CZ20023778A3 - Antitrombotická činidla - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předmětem tohoto vynálezu jsou monoklonální protilátky (mAb), které se vážou k lidskému koagulačnímu faktoru nebo kofaktoru, a jejich použití jakožto inhibitorů trombózy.

Dosavadní stav techniky

Za normálních okolností poranění, ať už malé nebo velké, vaskulárních endoteliálních buněk, jež tvoří výstelku krevních cév, spouští prostřednictvím sekvence událostí, která se obvykle označuje jako koagulační „kaskáda, hemostatickou odezvu. Uvedená kaskáda kulminuje při přeměně rozpustného fibrinogenu na nerozpustný fibrin, jenž spolu s krevními destičkami vytvoří lokalizovanou sraženinu, neboli trombus, který brání extravazaci krevních složek. Následně může dojít k hojení rány, po kterém následuje rozpuštění uvedené sraženiny a obnovení celistvosti krevní cévy a krevního toku.

Události, ke kterým dochází mezi poraněním a vytvořením sraženiny jsou pečlivě regulovány a řízeny sérií reakcí. Ve stručnosti je tento proces možné popsat tak, že za normálních okolností v krvi koluje mnoho proteinů v neaktivních proenzymových formách způsobujících koagulaci plazmy, a to spolu s různými kofaktory. V místě poranění dochází k vytvoření aktivních enzymových komplexů, které jsou postupně aktivovány na serinové proteasy, přičemž každá následující serinová proteasa katalyzuje za účelem aktivace proteasy další proenzym. Tato enzymatická kaskáda vede v každém stupni β β k zesílení účinku následujícího stupně. Pro přehledný popis koagulační kaskády je možné odkázat na první kapitolu publikace Thrombosis and Hemorrhage, editoři J. Loscalzo a A. Schafer, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Velká Británie (1994) .

Ačkoli účinné vytvoření sraženin omezuje ztrátu krve v místě poranění, nepřiměřená tvorba trombů v žílách a tepnách je obvykle příčinou invalidity a smrti. Abnormální srážlivá aktivita může vést k patologických stavům nebo k léčbě, jako je infarkt myokardu, nestabilní angína, fibrilace srdečních předsíní, mrtvice, poškození ledvin, perkutánní translumenální koronární angioplastika, roztroušená intravaskulární koagulace, sepse, pulmonární embólie a hluboká žilní trombóza, a/nebo může být výsledkem tohoto patologického stavu nebo léčby. Vytváření sraženin na površích umělých orgánů, umělých žil a protéz, jako jsou umělé srdeční chlopně, rovněž představuje vážný problém.

Mrtvice je hlavní příčinou smrti a běžnou příčinou trvalé invalidity. Akutní místní cerebrální ischemie vedoucí k neurologickým deficitům mrtvice jsou velmi často způsobeny tromboembolismem. Tromby mohou být vytvořeny ze srdečních zdrojů a ateromů. K in šitu trombóze může docházet ve velkých, extracerebrálnich cévách zásobujících mozek krví. Podle různých studií je možné předpokládat, že existuje určitý časový interval mezi vznikem cerebrální arteriální okluze a okamžikem, kdy dochází k výraznému nevratnému neuronovému poškození a trvalému neurologickému deficitu. Viz. kapitola 14 publikace Stroke Therapy: Basic, Preclinical, and Clinical • β & Ο u

0 0 φ · 0 » φ Φ 0

Φ φ φ φ Φ «ί φ « φ Φ Φ » 9 « 9 φ Φ * φ Φ Φ φ Φ Φ φ Φ Ο Φ Φ Φ

Ο © © φ Φ Φ φ © Φ φ Φ Φ 0 δί © « ΰ

Directíons, str. 355-381, editoři L. P. Miller, Wiley-Liss, lne. (1999).

Schválená antikoagulační činidla, která se v současnosti používají při léčení uvedených patologií a jiných trombotických a embolických poruch, zahrnují sulfatované heteropolysacharidy (heparin) a heparin o nízké molekulové hmotnosti (LMW heparin). Tato činidla se podávají parenterálně a mohou způsobit rychlou a úplnou inhibici srážení, a to aktivací inhibitoru trombinu, kterým je antitrombin III, a deaktivací všech koagulačních faktorů.

Avšak díky jejich účinnosti je s použitím heparinu a LMW heparinu spojeno několik nevýhod. Hlavní komplikací spojenou s užíváním heparinu a LMW heparinu je nekontrolované krvácení způsobené mírnou pohybovou zátěží a kontaktem s fyzickými objekty, který doprovází tuto zátěž, nebo ke kterému dochází v místě chirurgického zákroku, přičemž toto nekontrolované krvácení se vyskytuje u 1 až 7 procent pacientů užívajících kontinuální infúzi a u 8 až 14 procent pacientů, kteří užívají jednorázově podávané dávky. Za účelem minimalizace tohoto rizika se pacientovi nepřetržitě odebírají vzorky krve, které slouží pro ex vivo monitorování doby srážení krve, což podstatně přispívá k nákladům na celou terapii a k nepohodlí pro pacienta spojenému s touto léčbou.

Kromě toho rozsah terapeutického cíle pro dosažení požadované úrovně účinnosti, aniž by daný pacient byl vystaven riziku krvácení, je velmi úzký. Uvedený terapeutický rozsah je přibližně od 1 do méně než 3 mikrogramů heparinu/mililitr plazmy, což je dávka, která vede k dosažení času při testu ···

..¾ doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) v rozmezí od přibližně 35 sekund do přibližně 100 sekund. Při zvýšení koncentrace heparinu na 3 mikrogramy/mililitr plazmy dochází k vybočení z uvedeného cílového rozsahu a při koncentraci heparinu větší než 4 mikrogramy/mililitr plazmy není srážecí aktivita vůbec detekovatelná. Proto je tedy třeba věnovat velkou péči dodržení koncentrace heparinu v pacientově plazmě uvnitř uvedeného terapeutického rozsahu.

Dalším schváleným antikoagulačním činidlem s pomalejším a déle trvajícím účinkem je warfarin, což je derivát kumarinu. Warfarin působí tak, že soutěží s vitamin K-dependentn£ post-translační modifikací protrombinu a dalšími vitamin K-dependentními koagulačními faktory.

Jak v případě warfarinu, tak v případě heparinu a LMW heparinu je možné pozorovat obecný rys antikoagulačního účinku, kdy dochází k tomu, že krev se stává nesrážlivou při koncentracích uvedených sloučenin, které jsou jen mírně vyšší než je terapeutický rozsah dané sloučeniny.

Při akutním infarktu myokardu (MI) zahrnuje hlavní cíl trombolytické terapie časnou a trvalou reperfúzi cévy postižené infarktem. Současná terapie akutního infarktu myokardu (MI) zahrnuje použití jak aktivátoru plasminogenu, jako je aktivátor tkáňového plasminogenu (tPA) nebo streptokinasa, tak antikoagulačního činidla, jako jsou nefrakcionovaný heparin, heparin o nízké molekulové hmotnosti nebo přímé inhibitory trombinu nebo činidla proti shlukování krevních destiček, jako je aspirin nebo blokátor destičkového glykoproteinu Ilb/lIIa. Viz.publikace Topol, Am. Heart J., • · • · · <

..5

136, S66-S68 (1998) . Tato kombinace terapií je založena na pozorování, že tvorba sraženiny a její rozpouštění jsou dynamické procesy a na pozorování, že aktivita a tvorba trombinu pokračuje po vytvoření okluzívního trombu a během rozpouštění a po rozpuštění uvedené sraženiny. Viz. publikace Granger a spolupracovníci, J. Am. Coll. Cardiol., 31, 497-505

Γ (1998).

Optimální strategie pro léčbu akutního infarktu myokardu (MI) stále nebyla stanovena a v současné době dostupná činidla a postupy léčení vykazují jak negativní, tak pozitivní vlastnosti. Tak například trombin vázaný k fibrinu není citlivý k inhibici pomocí heparinu (Becker a spolupracovníci v kapitole 6 publikace Chemistry and Biology of Serpins,

Plenům Press, New York (1997)) a aktivita trombinu vykazuje zvýšení zpětné vaznosti po vysazení heparinové terapie s pozorovaným zvýšením opakovaného výskytu infarktu během 24 hodin po přerušení podávání heparinu. Viz. publikace Watkins a spolupracovníci, Catheterization and Cardiovascular Diagnosis, 44, 257-264 (1998) a Granger, Circulation, 91, 1929-1935 (1995). Kromě toho může. být použití činidel proti shlukování krevních destiček spojeno s krvácením nebo trombocytopenií.

Četné klinické testy rovněž prokázaly, že vysoké dávky trombolytických činidel vedly k výrazným změnám v hemostatických markérech plazmy. Viz. publikace Rao a spolupracovníci, J. Clin. Invest., 101, 10-14 (1988); Bovill a spolupracovníci, Ann. Int. Med., 115, 256-265 (1991); Neuhaus a spolupracovníci, J. Am. Coll. Cardiol., 19, 885-891 (1992).

Ačkoli zvýšení koncentrace tPa vede k podpoře rozpouštění • ·

sraženiny, změny v těchto hemostatických markérech se odrážejí ve zvýšené náchylnosti trombolytické terapie zejména k výskytu těžkého krvácení.

V případě tromboembolické mrtvice se za účelem zabránění nevratného poškození používá trombolytické terapie velmi časně (do 3 hodin) od nástupu symptomů mrtvice. Skupina trombolytických činidel, jež jsou v současné době schválena pro reperfúzi ischemické a/nebo infarzované tkáně, zahrnuje aktivátory plasminogenu tPA, urokinasu a streptokinasu. Avšak trombolytické terapie je spojená s náchylností k těžkému krvácení a hlavním problémem trombolytické terapie při tromboembolické mrtvici tak je, že uvedená léčba může vyvoláním krvácení ještě zhoršit ischemické poranění.

Je tedy zřejmé, že existuje poptávka po antitrombotických činidlech, která by byla účinná při likvidaci trombotických poruch při současném zachování hemostatických funkcí.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je způsob léčení posttromboembolicky indukované ischemie u živočichů, který zahrnuje podávání protilátky faktoru IX nebo fragmentu této protilátky.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je způsob léčení post-1romboembolicky indukované ischemie u živočichů, který zahrnuje podávání protilátky faktoru IX nebo fragmentu této protilátky v kombinaci s aktivátorem plasminogenu.

• · I ·· ·· ···

,.Ί

Dalším aspektem předmětného vynálezu je způsob snížení dávky trombolytického činidla potřebné při léčení posttromboembolicky indukované ischemie u živočichů, který zahrnuje podávání protilátky faktoru IX nebo fragmentu této protilátky v kombinaci s trombolytickým činidlem.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je způsob prevence tromboembolické mrtvice u živočichů, který zahrnuje podávání protilátky faktoru IX nebo fragmentu této protilátky živočichovi, který je vystaven riziku tromboembolické mrtvice.

Popis obrázků na výkresech

Na obrázku 1 je graf experimentálních výsledků zobrazující průběh titrace normální lidské plazmy myšími monoklonálními protilátkami (mAb) faktoru IX BC1 a BC2.

Na obrázku 2 je graf experimentálních výsledků zobrazující průběh titrace normální lidské plazmy myšími monoklonálními protilátkami (mAb) faktoru IX 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9.

Na obrázku 3 je graf experimentálních výsledků zobrazující průběh titrace normální lidské plazmy myšími monoklonálními protilátkami (mAb) faktoru X HFXHC a HFXLC a myší monoklonální protilátkou (mAb) faktoru XI HFXI.

Na obrázku 4 je histogram experimentálních výsledků zobrazující účinek heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myší monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX na čas dosažený při testu doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) • · • · · · ··· · * Ϊ a *·· ···· • * · • 9

v 60. minutě testu prováděného na krysím modelu trombózy krční tepny.

Na obrázku 5 je histogram experimentálních výsledků zobrazující účinek heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myší monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX na protrombinový čas v 60. minutě testu prováděného na krysím modelu trombózy krční tepny.

Na obrázku 6 je histogram experimentálních výsledků zobrazující účinek heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myší monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX na okluzi krevního toku v krční tepně u krysího modelu trombózy krční tepny.

Na obrázku 7 je histogram experimentálních výsledků zobrazující účinek heparinu, kyseliny acetylsalicylové a myší monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX na hmotnost trombu u krysího modelu trombózy krční tepny.

Na obrázku 8 je histogram experimentálních výsledků zobrazující účinek heparinu, myšího myší monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX BC2, chimérní monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX a humanizované monoklonální protilátky faktoru IX na aPTT v 60. minutě testu prováděného na krysím modelu trombózy krční tepny.

Na obrázku 9 je histogram experimentálních výsledků zobrazující účinek heparinu, myšího myší monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX BC2, chimérní monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX a humanizované monoklonální ► 4 » <

• ·· · • Q * * * • ·· y ·· ··· protilátky faktoru IX na hmotnost trombu u krysího modelu trombózy krční tepny.

Na obrázku 10 je histogram experimentálních výsledků zobrazující účinek monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX a heparinu na reperfúzi léčenou tPA.

Na obrázku 11 je histogram experimentálních výsledků zobrazující účinek monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX a heparinu na průchodnost krční tepny.

Na obrázku 12 je histogram experimentálních výsledků zobrazující účinek monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX a heparinu na dobu potřebnou k obnovení krevního toku.

Na obrázku 13 je znázorněn účinek tPA na hemostatické parametry, fibrinogen, plasminogen a antiplasmin.

Na obrázku 14 je znázorněn účinek tPA, heparinu a monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX na aPTT.

Na obrázku 15 je znázorněn účinek tPA, látky SB 249417 a směsi tPA a látky SB 249417 na střední hodnotu plochy infarzované tkáně u tromboembolické mrtvice.

V následujícím textu jsou podrobně popsány jednotlivé aspekty předmětného vynálezu.

Obsah všech publikací, včetně patentů a patentových přihlášek, citovaných v tomto popisu je zahrnut v tomto textu jako odkazový materiál.

«· ··· ·

Předmětem tohoto vynálezu jsou různé protilátky, změněné protilátky a jejich fragmenty zaměřené proti koagulačním faktorům, které jsou charakteristické samoomezovacím neutralizačním účinkem. Ve výhodném provedeni je uvedený koagulační faktor členem vlastní nebo společné koagulační kaskády. Nejvýhodněji jsou uvedené protilátky koagulačního faktoru vybrané ze skupiny zahrnující protilátky faktoru IX, protilátky faktoru IXa, protilátky faktoru X, protilátky faktoru Xa, protilátky faktoru XI, protilátky faktoru Xla, protilátky faktoru VIII, protilátky faktoru Vlila, protilátky faktoru V, protilátky faktoru Va, protilátky faktoru VII, protilátky faktoru Vila, protilátky trombinu a protilátky protrombinu. Zvlášť výhodné jsou protilátky faktoru IX. Jako příklad protilátky koagulačního faktoru je možné uvést humanizované monoklonální protilátky SB 249413, SB 249415,

SB 249416, SB 249417, SB 257731 a SB 257732 zaměřené proti lidskému faktoru IX, chimérní monoklonální protilátku chaFIX zaměřenou proti lidskému faktoru IX, myší monoklonální protilátky BC1, BC2, 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9, jež jsou zaměřené proti lidskému faktoru IX a/nebo faktoru IXa, nebo myší monoklonální protilátky HFXLC a HFXI, které jsou zaměřené proti lidskému faktoru X, respektive proti lidskému faktoru XI. Zvlášť výhodná je monoklonální protilátka lidského faktoru IX SB 249417.

Protilátky podle předmětného vynálezu je možné připravit běžnými hybridomovými technikami, pomocí kombinatorických knihoven vykazujících účinky bakteriofágu, posouváním řetězce imunoglobulinu a humanizačními technikami vedoucími k vytvoření nových samoomezujicích neutralizačních protilátek.

»· ··· · ··· 9

..*1

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají rovněž plně lidské monoklonální protilátky (mAb) mající samoomezující neutralizační účinek. Tyto produkty je možné použít v terapeutických a farmaceutických kompozicích určených pro léčení trombotických a embolických poruch spojených s infarktem myokardu, nestabilní angínou, fibrilací srdečních předsíní, mrtvicí, poškozením ledvin, pulmonární embolií, hlubokou žilní trombózou, perkutánní translumenální koronární angioplastikou, roztroušenou intravaskulární koagulací, sepsí, umělými orgány, umělými žílami a protézami.

Výrazem „samoomezující neutralizační účinek se v tomto textu rozumí účinek protilátky, která se váže k lidskému koagulačnímu faktoru, jenž je výhodně součástí vlastní nebo společné koagulační kaskády, jejichž skupina zahrnuje faktor IX/lXa, faktor X/Xa, faktor Xl/XIa, faktor VlIl/VIIIa, faktor V/Va, faktor VlI/VIIa a trombin/protrombin, přičemž tato protilátka inhibuje trombózu takovým způsobem, že dochází jen k omezenému snížení srážlivosti krve. Výrazem „omezené snížení srážlivosti krve se v tomto textu rozumí, že dochází k prodloužení doby srážení, což se projevuje naměřením delšího času při testu doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT), kdy plazma zůstává srážlivá s dosažením určité maximální hodnoty při aPTT i přes zvýšení koncentrací monoklonální protilátky. Toto omezené snížení srážlivosti krve je opakem případu, kdy se plasma stává nesrážlivou a vykazuje neurčitou hodnotu při aPTT v přítomnosti zvyšující se koncentrace heparinu. Ve výhodném provedení tohoto vynálezu spadají maximální hodnoty naměřené při aPTT prováděných při využití způsobů podle předmětného vynálezu do terapeutického rozsahu heparinu. V nejvýhodnějším provedení je maximální • « · · · · • ·· · ·

..12 ·, naměřená hodnota při aPTT v rozmezí od přibližně 35 sekund do přibližně 100 sekund, což odpovídá přibližně 1,5- až přibližně 3,5násobnému zvýšení normální hodnoty naměřené při srovnávacím testu aPTT. Při jednom z provedení tohoto vynálezu je doba naměřená při aPTT prodloužena, aniž by došlo k výraznému prodloužení protrombinového času (PT).

Výrazem „v kombinaci s se v tomto textu rozumí podávání jednoho terapeutického činidla před, po nebo souběžně s podáním jiného terapeutického, činidla během jediného průběhu léčby.

Výrazem „změněná protilátka se v tomto textu rozumí protein kódovaný změněným kódujícím úsekem imunoglobulinu, kterou je možné získat exprimovánim ve vybrané hostující buňce. Takovýmito změněnými protilátkami jsou uměle vytvořené protilátky (jako jsou například chimérní nebo humanizované protilátky) nebo fragmenty protilátek postrádající celý nebo část konstantního úseku imunoglobulinu, např. Fv, Fab, Fab' nebo F(ab')₂ apod.

Výrazem „změněný kódující úsek imunoglobulinu se v tomto textu rozumí sekvence nukleových kyselin kódující změněnou protilátku podle předmětného vynálezu. Pokud je uvedenou protilátkou CDR-roubovaná nebo humanizovaná protilátka, jsou do prvního imunoglobulinového partnera zahrnujícího variabilní sekvence lidského základního rámce inzerovány sekvence z nelidského imunoglobulinu, které kódují úseky určující komplementaritu (CDR). Případně je uvedený první imunoglobulinový partner operativně spojen s druhým imunoglobulinovým partnerem.

·· ·♦·· ··· « · · «

Ί·Ό · · · • ·#-° ♦· ··« „Prvním imunoglobulinovým partnerem se v tomto textu rozumí sekvence nukleových kyselin, která kóduje variabilní úsek lidského základního rámce nebo variabilní úsek lidského imunoglobulinu, ve které jsou nativní (neboli přirozeně se vyskytující) CDR-kódující oblasti nahrazeny CDR-kódujícími oblastmi dárcovské protilátky. Uvedeným variabilním lidským úsekem může být těžký řetězec imunoglobulinu, lehký řetězec imunoglobulinu (nebo oba tyto řetězce), jejich analog nebo funkční fragmenty těchto řetězců. Takovéto CDR oblasti, jež jsou umístěny ve variabilních úsecích protilátek (imunoglobulinů), je možné stanovit způsoby, které jsou v dané oblasti techniky známé. Tak například v publikaci Rabat a spolupracovníci „Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. vydání, US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) jsou popsány pravidla pro lokalizaci CDR. Kromě toho existují počítačové programy, které jsou užitečné při identifikaci CDR oblastí/ struktur.

„Druhým imunoglobulinovým partnerem se v tomto textu rozumí další nukleotidová sekvence kódující protein nebo peptid, ke kterému je rámcově nebo prostřednictvím případných běžných spojovacích sekvencí (tj. operativně) připojen uvedený první imunoglobulinový partner. Ve výhodném provedení se jedná o gen imunoglobulinu. Uvedený druhý imunoglobulinový partner může obsahovat sekvenci nukleových kyselin kódující celý konstantní úsek pro stejnou (tj . homologní úsek, ve kterém je první i druhá změněná protilátka odvozena ze stejného zdroje) nebo další (tj. heterologní úsek) protilátky. Uvedeným druhým imunoglobulinovým partnerem může být těžký nebo lehký řetězec ·· · · · · .4*4 imunoglobulinu (nebo oba tyto řetězce ve formě částí jediného peptidů). Povaha druhého imunoglobulinového partnera není omezena na konkrétní třídu nebo na konkrétní izotyp imunoglobulinu. Dále může druhý imunoglobulinový partner podle tohoto vynálezu zahrnovat část konstantního úseku imunoglobulinu, jako je tomu například u Fab nebo F(ab)₂ (tj . diskrétní část příslušného lidského konstantního úseku nebo příslušné úseky lidského základního rámce). Takovýto druhý imunoglobulinový partner může rovněž zahrnovat sekvenci kódující protein integrální membrány vystavený na vnějším povrchu hostitelské buňky, např. jakožto část knihovny vykazující účinky bakteriofágu, nebo sekvenci kódující protein pro analytickou a diagnostickou detekci, jako je například křenová peroxidasa, β-galaktosidasa atd.

Výrazy „Fv, Fc, Fd, Fab, Fab' nebo F(ab)₂ se v tomto textu používají ve svých obvyklých významech. V této souvislosti je možné odkázat například na publikaci Harlow a spolupracovníci, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988).

Výrazem „uměle vytvořená protilátka se v tomto textu rozumí typ změněné protilátky, tj. protilátky s plně syntetickým řetězcem (jako je například chimérní nebo humanizovaná protilátka, jež je opakem fragmentu protilátky), ve které je část variabilních domén v lehkém a/nebo těžkém řetězci vybrané akceptorové protilátky nahrazena analogickými částmi z jedné nebo více dárcovských (donorových) protilátek, které mají specifitu k vybranému epitopu. Takovéto molekuly mohou například zahrnovat protilátky charakteristické humanizovaným těžkým .řetězcem, jenž je spojený . o

• © · · · • · · · ·· ©· ···* ·· s nemodifikovaným lehkým řetězcem (nebo s chimérním lehkým řetězcem) a naopak. Uměle vytvořené protilátky mohou být rovněž charakteristické změnami sekvence nukleových kyselin, která kóduje variabilní úseky doménového rámce lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové protilátky, a to za účelem zachování vazné specifity dárcovské (donorové) protilátky.

Tyto protilátky mohou zahrnovat zde popsanou výměnu jedené nebo více CDR (výhodně všech) z akceptorové protilátky za CDR z dárcovské (donorové) protilátky.

Výrazem „chimérní protilátka se v tomto textu rozumí taková uměle vytvořená protilátka, která obsahuje přirozeně se vyskytující variabilní úsek (lehkého nebo těžkého řetězce) odvozený od dárcovské (donorové) protilátky ve spojení s konstantními úseky lehkého a těžkého řetězce odvozenými od akceptorové protilátky.

Výraz „humanizovaná protilátka označuje v tomto textu takový typ uměle vytvořené protilátky, jejíž CDR jsou odvozené od nelidského dárcovského (donorového) imunoglobulinu, a zbývající části molekuly, které jsou odvozeny od imunoglobulinu, jsou odvozeny od jednoho nebo více lidských imunoglobulinů. Dále je za účelem zachování vazné afinity možné změnit zbytky podporující základní rámec. V této souvislosti je možné odkázat například na publikace Queen a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10032 (1989) a Hodgson a spolupracovníci, Bio/TEchnology, 9, 421 (1991).

Výrazem „dárcovská (donorová) protilátka se v tomto textu rozumí monoklonální nebo rekombinantní protilátka, která ·* 0000

0· » 9 9 9

0 0 00 přispívá sekvencemi nukleových kyselin svých variabilních úseků, CDR nebo jinými funkčními fragmenty nebo jejich analogy prvnímu imunoglobulinovému partnerovi, takže vzniká úsek kódující změněný imunoglobulin, což vede k expresi změněné protilátky s antigenní specificitou a neutralizačním účinkem, jež jsou charakteristické pro uvedenou dárcovskou (donorovou) protilátku. Jednou z dárcovských (donorových) protilátek, které jsou vhodné pro použití podle tohoto vynálezu, je myší samoomezující monoklonální protilátka označovaná jako BC2. Skupina dalších vhodných dárcovských (donorových) protilátek zahrnuje myší samoomezující monoklonální protilátky označované jako BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC a HFXI.

Výrazem „akceptorová protilátka se v tomto textu rozumí monoklonální nebo rekombinantní protilátky, jež jsou heterologické k uvedené dárcovské protilátce a které všemi nebo částí sekvencí nukleových kyselin kódujících úseky základních rámců jejich těžkého a/nebo lehkého řetězce a/nebo konstantní úseky jejich těžkého a/nebo lehkého řetězce přispívají prvnímu imunoglobulinovému partnerovi. Ve výhodném provedení je uvedenou akceptorovou protilátkou lidská protilátka.

Zkratka „CDR se v tomto textu používá pro označení úseků aminokyselinových sekvencí protilátky určujících komplementaritu, přičemž těmito úseky jsou hypervariabilní úseky těžkého a lehkého řetězce imunoglobulinu. V této souvislosti je možné odkázat například na publikaci Rabat a spolupracovníci, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. vydání, US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987) . Ve variabilní >· ···· »· ·· • · · · · · « · · · · ·»· 9 · · · *

T·^ · · · ♦ r¹- ' 99 9999

• a

Λ části imunoglobulinu existují tři CDR v těžkém řetězci a tři CDR v lehkém řetězci. Zde používaná zkratka „CDR tedy označuje všechny tři CDR v těžkém řetězci, nebo všechny tři CDR v lehkém řetězci nebo, pokud je to vhodné, všechny CDR v těžkém i lehkém řetězci.

CDR poskytují většinu kontaktních zbytků pro vázání protilátky k antigenu nebo epitopu. CDR zajímavé z hlediska předmětného vynálezu jsou odvozeny od variabilních sekvencí těžkého a lehkého řetězce dárcovské (donorové) protilátky a jejich skupina zahrnuje analogy přirozeně se vyskytujících CDR, jejichž analogy rovněž sdílí nebo si uchovávají vaznou specifitu ke stejnému antigenu a/nebo stejnou neutralizační schopnost jako dárcovská (donorová) protilátka, od které jsou odvozeny.

Výrazem „sdílet vaznou specifitu k antigenu nebo neutralizační schopnost se v tomto textu například rozumí, že ačkoli mohou mAb BC2 být charakteristické určitou mírou samoomezujícího neutralizačního účinku, CDR kódované nukleokyselínovou sekvenci BC2 v příslušném strukturním prostředí může vykazovat nižší nebo vyšší účinek. Nicméně se předpokládá, že CDR BC2 v takovýchto prostředích rozeznají stejný(é) epitop(y) jako BC2.

Výraz „funkční fragment se v tomto textu používá pro označení části variabilní sekvence těžkého nebo lehkého řetězce (např. malé delece na N- nebo C-konci proměnlivé oblasti imunoglobulinu), která si zachovává vaznou specifitu ke stejnému antigenu a/nebo stejnou neutralizační schopnost jako protilátka, od které byl uvedený fragment odvozen.

• · • · · · ··: ·:

• · · ·

Výrazem „analog se rozumí aminokyselinová sekvence modifikovaná alespoň jednou aminokyselinou, kdy uvedenou modifikací může být chemická modifikace nebo substituce nebo přesmyk několika aminokyselin (tj. maximálně 10 aminokyselin), přičemž uvedená modifikace umožňuje, aby si daná aminokyselinová sekvence zachovala biologické vlastnosti, jako je například specifita a vysoká afinita k antigenu, nemodifikované sekvence. Příkladem takovýchto analogů jsou tiché mutace, které je možné vytvořit, pomocí substitucí, za účelem vytvoření restrikčních míst pro určité endonukleasy nacházejících se uvnitř nebo v okolí oblastí kódujících CDR.

Analogy mohou rovněž vznikat jakožto alelické modifikace. „Alelickou změnou nebo modifikací je změna aminokyselinové sekvence kódující aminokyselinovou nebo peptidovou sekvenci podle předmětného vynálezu. Takovéto změny nebo modifikace mohou být způsobeny degenerací genetického kódu nebo mohou být vytvořeny záměrně, a to za účelem zajištění požadovaných vlastností. Uvedené změny nebo modifikace mohou nebo naopak nemohou vést ke změnám v jakékoli kódované aminokyselinové sekvenci.

Výrazem „efektorová činidla se rozumí neproteinové nosné molekuly, se kterými mohou být běžnými prostředky spojeny změněné protilátky a/nebo přírodní nebo syntetické lehké nebo těžké řetězce dárcovské (donorové) protilátky nebo jiné fragmenty dárcovské (donorové) protilátky. Skupina takovýchto neproteinových nosičů může obsahovat běžné nosiče, které se používají v oblasti diagnostiky, jako jsou například polystyrénové nebo jiné plastové kuličky, polysacharidy, jako

1Ϊ9 • · · jsou například polysacharidy používané v systému BIAcore (Pharmacia), nebo jiné neproteinové látky, jež jsou užitečné v oblasti medicíny a jejichž podávání je bezpečné pro lidi a zvířata. Skupina dalších efektorových činidel může zahrnovat makrocyklus pro chelataci a komplexaci atomu těžkého kovu nebo radioizotopu. Uvedená efektorová činidla mohou být rovněž užitečná pro zvýšení poločasu biologické životnosti změněných protilátek (příkladem tohoto typu efektorového činidla je polyethylenglykol).

Pro použití při konstrukci protilátek, změněných protilátek a fragmentů podle předmětného vynálezu je možné využít látky nelidského původu, jako jsou látky pocházející z telat, ovcí, opic, kuřat, hlodavců (např. z myší nebo krys), po jejichž kontaktu s lidským koagulačním faktorem, kterým je výhodně faktor IX/lXa, faktor X/Xa, faktor Xl/XIa, faktor VlII/VIIIa, faktor V/Va, faktor VlI/VIIa nebo trombin/protrombin nebo peptidový epitop pocházející z některé z těchto látek, dochází k vytvoření požadovaného imunoglobulinu. Pro vytvoření hybridomové buněčné linie, která vylučuje nelidskou monoklonální protilátku (mAb) daného koagulačního faktoru, se používají běžné hybridomové techniky. Uvedené hybridomy se následně hromadně testují na vaznost s použitím faktoru IX/IXa, faktoru X/Xa, faktoru Xl/XIa, faktoru VlII/VIIIa, faktoru V/Va, faktoru VlI/VIIa nebo trombinu/protrombinu naneseného v 96jímkových platech, jak je popsáno dále v příkladech provedení vynálezu, nebo alternativně s použitím biotinylovaného faktoru IX/IXa, faktoru X/Xa, faktoru Xl/XIa, faktoru VlII/VIIIa, faktoru V/Va, faktoru VlI/VIIa nebo trombinu/protrombinu vázaného k platu potaženému streptavidinem. V alternativním • · ···<

• · · případě je možné odborníkovi známými technikami vytvářet zcela lidské monoklonální protilátky (mAb) a použít je při uskutečňování předmětného vynálezu.

Jedním z příkladů samoomezovací neutralizační monoklonální protilátky (mAb) podle předmětného vynálezu je mAb BC2, což je myší protilátka, kterou je možné použít pro vývoj chimérní nebo humanizované sloučeniny. Uvedená monoklonální protilátka (mAb) BC2 je charakteristická samoomezovacím inhibičním účinkem na dobu srážení krve. Podle měření testem aPTT se účinek mAb BC2 na dobu srážení krve projeví v její maximální hodnotě, která činí přibližně 100 sekund. Monoklonální protilátka (mAb) BC2 váže rovněž faktor IXa, inhibuje přeměnu faktoru IX na faktor IXa a inhibuje účinek faktoru IXa. Pro dosažení požadovaného účinku jsou zapotřebí kofaktory, kterými jsou dvoumocné kovy, přičemž uvedená mAb preferuje vápenaté ionty (Ca²⁺) před manganatými ionty (Mn²⁺) . Hodnota IC₅₀ naměřená při testu aPTT je přibližně 50 nM. Uvedená monoklonální (mAb) protilátka BC2 vykazuje druhovou křížovou reaktivitu s krysami a je označována jako izotyp IgG2a.

Dalšími požadovanými donorovými protilátkami podle tohoto vynálezu jsou myší monoklonální protilátky (mAb) BC1, 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9. Tyto monoklonální protilátky (mAb) jsou charakteristické samoomezovacím inhibičním účinkem na dobu srážení krve. Podle měření testem aPTT se účinek těchto mAb na dobu srážení krve projeví v její maximální hodnotě, která činí přibližně 90 až 100 sekund v případě 9E4(2)F4 a přibližně 80 sekund v případě 11G4(1)B9. Monoklonální protilátka (mAb)

BC1 váže rovněž faktor IXa, inhibuje účinek faktoru IXa, avšak neinhibuje přeměnu faktoru IX na faktor IXa. Pro dosažení ϊι • · · t « účinu této protilátky není nutná přítomnost kovového kofaktoru. Hodnota IC₅₀ naměřená při testu aPTT je pro protilátku BC1 přibližně 35 nM. Uvedená monoklonální (mAb) protilátka BC1 je označována jako izotyp IgGl.

Další požadovanou donorovou protilátkou podle tohoto vynálezu, která je charakteristická samoomezovacím inhibičním účinkem na dobu srážení krve, je myší monoklonální protilátka (mAb) HFXLC. Podle měření testem aPTT se účinek mAb HFXLC na dobu srážení krve projeví v její maximální hodnotě, která činí přibližně 50 až 60 sekund. Monoklonální protilátka (mAb) HFXLC váže lehký řetězec faktoru X a inhibuje účinek faktoru X/Xa. Hodnota IC₅₀ naměřená při testu aPTT je pro protilátku HFXLC přibližně 20 nM.

Další požadovanou donorovou protilátkou podle tohoto vynálezu, která je charakteristická samoomezovacím inhibičním účinkem na dobu srážení krve, je myší monoklonální protilátka (mAb) HFXI. Podle měření testem aPTT se účinek mAb HFXI na dobu srážení krve projeví v její maximální hodnotě, která činí přibližně 100 sekund. Monoklonální protilátka (mAb) HFXI váže faktor XI a inhibuje účinek faktoru Xl/XIa. Hodnota IC₅₀ naměřená při testu aPTT je pro protilátku HFXLC přibližně 3 0 nM.

Bez omezení na jakoukoli teorii týkající se mechanismu účinku se zdá, že uvedené monoklonální protilátky (mAb) regulují koagulaci nekompetitivním, neboli alosterickým mechanismem, při kterém je dosaženo pouze částečné inhibice.

• ·

Předmětný vynález není omezen jen na použití BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI nebo jejich hypervariabilnich (tj. CDR) sekvencí. Místo těchto protilátek je podle předmětného vynálezu možné použít jakékoli vhodné protilátky s vysokou afinitou, které jsou charakteristické samoomezovacím neutralizačním účinkem, a odpovídající CDR. V následujícím popisu je donorová protilátka označována jako BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC nebo HFXI pouze pro ilustraci a pro zjednodušení popisu.

Do rozsahu předmětného vynálezu spadá rovněž použití Fab fragmentů nebo F(ab')₂ fragmentů odvozených od monoklonálních protilátek (mAb) namířených proti příslušnému lidskému koagulačnímu faktoru nebo kofaktoru. Tyto fragmenty jsou užitečné jakožto činidla vykazující samoomezovací neutralizační účinek proti koagulačním faktorům, výhodně proti faktoru IX/lXa, faktoru X/Xa, faktoru Xl/XIa, faktoru VlII/VIIIa, faktoru V/Va, faktoru VlI/VIIa nebo trombinu/protrombinu. Fab fragment obsahuje celý lehký řetězec a N-koncovou část těžkého řetězce. F(ab')₂ fragment je fragment tvořený dvěma Fab fragmenty vázanými disulfidovými vazbami. Monoklonální protilátky BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC a HFXI a další podobné protilátky s vysokou afinitou poskytují zdroje Fab fragmentů a F(ab')₂ fragmentů, které je možné získat běžnými prostředky, jako například štěpením dané mAb vhodnými proteolytickými enzymy, papainem a/nebo pepsinem, nebo rekombinantními metodami. Tyto Fab a F(ab')2 fragmenty jsou samy o sobě užitečné jakožto terapeutická, profylaktická nebo diagnostická činidla a jakožto donory sekvencí obsahujících variabilní úseky a CDR sekvencí, které jsou užitečné pro • · ··· • · ·· < • · · • · • « • « «

0« «1 vytváření rekombinantních nebo humanizovaných protilátek podle tohoto vynálezu.

Uvedené Fab a F(ab')₂ fragmenty je možné vytvořit pomocí kombinatorické knihovny vykazující znaky bakteriofágu (viz. například publikace Winter a spolupracovníci, Ann. Rev.

Iiíwnunol. , 12, 433-455 (1994)) nebo pomocí přesouvání řetězce imunoglobulinu (viz. například Marks a spolupracovníci, Bio/Technology, 10, 779-783 (1982), kdy Fd nebo V_H imunoglobulinu z vybrané protilátky (např. BC2) jsou ponechány spojit se s repertoárem lehkého řetězce imunoglobulinů, V_L (nebo V_K) , za vzniku nových Fab fragmentů, přičemž obsah obou výše citovaných publikací je zahrnut v tomto textu jako odkazový materiál. Naopak lehký řetězec imunoglobulinu z vybrané protilátky může být ponechán spojit se s repertoárem těžkého řetězce imunoglobulinu, V_H (nebo Fd) , za vzniku nových Fab fragmentů. Samoomezovací neutralizační faktor IX Fab fragmenty je možné získat ponecháním Fd monoklonální protilátky (mAb) BC2 spojit se s repertoárem lehkého řetězce imunoglobulinu. Proto je tedy možné pomocí techniky přesouvání řetězce izolovat neutralizační Fab faktory s jedinečnými sekvencemi (nukleotidovými a aminokyselinovými).

Uvedená monoklonální protilátka (mAb) BC2 nebo ostatní shora popsané protilátky mohou přispívat sekvencemi, jako jsou variabilní peptidové sekvence těžkého a/nebo lehkého řetězce, sekvence základního rámce, CDR sekvence, funkční fragmenty, jejich analogy a nukleokyselinové sekvence, jež kódují uvedené sekvence, které jsou užitečné při vytváření a získávání různých změněných protilátek, jež jsou charakteristické vaznou specificitou k antigenu dané donorové protilátky.

··

S4

Nukleokyselinové sekvence podle předmětného vynálezu nebo jejich fragmenty kódující uvedené peptidové sekvence lehkého a těžkého řetězce jsou rovněž užitečné pro mutagenní zavedení specifických změn uvnitř nukleokyselinových sekvencí kódujících CDR nebo úseky základního rámce a pro vpravení vzniklé modifikované nebo fúzní nukleokyselinové sekvence do plazmidu za účelem exprese. Tak například tiché substituce v nukleotidové sekvenci kódující úseky základního rámce a CDR je možné použít pro vytvoření restrikčních enzymových míst, které usnadňují inzerci mutagenizovaných CDR a/nebo úseků základního rámce. Tyto CDR kódující oblasti je možné použít při vytváření humanizovaných protilátek podle předmětného vynálezu.

Nukleo- a aminokyselinové sekvence variabilního úseku těžkého řetězce BC2 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 5 a 7. CDR sekvence z této oblasti jsou uvedeny v SEQ ID NO: 8, 9 a 10.

Pokud se vezmou v úvahu degenerativní změny v genetickém kódu, je možné vytvořit různé kódující sekvence, které kódují variabilní aminokyselinové a CDR sekvence těžkého a lehkého řetězce podle předmětného vynálezu a jejich funkční fragmenty a analogy, které sdílejí specifitu ke stejnému antigenu jako daná donorová protilátka. Izolované nukleokyselinové sekvence podle předmětného vynálezu nebo jejich fragmenty, které kódují peptidové sekvence variabilního řetězce nebo CDR, je možné použít pro přípravu změněných protilátek, jako jsou například chimérní nebo humanizované protilátky nebo jiné uměle vytvořené protilátky podle tohoto vynálezu, a to v případě kdy ·« ···· ··· · · tyto jsou operativně zkombinovány s druhým imunoglobulinovým partnerem.

Na tomto místě je třeba poznamenat, že kromě izolovaných nukleokyselinových sekvencí, které kódují části uvedené změněné protilátky a zde popsaných protilátek, spadají do rozsahu tohoto vynálezu další nukleokyselinové sekvence, jako jsou nukleokyselinové sekvence, jež jsou komplementární k nativním sekvencím kódujícím CDR nebo jež jsou komplementární k modifikovaným úsekům lidského základního rámce obklopujícím oblasti kódující CDR. Skupina DNA sekvencí použitelných podle tohoto vynálezu zahrnuje DNA sekvence, které hybridizují za stringentních hybridizačních podmínek k uvedeným DNA sekvencím. V této souvislosti je možné odkázat na publikaci T Maniatis a spolupracovníci, Molecular Cloning:

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour laboratory (1982), str. 387-389. Jako příklad uvedených stringentních hybridizačních podmínek je možné uvést hybridizaci v 4XSSC při teplotě 65 °C, po které následuje promývání v O,1XSSC při teplotě 65 °C po dobu jedné hodiny. Alternativním příkladem stringentních hybridizačních podmínek je hybridizace v 50procentním formamidu a 4XSSC při teplotě 42 °C. Ve výhodném provedení tohoto vynálezu obsahují uvedené hybridizující DNA sekvence alespoň přibližně 18 nukleotidů, tj. jejich velikost odpovídá přibližně CDR.

Změněné imunoglobuliny mohou kódovat změněné protilátky, jejichž skupina zahrnuje uměle vytvořené protilátky, jako jsou chimérní protilátky a humanizované protilátky. Požadovaná oblast kódující změněný imunoglobulin obsahuje oblasti kódující CDR, které kódují peptidy mající antigenovou

9 $6

9999 ’

• · • · «·· · · ·· ···· specificitu protilátky faktoru IX/lXa, faktoru X/Xa, faktoru Xl/XIa, faktoru VlII/VIIIa, faktoru V/Va, faktoru VlI/VIIa nebo trombinu/protrombinu, výhodně pak kódují protilátku s vysokou afinitou, jako jsou protilátky podle tohoto vynálezu, inzerované do prvního imunoglobulinového partnera, jako je variabilní úsek lidského základního rámce nebo lidského imunoglobulinu.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je uvedený první imunoglobulinový partner operativně vázán k druhému imunoglobulinovému partnerovi.

Uvedený druhý imunoglobulinový partner byl definován výše a může obsahovat sekvenci kódující druhý úsek dané protilátky, jako je například úsek Fc. Druzí imunoglobulinoví partneři mohou rovněž obsahovat sekvence kódující jiný imunoglobulin, ke kterému je v základním rámci nebo prostřednictvím spojovací sekvence připojen konstantní úsek lehkého nebo těžkého řetězce. Uměle vytvořené protilátky namířené proti funkčním fragmentům nebo analogům koagulačních faktorů mohou být navrženy tak, aby vyvolaly zvýšenou vaznost ke stejné protilátce.

Uvedený druhý imunoglobulinový partner může být rovněž spojený s efektorovými činidly, které byly definovány výše, včetně neproteinových nosných sloučenin, přičemž k těmto efektorovým činidlům může být uvedený druhý imunoglobulinový partner operativně navázán běžnými prostředky.

Spojení mezi uvedenými druhými imunoglobulinovými partnery, jako jsou například protílátkové sekvence, a daným

A * • *· ·· « · · |7

• · • · ·« ···♦ efektorovým činidlem může být zajištěno jakýmikoli obvyklými prostředky, například běžnými kovalentními nebo iontovými vazbami, peptidovými vazbami nebo hetero-bifunkčními síťovacími vazbami, které jsou vytvořeny například pomocí karbodiimidu, glutaraldehydu apod. Takovéto techniky jsou v dané oblasti dobře známé a byly popsány v běžných učebnicích chemie a biochemie.

Dále mohou být běžné spojovací sekvence, které jednoduše slouží pro zajištění požadované, vzdálenosti mezi uvedený druhým imunoglobulinovým partnerem a uvedeným efektorovým činidlem, konstruovány do úseku kódující změněný imunoglobulin. Uspořádání takovýchto spojovacích sekvencí je odborníkovi v dané oblasti techniky dobře známé.

Kromě toho mohou být signální sekvence pro sloučeniny podle předmětného vynálezu modifikovány za účelem podpoření exprese, a to technikami, jež jsou odborníkovi v dané oblasti techniky známy.

Výhodná upravená protilátka podle předmětného vynálezu obsahuje proměnlivou peptidovou nebo proteinovou sekvenci těžkého a/nebo lehkého řetězce, která vykazuje antigenovou specifitu mAb BC2, jako jsou například řetězce V_H a V_L. Další požadovaná změněná protilátka podle předmětného vynálezu je charakteristická aminokyselinovou sekvencí obsahující alespoň jeden, výhodně pak všechny CDR variabilní úseky uvedeného těžkého a/nebo lehkého řetězce myší protilátky BC2, přičemž zbývající sekvence jsou odvozené z lidského zdroje, nebo funkčním fragmentem nebo analogem této aminokyselinové sekvence.

« · ·· ·«·· ·· ··

V dalším provedení tohoto vynálezu může být změněná protilátka podle předmětného vynálezu připojena k dalšímu činidlu. Tak například je možné použít technologii rekombinantní DNA pro přípravu změněné protilátky podle tohoto vynálezu, ve které je Fc fragment nebo CH2 CH3 doména celé molekuly protilátky nahrazena enzymem nebo jinou detekovatelnou sloučeninou (tj. polypeptidovým efektorem nebo referenční sloučeninou).

Uvedený druhý imunoglobulinový partner může být rovněž operativně spojen s ne-imunoglobulinovým peptidem, proteinem nebo jeho fragmentem, který je heterologní k CDR obsahující sekvenci vykazující antigenovou specifitu ke koagulačnímu faktoru, výhodně pak k faktoru IX/lXa, faktoru X/Xa, faktoru Xl/XIa, faktoru VlIl/VIIIa, faktoru V/Va, faktoru Vll/VIIa nebo k trombinu/protrombinu. Výsledný protein může po expresi vykazovat jak antigenovou specifitu, tak vlastnosti uvedeného ne-imunoglobulinu. Vlastnostmi tohoto vazného partnera se rozumí například funkční charakteristiky, jako je jiná vázací nebo receptorová doména, nebo terapeutické vlastnosti, pokud je uvedený vazný partner sám o sobě terapeutický protein, nebo další antigenové vlastnosti.

Další žádoucí protein podle předmětného vynálezu může zahrnovat celou molekulu protilátky, která obsahuje celý těžký a lehký řetězec nebo jeho diskrétní fragment, jako je

Fab fragment nebo F(ab')₂ fragment, dimer těžkého řetězce nebo jakékoli jeho minimální rekombinantní fragmenty, jako je F_v, nebo jednořetězcovou protilátku (SCA) nebo jakoukoli jinou sloučeninu se stejnou specificitou jako zvolený donor, jehož • · příkladem je monoklonální protilátka (mAb) BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC nebo HFXI. Uvedený protein může být použit ve formě změněné protilátky nebo může být použit v nevázané formě.

Kdykoli je uvedený druhý imunoglobulinový partner odvozen od protilátky, jež se liší od dané donorové protilátky, například izotypem nebo třídou základního rámce imunoglobulinu nebo konstantními úseky, je výsledkem vznik uměle vytvořené protilátky. Uměle vytvořené protilátky mohou zahrnovat konstantní úseky imunoglobulinu (Ig) a variabilní úseky základního rámce z jednoho zdroje, například z akceptorové protilátky, a jeden nebo více (výhodně všechny) úseky CDR z donorové protilátky, kterou může být například protilátka faktoru IX, protilátka faktoru IXa, protilátka faktoru X, protilátka faktoru Xa, protilátka faktoru XI, protilátka faktoru Xla, protilátka faktoru VIII, protilátka faktoru Vlila, protilátka faktoru V, protilátka faktoru Va, protilátka faktoru VII, protilátka faktoru Vila, protilátka trombinu a protilátka protrombinu, jež jsou popsány v tomto textu. Dále je možné za účelem zachování antigenové vazné specifity donorové protilátky provést různé změny, jako jsou například delece, substituce nebo inzerce, variabilní domény úseku základního rámce lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové mAb, a to na úrovni nukleové kyseliny nebo aminokyseliny, nebo donorových CDR oblastí.

Takovéto uměle vytvořené protilátky se navrhují tak, aby v nich byl použit variabilní těžký a/nebo lehký řetězec koagulačního faktoru monoklonální protilátky mAb (případně modifikovaný tak, jak je popsáno v tomto textu) nebo aby

v nich byl použit alespoň jeden úsek určující komplementaritu (CDR) uvedeného těžkého nebo lehkého řetězce. Uměle vytvořené protilátky podle předmětného vynálezu vykazují samoomezovací neutralizační účinek.

Skupina takovýchto uměle vytvořených protilátek může zahrnovat humanizovanou protilátku obsahující oblasti základního rámce vybraného lidského imunoglobulinu nebo subtyp nebo chimérní protilátku obsahující konstantní úseky lidského těžkého a lehkého řetězce vázané k funkčním fragmentům protilátky koagulačního faktoru. Vhodnou lidskou (nebo z jiného živočicha pocházející) akceptorovou protilátkou může být protilátka vybraná z běžně používané databáze, jako je například databáze KABAT°, databáze Los Alamos a databáze Swiss Protein, přičemž tento výběr lze provést podle homologie k nukleotidové nebo aminokyselinové sekvenci dané dárcovské (donorové) protilátky. Lidská protilátka charakteristická homologií k úsekům základního rámce dané donorové protilátky (na bázi aminokyselin) může být vhodná pro poskytnutí variabilního úseku těžkého řetězce základního rámce pro inzerci úseků určujících komplementaritu (CDR) uvedené donorové protilátky. Podobným způsobem je možné vybrat vhodnou akceptorovou protilátku schopnou darovat variabilní úseky lehkého řetězce základního úseku. Na tomto místě je třeba poznamenat, že uvedený těžký a lehký řetězec akceptorové protilátky nemusí nutně pocházet ze stejné akceptorové protilátky.

Ve výhodném provedení jsou heterologní a konstantní úseky základního rámce vybrány z různých tříd a izotypů lidského imunoglobulinu, jako je IgG (subtypy 1 až 4), IgM, IgA a IgE.

• · * · • · · ·

• · · • · ♦ · • ·

Nicméně uvedená akceptorová protilátka nemusí zahrnovat jen proteinové sekvence lidského imunoglobulinu. Tak je například možné zkonstruovat gen, ve kterém je DNA sekvence kódující část řetězce lidského imunoglobulinu vázána k DNA sekvenci kódující ne -imunoglobulinovou aminokyselinovou sekvenci, jako je molekula polypeptidového efektoru nebo molekula polypeptidové reportérové sloučeniny.

Zvlášť výhodná humanizovaná protilátka podle tohoto vynálezu obsahuje úseky BC2 určující komplementaritu (CDR) inzerované do úseků sekvence základního rámce vybrané lidské protilátky. Pro získání neutralizujících protilátek jsou jeden, dva nebo výhodně tři úseky určující komplementaritu (CDR) z variabilních úseků těžkého a/nebo lehkého řetězce protilátky faktoru IX, inzerovány do úseků základního rámce sekvence vybrané lidské protilátky, přičemž tyto úseky nahrazují nativní úseky určující komplementaritu (CDR) dané lidské protilátky.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu jsou variabilní domény lidského těžkého a lehkého řetězce humanizované protilátky uměle vytvořeny náhradami jednoho nebo více úseků určujících komplementaritu (CDR). Při těchto náhradách je možné použít všech šest úseků určujících komplementaritu (CDR), nebo různé kombinace méně než šesti úseků určujících komplementaritu (CDR). Ve výhodném provedení se provádí náhrada všech šesti úseků určujících komplementaritu (CDR). Je možné nahradit úseky určující komplementaritu (CDR) pouze v lidském těžkém řetězci, přičemž jako lehký řetězec se používá nemodifikovaný lehký řetězec z lidské akceptorové protilátky. V další alternativě je možné pomocí běžných • ·

··· · · • · • · « databází protilátek vybrat kompatibilní lehký řetězec z jiné lidské protilátky. Zbytek uvedené uměle vytvořené protilátky může být odvozen z jakéhokoli vhodného akceptorového lidského imunoglobulinu.

Uměle vytvořená humanizovaná protilátka podle předmětného vynálezu tak může mít ve výhodném provedení strukturu přírodní lidské protilátky nebo jejího fragmentu a může vykazovat vlastnosti potřebné pro účinné terapeutické použití, jako je například použití pro léčení trombotických a embolických nemocí u člověka.

V nejvýhodnějším provedení tohoto vynálezu obsahují humanizované protilátky těžký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 31, 52 nebo 89. Rovněž nejvýhodnější humanizované protilátky podle tohoto vynálezu obsahuji lehký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 44, 57, 62, 74, 78 nebo 99.

Zvlášť výhodnou humanizovanou protilátkou podle předmětného vynálezu je protilátka označovaná jako SB 249413, která obsahuje těžký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 31 a lehký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 44. Rovněž zvlášť výhodnou protilátkou podle předmětného vynálezu je humanizovaná protilátka označovaná jako SB 249415, která obsahuje těžký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 57. Další zvlášť výhodnou protilátkou podle předmětného vynálezu je humanizovaná protilátka označovaná jako SB 249416, která obsahuje těžký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí • ·

SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 62. Další zvlášť výhodnou protilátkou podle předmětného vynálezu je humanizovaná protilátka označovaná jako SB 249417, která obsahuje těžký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 74. Další zvlášť výhodnou protilátkou podle předmětného vynálezu je humanizovaná protilátka označovaná jako SB 257731, která obsahuje těžký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 52 a lehký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 78. Další zvlášť výhodnou protilátkou podle předmětného vynálezu je humanizovaná protilátka označovaná jako SB 257732, která obsahuje těžký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 89 a lehký řetězec tvořený aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 99.

Odborníkům v dané oblasti techniky je zřejmé, že uměle vytvořená protilátka může být dále modifikována změnami ve variabilní aminokyselinové doméně, aniž by nezbytně došlo k ovlivnění specificity a vysoké afinity dané donorové protilátky (tj. je možné vytvářet její analogy). Odborníkovi z oboru je zřejmé, že aminokyseliny obsažené v těžkém a lehkém řetězci mohou být substituovány jinými aminokyselinami, a to ve variabilních doménách základních rámců nebo v úsecích určujících komplementaritu (CDR) nebo v obou těchto částech. Zdrojem těchto substitucí by mohla být donorová protilátka nebo konsensuální sekvence z konkrétní podskupiny.

Kromě toho je možné za účelem posílení nebo zeslabení selektivních vlastnosti sloučenin podle předmětného vynálezu měnit konstantní úsek. Příkladem selektivních vlastností je • 1 · · · • ·

1111 ·

1

dimerace, vaznost k Fc receptorum nebo schopnost vázat a aktivovat komplement (v této souvislosti je možné odkázat například na publikace Angal a spolupracovníci, Mol. Immunol., 30, 105-108 (1993), Xu a spolupracovníci, J. Biol. Chem., 269,

3469-3474 (1974) a na evropský patent číslo EP 307434 (Winter a spolupracovníci)).

Změněná protilátka, která se označuje jako chimérní protilátka, se liší od shora popsaných humanizovaných protilátek tím, že poskytuje celý těžký řetězec nelidské donorové protilátky a variabilní úseky, včetně úseků základního rámce, ve spojeni s konstantními úseky obou řetězců lidského imunoglobulinu. Odborníkovi v dané oblasti techniky je zřejmé, že chimérní protilátky, ve kterých je zachována další nelidská sekvence, jež je příbuzná se sekvencí humanizovaných protilátek podle tohoto vynálezu, může u lidí vyvolávat výraznou imunitní odezvu.

Takovéto protilátky jsou užitečné pro prevenci a léčení trombotických a embolických poruch, jak bude podrobněji diskutováno v dalším textu.

Při vytváření změněných protilátek, výhodně humanizovaných protilátek podle předmětného vynálezu se výhodně používají variabilní sekvence lehkého a/nebo těžkého řetězce a úseky určující komplementaritu (CDR) monoklonální protilátky (mAb)

BC2 nebo jiné vhodné donorové monoklonální protilátky (mAb), jako je například BCl, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI a jejich kódující nukleokyselinové sekvence, přičemž uvedené změněné protilátky se připravují níže uvedeným postupem.

• · ··· • ·

Stejné nebo podobné postupy je možné použít i při jiných provedeních tohoto vynálezu.

Hybridom produkující vybranou monoklonální protilátku (mAb), jako je například myší protilátka BC2, se běžným způsobem klonuje a DNA variabilních úseků jeho těžkého a lehkého řetězce se získává technikami, jež jsou odborníkovi v daném oboru známé, jako jsou například techniky popsané v publikaci Sambrook a spolupracovníci, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor laboratory (1989). Uvedené úseky těžkého a lehkého řetězce BC2, které obsahují alespoň úseky kódující úsek určující komplementaritu (CDR) a ty části úseků lehké a/nebo těžké variabilní domény základního rámce akceptorové monoklonální protilátky (mAb), jež jsou potřeba pro zachování vazné specifity donorové monoklonální protilátky (mAb), jakož i zbývající, od imunoglobulinu odvozené části řetězce protilátky, které jsou odvozeny od lidského imunoglobulinu, se získávají s použitím polynukleotidových primerů a reverzní transkriptasy. Uvedené úseky kódující úsek určující komplementaritu (CDR) se identifikují pomocí známých databází a porovnáním s jinými protilátkami.

Následně může být připravena myší/lidská chimérní protilátka, jež může být testována na schopnost vaznosti. Takováto chimérní protilátka obsahuje celé V_H a V_L úseky nelidské donorové protilátky ve spojení s konstantními úseky obou řetězců lidského Ig.

Homologní úseky základního rámce variabilního úseku těžkého řetězce lidské protilátky se identifikují pomocí

• · · · *·· · · · • · · ♦ ··· počítačových databází, jako je například databáze KABAT°, a jako akceptorová protilátka se volí lidská protilátka, jež je homologní k BC2. Pomocí případných záměn nukleotidů v úsecích uvedeného základního rámce se za účelem vpravení restrikčních míst vytvářejí sekvence variabilních úseků syntetického těžkého řetězce, které obsahují úseky kódující úseky BC2 určující komplementaritu uvnitř základních rámců lidské protilátky. Takto vytvořená sekvence se následně syntetizuje pomocí dlouhých syntetických oligomerů. V alternativním provedení je možné uvedenou vytvořenou sekvenci syntetizovat překrytím oligonukleotidů s využitím amplifikace metodou polymerasové řetězové reakce PCR a následným opravením chyb. Podobným způsobem je možné vytvořit vhodný variabilní úsek základního rámce lehkého řetězce.

Humanizovaná protilátka může být odvozena od chimérní protilátky nebo, výhodně, může být synteticky vytvořena příslušnou inzercí úseků donorové monoklonální protilátky (mAb), jež kódují úsek určující komplementaritu, z těžkého a lehkého řetězce do vybraného základního rámce těžkého a lehkého řetězce. V alternativním případě je možné humanizovanou protilátku podle předmětného vynálezu připravit pomocí standardních technik mutageneze. Výsledná humanizovaná protilátka tak obsahuje úseky lidského základního rámce a úseky donorové monoklonální protilátky (mAb) kódující úseky určující komplementaritu (CDR). Na zbytcích základního rámce je možné provést následné manipulace. Vzniklou humanizovanou protilátku je možné exprimovat v rekombinantních hostitelských buňkách, jako jsou například buňky COS, buňky CHO nebo myelomové buňky. Použitím těchto technik na jiné vhodné samoomezující, neutralizující protilátce s vysokou afinitou a ·· «···

999 9 9 specifitou k faktoru IX nebo jinému koagulačnímu faktoru je možné připravit i jiné humanizované protilátky.

Běžný expresní vektor nebo rekombinantní plazmid se připravuje umístěním uvedených sekvencí kódujících změněnou protilátku do hostitelské buňky, přičemž uvedené sekvence jsou operativně spojeny s běžnými regulačními sekvencemi, jež jsou schopné regulovat replikaci a expresi v hostitelské buňce a/nebo sekreci z hostitelské buňky. Regulační sekvence obsahují sekvenci promotoru, jako je např. CMV promotor, a signální sekvence, které mohou být odvozeny s jiných známých protilátek. Podobně je možné připravit druhý expresní vektor, jenž obsahuje DNA sekvenci, která kóduje komplementární lehký nebo těžký řetězec protilátky. Aby bylo v maximální možné míře zajištěno, že je každý polypeptidový řetězec funkčně exprimován, je výhodně tento druhý expresní vektor, až na kódující sekvence a volitelné markéry, stejný s prvním expresním vektorem. V alternativním případě mohou sekvence kódující lehký a těžký řetězec změněné protilátky být uloženy v jediném vektoru.

Vybraná hostitelská buňka je kotransfekována běžnými technikami s použitím prvního a druhého vektoru (nebo jednoduše s použitím jediného vektoru) za vzniku transfekované hostitelské buňky podle tohoto vynálezu, která obsahuje jak lehký, tak těžký rekombinantní nebo syntetický řetězec. Tato transfekovaná buňka se následně běžnými technikami kultivuje za vzniku uměle vytvořené protilátky podle předmětného vynálezu. Uvedená humanizovaná protilátka, která obsahuje spojení těžkého a/nebo lehkého rekombinantního řetězce se hromadně testuje vhodným testem, jako je test ELISA nebo RIA.

•· «··♦ • · · • · · ··· · · • · .

• · · • · · · • ·

Podobné běžné techniky je možné použít pro vytvoření jiných změněných protilátek a sloučenin podle předmětného vynálezu.

Vhodné vektory pro provedení klonovacích a subklonovacích stupňů, které se používají při způsobech a vytváření kompozic podle předmětného vynálezu, mohou být vybrány každým zkušeným odborníkem z dané oblasti techniky. Tak je například možné použít klonovací vektory řady pUC, jako je pUC19, které jsou komerčně dostupné například od společnosti Amersham nebo Pharmacia. Kromě toho je možné pro klonování použít jakýkoli vektor, který je schopen snadné replikace, obsahuje dostatek klonovacích míst a selekčních genů (např. antibiotické rezistence) a je snadno manipulovatelný. Výběr klonovacího vektoru tak není faktorem omezujícím rozsah tohoto vynálezu.

Podobně mohou být vektory používané pro expresi uměle vytvořených protilátek podle tohoto vynálezu vybrány jakýmkoli zkušeným odborníkem z oboru ze skupiny běžných vektorů.

Uvedené vektory obsahují rovněž vybrané regulační sekvence (jako jsou CMV promotory), které řídí replikaci a expresi heterologních DNA sekvencí ve vybraných hostitelských buňkách. Tyto vektory obsahují shora popsané DNA sekvence, které kódují uměle vytvořenou protilátku, nebo úsek kódující změněný imunoglobulin. Kromě toho mohou uvedené vektory za účelem snadné manipulace zahrnovat vybrané sekvence imunoglobulinu, které jsou modifikované inzercí požadovaných restrikčních míst.

Expresní vektory podle předmětného vynálezu je rovněž možné charakterizovat geny, jež jsou vhodné pro posílení exprese heterologních DNA sekvencí. Příkladem takovéhoto genu ·« ·« ·· ····

je gen savčí dihydrofolátreduktasy (DHFR). Skupina dalších výhodných vektorových sekvencí zahrnuje póly A signální sekvence, jako je sekvence pocházející z hovězího růstového hormonu (BGH) a sekvence betaglobinového promotoru (betaglopro). Expresní vektory vhodné pro použití podle tohoto vynálezu je možné syntetizovat postupy, které jsou odborníkovi dobře známé.

Složky uvedených vektorů, jako jsou například replikace, selekční geny, enhancery, promotory, signální sekvence apod., je možné získat z komerčních nebo přírodních zdrojů nebo je možné je syntetizovat známými postupy řízení exprese a/nebo sekrece daného produktu rekombinantní DNA ve zvoleném hostiteli. Za tímto účelem je rovněž možné vybrat jiné vhodné expresní vektory, přičemž mnoho typů těchto expresních vektorů je známo v oblasti savčí, bakteriální, hmyzí, kvasinkové a plísnové exprese.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadá rovněž buněčná linie transfekovaná rekombinantním plazmidem, jenž obsahuje sekvence kódující uměle vytvořené protilátky nebo molekuly změněného imunoglubulinu těchto uměle vytvořených protilátek.

Hostitelskými buňkami, které se používají pro klonování a jiné manipulace těchto klonovacích vektorů, jsou rovněž běžně používané hostitelské buňky. Nicméně nejvýhodněji se při replikaci klonovacích vektorů a dalších stupních vytváření změněných protilátek podle tohoto vynálezu používají buňky pocházející z různých kmenů E. coli.

Vhodnými hostitelskými buňkami nebo buněčnými liniemi pro expresi uměle vytvořené protilátky nebo změněné protilátky

.

podle tohoto vynálezu jsou výhodně savčí buňky, jako jsou CHO, COS, fibroblastové buňky (např. 3T3) a myeloidní buňky, výhodněji potom CHO nebo myeloidní buňky. Je možné použít lidské buňky, čímž je umožněno, aby daná látka byla modifikována prostřednictvím lidské glykosylace.

V alternativním případě je možné použít jiné eukaryotní buněčné linie. Postup při výběru vhodných savčích hostitelských buněk a způsobů transformace, kultivace, amplifikace, hromadného testování, produkce a přečištění daného produktu je v dané oblasti techniky známý. V této souvislosti lze odkázat na již citovanou publikaci Sambrooka a spolupracovníků.

Bakteriální buňky mohou osvědčit svojí použitelnost jakožto hostitelské buňky, které jsou vhodné pro expresi rekombinantnich Fab protilátek podle tohoto vynálezu (viz. například publikace Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130, 151-188 (1992)). Nicméně díky tomu, že proteiny exprimované v bakteriálních buňkách mají tendenci se vyskytovat v nesvinuté nebo nedostatečně svinuté formě nebo v neglykosylované formě, musí být jakákoli rekombinantní Fab protilátka produkovaná v bakteriální buňce testována za účelem zjištění, jestli si takováto protilátka zachovala schopnost vázat se k antigenu. Pokud bakteriální buňka exprimuje danou látku ve správně svinuté formě, je tato bakteriální buňka označena za vhodného hostitele. Tak jsou například v oblasti biotechnologií známé různé kmeny E. coli, které se používají jakožto hostitelské buňky pro expresi. Dále je možné pro tento účel použít kmeny B. subtilis, Streptomyces a jiné bacily apod.

φ« ···» ♦ Φ φ * · φ φ · φ φ · φ φ φ φ φ φφφ φ φ ·

ΦΦΦΦ

41.

V případě potřeby jsou rovněž dostupné kmeny kvasinkových buněk, které jsou odborníkovi z oboru biotechnologií známé a které se používají jako hostitelské buňky, jakož i hmyzí buňky, jako jsou například buňky druhu Drosophila a

Lepidoptera, a virové expresní systémy. Viz. například publikace Miller a spolupracovníci, Genetic Engineering, 8, 277-298, Plenům Press (1986) a odkazy citované v této publikaci.

Obecně je možné uvést, že způsoby vytváření vektorů podle tohoto vynálezu, způsoby transfekace, které je třeba použít pro produkci hostitelských buněk podle předmětného vynálezu a kultivačními metodami, jež jsou nezbytné pro produkci změněné protilátky podle tohoto vynálezu z uvedených hostitelských buněk, jsou běžně používané techniky. Podobně je možné uvést, že jakmile dojde k produkci změněných protilátek podle předmětného vynálezu, je možné tyto protilátky izolovat v čistém stavu z obsahu buněčné kultury standardními postupy, které se používají v oblasti biotechnologií a jejichž skupina zahrnuje vysráženi pomocí síranu amonného, afinitní chromatografií, sloupcovou chromatografií, gelovou elektroforézu apod. Takovéto postupy zkušený odborník běžně ovládá, přičemž rozsah tohoto vynálezu není omezen na použití konkrétního postupu.

Při dalším způsobu exprese humanizovaných protilátek je možné využít exprese v transgenním zvířeti, jak je popsáno v patentu Spojených států amerických číslo US 4,873,316. Tento patent se týká expresních systémů, ve kterých se používá zvířecí kaseinový promotor, který když je transgenně vpraven

4« ···» * · ·

* * • · · ··* · · »

do zvířete, umožňuje samici produkovat v mléce požadovaný rekombinantní protein.

Jakmile dojde požadovaným způsobem k exprimaci uměle vytvořené protilátky podle tohoto vynálezu, je tato podrobena testům na in vitro aktivitu, přičemž při těchto testech se používá vhodná testovací metoda. V současné době se běžné testovací formáty ELISA používají pro kvalitativní a kvantitativní stanovení vazností dané uměle vytvořené protilátky faktoru IX nebo jiným vhodným koagulačním faktorům. Kromě toho je rovněž možné použít další in vitro testy, které slouží k ověření neutralizačního účinku dané protilátky před následnými klinickými studiemi prováděnými na lidech, které se provádějí za účelem stanovení doby, po kterou uměle vytvořená protilátka podle tohoto vynálezu setrvává v těle navzdory probíhajícím běžným mechanismům čištění organismu.

Podle shora popsaných postupů přípravy humanizovaných protilátek z BC2 může zkušený odborník vytvořit s použitím dalších zde popsaných donorových protilátek, sekvencí variabilních úseků a CDR peptidů i jiné humanizované protilátky. Je možné produkovat takové uměle vytvořené protilátky s variabilním úsekem základních rámců, které mohou být potenciálními příjemci takovéto uměle vytvořené protilátky rozpoznány jako „vlastní. Do daného variabilního úseku základních rámců je možné implementovat malé modifikace, které slouží pro dosažení velkého zvýšení vaznosti protilátky k antigenu, aniž by došlo ke značnému zvýšení imunogenicity pro pacienta. Takovéto uměle vytvořené protilátky mohou být použity pro účinnou léčbu lidí, kteří trpí chorobnými stavy

souvisejícími s koagulačními faktory. Takovéto protilátky mohou být užitečné i při diagnóze uvedených chorobných stavů.

Předmětný vynález se dále týká způsobu inhibice trombózy u živočichů, zejména u lidí, který zahrnuje podávání účinné dávky monoklonální protilátky koagulačního faktoru se samoomezovacím neutralizačním účinkem v kombinaci s aktivátorem plasminogenu. Kombinační terapie podporuje trombolýzu při menších než optimálních koncentracích aktivátoru plasminogenu, čímž dochází ke snížení doby potřebné k obnovení krevního toku a ke zvýšení frekvence a celkového trvání reperfúze cévy. Na rozdíl od heparinu, kombinační terapie výrazně nenarušuje normální hemostatické funkce a snižuje hladiny fibrinogenu, plasminogenu a a-2-antiplasminu.

V souladu s tím je předmětem tohoto vynálezu i způsob snížení dávky trombolytického činidla, kterou je třeba použít při léčení trombózy u živočichů, který zahrnuje podávání antikoagulantu, jenž je specificky zaměřen na složku vlastní koagulační kaskády, v kombinaci s trombolytickým činidlem.

Ve výhodném provedení je uvedený koagulační faktor vybraný ze skupiny faktorů účastnících se uvedené vlastní nebo společné koagulační kaskády. Nejvýhodněji je uvedenou monoklonální protilátkou koagulačního faktoru protilátka faktoru IX, protilátka faktoru IXa, protilátka faktoru X, protilátka faktoru Xa, protilátka faktoru XI, protilátka faktoru Xla, protilátka faktoru VIII, protilátka faktoru Vlila, protilátka faktoru V, protilátka faktoru Va, protilátka faktoru VII, protilátka faktoru Vila, protilátka trombinu nebo protilátka protrombinu. Uvedená monoklonální protilátka (mAb) může zahrnovat jednu nebo více zde popsaných • · · · ·· ·· ···· • · · · · · · · · · « · • · ··· ···· ··· ·· ·· ···· «· ·· uměle vytvořených protilátek nebo změněných protilátek nebo jejich fragmentů.

Ve výhodném provedení předmětného vynálezu je uvedeným aktivátorem plasminogenu tPA, streptokinasa, urokinasa. Zvlášť výhodným aktivátorem plasminogenu je tPA. Rovněž výhodně se podle tohoto vynálezu používají varianty tPA, které byly popsány například v publikacích Tachias a Madison, J. Biol. Chem., 272, 14580-14585 (1997); Fujise a spolupracovníci,

Circulation, 95, 715-722 (1997); Coombs a spolupracovníci,

J. Biol. Chem., 273, 4323-4328 (1998); Van de Werf a spolupracovníci, Am. Heart. J. , 137, 786-791 (1999), a varianty streptokinasy a urokinasy, jako je jednořetězcový urokinasový aktivátor plasminogenu, acylovaný komplex streptokinasového aktivátoru plasminogenu, aktivátor stafylokinasy a aktivátor plasminogenu pocházející z netopýra.

V alternativním provedení tohoto vynálezu se spolu monoklonální protilátkou koagulačního faktoru podle tohoto vynálezu může podávat kyselina acetylsalicylová. V některých případech kombinační terapie vede ke snížení terapeuticky účinné dávky monoklonální protilátky koagulačního faktoru.

Terapeutická odezva vyvolaná použitím látek podle tohoto vynálezu je výsledkem navázání daného koagulačního faktoru a následnou samoomezovací inhibici koagulační kaskády. Pokud jsou tedy látky podle předmětného vynálezu obsaženy v přípravcích a farmaceutických prostředcích vhodných pro terapeutické použití, jsou tyto látky vysoce žádoucí pro osoby se sklonem k abnormální koagulační aktivitě nebo pro osoby trpící abnormální koagulační aktivitou, přičemž tato • · · · · •« · · · • · · · • · · · · * • · · • · · ·« ·· abnormální koagulační aktivita souvisí například s infarktem myokardu, nestabilní angínou, fibrilací srdečních předsíní, mrtvicí, poškozením ledvin, pulmonární embolií, hlubokou žilní trombózou, perkutánní translumenální koronární angioplastikou, roztroušenou intravaskulární koagulací, sepsí, umělými orgány, umělými žílami a protézami, bez omezení na tyto příklady.

Dále se látky podle tohoto vynálezu výhodně používají při léčení post-tromboembolicky indukované ischemie. V souladu s tím je předmětem tohoto vynálezu způsob léčení posttromboembolicky indukované ischemie u živočichů, který zahrnuje podávání protilátky faktoru IX nebo fragmentu této protilátky. Uvedená protilátka nebo uvedený fragment protilátky se může podávat po výskytu embólie, tj. poté, co krevní sraženina vzniklá kdekoli ve vaskulatuře doputuje krevním oběhem do cerebrální vaskulatury, usadí se tam, zablokuje a/nebo sníží krevní tok a způsobí ischémii. Uvedená protilátka nebo uvedený fragment protilátky se může podávat po prodělání záchvatu mrtvice, tj. po rozpoznání na části jedince nebo pozorované osoby poškozeni neurologických funkcí, jež je způsobeno embolií. Dále je předmětem tohoto vynálezu způsob léčení post-tromboembolicky indukované ischemie u živočichů, který zahrnuje podáváni protilátky faktoru IX nebo fragmentu této protilátky v kombinaci s aktivátorem plasminogenu.

Uvedená protilátka nebo uvedený fragment protilátky se může podávat po výskytu embólie nebo po prodělání záchvatu mrtvice. Tyto léčebné metody vedou k udržení vaskulární perfúze kolaterálních cév. Způsoby léčby podle tohoto vynálezu, které se používají po vzniku poranění, zmírňují následky prodloužené ischemie, jako je pokračování patologické trombózy v místě • ·· · ·· ·· ·· · · ··· · · * · · · · • · · ·· · ·· ,-. · ······ « ··· · tr O · · ··· · · · · ··· ·· «· ···· ·· ·· ischemie, která může vést ke zvětšování infarzované tkáně a k větším neurologickým deficitům.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je způsob snížení dávky trombolytického činidla, kterou je třeba podávat při léčení post-tromboembolicky indukované ischemie u živočicha, který zahrnuje podávání protilátky faktoru IX v kombinaci trombolytickým činidlem.

Dalším výhodným použitím látek podle tohoto vynálezu je jejich profylaktické podávání živočichovi, který má sklon k tromboembolické mrtvici. Dalším aspektem předmětného vynálezu tak je způsob prevence tromboembolické mrtvice u živočicha, který zahrnuje podávání protilátky faktoru IX živočichovi, u něhož existuje riziko výskytu tromboembolické mrtvice. Mezi jedince s rizikem výskytu tromboembolické mrtvice náleží například pacienti se sklonem k fibrilaci srdečních předsíní nebo pacienti podstupující chirurgické zákroky nebo jiné prokoagulační invazivní zákroky, bez omezení na uvedené příklady.

Změněné protilátky, protilátky a jejich fragmenty podle předmětného vynálezu je možné použít i ve spojení s jinými protilátkami, zejména s lidskými monoklonálními protilátkami (mAb), které reagují s dalšími markéry (epitopy) jež jsou zodpovědné za chorobný stav, proti němuž je směrována změněná protilátka podle tohoto vynálezu.

Předpokládá se, že terapeutická činidla podle předmětného vynálezu jsou vhodná pro léčení abnormálního srážení krve po dobu od přibližně 1 dne do přibližně 3 týdnů, případně po • · · · · · · • · dobu, kterou lze určit podle potřeby. Tato skutečnost představuje výraznou výhodu oproti v současné době používaným antikoagulantům, kterými jsou heparin a warfarin. Velikost dávky a doba trvání léčby jsou závislé na době, po kterou látky podle předmětného vynálezu vydrží v krevním oběhu, přičemž tyto parametry mohou být upraveny odborníkem v dané oblasti techniky, a to v závislosti na povaze chorobného stavu, jenž má být léčen, a na celkovém zdravotním stavu daného pacienta.

Terapeutická činidla podle předmětného vynálezu je možné podávat jakýmkoli vhodným způsobem, kterým je možné dopravit uvedené činidlo do hostitele. Změněné protilátky, protilátky, uměle vytvořené protilátky a jejich fragmenty, aktivátory plasminogenu a farmaceutické kompozice podle předmětného vynálezu jsou zvlášť vhodné pro parenterální podávání, tj. pro subkutánní, intramuskulární, intravenózní nebo intranasální podávání.

Terapeutická činidla podle předmětného vynálezu mohou být připravena ve formě farmaceutických kompozic obsahujících jakožto účinné složky účinné množství uměle vytvořené (např. humanizované) protilátky podle předmětného vynálezu a aktivátoru plasminogenu ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

V alternativním provedení mohou farmaceutické kompozice podle předmětného vynálezu obsahovat rovněž kyselinu acetylsalicylovou. Profylaktické činidlo podle tohoto vynálezu má výhodně formu vodné suspenze nebo vodného roztoku, která/který obsahuje uměle vytvořenou protilátku podle tohoto vynálezu, přičemž pH této suspenze nebo tohoto roztoku je výhodně udržováno pomocí pufru na fyziologické hodnotě a daná *« · · ·· 4 9 4 4 4 4 • ··· 4 · · ♦ 4 · · 4 • · · · 4 4 4 4 4 ··· ·· ·· 4444 ·· ♦ · suspenze, respektive daný roztok má formu vhodnou pro okamžité injekční podání. Uvedené farmaceutické kompozice pro parenterální podávání běžně zahrnují roztok uměle vytvořené protilátky podle tohoto vynálezu nebo jejich směsi ve farmaceuticky přijatelném nosiči, kterým je výhodně vodný nosič. Podle tohoto vynálezu je možné použít různé vodné nosiče, jako je například 0,4procentní fyziologický roztok, 0,3procentni roztok glycinu apod. Uvedené roztoky jsou sterilní a obecně neobsahují žádné pevné částice. Tyto roztoky je možné sterilizovat běžnými, dobře známými sterilizačními metodami (jako je například filtrace). Farmaceutické kompozice podle tohoto vynálezu mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky, které jsou zapotřebí k vytvoření podmínek, jež se blíží fyziologickým a jejichž příkladem jsou činidla pro úpravu a udrženi hodnoty pH apod. Koncentrace protilátky podle předmětného vynálezu v uvedených farmaceutických kompozicích se může měnit v širokém rozsahu, tj. od méně než přibližně 0,5 hmotnostního procenta, přičemž obvykle tato koncentrace činí přibližně 1 hmotnostní procento nebo od alespoň 1 hmotnostního procenta do 15 hmotnostního procenta nebo do 20 hmotnostních procent a konkrétní hodnota koncentrace se primárně volí na základě objemu použité kapaliny, viskozity použité kapaliny atd. a podle konkrétního způsobu podávání dané farmaceutické kompozice.

Tak je tedy možné farmaceutickou kompozici podle tohoto vynálezu pro intramuskulární injekční podávání připravit tak, aby obsahovala 1 mililitr sterilní pufrované vody a od přibližně 1 nanogramu do přibližně 100 miligramů, například od přibližně 50 nanogramů do přibližně 30 nebo více miligramů, výhodně od přibližně 5 miligramů do přibližně 25 miligramů ····* · · · · · · • · · · · w · · • · · · · ·♦ · · · ·· uměle vytvořené protilátky podle předmětného vynálezu. Podobně může být farmaceutická kompozice podle předmětného vynálezu pro intravenózní infúzní podávání připravena tak, že obsahuje přibližně 250 mililitrů sterilního Ringerova roztoku a přibližně 1 miligram až přibližně 30 miligramů, výhodně pak od 5 miligramů do přibližně 25 miligramů uměle vytvořené protilátky podle tohoto vynálezu. Způsoby přípravy farmaceutických kompozic pro parenterální podávání jsou odborníkům v dané oblasti techniky dobře známé a jsou detailněji popsány například v publikaci „Remington's Pharmaceutical Science, 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Pokud se terapeutická činidla podle předmětného vynálezu nacházejí ve farmaceutických přípravcích, mají výhodně formu dávkové jednotky. Příslušnou terapeuticky aktivní dávku může snadno stanovit odborník z oblasti farmakologie. Za účelem účinné léčby trombotické nebo embolické poruchy u člověka nebo jiného živočicha by měla být parenterálně, výhodně intravenózně nebo intramuskulámě, podána jedna dávka proteinu nebo protilátky podle tohoto vynálezu, a to o velikosti od přibližně 0,1 miligramu/kilogram tělesné hmotnosti do přibližně 20 miligramů/kilogram tělesné hmotnosti. V případě potřeby je možné tuto dávku ve vhodných časových intervalech opakovat, přičemž tyto časové intervaly volí lékař během trombotické odezvy.

Protilátky, změněné protilátky nebo jejich fragmenty, které byly popsány v předcházejícím textu, je možné lyofilizovat za účelem uskladnění a rekonstituovat ve vhodném nosiči před jejich použitím. Tato technika se ukázala jako • ·· účinná v případě běžných imunoglobulinů a je možné při ní použít známé způsoby lyofilizace a rekonstituce.

Příklady provedení vynálezu

Předmětný vynález bude nyní popsán s odkazem na následující konkrétní příklady, které však nijak neomezují jeho rozsah.

Příklad 1

Příprava a hromadné testováni monoklonálních protilátek faktoru IX

Samicím Balb/C myší byl injikován lidský faktor IX, který byl přečištěn postupem popsaným v publikaci Jenny, R. a spolupracovníci, Prep. Biochem., 16, 227-245 (1986). Každé myši byla vstříknuta injekce 100 mikrogramů proteinu, který byl rozpuštěn v 0,15 mililitru fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým tlumivým roztokem (PBS) a smíchán s 0,15 mililitru kompletní Freundovy pomocné látky. Myším byly podávány po dobu 2 až 3 měsíců v přibližně dvoutýdenních intervalech podávány posilující imunizační dávky 50 mikrogramů proteinu, který byl rozpuštěn v 0,15 mililitru fyziologického roztoku pufrovaného fosfátovým tlumivým roztokem (PBS) a smíchán s 0,15 mililitru kompletní Freundovy pomocné látky. Po podání poslední podpůrné dávky bylo každé myši tři dny před fúzemi slezinných/myelomových buněk podáno 50 mikrogramů faktoru IX v PBS. Z imunizované myši byly izolovány slezinné buňky, které byly fúzovány s myelomovými buňkami NS-1 (Kohler, G. a spolupracovníci, Eur. J. Immunol., 6, 292-295 (1976)), a • 0 · · ·» 0 0 0 0 0 0

0 0 · 0 0 · 0 0 • ··· · * · 0 0 0 · 0 0 0 000 0 0 0 0 ··· 0· 00 0000 00 00 to s použitím polyethylenglykolu, jak bylo popsáno Oim, V. T. a spolupracovníky v publikaci „Selected Methods in Cellular Immunology, editoři Mishell, Β. B. a Shinghi, S. M., Freeman Press, San Francisco. Po provedení fúze byly buňky resuspendovány v médiu RPMI 1640, které obsahovalo lOprocentní telecí fetální sérum a alikvotní podíly vzniklé suspenze byly umístěny do všech jímek čtyř 24jímkových plat, přičemž každá jímka již obsahovala 0,5 mililitru buněčného média získaného výplachem peritoneální dutiny. Druhého dne byl do každé jímky přidán 1,0 mililitr 2 x 10’⁴M roztoku hypoxanthinu, 8 x 10'⁷M roztoku aminopterinu a 3,2 x 10~⁵M roztoku thymidinu v médiu RPMI 1640, které obsahovalo lOprocentní telecí fetální sérum. Buňky byly každý 3. až 4. den živeny, přičemž toto živení probíhalo tak, že z každé jímky byla odebrána polovina uvedeného média, jež byla nahrazena čerstvým médiem obsahujícím 1 χ 10’⁴ M hypoxanthinu a 1,6 χ 10’⁵ M thymidinu.

Po uplynutí přibližně 2 týdnů byl z každé jímky odebrán 1,0 mililitr hybridomového média a toto médium bylo pomocí testu ELISA, jenž byl popsán v publikaci Jenny, R. a spolupracovníci, Meth. Enzymol., 222, 400-416 (1993), testováno na přítomnost protilátek faktoru IX. Ve stručnosti je tento test možné popsat tak, že faktor IX byl imobilizován v plastických jímkách 96jímkových mikrotitračních plat.

V těchto jímkách byly poté inkubovány supernatanty, neboli zředěné roztoky přečištěné protilátky. Jímky byly promyty a přítomnost komplexů protilátka-antigen byla detekována pomocí druhé protilátky, jíž byl kozí anti-myší imunoglobulin konjugovaný ke křenové peroxidase, a pomocí chromogenního substrátu, kterým byl o-dianisidin.

* φφ ·· · φ φφ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φ φ φφφ φφφ φφφφ φ φ φφφ φφφφ φφφ φφ φφ φφφφ φφ φφ

Obsahy jímek obsahujících protilátky faktoru IX byly subklonovány omezením ředění a pěstovány v 96jímkových platech. Supernatanty z kultur klonovaných hybridomových buněk byly hromadně testovány na přítomnost protilátky faktoru IX shora popsaným testem ELISA a buňky z pozitivních hybridomů byly rozmnoženy, zmrazený, uloženy v kapalném dusíku a později pěstovány v myších ve formě břišních nádorů

Příklad 2

Samoomezovací účinek protilátek koagulačního faktoru při koagulaci

Účinek zvyšujících se koncentrací protilátek koagulačního faktoru na výsledky testu doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) lidské plazmy byl stanoven ve fibrometru (Becton-Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville,

Maryland) pomocí referenčního postupu Baxter LIB0293-J, revize 3/93 (Baxter Scientific, Edison, New Jersey, USA).

Před začátkem experimentu byla do ohřívací komory fibrometru umístěna 5mililitrová zkumavka obsahující 2 až 3 mililitry 0,02molárního roztoku CaCl₂. Vzorky lidské plazmy byly buď čerstvě odebrány a udržovány na ledě nebo rekonstituovány z produktu Hemostasis Reference Plasma (American Diagnostics, Greenwich, Connecticut, USA) podle instrukcí výrobce.

Nefrakcionovaný heparin z vepřové střevní sliznice (Sigma

Chemical, St. Louis, Missouri, USA), heparin o nízké molekulové hmotnosti z vepřové střevní sliznice (Lovenox”, * · · 9 9 9 9 • 9 · 9 9 9 9 ·· 9999 99 99 sodná sůl enoxaparinu, Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals, Collegeville, Pennsylvania, USA) nebo mAb antikoagulanty byly rozdělány do zásobních roztoků o koncentraci přibližně 50 μΜ a tyto roztoky byly sériově ředěny přímo v testované plazmě. Pro porovnáni byl použit slepý vzorek obsahující samotnou plazmu bez antikoagulantu.

Dva pohárky fibroTube° fibrometru byly naplněny 100 mikrolitry testované plazmy nebo 100 mikrolitry testované plazmy s antikoagulantem respektive 125 mikrolitry aktinem aktivovaného cefaloplastinového reakčního činidla (dále označovaného jako „aktinové reakční činidlo, přičemž se jednalo o roztok kefalinu z králičího mozku v kyselině elagové, Baxter Scientific) a naplněné pohárky byly umístěny při teplotě 37 °C do jímek fibrometru.

Po uplynutí jedné minuty bylo 100 mikrolitrů aktinového reakčního činidla přeneseno do pohárku obsahujícího plazmu a vzniklá směs byla několikrát promíchána pipetou. Po 3 minutách inkubace bylo 100 mikrolitrů roztoku CaCl₂, který byl předehřát na 37 °C, přidáno do směsi plazmy a aktinového reakčního činidla, a to pomocí kombinace automatické pipety/časového spínače (Becton-Dickinson). Byly měřeny doby srážení a získané výsledky jsou graficky znázorněny na přiloženém obrázku 1 ve formě grafu závislosti doby srážení na konečné koncentraci antikoagulantu v testovaném vzorku o celkovém objemu 300 mikrolitrů. Nominální koncentrace faktoru IX při tomto testu byla v rozmezí od 30 nM do 40 nM.

Z výsledků znázorněných na obrázku 1 je patrný účinek zvyšující se koncentrace myších monoklonálních protilátek ·9 99 99 999999

9 · 9 9999 · « ·

999 999 9999 9 • 9 999 9999

999 99 99 9999 99 99 (mAb) faktoru IX BC1 a BC2 na časy dosažené při testu doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT). Obě monoklonální protilátky (mAb) inhibovaly srážení krve prodloužením doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) a obě monoklonální protilátky (mAb) dosáhly konečného sytícího účinku na dobu potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT). IC₅₀ pro BC1 a BC2 byly podobné a jejich hodnoty činily přibližně 35 nM, respektive přibližně 50 nM, avšak byl zjištěn rozdíl v maximální odezvě na uvedené dvě protilátky. Sytící koncentrace BC1 zvýšily dobu potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) o přibližně 50 procent na přibližně 40 sekund, zatímco sytící koncentrace BC2 zvýšily dobu potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT)

3,5krát na přibližně 90 sekund. Na obrázku 1 je zvýrazněna terapeutická cílová zóna, která se používá při antikoagulační terapii s použitím heparinu. Z výsledků na obrázku 1 plyne, že uvedené dvě monoklonální protilátky (mAb) ohraničují uvedený terapeutický aPTT rozsah heparinu.

Vlastnosti monoklonálních protilátek (mAb) BC1 a BC2 jsou shrnuty v tabulce 1. Každá z uvedených monoklonálních protilátek (mAb) rozlišuje jak zymogen, faktor IX, tak aktivní proteasu, faktor IXa, avšak pouze BC2 byla schopná blokovat jak aktivaci zymogenu, tak proteasy. Bylo zjištěno, že BC1 a BC2 křížově reagovaly s faktorem IX opice Cynomologous. Kromě toho BC2 rovněž křížově reagovala s krysím faktorem IX.

• ·· 0 · · · ·· ···· • · · · · · · · · · · * ··· 0 0 · 0 0 0 0 0 • 0 · · · · · · · ··· ·· ·· ···· ·· ··

Tabulka 1 Souhrn in vitro vlastností anti-faktor IX monoklonálních protilátek IX

	BC1	BC2
Váže faktor IX	ano	ano
Váže faktor IXa	ano	ano
Inhibuje přeměnu faktoru IX na faktor IXa	ne	ano
Inhibuje aktivitu faktoru IXa v Xasovém komplexu	ano	ano
Požadavek kofaktoru	ne	dvouvazné kovy Ca2+ > Mn2+
aPTT max/aPTT normál (x 100 %)	150	350
IC50 (nM)	~35	~50
Druhová křížová reaktivita	opice	krysa, opice
Izotyp	IgGl	IgG2a

Výsledky znázorněné na přiloženém obrázku 2 ilustrují účinek zvyšujících se koncentrací monoklonálních protilátek (mAb) faktoru IX 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9 na časy dosažené při testu doby potřebné k částečné - aktivaci tromboplastinu (aPTT). Plazma použitá při tomto testu byla zředěna na polovinu normální koncentrace, takže počáteční doba potřebná k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) činila 45 sekund. Obě monoklonální protilátky (mAb) inhibovaly sráženi krve prodloužením doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) a obě monoklonální protilátky (mAb) dosáhly konečného sytícího účinku na dobu potřebnou k částečné aktivaci

• 9«	• 9	9 9	9 9	9999
• · · ·	9		9	9 9	9	9	9
• 9 9 9 9	9		9	9	9 9	9	9
• ·	9		9	9	9	9	9 9
• 99 99		9 9		9999	99		9 9

tromboplastinu (aPTT). Sytící koncentrace 9E4(2)F4 a 11G4(1)B9 zvýšily dobu potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) na přibližně 90 až 100 sekund, respektive na přibližně 80 sekund. Ze zjištěných výsledků vyplývá, že uvedené dvě monoklonální protilátky (mAb) působily v horní části terapeutického aPTT rozsahu heparinu.

Výsledky znázorněné na přiloženém obrázku 3 ilustrují účinek zvyšujících se koncentrací monoklonálních protilátek (mAb) faktoru X HFXLC (proti lehkému řetězci epitopu), HFXHC (proti těžkému řetězci epitopu) a monoklonální protilátky (mAb) faktoru XI HFXI na časy dosažené při testu doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT). Tyto monoklonální protilátky (mAb) byly získány od společnosti Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN, USA). Uvedené monoklonální protilátky (mAb) HFXLC a HFXI inhibovaly srážení krve prodloužením doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) a obě monoklonální protilátky (mAb) dosáhly konečného sytícího účinku na dobu potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT). Hodnota IC₅₀ HFXLC.činila přibližně 40 nM; sytící koncentrace zvýšily dobu potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) na přibližně 60 sekund. Hodnota IC₅₀ HFXI činila přibližně 20 nM; sytící koncentrace zvýšily dobu potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) na přibližně 100 sekund. Ze zjištěných výsledků vyplývá, že HFXLC působila uvnitř terapeutického aPTT rozsahu heparinu, zatímco HFXI působila v horní části terapeutického aPTT rozsahu heparinu. Monoklonální protilátka (mAb) HFXHC neměla na čas dosažený při testu doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) žádný účinek.

• ·· ·· ·· ·· ···· • · · · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 · 9 9 9

999 999 9999 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 9999 99 99

Samoomezovací účinek na prodloužení doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) byl pozorován i v případě protilátek proti faktoru VIII, což je kofaktor faktoru IXa. Tak například protilátka lidského faktoru VIII SAF8C-IG, pořízená od společnosti Affinity Biologicals, Inc., zvýšila dobu potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) maximálně o přibližně 65 sekund. Poloviční hodnota maximálního prodloužení doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) bylo dosaženo při koncentraci protilátky přibližně 100 nM.

Příklad 3

Účinnost myších monoklonálních protilátek (mAb) faktoru IX u krysího modelu trombózy

Aby bylo možné stanovit účinnost protilátek faktoru IX při prevenci arteriální trombózy, byl použit krysí model trombózy krční tepny popsaný v publikaci Schumacher a spolupracovníci,

J. Cardio. Pharm., 22, 526-533 (1993), který byl pro účely tohoto testu drobně upraven. Tento model sestával v segmentovém poranění endotelu krční tepny kyslíkovými radikály, které byly generovány roztokem chloridu železitého (FeCl₃) , jenž byl aplikován na povrch krční tepny.

Celý postup lze ve stručnosti popsat tak, že krysy byly uspány pentobarbitonem sodným, do krční žíly byla zavedena kanyla pro podávání intravenózních injekcí a dále byla zavedena kanyla do levé stehenní tepny za účelem monitorování krevního tlaku a tepové frekvence. Chirurgickým zákrokem v krku byla za sterilních podmínek izolována krční tepna, • ·< · · · * 444444

4 4 » 4 4 4 4 »· 4 • 444 444 4444 4

4 444 4444

4·· ·· 44 4444 44 44 která byla následně opatřena magnetickou průtokovou sondou pro měření krevního toku. Po určité době stabilizace byly získány základní hodnoty pro tyto proměnné: krevní tok v krční tepně, tlak v tepně, tepová frekvence, doba potřebná k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) a protrombinový čas (PT). Poté byl na uvedenou krční tepnu položen na 15 minut předem změřený filtrační papír Whatman, který byl nasáklý 50procentním roztokem chloridu železitého (FeCl₃) , přičemž tento postup sloužil pro úplné poranění endotelových buněk nacházejících se pod tímto filtračním papírem. Po 60 minutách od odstranění uvedeného papíru nasáklého chloridem železitým (FeCl₃) byl celý experiment ukončen. Na konci experimentu byl trombus nacházející se v krční tepně z této tepny vyjmut a zvážen.

Všechna testovaná činidla byla podávána 15 minut před vznikem poranění krční tepny. Byly zkoumány následující léčby, jež byly porovnávány s monoklonální protilátkou (mAb) faktoru IX BC2.

1. Heparin: jednorázová dávka 15, 30, 60 nebo 120 U/kilogram s následnou infúzí 0,5, 1, 2 nebo 4 U/kilogram/minutu, která trvala 60 minut.

2. Kyselina acetylsalicylová (ASA, aspirin): jednorázová dávka 5 miligramů/kilogram.

3. Monoklonální protilátka (mAb) faktoru IX BC2: jednorázová dávka 1, 3 nebo 6 miligramů/kilogram s následnou infúzi 0,3, 1 nebo 2 U/kilogram/minutu, která trvala 60 minut.

• 00	00 0	00 • 0	00 0	«	0 0 0» 0
* · 0 0	0
• 00· 0	0	0	0	0 0	•	•
0 0	0	0	0	•	0	0 0
«00 00		00	00 0 0	00		00

4. Heparin: jednorázová dávka 30 U/kilogram + 1 U/kilogram/ minutu + ASA v dávce 5 miligramů/kilogram.

5. Monoklonální protilátka (mAb) faktoru IX BC2:

miligram/kilogram + 0,3 mikrogramu/kilogram/minutu + ASA v dávce 5 miligramů/kilogram.

Na přiložených obrázcích 4 a 5 je znázorněno porovnání farmakologie různých režimů podávání antikoagulačních/ antitrombotických činidel, a to. vyjádřením účinku heparinu,

ASA a monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX BC2 na aPTT (obrázek 4) a na PT (obrázek 5).

Klíčový parametr krevní diathézy, kterým je doba potřebná k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT), byl použit jako primární kritérium pro hodnocení účinnosti daného testovaného antikoagulačního/antitrombotického činidla proti sklonu ke krvácení. Z výsledků uvedených na obrázku 4 je patrné prodlužování doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) pomocí haparinu, které bylo závislé na velikosti dávky, přičemž k maximálnímu prodloužení doby srážení, které přesahovalo hranice testu, došlo při podání dvou vyšších dávek. Podání samotné kyseliny acetylsalicylové (ASA) nevedlo k výraznému prodloužení doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT), avšak při podání kyseliny acetylsalicylové (ASA) v kombinaci s heparinem byl pozorován výrazný synergický účinek. Nejslabší účinek na dobu potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) vykázala monoklonální protilátka (mAb) faktoru IX, a to i při podání nejvyšší dávky, přičemž prodloužení doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) nepřesáhlo v žádném případě

» »·		··	··	♦ A	A···
· · ·	•	•	9 ·	• A	•
• ··· ·	•	•	•	1 · ·
• ·	•	•	•	• ·	• ·
• AA ··		• A		··	··

trojnásobek standardní hranice dané dobou potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) při použití běžných antikoagulantů. V této souvislosti je možné jako nejpozoruhodnější zjištění uvést skutečnost, že podání malé dávky monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX BC2 v kombinaci s kyselinou acetylsalicylovou (ASA) nevedlo ke změně doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT).

Z obrázku 5 vyplývá, že k výraznému prodloužení protrombinového času (PT) došlo.rovněž při podání dvou vyšších dávek heparinu a při podání heparinu v kombinaci s kyselinou acetylsalicylovou (ASA). Avšak podání jakékoli dávky uvedené monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX, ať už samotné nebo v kombinaci s kyselinou acetylsalicylovou (ASA), se neprojevilo výraznou změnou protrombinového času (PT).

Účinek heparinu, kyseliny salicylové (ASA) a uvedené monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX na okluzi krční tepny je znázorněn na přiloženém obrázku 6. Z výsledků na tomto obrázku vyplývá, že v odezvě na shora popsané poranění došlo k okluzi krčních tepen u všech zvířat, kterým bylo podáváno samotné vehikulum. Výskyt okluzi u zvířat léčených heparinem se snižoval v závislosti na velikosti dávky heparinu. Jinými slovy v závislosti na velikosti dávky heparinu docházelo k inhibici vzniku okluze krční tepny. Při podání maximální dávky heparinu došlo k úplnému zabránění vzniku okluze krční tepny, nicméně při této dávce heparinu nemohla být vůbec zahájena koagulace. Podání samotné kyseliny acetylsalicylové (ASA) mělo jen malý vliv na výskyt okluzi krční tepny. Podání kyseliny acetylsalicylové (ASA) v kombinaci s heparinem rovněž nevedlo k úplnému zabránění vzniku okluze krční tepny. Při podání dvou vyšších dávek uvedené monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX došlo k úplnému zabránění vzniku okluze krční tepny, přičemž doba koagulace při podání těchto dávek nebyla prodloužena mino klinicky požadovanou hodnotu. Nižší dávka uvedené monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX, která pokud byla podávána samotná nevedla ve většině případů k zajištění průchodnosti tepny, postačovala při podání v kombinaci s kyselinou acetylsalicylovou (ASA) k úplné inhibici vzniku okluze krční tepny.

Účinek heparinu, kyseliny acetylsalicylové (ASA) a uvedené monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX na hmotnost trombu je graficky znázorněn na obrázku 7. Ze zjištěných výsledků vyplynulo, že při podávání heparinu docházelo ke snižování hmotnosti trombu v krční tepně, přičemž snížení hmotnosti bylo tím větší, čím větší dávka heparinu byla podávána. Avšak i při úplném zablokování koagulace byl v krční páteři pozorován zbytkový trombus. Kyselina acetylsalicylová, ať už podávaná samostatně nebo v kombinaci s heparinem (v režimu

U/kilogram) měla na hmotnost trombu jen částečný účinek. Monoklonální protilátka (mAb) faktoru IX snižovala hmotnost trombu v závislosti na velikosti dávky, přičemž při podání vysoké dávky této protilátky docházelo k úplnému zabránění vytvoření trombu. Kromě toho podávání kombinace nízké dávky monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX a kyseliny acetylsalicylové (ASA), což byl léčebný režim, který vedl k úplnému zabránění vzniku okluze krční tepny aniž by byly negativně ovlivněny koagulační indexy, vedlo k úplnému zabránění vytvoření trombu.

« · ·· · · · ·

Uvedené studie provedené na krysím modelu trombózy v krční tepně zcela jasně prokázaly účinnost monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX při prevenci trombózy u modelu vysoce trombogenického tepenného poranění. Nejpozoruhodnějším faktem zjištěným při těchto studiích bylo, že uvedená monoklonální protilátka (mAb) faktoru IX vykazovala shora popsanou účinnost v rámci požadovaného terapeutického antikoagulačního rozsahu (cíle), jenž je definovaný dobou potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT). Dále bylo při uvedených studiích zjištěno, že heparin, což je v současné době standardně používaný antikoagulant, dosáhl účinnosti srovnatelné s monoklonální protilátkou (mAb) faktoru IX pouze v dávkách, které dramaticky omezily koagulaci, a to v takovém rozsahu, že došlo k vytvoření krve, ve které byla koagulace zcela zablokována. Zajímavým zjištěním při výše popsané studii bylo, že zesílení účinku a synergický účinek, který byl pozorován při kombinované léčbě kyselinou acetylsalicylovou (ASA) a heparinem, byl pozorován rovněž při kombinovaném podávání kyseliny salicylové (ASA) s monoklonální protilátkou (mAb) faktoru IX. Avšak na rozdíl od kombinovaného podávání heparinu a kyseliny acetylsalicylové (ASA), které vedlo k posílení jak antitrombotického účinku, tak k posílení antikoagulačního účinku, vedlo kombinované podávání monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX a kyseliny acetylsalicylové k posílení antitrombotického účinku, aniž by došlo k odpovídajícímu účinku na ex vivo koagulační parametry. V souhrnu je tedy možné uvést, že monoklonální protilátka (mAb) faktoru IX vykazuje lepší antitrombotické vlastnosti, než heparin, kyselina acetylsalicylová (ASA) nebo kombinace heparinu a kyseliny acetylsalicylové (ASA).

63.

··♦ · ·

Příklad 4

Řádkovací (skanovací) elektronová mikroskopie krysího modelu trombózy

Byly získány tři skupiny segmentů krysí krční tepny, přičemž první skupina byla tvořena segmenty neporaněné krční tepny (slepý, neboli kontrolní vzorek), druhá skupina byla tvořena segmenty krční tepny vystavené působení samotného chloridu železitého (FeCl₃) a třetí skupina byla tvořena segmenty krční tepny vystavené působení chloridu železitého (FeCl₃) a 6 miligramů/kilogram protilátky faktoru IX, přičemž každá skupina byla tvořena třemi segmenty a tyto segmenty byly odebírány 15 minut po aplikaci chloridu železitého. Vzorky tepen byly zafixovány perfúzí formaldehydem a podvázány nad a pod poraněnou oblastí. Zafixované tepny byly dehydratovány, inkubovány v hexamethyldisilazanu a usušeny v exsikátoru. Získané suché tepny byly směrem zleva otevřeny, umístěny do rastrovacího elektronového mikroskopu (SEM) a poprášeny zlatém.

Řádkovací elektronová mikroskopie (SEM) kontrolního vzorku tepen odhalila normální endotel s řídce rozptýlenými krevními destičkami. Endotel byl na několika místech porušený, což bylo pravděpodobně způsobeno mechanickým poškozením během chirurgického zákroku, a spodní membrána nacházející se pod endotelem byla pokryta vrstvou krevních destiček. U kontrolního vzorku krys (tj. nevystavených působení chloridu železitého) nebyly pozorovány známky vytváření trombu.

• ·

Řádkovací elektronová mikroskopie (SEM) vzorku tepen, které byly vystaveny působení samotného chloridu železitého, odhalila velké intramurální tromby, které zabíraly velkou část průchozí části cévou. Uvedené tromby byly složené shluknutými krevními destičkami, červenými krvinkami a amorfním a fibrilárním proteinovým materiálem. Uvedený proteinový materiál se shodoval s fibrinem. Endotel uvedených tepen byl většinou zakryt uvedenými velkými tromby. V místech, kde byl endotel viditelný, bylo zjištěno, že endotel překrývající oblast vystavenou působení chloridu železitého byl pokryt mnoha přilnutými krevními destičkami a amorfním proteinovým materiálem.

Řádkovací elektronová mikroskopie (SEM) vzorku tepen krys, které byly vystaveny působení samotného chloridu železitého a které byly zároveň vystaveny působení protilátky faktoru IX, odhalila, že průchozí části cév byly většinou prosty trombu. Endotel překrývající oblast vystavenou působení chloridu železitého vykazoval výrazné poškození a některé jeho oblasti byly pokryty přilnutými krevními destičkami a shluky krevních destiček, avšak jen velmi malým množstvím nebo žádným proteinovým materiálem.

Příklad 5

Sekvenční analýza těžkého a lehkého řetězce cDNA monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX BC2

Totální RNA byla přečištěna pomocí činidla TriReagent (Molecular Research Center, lne., Cincinnati, Ohio, USA), a to podle návodu dodávaného výrobcem. RNA byla vysrážena £5.

isopropylalkoholem a rozpuštěna v 0,5% SDS a upravena na 0,5M NaCl. Póly A⁺ RNA byla izolována pomocí produktu Dynabeads Oligo (dT)₂5 (Dynal A. S., Lake Success, NY, USA), a to podle návodu dodávaného výrobcem. Póly A⁺ RNA byla vymyta z uvedených kuliček a resuspendována v TE pufru. Dvanáct alikvotních podílů obsahujících po 100 nanogramech RNA bylo reverzně transkribováno pomocí kitu RT-PCR (Boehringer Mannheim, katalogové číslo 1483-188), a to opět podle návodu dodávaného výrobcem, přičemž pro senzibilaci byl použit produkt dT oligo. Pro těžký řetězec byly s použitím myšího IgG2a závislého primeru (SEQ ID NO: 1) a signální sekvence primeru těžkého řetězce (SEQ ID NO: 2) provedeny amplifikace 6 RNA/DNA hybridů pro 25 cyklů. Podobně pro lehký řetězec byly s použitím myšího kappa primeru (SEQ ID NO: 3) a signální sekvence degenerovaného primeru lehkého řetězce (SEQ ID NO: 4) provedeny amplifikace 6 RNA/DNA hybridů pro 25 cyklů. PCR produkty z každé z uvedených 12 amplifikací byly navázány do PCR2000 vektoru (produkt TA cloning Kit, Invitrogen, katalogové číslo K2000-01). V náhodném pořadí byly odebírány kolonie rekombinantních klonů a byly připraveny minipreparáty plazmidové DNA, přičemž při přípravě těchto minipreparátů byl použit postup alkalické extrakce popsaný v publikaci Birnboim a Doly, Nud. Acids Res., 7, 1513 (1979) . Izolovaná plazmidové DNA byla digestována EcoRI a analyzována na 0,8procentním agarosovém gelu. Inzerované dvouřetězcové cDNA o vhodné velikosti, tj. o velikosti přibližně 700 bp v případě těžkého řetězce a o velikosti přibližně 700 bp v případě lehkého řetězce, byly sekvenovány upravenou metodou dle Sangera. Sekvence všech 12 těžkých a lehkých řetězců byly porovnány za účelem zjištění shodné sekvence variabilního úseku těžkého ·» · · ·· ···· řetězce BC2 (SEQ ID NO: 5) a shodné sekvence variabilního úseku lehkého řetězce BC2 (SEQ ID NO: 6).

Sekvenční analýza cDNA variabilního úseku těžkého řetězce BC2 odhalila existenci otevřeného čtecího rámce obsahujícího 363 nukleotidů, který kódoval sekvenci 121 aminokyselin (SEQ ID NO: 7). CDR 1, 2 a 3 sekvence uvedeného těžkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 8, 9, respektive 10.

Sekvenční analýza cDNA variabilního úseku lehkého řetězce BC2 odhalila existenci otevřeného čtecího rámce obsahujícího 321 nukleotidů, který kódoval sekvenci 107 aminokyselin (SEQ ID NO: 11). Úseky určující komplementaritu (CDR) 1, 2 a 3 sekvence uvedeného těžkého řetězce jsou uvedeny v SEQ ID NO: 12, 13, respektive 14.

Příklad 6

Humanizované protilátky

Bylo vytvořeno šest humanizovaných protilátek, které byly označeny jako SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417,

SB 257731 a SB 257732 a které obsahovaly shora popsané myši úseky určující komplementaritu (CDR) uvnitř lidského základního rámce.

SB 249413

Protilátka SB 249413 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-0 a lehký řetězec F9HZLC 1-0. Syntetický variabilní úsek humanizovaného těžkého řetězce H9HZHC 1-0 byl vytvořen •”5>

• · • ·

• ·

1« «·»·

s použitím prvních tří úseků základního rámce těžkého řetězce získaného z imunoglobulinu RF-TS3'CL (viz. publikace Capra, J. D. a spolupracovníci, J. Clin. Invest., 86, 1320-1328 (1990), který je v databázi Kabat označen jako Kabpro:HhclOw) a s použitím výše popsaných úseků určujících komplementaritu (CDR) těžkého řetězce BC2. Nebyly provedeny žádné substituce aminokyselin základního rámce, které by mohly ovlivnit chování úseku určujícího komplementaritu (CDR). Byly vytvořeny čtyři překrývající se syntetické nukleotidy (SEQ ID NO: 15, 16, 17 a 18), které po tepelném zpracování a roztažení kódovaly aminokyselinové sekvence, jež představovaly variabilní úsek těžkého řetězce a které obsahovaly oblast určující komplementaritu 3 (CDR 3) (SEQ ID NO: 19 a 20). Tento syntetický gen byl následně amplifikován pomocí PCR primerů (SEQ ID NO: 21 a 22) a navázán do vektoru pCR2000 (produkt TA cloning Kit, Invitrogen, katalogové číslo K2000-01) a izolován po restrikční digesci pomocí Spěl, KpnI. Druhý DNA fragment, který kódoval signální sekvenci monoklonální protilátky campath a který obsahoval prvních pět aminokyselin variabilního úseku (SEQ ID NO: 23 a 24), byl vytvořen PCR amplifikací vhodného úseku konstruktu kódujícího těžký řetězec humanizovaného respiračního syncitiálního viru (SEQ ID NO: 25) pomocí dvou primerů (SEQ ID NO: 26 a 27) a digestován restrikčními enzymy EcoRI a Spěl. Uvedené dva vytvořené fragmenty byly navázány do expresního vektoru savčí buňky pFHZHC2-6pCD digestovaného EcoRI, Kpnl, který obsahoval zbytek shodného lidského rámce 4 a konstantní úsek IgGl. Uvedený vektor obsahoval jedinou aminokyselinovou mutaci vektoru pFHZHC2-3pCD, která byla popsána ve zveřejněné mezinárodní přihlášce číslo WO 94/05690. Konečný zbytek základního rámce 2 (zbytek 49) byl mutován ze šeřinu (Ser) na alanin (Ala)digesci • · • · pFHZHC2-3pCD pomocí Xbal a EcoR5 a inzercí línkem vytvořeného ze dvou syntetických oligonukleotidů (SEQ ID NO: 28 a 29). Sekvence inzertu F9HZHC 1-0 je uvedena na SEQ ID NO: 30 a 31.

Syntetický variabilní úsek humanizovaného lehkého řetězce F9HZLC 1-0 byl vytvořen s použitím úseků základního rámce lehkého řetězce získaného z imunoglobulinu LS8'CL (viz. publikace Carmack J. D. a spolupracovníci, J. Exp- Med., 169, 1631-1643 (1989), který je v databázi Kabat označen jako

Kabpro:Hkl318) a s použitím výše popsaných úseků určujících komplementaritu (CDR) těžkého řetězce BC2. Nebyly provedeny žádné substituce aminokyselin základního rámce, které by mohly ovlivnit chování úseku určujícího komplementaritu (CDR). Byly vytvořeny dva překrývající se syntetické nukleotidy (SEQ ID NO: 32 a 33), které po tepelném zpracování a roztažení kódovaly aminokyselinové sekvence, jež představovaly variabilní úsek těžkého řetězce (SEQ ID NO: 34 a 35). Tento syntetický gen byl následně amplifikován pomocí PCR primerů (SEQ ID NO: 36 a 37) a navázán do vektoru pCR2000 (produkt TA cloning Kit, Invitrogen, katalogové číslo K2000-01) a izolován po restrikční digesci pomocí Seal, Sadí. Druhý DNA fragment, který kódoval signální sekvenci monoklonální protilátky campath a který obsahoval první dvě aminokyseliny variabilního úseku (SEQ ID NO: 38 a 39), byl vytvořen PCR amplifikací vhodného úseku konstruktu kódujícího těžký řetězec humanizovaného respiračního syncitiálního viru (SEQ ID NO: 25) pomocí dvou primerů (SEQ ID NO: 26 a 40) a digesci restrikčními enzymy EcoRI a Seal. Uvedené dva vytvořené fragmenty byly navázány do expresního vektoru savčí buňky pFHZLCl-6pCN zpracovaného EcoRI, SacII, který obsahoval zbytek shodného lidského rámce 4 a konstantní úsek kappa. Uvedený

69’

ΦΦ «* » · · » φ ♦ » · · φφ φφφφ vektor obsahoval jedinou aminokyselinovou mutaci vektoru pFHZLCl-lpCN, která byla popsána ve zveřejněné mezinárodní přihlášce číslo WO 94/05690. Konečný zbytek základního rámce 2 byl mutován ze šeřinu (Ser) na prolin (Pro) digescí pFHZLClpCN pomocí Smál a Kpnl a inzercí linkeru vytvořeného ze dvou syntetických oligonukleotidů (SEQ ID NO: 41 a 42). Sekvence inzertu F9HZLC 1-0 je uvedena na SEQ ID NO: 43 a 44.

SB 249415

Protilátka SB 249415 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-1 a lehký řetězec F9HZLC 1-1. Tyto konstrukty těžkého a lehkého řetězce jsou odvozeny od F9HZHC 1-0, respektive F9HZLC 1-0, avšak v jejich základních rámcích byly provedeny substituce aminokyselin, které by mohly ovlivnit chování úseku určujícího komplementaritu (CDR).

F9HZHC 1-1 obsahoval v základním rámci tři substituce aminokyselin, které by mohly ovlivnit chování úseku určujícího komplementaritu (CDR). Byly vytvořeny dva překrývající se syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 45 a 46), které po tepelném zpracování a roztažení kódovaly aminokyselinové sekvence, jež představovaly změněnou část změněného variabilního úseku těžkého řetězce (SEQ ID NO: 47 a 48). Tento syntetický gen byl následně amplifikován pomocí PCR primerů (SEQ ID NO: 49 a 50) a navázán do vektoru pCR2000 (produkt TA cloning Kit, Invitrogen, katalogové číslo K2000-01) a izolován po restrikční digesci pomocí EcoNI, Kpnl. Tento fragment byl navázán do vektoru F9HZHC 1-0 zpracovaného EcoRI, SacII (SEQ ID NO: 30). Sekvence inzertu F9HZHC 1-1 je uvedena na SEQ ID NO: 51 a 52.

• · • · • · a ·

F9HZLC 1-1 obsahoval v základním rámci čtyři substituce aminokyselin, které by mohly ovlivnit chování úseku určujícího komplementaritu (CDR). Byly vytvořeny dva syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 53 a 54), které po tepelném zpracování obsahovaly KpnI a BamHI kohezní konce a kódovaly aminokyselinové sekvence, jež představovaly změněnou část variabilního úseku lehkého řetězce (SEQ ID NO: 55). F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) byl digestován restrikčními enzymy KpnI a BamHI a navázán k syntetické DNA. Sekvence inzertu F9HZLC 1-1 je uvedena na SEQ ID NO: 56 a 57.

SB 249416

Protilátka SB 249416 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-1 (který byl popsán výše) (SEQ ID NO: 52) a lehký řetězec F9HZLC 1-2. Uvedený konstrukt lehkého řetězce je odvozený od F9HZLC 1-1, avšak v jejich základním rámci byly provedeny další substituce aminokyselin, které mohou ovlivnit chování úseku určujícího komplementaritu (CDR).

Byly vytvořeny dva syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 58 a 59), které po tepelném zpracování obsahovaly BamHI a Xbal kohezní konce a kódovaly aminokyselinové sekvence, jež představovaly změněnou část variabilního úseku lehkého řetězce (SEQ ID NO: 60). F9HZLC 1-1 (SEQ ID NO: 56) byl digestován restrikčními enzymy BamHI a Xbal a navázán k syntetické DNA. Sekvence inzertu F9HZLC 1-2 je uvedena na SEQ ID NO: 61 a 62.

í7i··: • · · · · ·· «· ·· ·· ·· » · » · · » · • · · · · * • · 9 · · · · • ♦ · · · « ·

9« ···· ·* ·*

SB 249417

Protilátka SB 249417 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-1 (který byl popsán výše) (SEQ ID NO: 52) a lehký řetězec F9HZLC 2-0. Uvedený syntetický variabilní úsek humanizovaného lehkého řetězce byl vytvořen s použitím úseků základního rámce lidského lehkého řetězce získaného z imunoglobulinu REI (viz. publikace Palm a Hilschmann, Z. Physiol. Chem., 354, 1651-1654 (1973), který je v databázi Kabat označen jako Kabpro:HKL111) a s použitím výše popsaných úseků určujících komplementaritu (CDR) lehkého řetězce BC2. Bylo provedeno pět substitucí aminokyselin. Bylo provedeno šest substitucí aminokyselin základního rámce, které mohou ovlivnit chování úseku určujícího komplementaritu (CDR). Byly vytvořeny dva překrývající se syntetické nukleotidy (SEQ ID NO: 63 a 64), které po tepelném zpracování a roztažení kódovaly aminokyselinové sekvence, jež představovaly variabilní úsek lehkého řetězce (SEQ ID NO: 65 a 66). Tento syntetický gen byl následně amplifikován pomocí PCR primerů (SEQ ID NO: 67 a 68), navázán do vektoru pCR2000 (produkt TA cloning Kit,

Invitrogen, katalogové číslo K2000-01) a izolován po restrikční digesci pomocí Seal, SacII. Druhý DNA fragment, který kódoval signální sekvenci monoklonální protilátky campath a který obsahoval první dvě aminokyseliny variabilního úseku (SEQ ID NO: 38), byl vytvořen PCR amplifikaci vhodného úseku konstruktu kódujícího těžký řetězec humanizovaného antirespiračního syncitiálního viru (SEQ ID NO: 25) pomocí dvou primerů (SEQ ID NO: 26 a 69) a digesci restrikčními enzymy ScoRI a Seal. Třetí DNA fragment, který kódoval zbytek lidského rámce 4 (SEQ ID NO: 70) a který obsahoval SacII a Narl kohezní konce, byl vytvořen tepelným zpracováním dvou

9 •9 9999 syntetických oligonukleotidů (SEQ ID NO: 71 a 72). F9HZLC 1-0 (SEQ ID NO: 43) byl digestován restrikčními enzymy EcoRI a Narl a navázán k uvedeným třem DNA fragmentům. Sekvence inzertu F9HZHC 2-0 je uvedena na SEQ ID NO: 73 a 74.

SB 257731

Protilátka SB 257731 obsahuje těžký řetězec F9HZHC 1-1 (SEQ ID NO: 52) a lehký řetězec F9HZLC 1-3, což byl F9HZLC 1-2 obsahující jedinou aminokyselinovou mutaci (SEQ ID NO: 62). F9HZLC 1-2 byl amplifikován pomocí PCR dvou primerů (SEQ ID NO: 26 a 69) a digestován restrikčními enzymy EcoRI a Seal. Byl izolován fragment o velikosti 94 bp (SEQ ID NO: 75 a 76). Tento fragment byl navázán do vektoru F9HZLC 1-2 digestovaného EcoRI, SacII za účelem produkce konstruktu lehkého řetězce F9HZLC 1-3. Sekvence inzertu F9HZLC 1-3 je uvedena na SEQ ID NO: 77 a 78.

SB 257732

Protilátka SB 257732 obsahuje syntetický variabilní úsek humanizovaného těžkého řetězce F9HZHC 3-0 a lehký řetězec F9HZLC 3-0. Byly vytvořeny čtyři překrývající se syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 79, 80, 81 a 82), které po tepelném zpracování a roztaženi kódovaly aminokyselinové sekvence, jež představovaly změněnou část variabilního úseku těžkého řetězce (SEQ ID NO: 83 a 84). Tento syntetický gen byl následně amplifikován pomocí PCR primerů (SEQ ID NO: 85 a 86), navázán do vektoru pCR2000 (produkt TA cloning Kit,

Invitrogen, katalogové číslo K2000-01) a izolován po restrikční digesci pomocí Stul, Kpnl. Izolovaný fragment byl

9

9999 • ·· ι

73··· navázán do vektoru F9HZHC 1-1 zpracovaného Stul, Kpnl (SEQ ID NO: 52). Tento vektor byl následně zpracován pomocí FcoRI,

Spěl za účelem odstranění signální sekvence. DNA fragment, který kódoval signální sekvenci monoklonální protilátky campath (SEQ ID NO: 23) a který obsahoval prvních pět aminokyselin variabilního úseku, byl vytvořen PCR amplifikací F9HZHC 1-0 pomocí dvou primerů (SEQ ID NO: 26 a 87) a digescí restrikčními enzymy EcoRI a Spěl. Vytvořený fragment byl navázán do vektoru. Sekvence inzertu F9HZHC 3-0 je uvedena na SEQ ID NO: 88 a 89.

Byly vytvořeny čtyři překrývající se syntetické oligonukleotidy (SEQ ID NO: 90, 91, 92 a 93), které po tepelném zpracování a roztažení kódovaly aminokyselinové sekvence, jež představovaly změněnou část variabilního úseku lehkého řetězce (SEQ ID NO: 94 a 95). Tento syntetický gen byl následně amplifikován pomocí PCR primerů (SEQ ID NO: 96 a 97), navázán do vektoru pCR2000 (produkt TA cloning Kit,

Invitrogen, katalogové číslo K2000-01) a izolován po restrikční digescí pomocí Seal, Narl. Izolovaný fragment byl navázán do vektoru F9HZHC 1-3 digestovaného Seal, Narl (SEQ ID NO: 77). Sekvence inzertu F9HZLC 3-0 je uvedena na SEQ ID NO: 98 a 99.

Uvedené humanizované monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX byly exprimovány v CHO buňkách. Buněčná linie DG-44 přizpůsobená pro suspenzní růst v médiu neobsahujícím sérum byla pěstována ve 100 mililitrech média neobsahujícího protein, které však obsahovalo lnásobek nukleosidů a

0,05 procenta F68, přičemž uvedené pěstování probíhalo v jednorázové sterilní Erlenmeyerově baňce o objemu

• * • φ φ φ φ φ φφφφ í?4 « · φ , φφφ · ·

250 mililitrů (Corning) na deskové třepačce Innova 2100 (New Brunswick Scientific), která se pohybovala rychlostí 150 otáček za minutu a byl umístěn v inkubátoru temperovaném na teplotu 37 °C, v němž byla vytvořena atmosféra obsahující 5 procent oxidu uhličitého a 95 procent zvlhčeného vzduchu. Buňky byly dvakrát týdně pasážovány při koncentraci χ 10⁵ buněk/ mililitr. Vždy 15 mikrogramů vektoru pCN-Lc-lehký řetězec a vektoru pCD-Hc-těžký řetězec bylo linearizováno digescí pomocí Notl a linearizované vektory byly společně vysráženy za sterilních podmínek a resuspendovány v 50 mikrolitrech TE pufru (který obsahoval lOmM Tris, 1 mM EDTA a jehož pH bylo 7,5). Uvedená DNA byla elektroporována pomocí zařízení Bio-Rad Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories) do Acc-098 buněk, přičemž při uvedené elektroporaci byl použit postup popsaný v publikaci Hensley a spolupracovníci, J. Biol. Chem., 269, 23949-23958 (1994). 1,2 χ 10⁷ buněk bylo jednou promyto ve 12,5 mililitrech ledově vychlazené PBSacharosy (PBS, 272 mM sacharosy, 7 mM fosfátového pufru o pH 7,4, 1 mM MgCl₂) , resupendováno v 0,8 mililitru PBS, přidáno k 50 mikrolitrům roztoku uvedené DNA a inkubováno na ledě po dobu 15 minut. Buňky byly vystaveny elektrickým pulzům o napětí 380 voltů a kapacitě 25 mikrofaradů a následně inkubovány na ledě po dobu 10 minut. Poté byly buňky naneseny v udržovacím médiu na 96jímková plata, a to v koncentraci χ 10⁵ buněk/plato, přičemž toto nanesení bylo provedeno hodin před selekcí. Buňky byly selektovány podle odolnosti vůči G418 (Geneticin, Life Technologies, lne.), jehož koncentrace činila 400 mikrolitrů/mililitr udržovacího média. 24 hodin před testem byly buňky nasyceny 150 mikrolitry uvedeného udržovacího média.

·· ©···

999

Upravené médium z jednotlivých kolonií bylo testováno s použitím metody elektrochemiluminiscenční (ECL) detekce na analyzátoru Origen (IGEN, lne.). V této souvislosti je možné odkázat na publikaci Yang a spolupracovníci, Biotechnology,

12, 193-194 (1994) .

Roztoky, které byly zapotřebí k provedení uvedených testů (testovací pufr) a pro zajištění provozu uvedeného analyzátoru (roztok pro čištění cely) byly získány od společnosti IGEN. Protilátky (protilátka lidského IgG (specifická k řetězci g), získaná od společnosti Sigma Chemicals; a F(ab')₂ fragment lidského IgG (H+L), získaný od společnosti Kirkegaard & Perry Laboratories lne.) byly označeny TAG-NHS-esterem (IGEN, lne.) v molárním poměru TAG:protein 7:1, zatímco protein A (Sigma) byl označen Biotin-LC-Sulfo-NHS-esterem (IGEN, lne.) v molárním poměru biotin:protein 20:1, přičemž obě značení byla provedena v souladu s doporučeními společnosti IGEM, lne. Magnetické kuličky potažené streptavidinem (M-280) byly získány od společnosti Dynal.

Byly provedeny imunologické studie, při nichž byl použit následující postup: v případě každého vzorku bylo 50 mikrolitrů roztoku kuliček potažených streptavidinem (konečná koncentrace kuliček činila 600 mikrogramů/mililitr, přičemž tyto kuličky byly zředěné v PBS o pH 7,8 s obsahem 1,25 % produktu Tween) smícháno s 50 mikrolitry roztoku komplexu biotin-protein A (konečná koncentrace komplexu činila 1 mikrogram/mililitr, přičemž tento komplex byl zředěný v PBS o pH 7,8 s obsahem 1,25 % produktu Tween) a za neustálého míchání inkubováno 15 minut při teplotě místnosti. Poté bylo ke směsi přidáno 50 mikrolitrů roztoku komplexů TAG-protilátka • 44 ·» · * « · ·44

44 4

4 4 · • 4 4 * φ» 44 (směs ο konečné koncentraci 1,25 mikrogramu F(ab')₂ fragmentu lidského IgG (H+L)/mililitr a 0,25 mikrogramu anti-lidského IgG (specifický k řetězci g)/mililitr, přičemž tyto komplexy byly zředěny v PBS o pH 7,8 s obsahem 1,25 % produktu Tween), vzniklý roztok byl přidán k 50 mikrolitrům upraveného média a výsledná směs byla za neustálého míchání inkubována 1 hodinu při teplotě místnosti. K reakční směsi bylo přidáno 200 mikrolitrů testovacího pufru a u vzorku byla za účelem jeho analýzy změřena na shora uvedeném zařízení Origen elektrochemiluminiscence (ECL)..Ze zjištěných výsledků vyplynulo, že přibližně 20 až 37 procent z testovaných kolonií vylučovalo více než 15 nanogramů/mililitr protilátky s průměrnou expresí přibližně 150 nanogramů/mililitr.

Humanizované monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX byly za účelem snížení zátěže DNA zbaveny přečištěním upraveného média, přičemž při tomto přečištění byl nejprve použit sorpční materiál Procep A a následně byla provedena iontoměničová chromatografíe. Sorpční materiál Procep A (Bioprocessing Ltd., Durham, velká Británie) byl použit jako náplň do kolony s poměrem průměr:výška 1:1. Vyčeřené upravené médium bylo nanášeno na uvedenou kolonu rychlostí 150 centimetrů/hodinu. Kolona byla postupně promývána fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátovým tlumivým roztokem (PBS), PBS obsahující 1 M NaCI a nakonec PBS. Navázaný materiál byl zpětně izolován elucí uvedené kolony 0,lmolární kyselinou octovou. Hodnota pH získaného eluentu byla upravena na 5,5 a takto upravený eluent byl zředěn vodou v poměru 1:4. Tento zředěný roztok byl nanesen na kolonu o rozměrech 2,5 x 13 centimetrů, která byla naplněna S-sefarosou a která byla předem ekvilibrována na pH 5,5, a to promýváním 20 mM roztokem octanu sodného, jež

9 4 • 9 4 • ·

94·· • 4*· probíhalo rychlostí 80 centimetrů/hodinu. Uvedená kolona byla promývána acetátovým pufrem až do získání stabilní základní linie a navázaný protein byl eluován 20 mM roztokem fosforečnanu sodného, jehož pH bylo 7,4 a který protékal kolonou rychlostí 25 centimetrů/hodinu. Získaný eluovaný materiál byl přefiltrován skrz membránu s otvory o velikosti 0,4 mikrometru a skladován při teplotě 4 °C.

Příklad 7

Myší-lidská chimérni protilátka

100 nanogramů RNA BC2 bylo reverzně transkribováno pomoci kitu RT-PCR (Boehringer Mannheim, katalogové číslo 1483-188), a to podle návodu dodávaného výrobcem, s použitím produktu dT oligo pro senzibilaci a PCR amplifikace syntetickými primery Seal (SEQ ID NO: 100) a Narl (SEQ ID NO: 101) za vzniku variabilního úseku lehkého řetězce BC2, který obsahoval Seal, Narl konce (SEQ ID NO: 102 a 103). Tato DNA byla navázána do řetězce F9HZHC 1-3, jenž byl předem digestován Seal, Narl, (SEQ ID NO: 77) a následně digestována pomocí Seal, Narl, čímž došlo k vytvoření lehkého řetězce chimérni myší-lidské protilátky F9CHLC (SEQ ID NO: 104 a 105).

100 nanogramů RNA BC2 bylo reverzně transkribováno pomocí kitu RT-PCR (Boehringer Mannheim, katalogové číslo 1483-188), a to podle návodu dodávaného výrobcem, s použitím produktu dT oligo pro senzibilaci a PCR amplifikace syntetickými primery Spěl (SEQ ID NO: 106) a Nhel (SEQ ID NO: 107) za vzniku variabilního úseku těžkého řetězce BC2, který obsahoval Spěl, Nhel konce (SEQ ID NO: 108 a 109). Signální sekvence ·'· • ♦ · · I · • ·** ♦ · · · » „ · · · · ·Λ8 ·♦ ·· ····

protilátky campath byla PCR amplifikována z těžkého řetězce RSVHZ19 (SEQ ID NO: 25) pomocí EcoRI (SEQ ID NO: 26) a Spěl (SEQ ID NO: 87) primerů. Tyto dva fragmenty DNA byly navázány do vektoru IL4CHHCpcd digestovaného EcoRI, Nhel, jenž byl popsán ve zveřejněné mezinárodní přihlášce číslo WO 95/07301, přičemž variabilní úsek IL4 byl nahrazen variabilním úsekem BC2 myšího faktoru IX, za vzniku těžkého řetězce myší-lidské chimérní protilátky F9CHHC (SEQ ID NO: 110 a 111).

Společná transfekce a přečištění myší-lidské chimérní protilátky chaFIX byly provedeny postupem popsaným výše v souvislosti s lidskými konstrukty.

Příklad 8

Účinnost humanizovaných monoklonálních protilátek (mAb) faktoru IX u krysího modelu trombózy

Aby bylo možné stanovit účinnost humanizovaných monoklonálních protilátek (mAb) faktoru IX při prevenci arteriální trombózy, byl použit krysí model trombózy krční tepny, který byl popsán výše v příkladu 3. Byly získány základní hodnoty pro tyto proměnné: krevní tok v krční tepně, tlak v tepně, tepová frekvence, průchodnost cévy a doba potřebná k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT). Za 15 minut po zjištění těchto základních hodnot byla uvedená krční tepna 10 minut zraňována způsobem popsaným v příkladu 3. Po 60 minutách od počátku poranění krční tepny byly měřeny jednotlivé sledované parametry. Trombus nacházející se v krční tepně byl rovněž z této tepny vyjmut a zvážen.

0 ··»· .te

000 0 0 » · 0 •0 0000

Všechna testovaná činidla byla podávána intravenózně 15 minut před vznikem poranění krční tepny. Byly zkoumány účinky léčby následujícími činidly, jež byly porovnávány s léčbou monoklonální protilátkou (mAb) faktoru IX BC2.

1. vehikulum

2. chaFIX: jednorázová dávka 3 miligramy/kilogram

3. SB 249413: jednorázová dávka 3 miligramy/kilogram

4. SB 249415: jednorázová dávka 3 miligramy/kilogram

5. SB 249416: jednorázová dávka 3 miligramy/kilogram

6. SB 249417: jednorázová dávka 3 miligramy/kilogram

7. SB 257731: jednorázová dávka 3 miligramy/kilogram

6. Heparin: jednorázová dávka 60 jednotek/kilogram + infúze rychlostí 2 jednotky/kilogram/minutu.

Jako primární kritérium pro hodnocení účinnosti daného testovaného antikoagulačního/antitrombotického činidla proti sklonu ke krvácení byla použita doba potřebná k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT). Z výsledků uvedených na obrázku 8 je patrné, že uvedené humanizované monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417 a SB 257731 vykazovaly v dávce 3,0 miligramy/ kilogram mírný účinek na dobu potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT), který spadal do uvedeného terapeuticky přijatelného rozsahu.

Účinky uvedených monoklonálních protilátek (mAb) faktoru IX na hmotnost trombu je graficky znázorněn na obrázku 9. Z uvedených výsledků je patrné, že při snižování hmotnosti trombu vykazovaly všechny testované humanizované monoklonální protilátky (mAb) stejný účinek.

• ·« SO..· »· ··«.·

Uvedené studie provedené na krysím modelu trombózy v krční tepně zcela jasně prokázaly účinnost testovaných humanizovaných monoklonálních protilátek (mAb) faktoru IX při prevenci trombózy u modelu vysoce trombogenického tepenného poranění. Nejpozoruhodnějším faktem zjištěným při těchto studiích bylo, že uvedené humanizované monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX vykazovaly shora popsanou účinnost v rámci požadovaného terapeutického antikoagulačního rozsahu (cíle), jenž je definovaný dobou potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT).

Příklad 9

Biochemické a biofyzikálni vlastnosti protilátky

Metodou MALD-MS bylo stanoveno, že molekulová hmotnost protilátky SB 249417 činí 148 000. Analytickým ultraodstřeďováním protilátky SB 249417 byla zjištěna stejná hodnota. V přítomnosti faktoru IX a Ca²⁺ došlo k sedimentaci protilátek odvozených od BC2, přičemž molekulová hmotnost sedimentu činila 248 000, což odpovídalo součtu hmotností uvedené monoklonální protilátky (mAb) a dvou molekul faktoru IX. Jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti faktoru IX nebyly zjištěny žádné známky agregátů vyššího řádu.

Kinetika vázání faktoru IX k protilátce SB 249417 byla zkoumána analýzou BIAcore, při které byla uvedená protilátka navázána k povrchu imobilizovaného proteinu A. Při analýze byl použit rekombinantní lidský faktor IX (rhFIX, Genetics ·· ··»· ··· • Φΐ ··*

Institute) v koncentrací 49 nM a měření probíhala v přítomnosti 5 mM Ca²⁺.

Uvedená interakce byla charakteristická rychlou asociací, K_ass = 2,0 x 10⁵ M^s¹ a poměrně pomalým uvolňováním,

Kdiss = 4,1 x 10~⁴ s¹. Vypočtená hodnota Kd pro vázání faktoru IX byla 1,9 nM.

V tabulce 1 jsou shrnuty biofyzikální vlastnosti protilátky SB 249417

Tabulka 1 Biofyzikální vlastnosti protilátky SB 249417

Izotyp	IgGl, kappa
Čistota podle SDS-PAGE	>95 % (za redukčních podmínek)
Molekulová hmotnost Hmotnostní spektrometrie Analytické ultraodstředění	148 000 148 000
Stechiometrie vázání faktoru IX Izotermická titrační kalorimetrie	1,5 molu faktoru IX:1 molu mAb
Afinita vázání faktoru IX Izotermická titrační kalorimetrie Biosenzor	Kj = 4 nM při 25 °C Kd = 2 nM
Kinetika vázání faktoru IX Biosenzor	kass = 2,0 x 105 M^s1 kdiss = 4 x 10'4 s'1

V tabulce 2 jsou shrnuty vazebné vlastnosti monoklonálních protilátek podle předmětného vynálezu vzhledem k faktoru IX.

• 0 « • 0

0«

82·«* «· ·· > · » « ·· ····

Vypočtené disociační konstanty byly v podstatě shodné a zjištěné rozdíly byly v rámci experimentální chyby.

Tabulka 2 Kinetika vázání faktoru IX k monoklonálním protilátkám faktoru IX

mAb	kass (M^s1)	kdiss (s )	vypočtená KD (nM)
SB 249417	2,0 χ 105	4,1 χ 10’4	1,9
BC2	4,8 χ 105	9,1 χ 104	1,9
Chf9	2,4 x 10s	3,0 χ 10’4	1,3
SB 249413	6,5 χ 105	2,8 χ 10“3	3,7 - 5,1
SB 249415	7,5 χ 105	1,8 χ 10'4	1,1 - 2,3
SB 249416	5,2 χ 105	4,1 χ 10’4	0,8
SB 257731	9,2 X 105	9,9 x 104	1,1
SB 257732	1,1 χ 106	1,2 χ 10'3	1,5

Interakce mezi rhFIX a SB 249417, BC2 a dalšími humanizovanými konstrukty byly charakterizovány titrační mikrokalorimetrií, při které se měří vazebné interakce v roztoku na základě vlastního vazebného tepla. Do kalorimetru obsahujícího 2 μΜ mAb SB 249417 bylo nastříknuto devět injekcí FIX o koncentraci 106 μΜ. Vázání bylo detekováno pouze u prvních 4 injekcí, a to ve formě uvolněného tepla. V případě zbývajících 5 injekcí byla vazebná místa uvedené monoklonální protilátky (mAb) nasycena a bylo naměřeno jen směšovací teplo. Z výsledků vyplynulo, že bodu ekvivalence bylo podle očekávání dosaženo v blízkosti molárního vazebného poměru 2 FIX na monoklonální protilátky (mAb). Pomocí nelineární analýzy metodou nejmenších čtverců byla získána data týkající se vazebné afinity.

«· ** ·· 9 9 9 •«•3 •

·»« · • · · • * 9 9 ·' · ··· · ·· ·»··

9·

Afinity rhFIX k monoklonálním protilátkám (mAb) byly měřeny při teplotě v rozmezí od 34 °C do 44 °C ve směsi obsahující 10 mM HEPES, 10 mM CaCl₂, 150 mM NaCI, jejíž pH bylo 7,4. Získaná data umožnila přímé stanovení afinity při teplotě 37 °C a vypočtení afinity při teplotě 25 °C pomocí van't Hoffovy rovnice. Z údajů v tabulce 3 vyplývá, že afinity SB 249417, BC2 a dalších jejích humanizovaných konstruktů jsou stejné a liší se jen v rozsahu experimentální chyby (faktor 2).

Tabulka 3 Výsledky titrační kalorimetrie pro monoklonální protilátky FIX (mAb)

mAb	Kd, nM při 25 °C	Kd, nM při 37 °C	Molární vazebný poměr FIX/mAb
BC2	10	20	1,4
SB 249413	6	12	1,9
SB 249415	3	7	1,7
SB 249417	4	12	1,5
SB 257732	4	9	1,8

Všechny monoklonální protilátky (mAb) SB 249413,

SB'249415, SB 249417 a SB 257732 vykázaly při diferenční skanovací kalorimetrii velmi podobnou tepelnou stabilitu. Jejich Tms rozbalení se měnily od 70 °C do 75 °C, což bylo důkazem vysoké stability vůči tepelně indukované denaturaci.

A

A

A A

A

AA • · A · ···

84··* ·· ·· • · · · • · ·

A A ·

A A · A

AA AAAA

AA AAAA

A A

A A a *

A · a

AA AA

Příklad 10

Mechanismus protilátkou zprostředkované inhibice faktoru IX

Byla zkonstruována knihovna chimérních konstruktů složená ze sekvencí faktorů IX navázaných do rámce homologního proteinu faktoru VII, která byla použita pro mapování epitopu monoklonální protilátky (mAb) faktoru IX BC2. Viz. publikace Cheung a spolupracovníci, Thromb. Res., 80, 419-427 (1995).

Vázání bylo měřeno pomocí rezonančního zařízení s povrchovým plazminem BiaCore 2000. Uvedená BC2 protilátka byla NHS/EDC reakcí navázána přímo k danému štěpu. Vázání bylo měřeno během 2 minut kontaktování 20 mikrolitrů/minutu 200 nM každého z uvedených konstruktů v pufru obsahujícím 25 mM MOPS, 0,15 M NaCI, 5 mM CaCl₂, jehož pH bylo 7,4. Disociace byla monitorována po dobu 3 minut, a to s použitím stejného pufru, který neobsahoval protein. V přítomnosti 50 mM EDTA nebylo detekováno žádné vázání k divokému konstruktu. Zjištěné údaje jsou shrnuty v tabulce 4.

Tabulka 4 Souhrn testu vázání konstruktů faktoru IX k BC2 protilátce

Konstrukt	Stupeň vázání
Plazma IXa	Váže se
r-IX	Váže se
Plazma VII	Neváže se
IX LC/VII HC	Váže se
IX-A/VII	Váže se

• 9 • · •οι-··· · · · «85 · · · · »·· ·· ··

Tabulka 4 - dokončení

Konstrukt	Stupeň vázání
VII gla/IX	Neváže se
VII-A/IX	Neváže se
VII gla (IX 3-11)/IX	Váže se
VII gla (IX 3-6)/IX	Váže se velmi málo
VII gla (IX 9-11)/IX	Váže se velmi málo
IX K5A	Váže se

Z výše uvedených údajů vyplývá, že konstrukty obsahující lehký řetězec faktoru IX a těžký řetězec faktoru VII (IX LC/ VII HC); gla faktoru IX a aromatické svazkové domény (IX-A/VII); zbytky 3-11 gla domény faktoru IX v gla doméně faktoru VII (VII gla (IX 3-11)/IX); a faktor IX, ve kterém byl na zbytku 5 lysin nahrazen alaninem (IX K5A), se vázaly k BC2. Konstrukt VII gla (IX 3-11)/IX vykazoval stejnou vaznost k BC2 jako divoký faktor IX (plazma IXa a r-IX). Na základě tohoto pozorování bylo možné konstatovat, že protilátka BC2 se váže k epitopu obsaženému ve zbytcích 3-11 gla domény faktoru IX.

Příklad 11

Léčení arteriální trombózy pomocí protilátky faktoru IX a aktivátoru tkáňového plasminogenu

Podávání tPA s použitím nebo bez použití doplňkových terapií bylo zahájeno po úplné okluzí krční tepny. V uvedené tepně byl nepřetržitě monitorován krevní tok.

♦ · • I* • » • · · ·

Samci krys Sprague-Dawley (Charles River, Raleigh, NC,

USA) o hmotnosti 300 až 400 gramů byly uspány pentobarbitalem sodným (v dávce 55 miligramů/kilogram, podávané intraperitoneálně). Každá krysa byla položena hřbetem na operační stůl ohřívaný na teplotu 37 °C, v jejím krku byl proveden řez a byla z něj vyjmuta trachea, do které byla zavedena kanyla PE-240 (Intramedic). Byla izolována levá krční tepna a levá krční žíla. Pod uvedenou krční tepnu byla umístěna fólie Parafilm M (o velikosti 4 mm², American National Can) a na uvedenou tepnu byla za účelem měření krevního toku umístěna elektromagnetická sonda pro měření krevního toku (Carolina Medical). Do krční žíly byla zavedena kanyla (Tygon, 0,02 x 0,04, Norton Performance Plastics), která sloužila pro podávání léčiva. Poté byla izolována levá stehenní tepna a byla do ní zavedena kanyla za účelem měření krevního tlaku a pro odebíraní krevních vzorků.

Trombóza v uvedené krční tepně byla iniciována kruhovou náplastí o průměru 6,5 milimetru ze skleněného mikrofiltračního papíru, jenž byl nasycen 50procentním roztokem chloridu železitého (FeCl₃) , která byla umístěna na krční tepnu za sondu pro měření krevního toku, a to na dobu 10 minut, jak bylo popsáno výše v příkladu 3. V případě tohoto dobře charakterizovaného modelu docházelo k vytvoření trombu obvykle během 15 minut.

Anti-faktor IX protilátka, SB 249415, byla podána ve formě jednorázové dávky v kombinaci s tPA (Genetech, South San Francisco, CA, USA), zatímco heparin (Elkins-Sinn lne., Cherry Hill, NJ, USA) byl podán ve formě jednorázové dávky s následnou infúzí. Veškeré infúze léčiv probíhaly až do konce • · φφφ φ φφφφ φ experimentu, který trval 60 minut od okluze cévy. Byly odebírány krevní vzorky o objemu 1 mililitr, které byly použity pro test doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) a pro měření protrombinového času (PT), přičemž tyto vzorky byly odebrány v 0. minutě, 30. minutě a 60. minutě (na konci experimentu) ze stehenní tepny do citrátového roztoku o koncentraci 3,8 procenta a následně byly odstředěny. Měření doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) a protrombinového času (PT) probíhalo standardními technikami ve fibrometru (BB1L, Baxter Dade nebo MLA Electra 800 Automatic Coagulation Timer). Na konci experimentu byl trombus vyjmut z krční tepny a zvážen.

Veškerá data jsou udána ve formě střední hodnota ± směrodatná odchylka (SEM) pro udaný počet krys v dané skupině. Pro mnohonásobná porovnání mezi skupinami byl použit test ANOVA a test Bonferoni s akceptovaným koeficientem významnosti p < 0,05.

K vytvoření okluzivního trombu došlo přibližně 15 minut po iniciaci poranění tepny aplikací náplasti, jež byla nasycena chloridem železitým (FeCl₃) , na krční tepnu krys. Jak je patrné z přiloženého obrázku 10, v případě podávání samotného aktivátoru tkáňového plasminogenu (tPA) byla reperfúze okludované cévy pozorována pouze po podání dávky tPA o velikosti 9 miligramů/kilogram, přičemž během 60 minut doby trvání experimentu došlo k obnovení krevního toku ze 67 procent. Podávání této dávky tPA spolu s 60 U heparinu/ kilogram nebo 3 miligramy protilátky faktoru IX /kilogram se neprojevilo dalším zvýšením podílu reperfúze, z čehož byl vyvozen závěr, že při modelu poranění vlivem chloridu železitého (FeCl₃) vzniká trombus, který je jen z 30 procent odolný vůči lýze.

Z výsledků uvedených na obrázku 10 vyplývá, že při podávání nižších dávek tPA byl výskyt reperfúze výrazně závislý na druhu antikoagulantu, jenž byl společně podáván s uvedeným trombolytikem. Pokud bylo podáváno 60 U heparinu/ kilogram, došlo k dramatickému poklesu podílu reperfúze, a to na 12,5 procenta v případě podávání 3 miligramů tPA/kilogram, respektive na 40 procent v případě podávání 6 miligramů tPA/ kilogram. Nicméně podávání 3 miligramů SB 249415/kilogram spolu se 3 miligramy tPA/kilogram se projevilo zvýšením podílu reperfúze na více než 60 procent, respektive na 79 procent v případě podávání spolu se 6 miligramy tPA/kilogram. Bylo tedy zjištěno, že protilátka faktoru IX podle předmětného vynálezu výrazně posouvá křivku odezvy na trombolytickou dávku, což umožňuje dosažení reperfúze při podávání nižších dávek trombolytického činidla.

Trombolýza a vytváření sraženiny jsou dynamické procesy a v některých případech byly pozorovány období průchodnosti cévy s následnou reokluzí. Protože byl krevní tok v krční tepně během 60 minut trvání experimentu nepřetržitě monitorován, bylo rovněž možné stanovit celkovou dobu trvání průchodnosti krční tepny. Jak je patrné z přiloženého obrázku 11, byla celková doba trvání průchodnosti uvedené cévy výrazně prodloužena v případě kombinovaného podávání 3 miligramů protilátky faktoru IX/kilogram a tPA. Tato skutečnost je zvlášť patrná v případě nejnižší a středně vysoké dávky tPA, která činila 3 miligramy/kilogram, respektive miligramů/kilogram. Při kombinované dávce 3 miligramů • ** β9

SB 249415/kilogram a 3 miligramů tPA/kilogram činila celková doba trvání průchodnosti cévy 30,6 ±9,2 minuty, což bylo podstatně více v porovnání s kombinovanou dávkou 60 U heparinu/kilogram a 3 miligramů tPA/kilogram, kdy celková doba trvání průchodnosti cévy činila 7,1 ± 7,1 minuty. V případě podávání samotných 3 miligramů tPA/kilogram byla doba průchodnosti cévy nulová. V případě podávání 6 miligramů tPA/kilogram spolu s heparinem došlo jen k mírnému zvýšení doby trvání průchodnosti cévy na 12,9 ± 6,0 minuty, zatímco při podávání této dávky tPA spolu s protilátkou SB 249415 bylo dosaženo maximální doby trvání průchodnosti cévy, která činila 38,7 ± 8,4 minuty. Pouze při podávání nej vyšší dávky tPA (9 miligramů/kilogram) vedlo společné podávání heparinu k dosažení takové doby trvání průchodnosti cévy, která byla srovnatelná s dobou trvání průchodnosti dosažené při společném podání SB 249415, přičemž tato doba činila v případě heparinu 31,9 ±4,8 minuty a v případě SB 249415 činila tato doba 38,0 ± 8,4 minuty.

Pro minimalizaci poškození ischemické tkáně je kritické rychlé obnovení krevního toku po infarktu tepny. Z výsledků na obrázku 12 je patrné, že podávání kombinace protilátky faktoru IX a tPA vedlo ke zkrácení doby potřebné pro reperfúzi v porovnání s dobou potřebnou pro reperfúzi v případě podávání samotného tPA nebo kombinace heparinu a tPA, přičemž bylo zároveň zjištěno, že uvedeného zkrácení je dosaženo při podávání nižších dávek tPA. Pokud byla trombolýza prováděna podáváním dávky 3 miligramů SB 249415/kilogram spolu se 3 miligramy tPA/kilogram, činila doba do začátku trombolýzy 29,4 ±9,2 minuty. V případě, že byla trombolýza prováděna • 4 » « 4 β

» _ · · · · £0 ·

4*4 44 • · ·

4 4

4·· ·

4 4 4 • 4 44 podáváním pouze 3 miligramů tPA/kilogram, nebyla pozorována žádná reperfúze. Pokud byla trombolýza prováděna podáváním dávky 60 U heparinu/kilogram spolu se 3 miligramy tPA/kilogram, činila doba do začátku trombolýzy

52,8 ± 7,1 minuty. Při vyšších dávkách tPA, tj. při dávce 6 a 9 miligramů/kilogram, bylo při kombinovaném podávání protilátky a tPA dosaženo začátku trombolýzy během 19,4 ± 6,3 minuty, respektive 20,8 ± 8,7 minuty. Bez přidaného antikoagulantu činila doba do začátku trombolýzy při podávání 6 a 9 miligramů tPA/kilogram 60' minut (tj. do skončení experimentu trombolýza nezačala), respektive 27,5 ± 6,4 minuty Při přidání 60 U heparinu/kilogram činila odpovídající doba do začátku trombolýzy 44,0 ±7,1 minuty, respektive 27,0 ± 4,9 minuty. Z výše uvedených výsledků tedy vyplývá, že k reperfúzi docházelo při podávání tPA spolu s SB 249415 vždy dříve, než při podávání heparinu spolu s tPA nebo při podávání samotného tPA.

Příklad 12

Účinek protilátky faktoru IX na hemostatickou funkci

Dopad použití protilátky faktoru IX nebo heparinu jakožto doplňkových činidel na udržení hemostatické funkce byl stanoven monitorováním hladiny fibrinogenu, plasminogenu a a-2-antiplazminu na konci období léčby krys léčených samotným tPA, kombinací tPA a heparinu a kombinací tPA a SB 249415 a získané výsledky byly porovnány s výsledky zjištěnými u krys, kterým bylo podáváno samotné vehikulum. Jak je parné z obrázku 13, vedlo zvyšování dávek tPA k poklesu hladin všech • ·

• · « · ♦ · « · · · · • 9 99 9 9 >

..· ·..· sledovaných hemostatických markérů. Hladina a-2-antiplazminu klesla z hodnoty přibližně 90 procent, která byla zjištěna u zvířat neléčených tPA, na hodnotu přibližně 20 procent, která byla zjištěna po zvýšení dávky tPA na 9 miligramů/kilogram. Hladina plasminogenu klesla z průměrné hodnoty přibližně 100 procent, která byla zjištěna u zvířat neléčených tPA, na hodnotu přibližně 40 procent, která byla zjištěna po zvýšení dávky tPA na 9 miligramů/kilogram. Podobně hladina fibrinogenu klesla z hodnoty přibližně 150 miligramů/decilitr, která byla zjištěna u zvířat neléčených tPA, na hodnotu přibližně 90 miligramů/decilitr, která byla zjištěna u skupiny zvířat, kterým byla podávána vysoká dávka tPA.

Zajímavým zjištěním je skutečnost, že se zdá, že volba daného doplňkového činidla neměla výrazný účinek na kterýkoli z uvedených markérů. Při jakékoli velikosti dávky tPA byly u zvířat, kterým bylo spolu s tPA podáváno vehikulum, 30 nebo 60 U heparinu/kilogram nebo 1 nebo 3 miligramy SB 249415/ kilogram, pozorovány podobné hladiny a-2-antiplazminu, plasminogenu a fibrinogenu, přičemž pozorovaný pokles hladiny hemostatických markérů byl závislý pouze na velikosti dávky trombolytického činidla, tj. tPA, a tyto poklesy, zejména v případě fibrinogenu, se zdají být zvlášť velké při dávce tPA vyšší než 6 miligramů/kilogram, tj. u skupiny zvířat, kterým byly podávány vysoké dávky tPA (9 miligramů/kilogram).

Byly rovněž sledovány účinky různých léčebných režimů na průběh standardního testu doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) a na dobu potřebnou k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) (víz. přiložený obrázek 14).

S rostoucími dávkami tPA vzrostla doba potřebná k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) z hodnoty 19,3 ± 0,6 sekundy pro samotné vehikulum na 30,0 ±1,6 sekundy pro dávku 9 miligramů tPA/kilogram. Podávání 3 miligramů SB 249415/kilogram vedlo u kontrolní skupiny zvířat k omezenému zvýšení doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) na hodnotu

49,6 ± 6,4 sekundy. Pokud byla látka SB 249415 podávána spolu s tPA, bylo pozorované zvýšení mírně vyšší a závislé na velikosti dávky tPA. Při podávání kombinace SB 249415 a 3 miligramů tPA/kilogram byla dosažena doba potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) 58,3 ± 5,2 sekundy, zatímco podávání kombinace SB 249415 a 9 miligramů tPA/kilogram byla doba potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) zvýšena na 77,3 ± 19,7 sekundy. Podávání 30 nebo 60 U heparinu/kilogram vedlo k výraznému zvýšení doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT). V případě, že zvířata byla léčena jen heparinem, byla doba potřebná k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) pro dávky 30 a 60 U heparinu/kilogram v rozmezí od přibližně 300 sekund do 600 sekund. U zvířat, jež byla zároveň léčena tPA činila doba potřebná k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) přibližně 800 sekund.

Zvýšení doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT), které bylo pozorováno v případě léčby heparinem, zejména pokud je toto zvýšení spojené s porušením hemostatických parametrů v důsledku podávání vysokých dávek tPA pro dosažení účinné reperfúze, pravděpodobně přispívá ke sklonům ke krvácení. Na druhé straně podávání látky SB 249415 nezpůsobovalo zvýšení doby potřebné k částečné aktivaci tromboplastinu (aPTT) a umožňovalo použití nižších dávek tPA,

• · · • · · • · * • · · · · ·

což představuje výraznou výhodu při trombolytické terapii infarktu myokardu a mrtvice.

Příklad 13

Látka SB 249417 posiluje při mrtvici lytický potenciál aktivátoru tkáňového plasminogenu

Krysí model tromboembolické mrtvice, který byl použit při těchto studiích, byl v podstatě popsán v publikaci Buch a spolupracovnici, Brain Research, 778, 16-24 (1997). Třemi základními stupni tohoto modelu jsou: příprava embolie, preparace krysy po její embolizaci a farmakologický zákrok.

Od dárcovské (donorové) krysy byl do zkumavky obsahující citrát, ve které byl snížený tlak, odebrán vzorek celé krve. Tato citrátovaná krev (500 mikrolitrů) byla rychle přidána do zkumavky obsahující 1 jednotku lidského trombinu a mikrolitrů 1M roztoku CaCl₂, takže konečná koncentrace CaCl₂ činila 10 mM. Během 5 až 10 sekund byla malá část této směsi natažena do katetru PE50 o délce přibližně 15 centimetrů a byla ponechána srážet 1 hodinu při teplotě místnosti. Po uplynutí této doby byla válcová sraženina vytlačena z uvedeného katetru do Petriho misky obsahující fyziologický roztok a byla nařezána na kousky o délce 1,5 milimetru.

Dvanáct takovýchto kousků (sraženin) bylo přeneseno do fyziologického roztoku obsahujícího 0,04 miligramu/mililitr krysího albuminu a byly v objemu přibližně 60 mikrolitrů nataženy zpět do PE50 katetru. Uvedené sraženiny, tak jak byly v katetru uspořádány, sloužily pro embolizaci krysy.

,?.4

Samci krys Sprague Dawley o hmotnosti 350 až 400 gramů byly chirurgicky připraveni pro podání subkutánní dávky atropinu (0,5 miligramu/kilogram) a byly uspáni Sprocentním isofluranem s tím, že byly udržováni v narkóze dávkou 2procentního isofluranu. Tělesná teplota krys byla udržována v rozmezí od 37 do 38 °C. Za aseptických podmínek byl proveden sagitální řez střední linií krční oblasti, čímž došlo k odhalení společné pravé krční tepny (CCA), vnitřní pravé krční tepny (ICA), vnější pravé krční tepny (ECA) a pterygopalatální tepny. Uvedená pterygopalatální tepna byla podvázána. Byl izolován určitý úsek ECA, která byl následně podvázána a přeříznuta. CCA a ICA byly zasvorkovány a do pahýlu ECA byl zaveden uvedený katetr PE50 obsahující částice způsobující embolii a bylo přistoupeno k bifurkaci. Svorka na ICA byla odstraněna a uvedené částice způsobující embolii byly pomalu infúzně podávány do ICA, zatímco současně byla odstraněna svorka na CCA. Pět minut po provedení embolizace bylo započato s infúzi buď vehikula (fyziologického roztoku), SB 249417 (2,0 miligramy/kilogram) a/nebo tPA (5,0 miligramů/ kilogram), přičemž uvedená infúze byla provedena intravenózně skrz kaudální žílu. Látka SB 249417 byla infúzně podána ve formě jednorázové dávky, zatímco dávka tPA o velikosti 5 miligramů/kilogram byla infúzně podávána ve formě jednorázové dávky o velikosti 10 procent z uvedené celkové dávky tPA a zbývajících 90 procent z uvedené celkové dávky tPA bylo infúzně podáno během 30 minut. Chirurgický řez byl uzavřen a myši byly ponechány zotavit.

Dvacet čtyři hodin po provedení embolizace byly krysy uspány a usmrceny. Z těla každé krysy byl vyjmut mozek a čelní mozkový lalok byl nařezán na proužky o tloušťce 2 milimetry, *· • « • · • · ·

• · 99 9 9 ·· ···· čímž bylo připraveno sedm příčných řezů mozkem. Tyto řezy byly 20 minut inkubovány v lprocentnim roztoku 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloridu a následně zafixovány pomocí formalinu. Vybarvené řezy mozkem byly vyfotografovány a analyzovány pomocí systému zobrazovací analýzy (Optimus lne, Bothell, Washington, USA). Plocha infarzované oblasti v mm² byla vypočtena přenesením infarzované plochy do počítače.

Agregované střední hodnoty infarzované plochy pro každý typ léčby jsou graficky znázorněny na přiloženém obrázku 15 (kontrolní skupina zvířat obsahovala 20 jedinců (n = 20), skupina zvířat léčených tPA obsahovala 7 jedinců (n = 7) a skupina zvířat léčených látkou SB 249417 obsahovala 6 jedinců (n = 6) ) . Pokud byla krysám po provedení embolizace podána dávka tPA o velikosti 5,0 miligramů/kilogram, došlo ke snížení střední hodnoty plochy infarzované oblasti o přibližně 33 procent. Podávání samotné látky SB 249417 vedlo ke snížení střední hodnoty plochy infarzované oblasti o přibližně 70 procent. Podávání kombinace tPA o velikosti dávky 5,0 miligramů/kilogram a látky SB 249417 (v dávce 2,0 miligramy/kilogram), vedlo k další ochraně mozku, což se projevilo ve snížení střední hodnoty plochy infarzované oblasti o přibližně 88 procent (P = 0,126). U tohoto modelu docházelo přibližně stejně často k infarktu v bazální ganglii mozku a neokortexu. Na základě umístění infarzované tkáně se zdá, že nejčastějším místem okluze je střední mozková tepna (MCA). Na základě důkazů bylo rovněž stanoveno, že čas od času docházelo rovněž k okluzi cévnatkové, přední a zadní mozkové tepny, i když k těmto okluzím docházelo méně často. Z pohledu koronární sekce (výsledky testů nejsou zobrazeny), docházelo při léčení hlavně ke snížení plochy infarzované oblasti • · «9 9999 • 9 9 9 9 9 · · * · · ·

Λζ- 9 999 9999

9ÍP 99 99 9999 99 ·· v oblasti perfúze centrální MCA. Distribuce infarzované tkáně se po uvedených léčbách výrazně neměnila.

Z uvedených výsledků vyplývá, že pokud se po embolizaci podává protilátka faktoru. IX, jako je látka SB 249417, může docházet ke snížení vytváření infarzované mozkové tkáně, a to v případě, kdy se uvedená protilátka používá samostatně nebo jako doplňkové činidlo při léčbě trombolytickým činidlem, jako je tPA. Předpokládá se, že protilátky faktoru IX, jako je látka SB 249417, najdou klinické využití při léčení tromboembolické mrtvice, a to buď samotné nebo jako doplněk trombolytických činidel. Kombinovaná terapie by umožnila snížení množství podávaného trombolytického činidla, v důsledku čehož by došlo ke snížení rizika podpory hemoragického šoku.

Předmětný vynález je možné uskutečnit i jinými než shora popsanými způsoby, aniž by došlo k vybočení z jeho rozsahu.

V souladu s tím je pro definici rozsahu tohoto vynálezu třeba vycházet z následujících patentových nároků.

Claims (23)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky pro použití při. léčení post-tromboembolicky indukované ischemie u živočicha.
2. 2. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky pro použití definované v nároku 1, kdy se uvedené léčení provádí po výskytu embolie.
3. 3. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky pro použití definované v nároku 1, kdy se uvedené léčení provádí po mrtvici.
4. 4. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky pro použití definované v nároku 1, kdy uvedená protilátka faktoru IX nebo její fragment má identifikační vlastnosti látky SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417,

   SB 257731 nebo SB 257732.
5. 5. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky pro použití definované v nároku 4, kdy uvedená protilátka faktoru IX nebo její fragment má identifikační vlastnosti látky SB 249417.
6. 6. Látka SB 249417 pro použití při léčení posttromboembolicky indukované ischemie u živočicha.
7. 7. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s aktivátorem plasminogenu pro použití při • 4 • 4 léčení post-trombóembolicky indukované ischemie u živočicha.
8. 8. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s aktivátorem plasminogenu pro použití definované v nároku 7, kdy se uvedené léčení provádí po výskytu embolie.
9. 9. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s aktivátorem plasminogenu pro použití definované v nároku 7, kdy se uvedené léčení provádí po mrtvici.
10. 10. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s aktivátorem plasminogenu pro použití definované v nároku 7, kdy uvedená protilátka faktoru IX nebo její fragment má identifikační vlastnosti látky

    SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 nebo SB 257732.
11. 11. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s aktivátorem plasminogenu pro použití definované v nároku 10, kdy uvedená protilátka faktoru IX nebo její fragment má identifikační vlastnosti látky

    SB 249417.
12. 12. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s aktivátorem plasminogenu pro použití definované v nároku 7, kdy uvedeným trombolytickým činidlem je tPA, urokinasa, streptokinasa nebo jejich varianty.

    • · φφφφ • · · · · · · φ φ φ φ φ φφφφφ φφ φ φφ ΦΦΦΦ φφφφ φ φ φφ φφ φ φφφ φ φφ φφφφ φφ φφφ φ* φφ
13. 13. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s aktivátorem plasminogenu pro použití definované v nároku 12, kdy uvedeným tromboíytickým činidlem je tPA.
14. 14. Látka SB 249417 v kombinaci s tPA pro použití při léčení post-tromboembolicky indukované ischemie u živočicha.
15. 15. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s tromboíytickým činidlem pro použití.při snížení požadované dávky trombolytického činidla při léčení post-tromboembolicky indukované ischemie u živočicha.
16. 16. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s tromboíytickým činidlem pro použití definované v nároku 15, kdy uvedená protilátka faktoru IX nebo její fragment má identifikační vlastnosti látky SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417,

    SB 257731 nebo SB 257732.
17. 17. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s tromboíytickým činidlem pro použití definované v nároku 16, kdy uvedená protilátka faktoru IX nebo její fragment má identifikační vlastnosti látky SB 249417.
18. 18. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s tromboíytickým činidlem pro použití

    100 • · ··· · · · · · o • · ···· · · · · · · ·. · · definované v nároku 15, kdy uvedeným trombolytickým činidlem je tPA, urokinasa, streptokinasa nebo jejich varianty.
19. 19. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky v kombinaci s trombolytickým činidlem pro použití definované v nároku 18, kdy uvedeným trombolytickým činidlem je tPA.
20. 20. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky pro použití při prevenci tromboembolické mrtvice u živočicha, u něhož.existuje riziko výskytu tromboembolické mrtvice.
21. 21. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky pro použití definované v nároku 20, kdy uvedená protilátka faktoru IX nebo její fragment má identifikační vlastnosti látky SB 249413, SB 249415, SB 249416,

    SB 249417, SB 257731 nebo SB 257732.
22. 22. Protilátka faktoru IX nebo fragment této protilátky pro použití definované v nároku 20, kdy uvedená protilátka faktoru IX nebo její fragment má identifikační vlastnosti látky SB 249417.
23. 23. Látka SB 249417 pro použití při prevenci tromboembolické mrtvice u živočicha, u něhož existuje riziko výskytu tromboembolické mrtvice.