoácidos y codificante del anticuerpo anti integrina 2 murino original de hibridoma de ratón y verificadas por MS: SEC ID N°: 45 es la secuencia de nucleótidos de ADNc que codifica la LC del mAb anti integrina a2, SEC ID N°: 46 es la secuencia de nucleótidos de ADNc que codifica HC de mAb anti integrina 2, SEC ID N°: 47 es la secuencia de aminoácidos de la LC de mAb anti integrina oc2 como se secreta del hibridoma, SEC ID N°:48 es la secuencia de aminoácidos de la LC de mAb anti integrina a2 como se secreta del hibridoma. SEC ID N°: 53 es la secuencia de aminoácidos de la LC del mAb comparador TMC2206, SEC ID N°: 54 es la secuencia de aminoácidos de la HC del mAb comparador TMC2206.
La Figura 1 1 muestra constantes de disociación de los diferentes anticuerpos anti integrina alfa 2 como se determinó por Biacore. Los resultados muestran una constante de disociación en muchos casos mejor o al menos igual que el mAb TMC2206 La Figura 12 muestra la unión del mAb comparador TMC2206 con el dominio I de integrina al preunido por Fab no humanizado medida usando Biacore (tiempo en (s) segundos (eje x) frente a la diferencia en (UR) unidades de respuesta (eje y)). Como puede observarse a partir de la Figura 12, TMC2206 se une al dominio I de integrina preunido por Fab no humanizado.
La Figura 13 muestra la unión de Fab no humanizado con dominio I de integrina <¾2 preunido por mAb comparador TMC2206 (tiempo en (s) segundos (eje x) frente a la diferencia en (UR) unidades de respuesta (eje y)). Como puede observarse a partir de la Figura 13, Fab no humanizado se une al dominio I de integrina a2 preunido por el mAb comparador TMC2206.
La Figura 14 muestra la inhibición de adhesión de plaquetas a colágeno en condiciones estáticas usando plaquetas lavadas. El lote 660 corresponde a LC1/HC1 , el lote 661 corresponde a LC2/HC2, el lote 662 corresponde a LC3/HC3, el lote 663 corresponde a LC3/HC4, el lote 664 corresponde a LC4/HC5, el lote 665 corresponde a LC4/HC6, el lote 666 corresponde a LC5/HC7 y el lote 667 es el comparador. Los resultados también pueden derivarse de la tabla 12. Los números de lote 660, 662 y 663 muestran inhibición al menos igual o mejor de la lesión de plaquetas a colágeno que mAb TMC2206.
EJEMPLOS Ejemplo 1 : Generación y selección de mAb y Fab anti integrina a2 funcionales.
A - Aislamiento de secuencia de células clonadas de mAb de integrina a.2.
Producción y purificación de mAb de integrina al de hibrídoma Se descongeló un criovial que contenía 2x106 células del banco celular de mAb de integrina a2 rápidamente a 37 °C. Las células se transfirieron a un matraz T-25 cm2 en 5 mi de medio fresco consistente en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (Gibco 31053-028) complementado con FBS 10 %, ITS 1X (Gibco 41 400-045), piruvato sódico 1 X (Gibco 11 360-039), ácido oxaloacético 150 µg/ml, glutamina 2 mM (Gibco 25030-024) y penicilina/estreptomicina 100 U/ml (Gibco 15070-063) en un incubador a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 5 % en aire en una plataforma de agitación orbital que rotaba a 1 10 rpm.
La caracterización de isotipos de mAb purificado de hibridoma se realizó usando el kit de caracterización de isotipos comercial convencional de Serotec (Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit; ref. MMT1 ) y reveló un isotipo mlgG2a mCk.
Las células se subcultivaron cada 2 a 3 días para amplificación celular. Para la producción, las células se inocularon a 1,8 x 105 C/ml en Medio de Dulbecco Modificado por Iscove (Sigma I3390) complementado con FBS 10 %, ITS 1X, piruvato sódico 1 X, ácido oxaloacético 150 µg/ml1 glutamina 2 mM y penicilina/estreptomicina 100 U/ml en seis matraces T500 (200 ma durante 10 días.
Para purificación, el mAb anti integrina a2 se capturó directamente del sobrenadante en la cromatografía de afinidad de Proteína G (Hitrap Protein G, GE Healthcare) y se eluyó por ácido acético 0,1 M. Después de pulir la proteína por SEC usando un Superdex 200 (GE Healthcare) y ultrafiltración la proteína se usó en los experimentos indicados.
Determinación de la secuencia de las cadenas pesadas y ligeras del mAb de integrina a2 El ADNc que codifica los dominios variables del anticuerpo monoclonal se obtuvieron como sigue: se extrajo ARNm de células de hibridoma con el kit Oligotex de Qiagen. El ADNc correspondiente se amplificó por RT-PCR por el método RACE utilizando el kit Gene Racer (Invitrogen), la transcriptasa SuperScript III a 55 °C (Invitrogen) y cebadores descritos en la Tabla 1 (RACEMOG2a o CKFOR). Los fragmentos de ADNc se amplificaron por PCR con la polimerasa Phusion a 55 °C (Finnzymes) y cebadores también descritos en la Tabla 1.
Tabla 1. Cebadores usados para RT-PCR y PCR Los fragmentos amplificados que codifican las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) se clonaron en plásmidos pCR4-Topo de Invitrogen que se amplificaron en E. coli. Después se secuenció el ADNc clonado en ambas hebras.
Las secuencias proteicas se tradujeron a partir de secuencias codificantes plasmídicas y se calcularon las masas de las cadenas pesada (HC) y ligera (IX) (Tabla 2). Los valores obtenidos estaban en perfecto acuerdo con los datos de espectrometría de masas obtenidos de la preparación de mAb purificada a partir de cultivo del hibridoma correspondiente, véase Tabla 2. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de HC y LC se indican en la lista de secuencias como sigue: SEC ID N° 46 y 48 corresponden a la HC del mAb de integrina a2 purificado a partir de sobrenadante de hibridoma y SEC ID N° 45 y 47 corresponden a la LC de mAb de integrina cc2 purificada a partir del sobrenadante de hibridoma.
Tabla 2: Análisis de espectrometría de masas de mAb de integrina a2 de hibridoma B - Determinación de las secuencias de la CDR de los mAb anti integrina a2.
Las secuencias para las regiones CDR se dedujeron a partir de la secuencia proteica usando la nomenclatura KABAT.
Para la HC, CDR1 corresponde a SEC ID N°: 3, CDR2 corresponde a SEC ID N°: 4, CDR3 corresponde a SEC ID N°: 5.
Para la LC, CDR1 corresponde a SEC ID N°: 6, CDR2 corresponde a SEC ID N°: 7, CDR3 corresponde a SEC ID N°: 8.
C - Generación de plásmidos de expresión de mAb anti integrina a2 quiméricos.
La cadena pesada y ligera variable del mAb anti integrina oc2 se generó por PCR, usando el SuperMix AccuPrimePfx (Invitrogen; Cat. N°: 12344-040) y el ADNc de cadena ligera y pesada de mAb anti integrina cc2 respectivamente (para generación de ADNc véase anteriormente). En una reacción de PCR de 25 µ?, se ejecutaron 5 ciclos con los cebadores a2 mAb-VH DIR e INV (cadena pesada) o los cebadores cc2 mAb-VL DIR e INV (cadena ligera) (95 °C, 15 segundos; 62 °C, 30 segundos; 68 °C, 1 minuto). Para introducir la secuencia líder se usaron 0,5 µ? de cada una de las primeras muestras de PCR como un molde para una segunda PCR con Líder DIR 1-54 y los cebadores 2mAB-VL (o -VH) INV usando las mismas condiciones de PCR que para la primera PCR. Finalmente, se usaron 0,5 µ? de la segunda PCR como un molde para una tercera PCR realizando 25 ciclos con líder DIR 1-23 y los cebadores de mAb -VL (o -VH) INV de integrina a2 usando las mismas condiciones de PCR que para la primer reacción. Los productos de PCR de la tercera PCR se purificaron usando el kit de purificación de PCR (Qiagen, Cat. N° 28104) como se describe en el protocolo del kit. Los productos de PCR se clonaron en el pCR2.1-TOPO usando el kit de clonación TOPO TA de Invitrogen (Cat N° 450001) como se describe en el manual del proveedor y se secuenciaron usando los cebadores directo M13 e inverso M13 incluidos en el kit de clonación.
Las secuencias de la cadena pesada y ligera variable de anticuerpo cc2 murino pueden obtenerse a partir de la Figura N°: 5 refiriéndose SEC ID N°: 1 a la secuencia de aminoácidos, refiriéndose SEC ID N°: 12 a la secuencia codificante del dominio variable de cadena ligera, refiriéndose SEC ID N°: 2 a la secuencia de aminoácidos y refiriéndose SEC ID N°: 13 a la secuencia codificante del dominio variable de cadena pesada.
El dominio variable ligero (de acuerdo con SEC ID N°:1) se fusionó con la cadena ligera constante (IGKC, Swiss-Prot: Q502W4), digiriendo la VL con Nhel/BsiWI e IGKC BsiWI/HindIII dando lugar a la quimera de cadena ligera VL-IGKC del anticuerpo de a2 de acuerdo con SEC ID N°: 9 y 14. Esta fusión se ligó en los sitios Nhel/Hindlll del vector de expresión episomal pXL (Durocher et al. (2002), Nucí. Acids Res. 30(2)), E9, creando el plásmido de expresión de mamífero de la cadena ligera de anticuerpo de a2 quimérico "pFF0033_pXLc-Ascll-IGKC" como está depositado en DSMZ con el N° de acceso DSM 23944.
El dominio variable pesado (de acuerdo con SEC ID N°: 2) se fusionó con una variante mutada de la cadena pesada constante humana (IGHG4, Swiss-Prot P01861, S108P, L115E) dando lugar a la quimera de cadena pesada constante VH-IGHG4 de ¡ntegrina oc2 de acuerdo con SEC ID N°: 10/15 o para crear un Fab, fusionado con un dominio CH1 marcado con His 6x de la IGHG1 constante humana (Swiss-Prot: Q569F4) dando lugar a la quimera de Fab de cadena pesada constante VH-IGHG1 de integrina al de acuerdo con SEC ID N°: 1 1/16. Para este fin, la VH se digirió con Nhel/ApaLI y se fusionó con el dominio CH1 marcado con His o IGHG4 digerido con Apal/Hindlll respectivamente. Esta fusión se ligó en los sitios de Nhel/Hindlll del vector de expresión episomal pXL, creando respectivamente para el plásmido de expresión de mamífero de la cadena pesada de anticuerpo al quimérico lgG4 "pFF0036_pXLc-Ascll-IGHG4" como está depositado en DSMZ con el acceso DSM 23946 o para el plásmido de expresión de mamífero de la cadena pesada de anticuerpo al quimérico-Fab "pFF0035_pXLc-Ascll-CH1-Hi" como está depositado en DSMZ con el N° de acceso DSM 23945.
Los diferentes plásmidos se han depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig con los siguientes números de acceso: DSM 23945 (plásmido para expresión eucariota del fragmento Fab de cadena pesada de anticuerpo anti al quimérico), DSM 23946 (plásmido para la expresión de la cadena pesada de lgG4 de anticuerpo anti al quimérico) y DSM 23944 (plásmido para la expresión de la cadena ligera IGKC del anticuerpo anti al quimérico).
Secuencias de los Cebadores usados anteriormente SEC ID N° cc2 mAb-VL DIR: CTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCAACATTGTGCTGACCCAA TCTC 27 cx2 mAb -VL INV: ACCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCC 28 a2 mAb mAb-VH DIR: CTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGCCAGGTCCAACTGCATCA GCCTG 29 a2mAB mAb-VH INV: TAGGGCCCTTGGTG CTG G CTGAG G AGACTGTG AGAGTG G 30 Líder para 1-54: GCTAGCACCATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACC GCCAC 31 Líder para 1-23: CAAGCTAGCACCATGGGCTGGTCCTG 32 Ejemplo 2: Propiedades de mAb y Fab anti integrina a2 A - Producción de mAb y fragmentos Fab anti integrina a2 recombinantes Expresión de moléculas de lgG4 anti integrina a2 y Fab anti integrina a2 quiméricas Los plásmidos de expresión que codifican la cadena pesada y ligera del anticuerpo se propagaron en E. coli DH5a. Los plásmidos usados para la transfección se prepararon a través de E. coli usando el Kit Qiagen EndoFree Plasmid Mega.
Se transfectaron células HEK 293-FS que crecían en Medio Freestyle (Invitrogen) con plásmidos LC y HC indicados usando reactivo de transmisión Fugene (Roche). Después de 7 días las células se retiraron por centrifugación y el sobrenadante se pasó sobre un filtro de 0,22 µp? para retirar partículas.
Purificación de moléculas de lgG4 anti integrina a2 y Fab anti integrina a2 quiméricas Se purificó proteína lgG4 por cromatografía de afinidad en proteína A (HiTrap Protein A HP Columns, GE Life Sciences). Después de elución de la columna con tampón de acetato 100 mM con NaCI 100 mM pH 3,5, los anticuerpos monoclonales se desalaron usando columnas de desalación HiPrep 26/10, formuladas en PBS a una concentración de 1 mg/ml y filtradas en 0,22 µ?t?.
Las proteínas Fab se purificaron por IMAC en Columnas HiTrap IMAC HP (GE Life Sciences). Después de la elución de la columna con un gradiente lineal (tampón de elución: fosfato sódico 20 mM, NaCI 0,5 M, imidazol 50-500 mM, pH 7,4), las fracciones que contenían proteínas se agruparon y se desalaron usando Columnas de Desalación HiPrep 26/10, formuladas en PBS a una concentración de 1 mg/ml y se filtraron a 0,22 µ??.
La concentración de proteína se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm. Cada lote se analizó usando un kit Protein 200 Plus LabChip en el bioanalizador Agilent 2100 en condiciones reductoras y no reductoras para determinar la pureza y el peso molecular de cada subunidad y del monómero.
B - Propiedades de unión del mAb o Fab anti integrina ct2.
Se usó tecnología de resonancia de plasmón superficial en un Biacore 3000 (GE Healthcare) para caracterización cinética detallada del anticuerpo purificado y el fragmento Fab correspondiente. Se usó un ensayo de unión directa con el anticuerpo o el fragmento Fab anti integrina como ligando y el dominio I de integrina a2ß1 como analito. Típicamente, se inmovilizaron 600 UR de anticuerpo o fragmento Fab en una microplaca CM5 de uso en investigación por acoplamiento reactivo de amina, dando como resultado una Rmax de 80 y 140 UR para el dominio I unido al anticuerpo y el fragmento Fab, respectivamente. La cinética de unión se midió sobre un intervalo de concentración entre 0,4 a 28 nM de dominio I en tampón HBS-P complementado con MgCI2 4 mM (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCI 150 mM, Tensioactivo P20 0,005 %) a un caudal de 30 µ?/minuto. Las superficies de microplacas se regeneraron con glicina 10 mM pH 2,2. Se analizaron los parámetros cinéticos y se calcularon en el paquete de programas BIAevaluation (versión 4.1) usando una celda de flujo sin anticuerpo o fragmento Fab anti integrina inmovilizado como referencia. Se aplicó un modelo de unión 1 :1 con transferencia de masas para un ajuste global de los datos para curvas correspondientes a concentraciones de analitos de 0,4-28 nM del anticuerpo o fragmento Fab.
Tabla 3: Las cinéticas de unión de mAb y fragmento Fab anti integrina a2 contra el dominio I de integrina El Fab y mAb de bloqueo presentaron afinidades en el intervalo nanomolar al dominio a2ß1 humano (Tabla 3).
Para evaluar adicionalmente las propiedades de unión del mAb anti integrina a2, se realizó un ensayo basado en células con células HUVEC (promocell C12200, lote 6062203). Se recubrieron placas de alta unión con las células (Meso Scale Discovery (MSD), L15XB-3) en PBS (10.000 células/pocilio) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después las placas se vaciaron, se lavaron dos veces con PBS y se bloquearon con solución de bloqueo (MSD, R93BA-4) durante 90 minutos. Después de vaciar y lavar las placas otra vez como se ha descrito anteriormente, se añadieron diluciones seriadas de mAb anti cc2 y se incubaron con las células durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de otra etapa de lavado como anteriormente, se añadió tampón de Lectura T sin tensioactivo (Meso scale Discovery, R92TD-2). La electroquimioluminiscencia se leyó en un dispositivo adecuado (Meso scale Discovery, Sector imager). Se usó un análisis de representación de Scatchard para determinar la KD de los mAb ensayados (véase Figura 1).
C - Propiedades de reactividad cruzada del mAb anti integrina a2 El mAb anti integrina a2 se evaluó con respecto a su capacidad para interaccionar específicamente con plaquetas de macaco y hombre por medio de experimentos de FACS usando muestras de sangre o plaquetas humanas. El mAb se incubó con muestras de sangre humana, sangre de macaco o plaquetas humanas y con mAb secundarios acoplados con Ficoeritrina (PE) anti-lgG de ratón de cabra (Beckman Coulter N° 731856). Las muestras se trataron con Solución de Usado (BD N° 349202) y las plaquetas se centrifugaron, se resuspendieron y se analizaron por FACS.
El mAb anti integrina a2 mostró una reactividad similar con muestras sanguíneas de Macaca fascicularís (97,3 % de positivos, Figura 4b) que con muestra sanguínea completa humana (>98 % positivos, Figura 4d), mientras que no se ha detectado reactividad contra integrina a2ß1 de ratón, rata, perro, cobaya, cerdo o conejo como se ensayó con sangre completa de esas especies (datos no mostrados). Por lo tanto, de acuerdo con los análisis de FACS, parece existir una reactividad cruzada entre especies del anticuerpo con integrina a2ß1 de primate en plaquetas de sangre de macaco, mientras que no se ha detectado reactividad cruzada contra integrina a2ß1 de ratón, rata, perro, cobaya, cerdo o conejo como se ha ensayado con sangre completa de estas especies.
Ejemplo 3- Humanización y modificación por ingeniería genética del dominio Fv de IgG y Fab anti a2 Humanización Los modelos de homología 3D de las secuencias VL y VH del anticuerpo mAb anti integrina a2 se construyeron usando la aplicación de modelado de anticuerpos en MOE 2008. Se identificaron varios moldes de PDB para construir los armazones LC y HC y los bucles CDR. Todos los moldes tenían una identidad por encima de 83 % frente a las secuencias de mAb anti integrina a2 de VL y VH, excepto el mejor molde frente al bucle H3 (56 % de identidad). Los modelos de LC y HC resultantes se minimizaron posteriormente con respecto a su energía usando el procedimiento convencional implementado en MOE. Se realizó posteriormente un cálculo dinámico molecular (MD) del modelo de homología 3D minimizado de la VLA H murina, con restricciones en la cadena principal de proteína y una temperatura de 500 K durante 1 ,1 nanosegundos en disolvente implícito de Born Generalizado. Se extrajeron 10 conformaciones diversas de este primer ciclo de MD cada 100 ps para el último 1 ns. Se sometió después cada una de estas 10 conformaciones diversas a un MD, sin restricciones en la cadena principal de proteína y a una temperatura de 300K, durante 2, 3 nanosegundos en disolvente implícito de Born Generalizado. Para cada uno de los 10 ciclos de MD, las últimas 2.000 instantáneas, una cada picosegundo, de la trayectoria de MD se usaron después para calcular, para cada aminoácido de mAb anti ¡ntegrina a2, sus desviaciones del valor cuadrático medio (rmsd) en comparación con una posición medoide de referencia. Comparando la rmsd media de los 0 ciclos de MD separados de un aminoácido dado con la rmsd media global de todos los aminoácidos murinos de mAb anti ¡ntegrina al, se decide si el aminoácido es suficientemente flexible, como se ve durante el MD, para considerar que interacciona probablemente con receptores de linfocitos T y responsable de la activación de la respuesta inmune. Finalmente se identifican 64 aminoácidos como flexibles en el anticuerpo mAb anti ¡ntegrina a.2, de los que 34 no se localizan en las CDR o sus alrededores inmediatos (5 A). Los aminoácidos localizados en la zona "Vernier" tampoco se consideran (J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499).
El movimiento de la mayoría de los 34 aminoácidos de mAb anti ¡ntegrina a2 (excluyendo la región CDR+5Á), durante los 20 ns (10x2ns), se compara después con el movimiento de los aminoácidos flexibles correspondientes de 49 modelos de homología de línea germinal humanos, para cada uno de los cuales se ejecutaron las simulaciones de MD de 10x2ns. Los 49 modelos de línea germinal humana se construyeron combinando sistemáticamente las 7 cadenas ligeras de línea germinal humana más habituales (vk1 , vk2, vk3, vk4, vlambdal , vlambda2, vlambda3) y las 7 cadenas pesadas de línea germinal humana más habituales (vhla, vhl b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6). El anticuerpo de línea germinal humana vk1-vhl b mostró una similitud de 4D de 62 % de sus aminoácidos flexibles en comparación con los aminoácidos flexibles del mAb anti integrina a2; el anticuerpo de línea germinal vk1-vh1 b se usó por lo tanto para humanizar el anticuerpo mAb anti integrina a2 centrándose en los aminoácidos flexibles. Para la asociación de aminoácidos por parejas entre mAb anti integrina ct2 y los aminoácidos de vk1-vh1b, las dos secuencias se alinearon basándose en la superposición tridimensional óptima de los carbonos a de los 2 modelos de homología correspondientes.
Estabilización Se propone originalmente que los aminoácidos de las cadenas ligera y pesada con baja frecuencia de aparición frente a sus secuencias canónicas respectivas, excluyendo las CDR, se muten a los aminoácidos más frecuentemente hallados (AAGth > 0.5 kcal/mol; [E. Monsellier, H. Bedouelle. Improving the stability of an antibody variable fragment by a combination of knowledge-based approaches: validation and mechanisms. J. Mol. Biol. 2006, 362,580-593]). Una primera lista de mutaciones consenso para la LC y para la HC se ha restringido a los aminoácidos hallados en la línea germinal humana más cercana (es decir vk1-vh1b), es decir a 4 mutaciones potenciales en la LC y 3 en la HC. Ninguna de estas mutaciones se localiza en las CDR, sus alrededores inmediatos (+5 Ángstrom) o en la zona "Vernier" (J. Mol. Biol. 1992, 224, 487-499). Se han tenido en cuenta otros criterios para considerar estas mutaciones consenso para estabilizar potencialmente el anticuerpo anti integrina a2. Estos criterios son un cambio favorable de hidropatía en la superficie o una estabilización predicha basada en la mecánica molecular del muíante.
Humanización por Injerto La humanización comienza identificando las líneas germinales humanas más cercanas a, respectivamente, las cadenas ligera y pesada de mAb anti integrina a2. Esto se hace realizando una búsqueda de BLAST frente a todas las líneas germinales humanas que se enumeran sistemáticamente (todas las combinaciones posibles de los dominios V y J para las cadenas kappa y lambda; dominios V, D y J para las cadenas pesadas). Las búsquedas de BLAST se realizaron usando una aplicación de intranet interna.
Las siguientes líneas germinales humanas más cercanas se identificaron con respectivamente 77 % y 68 % de identidad con las cadenas ligera y pesada anti integrina al: a2 le NIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVE SYGNSFIYWY QQKPGQAPKL LIYLASNLAS IGLKV79 IGLKJ2 DIVLTQSPAS LAVSPGQRAT ITCRASESVS FLGINLIHWY QQKPGQPPKL LIYQASNKDT a2 le GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY TFGGGTKLEI K IGLKV79 IGLKJ2 GVPARFSGSG SGTDFTLTIN PVEANDTANY YCLQSKNFPY TFGQGTKLEI K a2 he QVQLHQPGAE LVKPGAPVKL SCKASGYTFT SYWMNWVKQR PGRGLEWIGR IDPSDSETHY IGHV1 1 IGHD33 IGHJ QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT 8 SYYMHWVRQA PGQGLEWMGI INPSGGSTSY a2 he NQKFKDKATL TVDKSSSTAY IQLSSLTSED SAVYYCAKVG RGYFDYWGQG TTLTVSS IGHV11 IGHD33 IGHJ AQKFQGRVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED 8 TAVYYCARL- TGYFDYWGQG TLVTVSS IGLKV79JGLKJ2 corresponde a SEC ID N°: 49. IGHV1 1JGHD33JGHJ8 corresponde a SEC ID N°: 50.
Las mutaciones humanizadoras se obtienen realizando una comparación por pares de las 2 secuencias alineadas, excluyendo los restos de zona de Vernier y CDR (numeración de Kabat).
Mutación de motivos de secuencia no deseados Se consideraron los siguientes motivos de secuencias: Asp-Pro (enlace lábil ácido), Asn-X-Ser/Thr (glucosilación, X = cualquier aminoácido excepto Pro), Asp-Gly/Ser/Thr (formación de iso-asp/succinimida en áreas flexibles), Asn-Gly/His/Ser/Ala/Cys (sitio de desamidación expuestos), Met (oxidación en área expuesta). Las secuencias humanizadas resultantes se compararon por blast con respecto a similitud de secuencia frente a la base de datos IEDB (http://www.immuneepitope.org/home.do; versión de junio de 2009) para asegurar que ninguna de las secuencias contenga ningún epítopo linfocito T o B conocido. 1. Secuencias originales de los dominios variables anti-integrina a2b1 a. Cadena ligera (las CDR+5A están destacadas, un motivo problemático potencial NS en la región CDR subrayado) NIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVE SYGNSFIYWY QQKPGQAPKL LIYLASNLAS GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY TFGGGTKLEI K b. Cadena pesada (las CDR+5Á están destacadas, un sitio problemático en la región CDR [sitio de formación de iso-Asp y succinimida DS1 subrayado) QVQLHQPGAE LVKPGAPVKL SCKASGYTFT SYWMNWVKQR PGRGLEWIGR IDPSDSETHY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY IQLSSLTSED SAVYYCAKVG RGYFDYWGQG TTLTVSS Secuencias obtenidas por ingeniería genética Se diseñaron cinco versiones para la cadena ligera (variantes de cadena ligera LC1, LC2, LC3, LC4, LC5) y siete versiones para la cadena pesada (variantes de cadena pesada HC1 , HC2, HC3, HC4, HC5, H6, H7). La versión LC1 presenta cuatro mutaciones que derivan de la comparación directa entre los aminoácidos más flexibles no CDR de la cadena ligera de mAb anti-integrina a 2 y la cadena ligera de línea germinal humana VK1. La versión LC2 incluye una mutación adicional para retirar un sitio de desamidación potencial en la región CDR (N34Q). La versión LC3 incluye mutaciones humanizadoras y estabilizad oras que se predice que estabilizan óptimamente la cadena ligera de mAb anti-integrina a2. La versión LC4 incluye una mutación adicional para retirar el sitio de desamidación potencial (N34Q). La versión LC5 presenta 6 mutaciones que derivan del método de injerto.
La versión HC1 presenta 3 mutaciones, que derivan de la comparación directa entre los aminoácidos más flexibles no CDR de la cadena pesada de mAb anti-integrina a 2 y la línea germinal humana VH1b. La versión HC2 incluye otra mutación adicional para retirar un sitio de formación de Asp-lso succinimida potencialmente problemático en la región de CDR (D55E). La versión HC3 incluye mutaciones humanizadoras y estabilizadoras que se predice que estabilizan óptimamente la cadena pesada de mAb anti-integrina 2. La versión HC4 incluye una mutación adicional para afrontar un problema de agregación potencial. La versión HC5 incluye mutaciones de HC3 y una mutación adicional para retirar un sitio de formación de Asp-lso succinimida potencialmente problemático en la i 5 región CDR (D55E). La versión HC6 incluye una mutación adicional para afrontar el problema de agregación potencial. La versión HC7 presenta 20 mutaciones que derivan del método de injerto En total se han preparado siete combinaciones: I o LC1/HC1 (mutaciones que se dirigen solamente a 10 humanización) o LC2/HC2 (mutaciones que se dirigen a mutación y sitio potencialmente problemático de LC/HC [NS y DS]) o LC3/HC3 (mutaciones que se dirigen a humanización y estabilización) 15 o LC3/HC4 (mutaciones que se dirigen a humanización, estabilización y anti-agregación) o LC4/HC5 (mutaciones que se dirigen a humanización, estabilización, sitio potencialmente problemático de LC [NS] y sitio potencialmente problemático de HC [DS] ) 20 o LC4/HC6 (mutaciones que se dirigen a humanización, estabilización, anti-agregación, sitio potencialmente problemático de LC [NS] y sitio potencialmente problemático de HC [DS]) o LC5/HC7 (mutaciones que se dirigen a humanización por injerto) Tabla 4: sumario de las 7 combinaciones LCxHC Tabla 5: Sumario de las mutaciones introducidas para la cadena ligera obtenida por ingeniería genética del Fab anti-a2pi Tabla 6: Mutaciones de las 7 variantes de HC del anticuerpo anti-integrina a 2 Se generaron secuencias variables humanizadas por síntesis génica y se clonaron en los vectores de expresión de cadena pesada y ligera correspondientes como se describe en el Ejemplo 1C.
Secuencias de cadena ligera obtenidas por ingeniería genética Se clonaron cinco versiones variantes de cadena ligera (LC1 , LC2, LC3, LC4, LC5). Las mutaciones introducidas a través de ingeniería genética de las cadenas variables están destacadas o subrayadas.
LC1 (mutaciones humanizadoras subrayadas en negrita): NIVLTQSPSS LAVSVGQRAT ISCRASESVE SYGNSFIYWY QQKPGKAPKL LIYLASNLAS GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVQADDAATY YCQQNNEDPY TFGGGTKLEI K (SEC ID N°: 33) LC2 (las mutaciones humanizadoras están destacadas, las mutaciones para el sitio NS de CDR subrayadas): NIVLTQSPSS LAVSVGQRAT ISCRASESVE SYGQSFIYWY QQKPGKAPKL LIYLASNLAS GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVQADDAATY YCQQNNEDPY TFGGGTKLEI K (SEC ID N°: 34) LC3 (las mutaciones humanizadoras y estabilizadores están destacadas): NIVLTQSPSS LSVSVGQRAT ISCRASESVE SYGNSFIYWY QQKPGQAPKL LIYLASNLAS GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVQAEDAATY 5 YCQQNNEDPY TFGGGTKLEI K (SEC ID N°: 35) LC4 (las mutaciones humanizadoras y estabilizadores están destacadas, la mutación para el sitio NS de CDR subrayada en negrita): I 10 NIVLTQSPSS LSVSVGQRAT ISCRASESVE SYGQSFIYWY i QQKPGQAPKL LIYLASNLAS GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVQAEDAATY YCQQNNEDPY TFGGGTKLEI K (SEC ID N°: 36) LC5 (las mutaciones injertadas están destacadas): 15 NIVLTQSPAS LAVSPGQRAT ITCRASESVE SYGNSFIYWY QQKPGQPPKL LIYLASNLAS GVPARFSGSG SRTDFTLTIN PVEADDTANY YCQQNNEDPY TFGGGTKLEI K (SEC ID N°: 37) A continuación está el alineamiento de la LC anti-integrina a2ß1 20 frente a la línea germinal humana VK1-Vh1 b: LC_anti_a2b1 NIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVE SYGNSFIYWY QQKPGQAPKL Vk LC DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLN— WY QQKPGKAPKL LC_anti_a2b1 LIYLASNLAS GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY VklLC LIYAASSLQS GVPSRFSGSG SGTDFTLTIS SLQPEDLATY YCQQSYSTPP LC_anti_a2b1 TFGGGTKLEI K- VklLC TFGQGTKVEI KR (SEC ID N°: 51) Secuencias de cadena pesada obtenidas por ingeniería genética Se clonaron siete versiones de variantes de cadena pesada (HC1 , HC2, HC3, HC4, HC5, HC6, HC7). Las mutaciones introducidas a través de ingeniería genética de las cadenas variables están destacadas.
HC1 (mutaciones humanizadoras destacadas): QVQLHQPGAE LVKPGAPVKL SCKASGYTFT SYWMNWVKQR PGQGLEWIGR IDPSDSETHY NQKFKDRATL TVDKSSSTAY IQLSSLTSED SAVYYCAKVG RGYFDYWGQG TTLTWS (SEC ID N°: 38) HC2 (las mutaciones humanizadoras están destacadas, motivos potencialmente problemáticos [sitio DS de CDR]): QVQLHQPGAE LVKPGAPVKL SCKASGYTFT SYWMNWVKQR PGQGLEWIGR IDPSESETHY NQKFKDRATL TVDKSSSTAY IQLSSLTSED SAVYYCAKVG RGYFDYWGQG TTLTWS (SEC ID N°: 39) HC3 (las mutaciones humanizadoras y estabilizadoras destacadas): QVQLHQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT SYWMNWVKQR PGRGLEWIGR IDPSDSETHY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY IQLSSLTSED SAVYYCAKVG RGYFDYWGQG TTLTWS (SEC ID N°: 40) HC4 (las mutaciones humanizadoras y estabilizadoras están destacadas, mutación anti-agregación): QVQLHQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT SYWMNWVKQR PGRGLEWIGR IDPSDSETHY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY IQLSSLTSED SAKYYCAKVG RGYFDYWGQG TTLTWS (SEC ID N°: 41) HC5 (las mutaciones humanizadoras y estabilizadoras están destacadas, motivos potencialmente problemáticos [sitio DS de CDR]): QVQLHQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT SYWMNWVKQR PGRGLEWIGR IDPSESETHY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY IQLSSLTSED SAVYYCAKVG RGYFDYWGQG TTLTWS (SEC ID N°: 42) HC6 (las mutaciones humanizadoras y estabilizadoras están destacadas, motivos potencialmente problemáticos [sitio DS de CDR], mutación anti-agregación): QVQLHQPGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT SYWMNVWKQR PGRGLEWIGR IDPSESETHY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY IQLSSLTSED SA YYCAKVG RGYFDYWGQG TTLTWS (SEC ID N°: 43) HC7 (las mutaciones injertadas están destacadas): QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT S YWM NWVRQA PGQGLEWIGR IDPSDSETHY AQKFQGRATL TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAKVG RGYFDYWGQG TLVTVSS (SEC ID N°: 44) A continuación está el alineamiento de mAb anti-integrina a21 de HC frente a la línea germinal humana Vk1_Vh1 b: HC2_anti_a2 QVQLHQPGAE LVKPGAPVKL SCKASGYTFT SYWMNVWKQR PGRGLEWIGR Vh1 b QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYYMHWVRQA PGQGLEWMGW HC2_anti_a2 IDPSDSETHY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY IQLSSLTSED SAVYYCAKVG Vh1 b INPNSGGTNY AQKFQGRVTM TRDKSSSTAY MELSSLRSED TAVYYCARWG HC2_anti_a2 RGY F DYWGQGTTLT VSS Vh1b YDYDVFYYAM DYWGQGTLVT VSS (SEC ID N°: 52) Las cadenas pesada y ligera variables de cada variante de mAb anti-integrina a2 (5 cadenas ligeras diferentes: VL1-VL5 y 7 siete cadenas pesadas diferentes: VH1-VH7) se generaron por síntesis génica incluyendo una secuencia 5'UTR (5'-GTGCACAGC-3') con ApaLI y una 3'UTR (5 -GCTTCCACCAAGGGCCC-3') con Apal (cadena pesada) o BsiWI (cadena ligera). Los dominios pesados variables se ligaron a los sitios ApaLI/Apal de un vector de expresión pXL modificado que contiene una variante mutada de la cadena pesada constante humana (IGHG4, Swiss-Prot P01861 , S108P, L115E) dando lugar a un mAb de cadena pesada constante VH-IGHG4 anti-integrina a2.
Los dominios ligeros variables se ligaron a los sitios ApaLI/BsiWI de un vector de expresión pXL modificado que contiene la cadena ligera constante humana (IGKC, Swiss-Prot: Q502W4) dando lugar a un mAb de cadena ligera constante VL-IGKC anti-integrina a2. El procedimiento completo de síntesis génica, clonación y producción de ADN se realizó por un proveedor comercial (Geneart AG).
Para comparación, se usó un anticuerpo anti-integrina alfa-2 hlgG4 humanizado conocido en la técnica (TMC2206) ("el comparador"). Las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada del comparador se enumeran en la presente memoria como SEC ID N°: 53 y 54 en la Figura 10e.
Tabla 7: Lista de variantes de humanización de mAb anti-integrina a2 Para verificar las secuencias, los mAb se analizaron usando espectrometría de masas. Para mediciones de masa intactas la muestra se atrapó durante 20 minutos y se desaló con 20 µ?/min en una columna de trampa monolítica con Acetonitrilo 2 %/TFA 0,1 % (v/v) antes de elución con un gradiente que variaba de Eluyente A 15 % (H20 TFA 0,05 %) a Eluyente B 50 % (Acetonitrilo TFA 0,05 %).
La muestra se separó actuando en nanoflujo (300 nl/min) en una columna monolítica (PS-DVB; 100 µ?? I.D. x 5 cm) con una temperatura de 37 °C. La introducción de la muestra se llevó a cabo usando agujas de electropulverización de nuevo objetivo con un diámetro exterior de 365 µp?, diámetro interior de 75 µ?? y un diámetro del extremo de la punta de 15 µ?? más gas de protección. Después de la adquisición los espectros se sumaron sobre el intervalo temporal correspondiente y se sometieron a desconvolución usando la herramienta de reconstrucción proteica suministrada con BioAnalyst de Applied Biosystems/MDS Sciex.
Se tradujeron secuencias proteicas de secuencias codificantes de plásmido y se calcularon las masas de HC y LC (Tabla 8).
Tabla 8: Análisis espectrométrico de masas de los mAb anti-integrina 2 humanizados purificados.
Los valores observados estuvieron en concordancia con las masas calculadas y verifican las construcciones clonadas.
Ejemplo 4 - Evaluación de mAb de integrina <x2 en ensayos basados en células y bioquímicos in vitro Para el Ensayo de Fase Sólida, se inmovilizó integrina (dominio ct2-l: dominio a2-l GST aminoácidos 140-339 en TBS/Mn2+ 5 mM, 50 µ?/pocillo) en una placa de 96 pocilios (Corning Costar, 3690), a temperatura ambiente durante una noche. Después, se añadió solución de bloqueo 25 µ?/pocillo (BSA 5 % (en bruto) (A7906), TBS 1x) y se descartó. Se añadieron 200 µ?/pocillo de solución de bloqueo y se dejaron durante 3 h a temperatura ambiente. Después de una etapa de lavado (3 veces con tampón de lavado 200 µ?/pocillo: TBS 1x y BSA 0,1 % (A7638) y Mn2+ 2mM; TBS: NaCI 150 mM, Tris 25 mM (Fluka 93371) pH 7,4), las muestras se incubaron a TA durante 3 h en reposo con 50 µ? de: a) colágeno biotinilado solamente - control (10 µ? de tampón de unión y 40 µ? de colágeno biotinilado) b) 10 µ?/pocillo de compuesto, 40 µ?/pocillo de colágeno biotinilado c) Blanco: 50 µ?/pocillo de tampón de unión Después de una etapa de lavado (3 veces con 200 µ?/pocillo de tampón de unión), las muestras se incubaron con 50 µ?/pocillo de Peroxidasa ExtrAvidin (conjugado de Peroxidasa, Sigma E2886; 1:500 en tampón de unión) durante 30 minutos a TA y se lavaron de nuevo 4 veces con 200 µ?/pocillo de tampón de unión. Después de la adición de 50 µ?/pocillo de sustrato de peroxidasa (solución ABTS; ácido 2,2'-Azino-bis 3-Etilbenztiazolin-6-sulfónico), Sigma A-1888; 275 µ? (11 mg de ABTS disueltos en 0,5 mi de dH20; y 5,5 mi de acetato sódico 0,1 M (Sigma S-3272)/NaH2P04 0,05 M (Riedel de Haen 04270) pH 5,0; y 55 µ? de H202 Sigma H-1009 (10 µ? (= 30 %) y 1045 µ? de dH20) durante 10 - 30 minutos a TA, en reposo (hasta que se obtuvo una tinción verde) y adición de 50 µ?/pocillo de SDS 2 %, se leyó la absorbancia a 405 nm (SpectraMax 190). El % de inhibición se calculó como 100-((valor medio de los compuestos *100)/valor medio del control positivo de colágeno) después de la resta del blanco.
Tabla 9: Inhibición de interacción de colágeno por mAb de integrina a 2 En resumen, el mAb de ¡ntegrina a 2 no mostró efecto en la interacción de a? ß?/colágeno (ensayo de fase sólida), interacción de a5 i/fibronectina (ensayo de fase sólida), activación de allbb3 (GPMbllla) (ensayo de FACS), expresión de selectina P en hu plt (ensayo de FACS), agregación de plaquetas humanas en sangre completa sola o después de estimulación con ADP, TRAP, colágeno, liberación de LDH-, TNFa-, o IL1 ß -de PBL hu (solo o en combinación con LPS).
Formación de longitud de túbulos de Huvec Para valorar la actividad del mAb anti-integrina a2 en la angiogénesis se realizó un ensayo in vitro con células HUVEC. Se mezcló Matrigel (BD Biosciences, n° 354230) con colágeno de tipo I (BD Biosciences n° 35429) (matrigel 1/3,25, PBS 5x 1/5, colágeno I 1 mg/ml, agua qsp) y se incubó durante 1 h a 37 °C, C02 5 %. Las células HUVEC adherentes se separaron cuidadosamente de los matraces de cultivo con solución de Accutase, se centrifugaron y se suspendieron en medio de cultivo (EBM, FCS 2 %, kit de bala EGF) a 1 ,2 105 células/ml. Se añadieron 100 µ? de la suspensión celular a los pocilios con la matriz en presencia o ausencia de diluciones seriadas de mAb ant¡-oc2 y FGF2 (Peptrotech, 10 ng/ml) y se incubaron durante 18 h a 37 °C, C02 5 %. Para la detección de formación de túbulos se añadió solución de violeta de cresilo y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. La formación de túbulos se determinó midiendo la suma de la longitud de los túbulos por pocilio. Se realizaron cálculos frente al control negativo (sin FGF2) y controles positivos (con FGF2 pero sin mAb anti-a2) usando software Image Proand (MediaCybernetics), midiendo 6 réplicas por condición. Los resultados consecuentes se muestran en la Figura 2. El mAb anti-integrina alfa2 fue capaz de inhibir la angiogénesis inducida por FGF2 de una manera dependiente de dosis.
Ejemplo 5 - Inhibición de adhesión de plaquetas a colágeno por mAb-Fab anti-integrina a2 en condiciones de flujo y estáticas.
Para estudios de interacción proteína-proteína se recubrieron placas de 96 pocilios (Corning Costar 3690) con integrina a2ß1 expresada de forma recombinante o el dominio I de la integrina a2ß1 en tampón TBS durante una noche a 4 °C. Después de retirar por lavado la proteína excesiva, las placas se bloquearon con solución de BSA (Sigma A7906 5 %) y se lavaron de nuevo. Se añadieron diluciones en serie de mAb de integrina a2 a las placas así como colágeno biotinilado (cola de rata, Sigma C8897). Esto se realizó en presencia o ausencia de HSA 4 %. Después de una incubación de 2 h a temperatura ambiente las placas se lavaron de nuevo. Se añadió solución de peroxidasa Extravidin (Sigma E2886) y las placas se incubaron durante 20 minutos en oscuridad. Se realizó medición en un lector de Elisa (SpectraMax190 Molecular Devices) a 405 nM. El porcentaje de inhibición y las CI50 se calcularon frente a patrones conocidos.
Para estudios de unión de plaquetas con colágeno, las placas (Isoplate, Perkin Elmer, F1450 571) se recubrieron con colágeno (Sigma C8897) en TBS durante 1 h a temperatura ambiente. Los pocilios se lavaron con TBS repetidamente antes de que se añadieran diluciones seriadas de mAb anti-integrina a2. Se añadieron plaquetas humanas aisladas o plasma rico en plaquetas humanas de nueva preparación, que se ariticoagularon con hirudina, PGE1 y ReoPro y se marcaron con Calceína AM (C-3099 Molecular Probes) y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz. Después de lavar, las placas se midieron en un lector M5 (Molecular Devices) a 492 nm EX, 535 nm EM. El porcentaje de inhibición y las CI50 se calcularon frente a patrones conocidos.
En experimentos con cizallamiento, se analizó mAb anti-integrina cc2 con respecto a su capacidad para inhibir la adhesión de plaquetas a colágeno en flujo. Se recubrieron capilares de vidrio con colágeno durante una noche a 4 °C. Después de lavar y bloquear con BSA, se instalaron en un dispositivo de flujo. Se marcó sangre humana anticoagulada recién extraída de voluntarios con D¡OC6(3) y se incubó durante 10 minutos con diluciones en serie de mAb anti-integrina a.2 a 37 °C. Se hizo fluir a las muestras a través de los capilares a una tasa de cizallamiento de 3000s-1 imitando el flujo arterial. Después de aclarar los capilares, se tomaron 10 imágenes que representan la superficie del capilar que estaba en contacto con la sangre en flujo. Usando un software de formación de imágenes, se determinó la cobertura de superficie y el porcentaje de inhibición y CI50 se calcularon frente a patrones conocidos.
Para el ensayo de adhesión de trombocitos, se enriquecieron trombocitos como sigue: se centrifugó Hirudina (Refludan 20 g/ml; (Pharmion)) y sangre a 150 g durante 20 minutos para producir sangre humana anticoagulada. Se recogió plasma rico en plaquetas (PRP) y se centrifugó de nuevo y se recogió como anteriormente. Se obtuvo plasma pobre en plaquetas de la sangre restante por centrifugación a 1940 g durante 10 minutos (2 veces). Se añadió PPP a las células diluidas (Mg 2 mM) y se ajustó la concentración de células a 2 x 105/µ?. Se dejaron las células durante 0,5 horas y se diluyeron a 5?10 /µ?. A continuación las células se pusieron en contacto con ReoPro 3 µg/ml (2,5 µg/ml; Centocor B.V., Leiden, NL) (10 min, TA), se añadió MnCI2x4H20 6 mM (5 mM) (incubación durante 10 minutos).
Se prepararon placas como sigue: se incubaron placas (Perkin Elmer, IsoPlate, 1450-571) con 100 µ?/pocillo de colágeno de Tipo I 10 µg/ml (Tipo I de reserva de Sigma C8897 de cola de rata 200 µg ml en ácido acético 0,01 M) a TA durante 1 hora. Después, se lavaron 3 veces con 200 µ?/pocillo de TBS (Tris-HCI 50 mM, pH 7,4, NaCI 120 mM, KCI 2,7 mM, CaCI2 0,05mM, MgCI2 x 6 H20 2 mM, BSA 0,1 %. A continuación, se añadieron 10 µ?/pocillo de compuesto y trombocitos tratados con ReoPro- y Mn (5x104 células/µ?, 50 µ?/pocillo). Las células se incubaron durante 1 ,5 horas (oscuridad) y se lavaron 3 veces con 200 µ?/pocillo de TBS. Se añadió calceína AM 2,5 µ? (50 µ?/pocillo, C-3099, Molecular Probes, PM 994,87, 30 minutos, TA), seguido de una etapa de lavado. La etapa de lectura se llevó a cabo usando un SpectraMax M5: Fluorescencia EX 492 EM 535 Punto de corte: 530 Automático en ausencia de células. El porcentaje de inhibición se calculó como 100-((valor medio de los compuestos*100)/valor medio del control) después de restar el blanco.
Como puede observarse a partir de la figura 3, el mAb anti-integrina a2 inhibe de forma dependiente de dosis la adhesión de plaquetas en estrés de cizallamiento, con una CI50 nanomolar Ejemplo 6 - Comportamiento de agregación de mAb anti-integrina a2 según se determina por cromatografía de exclusión de tamaño Todas las variantes humanizadas y el comparador se ensayaron con respecto al porcentaje de reacción. Se realizó cromatografía de exclusión de tamaños en un explorador ÁKTA 10 (GE Healthcare) usando una columna TSKgel G3000SWXL (7,8 mm ID x 30,0 cm L, TosohBioscience) con una precolumna TSKgel SWXL (TosohBioscience). Se inyectaron 30 µ? de la muestra a 0,4-1 mg/ml y la cromatografía se realizó a 1 ml/min usando Na2SO 100 mM, Na2HP0 100 mM, NaN3 0,05 %, pH 6,7 como tampón de ejecución y un longitud de onda de detección de 280 nm. La columna se calibró usando marcadores de peso molecular de filtración en gel (Sigma Aldrich). Se realizó una evaluación de los datos usando software Unicorn v5.11 (GE Healthcare).
Tabla 10: Porcentaje de agregación de mAb anti-integrina cc2 determinado por cromatografía de exclusión de tamaños Como puede observarse a partir de la tabla 10, todas las variantes ensayadas del mAb de integrina alfa-2 tienen un bajo porcentaje de agregados. Cuando se compararon con el comportamiento de agregación del comparador, todos los anticuerpos de integrina alfa-2 ensayados mostraron valores de porcentaje de agregación menores que el comparador.
Ejemplo 7 - Datos de unión cinética de mAb anti-integrina a2 determinados por Biacore Se usó tecnología de resonancia de plasmón superficial en un Biacore 3000 (GE Healthcare) para una caracterización cinética detallada de los anticuerpos humanizados purificados. Se usó un anticuerpo de captura con el anticuerpo anti-integrina capturado por un anticuerpo específico anti-Fc humano (MAB1302, Millipore) y se usó el dominio I de integrina 2 como analito. Típicamente, se capturaron 120 UR de anticuerpo anti-integrina en CM5 de uso en investigación por el anticuerpo específico anti- Fe humano inmovilizado, dando como resultado una Rmax de 30 UR para el dominio I unido al anticuerpo. El cinética de unión se midió sobre un intervalo de concentraciones entre 0,8 y 25 nM del dominio I en tampón HBS-P complementado con MgCI2 4 mM (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCI 150 mM, tensioactivo P20 0,005 %) a un caudal de 30 µ?/min. Se regeneraron las superficies de microplacas con glicina 10 mM, pH 2,5. Se analizaron los parámetros cinéticos y se calcularon en el paquete de programas BIAevaluation (versión 4.1) usando una celda de flujo con el anticuerpo específico anti- Fe humano como referencia. Se aplicó un modelo de unión 1 :1 con transferencia de masas para un ajuste global de los datos para las curvas correspondientes a las concentraciones de analitos de anticuerpo 0,8-25 nM.
Tabla 11). Tres variantes tienen una KD similar en Biacore que el mAb no humanizado: - combinación LC1/HC1 (Mutaciones que se dirigen solamente a humanización) - combinación LC3/HC3 (Mutaciones que se dirigen a humanización y estabilización) - combinación LC3/HC4 (Mutaciones que se dirigen a humanización, estabilización y anti-agregación).
La mutación variante por injerto es cercana al mAb no humanizado.
Ejemplo 8 - Determinación de epítopos de anticuerpo anti-integrina alfa 2 Para verificar el epítopo del mAb anti-alfa 2 no humanizado con el mAb comparador se realizó caracterización de epítopos usando tecnología de resonancia de plasmón superficial en un Biacore 3000 (GE Healthcare). El fragmento Fab correspondiente al mAb anti-alfa 2 no humanizado se inmovilizó en una microplaca CM5 por acoplamiento reactivo de amina a 500 UR. El dominio I de integrina se capturó por el fragmento Fab a 10 µ?/min y después de un periodo corto de disociación, se permitió que el anticuerpo TMC2206 se uniera a 30 µ?/min al dominio I de ?¾. Se realizó regeneración con tampón de glicina 10 mM, pH 2,0. En un segundo experimento se capturó el mAb comparador TMC2206 en una superficie de anticuerpo específico anti- Fe humano (MAB1302 Millipore). Después se unió el dominio I de integrina seguido del Fab no humanizado. Los resultados pueden obtenerse de las figuras 13 y 14. Los resultados claramente muestran que el anticuerpo comparador TMC2206 se une al dominio I de integrina preunido por Fab no humanizado.
Por lo tanto, el Fab no humanizado se une al dominio I de integrina que está preunido por el mAb comparador TMC2206. La unión simultánea del Fab no humanizado y el mAb comparador con el dominio I de integrina ot2 indica que el epítopo de tanto el Fab como el mAb comparador no son idénticos. Esto indica que el anticuerpo anti-alfa 2 de la presente invención y el anticuerpo comparador son diferentes epítopos dentro de la integrina alfa-2.
Ejemplo 9 - Ensayo de unión de plaquetas en condiciones estáticas usando placas recubiertas con colágeno y plaquetas lavadas o plasma rico en plaquetas.
Como la integrina a2ß1 se expresa en plaquetas de sangre, desempeñando un papel importante en su adhesión a colágeno, se usó un sistema de ensayo in vitro para estudios de unión de plaquetas usando estas células. Para estudios de unión de plaquetas, se recubrieron placas (Isoplate, Perkin Elmer, F1450 571) con colágeno (Sigma C8897) en TBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocilios se lavaron con TBS repetidamente antes de que se añadieran diluciones en serie de mAb anti-integrina a2. Se añadieron plasma con plaquetas humano de nueva preparación o plaquetas humanas recién aisladas, que se anticoagularon con hirudina, PGE1 y ReoPro y se marcaron con Calceína AM (C-3099 Molecular Probes) y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente protegidas de la luz. Después de lavar, las placas se midieron en un lector M5 (Molecular Devices) a 492 nm de Excitación, 535 nm de Emisión. El porcentaje de inhibición y las CI50 se calculan frente a curvas de valoración preparadas usando moléculas pequeñas inhibidoras de integrina alfa 2 o el mAb de alfa 2 no humanizado. Los resultados pueden obtenerse a partir de la Tabla 12.
Tabla 12: Inhibición de la unión de plaquetas lavadas con colágeno Como puede observarse a partir de los resultados mostrados en la Tabla 12, la inhibición de plaquetas presentada por las diferentes variantes de anticuerpo anti- alfa 2 en condiciones estáticas usando plaquetas lavadas es comparable a la del anticuerpo comparador y para algunas variantes (LC3/HC3 o LC3/HC4) incluso significativamente o ligeramente (LC1/HC1 ) más fuerte.
Tabla 13: Inhibición de la unión de plaquetas a colágeno en plasma rico en plaquetas Como puede observarse a partir de los resultados mostrados en la tabla 13, la inhibición de plaquetas presentada por las diferentes variantes del anticuerpo anti- alfa 2 en condiciones estáticas usando plasma rico en plaquetas, variantes LC1/HC1 , LC3/HC3, LC3/HC4 y LC5/HC7 es comparable a la del anticuerpo comparador.
Como puede concluirse a partir de los ensayos de unión de plaquetas estáticos, las formas humanizadas del anticuerpo anti-integrina 02 bloquea la adhesión de plaquetas humanas recién aisladas en presencia o ausencia de plasma sanguíneo de una manera dependiente de concentración. Cuatro de las variantes muestran una actividad inhibidora similar en el bioensayo que el mAb no humanizado: - combinación LC1/HC1 (Mutaciones que se dirigen solamente a humanización) - combinación LC3/HC3 (Mutaciones que se dirigen a humanización y estabilización) - combinación LC3/HC4 (Mutaciones que se dirigen a humanización, estabilización y anti-agregación) - combinación LC5/HC7 (Mutaciones que se dirigen a humanización por injerto) Las tres variantes que se dirigen a los sitios problemáticos (NS; DS) LC2/HC2, LC4/HC5 y LC4/HC6 y que muestran inhibición de plaquetas menor en los experimentos de unión a plaquetas anteriores eran idénticas a las variantes que mostraban actividad de unión a dominio I de alfa 2 más débil que el anticuerpo anti-integrina alfa 2 no humanizado en los anteriores experimentos de Biacore del Ejemplo 7 (véase tabla 11). Por lo tanto, los resultados de los ensayos de unión de plaquetas concuerdan bien con los datos de afinidad de las evaluaciones de Biacore.
Ejemplo 10 - Estabilidad térmica de las diferentes variantes de anticuerpo anti- alfa 2 Los resultados con respecto a estabilidad térmica se resumen en la Tabla 14. Los anticuerpos muestran estabilidad térmica comparable, igual o mejor que el comparador. Las mediciones de termoestabilidad se realizan usando un termociclador de PCR (My-IQ - dos) en un intervalo de temperatura entre 10 y 90 °C con 1 °C/min. Se complementaron 2 microgramos de anticuerpos diluidos en tampón PBS con Naranja 40XSYPRO (Invitrogen).
Tabla 14: estabilidad térmica de las diferentes variantes

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Péptido o complejo peptídico, preferentemente anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que dicho péptido o complejo peptídico, anticuerpo o fragmento se unen específicamente al dominio I de la integrina a2 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento un dominio de región variable de la cadena pesada (VH) y un dominio de región variable de la cadena ligera (VL), en el que dicho anticuerpo o fragmento presenta reactividad cruzada con integrina a2 no humana de primate pero no presenta reactividad cruzada con integrina a2 que no sea de primate. Péptido o complejo peptídico, preferentemente anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, en el que dicho péptido o complejo peptídico, anticuerpo o fragmento se unen específicamente al dominio I de la integrina a2 humana, comprendiendo dicho anticuerpo o fragmento un dominio de región variable de la cadena pesada (VH) y un dominio de región variable de la cadena ligera (VL), en el que dicho anticuerpo o fragmento compite con un anticuerpo de referencia por la unión al epítopo del anticuerpo de referencia, comprendiendo dicho anticuerpo de referencia una cadena ligera codificada por el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de adhesión DSM 23944 y una cadena pesada codificada por (i) el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de adhesión DSM 23946 o bien (ii) el plásmido que está depositado en la DSMZ con el N° de adhesión DSM 23945. Péptido o complejo peptídico, preferentemente anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende uno o más de los siguientes componentes a) a f): a) LCDR1 , en el que LDR1 es RASESVESYGNSFIY (SEC ID N° 6) o una variante funcionalmente activa de la misma, b) LCDR2, en el que LDR2 es LASNLAS (SEC ID N° 7) o una variante funcionalmente activa de la misma, c) LCDR3, en el que LDR3 es QQNNEDPYT (SEC ID N° 8) o una variante funcional activa de la misma, d) HCDR1 , en el que HDR1 es (GYTFTSYWMN, SEC ID N° 3) o una variante funcionalmente activa de la misma, e) HCDR2, en el que HDR2 es RIDPSDSETHYNQKFK (SEC ID N° 4) o una variante funcionalmente activa de la misma, y f) HCDR3, en el que HDR3 es VGRGYFDY (SEC ID N° 5) o una variante funcional activa de la misma, y en el que el uno o más de los componentes a) a f) se disponen para permitir la unión del péptido o complejo peptídico a la integrina a2. Péptido o complejo peptídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-3, (i) en el que los componentes a) a c) están comprendidos en un dominio variable de una cadena ligera (VL); y/o (ii) en el que los componentes d) a f) están comprendidos en un dominio variable de una cadena pesada (VH); y/o (iii) en el que el péptido o complejo peptídico es un anticuerpo; y/o (iv) en el que el péptido o complejo peptídico es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv unido por puente disulfuro, un scFv, un (scFv)2, un anticuerpo de dominio único, un dianticuerpo, un anticuerpo multíespecífico, un anticuerpo específico doble, un anticuerpo de isotipo, un anticuerpo de dominio variable doble y un anticuerpo biespecífico; y/o (v) en el que el péptido o complejo peptídico comprende un dominio constante de inmunoglobulina de la cadena pesada seleccionado entre el grupo que consiste en: un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgGI humana, un dominio constante de lgG2 humana, un dominio constante de lgG3 humana, un dominio constante de lgG4 humana, un dominio constante de IgE humana y un dominio constante de IgA humana; y/o (vi) en el que la variante funcionalmente activa es un fragmento funcionalmente activo que consiste en al menos 90 % de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEC ID N° 3 a 8; y/o (vii) en el que la variante funcionalmente activa es una variante funcionalmente activa que tiene al menos 70 %, preferentemente al menos 80 %, más preferentemente al menos 90 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID N° 3 a 8, particularmente en el que la variante funcionalmente activa deriva de una o más sustituciones conservativas de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de cualquiera de SEC ID N° 3 a 8; y/o (viii) que comprende la secuencia de aminoácidos de: SEC ID N° 1 , o una variante funcionalmente activa de la misma, y/o SEC ID N° 2, o una variante funcionalmente activa de la misma, y/o SEC ID N° 9, o una variante funcionalmente activa de la misma, y/o SEC ID N° 10, o una variante funcionalmente activa de la misma, y/o SEC ID N° 11 , o una variante funcionalmente activa de la misma, o (ix) que comprende la secuencia de aminoácidos de: SEC ID N° 1 , o una variante funcionalmente activa de la misma, y SEC ID N° 2, o una variante funcionalmente activa de la misma, y opcionalmente 50 restos de aminoácido adicionales, preferentemente de 1 a 40, más preferentemente de 1 a 30, incluso más preferentemente como máximo de 1 a 25, todavía más preferentemente como máximo de 1 a 10, lo más preferentemente 1 , 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácido adicionales o (x) que comprende la secuencia de aminoácidos de: SEC ID N° 9, o una variante funcionalmente activa de la misma, y SEC ID N° 10, o una variante funcionalmente activa de la misma, y opcionalmente 50 restos de aminoácido adicionales, preferentemente de 1 a 40, más preferentemente de 1 a 30, incluso más preferentemente como máximo de 1 a 25, todavía más preferentemente como máximo de 1 a 10, lo más preferentemente 1 , 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácido adicionales o (xi) que comprende la secuencia de aminoácidos de: SEC ID N° 9, o una variante funcionalmente activa de la misma, y SEC ID N° 11 , o una variante funcionalmente activa de la misma, y opcionalmente 50 restos de aminoácido adicionales, preferentemente de 1 a 40, más preferentemente de 1 a 30, incluso más preferentemente como máximo de 1 a 25, todavía más preferentemente como máximo de 1 a 10, lo más preferentemente 1 , 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácido adicionales. Péptido o complejo peptídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 - 4; en el que la variante funcionalmente activa de LDR1 comprende una mutación en el aminoácido en la posición 11 , particularmente 11Asn?Gln; y/o en el que la variante funcionalmente activa de HDR2 comprende una mutación en el aminoácido de la posición 6, particularmente 6Asp?Glu; y/o - en el que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 1 comprende una o más mutaciones en los aminoácidos en las posiciones 9, 12, 15, 22, 34, 46, 47, 80, 83, 85, 87 y/o 89, seleccionadas particularmente entre el grupo que consiste en 9Ala?Ser, 12Ala?Ser, 15Leu?Val, 15Leu?Pro, 22Ser?Thr, 34Asn?Gln, 46Gln?Lys, 47Ala-»Pro, 80Asp?Asn, 83Glu?Gln, 85Asp?Glu, 87Ala?Thr y 89Thr?Asn¡ y/o - en el que la variante funcionalmente activa de SEC ID N° 2 comprende una o más mutaciones en los aminoácidos en las posiciones 5, 7, 11 , 12, 17, 20, 38, 40, 43, 55, 61 , 65, 66, 67, 76, 81 , 82, 87, 91 , 93, 112, 1 13 y/o 1 16, seleccionadas particularmente entre el grupo que consiste en 5His?Val, 7Pro?Ser, 1 1 Leu?Val, 12Val?Lys, 17Pro?Ser, 20Leu-»Val, 38Lys?Arg, 40Arg?Ala, 43Arg?Gln, 55Asp?Glu, 61Asn?Ala, 65Lys?Gln, 66Asp?Gly, 67Lys?Arg, 76Ser?Thr, 81 lle?Met, 82Gln?Glu, 87Thr?Arg, 91 Ser?Thr, 93Val?Lys, 112Thr?Leu, 113Leu?Val y 1 16Ser?Val . 6. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho anticuerpo o fragmento se une específicamente al dominio I de la integrina a2 humana con una afinidad de unión de orden nM. 7. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho péptido o complejo peptídico inhibe la interacción de la integrina a2 humana con el colágeno in vitro, inhibiendo de esa manera la activación de las plaquetas debida a la adhesión de dichas plaquetas a dicho colágeno. 8. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena pesada la cadena pesada HCDR3 de SEC ID N° 5. 9. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena pesada las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDRs) de la cadena pesada de SEC ID N° 3 (HCDR1), SEC ID N° 4 (HCDR2), y SEC ID N° 5 (HCDR3), o variantes funcionalmente activas de las mismas. 10. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la variante funcionalmente activa de HCDR2 comprende la mutación Asp-»Glu en el aminoácido en la posición 6. 1 . El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena ligera la cadena ligera LCDR3 de SEC ID N° 8. 12. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena ligera las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDRs) de la cadena ligera de SEC ID N° 6 (LCDR1), SEC ID N° 7 (LCDR2), y SEC ID N° 8 (LCDR3), o variantes funcionalmente activas de las mismas. 13. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la variante funcionalmente activa de LCDR1 comprende la mutación Asn?Gln en el aminoácido en la posición 11. 14. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, teniendo dicho dominio de región variable de la cadena pesada (VH) al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de VH de SEC ID N° 2. 15. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho dominio de región variable de la cadena pesada (VH) comprende la secuencia de SEC ID N° 2 o una variante funcionalmente activa de la misma. 16. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, teniendo dicho dominio de región variable de la cadena ligera (VL) al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de VL de SEC ID N° 1. 17. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con la reivindicación 16, en el que dicho dominio de región variable de la cadena ligera (VL) comprende la secuencia de SEC ID N° 1 o una variante funcionalmente activa de la misma. 18. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que dicho dominio de región variable de la cadena pesada (VH) comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones seleccionadas entre el grupo que consiste en H5, H7, H11 , H12, H17, H20, H38, H40, H43, H55, H61 , H65, H66, H67, H76, H81 , H82, H87, H91 , H93, H112, H113 y H116. 19. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con la reivindicación 18, en el que las una o más sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre el grupo que consiste en 5His-»Val, 7Pro?Ser, 11l_eu->Val, 12Val?Lys, 17Pro?Ser, 20Leu?Val, 38Lys?Arg, 40Arg?Ala, 43Arg?Gln, 55Asp?Glu, 61Asn?Ala, 65l_ys?Gln, 66Asp?Gly, 67Lys?Arg, 76Ser?Thr, 81 lle?Met, 82Gln?Glu, 87Thr?Arg, 91Ser?Thr, 93Val?Lys, 112Thr?Leu, 113Leu-»Val y 116Ser?Val . 20. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que dicho dominio de región variable de la cadena ligera (VL) comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones seleccionadas entre el grupo que consiste en L9, L12, L 5, L22, L34, L46, L47, L80, L83, L85, L87, y L89. 21. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con la reivindicación 20, en el que las una o más sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre el grupo que consiste en 9Ala- Ser, 12Ala?-Ser, 15Leu?Val, 15Leu?Pro, 22Ser?Thr, 34Asn?Gln, 46Gln?Lys, 47Ala?Pro, 80Asp?Asn, 83Glu-»Gln, 85Asp?Glu, 87Ala?Thr y 89Thr?Asn. 22. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las ¡ reivindicaciones previas, teniendo dicho dominio de región variable de la cadena pesada (VH) al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de VH seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 38 (HC1), SEC ID N° 39 (HC2), SEC ID N° 40 (HC3), SEC ID N° 41 (HC4), SEC ID N° 42 (HC5), SEC ID N° 43 (HC6), y SEC ID N° 44 (HC7). 23. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con la reivindicación 22, comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena pesada (VH) una secuencia de VH seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 38 (HC1), SEC ID N° 39 (HC2), SEC ID N° 40 (HC3), SEC ID N° 41 (HC4), SEC ID N° 42 (HC5), SEC ID N° 43 (HC6), y SEC ID N° 44 (HC7). 24. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, teniendo dicho dominio de región variable de la cadena ligera (VL) al menos 90%, 95%, 97% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de VL seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 33 (LC1), SEC ID N° 34 (LC2), SEC ID N° 35 (LC3), SEC ID N° 36 (LC4), y SEC ID N° 37 (LC5). 25. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con la reivindicación 24, comprendiendo dicho dominio de región variable de la cadena ligera (VL) una secuencia de VL seleccionada entre el grupo que consiste en SEC ID N° 33 (LC1), SEC ID N° 34 (LC2), SEC ID N° 35 (LC3), SEC ID N° 36 (LC4), y SEC ID N° 37 (LC5). 5 26. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que dicho anticuerpo o porción de unión es un | anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. 27. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las i 10 reivindicaciones previas, en el que la porción de unión a antígeno se selecciona entre el grupo que consiste en un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv unido por puente disulfuro, un scFv, y un (scFv)2. i j 28. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las 15 reivindicaciones previas, que se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo específico doble, un anticuerpo i de isotipo, un anticuerpo de dominio variable doble y un anticuerpo biespecífico. 20 29. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende un dominio constante , de inmunoglobulina de la cadena pesada seleccionado entre el grupo que consiste en: un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgGI humana, un dominio constante de lgG2 humana, un dominio constante de lgG3 humana, un dominio constante de lgG4 humana, un dominio constante de IgE humana, y un dominio constante de IgA humana. 30. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, que comprende un dominio constante de lgG4 humana. 31. El péptido o complejo peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que el péptido o complejo peptídico comprende o consiste en un anticuerpo monoclonal aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo. 32. Uno o más ácidos nucleicos que codifican el péptido o complejo peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31. 33. Péptido o complejo peptídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-31 para su uso en el tratamiento, profilaxis o diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con la integrina a2. 34. El ácido o ácidos nucleicos de la reivindicación 32, en el que el ácido o ácidos nucleicos se localizan en un vector. 35. Una célula que expresa de forma heteróloga uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con las reivindicaciones 32 o 34. 36. Un método para la producción de un péptido o complejo peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 que comprende el cultivo de la célula de acuerdo con la reivindicación 35 en condiciones que permitan la expresión del péptido o complejo peptídico y opcionalmente la recuperación del péptido o complejo peptídico de la célula anfitriona. 37. Una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido o complejo peptídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 y/o al menos un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 32 o 34 para su uso como un medicamento. 38. La composición farmacéutica de la reivindicación 37 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno relacionado con la ¡ntegrina a2, seleccionado preferentemente entre el grupo que consiste en trombosis, una enfermedad vascular, cáncer, incluyendo neo-angiogénesis y metástasis, inflamación, enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune y una enfermedad caracterizada por una angiogénesis anormal o aumentada, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, reacciones a trasplantes, neuritis óptica, traumatismo de la médula espinal, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), esclerosis múltiple, síndrome de Reynaud, encefalomielitis autoinmune experimental, síndrome de Sjorgen, esclerodermia, enfermedad cardiovascular, psoriasis, e infecciones que provocan una respuesta inflamatoria. 39. La composición farmacéutica de la reivindicación 37 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad vascular y/o trombosis, particularmente en el tratamiento de síndrome coronario agudo, intervención coronaria percutánea, apoplejía isquémica, estenosis de la arteria carótida o enfermedad oclusiva arterial periférica. 40. Un método para el diagnóstico de una enfermedad asociada con integrina a2 alterada, comprendiendo el método: a) poner en contacto una muestra que comprende integrina a2 con el péptido o complejo peptídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 ; y b) detectar la unión de la integrina a2 al péptido o complejo peptídico; y c) comparar la unión de la etapa b) con una referencia, en el que una unión a integrina a2 alterada en la muestra con respecto a la referencia es indicativa de la enfermedad. 41. Artículo de manufactura que comprende: a) un material de envasado, b) un péptido o complejo peptídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-31 o 33 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo o que comprenda la composición farmacéutica de una de las reivindicaciones 36-38 197 c) una etiqueta o un prospecto, estando contenido el prospecto dentro de dicho material de envasado, que indica que dicho péptido o complejo peptídico es eficaz para el tratamiento de una enfermedad o trastorno, especialmente para una enfermedad o trastorno relacionado con la integrina a2. 42. Kit de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con la integrina a2 que comprende un péptido o complejo peptídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-31 y un envasado adecuado, y posiblemente instrucciones adecuadas para el uso de dicho péptido o complejo peptídico en la detección de integrina a2. 43. Método de tratamiento o diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con la integrina a2 que usa uno o más péptidos o complejos de péptidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-31 y/o uno o más ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 32 o 34 o una de las composiciones farmacéuticas de acuerdo con una de las reivindicaciones 36-38. 44. Un método para el diagnóstico de una enfermedad asociada con integrina a2 alterada, comprendiendo dicho método: a) poner en contacto una muestra tomada de un individuo con el péptido o complejo peptídico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 ; y b) detectar la unión de la integrina a2 al péptido o complejo peptídico; y c) comparar la unión de la etapa b) con la unión de la integrina a2 al péptido o complejo peptídico en una o más muestras de referencia, en el que una unión alterada en la muestra tomada con respecto a la unión detectada en las una o más muestras de referencia es indicativa de la enfermedad. Resumen La presente invención se refiere a un péptido o complejo peptídico que se unen a integrina al, a uno o más ácidos nucleicos que codifican el péptido o complejo peptídico, a una célula recombinante que produce el péptido o complejo peptídico, a un método para la producción del péptido o complejo peptídico, a una composición farmacéutica que comprende el péptido o complejo peptídico o el ácido o ácidos nucleicos para su uso como un medicamento, a un método para la detección de integrina al y a un método de cribado.
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