DE69530316T2

DE69530316T2 - Antithrombose mittel und gegen den von willebrand-faktor gerichtete monoklonale antikörper

Info

Publication number: DE69530316T2
Application number: DE69530316T
Authority: DE
Inventors: Mitsuyo Kawasaki-ku NAGANO; Hiroshi Kawasaki-ku YAMAMOTO; Morikazu Kawasaki-ku KITO; Ryota Kawasaki-ku YOSHIMOTO; Tsuyoshi Kawasaki-ku KOBAYASHI
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1994-11-30
Filing date: 1995-11-29
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2015-11-30
Also published as: EP0795608A1; US5916805A; KR100406072B1; DE69530316D1; US6793920B2; NO972253L; FI972279A; DK0795608T3; WO1996017078A1; US20020028204A1; EP0795608A4; ATE236993T1; PT795608E; NO972253D0; CN1174575A; ES2197210T3; NO319738B1; FI119734B; FI972279A0; CN1254275C

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen monoklonalen Antikörper gegen den menschlichen von-Willebrand-Faktor, der in einer medizinisch wirksamen Dosis, um seine thrombosehemmende Wirkung zu entfalten, keine Blutungen verursacht. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Hybridom, das diesen monoklonalen Antikörper produziert, und ein thrombosehemmendes Mittel, das diesen monoklonalen Antikörper als Wirkbestandteil enthält.
Hintergrund der Erfindung
Wenn Subendothel eines lebenden Körpers aufgrund einer Verletzung von Gefäßwänden freiliegt, haften sich durch den Blutstrom fließende Blutplättchen sofort an das Subendothel. Dies löst eine Reihe von Blutplättchenaktivierungsvorgängen aus, einschließlich einer Blutplättchenaggregation und der Abgabe von intrazellulären Granula, wonach ein Thrombus gebildet und damit die Blutung gestoppt wird. Demgemäß ist die Thrombenbildung notwendig und unentbehrlich für den physiologischen hämostatischen Mechanismus. Auf der anderen Seite verursachen Thromben jedoch thrombotische Erkrankungen wie beispielsweise Myokardinfarkte, Angina pectoris, Hirninfarkte und Gehirnthrombosen, die mit der Alterung der Gesellschaft immer häufiger als Todesursachen angegeben werden. Diese Situation stellt ein ernsthaftes Problem dar.
Es wurden schon viele thrombosehemmende Mittel entwickelt, um thrombotische Erkrankungen zu heilen und zu verhindern. Die Probleme, die jedoch noch nicht gelöst wurden, sind, dass viele der herkömmlichen thrombosehemmenden Mittel in der klinischen Anwendung immer noch geringe Heilwirkung aufweisen, dass sie eine geringe Spezifität für Thromben aufweisen und dass sie als Nebenwirkung Blutungsneigung hervorrufen. Eine der Ursachen für diese Umstände ist die folgende: Fast alle thrombosehemmenden Mittel sind nur für den Zweck entworfen worden, den Blutplättchenaktivierungsvorgang zu hemmen. Ein Verfahren zur Messung der Blutplättchenaggregation in vitro, das einen Index der Aktivität bereitstellt, reicht jedoch nicht aus, um den komplizierten Thrombenbildungsprozess in vivo widerzuspiegeln.
Die Thrombenbildung schreitet in Übereinstimmung mit der Bildung von spezifischen Bindungen zwischen Glykoproteinen der Blutplättchenmembran und Subendothelen oder Proteinen im Plasma fort. Insbesondere das Glykoprotein IIb/IIIa (hierin im Folgenden als "GPIIb/IIIa" abgekürzt) der Blutplättchenmembran agiert im Endstadium der Thrombenbildung als Rezeptor für das Fibrinogen. Folglich wird erwartet, dass GPIIb/ IIIa-Antagonisten als starke thrombosehemmende Mittel eingesetzt werden können. Die Fibrinogen bindende Stelle auf GPIIb/IIIa umfasst eine primäre RGD-Sequenz von Aminosäuren. Durch die Synthese und Evaluierung vieler RGD-Derivate wurde bestätigt, dass der GPIIb/IIIa-Antagonist eine thrombosehemmende Wirkung aufweist, indem er die Blutplättchenaggregation stark hemmt, wie in Tiermodellen in vivo und in klinischen Untersuchungen gezeigt wurde (Thrombosis and Haemostasis 69, 560 (1993)). Das Problem ist jedoch, dass GPIIb/IIIa-Antagonisten gleichzeitig den normalen hämostatischen Mechanismus unterdrücken, wodurch die Blutungsneigung stärker als Nebenwirkung auftritt als bei herkömmlichen thrombosehemmenden Mitteln (The Lancet 343, 881 (1994); The New England Journal of Medicine 330, 956 (1994)).
Auf der anderen Seite umfassen die bekannten wichtigen Proteine, die in der Anfangsphase der Thrombenbildung aktiv sind, das Glykoprotein Ib der Blutplättchenmembran (hierin im Folgenden als "GPIb" abgekürzt) und den von-Willebrand-Faktor im Blutplasma (hierin im Folgenden als "vWF" abgekürzt). Hämorrhagische Läsionen, die mit dem Auftreten von qualitativen und quantitativen Veränderungen des vWF verbunden sind, umfassen die von-Willebrand-Krankheit (hierin im Folgenden als "vWD" abgekürzt). In klinischen Untersuchungen hat sich herausgestellt, dass bei vWD-Patienten seltener schwere Blutungen auftreten als bei Thrombasthenie-Patienten (hämorrhagische Erkrankung aufgrund eines Mangels an GPIIb/IIIa). Hierin wurde eine Möglichkeit gesehen, eine starke thrombosehemmende Wirkung zu erzielen, ohne die Blutungsneigung zu beeinflussen, indem die Wechselwirkung zwischen GPIb und vWF gehemmt wird. Es waren aber nur ein monoklonaler Antikörper und die niedermolekulare Verbindung ATA (Aurintricarbonsäure; Blood 72, 1898 (1988) als Substanzen bekannt, welche die Wechselwirkung zwischen GPIb und vWF spezifisch hemmen. Eine thrombosehemmende Wirkung des monoklonalen Anti-GPIb-Antikörpers konnte in vivo nicht nachgewiesen werden. Stattdessen werden die Nebenwirkungen verstärkt, indem der monoklonale Anti-GPIb-Antikörper Thrombopenie auslöst, und es verlängert die Blutungszeit (Blood 70, 344a (1987); Jpn. J. Clin. Pathol. 40, 266 (1992)). Außerdem wurde in Bezug auf vWF-Antagonisten berichtet, dass das oben beschriebene ATA und ein antiklonaler Mäuse-Anti-Schweine-vWF-Antikörper BB3-BD5 in einem In-vivo-Experiment mit Tieren thrombosehemmende Wirkung zeigten (Circulation 81, 1106 (1990)). Die Nebenwirkungen können jedoch weder im Falle von ATA noch von BB3-BD5 außer Acht gelassen werden. ATA entfaltet nämlich eine thrombosehemmende Wirkung, indem es die Wechselwirkung zwischen GPIb und vWF hemmt, während ATA gleichzeitig komplett entgegengesetzte Nebenwirkungen umfasst, so dass es die Blutplättchenaggregation und die Abgabereaktion, ausgelöst durch Kollagen, Arachidonsäure, A23187, PAF und TXA₂, erhöht (Thrombosis and Haemostasis 68, 189 (1992)). Auf der anderen Seite löst BB3-BD5 in seiner thrombosehemmenden Dosis eine starke Blutungsneigung aus (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8100 (1987); SURGERY 112, 433 (1992)).
Wie oben beschrieben gibt es bei existierenden thrombosehemmenden Mitteln das Dilemma, dass die thrombosehemmende Wirkung als medizinische Wirkung nicht von der Blutungsneigung als Nebenwirkung getrennt werden kann (es gibt keinen Unterschied zwischen der medizinisch wirksamen Menge und der Nebenwirkungen verursachenden Menge).
Seit kurzem zieht die durch Scherbeanspruchung induzierte Blutplättchenaggregation (hierin im Folgenden als "SIPA" abgekürzt) Aufmerksamkeit auf sich, da sie eng mit der Thrombenbildung im pathologischen Zustand verbunden ist. Der Gefäßdurchmesser ist klein und der Blutstrom weist bei arteriosklerotischen Läsionen und in kleinen Arterien große Geschwindigkeit auf. Daher tritt in solch einem Bereich aufgrund der Wechsel wirkung zwischen Gefäßwand und Blut eine höhere Scherbeanspruchung auf. In solch einer Situation wird vWF im Blut aktiviert und seine tertiäre Struktur wird verändert. Folglich spielt vWF eine entscheidende Rolle bei der Thrombenbildung. Es ist nämlich der folgende Vorgang bekannt: Als Erstes bindet sich auf dem Subendothel vorhandenes vWF an GPIb der Blutplättchenmembran, wodurch die Blutplättchen sich an die Gefäßwand haften. Als Zweites vernetzt im Blutplasma vorhandenes vWF das Glykoprotein ib/IIIa der Blutplättchenmembran, wodurch die Blutplättchenaggregationsreaktion fortschreiten kann. Als Folge findet schließlich die Thrombenbildung statt.
Es ist allgemein bekannt, dass antibiotisches Ristocetin oder Schlangengift-Botrocetin es vWF ermöglichen, die tertiäre Struktur in vitro wie bei einer hohen Scherbeanspruchung zu verändern. In Gegenwart von Ristocetin oder Botrocetin erwirbt vWF nämlich eine Bindefähigkeit an GPIb. Verfahren zur Messung der physiologischen Aktivität von vWF in vitro unter Nutzung des vorher erwähnten Charakteristikums umfassen Ristocetininduzierte Blutplättchenaggregation (hierin im Folgenden als "RIPA" abgekürzt) und Botrocetin-induzierte Blutplättchenaggregation (hierin im Folgenden als "BIPA" abgekürzt), sowie ein Verfahren zur Messung der Bindung von vWF an GPIb in Gegenwart von Ristocetin oder Botrocetin. Die oben genannten Verfahren sind weit verbreitet. Aufgrund des Fortschritts bei Versuchstechniken wurde außerdem ein Gerät entwickelt, in dem SIPA in vitro gemessen werden kann, indem wirklich eine Scherbeanspruchung erzeugt wird. Es wird angenommen, dass bei allen Reaktionen eine identische Domäne von vWF an der Bindung an das GPIb beteiligt ist.
Es wurden schon verschiedene Antikörper gegen vWF erzeugt, welche die Aktivität von vWF in vitro hemmen. Viele davon weisen jedoch eine geringere Reaktionsspezifität auf, und fast alle hemmen die durch Botrocetin bedingte Reaktion nicht, obwohl sie die durch Ristocetin bedingte Reaktion hemmen. Wie oben beschrieben, wird angenommen, dass die durch Ristocetin induzierte GPIb-Bindungsstelle von vWF homolog zu der durch Botrocetin induzierten ist. Daher erkennen die oben genannten Antikörper vielleicht die Bindungsstelle für Ristocetin oder Botrocetin am vWF. Genaugenommen könnte man sagen, dass sie die physiologische Aktivität von vWF nicht hemmen und daher eine geringe Reaktionsspezifität aufweisen. Es wurde berichtet, dass unter solchen Umständen zwei Antikörper, nämlich NMC-4, hergestellt von Fujimura et al. (J. Nara Med. Assoc. 36, 662 (1985)), und RFF-VIIIRAG:1, hergestellt von Tuddenham et al., sowohl die durch Ristocetin bedingte als auch die durch Botrocetin bedingte Reaktion in vitro hemmen (Blood 177, Nr. l, 113 (1992)).
Es wurde berichtet, dass in der GPIb-Bindungsstelle des vWF-Moleküls Epitope für die beiden Antikörper vorhanden sind, die sich zwischen dem 449. und dem 728. Aminosäurerest einer Aminosäuresequenz des vWF-Moleküls befinden. Darüber hinaus wird die Bindung von Jod-markiertem NMC-4- und vWF durch RFF-VIIIRAG:1 teilweise gehemmt. Aufgrund dieser Tatsache wird angenommen, dass die beiden Epitope sich an zwei nahe beieinander liegenden Positionen befinden. Außerdem hemmt RFF-VIIRAG:1 BIPA nur teilweise, während NMC-4 BIPA vollkommen hemmt. Aus diesem Grund wurden unter Verwendung von NMC-4 genaue wissenschaftliche Untersuchungen über vWF gemacht, welche bestimmte Ergebnisse erbrachten. Bei Tieren weist NMC-4 nur mit Ratten-vWF Reaktivität auf.
Wenn ein monoklonaler Antikörper gegen Human-vWF hergestellt wird, um Informationen über die BPIb-Bindungstelle von Human-vWF zu erhalten, oder um den monoklonalen Antikörper als präventiven Wirkstoff und als therapeutischen Wirkstoff gegen mit vWF zusammenhängende Erkrankungen einzusetzen, wird angenommen, dass der monoklonale Antikörper wünschenswerterweise als Antikörper mit hoher Spezifität für Human-vWF hergestellt werden sollte.
Auf der anderen Seite ist es, wenn ein neues Medikament auf herkömmliche Weise entwickelt wird, nicht erlaubt, Tests an Menschen durchzuführen, bevor nicht ein Test mit Tieren durchgeführt wurde. Wenn ein Test in Bezug auf die physiologischen Aktivitäten von vWF und monoklonalen Anti-vWF-Antikörpern in vivo durchgeführt wird, muss ein monoklonaler Antikörper eingesetzt werden, der die Durchführung eines Tests mit Tie ren ermöglicht, d. h. ein monoklonaler Antikörper, der gleichzeitig Reaktivität mit vWF eines Tiers aufweist. GPIIb/IIIa-Antagonisten, welche die Plättchenaggregation beim Menschen mithilfe von Fibrinogenen stark unterdrücken, wirken übrigens bei Ratten nicht (Thrombosis and Haemostasis 70, 531 (1993)). Außerdem weist eine Ratte keine Ristocetin-induzierte Aggregation auf. Aufgrund dieser Fakten wird im Allgemeinen angenommen, das der Mechanismus der Thrombenbildung sich bei Ratten und Menschen stark unterscheidet. Daher ist es fast sinnlos, die thrombosehemmende Wirkung eines Anti-vWF-Antikörpers in einer Ratte zu evaluieren. Im Gegensatz dazu wird bei Meerschweinchen die Blutplättchenaggregation durch GPIIb/IIIa-Antagonisten unterdrückt. Außerdem wird auch die Ristocetin-induzierte Aggregation auf dieselbe Weise wie beim Menschen induziert. Daher wird angenommen, dass Meerschweinchen am besten als tierisches Thrombenmodell für In-vivo-Experimente geeignet sind, in denen die thrombosehemmende Wirkung evaluiert werden kann.
In Anbetracht der oben genannten Gesichtspunkte ist ein monoklonaler Antikörper, der für sowohl Human-vWF und Meerschweinchen-vWF Reaktivität aufweist, nützlich. Solche monoklonalen Anti-Human-vWF-Antikörper sind jedoch nicht bekannt.
Darüber hinaus ist kein monoklonaler Anti-Human-vWF-Antikörper bekannt, dessen thrombosehemmende Wirkung in vivo bestätigt wurde.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf den oben beschriebenen Gesichtspunkten gemacht und zielt darauf ab, monoklonale Antikörper gegen den Human-von-Willebrand-Faktor, insbesondere einen monoklonalen Antikörper, der sowohl mit Human-vWF als auch mit Meerschweinchen-vWF reaktiv ist, welche in einer medizinisch wirksamen Dosis, die ausreicht, um eine thrombosehemmende Wirkung zu zeigen, zu keinen Blutungen führen, Hybridome zur Produktion dieser monoklonalen Antikörper und ein thrombosehemmendes Mittel, der einen der oben genannten monoklonalen Antikörper als Wirkbestandteil enthält, bereitzustellen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung hatten Erfolg bei der Suche nach einem monoklonalen Antikörper, der mit dem Human-von-Willebrand-Faktor reaktiv ist und RIPA, BIPA und SIPA von Human-Blutplättchen hemmt, indem sie eine Maus mit Human-vWF immunisierten und Milzzellen der immunisierten Maus mit Mäuse-Myelomzellen fusionierten, um ein Hybridom herzustellen. Darüber hinaus haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass der monoklonale Antikörper in einem In-vivo-Thrombosemodell eine starke thrombosehemmende Wirkung aufweist, ohne Blutungen auszulösen. Die vorliegende Erfindung wurde somit abgeschlossen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein thrombosehemmendes Mittel gemäß den beiliegenden Ansprüchen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt einen monoklonalen Antikörper gemäß den beiliegenden Ansprüchen bereit.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Hybridom zur Produktion des monoklonalen Antikörpers mit den zuvor genannten Eigenschaften bereit, das durch Fusion zwischen einer Milzzelle einer mit von-Willbrand-Faktor immunisierten Maus und einer Sp2/O-Ag14-Mäuse-Myelomzelle gebildet wurde.
Im Folgenden wird die Erfindung im Detail beschrieben.
<1> Monoklonaler Antikörper gemäß vorliegender Erfindung
Der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung ist ein monoklonaler Antikörper gemäß den beiliegenden Ansprüchen.
Eine spezifische Ausführungsform des oben beschriebenen monoklonalen Antikörpers ist das Beispiel eines monoklonalen Antikörpers, der neben den oben genannten Eigenschaften noch die folgenden Eigenschaften aufweist:

(e) der monoklonale Antikörper hemmt BIPA (Botrocetin-induzierte Blutplättchenaggregation) von Ratten-Blutplättchen; und
(f) der monoklonale Antikörper hemmt BIPA (Botrocetin-induzierte Blutplättchenaggregation) von Hasen-Blutplättchen.

Der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung weist insofern eine hohe Reaktionsspezifität auf, dass er mit Human-vWF reaktiv ist, eine hohe Affinität dazu aufweist und RIPA, BIPA und SIPA in vitro stark hemmt. Auf der anderen Seite hemmt der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung zumindest RIPA und BIPA von Meerschweinchen. Ein monoklonaler Antikörper, wie er in den weiter unten beschriebenen Beispielen erhalten wurde, hemmt BIPA von Ratten und Hasen in vitro. Gemäß einem Versuch einer einzelnen intravenösen Verabreichung an ein Meerschweinchen, hemmt der monoklonale Antikörper RIPA und BIPA ex vivo, ohne die hämatologischen Parameter und die Koagulationsparameter im Geringsten zu beeinflussen. Der monoklonale Antikörper verlängert die Zeit, die in einem photochemisch reaktionsinduzierten Thrombosemodell, das auf der Verwendung eines Meerschweinchens basiert, für einen femoralen Arterienverschluss notwendig ist, und er verlängert die Zeit, die für den Verschluss in einem arteriovenösen Shuntbildungsmodell notwendig ist. Wenn der monoklonale Antikörper in seiner medizinisch wirksamen Dosis eingesetzt wird, dauert seine Wirkung außerdem lange an, ohne jedoch eine Verlängerung der Blutungszeit zu verursachen.
Bisher war kein monoklonaler Antikörper mit den oben beschriebenen Eigenschaften bekannt. Der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung ist ein neuer monoklonaler Antikörper. Der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung unterscheidet sich vom oben beschriebenen NMC-4 nicht nur darin, dass es mit Tier-vWF reagiert, sondern auch darin, dass es die Bindung von NMC-4 and vWF überhaupt nicht hemmt (siehe die weiter unten beschriebenen Beispiele). Die Tatsache, dass der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung die Thrombenbildung in einem In-vivo-Thrombosemodell stark unterdrückt hat, ohne die Blutungsneigung zu beeinflussen, deutet auf die Möglichkeit hin, dass der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung auch ein idealer therapeutischer Wirkstoff für thrombotische Erkrankungen sein könnte. Der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung ist nicht nur neu, sondern auch gewerblich anwendbar.
Der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung ist nämlich nicht nur zur Spezifizierung der GPIb bindenden Stelle des vWF nützlich. Es wird außerdem angenommen, dass der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung als Mittel zur Analyse vorhandener Formen von vWF und ihrer Verteilung in vivo, zur Erforschung der Ursachen von vWD (von-Willbrand-Krankheit), sowie als präventiver Wirkstoff und therapeutischer Wirkstoff gegen thrombotische Erkrankungen eingesetzt werden kann. Darüber hinaus kann der erste monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung vorzugsweise für In-vivo-Experimente an Meerschweinchen eingesetzt werden, in denen die thrombosehemmende Wirkung evaluiert wird.
Der monoklonale Antikörper kann außerdem die durch Scherbeanspruchung induzierte Blutplättchenaggregation (hierin im Folgenden als "SIPAd" abgekürzt) von menschlichen Blutplättchen hemmen. SIPAd bezieht sich auch auf die Thrombenbildung in einem pathologischen Zustand. In einem Experiment auf der Basis von normalem menschlichen Blut wurde bestätigt, dass der monoklonale Antikörpers SIPAd in Abhängigkeit von der Dosis hemmt. Solch eine Hemmung wurde bei GIIb/IIIa-Antagonisten, die derzeit als thrombosehemmende Mittel eingesetzt werden sollen, nicht beobachtet.
Der monoklonale Antikörper mit den oben beschriebenen Eigenschaften kann als Medikament eingesetzt werden. Das Medikament umfasst im Speziellen beispielsweise ein weiter unten beschriebenes thrombosehemmendes Mittel.
<2> Bildung von Hybridomen und des monoklonalen Antikörpers gemäß vorliegender Erfindung
Der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung wird erhalten, indem eine Zellfusion zwischen Antikörper produzierenden Zellen eines mit Human-vWF immunisierten Tiers und Myelomzellen durchgeführt wird, um Hybridome zu bilden, ein zur Produktion eines monoklonalen Antikörpers mit Reaktionsspezifität für Human-vWF und zur Hemmung von RIPA, BIPA und SIPA von menschlichen Blutplättchen fähiges Hybridom kloniert wird und das Hybridom oder eine Variante davon kultiviert wird.
Der monoklonale Antikörper wird erhalten, indem ein Hybridom, das zur Produktion eines RIPA und BIPA von Meerschweinchen-Blutplättchen hemmenden monoklonalen Antikörpes fähig ist, kloniert wird und das Hybridom oder eine Variante davon kultiviert wird.
Das Hybridom kann in Übereinstimmung mit einem Verfahren von Köhler und Milstein (Nature, 495–492 (1975)) gebildet werden. Ein Verfahren zur Bildung von Hybridomen und ein Verfahren zur Auswahl eines Hybridoms, das zur Produktion eines gewünschten monoklonalen Antikörpers fähig ist, wird im Folgenden erläutert.
Antikörper produzierende Zellen werden erhalten, indem ein Tier, beispielsweise eine BALB/c-Maus, mit Human-vWF immunisiert wird und aus dem Tier Antikörper produzierende Zellen, wie beispielsweise Milzzellen, Lymphknotenzellen und peripheres Blut, bereitgestellt werden. Human-vWF kann durch Reinigung aus menschlichem Blutplasma oder durch beispielsweise Gelfiltration erhalten werden.
Die Antikörper produzierenden Zellen werden aus dem mit Human-vWF immunisierten Tier entnommen, um eine Zellfusion mit Myelomzellen durchzuführen. Als Myelomzellen für die Zellfusion können Zellstämme von verschiedenen Säugetieren verwendet werden. Vorzugsweise sollte jedoch ein Zellstamm von einem Tier derselben Spezies wie das zur Bildung der Antikörper produzierenden Zellen verwendete Tier eingesetzt werden. Um fusionierte Zellen nach der Zellfusion von unfusionierten Zellen unterscheiden zu können, sollte vorzugsweise ein Myelom-Zellstamm mit einem Marker verwendet werden, so dass unfusionierte Myelomzellen nicht überleben und nur Hybridome proliferieren können. Ein Hybridom, beispielsweise, das durch eine Zellfusion zwischen einer gegen 8-Azaguanin resistenten Myelomzelle und einer Antikörper produzierenden Zelle als normale Zelle gebildet wird, kann in einem Medium (HAT-Medium), das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält, proliferieren, während die gegen 8-Azaguanin resistente Myelomzelle im HAT-Medium stirbt und die normale, Antikörper produzierende Zelle nicht lange kultiviert werden kann. Daher kann nur das Hybridom selektiv kultiviert werden (Science 145, 709 (1964)). Vorzugsweise sollte als Myelomzelle ein Stamm eingesetzt werden, der kein eigenes Immunoglobulin absondert, so dass der gewünschte Antikörper leicht aus einem Kulturüberstand des Hybridoms erhalten werden kann.
Die Zellfusion wird beispielsweise wie folgt durchgeführt. Milzzellen einer mit Human-vWF immunisierten Maus werden in der logarithmischen Wachstumsphase mit Mäuse-Myelomzellen, z. B. Sp2/O-Ag14 (gegen 8-Azaguanin resistent, kein IgG absondernd), vermischt, so dass das Verhältnis zwischen den Milzzellen und den Myelomzellen etwa 10 : 1 bis 1 : 1 beträgt. Nach einer Zentrifugation wird zum zurückbleibenden Niederschlag Polyethylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von 1.000 bis 6.000 zugesetzt, um eine Endkonzentration von 30 bis 50% zu erhalten, so dass die Zellen fusioniert werden. Die Fusion kann anstelle des Zusetzens von Polyethylenglykol auch durch Anlegen eines elektrischen Impulses an eine Mischlösung der Zellen durchgeführt werden.
Die Zellen, die der Fusionsbehandlung unterzogen wurden, werden in einem HAT-Medium, beispielsweise in Dulbecco's Modified Eagle's Minimum Essential Medium (hierin im Folgenden als "DMEM-Medium" abgekürzt), das Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin und 10% Rinderfötenserum enthält, suspendiert. Die Suspension wird dispensiert und in eine 96-Napf-Mikrotiterplatte oder dergleichen gegossen, und die Zellen werden bei 37°C in 5% Kohlendioxid so kultiviert, dass sich nur Hybridome vermehren können.
Die auf die oben beschriebene Weise erhaltenen Hybridome liegen als Mischkultur vor, die ein Hybridom enthalten, das den gewünschten monoklonalen Antikörper produziert, sowie Hybridome, die monoklonale Antikörper gegen andere Proteine, die in dem Human-vWF-Präparatsgemisch enthalten sind, produzieren oder monoklonale Antikörper gegen Stellen des Human-vWF, die für RIPA, BIPA und SIPA irrelevant sind. Demgemäß wird ein Stamm, der den gewünschten monoklonalen Antikörper produziert, aus den oben genannten Hybridomen ausgewählt.
Das Hybridom, das den monoklonalen Antikörper mit Reaktivität gegenüber Human-vWF produziert, kann in Übereinstimmung mit einem auf der Verwendung von Human-vWF als Antigen basierenden Enzymimmunoassay ausgewählt werden. Ein Stamm, der einen monoklonalen Antikörper produziert, welcher sowohl durch Human-vWF vermitteltes RIPA und BIPA hemmt, wird ausgewählt, indem die Hemmaktivität gegenüber RIPA und BIPA unter Verwendung eines Teils des Mediums in jedem Napf gemessen wird.
Das Hybridom, das den monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung produziert, wird durch die Auswahl eines Hybridoms erhalten, das einen monoklonalen Antikörper, der sich an vWF eines Tiers, wie beispielsweise eines Meerschweinchens, einer Ratte oder eines Hasen, bindet, oder einen monoklonalen Antikörper, der BIPA oder RIPA von Blutplättchen eines des oben genannten Tiere hemmt, produziert, in Übereinstimmung mit einem Enzymimmunoassayverfahren wie etwa ELISA (enzymgebundenes Immunosorptionsassay).
Nach Bestätigung der Tatsache, dass das Hybridom zur Produktion des gewünschten monoklonalen Antikörpers in einer Kultur enthalten ist, wird die Kultur in ein HT-Me dium derselben Zusammensetzung wie das HAT-Medium, mit der Ausnahme, dass das Aminopterin aus dem HAT-Medium entfernt wird, übertragen. Das Hybridom wird weiter kultiviert, um die Klonierung in Übereinstimmung mit beispielsweise einem Grenzverdünnungsverfahren durchzuführen.
So wurden die Hybridome AJvW-2 und AJvW-4 erhalten, wie weiter unten in den Beispielen demonstriert wird. Beide wurden am 24. August 1994 im National Institute of Bioscience and Human Technology der Agency of Industrial Science and Technology des Ministry of International Trade and Industry (Postleitzahl 305, 1–3 Higashi-Icchome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan) unter den Hinterlegungsnummer FERM P-14487 und FERM P-14489 in dieser Reihenfolge hinterlegt und wurden gemäß dem Budapester Abkommen am 29. September 1995 unter den Hinterlegungsnummern FERM BP-5248 und FERM BP-5250 international hinterlegt.
Wie in den weiter unten aufgeführten Beispielen beschrieben, gehört der durch AJvW-2 produzierte monoklonale Antikörper zur Subklasse IgG1 und der durch AJvW-4 produzierte monoklonale Antikörper zur Subklasse IgG2b. NMC-4 gehört zu IgG1, wie auch bisher berichtet wurde.
Der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung wird durch die Kultivierung des auf die oben beschriebene Weise erhaltenen Hybridoms oder einer Variante davon, ausgewählt durch das Klonieren des Hybridoms in Übereinstimmung mit dem Grenzverdünnungsverfahren in einem geeigneten Medium oder in Mäuse-Aszitesflüssigkeit kultiviert wird, beispielsweise eine Variante des Hybridoms mit hoher Antikörper-Produktivität. Alternativ dazu kann der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung durch Isolieren eines Gens, das mit der Antikörper-Produktion zusammenhängt, aus dem erhaltenen Hybridom, Aufnahme des Gens in einen Expressionsvektor, Einführung des erhaltenen Vektor ein einen Mikroorganismus wie beispielsweise Escherichia coli und Kultivierung des erhaltenen Antikörper produzierenden Mikroorganismus ge wonnen werden. Das Hybridom umfasst das oben beschriebene AJvW-2 und AJvW-4 sowie Varianten davon.
Das Medium zur Kultivierung des Hybridoms umfasst beispielsweise ein Medium, das auf einem DMEM-Medium basiert und darüber hinaus Rinderfötenserum, L-Glutamin, Glucose, Natriumpyruvat, 2-Mercaptoethanol und ein Antibiotikum (z. B. Penicillin G, Streptomycin und Gentamicin) enthält. Das Hybridom gemäß vorliegender Erfindung wird üblicherweise 2 bis 4 Tage bei 37°C in dem Medium mit einer Gasphase, die 5 Kohlendioxid und 95% Luft umfasst, kultiviert. Alternativ dazu kann das Hybridom auch etwa 10 bis 15 Tage in der Bauchhöhle einer mit 2,6,10,14-Tetramethylpentadecan (z. B. Pristane (Markenname), hergestellt von Sigma) vorbehandelten Balb/c-Maus kultiviert werden. So wird der monoklonale Antikörper in einer Menge produziert, die eine Reinigung unterzogen werden kann.
Der so produzierte monoklonale Antikörper kann gemäß einem herkömmlichen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Proteinen aus Kulturüberstand oder Aszitesflüssigkeit abgetrennt und gereinigt werden. Solche Verfahren umfassen beispielsweise Zentrifugation, Dialyse, Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat und Säulenchromatographie unter Verwendung von beispielsweise DEAE-Cellulose, Hydroxyapatit, Protein-A-Agarose und Protein-G-Agarose.
<3> Thrombosehemmendes Mittel gemäß vorliegender Erfindung
Ein thrombosehemmendes Mittel gemäß vorliegender Erfindung umfasst als Wirkbestandteil einen monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung.
Wenn der von der Maus stammende monoklonale Antikörper am Menschen als thrombosehemmendes Mittel angewendet wird, ist es aufgrund von Problemen der Antigenität und der Halbwertszeit im Blut wünschenswert, dass der monoklonale Antikörper in einen menschlichen Typen umgewandelt wird. Variable Regionen des Antikörpers kön nen in Übereinstimmung mit den von Jones et al. (Nature 321, 522 (1986)) und Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989)) beschriebenen Verfahren in solche vom menschlichen Typen umgewandelt werden, ohne die Reaktionsspezifität zu verlieren. Seit Kurzem ist auch das von Winter et al. und Lerner et al. beschriebene Repertoir-Klonierungsverfahren verfügbar (J. Mol. Biol 222, 581 (1991); Proc. Natl. Aca. Sci. USA 88, 2432 (1991)).
Die Fragmente F(ab')₂, Fab' und Fab, die durch Verdauen der oben genannten monoklonalen Antikörper mit einem proteolytischen Enzym, wie beispielsweise Trypsin, Papain und Pepsin, und einer darauffolgenden Reinigung erhalten werden, können auch als thrombosehemmendes Mittel eingesetzt werden, vorausgesetzt die Fragmente weisen dem oben genannten monoklonalen Antikörper gleichwertige Eigenschaften auf.
Der Typ oder die Form des thrombosehemmenden Mittels gemäß vorliegender Erfindung umfassen beispielsweise Injektionen, sublinguale Tabletten, Hautumschläge, Tabletten oder Pillen, Kapseln, Granula, Sirupe, Zäpfchen, Salben und Instillationen. Davon sind Injektionen, sublinguale Tabletten und Hautumschläge zu bevorzugen. Je nach Typ des Wirkstoffs kann der thrombosehemmende Wirkstoff mit pharmazeutisch zulässigen Arnzeimittelträgern, z. B. Lactose, Kartoffelstärke, Calciumcarbonat und Natriumalginat, vermischt werden. Im Fall der Injektion umfassen mögliche Lösungsmittel beispielsweise Wasser zur Injektion, physiologische Kochsalzlösung und Ringer-Lösung. Das Lösungsmittel kann mit einem Dispersionsmittel versetzt werden. Darüber hinaus kann auch eine andere thrombosehemmende Komponente als die monoklonalen Anti-vWF-Antikörper eingesetzt werden.
Die Verabreichungsdosis des thrombosehemmenden Mittels gemäß vorliegender Erfindung variiert je nach beispielsweise Alter und Verfassung eines Patienten. Im Allgemeinen kann jedoch bei der intravenösen Verabreichung eine vorbestimmte Wirkung erwartet werden, indem einem Erwachsenen pro Tag vorzugsweise eine Menge des thrombosehemmenden Mittels gemäß vorliegender Erfindung im Bereich von 0,1 μm/kg bis 1.000 mg/kg, noch bevorzugter 1 μg/kg bis 100 mg/kg, verabreicht wird, dargestellt durch die Menge des monoklonalen Antikörpers der als Wirkbestandteil dienen soll.
Das thrombosehemmende Mittel gemäß vorliegender Erfindung kann für allgemeine Anwendungen thrombosehemmender Mittel eingesetzt werden. Das heißt, das thrombosehemmende Mittel gemäß vorliegender Erfindung kann verwendet werden, um mit der Blutplättchenadhäsion und -aggregation zusammenhängende Erkrankungen zu verhindern oder zu behandeln. Insbesondere ist das thrombosehemmende Mittel gemäß vorliegender Erfindung beispielsweise wirksam bei der Behandlung von vorübergehenden ischämischen zerebralen Attacken, instabiler Angina pectoris, Hirninfarkten, Myokardinfarkten und peripherer arterieller Verschlüssen, er ist wirksam bei der Prävention von Reokklusionen nach einer PTCA und von Okklusionen eines koronararteriellen Bypasses und er ist wirksam bei der Behandlung von Koronararterien-Klappenprothesen und essentieller Thrombozytämie.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Hemmaktivitäten des Antikörpers 2 und des Antikörpers 4 in Bezug auf Beispiele der vorliegenden Erfindung und von NMC-4 als Kontrollvergleich, gemessen als RIPA basierend auf der Verwendung von Human-PRP.
2 (Vergleich) zeigt Hemmaktivitäten des Antikörpers 1 und des Antikörpers 3 in Bezug auf Beispiele der vorliegenden Erfindung und von NMC-4 als Kontrollvergleich, gemessen als RIPA basierend auf der Verwendung von Human-PRP.
3 zeigt Hemmaktivitäten des Antikörpers 2, des Antikörpers 4 und von NMC-4, gemessen als RIPA basierend auf der Verwendung von Meerschweinchen-PRP.
4 zeigt Hemmaktivitäten des Antikörpers 2, des Antikörpers 4 und von NMC-4, gemessen als BIPA basierend auf der Verwendung von Human-PRP.
5 (Vergleich) zeigt Hemmaktivitäten des Antikörpers 1, des Antikörpers 3 und von NMC-4, gemessen als BIPA basierend auf der Verwendung von Human-PRP.
6 zeigt Hemmaktivitäten des Antikörpers 2, des Antikörpers 4 und von NMC-4, gemessen als BIPA basierend auf der Verwendung von Meerschweinchen-PRP.
7 zeigt Hemmaktivitäten des Antikörpers 2, des Antikörpers 4 und von NMC-4, gemessen als BIPA basierend auf der Verwendung von Ratten-PRP.
8 zeigt Hemmaktivitäten des Antikörpers 2, des Antikörpers 4 und von NMC-4, gemessen als BIPA basierend auf der Verwendung von Hasen-PRP.
9 (Vergleich) zeigt Hemmaktivitäten des Antikörpers 1, des Antikörpers 3 und von NMC-4, gemessen als BIPA basierend auf der Verwendung von Hasen-PRP.
10 zeigt Hemmaktivitäten des Antikörpers 2, des Antikörpers 4 und von NMC-4, gemessen als SIPA basierend auf der Verwendung von Human-PRP.
11 (Vergleich) zeigt Hemmaktivitäten des Antikörpers 1, des Antikörpers 3 und von NMC-4, gemessen als SIPA basierend auf der Verwendung von Human-PRP.
12. zeigt Einflüsse des Antikörpers 2, des Antikörpers 4 und von NMC-4 auf die Bindung von vWF an immobilisierte Human-Blutplättchen (in Gegenwart von Ristocetin).
13 (Vergleich) zeigt Einflüsse des Antikörpers 1, des Antikörpers 3 und von NMC-4 auf die Bindung von vWF an immobilisierte Human-Blutplättchen (in Gegenwart von Ristocetin).
14 zeigt Einflüsse des Antikörpers 2, des Antikörpers 4 und von NMC-4 auf die Bindung von vWF an immobilisierte Human-Blutplättchen (in Gegenwart von Botrocetin).
15 (Vergleich) zeigt Einflüsse des Antikörpers 1, des Antikörpers 3 und von NMC-4 auf die Bindung von vWF an immobilisierte Human-Blutplättchen (in Gegenwart von Botrocetin).
16 zeigt Auswirkungen der jeweiligen monoklonalen Antikörper auf die Bindung von biotinyliertem AJvW-1 an immobilisiertes vWF.
17 zeigt Auswirkungen der jeweiligen monoklonalen Antikörper auf die Bindung von biotinyliertem AJvW-2 an immobilisiertes vWF.
18 zeigt Auswirkungen der jeweiligen monoklonalen Antikörper auf die Bindung von biotinyliertem AJvW-3 an immobilisiertes vWF.
19 zeigt Auswirkungen der jeweiligen monoklonalen Antikörper auf die Bindung von biotinyliertem AJvW-4 an immobilisiertes vWF.
20 zeigt Auswirkungen der jeweiligen monoklonalen Antikörper auf die Bindung von biotinyliertem NMC-4 an immobilisiertes vWF.
21 zeigt Hemmwirkungen des Antikörpers 2 und des Antikörpers 4, gemessen an Ex-vivo-Meerschweinchen-RIPA.
22 zeigt eine Hemmwirkung des Antikörpers 4, gemessen an Ex-vivo-Meerschweinchen-BIPA.
23 zeigt eine Wirkung des Antikörpers 2 auf die Okklusionszeit in einem Meerschweinchen-PIT-Modell.
24 zeigt eine Wirkung des Antikörpers 4 auf die Okklusionszeit in einem Meerschweinchen-PIT-Modell.
25 zeigt eine Wirkung des Antikörpers 2 auf die Okklusionszeit in einem Meerschweinchen-A-V-Shuntmodell.
26 zeigt eine Wirkung des Antikörpers 2 auf die Blutungszeit in einem Meerschweinchen-Blutungszeitmodell.
27 zeigt eine Wirkung des Antikörpers 4 auf die Blutungszeit in einem Meerschweinchen-Blutungszeitmodell.
Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele im Detail erläutert. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die unten beschriebenen Beispiele beschränkt.
Beispiele
<1> Bildung von monoklonalen Antikörpern
(1) Immunsensibilisierung und Zellfusion
Gereinigtes Human-vWF wurde mit einer gleichen Menge eines Adjuvans (MPL + TDM EMULSION: Markenname RIBI) vermischt, und das erhaltene Gemisch wurde männlichen Balb/c-Mäusen (zu Beginn der Immunisierung 8 Wochen alt) subkutan verabreicht, und zwar in einer Menge, die der Menge von 100 μg vWF pro Maus entsprach (Grundimmunisierung). Nach 21 Tagen wurde auf dieselbe Weise wie oben beschrieben eine weitere Immunisierung durch subkutane Verabreichung durchgeführt (Booster-Immunisierung). 19 Tagen oder 30 Tage nach dem Booster wurden den Mäusen durch ihre Schwanzvenen 200 μl eines Präparats verabreicht, das durch Verdünnen von Human-vWF mit PBS (phosphatgepufferte physiologische Salzlösung, hergestellt von Nissui) erhalten wurde, um eine Konzentration von 250 μg/ml zu erhalten (Endimmunisierung).
3 Tage nach der Endimmunisierung wurden die Milzen der Mäuse entfernt und in einzelne Zellen aufgetrennt. Danach wurden die Milzzellen mit einem DMEM-Medium gewaschen. Außerdem wurden Sp2/O-Ag14-Mäuse-Myelomzellen in der logarithmischen Wachstumsphase gesammelt und mit einem DMEM-Medium gewaschen. Die Milzzellen und die Mäuse-Myelomzellen wurden in einem Verhältnis der Zellenanzahl von 10 : 1 in einem Kunststoffrohr ausreichend vermischt, und dann wurde 50% (Gew./Vol.) Polyethylenglykol (hergestellt von Boehringer Mannheim, mittleres Molekulargewicht: 4.000) zugesetzt, um eine 7-minütige Zellfusion bei 37°C durchzuführen.
Eine Überstandslösung wurde durch Zentrifugation entfernt, und dem Rückstand wurde ein HAT-Medium zugesetzt (DMEM-Medium mit 10% Rinderfötenserum, dem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin zugesetzt wurden). Der Rückstand wurde suspendiert, so dass die Konzentration der Milzzellen 5 × 10⁶ Zellen/ml betrug. Diese Zellsuspension wurde dispensiert und in 96-Napf-Kunststoffplatten gegossen, so dass jeder Napf 100 μl der Suspension enthielt, wonach sie bei 37°C in 5% Kohlendioxid kultiviert wurde. Am 2. und 5. Tag wurde das HAT-Medium wurde um eine Menge von 50 μl/Napf ergänzt. Danach wurde alle 3 oder 4 Tage das halbe Volumen des Mediums in Übereinstimmung mit der Proliferation der Hybridome ausgetauscht.
(2) Screening und Klonierung der Hybridome
Hybridome, die den monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung produzierten, wurden unter Nutzung der Hemmaktivität des monoklonalen Antikörpers in Bezug auf die physiologische Aktivität von vWF als Index gescreent. Nach Beendigung der Proliferation der Hybridome wurden aus einem Teil des Mediums in jedem Napf Proben gezogen, welche dann auf ihre Hemmaktivitäten gegenüber RIPA und BIPA gemessen wurden. Hybridomklone, die beide Reaktionen stark hemmen, wurden ausgewählt.
Aus den ausgewählten Klonen wurden Hybridome, die monoklonale Antikörper produzierten, welche Reaktivität mit vWFs von Meerschweinchen, Hasen und Ratten aufwie sen, ausgewählt. Die erhaltenen Hybridome wurden in ein HT-Medium derselben Zusammensetzung wie das HAT-Medium, mit der Ausnahme, dass das Aminopterin aus dem HAT-Medium entfernt wurde, übertragen, und weiter kultiviert. In Übereinstimmung mit dem Grenzverdünnungsverfahren wurde zwei Mal kloniert. So wurden stabile Hybridome erhalten. Die zwei letztendlich erhaltenen Hybridome wurden als AJvW-2 und AJvW-4 bezeichnet.
Auf der anderen Seite wurden aus den Klonen, welche die oben beschriebenen Reaktionen von RIPA und BIPA stark hemmten, Hybridome ausgewählt, die monoklonale Antikörper produzierten, welche keine Reaktivität mit vWFs von Meerschweinchen, Hasen und Ratten aufwiesen. Die erhaltenen Hybridome wurden in ein HT-Medium derselben Zusammensetzung wie das HAT-Medium, mit der Ausnahme, dass das Aminopterin aus dem HAT-Medium entfernt wurde, übertragen, und dort weiter kultiviert. In Übereinstimmung mit dem Grenzverdünnungsverfahren wurde zwei Mal kloniert. So wurden stabile Hybridome erhalten. Die zwei letztendlich erhaltenen Hybridome wurden als AJvW-1 und AJvW-3 bezeichnet.
AJvW-2 und AJvW-4 produzierten monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung, und AJvW-1 und AJvW-3 produzierten monoklonale Antikörper, die nicht im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen.
<2> Produktion und Reinigung von monoklonalen Antikörpern
(1) Produktion von monoklonalen Antikörpern
2,6,10,14-Tetramethylpentadecan (Markenname: Pristane, hergestellt von Sigma, 0,5 ml) wurde intraperitoneal in 6 bis 8 Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse injiziert. Nach 10 bis 20 Tagen wurden Zellen von AJvW-1, AJvW-2, AJvW-3 oder AJvW-4 (1 × 10⁶ bis 10⁷ Zellen) in PBS suspendiert, und die Mäuse wurden intraperitoneal damit geimpft. Nach 7 bis 10 Tagen wurden die Mäuse getötet und einer Unterleibsoperation unterzogen, wobei produzierte Aszitesflüssigkeit gesammelt wurde. Die Aszitesflüssigkeit wur de zentrifugiert, um unlösliche Stoffe zu entfernen, und ein Überstand wurde gewonnen und bei –20°C gelagert.
(2) Reinigung von monoklonalen Antikörpern
IgG wurde unter Verwendung eines Hi-Trap Protein-A Antikörperreinigungskits (Markenname, hergestellt von Pharmacia) aus dem oben beschriebenen Aszitesflüssigkeit-Überstand gereinigt. Zur Aszitesflüssigkeit (2 ml) wurde eine Lösung A (1,5 Mol Glycin, 3 Mol NaCl, pH 8,9, 8 ml) zugesetzt, und dann wurde sie durch einen Filter mit einer Porengröße von 45 μm (hergestellt von Millipore) filtriert. Danach wurde das erhaltene Filtrat auf eine mit Protein Sepharose HP (hergestellt von Pharmacia) befüllte und ausreichend mit der Lösung A äquilibrierte Säule (Säulenvolumen: 1 ml) aufgetragen, und die Säule wurde dann mit einer 10fachen Menge des Säulenvolumens der Lösung A gewaschen. Danach wurde eine IgG-Fraktion mit einer 10fachen Menge des Säulenvolumens einer Lösung B (0,1 Mol Glycin, pH 2,8) eluiert. Die eluierte IgG-Fraktion wurde gegen PBS dialysiert, welche als gereinigte Probe verwendet wurde.
Die von AJvW-1, AJvW-2, AJvW-3 und AJvW-4 produzierten monoklonalen Antikörper werden hierin im Folgenden als "Antikörper 1 ", "Antikörper 2", "Antikörper 3" und "Antikörper 4" bezeichnet.
NMC-4 wurde auf dieselbe Weise wie oben beschrieben von NMC-4 enthaltender Mäuse-Aszitesflüssigkeit gereinigt, um eine Probe zu erhalten, die als Kontrollvergleich verwendet wurde.
<3> Bestimmung von Subklassen von monoklonalen Antikörpern
Die IgG-Subklassen der monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung wurden unter Verwendung der unter Punkt < 2 > erhaltenen gereinigten Antikörper bestimmt, wobei ein im Handel erhältliches Subklassen-Bestimmungskit (Markenname: Mono Ab-ID EIA Kit A, hergestellt von Zymed) verwendet wurde. Dieses Verfahren basiert auf dem ELISA-Verfahren. Das Ergebnis war, dass "Antikörper 1 ", "Antikörper 2", "Antikörper 3" und "Antikörper 4" zur Klasse des IgG gehörten. Es wurde bestimmt, dass die Subklasse von Antikörper 1 und Antikörper 3 IgG2a-Isotyp, die Subklasse von Antikörper 2 IgG1-Isotyp und die Subklasse von Antikörper 4 IgG2b-Isotyp war. NMC-4 gehörte zu IgG1, was auch zuvor berichtet worden war.
<4> Hemmaktivitäten von monoklonalen Antikörpern gemäß vorliegender Erfindung gegenüber der Blutplättchenaggregation
(1) Hemmwirkungen gegenüber RIPA
Blut von einem normalen menschlichen Spender wurde in einem Verhältnis von 9 : 1 mit 3,8% Natriumcitrat gemischt und dann bei 1.100 U/min 10 Minuten lange zentrifugiert, um blutplättchenreiches Plasma (PRP) herzustellen. PRP (3 × 10⁸ Plättchen/ml, 225 μl) wurde bei 37°C 3 Minuten lang mit dem monoklonalen Antikörper (2 μl) in verschiedenen Konzentrationen umgesetzt. Danach wurde Ristocetin (hergestellt von Sigma) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1,5 mg/ml zu erhalten. Die Blutplättchenaggregation wurde bei 37°C 10 Minuten lang beobachtet, indem ein Gerät zu Messung der Blutplättchenaggregationsfähigkeit verwendet wurde (Markenname: HE-MATRCER, hergestellt von Niko Bioscience). Das Ausmaß der Blutplättchenaggregation wurde durch eine Veränderung der optischen Durchlässigkeit ausgedrückt. Die Hemmaktivität gegenüber der Blutplättchenaggregation wurde bestimmt, indem die maximale Aggregation, die durch Zusatz von DMEM oder des Puffers zur Lösung der Probe erhalten wurde, als Kontrolle verwendet wurde.
Die Ergebnisse sind in 1 (Antikörper 2, 4) und 2 (Antikörper 1, 3) dargestellt. Antikörper 1, Antikörper 2, Antikörper 3, Antikörper 4 und NMC-4 hemmten Human-RIPA in Abhängigkeit von der Dosis. Die Werte für IC₅₀ waren 0,8 μg/ml für Antikörper 1, 3,5 μg/ml für Antikörper 2, 1,0 μg/ml für Antikörper 3, 2,0 μg/ml für Antikörper 4 und 0,7 μg/ml für NMC-4.
Meerschweinchen-PRP wurde auf dieselbe Weise wie oben beschrieben hergestellt, diesem wurde dann Ristocetin zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1,75 mg/ml zu erhalten, und dieselben Messungen wie oben beschrieben wurden durchgeführt. Antikörper 1 (Endkonzentration: 80 μg/ml), Antikörper 3 (Endkonzentration: 80 μg/ml) und NMC-4 (Endkonzentration: 27 μg/ml) hemmten RIPA bei Meerschweinchen nicht im Geringsten, während Antikörper 2 und Antikörper 4 RIPA bei Meerschweinchen in Abhängigkeit von der Dosis hemmten (3). Die Werte für IC₅₀ waren 0,4 μg/ml für Antikörper 2 und 1 μg/ml für Antikörper 4.
(2) Hemmaktivitäten gegenüber BIPA
Vor der Messung von BIPA wurde ein Schlangengift, d. h. Botrocetin, aus einem rohen Giftpräparat (hergestellt von Sigma) der Bothorops jararaca purifiziert. 1 g des rohen Giftpräparats wurde in 20 mMol 0,15 Mol NaCl enthaltendem Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) gelöst, und unlösliche Stoffe wurden durch Zentrifugation bei 3.000 U/min entfernt. Der erhaltene Überstand wurde einer Gelfiltration unter Verwendung des Sephadex G-75 (5 × 90 cm, hergestellt von Pharmacia) unterzogen. Fraktionen, die einem Elutionsvolumsbereich von 480 bis 570 ml entsprachen, wurden gesammelt, und die erhaltene Lösung wurde unter Verwendung eines Ultrafiltrations-Konzentrationsgeräts (DIAFLO YM-10, hergestellt von Amicon) auf ein Volumen von 20 ml eingeengt. Danach wurde die konzentrierte Lösung auf eine auf der Verwendung von DEAD-TOYOPEARL-650M basierende lonenaustauschsäule (1,6 × 32 cm, hergestellt von Pharmacia) aufgetragen und durch Anlegung eines Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,3 Mol NaCl eluiert. Die nach 600 bis 640 Minuten eluierten Fraktionen wurden gesammelt, und die erhaltene Lösung wurde auf dieselbe Weise wie oben beschrieben auf ein Volumen von 4 ml eingeengt. Danach wurde die konzentrierte Lösung auf eine Gelfiltrationssäule (Sephadex G-75, 2,6 × 90 cm, hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, indem als Lösungsmittel 20 mMol 0,15 Mol NaCl enthaltender Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) verwendet wurden. Es wurden Fraktionen mit starken Blutplättchenaggregationsaktivitäten abgenommen, und eine kombinierte Lösung wurde als gereinigte Probe verwendet.
Human-PRP (3 × 10⁸ Blutplättchen/ml, 225 μl) wurde bei 37°C 3 Minuten lang mit dem monoklonalen Antikörper (2 μl) in verschiedenen Konzentrationen umgesetzt. Danach wurde wie oben beschrieben erhaltenes Botrocetin zugesetzt, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml zu erhalten, und die Blutplättchenaggregation wurde auf dieselbe Weise wie in Punkt (1) gemessen. Die Ergebnisse sind in 4 (Antikörper 2, 4) und 5 (Antikörper 1, 3) dargestellt. Antikörper 1, Antikörper 2, Antikörper 3, Antikörper 4 und NMC-4 hemmten BIPA in Abhängigkeit von der Dosis. Die Werte für IC₅₀ waren 0,8 μg/ml für Antikörper 1, 2,0 μg/ml für Antikörper 2, 1,0 μg/ml für Antikörper 3, 5,6 μg/ml für Antikörper 4 und 2,0 μg/ml für NMC-4.
Meerschweinchen-PRP wurde auf dieselbe Weise wie oben beschrieben hergestellt, diesem wurde dann Botrocetin zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2 μg/ml zu erhalten, und dieselben Messungen wie oben beschrieben wurden durchgeführt. Antikörper 1 (Endkonzentration: 80 μg/ml), Antikörper 3 (Endkonzentration: 80 μg/ml) und NMC-4 (Endkonzentration: 27 μg/ml) hemmten BIPA bei Meerschweinchen nicht im Geringsten, während Antikörper 2 und Antikörper 4 BIPA bei Meerschweinchen in Abhängigkeit von der Dosis hemmten (6). Die Werte für IC₅₀ waren 3,1 μg/ml für Antikörper 2 und 3,5 μg/ml für Antikörper 4.
PRP wurde hergestellt, indem zitriertes Rattenblut bei 1.300 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert wurde. Dem PRP wurde dann Botrocetin zugesetzt (5 × 10⁸ Blutplättchen/ ml), um eine Endkonzentration von 0,08 μg/ml zu erhalten, und dieselben Messungen wie oben beschrieben wurden durchgeführt. Antikörper 1 (Endkonzentration: 80 μg/ml), Antikörper 3 (Endkonzentration: 80 μg/ml) hemmten BIPA bei Ratten nicht im Geringsten, während Antikörper 2, Antikörper 4 und NMC-4 BIPA bei Ratten in Abhängigkeit von der Dosis hemmten (7). Die Werte für IC₅₀ waren 1,2 μg/ml für Antikörper 2, 5,0 μg/ml für Antikörper 4 und 2,2 für NMC-4.
PRP wurde hergestellt, indem zitriertes Hasenblut bei 1.200 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert wurde. Dem PRP wurde dann Botrocetin zugesetzt (3 × 10⁸ Blutplättchen/ ml), um eine Endkonzentration von 0,075 μg/ml zu erhalten, und dieselben Messungen wie oben beschrieben wurden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 8 (Antikörper 2, 4) und 9 (Antikörper 1, 3) dargestellt. Antikörper 1 (Endkonzentration: 80 μg/ml), Antikörper 3 (Endkonzentration: 80 μg/ml) und NMC-4 (Endkonzentration: 80 μg/ml) hemmten BIPA bei Hasen nicht im Geringsten, während Antikörper 2 und Antikörper 4 BIPA in Abhängigkeit von der Dosis hemmten. Die Werte für IC₅₀ waren 5,0 μg/ml für Antikörper 2 und 1,8 μg/ml für Antikörper 4.
(3) Hemmaktivitäten gegenüber SIPA
Human-PRP (2,5 × 10⁸ Blutplättchen/ml, 360 μl) wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten lang mit dem monoklonalen Antikörper (40 μl) in verschiedenen Konzentrationen umgesetzt. Danach wurde die durch Scherbeanspruchung induzierte Blutplättchenaggregation unter Verwendung eines Geräts zur Messung der Zelltfunktion (hergestellt von Toray) gemessen. Das Reaktionsgemisch wurde während eines Zeitraums von 0 bis 15 Sekunden mit einer konstanten Scherung von 6 Dyn/cm², während eines Zeitraums von 15 bis 105 Sekunden mit einem niedrigen Schergradienten von 6 → 12 Dyn/cm², während eines Zeitraums von 105 bis 226 Sekunden mit einem hohen Schergradienten von 12 → 108 Dyn/cm² und während eines Zeitraums von bis zu 350 Sekunden mit einer konstanten Scherung von 108 Dyn/cm² aufgetragen. Das Ausmaß der Blutplättchenaggregation wurde durch die Verwendung der maximalen Aggregation als Kontrolle bestimmt, wobei die maximale Aggregation durch Zusatz von DMEM oder des Puffers zur Lösung der Probe erhalten wurde.
Die Ergebnisse sind in 10 (Antikörper 2, 4) und 1 1 (Antikörper 1, 3) dargestellt. Antikörper 1, Antikörper 2, Antikörper 3, Antikörper 4 und NMC-4 hemmten Human-SIPA in Abhängigkeit von der Dosis. Die Werte für IC₅₀ waren 0,7 μg/ml für Antikörper 1, 1,1 μg/ml für Antikörper 2, 0,9 μg/ml für Antikörper 3, 1,5 μg/ml für Antikörper 4 und 1,5 μg/ml für NMC-4.
<5> Affinität monoklonaler Antikörper gemäß vorliegender Erfindung zu Human-vWF
(1)¹²⁵I-Markierung von Human-vWF
Iodogen (hergestellt von Pierce, 1 mg/ml) und eine Dichlormethanlösung (1 ml) wurden in ein Polypropylenröhrchen zugesetzt, aus dem das Lösungsmittel unter Verwendung eines Stickstoffstrahls entfernt wurde. Eine Lösung von Human-vWF (0,43 mg/ml) wurde in das Polypropylenrörchen gegossen, und dann wurde eine Lösung von Na¹²⁵I (15,9 MBq, 8,6 μl) zugesetzt, um eine 2-minütige Reaktion bei Raumtemperatur durchzuführen. Nach der Reaktion wurde die Reaktionslösung auf eine PD10-Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit einer 2 ml eines 10% BSA (Rinder-Serumalbumin) enthaltenden TBS-Lösung (trisgepufferte Kochsalzlösung) blockiert und mit 100 ml TBS gewaschen worden war. Danach wurde eine Elution mit TBS durchgeführt. Die eluierte Lösung wurde in Fraktionen fraktioniert, die jeweils ein Volumen von 500 μl aufwiesen. Ein aliquoter Teil (2 μl) jeder eluierten Fraktion wurde unter Verwendung eines γ-Zählers (Zählzeit: 1 Minute) auf seine Radioaktivität gemessen. Fraktionen mit hohen Zählwerten wurden gesammelt, und eine kombinierte Fraktion (1 ml) wurde als Lösung von '²⁵I-markiertem Human-vWF (¹²⁵I-vWF) (0,3 mg/ml Human-vWF, 220630 cpm/μl) bestimmt.
(2) Herstellung immobilisierter Blutplättchen
Human-PRP, das auf dieselbe Weise wie unter Punkt <4>, (1) beschrieben gesammelt wurde, wurde zu einem gleichen Volumen einer 2% Paraformaldehyd-Lösung zugesetzt und mit ihr vermischt und dann bei 4°C über Nacht stehen gelassen. Am nächsten Tag wurden die immobilisierten Blutplättchen wiedergewonnen und in einem Zentrifugationsvorgang drei Mal mit PBS gewaschen. Danach wurden die immobilisierten Plättchen wieder in PBS suspendiert, wobei dessen Volumen dem PRP-Volumen beim Sammeln entsprach, und die erhaltene Suspension wurde als Suspension von immobilisierten Blutplättchen verwendet.
(3) Wirkung monoklonaler Antikörper gemäß vorliegender Erfindung auf die Blutplättchen-Bindefähigkeit von vWF
Die Suspension von immobilisierten Blutplättchen, eine Lösung des Antikörpers in verschiedenen Konzentrationen und eine Ristocetin-Lösung oder eine Botrocetin-Lösung wurden dispensiert und ein einen 96-Napf-Filtrationsfilterplatte gegossen, die vorher mit 1% BSA enthaltendem PBS blockiert worden war, dann wurde die ¹²⁵I-vWF-Lösung zugesetzt und das Ganze 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nachdem die Platte stehengelassen worden war, wurde nicht an immobilisierte Blutplättchen gebundenes ¹²⁵I-vWF durch Absaugen abfiltriert, und der Filter wurde mit 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen. Auf dem Filter verbleibendes ¹²⁵I wurde unter Verwendung eines γ-Zählers (Summierzeit: 1 Minute) gemessen, um das Ausmaß der Bindung des Human-vWF and die immobilisierten Blutplättchen zu bestimmen. Das Verhältnis zwischen dem Bindungsausmaß von Human-vWF an die Blutplättchen in Gegenwart der Antikörper und dem Bindungsausmaß von Human-vWF and die Blutplättchen in Abwesenheit der Antikörper wurde als Bindungsverhältnis (%) bezeichnet.
Die in Gegenwart von Ristocetin erhaltenen Ergebnisse sind in 12 (Antikörper 2, 4) und 13 (Antikörper 1, 3) dargestellt. Die in Gegenwart von Botrocetin erhaltenen Ergebnisse sind in 14 (Antikörper 2, 4) und 15 (Antikörper 1, 3) dargestellt. Antikörper 1, Antikörper 2, Antikörper 3, Antikörper 4 und NMC-4 hemmten die mit Ristocetin zusammenhängende Bindung und die mit Botrocetin zusammenhängende Bindung von vWF and die Blutplättchen in Abhängigkeit von der Dosis. Die Werte für IC₅₀ bei der mit Ristocetin zusammenhängenden Reaktion waren 0,37 μg/ml für Antikörper 1, 1,1 μg/ml für Antikörper 2, 20,0 μg/ml für Antikörper 3, 0,95 μg/ml für Antikörper 4 und 0,35 μg/ml für NMC-4. Die Werte für IC₅₀ bei der mit Botrocetin zusammenhängenden Reaktion waren 1,2 μg/ml für Antikörper 1, 0,9 μg/ml für Antikörper 2, 2,1 μg/ml für Antikörper 3, 0,9 μg/ml für Antikörper 4 und 0,3 μg/ml für NMC-4.
<6> Vergleich von Epitopen von Antikörper 1, Antikörper 2, Antikörper 3 und Antikörper 4 mit einem Epitop von NMC-4
Um Epitope von Antikörper 1, Antikörper 2, Antikörper 3 und Antikörper 4 mit einem Epitop von NMC-4 zu vergleichen, wurden die Hemmwirkungen von Antikörper 1, Antikörper 2, Antikörper 3 und Antikörper 4 auf die Bindung von NMC-4 an immobilisierten Human-vWF untersucht.
Gereinigte Antikörper 1, Antikörper 2, Antikörper 3 und Antikörper 4 sowie NMC-4 wurden unter Verwendung eines Biotinylierungskits (Markenname von Amersham) biotinyliert, um Proben des biotinylierten Antikörpers 1, biotinylierten Antikörpers 2, biotinylierten Antikörpers 3, biotinylierten Antikörpers 4 und biotinylierten NMC-4 bereitzustellen. Eine gegen eine PBS-Lösung dialysierte Lösung von jedem der monoklonalen Antikörper wurde zu einer Lösung von Biotin-Spacerarm-N-Hydroxysuccinimidester zugesetzt, um eine 1-stündige Reaktion bei Raumtemperatur durchzuführen, wonach eine Reinigung unter Verwendung einer Säule Sephadex G25 (hergestellt von Pharmacia) durchgeführt wurde.
In einer PBS-Lösung gelöstes Human-vWF (5 μg/ml) wurde in einer Menge von 50 μl zu jedem Napf der E.I.A. Mikrotiterplatte (hergestellt von Linbro/Titertek) zugesetzt, welche denn bei 4°C über Nacht stehen gelassen wurden. So wurde Human-vWF immobilisiert. Am nächsten Tag wurde jeder Napf drei Mal mit einer Waschlösung (0,05 Tween 20 enthaltendes PBS) gewaschen, und dann wurde eine 0,5% BSA enthaltende PBS-Lösung zugesetzt und das Ganze wurde 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. So wurden Teile blockiert, in denen kein Protein absorbiert war.
Jeder der biotinylierten Antikörper wurde in einem Eppendorf-Rohr mit nicht biotinyliertem Antikörper 1, Antikörper 2, Antikörper 3, Antikörper 4 oder NMC-4 vermischt, und jede der erhaltenen Lösungen wurde in einer Menge von 50 μl zu jeder der oben beschriebenen immobilisierten Human-vWF-Näpfe zugesetzt, um eine 1-stündige Inkuba tion bei 37°C durchzuführen. Nachdem die Näpfe gewaschen worden waren, wurden zu jedem Napf 50 μl einer Lösung von Streptavidinalkalinphosphatase (hergestellt von Amersham), die 500fach mit 0,05 Mol 0,05% Tween 20 und 1% BSA enthaltendem TBS verdünnt war, zugesetzt, wonach bei 37°C eine 1-stündige Reaktion durchgeführt wurde.
Nachdem die Näpfe gewaschen worden waren, wurden zu jedem Napf 100 μl eines Farbentwickler-Substrats, d. h. p-Nitrophenylphosphat (hergestellt von Sigma) zugesetzt, wonach das Ganze 20 Minuten lang ruhig stehen gelassen wurde. Der an Human-vWF gebundene, biotinylierte Antikörper wurde bei 405 nm auf Basis der Absorption gemessen. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart einer überschüssigen Menge (100-fach) des nicht biotinylierten Antikörpers auf dieselbe Weise wie oben beschrieben gemessen. Der Wert der zweiten Messung wurde vom Wert der ersten Messung subtrahiert, um den Wert zu erhalten, der als spezifische Absorption bezeichnet wurde.
Die Ergebnisse sind in 16 bis 20 dargestellt. Antikörper 1, Antikörper 2, Antikörper 3 und Antikörper 4 hemmten die Bindung des biotinylierten NMC-4 an das immobilisierte vWF nicht im Geringsten, während sie die Bindung des biotinylierten Antikörpers 1, biotinylierten Antikörpers 2, biotinylierten Antikörpers 3 und biotinylierten Antikörpers 4 an das immobilisierte vWF hemmten. Auf der anderen Seite hemmte NMC-4 die Bindung des biotinylierten Antikörpers 1, biotinylierten Antikörpers 2, biotinylierten Antikörpers 3 und biotinylierten Antikörpers 4 an das immobilisierte vWF nicht im Geringsten. Die oben genannten Ergebnisse zeigten, dass die Epitope für Antikörper 1, Antikörper 2, Antikörper 3 und Antikörper 4 an aneinandergrenzenden Positionen auf dem vWF vorhanden sind, dass sie sich jedoch vom Epitop für NMC-4 unterscheiden.
<7> Hemmwirkung auf die Blutplättchenaggregation bei Meerschweinchen (ex vivo)
Die unter dem vorhergehenden Punkt <2> gereinigten Antikörper 2 und Antikörper 4 wurden auf verschiedene Konzentrationen mit PBS eingestellt und in einer Dosis von 100 μg/kg oder 300 μg/kg intravenös an Meerschweinchen (weiblich, 430 bis 600 g) verabreicht (eine Gruppe: 4 Meerschweinchen). PBS wurde als Placebokontrolle verwendet. Nach 5 Minuten wurde unter Etherbetäubung Blut mit Zitronensäure aus der Bauchaorta entnommen, aus dem PRP (Zahl der Blutplättchen: 3,0 × 10⁸ Plättchen/ml) hergestellt wurde, um RIPA oder BIPA in Übereinstimmung mit dem unter Punkt <4> beschriebenen Verfahren zu messen. Der prozentuelle Hemmwert der einzelnen Antikörper auf die Blutplättchenaggregation wurde unter der Voraussetzung berechnet, dass der maximale Aggregationswert in der PBS-Gruppe mit 100% angenommen wurde.
Die Ergebnisse sind in 21 und 22 dargestellt. Antikörper 2 und Antikörper 4 hemmten RIPA in Abhängigkeit von der Dosis. Die ED₅₀-Werte (Werte der 50%igen Hemmung der Blutplättchenaggregation) betrugen 70 μg/kg für Antikörper 2 und 90 μg/kg für Antikörper 4. Bei BIPA wies Antikörper 4 einen ED₅₀-Wert von 55 μg/kg auf. Die starke Wirkung von Antikörper 2 und Antikörper 4 bei der Hemmung von RIPA und BIPA wurde bis zu 6 Stunden nach der Verabreichung kontinuierlich beobachtet und verschwand nach 48 Stunden.
Unabhängig vom oben beschriebenen Test wurden 5 Minuten nach der Verabreichung des Antikörpers unter Verwendung eines automatisierten Hämatologieanalysators (Sysmex E-2000, hergestellt von Toa Medical Electronics) hämatologische Parameter des mit Zitronensäure entnommenen Vollbluts gemessen. Antikörper 2 oder Antikörper 4 wurde in einer Verabreichungsdosis von 100 μg/kg oder 300 μg/kg verabreicht. In beiden Fällen trat keine bedeutende Veränderung in der Gesamtzahl der Blutplättchen, in der Gesamtzahl der Erythrozyten, in der Gesamtzahl der Leukozyten, in der Hämoglobinkonzentration, im Hematokritwert, im mittleren Blutkörperchenvolumen, im mittleren Blutkörperchenhämoglobin, in der mittleren Blutkörperchenhämoglobinkonzentration, in der Verteilungsbreite der Erythrozyten, in der Blutplättchenverteilungsbreite, im mittleren Blutplättchenvolumen, im Anteil großer Zellen unter den Leukozyten und im Blutplättchenhematrokritwert auf.
Blutplasma wurde mithilfe eines Zentrifugationsvorgangs auf dieselbe Weise wie oben beschrieben vom Blut abgetrennt, das 5 Minuten nach der Verabreichung des Antikörpers erhalten wurde. Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit, die Thromboplastinzeit und die Fibrinogenkonzentration des Blutplasmas wurden unter Verwendung eines Koagulationsparameter-Messgeräts (Sysmex CA-3000, hergestellt von Toa Medical Electronics) gemessen. Das Ergebnis war, dass keine bedeutenden Veränderung in den jeweiligen Parametern auftraten, auch nicht wenn Antikörper 2 oder Antikörper 4 in einer Verabreichungsdosis von 1.000 μg/kg verabreicht wurden.
<8> Präventive Wirkungen der monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender Erfindung auf die Thrombenbildung bei Meerschweinchen (in vivo)
(1) Evaluierung der präventiven Wirkungen auf die Thrombenbildung in einem photochemisch induzierten Thrombenmodell in der Arteria carotis eines Meerschweinchens (PIT-Modell)
In der Arteria carotis eines Meerschweinchens wurde nach dem Verfahren von Nakajima et al. (Thrombosis Research 67, 435 (1992) die Bildung eines okklusiven Thrombus ermöglicht, so dass die Zeit der Thrombenbildung mit oder ohne Verabreichung von Antikörper 2 oder Antikörper 4 gemessen wurde.
Die Arteria carotis des Meerschweinchens wurde unter Urethananästhesie freigelegt und abgeblättert, wonach eine Sonde eines Puls-Doppler-Blutdurchflussmessers eingesetzt wurde. Antikörper 2, Antikörper 4 oder physiologische Kochsalzlösung wurden in einer Menge von 30, 100 oder 300 μg/kg durch eine an die Arteria carotis angeschlossenen Kanüle verabreicht. Nach 5 Minuten wurde ein Photosenisibilisator, d. h. Diodeosin, in einer Menge von 10 mg/kg durch dieselbe Kanüle verabreicht. Gleichzeitig wurde ein stromauf von der Stelle, an der die Sonde plaziert war, liegendes Blutgefäß (auf der Herzseite gelegen) unter Verwendung einer thrombenproduzierenden Lichtquelle (hergestellt von Hamamatsu Photonics) bei 540 nm mit anregendem grünen Licht bestrahlt, um die Zeit (Okklusionszeit) bis zur Okklusion des Blutgefäßes und zur Unterbrechung des Blutkreislaufes aufgrund der Thrombenbildung zu messen.
Die Ergebnisse sind in 23 und 24 dargestellt. Antikörper 2 und Antikörper 4 verlängerten die Okklusionszeit in einer Verabreichungsdosis von nicht weniger als 100 μg/kg bedeutend. Die Daten wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests statistisch verarbeitet. In 23 und 24 weist das Symbol * auf p < 0,05 und das Symbol * * auf p < 0,01 hin.
(2) Evaluierung der präventiven Wirkung auf die Thrombenbildung basierend auf einem A-V-Shuntmodell
Ein Polyethylenschlauch wurde unter Urethananästhesie in die linke Vena jugularis eines Meerschweinchens eingeführt, und Antikörper 2 oder physiologische Kochsalzlösung wurden durch ihn in einer Dosis von 30, 100 oder 300 μg/kg verabreicht. Nach 5 Minuten wurde das entgegengesetzte Ende des Schlauchs in die recht Vena jugularis eingeführt, um einen Shunt zu bilden, und der Blutkreislauf wurde wieder geöffnet. Die Zeit bis zur Unterbrechung des Blutkreislaufs (Okklusionszeit) wurde unter Verwendung eines Puls-Doppler-Blutdurchflussmessers gemessen.
Die Ergebnisse sind in 25 dargestellt. Antikörper 2 verlängerte die Okklusionszeit in einer Verabreichungsdosis von nicht weniger als 100 μg/kg bedeutend. Die Daten wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests statistisch verarbeitet. In 25 weist das Symbol * auf p < 0,05 und das Symbol ** auf p < 0,01 hin.
(3) Evaluierung der Verlängerung der Blutungszeit
Antikörper 2, Antikörper 4 oder eine physiologische Salzlösung wurden einem Meerschweinchen unter Pentobarbitalanästhesie in einer Dosis von 100 oder 300 μg/kg intravenös verabreicht. Nach 5 Minuten wurde die Arteria plantaris über eine Länge von 5 mm aufgeschnitten. Alle 15 Minuten wurde überprüft, ob Blutungen vorhanden waren oder nicht, wobei als Index ein Blutfleck auf einem Filterpapier verwendet wurde. Die Zeit vom Einschnitt bis zum Ende der Blutung wurde gemessen.
Die Ergebnisse sind in 26 und 27 dargestellt. Antikörper 2 und Antikörper 4 verlängerten die Blutungszeit in einer Dosis von 1.000 μg/kg. Antikörper 2 und Antikörper 4 veränderten die Blutungszeit in einer Verabreichungsdosis von 300 μg/kg nicht im Geringsten, während sie in dieser Dosis die Okklusionszeit im oben beschriebenen PIT-Modell und A-V-Shuntmodell verlängert hatten. Die Daten wurden unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests statistisch verarbeitet. In 26 und 27 weist das Symbol * auf p < 0,05 und das Symbol ** auf p < 0,01 hin.
Die oben aufgeführten Versuchsergebnisse zeigen, dass sowohl Antikörper 2 als auch Antikörper 4, wenn sie in einen lebenden Körper verabreicht werden, eine starke Hemmwirkung in Bezug auf die Thrombenbildung ausüben, ohne eine Blutungsneigung hervorzurufen, die sonst klinische Probleme verursachen würde.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Der monoklonale Antikörper, der gemäß vorliegender Erfindung erhalten wird, weist eine starke Affinität und hohe Reaktionsspezifität zu vWF auf, er hat ein anderes Epitop als die bisher bekannten monoklonalen Antikörper gegen vWF und er kann als Wirkbestandteil eines thrombosehemmenden Mittels eingesetzt werden. Es ist zu erwarten, dass das thrombosehemmende Mittel gemäß vorliegender Erfindung als äußerst effektives präventives Mittel und therapeutisches Mittel gegen Krankheiten im Zusammenhang mit vWF verwendet werden kann (beispielsweise thrombotische Erkrankungen und instabile Angina pectoris). Außerdem können äußerst nützliche Informationen über die GPIb bindende Stelle von vWF erhalten werden, indem der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt wird.
Darüber hinaus weist der monoklonale Antikörper gemäß vorliegender Erfindung Reaktivität mit Meerschweinchen-vWF auf, wodurch es beispielsweise möglich ist, Tests über physiologische Aktivitäten und Tests über Nebenwirkungen an Meerschweinchen durchzuführen.

Claims

Monoklonaler Antikörper mit den folgenden Eigenschaften: (a) der monoklonale Antikörper erkennt ein Epitop des von Willebrand-Faktors von Menschen und von Meerschweinchen, worin das Epitop von jenen Antikörpern erkannt wird, die vom Hybridom FERM BP-5248 (AJvW-2) oder FERM BP-5250 (AJvW-4) produziert werden; (b) der monoklonale Antikörper hemmt RIPA (Ristocetin-induzierte Blutplättchenaggregation), BIPA (Botrocetin-induzierte Blutplättchenaggregation) und SIPA (durch Scherbeanspruchung induzierte Blutplättchenaggregation) von Human-Blutplättchen; (c) der monoklonale Antikörper hemmt RIPA (Ristocetin-induzierte Blutplättchenaggregation) und BIPA (Botrocetin-induzierte Blutplättchenaggregation) von Meerschweinchen-Blutplättchen; und (d) der monoklonale Antikörper weist bei Meerschweinchen in vivo starke thrombosehemmende Wirkung auf, verursacht aber keine Blutung.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der von einem Hybridom produziert wird, das durch Fusion zwischen einer Mäuse-Myelomzelle und einer Milzzelle einer mit Human-von Willebrand-Faktor immunisierten Maus gebildet wurde.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, worin das Hybridom FERM BP-5248 (AJvW-2) oder FERM BP-5250 (AJvW-4) ist.
Hybridom zur Produktion eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 2, das durch Fusion zwischen einer Sp2/O-Ag14-Mäuse-Myelomzelle und einer Milzzelle einer mit von Willebrand-Faktor immunisierten Maus gebildet wurde.
Hybridom nach Anspruch 4, das FERM BP-5248 (AJvW-2) oder FERM BP-5250 (AJvW-4) ist.
Thrombosehemmendes Mittel, das als Wirkbestandteil einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.