DE60032029T2

DE60032029T2 - Antithrombose agenzien

Info

Publication number: DE60032029T2
Application number: DE60032029T
Authority: DE
Inventors: C. Frank Audubon BARONE; N. Michael Phoenixville BLACKBURN; Z. Giora Wynnewood FEUERSTEIN; R. John Collegeville TOOMEY
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 2000-05-15
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2020-10-06
Also published as: NZ522632A; PL360060A1; MXPA02011385A; CZ20023778A3; KR20070116192A; BR0015872A; HUP0301804A3; AU7858400A; CN101134107A; EP1825864A3; KR20030034071A; NO20025463D0; HUP0301804A2; ES2277597T3; DE60032029D1; EP1282444A1; US20050037006A1; EP1825864A2; ATE345816T1; HU225874B1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft monoklonale Antikörper (mAbs), die an humanen Gerinnungsfaktor oder -kofaktor binden, und ihre Verwendung als Inhibitoren der Thrombose.
Hintergrund der Erfindung
Unter normalen Umständen löst eine Verletzung, sei es eine kleinere oder größere, der vaskulären Endothelzellen, die ein Blutgefäß auskleiden, eine hämostatische Reaktion durch einen Sequenz von Ereignissen aus, die üblicherweise als die Gerinnungs-"Kaskade" bezeichnet werden. Die Kaskade kulminiert in der Umwandlung von löslichem Fibrinogen zu unlöslichem Fibrin, das zusammen mit Blutplättchen ein lokalisiertes Gerinnsel oder einen Thrombus bildet, der das Austreten von Blutkomponenten verhindert. Die Wundheilung kann dann erfolgen, gefolgt von der Gerinnselauflösung und Wiederherstellung der Integrität des Blutgefäßes und des Blutflusses.
Die Ereignisse, die zwischen der Verletzung und der Gerinnselbildung auftreten, sind eine sorgfältig regulierte und verbundene Reihe von Reaktionen. Kurz gesagt zirkulieren eine Anzahl von Plasmagerinnungsproteinen in inaktiven Proenzymformen und Kofaktoren im Blut. Aktive Enzymkomplexe werden am Verletzungsort zusammengesetzt und werden nacheinander zu Serinproteasen aktiviert, wobei jede aufeinanderfolgende Serinprotease das nachfolgende Proenzym zur Proteaseaktivierung katalysiert. Diese enzymatische Kaskade führt dazu, daß jeder Schritt die Wirkung des nachfolgenden Schrittes vergrößert. Für eine Übersicht über die Gerinnungskaskade siehe das erste Kapitel aus "Thrombosis and Hemorrhage", J. Loscalzo und A. Schafer, Hrsg., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England (1994).
Während eine effiziente Gerinnung den Blutverlust am Verletzungsort begrenzt, ist eine unangemessene Bildung von Thromben in Venen oder Arterien eine übliche Ursache für Invalidität und Tod. Eine abnormale Gerinnungsaktivität kann zu Pathologien führen und/oder aus Behandlungen resultieren, wie Myokardinfarkt, instabile Angina, Vorhofflimmern, Schlag, Nierenschädigung, perkutane transluminale Koronarangioplastie, gestreute intravaskuläre Gerinnung, Sepsis, Lungenembolie und tiefe Venenthrombose. Die Bildung von Gerinnseln auf Fremdoberflächen von künstlichen Organen, Shunts und Prothesen wie künstlichen Herzventilen ist ebenfalls problematisch.
Schlag ist eine führende Ursache für Tod und eine übliche Ursache von permanenter Invalidität. Die akute fokale zerebrale Ischämie, die zu den neurologischen Defiziten von Schlag führt, wird am häufigsten durch Thromboembolie verursacht. Thromben können aus kardialen Quellen und Atheromen erzeugt werden. In-situ-Thrombose kann in großen, extrazerebralen Hirnzufuhrgefäßen erfolgen. Studien legen ein endliches Zeitintervall nach einem zerebralen arteriellen Verschluß nahe, über das hinaus eine signifikante irreversible neuronale Schädigung und ein anhaltendes neurologisches Defizit auftritt. Siehe Kapitel 14 aus "Stroke Therapy: Basic, Preclinical, and Clinical Directions", S. 355–381, Hrsg. L. P. Miller, Wiley-Liss, Inc. (1999).
Zugelassene Gerinnungshemmer, die derzeit in der Behandlung dieser Pathologien und anderer thrombotischer und embolischer Störungen verwendet werden, schließen die sulfatierten Heteropolysaccharide Heparin und Heparin mit geringem Molekulargewicht (LMW) ein. Diese Mittel werden parenteral verabreicht und können eine schnelle und vollständige Inhibierung der Gerinnung durch Aktivierung des Thrombininhibitors, Antithrombin III, und Inaktivierung aller Gerinnungsfaktoren verursachen.
Jedoch leiden Heparin und LMW-Heparin aufgrund ihrer Wirksamkeit an Nachteilen. Ein unkontrolliertes Bluten als Ergebnis der einfachen Belastungen von Bewegung und begleitenden Kontakten mit physikalischen Objekten oder an chirurgischen Orten ist die Hauptkomplikation und wird bei 1 bis 7% der Patienten, die eine kontinuierliche Infusion erhalten, und bei 8 bis 14% der Patienten beobachtet, denen unterbrochene Bolusdosen gegeben werden. Zur Minimierung dieses Risikos werden kontinuierlich Proben entnommen, um ex-vivo-Gerinnungszeiten kontinuierlich überwachen zu können, was substantiell zu den Therapiekosten und den Unannehmlichkeiten für den Patienten beiträgt.
Ferner ist der therapeutische Zielbereich zum Erreichen des gewünschten Ausmaßes an Wirksamkeit, ohne den Patienten dem Risiko für das Bluten auszusetzen, eng. Der therapeutische Bereich ist ca. 1 bis weniger als 3 μg Heparin/ml Plasma, was zu Testzeiten der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) von ca. 35 bis ca. 100 Sekunden führt. Eine Zunahme der Heparinkonzentration auf 3 μg/ml überschreitet den Zielbereich, und bei Konzentrationen von mehr als 4 μg/ml ist eine Gerinnungsaktivität nicht mehr nachweisbar. Daher muß große Sorge getragen werden, die Plasmakonzentrationen des Patienten innerhalb des therapeutischen Bereichs zu halten.
Ein anderer zugelassener Gerinnungshemmer mit langsamerer und länger andauernder Wirkung ist Warfarin, ein Cumarin-Derivat. Warfarin wirkt durch Konkurrieren mit der Vitamin K-abhängigen posttranslationalen Modifikation von Prothrombin und anderen Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren.
Das allgemeine Muster der gerinnungshemmenden Wirkung, bei der Blut nicht-gerinnungsfähig bei Konzentrationen von nur geringfügig mehr als dem therapeutischen Bereich gemacht wird, wird für Warfarin sowie für Heparin und LMW-Heparin beobachtet.
Bei akutem Myokardinfarkt (MI) schließen die Hauptziele der thrombolytischen Therapie eine frühe und anhaltende Reperfusion des infarktierten Gefäßes ein. Die derzeitige Therapie für akuten MI schließt sowohl einen Plasminogenaktivator wie Gewebeplasminogenaktivator (tPA) oder Streptokinase als auch einen Gerinnungshemmer wie unfraktioniertes Heparin, Heparin mit geringem Molekulargewicht oder direkte Thrombininhibitoren oder Antiblutplättchenmittel wie Aspirin oder Blutplättchenglycoprotein IIb/IIIa-Blocker ein. Siehe Topol, Am. Heart J., 136, S66–S68 (1998). Diese Kombination von Therapien beruht auf der Beobachtung, daß die Gerinnselbildung und -auflösung dynamische Prozesse sind und die Thrombinaktivität und -erzeugung sich nach der Bildung des okklusiven Thrombus und während und nach der Auflösung der Gerinnsels fortsetzen. Siehe Granger et al., J. Am. Coll. Cardiol., 31, 497–505 (1998).
Die optimale Strategie zur Behandlung von akutem MI bleibt weiterhin schwer zu fassen, und verfügbare Mittel und Behandlungsprotokolle zeigen sowohl negative als auch positive Eigenschaften. Zum Beispiel ist Fibrin-gebundenes Thrombin unempfindlich gegenüber der Inhibierung durch Heparin (Becker et al. in Kapitel 6 aus "Chemistry and Biology of Serpins", Plenum Press, New York (1997)), und die Thrombinaktivität weist eine sich erholende Zunahme nach dem Absetzen der Heparintherapie auf, mit einer beobachteten Zunahme des Reinfarkts innerhalb von 24 Stunden nach dem Absetzen von Heparin. Siehe Watkins et al., Catheterization and Cardiovascular Diagnosis, 44, 257–264 (1998) und Granger, Circulation, 91, 1929–1935 (1995). Außerdem können Antiblutplättchenmittel von Blutung oder Thrombozytopenie begleitet sein.
Auch haben zahlreiche klinische Versuche gezeigt, daß hohe Dosen von thrombolytischen Mitteln zu einer signifikanten Veränderung der hämostatischen Plasmamarker führen. Siehe Rao et al., J. Clin. Invest., 101, 10–14 (1988); Bovill et al., Ann. Int. Med., 115, 256–265 (1991); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol., 19, 885–891 (1992). Obwohl zunehmende Konzentrationen von tPA zu einer gesteigerten Gerinnselauflösung führen, spiegelt die Veränderung dieser hämostatischen Marker zunehmende Anfälligkeiten der thrombolytischen Therapie wider, insbesondere das Auftreten von schwerer Blutung.
Für den Fall von thromboembolischem Schlag wird eine thrombolytische Therapie früh (innerhalb von 3 Stunden) nach dem Einsetzen der Schlaganfallssymptome eingesetzt, um eine irreversible Schädigung zu verhindern. Derzeit für die Reperfusion von ischämischem und/oder infarktiertem Gewebe zugelassene thrombolytische Mittel schließen die Plasminogenaktivatoren tPA, Urokinase und Streptokinase ein. Jedoch ist die thrombolytische Therapie mit einer ernsthaften Blutungsanfälligkeit verbunden, und ein Hauptbedenken der thrombolytischen Therapie im thromboembolischen Schlag besteht darin, daß die Behandlung die ischämische Verletzung durch Induzieren von Blutung verschlimmern wird.
Offensichtlich besteht ein Bedarf an antithrombotischen Mitteln, die wirksam in der Bekämpfung von thrombotischen Zuständen sind, während die hämostatischen Funktionen bewahrt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Anti-Faktor IX-Antikörpers oder -Antikörperfragments, ausgewählt aus SB249413, SB249415, SB249417, SB257731, SB257732, und eines thrombolytischen Mittels, ausgewählt aus tPA, Urokinase, Streptokinase, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von post-thromboembolisch induzierter Ischämie.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Reduzierung einer erforderlichen Dosis eines thrombolytischen Mittels in der Behandlung einer tierischen post-thromboembolisch induzierten Ischämie, das das Verabreichen eines Anti-Faktor IX-Antikörpers oder -Antikörperfragments in Kombination mit dem thrombolytischen Mittel umfaßt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm der experimentellen Ergebnisse, die die Titration von normalem humanen Plasma mit den murinen Anti-Faktor IX-mAbs BC1 und BC2 zeigen.
2 ist ein Diagramm der experimentellen Ergebnisse, die die Titration von normalem humanen Plasma mit den murinen Anti-Faktor IX-mAbs 9E4(2)F4 und 11G4(1)B9 zeigen.
3 ist ein Diagramm der experimentellen Ergebnisse, die die Titration von normalem humanem Plasma mit den murinen Anti-Faktor X-mAbs HFXHC und HFXLC und dem murinen Anti-Faktor XI-mAb HFXI zeigen.
4 ist ein Histogramm der experimentellen Ergebnisse, die die Wirkung von Heparin, Acetylsalicylsäure und murinen Faktor IX-mAbs auf die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) nach 60 Minuten in einem Ratten-Karotisthrombosemodell zeigen.
5 ist ein Histogramm der experimentellen Ergebnisse, die die Wirkung von Heparin, Acetylsalicylsäure und murinen Faktor IX-mAbs auf die Prothrombinzeit nach 60 Minuten in einem Ratten-Karotisthrombosemodell zeigen.
6 ist ein Histogramm der experimentellen Ergebnisse, die die Wirkung von Heparin, Acetylsalicylsäure und murinen Faktor IX-mAbs auf den Verschluß des Blutflusses in der Karotisarterie in einem Ratten-Karotisthrombosemodell zeigen.
7 ist ein Histogramm der experimentellen Ergebnisse, die die Wirkung von Heparin, Acetylsalicylsäure und murinen Faktor IX-mAbs auf das Thrombusgewicht in einem Ratten-Karotisthrombosemodell zeigen.
8 ist ein Histogramm der experimentellen Ergebnisse, die die Wirkung von Heparin, des murinen Faktor IX-mAb BC2, eines chimären Faktor IX-mAb und von humanisierten Faktor IX-mAbs auf aPTT nach 60 Minuten in einem Ratten-Karotisthrombosemodell zeigen.
9 ist ein Histogramm der experimentellen Ergebnisse, die die Wirkung von Heparin, des murinen Faktor IX-mAb BC2, eines chimären Faktor IX-mAb und von humanisierten Faktor IX-mAbs auf das Thrombusgewicht in einem Ratten-Karotisthrombosemodell zeigen.
10 ist ein Histogramm der experimentellen Ergebnisse, die die Wirkung von Anti-Faktor IX-mAb und Heparin auf die tPA-vermittelte Reperfusion zeigen.
11 ist ein Histogramm der experimentellen Ergebnisse, die die Wirkung von Anti-Faktor IX-mAb und Heparin auf die Karotisgefäßdurchgängigkeit zeigen.
12 ist ein Histogramm der experimentellen Ergebnisse, die die Wirkung von Anti-Faktor IX-mAb und Heparin auf die Zeit bis zur Wiederherstellung des Blutflusses zeigen.
13 zeigt die Wirkung von tPA auf die hämostatischen Parameter, Fibrinogen, Plasminogen und Antiplasmin.
14 zeigt die Wirkung von tPA, Heparin und Anti-Faktor IX-mAb auf aPTT.
15 zeigt die Wirkung von tPA, SB 249417 und der Kombination aus tPA und SB 249417 auf das aggregierte mittlere Infarktvolumen bei thromboembolischem Schlag.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Offenbarung stellt eine Vielzahl von Antikörpern, veränderten Antikörpern und Fragmenten davon bereit, die gegen Gerinnungsfaktoren gerichtet sind, die durch selbstlimitierende neutralisierende Aktivität gekennzeichnet sind. Bevorzugt stammt der Gerinnungsfaktor aus dem intrinsischen oder gemeinen Gerinnungsreaktionsweg. Am meisten bevorzugt sind die Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörper Anti-Faktor IX, Anti-Faktor IXa, Anti-Faktor X, Anti-Faktor Xa, Anti-Faktor XI, Anti-Faktor XIA, Anti-Faktor VIII, Anti-Faktor VIIIa, Anti-Faktor V, Anti-Faktor Va, Anti-Faktor VII, Anti-Faktor VIIa, Anti-Thrombin oder Anti-Prothrombin. Besonders bevorzugt sind Anti-Faktor IX-Antikörper. Exemplarische Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörper sind die humanisierten monoklonalen Antikörper SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 und SB 257732, die gegen humanen Faktor IX gerichtet sind, der chimäre monoklonale Antikörper chαFIX, der gegen humanen Faktor IX gerichtet ist, die murinen monoklonalen Antikörper BC1, BC2, 9E4(2)F4 und 11G4(1)B9, die gegen humanen Faktor IX und/oder Faktor IXa gerichtet sind, oder die murinen molekularen Antikörper HFXLC und HFXI, die gegen die humanen Faktoren X bzw. XI gerichtet sind. Besonders bevorzugt ist der monoklonale anti-humane Faktor IX-Antikörper SB 249417.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können durch herkömmliche Hybridomtechniken, kombinatorische Phagen-Display-Bibliotheken, Immunglobulin-"Chain Shuffling" und Humanisierungstechniken zur Erzeugung neuer selbstlimitierender neutralisierender Antikörper hergestellt werden. Auch eingeschlossen sind vollständig humane mAbs mit selbstlimitierender neu tralisierender Aktivität. Diese Produkte sind nützlich in therapeutischen und pharmazeutischen Zusammensetzungen für thrombotische und embolische Störungen, die mit Myokardinfarkt, instabiler Angina, Vorhofflimmern, Schlag, Nierenschädigung, Lungenembolie, tiefer Venenthrombose, perkutaner transluminaler Koronarangioplastie, gestreuter intravaskulärer Gerinnung, Sepsis, künstlichen Organen, Shunts oder Prothesen verbunden sind.
Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff "selbstlimitierende neutralisierende Aktivität" die Aktivität eines Antikörpers, der an einen humanen Gerinnungsfaktor bindet, bevorzugt aus den intrinsischen und gemeinen Reaktionswegen, einschließlich Faktor IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa und V/Va, VII/VIIa und Thrombin/Prothrombin, und die Thrombose in einer solchen Weise inhibiert, daß eine beschränkte Modulation der Gerinnung erzeugt wird. "Beschränkte Modulation der Gerinnung" wird als eine Zunahme der Gerinnungszeit gemäß Messung durch Verlängerung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) definiert, wenn Plasma gerinnungsfähig bleibt, wobei aPTT einen maximalen Wert erreicht, trotz zunehmender Konzentrationen von monoklonalem Antikörper. Diese beschränkte Modulation der Gerinnung steht im Gegensatz zu Plasma, das nicht gerinnungsfähig gemacht wird und eine unendliche aPTT in Gegenwart zunehmender Konzentrationen von Heparin aufweist. Bevorzugt sind die maximalen aPTT-Werte der Verfahren der Erfindung im therapeutischen Heparinbereich. Am meisten bevorzugt ist die maximale aPTT im Bereich von ca. 35 Sekunden bis zu 100 Sekunden, was dem ca. 1,5- bis 3,5-fachen des normalen Kontroll-aPTT-Wertes entspricht. In einer Ausführungsform der Erfindung ist aPTT verlängert ohne signifikante Verlängerung der Prothrombinzeit (PT).
Der Ausdruck "in Kombination mit" bezeichnet die Verabreichung eines Therapeutikums vor, nach oder gleichzeitig mit der Verabreichung eines anderen Therapeutikums in einem einzelnen Behandlungsverlauf.
"Veränderter Antikörper" bezeichnet ein Protein, das durch eine veränderte Immunglobulin-codierende Region codiert wird und durch Expression in einer ausgewählten Wirtszelle erhalten werden kann. Solche veränderten Antikörper sind gentechnisch veränderte Antikörper (z.B. chimäre oder humanisierte Antikörper) oder Antikörper-Fragmente, denen die gesamte oder ein Teil einer konstanten Immunglobulin-Region fehlt, z.B. Fv, Fab, Fab' oder F(ab')₂ und dgl.
"Veränderte Immunglobulin-codierende Region" bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, die einen veränderten Aminosäure der Erfindung codiert. Wenn der veränderte Antikörper ein CDR-grafted oder humanisierter Antikörper, sind die Sequenzen, die die Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDRs) aus einem nicht-humanen Immunglobulin codieren, in einen ersten Immunglobulinpartner inseriert, der humane variable Gerüstsequenzen umfaßt. Gegebenenfalls ist der erste Immunglobulinparter funktionsfähig mit einem zweiten Immunglobulinpartner verbunden.
"Erster Immunglobulinpartner" bezeichnet eine Nukleinsäuresequenz, die eine humane Gerüstregion oder humane variable Immunglobulinregion codiert, in der die nativen (oder natürlich vorkommenden) CDR-codierenden Regionen durch die CDR-codierenden Regionen eines Donor-Antikörpers ersetzt sind. Die humane variable Region kann eine schwere Immunglobulinkette, eine leichte Kette (oder beide Ketten), ein Analogon oder funktionelle Fragmente davon sein. Solche CDR-Regionen, die sich innerhalb der variablen Region von Antikörpern (Immunglobulinen) befinden, können durch fachbekannte Verfahren bestimmt werden. Zum Beispiel offenbaren Kabat et al. in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4. Auflage, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987), Regeln zur Lokalisierung von CDRs. Zusätzlich sind Computerprogramme bekannt, die nützlich zur Identifizierung von CDR-Regionen/Strukturen sind.
"Zweiter Immunglobulinpartner" bezeichnet eine andere Nukleotidsequenz, die ein Protein oder Peptid codiert, an das der erste Immunoglobulinpartner im Raster oder mittels einer optionalen herkömmlichen Linker-Sequenz fusioniert ist (d.h. funktionsfähig verbunden). Bevorzugt ist er ein Immunglobulin-Gen. Der zweite Immunglobulinparter kann eine Nukleinsäuresequenz einschließen, die die gesamte konstante Region für den gleichen (d.h. homologen, wenn die ersten und zweiten veränderten Antikörper aus der gleichen Quelle stammen) oder einen zusätzlichen (d.h. heterologen) Antikörper von Interesse codiert. Er kann eine schwere Kette oder leichte Kette eines Immunglobulins sein (oder beide Ketten als Teil eines einzelnen Polypeptids). Der zweite Immunglobulinpartner ist nicht auf eine(n) Immunglobulinklasse oder -isotyp beschränkt. Zusätzlich kann der zweite Immunglobulinpartner einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion umfassen, wie er in Fab oder F(ab)₂ gefunden wird (d.h. einen diskreten Teil einer geeigneten humanen konstanten Region oder Gerüstregion). Ein solcher zweiter Immunglobulinpartner kann auch eine Sequenz umfassen, die ein integrales Membranprotein codiert, das auf der Außenoberfläche einer Wirtszelle angeboten wird, zum Beispiel als Teil einer Phagen-Display-Bibliothek, oder eine Sequenz, die ein Protein zur analytischen oder diag nostischen Detektion codiert, z.B. Meerrettichperoxidase, β-Galactosidase etc.
Die Begriffe Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' oder F(ab')₂ werden mit ihren Standardbedeutungen verwendet. Siehe z.B. Harlow et al. in "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
Wie hier verwendet beschreibt ein "gentechnisch veränderter Antikörper" einen Typ von verändertem Antikörper, d.h. einen synthetischen Antikörper voller Länge (z.B. einen chimären oder humanisierten Antikörper im Gegensatz zu einem Antikörperfragment), in dem ein Teil der variablen Domänen der leichten und/oder schweren Kette eines ausgewählten Akzeptor-Antikörpers durch analoge Teile aus einem oder mehreren Donor-Antikörpern, die Spezifität für das ausgewählte Epitop besitzen, ausgetauscht ist. Zum Beispiel können solche Moleküle Antikörper einschließen, die durch eine humanisierte schwere Kette gekennzeichnet sind, die mit einer unmodifizierten leichten Kette (oder chimären leichten Kette) assoziiert ist, oder umgekehrt. Gentechnisch veränderte Antikörper können auch durch Veränderung der Nukleinsäuresequenzen gekennzeichnet sein, die die Gerüstregionen der leichten und/oder schweren variablen Domäne des Akzeptor-Antikörpers codieren, um die Bindungsspezifität des Donor-Antikörpers zu bewahren. Diese Antikörper können einen Austausch eines oder mehrerer CDRs (bevorzugt aller) aus dem Akzeptor-Antikörper gegen CDRs aus einem hier beschriebenen Donor-Antikörper umfassen.
Ein "chimärer Antikörper" bezeichnet einen Typ von gentechnisch verändertem Antikörper, der eine natürlich vorkommende variable Region (leichte Kette und schwere Ketten), die aus einem Donor-Antikörper stammt, in Assoziation mit konstanten Regionen der leichten und schweren Kette enthält, die aus einem Akzeptor-Antikörper stammen.
Ein "humanisierter Antikörper" bezeichnet einen Typ von gentechnisch verändertem Antikörper, dessen CDRs aus einem nicht-humanen Donor-Immunglobulin stammen, wobei die verbleibenden aus Immunglobulin stammenden Teile des Moleküls aus einem oder mehreren humanen Immunglobulinen stammen. Zusätzlich können Gerüstträgerreste verändert sein, um die Bindungsaffinität zu bewahren. Siehe z.B. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029–10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991).
Der Begriff "Donor-Antikörper" bezeichnet einen monoklonalen oder rekombinanten Antikörper, der die Nukleinsäuresequenzen seiner variablen Regionen, CDRs oder anderer funktioneller Fragmente oder Analoga davon für einen ersten Immunglobulinparter beiträgt, um die veränderte codierende Immunglobulinregion und den resultierenden exprimierten veränderten Antikörper mit der antigenen Spezifität und neutralisierenden Aktivität zu versehen, die charakteristisch für den Donor-Antikörper sind. Ein zur Verwendung in dieser Erfindung geeigneter Donor-Antikörper ist ein als BC2 bezeichneter selbstlimitierender neutralisierender monoklonaler Antikörper. Andere geeignete Donor-Antikörper schließen die als BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC und HFXI bezeichneten murinen selbstlimitierenden neutralisierenden monoklonalen Antikörper ein.
Der Begriff "Akzeptor-Antikörper" bezeichnet monoklonale oder rekombinante Antikörper, die heterolog zum Donor-Antikörper sind und alles oder einen Teil der Nukleinsäuresequenzen beiträgt, die seine Gerüstregionen der schweren und/oder leichten Kette und/oder seine konstanten Regionen der schweren und/oder leichten Kette für den ersten Immunglobulinpartner codieren. Bevorzugt ist ein humaner Antikörper der Akzeptor-Antikörper.
"CDRs" werden als Aminosäuresequenzen der Komplementarität bestimmenden Region eines Antikörpers definiert, die die hypervariablen Regionen von schweren und leichten Immunglobulinketten sind. Siehe z.B. Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4. Auflage, U.S. Department of Health und Human Services, National Institutes of Health (1987). Es gibt drei CDRs oder CDR-Regionen der schweren Kette und drei der leichten Kette im variablen Teil eine Immunglobulins. Somit bezeichnet "CDRs" wie hier verwendet alle drei CDRs der schweren Kette oder alle drei CDRs der leichten Kette oder sowohl alle CDRs der schweren als auch alle der leichten Kette, je nach Eignung.
CDRs stellen die Mehrzahl der Kontaktreste für die Bindung des Antikörpers an das Antigen oder Epitop bereit. CDRs von Interesse in dieser Erfindung stammen aus Sequenzen der variablen schweren und leichten Kette des Donor-Antikörpers und schließen Analoga der natürlich vorkommenden CDRs ein, wobei die Analoga ebenfalls die gleiche Antigenbindungsspezifität und/oder neutralisierende Fähigkeit wie der Donor-Antikörper teilen oder bewahren, aus dem sie stammen.
Mit "Teilen der Antigenbindungsspezifität oder neutralisierenden Fähigkeit" ist zum Beispiel gemeint, daß, obwohl mAb BC2 durch ein gewisses Maß an selbstlimitierender neutralisierender Aktivität gekennzeichnet sein kann, ein durch eine Nukleinsäuresequenz von BC2 codiertes CDR in einer geeigneten strukturellen Umgebung eine geringere oder höhere Aktivität haben kann. Es wird erwartet, daß CDRs von BC2 in solchen Umgebungen dennoch das gleiche Epitop (die gleichen Epitope) wie BC2 erkennen werden.
Ein "funktionelles Fragment" ist eine partielle variable Sequenz der schweren oder leichten Kette (z.B. geringfügige Deletionen am Amino- oder Carboxyterminus der variablen Immunglobulinregion), das die gleiche Antigenbindungsspezifität und/oder neutralisierende Fähigkeit wie der Antikörper bewahrt, aus dem das Fragment abgeleitet wurde.
Ein "Analogon" ist eine durch wenigstens eine Aminosäure modifizierte Aminosäuresequenz, worin die Modifikation chemisch oder eine Substitution oder Umlagerung einiger Aminosäuren (d.h. nicht mehr als 10) sein kann, wobei die Modifikation es der Aminosäuresequenz erlaubt, die biologischen Eigenschaften, zum Beispiel Antigenspezifität und hohe Affinität, der unmodifizierten Sequenz zu bewahren. Exemplarische Analoga schließen stumme Mutationen ein, die über Substitutionen konstruiert werden können, um bestimmte Endonuklease-Restriktionsorte innerhalb von CDR-codierenden Regionen oder diese umgebend zu erzeugen.
Analoga können auch als allelische Variationen entstehen. Eine "allelische Variation oder Modifikation" ist eine Veränderung der Nukleinsäuresequenz, die die Aminosäure- oder Peptidsequenzen der Erfindung codiert. Solche Variationen oder Modifikationen können aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes bestehen oder können absichtlich manipuliert sein, um gewünschte Eigenschaften bereitzustellen. Diese Variationen oder Modifikationen können zu Veränderungen jeder codierten Aminosäuresequenz führen oder nicht.
Der Begriff "Effektormittel" bezeichnet Nicht-Protein-Trägermoleküle, an die die veränderten Antikörper und/oder natürlichen oder synthetischen leichten oder schweren Ketten des Donor-Antikörpers oder andere Fragmente des Donor-Antikörpers durch konventionelle Mittel assoziiert werden können. Solche Nicht-Proteinträger können herkömmliche Träger einschließen, die auf dem diagnostischen Gebiet verwendet werden, z.B. Polystyrol- oder andere Kunststoffperlen, Polysaccharide, wie sie z.B. im BIAcore-System (Pharmacia) verwendet werden, oder andere Nicht-Proteinsubstanzen, die auf dem medizinischen Gebiet nützlich und sicher zur Verabreichung an Menschen und Tiere sind. Andere Effektormittel können einen Makrozyklus zum Komplexieren eines Schwermetallatoms oder von Radioisotopen einschließen. Solche Effektormittel können auch nützlich zur Erhöhung der Halbwertszeit der veränderten Antikörper sein, z.B. Polyethylenglykol.
Zur Verwendung in der Konstruktion der Antikörper, veränderten Antikörper und Fragmente dieser Erfindung kann eine nicht-humane Art wie Rind, Schaf, Affe, Huhn, Nagetier (z.B. Maus und Ratte) eingesetzt werden, um ein wünschenswertes Immunglobulin bei Präsentation mit einem humanen Gerinnungsfaktor, bevorzugt Faktor IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa oder Thrombin/Prothrombin oder einem Peptidepitop daraus, zu erzeugen. Herkömmliche Hybridomtechniken werden eingesetzt, um eine Hybridomzellinie bereitzustellen, die einen nicht-humanen mAb für den jeweiligen Gerinnungsfaktor sezerniert. Solche Hybridome werden dann auf Bindung unter Verwendung von Faktor IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa oder Thrombin/Prothrombin, die auf Platten mit 96 Vertiefungen aufgetragen sind, wie im Abschnitt der Beispiele beschrieben, oder alternativ mit biotinyliertem Faktor IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa oder Thrombin/Prothrombin, die an eine mit Streptavidin beschichtete Platte gebunden sind, durchmustert. Alternativ können vollständig humane mAbs durch den Fachleuten bekannte und in dieser Erfindung verwendete Techniken erzeugt werden.
Ein exemplarischer selbstlimitierender neutralisierender mAb dieser Erfindung ist mAb BC2, ein muriner Antikörper, der zur Entwicklung eines chimären oder humanisiertem Moleküls verwendet werden kann. Der BC2-mAb ist durch eine selbstlimitierende inhibitorische Aktivität auf die Gerinnungszeit gekennzeichnet. Gemäß Messung durch den aPTT-Test weist die Wirkung des BC2-mAb auf die Gerinnungszeit einen maximalen Wert von ca. 100 Sekunden auf. Der BC2-mAb bindet auch Faktor IXa, inhibiert Faktor IX gegen IXa-Umwandlung und inhibiert Faktor IXa-Aktivität. Zweiwertige Metallkofaktoren sind für die Aktivität erforderlich, wobei der mAb eine größere Präferenz für Ca²⁺ gegenüber Mn²⁺ aufweist. Der beobachtete IC₅₀-Wert im aPTT-Test beträgt ca. 50 nM. Der BC2-mAb weist eine Arten-Kreuzreaktivität gegenüber Ratte auf und ist vom Isotyp IgG2a.
Andere wünschenswerte Donor-Antikörper sind die murinen mAbs, BC1, 9E4(2)F4 und 11G4(1)B9. Diese mAbs sind durch eine selbstlimitierende inhibitorische Aktivität auf die Gerinnungszeit gekennzeichnet. Gemäß Messung durch den aPTT-Test weist die Wirkung dieser mAbs auf die Gerinnungszeit einen maximalen Wert von ca. 90 bis 100 Sekunden für 9E4(2)F4 und ca. 80 Sekunden für 11G4(1)B9 auf. Der BC1-mAb bindet auch Faktor IXa, inhibiert Faktor IXa-Aktivität, aber inhibiert keine Faktor IX-zu-IXa-Umwandlung. Ein Metall-Kofaktor ist nicht für seine Aktivität erforderlich. Der beobachtete IC₅₀-Wert für BC1 im aPTT-Test beträgt ca. 35 nM. Der BC1-mAb ist vom Isotyp IgG1.
Noch ein anderer wünschenswerter Donor-Antikörper, der durch eine selbstlimitierende inhibitorische Aktivität auf die Gerinnungszeit gekennzeichnet ist, ist der murine mAb HFXLC. Gemäß Messung durch den aPTT-Test weist die Wirkung des HFXLC-mAb auf die Gerinnungszeit einen maximalen Wert von ca. 50 bis 60 Sekunden auf. Der HFXLC-mAb bindet die leichte Kette von Faktor X und inhibiert Faktor X/Xa-Aktivität. Der beobachtete IC₅₀-Wert im aPTT-Test beträgt ca. 20 nM.
Noch ein anderer wünschenswerter Donor-Antikörper, der durch eine selbstlimitierende inhibitorische Aktivität auf die Gerinnungszeit gekennzeichnet ist, ist der murine mAb, HFXI. Gemäß Messung durch den aPTT-Test weist die Wirkung des HFXI-mAb auf die Gerinnungszeit einen maximalen Wert von ca. 100 Sekunden auf. Der HFXLC-mAb bindet Faktor XI und inhibiert Faktor XI/XIa-Aktivität. Der beobachtete IC₅₀-Wert im aPTT-Test beträgt ca. 30 nM.
Ohne Beabsichtigung zur Bindung an eine besondere Theorie in bezug auf den Wirkungsmechanismus scheinen diese mAbs die Gerinnung durch einen nicht-kompetitiven oder allosterischen Mechanismus zu regulieren, wodurch eine nur partielle Inhibierung erreicht wird.
Diese Erfindung ist nicht auf die Verwendung der BC1-, BC2-, 9E4(2)F4-, 11G4(1)B9-, HFXLC-, HFXI- oder deren hypervariable (d.h. CDR) Sequenzen beschränkt. Alle anderen geeigneten hochaffinen Antikörper, die durch eine selbstlimitierende neutralisierende Aktivität gekennzeichnet sind, und entsprechende CDRs können dafür substituiert werden. Die Identifizierung des Donor-Antikörpers in der folgenden Beschreibung als BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC oder HFXI wird allein zur Illustration und Vereinfachung der Beschreibung vorgenommen.
Die vorliegende Erfindung schließt auch die Verwendung von Fab-Fragmenten oder F(ab')₂-Fragmenten ein, die aus mAbs stammen, die gegen den geeigneten humanen Gerinnungsfaktor oder -kofaktor gerichtet sind. Diese Fragmente sind nützlich als Mittel mit selbstlimitierender neutralisierender Aktivität gegen Gerinnungsfaktoren, bevorzugt gegen Faktor IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa oder Thrombin/Prothrombin. Ein Fab-Fragment enthält die gesamte leichte Kette und den Amino-terminalen Teil der schweren Kette. Ein F(ab')₂-Fragment ist das durch zwei Fab-Fragmente gebildete Fragment, die durch Disulfidbindungen gebunden sind. Die mAbs BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC und HFXI und andere ähnliche hochaffine Antikörper stellen Quellen für Fab-Fragmente und F(ab')₂-Fragmente bereit, die durch herkömmliche Mittel, z.B. Spaltung des mAb mit den geeigneten proteolytischen Enzymen, Papain und/oder Pepsin, oder durch rekombinante Verfahren erhalten werden können. Diese Fab- und F(ab')₂-Fragmente sind als solche nützlich als therapeutische, prophylaktische oder diagnostische Mittel und als Donoren für Sequenzen, einschließlich der variablen Regionen und CDR-Sequenzen, die nützlich in der Bildung von hier beschriebenen rekombinanten oder humanisierten Antikörpern sind.
Die Fab- und F(ab')₂-Fragmente können über eine kombinatorische Phagen-Bibliothek (siehe z.B. Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12, 433–455 (1994)) oder Immunglobulin-Chain-Shuffling (siehe z.B. Marks et al., Bio/Technology, 10, 779–183 (1992)) konstruiert werden, die hier beide durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt werden, worin das Fd- oder v_H-Immunglobulin aus einem ausgewählten Antikörper (z.B. BC2) mit einem Repertoire von Immunglobulinen der leichten Kette, v_L (oder v_K), zur Bildung neuer Fabs assoziiert. Umgekehrt kann das Immunglobulin der leichten Kette aus einem selektierten Antikörper mit einem Repertoire von Immunglobulinen der schweren Kette, v_H (oder Fd), unter Bildung neuer Fabs assoziieren. Selbstlimitierende neutralisierende Faktor IX-Fabs können durch Assoziieren des Fd von mAb BC2 mit einem Repertoire von Immunglobulinen der leichten Kette erhalten werden. Daher kann man neutralisierende Fabs mit besonderen Sequenzen (Nukleotid und Aminosäure) aus der Chain-Shuffling-Technik gewinnen.
Der mAb BC2 oder andere oben beschriebene Antikörper können Sequenzen wie Peptidsequenzen der variablen schweren und/oder leichten Kette, Gerüstsequenzen, CDR-Sequenzen, funktionelle Fragmente und Analoga davon und die sie codierenden Nukleinsäuresequenzen bereitstellen, die in der Konstruktion und im Erhalt verschiedener veränderter Antikörper nützlich sind, die durch ihre Antigen-Bindungsspezifität des Donor-Antikörpers gekennzeichnet sind.
Die Nukleinsäuresequenzen dieser Erfindung oder Fragmente davon, die die Peptidsequenzen der variablen leichten Kette und schweren Kette codieren, sind ebenfalls nützlich zur mutagenen Einführung von spezifischen Veränderungen innerhalb der Nukleinsäuresequenzen, die die CDRs oder Gerüstregionen codieren, und zur Aufnahme der resultierenden modifizierten oder Fusions-Nukleinsäuresequenz in ein Plasmid zur Expression. Zum Beispiel können stumme Substitutionen in der Nukleotidsequenz der Gerüst- und CDR-codierenden Regionen verwendet werden, um Restriktionsenzymorte zu schaffen, die die Insertion von mutagenisierten CDR- und/oder Gerüstregionen erleichtern. Diese CDR-codierenden Regionen können in der Konstruktion der humanisierten Antikörper der Erfindung verwendet werden.
Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen der variablen Region der schweren Kette von BC2 sind in SEQ ID NOs: 5 und 7 aufgeführt. Die CDR-Sequenzen aus dieser Region sind in SEQ ID NOs: 8, 9 und 10 aufgeführt.
Die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen der variablen Region der leichten Kette von BC2 sind in SEQ ID NOs: 6 und 11 aufgeführt. Die CDR-Sequenzen aus dieser Region sind in SEQ ID NOs: 12, 13 und 14 aufgeführt.
Unter Berücksichtigung der Degeneriertheit des genetischen Codes können verschiedene codierende Sequenzen konstruiert werden, die die Aminosäuresequenzen und CDR-Sequenzen der variablen schweren und leichten Kette der Erfindung sowie funktionelle Fragmente und Analoga davon codieren, die die Antigenspezifität des Donor-Antikörpers teilen. Die isolierten Nukleinsäuresequenzen dieser Erfindung oder Fragmente davon, die die Peptidsequenzen oder CDRs der variablen Kette codieren, können zur Erzeugung veränderter Antikörper verwendet werden, z.B. chimärer oder humanisierter Antikörper oder in anderer Weise veränderter Antikörper dieser Erfindung, wenn sie funktionsfähig mit einem zweiten Immunglobulinpartner kombiniert werden.
Es sollte bemerkt werden, daß zusätzlich zu isolierten Nukleinsäuresequenzen, die Teile des (der) hier beschriebenen veränderten Antikörper s) codieren, andere solche Nukleinsäuresequenzen von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind, wie diejenigen, die komplementär zu den nativen CDR-codierenden Sequenzen oder komplementär zu den modifizierten humanen Gerüstregionen sind, die die CDR-codierenden Regionen umgeben. Nützliche DNA-Sequenzen schließen diejenigen Sequenzen ein, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit den DNA-Sequenzen hybridisieren. Siehe T. Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1982), S. 387–389. Ein Beispiel für eine solche stringente Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung mit 4 × SSC bei 65°C, gefolgt von einer Spülung in 0,1 × SSC bei 65°C für 1 Stunde. Alternativ ist eine exemplarische stringente Hybridisierungsbedingung 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C. Bevorzugt haben diese hybridisierenden DNA-Sequenzen eine Länge von zumindest ca. 18 Nukleotiden, d.h. von etwa der Größe eines CDR.
Veränderte Immunglobulinmoleküle können veränderte Antikörper codieren, die gentechnisch veränderte Antikörper wie chimäre Antikörper und humanisierte Antikörper einschließen. Eine gewünschte veränderte Immunglobulin-codierende Region enthält CDR-codierende Regionen, die Peptide mit der Antigen-Spezifität eines Faktor IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa oder Thrombin/Prothrombin-Antikörpers codieren, bevorzugt eines hochaffinen Antikörpers, wie er von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, inseriert in einen ersten Immunglobulinpartner wie eine humane Gerüstregion oder eine variable Region eines Humanimmunglobulins.
Bevorzugt ist der erste Immunglobulinpartner funktionsfähig mit einem zweiten Immunglobulinpartner verbunden. Der zweite Immunglobulinpartner wird oben definiert und kann eine Sequenz einschließen, die eine zweite Antikörperregion von Interesse codiert, zum Beispiel eine Fc-Region. Zweite Immunglobulinpartner können auch Sequenzen einschließen, die ein anderes Immunoglobulin codieren, an das die konstante Region der leichten oder schweren Kette im Raster oder mittels einer Linker-Sequenz fusioniert ist. Gentechnisch veränderte Antikörper, die gegen funktionelle Fragmente oder Analoga von Gerinnungsfaktoren gerichtet sind, können geschaffen werden, um eine gesteigerte Bindung mit dem gleichen Antikörper hervorzurufen.
Der zweite Immunglobulinpartner kann auch mit Effektormitteln wie oben definiert assoziiert sein, einschließlich von Nicht-Protein-Trägermolekülen, an die der zweite Immunglobulinpartner funktionsfähig durch herkömmliche Mittel gebunden sein kann.
Die Fusion oder Bindung zwischen den zweiten Immunglobulinpartnern, z.B. Antikörpersequenzen, und dem Effektormittel kann durch jedes geeignete Mittel erfolgen, z.B. durch herkömmliche kovalente oder ionische Bindungen, Proteinfusionen oder heterobifunktionelle Vernetzer, z.B. Carbodiimid, Glutaraldehyd und dgl. Solche Techniken sind fachbekannt und werden in herkömmlichen Chemie- und Biochemiebüchern beschrieben.
Zusätzlich können herkömmliche Linker-Sequenzen, die einfach einen gewünschten Raum zwischen dem zweiten Immunglobulinpartner und dem Effektormittel liefern, auch zur veränderten Immunglobulin-codierenden Region konstruiert werden. Die Schaffung solcher Linker ist den Fachleuten wohlbekannt.
Zusätzlich können Signalsequenzen für die Moleküle der Erfindung durch den Fachleuten bekannte Techniken zur Steigerung der Expression modifiziert werden.
Ein bevorzugter veränderter Antikörper enthält eine Peptid- oder Proteinsequenz der variablen schweren und/oder leichten Kette mit der Antigen-Spezifität von mAb BC2, z.B. die V_H- oder V_L-Ketten. Noch ein anderer wünschenswerter veränderter Antikörper dieser Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz wenigstens eines und bevorzugt alle der CDRs der variablen Region der schweren und/oder leichten Ketten des murinen Antikörpermoleküls BC2 enthält, wobei die verbleibenden Sequenzen aus einer humanen Quelle stammen, oder ein funktionelles Fragment oder Analogon davon.
In einer weiteren Ausführungsform kann der veränderter Antikörper der Erfindung ein zusätzliches Mittel daran gebunden aufweisen. Zum Beispiel kann rekombinante DNA-Technik verwendet werden, um einen veränderten Antikörper der Erfindung zu erzeugen, in dem das Fc-Fragment oder die CH2-CH3-Domäne. eines kompletten Antikörpermoleküls durch ein Enzym oder ein anderes detektierbares Molekül (d.h. einen Polypeptideffektor oder ein Reportermolekül) ersetzt wurde.
Der zweite Immunglobulinpartner kann auch funktionsfähig mit einem Nicht-Immunglobulinpeptid, -protein oder Fragment davon gebunden sein, das heterolog für die CDR-enthaltene Sequenz mit Antigen-Spezifität für einen Gerinnungsfaktor, bevorzugt für Faktor IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa oder Thrombin/Prothrombin, ist. Das resultierende Protein kann sowohl Antigenspezifität als auch Eigenschaften des Nicht-Immunglobulins bei Expression aufweisen. Diese Fusionspartnereigenschaft kann z.B. eine funktionelle Eigenschaft wie eine andere Bindungs- oder Rezeptordomäne oder eine therapeutische Eigenschaft, falls der Fusionspartner selbst ein therapeutisches Protein ist, oder zusätzliche antigene Eigenschaften sein.
Ein anderes wünschenswertes Protein dieser Erfindung kann ein vollständiges Antikörpermolekül mit schweren und leichten Ketten voller Länge oder jedes diskrete Fragment davon, wie zum Beispiel die Fab- oder F(ab')₂-Fragmente, ein Dimer der schweren Kette oder etwaige minimale rekombinante Fragmente davon, wie zum Beispiel ein F_v oder ein einkettiger Antikörper (SCA), oder ein anderes Molekül mit der gleichen Spezifität wie der ausgewählte Donor-mAb sein, z.B. mAb BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC oder HFXI. Ein solches Protein kann in der Form eines veränderten Antikörpers verwendet werden oder kann in seiner unfusionierten Form verwendet werden.
Immer wenn der zweite Immunglobulinpartner aus einem Antikörper stammt, der unterschiedlich vom Donor-Antikörper ist, z.B. jeder Isotyp oder jede Klasse von Gerüst- oder konstanten Regionen des Immunglobulins, resultiert ein gentechnisch veränderter Antikörper. Gentechnisch veränderte Antikörper können konstante Regionen des Immunglobulins (Ig) und variable Gerüstregionen aus einer Quelle, zum Beispiel den Akzeptor-Antikörper, und ein oder mehrere (bevorzugt alle) CDRs aus dem Donor-Antikörper umfassen, z.B. die Anti-Faktor IX/IXa, X/Xa, XI/XIa, VIII/VIIIa, V/Va, VII/VIIa oder Thrombin/Prothrombin-Antikörper wie hier beschrieben. Zusätzlich können Veränderungen, z.B. Deletionen, Substitutionen oder Additionen, der Gerüstregion der variablen Domäne der leichten und/oder schweren Kette des Akzeptor-mAb auf der Nukleinsäure- oder Aminosäureebene vorgenommen werden, oder die Donor-CDR-Regionen können hergestellt werden, um die Donor-Antikörper-Antigen-Bindungsspezifität zu bewahren.
Solche gentechnisch veränderten Antikörper werden geschaffen, um eine (oder beide) der variablen schweren und/oder leichten Ketten des Gerinnungsfaktor-mAb (gegebenenfalls modifiziert wie beschrieben) oder ein oder mehrere CDRs der schweren oder leichten Kette einzusetzen. Die veränderten Antikörper der Erfindung weisen selbstlimitierende neutralisierende Aktivität auf.
Solche veränderten Antikörper können einen humanisierten Antikörper, der die Gerüstregionen eines selektierten Humanimmunglobulins oder Subtyps enthält, oder einen chimären Antikörper einschließen, der die humanen konstanten Regionen der schweren und leichten Kette enthält, fusioniert an die funktionellen Gerinnungsfaktor-Antikörperfragmente. Ein geeigneter humaner (oder anderer tierischer) Akzeptor-Antikörper kann ein solcher sein, der aus einer herkömmlichen Datenbank ausgewählt wird, z.B. aus der KABAT^®-Datenbank, Los Alamos-Datenbank und Swiss Protein-Datenbank, durch Homologie mit den Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des Donor-Antikörpers. Ein humaner Antikörper, der durch eine Homologie mit den Gerüstregionen des Donor-Antikörpers (auf Aminosäurebasis) gekennzeichnet ist, kann geeignet sein, um eine variable Gerüstregion der schweren Kette zur Insertion der Donor-CDRs bereitzustellen. Ein geeigneter Akzeptor-Antikörper, der variable Gerüstregionen der leichten Kette spenden kann, kann in einer ähnlichen Weise ausgewählt werden. Es sollte bemerkt werden, daß die schweren und leichten Ketten des Akzeptor-Antikörpers nicht aus dem gleichen Akzeptor-Antikörper stammen müssen.
Bevorzugt werden die heterologen Gerüst- und konstanten Regionen aus Humanimmunglobulin-Klassen und -Isotypen wie IgG (Subtypen 1 bis 4), IgM, IgA und IgE ausgewählt. Jedoch braucht der Akzeptor-Antikörper nicht allein humane Immunglobulin-Proteinsequenzen umfassen. Zum Beispiel kann ein Gen konstruiert werden, in dem eine DNA-Sequenz, die einen Teil einer Human immunglobulinkette codiert, an eine DNA-Sequenz fusioniert ist, die eine Nicht-Immunglobulin-Aminosäuresequenz codiert, wie ein Polypeptideffektor oder Reportermolekül.
Ein besonders bevorzugter humanisierter Antikörper enthält CDRs von BC2, inseriert auf die Gerüstregionen einer ausgewählten humanen Antikörpersequenz. Zur Neutralisierung humanisierter Antikörper werden ein, zwei oder bevorzugt drei CDRs aus den variablen Regionen der schweren Kette und/oder leichten Kette des Faktor IX-Antikörpers in die Gerüstregionen der ausgewählten humanen Antikörpersequenz inseriert, wodurch die nativen CDRs des letzteren Antikörpers ausgetauscht werden.
Bevorzugt wurden in einem humanisierten Antikörper die variablen Domänen sowohl in den humanen schweren als auch leichten Ketten durch eine oder mehrere CDR-Austauschungen verändert. Es ist möglich, alle sechs CDRs oder verschiedene Kombinationen von weniger als den sechs CDRs zu verwenden. Bevorzugt werden alle sechs CDRs ausgetauscht. Es ist möglich, die CDRs nur in der humanen schweren Kette auszutauschen, wobei als leichte Kette die unmodifizierte leichte Kette aus dem humanen Akzeptor-Antikörper verwendet wird. Auch alternativ kann eine kompatible leichte Kette aus einem anderen humanen Antikörper durch Rückgriff auf die herkömmlichen Antikörper-Datenbanken ausgewählt werden. Der Rest des veränderten Antikörpers kann aus jedem geeigneten Akzeptor-Humanimmunglobulin stammen.
Der veränderte humanisierte Antikörper hat somit bevorzugt die Struktur eines natürlichen humanen Antikörpers oder eines Fragments davon und besitzt die Kombination von Eigenschaften, die für die effektive therapeutische Verwendung erforderlich sind, zum Beispiel Behandlung von thrombotischen und embolischen Krankheiten im Menschen.
Am meisten bevorzugt haben die humanisierten Antikörper eine Aminosäuresequenz der schweren Kette wie in SEQ ID NO: 31, 52 oder 89 dargestellt. Ebenfalls am meisten bevorzugt sind humanisierte Antikörper mit einer Aminosäuresequenz der leichten Kette wie in SEQ ID NO: 44, 57, 62, 74, 78 oder 99 dargestellt. Besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 249413, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 31 dargestellt hat und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 44 dargestellt hat. Auch besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 249415, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 52 dargestellt hat und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 57 dargestellt hat. Auch besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 249416, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie SEQ ID NO: 52 dargestellt hat und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 62 dargestellt hat. Auch besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 249417, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 52 dargestellt hat und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 74 dargestellt hat. Auch besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 257731, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 52 dargestellt hat und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 78 dargestellt hat. Auch besonders bevorzugt ist der humanisierte Antikörper SB 257732, worin die schwere Kette die Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 89 dargestellt hat und die leichte Kette die Aminosäuresequenz wie SEQ ID NO: 99 dargestellt hat.
Die Fachleute werden verstehen, daß ein gentechnisch veränderter Antikörper weiter durch Veränderungen in den Aminosäuren der variablen Domäne modifiziert werden kann, ohne notwendigerweise die Spezifität und hohe Affinität des Donor-Antikörpers zu beeinflussen (d.h. ein Analogon). Es wird vorhergesehen, daß die Aminosäuren der schweren und leichten Kette durch andere Aminosäuren entweder in den Gerüsten der variablen Domäne oder CDRs oder beiden substituiert werden können. Diese Substitutionen könnten durch die Donor-Antikörper- oder Konsensus-Sequenzen aus einer besonderen Untergruppe geliefert werden.
Zusätzlich kann die konstante Region verändert werden, um die selektiven Eigenschaften der Moleküle dieser Erfindung zu steigern oder zu verringern. Zum Beispiel eine Dimerisierung, Bindung an Fc-Rezeptoren oder die Fähigkeit zur Bindung und Aktivierung von Komplement (siehe z.B. Angal et al., Mol. Immunol., 30, 105–108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem., 269, 3469–3474 (1994), Winter et al., EP 307434-B).
Ein veränderter Antikörper, der ein chimärer Antikörper ist, unterscheidet sich von den oben beschriebenen humanisierten Antikörpern durch die Bereitstellung der gesamten variablen Regionen der schweren Kette und leichten Kette des nicht-humanen Donor-Antikörpers, einschließlich der Gerüstregionen, in Verbindung mit konstanten Regionen des Humanimmunglobulins für beide Ketten. Es wird vorhergesehen, daß chimäre Antikörper, die eine zusätzliche nicht-humane Sequenz behalten, relativ zu humanisierten Antikörpern dieser Erfindung, eine signifikante Immunreaktion im Menschen hervorrufen können.
Solche Antikörper sind nützlich in der Prävention und Behandlung von thrombotischen und embolischen Störungen wie nachfolgend erörtert.
Bevorzugt werden die Sequenzen der variablen leichten und/oder schweren Kette und die CDRs von mAb BC2 oder anderen geeigneten Donor-mAbs, z.B. BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI, und ihre codierenden Nukleinsäuresequenzen in der Konstruktion von veränderten Antikörpern, bevorzugt humanisierten Antikörpern, dieser Erfindung durch das folgende Verfahren verwendet. Die gleichen oder ähnliche Techniken können auch zur Erzeugung anderer Ausführungsformen dieser Erfindung eingesetzt werden.
Ein Hybridom, das einen ausgewählten Donor-mAb erzeugt, z.B. den murinen Antikörper BC2, wird herkömmlich kloniert und die DNA seiner variablen Regionen der schweren und leichten Kette durch einem Fachmann bekannte Techniken erhalten, zum Beispiel die Techniken, die beschrieben werden in Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Die variablen schweren und leichten Regionen von BC2, die wenigstens die CDR-codierenden Regionen enthalten, und diejenigen Teile der Gerüstregionen der leichten und/oder schweren variablen Domäne des Akzeptor-mAb, die zur Bewahrung der Bindungsspezifität des Donor-mAb erforderlich sind, sowie die verbleibenden aus Immunoglobulin stammenden Teile der Antikörperkette, die aus einem Humanimmunglobulin stammt, werden unter Verwendung von Polynukleotidprimern und reverser Transkriptase erhalten. Die CDR-codierenden Regionen werden unter Verwendung einer bekannten Datenbank und durch Vergleich mit anderen Antikörpern identifiziert.
Ein chimärer Maus/Mensch-Antikörper kann dann hergestellt und auf Bindungsfähigkeit getestet werden. Ein solcher chimärer Antikörper enthält die gesamten nicht-humanen V_H- und V_L-Regionen des Donor-Antikörpers in Verbindung mit konstanten Regionen des humanen Ig für beide Ketten.
Homologe Gerüstregionen einer variablen Region der schweren Kette aus einem humanen Antikörper werden unter Verwendung von Computerdatenbanken, z.B. KABAT^®, identifiziert, und ein humaner Antikörper mit Homologie zu BC2 wird als Akzeptor-Antikörper ausgewählt. Die Sequenzen der synthetischen variablen Regionen der schweren Kette, die die BC2-CDR-codierenden Regionen in den humanen Antikörpergerüsten enthalten, werden mit optionalen Nukleotidaustauschungen in den Gerüstregionen geschaffen, um Restriktionsorte aufzunehmen. Diese geschaffene Sequenz wird dann unter Verwendung langer synthetischer Oligomere synthetisiert. Alternativ kann die geschaffene Sequenz durch überlappende Oligonukleotide synthetisiert, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und auf Fehler korrigiert werden. Eine geeignete variable Gerüstregion der leichten Kette kann in einer ähnlichen Weise geschaffen werden.
Ein humanisierter Antikörper kann aus dem chimären Antikörper abgeleitet werden oder bevorzugt synthetisch durch Inserieren der CDR-codierenden Regionen des Donor-mAb aus den schweren und leichten Ketten in geeigneter Weise in das ausgewählte Gerüst der schweren und leichten Kette hergestellt werden. Alternativ kann ein humanisierter Antikörper der Erfindung unter Verwendung von Standard-Mutagenesetechniken hergestellt werden. So enthält der resultierende humanisierte Antikörper humane Gerüstregionen und CDR-codierende Regionen des Donor-mAb. Es kann eine anschließende Manipulation von Gerüstresten geben. Der resultierende humanisierte Antikörper kann in rekombinanten Wirtszellen, z.B. COS-, CHO- oder Myelomzellen, exprimiert werden. Andere humanisierte Antikörper können unter Verwendung dieser Technik an anderen geeigneten Faktor IX-spezifischen oder anderen Gerinnungsfaktor-spezifischen, selbstlimitierenden, neutralisierenden, hochaffinen, nicht-humanen Antikörpern hergestellt werden.
Ein herkömmlicher Expressionsvektor oder ein rekombinantes Plasmid wird durch Plazieren dieser codierenden Sequenzen für den veränderten Antikörper in funktionsfähiger Verbindung mit herkömmlichen regulatorischen Kontrollsequenzen hergestellt, die die Replikation und Expression in und/oder Sezernierung aus einer Wirtszelle steuern können. Regulatorische Sequenzen schließen Promotorsequenzen, z.B. den CMV-Promotor, und Signalsequenzen ein, die aus anderen bekannten Antikörpern stammen können. In ähnlicher Weise kann ein zweiter Expressionsvektor mit einer DNA-Sequenz hergestellt werden, die eine leichte oder schwere Kette eines komplementären Antikörpers codiert. Bevorzugt ist dieser zweite Expressionsvektor identisch mit dem ersten, ausgenommen in bezug auf die codierenden Sequenzen und selektierbaren Marker, um soweit wie möglich sicherzustellen, daß jede Polypeptidkette funktionell exprimiert wird. Alternativ können die codierenden Sequenzen der schweren und leichten Kette für den veränderten Antikörper auf einem einzelnen Vektor sitzen.
Eine ausgewählte Wirtszelle wird durch herkömmliche Techniken mit sowohl dem ersten als auch dem zweiten Vektor kotransfiziert (oder einfach durch einen einzelnen Vektor transfiziert), um die transfizierte Wirtszelle der Erfindung zu erzeugen, die sowohl die rekombinanten oder synthetischen leichten als auch schweren Ketten umfaßt. Die transfizierte Zelle wird dann durch herkömmliche Techniken kultiviert, um den gentechnisch veränderten Antikörper der Erfindung zu erzeugen. Der humanisierte Antikörper, der die Verbindung der rekombinanten schweren Kette und/oder leichten Kette einschließt, wird aus der Kultur durch einen geeigneten Test wie ELISA oder RIA durchmustert. Ähnliche herkömmliche Techniken können zur Konstruktion anderer veränderter Antikörper und Moleküle dieser Erfindung eingesetzt werden.
Geeignete Vektoren für die in den Verfahren und der Konstruktion der Zusammensetzungen dieser Erfindung eingesetzten Klonierungs- und Subklonierungsschritte können durch einen Fachmann ausgewählt werden. Zum Beispiel kann die pUC-Reihe von Klonierungsvektoren verwendet werden, wie zum Beispiel pUC19, die kommerziell erhältlich von Lieferanten wie Amersham oder Pharmacia ist. Zusätzlich kann jeder Vektor, der sich leicht vervielfältigen kann, eine Vielzahl an Klonierungsorten und selektierbaren Genen hat (z.B. Antibiotikaresistenz) und leicht manipuliert wird, zur Klonierung verwendet werden. Somit ist die Selektion des Klonierungsvektors kein beschränkender Faktor in dieser Erfindung.
In ähnlicher Weise können die zur Expression der erfindungsgemäß veränderten Antikörper eingesetzten Vektoren durch einen Fachmann aus jedem herkömmlichen Vektor ausgewählt werden. Die Vektoren enthalten auch ausgewählte regulatorische Sequenzen (wie CMV-Promotoren), die die Replikation und Expression von heterologen DNA-Sequenzen in ausgewählten Wirtszellen ausrichten. Diese Vektoren enthalten die oben beschriebenen DNA-Sequenzen, die für den veränderten Antikörper oder eine veränderte Immunglobulin-codierende Region codieren. Zusätzlich können die Vektoren die ausgewählten Immunglobulinsequenzen aufnehmen, die durch die Insertion von wünschenswerten Restriktionsorten zur leichten Manipulation modifiziert wurden.
Die Expressionsvektoren können auch durch Gene gekennzeichnet sein, die zur Amplifizierung der Expression der heterologen DNA-Sequenzen geeignet sind, z.B. das Säugetier-Dihydrofolatreduktasegen (DHFR). Andere bevorzugte Vektorsequenzen schließen eine Poly A-Signalsequenz wie aus Rinderwachstumshormon (BGH) und die Betaglobin-Promotorsequenz (Betaglopro) ein. Die hier nützlichen Expressionsvektoren können durch den Fachleuten wohlbekannte Techniken synthetisiert werden.
Die Komponenten solcher Vektoren, z.B. Replikons, Selektionsgene, Verstärker, Promotoren, Signalsequenzen und dgl., können von kommerziellen oder natürlichen Quellen erhalten oder durch bekannte Verfahren zur Verwendung in der Ausrichtung der Expression und/oder Sezernierung des Produkts der rekombinanten DNA in einem ausgewählten Wirt synthetisiert werden. Andere geeignete Expressionsvektoren, für die zahlreiche Typen für die Säugetier-, bakterielle, Insekten-, Hefe- und pilzliche Expression fachbekannt sind, können auch für diesen Zweck ausgewählt werden.
Die vorliegende Offenbarung umfaßt auch eine Zellinie, die mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert ist, das die codierenden Sequenzen der veränderten Antikörper oder veränderten Immunglobulinmoleküle davon enthält. Wirtszellen, die für die Klonierung und andere Manipulationen dieser Klonierungsvektoren nützlich sind, sind ebenfalls herkömmlich. Jedoch werden am meisten wünschenswert Zellen aus verschiedenen Stämmen von E. coli zur Vervielfältigung der Klonierungsvektoren und andere Schritte in der Konstruktion von veränderten Antikörpern dieser Erfindung verwendet.
Geeignete Wirtszellen oder Zellinien für die Expression des gentechnisch veränderten Antikörpers oder veränderten Antikörpers der Erfindung sind bevorzugt Säugetierzellen wie CHO, COS, eine Fibroblastenzelle (z.B. 3T3) und Myeloidzellen und besonders bevorzugt eine CHO- oder Myeloidzelle. Humane Zellen können verwendet werden, wodurch ermöglicht wird, daß das Moleküle mit humanen Glycosylierungsmustern modifiziert wird. Alternativ können andere eukaryontische Zellinien eingesetzt werden. Die Selektion geeigneter Säugetierwirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultur, Amplifikation, Durchmusterung und Produkterzeugung und Reinigung sind fachbekannt. Siehe z.B. Sambrook et al., s.o.
Bakterielle Zellen können sich als nützlich als Wirtszellen erweisen, die zur Expression der rekombinanten Fabs der vorliegenden Erfindung geeignet sind (siehe z.B. A. Plückthun, Immunol. Rev. 130, 151–188 (1992)). Jedoch müßte aufgrund der Tendenz von Proteinen, die in bakteriellen Zellen exprimiert werden, in einer ungefalteten oder ungeeignet gefalteten Form oder in einer nicht-glycosylierten Form zu sein, jedes in einer bakteriellen Zelle erzeugte rekombinante Fab auf Bewahrung von Antigen-Bindungsfähigkeit durchmustert werden. Falls das durch die bakterielle Zelle exprimierte Molekül in einer geeignet gefalteten Form erzeugt würde, wäre die bakterielle Zelle ein wünschenswerter Wirt. Zum Beispiel sind verschiedene Stämme von E. coli, die zur Expression verwendet werden, als Wirtszellen auf dem Gebiet der Biotechnologie wohlbekannt. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Streptomyces, anderen Bacilli und dgl. können ebenfalls eingesetzt werden.
Nach Wunsch sind auch Stämme von Hefezellen, die den Fachleuten bekannt sind, als Wirtszellen erhältlich, sowie Insektenzellen, zum Beispiel Drosophila und Lepidoptera, und virale Expressionssysteme. Siehe z.B. Miller et al., Genetic Engineering, 8, 277–298, Plenum Press (1986) und darin zitierte Verweise.
Die allgemeinen Verfahren, durch die die Vektoren der Erfindung konstruiert werden können, die Transfektionsverfahren, die zur Erzeugung der Wirtszellen der Erfindung erforderlich sind, und Kulturverfahren, die zur Erzeugung des veränderten Antikörpers der Erfindung aus solchen Wirtszellen notwendig sind, sind allesamt herkömmliche Techniken. Gleichsam können die veränderten Antikörper der Erfindung, sobald sie erzeugt sind, aus den Zellkulturinhalten gemäß Standardverfahren auf diesem Gebiet gereinigt werden, die Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dgl. einschließen. Solche Techniken sind im fachlichen Können und beschränken diese Erfindung nicht.
Noch ein anderes Verfahren zur Expression der humanisierten Antikörper kann die Expression in einem transgenen Tier verwenden, wie in US-PS 4,873,316 beschrieben. Dies betrifft ein Expressionssystem unter Verwendung des Caseinpromotors des Tieres, der es bei transgener Aufnahme in einem Säugetier dem weiblichen Tier erlaubt, das gewünschte rekombinante Protein in seiner Milch zu erzeugen.
Nach Expression durch das gewünschte Verfahren wird der gentechnisch veränderte Antikörper dann auf in-vitro-Aktivität durch Verwendung eines geeigneten Tests untersucht. Derzeit werden herkömmliche ELISA-Testformate zur Bewertung der qualitativen und quantitativen Bindung des gentechnisch veränderten Antikörpers an Faktor IX oder an andere geeignete Gerinnungsfaktoren eingesetzt. Zusätzlich können andere in-vitro-Tests auch zur Verifizierung der neutralisierenden Effizienz verwendet werden, bevor anschließende humane klinische Studien durchgeführt werden, um die Persistenz des gentechnisch veränderten Antikörpers im Körper trotz der gewöhnlichen Klärungsmechanismen auszuwerten.
Unter Befolgen der für aus BC2 hergestellte humanisierte Antikörper beschriebenen Verfahren kann ein Fachmann auch humanisierte Antikörper aus anderen Donor-Antikörpern, Sequenzen der variablen Region und CDR-Peptiden, die hier beschrieben werden, konstruieren. Gentechnisch veränderte Antikörper können mit Gerüsten der variablen Region erzeugt werden, die potentiell als "selbst" durch Empfänger des veränderten Antikörpers erkannt werden. Geringfügige Modifikationen an den Gerüsten der variablen Region können implementiert werden, um hohe Zunahmen der Antigenbindung ohne merklich erhöhte Immunogenität für den Empfänger zu bewirken. Solche veränderten Antikörper können wirksam einen Menschen für Gerinnungsfaktor-vermittelte Zustände behandeln. Solche Antikörper können auch nützlich in der Diagnose solcher Zustände sein.
Diese Erfindung betrifft auch die Inhibierung von Thrombose in einem Tier, insbesondere einem Menschen, unter Verwendung einer wirksamen Dosis eines monoklonalen Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörpers mit selbstlimitierender neutralisierender Aktivität, der aus SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731, SB 257732 ausgewählt ist, in Kombination mit einem Plasminogenaktivator. Die Kombinationstherapie steigert die Thrombolyse bei suboptimalen Konzentrationen des Plasminogenaktivators, wodurch die Zeit zur Wiederherstellung des Blutflusses verringert und die Häufigkeit und gesamte Dauer der Gefäßreperfusion erhöht werden. Im Gegensatz zu Heparin stört die Kombinationstherapie nicht signifikant die normalen hämostatischen Funktionen und beläßt Fibrinogen-, Plasminogen- und alpha-2-Antiplasminpsiegel. Entsprechend betrifft diese Erfindung auch ein Verfahren zur Reduzierung einer erforderlichen Dosis eines thrombolytischen Mittels in der Behandlung von Thrombose in einem Tier, das das Verabreichen eines Antigerinnungsmittels, das spezifisch auf eine Komponente des intrinsischen Gerinnungsreaktionswegs abzielt, in Kombination mit dem thrombolytischen Mittel umfaßt.
Bevorzugt ist der Gerinnungsfaktor aus dem intrinsischen oder gemeinen Gerinnungsreaktionsweg. Am meisten bevorzugt ist der monoklonale Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörper ein Anti-Faktor IX, Anti-Faktor IXa, Anti-Faktor X, Anti-Faktor Xa, Anti-Faktor XI, Anti-Faktor XIa, Anti-Faktor VIII, Anti-Faktor VIIIa, Anti-Faktor V, Anti-Faktor Va, Anti-Faktor VII, Anti-Faktor VIIa, Anti-Thrombin oder Anti-Prothrombin. Der mAb kann einen oder mehrere der hier beschriebenen gentechnisch veränderten Antikörper oder veränderten Antikörper oder Fragmente davon einschließen.
Bevorzugt ist der Plasminogenaktivator tPA, Streptokinase, Urokinase. Besonders bevorzugt ist tPA. Auch bevorzugt sind tPA-Varianten, die zum Beispiel beschrieben werden in Tachias und Madison, J. Biol. Chem., 272, 14580–14585 (1997); Fujise et al., Circulation, 95, 715–722 (1997); Coombs et al., J. Biol. Chem. 273, 4323–4328 (1998); Van de Werf et al., Am. Heart J. 137, 786–791 (1999) und Streptokinase- und Urokinasevarianten wie einkettiger Urokinase-Plasminogenaktivator, acylierter Plasminogen-Streptokinaseaktivator-Komplex, Staphylokinase und Plasminogenaktivatoren mit Ursprung Vampirfledermaus.
Alternativ kann Acetylsalicylsäure in Kombination mit dem monoklonalen Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörper verabreicht werden. In manchen Fällen verringert die Kombinationstherapie die therapeutisch wirksame Dosis des monoklonalen Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörpers.
Die durch die Verwendung der Moleküle dieser Erfindung induzierte therapeutische Reaktion wird durch die Bindung an den jeweiligen Gerinnungsfaktor und die anschließende selbstlimitierende Inhibierung der Gerinnungskaskade erzeugt. Somit sind die Moleküle der vorliegenden Erfindung, wenn sie in Zubereitungen und Formulierungen vorliegen, die zur therapeutischen Verwendung geeignet sind, höchst wünschenswert für Personen, die anfällig für eine abnormale Gerinnungsaktivität sind oder diese erfahren, die ohne Beschränkung verbunden ist mit Myokardinfarkt, instabiler Angina, Vorkammerflimmern, Schlag, Nierenschädigung, Lungenembolie, tiefer Venenthrombose und künstlichen Organ- und Prothesenimplantaten. Eine besonders bevorzugte Verwendung liegt im Myokardinfarkt.
Eine andere bevorzugte Verwendung liegt in der Behandlung von postthromboembolisch induzierter Ischämie. Entsprechend betrifft diese Erfindung auch die Verwendung eines Anti-Faktor IX-Antikörpers oder -Antikörperfragments, ausgewählt SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731, SB 257732, zur Behandlung post-thromboembolisch induzierter Ischämie. Der Antikörper oder ein Fragment soll nach dem Embolus verabreicht werden, d.h. nachdem ein Gerinnsel, das irgendwo im Gefäßsystem entspringt, in das zerebrale Gefäßsystem gewandert ist und anhält, wodurch der Blutfluß blockiert und/oder reduziert und Ischämie verursacht wird. Der Antikörper oder ein Fragment soll auch nach Schlaganfall verabreicht werden, d.h. nach der Erkennung einer beeinträchtigten neurologischen Funktion, die aus der Embolisation resultiert, auf Seiten eines Individuums oder eines Betrachters. Ferner betrifft diese Erfindung die Verwendung eines Anti-Faktor IX-Antikörpers oder -Antikörperfragments in Kombination mit einem Plasminogenaktivator, ausgewählt aus SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731, SB 257732. Der Antikörper oder ein Fragment und der Plasminogenaktivator können nach Embolie oder nach Schlaganfall verabreicht werden. Diese Verwendungen führen zur Aufrechterhaltung der vaskulären Perfusion in Kollateralgefäßen. Die Verwendungen der Erfindung nach der Verletzung mildern die Konsequenzen von anhaltender Ischämie wie fortgesetzte pathologische Thrombose im ischämischen Bett, was zu Wachstum von infarktiertem Gewebe und größeren neurologischen Ausfallerscheinungen führen kann.
Ferner betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Reduzierung einer erforderlichen Dosis eines thrombolytischen Mittels in der Behandlung einer tierischen post-thromboembolisch induzierten Ischämie, worin ein Anti-Faktor IX-Antikörper in Kombination mit dem thrombolytischen Mittel verabreicht werden soll.
Eine andere bevorzugte Verwendung ist die prophylaktische Verabreichung an ein Tier, das für thromboembolischen Schlaganfall anfällig ist. Daher betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines Anti-Faktor IX-Antikörpers zur Prävention von thromboembolischem Schlaganfall. Diejenigen Personen mit Risiko für einen thromboembolischen Schlaganfall schließen ohne Beschränkung Patienten ein, die für Vorhofflimmern anfällig sind, oder diejenigen, die sich chirurgischen Eingriffen oder anderen gerinnungsfördernden invasiven Techniken unterziehen.
Die veränderten Antikörper, Antikörper und deren Fragmente dieser Erfindung können auch in Verbindung mit anderen Antikörpern verwendet werden, insbesondere humanen mAbs, die reaktiv gegenüber anderen Markern (Epitopen) sind, die verantwortlich für den Zustand sind, gegen den der veränderte Antikörper der Erfindung gerichtet ist.
Es wird angenommen, daß die therapeutischen Mittel dieser Erfindung wünschenswert zur Behandlung von abnormalen Gerinnungszuständen für ca. 1 Tag bis ca. 3 Wochen oder nach Bedarf sind. Dies stellt einen beträchtlichen Fortschritt gegenüber den derzeit verwendeten Antikoagulantien Heparin und Warfarin dar. Die Dosis und Dauer der Behandlung betrifft die relative Dauer der Moleküle der vorliegenden Erfindung im menschlichen Kreislauf und kann durch einen Fachmann in Abhängigkeit vom behandelten Zustand und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten eingestellt werden.
Der Verabreichungsmodus der therapeutischen Mittel der Erfindung kann jeder geeignete Weg sein, der das Mittel auf den Wirt überträgt. Die veränderten Antikörper, Antikörper, gentechnisch veränderten Antikörper und Fragmente davon, der Plasminogenaktivator und die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung sind besonders nützlich zur parenteralen Verabreichung, d.h. subkutan, intramuskulär, intravenös oder intranasal.
Therapeutische Mittel der Erfindung können als pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt werden, die eine wirksame Menge des gentechnisch veränderten (z.B. humanisierten) Antikörpers der Erfindung und Plasminogenaktivator als aktive Bestandteile in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten. Alternativ könnten die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung auch Acetylsalicylsäure enthalten. Im prophylaktischen Mittel der Erfindung ist eine wäßrige Suspension oder Lösung bevorzugt, die den gentechnisch veränderten Antikörper, bevorzugt gepuffert bei physiologischem pH, in einer injektionsfertigen Form enthält. Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung werden üblicherweise eine Lösung des gentechnisch veränderten Antikörpers der Erfindung oder einen Cocktail daraus umfassen, gelöst in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, bevorzugt einem wäßrigen Träger. Eine Vielzahl wäßriger Trägern kann eingesetzt werden, z.B. 0,4% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin und dgl. Diese Lösungen sind steril und allgemein frei von teilchenförmigen Stoffen. Diese Lösungen können durch herkömmliche, wohlbekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden (z.B. Filtration). Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe nach Bedarf zur Annäherung an physiologische Zustände enthalten, wie zum Beispiel pH-Einstellungs- und Puffermittel etc. Die Konzentration des Antikörpers der Erfindung in einer solchen pharmazeutischen Formulierung kann weithin variieren, d.h. von weniger als ca. 0,5, gewöhnlich um oder wenigstens ca. 1% bis so viel wie 15 oder 20 Gew.-%, und wird primär auf Basis von Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten etc. gemäß dem ausgewählten besonderen Verabreichungsmodus ausgewählt werden.
Daher könnte eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur intramuskulären Injektion hergestellt werden, so daß sie 1 ml steriles gepuffertes Wasser und ca. 1 ng bis ca. 100 mg, z.B. ca. 50 ng bis ca. 30 mg oder besonders bevorzugt ca. 5 mg bis ca. 25 mg, eines gentechnisch veränderten Antikörpers der Erfindung enthält. In ähnlicher Weise könnte eine pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung zur intravenösen Infusion hergestellt werden, so daß sie ca. 250 ml sterile Ringer-Lösung und ca. 1 mg bis ca. 30 mg und bevorzugt 5 mg bis 25 mg eines gentechnisch veränderten Antikörpers der Erfindung enthält. Tatsächliche Verfahren zur Herstellung parenteral verabreichbarer Zusammensetzungen sind wohlbekannt oder werden den Fachleuten ersichtlich sein und werden in größerem Detail zum Beispiel beschrieben in "Remington's Pharmaceutical Science", 15. Auflage, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
Es ist bevorzugt, daß die therapeutischen Mittel der Erfindung, wenn sie in einer pharmazeutischen Zubereitung sind, in Einheitsdosisformen vorliegen. Die geeignete therapeutisch wirksame Dosis kann leicht durch die Fachleute festgestellt werden. Zur wirksamen Behandlung einer thrombotischen oder embolischen Störung in einem Menschen oder anderen Tier sollte eine Dosis von ca. 0,1 mg bis ca. 20 mg pro kg Körpergewicht aus einem Protein oder einem Antikörper dieser Erfindung parenteral verabreicht werden, bevorzugt i.v. oder i.m. Eine solche Dosis kann nach Bedarf zu geeigneten Zeitintervallen wiederholt werden, die soweit erforderlich durch einen Arzt während der thrombotischen Reaktion ausgewählt werden.
Die Antikörper, veränderten Antikörper oder Fragmente davon, die hier beschrieben werden, können zur Lagerung lyophilisiert werden und in einem geeigneten Träger vor der Verwendung wiederhergerichtet werden. Diese Technik hat sich als wirksam bei herkömmlichen Immunglobulinen erwiesen, und fachbekannte Lyophilisierungs- und Wiederherrichtungstechniken können eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele beschrieben werden.
Beispiel 1
Herstellung und Durchmusterung von monoklonalen Anti-Faktor IX-Antikörpern
Weiblichen Balb/C-Mäusen wurde humaner Faktor IX injiziert, gereinigt wie beschrieben in R. Jenny et al., Prep. Biochem., 16, 227–245 (1986). Typischerweise erhielt jede Maus eine Anfangsinjektion von 100 μg Protein, gelöst in 0,15 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und vermischt mit 0,15 ml komplettem Freund-Adjuvans. Auffrischungsimpfungen mit 50 μg Protein in 0,15 ml PBS mit 0,15 ml unvollständigem Freund-Adjuvans wurden etwa zweiwöchentlich über einen Zeitraum von 2–3 Monaten gegeben. Nach der letzten Auffrischung erhielt die Maus 50 μg von Faktor IX in PBS 3 Tage vor den Milz/Myelomzellfusionen. Milzzellen wurden aus einer immunisierten Maus isoliert und mit NS-1-Myelomzellen (G. Kohler et al., Eur. J. Immunol., 6, 292–295 (1976)) unter Verwendung von Polyethylenglykol fusioniert, wie beschrieben von V. T. Oi et al., "Selected Methods in Cellular Immunology", B. B. Mishell und S. M. Shigii , Hrsg., Freeman Press, San Francisco. Nach der Fusion wurden die Zellen in RPMI 1640-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthielt, resuspendiert, und Teilmengen wurden in jede Vertiefung von 4 Platten mit 24 Vertiefungen gegeben, die 0,5 ml von Zell-konditioniertem peritonealem Spülungsmedium enthielten. Am folgenden Tag erhielt jede Vertiefung 1,0 ml 2 × 10^–4 M Hypoxanthin, 8 × 10^–7 M Aminopterin und 3,2 × 10^–5 M Thymidin in RPMI 1640-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthielt. Die Zellen wurden alle 3–4 Tage durch Entfernen der Hälfte des Mediums und Austauschen gegen frisches Medium gefüttert, das 1 × 10^–4 M Hypoxanthin und 1,6 × 10^–5 M Thymidin enthielt.
Ca. 2 Wochen später wurden 1,0 ml des Hybridommediums aus jeder Vertiefung entfernt und auf Anti-Faktor IX-Antikörper unter Verwendung eines von R. J. Jenny et al. beschriebenen ELISA-Assays getestet, Meth. Enzymol., 222, 400–416 (1993). Kurz gesagt wurde Faktor IX auf Kunststoffvertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen immobilisiert. Hybridomüberstände oder Verdünnungen von gereinigtem Antikörper wurde dann in den Vertiefungen inkubiert. Die Vertiefungen wurden gewaschen und die Gegenwart von Antikörper-Antigen-Komplexen mit einem zweiten Ziege-Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper, der an Meerrettichperoxidase konjugiert war, und dem chromogenen Substrat o-Dianisidin detektiert.
Vertiefungen, die Anti-Faktor IX-Antikörper enthielten, wurden durch limitierende Verdünnung subkloniert und in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert. Überstand aus den klonierten Hybridomzellkulturen wurde auf Antikörper gegen Faktor IX durch den oben beschriebenen ELISA-Test durchmustert, und Zellen aus positiven Hybridomen wurden expandiert, eingefroren, in flüssigem Stickstoff gelagert und dann als Aszites-Tumoren in Mäusen kultiviert.
Beispiel 2
Selbstlimitierende Wirkung von Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörpern in der Gerinnung
Die Wirkung zunehmender Konzentrationen von Anti-Gerinnungsfaktor-Antikörpern auf die aktivierte partielle Thromboplastinzzeit (aPTT) von Humanplasma wurde in einem Fibrometer (Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland) unter Verwendung des Baxter-Referenzverfahrens LIB0293-J, Revision 3/93 (Baxter Scientific, Edison, New Jersey) bestimmt.
Vor dem Beginn des Experiments wurden 2 bis 3 ml von 0,02 M CaCl₂ in einem 5 ml-Röhrchen in die Heizkammer des Fibrometers gegeben. Humanplasmaproben wurden entweder frisch entnommen und auf Eis aufbewahrt oder gemäß Herstellerempfehlung von Hemostasis Reference Plasma (American Diagnostics, Greenwich, Connecticut) rekonstituiert.
Unfraktioniertes Heparin aus Schweinedarmschleimhaut (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri), Heparin mit geringem Molekulargewicht aus Schweinedarmschleimhaut (Lovenox^®, Enoxaparinnatrium, Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals, Collegeville, Pennsylvania) oder mAb-Antikoagulantien wurden als ca. 50 μM Vorratslösungen hergestellt und seriell direkt in das Testplasma verdünnt. Eine Leerprobe, die Plasma ohne Gerinnungshemmer enthielt, wurde als Referenz eingeschlossen.
Zwei fibroTube^®-Fibrometerbecher wurden mit 100 μl Testplasma oder 100 μl Testplasma mit Gerinnungshemmer bzw. 125 μl von Actin-aktiviertem Cephaloplastin-Reagens (Actin-Reagens aus Kaninchenhirncephalin in Ellagsäure, erhältlich von Baxter Scientific) gefüllt und in die Fibrometervertiefungen bei 37°C gegeben.
Nach einer Minute wurden 100 μl von Actin-Reagens in einen Plasma enthaltenden Becher überführt und der Inhalt mehrmals mit einer Pipette vermischt. Nach 3 Minuten Inkubation wurden 100 μl von CaCl₂, vorgewärmt auf 37°C, zur Plasma-Actinreagensmischung unter Verwendung einer automatischen Pipette/Zeitnehmerauslöser (Becton-Dickinson) hinzugegeben. Die Gerinnungszeiten wurden notiert, und die Ergebnisse sind in 1 als Gerinnungszeiten als Funktion der Endkonzentrationen von Gerinnungshemmer im Gesamttestvolumen von 300 μl dargestellt. Die Nennkonzentration von Faktor IX im Test beträgt 30–40 nM.
Die in 1 gezeigten Ergebnisse zeigen die Wirkung zunehmender Konzentrationen der murinen Anti-Faktor IX-mAbs BC1 und BC2 auf die aPTT-Gerinnungszeiten. Beide mAbs inhibieren die Gerinnung durch Verlängerung von aPTT, und beide mAbs erreichen einen letztendlichen Sättigungseffekt auf den aPTT-Wert. Die IC₅₀-Werte sind ähnlich bei –35 nM und –50 nM für BC1 bzw. BC2, aber der Unterschied der maximalen Reaktion auf die zwei Antikörper ist deutlich. Sättigungskonzentrationen von BC1 erhöhen den aPTT-Wert um ca. 50% auf –40 s. BC2 andererseits erhöht den aPTT-Wert um das 3,5-fache auf ca. 90 s. Die in der Antikoagulanztherapie mit Heparin verwendete therapeutische Zielzone ist hervorgehoben. Die Ergebnisse zeigen, daß die zwei mAbs der therapeutischen aPTT-Bereich von Heparin umklammern.
Die Eigenschaften der mAbs BC1 und BC2 sind in Tabelle I zusammengefaßt. Jeder der BC-mAbs erkennt das Zymogen, Faktor IX, sowie die aktive Protease, Faktor IXa, aber nur BC2 kann sowohl die Zymogenaktivierung als auch die Proteaseaktivität blockieren. Es wurde festgestellt, daß BC1 und BC2 mit Faktor IX aus Cynomolgus-Affen kreuzreagierte. Zusätzlich kreuzreagierte BC2 auch mit Faktor IX aus Ratte.
Tabelle I. Zusammenfassung der in-vitro-Eigenschaften von Anti-Faktor IX-mAbs
Die in 2 gezeigten Ergebnisse zeigen die Wirkung zunehmender Konzentrationen der Anti-Faktor IX-mAbs 9E4(2)F4 und 11G4(1)B9 auf die aPTT-Gerinnungszeiten. Das Plasma für den Test wurde auf die Hälfte der normalen Konzentration verdünnt, was einen Anfangs-aPTT-Wert von 45 s ergibt. Beide mAbs inhibieren die Gerinnung durch Verlängerung der aPTT-Zeit und beide mAbs erreichen eine letztliche Sättigungswirkung auf den aPTT-Wert. Sättigungskonzentrationen von 9E4(2)F4 und 11G4(1)B9 erhöhen den aPTT-Wert auf –90 bis 100 s für 9E4(2)F4 und –80 s für 11G4(1)B9. Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß die zwei mAbs am oberen Ende des therapeutischen aPTT-Bereichs von Heparin sind.
Die in 3 gezeigten Ergebnisse zeigen die Wirkung zunehmender Konzentrationen der Anti-Faktor X-mAbs HFXLC (gegenüber Epitop der leichten Kette), HFXHC (gegenüber Epitop der schweren Kette) und des Anti-Faktor XI-mAb HFXI auf die aPTT-Gerinnungszeiten. Diese mAbs wurden von Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN) erhalten. Die mAbs HFXLC und HFXI hemmen die Gerinnung durch Verlängerung des aPTT-Wertes, und beide mAbs erreichen eine letztliche Sättigungswirkung auf den aPTT-Wert. Der IC₅₀-Wert für HFXLC beträgt –40 nM; Sättigungskonzentrationen erhöhen den aPTT-Wert auf –60 s. Der IC₅₀-Wert für HFXI beträgt –20 nM; Sättigungskonzentrationen erhöhen den aPTT-Wert auf –100 s. Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß HFXLC im therapeutischen aPTT-Bereich von Heparin ist, während HFXI in das obere Ende des therapeutischen Bereichs von Heparin fällt. Der mAb HFXHC hatte keine Wirkung auf aPTT-Gerinnungszeiten.
Selbstlimitierende Ausdehnung des aPTT-Wertes wurde auch mit Antikörpern gegen Faktor VIII, dem Kofaktor für Faktor IXa, beobachtet. Zum Beispiel erhöhte der Anti-Humanfaktor VIII-Antikörper, SAF8C-IG, erworben von Affinity Biologicals, Inc., den aPTT-Wert auf ein Maximum von ca. 65 s. Eine halb-maximale Ausdehnung des aPTT-Wertes wurde mit ca. 100 nM Antikörper erreicht.
Beispiel 3
Wirksamkeit von murinen Faktor IX-mAbs im Ratten-Thrombusmodell
Zur Auswertung der Wirksamkeit von Anti-Faktor IX-Antikörpern in der Prävention von arterieller Thrombose wurde das Ratten-Karotisarterie-Thrombosemodell wie von Schumacher et al. angegeben, J. Cadio. Pharm., 22, 526–533 (1993), angepaßt. Dieses Modell besteht aus einer Segmentverletzung des Karotisendothels durch Sauerstoffradikale, die durch FeCl₃-Lösung erzeugt werden, aufgetragen auf die Oberfläche der Karotisarterie.
Kurz gesagt wurden Ratten mit Pentobarbitonnatrium anästhesiert, die Drosselvene wurde für intravenöse Injektionen mit einer Kanüle versehen, und die linke Femoralarterie wurde zur Überwachung von Blutdruck und Herzschlag mit einer Kanüle versehen. Die Karotisarterie wurde durch aseptische Technik über einen chirurgischen Einschnitt im Hals isoliert und mit einer magnetischen Durchflußsonde für die Blutflußmessung ausgerüstet. Nach einem Stabilisierungszeitraum wurden Basislinienparameter für die folgenden Variablen festgestellt: Karotis-Blutfluß, arterieller Druck, Herzschlag, aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und Prothrombinzeit (PT). Danach wurde ein in 50%iger FeCl3-Lösung getränktes, vorgemessenes Whatman-Filterpapier auf die Karotisarterie für 15 Minuten zur vollständigen Vernetzung der darunterliegenden Endothelzellen plaziert. Nach Entfernung des mit FeCl₃ getränkten Papiers wurde das Experiment bis zur Beendigung über 60 Minuten verfolgt. Am Ende des Experiments wurde der Karotisthrombus aus der Karotisartherie extrahiert und gewogen.
Alle Mittel wurden 15 Minuten vor dem Einsetzen der Karotisverletzung verabreicht. Die folgenden Behandlungen wurden untersucht und mit dem Faktor IX-mAb BC2 verglichen.

1. Heparin: 15, 30, 60 oder 120 U/kg Bolus, gefolgt von Infusion von 0,5, 1, 2 bzw. 4 U/kg/min über 60 Minuten.
2. Acetylsalicylsäure (ASA, Aspirin): 5 mg/kg Bolus.
3. Anti-Faktor IX-mAb BC2: 1, 3 oder 6 mg/kg Bolus, gefolgt von Infusion von 0,3, 1 bzw. 2 μg/kg/min über 60 Minuten.
4. Heparin: 30 U/kg Bolus + 1 U/kg/min + ASA mit 5 mg/kg.
5. Anti-Faktor IX-mAb BC2: 1 mg/kg + 0,3 μg/kg/min + ASA mit 5 mg/kg.

4 und 5 zeigen die vergleichende Pharmakologie der Antikoagulans/thrombotischen Schemata durch Aufzeigen der Wirkung von Heparin, ASA und Faktor IX-mAb BC2 auf aPTT (4) und PT (5).
Der Schlüsselindex für die Blutungsdiathese, aPTT, wurde als primäres Kriterium zur Bewertung der Wirksamkeit gegenüber Blutungsneigungen der in der Untersuchung verwendeten Antikoagulantien/thrombotischen Mittel verwendet. Die Ergebnisse in 4 zeigen die dosisabhängige Verländerungen von aPTT durch Heparin mit maximaler Verlängerung der Gerinnungszeit, über die Testgrenze hinaus, bei den zwei höheren Dosen. ASA allein erhöhte den aPTT-Wert nicht signifikant, aber in Kombination mit Heparin wurde ein deutlicher synergistischer Effekt beobachtet. Die Faktor IX-mAbs hatten eine gemäßigte Wirkung auf aPTT, und selbst bei der höchsten Dosis überstieg die Zunahme der Gerinnungszeit nicht die 3-fache Grenze des klinisch eingesetzten Standard-Antikoagulans. Besonders bemerkenswert veränderte die geringe Dosis von Faktor IX-mAb BC2 im Kombination mit ASA nicht den aPTT-Wert.
In 5 weisen die Daten darauf hin, daß PT auch signifikant durch Heparin bei den zwei höheren Dosen und durch die Kombination aus ASA + Heparin verlängert wurde, aber nicht durch eine beliebige der Faktor IX-mAb-Dosen allein oder in Kombination mit ASA.
Die Wirkung von Heparin, ASA und Faktor IX-mAb auf die Karotisarterienokkulusion ist in 6 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Karotisarterien aller mit Träger behandelten Tiere als Reaktion auf die Verletzung okkludierten. Heparin hemmte dosisabhängig die Okklusion der Karotisarterie. Bei der höchsten Dosis verhinderte Heparin vollständig die Okklusion der Karotisarterie; bei dieser Dosis konnte jedoch keine Gerinnung eingeleitet werden. ASA allein hatte nur eine geringfügige Wirkung auf die Karotisokklusion. ASA in Kombination mit Heparin versagte ebenfalls in der vollständigen Verhinderung der Karotisokklusion. Faktor IX-mAb blockierte vollständig die Karotisokklusion bei den zwei höheren Dosen, die die Gerinnung nicht über das klinisch erwünschte Ziel hinaus verlängert haben. Die niedrigere Dosis von Faktor IX-mAb, die weitgehend in der Sicherstellung der Durchgängigkeit allein versagte, zeigte eine vollständige Inhibierung der Karotisokklusion bei Verabreichung in Kombination mit ASA.
Wie Wirkung von Heparin, ASA und Faktor IX-mAb auf das Thrombusgewicht ist in 7 gezeigt. Heparin reduzierte dosisabhängig die Thrombusmasse in der Karotisarterie. Jedoch wurde noch etwa Restthrombus in der Karotisarterie trotz der vollständigen Blockade der Gerinnung gefunden. ASA allein oder in Kombination mit Heparin (30 U/kg-Schema) hatte nur eine partielle Wirkung auf das Thrombusgewicht. Faktor IX-mAb reduzierte dosisabhängig die Thrombusmasse, und die hohe Dosis verhinderte praktisch vollständig die Thrombusbildung. Außerdem verhinderte die Kombination aus dem gering dosierten Anti-Faktor IX-mAb und ASA, ein Schema, das vollständig die Karotisokkulsion verhinderte, ohne nachteilig die Gerinnungsindizes zu beeinflussen, vollständig die Thrombusbildung.
Die im Ratten-Karotisthrombosemodell durchgeführten Untersuchungen zeigen eindeutig die Wirksamkeit von Faktor IX-mAb in der Prävention von Thrombose in einem hochthrombogenen arteriellen Verletzungsmodell. Am bemerkenswertesten wurde die Wirksamkeit von Faktor IX-mAb innerhalb des durch den aPTT-Wert definierten gewünschten therapeutischen Antikoagulans-Ziels gezeigt. Außerdem erreichte Heparin, das derzeitige Standardantikoagulans, eine mit Faktor IX-mAb vergleichbare Wirksamkeit nur bei Dosen, die ernsthaft die Gerinnung in einem Ausmaß der Erzeugung von nicht-gerinnungsfähigem Blut beeinträchtigten. Interessanterweise wurde die beobachtete Potenzierung und Synergie, die durch die gemeinsame Behandlung durch ASA mit Heparin erworben wurde, auch gezeigt, wenn ASA mit Anti-Faktor IX-mAb gegeben wurde. Anders als die Kombination aus Heparin und ASA, die in einer Potenzierung sowohl der antithrombotischen als auch der gerinnungshemmenden Wirkungen resultierte, führte die Kombination aus Faktor IX-mAb und ASA jedoch zu einer Potenzierung der antithrombotischen Wirksamkeit ohne eine durchgehende Wirkung auf die Blutgerinnungsparameter ex vivo. Zusammen zeigen die Daten einen überlegene antithrombotische Fähigkeit von Faktor IX-mAb im Vergleich mit Heparin, ASA oder einer Kombination aus Heparin und ASA.
Beispiel 4
Rasterelektronenmikroskopie im Ratten-Thrombosemodell
Segmente von Ratten-Karotisarterie wurden gesammelt aus Scheinbehandlung, nur Eisen(III)-chlorid und Eisen(III)-chlorid + 6 mg/kg Faktor IX-Antikörper mit 3/Gruppe 15 Minuten nach der Einwirkung von Eisen(III)-chlorid. Die Arterien wurden durch Perfusion mit Formaldehyd fixiert und oberhalb und unterhalb des verletzten Gebietes abgebunden. Fixierte Arterien wurden dehydratisiert, in Hexamethyldisilazan inkubiert und in einem Exsikkator getrocknet. Getrocknete Arterien wurden längs geöffnet, auf Rasterelektronenmikroskopie-(REM)-Halter plaziert und mit Gold bedampft.
REM von scheinbehandelten Arterien zeigte ein im wesentlichen normales Endothel mit wenigen verstreuten Blutplättchen. Es gab einige Brüche im Endothel, wahrscheinlich als Ergebnis der mechanischen Beschädigung während der Operation, und die darunterliegende Basalmembran war mit einem Teppich von Blutplättchen bedeckt. Kein Hinweis auf Thrombusbildung wurde in den scheinbehandelten Ratten beobachtet.
REM der mit Eisen(III)-chlorid behandelten Arterien zeigte große Wandthromben, die einen großen Teil des Lumens des Gefäßes besetzten. Die Thromben waren aus aggregierten Blutplättchen, roten Blutkörperchen und amorphem und fibrillärem proteinhaltigem Material zusammengesetzt. Das proteinhaltige Material ist übereinstimmend mit Fibrin. Das Endothel der Arterien war größtenteils durch die großen Thromben verdeckt. Wenn sichtbar, war das Endothel, das über der mit Eisen(III)-chlorid behandelten Region lag, durch zahlreiche anhaftende Blutplättchen und amorphes proteinhaltiges Material bedeckt.
REM der mit Eisen(III)-chlorid behandelten Arterien aus Ratten, die auch mit Faktor IX-Antikörper behandelt wurden, zeigte, daß das Lumen der Gefäße weitgehend frei von Thrombus war. Das über der mit Eisen(III)-chlorid behandelten Region liegende Endothel zeigte eine umfassende Schädigung, und einige Gebiete waren durch anhaftende Blutplättchen und Blutplättchenaggregate bedeckt, aber es gab wenig oder kein proteinhaltiges Material.
Beispiel 5
Sequenzanalyse der cDNA der schweren und leichten Kette von Anti-Faktor IX-mAb BC2
Vollständige RNA wurde unter Verwendung von TriReagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) gemäß Herstellerprotokoll gereinigt. RNA wurde mit Isopropanol ausgefällt und in 0,5% SDS gelöst und auf 0,5 M NaCl eingestellt. Poly A⁺-RNA wurde mit Dynabeads Oligo (dT)₂₅ (Dynal A. S., Lake Success, NY) gemäß Herstellerprotokoll isoliert. Poly A⁺-RNA wurde aus den Perlen eluiert und in TE-Puffer resuspendiert. 12 Teilmengen von 100 ng RNA wurden mit einem RT-PCR-Kit gemäß Herstelleranweisungen (Boehringer Mannheim Katalog Nr. 1483-188) unter Verwendung eines dT-Oligonukleotids zum Priming revers transkribiert. Für die schwere Kette wurden PCR-Amplifikationen von 6 RNA/DNA-Hybriden für 25 Zyklen unter Verwendung eines murinen IgG2a-Gelenkprimers (SEQ ID NO: 1) und eines Signalsequenzprimers für die schwere Kette (SEQ ID NO: 2) durchgeführt. In ähnlicher Weise wurden für die leichte Kette PCR-Amplifikationen von 6 RNA/DNA-Hybriden für 25 Zyklen unter Verwendung eines murinen kappa-Primers (SEQ ID NO: 3) und eines degenerierten Signalsequenzprimers für die leichte Kette (SEQ ID NO: 4) durchgeführt. Die PCR-Produkte aus jeder der 12 Amplifikationen wurden in einem PCR2000-Vektor (TA Cloning Kit, Invitrogen, Katalognr. K2000-01) ligiert. Kolonien von rekombinanten Klonen wurden zufällig gepickt und Minizubereitungen von Plasmid-DNA wurden unter Verwendung eines von Birnboim und Doly beschriebenen alkalischen Extraktionsverfahrens hergestellt, Nucl. Acids Res. 7, 1513 (1979). Die isolierte Plasmid-DNA wurde mit EcoRI verdaut und an einem 0,8%igen Agarosegel analysiert. Doppelsträngige cDNA-Inserts der entsprechenden Größe, d.h. ~700 bp für die schwere Kette und ~700 bp für die leichte Kette, wurden durch eine Modifikation des Sanger-Verfahrens sequenziert. Die Sequenz aller 12 schweren und leichten Ketten wurde verglichen, um eine Konsensussequenz der variablen Region der schweren Kette von BC2 (SEQ ID NO: 5) und eine Konsensussequenz der variablen Region der leichten Kette von BC2 (SEQ ID NO: 6) zu erzeugen.
Die Sequenzanalyse der cDNA der variablen Region der schweren Kette von BC2 zeigte ein offenes Leseraster mit 363 Nukleotiden, das eine Sequenz von 121 Aminosäuren codiert (SEQ ID NO: 7). Die Sequenzen von CDR1, 2 und 3 der schweren Kette sind in SEQ ID NO: 8, 9 bzw. 10 aufgeführt.
Die Sequenzanalyse der cDNA der variablen Region der leichten Kette von BC2 zeigte ein offenes Leseraster mit 321 Nukleotiden, das eine Sequenz von 107 Aminosäuren codiert (SEQ ID NO: 11). Die Sequenzen von CDR1, 2 und 3 der leichten Kette sind in SEQ ID NOs: 12, 13 bzw. 14 aufgeführt.
Beispiel 6
Humanisierte Antikörper
Sechs als SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 und SB 257732 bezeichnete humanisierte Antikörper wurden konstruiert, so daß sie die oben beschriebenen murinen CDRs in einem humanen Antikörpergerüst enthielten.
SB 249413
SB 249413 enthält die schwere Kette F9HZHC 1-0 und die leichte Kette F9HZLC 1-0. Die synthetische humanisierte schwere Kette F9HZHC 1-0 der variablen Region wurde konstruiert unter Verwendung der ersten drei Gerüstregionen der schweren Kette, erhalten aus Immunglobulin RF-TS3'CL (J. D. Capra et al., J. Clin. Invest. 86, 1320–1328 (1990), identifiziert in der Kabat-Datenbank als Kabpro:Hhc10w), und der zuvor beschriebenen CDRs der schweren Kette von BC2. Keine Aminosäuresubstitutionen im Gerüst, die die CDR-Darbietung beeinflussen könnten, wurden vorgenommen. Vier überlappende synthetische Oligonukleotide wurde erzeugt (SEQ ID NOs: 15, 16, 17 und 18), die bei Verschmelzen und Verlängerung für die Aminosäuren codieren, die die variable Region der schweren Kette darstellen, durchgehend und einschließlich CDR3 (SEQ ID NOs: 19 und 20). Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert (SEQ ID NOs: 21 und 22) und in den pCR2000-Vektor (TA Cloning Kit, Invitrogen, Katalognr. K2000-01) ligiert und aus einem SpeI-, KpnI-Restriktionsverdau isoliert. Ein zweites DNA-Fragment, das für die Campath-Signalsequenz codiert, einschließlich der ersten fünf Aminosäuren der variablen Region (SEQ ID NOs: 23 und 24), wurde durch PCR-Amplifikation der entsprechenden Region eines Konstrukts hergestellt, das eine humanisierte Anti-respiratorisches Synzytialvirus-schwere Kette (SEQ ID NO: 25) codiert, mit zwei Primern (SEQ ID NOs: 26 und 27) und Verdauen mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SpeI hergestellt. Die zwei erzeugten Fragmente wurden in einen EcoRI-, KpnI-verdauten pFHZHC2-6pCD-Säugetierzell-Expressionsvektor ligiert, der den Rest eines humanen Konsensusgerüsts 4 und die konstante Region von IgG1 enthielt. Der Vektor enthielt eine einzelne Aminosäuremutation des pFHZHC2-3pCD-Vektors, beschrieben in WO 94/05690. Der fertige Rest von Gerüst 2 (Rest 49) wurde von Ser zu Ala durch Verdauen von pFHZHC2-3pCD mit XbaI und EcoRV und Inserieren eines Linkers, der aus zwei synthetischen Oligonukleotiden (SEQ ID NOs: 28 und 29) erzeugt wurde, mutiert. Die Sequenz des F9HZHC 1-0-Inserts ist in SEQ ID NOs: 30 und 31 gezeigt.
Die humanisierte leichte Kette F9HZLC 1-0 der synthetischen variablen Region wurde unter Verwendung der Gerüstregionen der humanen leichten Kette, erhalten aus Immunglobulin LS8'CL (Carmack et al., J. Exp. Med. 169, 1631–1643 (1989), identifiziert in der Kabat-Datenbank als Kabpro:Hkl138), und der zuvor beschriebenen CDRs der leichten Kette von BC2 konstruiert. Keine Gerüstaminosäuresubstitutionen, die die CDR-Darbietung beeinflussen könnten, wurden vorgenommen. Zwei überlappende synthetische Oligonukleotide wurden erzeugt (SEQ ID NOs: 32 und 33), die bei Verschmelzen und Verlängerung für Aminosäuren codieren, die die variable Region der leichten Kette darstellen (SEQ ID NOs: 34 und 35). Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung von PCR-Primern (SEQ ID NOs: 36 und 37) amplifiziert und in den pCR200-Vektor (Ta Cloning Kit, Invitrogen, Katalognr. K2000-01) ligiert und aus einem ScaI-, SacII-Reaktionsverdau isoliert. Ein zweites DNA-Fragment, das für die Campath-Signalsequenz codiert, einschließlich der ersten zwei Aminosäuren der variablen Region (SEQ ID NOs: 38 und 39), wurde durch PCR-Amplifikation der entsprechenden Region eines Konstrukts, das eine humanisierte Anti-respiratorisches Synzytialvirus-schwere Kette codiert (SEQ ID NO: 25), mit den zwei Primern (SEQ ID NOs: 26 und 40) und Verdauen mit den Reaktionssystemen EcoRI und SacI hergestellt. Die zwei erzeugten Fragmente wurden in einen EcoRI-, SacII-verdauten pFHzLC1-2pCN-Säugetierzell-Expressionsvektor ligiert, der den Rest eines humanen Gerüsts 4 und die konstante kappa-Region enthielt. Der Vektor enthielt eine einzelne Aminosäuremutation des pFHZLC1-1pCN-Vektors, beschrieben in WO 94/05690. Ein Gerüst 2-Rest wurde Ser zu Pro durch Verdauen von pFZHLC1-pCN mit SmaI und KpnI und inserieren eines Linkers, der aus zwei synthetischen Oligonukleotiden erzeugt wurde (SEQ ID NOs: 41 und 42), mutiert. Die Sequenz des F9HZLC 1-0-Inserts ist in SEQ ID NOs: 43 und 44 gezeigt.
SB 249415
SB 249415 enthält die schwere Kette F9HZHC 1-1 und leichte Kette F9HZLC 1-1. Diese Konstrukte der schweren und leichten Kette beruhen auf F9HZHC 1-0 bzw. F9HZLC 1-0, jedoch besitzen sie Gerüst-Aminosäuresubstitutionen, die die CDR-Präsentation beeinflussen können.
F9HZHC 1-1 hat drei Gerüst-Aminosäuresubstitutionen, die die CDR-Präsentation beeinflussen könnten. Zwei überlappende synthetische Oligonukleotide wurden erzeugt (SEQ ID NOs: 45 und 46), die bei Verschmelzung und Verlängerung für Aminosäuren codieren, die den veränderten Teil der variablen Region der schweren Kette darstellen (SEQ ID NOs: 47 und 48). Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung von PCR-Primern (SEQ ID NOs: 49 und 50) amplifiziert, in den pCR200-Vektor (TA Cloning Kit, Invitrogen, Katalognr. K2000-01) ligiert und aus einem EcoNI, KpnI-Restriktionsverdau isoliert. Dieses Fragment wurde in den mit EcoNI, KpnI verdauten F9HZHC1-0-Vektor (SEQ ID NO: 30) ligiert. Die Sequenz des F9HZHC 1-1-Inserts ist in SEQ ID NOs: 51 und 52 gezeigt.
F9HZLC-1 hat vier Gerüst-Aminosäuresubstitutionen, die die CDR-Präsentation beeinflussen können. Zwei synthetische Oligonukleotide wurden erzeugt (SEQ ID NOs: 53 und 54), die bei Verschmelzung kohäsive KpnI- und BamHI-Enden haben und für Aminosäuren codieren, die den veränderten Teil der variablen Region der leichten Kette darstellen (SEQ ID NO: 55). F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) wurde mit den Restriktionsenzymen KpnI und BamHI verdaut und an die synthetische DNA ligiert. Die Sequenz des F9HZLC 1-1-Inserts ist in SEQ ID NOs: 56 und 57 gezeigt.
SB 249416
SB 249416 enthält die schwere Kette F9HZHC 1-1 (oben beschrieben) (SEQ ID NO: 52) und die leichte Kette F9HZLC 1-2. Das Konstrukt der leichten Kette beruht auf F9HZLC 1-1, jedoch hat es eine zusätzliche Gerüst-Aminosäuresubstitution, die die CDR-Präsentation beeinflussen kann.
Zwei synthetische Oligonukleotide wurden erzeugt (SEQ ID NOs: 58 und 59), die bei Verschmelzung kohäsive BamHI- und XbaI-Enden haben und für Aminosäuren codieren, die den veränderten Teil der variablen Region der leichten Kette darstellen (SEQ ID NO: 60). Der F9HZLC 1-1-Vektor (SEQ ID NO: 56) wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI verdaut und an die synthetische DNA ligiert. Die Sequenz des F9HZLC 1-2-Inserts ist in SEQ ID NOs: 61 und 62 gezeigt.
SB 249417
SB 249417 enthält die schwere Kette F9HZHC 1-1 (oben beschrieben) (SEQ ID NO: 52) und die leichte Kette F9HZLC 2-0. Eine humanisierte leichte Kette F9HZLC 2-0 der synthetischen variablen Region wurde unter Verwendung der Gerüstregionen der humanen leichten Kette, erhalten aus Immunglobulin REI (Palm und Hilschmann, Z. Physiol. Chem. 354, 1651–1654 (1973), identifiziert in der Kabat-Datenbank als Kabpro: HKL111), und der zuvor beschriebenen CDRs der leichten Kette von BC2 konstruiert. Fünf humane Konsensus-Aminosäuresubstitutionen wurden eingeführt. Sechs murine Gerüst-Aminosäuresubstitutionen, die die CDR-Präsentation beeinflussen können, wurden vorgenommen. Zwei überlappende synthetische Oligonukleotide wurden erzeugt (SEQ ID NOs: 63 und 64), die bei Verschmelzung und Verlängerung für Aminosäuren codieren, die die variable Region der leichten Kette darstellen (SEQ ID NOs: 65 und 66). Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung von PCR-Primern amplifiziert (SEQ ID NOs: 67 und 68), in den PCR2000-Vektor (TA Cloning Kit, Invitrogen, Katalognr. K2000-01) ligiert und aus einem SacI, SacII-Restriktionsverdau isoliert. Eine zweites DNA-Fragment, das für die Campath-Signalsequenz codiert, einschließlich der ersten zwei Aminosäuren der variablen Region (SEQ ID NO: 38), wurde durch PCR-Amplifikation der entsprechenden Region eines Konstrukts, das eine humanisierte Anti-respiratorisches Synzytialvirus-schwere Kette (SEQ ID NO: 25) codiert, mit zwei Primern (SEQ ID NOs: 26 und 69) und Verdauen mit den Restriktionsenzymen EcoRI und ScaI hergestellt. Ein drittes DNA-Fragment, das den Rest eines humanen Gerüsts 4 (SEQ ID NO: 70) codiert und kohäsive SacII- und NarI-Enden aufweist, wurde durch Verschmelzen von zwei synthetischen Oligonukleotiden (SEQ ID NO: 71 und 72) erzeugt. F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und NarI verdaut und an die drei DNA-Fragmente ligiert. Die Sequenz des Inserts F9HZLC 2-0 ist in SEQ ID NOs: 73 und 74 gezeigt.
SB 257731
SB 257731 enthält die schwere Kette F9HZHC 1-1 (SEQ ID NO: 52) und die leichte Kette F9HZLC 1-3, eine einzelne Aminosäuremutation von F9HZLC 1-2 (SEQ ID NO: 62). F9HZLC 1-2 wurde mit zwei Primern (SEQ ID NOs: 26 und 69) PCR-amplifiziert und mit den Restriktionsenzymen EcoRI und ScaI verdaut. Ein 94 bp-Fragment (SEQ ID NOs: 75 und 76) wurde isoliert. Das Fragment wurde in den mit EcoRI, SacI verdauten Vektor F9HZLC 1-2 ligiert, um das Konstrukt der leichten Kette F9HZLC 1-3 zu erzeugen. Die Sequenz des Inserts F9HZLC 1-3 ist in SEQ ID NOs: 77 und 78 gezeigt.
SB 257732
SB 257732 enthält die humanisierte schwere Kette F9HZHC 3-0 der synthetischen variablen Region und die leichte Kette F9HZLC 3-0. Vier überlappende synthetische Oligonukleotide wurden erzeugt (SEQ ID NOs: 79, 80, 81 und 82), die bei Verschmelzung und Verlängerung für die Aminosäuren codieren, die die variable Region der schweren Kette darstellen, die verändert ist (SEQ ID NOs: 83 und 84). Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung von PCR-Primern (SEQ ID NOs: 85 und 86) amplifiziert, in den pCR200-Vektor (TA Cloning Kit, Invitrogen, Katalognr. K2000-01) ligiert und aus einem Stul, KpnI-Restriktionsverdau isoliert. Das isolierte Fragment wurde in den mit StuI, KpnI verdauten F9HZHC1-1-Vektor (SEQ ID NO: 52) ligiert. Dieser Vektor wurde dann mit EcoRI, SpeI verdaut, um die Signalsequenz zu entfernen. Ein DNA-Fragment, das für die Campath-Signalsequenz codiert (SEQ ID NO: 23), einschließlich der ersten fünf Aminosäuren der variablen Region, wurde durch PCR-Amplifikation von F9HZHC1-0 mit zwei Primern (SEQ ID NOs: 26 und 87) und Verdauen mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SpeI hergestellt. Das erzeugte Fragment wurde in den Vektor ligiert. Die Sequenz des Inserts F9HZHC3-0 ist in SEQ ID NOs: 88 und 89 gezeigt.
Vier überlappende synthetische Oligonukleotide wurden erzeugt (SEQ ID NOs: 90, 91, 92 und 93), die bei Verschmelzung und Verlängerung für Aminosäuren codieren, die die variable Region der leichten Kette darstellen (SEQ ID NOs: 94 und 95). Dieses synthetische Gen wurde dann unter Verwendung von PCR-Primern (SEQ ID NOs: 96 und 97) amplifiziert und in den pCR2000-Vektor (TA Cloning Kit, Invitrogen, Katalognr. K2000-01) ligiert und aus einem ScaI-, NarI-Restriktionsverdau isoliert. Das isolierte Fragment wurde in den mit ScaI, NarI verdauten F9HZLC1-3-Vektor (SEQ ID NO: 77) ligiert. Die Sequenz des Inserts F9HZLC3-0 ist in SEQ ID NOs: 98 und 99 gezeigt.
Die humanisierten Anti-Faktor IX-mAbs wurden in CHO-Zellen exprimiert. Eine für Suspensionswachstum in serumfreiem Medium angepaßte DG-44-Zellinie wurde in 100 ml proteinfreiem Medium, das 1X Nukleoside und 0,05% F68 enthielt, in sterilen 250 ml Einweg-Erlenmeyerkolben (Corning) auf einem Schütteltisch Innova 2100 (New Brunswick Scientific) mit 150 U/min bei 37°C in einem Inkubator mit 5% CO₂ und 95% befeuchteter Luft kultiviert. Diese Zellen wurden zweimal wöchentlich mit 4 × 10⁵ Zellen/ml passagiert. 15 μg jedes der Vektoren der leichten pCN-Lc-Kette und schweren pCD-Hc-Kette wurden durch Verdau mit NotI linearisiert, unter sterilen Bedingungen kopräzipitiert und in 50 ml 1X TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) resuspendiert. Die DNA wurde unter Verwendung eines Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories) in die Acc-098-Zellen unter Verwendung der Technik von Hensley et al. elektroporiert, J. Biol. Chem. 269, 23949–23958 (1994). 1,2 × 10⁷ Zellen wurden einmal in 12,5 ml von eiskalter PBSucrose (PBS, 272 mM Saccharose, 7 mM Natriumphosphat pH 7,4, 1 mM MgCl₂) gewaschen, in 0,8 ml PBS resuspendiert, zu 50 μl der DNA-Lösung gegeben und auf Eis für 15 min inkubiert. Die Zellen wurden mit 380 V und 25 μF gepulst und dann auf Eis für 10 min inkubiert. Zellen wurden in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen mit 5 × 10⁵ Zellen/Platte in einem Erhaltungsmedium für 24 h vor der Selektion inkubiert. Zellen wurden auf Resistenz gegen 400 μg/ml G418 (Geneticin, Life Technologies, Inc.) in Erhaltungsmedium selektiert. 24 h vor dem Test wurden die Zellen mit 150 μl des Erhaltsmediums gefüttert.
Konditioniertes Medium aus individuellen Kolonien wurde unter Verwendung eines Elektrochemielumineszenz-(ECL)-Detektionsverfahrens an einem Origen-Analysator (IGEN, Inc.) getestet. Siehe Yang et al., Biotechnology, 12, 193–194 (1994).
Alle zur Durchführung der Tests (Testpuffer) und für den Betrieb des Analysators (Zellreiniger) erforderlichen Lösungen wurden von IGEN erhalten. Die Antikörper (Anti-humanes IgG (g-kettenspezifisch), Sigma Chemicals und F(ab')₂-Fragment für humanes IgG (H + L), Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) wurden mit TAG-NHS-Ester (IGEN, Inc.) in einem Molverhältnis TAG:Protein von 7:1 markiert, während das Protein A (Sigma) mit Biotin-LC-Sulfo-NHS-Ester (IGEN, Inc.) mit einem Molverhältnis Biotin:Protein von 20:1 markiert wurde, beide gemäß IGEN-Empfehlungen. Streptavidin-beschichtete Magnetperlen (M-280) wurden von Dynal erhalten.
Immunoassays wurden unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt: pro Probe wurden 50 μl der Streptavidin-beschichteten Perlen (Endkonzentration 600 μg/ml, verdünnt in PBS, pH 7,8, mit 1,25% Tween) mit 50 μl Biotin-Protein A (Endkonzentration 1 μg/verdünnt in PBS, pH 7,8, mit 1,25% Tween) vermischt und bei Raumtemperatur für 15 min unter Rühren inkubiert, 50 μl der TAG-Antikörper (eine Mischung mit einer Endkonzentration von 1,25 μg/ml F(ab')₂-Fragment für humanes IgG (H + L) und 0,25 μg/ml Anti-humanes IgG (g-kettenspezifisch), verdünnt in PBS, pH 7,8, mit 1,25% Tween) wurden hinzugegeben, die Lösung wurde dann zu 50 μl von konditioniertem Medium gegeben und unter Rühren bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert. 200 μl des Testpuffers wurden zur Reaktionsmischung gegeben und die Probe mit dem Origen I-Analysator zur Messung von ECL analysiert. Die Ergebnisse zeigten, daß ca. 20–37% der getesteten Kolonien über 15 ng/ml des Antikörpers mit einer durchschnittlichen Expression von ca. 150 ng/ml sezernieren.
Humanisierte Anti-Faktor IX-mAbs wurden aus den konditionierten Medien unter Verwendung eines Procep A-Capture-Schrittes, gefolgt von Ionenaustauscherchromatographie zur Reduzierung der DNA-Belastung gereinigt. Procep A-Sorbtionsmaterial (Bioprocessing Ltd., Durham, England) wurde zur Herstellung einer Säule mit einem Verhältnis von Durchmesser zu Höhe von 1:1 verwendet. Geklärtes konditioniertes Medium wurde auf die Säule mit ca. 150 cm/h aufgetragen. Die Säule wurde nacheinander mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), PBS, das 1 M NaCl enthielt, und schließlich mit PBS gewaschen. Das gebundene Material wurde mit 0,1 M Essigsäureelution gewonnen. Das Eluat wurde auf pH 5,5 eingestellt und mit Wasser verdünnt (1:4). Die verdünnte Lösung wurde auf eine S-Sepharosesäule (2,5 × 13 cm) aufgetragen, die mit 20 mM Natriumacetat, pH 5,5 mit 80 cm/h voräqulibriert worden war. Die Säule wurde mit dem Acetatpuffer gewaschen, bis eine konstante Basislinie erhalten wurde, und das gebundene Protein wurde mit 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4 mit 25 cm/h eluiert. Das eluierte Material wurde mit einer 0,4 μm-Membran filtriert und bei 4°C gelagert.
Beispiel 7
Chimärer Maus-humaner Antikörper
100 ng BC2-RNA wurden mit einem RT-PCR-Kit gemäß Herstelleranweisungen (Boehringer Mannheim, Katalognr. 1483-188) unter Verwendung eines dT-Oligonukleotids zum Priming revers transkribiert und mit synthetischen Primern ScaI (SEQ ID NO: 100) und NarI (SEQ ID NO: 101) PCR-amplifiziert, um die variable Region der leichten Kette von BC2 mit ScaI-, NarI-Enden zu erzeugen (SEQ ID NOs: 102 und 103). Diese DNA wurde in mit ScaI, NarI verdautes F9HZHC1-3 (SEQ ID NO: 77) ligiert und mit ScaI, NarI verdaut, um eine chimäre Maus-humane leichte Kette F9CHLC zu erzeugen (SEQ ID NOs: 104 und 105).
100 ng von BC2-RNA wurden mit einem RT-PCR-Kit gemäß Herstelleranweisungen (Boehringer Mannheim, Katalog Nr. 1483-188) unter Verwendung eines dT-Oligonukleotids zum Priming revers transkribiert und mit synthetischen Primern SpeI (SEQ ID NO: 106) und NheI (SEQ ID NO: 107) PCR-amplifiziert, um die variable Region der schweren Kette von BC2 mit SpeI-, NheI-Enden zu erzeugen (SEQ ID NOs: 108 und 109). Die Campath-Signalsequenz wurde aus der schweren Kette von RSVHZI9 (SEQ ID NO: 25) mit den Primern EcoRI (SEQ ID NO: 26) und SpeI (SEQ ID NO: 87) PCR-amplifiziert. Diese zwei DNA-Fragmente wurden in einen in WO 95/07301 beschriebenen, mit EcoRI, NheI verdauten IL4CHHCpcd-Vektor ligiert, unter Ersatz der variablen Region von IL4 gegen die variable Region von BC2 Faktor IX aus Maus, um eine chimäre Maus-humane schwere Kette F9CHHC zu erzeugen (SEQ ID NOs: 110 und 111).
Kotransfektion und Reinigung des chimären Maus-humanen Antikörpers chαFIX wurden wie oben für die humanisierten Konstrukte beschrieben erreicht.
Beispiel 8
Wirksamkeit von humanisierten Faktor IX-mAbs im Ratten-Thrombusmodell
Zur Auswertung der Wirksamkeit von humanisierten Anti-Faktor IX-Antikörpern in der Prävention von arterieller Thrombose wurde das Karotisarterien-Thrombosemodell der Ratte wie oben in Beispiel 3 beschrieben verwendet. Basislinienparameter wurden für den Karotisblutfluß, den arteriellen Druck, den Herzschlag, die Gefäßdurchgängigkeit und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) ermittelt. 15 Minuten danach wurde die Karotisverletzung für 10 Minuten bewirkt. Die Parameter wurden 60 Minuten nach dem Einsetzen der Karotisverletzung bestimmt. Der Karotisthrombus wurde ebenfalls aus der Karotisarterie extrahiert und gewogen.
Alle Mittel wurden intravenös 15 Minuten vor dem Einsetzen der Karotisverletzung verabreicht. Die folgenden Behandlungen wurden untersucht und mit dem Anti-Faktor IX-mAb BC2 verglichen.

1. Träger
2. chαFIX: 3 mg/kg Bolus
3. SB 249413: 3 mg/kg Bolus
4. SB 249415: 3 mg/kg Bolus
5. SB 249416: 3 mg/kg Bolus
6. SB 249417: 3 mg/kg Bolus
7. SB 257731: 3 mg/kg Bolus
8. Heparin: 60 Einheiten/kg Bolus + 2 Einheiten/kg/min Infusion.

Die aPTT-Zeit wurde als primäres Kriterium zur Auswertung der Wirksamkeit gegenüber Blutungsanfälligkeiten der in der Studie verwendeten Antikoagulantien/thrombotischen Mittel verwendet. Die Ergebnisse in 8 zeigen, daß die humanisierten Faktor IX-mAbs SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417 und SB 257731 eine gemäßigte Wirkung auf aPTT bei 3,0 mg/kg hatten, was innerhalb des klinisch akzeptierten Bereichs ist.
Die Wirkung der Faktor IX-mAbs auf die Thrombusmasse ist in 9 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß alle humanisierten mAbs gleich wirksam in der Reduzierung der Thrombusmasse sind.
Die durchgeführten Studien im Ratten-Karotisthrombosemodell zeigen eindeutig die Wirksamkeit der humanisierten Faktor IX-mAbs in der Prävention von Thrombose in einem hochthrombogenen arteriellen Verletzungsmodell. Am bemerkenswertesten wurde die Wirksamkeit aller humanisierten Faktor IX-mAbs innerhalb des durch die aPTT-Zeit definierten gewünschten therapeutischen Antikoagulans-Ziels gezeigt.
Beispiel 9
Biochemische und biophysikalische Eigenschaften des Antikörpers
Die molekulare Masse von SB 249417 wurde durch MALD-MS zu 14800 Da bestimmt. Analytisches Ultrazentrifugieren von SB 249417 ergab einen identischen Wert. In Gegenwart von Faktor IX plus Ca²⁺ sedimentierten die aus BC 2 stammenden Antikörper mit einer Masse von 248000 Da, was der kombinierten Masse des mAb und zwei Molekülen von Faktor IX entspricht. Kein Hinweis auf Aggregate höherer Ordnung wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von Faktor IX beobachtet.
Die Kinetik der Faktor IX-Bindung an SB 249417 wurde durch BIAcore-Analyse mit an immobilisierte Protein A-Oberfläche gebundenen Antikörper getestet. Rekombinanter humaner Faktor IX (rhFIX, Genetics Institute) mit 49 nM wurde verwendet und die Messungen in Gegenwart von 5 mM Ca²⁺ durchgeführt. Die Wechselwirkung war durch eine schnelle Assoziation, kass = 2,0 × 10⁵ M^–1s^–1, und eine relativ langsame Abklingrate gekennzeichnet, kdiss = 4,1 × 10^–4 s^–1. Der berechnete K_d-Wert für die Faktor IX-Bindung betrug 1,9 nM.
Tabelle 1 faßt die biophysikalischen Eigenschaften von SB 249417 zusammen.
Tabelle 1 Zusammenfassung der biophysikalischen Eigenschaften von SB 249417
Tabelle 2 faßt die Faktor IX-Bindungseigenschaften von mAbs der vorliegenden Erfindung zusammen. Die berechneten Dissoziationskonstanten waren im wesentlichen identisch innerhalb des experimentellen Fehlers.
Tabelle 2 Kinetik der Faktor IX-Bindung an Anti-Faktor IX-mAbs
Die Wechselwirkungen zwischen rhFIX und SB 249417, BC2 und anderen humanisierten Konstrukten wurden durch Titrationsmikrokalorimetrie charakterisiert, die die Bindungswechselwirkungen in Lösung aus der intrinsischen Bindungswärme mißt. Neun Injektionen von 106 μM FIX wurden in das Kalorimeter vorgenommen, das 2 μM mAb SB 249417 enthielt. Die Bindung wurde in den ersten vier Injektionen als exotherme Wärme detektiert. Bei den letzten 5 Injektionen waren die mAb-Bindungsorte mit FIX gesättigt, und nur Hintergrund-Vermischungswärmen wurden beobachtet. Die Ergebnisse zeigten, daß der Äquivalenzpunkt bei einem molaren Bindungsverhältnis nahe 2 FIX pro mAb wie erwartet auftrat. Eine nicht-lineare Analyse der Daten nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate liefert die Bindungsaffinität.
Die rhFIX-Affinitäten der mAbs wurden über einen Temperaturbereich von 34–44°C in 10 mM HEPES, 10 mM CaCl₂, 150 mM NaCl, pH 7,4 gemessen. Diese Daten erlauben die direkte Bestimmung der Affinität bei 37°C und die Berechnung der Affinität bei 25°C aus der van't Hoff-Gleichung. Die Daten in Tabelle 3 zeigen, daß die Affinitäten von SB 249417, BC2 und seinen anderen humanisierten Konstrukten innerhalb des Fehlers (ein Faktor von 2) gleich sind.
Tabelle 3 Titrationskalorimetrieergebnisse für Anti-FIX-mAbs
Die mAbs SB 249413, SB 249415, SB 249417 und SB 257732 wiesen alle sehr ähnliche thermische Stabilitäten gemäß Differentialrasterkalorimetrie auf. Ihre Entfaltungs-Tms-Werte reichten von 70–75°C, was eine hohe Stabilität gegen thermisch induzierte Denaturierung zeigte.
Beispiel 10
Mechanismus der Antikörper-vermittelten Inhibierung von Faktor IX
Eine Bibliothek von chimären Konstrukten, zusammengesetzt aus Sequenzen von Faktor IX, gespleißt in das Gerüst des homologen Proteins Faktor VII, wurde konstruiert und zur Kartierung des Epitops für den Faktor IX-BC2-mAb verwendet. Siehe Cheung et al., Thromb. Res. 80, 419–427 (1995). Die Bindung wurde unter Verwendung eines Oberflächen-Plasmonresonanzgerätes BiaCore 2000 gemessen. Der BC2-Antikörper wurde direkt an den Chip unter Verwendung der NHS/EDC-Reaktion gekuppelt. Die Bindung wurde durch 2 min Kontaktzeit bei 20 μl/min mit jeweils 200 nM der vorgegebenen Konstrukte in 25 mM MOPS, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 5 mM CaCl₂ gemessen. Die Dissoziation wurde für 3 min unter Verwendung des gleichen Puffers ohne Protein überwacht. Keine Bindung wurde zum Wildtyp-Konstrukt in Gegenwart von 50 mM EDTA detektiert. Die Daten sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4 Zusammenfassung der Bindung von Faktor IX-Konstrukten an BC2-Antikörper
Diese Daten zeigen, daß die Konstrukte, die die die leichte Kette von Faktor IX und die schwere Kette von Faktor VII enthalten (IX LC/VII HC); die Faktor IX gla- und aromatischen Stapeldomänen (IX-A/VII); die Reste 3–11 der Faktor IX gla-Domäne innerhalb der Faktor VII-gla-Domäne (VII gla (IX 3–11)/IX); und Faktor IX mit einer Lysin-zu-Alanin-Substitution am Rest 5 (IX K5A) Bindung an BC2 aufweisen. Das VII gla (IX 3–11)/IX-Konstrukt wies eine BC2-Bindung äquivalent zum Faktor IX vom Wildtyp (Plasma IXa und r-IX) auf. Somit bindet der BC2-Antikörper an ein Epitop, das innerhalb der Reste 3–11 der Faktor IX gla-Domäne enthalten ist.
Beispiel 11
Behandlung von arterieller Thrombose mit Anti-Faktor IX-Antikörper und Gewebe-Plasminogenaktivator
Die Verabreichung von tPA mit oder ohne adjunktive Therapien wurde eingeleitet nach vollständiger Okklusion der Karotisarterie. Blutfluß in der Arterie wurde kontinuierlich überwacht. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (Charles River, Raleigh, NC) mit einem Gewicht von 300–490 g wurden mit Natriumpentobarbital (55 mg/kg, i.p.) anästhesiert. Die Ratten wurden dorsal auf einen erwärmten (37°C) Operationstisch gelegt, und ein Einschnitt wurde am Hals vorgenommen; die Trachea wurde isoliert und mit einem PE-240 Intramedic-Schlauch als Kanüle versehen. Die linke Karotisarterie und Drosselvene wurden isoliert. Eine Parafilm M-Folie (4 mm², American National Can) wurde unter die Karotisarterie plaziert, und eine elektromagnetische Blutflußsonde (Carolina Medical) wurde auf die Arterie zur Messung des Blutflusses plaziert. Eine Kanüle (Tygon, 0,02'' × 0,04'', Norton Performance Plastics) wurde in die Drosselvene zur Wirkstoffverabreichung eingeführt. Die linke Femoralarterie wurde dann isoliert und zur Messung von Blutdruck und Entnahme von Blutproben mit einer Kanüle versehen.
Eine Thrombose in der Karotisarterie wurde mit einem kreisförmigen Pflaster mit einem Durchmesser von 6,5 mm aus Glas-Mikrofilterpapier eingeleitet, das mit FeCl₃-Lösung (50%ig) gesättigt war und auf die Karotisarterie stromabwärts der Durchflußsonde für 10 Minuten wie in Beispiel 3 beschrieben plaziert wurde. In diesem gut charakterisierten Modell ist die Thrombusbildung gewöhnlich innerhalb von 15 min beendet.
Der Anti-Faktor IX-Antikörper, SB 249415, wurde als Bolus in Kombination mit tPA (Genentech, South San Francisco, CA) verabreicht, während Heparin (Elkins-Sinn Inc., Cherry Hill, NJ) als Bolus gefolgt von einer Infusion verabreicht wurde. Alle Wirkstoffinfusionen wurden bis zum Ende des experimentellen Zeitraums fortgesetzt – 60 Minuten ab dem Zeitpunkt der Gefäßokklusion. Blutproben mit 1 ml wurden für den aPTT- und PT-Test bei 0, 30 und 60 min (Ende der Studie) aus der Femoralarterie in 3,8%iger Citratlösung aufgefangen und zentrifugiert. aPTT und Prothrombinzeit (PT) wurden durch ein Fibrometer (BB1L, Baxter Dade oder MLA Electra 800 Automatic Coagulation Timer) mit Standardverfahren überwacht. Am Ende des Experiments wurde der Thrombus aus der Karotisarterie extrahiert und gewogen.
Alle Daten werden als mittlere Gruppenwerte ± Standardfehler des Mittelwerts für die angegebene Anzahl von Ratten in jeder Gruppe dargestellt. ANOVA- und Bonferoni-Tests für multiple Vergleiche wurden für Analysen zwischen Gruppen verwendet und p < 0,05 als Signifikanz akzeptiert.
Die Bildung eines okklusiven Thrombus erfolgt ca. 15 min nach Einleitung der arteriellen Verletzung durch Anwendung des mit FeCl₃ behandelten Pflasters auf der Karotisarterie der Ratte. Wie in 10 gezeigt wird, wurde mit tPA allein eine Reperfusion des okkludierten Gefäßes nur nach Verabreichung einer Dosis von 9 mg/kg tPA beobachtet, wobei 67% der behandelten Gefäße eine Wiedereinstellung des Blutflusses während des 60-minütigen Protokolls aufwiesen. Bei dieser Dosis von tPA führte der Einschluß von 60 U/kg Heparin oder 3 mg/kg Anti-Faktor IX-Antikörper, SB 249415, nicht zu einer weiteren Zunahme des Auftretens von Reperfusion, was nahelegt, daß im Verletzungsmodell mit FeCl₃ ca. 30% der Thromben refraktär für Lyse sind.
Die Ergebnisse in 10 zeigen, daß bei geringeren Dosen von tPA das Auftreten von Reperfusion signifikant davon abhängig ist, welches Antikoagulans zusammen mit dem Thrombolytikum verabreicht wird. Wenn 60 U/kg Heparin verabreicht wurden, nahm der Prozentwert der Gefäße, die Reperfusion zeigen, dramatisch ab, wobei nur 12,5% und 40% Reperfusion mit 3 bzw. 6 mg/kg tPA beobachtet wurden. Gleichzeitige Verabreichung von 3 mg/kg SB 249415 mit dem tPA erreichte jedoch mehr als 60% Reperfusion mit 3 mg/kg tPA und 79% Reperfusion mit der Dosis von 6 mg/kg tPA. Somit verschiebt der Anti-Faktor IX-Antikörper die thrombolytische Dosis-Reaktions-Kurve signifikant, was eine Reperfusion bei geringeren Dosen des Thrombolytikums erlaubt.
Thrombolyse und Gerinnselbildung sind dynamische Prozesse, und Perioden von Durchgängigkeit gefolgt von Reokklusion wurden manchmal beobachtet. Da der Karotis-Blutfluß kontinuierlich während des 60-minütigen experimentellen Protokolls überwacht wurde, war es auch möglich, die Gesamtzeit der Karotisdurchgängigkeit zu quantifizieren. Wie in 11 gezeigt wird, ist der gesamte Zeitraum der Gefäßdurchgängigkeit wesentlich erhöht durch Kombination von 3 mg/kg Anti-Faktor IX-Antikörper plus tPA. Dies ist besonders ersichtlich bei den geringsten und den mittleren Dosen von tPA, 3 bzw. 6 mg/kg. Bei einer kombinierten Dosis von 3 mg/kg SB 249415 plus 3 mg/kg tPA betrug die gesamte Durchgängigkeitszeit 30,6 ± 9,2 min, verglichen mit 7,1 ± 7,1 min für die Kombination von 60 U/kg Heparin plus 3 mg/kg tPA. Die Durchgängigkeitszeit war Null bei allein 3 mg/kg tPA. Bei einer Dosis von 6 mg/kg tPA erhöht die gleichzeitige Verabreichung mit Heparin die Durchgängigszeit nur geringfügig auf 12,9 ± 6,0 min, wohingegen die Kombination tPA-SB 249415 eine maximale Durchgängigkeitszeit von 38,7 ± 8,4 min erreicht. Nur bei der höchsten Dosis von tPA (9 mg/kg) nähert sich die Heparinkombination der Durchgängigkeit an, die mit SB 249415 erreicht wird, 31,9 ± 4,8 min bzw. 38,0 ± 8,4 min.
Eine schnelle Wiederherstellung des Blutflusses nach arteriellem Infarkt ist kritisch zur Minimierung von Schädigung des ischämischen Gewebes. Die Ergebnisse in 12 zeigen, daß die Kombination von Anti-Faktor IX-Antikörper mit tPA zur einer verringerten Zeit bis zur Reperfusion führte, verglichen mit tPA allein oder Heparin plus tPA, und daß diese mit geringeren Dosen von tPA erreicht wird. Wenn Thrombolyse mit 3 mg/kg SB 249415 plus 3 mg/kg tPA bewirkt wurde, betrug die Zeit bis zur Thrombolyse 29,4 ± 9,2 min. Bei 3 mg/kg tPA allein wurde keine Reperfusion beobachtet. Bei 60 U/kg Heparin plus 3 mg/kg tPA betrug die Zeit bis zur Thrombolyse 52,8 ± 7,1 min. Bei höheren Dosen von tPA, 6 und 9 mg/kg, erreichte das Behandlungsschema mit Antikörper plus tPA eine anfängliche Thrombolyse in 19,4 ± 6,3 bzw. 20,8 ± 8,7 min. In Abwesenheit von hinzugegebenem Antikoagulans betrug die Zeit bis zur Thrombolyse 60 min (d.h. die Grenze des experimentellen Protokolls) und 27,5 ± 6,4 min für Dosen von 6 bzw. 9 mg/kg. Bei Zugabe von 60 U/kg Heparin betrugen die entsprechenden Zeiten bis zur Thrombolyse 44,0 ± 7,1 und 27,0 ± 4,9 min. Somit wurde mit SB 249415 immer eine frühere Reperfusion als mit Heparin oder mit tPA allein erreicht.
Beispiel 12
Wirkung von Anti-Faktor IX-Antikörper auf die hämostatische Funktion
Der Einfluß von Anti-Faktor IX oder Heparin als adjunktive Mittel auf die Erhaltung der hämostatischen Funktion wurde durch Überwachung der Spiegel von Fibrinogen, Plasminogen und alpha-2-Antiplasmin am Ende des Behandlungszeitraums in Ratten bestimmt, die mit tPA allein, tPA plus Heparin und tPA plus SB 249415 behandelt wurden, und die Ergebnisse wurden mit Tieren verglichen, die mit Träger behandelt wurden. Wie in 13 gezeigt wird, führten zunehmende Dosen von tPA zu verringerten Werten jedes der gemessenen hämostatischen Marker. alpha-2-Antiplasminspiegel fielen von ca. 90% in Tieren, die nicht mit tPA behandelt wurden, zu ca. 20%, wenn die Dosis von tPA auf 9 mg/kg erhöht wurde. Plasminogenspiegel fielen von durchschnittlich ca. 100% ohne tPA-Behandlung auf ca. 40% in der Behandlungsgruppe mit 9 mg/kg. In gleicher Weise fielen Fibrinogenspiegel von ca. 150 mg/dl auf ca. 90 mg/dl in der hochdosierten tPA-Gruppe. Interessanterweise scheint die Auswahl des adjunktiven Mittels keinen dieser Marker signifikant zu beeinflussen. Bei jeder tPA-Dosis wurden ähnliche Spiegel von alpha-2-Antiplasmin, Plasminogen und Fibrinogen in Tieren beobachtet, denen Träger, 30 oder 60 U/kg Heparin oder 1 oder 3 mg/kg SB 249415 gegeben wurde; die beobachtete Abnahme der hämostatischen Marker ist nur eine Funktion der Dosis des Thrombolytikums, tPA, und diese Abnahmen, speziell im Fall von Fibrinogen, scheinen besonders groß bei tPA-Dosen von mehr als 6 mg/kg zu sein, d.h. in der hochdosierten Gruppe mit 9 mg/kg.
Die Wirkungen der unterschiedlichen Behandlungsschemata auf den Standard-aPTT-Gerinnungstest wurden auch überwacht (14). Mit zunehmenden Dosen von tPA erhöhte sich der aPTT-Wert von 19,3 ± 0,6 s auf 30,3 ± 1,6 s für Träger bzw. 9 mg/kg tPA. Die Verabreichung von 3 mg/kg SB 249415 erzeugte eine beschränkte Zunahme des aPTT-Wertes der Kontrolltiere auf 49,6 ± 6,4 s. Wenn SB 249415 gleichzeitig mit tPA verabreicht wurde, war die beobachtete Zunahme geringfügig größer und abhängig von der tPA-Dosis. Die Kombination von SB 249415 mit 3 mg/kg tPA erzeugte einen aPTT-Wert von 58,3 ± 5,2 s, wohingegen die Kombination von SB 249415 mit der tPA-Dosis von 9 mg/kg den aPTT-Wert auf 77,3 ± 19,7 s erhöhte. Die Verabreichung der Heparin-Dosis von entweder 30 U/kg oder 60 U/kg führte zu starken Zunahmen des aPTT-Wertes. Ohne tPA reichte der aPTT-Wert von ca. 300 bis 600 s für Dosen von 30 bzw. 60 U/kg. In mit tPA behandelten Tieren betrug der aPTT-Wert ca. 800 s.
Die mit Heparin erhaltene Erhöhung des aPTT-Wertes, insbesondere bei Kupplung mit der Störung der hämostatischen Parameter aufgrund der Notwendigkeit für hohe Dosen von tPA zum Erreichen einer wirksamen Reperfusion, wird wahrscheinlich zu Blutungsanfälligkeiten beitragen. Umgekehrt verursacht SB 249415 keine größere Anhebung des aPTT-Wertes und ermöglicht die Verwendung geringerer Dosen von tPA, was einen signifikanten Vorteil in der thrombolytischen Therapie bei Myokardinfarkt und Schlaganfall liefert.
Beispiel 13
SB 249417 steigert das lytische Potential von Gewebe-Plasminogenaktivator bei Schlaganfall
Das in diesen Studien verwendete thromboembolische Schlaganfallsmodell in der Ratte war im wesentlichen wie beschrieben von Busch et al., Brain Research, 778, 16–24 (1997). Die drei Hauptschritte des Modells sind die Herstellung von Emboli, die Präparation der Ratte, gefolgt von der Embolisation, und der pharmakologische Eingriff.
Vollblut wurde aus einer Spenderratte in ein mit Citrat versetztes Vacutainer-Röhrchen entnommen. Das mit Citrat versetzte Blut (500 μl) wurde prompt in ein Reagenzglas, das 1 Einheit von Humanthrombin und 5 μl von 1 M CaCl₂ enthielt, auf eine CaCl₂-Endkonzentration von 10 mM gegeben. Innerhalb von 5–10 s wurde eine kleine Portion dieses Cocktails in einen PE50-Katheter mit einer Länge von ca. 15 cm abgezogen und bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerinnen gelassen. Am Ende des Zeitraums wurde das röhrenförmige Gerinnsel aus dem Katheter in eine mit Kochsalzlösung gefüllte Petrischale extrudiert und in Abschnitte von 1,5 mm Länge zerschnitten. 12 dieser Abschnitte (Gerinnsel) wurden in eine Kochsalzlösung überführt, die 0,04 mg/ml Rattenalbumin enthielt, und in einen PE50-Katheter in einem Volumen von –60 μl erneut aufgezogen. Die Gerinnsel wurden im Katheter zur Embolisation in der Ratte von oben nach unten aufgestellt.
Männliche Sprague Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 350–400 g wurden chirurgisch präpariert, um eine subkutane Dosis von Atropin (0,5 mg/kg) zu erhalten, und wurden dann mit 5% Isofluran anästhesiert, gefolgt von einer Erhaltungsdosis von 2%. Die Körpertemperatur wurde zwischen 37 und 38°C gehalten. Unter aseptischen Bedingungen wurde ein saggitaler Mittellinieneinschnitt im zervikalen Bereich gemacht, der die rechte gemeinsame Karotisarterie (CCA), rechte interne Karotisarterie (ICA), rechte externe Karotisarterie (ECA) und die Keilbeinflügel-Gaumen-Arterie freilegte. Die Keilbeinflügel-Gaumen-Arterie wurde abgebunden. Eine Länge der ECA wurde isoliert, dann abgebunden und geschnitten. Die CCA und ICA wurden geklammert, und der die Embolie enthaltende PE50-Katheter wurde in den ECA-Stumpf eingeführt und bis zur Zweiteilung vorgetrieben. Die ICA-Klammer wurde entfernt, und die Embolie wurden langsam in die ICA infundiert, während gleichzeitig die Klammer der CCA entfernt wurde. Die Infusion von entweder Träger (Kochsalzlösung), SB 249417 (2,0 mg/kg) und/oder tPA (5,0 mg/kg) wurde intravenös durch eine Schwanzvene 5 Minuten nach der Embolisation begonnen. SB 249417 wurde als Einzelbolusdosis infundiert, wohingegen die tPA-Dosis mit 5 mg/kg als 10%iger Bolus infundiert wurde, gefolgt von den verbleibenden 90% während 30 Minuten. Der chirurgische Einschnitt wurde verschlossen, und man ließ die Ratte sich erholen.
24 Stunden nach der Embolisation wurden die Ratten anästhesiert und getötet. Das Gehirn wurde entfernt, und sieben zerebrale Querschnitte wurden alle 2 mm ab dem frontalen zerebralen Pol vorgenommen. Die Schnitte wurden in 1%igem 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid für 20 Minuten inkubiert, gefolgt von Formalinfixierung. Die angefärbten zerebralen Schnitte wurden photographiert und unter Verwendung eines Bildanalysesystems (Optimus Inc., Bothell, Washington) analysiert. Das Infarktgebiet in mm² wurde durch Verfolgen der Infarktbildung auf dem Computerbildschirm mit einem unwissenden Operator berechnet. Der aggregierte mittlere Infarkt für jede Behandlung ist in 15 gezeigt (Kontrolle (n = 20), tPA (n = 7) und SB 249417 (n = 6)). Die Dosierung von Ratten nach dem Embolus mit tPA (5,0 mg/kg) verursachte eine Reduzierung von –33% im resultierenden mittleren Infarktvolumen. Die Verabreichung von SB 249417 allein verursachte eine –70%ige Reduzierung der resultierenden Infarktvolumina. Die Kombination von tPA (5,0 mg/kg) und SB 249417 (2,0 mg/kg) lieferte weiteren Schutz, der zu einer Reduzierung von –88% der mittleren Infarktvolumina (P = 0,126) führte. Infarkte in diesem Modell traten mit ähnlicher Häufigkeit im Striatum und Neokortex auf. Auf Basis des Ortes des infarktierten Gewebes schien der häufigste Okklusionsort die mittlere Zerebralarterie (MCA) zu sein. Obwohl weniger häufig, legte das Beweismaterial nahe, daß die Arteria cerebrales chorioidae, anterior und posterior gelegentlich ebenfalls okkludiert waren. Bei Betrachtung des koronalen Schnittes (Daten nicht gezeigt) war die Mehrzahl der Infarktvolumenreduzierung, die bei Behandlung auftrat, innerhalb des zentralen MCA-Perfusionsgebietes. Die Verteilung von infarktiertem Gewebe veränderte sich nicht merklich nach den Behandlungen.
Die Ergebnisse zeigen, daß ein Anti-Faktor IX-Antikörper wie SB 249417 bei Verabreichung nach Embolie die Bildung von infarktiertem Hirngewebe bei Verwendung als Monotherapie oder als Beigabe zu einem Thrombolytikum wie tPA reduzieren kann. Es wird erwartet, daß Anti-Faktor IX-Antikörper wie SB 249417 klinischen Nutzen in der Behandlung von thromboembolischem Schlaganfall entweder allein oder als Beigabe zu thrombolytischen Mitteln haben. Die Kombinationstherapie würde eine Reduzierung der Menge des Thrombolytikums und eine anschließende Reduzierung des Risikos der Förderung von hämorrhagischem Schlaganfall erlauben.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Antikörpers oder eines Fragments davon, ausgewählt aus (i) Antikörper SB249413, worin die schwere Kette die in SEQ ID NO: 31 dargestellte Aminosäuresequenz hat und die leichte Kette die in SEQ ID NO: 44 dargestellte Aminosäuresequenz hat; (ii) Antikörper SB249415, worin die schwere Kette die in SEQ ID NO: 52 dargestellte Aminosäuresequenz hat und die leichte Kette die in SEQ ID NO: 57 dargestellte Aminosäuresequenz hat; (iii) Antikörper SB249416, worin die schwere Kette die in SEQ ID NO: 52 dargestellte Aminosäuresequenz hat und die leichte Kette die in SEQ ID NO: 62 dargestellte Aminosäuresequenz hat; (iv) Antikörper SB249417, worin die schwere Kette die in SEQ ID NO: 52 dargestellte Aminosäuresequenz hat und die leichte Kette die in SEQ ID NO: 74 dargestellte Aminosäuresequenz hat; (v) Antikörper SB257731, worin die schwere Kette die in SEQ ID NO: 52 dargestellte Aminosäuresequenz hat und die leichte Kette die in SEQ ID NO: 78 dargestellte Aminosäuresequenz hat; (vi) Antikörper SB257732, worin die schwere Kette die in SEQ ID NO: 89 dargestellte Aminosäuresequenz hat und die leichte Kette die in SEQ ID NO: 99 dargestellte Aminosäuresequenz hat, und eines thrombolytischen Mittels, ausgewählt aus der Gruppe, die aus tPA, Urokinase und Streptokinase besteht, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von post-thromboembolisch induzierter Ischämie.
Verwendung gemäss Anspruch 1, worin der Antikörper SB249417 ist.
Verwendung gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das thrombolytische Mittel tPA ist.