DE60033814T2

DE60033814T2 - Monoklonaler Antikörper der Faktor VIII selbst in molarem Überschuß nur teilweise inaktiviert und eine Methode zur Herstellung solch eines Antikörpers

Info

Publication number: DE60033814T2
Application number: DE60033814T
Authority: DE
Inventors: Marc G. Jacquemin; Jean-Marie R. Saint-Remy
Original assignee: Desire Collen Research Foundation vzw
Current assignee: Desire Collen Research Foundation vzw
Priority date: 1999-07-14
Filing date: 2000-07-13
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2020-07-14
Also published as: PT1194528E; DE60033814D1; CA2381125C; AU781638B2; WO2001004269A1; ATE356201T1; AU6273000A; EP1194528B1; EP1194528A1; JP2008295455A; JP4297207B2; JP2003504045A; CA2381125A1; ES2283308T3; DK1194528T3; CY1107638T1; JP4297225B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Zelllinien und Liganden, und zwar humane und/oder humanisierte monoklonale Antikörper sowie Fragmente, wie beispielsweise Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, einzelne variable Domänen, komplementaritätsbestimmende Regionen, Derivate, Homologe und deren Kombinationen, die aus diesen Zelllinien erhältlich sind. Sie betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Liganden enthalten, und Verfahren zur Prophylaxe und zur Behandlung von Koagulationserkrankungen und resultierenden thrombotischen pathologischen Zuständen bei Menschen durch Verabreichen dieser Liganden an Patienten mit dem Bedarf danach. Sie betrifft auch Verfahren zum Erhalten spezifischer Antikörper aus Säugern.
Hintergrund der Erfindung
Die Bildung von Blutgerinnseln behindert nicht nur die Blutung aufgrund von Verletzungen (Hämostase), sondern kann in Verbindung mit Arterioskleroseerkrankungen durch Verschluss einer wichtigen Arterie oder Vene zu ernsthaften Organschäden und zum Tod führen. Eine Thrombose ist daher die Bildung von Blutgerinnseln zur falschen Zeit und am falschen Ort. Sie beinhaltet eine Kaskade aus komplizierten und regulierten biochemischen Reaktionen zwischen im Blut zirkulierenden Proteinen (Koagulationsfaktoren), Blutzellen (insbesondere Thrombozyten) und Elementen einer verletzten Gefäßwand. Antikoagulations- und Antithrombosebehandlungen zielen darauf ab, die Bildung von Blutgerinnseln zu hemmen, um so diesen gefährlichen Folgen, wie beispielsweise Myokardinfarkt, Schlaganfall, Extremitätenverlust bei peripherer arterieller Erkrankung oder Lungenembolie, vorzubeugen. Angesichts der Wichtigkeit dieser Erkrankungen ist es daher ziemlich überraschend, dass Antithrombosetherapien seit Jahren auf einige wenige Medikamente, und zwar Acetylsalicylsäure zum Hemmen der Thrombozyten, Heparin, das die Koagulationsfaktoren IX, X und II (Thrombin) indirekt hemmt, und orales Warfarin, das die Vit K-abhängigen Faktoren (VII, IX, X, II und Prot C) hemmt, zurückgreifen. Seit neuestem wurden niedermolekulare Heparine (die die Faktoren X und II in verschiedenem Maße hemmen), zum großen Teil aufgrund der Leichtigkeit ihrer Anwendung (einmal pro Tag eine subcutane Injektion ohne das Erfordernis von Monitoring) die Antikoagulantien der Wahl. Mit wachsendem Verständnis der an Thrombose beteiligten Prozesse, wurde eine wachsende Anzahl an spezifischen Inhibitoren von Koagulationsfaktoren entwickelt. Ein besseres Verhältnis zwischen Wirksamkeit und Sicherheit konnte mit diesen jedoch bis heute nicht erreicht werden. In großen klinischen Versuchen wurden insbesondere direkte Thrombin-Inhibitoren mit Komplikationen bei einer erhöhten Blutung in Verbindung gebracht.
Acetylsalicylsäure stellt auch einen Schutzeffekt vor Thrombose bereit. Sie induziert einen lang anhaltenden, funktionellen Defekt in Thrombozyten, klinisch als Verlängerung der Blutungszeit nachweisbar, durch Hemmung der Cyclooxygenase-Aktivität des humanen Thrombozytenenzyms Prostaglandin H-Synthase (PGHS-1) in so geringen Dosen wie 30 bis 70 mg. Da gastrointestinale Nebenwirkungen von Acetylsalicylsäure dosisabhängig zu sein scheinen und, zur Sekundärprophylaxe, eine Behandlung mit Acetylsalicylsäure für einen unbegrenzten Zeitraum empfohlen wird, gibt es praktische Gründe, die niedrigste Wirkdosis auszuwählen. Des Weiteren wurde spekuliert, dass eine niedrige Dosis (30 mg täglich) mehr antithrombotisch wirken könnte, jedoch lieferten Versuche zur Identifizierung der optimalen Dosierung widersprüchliche Ergebnisse. Es wurde behauptet, dass die Dosis von Acetylsalicylsäure, die zum vollständigen Unterdrücken der Thrombozytenaggregation benötigt wird, bei Patienten mit zerebrovaskulärer Erkrankung höher sein könnte als bei gesunden Testpersonen und beim gleichen Patienten von Zeit zu Zeit variieren könnte. Mit einer täglichen Dosisgabe von 30 mg oder mehr senkt Acetylsalicylsäure jedoch das Risiko für größere vaskuläre Ereignisse um höchstens 20 %, so dass ein großer Spielraum für Verbesserungen bleibt.
Die hemmende Rolle von Acetylsalicylsäure kann zudem sowohl zu einer Prophylaxe von Thrombose als auch zu einer übermäßigen Blutung führen. Der Ausgleich zwischen diesen beiden hängt entscheidend von dem absoluten Risiko eines Patienten für Thrombose gegenüber dem für Hämorrhagie ab.
Bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt wurden mit verschiedenen Thrombolysemitteln eine Reduktion der Infarktgröße, eine Aufrechterhaltung der Ventrikelfunktion und eine Reduktion der Mortalität gezeigt. Diese Mittel zeigen jedoch signifikante Mängel, einschließlich der Notwendigkeit für große therapeutische Dosen, einer begrenzten Fibrinspezifizität und einer signifikanten Neigung zu assoziierter Blutung. Der rekombinante Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) stellt bei mehr als der Hälfte der Patienten wieder eine vollständige Durchgängigkeit her, während Streptokinase dieses Ziel bei weniger als einem Drittel erreicht. Zudem tritt in 5 bis 10 % aller Fälle ein erneutes Verschließen nach einer Thrombolysetherapie während des Krankenhausaufenthalts und in bis zu 30 % aller Fälle innerhalb des ersten Jahres auf, nach Verheugt et al., J. Am. Coll. Cardiol. (1996) 27: 618–627. Daher wurden in zahlreichen Studien die Auswirkungen einer kombinativen Antithrombintherapie auf Patienten mit akutem Myokardinfarkt untersucht. Das U.S. Patent 5,589,173, als ein Beispiel, offenbart ein Verfahren zur Auflösung und zur Prophylaxe einer erneuten Bildung eines sich verschließenden Thrombus, welches das Verabreichen eines Gewebefaktor-Protein-Antagonisten, der ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein kann, in Kombination mit einem Thrombolysemittel, umfasst.
Es wurde bereits gezeigt, dass monoklonale Antikörper einen therapeutischen Wert als Antithrombosemittel haben. Das erste zugelassene Medikament in diesem Bereich war Abciximab (ReoPro^TM), ein humanisiertes Fab-Fragment eines murinen monoklonalen Antikörpers (7E3) gegen Thrombozyten-GP IIbIIIa-Rezeptoren. Murine Antikörper besitzen Eigenschaften, die ihre Verwendung bei der Therapierung von Menschen stark einschränken kann. Als fremde Proteine können sie eine anti-Immunglobulin-Antwort, bezeichnet als Mensch-anti-Maus-Antikörper (HAMA), auslösen, die ihre therapeutische Wirksamkeit reduziert oder zerstört und/oder allergische Reaktionen oder Reaktionen der Überempfindlichkeit bei Patienten hervorruft, wie bei Jaffers et al., Transplantation (1986) 41:572 zu lesen ist. Die Notwendigkeit nach erneuter Verabreichung bei einer Therapie von thromboembolischen Erkrankungen erhöht die Wahrscheinlichkeit solcher Immunreaktionen. Obwohl die Verwendung humaner monoklonaler Antikörper diese Einschränkung ansprechen würde, hat es sich als schwierig herausgestellt, große Mengen solcher Antikörper mit herkömmlichen Hybridomtechnologien zu erzeugen.
Aus diesem Grund wurden rekombinante Technologien dazu verwendet, „humanisierte" Antikörper herzustellen, die die hohe Bindungsaffinität von murinen monoklonalen Antikörpern beibehalten, aber eine verminderte Immunogenität bei Menschen aufweisen. Insbesondere wurden chimäre Antikörper vorgeschlagen, bei denen die variable Region (V) eines nicht-humanen Antikörpers mit der konstanten (C) Region eines humanen Antikörpers kombiniert ist. Als ein Beispiel wurde das murine Fc-Fragment von 7 E3 entfernt und durch die humane konstante Immunglobulin G-Fab-Region ersetzt, so dass ein als c7 E3 Fab oder Abciximab bekannter chimärer Antikörper ausgebildet wurde. Verfahren zum Erhalten solcher chimären Immunglobuline ist ausführlich im U.S. Patent 5,770,198 beschrieben.
Das Potential für einen Synergismus zwischen der Hemmung von GPIIb/IIIa durch den monoklonalen Antikörper 7 E3 Fab und einer Thrombolysetherapie wurde von Kleinman et al., J. Am. Coll. Cardiol. (1993) 22: 381–389 beurteilt. Bei dieser Studie trat häufig eine starke Blutung auf. Das Potential für eine lebensbedrohliche Blutung stellt bei dieser Kombination aus starken Antithromboseverbindungen eindeutig die größte Sorge dar.
In einem neueren Ansatz zur Senkung der Immunogenität muriner Antikörper werden nur die komplementaritätsbestimmenden Regionen (complementarity determining region, CDR), d.h. Regionen mit Hypervariabilität in den V-Regionen, anstelle der gesamten V-Domäne auf einen humanen Antikörper übertragen. Auf diese Weise humanisierte Antikörper sind als „CDR-grafted"-Antikörper bekannt. Ein solcher „CDR-gafted"-Antikörper wurde erfolgreich gegen das relativ einfache Nitrophenacetyl-Antigen konstruiert, die Konstruktion von „CDR-grafted"-Antikörpern, die komplexere Antigene erkennen, hat jedoch zu Antikörpern geführt, die eine signifikant geringere Bindungsaktivität besitzen als die nativen, nicht-humanen Antikörper. Anhand zahlreicher Fälle wurde gezeigt, dass das bloße Einschleusen von nicht-humanen CDRs in einen humanen Antikörper nicht dazu ausreicht, die gesamte Bindungsaktivität aufrechtzuerhalten. Obwohl ein verfeinertes Computermodell für die murinen Antikörper von Interesse dazu erforderlich ist, die entscheidenden Aminosäuren, die bei der Gestaltung eines humanisierten Antikörpers in Betracht gezogen werden sollten, zu identifizieren und allgemeine theoretische Richtlinien für eine solche Darstellung vorgeschlagen wurden, muss die Vorgehensweise jedoch bei jedem Fall auf den bestimmten nicht-humanen Antikörper von Interesse zugeschnitten und optimiert werden.
Gewebefaktor (tissue factor, TF), ein als Rezeptor für Faktor VII und VIIa fungierendes und dabei den extrinsischen Weg initiierendes Membranglykoprotein, wurde als Ziel einer antikoagulanten Therapie untersucht. Neben dieser Rolle wurde TF mit pathogenen Zuständen, wie beispielsweise Gefäßerkrankung und gram-negativem septischem Schock, in Verbindung gebracht. Eine Studie, die versucht, das antikoagulante Potential von murinen monoklonalen Antikörpern zu charakterisieren, ergab, dass die Hemmung der TF-Funktion bei den meisten der getesteten monoklonalen Antikörper von der Dissoziation des TF/VIIa-Komplexes abhing, der sich schnell bildete, wenn der TF mit Plasma in Berührung kommt. Ein monoklonaler Antikörper, TF8-5G9, war in der Lage, den TF/VIIa-Komplex ohne eine Dissoziation des Komplexes zu hemmen, wobei eine unmittelbare, antikoagulante Wirkung auf das Plasma bereitgestellt wurde, wie in der WO 96/40,921 offenbart ist.
Als Target bestimmte Gerinnungsfaktoren liegen sowohl mit einem mittleren Molekulargewicht (ungefähr 45.000 bis 160.000) als auch in einer relativ hohen Normalkonzentration im Plasma (mindestens 0,01 Mikromol/l) vor.
Eine anhaltende Sorge bei allen verfügbaren Antithrombosemitteln stellt das Risiko einer Überdosierung und damit einer übermäßigen und lebensbedrohlichen Blutung dar. Bei den meisten der derzeitigen Antithrombosemittel wird somit ein enges Patienten-Monitoring gewährleistet.
Es besteht daher der Bedarf nach wirksamen Verbindungen für die Behandlung von Koagulationserkrankungen, die nicht überdosiert werden können, kein Monitoring erfordern und keine Probleme mit Blutungen zeigen. Für ein auf Antikörpern basierendes, therapeutisches Mittel wäre die ideale Verbindung ein humaner Antikörper mit einer vollständigen antikoagulanten Wirksamkeit, der keine Immunogenität induziert.
Faktor VIII ist ein Protein, das die wichtige Aktivität eines koagulanten Cofaktors bereitstellt und einer der humanen Gerinnungsfaktoren mit einem ziemlich hohen Molekulargewicht (265.000) und einer sehr geringen Konzentration im Plasma (0,0007 Mikromol/Liter) ist. Mit seinen 2.332 Aminosäureresten ist Faktor VIII eine der längsten bekannten Polypeptidketten und wird in der Leber, in der Milz und in der Plazenta synthetisiert. Es wurde gezeigt, dass sein Gen 186.000 Nukleotide umfasst.
Faktor VIII zirkuliert im Plasma als inaktives Protein. Die Faktoren V und VIII sind homologe Proteine, die eine übliche strukturelle Konfiguration aus verdreifachten A-Domänen und verdoppelten C-Domänen mit strukturell verschiedenen B-Domänen, welche die A2- und A3-Domäne verbinden, teilen. Faktor VIII zirkuliert mit einer Konzentration von 1 nmol/l in einer Vielzahl von fragmentierten Spezies in einem fest assoziierten Komplex mit dem von-Willebrand-Faktor. Die Aktivierung von Faktor VIII erfolgt durch eine Spaltung zwischen den A1- und A2-Domänen, was zu dem instabilen, heterotrimeren Faktor VIIIa-Molekül führt. Faktor VIIIa bindet fest an saure Phospholipide enthaltende Membranen. Nach Arai et al., in J. Clin. Invest. (1989) 83:1978, enthält Faktor VIII eine Phospholipid-Bindungsstelle in der C2-Domäne, zwischen den Aminosäuren 2302 und 2332. Nach Shima et al., in Throm. Haemost. (1993) 69:240 und J. Biol. Chem. (1994) 269:11601, befindet sich in der gleichen Region des Faktors VIII auch eine von-Willebrand-Faktor-Bindungsstelle, die in Verbindung mit den Aminosäureresten 1645–1689 in der A3-Domäne wirkt.
Polyklonale Antikörper, die die Cofaktor-Aktivität von Faktor VIII hemmen, wurden nach ihrem Vermögen, Faktor VIII entweder komplett (Typ I) oder nur teilweise (Typ II) zu hemmen, als Typ I- oder Typ II-Inhibitoren klassifiziert. Gemäß Gawryl et al., Blood (1982) 60:1103-9, wird vermutet, dass die reduzierte Inaktivierung von Faktor VIII durch humane Typ II-Autoantikörper von einem sterischen Effekt des von-Willebrand-Faktors herrührt. Es werden keine monoklonalen Antikörper erwähnt und bis heute wurde aus diesen Typ II-Inhibitoren kein therapeutischer Nutzen gezogen. Biggs et al., Br. J. Haematol. (1972) 23:137 stellten bereits vorher die aus Daten, die unter Verwenden von humanen polyklonalen Antikörpern erhalten wurden, abgeleitete Interpretation bereit, dass das Muster eines Typ II-Inhibitors mit einer geringen Affinität verbunden ist. B. Ly et al., Scandinavian Journal of Haematology (1982) 28: 132–140 offenbaren polyklonale Antikörper gegen Faktor VIII, die sowohl bei Blutern, die Alloantikörper entwickeln, als auch bei den seltener vorkommenden Patienten, die Autoantikörper gegen ihren eigenen Faktor VIII besitzen, sehr oft zu der IgG-Klasse gehören. Wie die Antikörper, die bei Biggs et al. (1972) und Hoyer et al. (1982) beschrieben sind, inaktivieren auch diese polyklonalen Antikörper teilweise die Aktivität von Faktor VIII. Auch dieses Dokument führt in keinster Weise aus, ob monoklonale Antikörper das Muster der Inaktivierung von Faktor VIII, das von den polyklonalen Antikörpern der Patienten gezeigt wird, wiedergeben können. Es werden wiederum keine monoklonalen Antikörper erwähnt.
Die europäischen Patentanmeldungen EP-A-123,945, EP-A-152,746 und EP-A-432,134 offenbaren jeweils monoklonale Antikörper, die in Hybridomzelllinien produziert wurden und ein spezifisches Reaktivitätsmuster mit Faktor VIIIc-Polypeptidfragmenten zeigen. Es wird gesagt, dass diese monoklonalen Antikörper zum Nachweisen des Vorhandenseins von Faktor VIIIc und verwandten Polypeptiden im Plasma mit Hilfe von Immunoassay-Techniken nützlich sind, in diesen Dokumenten wird jedoch keine mögliche Verwendung in Therapien vorgeschlagen.
J. Battle et al., Annals of Hematology (1997) 75: 111–115 offenbaren einen polyklonalen Alloantikörper aus einem Patienten mit schwerer von-Willebrand-Erkrankung, der, gleich einem polyklonalen Antikörper aus Kaninchen gegen den von-Willebrand-Faktor, eine teilweise hemmende Aktivität gegen Faktor VIII im Plasma zeigt. Diese polyklonalen anti-Faktor VIII-Antikörper inaktivieren somit Faktor VIII, wobei sie ein Muster befolgen, das demjenigen bei Patienten mit Hämophilie A gefundenen anti-Faktor VIII-Typ II-Antikörpern ähnelt (Gawryl et al., Blood (1982) 60:1103-9). In diesem humanen Alloantikörper wurden jedoch keine Faktor VIII-Antikörper nachgewiesen, was eine nicht-spezifische Hemmung nahe legt.
J. Ingerslev et al., Clinica Chimica Acta (1988) 174: 65–82 offenbaren eine Reihe von murinen monoklonalen Antikörpern gegen humanen von-Willebrand-Faktor: zwei von diesen, die zum Immunglobulin-Isotyp IgG1 gehören, zeigen eine extrem geringe (1,3 BE (Bethesda-Einheit)/mg Immunglobulin) Hemmung von Faktor VIII, wie in der Tabelle I dieses Dokuments gezeigt ist. Humaner monoklonaler Antikörper BO2C11, der von einem Hämophilie A-Patienten mit Inhibitor stammt, besitzt im Vergleich dazu eine spezifische Aktivität von 7.000 BE/mg Protein (Jacquemin et al., Blood (1998) 92: 496–506). Dies zeigt an, dass eine Verabreichung von Antikörpern, wie sie bei Ingerslev et al. beschrieben sind, an ein Tier oder einen Menschen die Aktivität des Faktors VIII nicht beeinflussen würde, solange nicht eine extrem hohe Menge von Antikörpern (Hunderte von mg/ml) im Plasma vorhanden wäre. Die Autoren offenbaren nicht, ob diese Antikörper, wenn sie in großem Überschuss verwendet werden, eine hemmende Aktivität gleich den polyklonalen humanen Typ I- oder Typ II- (d.h. teilweise Inaktivierung) Faktor VIII-Inhibitoren, wie sie bei Gawryl et al., Blood (1982) 60:1103-9 beschrieben sind, zeigen.
Maraganore et al., Circulation (1992) 86:413 zeigten, dass ein synthetisches, aus 12 Aminosäuren bestehendes Peptid entsprechend den Resten 1675–1686 von Faktor VIII die Spaltung der schweren Kette, die zur Aktivierung der prokoagulanten Aktivität von Faktor VIII erforderlich ist, und auch die Spaltung der leichten Kette, die zur Dissoziation des Faktors VIII vom von-Willebrand-Faktor benötigt wird, durch Thrombin hemmt und dass eine Tyrosinsulfatierung dieses Peptids dessen Erkennung von Faktor VIII möglich macht.
J. Clin. Invest. (1988) 82: 206–211 beschreibt das Erhalten eines Tiermodells für Hämophilie A durch Infusion von humanem anti-Faktor VIII-Antikörper in Kaninchen. Gemäß der WO 95/01570 wurden Antikörper gegen die leichte Kette von humanem Faktor VIII oder von Faktor VIII von Schweinen in einem ersten Tier produziert und danach wurde eine vorübergehende Hämophilie mit Hilfe des erhaltenen, gereinigten monospezifischen Antikörpers in einem zweiten Tier induziert. Das U.S. Patent 5,804,159 offenbart auch das Induzieren einer vorübergehenden Verschlusserkrankung in einem Säuger mit Hilfe einer Zubereitung eines anti-Plasma-Antikörpers, die auf mehrere Koagulationsfaktoren im Blut wirkt, z.B. einer Zubereitung, die Antikörper gegen humanen von-Willebrand-Faktor und Faktor VIII, oder gegen einen Komplex aus Faktor VIII und von-Willebrand-Faktor, oder gegen Prokoagulantien, Antikoagulantien, Strukturfaktoren des Blutgerinnsels, Fibrinolysefaktoren und Phospholipide umfasst.
Jedoch wurden keine der oben erwähnten, Faktor VIII enthaltenden Antikörperverbindungen für therapeutische Zwecke beschrieben. Tatsächlich besteht unter Fachleuten ein Vorurteil dagegen, anti-Faktor VIII-Antikörper für Antithrombosetherapien zu untersuchen, da angenommen wird, dass solche Antikörper einen Blutungszustand induzieren würden, da ja ein Mangel an Faktor VIII die Ursache für Hämophilie A ist.
Die WO 97/26010 offenbart monoklonale Antikörper mit selbst begrenzender, neutralisierender Aktivität gegen einen Koagulationsfaktor, die in pharmazeutischen Zusammensetzungen für Thromboseerkrankungen von Nutzen sind. Selbst begrenzende, neutralisierende Aktivität ist in diesem Dokument als die Aktivität eines Antikörpers definiert, der an einen humanen Koagulationsfaktor bindet und die Thrombose so hemmt, dass eine begenzte Modulation der Koagulation erzeugt wird. Eine begenzte Modulation der Koagulation ist als ansteigende Blutgerinnungszeit definiert, die durch Verlängerung der aktivierten Partiellen Thromboplastinzeit (aPTT), wo das Plasma, wenn aPTT einen Maximalwert, vorzugsweise 35 bis 100 Sekunden, erreicht, trotz erhöhter Konzentrationen des monoklonalen Antikörpers gerinnungsfähig bleibt, gemessen wurde. APTT wird daher als das primäre Kriterium für die Bewertung der Wirksamkeit gegenüber der Verantwortlichkeit von Antithrombosemitteln für Blutungen verwendet.
Insbesondere zeigt dieses Dokument, dass ein polyklonaler Antikörper von Schafen gegen Faktor VIII (SAF8C-IG, käuflich erworben bei Affinity Biologicals) eine selbst begenzende Verlängerung von aPTT induziert (die aPTT erhöhte sich auf ein Maximum von ungefähr 65 Sekunden). Wir haben jedoch gezeigt, dass SAF8C-IG die Aktivität von humanem Faktor VIII vollständig hemmt (siehe 10), d.h. ein Typ I-Inhibitor in der Klassifikation nach Gawryl et al., Blood (1982) 60:1103-9 ist. Dies zeigt, dass ein begrenzter Anstieg der Gerinnungszeit bis auf einen bestimmten Maximalwert nicht notwendigerweise mit einer teilweisen Inaktivierung eines Gerinnungsfaktors und noch weniger mit einer Senkung des Risikos für Blutungen verbunden ist. Es ist zum Beispiel allgemein bekannt, dass Patienten mit einem vollständigen Mangel an Koagulationsfaktoren zwar eine begenzte Verlängerung von aPTT, üblicherweise im Bereich von 60 bis 100 Sekunden, zeigen, jedoch niemals einem drastischen Risiko für Blutungen ausgesetzt sind (Hathaway et al., Am. J. Clin. Pathol. (1979) 71: 22–25 und Hoffmann et al., Thromb. Haemostas. (1978) 39: 640–645).
Im Gegensatz dazu ist allgemein bekannt, dass eine verlängerte aPTT keinen gültigen Parameter für die Senkung des Thromboserisikos bereitstellt. Besonders der Mangel an Faktor XII, einem weiteren Koagulationsfaktor des intrinsischen Koagulationswegs, führt zu einer bis zu 6-fach verlängerten aPTT (Hathaway et al., Am. J. Clin. Pathol. (1979) 71: 22–25 und Hoffmann et al., Thromb. Haemostas. (1978) 39: 640–645). Eine signifikante Anzahl an Patienten mit diesem Mangel haben jedoch einen Myokardinfarkt oder eine Thromboembolie erlitten, was den mangelnden Schutz vor einer Thromboseerkrankung in Patienten mit Mangel an Faktor XII, trotz einer wichtigen Verlängerung der aPTT zeigt (McPherson RA, Am. J. Clin. Pathol. (1977) 68:420 und Glueck HI et al., Ann. Intern. Med. (1966) 64:390).
Jacquemin et al., in Blood (1998) 92: 496–506 beziehen sich auf einen Faktor VIII-spezifischen, humanen monoklonalen IgG4-Antikörper (BO2C11), der mit einer Zelllinie produziert wurde, die aus einem Repertoir von Gedächtnis-B-Zellen eines Hämophilie A-Patienten mit Inhibitoren stammt. Es wird gesagt, dass BO2C 11 die C2-Domäne von Faktor VIII erkennt und dessen Bindung an sowohl den von-Willebrand-Faktor als auch an Phospholipide hemmt. Es wird gesagt, dass er die prokoagulante Aktivität von nativem und aktiviertem Faktor VIII mit einer spezifischen Aktivität von 7.000 Bethesda-Einheiten/mg vollständig hemmt. Die vorliegenden Erfinder haben zudem gezeigt, dass BO2C11, während er die Aktivität von humanem Faktor VIII vollständig hemmt, eine Verlängerung der Gerinnungszeit von ungefähr 110 Sekunden bereitstellt, die mit aPTT gemessen wurde, was erneut zeigt, dass eine Erhöhung der Gerinnungszeit bis auf einen bestimmten Maximalwert nicht notwendiger Weise mit einer teilweisen Inaktivierung eines Koagulationsfaktors verbunden ist. Eine solche Senkung von Faktor VIII-Spiegeln würde den Patienten einem ernsthaften Risiko für Blutungen, wie bei Patienten mit schwerer Hämophilie A, aussetzen (Levine PH, Ann. NY Acad Sci. (1975) 240:201; Gilbert MS, Mount Sinai J. Med. (1977) 44:339).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Liganden, und zwar neue monoklonale humane oder humanisierte Antikörper, Fragmente, Derivate und Homologe davon, wie sie in den beigefügten Ansprüchen definiert sind, die an Faktor VIII oder einen Komplex davon binden; eine neue Zelllinie, aus der die monoklonalen Antikörper erhalten werden können und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Liganden umfassen.
Eine erste Hauptaufgabe der vorliegenden Offenbarung ist daher, eine wirksame und sichere Antithrombosetherapie bereitzustellen, die das Risiko für Blutungen in Säugern, insbesondere in Menschen, reduziert.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, therapeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die eine wirksame Antithrombosetherapie, welche das Risiko für Blutungen in Säugern, und insbesondere Menschen, reduziert, ermöglichen.
Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, eine Antithrombosetherapie und Antithromboseverbindungen bereitzustellen, die sicherer zu Verwenden sind als die bislang bekannten Therapien und Zusammensetzungen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, unter Verwenden spezifischer Liganden, gegen Faktor VIII oder einen Komplex davon gerichtet. Diese Liganden, die monoklonale Antikörper sind, stellen eine therapeutisch nützliche Plateau-Ebene bereit, da sie die Funktion des Faktors, gegen den sie gerichtet sind, nur teilweise hemmen, so dass, selbst wenn der Ligand in molarem Überschuss verwendet wird, eine Restaktivität des Faktors erhalten bleibt. Eine Kurve des hemmenden Effekts eines erfindungsgemäßen Liganden bezogen auf einen bestimmten Faktor, gegen den er gerichtet ist, über die Konzentration des Liganden kann ermittelt werden und die Konzentration, bei der noch eine minimale Restaktivität des Faktors vorhanden ist, welche mindestens 1 %, vorzugsweise mindestens 2 % beträgt, kann bestimmt werden. Die Restaktivität des Faktors bei der fünffachen Konzentration sollte sich im Wesentlichen nicht von Restaktivität am minimalen Punkt unterscheiden. Die vorliegende Erfindung stellt hochaffine, sowohl humane als auch humanisierte, monoklonale Antikörper, sowie Fragmente, Derivate und Homologe all dieser mit dem Vermögen, Faktor VIII oder einen Komplex davon, selbst bei molarem Überschuss des Liganden, nur teilweise zu hemmen, und dadurch dem Risiko einer Überdosierung und den resultierenden Komplikationen mit Blutungen vorzubeugen, bereit. Es ist noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, eine neue Zelllinie bereitzustellen, die den entsprechenden humanen monoklonalen Antikörper produziert.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Polynukleotidsequenzen ein, die für die oben genannten Antikörper oder Fragmente davon codieren. Es wird verständlich sein, dass es viele Nukleotidsequenzen gibt, die infolge der Redundanz des genetischen Codes in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen. Die vorliegende Erfindung schließt auch komplementäre Sequenzen ein, die den oben angegebenen, monoklonalen Antikörpern oder Fragmenten davon entsprechen. Die vorliegende Offenbarung schließt insbesondere Sonden ein, die aus den oben angegebenen, monoklonalen Antikörpern oder Fragmenten davon oder aus den oben angegebenen Polynukleotiden oder den komplementären Sequenzen konstruiert wurden.
Die vorliegende Offenbarung stellt des Weiteren ein Verfahren zur verzögerten Koagulation in Menschen bereit, das das Verabreichen eines, entweder humanen oder humanisierten, monoklonalen Antikörpers, Fragments, Derivats oder Homologons davon, der/das in der Lage ist, Faktor VIII oder einen Komplex davon nur teilweise zu inaktivieren, an einen Patienten mit dem Bedarf nach einer solchen Verzögerung, selbst wenn der Ligand in einem molaren Überschuss vorliegt, umfasst. Sie offenbart ferner ein Verfahren zur Behandlung oder zur Prophylaxe eines thrombotischen pathologischen Zustands in Säugern, und zwar in Menschen, das das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Liganden, und zwar eines, entweder humanen oder humanisierten, monoklonalen Antikörpers, oder eines Fragments, Derivats oder Homologons davon, der/das in der Lage ist, Faktor VIII oder einen Faktor VIII einschließenden Komplex nur teilweise zu hemmen, selber wenn der Ligand in einem molaren Überschuss vorliegt, an einen Säuger mit dem Bedarf nach einer solchen Behandlung oder einer solchen Prophylaxe umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform kann der thrombotische pathologische Zustand ausgewählt sein aus zum Beispiel intravaskulärer Koagulation, arterieller Thrombose, arterieller Restenose, venöser Thrombose und Arteriosklerose.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, die einen monoklonalen Antikörper mit der Fähigkeit, an einer Stelle auf einem Faktor VIII oder einen Faktor VIII einschließenden Komplex zu binden, um diesen Faktor oder Faktorkomplex, selbst wenn der Ligand in molarem Überschuss vorliegt, nur teilweise zu inaktivieren, in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Dieser Ligand ist ein hochaffiner anti-Faktor VIII- oder ein anti-Faktor VIII-von-Wilebrand-Faktor-Komplex, entweder humaner oder humanisierter oder hybridisierter, monoklonaler Antikörper oder ein Fragment, Derivat oder Homologon davon. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann ferner gegebenenfalls eine therapeutisch wirksame Menge eines Thrombolysemittels umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf Verfahren für die Auswahl von spezifischen monoklonalen Antikörpern gerichtet. Die herkömmliche Technik zum Immunisieren eines Tieres, wie beispielsweise einer Maus, mit einem Protein, wie beispielsweise Faktor VIII, ruft eine immunologische Reaktion hervor, an der mehrere Epitope auf dem Faktor VIII-Molekül beteiligt sein können. Die vorliegende Erfindung stellt selektivere Verfahren zum Erhalten spezifischer monoklonaler Antikörper gegen ein Epitop eines Wildtyp-Proteins bereit. Zunächst wird ein nicht-menschlicher Säuger bereitgestellt (d.h. ausgewählt), der eine zumindest teilweise in der Funktion modifizierte Version eines Wildtyp-Proteins besitzt. Diese Modifikation, die in einer Domäne des Proteins liegt, kann eine beliebige Ursache haben, wie z.B. Rasse oder Sorte, genetische Defekte bei der Geburt, eine Krankheit oder Störung bei einem Menschen, z.B. eine Immuntoleranz gegen die in der Funktion modifizierte Version. Dem Spender, einem nicht-menschlichen Säuger, wird dann das Wildtyp-Protein verabreicht, um so eine Immunantwort hervorzurufen; an diesem Punkt ist es wichtig, dass solange eine ausreichende Menge des Wildtyp-Proteins (z.B. Faktor VIII) verabreicht wird, bis eine Immunantwort erfolgt. Dann, in einem finalen Schritt des Verfahrens, wird die Auswahl von B-Zellen aus dem Spender, einem nicht-menschlichen Säuger, zu einer viel größeren Wahrscheinlichkeit für das Erhalten von monoklonalen Antikörpern gegen ein Epitop in der Region der Modifikation führen, wie zum Beispiel durch Auswählen von B-Lymphozyten aus dem Spender, der Antikörper produziert, die das Wildtyp-Protein nur teilweise inaktivieren.
Das antikoagulante Potential zum Hemmen von Faktor VIII wurde bis heute nicht untersucht, möglicherweise aufgrund der allgemein bekannten Komplikationen mit Blutungen, die bei Hämophilie A-Patienten, denen die Aktivität von Faktor VIII vollständig (schwere Hämophilie) oder in einem hohem Maß (gemäßigte Hämophilie) fehlen, auftreten. Hämophilie A zeigt jedoch nicht nur die Wichtigkeit von Faktor VIII als limitierender Co-Faktor bei der Koagulation, sondern auch die vorhandene Verbindung zwischen Koagulation und der Entwicklung von Arteriosklerose. In der Tat wurde gefunden, dass Arteriosklerose und dessen thrombotische Komplikationen in Patienten mit Hämophilie A deutlich seltener auftreten. Die Aktivität von antagonisierendem Faktor VIII, in einem Maß, in der sie eine ausreichende Hämostase zur Prophylaxe von Blutungen zulässt, aber vor der Bildung eines pathologischen, intravaskulären Thrombus schützt, hält daher die wesentliche Hoffnung auf eine sichere Antikoagulation bei prothrombotischen Erkrankungen, wie beispielsweise tiefer Venenthrombose (deep vein thrombosis, DVT), Lungenembolie (pulmonar embolism, PE), postoperativ, in der Schwangerschaft, bei Koronararterienerkrankung (coronary artery disease, CAD), zerebrovaskulärer Erkrankung (cerebrovascular disease, CVD), peripherer arterieller Erkrankung (peripheral artery disease, PAD) und bei vaskulären Störungen), aufrecht.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der überraschenden Bestimmung neuer Liganden, und zwar neuer humaner und humanisierter monoklonaler Antikörper und Fragmente, Derivate und Homologe davon, wie sie in den beigefügten Ansprüchen spezifiziert sind. Diese zeigen einen unvorhergesehenen „Plateau-Effekt", d.h. das Erreichen einer nur teilweisen Inaktivierung von Faktor VIII, der an der Hämostase, insbesondere an der Koagulationskaskade, entweder einzeln oder in Kombination beteiligt ist, unabhängig von dem Überschuss des Liganden. Die Liganden können an Faktor VIII oder an einen Komplex von Faktor VIII binden, was in einer teilweisen Beeinträchtigung der Funktion einer physiologisch funktionellen Stelle des Faktors oder Faktorkomplexes führt. Dieser „Plateau-Effekt" macht die Liganden insbesondere zum Behandeln von Koagulationserkrankungen und resultierenden thrombotischen pathologischen Zustände geeignet, während das Risiko für Blutungen, im Vergleich zu, insbesondere, Antikörpern mit selbst begrenzender, neutralisierender Aktivität, die in der WO 97/26010 erwähnt sind, minimiert wird. Es besteht daher ein scharfer Kontrast zwischen der „selbst begrenzenden, neutralisierenden Aktivität" von Antikörpern gegen Koagulationsfaktoren, die in der WO 97/26010 offenbart sind, und der klinisch bedeutungsvollen Plateau-Hemmung, die von der vorliegenden Erfindung erfasst wird und bei der anti-Faktor VIII-Antikörper, wie beispielsweise KRIX-1, die Aktivität von Faktor VIII um nicht mehr als 85 % hemmen.
Insbesondere von Nutzen ist eine Eigenschaft der erfindungsgemäßen Liganden, die eine geringe physiologische Funktion der betroffenen Stelle, selbst wenn der Ligand in molarem Überschuss vorliegt, zulasst. Die Liganden sind anti-Faktor VIII-Antikörper oder Antikörper gegen einen Faktor VIII-Komplex und insbesondere humane oder humanisierte monoklonale Hybridantikörper, die an Faktor VIII oder einen Faktor VIII-Komplex binden und die Aktivität von Faktor VIII zumindest teilweise hemmen. Daten geben an, dass Typ II-Inhibitoren mit anderen antigenen Determinanten als Typ I-Antikörpern reagieren und dass diese Determinanten in dem Komplex aus Faktor VIII und von-Willebrand-Faktor teilweise blockiert werden.
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren ausführlicher beschrieben. Die Erfindung ist durch die beigefügten Ansprüche definiert.
Kurze Beschreiben der Figuren
1 stellt die Ergebnisse der Erzeugung humaner monoklonaler Antikörper dar, die von einem Hämophilie A-Patienten stammen, die in der Form von Bindung von IgG-Antikörper an Faktor VIII in ELISA ausgedrückt sind.
2 zeigt die Hemmung der Aktivität von Faktor VIII durch den monoklonalen Antikörper BO2C11.
3 zeigt die Hemmung der Aktivität von Faktor VIII durch den in der Zelllinie KRIX-1 produzierten monoklonalen Antikörper.
4 zeigt die Hemmung der Bindung von aktiviertem Faktor VIII an Phosphatidyl-L-Serin durch den in der Zelllinie KRIX-1 produzierten monoklonalen Antikörper.
5 zeigt den Einfluss von bestimmten polyklonalen Antikörpern auf die Dissoziation von aktiviertem Faktor VIII vom von-Willebrand-Faktor.
6 und 8 zeigen Aminosäuresequenzen (die unteren Linien) und Nukleotidsequenzen (obere Linien) für die variablen Regionen V_H der schweren Ketten von BO2C11 bzw. den monoklonalen KRIX-1-Antikörpern. Es sind auch die drei komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR) von jeder Kette gezeigt, die gemäß einer bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung jeweils ein einzelner Peptidligand sind.
7 und 9 zeigen Aminosäuresequenzen (die unteren Linien) und Nukleotidsequenzen (obere Linien) für die variablen Regionen V_L der leichten Ketten von BO2C11 bzw. den monoklonalen KRIX-1-Antikörpern. Es sind auch die drei CDRs von jeder Kette gezeigt, die gemäß einer bestimmten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung jeweils ein einzelner Polypeptidligand sind.
10 stellt einen Graphen bereit, der die Hemmung der Aktivität von Faktor VIII durch den in der WO 97/26010 erwähnten Antikörper SAF8C-Ig zeigt.
11 veranschaulicht die Kinetik der Hemmung von Faktor VIII durch KRIX-1.
12 veranschaulicht die Hemmung von venöser Thrombose in einem Hamstermodell durch KRIX-1.
Definitionen
Der Begriff "Antikörper" bezeichnet intakte Moleküle sowie Fragmente davon, wie beispielsweise Fab, Fab', F(ab')₂ oder Fv, die in der Lage sind, an die Epitop-Determinante des relevanten Faktors oder an die relevante Domäne des Faktors zu binden.
„Humanisierter Antikörper", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet Antikörpermoleküle, bei denen die Aminosäuren in den nicht-Antigen-bindenden Regionen ausgetauscht wurden, um so mehr einem humanen Antikörper zu ähneln.
Ein „neu geformter humaner Antikörper" oder ein „humaner Hybridantikörper", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen humanen Antikörper, bei dem die Aminosäuren in den Antigen-bindenden Regionen gegen erfindungsgemäße Sequenzen, z.B. CDRs oder andere Teile der variablen Regionen, die aus dem Repertoir humaner Antikörper stammen, ausgetauscht wurden.
Der Begriff „Homologie" oder „homolog", wie er hierin unter Bezugnahme auf erfindungsgemäße Liganden verwendet wird, bezeichnet ein Molekül, das mit einem der erfindungsgemäßen Liganden um die Zielstelle konkurrieren oder dessen Bindung an die Zielstelle hemmen wird. Die Bindung sollte spezifisch sein, d.h. die Bindung des alternativen Moleküls sollte zu der Stelle genauso spezifisch sein wie die des erfindungsgemäßen Liganden. Wenn die Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung Aminosäuresequenzen umfassen, kann Homologie mindestens 80 %, besonders bevorzugt 90 % und ganz besonders bevorzugt 95 % Aminosäuresequenzidentität mit dem relevanten Liganden einschließen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen und bestimmte Figuren beschrieben werden, die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht dadurch, sondern nur durch die Ansprüche beschränkt. Die vorliegende Offenbarung betrifft ein allgemeines Konzept zum Erhalten einer therapeutisch nützlichen „Plateau-Hemmung" durch nur teilweises Inaktivieren eines Faktors in der Hämostase durch Auswahl bestimmter monoklonaler Antikörper, sowie das Herstellen solcher humanen oder humanisierten monoklonalen Antikörper oder Fragmente, Derivate oder Homologe davon und das Verwenden dieser für Antithrombosetherapien und in antithrombotischen therapeutischen Zusammensetzungen. Diese Liganden und Zusammensetzungen können die vorteilhafte Eigenschaft aufweisen, dass die Inaktivierung des Faktors nur teilweise erfolgt, selbst wenn der Ligand in molarem Überschuss vorliegt. Das bedeutet, dass die Inaktivierung noch unvollständig ist, obwohl der Ligand in einer Menge verwendet wird, die den Faktor, gegen den er gerichtet ist, erwartungsgemäß vollständig inaktivieren würde.
Die vorliegende Erfindung stellt eine spezielle Zelllinie bereit, die humane monoklonale Antikörper produziert, die mit humanem Faktor VIII reagieren und insbesondere die Fähigkeit besitzen, die Cofaktor-Aktivität von humanem Faktor VIII durch Wechselwirkung mit der Stelle der proteolytischen Spaltung oder dem von-Willebrand-Faktor oder der Tenase-Komplex-Reaktion oder durch Induzieren einer dreidimensionalen Konformationsänderung im Faktor VIII, insbesondere durch ihr Richten gegen eine Domäne von Faktor VIII und Erkennen von Epitopen, die auf dieser Domäne lokalisiert sind, zu inaktivieren. Eine bevorzugte Domäne ist die C1-Domäne von Faktor VIII, die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt. Eine Stelle auf der C2-Domäne von Faktor VIII kann ebenfalls teilweise gehemmt werden. Die vorliegende Erfindung schließt auch andere als die polyklonalen Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, ein, die die Geschwindigkeit der Freisetzung von Faktor VIII vom von-Willebrand-Faktor senken. Diese monoklonalen Antikörper sind spezifisch auf Faktor VIII, wenn er an den von-Willebrand-Faktor gebunden ist, gerichtet und sind daher gegen ein Epitop gerichtet, das mit dem Komplex aus Faktor VIII und dem von-Willebrand-Faktor assoziiert ist. Die vorliegende Erfindung stellt auch Fragmente von irgendeinem der oben genannten monoklonalen Antikörper, wie beispielsweise Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, CDRs, einzelne variable Domänen sowie Derivate, Homologe und Kombinationen davon, bereit. Insbesondere können diese monoklonalen Antikörper und Fragmente gegen eine Domäne von Faktor VIII, insbesondere die C1-Domäne von Faktor VIII, gerichtet sein. Sie können auch eine Stelle auf der C2- Domäne von Faktor VIII teilweise hemmen. Sie können auch gegen ein mit dem Komplex aus von-Willebrand-Faktor und Faktor VIII assoziiertes Epitop gerichtet sein. Ein Aspekt der vorliegenden Offenbarung stellt daher andere Liganden als die polyklonalen Antikörper bereit, die in einer solchen Weise an eine erste Stelle (z.B. in der C1-Domäne von Faktor VIII) entfernt von einer funktionellen zweiten Stelle (z.B. der Stelle in der C2-Domäne von Faktor VIII, die für die Bindung von Phospholipiden verantwortlich ist) binden, dass die Funktion der zweiten Stelle, selbst wenn der Ligand in einem molaren und therapeutischen Überschuss vorliegt, nur teilweise beeinträchtigt wird.
Die KRIX-1 genannte Zelllinie, die monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung produziert, wurde am 1. Juli 1999 bei BCCM/LMBP (Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms/Plasmid Collection Laboratorium voor Moleculaire Biologie, University of Ghent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent, BE) unter der Zugangsnummer LMBP 5089CB hinterlegt.
Die vorliegende Offenbarung stellt zudem Zelllinien, die humane monoklonale Antikörper mit einer Reaktivität produzieren, die im Wesentlichen derjenigen der humanen monoklonalen Antikörper ähnelt, die mit der oben erwähnten, hinterlegten Zelllinie erhalten werden, sowie die humanen monoklonalen Antikörper, die aus diesen weiteren Zelllinien erhältlich sind, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren neu geformte, humane monoklonale Antikörper oder humane monoklonale Hybridantikörper gegen Faktor VIII bereit, die an Faktor VIII oder einen Faktor VIII und von-Willebrand-Faktor einschließenden Komplex binden und diesen nur teilweise inaktivieren und nur Elemente umfassen, die aus dem Repertoire humaner Antikörper stammen. Mit humanen monoklonalen Hybridantikörpern ist ein Hybridantikörper gemeint, der aus einem humanen Antikörper und aus variablen Regionen gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde. Üblicherweise war es im Stand der Technik bis jetzt nur möglich, Antikörper gegen Faktor VIII, der von Tieren, z.B. Mäusen, stammte, zu erhalten oder chimäre Antikörper aus humanen Antikörpern und den variablen Anteilen, die aus Antikörpern von Mäusen stammten, zu konstruieren.
Die vorliegende Offenbarung stellt auch andere Liganden als die polyklonalen Antikörper bereit, die die Fähigkeit besitzen, einen an der Hämostase, und insbesondere an der Koagulationskaskade von Blut, beteiligten Faktor (oder einen Komplex, der einen Faktor einschließt), vorzugsweise Faktor VIII oder einen Komplex, der Faktor VIII einschließt, durch Binden an eine Stelle des Faktors oder Komplexes nur teilweise zu inaktivieren, wobei die nur teilweise Inaktivierung auch dann stattfindet, wenn der erfindungsgemäße Ligand bezogen auf den Faktor in einem molaren Überschuss vorliegt. Die Stelle, an die der Ligand bindet, kann direkt oder im Wesentlichen an einer physiologischen Wechselwirkung dieses Faktors oder Komplexes beteiligt sein oder nicht beteiligt sein. Beispielsweise kann der Ligand an eine Stelle binden, die in einem vorher festgelegten Abstand von einer physiologisch funktionellen Stelle dieses Faktors entfernt ist. Mit teilweiser „Plateau"-Hemmung meinen wir hier eine höchstens 98%-ige Inaktivierung, vorzugsweise eine höchstens 95%-ige Inaktivierung, die mit einem geeigneten Testverfahren, wie zum Beispiel dem von Coatest^® (Kabi Vitrum, Brüssel, Belgien) oder von Chromogenix AB, Mölndal (Schweden) erhältlichen Chromogenitätstest bestimmt wird. Der Grad der erforderlichen Aktivierung kann von der physiologischen Funktion des an der Hämostase beteiligten Faktors abhängen. Um einen therapeutischen Nutzen bereitzustellen, sollte die Inaktivierung des Blutfaktors andererseits mindestens ungefähr 65 %, vorzugsweise mindestens ungefähr 70 %, betragen und mit dem gleichen Testverfahren wie oben bestimmt werden. Es wird bevorzugt, dass die Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung auf eine andere Weise als dem üblicherweise den Typ II-Antikörpern gegen Faktor VIII zugeschriebenen Mechanismus operieren. Ein herkömmlicher Mechanismus ist die Konkurrenz mit einem anderen Faktor, z.B. dem von-Willebrand-Faktor. Die Kinetik eines Konkurrenzmechanismus meint, dass, wenn die eine Spezies im Vergleich zu der anderen in einer hohen Konzentration (z.B. in einem molaren Überschuss) vorliegt, die Hemmung in ihrer Auswirkung vollständig ist. Im Gegensatz dazu erreichen die erfindungsgemäßen Liganden bei der Inaktivierung des relevanten Faktors ein Plateau, das im Wesentlichen von dem Überschuss des Liganden unabhängig ist. Der andere herkömmliche Mechanismus, der Typ II-Antikörpern zugeschrieben wird, ist derjenige der geringen Affinität: auch in diesem Fall wird ein Überschuss die Reaktion zur einer vollständigen Hemmung führen.
Wenn der Blutfaktor, gegen den die erfindungsgemäßen Liganden gerichtet ist, Faktor VIII ist, können die erfindungsgemäßen Liganden humane monoklonale Antikörper sein, die mit der hinterlegten Zelllinie KRIX 1 erhältlich sind, vorzugsweise von der Klasse IgG sind und die Fähigkeit besitzen, die Cofaktor-Aktivität von Faktor VIII nur teilweise zu inaktivieren. Insbesondere betrifft die Offenbarung, in einer bevorzugten Ausführungsform, humane monoklonale Antikörper eines solchen Ursprungs, die in der Lage sind, in der C1-Domäne von Faktor VIII lokalisierte Epitope zu erkennen. Obwohl sich die Erfinder nicht auf eine einzige Erklärung oder Theorie festlegen wollen, wird vermutet, dass die Bindung solcher humaner monoklonaler Antikörper in einer teilweisen Beeinträchtigung der Bindung von aktiviertem Faktor VIII an Phospholipide, was ein notwendigen Schritt für die Expression der Cofaktor-Aktivität darstellt, resultiert.
Die vorliegende Offenbarung stellt ferner monoklonale Antikörper mit den im Wesentlichen gleichen Eigenschaften, wie sie oben offenbart sind, bereit, die durch absichtliche Immunisierung in Tieren, vorzugsweise in Mäusen, produziert werden, indem zum Beispiel humaner Faktor VIII in Mäuse injiziert wird und die Milzlymphozyten anschließend mit einer Maus-Myelomzelllinie fusioniert werden, worauf die Identifizierung und Klonierung der anti-Faktor VIII-Antikörper produzierenden Zellkulturen erfolgt. Die in den Tieren produzierten monoklonalen Antikörper werden dann humanisiert, indem beispielsweise die bindende komplementaritätsbestimmende Region („CDR") aus dem nicht-humanen monoklonalen Antikörper mit humanen Framework-Regionen – insbesondere der konstanten C-Region eines humanen Gens – assoziiert wird, wie es bei Jones et al in Nature (1986) 321:522 oder bei Ricchmann in Nature (1988) 332:323 offenbart ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Fragmente und Derivate, insbesondere komplementaritätsbestimmende Regionen („CDRs") der oben angegebenen monoklonalen anti-Faktor VIII-Antikörper sowie Homologe davon bereit. Die Erfindung stellt beispielsweise die Antigen-bindenden Fragmente Fab, Fab' und F(ab')₂ bereit, die durch proteolytischen Verdau dieser monoklonalen Antikörper unter Verwenden von im Stand der Technik allgemein bekannten Verfahren, wie sie zum Beispiel bei Stanworth et al., Handbook of Experimental Immunology (1978) Band 1, Kapitel 8 (Blackwell Scientific Publications) beschrieben sind, erzeugt werden. Solche Fragmente, die die Antikörper-bindende Stelle enthalten, haben eine Reihe von Eigenschaften des ursprünglichen Antikörpers, wie beispielsweise die Komplementaktivierung von oder Fähigkeit zur Bindung an Fc-gamma-Rezeptoren, verloren. Die vorliegende Erfindung schließt auch Variable-Fragment-Einzelketten (single chain fragment variables, scFv), Fragmente einzelner variabler Domänen der Antikörper und eine Kombination dieser Fragmente und der oben erwähnten Fragmente ein.
Die Erfindung stellt auch lösliche oder in der Membran verankerte Variable-Teile-Einzelketten der oben genannten monoklonalen Antikörper und ein Verfahren, um diese wie folgt zu erhalten, bereit. Die DNA-Sequenzen der variablen Teile humaner schwerer und leichter Ketten werden in getrennten Reaktionen amplifiziert und kloniert. Eine fünfzehn Aminosäuren lange Linker-Sequenz, zum Beispiel (Gly4 Ser)3, wird in einer zweistufigen Polymerasekettenreaktion (PCR), zum Beispiel gemäß Dieffenbach und Dveksler, „PCR Primer a laboratory manual" (1995), Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY, USA, zwischen die VH und die VL inseriert. Das resultierende Fragment wird dann zur Expression von Variablen-Fragment-Einzelketten (scFv) als lösliches oder von Phagen präsentiertes Polypeptid in einen geeigneten Vektor inseriert. Dies kann mit einem Fachmann allgemein bekannten Verfahren, wie beispielsweise dem bei Gilliland et al., Tissue Antigens (1996) 47: 1–20 beschriebenen, erreicht werden. Die vorliegende Erfindung schließt auch einen Liganden ein, der für hypervariable Regionen eines monoklonalen Antikörpers repräsentative Peptide umfasst, wobei die hypervariablen Regionen in einer Synthese unter Verwenden eines Applied Biosystem-Synthetisierers, wie beispielsweise einem Polypeptid-Synthetisierer, wie zum Beispiel dem von Milligen (USA) erhältlichen Modell 9050 oder einem Modell aus einer verwandten Technologie, erhalten werden und allein oder in Kombination mit anderen oder ähnlichen hypervariablen Regionen Eigenschaften zeigen werden, die denen des ursprünglichen Antikörper ähneln.
Die Offenbarung stellt des Weiteren eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe oder zur Behandlung von Erkrankungen der Hämostase, insbesondere der Koagulationskaskade, und den resultierenden thrombotischen pathologischen Zuständen in Menschen, bereit, die, als einen Wirkstoff, einen anderen Liganden als einen polyklonalen Antikörper, vorzugsweise einen humanen monoklonalen Antikörper, wie er beispielsweise weiter oben offenbart ist, in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Besonders bevorzugt ist der monoklonale Antikörper ein humaner monoklonaler Antikörper oder ein Fragment, Derivat oder Homologon davon, der/das aus der unter der Zugangsnummer LMBP 5089CB bei der Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms hinterlegten Zelllinie KRIX-1 erhältlich ist. Der Grad an Homologie mit dem monoklonalen Antikörper beträgt vorzugsweise mindestens 80 %, besonders bevorzugt 90 % und ganz besonders bevorzugt 95 %, und die Homologie bezieht sich vorzugsweise insbesondere auf die komplementaritätsbestimmenden Regionen des Antikörpers. Ein Ligand gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch ein synthetisches Polypeptid mit äquivalenter Wirksamkeit einschließen. Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung sollte eine therapeutisch wirksame Menge des oben angegebenen Wirkstoffs, wie er beispielsweise unter Bezugnahme auf das Verfahren zur Behandlung oder zur Prophylaxe nachfolgend angegeben wird, umfassen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Offenbarung kann ferner, und zwar in Bezug auf eine so genannte kombinative Antithrombosetherapie, eine therapeutisch wirksame Menge eines Thrombolysemittels umfassen. Solche Thrombolysemittel, sowie ihre von der Klasse, zu der sie gehören, abhängige, gewöhnliche Dosierung sind Fachleuten allgemein bekannt. Unter den zahlreichen Beispielen für Thrombolysemittel, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten sein können, kann insbesondere die folgende, nicht einschränke Liste genannt werden: t-PA, Streptokinase, Reptilase, TNK-t-PA oder Staphylokinase.
Geeignete pharmazeutische Träger zur Verwendung in den pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung sind beispielsweise bei Remington's Pharmacial Sciences 16. Ausgabe (1980) beschrieben und ihre Formulierung ist Fachleuten allgemein bekannt. Sie schließen jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und antimykotische Mittel (zum Beispiel Phenol, Sorbinsäure, Chlorbutanol), isotonische Mittel (wie beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid) und Ähnliche ein. Es können weitere Inhaltsstoffe enthalten sein, um die Wirkdauer des monoklonale Antikörper enthaltenden Wirkstoffs in der Zusammensetzung zu kontrollieren. Zusammensetzungen mit kontrollierter Freisetzung können daher durch Auswahl eines geeigneten Trägers aus Polymeren, wie zum Beispiel Polyestern, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylen-Vinylacetat-Copolymeren, Methylzellulose, Carboxymethylzellulose, Protaminsulfat und Ähnlichen erhalten werden. Die Geschwindigkeit der Freisetzung des Medikaments und die Wirkdauer können auch durch Einschluss des monoklonalen Antikörper enthaltenden Wirkstoffs in Teilchen, z.B. Mikrokapseln, oder eine polymere Substanz, wie beispielsweise Hydrogele, Polymilchsäure, Hydroxymethylzellulose, Polymethylmethacrylat und die anderen, oben beschriebenen Polymere, kontrolliert werden. Entsprechende Verfahren umfassen kolloidale Systeme zur Medikamentenabgabe, wie Liposome, Mikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanopartikel, Nanokapseln und so weiter. In Abhängigkeit vom Verabreichungsweg kann die den Wirkstoff umfassende, pharmazeutische Zusammensetzung Schutzbeschichtungen erfordern. Die zur injizierbaren Verwendung geeignete, pharmazeutische Form schließt sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für noch nicht vorbereitete Zubereitungen davon ein. Übliche Träger schließen daher biologisch verträgliche wässrige Puffer, Ethanol, Glycerin, Polypropylenglykol, Polyethylenglykol und deren Mischungen ein.
Die vorliegende Offenbarung stellt auch die Verwendung eines anderen Liganden als eines polyklonalen Antikörpers (wie er oben offenbart ist) als Medikament bereit. Besonders bevorzugt ist das in der vorliegenden Erfindung verwendete Medikament ein Mittel zur Prophylaxe und/oder zur Behandlung von Erkrankungen der Hämostase, insbesondere Koagulationserkrankungen und anderen thrombotischen pathologischen Zuständen in Säugern, vorzugsweise in Menschen. Der Ligand kann einem Patienten auf irgendeinem, im Stand der Technik allgemein bekannten Weg, d.h. oral, intranasal, subcutan, intramuskulär, intradermal, intravenös, intraarteriell, parenteral oder über einen Katheter, zur Verfügung gestellt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Ligand auch als ein Medikament in Verbindung oder in Assoziation mit einem anderen Medikament, zum Beispiel einem Thrombolysemittel, wie es beispielsweise weiter oben unter dem Punkt pharmazeutischer Zusammensetzungen offenbart ist, verwendet werden.
Die vorliegende Offenbarung stellt daher ein Verfahren zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe von Hämostase, Koagulationserkrankung oder einem thrombotischen pathologischen Zustand sowie ein Verfahren zur verzögerten Koagulation in einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, bereit, das das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines anderen Liganden als eines polyklonalen Antikörpers, wie er beispielsweise weiter oben offenbart ist, an einen Säuger mit dem Bedarf nach einer solchen Behandlung oder Prophylaxe oder verzögerten Koagulation umfasst. Der Ligand ist vorzugsweise ein humaner oder humanisierter monoklonaler Antikörper, der aus der unter der Zugangsnummer LMBP 5089CB bei der Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms hinterlegten Zelllinie KRIX-1 erhältlich ist, oder ein Antigen-bindendes Fragment Fab, Fab' oder F(ab')₂, eine komplementaritätsbestimmende Region (CDR), ein löslicher oder in der Membran verankerter Einzelketten-Variabler-Teil (scFv), eine einzelne variable Domäne oder ein Derivat oder eine Kombination aus all diesen Elementen.
Eine therapeutisch wirksame Menge, wie sie hierin verwendet wird, meint zwischen ungefähr 1 Mikrogramm und ungefähr 10 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht, besonders bevorzugt zwischen ungefähr 10 Mikrogramm und ungefähr 1 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht des zu behandelnden Säugers. Es wird bevorzugt, dass, hinsichtlich der langen Halbwertszeit der meisten humanen IgG-Antikörper, die Liganden der vorliegenden Offenbarung, die monoklonale Antikörper dieser Klasse sind, in einer für den Patienten komfortablen Regelmäßigkeit der Behandlung verabreicht werden.
Als bevorzugte Ausführungsformen des thrombotischen pathologischen Zustands, gegen den eine Prophylaxe erfolgen oder der behandelt werden soll, können intravaskuläre Koagulation, arterielle Thrombose (die für akuten Myokardinfarkt und Schlaganfall verantwortlich sein kann), arterielle Restenose, venöse Thrombose (die üblicherweise infolge eines Traumas nach einem Unfall oder einer Operation oder einer Ruhigstellung auftritt) oder Arteriosklerose genannt werden. In einem ganz besonders bevorzugten Verfahren der Behandlung wird der Patient mit einem (intravenös injizierten) Bolus in einer Dosierung, die von einem Facharzt in Abhängigkeit von den Kriterien, die den speziellen klinischen Zustand des Patienten ausmachen, versorgt.
Das Verfahren zur Behandlung und/oder zur Prophylaxe gemäß der Offenbarung kann des Weiteren die Behandlung oder Prophylaxe des gleichen thrombotischen pathologischen Zustands durch Verabreichen, vorzugsweise nacheinander Verabreichen, einer therapeutisch wirksamen Menge eines Thrombolysemittels, wie beispielsweise desjenigen, das weiter oben unter dem Punkt pharmazeutische Zusammensetzungen offenbart ist, an einen Patienten einschließen. Wie hierin verwendet meint nacheinander, dass der Ligand der vorliegenden Erfindung und das bekannte Thrombolysemittel einem Patienten hintereinander, jedoch nicht gleichzeitig verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Erhalten monoklonaler Antikörper aus einem nicht-menschlichen Säuger bereit, das die Schritte umfasst:

a) Auswählen eines nicht-menschlichen Säugers mit einem modifizierten und zumindest teilweise funktionellen, physiologisch aktiven Protein, wobei die Modifikation hinsichtlich eines Wildtyp-Proteins auftritt und in einer Domäne des Proteins liegt;
b) Verabreichen des Wildtyp-Proteins an den nicht-menschlichen Säuger, um eine Immunantwort hervorzurufen, und
c) Auswählen von B-Lymphozyten aus dem nicht-menschlichen Säuger, die Antikörper produzieren, die das Wildtyp-Protein nur teilweise inaktivieren.

Gemäß diesem Verfahren ist es Standardpraxis, den nicht-menschlichen Säuger zu töten und, um Schritt (c) durchführen zu können, dessen Milz zu entfernen.
Die vorliegende Offenbarung stellt zusätzlich ein Verfahren zum Erhalten von monoklonalen Antikörpern aus dem Blut eines Menschen mit einem modifizierten und zumindest teilweise funktionellen, physiologisch aktiven Protein bereit, wobei die Modifikation hinsichtlich eines Wildtyp-Proteins auftritt und in einer Domäne des Proteins liegt, und diesem das Wildtyp-Protein verabreicht wird, wobei das Verfahren den Schritt des Auswählens von B-Lymphozyten, die die Antikörper, die das Wildtyp-Protein nur teilweise inaktivieren, produzieren, aus dem Blut dieses Menschen umfasst.
Die vorliegende Erfindung, wie sie in den verschiedenen, oben offenbarten Aspekten ausgeführt und in den beigefügten Ansprüchen definiert ist, zeigt eine Reihe von Vorteilen. Der Hauptvorteil der therapeutischen Verwendung der humanen monoklonalen Antikörper der Erfindung ist, dass die Behandlung für die zur Diskussion stehende Immunantwort hochspezifisch ist. Bei Zuständen der Hyperkoagulation stellt die Spezifität der humanen monoklonalen Antikörper der Erfindung sicher, dass die Wechselwirkung innerhalb des Koagulationskaskadewegs auf den von dem Antikörper erkannten Faktor beschränkt ist.
Die Verwendung von anti-Faktor VIII-Antikörpern mit den oben genannten, bevorzugten Eigenschaften stellt insbesondere eine einzigartige Kombination der Vorteile dar, die auf die Richtung gegen Faktor VIII bezogen sind, wobei die einen auf die Eigenschaften der Hemmung von Faktor VIII und die anderen auf die Verwendung von Antikörpern bezogen sind.

– gegen Faktor VIII zu richten meint, dass das Neutralisieren einer Cofaktor-Aktivität, wie beispielsweise derjenigen von Faktor VIII, kein Risiko einer vollständigen Hemmung der enzymatischen Aktivität, die er verstärkt, in sich birgt, und somit einen Vorteil gegenüber den Verfahren darstellt, die direkt gegen Enzyme, wie beispielsweise Faktor IX, gerichtet sind.
– die Ausführungsformen der oben beschriebenen Inhibitoren können gemeinsam haben, dass sie wirkungsvoll, jedoch nur teilweise die Cofaktor-Aktivität von Faktor VIII hemmen, wobei sie, selbst wenn der monoklonale Antikörper der Erfindung in mehr als einem 100-fachen Überschuss verwendet wird, ein therapeutisch nützliches Plateau festlegen. Monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung erreichen bei der Inaktivierung von Faktor VIII einen Plateau-Effekt, der die Verabreichung von Boli erlaubt, wodurch ein sicherer Antithromboseschutz über mehrere Wochen ohne das Erfordernis von Monitoring oder dem Risiko einer Überdosierung erzielt wird.
– humane IgG-Antikörper zeigen eine verlängerte Halbwertszeit von drei Wochen (außer bei IgG3 mit nur einer Woche), so dass dadurch sehr stabile Plasmaspiegel des Antithrombosemittels bereitgestellt werden und eine drastische Senkung der Häufigkeit der Verabreichung möglich wird. Des Weiteren birgt die Verwendung von humanen Antikörpern oder Derivaten ein minimales Risiko für das Induzieren von Immunantworten.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, die nur zum Zweck der Veranschaulichung bereitgestellt wurden, weiter beschrieben.
BEISPIEL 1 – Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die aus Hämophilie A-Patienten stammen
Humane monoklonale Antikörper mit der gewünschten Spezifität und den gewünschten Eigenschaften werden durch Transformation von B-Lymphozyten produziert, welche aus dem peripheren Blut von an Hämophilie A oder erworbener Hämophilie leidenden Patienten, erhalten wurden. Das Verfahren des Auswählens von Patienten ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Um eine spezifischere immunologische Reaktion zu erhalten, werden Patienten gesucht, die eine beeinträchtigte Funktion eines physiologisch aktiven Proteins, z.B. Faktor VIII, aufweisen. Mit „beeinträchtigt" ist gemeint, dass eine bestimmte Restfunktion verfügbar ist, dass diese jedoch kleiner ist, als es für den Wildtyp des gleichen Proteins bekannt ist. Ein Vergleich zwischen dem Selbstprotein und dem Wildtyp-Protein sollte einen Unterschied zwischen den beiden Proteinen, vorzugsweise in einer Region oder in einer Domäne von Interesse, aufweisen. Dieser Unterschied kann eine Deletion oder eine Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren mit anderen sein. Den Patienten wird dann genug Wildtyp-Protein verabreicht, so dass eine immunologische Reaktion hervorgerufen wird. Danach werden die B-Lymphozyten aus den Patienten extrahiert und auf der Basis der Herstellung von Antikörpern mit den gewünschten Eigenschaften ausgewählt. Obwohl hier auf die oben genannten „Patienten" Bezug genommen wird, kann das Verfahren gemäß dieser Ausführungsform allgemein auf Säuger angewendet werden. Die oben angegebene Vorgehensweise führt zu einer größeren Wahrscheinlichkeit für das Erhalten von Antikörpern, die gegen die Domäne gerichtet sind, welche den Defekt enthält.
B-Zellen werden durch Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus und Aktivierung von Oberflächen-Antigenen unter Verwenden von Fachleuten allgemein bekannten Techniken transformiert. Die Zellüberstände, die die geeigneten Antikörper enthalten, werden mit einem speziellen Testverfahren, wie es zum Beispiel weiter unten ausführlicher beschrieben ist, identifiziert.
Antikörper gegen Faktor VIII werden somit identifiziert, indem der Überstand mit Faktor VIII oder mit Faktor VIII/von-Willebrand-Faktor-Komplexen beschichteten Polystyrol-Mikrotiterplatten reagieren gelassen wird. Die Bindung von spezifischen Antikörpern wird durch Zugabe eines an ein Enzym gekoppeltes, nicht-humanes IgG-Reagens nachgewiesen. Die Zugabe eines Enzymsubstrats, das in Gegenwart des Enzyms in eine Farbverbindung umgewandelt wird, erlaubt den Nachweis spezifischer Antikörper. Solche als enzymgebundene Immunoassays (ELISA) bezeichneten Verfahren sind Fachleuten allgemein bekannt und ausführlich in z.B. Current Protocols in Immunology, Kapitel 2, John Wiley & Sons (1994) beschrieben.
Insbesondere im vorliegenden Fall wurde die Bindung von anti-Faktor VIII-IgG-Antikörpern durch Zugabe eines für humanes Fc-gamma spezifischen, mit einer Meerrettichperoxidase markierten, murinen monoklonalen Antikörpers nachgewiesen. Die IgG-Subklasse des anti-Faktor VIII-Antikörpers wurde in einem ELISA nachgewiesen, wie in 1 dargestellt ist. Die Hemmung der funktionellen Aktivität von Faktor VIII wurde wie folgt in einem funktionellen Koagulationstest getestet. Gleiche Volumina eines Zellkulturüberstands und eines Pools aus normalem Plasma wurden zwei Stunden lang bei 37 °C inkubiert und danach die Restaktivität von Faktor VIII gemessen. Diejenigen Antikörper, die die Aktivität von Faktor VIII signifikant hemmen, sind in 1 mit einem Stern gekennzeichnet.
Anti-Faktor VIII-Antikörper produzierende B-Zellen (wie beispielsweise BO2C11) wurden dann expandiert und mit limitierender Verdünnung kloniert, wie beispielsweise in Current Protocols in Immunology (siehe oben) beschrieben ist. Anti-Faktor VIII-Antikörper mit der Fähigkeit, die prokoagulante Aktivität von Faktor VIII zu hemmen, wie es oben beschrieben ist, werden unter Verwenden eines Chromogenitätstest-Kits, wie zum Beispiel eines Chromogenitätstests zum Testen von Faktor VIII von Dade, Düchingen, Deutschland oder Coatest^®, der kommerziell bei Kai Vitrum (Brüssel, Belgien) erhältlich ist, oder Chromogenix AB (Mölndal, Schweden), identifiziert.
Gleiche Volumina monoklonaler Antikörper BO 2C11 und eines Pools aus normalem Blutplasma wurden 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die BO 2C11-Konzentrationen vor dem Mischen sind auf der x-Achse angezeigt. Die Senkung der Aktivität von Faktor VIII wurde in einem Koagulationstest gemessen und als Prozent der Aktivität, die bei Abwesenheit des Antikörpers erhalten wurde, ausgedrückt (siehe 2). Die Restaktivität geht asymptotisch gegen null(vollständige Hemmung).
Antikörper, die die Funktion von Faktor VIII mit ausreichender Affinität hemmen, jedoch die prokoagulante Aktivität von Faktor VIII nicht vollständig hemmen, selbst wenn ein großer Überschuss an Antikörpern verwendet wird, wurden in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ausgewählt. Ein repräsentatives Beispiel für einen solchen Antikörper wird in 3 bereitgestellt, wo, wenn gleiche Volumina von KRIX-1 und des rekombinanten Faktors VIII oder von normalem Plasma 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wurden und die Konzentrationen (ausgedrückt in Mikrogramm/ml) von KRIX-1 vor dem Mischen mit Plasma so wie angegeben waren, die Restaktivität von Faktor VIII unter Verwenden des oben angegebenen Chromogentests gemessen wurde. 3 zeigt interessanter Weise eine ungefähr 60%-ige Hemmung von Faktor bei einer Konzentration von 0,1 Mikrogramm/ml und in noch interessanterer Weise eine asymptotische Hemmung von Faktor VIII von ungefähr 80 % in dem gesamten Konzentrationsbereich von 0,5 bis 300 Mikrogramm/ml.
Die auf diese Weise ausgewählten Antikörper werden dann in einer Großkultur produziert und mittels Affinitätschromatographie unter Verwenden von Fachleuten allgemein bekannten Verfahren gereinigt.
Die Einzelheiten einer nicht-limitierenden Technik zur Herstellung waren wie folgt. Humaner rekombinanter Faktor VIII (spezifische Aktivität: 4000 IE/mg) wurde als Material für eine ausschließliche Verwendung im Labor von Hyland (Glendale, CA) erhalten; aus Plasma stammender (plasma-derived, pd) Faktor VIII-von-Willebrand-Faktor-Komplex, mittels Ionenaustauschchromatographie gereinigt (spezifische Aktivität ± 160 IE/mg Protein; Verhältnis von von-Willebrand-Faktor zu Faktor VIII 15:1 (w/w)), und gereinigter, an Faktor VIII verarmter von-Willebrand-Faktor (Verhältnis von von-Willebrand-Faktor zu Faktor VIII 4800:1 (w/w); Charge 951016) wurden vom Belgischen Roten Kreuz (Brüssel, Belgien) erhalten.
Proben aus peripherem Blut wurden aus an milder Hämophilie leidenden Spendern mit Inhibitoren gesammelt. Mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) wurden durch Infektion mit EBV und gleichzeitiger Aktivierung von Oberflächen-Antigenen immortalisiert. Für die Produktion von Antikörpern gegen Faktor VIII wurden vierhundertachtzig Zelllinien in einem ELISA gescreent. Zum Beispiel wurde eine Zelllinie, KRIX 1 genannt, erfolgreich mit limitierender Verdünnung kloniert. Die Klonalität wurde mit Hilfe einer RT-PCR-Amplifikation von mRNA, die für die V-Regionen der schweren und leichten Ketten des Antikörpers codiert, überprüft: eine einzelne Sequenz wurde aus 10 Klonen der PCR-Produkte erhalten. Gereinigte Antikörper wurden bei einem Durchlaufen des Überstandes der KRIX 1-Zellkultur von Protein-A-Sepharose erhalten. Ein ELISA, der mit Antikörpern der IgG-Subklasse und für die leichte Kette spezifischen Antikörpern durchgeführt wurde, identifizierte KRIX-1 als einen IgG4k.
Die humanen monoklonalen Antikörper wurden durch Adsorption an immobilisiertes Protein A (high-TRAP^R Protein A; Pharmacia, Uppsala, Schweden) gereinigt. Die Fab-Fragmente des humanen monoklonalen Antikörpers wurden durch Papain-Verdau hergestellt. Ein mg eines ausgewählten Antikörpers wurde in 50 mmol/l L-Cystein (Sigma), 1 mmol/l EDTA (Merck) und 10 Mikrogramm Papain enthaltendem Phosphatpuffer (40 mmol/l KH₂PO₄, 60 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 0,15 M NaCl) auf 500 Mikrogramm/ml verdünnt. Die Mischung wurde unter kontinuierlichem Rühren für 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Iodacetamid zu einer finalen Konzentration von 75 mmol/l für 30 Minuten bei RT gestoppt. Der verdaute Antikörper wurde gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (140 mmol/l NaCl, 67 mmol/l KCl, 20 mmol/l Na₂HPO₄, 4,4 mmol/l KH₂PO₄, pH 7,4) dialysiert. Die unverdauten IgG- und Fc-Fragmente wurden dann in durch Durchlaufen von Protein A-Sepharose (Hi Trap Protein A; Pharmacia) eliminiert. Das Fab- Fragment wurde mittels Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 (Pharmacia) weiter gereinigt.
Zum Nachweis von anti-Faktor VIII-IgG-Antikörpern, zur Bestimmung der IgG-Subklasse und zur Bewertung der Hemmung von an von-Willebrand-Faktor bindendem Faktor VIII wurden herkömmliche Verfahren verwendet. Für die Analyse der Hemmung der Bindung von r-Faktor VIII an einen ausgewählten Antikörper durch Fab und den nativen Antikörper wurden Maxisorb-Polystyrol-Platten (Nunc) 2 Stunden lang mit 50 μl des auf 5 Mikrogramm/ml in glycingepufferter Kochsalzlösung (20 mmol/l Glycin, 34 mmol/l NaCl, pH 9,2) verdünnten Antikörpers beschichtet. Nach dem Waschen wurden 50 μl von auf 1 Mikrogramm/ml in Tris-Casein (10 mmol/l Tris(hydroxymethyl)aminoethan, pH 7,3, enthaltend 150 mmol/l NaCL und 0,5 % Casein) verdünntem, mit Biotin markiertem r-Faktor VIII 1 Stunde lang bei 37 °C mit 50 μl humanem IgG in verschiedenen Konzentrationen vermischt. Ein 50 μl-Aliquot der Mischung wurde für 2 Stunden bei RT zu den Platten gegeben. Nach dem Waschen wurde die Bindung von biotinyliertem r-Faktor VIII durch sequentielle Zugabe von Avidinperoxidase und OPD nachgewiesen.
r-Faktor VIII (finale Konzentration 0,2 Mikrogramm/ml) wurde 2 Stunden lang bei 37 °C mit humanem IgG-Antikörper in verschiedenen Konzentrationen inkubiert und die Restaktivität von Faktor VIII wurde in einem Chromogenitätstest (Coatest Factor VIII, Chromogenix AB, Mölndal, Schweden oder Kabi Vitrum, Brüssel, Belgien) bewertet. Die Hemmung der Aktivität von Faktor VIII im Plasma wurde mit dem Bethesda-Verfahren gemessen, bei dem ein Pool aus normalem Plasma, das in gepuffertem Trinatrumcitrat gesammelt worden war, als Quelle für Faktor VIII verwendet. Die Restaktivität von Faktor VIII wurde mit einem Chromogenitätstest oder einem einstufigen Gerinnungstest bewertet
Beispiel 2 – Produktion von monoklonalen Antikörpern durch Immunisierung in Tieren
Alternativ dazu können monoklonale Antikörper mit den gleichen Eigenschaften, wie sie in Beispiel 1 offenbart sind, durch absichtliche Immunisierung in Tieren produziert werden. Der humane Faktor VIII in Freund-Adjuvans wird daher in Mäuse injiziert.
Die monoklonalen anti-humaner Faktor VIII-Antikörper werden dann durch Fusion von Milz-Lymphozyten mit einer murinen Myelomzelllinie erhalten. Die anti-Faktor VIII-Antikörper produzierenden Zellkulturüberstände werden identifiziert und mit limitierender Verdünnung unter Verwenden von in Current Protocols in Immunology (siehe oben) beschriebenen Verfahren kloniert. Des Weiteren wird die Auswahl von Inhibitoren mit der gewünschten Fähigkeit, die prokoagulante Aktivität von Faktor VIII zu hemmen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, vorgenommen.
Die in den Mäusen produzierten monoklonalen Antikörper werden dann humanisiert. Mit den Sequenzen der variablen Teile der murinen schweren und leichten Ketten und den variablen Regionen des humanen Immunglobulins wird daher ein Alignment durchgeführt, um so einen humanen Antikörper mit der größten Homologie in den Framework-Regionen zu identifizieren. Das für die humanisierten variablen Regionen codierende DNA-Fragment wird dann in einem PCR-basierten CDR-(komplementaritätsbestimmende Regionen) Graft-Verfahren, wie es beispielsweise bei Sato et al., Cancer Research (1993) 53:851-6 beschreiben ist, synthetisiert. Das für den variablen Teil der schweren Kette des humanisierten Antikörpers codierende, finale PCR-Produkt wurde verdaut und stromaufwärts von dem humanen C-gamma-1-Gen in einem ersten Expressionsplasmid subkloniert. Die humanisierte, variable Region der leichten Kette der finalen Konstruktion wurde stromaufwärts vom C-kappa-Gen in ein zweites Expressionsplasmid inseriert. Die beiden Konstruktionen werden dann in einem Expressionssystem aus COS-Zellen co-exprimiert.
Beispiel 3 – Charakterisierung von anti-Faktor VIII-Antikörpern
Die monoklonalen Antikörper von entweder humanem (Beispiel 1) oder tierischem (Beispiel 2) Ursprung wurden unter Verwenden eines Testsystems, in dem ihre Fähigkeit, die Bindung von Faktor VIII an Phospholipide zu hemmen, bewertet wurde, charakterisiert. Aus diesem Grund werden Polystyrol-Mikrotiterplatten mit Phosphatidyl-L-Serin beschichtet. Löslicher, rekombinanter Faktor VIII mit einer finalen Konzentration von 2 Mikrogramm/ml wird 30 Minuten lang bei 37 °C mit verschiedenen Konzentrationen des zu bewertenden Antikörpers vermischt. Die Mischung wird dann schnell mit Thrombin aktiviert und zu den mit Phosphatidyl-L-Serin beschichteten Platten gegeben. Die Platten wurden dann zwei Minuten lang bei 21 °C inkubiert und die Bindung von Faktor VIII wurde durch Zugabe der anti-Faktor VIII-A1-Domäne mAbF14A2, für zwei Minuten, gefolgt von einer zweiminütigen Inkubation mit HRP-konjugiertem Ziege-anti-Maus-Fc-gamma nachgewiesen. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind für den mit der Zelllinie KRIX 1 produzierten, monoklonalen Antikörper in 4 gezeigt. In der Figur sind die durchschnittliche Bindung von aktiviertem Faktor VIII in Abwesenheit (geschlossene Symbole) oder Anwesenheit (offene Symbole) des Antikörpers, sowie die Standardabweichung der Dreifachbestimmungen angegeben. Kontrollen in der Abwesenheit von Faktor VIII ergaben eine OD490 von kleiner als 0,05.
4 zeigt deutlich, dass der von der Zelllinie KRIX-1 produzierte, monoklonale Antikörper die Bindung von Faktor VIII an Phospholipide signifikant hemmt, jedoch eine nur unvollständige Hemmung bewirkt, selbst wenn er in großem Überschuss vorliegt.
Um zu zeigen, dass in Abwesenheit von Plasma, KRIX 1 die leichte Kette des mutierten Faktors VIII aus dem Spender nicht erkannte, wurden DNA-Fragmente, die für die leichten Ketten des Wildtyps und des mutierten Faktors VIII codieren, synthetisiert. Die entsprechenden Proteine wurden in Reticulocyten-Lysaten exprimiert. Die korrekte Faltung der nativen und der mutierten leichten Ketten wurde mittels Immunpräzipitation mit dem humanen monoklonalen Antikörper BO2C11 bestimmt, der ein Konformations-Epitop innerhalb des Carboxy-terminalen Teils der leichten Kette von Faktor VIII erkennt. Immunpräzipitationsversuche zeigten, dass BO2C11 an leichte Ketten des Wildtyps und Arg2150His gebunden hat, während KRIX 1 ausschließlich die leichte Kette des Wildtyps erfasste. Mit einem verlängerten Aussetzen von SDS-PAGE-Gelen gegen den Autoradiographiefilm konnte keine signifikante Bindung von KRIX 1 an die mutierte leichte Kette nachgewiesen werden. Kontrollversuche zeigten keine Bindung an andere Reagenzien aus dem Test an Faktor VIII oder Fragmente von Faktor VIII und eine Vor-Inkubation mit dem löslichen r-Faktor VIII verhinderte die Bindung an mit Methionin markierte Faktor VIII-Fragmente, wodurch die Bindungsspezifität bestätigt wird.
KRIX 1 erkannte Faktor VIII in einem Western Blot nicht, was zeigt, dass das erkannte Epitop ein Konformations-Epitop war. Eine weitere Epitop-Kartierung wurde daher mit in Reticulocyten-Lysaten produzierten Faktor VIII-Fragmenten durchgeführt. Vorhergehende Versuche hatten gezeigt, dass ein solcher Ansatz für die Synthese von Faktor VIII-Domänen wirkungsvoll war. Das Immunpräzipitationsverfahren unter Verwenden von in Reticulocyten-Lysaten produzierten, markierten Faktor VIII-Domänen wurde durch Kartierung des von dem humanen monoklonalen Antikörper BO2C11 erkannten Epitops bestätigt. Eine komplette Übereinstimung wurde zwischen der Bindung an in Reticulocyten-Lysaten produzierten Fragmenten von Faktor VIII mit C2-Deletion und der Bindung an in E. coli oder COS-Zellen produzierten, rekombinanten Fragmenten beobachtet. KRIX 1 hat über die ganze Länge an die leichte Kette, an Fragmente, die A3C1, C1C2 und der isolierten C1-Domäne entsprechen, gebunden. Im Gegensatz dazu hat KRIX 1 nicht an die C1- oder C1C2-Domänen mit der Substitution Arg2150His gebunden, obwohl die Arg2150His-C1C2-Domäne in einem Kontrollversuch wie ihr normaler Gegenspieler von BO2C11 gebunden wurde.
Es wurde nach anderen Mutationen in der leichten Kette gesucht, die die Bindung von KRIX 1 verändern könnten. Wie in Tabelle I gezeigt ist, hemmte KRIX 1 die Aktivität von allen bisher getesteten, mutierten Faktor VIII-Molekülen, außer von denjenigen, die die Mutation Arg2150His trugen. Tabelle I. Hemmung der Aktivität von Faktor VIII im Plasma aus Patienten mit milder Hämophilie A
Bei der Verwendung von KRIX 1 als ein Medikament zur teilweisen Hemmung von Faktor VIII werden milde Mutationen von Faktor VIII nicht die Wirksamkeit der Therapie beeinträchtigen.
KRIX 1 hemmte in dosisabhängiger Weise die Bindung von Faktor VIII an den von-Willebrand-Faktor. Die zum Erreichen einer 50%-igen Hemmung (IC₅₀) der Bindung von Faktor VIII erforderliche Konzentration von KRIX 1 betrug 0,25 Mikrogamm/ml und eine mehr als 95%-ige Hemmung wurde mit 20 Mikrogamm/ml KRIX 1 erhalten. Fab-Fragmente von KRIX 1 hemmten auch die Bindung von Faktor VIII an den von-Willebrand-Faktor. Auf molarer Basis waren jedoch 15-mal soviel Fab wie natives KRIX 1 erforderlich, um die Bindung von Faktor VIII an den von-Willebrand-Faktor um 50 % zu hemmen. Es wurden zusätzliche Versuche durchgeführt, um auszuschließen, dass die Fab-Fragmente von KRIX 1 noch einen intakten oder teilweise verdauten Antikörper enthielten. Die SDS-PAGE-Analyse der mittels Protein A-Adsorption und Gelfiltrationschromatographie gereinigten Fab-Fragmente zeigte eine einzelne Bande. Das Vorhandensein von in Spuren vorliegenden Mengen der Fc-gamma-Fragmente, die an Fab-Fragmente gebunden blieben, wurde in einem ELISA ausgeschlossen. Vertiefungen mit unlöslich gemachtem Faktor VIII wurden mit nativem oder Fab-KRIX 1 inkubiert. Die Bindung von sowohl Fab- als auch nativem KRIX 1 konnte durch Zugabe von mit Peroxidase markiertem, anti-kappa-leichte Kette IgG nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu offenbarte die Zugabe von mit Peroxidase markiertem anti-Fc-gamma IgG keine spezifische Bindung, selbst wenn 100 Mikrogramm/ml der Fab-Zubereitung in den Vertiefungen inkubiert wurden. Im Vergleich dazu ergab die Zugabe von 0,1 Mikrogramm/ml des nativen Antikörpers eine signifikante Bindung. In einem ELISA war eine 15-mal so große Konzentration von Fab wie die von nativem Antikörper dazu nötig, um die Bindung von biotinyliertem KRIX 1 an den unlöslich gemachten Faktor VIII um 50 % zu hemmen, was zeigt, dass das Fab-KRIX 1-Fragment eine geringere Affinität zu Faktor VIII hat als der native Antikörper. Das Erfordernis von höheren Konzentrationen von KRIX 1-Fab als von nativem Antikörper zur Hemmung der Bindung von Faktor VIII an den von-Willebrand-Faktor sollte entsprechend der verminderten Affinität von KRIX 1-Fab-Fragmenten zu Faktor VIII zugeschrieben werden.
Um zu bestimmen, ob KRIX 1 für die polyklonalen Antikörper aus dem Spender repräsentativ war, wurde ein Konkurrenztest durchgeführt. Die Bindung von biotinyliertem KRIX 1 an unlöslich gemachten Faktor VIII wurde in Gegenwart von ansteigenden Konzentrationen von entweder KRIX 1, polyklonalem IgG aus dem Spender oder polyklonalem IgG als Kontrolle gemessen. IgG aus dem Spender hemmte in dosisabhängiger Weise die Bindung von KRIX 1 an den Faktor VIII. Die Konzentration von KRIX 1 und IgG aus dem Spender zur 50%-igen Hemmung von biotinyliertem KRIX 1 an Faktor VIII betrug 0,3 Mikrogramm/ml bzw. 170 Mikrogramm/ml, wohingegen bei dem IgG als Kontrolle keine Hemmung beobachtet wurde.
BEISPIEL 4 – Produktion von monoklonalen Antikörpern, die aus Hämophilie A- Patienten stammen und an den Komplex aus Faktor VIII und von-Willebrand-Faktor binden
Alternativ dazu wurden Antikörper, die die Geschwindigkeit der Freisetzung von Faktor VIII vom von-Willebrand-Faktor reduzieren, wie folgt identifiziert. Polystyrol-Mikrotiterplatten wurden mit einem spezifischen Antikörper gegen von-Willebrand-Faktor beschichtet. Eine Lösung von biotinyliertem, rekombinantem Faktor VIII (0,5 Mikrogram/ml) in einem Komplex mit von-Willebrand-Faktor (5 Mikrogramm/ml) wurde mit verschiedenen Konzentrationen von IgG aus einem Spender (5, volle Quadrate), d.h. dem gleichen Patienten, der oben beschrieben ist (aus dem KRIX 1 stammte), MoAb4H1D7, oder IgG aus einer nicht unter Hämophilie leidenden Testperson (5 volle Dreiecke) vermischt. Das IgG in den angegebenen Konzentrationen wurde für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur zu den mit einem murinen Antikörper, MoAb4H1D7, gegen von-Willebrand-Faktor beschichteten Mikrotiterplatten gegeben. Nach dem Waschen wurde der Faktor VIII in zwei Minuten bei 37 °C durch Thrombin aktiviert. Der an von-Willebrand-Faktor gebundene Faktor VIII wurde durch Zugabe von Avidinperoxidase nachgewiesen. Kontrollen schlossen den Nachweis von gebundenem, biotinyliertem Faktor VIII in Abwesenheit eines Thrombin-Verdaus (OD450 = 460 + 47,7SD) und von biotinyliertem rekombinanten Faktor VIII nach Thrombin-Verdau in Abwesenheit von Antikörpern (OD450 = 160 + 16,0SD) ein.
Die Ergebnisse dieser Versuche für polyklonale Antikörper sind in 5 gezeigt. In dieser Figur sind die Durchschnittswerte sowie die Standardabweichungen der Dreifachbestimmungen angegeben. 5 zeigt deutlich, dass ein signifikant höherer Anteil an aktiviertem Faktor VIII in Gegenwart ansteigender Konzentrationen des Antikörpers an die Platte gebunden bleibt, d.h. es zeigt eine Verminderung der Dissoziation von aktiviertem Faktor VIII vom von-Willebrand-Faktor in Gegenwart eines Inihibitor-Antikörpers, der an von-Willebrand-Faktor gebundenen Faktor VIII erkennt. Gemäß den in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren wurden aus diesen polyklonalen Antikörpern monoklonale Antikörper erhalten, wodurch gezeigt ist, dass die vorliegende Erfindung auf monoklonale Antikörper und Fragmente und Derivate davon, die an Faktor VIII/von-Willebrand-Faktor-Komplexe binden, erweitert werden kann.
Beispiel 5 – Seguenzierung von variablen Domänen der Antikörper
Die Sequenzierung der variablen Domänen der Antikörper wurde wie folgt ausgeführt. Die Isolierung von RNA aus EBV-immortalisierten, humanen B-Zelllinien wurde unter Verwenden von TRIzol Reagens gemäß den Anweisungen des Herstellers (Life Technologies) durchgeführt. Die cDNA wurde mit dem Superscript Preamplification-System zur Synthese des ersten cDNA-Strangs synthetisiert. Die für die Gene der variablen Regionen der schweren Kette (V_H) codierende cDNA wurde mit Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwenden von für die Leader-Sequenz der V_H-Familien und für das erste Exon der C-gamma-Region spezifischen Primern so amplifiziert, wie es beschrieben wurde (Bakkus et al., Blood, 80:2326, 1992). Das Annealing wurde bei 60 °C in 40 PCR-Zyklen durchgeführt. PCR-Produkte mit der geeigneten Größe (460 bp) wurden aus einem 1,5%-igen Agarosegel isoliert und unter Verwenden des TA Cloning Kit (Invitrogen BV, Leek, Niederlande) kloniert. Ein PCR-Screening unter Verwenden von der V_H-Genfamilie von Interesse entsprechenden Primerpaaren wurde an Kulturen aus zufällig ausgewählten Kolonien durchgeführt. Plasmid-DNA aus positiven Kolonien wurde unter Verwenden von Wizard Plus Minipreps (Promega, Menlo Park, CA) isoliert und in beiden Richtungen mit Sequenase (US Biochemical, Cleveland, OH) nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Die Analyse der variablen Gensequenzen wurde unter Verwenden des V BASE Sequence Directory (Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) vorgenommen.
Die vollständigen Sequenzen der V_H und der V_L des Antikörpers BO 2C11, der in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden bei der EMBL Nucleotide Sequence Database unter den Zugangsnummern AJ224083 bzw. AJ224084 eingereicht.
Die in den 6 und 7 gezeigten Aminosäuresequenzen definieren die V_H- und V_L-Regionen des Antikörpers BO2C11, einschließlich der drei CDRs für jede der schweren und leichten Ketten. Es sind auch die Polynukleotidsequenzen angegeben, die für diese Regionen codieren. Die SEQ-Nr. 2 und 3 sind die Aminosäuresequenzen der schweren und leichten Ketten von BO2C11, während die SEQ-Nr. 5 und 6 entsprechend die Polynukleotidsequenzen, die für diese variablen Regionen codieren, bereitstellen.
Die in den 8 und 9 gezeigten Aminosäuresequenzen definieren die V_H- und V_L-Regionen des Antikörpers KRIX-1, einschließlich der drei CDRs 1–3 für jede der kurzen und langen Ketten. Es sind auch die Polynukleotidsequenzen angegeben, die für diese Regionen codieren. Die SEQ-Nr. 8 und 1 sind die Aminosäuresequenzen der schweren und leichten Ketten von KRIX-1, während die SEQ-Nr. 7 und 4 entsprechend die Polynukleotidsequenzen, die für diese variablen Regionen codieren, bereitstellen.
BEISPIEL 6 (VERGLEICHEND) – Hemmung der Aktivität von Faktor VIII durch den Antikörper SAF8C-Ig
Die Mengen an Faktor VIII werden nach einer Inkubationsdauer von zwei Stunden bei 37 °C mit verschiedenen Konzentrationen des Antikörpers SAF8C-Ig unter Verwenden des in Beispiel 1 beschriebenen Chromogenitätstests in einem funktionellen Test gemessen. Wie in 10 gezeigt, wird die Restaktivität von Faktor VIII in dosisabhängiger Weise reduziert. Schon bei 100 Mikrogramm/ml SAF8C-Ig beträgt die Restaktivität von Faktor VIII weniger als 1 % der normalen Aktivität. Solche geringen Mengen an Faktor VIII setzen den Patienten einem hohen Risiko für spontane Blutungen aus, wie es beispielsweise aus Levine, Ann. NY Acad. Sci. (1975) 240:201 und Gilbert, Mount Sinai J. Med. (1977) 44:339 allgemein bekannt ist.
BEISPIEL 7 – Hemmung von venöser Thrombose in Hamstern durch KRIX 1
In einem Versuch wurde in der Oberschenkelvene von betäubten Hamstern durch Injizieren des Farbstoffs Bengalrosa in die Halsvene und Aussetzen der Oberschenkelvene gegen grünes Licht einer Xenonlampe für 4 Minuten Thrombose induziert (Kawazaki et al., Thromb. Haemost. (1999) 81:306-11). Infolge der Illumination des Gefäßes zersetzt sich der Farbstoff und erzeugt Radikale, die die Endothelzellen des Gefäßes verletzen. Dadurch werden subendotheliale Strukturen dem Blutkreislauf ausgesetzt und eine Thrombusbildung initiiert. Die Menge an gebildetem Thrombus wird durch die Durchleuchtung des verletzten Gefäßes gemessen (Kawazaki et al., Thromb. Haemost. (1999) 81:306-11) und über die Menge an weißem Licht, das das Gefäß durchleuchtet, charakterisiert. Wie in 11 gezeigt ist, wenn dieser Versuch in Kontrolltieren durchgeführt wird, liegt die in 13 Hamstern gemessene, durchschnittliche Größe des Thrombus, bei 220.000 ± 32.575 (Mittelwert ± SEM) beliebige Lichteinheiten (arbitrary units, A.I.), wohingegen die Behandlung einer Gruppe von 12 Hamstern mit KRIX-1 (400–800 Mikrogramm/kg, in Form eines Bolus unmittelbar vor Induktion der Thrombose gegeben) die mittlere Größe des Thrombus auf 122.000 ± 27.100 A. U. (p = 0, 0188, Mann-Whitney-Test) reduzierte.
Zusätzlich wurde die Kinetik der Hemmung von Faktor VIII durch KRIX-1 ex vivo wie folgt analysiert: KRIX-1 (1.600 Mikrogram/kg) wurde Hamstern intravenös injiziert. Mengen an Faktor VIII: c wurden in einem Chromogenitätstest (Coated Factor VIII^R (Chromogenix AB, Mölndal, Schweden) und Factor VIII Chromogenic Assay (Dade, Düdingen, Schweiz) unter Verwenden von Plasma, das vor und in verschiedenen Zeitintervallen nach der Injektion gesammelt wurde, gemessen. 12 zeigt, dass die Aktivität von Faktor VIII in diesen Hamstern schon 30 Minuten nach der Injektion der Antikörper von 1,6 IE/ml auf 0,3 IE/ml reduziert wird, was bestätigt, dass KRIX-2 den Faktor VIII nur teilweise hemmt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zelllinie KRIX 1, hinterlegt bei Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms unter der Zugangsnummer LMBP 5089CB.
Monoklonaler Antikörper, der an eine Stelle des Faktors VIII oder einem Komplex zweier oder mehrerer Faktoren, die den Faktor VIII umfassen bindet, dadurch gekennzeichnet, dass der monoklonale Antikörper die Fähigkeit zur Inaktivierung des Faktors VIII oder eines Komplexes zweier oder mehrerer Faktoren, die den Faktor VIII umfassen, um bis 98 %, bestimmt durch einen Faktor VIII-Chromogenitätstest, wenn der monoklonale Antikörper in einem molaren Überschuss vorliegt, besitzt.
Zelllinie, die menschliche monoklonale Antikörper nach Anspruch 2 produziert.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, wobei die Bindungsstelle des monoklonalen Antikörpers nicht direkt in einer physiologischen Wechselwirkung des Faktors oder des Komplexes involviert ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, der der Krix-1-Antikörper ist, produziert durch die Zelllinie KRIX 1, hinterlegt bei der Belgian Coordinated Collections of Microorganisms unter der Zugangsnummer LMBP 5089CB, oder ein Antikörper mit zumindest 80 % Sequenzhomologie hierzu innerhalb der CDR-Regionen.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, der ein menschlicher monoklonaler Antikörper ist, erhältlich von der Zelllinie nach Anspruch 1.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, Anspruch 4 oder Anspruch 6, der ein Antikörper der Klasse IgG ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, oder einem der Ansprüche 4 bis 7, der zur Erkennung eines Epitops befähigt ist, welches in der C1-Domäne des Faktors VIII lokalisiert ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, 4, 7 oder 8, erhältlich durch absichtliche Immunisierung in Tieren.
Humanisierter monoklonaler Antikörper, erhältlich von dem monoklonalen Antikörper nach Anspruch 9.
Antigen-Bindungsfragment, beispielsweise ein Fab, Fab' oder F(ab')₂, ein komplementaritätsbestimmende Region, ein löslicher oder membranverankerter einkettiger variabler Teil, ein Derivat oder eine einzelne variable Domäne eines monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 2 oder einem der Ansprüche 4 bis 9, oder von einem humanisierten monoklonalen Antikörper nach Anspruch 10, wobei das Antigen-Bindungsfragment befähigt ist zur Inaktivierung des Faktors VIII oder eines Komplexes zweier oder mehrerer Faktoren, die den Faktor VIII umfassen, um bis zu 98%, bestimmt durch einen Faktor VIII-Chromogenitätstest, wenn das Fragment in einem molaren Überschuss vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Prophylaxe oder Behandlung von Erkrankungen der Hämostase, von Koagulationserkrankungen, thrombotischen pathologischen Zuständen oder einer verzögerten Koagulation in Säugern, enthaltend als einen Wirkstoff einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2 oder einem der Ansprüche 4 bis 9 oder einen humanisierten monoklonalen Antikörper nach Anspruch 10 oder ein Antigen-Bindungsfragment nach Anspruch 11, in Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, weiterhin umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Thrombolysemittels.
Polynukleotid, welches für ein Antigen-Bindungsfragment Fab, Fab' oder F(ab')₂ oder einen komplementaritätsbestimmenden Abschnitt oder einen löslichen oder einen membranverankerten einkettigen variablen Teil oder eine einzelne variable Domäne oder ein Derivat nach Anspruch 11 codiert.
Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern aus einem nicht-menschlichen Säuger mit den Schritten: a) Auswählen eines nicht-menschlichen Säugers mit einem modifizierten und teilweise funktionellen Protein, wobei die Modifikation in Bezug auf das Wildtypprotein der Koagulationskaskade vorliegt und in einer Domäne des Proteins liegt; b) Verabreichung des Wildtypproteins an den nicht-menschlichen Säuger, um eine Immunantwort hervorzurufen, und c) Auswählen von B-Lymphozyten aus dem nicht-menschlichen Säuger, der Antikörper produziert, die das Wildtypprotein nur teilweise inaktivieren.
Isolierter monoklonaler Antikörper nach Anspruch 2, wobei der Antikörper durch menschliche B-Lymphozyten produziert wird.
Verwendung des monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 2, 4 bis 10 oder 16, oder des Antigen-Bindungsfragments nach Anspruch 11, zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe oder Behandlung einer Erkrankung der Hämostase, einer Koagulationserkrankung oder eines thrombotischen pathologischen Zustands oder einer verzögerten Koagulation in einem Säuger.