DE60133663T2

DE60133663T2 - Antithrombotische von willebrand faktor (vwf) kollagen überbrückungsinhibitoren

Info

Publication number: DE60133663T2
Application number: DE60133663T
Authority: DE
Inventors: Hans Deckmyn; Nancy Cauwenberghs; Karen Vanhoorelbeke
Original assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Current assignee: Katholieke Universiteit Leuven
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2021-12-22
Also published as: US20070081999A1; GB0031448D0; US20040071704A1; WO2002051351A3; WO2002051351A2; EP1343823B1; DE60133663D1; ATE392436T1; US7754215B2; EP1343823A2; ES2305129T3; AU2002224675A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Ein Schaden einer arteriellen Gefäßwand führt zu Plättchenadhäsion, Aggregation und kann letzendlich in einer Thrombose resultieren. Diese Ereignisse sind bekannt, zu der Entwicklung von Verschlusssyndromen in dem koronaren, cerebralen und peripher vaskulären System, genauso wie Restenose und intimale Hyperplasie, welche nach einer Angioplastie, Atherektomie und arteriellen Stent-Implantation auftreten, beizutragen (1; 2). Sowohl bei einer Thrombose, als auch einer Reokklusion heften sich Plättchen durch eine Interaktion mit dem von Willebrand Faktor (vWF), der eine Brücke zwischen Collagen, einem Bestandteil der beschädigten Gefäßwand und dem Plättchen Glykoprotein Ib (GPIb) bildet, an das Subendothelium von beschädigten Blutgefäßen (3). Diese reversible Adhäsion oder Anbindung der Plättchen bei hoher Scherrate wird gefolgt von einer stabilen Adhäsion durch die Collagenrezeptoren (GPIa-IIa; GPIV, ...) (4), was in einer Plättchenaktivierung und Freisetzung von ADP, Thromboxan und Serotonin resultiert. Diese wiederum aktivieren zusätzliche Plättchen und lösen die konformative Aktivierung des Plättchen GPIIb/IIIa Rezeptors aus, was zur Fibrinogen-Bindung und schließlich zur Plättchenaggregation führt (5). Letzendlich wird ein Plättchen-initiierter Thrombus gebildet.
Die Suche nach Anti-Plättchen Arzneimitteln zur Verhinderung von Thrombose hat sich vor kurzem auf die Blockade des GPIIb-IIIa-Rezeptors und der Inhibition der vWF-GPIb-Achse konzentriert. Die am besten charakterisierten Arzneimittel sind Antikörper und Peptide, welche die Bindung von adhäsiven Proteinen an GPIIb-IIIa blockieren, welche in Tiermodellen getestet wurden, und von denen viele in klinischen Versuchen getestet werden und/oder in der Klinik verwendet werden (6–8). Auch Verbindungen, die die vWF-GPIb Achse beeinträchtigen, inhibieren eine Thrombusbildung in verschiedenen Tiermodellen. Der GPIb/IX/V-Komplex besteht aus 4 verschiedenen Polypeptiden, GPIbα, GPIbβ, GPIX und GPV, welche alle Mitglieder der Leucin-reichen Protein Familie sind (9; 10). Die N-terminale Domäne des GPIbα-Polypeptids enthält die vWF-Bindestelle (11). vWF ist aus verschiedenen homologen Domänen, wobei jede mehrere Funktionen abdeckt, zusammengesetzt: es interagiert durch seine A1 Domäne hauptsächlich mit dem GPIb/V/IX Komplex (12), wobei seine A3-Domäne überwiegend mit fibrillären Collagen-Fasern interagiert (13; 14). Verbindungen, welche mit GPIbα interagieren, wie die GPIb-bindenden Schlangengift Proteine Echicetin und Crotalin (15; 16), ein anti-Meerschweinchen GPIb-Antikörper (17; 18), ein rekombinantes A1 Domänen-Fragment (VCL) (2; 23) und vor kurzem ein anti-humaner GPIb-Antikörper (19) oder Verbindungen, welche an vWF binden, wie anti-A1-vWF-monoklonale Antikörper (mAbs) (20; 21) und Aurin-Tricarbonsäure (ATA) (22), inhibieren eine in vivo Thrombusbildung.
Eine spezifische Blockade der vWF-Collagen-Interaktion in vivo wurde bis jetzt noch nicht gezeigt, aber könnte eine neue Strategie für die Verhinderung einer Thrombusbildung in stenosierten Arterien sein. Wir beschreiben hier zum ersten Mal die antithrombotische Wirkung eines anti-humanen vWF einer Maus, mAb82D6A3, welcher bekannt ist, an die A3-Domäne zu binden und die vWF-Bindung an die fibrillären Collagene Typ I, III und Collagen der Kalbshaut, aber nicht an Collagen VI zu inhibieren (24), Vanhoorelbeke et al., 2000b).
„Verschiedene Studien haben die Entwicklung von Antikörpern beschrieben, welche fähig sind, die Interaktion von vWF mit Collagen in vitro zu reduzieren. Monoklonale Antikörper (RU 5), welche gegen die A3-Domäne von vWF gerichtet sind, welche fähig sind, die Plättchenadhäsion an Collagen III in vitro unter geringen Scherrstress-Bedingungen um 59% zu reduzieren, sind beschrieben worden (30). Unter diesen limitierten Flussbedingungen wird eine vWF-abhängige Bindung von Plättchen an Collagen nur bedingt induziert.
Polyklonale auto-Antikörper, welche fähig sind, die Interaktion von vWF an Collagen zu inhibieren, sind aus einem Patienten isoliert worden, der an vWD erkrankt ist (32). Anti-vWF monoklonale Antikörper („Moabs"), welche gegen das SpI-Fragment (aa911-1365) gerichtet sind, welches die A3-Domäne des vWF-Moleküls überlappt, welche fähig sind, die Bindung von vWF an Collagen in vitro zu blockieren, sind auch beschrieben worden (33)."
Die vorliegende Studie ist darauf gerichtet, die antithrombotische Wirksamkeit von mAB 82D6A3 in Pavianen durch Verwendung eines modifizierten Folts Modells zu evaluieren, wo zyklische Flussreduktionen (CFRs) aufgrund von Thrombusbildung und seiner Entfernung in einer Arterie nach einem Intimaschaden und Platzierung einer kritischen Stenose, um den Lumendurchmesser zu reduzieren, gemessen werden (25).
Erläuternde Ausführungsformen der Erfindung
Beispiele
Materialien.
Humanes plazentales Collagen Typ I und III und Kalbshaut Typ I wurden erworben von Sigma (St. Louis, MO). Die Collagene wurden in 50 mmol/L Essigsäure solubilisiert und danach gegen Phosphat-gepufferter Saline PBS (48 Stunden, 4°C) dialysiert, um fibrilläres Collagen zu erhalten. Die Phagen-Display-Bibliothek mit zufälligen Hexapeptiden, welche durch Cysteinreste flankiert sind, wurde von Corvas (Gent, Belgien) erhalten, die Pentadecamer-Phagen-Display-Peptid-Bibliothek war ein freundliches Geschenk von Dr. G. Smith (University of Missouri, Columbia, Mo). vWF wurde von dem Roten Kreuz (Belgien) erworben. Das SpI proteolytische Fragment und die rekombinante A3-Domäne waren freundliche Geschenke von Drs. JP Girma (INSERM 134, Paris) und Ph. G. de Groot (Utrecht, Niederlande).
Aufreinigung von mAb 82D6A3
mAb 82D6A3 wurde aus einer Zelllinie erhalten, die bei den Belgischen Sammlungen für Mikroorganismen unter der Zugangsnummer LMBP 5606CB hinterlegt wurde und aus Aszites durch Protein A Chromatographie aufgereinigt wurde.
Zubereitung des 82D6A3 F(ab) Fragments.
82D6A3-F(ab) wurde durch Verdauung mit Papain zubereitet. In Kürze, 5 mg Ab werden mit 50 μg Papain (Sigma) in Gegenwart von 10 mmol/L Cystein und 50 mmol/L EDTA verdaut (37°C, über Nacht). Das F(ab) wurde durch Protein A-Affinitätschromatographie aufgereinigt (Pharmacia, Roosendaal, Niederlande) und die Reinheit wurde durch SDS-Page überprüft.
Chirurgische Zubereitung
Sieben Paviane beider Geschlechter, welche 12–18 kg wiegen, wurden in der vorliegenden Studie verwendet.
Die experimentelle Vorgehensweise, der gefolgt wurde, war eine Modifikation des original Folts-Modells (25). Die Paviane wurden mit Ketamin-Hydrochlorid (10 mg/kg, i. m.) anästhesiert, mit einem endotrachealen Tubus mit Manschette intubiert und durch ein Beatmungsgerät mit Sauerstoff, der mit 0,5% Fluothan ergänzt wurde, ventiliert, um die Anästhesie aufrecht zu erhalten. Die Körpertemperatur wurde bei 37°C mit einem Heiztisch aufrecht erhalten. Ein Katheter wurde zur Arzneimittelverabreichung und Blutentnahme in eine Oberschenkelvene platziert. Ein Segment einer anderen Oberschenkelarterie wurde behutsam von dem umgebenden Gewebe frei seziert, und eine perivasculäre Ultraschall-Flusssonde (Transonic Systems Inc., New York, NY) wurde um die distale Sezierstelle herum platziert. Der durchschnittliche und phasische Blutfluss wurden kontinuierlich das Experiment hindurch aufgezeichnet. Den Pavianen wurde gewährt, sich für 30 Minuten zu stabilisieren. Dann wurde die proximale Sezierstelle der Oberschenkelarterie durch Anwendungen von 3 Verschlüssen der Arterie für zehn Sekunden mit einem 2 mm Abstand unter Verwendung einer federunterstützten Pinzette verletzt. Eine federunterstützte Klemme wurde als nächstes in der Mitte der verletzten Stelle platziert, um eine externe Stenose von 65–80% herzustellen. Eine schrittweise Abnahme des Blutflusses aufgrund von Plättchenadhäsion und Aggregation wurde beobachtet. Wenn der Fluss 0 erreicht hat, wurde der Blutfluss durch Drücken der Feder der Klemme, um den Plättchen-reichen Thrombus mechanisch zu entfernen, wieder hergestellt. Dieses sich wiederholende Muster des abnehmenden Blutflusses im Anschluss an eine mechanische Wiederherstellung wurde als zyklische Flussreduktionen (CFRs) bezeichnet. Eine zusätzliche Endothel-Verletzung und eine geeignete äußerliche Stenose-Selektion wurde wiederholt. Letztendlich wurden stabile CFRs in diesen Pavianen erhalten.
Nach einer 60-minütigen Kontrolldauer von reproduzierbaren CFRs (t = –60 Minuten bis 0 Minuten) wurden Testwirkstoffe (Saline oder mAb 82D6A3) mittels einer intravenösen Bolusinjektion (t = 0) gegeben, und eine Überwachung wurde bis zu 60 Minuten nach der Arzneimittelverabreichung (t = +60 Minuten) fortgesetzt. Die antithrombotische Wirkung wurde durch einen Vergleich der Anzahl der CFRs pro Stunde vor und nach der Arzneimittelverabreichung quantifiziert. Blutproben für die verschiedenen Labormessungen (Plättchenzahl, Coagulation, vWF-Belegung, vWF-Collagen-Bindung und Plasmaspiegel) wurden bei t = 0, +30, +60, +150, +300 Minuten und 24 und 48 Stunden nach der Behandlung bestimmt.
Arzneimittelbehandlung:
Die Dosen an mAb 82D6A3 wurden auf der Basis von vorausgehenden Dosis-Befunds-Studien ausgewählt. In der Gruppe I wurden zwei Paviane als Saline-Kontrolle verwendet. Drei Paviane, die Gruppe II, erhielten eine Dosis von 0,1 mg/kg mAb 82D6A3, und nach einer 60-minütigen Aufzeichnung wurden zusätzlich 0,2 mg/kg mAb 82D6A3 gegeben. Da eine vorausgehende Studie gezeigt hat, dass mAb 82D6A3 eine lange Halbwertszeit hat, resultierte dies daher in einer Enddosis von 0,3 mg/kg. In der Gruppe III wurde eine Dosis von 0,6 mg/kg mAb 82D6A3 zu zwei Pavianen gegeben. Alle Mittel wurden mit Saline verdünnt.
Plättchenzahl, Coagulation und Blutungszeit
Alle Blutproben wurden in einer Plastikspritze, die eine Endkonzentration von 0,32% Tri-Natriumcitrat enthielt, gesammelt. Die Plättchenzahl wurde unter Verwendung eines Technicon H₂ Blutzell-messgerätes (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY) bestimmt.
Die Prothrombinzeit (PT) und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) wurden bei 37°C unter Verwendung eines Coagulometers (Clotex II, Hyland) gemessen. Die Blutungszeit (nach Ivy in der Modifikation nach Mielke; „template bleeding time") wurde auf der Oberfläche des Vorderarms unter Verwendung der Simplate^® II Vorrichtung (Organon Teknika, Durham, NC) gemessen. Die hohlhandseitige Oberfläche des Vorderarms wurde rasiert, und eine Druckmanschette wurde angewendet und bis 40 mmHg aufgepumpt. Die Zeit, die bis zum visuellen Stillstand von Blut auf dem Filterpapier verging, wurde als die Blutungszeit aufgezeichnet. Die Blutungszeiten folgten für bis zu 10 Minuten.
Plasma-Konzentration von 82D6A3
Mikrotiterplatten (96-Well, Greiner, Frickenhausen, Deutschland) wurden über Nacht bei 4°C mit 5 μg/ml (in PBS, 100 μl/Well) eines gesamten Moleküls eines anti-Maus IgG einer Ziege (Sigma, St. Louis, MO) bedeckt. Platten wurden mit 3%-igem Milchpulver (PBS, 250 μl/Well) für 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Gefrorene Plasmaproben wurden aufgetaut und für 5 Minuten bei 37°C vor der Zugabe zu der Platte inkubiert. Verdünnungsreihen der Proben (1/2 in PBS) wurden gemacht und für 2 Stunden bei RT inkubiert. Anti-Maus IgG einer Ziege, welches mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiert war, wurde zugegeben und für eine Stunde bei RT inkubiert. Eine Visualisierung wurde mit Ortho-Phenylendiamin (OPD, Sigma) erhalten, und die Färbungsreaktion wurde mit 4 mol/l H₂SO₄ gestoppt. Das Absorptionsvermögen wurde bei 490 nm bestimmt. Nach jedem Inkubationsschritt wurden die Platten mit PBS, 0,1% Tween-20, gewaschen, dreimal nach den Beschichtungs- und Blockierungsschritten und zwölf mal an anderer Stelle. Die Plasmakonzentration von mAb 82D6A3 in jeder Probe wurde mittels einer Standartkurve berechnet. Diese Kurve wurde durch Zugabe von bekannten Mengen an mAb 82D6A3 zu dem Pavianplasma (frei von Antikörper) und Plattierung von 1/2 Verdünnungen in PBS (angefangen bei 6 μg/ml) erhalten.
vWF-Ag-Spiegel
Die Bestimmung der vWF-Ag-Spiegel wurde im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (26). In Kürze, Mikrotiterplatten wurden mit einer polyklonalen anti-vWF-Ig-Lösung beschichtet (Dako, Glostrup, Dänemark). Die Platten wurden mit 3%-igem Milchpulver blockiert, und die Proben wurden zu den Wells in Verdünnungen von 1/40 bis 1/2560 zugegeben (Proben wurden in PBS, 0,3% Milchpulver, verdünnt). Gebundener vWF wurde mit anti-humanen vWF-HRP-Antikörpern eines Kaninchens (Dako) nachgewiesen. Die Visualisierung und die Waschschritte wurden, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die vWF-Ag-Spiegel wurden mittels einer Standartkurve, welche durch Zugabe von 1/40 bis 1/2560 Verdünnungen zu den beschichteten Wells einer humanen Plasma Vereinigung („pool"), von der bekannt ist, dass sie 10 μg/ml humanen vWF enthält, erhalten wurde, berechnet.
vWF-Belegung
Mikrotiterplatten (96-Well) wurden über Nacht bei 4°C mit 125 μl/Well einer polyklonalen anti-vWF-Ig-Lösung (Dako) (1/1000 in PBS) beschichtet. Die Platten wurden mit einer 3%-igen Milchpulverlösung (in PBS, 250 μl/Well) für 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Plasmaproben wurden für 5 Minuten bei 37°C vor der Zugabe zu der Platte inkubiert. Reine Proben wurden zugegeben, und Verdünnungsreihen (1/2 in PBS) wurden gemacht. Die Proben wurden für 2 Stunden bei RT inkubiert. Die Proben, die zu 100% belegten vWF enthielten, wurden durch Zugabe einer gesättigten Menge an mAb 82D6A3 (6 μg/ml) zu dem entsprechenden Pavianplasma erhalten. Gebundener mAb 82D6A3 wurde durch Zugabe von anti-Maus IgG-HRP einer Ziege (1 Stunde bei RT) nachgewiesen. Die Visualisierung und die Waschschritte wurden, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die vWF-Belegung jeder Probe wurde wie folgt berechnet: (A490 nm Probe/A490 nm Probe gesättigt mit mAB 82D6A3)·100.
Bestimmung der vWF-Collagen-Bindungsaktivität
Der ELISA wurde im Wesentlichen wie beschrieben (26) durchgeführt. In Kürze, Mikrotiterplatten wurden mit humanem Collagen Typ I (Sigma) bedeckt. Die Platten wurden mit einer 3%-igen Milchpulverlösung (in PBS, 250 μl/Well) blockiert. Reine Proben und 1/2 Verdünnungsreihen wurden zugegeben. Gebundener vWF wurde mit anti-humanen vWF-HRP-Antikörpern eines Kaninchens nachgewiesen. Die Bindung von vWF eines Pavians an Collagen in den verschiedenen Blutproben wurde mit der Bindung von vWF in der Blutprobe verglichen, welche zum Zeitpunkt null (Vorprobe) genommen wurde und als 100% festgesetzt wurde.
Bestimmung der vWF-Bindung an Collagen und Inhibition durch das F(ab) Fragment von 82D6A3.
Eine 96-Well-Platte wurde über Nacht mit humanem Collagen Typ I oder III oder Collagen der Kalbshaut Typ I (25 μg/ml) bedeckt und geblockt. 2,5 μg/ml von rekombinantem vWF wurden in den Bindungsexperimenten verwendet. Für die Kompetitionsexperimente wurde aufgereinigter humaner vWF (0,5 μg/ml fc) oder Plasma (1/50 fc) mit einer Verdünnungsreihe von 82D6A3 oder seinem F(ab) Fragment während 30 Minuten in einer vorgeblockten 96-Well-Platte vorinkubiert. Dann wurden die Gemische zu der blockierten Collagen-bedeckten Platte zugegeben. Nach einer 90 minütigen Inkubation wurde gebundener vWF mit einem polyklonalen anti-vWF-HRP konjugierten Antikörper (Dako, Glostrup, Dänemark) nachgewiesen und die Visualisierung wurde mit Ortho-phenylendiamin (OPD, Sigma) durchgeführt. Die Reaktion wurde mit 4 mol/L H₂SO₄ gestoppt, und das Absorptionsvermögen wurde bei 490–630 nm bestimmt. Die Platten wurden zwischen jedem Inkubationsschritt 3–9 mal mit PBS (0,1% Tween 20) gewaschen.
Flussexperimente.
Plastik-Deckgläser von Thermanox wurden mit 40%-igem Ethanol gespült und vor der Besprühung mit humanem fibrillären Collagen Typ I (100 μl (1 mg/ml)/Deckglas) mit Wasser gewaschen. Blut wurde von gesunden Freiwilligen genommen, welche kein Aspirin oder Analoga in den letzten 10 Tagen genommen hatten. Das Blut wurde mit 25 U/ml Heparin von niedrigem Molekulargewicht (LMWH) (Leo Pharmaceuticals, Vilvoorde, Belgien) anticoaguliert. Die Perfusionsexperimente wurden in einer Flusskammer des Sakariassen-Typs bei 37°C bei Wandscherraten von 600 s^–1, 1300 s^–1 und 2600 s^–1 durchgeführt. Die Perfusionskammer und die Schlauchmaterialien wurden mit Plasma 20 Minuten gespült und mit 25 ml Hepes gepufferter Saline (HBS) vor dem Start des Experiments gewaschen. In jedem Experiment wurden 15 ml Blut, welche für 15 Minuten mit einem Inhibitor wie angezeigt vorinkubiert wurden, für 5 Minuten durchgeschwemmt. Nach der Perfusion wurden die Deckgläser mit 25 ml Hepes gepufferter Saline gespült und in 0,5%-igem Glutardialdehyd (10 Minuten) gestellt. Danach wurden die Deckgläser in Methanol platziert (5 Minuten), mit May-Grünwald (3–5 Minuten) und Giemsa (15–20 Minuten) gefärbt und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Deckgläser wurden getrocknet und mit einem Bild-Messgerät („image analyser") wie beschrieben ausgewertet (29).
Isolation von MoAb-Bindungs-Phagen.
Die Selektion von Phagen wurde wie folgt durchgeführt. Biotinylierter (siehe unten) MoAb (10 μg) wurde an blockierte, Streptavidin-bedeckte, magnetische Kügelchen (Dynal, Oslo, Norwegen) gebunden. 2,10¹² Phagen (PBS, 0,2% Milchpulver) wurden zunächst mit blockierten, Streptavidin-bedeckten Kügelchen für eine Stunde inkubiert, um die Streptavidin-Bindemittel zu beseitigen. Danach wurden die Phagen zu den MoAb enthaltenden Kügelchen zugegeben, und nach 90 Minuten wurden die Eingangs-Phagen entfernt, und die Kügelchen wurden 10 mal mit PBS (0,1% Tween-20) gewaschen, um die nicht spezifischen Bindemittel zu entfernen. Die gebundenen Phagen wurden mit 0,1 mol/L Glycin, pH 2,2, eluiert, und das Eluat wurde sofort mit 1 mol/L Tris, pH 8, neutralisiert. Nach der Amplifizierung der Phagen wurden zusätzliche Schwenkrunden durchgeführt. Die Phagen wurden durch Infektion von Escherichia coli TG1-Zellen amplifiziert und teilweise aus dem Überstand durch Polyethylen-Glycol-Präzipitation aufgereinigt. E. coli, welche einen einzelnen Phagen trugen, wurden in einer 96-Well-Platte wachsen gelassen, und der Überstand wurde auf die Gegenwart der 82D6A3-Bindungs-Phagen getestet. Phagen-DNA wurde zubereitet, und die Sequenzierungsreaktionen wurden gemäß des T7-Polymerase-Sequenzierungs-Kits (Pharmacia) unter Verwendung des Primers 5'-TGAATTTTCTGTATGAGG-3' durchgeführt.
Messung der Phagenbindung an 82D6A3.
Eine 96-Well-Platte wurde über Nacht mit aufgereinigtem 82D6A3 (10 μg/mL) bedeckt. Nach 2-stündiger Blockierung mit 2%-igem Milchpulver wurde eine Verdünnungsreihe der Klone, welche einen einzelnen Phagen trugen, in PBS mit 0,2% Milchpulver zu den Wells zugegeben, und die Phagen wurden bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert. Gebundene Phagen wurden nach einer einstündigen Inkubation mit einem polyklonalen anti-M13-HRP konjugierten Antikörper (Pharmacia) nachgewiesen, und die Visualisierung wurde mit OPD durchgeführt.
Spezifität der Phagenbindung an 82D6A3.
Eine 96-Well-Platte wurde über Nacht mit aufgereinigtem 82D6A3 (10 μg/ml) bedeckt. Nach einer 2-stündigen Blockierung mit 2%-igem Milchpulver wurde eine Verdünnungsreihe des vWF oder der rekombinanten A3-Domäne zugegeben. Nach einer 30-minütigen Vorinkubation wurde eine konstante Menge an Phagen zu den vWF/A3 enthaltenden Wells zugegeben. 90 Minuten später wurden gebundene Phagen wie oben beschrieben nachgewiesen.
Die Kompetition zwischen den verschiedenen Phagen-Klonen für eine Bindung an 82D6A3 wurde wie oben ausgewertet, außer dass 2,10¹⁰/ml biotinylierte Phagen des Klons 1 mit verschiedenen Konzentrationen der Phagen des Klons 2 gemischt wurden, wonach gebundene biotinylierte Phagen mit Streptavidin-HRP und OPD nachgewiesen wurden.
MoAb und Phagen wurden unter Verwendung von NHS-LC-Biotin (Pierce, Rockford, IL) gemäß den Herstellerangaben biotinyliert.
Immunblot von Phagen
Aufgereinigte Phagen-Klone (2,10¹⁰) wurden mittels einer Elektrophorese auf einem 10%-igen SDS-PAGE Gel unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf eine Nitrozellulose-Membran elektro-übertragen. Nach der Blockierung der Membran mit 4%-iger Magermilch in PBS wurde die Membran mit 82D6A3 (2 μg/ml) während 90 Minuten inkubiert, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit GaM-HRP und unter Verwendung des ECL-Nachweissystems von Amersham (Buckinghamshire, England) entwickelt. Nach jedem Inkubationsschritt wurde die Membran mit PBS, welche 0,05% Tween80 enthielt, gewaschen.
Ergebnisse
Antithrombotische Wirkung
Die Frequenz der CFRs wurde durch eine Injektion von Saline (107 ± 7%) nicht geändert. Eine Dosis von 100 μg/kg mAb 82D6A3 resultierte in einer signifikanten Reduktion der CFRs von 58,3 ± 4,8% (1). Von einer Dosis von 300 μg/kg aufwärts wurden die CFRs vollständig beseitigt und konnten durch einen ansteigenden Intimaschaden oder eine ansteigende Stenose nicht wieder hergestellt werden (2).
Plättchenzahl, Coagulation und Blutungszeit
Die Plättchenzahl war nicht durch eine Injektion der verschiedenen Dosen von mAb 82D6A3 signifikant betroffen (Tabelle 1). Es wurden keine signifikanten Veränderungen der PT oder aPTT in irgendeinem der Tiere beobachtet (Daten nicht gezeigt), Die Blutungszeit war nach einer Injektion von 300 μg/kg und 600 μg/kg mAb 82D6A3 etwas verlängert, aber kehrte 5 Stunden später auf die Grundlinie zurück (Tabelle I).
Ex vivo mAb 82D6A3 Plasma-Konzentration, die vWF-Ag-Spiegel, vWF-Belegung und vWF-Collagen-Bindung
Plasmaproben, die nach mehreren Zeitpunkten in jeder Studie genommen wurden (siehe Material und Methoden), wurden auf ihre mAb 82D6A3-Plasmaspiegel, vWF-Ag-Spiegel, vWF-Belegung und Collagen Bindungsaktivität ex vivo analysiert.
Dreißig Minuten nach der Injektion der verschiedenen Dosen an mAb 82D6A3 wurde eine kleine Senkung der vWF-Ag-Spiegel beobachtet, während ein Anstieg der vWF-Ag-Spiegel über der Grundlinie nach 24 h konsistent gemessen wurde (Tabelle II und III).
Die Messung der mAb 82D6A3 Plasmaspiegel offenbarten keine Senkung der mAb 82D6A3 Plasmaspiegel in den ersten 3 Stunden des Experiments. Dann waren 69%, 23% und 7,6% mAb 82D6A3 nach 300 Minuten, 24 h beziehungsweise 48 h vorhanden, wenn 300 μg/kg mAb 82D6A3 verabreicht wurden (Tabelle II).
Eine Injektion von 100 μg/kg mAb 82D6A3 resultierte in einer ex vivo Inhibition der vWF-Collagen-Bindung von 31% (Blutprobe genommen nach 1 h) (Tabelle II). Bei Dosen von 300 μg/kg und 600 μg/kg wurde keine Interaktion zwischen Pavian-vWF und Collagen in Proben beobachtet, die bis zu 5 Stunden nach der Verabreichung von mAb genommen wurden. Blutproben, die 24 Stunden nach der Injektion des Arzneimittels genommen wurden, offenbarten die vWF-Collagen-Interaktion (Tabelle II).
Bei 300 Minuten nach der Verabreichung gab es eine vWF-Belegung von 80% für die 100 μg/kg Dosis und nahe 100% für die 300 μg/kg und 600 μg/kg Dosen. vWF blieb für eine lange Zeit belegt: sogar 48 h nach der Injektion von mAb 82D6A3 waren noch 63% an vWF mit mAb 82D6A3 belegt (Tabelle II).
Verhältnis zwischen der ex vivo vWF-Belegung und Collagen-Bindung, der vWF-Belegung und 82D6A3-Plasmaspiegel und zwischen vWF-Ag-und 82D6A3-Plasmaspiegel
vWF-Belegung umgekehrt korreliert mit der vWF-Bindung an Collagen: um eine Inhibition der vWF-Bindung an Collagen zu erhalten, war eine vWF-Belegung von mindestens 70% erforderlich, mit einer vollständigen Inhibition bei 90–100% Belegung (3). Diese Daten wurden von in vitro Experimenten bestätigt, wo unterschiedliche Konzentrationen an mAb 82D6A3 zu dem Pavianplasma zugegeben wurden (4): Belegungsspiegel von bis zu 60% resultierten in einer geringen Inhibition der vWF-Bindung an Collagen, während eine Inhibition beobachtet wurde, wenn 70%–100% der vWF-Bindungsstellen für den Antikörper belegt waren.
Ein gutes Verhältnis zwischen 82D6A3-Plasmaspiegel und vWF-Belegung wurde auch mit einer maximalen vWF-Belegung von etwa 1 μg/ml 82D6A3 aufwärts erhalten (5).
Charakterisierung von 82D6A3 und seinem F(ab)-Fragment sowohl unter statischen als auch Flussbedingungen.
82D6A3 ist ein anti-vWF Antikörper, der mit hoher Affinität an vWF (Kd: 0,4 nM) (24) an das SpI proteolytische Fragment und der rekombinanten vWF-A3-Domäne bindet. Sowohl der MoAb als auch sein F(ab) Fragment sind in der Lage, Plasma oder die Bindung von aufgereinigtem vWF an humanem Collagen Typ I in einer spezifischen und Dosis-abhängigen Art und Weise mit einer IC₅₀ von 20 ng/ml für den MoAb und 1 μg/ml für das F(ab) Fragment zu inhibieren (6). Die vWF-Bindung an humanem Collagen Typ III und Collagen Typ I der Kalbshaut wurde ebenso inhibiert. Als nächstes wurden 82D6A3 und sein F(ab) Fragment unter Fluss-Bedingungen bei unterschiedlichen Scherraten getestet (600, 1300 und 2600 s^–1). Bei einer Scherrate von 1300 s^–1 inhibierten sowohl der intakte MoAb als auch das F(ab) vollständig die Plättchenablagerung bei 1–5 μg/ml beziehungsweise 10 μg/ml (7a), und die inhibitorische Wirkung erhöhte sich mit der angewendeten Scherung (7b).
Epitop-Kartierung von 82D6A3 mittels Phagen-Display.
2 Peptid-Phagen-Display-Bibliotheken, eine lineare Pentadecamer- und eine zyklische Hexamer-Bibliothek, wurden verwendet. Nach drei Runden „Biopanning" mit der Pentadecamer-Bibliothek wurden einzelne Klone wachsen gelassen und auf ihre Fähigkeit getestet, an 82D6A3 zu binden (8a). Um zu bestimmen, ob die Phagen an die Antigen-Bindetasche des Antikörpers gebunden haben, wurden die Phagen-Klone einem Kompetitions-ELISA ausgesetzt, um zu testen, ob der vWF und die A3-Domäne in der Lage waren, mit den Phagen um eine Bindung an den 82D6A3 zu konkurrieren (8b). Von den verschiedenen inhibitorischen Klonen, die dadurch identifiziert wurden, wurde die Sequenz bestimmt, was in der Identifizierung von 2 Sequenzen resultierte: GDCFFGFLNSPWRVC (L15G8) und RSSYWVYSPWRFISR (L15C5). Beide Sequenzen teilten die gleiche 4 aa Sequenz SPWR. Jedoch war die Affinität des L15G8 Phagen für eine Bindung an den MoAb höher als die des L15C5 Phagen.
Nach vier Runden „Biopanning" mit der zyklischen Hexamer-Bibliothek wurden einzelne Klone auf ihre Bindung an 82D6A3 (9a) und Inhibition durch vWF und der A3-Domäne (9b) überprüft. Von den Phagen-Klonen, die konkurrierten, wurde Einzelstrang-DNA („ssDNA") zubereitet und die Sequenz bestimmt. 8 von 13 Klonen zeigten CMTSPWRC (C6H5) an, 4 von 13 CRTSPWRC (C6G12), und 1 hatte die CYRSPWRC (C6A12) Sequenz. Diese Sequenzen können mit den L15-Sequenzen, die auch die SPWR-Sequenz enthielten, abgeglichen („aligned") werden. Der L15G8- und C6H5-Phage konkurrierten miteinander für eine Bindung an 82D6A3 (10), was uns schlussfolgern lässt, dass das Epitop SPWR ein Teil des Epitops von 82D6A3 sein kann. Zudem wurde durch die Durchführung eines Immunblots der L15G8- und C6H5-Phagen gezeigt, dass die beiden Cysteine, welche in beiden Klonen vorhanden sind, eine Disulfidbrücke bilden, welche notwendig für die Erkennung durch 82D6A3 sind (11). Sowohl die L15G8-Sequenz als auch die C6H5-Sequenz konnten versuchsweise mit der vWF-Sequenz, beziehungsweise innerhalb der A3-Domäne, abgeglichen werden.
Diskussion
Plättchenadhäsion an eine beschädigte Gefäßwand ist der erste Schritt in der arteriellen Thrombusbildung. Das Anbinden der Plättchen durch vWF an das Collagen, welches in der beschädigten Gefäßwand ausgesetzt wird, ist besonders unter starken Scherbedingungen wichtig. Antithrombotische Verbindungen, welche die GPIb-vWF-Achse stören, sind in Tiermodellen untersucht worden und es wurde für sie gezeigt, dass sie wirksam sind (19; 21).
Die vorliegende Studie evaluiert zum ersten Mal die antithrombotischen Wirkungen der Inhibierung der vWF-Collagen Interaktion in vivo. Für diesen Zweck verwendeten wir einen monoklonalen anti-humanen vWF-Antikörper, mAb 82D6A3, der durch eine Bindung an die vWF A3-Domäne die vWF-Bindung an die fibrillären Collagene Typ I und III inhibiert. mAb 82D6A3 kreuzreagiert zudem mit dem vWF eines Pavians und inhibiert die Pavian-vWF-Bindung an Collagen Typ I unter statischen und Flussbedingungen (Depraetere et al., vorgelegt). Ein modifiziertes Folts-Modell wurde verwendet, um die antithrombotische Wirkung von mAb 82D6A3 unter starken Scherbedingungen (15) in Pavianen zu evaluieren. Dieses Modell erlaubt die Untersuchung der zyklischen Flussreduktionen (CFRs) aufgrund von Plättchenabhängigen Thromben, welche sich an der verletzten, stenotischen Stelle der Arterie bilden. Für dieses zyklische Flussmodell ist beschrieben worden, einige der Vorgänge, die in Patienten mit einer unstabilen Angina auftreten, darzustellen und nützlich für die Untersuchung der Mechanismen der unstabilen Angina zu sein. Des weiteren erlaubt dieses Modell, ein reproduzierbares Muster einer wiederkehrenden Thrombose zu erstellen, und ist weitgehend als sehr wirksam und klinisch relevant bei der Prüfung von möglichen antithrombotischen Mitteln akzeptiert (27; 28).
Die Verabreichung von 100 μg/kg, 300 μg/kg und 600 μg/kg mAb 82D6A3 resultierte in 58%-iger, 100%-iger beziehungsweise 100%-iger Inhibition der CFRs (2), was gut der 31%-igen, 96%-igen und 96%-igen (gemessen in den 60 Minuten Plasmaproben) ex vivo Inhibition der vWF-Collagen Interaktion entspricht (Tabelle II und III).
Keine der verabreichten Dosen, selbst die Höchste, 600 μg/kg, die getestet wurde, resultierte in einer schweren Verlängerung der Blutungszeit oder in einer Thrombocytopenie (Tabelle 1), noch waren die vWF-Ag-Spiegel beeinträchtigt (Tabelle II und III). Diese Ergebnisse zusammen mit der ex vivo Inhibition der vWF-Collagen-Interaktion zeigen, dass die beobachtete inhibitorische Wirkung aus einer spezifischen Inhibition der vWF-Collagen-Interaktion resultiert.
Das Fehlen von bedeutenden Blutungsproblemen korreliert mit unserem Befund, dass die Wirkung von mAb 82D6A3 auf die Plättchenadhäsion an humanem Collagen Typ I bei höheren Scherraten ausgeprägter war. Dies bestätigt, dass die vWF-Collagen-Interaktion besondere wichtig bei hohem Scherstress ist, mit anderen Worten, in dem arteriellen System, was die Beobachtung einer nur geringen Verlängerung der Blutungszeit erklären könnte.
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass die Inhibition der Thrombusbildung unter hohem Scherstress in vivo nicht nur durch eine Inhibition der vWF-GPIb-Interaktion erhalten werden kann, sondern auch durch eine Beeinträchtigung der vWF-Collagen-Interaktion. Obwohl auch eine Anzahl von anti-Plättchen GPIb-Verbindungen erfolgreich ohne Wirkung auf die Plättchenzahlen verwendet wurden, kann das Risiko einer Induzierung einer Thrombocytopenie in einigen Ereignissen nie ausgeschlossen werden, wie bei den GPIIb-IIIa Inhibitoren gesehen wird. Ein vWF-Inhibitor kann offensichtlich in dieser Hinsicht sicherer sein. Beide Arten von Antithrombotika haben den Vorteil der Blockierung des ersten Schritts der Thrombusbildung, was zusätzlich irgendeinen vorteilhaften Einfluss bei der Verhinderung von Restenose nach einer PTCA oder einer Stent-Implantation haben könnte, im Gegensatz zu spezifischen GPIIb-IIIa-Inhibitoren, welche nur störend einwirken, nachdem die Plättchen aktiviert worden sind. Aktivierte Plättchen sondern nicht nur Plättchen-aktivierende Substanzen ab, sondern auch vasoaktive Verbindungen, wie ein Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor, von dem bekannt ist, dass er glatte Muskel-Zellen-Migration und Proliferation induziert, was in einer Restenose resultiert.
Es wurde auch aufgedeckt, dass F(ab)-Fragmente von 82D6A3, welche gegen die A3-Domäne von vWF gerichtet sind, auch mit hoher Affinität an vWF binden und starke Inhibitoren der vWF-Collagen-Interaktion sowohl unter statischen als auch unter Flussbedingungen sind.
Die Auswahl von Antikörper-bindenden Phagen aus zwei verschiedenen Phagen-Display-Bibliotheken, einer Pentadecamer- und einer zyklischen Hexamer-Bibliothek, resultierte in Phagen, die in einer Dosis-abhängigen Art und Weise an 82D6A3 binden. Ferner waren vWF und die rekombinante A3-Domäne fähig, die Phagenbindung an den MoAb zu inhibieren, was darauf hinweist, dass die Phagen an oder nahe zu der Antigen-Bindungs-Stelle von 82D6A3 binden. Ein Sequenzvergleich der Phagen-angezeigten Peptide deckte auf, dass eine Konsensus-SPWR-Sequenz in allen ausgewählten Phagen vorhanden war. Aus diesen Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass die SPWR-Sequenz ein Teil des 82D6A3-Epitops sein kann. Die SPWR-Sequenz könnte mit der VPWN-Sequenz (aa 980–983) innerhalb der A3-Domäne und der dreidimensionalen Struktur der A3-Domäne, welche in der Umgebung der voher identifizierten Aminosäurereste, welche wichtig für die vWF-Collagen-Interaktion sind, lokalisiert ist, abgeglichen werden. Durchweg die gleiche 4 aa Konsensus-Sequenz zu finden, deutet auf der einen Seite an, dass diese Sequenz tatsächlich wichtig in der Antikörpererkennng sein könnte.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Erfindung, dass die vWF-Collagen-Interaktion eine wichtige Rolle bei der akuten Plättchen-abhängigen arteriellen Thrombus-Bildung spielt: eine Blockade der vWF-Collagen-Interaktion durch mAB 82D6A3 oder durch Antigen-erkennende Fragmente davon kann eine vollständige Beseitigung der Thrombusbildung in den verletzten oder stenosierten Oberschenkelarterien eines Pavians induzieren. Folglich kann mAb 82D6A3 als eine Verbindung zur Verhinderung von akuten arteriellen thrombotischen Syndromen oder zur Herstellung von Medikamenten zur Verhinderung von akuten arteriellen thrombotischen Syndromen verwendet werden.
Tabellenlegende
Tabelle I: Plättchenzahl und Blutungszeit gemessen nach der Verabreichung von verschiedenen Dosen an mAb 82D6A3 in Pavianen.

Werte sind Durchschnittsdaten ±S_D, /: nicht bestimmt.

Tabelle II: Ex vivo mAb 82D6A3 Plasmakonzentration, vWF-Ag-Spiegel, vWF-Belegung und vWF-Collagen-Bindungsaktivität gemessen nach der Verabreichung von 100 und 300 μg/kg mAb 82D6A3 an Paviane.
Daten sind Durchschnittsdaten ±SD, von n = 9, das heißt zu jedem Zeitpunkt wurden die Plasmaproben 3 mal in drei verschiedenen ELISAs und dies für die 3 Tierexperimente gemessen.
Tabelle III: Ex vivo mAb 82D6A3 Plasmakonzentration, vWF-Ag-Spiegel, vWF-Belegung und vWF-Collagen-Bindungsaktivität gemessen nach der Verabreichung von 600 μg/kg mAb 82D6A3.
Daten sind Durchschnittsdaten ±SD, von n = 6, das heißt zu jedem Zeitpunkt wurden die Plasmaproben 3 mal in drei verschiedenen ELISAs und dies für die 2 Tierexperimente gemessen.
Figurenlegende
1: Inhibition der CFR durch mAb 82D6A3.
Die dargestellten Aufzeichnungen der CFRs zeigen die Wirkung einer Bolusinjektion von 100 μg/kg und 300 μg/kg mAb 82D6A3.
2: Inhibition der CFR durch mAb 82D6A3.
Verschiedene Dosen an mAb 82D6A3 wurden an Paviane verabreicht und die CFRs wurden für 60 Minuten gemessen. Die Daten stellen den Durchschnitt ±SD mit n = 3 für 0,1 und 0,3 mg/kg mAb 82D6A3 und n = 2 für 0,6 mg/kg dar.
3: Verhältnis zwischen der ex vivo vWF-Bindung an Collagen und vWF-Belegung
Alle Durchschnittsdaten, die zu verschiedenen Zeitpunkten in den drei verschiedenen Dosis-Studien gemessen wurden, wurden verwendet (Tabelle II und III).
4: Korrelation zwischen den in vitro Messungen der vWF-Bindung an Collagen und vWF-Belegung
Das Experiment ist eine Darstellung von 2 Experimenten
5: Verhältnis zwischen der ex-vivo vWF-Belegung und der mAb 82D6A3 Plasmaspiegel.
Alle Durchschnittsdaten, die zu verschiedenen Zeitpunkten in den drei verschiedenen Dosis-Studien gemessen wurden, wurden verwendet (Tabelle II und III).
6: Inhibition der VWF-Bindung an humanem Collagen Typ I
Inhibition der vWF (Endkonzentration von 0,5 μg/ml)-Bindung an humanem Collagen Typ I (☐), Typ III (•) oder an Collagen der Kalbshaut (Δ) durch 82D6A3 F(ab). Die Platten wurden mit 25 μg/ml, 100 μl/Well Collagen bedeckt. Gebundener vWF wurde nachgewiesen.
7: Inhibition der Plättchenablagerung auf einem humanen Collagen Typ I
7a: Inhibition der Plättchenablagerung auf einer mit humanem Collagen Typ I bedeckten Oberfläche im Flussei einer Scherrate von 2600 s^–1. Gefüllter Balken: kein Antikörper, offener Balken: 3 μg/ml 82D6A3, schraffierte Balken: verschiedene Konzentrationen an 82D6A3 F(ab)-Fragmenten.
7b: Scherungs-abhängige Inhibition der Plättchenablagerung auf einer mit humanem Collagen Typ I bedeckten Oberfläche durch 82D6A3: gefüllte Balken: kein Antikörper, offene Balken: 5 μg/ml 82D6A3 F(ab)-Fragmente.
8: Bindung der Phagen-Klone
8a: Die Bindung der Phagen-Klone L15G8 (•) und L15C5
an mit 10 μg/ml 82D6A3 bedeckten Mikrotiterplatten.
8b: Inhibition der Bindung der Phagen L15G8 (•) und L15C5
an mit 10 μg/ml 82D6A3 bedeckten Mikrotiterplatten durch vWF. Endkonzentration von L15G8: 2,10⁹/ml, L15C5: 8,10⁹/ml. Gebundene Phagen wurden nachgewiesen.
9: Bindung der Phagen-Klone
9a: Die Bindung der Phagen-Klone C6H5 (•), C6G12
und C6A12
an mit 10 μg/ml 82D6A3 bedeckten Mikrotiterplatten.
9b: Inhibition der Bindung der Phagen C6H5 (•), C6G12
und C6A12
an mit 10 μg/ml MoAb 82D6A3 bedeckten Mikrotiterplatten durch vWF. Endkonzentration der Phagen: 5,10¹⁰/ml. Gebundene Phagen wurden nachgewiesen.
10: Inhibition der Bindung von biotinylierten C6H5-Phagen an mit 10 μg/ml 82D6A3 bedeckten Mikrotiterplatten durch L15G8-Phagen
Inhibition der Bindung von biotinylierten C6H5-Phagen an mit 10 μg/ml 82D6A3 bedeckten Mikrotiterplatten durch L15G8-Phagen. Die C6H5-Phagen wurden bei einer Endkonzentration von 2,10¹⁰/ml verwendet. Gebundene biotinylierte C6H5-Phagen wurden mit Streptavidin-HRP nachgewiesen.
11: Abgleichung („Alignment") der vWF-Sequenz mit den Phagen-Sequenzen

Abgleichung („Alignment") der vWF-Sequenz mit den Phagen-Sequenzen (: Ähnlichkeit, | Identität).

Tabelle 1

min	vWF-Ag-Spiegel (μg/ml)		MoAb 82D6A3-Spiegel (μg/ml)		vWF-Belegung (%)		Collagenbindung (%)
	100 μg/kg	300 μg/kg	100 μg/kg	300 μg/kg	100 μg/kg	300 μg/kg	100 μg/kg	300 μg/kg
0	10.2 ± 1.7	10.2 ± 1.7	0	0	2.3 ± 1.3	2.3 ± 1.3	101 ± 7	101 ± 7
30	10.2 ± 2.5	8.8 ± 1.4	0.4 ± 0.07	2.9 ± 0.3	80 ± 10.8	102 ± 10.4	64 ± 7	4 ± 1
60	8.9 ± 1.4	9.1 ± 2.4	0.4 ± 0.1	2.8 ± 0.3	80 ± 2.4	99 ± 10.6	69 ± 9	4 ± 1
150		9.7 ± 2.7		2.6 ± 0.1		101 ± 7.6		4 ± 1
300		8.8 ± 0.1		2.0 ± 0.5		94 ± 0.9		4 ± 1
24 h		12.8 ± 1.3		0.7 ± 0.2		74 ± 31		91 ± 18
48 h		13.2 ± 0.8		0.2 ± 0.01		63 ± 7.8		93 ± 0

Tabelle 2

	VWF-Ag-Spiegel (μg/ml)	mAb 82D6A3-Spiegel (μg/ml)	vWF-Belegung (%)	Collagenbindung (%)
0 min	14 ± 1.7	0	6.9 ± 0.1	100 ± 0
30 min	11.5 ± 0.9	4.5 ± 0.5	96 ± 1	4 ± 0.2
60 min	10.8 ± 0.1	4.8 ± 0.7	96 ± 0.2	3.5 ± 0.2
150 min	11.9 ± 1.8	3.8 ± 0.5	97 ± 4	3.52 ± 0.2
300 min	10.5 ± 0	3.8 ± 0.6	97	4
24 h	22.9 ± 0	1.4 ± 0.01	88	45

Tabelle 3

Referenzliste

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Sequenzprotokoll

Claims

Ligand, der ein Antikörper oder ein ein Antigen erkennendes Fragment hiervon ist, der spezifisch an die A3-Domäne des von Willebrand-Faktors (vWF) oder ein Epitop hiervon bindet, dadurch gekennzeichnet, dass er weder die GP1b-vWF-Bindung noch die GPIIb-IIIA-Rezeptorbindung blockiert, zur Verwendung als Medikament.
Ligand nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass er spezifisch an ein Epitop bindet, welches Aminosäuren umfasst, die in der Sequenz lokalisiert sind, welche die Aminosäuren 974 bis 989 innerhalb der A3-Domäne des vWF umfasst.
Ligand nach Anspruch 2, der an ein Epitop bindet, welches die Aminosäure PW (aa981–982) in der A3-Domäne von vWF umfasst.
Ligand nach Anspruch 3, der an ein Epitop bindet, welches die Aminosäuren V, P, W und N innerhalb der A3-Domäne von vWF umfasst.
Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, dass wenn der Ligand an einen Pavian durch intravenöse Bolusverabreichung in einer 300 Mikrogramm/kg an monoklonalem Antikörper entsprechenden Dosis verabreicht wird, er die vWF-Bindung an Collagen wenigstens bis zu 5 Stunden nach Injektion inhibiert.
Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand keine heftige Abnahme an zirkulierenden vWF-Spiegeln oder keinen heftigen Abfall in der Blättchenanzahl induziert, wenn der Ligand an einen Primaten durch intravenöse Bolusverabreichung in einer Dosis von bis zu 600 Mikrogramm/kg verabreicht wird.
Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand keine starke Verlängerung der Blutungszeit bewirkt und dass keine Thrombozytopenie induziert wird, wenn der Ligand an einen Primaten durch intravenöse Bolusverabreichung in einer Dosis von bis zu 600 Mikrogramm/kg verabreicht wird.
Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 7, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand eine vWF-Besetzung induziert und eine vWF-Collagenbindung inhibiert, wenn er in einer therapeutisch wirksamen Dosis von bis zu 600 Mikrogramm/kg an einen Primaten durch intravenöse Bolusver- abreichung verabreicht wird.
Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 8, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Gerinnungszeit (Prothrombinzeit (PT) oder aktivierte Teil-Thromboplastinzeit (aPTT) nicht drastisch beeinflusst wird, und die vWF-Collagenbindung inhibiert wird und eine erhöhte vWF-Belegung induziert wird, wenn der Ligand an einen Primaten durch intravenöse Bolusverabreichung in einer therapeutisch wirksamen Dosis von bis zu 600 Mikrogramm/kg verabreicht wird.
Ligand nach einem der Ansprüche l bis 9, weiter dadurch gekennzeichnet, dass bei einer Konzentration von 1 μg/ml die Blättchenablagerung auf einem Collagensubstrat mit einer Scherrate von 1300 s^–1 oder darüber inhibiert wird.
Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 10, der, wenn er an ein Individuum als antithrombotisches Mittel verabreicht wird, die Interaktion von vWF mit Collagen inhibiert und keine starken Blutungserkrankungen bei einer minimalen medizinisch wirksamen Dosis induziert, um eine antithrombotische Wirkung zu erhalten.
Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 11, der, wenn er an ein Individuum als antithrombotisches Mittel verabreicht wird, zirkulierende vWF-Spiegel oder Blättchenanzahl bei einer minimalen medizinisch wirksamen Dosis aufrecht erhält, um eine antithrombotische Wirkung zu erhalten.
Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 12, der ein monoklonaler Antikörper ist, erhältlich von einer Zell-Linie, die bei den Belgischen Sammlungen für Mikroorganismen unter der Zugangsnummer LMBP 5606CB hinterlegt wurde oder ein ein Antigen erkennendes Fragment hiervon.
Immunokonjugat, umfassend den Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und ein thrombolytisches Mittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder das Immunokonjugat nach Anspruch 14, in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.