HU225874B1 - Antithrombotic agents - Google Patents

Description

A jelen találmány a humán koagulációs faktorhoz vagy kofaktorhoz kötődő monoklonális ellenanyagokra (mAb-k), valamint ezeknek a trombózis inhibitoraként való alkalmazására vonatkozik.

Normális körülmények között a véredények bevonatát képező endoteliális sejtek sérülése, legyen az kicsi vagy nagy, hemosztatikus választ indít be egy eseménysorozaton keresztül, amit általában csak mint koagulációs „kaszkád”-ot ismernek. A kaszkád az oldható fibrinogén oldhatatlan fibrinogénné való konverziójában kulminál, ami a vérlemezkékkel együtt egy lokalizált vérrögöt vagy trombust képez, ami megakadályozza a vér komponenseinek kiszivárgását. A sebgyógyulás aztán a vérrög feloldódása és a véredény integritásának, valamint a véráramlásnak a helyreállása után történik meg.

Azok az események, amik a sérülés és a vérrög képződése között történnek, gondosan szabályozott és kapcsolt reakciósorok. Röviden, a vérben plazma koagulációs fehérje kering inaktív proenzim formájában, valamint számos kofaktor. Az aktív enzimkomplexek a sérülés helyén állnak össze, és szekvenciálisán aktiválódnak szerinproteázokká, és minden egyes, egymást követő szerinproteáz a következő proenzimet katalizálja proteázaktiválásra. Ez az enzimes kaszkád azt eredményezi, hogy minden egyes lépés felnagyítja a következő lépés hatását. A koagulációs kaszkád összefoglalását lásd a szakirodalomban [„Thrombosis and Hemorrhage”, 1. fejezet, szerk.: J. Loscalzo és A. Schafer, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Anglia (1994)].

Miközben a hatékony véralvadás korlátozza a vérveszteséget egy adott sérülési helyen, a vérrögök nem megfelelő képződése a vénákban vagy artériákban a betegség és halál egy általános oka. Az abnormális véralvadási aktivitás származhat kóros állapotokból vagy kóros állapotokban, vagy származhat kezelésekből, azaz például szívinfarktusból, instabil anginából, pitvari fibrillációból, stroke-ból, vesekárosodásból, bőr alatti transzlumenális koronária angioplasztiából, disszeminált intravaszkuláris koagulációból, szepszisből, tüdőembóliából és mélyvénás trombózisból. A vérrögök keletkezése mesterséges szervek, összeköttetések és protézisek, azaz például mesterséges szívbillentyűk felszínén szintén problémát jelent.

A stroke egy vezető halálok, és általános oka az állandó rokkantságnak. A stroke neurológiai deficitjeit eredményező akut fokális agyi ischaemiát leggyakrabban a tromboembólia okozza. A vérrögök képződhetnek szívből és atheromákból. Az in situ trombózis a nagy, extracerebrális agyellátó véredényekben fordulhat elő. A vizsgálatok azt sugallják, hogy véges idő telik el az agyi artéria elzáródása után, ami után szignifikáns irreverzíbilis neuronális károsodás és állandó neurológiai deficit marad vissza [„Stroke Therapy: Basic, Preclinical and Clinical Directions, 14. fejezet, 355-381. oldal, szerk.: L. P. Miller, Wiley-Liss Inc. (1999)].

Az ezeknek a kóros állapotoknak és más trombotikus, valamint embóliás rendellenességeknek a kezelésében használt, jóváhagyott antikoaguláns ágensek közé tartozik a szulfátéit heteropoliszacharid, a heparin és az alacsony molekulasúlyú (LMW) heparin. Ezeket az ágenseket parenterálisan adják be, és a véralvadás gyors, teljes gátlását okozhatják, a trombininhibitor, az antitrombin III aktiválásával és az összes véralvadási faktor inaktiválásával.

Azonban hatásuk miatt a heparin és az LMW heparin hátrányokkal sújtott. A kontrollálatlan vérzés, ami a mozgás egyszerű feszültségeiből, valamint a fizikai tárgyakkal való ezt követő érintkezésből származik, vagy a műtét helyén lép fel, a legfőbb komplikáció, és a folyamatos infúziót kapó betegek közül 1-7%-ban figyelhető meg, míg az intermittáló bolus dózisokat kapó betegek 8-14%-ában figyelhető meg. Ahhoz, hogy ezt a kockázatot minimalizáljuk, folyamatosan mintát veszünk, hogy folyamatosan ellenőrizzük az ex vivő véralvadási időket, ami lényegesen hozzájárul a terápia költségeihez és a beteg kényelmetlenségeihez.

Emellett nagyon szűk az a terápiás tartomány, amivel el lehet érni a hatékonyság kívánt szintjét, anélkül hogy a beteget a vérzés kockázatának tennénk ki. A terápiás tartomány körülbelül 1-3 pg heparin/ml plazma, ami körülbelül 35-100 másodperc aktivált részleges tromboplasztinidő (aPTT) esszé időt eredményez. Ha a heparin koncentrációját 3 pg/ml fölé emeljük, meghaladja a kiválasztott tartományt, és 4 pg/ml fölötti koncentrációkban a véralvadási aktivitás nem mutatható ki. Tehát nagyon óvatosnak kell lenni, hogy a beteg plazmakoncentrációját a terápiás tartományon belül tartsuk.

Egy másik jóváhagyott antikoaguláns, aminek lassúbb és hosszabb ideig tartó a hatása, a warfarin, egy kumarinszármazék. A warfarin a protrombin és más K-vitamin-dependens véralvadási faktor K-vitamin-dependens poszttranszlációs módosításának kompetitoraként hat.

Az antikoaguláns hatás általános mintázata, amiben a vér nem koagulálóvá válik olyan koncentrációban, ami csak valamivel magasabb a terápiás tartománynál, látható a warfarin esetében, valamint a heparin és az LMW heparin esetében.

Az akut szívinfarktusban (Ml) a trombolitikus terápia fő célja az elzáródott véredény korai és állandó reperfúziójának elérése. Az akut szívinfarktus jelenlegi terápiájában egy plazminogén aktivátort, azaz például a szöveti plazminogén aktivátort (tPA), vagy sztreptokinázt és egy antikoagulánst, azaz például nem frakcionált heparint, vagy direkt trombininhibitorokat vagy vérlemezke elleni ágenseket, mint például aszpirint vagy vérlemezke glikoprotein llb/llla blokkolót használnak [Topol: Am. Heart J. 136, S66-S68 (1998)]. A terápiáknak ez a kombinációja azon a megfigyelésen alapul, hogy a vérrögképződés és -feloldódás dinamikus folyamat, és a trombin aktivitása és generálása folytatódik az elzáró vérrög kialakulása után is, valamint a vérrög oldódása során és után is [Granger és munkatársai: J. Am. Coll. Cardiol. 31, 497-505 (1998)].

Az akut szívinfarktus kezelésének optimális stratégiája még mindig bizonytalan, és a hozzáférhető ágen2

HU 225 874 Β1 sek, valamint kezelések mind negatív, mind pozitív jellemzőkkel rendelkeznek. Például a fibrinhez kötött trombin érzéketlen a heparinnal való gátlásra [Becker és munkatársai: „Chemistry and Biology of Serpins”, 6. fejezet, Plenum Press, New York (1997)], és a trombinaktlvitás újra növekedést mutat a heparinterápia megszakítása után, és a heparinbeadás megszakítása után 24 órán belül megnő az infarktus újra megtörténtének a gyakorisága [Watkins és munkatársai: „Catheterization and Cardiovascular Diagnosis”, 44, 257-264 (1998); Granger: CÍrculation 91, 1929-1935 (1995)]. Emellett a vérlemezkeágensek használatát vérzés vagy trombocitopénia kísérheti.

Emellett számos klinikai kísérletben igazolták, hogy a trombolitikus ágensek magas dózisait a plazma hemosztatikus markerek szignifikáns megváltozása kíséri [Rao és munkatársai: J. Clinic. Invest. 101, 10-14 (1988); Bovill és munkatársai: Annals Int. Med. 115, 256-265 (1991); Neuhaus és munkatársai: J. Am. Coll. Cardiol. 19, 885-891 (1992)]. Bár a tPA növekvő koncentrációi a vérrög fokozott feloldódásához vezettek, ezeknek a markereknek a megváltozása a trombolitikus terápia fokozott veszélyeit tükrözi, főleg a súlyos vérzés előfordulását.

A tromboembóliás stroke esetében a trombolitikus terápiát a stroke tünetei után korán (három órán belül) alkalmazzák, hogy megelőzzék az irreverzíbilis károsodást. A jelenleg az ischaemiás és/vagy infarktusos szövet reperfúziójához használt trombolitikus ágensek közé tartoznak a plazminogén aktivátorok, az urokináz és a sztreptokináz. A trombolitikus terápia azonban kapcsolódik egy súlyos vérzés veszélyéhez, és a tromboembóliás stroke trombolitikus terápiája esetében egy lényeges megfontolás, hogy a kezelés fokozza-e az ischaemiás sérülést, haemorrhagia indukálásával.

Tehát világos, hogy igény van olyan antitrombotikus ágensekre, amik hatékonyan kontrollálják a trombotikus rendellenességeket, miközben fenntartják a hemosztatikus funkciókat.

A jelen találmány tárgya anti-IX-es faktor ellenanyag vagy ellenanyag fragmens - mely ellenanyag az SB 249413, SB 249415, SB 249417, SB 257731 és SB 257732 közül van választva - és egy trombolitikus ágens, mely tPA, urokináz, sztreptokináz közül választott, alkalmazása, poszttromboembóliásan indukált ischaemia kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására.

A találmány másik aspektusa eljárás a trombolitikus ágens kívánt mennyiségének csökkentésére állatokban poszttromboembóliásan indukált ischaemia kezelésénél, ahol egy anti-IX-es faktor ellenanyagot vagy ellenanyag fragmenst adunk be a trombolitikus ágenssel kombinációban.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásban említett ábrákat.

Az l.ábra kísérleti eredmények grafikonja, ami a normál humán plazma BC1 és BC2 rágcsáló anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyaggal való titrálását demonstrálja.

A 2. ábra kísérleti eredmények grafikonja, ami a normál humán plazma 9E4(2)F4 és 11G4(1)B9 rágcsáló anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyaggal való titrálását demonstrálja.

A 3. ábra kísérleti eredmények grafikonja, ami a normál humán plazma HFXHC és HFXLC rágcsáló anti-X-es faktor és a HFXI rágcsáló anti-XI-es faktor monoklonális ellenanyaggal való titrálását demonstrálja.

A 4. ábra a kísérleti eredmények hisztogramja, ami a heparin, acetilszalicilsav és rágcsáló IX faktor monoklonális ellenanyag hatását demonstrálja az aktivált részleges tromboplasztinidőre (aPTT) 60 percnél, patkány karotid trombózis modellben.

Az 5. ábra a kísérleti eredmények hisztogramja, ami a heparin, acetilszalicilsav és rágcsáló IX faktor monoklonális ellenanyag hatását demonstrálja a protrombinidőre 60 percnél, patkány karotid trombózis modellben.

A 6. ábra a kísérleti eredmények hisztogramja, ami a heparin, acetilszalicilsav és rágcsáló IX faktor monoklonális ellenanyag hatását demonstrálja a karotid artériás áramlásra, patkány karotid trombózis modellben.

A 7. ábra a kísérleti eredmények hisztogramja, ami a heparin, acetilszalicilsav és rágcsáló IX faktor monoklonális ellenanyag hatását demonstrálja a vérrög súlyára, patkány karotid trombózis modellben.

A 8. ábra a kísérleti eredmények hisztogramja, ami a heparin, a BC2 rágcsáló IX-es faktor monoklonális ellenanyag, egy kiméra IX-es faktor monoklonális ellenanyag és humanizált IX-es faktor monoklonális ellenanyagok hatását demonstrálja az aPTT-re 60 percnél, patkány karotid trombózis modellben.

A 9. ábra a kísérleti eredmények hisztogramja, ami a heparin, a BC2 rágcsáló IX-es faktor monoklonális ellenanyag, egy kiméra IX-es faktor monoklonális ellenanyag és humanizált IX-es faktor monoklonális ellenanyagok hatását demonstrálja a vérrög súlyára, patkány karotid trombózis modellben.

A 10. ábra a kísérleti eredmények hisztogramja, ami az anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyag és a heparin hatását demonstrálja a tPA által előidézett reperfúzióra.

A 11. ábra a kísérleti eredmények hisztogramja, ami az anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyag és a heparin hatását demonstrálja a karotid véredény nyitott voltára.

HU 225 874 Β1

A 12. ábra a kísérleti eredmények hisztogramja, ami az anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyag és a heparin hatását demonstrálja a véráramlás helyreállásának idejére.

A 13. ábra a tPA hatását demonstrálja a hemosztatikus paraméterekre, fibrinogénre, plazminogénre és antiplazminra.

A 14. ábra a tPA, a heparin és az anti-IX-es faktor hatását demonstrálja az aPTT-re.

A 15. ábra a tPA, az SB 249417, valamint a tPA és az SB 249417 kombinációjának hatását demonstrálja az aggregált átlagos infarktus időre tromboembóliás strokeban.

A jelen találmány koagulációs faktorok elleni különböző ellenanyagokat, megváltoztatott ellenanyagokat és ezek fragmenseit biztosítja, amiket önkorlátozó neutralizáló aktivitás jellemez. A koagulációs faktor előnyösen a belső vagy közös koagulációs bioszintézisútból származik. Az a legelőnyösebb, ha az antikoagulációs faktor ellenanyag az anti-IX-es faktor, anti-IXa faktor, anti-X-es faktor, anti-Xa faktor, anti-XI-es faktor, anti-XIa faktor, anti-VIII-as faktor, anti-Vllla faktor, antiV-ös faktor, anti-Va faktor, anti-VII-es faktor, anti-Vlla faktor, antitrombin vagy antiprotrombin. Leginkább az anti-IX-es faktor ellenanyagokat részesítjük előnyben. Az antikoagulációs faktor ellenanyagok példái a humán IX-es faktor elleni SB 249413; SB 249415; SB249416; SB 249417; SB 257731 és SB 257732 humanizált monoklonális ellenanyagok, a humán IX-es faktor elleni kiméra chaFIX monoklonális ellenanyag, a humán IX-es faktor és/vagy a IXa faktor elleni BC1, BC2, 9E4(2)F4 és 11G4(1)B9 rágcsáló monoklonális ellenanyagok, vagy a humán X-es faktor és Xl-es faktor elleni HFXLC és HFXI rágcsáló monoklonális ellenanyagok. Leginkább az SB 249417 antihumán IX-es faktor monoklonális ellenanyagot részesítjük előnyben.

A jelen találmány szerinti ellenanyagokat hagyományos hibridómatechnikákkal, fágbemutatásos kombinatoriális könyvtárakkal, immunglobulinlánc-keveréssel és humanizálási technikákkal lehet előállítani, azzal a céllal, hogy új, önkorlátozó neutralizáló ellenanyagokat állítsunk elő. Idetartoznak a teljesen humán monoklonális ellenanyagok is, amik önkorlátozó neutralizáló aktivitással rendelkeznek. Ezek a termékek jól használhatók azokban a terápiás és gyógyászati készítményekben, amikkel a szívinfarktushoz, instabil anginához, pitvari fibrillációhoz, stroke-hoz, vesekárosodáshoz, tüdőembóliához, mélyvénás trombózishoz, bőr alatti transzlumenális koronáris angioplasztiához, disszeminált intravaszkuláris koagulációhoz, szepszishez, mesterséges szervekhez, összekötésekhez vagy protézisekhez kötődő trombotikus és embóliás rendellenességeket lehet kezelni.

A továbbiakban az „önkorlátozó neutralizáló aktivitás szakkifejezés egy ellenanyagnak azt az aktivitását jelenti, hogy egy humán koagulációs faktorhoz kötődik, ami előnyösen a belső és közös bioszintézisutakból származik, beleértve a IX/IXa faktort, a X/Xa faktort, a

Xl/XIa faktort, a Vlll/Vllla faktort, az V/Va faktort, a Vll/Vlla faktort és a trombint/protrombint, és úgy gátolja a trombózist, hogy a koaguláció korlátozott modulációja történik meg. A „koaguláció korlátozott modulációja” szakkifejezést úgy definiáljuk, mint a véralvadási idő megnövekedését, amit az aktivált részleges tromboplasztinidővel (aPTT) lehet mérni, ahol is a plazma megalvadó állapotban marad, és az aPTT eléri a maximális értékét, a monoklonális ellenanyag növekvő koncentrációja ellenére. A koagulációnak ez a korlátozott modulációja ellentétben van egy meg nem alvadóvá tett plazmával, ami végtelen aPTT-t mutat növekvő koncentrációjú heparin jelenlétében. A jelen találmány szerinti módszerek maximális aPTT-értéke előnyösen a heparin terápiás tartományán belül van. Az a legelőnyösebb, ha a maximális aPTT körülbelül 35 másodperc és körülbelül 100 másodperc között van, ami körülbelül 1,5-3,5-szer nagyobb, mint a normális kontroll aPTT-érték. A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint az aPTT meghosszabbodik, a protrombinidő (PT) szignifikáns meghosszabbodása nélkül.

A „kombinációban” (vmivel) szakkifejezés arra utal, hogy egy terápiás ágenst egy másik terápiás ágens beadása előtt, után vagy azzal egy időben adunk be, egyetlen kezelés során.

A „megváltoztatott ellenanyag” szakkifejezés egy olyan fehérjére utal, amit egy megváltoztatott immunglobulin-régió kódol, amit egy kiválasztott gazdasejtben való expresszióval lehet előállítani. Az ilyen megváltoztatott ellenanyag a génsebészeti úton megváltoztatott ellenanyagok (azaz például kiméra vagy humanizált ellenanyagok) vagy ellenanyagfragmensek, amikből az immunglobulin konstans régiója vagy annak egy része hiányzik, ilyen például az Fv, a Fab, a Fab’ vagy a F(ab’)2 és hasonlók.

A „megváltoztatott immunglobulin-kódolórégió” szakkifejezés egy olyan nukleinsavszekvenciára vonatkozik, ami egy, jelen találmány szerinti megváltoztatott ellenanyagot kódol. Ha a megváltoztatott ellenanyag egy CDR-graftolt vagy humanizált ellenanyag, akkor azokat a szekvenciákat, amik egy nem humán immunglobulinból a komplementaritást meghatározó régiókat (CDR-eket) kódolják, egy első immunglobulin-partnerbe inszertáljuk, ami humán variábilis keretszekvenciákat tartalmaz. Adott esetben az első immunglobulinpartner működés szempontjából egy második immunglobulin-partnerhez van kapcsolva.

Az „első immunglobulin-partner szakkifejezés egy olyan nukleinsavszekvenciára vonatkozik, ami egy humán keretrégiót vagy humán immunglobulin variábilis régiót kódol, amiben a természetes (vagy természetben előforduló), komplementaritást meghatározó régiót kódoló régiókat egy donor ellenanyag komplementaritást meghatározó régióival helyettesítjük. A humán variábilis régió lehet egy immunglobulin nehéz lánc, könnyű lánc (vagy mindkét lánc), egy analóg, vagy a kettő funkcionális fragmensei. Az ilyen CDR régiók, amik az ellenanyag variábilis régiójában találhatók (immunglobulinok), a szakterületen ismert módszerekkel határozhatók meg [például Kábát és munkatársai: Se4

HU 225 874 Β1 quences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) és (1991) írják le a CDR-ek lokalizálásának szabályait]. Emellett ismertek számítógépes programok, amik jól használhatók a CDR régiók/struktúrák azonosításában.

A „második immunglobulin-partner” egy másik nukleotidszekvenciára vonatkozik, ami egy olyan fehérjét vagy peptidet kódol, amihez az első immunglobulinpartner leolvasási keretben, vagy egy opcionális hagyományos linkerszekvencián keresztül fuzionáltatva van (azaz működés szempontjából kapcsolva vannak). Előnyösen ez egy immunglobulingén. A második immunglobulin-partner tartalmazhat egy nukleinsavszekvenciát, ami a teljes konstans régiót kódolja (azaz homológ, ahol is az első és második megváltoztatott ellenanyag ugyanabból a forrásból származik), vagy egy további (azaz heterológ), számunkra érdekes ellenanyagot. Lehet immunglobulin nehéz lánc vagy könnyű lánc (vagy mindkét lánc egyetlen polipeptidrésze). A második immunglobulin-partner nem korlátozódik egy bizonyos immunglobulin-osztályra vagy -izotfpusra. Emellett a második immunglobulin-partner tartalmazhatja egy immunglobulin konstans régió egy részét, amint a Fab-ban vagy a F(ab)₂-ben (azaz egy megfelelő humán konstans régió vagy keretrégió diszkrét része). Az ilyen második immunglobulin-partner emellett tartalmazhat egy olyan szekvenciát is, ami egy integrális membránfehérjét tartalmaz, ami egy gazdasejt külső felszínén található, azaz egy fágbemutató könyvtár egy része, vagy egy olyan szekvenciát, ami az analitikai vagy diagnosztikai kimutatáshoz használható fehérjét kódolja, azaz például torma-peroxidázt, β-galaktozidázt stb.

Az Fv, Fd, Fab, Fab’ vagy F(ab')₂ szakkifejezéseket standard értelmüknek megfelelően használjuk [Harlow és munkatársai: „Antibodies: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)].

A továbbiakban a „génsebészetileg módosított ellenanyag szakkifejezés egy megváltoztatott ellenanyagtípust ír le, azaz például egy teljes hosszúságú szintetikus ellenanyagot (azaz például egy kiméra vagy humanizált ellenanyagot, egy ellenanyagfragmenssel ellentétben), amiben egy kiválasztott akceptor ellenanyag könnyű lánc és/vagy nehéz lánc variábilis doménjeinek egy részét helyettesítjük egy vagy több donor ellenanyagból származó analóg részekkel, amik a kiválasztott epitoppal szemben specifitást mutatnak. Az ilyen molekulák közé tartozhatnak például azok az ellenanyagok, amiket az jellemez, hogy egy humanizált nehéz lánc asszociálódik egy módosítatlan könnyű lánccal (vagy kiméra könnyű lánccal), vagy fordítva. A génsebészetileg módosított ellenanyagokat az is jellemezheti, hogy az akceptor ellenanyag könnyű lánc és/vagy nehéz lánc dómén keretrégiót kódoló nukleinsavszekvenciái vannak megváltoztatva, azzal a céllal, hogy megtartsuk a donor ellenanyag kötési specifitását. Ezek az ellenanyagok tartalmazhatják az akceptorban levő egy vagy több CDR (előnyösen az összes) helyettesítését egy itt ismertetett donor ellenanyagból származó CDR-ekkel.

A „kiméra ellenanyag” szakkifejezés a génsebészetileg megváltoztatott ellenanyag egy típusára vonatkozik, ami egy természetes körülmények között előforduló variábilis régiót (könnyű lánc és nehéz lánc) tartalmaz, ami egy donor ellenanyagból származik, egy akceptor ellenanyagból származó könnyű lánc és nehéz lánc konstans régióval.

A „humanizált ellenanyag” szakkifejezés a génsebészetileg módosított ellenanyag egy olyan típusára vonatkozik, aminek a CDR-jei egy nem humán immunglobulinból származnak, és a molekula többi, immunglobulin-eredetű részei egy vagy több humán immunglobulinból származnak. Emellett a keretrégió támogatócsoportjai is megváltoztathatók, hogy megőrizzük a kötési affinitást [Queen és munkatársai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 10 029-10 032 (1989); Hodgson és munkatársai: Bio/Technology 9, 421 (1991)].

A „donor ellenanyag” szakkifejezés egy olyan monoklonális vagy rekombináns ellenanyagra vonatkozik, ami egy első immunglobulin-partner variábilis régióinak, CDR-jeinek vagy más funkcionális fragmenseinek a nukleinsavszekvenciáit biztosítja, ezzel biztosítja a megváltoztatott immunglobulín-kódolórégiót, és az ennek eredményeképpen kapott expresszált megváltoztatott ellenanyagot, ami a donor ellenanyag antigénspecifitásával és neutralizálójellemzőivel rendelkezik. Az ebben a találmányban használható egyik donor ellenanyag a BC2 jelű, rágcsáló önkorlátozó neutralizáló monoklonális ellenanyag. Más alkalmas donor ellenanyagok lehetnek például a következő rágcsáló önkorlátozó neutralizáló monoklonális ellenanyagok: BC1, 9E4(2)F4, 11 G4(1)B9, HFXLC és HFXI.

Az „akceptor ellenanyag” jelentése olyan monoklonális vagy rekombináns ellenanyag, ami az első immunglobulin-partner nehéz lánc és/vagy könnyű lánc keretrégiókat és/vagy nehéz lánc és/vagy könnyű lánc konstans régiókat kódoló nukleinsavszekvenciákat vagy azoknak egy részét biztosítja. Az akceptor ellenanyag előnyösen egy humán ellenanyag.

A „CDR” jelölés jelentése egy ellenanyag komplementaritást meghatározó régiójának aminosavszekvenciája, amik az immunglobulin nehéz láncok és könnyű láncok hipervariábilis régiói [Kábát és munkatársai: Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) és (1991)]. Egy immunglobulin variábilis részében három nehéz lánc és három könnyű lánc CDR vagy CDR régió van. Tehát a „CDR-ek szakkifejezés jelentése a továbbiakban mind a három nehéz lánc CDR-re vonatkozik, vagy mind a három könnyű lánc CDR-re vonatkozik, vagy mind a nehéz, mind a könnyű lánc CDR-ekre, ha ez megfelelő.

A CDR-ek biztosítják a kontaktcsoportok legnagyobb részét, amikkel az ellenanyag az antigénhez vagy az epitophoz kötődik. Az ebben a találmánnyal jelentőséggel bíró CDR-ek donor ellenanyag variábilis nehéz lánc és könnyű lánc szekvenciákból származnak, és idetartoznak a természetes körülmények között előforduló CDR-ek, amely analógok ugyanazokat az

HU 225 874 Β1 antigénspecifitást és/vagy neutralizálóképességet tartják meg, mint amivel az a donor ellenanyag rendelkezik, amiből származnak.

Az „antigénkötési specifitás vagy neutralizálóképesség megosztása” szakkifejezés azt jelenti például, hogy bár a BC2 monoklonális ellenanyagot jellemzi bizonyos szintű önkorlátozó neutralizáló aktivitás, a BC2 egy nukleinsavszekvenciája által kódolt CDR egy megfelelő strukturális környezetben kisebb vagy nagyobb aktivitással rendelkezhet. Az várható, hogy a BC2 CDR-jei egy ilyen környezetben azért felismerik ugyanazt az epitopot (epitopokat), mint a BC2.

A „funkcionális fragmens szakkifejezés jelentése részleges nehéz lánc vagy könnyű lánc variábilis szekvencia (azaz például az immunglobulin variábilis régió N-terminálisán vagy C-terminálisán minor deléciók vannak), ami megtartja ugyanazt az antigénkötő specifitást és/vagy neutralizálóképességet, mint amivel az az ellenanyag rendelkezik, amiből a fragmens származik.

Az „analóg szakkifejezés jelentése egy legalább egy aminosavpozícióban módosított aminosavszekvencia, amely módosítás lehet kémiai, vagy néhány (azaz maximum 10) aminosav helyettesítése vagy átrendeződése, amely módosítás lehetővé teszi, hogy az aminosavszekvencia megtartsa a módosítatlan szekvencia biológiai jellemzőit, azaz például az antigénspecifitását és magas affinitását. A példaként megadott analógok közé tartoznak a csendes mutációk, amiket helyettesítésekkel lehet előállítani, hogy endogén restrikciós hasítási helyeket hozzunk létre a környező CDR-t kódoló régiókban vagy azok körül.

Az analógok allélvaríánsok is lehetnek. Az „allélvariáns vagy modifikáció szakkifejezés a jelen találmány szerinti peptidszekvenciát kódoló nukleinsavszekvencia megváltoztatása. Ezek a variánsok vagy módosítások a genetikai kód degenerációjának lehetnek a következményei, vagy szándékosan vihetjük be, ami a kívánt jellemzőket biztosítja. Az ilyen variációk vagy módosítások vagy eredményezik valamelyik kódolt aminosavszekvencia megváltozását, vagy nem.

Az „effektorágensek” szakkifejezés nemfehérje hordozómolekulákra vonatkozik, amikhez a megváltoztatott ellenanyagok és/vagy a donor ellenanyag természetes vagy szintetikus könnyű láncai vagy nehéz láncai, vagy a donor ellenanyag hagyományos eszközökkel asszociálható. Az ilyen nemfehérje hordozók közé tartozhatnak hagyományos, a diagnosztika területén alkalmazott hordozók, azaz például a polisztirol vagy más műanyag gyöngyök, poliszacharidok, azaz például amiket a BIAcore (Pharmacia) rendszer alkalmaz, vagy más nemfehérje anyagok, amik jól használhatók a gyógyászat területén, és biztonságosan beadhatók embereknek és állatoknak. Egy másik effektorágens lehet például egy makrociklus, egy nehézfém atom vagy radioaktív izotóp kelátba fogására. Az ilyen effektorágensek arra is jól használhatók lehetnek, hogy növeljék a megváltoztatott ellenanyagok féléletidejét, ilyen például a polietilénglikol.

Az ellenanyagok előállításában való felhasználásra a jelen találmány szerinti megváltoztatott ellenanyagok és fragmensek, egy nem humán faj, azaz például szarvasmarha, juh, majom, csirke, rágcsáló (azaz például rágcsáló és patkány) használható egy kívánt immunglobulin generálására, egy humán koagulációs faktornak való bemutatás után, ami lehet előnyösen a IX/IXa faktor, a X/Xa faktor, a Xl/XIa faktor, a Vlll/Vllla faktor, az V/Va faktor, a Vll/Vlla faktor és a trombin/protrombin vagy ezekből származó peptidepitop. A hagyományos hibridómatechnikákat használjuk arra, hogy egy hibridóma-sejtvonalat biztosítsunk, ami a kiválasztott koagulációs faktor elleni nem humán monoklonális ellenanyagot szekretál. Az ilyen hibridómákat azután a kötődés szempontjából átvizsgáljuk, a IX/IXa faktorral, a X/Xa faktorral, a Xl/XIa faktorral, a Vlll/Vllla faktorral, az V/Va faktorral, a Vll/Vlla faktorral és a trombin/protrombinnal bevont 96 lyukas lemezt használva, a Példák részben ismertetett módon, vagy egy másik változat szerint sztreptavidinnel bevont lemezhez kötött, biotinilezett IX/IXa faktorral, X/Xa faktorral, a Xl/XIa faktorral, Vlll/Vllla faktorral, V/Va faktorral, Vll/Vlla faktorral és trombin/protrombinnal. Egy másik változat szerint teljesen humán monoklonális ellenanyagokat a szakterületen jártas szakember számára ismert technikákkal lehet előállítani, és ezek a jelen találmányban használhatók.

A jelen találmány egy példaként megadott, önkorlátozó neutralizáló monoklonális ellenanyaga a BC2 monoklonális ellenanyag, egy rágcsáló ellenanyag, amit egy kiméra vagy humanizált molekula kifejlesztésére lehet használni. A BC2 monoklonális ellenanyagot a véralvadási időre kifejtett önkorlátozó gátlóaktivitás jellemzi. Amint az aPTT esszével lehet mérni, a BC2 monoklonális ellenanyagnak a véralvadási időre gyakorolt hatásának maximális értéke körülbelül 100 másodperc. A BC2 monoklonális ellenanyag köti a IXa faktort, gátolja a IX-es faktor IXa faktor konverziót, és gátolja a IXa faktor aktivitását. Kétértékű fémkofaktorokra van szükség az aktivitáshoz, és a monoklonális ellenanyag jobb teljesítményt nyújt Ca²⁺, mint Mn²⁺ jelenlétében. Az aPTT esszében a megfigyelt IC₅₀ értéke körülbelül 50 nM. A BC2 monoklonális ellenanyag faji keresztreaktivitást mutat a patkánnyal, és lgG2a izotípusú.

Más, előnyben részesített donor ellenanyagok a rágcsáló monoklonális ellenanyagok, azaz a BC1, a 9A4(2)F4 és a 11G4(1)B9. Ezeket a monoklonális ellenanyagokat a véralvadási időre gyakorolt önkorlátozó gátlóaktivitás jellemzi. Az aPTT esszével végzett mérések szerint ezen monoklonális ellenanyagok hatásának maximális értéke a 9E4(2)F4 esetében körülbelül 90-100 másodperc, míg a 11 G4(1)B9 esetében körülbelül 80 másodperc. A BC1 monoklonális ellenanyag kötődik a IXa faktorhoz, gátolja a IXa faktor aktivitását, de nem gátolja a IX-es faktor-IXa faktor konverziót. A BC1 aPTT esszé megfigyelt IC₅₀-érték körülbelül 35 nM. A BC1 monoklonális ellenanyag IgG 1 izotípusú.

Egy további, előnyben részesített donor ellenanyag, amit a véralvadási időre gyakorolt önkorlátozó gátlóaktivitás jellemez, a HFXLC rágcsáló monoklonális ellenanyag. Az aPTT esszével végzett mérések szerint a HFXLC monoklonális ellenanyag hatásának ma6

HU 225 874 Β1 ximális értéke körülbelül 50-60 másodperc. A HFXLC monoklonális ellenanyag kötődik a X-es faktorhoz, és gátolja a X/Xa faktor aktivitását. Az aPTT esszében megfigyelt IC₅₀-érték körülbelül 20 nM.

További, előnyös donor ellenanyag, amit a véralvadási időre gyakorolt önkorlátozó gátlóaktivitás jellemez, a HFXLC rágcsáló monoklonális ellenanyag. Az aPTT esszével végzett mérések szerint a 4FXLC monoklonális ellenanyag hatásának maximális értéke körülbelül 100 másodperc. A HFXLC monoklonális ellenanyag kötődik a Xl-es faktorhoz, és gátolja a Xl/XIa faktor aktivitást. Az aPTT esszében megfigyelt IC₅₀-érték körülbelül 30 nm.

Bár nem szándékozunk semmilyen, a hatásmechanizmusra vonatkozó elmélethez ragaszkodni, mégis úgy tűnik, hogy ezek a monoklonális ellenanyagok nemkompetitív vagy alloszterikus mechanizmussal szabályozzák a koagulációt, amivel csak részleges gátlás érhető el.

A jelen találmány nem korlátozódik a BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI ellenanyagok vagy ezek hipervariábilis régió- (azaz CDR) szekvenciáinak a használatára. Ezeket bármilyen olyan, megfelelő magas affinitású ellenanyaggal helyettesíthetjük, amiket önkorlátozó neutralizáló aktivitás és ennek megfelelő CDR jellemez. A donor ellenanyagnak az alábbi leírásban BC1-ként, BC2-ként, 9E4(2)F4-ként, 11G4(1)B9-ként, HFXLC-ként vagy HFXI-ként való azonosítását csak illusztrálás és a leírás egyszerűsítése céljából tesszük.

A jelen találmány vonatkozik továbbá a megfelelő humán koagulációs faktor vagy kofaktor elleni monoklonális ellenanyagból származó Fab fragmensekre vagy F(ab’)₂ fragmensekre is. Ezek a fragmensek jól használhatók olyan ágensekként, amik önkorlátozó neutralizáló aktivitással rendelkeznek a koagulációs faktorokkal szemben, előnyösen a IX/IXa faktor, a X/Xa faktor, a Xl/XIa faktor, a Vlll/Vllla faktor, az V/Va faktor, a Vll/Vlla faktor és a trombin/protrombin ellen. Egy Fab fragmens tartalmazza a teljes könnyű láncot és a nehéz lánc N-terminális részét. Egy F(ab')₂ fragmens két Fab fragmensből keletkezik, amiket diszulfidhidak tartanak össze. A BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC, HFXI monoklonális ellenanyagok és más hasonló, erős affinitással rendelkező ellenanyagok biztosítják a Fab fragmensek és F(ab’)₂ fragmensek forrását, amiket hagyományos módszerekkel lehet előállítani, azaz például a monoklonális ellenanyag megfelelő proteolitikus enzimmel, azaz például papainnal és/vagy pepszinnel való hasításával lehet előállítani, vagy rekombináns módszerekkel. Ezek a Fab és F(ab')₂ fragmensek jól használhatók önmagukban is, mint terápiás, profilaktikus vagy diagnosztikai ágensek, valamint szekvenciadonorokként is, beleértve a variábilis régió- és CDR-szekvenciákat, amik az itt ismertetett módon rekombináns vagy humanizált ellenanyagok előállításában használhatók.

A Fab és F(ab')₂ fragmenseket egy kombinatoriális fág könyvtáron keresztül állíthatjuk elő [Winter és munkatársai: Ann. Rév. Immunoi. 12, 433-455 (1994)], vagy immunglobulinlánc-keveréssel [Marks és munkatársai: Bio/Technology 10, 779-783 (1992)], amely publikációkat a továbbiakban teljes egészükben referenciaként kezelünk, és amikben az egy kiválasztott ellenanyagból (azaz például a BC2-ből) származó Fd vagy V_H immunglobulint hagyjuk asszociálódni könnyű lánc immunglobulinok egy repertoárjával, V_L-lel (vagy V_K-val), új Fab-okat képezve. Ezzel szemben egy kiválasztott ellenanyagból származó könnyű lánc immunglobulint hagyhatunk asszociálódni nehéz lánc immunglobulinok (V_H vagy Fd) repertoárjával, új Fab-okat képezve. Az önkorlátozó neutralizáló IX-es faktor Fabokat úgy állíthatjuk elő, hogy hagyjuk, hogy a BC2 monoklonális ellenanyag Fd-je asszociálódjon könnyű lánc immunglobulinok repertoárjával. így tehát lánckeverési technikával ki lehet nyerni az egyedi szekvenciával (nukleotid- és aminosavszekvencia) rendelkező neutralizáló Fab-okat.

Az előzőkben ismertetett BC2 monoklonális ellenanyag vagy más ellenanyagok szolgáltathatnak olyan szekvenciákat, azaz például variábilis nehéz lánc és/vagy könnyű lánc peptidszekvenciákat, keretszekvenciákat, CDR-szekvenciákat, funkcionális fragmenseket és ezek analógjait, valamint az ezeket kódoló nukleinsavszekvenciákat, amik jól használhatók különböző megváltoztatott ellenanyagok tervezésében és előállításában, amiket a donor ellenanyag antigénkötő specifitása jellemez.

A jelen találmány szerinti nukleinsavszekvenciák vagy ezek fragmensei, amik a variábilis könnyű lánc és nehéz lánc peptidszekvenciákat kódolják, szintén jól használhatók arra, hogy specifikus változásokat mutagén módszerrel vezessünk be a CDR-eket vagy keretrégiókat kódoló nukleinsavszekvenciákba, és a kapott módosított vagy fuzionáltatott nukleinsavszekvenciákat egy plazmidba vigyük be az expresszióhoz. Például a keretrégióban és a CDR-t kódoló régióban készített csendes mutációk arra használhatók, hogy restrikciós hasítási helyeket hozzunk létre, amik megkönnyítik a mutagenizált CDR és/vagy keretrégió beépítését. Ezeket a CDR-kódoló régiókat lehet azután használni a jelen találmány szerinti humanizált ellenanyagok készítésében.

A BC2 nehéz lánc variábilis régió nukleinsav- és aminosavszekvenciáját az 5. és 7. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be. Ennek a régiónak a CDR-szekvenciáit a 8., 9. és 10. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

A BC2 könnyű lánc variábilis régió nukleinsav- és aminosavszekvenciáit a 6. és 11. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be. Ennek a régiónak a CDR-szekvenciáit a 12., 13. és 14. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

Ha figyelembe vesszük a genetikai kód degenerációját, akkor különböző kódolószekvenciák készíthetők, amik a jelen találmány szerinti variábilis nehéz lánc és könnyű lánc aminosavszekvenciákat és CDR-szekvenciákat kódolják, valamint ezek funkcionális fragmenseit és analógjait, amiknek az antigénspecifitása ugyanaz, mint a donor ellenanyagnak. A jelen talál7

HU 225 874 Β1 mány szerinti, izolált nukleinsavszekvencia vagy annak fragmensei, amik a variábilis lánc peptidszekvenciáját vagy CDR-jét kódolják, használhatók megváltoztatott ellenanyagok előállítására, azaz például kiméra vagy humanizált ellenanyagok, vagy más, a jelen találmány szerinti, génsebészeti úton megváltoztatott ellenanyagok előállítására, ha működés szempontjából egy második immunglobulin-partnerrel kombináljuk.

Meg kell jegyeznünk, hogy az izolált nukleinsavszekvenciák mellett, amik a megváltoztatott ellenanyagot és az itt ismertetett ellenanyagokat kódolják, a jelen találmányban más ilyen nukleinsavszekvenciákra is gondoltunk, azaz például azokra, amik komplementerek a természetes CDR-t kódoló szekvenciákkal, vagy komplementerek a CDR-t kódoló régiót körülvevő módosított humán keretrégiókkal. A jól használható szekvenciák közé tartoznak azok a szekvenciák, amik szigorú körülmények között hibridizálódnak a DNS-szekvenciákhoz [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. Egy ilyen szigorú hibridizációs körülményre példa az alábbi: hibridizáció 4*SSC-ben 65 °C-on, majd mosás egy óra hosszat 0,1*SSC-ben 65 °C-on. Egy másik változat szerint a szigorú hibridizációs körülmény az alábbi: 50% formamid, 4*SSC 42 °C-on. Ezek a hibridizálódó DNS-szekvenciák előnyösen legalább 18 nukleotidból állnak, azaz méretük körülbelül megegyezik egy CDR méretével.

A megváltoztatott immunglobulin-molekulák képesek megváltoztatott ellenanyagokat kódolni, amik lehetnek génsebészeti úton megváltoztatott ellenanyagok, azaz például kiméra ellenanyagok és humanizált ellenanyagok. Egy kívánt megváltoztatott immunglobulin-kódolórégió CDR-t kódoló régiókat tartalmaz, amik olyan peptideket kódolnak, amik a IX/IXa faktor, a X/Xa faktor, a Xl/XIa faktor, a VII l/VII la faktor, az V/Va faktor, a Vll/Vlla faktor és a trombin/protrombin ellenanyag antigénspecifitásával rendelkeznek, előnyösen egy nagy affinitású ellenanyagéval, azaz például olyanéval, amit a jelen találmány biztosít, egy első immunglobulinpartnerbe, azaz például humán keretrégióba vagy humán immunglobulin variábilis régióba beépítve.

Az első immunglobulin-partner előnyösen működés szempontjából egy második immunglobulin-partnerhez kapcsolódik. A második immunglobulin-partner az, amit az előzőkben definiáltunk, és tartalmazhat egy olyan szekvenciát, ami egy számunkra érdekes második ellenanyag-régiót kódol, például egy Fc régiót. A második immunglobulin-partnerek tartalmazhatnak még egy másik immunglobulint kódoló szekvenciákat is, amikhez a könnyű lánc vagy nehéz lánc konstans régió leolvasási keretben vagy egy linkerszekvencián keresztül van fuzionáltatva. A koagulációs faktorok funkcionális fragmensei vagy analógjai elleni, génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagok úgy tervezhetők meg, hogy ugyanazzal az ellenanyaggal fokozott kötést mutassanak.

A második immunglobulin-partner is asszociálódhat az előzőkben ismertetett effektorágensekhez, beleértve a nemfehérje hordozómolekulákat, amikhez a második immunglobulin-partner hagyományos eszközökkel hozzá lehet kapcsolva.

A második immunglobulin-partnerek, azaz például ellenanyag-szekvenciák, és az effektorágens közötti fúzió vagy kötés bármilyen megfelelő módszerrel létrehozható, például hagyományos kovalens vagy ionos kötéssel, fehérjefúziókkal vagy heterobifunkciós keresztkötő ágensekkel, azaz például karbodiimiddel, glutáraldehiddel és hasonlókkal. Az ilyen technikák ismertek a szakterületen jártas szakember számára, és az ismert kémiai és biokémiai szakkönyvekben le vannak írva.

Emellett a hagyományos linkerszekvenciák, amik egyszerűen a kívánt távolságot biztosítják a második immunglobulin-partner és az effektorágens között, szintén beépíthetők a megváltoztatott immunglobulinkódolórégióba. Az ilyen linkerek tervezése jól ismert a szakterületen jártas szakember számára.

Emellett a jelen találmány szerinti molekulák szignálszekvenciái módosíthatók a szakterületen jártas szakember számára ismert technikákkal, azzal a céllal, hogy fokozzuk expressziójukat.

Egy előnyben részesített megváltoztatott ellenanyag tartalmaz egy variábilis nehéz lánc és/vagy könnyű lánc peptidet vagy fehérjeszekvenciát, ami a BC2 monoklonális ellenanyag antigénspecifitásával rendelkezik, azaz például a V_H és V_L láncokat. Egy további, jelen találmány szerinti, kívánatos ellenanyagot az jellemez, hogy az aminosavszekvencia a BC2 rágcsáló ellenanyag molekula nehéz lánca és/vagy könnyű lánca variábilis régiójának legalább egy, előnyösen az összes CDR-jét tartalmazza, és a többi szekvencia humán forrásból vagy ezek funkcionális fragmenséből vagy analógjaiból származik.

Egy további megvalósítási mód szerint a jelen találmány szerinti megváltoztatott ellenanyag hozzácsatolva tartalmazhat egy további ágenst. Például rekombináns DNS technológiát használhatunk, hogy olyan, jelen találmány szerinti megváltoztatott ellenanyagot állítsunk elő, amiben egy komplett ellenanyag-molekula Fc fragmensét vagy CH2 CH3 doménjét egy enzimmel vagy mással kimutatható molekula helyettesíti (azaz polipeptid effektor vagy riporter molekula).

A második immunglobulin-partner is kapcsolódhat működés szempontjából egy nem immunglobulin pepiidhez, fehérjéhez vagy ennek fragmenséhez, ami heterológ ahhoz a CDR-t tartalmazó szekvenciához képest, ami egy koagulációs faktor, azaz a IX/IXa faktor, a X/Xa faktor, a Xl/XIa faktor, a Vlll/Vllla faktor, az V/Va faktor, a Vll/Vlla faktor és a trombin/protrombin antigénspecifitásával rendelkezik. A keletkező fehérje expresszió után tartalmazhatja a nem immunglobulinnak mind az antigénspecifitását, mind a jellemzőit. A fúziós partner jellemzője lehet például egy funkcionális jellemző, azaz például egy másik kötő- vagy receptordomén, vagy egy terápiás jellemző, ha a fúziós partner maga is terápiás fehérje, vagy további antigéntulajdonságokkal rendelkezik.

A jelen találmány egy további kívánatos fehérjéje tartalmazhat egy teljes ellenanyag-molekulát, ami tar8

HU 225 874 Β1 talmaz teljes hosszúságú nehéz láncokat és könnyű láncokat, vagy ezeknek diszkrét fragmenseit, azaz például a Fab vagy F(ab’)₂ fragmenseket, egy nehéz lánc dimert, vagy ezek bármilyen minimális rekombináns fragmensét, azaz például egy F_v-t vagy egy egyláncú ellenanyagot (SCA) vagy más molekulát, ami ugyanolyan specifitással rendelkezik, mint a donor monoklonális ellenanyag, azaz például a BC1, BC2, 9E4(2)F4, 11 G4(1)B9, HFXLC vagy HFXI. Egy ilyen fehérje használható egy megváltoztatott ellenanyag formájában, vagy használható nem fuzionált formában.

Ha a második immunglobulin-partner egy olyan ellenanyagból származik, ami eltér a donor ellenanyagtól, azaz például az immunglobulin-keretrégió vagy konstans régió bármilyen izotípusa vagy osztálya, akkor egy génsebészetileg megváltoztatott ellenanyag keletkezik. A génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagok tartalmazhatnak immunglobulin (lg) konstans régiókat és variábilis keretrégiókat az egyik forrásból, azaz például az akceptor ellenanyagból, és egy vagy több (előnyösen az összes) CDR-t a donor ellenanyagból, azaz például az itt ismertetett anti-IX/IXa faktor, a X/Xa faktor, a Xl/XIa faktor, a Vlll/Vllla faktor, az V/Va faktor, a Vll/VIla faktor vagy a trombin/protrombin ellenanyagból. Emellett az akceptor monoklonális ellenanyag könnyű lánca és nehéz lánca variábilis dómén keretrégiójának a változtatásai, azaz például deléciója, helyettesítése vagy addíciója a nukleinsav- vagy aminosavszinteken, vagy a donor CDR régiók változtatásai megtehetők, hogy megtartsuk a donor antigénkötési specifitását.

Az ilyen génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagokat úgy tervezik meg, hogy használják a koagulációs faktor monoklonális ellenanyag (ami adott esetben az előzőkben ismertetett módon módosítva van) egyik (vagy mindkét) könnyű lánc és/vagy nehéz láncát, vagy a nehéz lánc és a könnyű lánc CDR-ek közül egyet vagy többet. A jelen találmány szerinti génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagok önkorlátozó neutralizáló aktivitással rendelkeznek.

Az ilyen génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagok tartalmazhatnak egy humanizált ellenanyagot, ami tartalmazza egy kiválasztott humán immunglobulin vagy altípus, vagy egy kiméra ellenanyag keretrégióját, ami a humán könnyű lánc és nehéz lánc konstans régiókat tartalmazza a koagulációs faktor ellenanyag funkcionális fragmenseihez fuzionáltatva. Egy megfelelő humán (vagy más állati) akceptor ellenanyagot kiválaszthatunk például egy hagyományos adatbázisból, azaz például a KÁBÁT adatbázisból, a Los Alamos adatbázisból és a Swiss Protein adatbázisból, a donor ellenanyag nukleotid- és aminosavszekvenciájához viszonyított homológia alapján. Egy humán ellenanyag, amit a donor ellenanyag keretrégióhoz viszonyított homológia jellemez (az aminosavszekvencia alapján), alkalmas lehet arra, hogy egy nehéz lánc variábilis keretrégiót biztosítson a donor CDR-ek beépítéséhez. Egy megfelelő akceptor ellenanyagot, ami képes könnyű lánc variábilis keretrégiókat szolgáltatni, szintén az említett módon választhatunk ki. Meg kell jegyeznünk, hogy az akceptor ellenanyag nehéz láncainak és könnyű láncainak nem kell ugyanabból az akceptor ellenanyagból származniuk.

A heterológ keretrégiókat és konstans régiókat a humán immunglobulin-osztályokból és -izotípusokból választjuk ki, azaz például lehet IgG (1-4-es altípus), IgM, IgA és IgE. Azonban az akceptor ellenanyagnak nem kell csak humán immunglobulin-fehérjeszekvenciákat tartalmaznia. Előállítható például egy olyan gén, amiben egy DNS-szekvencia, ami egy humán immunglobulinlánc egy részét kódolja, olyan DNS-szekvenciához van fuzionáltatva, ami egy nem immunglobulin aminosavszekvenciát, azaz például egy polipeptid effektor vagy riporter molekulát kódol.

Egy különösen előnyben részesített humanizált ellenanyag a BC2 CDR-jeit egy kiválasztott humán ellenanyag szekvencia keretrégióiba beépítve tartalmazza. A neutralizáló humanizált ellenanyagokhoz a IX-es faktor ellenanyag nehéz láncából és/vagy könnyű láncából egy, két vagy előnyösen három CDR-t építünk be a kiválasztott humán ellenanyag szekvencia keretrégióiba, amivel az utóbbi ellenanyag natív CDR-jeit helyettesítjük.

Egy humanizált ellenanyagban a variábilis domének mind a humán könnyű láncokban, mind a nehéz láncokban génsebészetileg meg vannak változtatva, egy vagy több CDR helyettesítésével. Lehetséges mind a hat CDR használata, vagy a hat CDR-nél kevesebb CDR különböző kombinációi. Előnyösen mind a hat CDR-t helyettesítjük. Lehetséges, hogy csak a humán könnyű láncban helyettesítjük a CDR-eket, könnyű láncként a humán akceptor ellenanyagból származó, módosítatlan könnyű láncot használva. Egy további alternatíva az, hogy egy kompatibilis könnyű láncot egy másik humán ellenanyagból választunk ki, a hagyományos ellenanyag-adatbázisokhoz fordulva. A génsebészetileg megváltoztatott ellenanyag többi része bármelyik megfelelő akceptor humán immunglobulinból származhat.

A génsebészetileg megváltoztatott humanizált ellenanyag tehát előnyösen egy természetes humán ellenanyag vagy annak egy fragmense struktúrájával rendelkezik, és a hatékony terápiás alkalmazáshoz szükséges tulajdonságok kombinációjával rendelkezik, azaz például a trombotikus és embóliás betegségek emberekben való kezelésére alkalmas.

A humanizált ellenanyag nehéz lánc aminosavszekvenciája legelőnyösebben a 31., 52. vagy 89. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg. Szintén nagyon előnyös, ha a humanizált ellenanyag könnyű láncának aminosavszekvenciája a 44., 57., 62., 74., 78. vagy 99. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg. Különösen előnyös az SB 249413 humanizált ellenanyag, amiben a nehéz lánc aminosavszekvenciája a 31. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, a könnyű lánc szekvenciája pedig a 44. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg. Szintén különösen előnyös az SB249415 humanizált ellenanyag, amiben a nehéz

HU 225 874 Β1 lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg, a könnyű lánc szekvenciája pedig az 57. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg. Szintén különösen előnyös az SB249416 humanizált ellenanyag, amiben a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg, a könnyű lánc szekvenciája pedig a 62. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg. Szintén különösen előnyös az SB249417 humanizált ellenanyag, amiben a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg, a könnyű lánc szekvenciája pedig a 74. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg. Szintén különösen előnyös az SB257731 humanizált ellenanyag, amiben a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg, a könnyű lánc szekvenciája pedig a 78. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg. Szintén különösen előnyös az SB257732 humanizált ellenanyag, amiben a nehéz lánc aminosavszekvenciája a 89. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg, a könnyű lánc szekvenciája pedig a 99. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciáknak felel meg.

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy egy génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagot tovább lehet módosítani, ha a variábilis dómén aminosavaiban végzünk változtatásokat, anélkül hogy szükségszerűen érintenénk a donor ellenanyag specifitását és nagy affinitását (azaz ez egy analóg). Az várható, hogy a nehéz lánc és a könnyű lánc aminosavai helyettesíthetők egy másik aminosawal, mind a variábilis dómén keretrégiókban, mind a CDR-ben, vagy mindkettőben. Ezeket a helyettesítéseket a donor ellenanyag biztosíthatja, vagy egy bizonyos alcsoport konszenzusszekvencíái.

Emellett a konstans úgy is megváltoztatható, hogy fokozza vagy csökkentse a jelen találmány szerinti molekulák szelektív tulajdonságait. Ilyen például a dimerizáció, az Fc receptorokhoz való kötődés, vagy komplementhez való kötődés vagy annak aktiválása [Angal és munkatársai: J. Mól. Immunoi. 30, 105-108 (1993); Xu és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 269, 3469-3474 (1994); Winter és munkatársai:

EP 307434-B].

Egy megváltoztatott ellenanyag, ami egy kiméra ellenanyag, abban tér el az előzőkben ismertetett humanizált ellenanyagoktól, hogy a teljes nem humán donor ellenanyag nehéz lánc és könnyű lánc variábilis régiókat biztosítja, beleértve a keretrégiókat, a humán immunglobulin konstans régiókkal együtt mindkét lánc esetében. Az várható, hogy azok a kiméra ellenanyagok, amik a jelen találmány szerinti humanizált ellenanyagokhoz viszonyítva megtartják további nem humán szekvenciájukat, szignifikáns immunválaszt válthatnak ki emberekben.

Az ilyen ellenanyagok jól használhatók a trombotikus és embóliás rendellenességek kezelésében, az alábbiakban ismertetett módon.

A BC2 vagy más megfelelő donor monoklonális ellenanyag, azaz például a BC1, 9E4(2)F4, 11G4(1)B9, HFXLC és HFXI variábilis könnyű lánc és/vagy nehéz lánc szekvenciáit és CDR-jeit, valamint az ezeket kódoló nukleinsavszekvenciákat előnyösen a jelen találmány szerinti megváltoztatott ellenanyagok, előnyösen humanizált ellenanyag készítésében lehet felhasználni, az alábbi eljárás alkalmazásával. Az ilyen vagy hasonló technikák szintén használhatók a jelen találmány más megvalósítási módjainak a generálására.

Egy hibridómát, ami egy kiválasztott donor monoklonális ellenanyagot, azaz például a BC2 rágcsáló ellenanyagot termeli, kényelmesen klónozhatunk, és nehéz lánc, valamint könnyű lánc variábilis régiói DNS-ét a szakterületen jártas szakember számára ismert technikákkal elő lehet állítani [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. A BC2-nek a variábilis könnyű lánc és nehéz lánc régióit, amik legalább a CDR-t kódoló régiót tartalmazzák, valamint az akceptor monoklonális ellenanyag könnyű lánc és/vagy nehéz lánc variábilis dómén keretrégióknak azokat a részeit, amik ahhoz kellenek, hogy megtartsuk a donor monoklonális ellenanyag kötési specifítását, valamint a humán immunglobulinból származó ellenanyaglánc többi immunglobulin-eredetű részét polinukleotidprimerekkel és reverz transzkriptázzal állíthatjuk elő. A CDR-t kódoló régiókat az ismert adatbázisok felhasználásával, valamint más ellenanyagokhoz való összehasonlítással azonosíthatjuk.

Azután előállíthatunk egy egér/humán kiméra ellenanyagot, és vizsgálhatjuk kötési képességét. Egy ilyen kiméra ellenanyag tartalmazza a teljes nem humán donor ellenanyag V_H és V_L régióit, a humán lg konstans régiókhoz kapcsolódva, mindkét lánc esetében.

Egy humán ellenanyagból származó nehéz lánc variábilis régió homológ keretrégióit számítógépes adatbázisok, azaz például a KÁBÁT segítségével azonosítjuk, és akceptor ellenanyagként egy olyan humán ellenanyagot választunk ki, ami homológiát mutat a BC2höz. A szintetikus nehéz lánc variábilis régióknak a humán ellenanyag keretrégióban levő BC2 CDR-t kódoló régióinak a szekvenciáját úgy tervezzük meg, hogy optimális nukleotidhelyettesítést kapjunk a keretrégiókban, hogy restrikciós hasítási helyeket építsünk be. Ezt a tervezett szekvenciát azután hosszú szintetikus oligomerekkel szintetizáljuk meg. Egy másik változat szerint a tervezett szekvenciát átlapoló oligonukleotidokkal szintetizálhatjuk meg, polimeráz-láncreakcióval amplifikálva (PCR), és a hibákat kijavítva. Egy megfelelő könnyű lánc variábilis keretrégiót hasonló módon lehet megtervezni.

Egy humanizált ellenanyag származhat a kiméra ellenanyagból, vagy előnyösen előállítható szintetikusan is, oly módon, hogy a donor monoklonális ellenanyag CDR-t kódoló régióit a nehéz láncokból és könnyű láncokból beszúrjuk a kiválasztott nehéz lánc és könnyű

HU 225 874 Β1 lánc keretrégióba. Egy másik változat szerint egy jelen találmány szerinti humanizált ellenanyag előállítható standard mutagenezistechnikákkal. Tehát a kapott humanizált ellenanyag tartalmazza a humán keretrégiókat és a donor monoklonális ellenanyag CDR-t kódoló régióit. A keretrégió-csoportokat azután manipulálhatjuk. A kapott humanizált ellenanyagot azután rekombináns gazdasejtekben, azaz például COS-, CHO- vagy mielómasejtekben expresszáltathatjuk. Más humanizált ellenanyagokat is előállíthatunk ezzel a technikával más alkalmas IX-es faktor-specifikus vagy más koagulációsfaktor-specifikus, önkorlátozó, neutralizáló, nagy affinitású, nem humán ellenanyagokon.

Egy hagyományos expressziós vektort vagy rekombináns plazmidot úgy állítunk elő, hogy ezeket a megváltoztatott ellenanyagot kódoló szekvenciákat operatív kapcsolatba hozzuk hagyományos szabályozó kontrollszekvenciákkal, amik képesek a replikácíó és az expresszió szabályozására egy gazdasejtben, vagy a szekréciónak a gazdasejtből való szekréciójára. A szabályozószekvenciák közé tartoznak a promoterszekvenclák, azaz például a citomegalovíruspromoter, és a szignálszekvenciák, amik más ismert ellenanyagokból is származhatnak. Hasonlóképpen, egy második expressziós vektort is előállíthatunk, olyan DNS-szekvenciát állítva elő, ami egy komplementer ellenanyag könnyű láncot vagy nehéz láncot kódol. Előnyösen ez a második expressziós vektor azonos az elsővel, azzal a különbséggel, hogy mások a kódolószekvenciák és a szelekciós markerek, azzal a céllal, hogy biztosítsuk, amennyire csak lehet, hogy mindegyik polipeptidlánc funkcionálisan expresszálódjon. Egy másik változat szerint a megváltoztatott ellenanyag nehéz láncát és könnyű láncát kódoló szekvenciák lehetnek egyetlen vektoron.

Egy kiválasztott gazdasejtet hagyományos technikákkal kotranszfektáiunk mind az első, mind a második vektorral (vagy egyszerűen transzfektálunk az egyetlen vektorral), hogy előállítsuk a jelen találmány szerinti transzfektált gazdasejtet, ami tartalmazza mind a könnyű láncokat, mind a nehéz láncokat, legyenek azok rekombináns vagy szintetikus eredetűek. A transzfektált gazdasejtet azután hagyományos technikákkal szaporítjuk, hogy előállítsuk a jelen találmány szerinti génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagot. A humanizált ellenanyagot, ami tartalmazza a rekombináns nehéz lánc és/vagy könnyű lánc asszociációját, megfelelő esszével, azaz például ELISA-val vagy RIAval vizsgáljuk át a tenyészetekből. Hasonló hagyományos technikák használhatók más, jelen találmány szerinti megváltoztatott ellenanyagok és molekulák előállítására.

A jelen találmány szerinti készítmények eljárásaiban és készítményeinek készítésében használt klónozási és szubklónozási lépésekhez megfelelő vektorokat a szakterületen jártas szakember képes kiválasztani. Például a klónozóvektorok pUC sorozata, azaz például a pUC19 használható, ami kereskedelmi forgalomban van (Amersham vagy Pharmacia). Emellett bármilyen vektor, ami képes könnyen replikálódni, bőségesen tartalmaz klónozóhelyeket és szelektálható géneket (azaz például antibiotikumrezisztenciát), és könnyen manipulálható, használható a klónozásra. Tehát a klónozóvektor kiválasztása ebben a találmányban nem egy korlátozó faktor.

Hasonlóképpen, a jelen találmány szerinti génsebészetileg megváltoztatott ellenanyag expresszálására használt vektorokat a szakterületen jártas szakember bármelyik hagyományos vektorból kiválaszthatja. A vektorok emellett tartalmaznak szelektált szabályozószekvenciákat (azaz például citomegalovíruspromotereket), amik a kiválasztott gazdasejtekben vezérlik a heterológ DNS-szekvenciák replikációját és expresszióját. Ezek a vektorok tartalmazzák az előzőkben ismertetett DNS-szekvenciákat, amik a megváltoztatott ellenanyag vagy a megváltoztatott immunglobulin-kódolórégiót kódolják. Emellett a vektorok tartalmazhatnak kiválasztott immunglobulin-szekvenciákat, amiket a könnyű manipulálás miatt a kívánt restrikciós hasítási helyek beszúrásával módosítottunk.

Az expressziós vektorokat jellemezhetjük még a heterológ DNS-szekvenciák expressziójának amplifikálására alkalmas génekkel, ilyen például az emlős dihidrofolát-reduktáz (DHFR). Más előnyben részesített vektorszekvencia a poli A szignálszekvencia, azaz például ami a szarvasmarha növekedési hormonból (BGH) származik, és a betaglobin promoterszekvencia (betaglopro). Az itt használható expressziós vektorokat a szakterületen jártas szakember számára jól ismert módszerekkel szintetizálhatjuk meg.

Az ilyen vektorok komponensei, azaz például a replikonok, a szelekciós gének, fokozok, promoterek, szignálszekvenciák és hasonlók, előállíthatók kereskedelmi vagy természetes forrásokból, vagy ismert eljárásokkal megszintetizálhatók, hogy vezéreljék a rekombináns DNS termékének expresszióját és/vagy szekrécióját egy kiválasztott gazdaszervezetben. Más megfelelő expressziós vektorok, amiknek számos típusa ismert a szakterületen az emlős-, bakteriális, rovar-, élesztő- és gombaexpresszióhoz, szintén kiválaszthatók erre a célra.

A jelen találmány vonatkozik továbbá egy olyan sejtvonalra, ami egy olyan rekombináns plazmiddal van transzferálva, ami tartalmazza a génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagokat vagy a megváltoztatott immunglobulin molekuláit kódoló szekvenciákat. Ezeknek a klónozóvektoroknak a klónozásában és más manipulációiban jól használható gazdasejtek szintén konvencionálisak. Azonban az a legjobb, ha az Escherichia coli különböző törzseit használjuk a klónozóvektorok replikációjára és a jelen találmány szerinti megváltoztatott ellenanyagok készítésének más lépéseiben.

A jelen találmány szerinti génsebészetileg megváltoztatott ellenanyag vagy megváltoztatott ellenanyag expresszálására alkalmas gazdasejtek vagy sejtvonalak előnyösen emlőssejtek, azaz például CHO-, COS-, fibroblasztsejtek (azaz például 3T3) és mieloid sejtek, még előnyösebben egy CHO- vagy egy mieloid sejt. Humán sejtek használhatók, ezzel lehetővé téve, hogy a molekula a humán glikozilezési mintázat szerint le11

HU 225 874 Β1 gyen módosítva. Egy másik változat szerint más eukarióta sejtvonalak is használhatók. A megfelelő emlős gazdasejtek és a transzformálási, tenyésztési, amplifikálási, szűrővizsgálati, termék-előállítási és tisztítási eljárások kiválasztása ismert a szakterületen [Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)].

A bakteriális sejtek hasznosnak bizonyulhatnak olyan gazdasejtekként, amik alkalmasak a jelen találmány szerinti rekombináns Fab-ok expresszálására [Plückthun, A.: Immunoi. Rév. 130, 151-188 (1992)]. Azonban mivel a bakteriális sejtekben expresszálódott fehérjék hajlamosak arra, hogy fel nem tekeredett vagy nem megfelelően tekeredett formában legyenek, vagy nem megfelelően glikozilezett formában, bármilyen, bakteriális sejtben előállított rekombináns Fab-ot meg kell vizsgálni, hogy megtartotta-e az antigénkötő képességét. Ha a bakteriális sejt által expresszált molekula megfelelő térszerkezetű, akkor a bakteriális sejt a kívánt gazdaszervezet. Például az Escherichia coli különböző, expresszióra használt törzsei jól ismertek gazdasejtként a biotechnológia területén. A Bacillus subtilis, a Straptomyces, más bacillusok és hasonlók is használhatók.

Ha szükséges, akkor a szakterületen jártas szakember számára ismert élesztőtörzsek is hozzáférhetők gazdasejtként, valamint a rovarsejtek is, azaz például a Drosophila és a Lepidoptera és virális expressziós rendszerek [lásd például Miller és munkatársai: Genetic Engineering 8, 277-298, Plenum Press (1986), valamint az ebben idézett referenciák].

Az általános módszerek, amikkel a jelen találmány szerinti vektorok előállíthatok, a transzfekciós módszerek, amik a találmány szerinti gazdasejtek előállításához szükségesek, és a tenyésztési módszerek, amik a találmány szerint megváltoztatott ellenanyagnak ezekből a sejtekből való előállításához szükségesek, mind hagyományos technikák. Hasonlóképpen, ha egyszer már előállítottuk, akkor a jelen találmány szerinti megváltoztatott ellenanyag a szakterületen ismert standardeljárásokkal tisztítható a sejttenyészetből, beleértve az ammónium-szulfátos kicsapást, az affinitásoszlopokat, az oszlopkromatográfiát, a gélelektroforézist és a hasonlókat. Az ilyen technikák a szakterületen jártas szakember ismereteihez tartoznak, és nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

A humanizált ellenanyag expresszálásának egy további módszere alkalmazhatja az egy transzgenikus állatban való expressziót, amit például a 4,873,416 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetnek. Ez egy olyan expressziós rendszert ismertet, ami az állat kazeinpromoterét alkalmazza, ami azután, hogy transzgenikusan beépül az emlősbe, lehetővé teszi, hogy a nőstény a tejében termelje a kívánt rekombináns fehérjét.

Ha a kívánt ellenanyagot már expresszáltuk, akkor a génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagnak egy megfelelő esszével megvizsgáljuk az in vitro aktivitását. Jelenleg hagyományos ELISA esszé formátumot használunk a génsebészetileg megváltoztatott IX-es faktor vagy más megfelelő koagulációs faktor mennyiségi és minőségi kötési tulajdonságainak a vizsgálatára. Emellett más in vitro esszék is használhatók arra, hogy igazoljuk a neutralizáló hatékonyságot az ezután következő humán klinikai vizsgálatok előtt, amiket azzal a céllal hajtunk végre, hogy kiértékeljük a génsebészetileg megváltoztatott ellenanyag fennmaradását a testben, a szokásos kiürülési mechanizmusok ellenére.

A humanizált ellenanyagok BC2-ből való előállítására ismertetett eljárást követve a szakterületen jártas szakember más, itt ismertetett donor ellenanyagokból, variábilis régiószekvenciákból és CDR-peptidekből is képes humanizált ellenanyagokat előállítani. A génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagokkal olyan variábilis régiókereteket lehet előállítani, amiket potenciálisan „sajátéként ismer fel a génsebészetileg megváltoztatott ellenanyag befogadója. A variábilis régiókeret minor módosításai valósíthatók meg, amikkel az antigénkötődés nagymértékben növelhető, anélkül hogy észrevehető módon növelnénk a befogadó immunogenitását. Az ilyen ellenanyagok az ilyen állapotok diagnosztizálásában is hasznosak lehetnek.

A jelen találmány vonatkozik továbbá trombózis gátlására egy állatban, különösen emberben, ami abból áll, hogy egy antikoagulációs faktor monoklonális ellenanyag hatékony dózisát adjuk be, aminek önkorlátozó neutralizáló aktivitása van, és az SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 257731, SB 257732 közül van választva, és egy plazminogén aktivátorral van kombinálva. A kombinációs terápia a plazminogén aktivátor szuboptimális koncentrációjában fokozza a trombol ízist, csökkentve ezzel a véráramlás helyreállításához szükséges időt, és fokozva a véredény-reperfúzió gyakoriságát és összidőtartamát. A heparinnal ellentétben a kombinációs terápia nem zavarja szignifikánsan a normális hemosztatikus funkciókat, és megvédi a fibrinogén, plazminogén és alfa-2-antiplazmin-szinteket. Ennek megfelelően a jelen találmány tárgya továbbá eljárás egy trombolitikus ágens szükséges dózisának csökkentésére állatban a trombózis kezelése során, ami abból áll, hogy a trombolitikus ágenssel kombinálva egy olyan antikoagulációs faktort adunk be, ami specifikusan célozza meg a belső koagulációs bioszintézisút egy komponensét.

A koagulációs faktor előnyösen a belső vagy közös koagulációs bioszintézisútból származik. Az a legelőnyösebb, ha az antikoagulációs faktor monoklonális ellenanyag egy anti-IX-es faktor, anti-IXa faktor, antiX-es faktor, anti-Xa faktor, anti-XI-es faktor, anti-XIa faktor, anti-VIII-as faktor, anti-Vllla faktor, anti-V-ös faktor, anti-Va faktor, anti-VII-es faktor, anti-Vlla faktor, antritrombin vagy antiprotrombin. A monoklonális ellenanyag lehet egy vagy több, itt ismertetett génsebészetileg megváltoztatott ellenanyag, vagy megváltoztatott ellenanyag, vagy azok fragmensei.

A plazminogén aktivátor előnyösen tPA, sztreptokináz, urokináz. Különösen előnyös a tPA. A tPA-variánsok is előnyösek, a szakirodalomban ismertetett módon [Tachias és Madison: Journal of Biological Che12

HU 225 874 Β1 mistry 272, 14 580-14 585 (1997); Fujuse és munkatársai: Circulation 95, 715-722 (1997); Coombs és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 273, 4323-4328 (1998); Van de Werf és munkatársai: Am. Heart J. Am. Heart J. 137, 786-791 (1999)], valamint a sztreptokináz- és urokinázvariánsok, azaz például az egyláncú urokináz plazminogén aktivátor, az acilezett plazminogén sztreptokináz aktivátor komplex, a vámpírdenevér-eredetű staphylokináz és plazminogén aktivátorok.

Egy másik változat szerint acetilszalicilsavat adhatunk be az antikoagulációs faktor monoklonális ellenanyaggal kombinálva. Néhány esetben a kombinációs terápia csökkenti az antikoagulációs faktor monoklonális ellenanyag terápiásán hatásos dózisát.

A jelen találmány szerinti molekulák használatával indukált terápiás választ a megfelelő koagulációs faktorhoz való kötődés és a koagulációs kaszkád ezt követő önkorlátozó gátlása indukálja. Tehát a jelen találmány szerinti molekulák, ha a terápiás használathoz megfelelő készítményben és kiszerelési formában vannak, akkor nagyon kívánatosak olyan személyek számára, akik abnormális véralvadási aktivitásban szenvednek, vagy ama érzékenyek, ami kapcsolatban van, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a szívinfarktussal, az instabil anginával, a pitvari fibrillációval, a stroke-kal, a vesekárosodással, a tüdőembóliával, a mélyvénás trombózissal és a mesterséges szervekkel és beültetett protézisekkel. Használata különösen előnyös a szívinfarktusban.

Egy további előnyben részesített felhasználási mód a poszttromboembóliásan indukált ischaemia kezelése. Ennek megfelelően a találmány vonatkozik egy anti-IX-es faktor ellenanyag vagy ellenanyag fragmens alkalmazására, mely az SB 249413, SB 249415, SB 249 416, SB 249417, SB 257731, SB 257732 közül van választva, poszttromboembóliásan indukált ischaemia kezelésére. Az ellenanyagot vagy fragmenst beadhatjuk postembolus módon, azaz például azután, hogy egy vérrög, ami a véredényrendszerben bárhol kialakult, az agyi erekbe vándorolt és lerakodott, blokkolva és/vagy redukálva a véráramlást, és ischaemiát okoz. Az ellenanyagot vagy a fragmenst beadhatjuk a stroke után is, azaz azután, hogy egy beteg vagy egy megfigyelő felismeri az embolizációból származó károsodott neurológiai funkciót. Emellett a jelen találmány tárgya anti-IX-es faktor ellenanyag vagy ellenanyag faktor plazminogén aktivátorral való kombinációjának alkalmazása, az ellenanyag az SB 249413, SB 249415, SB 249 416, SB 249 417, SB 257 731, és SB 257732 közül van választva. Az ellenanyagot vagy a fragmenst és a plazminogén aktivátort az embolus vagy a stroke után adhatjuk be. Ezek a kezelések a vaszkuláris perfúzió fennmaradását eredményezik a kollaterális erekben. A jelen találmány szerinti, kezelés utáni kezelési módszerek csillapítják a meghosszabbodott ischaemia következményeit, azaz például a folyamatos patológiás trombózist az ischaemiás ágyban, ami az infarktusos szövet növekedését és nagyobb neurológiai deficiteket okoz.

Emellett a jelen találmány eljárásra is vonatkozik a trombolitikus ágens kívánt mennyiségének csökkentésére poszttromboembóliásan indukált ischaemia kezelésére egy állatban, ami abból áll, hogy egy anti-IX-es faktor ellenanyag fragmenst adunk be a trombolitikus ágenssel kombinálva.

Egy másik előnyben részesített alkalmazás a profilaktikus beadás egy állatnak, ami érzékeny a tromboembóliás stroke-ra. Tehát a jelen találmány továbbá anti-IX-es faktor ellenanyag alkalmazására vonatkozik a tromboembóliás stroke megelőzésére. A tromboembóliás stroke kockázatának kitettek közé tartoznak, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, azok a betegek, akik érzékenyek a pitvari fibrillációra, vagy akik műtéti beavatkozásokon vagy más prokoaguláns invazív technikák alkalmazásán esnek át.

A jelen találmány szerinti megváltoztatott ellenanyag, ellenanyagok és ezek fragmensei használhatók más ellenanyagokkal együtt is, különösen olyan humán monoklonális ellenanyagokkal, amik olyan más markerekkel (epitopok) reakcióképesek, amik felelősek azokért az állapotokért, amik ellen a jelen találmány szerinti génsebészetileg megváltoztatott ellenanyag irányul.

A jelen találmány szerinti terápiás ágensekről azt gondoljuk, hogy az abnormális véralvadási körülmények kezelésében kívánatosak, 1 naptól 3 hétig terjedő ideig, vagy szükség szerint. Ez jelentős előnyt jelent a jelenleg használt antikoaguláns heparinnal és warfarinnal szemben. A kezelés dózisa és időtartama a jelen találmány szerinti molekuláknak a humán keringésben való relatív fennmaradásával áll kapcsolatban, és a szakterületen jártas szakember a kezelendő állapottól és a beteg egészségi állapotától függően be tudja állítani.

A jelen találmány szerinti terápiás ágens beadásának módja lehet bármilyen alkalmas mód, ami az ágenst bejuttatja a gazdaszervezetbe. A megváltoztatott ellenanyagok, ellenanyag, a génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagok és ezek fragmensei, a jelen találmány szerinti plazminogén aktivátor és gyógyászati készítmények különösen jól használhatók parenterális, azaz például szubkután, intramuszkuláris, intravénás vagy intranazális beadáshoz.

A jelen találmány szerinti terápiás ágensek előállíthatok olyan gyógyászati készítmények formájában, amik hatékony mennyiséget tartalmaznak egy jelen találmány szerinti génsebészetileg megváltoztatott (azaz például humanizált) ellenanyagból és plazminogén aktivátorból, mint aktív adalék anyagokból, egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban. Egy másik változat szerint a jelen találmány szerinti gyógyászati készítmények tartalmazhatnak acetilszalicilsavat is. A jelen találmány szerinti profilaktikus ágensben előnyben részesítjük a génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagot tartalmazó vizes szuszpenziót vagy oldatot, ami előnyösen fiziológiás pH-ra van pufferelve, injekciózásra kész kiszerelési formában. A parenterális beadáshoz készített készítmények általában tartalmazzák a jelen találmány szerinti génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagot

HU 225 874 Β1 vagy annak egy koktélját gyógyászatilag elfogadható hordozóban, előnyösen vizes hordozóban oldva. Számos különböző vizes hordozó használható, azaz például 0,4%-os sóoldat, 0,3%-os glicin és hasonlók. Ezek az oldatok sterilek, és általában mentesek a szemcséktől. Ezeket az oldatokat hagyományos, jól ismert sterilezési technikákkal sterilezhetjük (azaz például szűréssel). A készítmények tartalmazhatnak gyógyászatilag elfogadható kiegészítő anyagokat is, amik a fiziológiás körülmények megközelítéséhez szükségesek, ilyenek például a pH-beállító és a pufferelőágensek stb. A jelen találmány szerinti ellenanyag koncentrációja az ilyen gyógyászati készítményben széles határok között változhat, azaz lehet például 0,5%, általában legalább körülbelül 1%-tól körülbelül 15 vagy 20 tömegszázalékig, és elsődlegesen a folyadéktérfogatok, viszkozitások stb. alapján lehet kiválasztani, a kiválasztott beadási módnak megfelelően.

Tehát a jelen találmány szerinti, intramuszkuláris beadásra szánt gyógyászati készítményt úgy állíthatjuk elő, hogy 1 ml steril puffért tartalmazzon, és körülbelül 1 ng-körülbelül 100 mg, azaz például körülbelül 50 ng-körülbelül 30 mg vagy több, előnyösen körülbelül 5 mg-körülbelül 25 mg mennyiséget tartalmazzon egy jelen találmány szerinti génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagból. Hasonlóképpen, egy jelen találmány szerinti, intravénás infúzióhoz előállított gyógyászati készítményt úgy állíthatunk elő, hogy körülbelül 250 ml steril Ringer-oldatot, és körülbelül 1 mg-körülbelül 30 mg, előnyösen körülbelül 5 mg-körülbelül 25 mg mennyiséget tartalmazzon egy jelen találmány szerinti génsebészetileg megváltoztatott ellenanyagból. A parenterálisan beadható készítmények előállításának aktuális módszerei jól ismertek, vagy nyilvánvalóak lesznek a szakterületen jártas szakember számára, és részletesebben le vannak írva a vonatkozó szakirodalomban [Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. kiadás, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania].

Az az előnyös, ha a jelen találmány szerinti terápiás ágens, ha gyógyászati készítményben van, akkor egységdózis formájában van jelen. A megfelelő terápiásán hatásos dózist a szakterületen jártas szakember könnyen meg tudja határozni. Ahhoz, hogy egy emberben vagy más állatban hatékonyan kezeljünk egy trombotikus vagy embóliás rendellenességet, egy dózisnak körülbelül 0,1 mg-körülbelül 20 mg testsúly-kg jelen találmány szerinti fehérjét vagy ellenanyagot kell tartalmaznia, és ezt kell parenterálisan beadni, előnyösen intravénásán vagy intramuszkulárisan. Egy ilyen dózist ha kell, akkor megfelelő időközönként megismételhetünk, amiket a trombotikus válasz során a kezelőorvos választ ki.

Az itt ismertetett ellenanyagok, megváltoztatott ellenanyagok vagy ezek fragmensei a tároláshoz liofilezhetők, és felhasználás előtt egy megfelelő hordozóban rekonstruálni lehet. Erről a technikáról kimutatták, hogy a hagyományos immunglobulinokkal hatékony, és a szakterületen ismert liofilezési és rekonstruálási technikák használhatók.

A jelen találmányt az alábbi specifikus, nem korlátozó példák alapján ismertetjük.

1. példa

Az anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyagok előállítása és szűrővizsgálata

Nőstény Balb/C egereket injekciózunk a szakirodalomban ismertetett módon tisztított humán IX-es faktorral [Jenny, R. és munkatársai: Prep. Biochem. 16, 227-245 (1986)]. Tipikus esetben mindegyik egér kiindulásként 100 pg fehérjeinjekciót kap, 0,15 ml foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS) oldva, és 0,15 ml komplett Freund-féle adjuvánssal összekeverve. Az 50 pg fehérjét 0,15 ml foszfáttal puffereit sóoldatban, 0,15 ml inkomplett Freund-féle adjuvánssal összekeverve tartalmazó erősítőinjekciókat 2-3 hónapig, körülbelül kéthetente adjuk be. Az utolsó erősítőinjekció után, három nappal a lép/mielóma sejtfúziók előtt, az egér 50 pg IX-es faktort kap foszfáttal puffereit sóoldatban. Az immunizált egerekből lépsejteket izolálunk, majd NS-1 mielómasejtekkel fuzionáltatjuk [Kohler, G. és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 6, 292-295 (1976)], polietilénglikolt használva Oi és munkatársai szerint [Oi, V. T. és munkatársai: In: „Selected Methods in Cellular Immunology, szerk.: Mishell, Β. B. és Shigii, S. M., Freeman Press, San Francisco], A fúziót követően a sejteket RPMI 1640 táptalajban reszuszpendáljuk, ami 10% borjúmagzatszérumot tartalmaz, majd aliquot részeket teszünk egy 24 lyukas lemez lyukaiba, amik 0,5 ml peritoneális mosásból származó sejtkondicionált közeget tartalmaznak. A következő napon mindegyik 1,0 ml 2x1ο^-4 mol/l hipoxantint, 8χ10^-7 mol/l aminopterint és 3,2*10^-5 mol/l timidint tartalmazó RPMI 1640 táptalajt kap, ami 10% borjúmagzatszérumot tartalmaz. A sejtekhez minden 3-4 napban friss táptalajt adunk, oly módon, hogy a közeg felét eltávolítjuk, és friss táptalajjal helyettesítjük, ami ΙχΙΟ^-4 mol/l hipoxantint és 1,6*10^-5 mol/l timidint tartalmaz.

Körülbelül két héttel később 1,0 ml hibridómaközeget eltávolítunk az egyes lyukakból, és vizsgáljuk antiIX-es faktor ellenanyag tartalmukat [Jenny, R. J. és munkatársai: Methods in Enzymology 222, 400-416 (1993)]. Röviden, a IX-es faktort 96 lyukas mikrotiterlemezek műanyag lyukaiba immobilizáljuk. A tisztított ellenanyag hibridóma-felülúszóit vagy hígításait azután a lyukakban ínkubáljuk. A lyukakat mossuk, és az ellenanyag-antigén komplexek jelenlétét egy második, kecske antirágcsáló immunglobulin ellenanyaggal mutatjuk ki, ami torma-peroxidázhoz van konjugáltatva, az o-dianizidin kromogén szubsztrátot használva.

Az anti-IX-es faktor ellenanyagokat tartalmazó lyukakat határhígítással szubklónozzuk, és 96 lyukas lemezeken szaporítjuk. A klónozott hibridóma-sejttenyészetekből származó felülúszókat az előzőkben ismertetett ELISA esszével átvizsgáljuk a IX-es faktor elleni ellenanyagot keresve, majd a pozitív hibridómákból származó sejteket elszaporítjuk, lefagyasztjuk, folyékony nitrogénben tároljuk, majd ascites tumor formájában szaporítjuk egerekben.

HU 225 874 Β1

2. példa

Antikoagulációs faktor ellenanyagok önkorlátozó hatása a koagulációban

Az antikoagulációs faktor ellenanyagok növekvő koncentrációinak hatását humán plazma aktivált részleges tromboplasztinidejére (aPTT) egy fibrométerrel mérjük meg (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Maryland), a Baxter LIB0293-J, 3/93-as revízíójú referenciaeljárást használva (Baxter Scientific, Edison, New Jersey).

A kísérlet megkezdése előtt egy 5 ml-es csőben 2-3 ml 0,02 mol/l CaCI₂-ot teszünk a fibrométer fűtőkamrájába. A humán plazmamintákat vagy frissen vesszük le, és jégen tartjuk, vagy a gyártó utasításai szerint rekonstruáljuk Hemostasis Reference Plasmából (American Diagnostics, Greenwich, Connecticut).

Sertés-bélnyálkahártyából származó frakcionálatlan heparint (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), sertés-bélnyálkahártyából származó alacsony molekulasúlyú heparint (Lovenox, enoxaparin nátriumsó, Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals, Collegeville, Pennsylvania) vagy monoklonális ellenanyag antikoagulánsokat állítunk elő legalább 50 pmol/l-es törzsoldatok formájában, majd a vizsgált plazmát sorozathígítjuk. Referenciaként egy olyan plazmát használunk, ami nem tartalmaz antikoagulánst.

Két fibroTube fibrométercsészét töltünk meg 100 μΙ vizsgált plazmával vagy 100 μΙ tesztelt plazmával, antikoagulánssal és 125 μΙ aktinnal aktivált cephaloplastin reagenssel (Actin reagens, nyúlagy cephalinból, ellaginsavban, beszerezhető a Baxter Scientifictől), majd 37 °C-on levő fibrométerlyukakba tesszük.

Egy perc elteltével 100 μΙ aktin reagenst viszünk át egy plazmát tartalmazó csészébe, majd a tartalmakat többször összekeverjük egy pipettával. Háromperces inkubálás után 100 μΙ 37 °C-ra előmelegített CaCI₂-ot adunk a plazma-aktin reagens elegyhez, egy Automatic Pipette/Timer-trigger használatával (Becton Dickinson). Feljegyezzük a véralvadási időket, majd az 1. ábrán látható eredményeket úgy mutatjuk be, hogy a 300 μΙ összes esszétérfogatban levő antikoaguláns végkoncentráció függvényében adjuk meg a véralvadási időket. A IX-es faktor nominális koncentrációja a IX-es faktor 30-40 nM.

Az 1. ábrán bemutatott eredmények a BC1 és BC2 rágcsáló anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyagok növekvő koncentrációinak a hatását demonstrálják egy aPTT véralvadási időre. Mindkét monoklonális ellenanyag gátolja a véralvadást, oly módon, hogy meghosszabbítja az aPTT-t, és mindkét monoklonális ellenanyag elér egy végső telítési hatást az aPTT-η. Az IC50értékek hasonlóak, -45 nM és -50 nM BC1, illetve BC2 esetében, de a két ellenanyagra adott maximális válasz különbsége jelentős. A BC1 telítési koncentrációi körülbelül 50%-kal, körülbelül 40 másodpercre növelik az aPTT-t. A BC2 viszont körülbelül 3,5-szeresre növeli az aPTT-t, körülbelül 90 másodpercre. A heparinnal végzett antikoaguláns terápia terápiás célzónáját kiemeljük. Az eredmények azt jelzik, hogy a két monoklonális ellenanyag közreveszi a heparin terápiás aPTT tartományát.

A BC1 és BC2 tulajdonságait az I. táblázatban foglaljuk össze. Mindegyik monoklonális ellenanyag felismeri mindkét zimogént, a IX-es faktort, valamint az aktív proteázt, a IXa faktort, de csak a BC2 képes blokkolni mind a zimogén aktiválást, mind a proteáz aktivitását. A BC 1-ről és a BC2-ről kiderült, hogy keresztreakciót ad a Cynomologous majom IX-es faktorával. Emellett a BC2 keresztreakciót ad a patkány IX-es faktorral is.

/. táblázat

Az anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyagok in vitro tulajdonságainak összefoglalása

	BC1	BC2
Köti a IX-es faktort	igen	igen
Köti a IXa faktort	igen	igen
Gátolja a IX-es faktor-IXa faktor konverziót	nem	igen
Gátolja a IXa faktor aktivitását a X-áz komplexben	igen	igen
Kofaktorigény	nincs	kétértékű fémek Ca2+>Mn2+
aPTTmax *100% aPTTnormál	150	350
IC50, nM	-35	-50
Fajok közötti keresztreaktivitás	majom	patkány, majom
Izotípus	lgG1	lgG2a

A 2. ábrán bemutatott eredmények demonstrálják a 9E4(2)F4 és 11G4(1)B9 anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyag növekvő koncentrációjának a hatását az aPTT véralvadási időre. Az esszéhez a plazmát a normális koncentráció felére hígítjuk, ezzel 45 másodperces kezdő aPTT-t kapunk. Mindkét monoklonális ellenanyag gátolja a véralvadást az aPTT meghosszabbításával, és mindkét monoklonális ellenanyag végső telítési hatást ér el az aPTT-η. A 9E4(2)F4 és a 11G4(1)B9 telítési koncentrációi az aPTT-t körülbelül 90-100 másodpercre [9E4(2)F4], illetve körülbelül 80 másodpercre [11G4(1)B9] növelik. Az eredmények azt mutatják, hogy a két monoklonális ellenanyag a heparin terápiás aPTT tartomány felső végénél van.

A 3. ábrán bemutatott eredmények a HFXLC (a könnyű lánc epitoppal szemben), a HFXHC (a nehéz lánc epitoppal szemben) anti-X-es faktor monoklonális ellenanyagok és a HFXI anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyag növekvő koncentrációinak a hatását mutatják az aPTT véralvadási időkre. Ezeket a monoklonális ellenanyagokat az Enzyme Research Laboratoriestól (South Bend, IN) szereztük be. A HFXLC és HFXI monoklonális ellenanyag úgy gátolja a véralvadást, hogy meghosszabbítja az aPTT-t, és mindkét monoklonális ellenanyag elér egy végső telítési hatást az aPTT-n. A HFXLC ICso-értéke körülbelül 40 nM; a telítési koncentrációk az aPTT-t körülbelül 60 másodpercre növelik. A HFXI IC₅₀-értéke körülbelül 20 nM; a telítési koncentrációk az aPTT értékét körülbelül 100 másodperc15

HU 225 874 Β1 re növelik. Az eredmények azt mutatják, hogy a HFXLC a heparin terápiás tartományában van, míg a HFXI a heparin terápiás tartományának a felső végébe esik. A HFXHC nincs hatással az aPTT véralvadási időkre.

Az aPTT önkorlátozó meghosszabbítását is megfigyeltük a Vlll-as faktor, a IXa faktor kofaktora elleni ellenanyagokkal is. Például az antihumán Vlll-as faktor ellenanyag, az SAF8C-IG, amit az Affinity Biologicals Inc.-től vásároltunk, az aPTT-t maximum körülbelül 65 másodpercre növeli. Az aPTT félmaximális meghosszabbodását körülbelül 100 nM ellenanyaggal lehet elérni.

3. példa

A rágcsáló IX-es faktor monoklonális ellenanyagok hatékonysága patkánytrombusmodellben

Azzal a céllal, hogy kiértékeljük az anti-IX-es faktor ellenanyagok hatékonyságát az artériás trombózis megelőzésében, a patkány karotid artériás modelljét használjuk, Schumacher és munkatársai publikációját adaptálva [Schumacher és munkatársai: J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, 526-533 (1993)]. Ez a modell abból áll, hogy a karotid artéria felszínére alkalmazott FeC^-oldattal generált oxigéngyökök szegmentális sérülést okoznak a karotid endotéliumán.

Röviden, a patkányokat pentobarbiton nátriumsójával anesztetizáljuk, a nyaki eret kanülözzük az intravénás injekciókhoz, és a bal femorális artériát is kanülözzük a vérnyomás és a szívverés ellenőrzésére. A karotid artériát aszeptikus technikával izoláljuk, a nyakon sebészeti bemetszést téve, és egy mágneses áramlásmérővel felszerelve a véráramlás mérésére. Egy stabilizálódási periódus után meghatározzuk a következő változók alapparamétereit: karotid véráramlás, artériás nyomás, szívverés sebessége, aktivált részleges tromboplasztinidő (aPTT) és protrombinidő (PT). Ezután egy előre lemért Whatman szűrőpapírt belemártunk 50%-os FeCI₃-oldatba, majd 15 percre a karotid artériára tesszük, hogy az alatta levő endoteliális sejtek teljesen sérüljenek. A FeCI₃-oldattal átitatott papír eltávolítása után a kísérletet 60 percig, teljes befejezésig folytatjuk. A kísérlet végén a karotid vérrögöt extraháljuk a karotid artériából, és súlyát meghatározzuk.

Minden ágenst 15 perccel a karotid sérülés előtt 15 perccel adunk be. Az alábbi kezeléseket vizsgáljuk és hasonlítjuk össze a BC2 IX-es faktor monoklonális ellenanyaggal:

1. Heparin: 15, 30, 60 vagy 120 E/kg bolus, amit 0,5, 1, 2 vagy 4 E/kg/perc infúzió követ, 60 percig.

2. Acetilszalicilsav (ASA, aszpirin): 5 mg/kg bolus.

3. BC2 anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyag: 1,3 vagy 6 mg/kg bolus, amit 0,3 ml vagy 3 μg/kg infúzió követ, 60 percig.

4. Heparin: 30 E/kg bolus+1 E/kg/perc+ASA 5 mg/kg.

5. BC2 anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyag: 1 mg/kg+0,3 pg/kg/perc+ASA 5 mg/kg-ban.

A 4. és 5. ábra demonstrálja az antikoaguláns/trombotikus kezelési módok összehasonlító farmakológiáját, a heparin, az ASA és a BC2 IX-es faktor monoklonális ellenanyag hatását mutatva az aPTT-n (4. ábra) és a PT-n (5. ábra).

A vérzésre való hajlamosság kulcsindexét, az aPTT-t használjuk primer kritériumként a vizsgálatban használt antikoaguláns/trombotikus ágensek hatékonyság vs. vérzésre való hajlamosság összefüggésének kiértékelésére. A 4. ábrán bemutatott eredmények demonstrálják az aPTT heparinnal való dózisfüggő meghosszabbodását, a két legmagasabb dózisban a véralvadási időnek a teszt határain túl maximális meghosszabbodásával. Az ASA önmagában nem növelte szignifikánsan az aPTT-t, de heparinnal kombinálva jelentős szinergisztikus hatás volt megfigyelhető. A IX-es faktor monoklonális ellenanyagoknak közepes hatásuk van az aPTT-re, és még a legmagasabb dózisban is a véralvadási idő növekedése nem haladja meg a klinikai gyakorlatban használ standard antikoaguláns háromszoros határát. A legfigyelemreméltóbb, hogy a BC2 IX-es faktor monoklonális ellenanyag nem változtatja meg az aPTT-t.

Az 5. ábrán az adatok azt mutatják, hogy a heparin a két legmagasabb dózisban és az ASA+heparin kombináció is szignifikánsan megnöveli a PT-t, de a IX-es faktor monoklonális ellenanyag dózisok önmagukban vagy ASA-val kombinálva ezt nem teszik.

A heparin, az ASA és a IX-es faktor monoklonális ellenanyagnak az artériaelzáródásra gyakorolt hatását a 6. ábrán mutatjuk be. Az eredmények azt mutatják, hogy az összes, hordozóval kezelt állat karotid artériái elzáródnak a sérülés hatására. A heparindózis függetlenül gátolja a karotid artéria elzáródását. A legmagasabb dózisban a heparin teljesen megakadályozza a karotid artéria elzáródását; azonban ebben a dózisban koaguláció nem iniciálható. Az ASA önmagában csak kis hatással van a karotidelzáródásra. Az ASA heparinnal való kombinációja nem képes teljesen megakadályozni a karotid elzáródását. A IX-es faktor monoklonális ellenanyag a két nagyobb dózisban teljesen megakadályozza a karotid elzáródását, ami a koagulációt nem hosszabbítja meg a klinikaiiag kívánt célon túl. A IX-es faktor monoklonális ellenanyag alacsonyabb dózisa, ami nem nagyon képes önmagában biztosítani a nyitott állapotot, a karotidelzáródás teljes gátlását biztosítja ASA-val kombinált beadása esetében.

A heparinnak, az ASA-nak és a IX-es faktor monoklonális ellenanyagnak a vérrög súlyára gyakorolt hatását a 7. ábrán mutatjuk be. A heparin dózisfüggő módon csökkenti a vérrög tömegét a karotid artériában. Azonban valamennyi visszamaradt vérrög visszamarad a karotid artériában, a koaguláció teljes blokkolása ellenére. Az ASA önmagában vagy heparinnal kombinálva (30 E/kg kezelési mód) csak részleges hatással van a vérrög súlyára. A IX-es faktor dózisfüggő módon csökkenti a vérrög tömegét, és a magas dózis virtuálisan megakadályozza a komplett vérrögképződést. Emellett a kis dózisú anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyag és az ASA kombinálása egy olyan kezelési mód, ami teljesen megelőzi a karotid elzáródását, anélkül hogy károsan érintené a koagulációindikációkat, teljesen megakadályozza a vérrög képződését.

HU 225 874 Β1

A patkány karotid trombózis modellel végzett kísérletek világosan demonstrálják a IX-es faktor monoklonális ellenanyag hatékonyságát a trombózis megelőzésében, egy erősen trombogén artériás sérülési modellben. A legfigyelemreméltóbb, hogy a IX-es faktor monoklonális ellenanyag hatékonyságát az aPTT által definiált, kívánt antikoaguláns célon belül demonstrálja. Emellett a heparin, a jelenleg standardként használt antikoaguláns csak olyan dózisban éri el a IX-es faktor monoklonális ellenanyaggal összehasonlítható hatékonyságot, ami súlyosan gátolja a koagulációt, egészen addig a mértékig, hogy nem koagulálódó vért eredményez. Érdekes módon az ASA-val és heparinnal egyszerre végzett kezelésnél megfigyelt potenciáció és szinergizmus akkor is megfigyelhető volt, amikor az ASA-t anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyaggal együtt adtuk be. Azonban a heparin és az ASA kombinációjával ellentétben, ami mind az antitrombotikus, mind az antikoaguláns hatások potenciálását eredményezi, a IX-es faktor monoklonális ellenanyag és az ASA kombinációja az antitrombotikus hatékonyság potenciálását eredményezi, és nincs konzisztens hatással a vér ex vivő koagulációs paramétereire. Ezeket összerakva az adatok a IX-es faktor monoklonális ellenanyag olyan antitrombotikus kapacitását mutatják, ami sokkal jobb, mint a hepariné, az ASA-é, vagy a heparin és az ASA kombinációjáé.

4. példa

Patkány-trombózismodell pásztázó elektronmikroszkópiája

Színlelten kezelt, csak vas-kloriddal, és vas-klorid+6 mg/kg IX-es faktor ellenanyaggal kezelt patkány karotid artéria szegmenseit gyűjtjük össze, csoportonként három állatot használva, 15 perccel a vas-klorid alkalmazása után. Az artériákat formaldehides perfúzióval fixáljuk, majd ligáljuk a léziót tartalmazó terület előtt és után. A fixált artériákat dehidratáljuk, hexametilén-diszilazánban inkubáljuk, majd deszikkátorban szárítjuk. A szárított artériákat hosszában felnyitjuk, pásztázó elektronmlkroszkópiás rácsra tesszük, és arannyal borítjuk.

A színlelten kezelt artériák pásztázó elektronmikroszkópiás vizsgálata lényegében normális endotéliumot mutat, ritkán, elszórtan található vérlemezkékkel. Az endotéliumban néhány törés látható, ami valószínűleg a műtét által okozott mechanikai károsodás eredménye, és az alul levő alapmembránt vériemezkeszőnyeg borítja. A színlelten kezelt patkányokban nincs bizonyíték vérrög képződésére.

A vas-kloriddal kezelt artériák pásztázó elektronmikroszkópiás vizsgálata nagy fali vérrögöket mutat, amik a véredény belvilágának nagy részét elfoglalják. A vérrögök aggregálódott vérlemezkékből, vörösvérsejtekből és amorf, valamint fonalas fehérjeszerű anyagból állnak. A fehéijeszerű anyag fibrinből áll. Az artériák endotéliumát nagyrészt elfedik a nagy vérrögök. Ahol látható, ott a vas-kloriddal kezelt régiót borító endotéliumot számos tapadó vérlemezke és amorf fehérjeszerű anyag borítja.

Azokból a patkányokból, amiket vas-kloriddal és IX-es faktor monoklonális ellenanyaggal is kezeltünk, vett artériák pásztázó elektronmlkroszkópiás vizsgálata kiderítette, hogy a véredények belvilága nagymértékben mentes a vérrögtől. A vas-kloriddal kezelt régiót borító endotélium kiterjedt károsodást mutat, és néhány területet tapadó vérlemezkék és vérlemezke-aggregátumok borítanak, de nincs, vagy csak nagyon kevés a fehérjeszerű anyag.

5. példa

A BC2 IX-es faktor monoklonális ellenanyag nehéz és könnyű láncának szekvenciaelemzése össz-RNS-t tisztítunk TriReagent használatával (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH), a gyártó utasításai szerint. Az RNS-t izopropil-alkohollal kicsapjuk, majd 0,5% SDS-ben oldjuk, és 0,5 mol/l nátrium-klorid-koncentrációt állítunk be. A poli A⁺ RNS-t Dynabeads Oligo (dT)₂s-tel izoláljuk (Dynal A. S., Laké Success, NY), a gyártó utasításai szerint. A poli A⁺ RNS-t eluáljuk a gyöngyökről, és TE pufferben reszuszpendáljuk. 100 ng RNS tizenkét aliquot részét reverz transzkripcióba visszük egy RT-PCR kittel, a gyártó utasításai szerint (Boehringer Mannheim Cat. No. 1483-188), a beindításhoz dT oligomert használva. A nehéz lánchoz 6 RNS/DNS hibrid polimeráz-láncreakciós amplifikációját hajtjuk végre 25 ciklusban, a rágcsáló lgG2 csukló régió prímért (1. számú szekvencia) és egy nehéz lánc szignálszekvencia prímért (2. számú szekvencia) használva. Hasonlóképpen, a könnyű lánchoz 6 RNS/DNS hibrid polimeráz-láncreakciós amplifikálását hajtjuk végre 25 ciklusban, rágcsáló kappa prímért (3. számú szekvencia) és egy degenerált könnyű lánc szignálszekvencia prímért (4. számú szekvencia) használva. A 12 amplifikálásból származó polimerázláncreakció-terméket egy PCR2000 vektorba ligáljuk (TA cloning Kit, Invitrogen, Cat. No. K2000-01). A rekombináns kiónok telepeit véletlenszerűen választjuk ki, és a plazmid DNS-ből miniprep készítményeket állítunk elő, Bimbóim és Doly lúgos extrakciós eljárását használva [Bimbóim és Doly: Nucleic Acids Research 7, 1513 (1979)]. Az izolált plazmid DNS-t EcoRI restrikciós enzimmel emésztjük, majd 0,8%-os agarózgélen elemezzük. A nehéz lánc megfelelő, azaz körülbelül 700 bázispár méretű, kétszálú cDNS-inszertjeit, és a könnyű lánc megfelelő, azaz körülbelül 700 bázispár méretű, kétszálú cDNS-inszertjeit a Sanger-módszer módosításával szekvenáljuk. Mind a 12 nehéz és könnyű lánc szekvenciáját összehasonlítjuk, így egy konszenzus BC2 nehéz lánc variábilis régió szekvenciát állítunk össze (5. számú szekvencia), valamint egy konszenzus BC2 könnyű lánc variábilis régió szekvenciát (6. számú szekvencia).

A BC2 nehéz lánc variábilis régió cDNS-szekvenciájának elemzéséből kiderült egy 363 nukleotid méretű nyitott leolvasási keret, ami egy 121 aminosavból álló szekvenciát kódol (7. számú szekvencia). A nehéz lánc CDR1, 2 és 3 szekvenciáit a 8., 9. és 10. számú szekvenciavázlaton adjuk meg.

A BC2 könnyű lánc variábilis régió cDNS-szekvenciájának elemzéséből kiderült egy 321 nukleotid mére17

HU 225 874 Β1 tű nyitott leolvasási keret, ami egy 107 aminosavból álló szekvenciát kódol (11. számú szekvencia). A nehéz lánc CDR1, 2 és 3 szekvenciáit a 12., 13. és 14. számú szekvenciavázlaton adjuk meg.

6. példa

Humanizált ellenanyagok

Hat humanizált ellenanyagot terveztünk (jelzésük SB 249413, SB 249415, SB 249416, SB 249417, SB 257731 és SB 257732), amik tartalmazzák az előzőkben ismertetett CDR-eket egy humán ellenanyag keretben.

SB 249413

Az SB 249413 az F9HZHC 1-0 nehéz láncot és az F9HZLC 1-0 könnyű láncot tartalmazza. A szintetikus variábilis régió humanizált nehéz lánc F9HZHC 1-0-t úgy terveztük meg, hogy az RF-TS3’CL immunglobulinból kapott nehéz láncot használjuk [Capra, J. D. és munkatársai: J. Clinic. Invest. 86, 1320-1328 (1990), ami a Kabat-féle adatbázisban Kabpro:Hhc10w néven van azonosítva], valamint a BC2 nehéz lánc korábban ismertetett CDR-jeit. A keretrégióban nem hajtottunk végre olyan aminosavhelyettesítéseket, amik befolyásolhatják a CDR prezentációját. Négy átlapoló szintetikus oligonukleotidot készítettünk (15., 16., 17. és 18. számú szekvencia), amik, ha egymáshoz illesztjük és meghosszabbítjuk, akkor a nehéz lánc variábilis régió aminosavait kódolják, a CDR3-on keresztül, illetve azt is tartalmazva (19. és 20. számú szekvencia). Ezt a szintetikus gént azután primerekkel amplifikáljuk (21. és 22. számú szekvencia), majd a pCR2000 vektorba ligáljuk (TA cloning Kit, Invitrogen, Cat. No. K2000-01), majd egy Spel, Kpnl restrikciós emésztésből izoláljuk. Egy második DNS-fragmenst, ami a campath szignálszekvenciát kódolja, beleértve a variábilis régió első öt aminosavat (23. és 24. számú szekvencia), egy humanizált anti-légzési szincitiális vírus nehéz lánc monoklonális ellenanyagot kódoló konstrukció (25. számú szekvencia) megfelelő régiójából polimeráz-láncreakcióval amplifikáljuk, két primerrel (26. és 27. számú szekvencia), majd az EcoRI és Spel restrikciós enzimekkel emésztjük. A két generált fragmenst EcoRI, Kpnl restrikciós enzimekkel emésztett pFHZHC2-6pCD emlőssejt expressziós vektorba ligáljuk, ami a humán 4-es konszenzus keretrégió és az lgG1 konstans régió többi részét tartalmazza. A vektor egyetlen aminosavhelyettesítést tartalmaz a W094/05690 számú nemzetközi szabadalmi leírásban publikált pFHZHC2-3pCD vektorhoz képest. A 2-es keretrégió utolsó csoportját (49-es csoport) Ser-ről Ala-ra változtatjuk, oly módon, hogy a pFHZHC2-3pCD vektort Xbal és EcoRV restrikciós enzimekkel emésztjük, majd egy olyan linkért építünk be, amit két szintetikus oligonukleotidból állítottunk elő (28. és 29. számú szekvencia). Az F9HZHC 1-0 inszert szekvenciáját a 30. és 31. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

A szintetikus variábilis régió humanizált könnyű lánc F9HZLC 1-0 régiót az LS8’CL immunglobulinból nyert humán könnyű lánc keretrégióinak [Carmack és munkatársai: J. Exp. Med. 169, 1631-1643 (1989), amik a Kabat-féle adatbázisban Kabpro:Hk1318 néven szerepelnek] és az előzőkben ismertetett BC2 könnyű lánc CDR-ek használatával állítjuk elő. A keretrégióban nem hajtottunk végre olyan aminosavhelyettesítéseket, amik befolyásolhatják a CDR prezentációját. Két átlapoló szintetikus oligonukleotidot készítettünk (32. és 33. számú szekvencia), amik, ha egymáshoz illesztjük és meghosszabbítjuk, akkor a könnyű lánc variábilis régió aminosavait kódolják (36. és 37. számú szekvencia). Ezt a szintetikus gént azután primerekkel amplifikáljuk (36. és 37. számú szekvencia), majd a pCR2000 vektorba ligáljuk (TA cloning Kit, Invitrogen, Cat. No. K2000-01), majd egy Seal, Sacll restrikciós emésztésből izoláljuk. Egy második DNS-fragmenst, ami a campath szignálszekvenciát kódolja, beleértve a variábilis régió első két aminosavát (38. és 39. számú szekvencia), egy humanizált anti-légzési szincitiális vírus nehéz lánc monoklonális ellenanyagot kódoló konstrukció (25. számú szekvencia) megfelelő régiójából polimeráz-láncreakcióval amplifikáljuk, két primerrel (26. és 40. számú szekvencia), majd EcoRI és Seal restrikciós enzimekkel emésztjük. A két generált fragmenst EcoRI, Sacll restrikciós enzimekkel emésztett pFHzLC1-2pCN emlőssejt expressziós vektorba ligáljuk, ami a humán 4-es konszenzus keretrégió és a konstans kappa régiót tartalmazza. A vektor egyetlen aminosavhelyettesítést tartalmaz a W094/05690 számú nemzetközi szabadalmi leírásban publikált pFHZLC1-1pCN vektorhoz képest. A 2-es keretrégió utolsó csoportját (49-es csoport) Ser-ről Ala-ra változtatjuk, oly módon, hogy a pFHZLC1-1pCN vektort Smal és Kpnl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd egy olyan linkért építünk be, amit két szintetikus oligonukleotidból állítottunk elő (41. és 42. számú szekvencia). Az F9HZLC 1-0 inszert szekvenciáját a 43. és 44. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

SB 249415

Az SB 249415 az F9HZHC 1-1 könnyű láncát és az F9HZLC 1-1 nehéz láncát tartalmazza. Ezek a nehéz és könnyű lánc konstrukciók az F9HZHC 1-0-n és az F9HZLC 1-0-n alapulnak, azonban keretrégió aminosav helyettesítéseket tartalmaznak, amik befolyásolhatják a CDR-prezentációt.

Az F9HZHC 1-1-nek három keretrégió aminosav helyettesítése van, amik befolyásolhatják a CDR prezentációját. Két átlapoló szintetikus oligonukleotidot generálunk (45. és 46. számú szekvencia), amiket ha egymáshoz illesztünk és meghosszabbítunk, akkor a megváltoztatott variábilis régió nehéz láncának megváltoztatott részét reprezentálják (47. és 48. számú szekvencia). Ezt a szintetikus gént azután polimerázláncreakció-primerekkel amplifikáljuk (49. és 50. számú szekvencia), majd a pCR2000 vektorba ligáljuk (TA cloning Kit, Invitrogen, Cat. No. K2000-01), majd egy EcoNI, Kpnl restrikciós emésztésből izoláljuk. Ezt a fragmenst EcoNI, Kpnl restrikciós enzimekkel emésztett F9HZHC-1 vektorba (30. számú szekvencia) ligáljuk. Az F9HZHC 1-1 inszert szekvenciáját az 51. és 52. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

HU 225 874 Β1

Az F9HZLC 1-1 négy keretrégió aminosav helyettesítéssel rendelkezik, amik képesek befolyásolni a CDR prezentációját. Két átlapoló szintetikus oligonukleotidot generálunk (53. és 54. számú szekvencia), amiket ha egymáshoz illesztünk, akkor Kpnl és BamHI fapados végekkel rendelkeznek, és a könnyű lánc variábilis régió megváltoztatott részét kódoló reprezentáló aminosavakat kódolják (55. számú szekvencia). Az F9HZLC

1-0-t (43. számú szekvencia) Kpnl és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a szintetikus DNShez ligáljuk. Az F9HZLC 1-1 inszert szekvenciáját az 56. és 57. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

SS 249416

Az SB 249416 az F9HZHC 1-1 nehéz láncot (amit az előzőkben ismertettünk) (52. számú szekvencia) és az F9HZLC 1-2 könnyű láncot tartalmazza. A könnyű lánc konstrukció az F9HZLC 1-1-en alapul, azonban tartalmaz még egy keretrégió aminosav helyettesítést, ami befolyásolhatja a CDR prezentációját.

Két szintetikus oligonukleotidot generálunk (58. és 59. számú szekvencia), amiket ha egymáshoz illesztünk, akkor BamHI és Xbal fapados végekkel rendelkeznek, és a könnyű lánc variábilis régió megváltoztatott részét reprezentáló aminosavakat kódolják (60. számú szekvencia). Az F9HZLC 1-1 vektort (56. számú szekvencia) BamHI és Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a szintetikus DNS-hez ligáljuk. Az F9HZLC 1-2 inszert szekvenciáját a 61. és 62. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

SB249417

Az SB 249417 tartalmazza az F9HZHC 1-1 nehéz láncot (amit az előzőkben ismertettünk) (52. számú szekvencia) és az F9HZLC 2-0 könnyű láncot. Egy F9HZLC 2-0 szintetikus variábilis régió humanizált könnyű láncot tervezünk, a REI immunglobulinból kapott humán könnyű lánc keretrégiói [Palm és Hilschmann: Z. Physiol. Chem. 354, 1651-1654 (1973), amit a Kabat-féle adatbázisban Kabpro:HKL111-ként azonosítanak] és az előzőkben ismertetett BC2 könnyű lánc CDR-ek alapján, öt aminosav konszenzus humán helyettesítést végzünk. Hat keretrégió aminosav rágcsáló helyettesítést végzünk, amik befolyásolhatják a CDR prezentációját. Két átlapoló szintetikus oligonukleotidot generálunk (63. és 64. számú szekvencia), amik, ha egymáshoz illesztjük és meghosszabbítjuk őket, akkor a könnyű lánc variábilis régiót reprezentáló aminosavakat kódolják (65. és 66. számú szekvencia). Ezt a szintetikus gént azután polimerázláncreakció-primerekkel amplifikáljuk (67. és 68. számú szekvencia), majd a pCR2000 vektorba ligáljuk (TA cloning Kit, Invitrogen, Cat. No. K2000-01), majd egy Seal, Sacll restrikciós emésztésből izoláljuk. Egy második, a campath szignálszekvenciát kódoló DNS-fragmenst, ami tartalmazza a variábilis régió első két aminosavát, egy humanizált anti-légzési szincitiális vírus nehéz lánc monoklonális ellenanyagot kódoló konstrukció (25. számú szekvencia) megfelelő régiójából polimeráz-láncreakcióval amplifikáljuk, két primerrel (26. és 69. számú szekvencia), majd EcoRI és Seal restrikciós enzimekkel emésztjük. Egy harmadik DNS-fragmenst, ami a humán 4-es keretrégió maradékát kódolja (70. számú szekvencia), és Sacll, valamint egy Narl fapados véget tartalmaz, úgy állítunk elő, hogy két szintetikus oligonukleotidot (71. és 72. számú szekvencia) illesztünk egymáshoz. Az F9HZLC 1-0-t (43. számú szekvencia) EcoRI és Narl restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a három DNS-fragmenst összeligáljuk. Az F9HZLC

2- 0 inszertet a 73. és 74. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

SB257731

Az SB257731 tartalmazza az F9HZHC 1-1 nehéz láncot (52. számú szekvencia) és az F9HZLC 1-3 könnyű láncot, ami az F9HZLC 1-2-höz képest egyetlen aminosavmutációt tartalmaz (62. számú szekvencia). Az F9HZLC 1-2-t polimeráz-láncreakcióval amplifikáljuk, két primerrel (26. és 69. számú szekvencia), majd EcoRI és Seal restrikciós enzimekkel emésztjük. Egy 94 bázispár méretű fragmenst ligálunk az EcoRI, Seal restrikciós enzimekkel emésztett F9HZLC 1-2 vektorba, hogy előállítsuk az F9HZLC 1-3 könnyű lánc konstrukciót. Az F9HZLC 1-3 inszert szekvenciáját a 77. és 78. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

SB 257732

Az SB 257732 a humanizált nehéz lánc F9HZHZ

3- 0 variábilis régióját és az F9HZLC 3-0 könnyű láncot tartalmazza. Négy átlapoló szintetikus oligonukleotidot tervezünk (79., 80,, 81. és 82. számú szekvencia), amik, ha egymáshoz illesztjük és meghosszabbítjuk őket, akkor a megváltoztatott nehéz lánc variábilis régiót reprezentáló aminosavakat kódolják (83. és 84. számú szekvencia). Azután ezt a szintetikus gént amplifikáljuk polimerázláncreakció-primerekkel (85. és 86. számú szekvencia), majd a pCR2000 vektorba ligáljuk (TA cloning Kit, Invitrogen, Cat. No. K2000-01), majd egy Stul, Kpnl restrikciós emésztésből izoláljuk. Az izolált fragmenst egy Stul, Kpnl restrikciós enzimekkel emésztett F9HZHC 1-1 vektorba ligáljuk (52. számú szekvencia). Ezt a vektort EcoRI, Spel restrikciós enzimekkel emésztjük, hogy eltávolítsuk a szignálszekvenciát. A campath szignálszekvenciát kódoló DNS-fragmenst (23. számú szekvencia), ami tartalmazza a variábilis régió első öt aminosavát, az F9HZHC 1-0 polimeráz-láncreakciós amplifikálásával állítjuk elő, két primerrel (26. és 87. számú szekvencia), majd EcoRI és Spel restrikciós enzimekkel emésztjük. A generált fragmenst a vektorba ligáljuk. Az F9HZHC 3-0 inszert szekvenciáját a 88. és 89. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

Négy átlapoló szintetikus oligonukleotidot generálunk (90., 91., 92. és 93. számú szekvencia), amik, ha egymáshoz illesztjük és meghosszabbítjuk őket, a könnyű lánc variábilis régiót reprezentáló aminosavakat kódolják (94. és 95. számú szekvencia). Ezt a szintetikus gént azután polimerázláncreakció-primerekkel (96. és 97. számú szekvencia) amplifikáljuk, majd a

HU 225 874 Β1 pCR2000 vektorba ligáljuk (TA cloning Kit, Invitrogen, Cat. No. K2000-01), majd egy Seal, Kpnl restrikciós emésztésből izoláljuk. Az izolált fragmenst egy Stul, Narl restrikciós enzimekkel emésztett F9HZLC 1-3 vektorba ligáljuk (77. számú szekvencia). Az F9HZLC 3-0 inszert szekvenciáját a 98. és 99. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

A humanizált anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyagokat CHO-sejtekben expresszáltatjuk. Egy szérummentes táptalajban szuszpenziós növekedéshez adaptált DG-44 sejtvonalat szaporítunk 100 ml fehérjementes táptalajban, ami Ixnukleozidokat és 0,05% F68-at tartalmaz egy 250 ml-es, egyszer használatos steril Erlenmeyer-lombikban (Corning), egy Innova 2100 rázón (New Brunswick Scientific), 150 per perc fordulatszámmal, 37 °C-on, 5% CO₂, 95% nedvesített levegőjű atmoszféra mellett. Ezeket a sejteket hetente kétszer 4*10⁵ sejt/ml koncentrációban átoltjuk. Az egyes pCN-Lc-könnyű lánc és pCD-Hc-nehéz lánc vektorokat Notl restrikciós enzimmel emésztve linearizáljuk, steril körülmények között együtt kicsapjuk őket, majd 50 ml 1*TE pufferben reszuszpendáljuk (100 mmol/l TRISZ, 1 mmol/l EDTA, pH=7,5). A DNS-t egy Bio-Rad Gene Pulserrel (Bio-Rad Laboratories) elektroporáljuk Acc-098 sejtekbe, Hensley és munkatársai technikáját alkalmazva [Hensley és munkatársai: Journal of Biological Chemistry 269, 23 949-23 958 (1994)]. 1,2*10⁷ sejtet mosunk egyszer 12,5 ml jéghideg PBSucrose-zal (PBS, 272 mmol/l szacharóz, 6 mmol/l nátrium-foszfát pH=7,4,1 mmol/l MgCI₂), majd 0,8 ml foszfáttal puffereit sóoldatban reszuszpendáljuk, hozzáadjuk 50 μΙ DNS-oldathoz, majd 15 percig jégen inkubáljuk. A sejteket 380 volton, 25 mikrofaraddal pulzáltatjuk, majd 10 percig jégen inkubáljuk. A sejteket a szelekció előtt 96 lyukas tenyésztőlemezekre szélesztjük, 5*10⁵ sejt/lemez sűrűségben, fenntartó táptalajban, 24 óra hosszat. A sejteket 400 pg/ml G418 (Geneticin, Life Technologies, Inc.) rezisztencia alapján szelektáljuk, fenntartó táptalajban. Az esszé előtt 24 órával a sejteket 150 pl fenntartó táptalajban tápláljuk.

Az egyes telepekből származó kondicionált táptalajt elektrolumineszcencia (ECL) kimutatási módszerrel vizsgáljuk, egy Origen analizátorban (IGEN, Inc.) [Yang és munkatársai: Biotechnology 12, 193-194 (1994)].

Az esszé elvégzéséhez szükséges összes oldatot (esszépuffer) és az analizátor működtetéséhez szükséges oldatot (sejttisztító) az IGEN-től szereztük be. Az ellenanyagokat [antihumán IgG (g-lánc-specifikus), Sigma Chemical Co., és a humán IgG F(ab’)₂ fragmensét (H+L), Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.] TAFNHS észterrel jeleztük (IGEN, Inc.) 7:1 TAGíehérje mólarányban, míg a Protein A-t (Sigma Chemical Co.) Biotin-LC-Sulfo-NHS-észterrel (IGEN, Inc.) jeleztük, 20:1 Biotin:fehérje mólarányban, mindkettőt az IGEN előírásai szerint. A sztreptavidinnel borított mágneses gyöngyöket (M-280) a Dynaltól szereztük be.

Az immunesszéket a következő protokoll alapján hajtjuk végre: mintánként 50 μΙ sztreptavidinnel borított gyöngyöket (végkoncentráció 600 pg/ml, foszfáttal puffereit sóoldatban hígítva pH=7,8, 1,25% Tweennel) keverünk össze 50 pl Biotin-Protein A-val (végkoncentráció 1 pg/PBS hígítás, pH=7,8, 1,25% Tweennel), majd kevertetés közben szobahőmérsékleten 15 percig inkubáljuk, 50 pl TAG ellenanyagokkal [1,25 pg/ml végkoncentráció F(ab’)₂, a humán IgG fragmense (H+L), és 0,25 pg/ml antihumán IgG-vel (g-lánc-specifikus), PBSben hígítva pH=7,8, 1,25% Tweennel] adunk hozzá, majd az oldatot 50 pl kondicionált táptalajhoz adjuk, és szobahőmérsékleten kevertetés közben 1 óra hosszat inkubáljuk. Az esszépufferből 200 μΙ-t adunk a reakcióelegyhez, majd a mintát az Origen I analizátorral elemezzük az ECL mérésére. Az eredmények azt mutatják, hogy a vizsgált telepeknek körülbelül 20-37%-a több mint 15 ng/ml ellenanyagot expresszál, és az átlagos expresszió körülbelül 150 ng/ml.

A humanizált anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyagokat a kondicionált táptalajból tisztítjuk, egy Procep A befogási lépést használva, amit ioncserélő kromatográfia követ, a DNS-teher csökkentésére. A Procep A szorbens anyagot (Bioprocessing Ltd., Durham, Anglia) használjuk egy 1:1 átmérő:magasság aránnyal rendelkező oszlop előállítására. A tisztított kondicionált táptalajt körülbelül 150 cm/óra sebességgel visszük az oszlopra. Az oszlopot szekvenciálisán mossuk foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS), 1 mol/l nátrium-kloridot tartalmazó PBS-sel, majd végül PBS-sel. A megkötött anyagot 0,1 mol/l ecetsavas elúcióval nyerjük ki. Az eluátum pH-ját 5,5-re állítjuk, majd vízzel 1:4 arányban hígítjuk. A hígított oldatot egy S-Sepharose oszlopra visszük (2,5*13 cm), amit előtte 20 mmol/l nátrium-acetáttal hoztunk egyensúlyba (80 cm/óra). Az oszlopot addig mossuk az acetátpufferrel, amíg állandó alapvonalat kapunk, majd a megkötött fehérjét 20 mmol/l nátrium-foszfáttal (pH=7,4) eluáljuk, 25 cm/óra sebességgel. Az eluált anyagot egy 0,4 mikronos membránnal megszűrjük, majd 4 °C-on tároljuk.

7. példa

Egér-humán kiméra ellenanyag

100 ng BC2 RNS-t reverz transzkripcióba viszünk egy RT-PCR kittel, a gyártó utasításai szerint (Boehringer Mannheim Cat. No. 1483-188), az indításhoz dT oligonukleotidot használva, majd a polimeráz-láncreakciós amplifikálást szintetikus Seal (100. szekvencia) és Narl (101. szekvencia) primerekkel hajtjuk végre, így Seal, Narl végekkel rendelkező BC2 könnyű lánc variábilis régiót állítva elő (102. számú szekvencia és 103. számú szekvencia). Ezt a DNS-t Seal, Narl restrikciós enzimekkel emésztett F9HZHC 1-3-ba ligáljuk (77. számú szekvencia), majd Seal, Narl restrikciós enzimekkel emésztjük, ezzel egér-humán kiméra könnyű lánc F9CHLC-t állítunk elő (104. és 105. számú szekvencia).

100 ng BC2 RNS-t reverz transzkripcióba viszünk egy RT-PCR kittel, a gyártó utasításai szerint (Boehringer Mannheim Cat. No. 1483-188), az indításhoz dT oligonukleotidot használva, majd a polimeráz-láncreakciós amplifikálást szintetikus Spel (106. szekvencia) és Nhel (107. szekvencia) primerekkel hajtjuk végre, így

HU 225 874 Β1

Spel, Nhel végekkel rendelkező BC2 könnyű lánc variábilis régiót állítva elő (108, számú szekvencia és 109. számú szekvencia). A campath szignálszekvenciát polimeráz-láncreakcióval amplifikáljuk az RSVHZ19 nehéz láncból (25. számú szekvencia), EcoRI (26. számú szekvencia) és Spel (87. számú szekvencia) primerekkel. Ezt a két DNS-fragmenst ligáljuk egy EcoRI, Nhel restrikciós enzimekkel emésztett IL4CHHCpcd vektorba (leírását lásd a W095/07301 számú nemzetközi szabadalmi leírásban), ezzel az IL4 variábilis régiót a BC2 IX-es faktor egér variábilis régióval helyettesítve, így F9CHHC egér-humán kiméra nehéz láncot állítva elő (110. és 111. számú szekvencia).

A chaFIX egér-humán kiméra ellenanyag kotranszfekcióját és tisztítását az előzőkben a humanizált konstrukciókra ismertetett módon hajtjuk végre.

8. példa

A humanizált IX-es faktor monoklonális ellenanyagok hatékonysága patkányvérrögmodellben

Ahhoz, hogy kiértékeljük a humanizált anti-IX-es faktor ellenanyagokat az artériás trombózisban, a patkány karotid artériás trombózis modellt használjuk az előzőkben, a 3. példában ismertetett módon. Megállapítottuk az alapparamétereket a karotid véráramlásra, az artériás nyomásra, a szívverés sebességére, a véredény átjárhatóságára és az aktivált részleges tromboplasztinidőre (aPTT). Tizenöt perccel később 10 percig karotid sérülést okoztunk. A paramétereket a karotid sérülés előidézése után 60 perccel később mérjük. A karotid vérrögöt is extraháljuk a karotid artériából, és súlyát meghatározzuk.

Minden ágenst intravénásán adunk be a karotid sérülés okozása előtt 15 perccel. Az alábbi kezeléseket vizsgáljuk és hasonlítjuk a BC2 anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyaghoz:

Hordozó
chaFIX:	3 mg/kg bolus
SB 249413:	3 mg/kg bolus
SB 249415:	3 mg/kg bolus
SB 249416:	3 mg/kg bolus
SB 249417:	3 mg/kg bolus
SB 257731:	3 mg/kg bolus
heparin:	60 egység/kg bolus+ 2 egység/kg infúzió

Az aPTT-t használjuk primer kritériumként a hatékonyság kiértékelésében, a vizsgálatban használt antikoaguláns/trombotikus ágensek vérzést okozó hatásával szemben. A 8. ábrán látható eredmények azt demonstrálják, hogy az SB 249415, SB 249416, SB 249417 és SB 257731 humanizált IX-es faktor monoklonális ellenanyagok 3,0 mg/kg-ban közepes hatással vannak az aPTT-re, ami a klinikailag elfogadott tartományban van.

A IX-es faktor monoklonális ellenanyagoknak a vérrög tömegére gyakorolt hatását a 9. ábrán mutatjuk be. Az eredmények azt mutatják, hogy az összes humanizált monoklonális ellenanyag egyforma hatékonyságú a vérrög tömegének csökkentésében.

A patkány karotid trombózis modellben végzett vizsgálatok világosan demonstrálják a humanizált

IX-es faktor monoklonális ellenanyagok hatékonyságát a trombózis megelőzésében, erősen trombogén artériás sérülés modellben. A legfigyelemreméltóbb, hogy az összes humanizált IX-es faktor monoklonális ellenanyag hatékonyságát az aPTT által definiált, kívánt terápiás antikoaguláns célon belül lehetett demonstrálni.

9. példa

Az ellenanyag biokémiai és biofizikai tulajdonságai

Az SB 249417 molekulasúlya MALD-MS-sel meghatározva 148,000 dalton. Az SB 249417 analitikai ultracentrifugálása azonos értéket adott. IX-es faktor plusz Ca²⁺ jelenlétében a BC2-ből származó ellenanyagok 248,000 dalton tömegnek megfelelően ülepedtek, ami megfelel a monoklonális ellenanyag és két molekula IX-es faktor kombinált tömegének. Magasabb rendű aggregátumok jelenlétére vonatkozó bizonyíték nem volt megfigyelhető IX-es faktor jelenlétében vagy távollétében.

A IX-es faktor SB 249417-hez való kötődésének kinetikáját BIAcore elemzéssel vizsgáljuk, az ellenanyagot immobilizált protein A felszínhez kötve. A rekombináns humán IX-es faktort (rhFIX, Genetics Institute) 49 nM-ban használjuk, és a méréseket 5 mmol/l Ca²⁺ jelenlétében hajtjuk végre. A kölcsönhatást a gyors asszociáció jellemzi: kass=2,0*10⁵/M*s, és viszonylag alacsony szétválási sebesség kdiss=4,1 *10-4/s. A IX-es faktor kötődésére számított K_d 1,9 nM.

Az 1. táblázatban az SB 249417 biofizikai tulajdonságait foglaljuk össze.

1. táblázat

Az SB 249417 biofizikai tulajdonságainak összefoglalása

Izotípus	lgG1, kappa
Tisztaság SDS-PAGE alapján	>95% (redukáló körülmények között)
Molekulasúly
Tömegspektroszkó- pia	148,000 Da
Analitikai ultracentrifugálás	148,000 Da
A IX-es faktor kötődésének sztöchiometriája
Izotermális titrálási kalorimetria	1,5 mól IX-es faktor: 1 mól monoklonális ellenanyag
A IX-es faktor kötődési affinitása
Izotermális titrálási kalorimetria	Kd=4 nM 25 °C-on
Bioszenzor	Kd=2 nM
A IX-es faktor kötődésének kinetikája
Bioszenzor	kass=2,0*105/Mxs
	kdiSS=4x10-+/s

HU 225 874 Β1

A 2. táblázatban a jelen találmány szerinti monoklonális ellenanyagok IX-es faktort kötő tulajdonságait foglaljuk össze. A számított disszociációs konstansok lényegében egyformák a kísérleti hibahatáron belül.

2. táblázat

A IX-es faktor anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyagokhoz való kötődésének kinetikája

Monoklonális ellenanyag	kass (M-1s-1)	kdiss=(s_1)	Számított KD (nM)
SB249417	2,0*105	4,1*1(H	1,9
BC2	4,8*105	9,1*10^»	1,9
Chf9	2,4*105	3,0x1ο-4	1,3
SB 249413	6,5*105	2,8*10-3	3,7-5,1
SB 249415	7,5*105	1,8*1(H	1,1-2,3
SB 249416	5,2*105	4,1x1ο-4	0,8
SB 257731	9,2*105	9,9*10^	1,1
SB 257732	1,1*10«	1,2*10-5	1,5

Az rhFIX és az SB 249417, BC2 és más humanizált konstrukciók közötti kölcsönhatásokat titrálásos mlkrokalorimetriával jellemezzük, ami a kötés belső hője alapján oldatban méri a kötési kölcsönhatásokat. 106 μΜ IX-es faktort kilencszer injekciózunk a kaloriméterbe, ami 2 μΜ SB 249417 monoklonális ellenanyagot tartalmaz. A kötést az első 4 injekciózás esetében exoterm hőfejlődés kíséri. Legalább 5 injekciónál a monoklonális ellenanyag kötési helyek IX-es faktorral telítettek, és csak a keverés háttérhőjét lehet megfigyelni. Az eredmények azt mutatják, hogy az ekvivalenciapont közel 2 IX-es faktor per monoklonális ellenanyag moláris kötési aránynál lép fel, amint az várható volt. Az adatok nemlineáris legkisebb négyzetek módszerével végzett elemzése eredményezi a kötési affinitást.

A monoklonális ellenanyagok rhFIX affinitásait 34-44 °C hőmérséklet-tartományban mérjük 10 mmol/l HEPES, 10 mmol/l CaCI₂, 150 mmol/l nátrium-klorid pH=7,4 összetételű oldatban. Ezek az adatok lehetővé teszik, hogy 37 °C-on közvetlenül meghatározzuk az affinitást, és a 25 °C-os affinitást a van’t Hoff-egyenletből lehet kiszámítani. A 3. táblázat adatai azt mutatják, hogy az SB 249417 és a BC2, valamint más humanizált konstrukciók affinitása a hibahatáron belül van (2-es faktor).

3. táblázat

Az anti-IX-es faktor monoklonális ellenanyagok titrálási kalorimetriás eredményei

Monoklonális ellenanyag	Kd, nM 25 °C-on	Kd, nM 37 °C-on	Moláris kötési arány FlX/monoklonális ellenanyag
BC2	10	20	1,4
SB 249413	6	12	1,9

Monoklonális ellenanyag	Kd, nM 25 °C-on	Kd, nM 37 “C-on	Moláris kötési arány FlX/monoklonális ellenanyag
SB 249415	3	7	1,7
SB 249417	4	12	1,5
SB 257732	4	9	1,8

Az SB 249413-as, SB 249415-ös, SB 249417-es és SB 257732-es monoklonális ellenanyagok differenciál pásztázó kalorimetriával mind nagyon hasonló hőstabilitást mutatnak. A kitekeredési hőmérsékletük 70-75 °C között van, ami arra utal, hogy erősen stabilak a hővel indukált denaturálással szemben.

10. példa

A IX-es faktor ellenanyaggal indukált gátlásának mechanizmusa

Kiméra konstrukciók könyvtárát készítjük el, amik a IX-es faktor szekvenciáiból állnak, a homológ Vll-es faktor fehérje keretrégiójába illesztve, és arra használjuk, hogy feltérképezzük a BC2 IX-es faktor monoklonális ellenanyag epitopját [Cheung és munkatársai: Tromb. Rés. 80, 419-427 (1995)]. A kötést a BiaCore 2000 felszíni plazmon rezonancia berendezéssel mérjük. A BC2 ellenanyagot közvetlenül kapcsoljuk a csiphez, az NHS/EDC reakció használatával. A kötést kétperces érintkezési idővel mérjük, 20 μΙ/percnél, az egyes konstrukciókból 200 nM-t használva 25 mmol/l MOPS pH=7,4, 0,15 mol/l nátrium-klorid, 5 mmol/l CaCI₂ összetételű oldatban. A disszociációt három percig mérjük, ugyanazt a puffért használva fehérje nélkül. 50 mmol/l EDTA jelenlétében nem volt kimutatható kötés a vad típusú konstrukcióhoz. Az adatokat a 4. táblázatban mutatjuk be.

4. táblázat

A IX-es faktor konstrukcióknak a BC2 ellenanyaghoz való kötődésének összefoglalása

Konstrukció	A kötés mértéke
Plazma IXa faktor	Kötődik
r-IX	Kötődik
Plazma Vll-es faktor	Nincs kötődés
IX LC/VII HC	Kötődik
IX-A/VII	Kötődik
VII gla/IX	Nincs kötődés
VII-A/IX	Nincs kötődés
VII gla(IX3—11)/IX	Kötődik
VII gla (IX3-6)/IX	Nagyon alacsony kötődés
VII gla(IX9—11)/IX	Nagyon alacsony kötődés
IX K5A	Kötődik

HU 225 874 Β1

Ezek az adatok azt mutatják, hogy a IX-es faktor könnyű láncát és a Vll-es faktor nehéz láncát (IX LC/VII HC); a IX-es faktor gla és aromás stack doméneket (IXA/VII); a IX-es faktor gla domént a Vll-es faktor gla doménben [VII gla (1X3-11)/IX]; és a IX-es faktort, ami egy lizin-alanin helyettesítést tartalmaz az 5-ös pozícióban (IX K5A) tartalmazó konstrukciók mutatnak kötést a BC2-höz. A VII gla (1X3-11)/IX konstrukció a vad típusú IX-es faktoréval (plazma IXa faktor és r-IX) ekvivalens BC2-kötődést mutat. Tehát a BC2 ellenanyag kötődik egy epitophoz, ami a IX-es faktor gla dómén

3-11-es csoportjaiban található.

11. példa

Az artériás trombózis kezelése anti-IX-es faktor ellenanyaggal és szöveti plazminogén aktivátorral

A tPA beadását járulékos terápiákkal vagy azok nélkül kezdjük meg, a karotid artéria teljes elzáródása után. A vér artériában való áramlását folyamatosan ellenőrizzük.

300-490 gramm súlyú hím Sprague-DawIey-patkányokat (Charles River, Raleigh, NC) anesztetizálunk nátrium-pentobarbitállal (55 mg/kg, intraperitoneálisan). A patkányokat a hátukra fektetve tesszük egy 37 °C-ra melegített műtőasztalra, majd a nyakon egy bemetszést teszünk; a légcsövet izoláljuk, és egy ΡΕ-240-nel (Intramedic cső) kanülözzük. Azután a bal karotid artériát és a nyaki vénát izoláljuk. 4 mm² Parafilm M lapot (American National Can) teszünk a karotid artéria alá, és egy elektromágneses véráramlási próbát (Carolina Medical) teszünk az artériára, hogy mérjük a vér áramlását. A gyógyszer beadásához egy kanült (Tygon, 0,5 mm*1 mm, Norton Performance Plastics) szúrunk be a nyaki vénába. Azután izoláljuk a bal combcsonti artériát, és kanülözzük, hogy mérjük a vérnyomást, és vérmintákat vegyünk.

A karotid artériában a trombózist úgy iniciáljuk, hogy 10 percre egy 6,5 mm átmérőjű, kör alakú, 50%-os FeCI₃-oldattal átitatott üveg mikroszűrőpapír tapaszt teszünk az áramlásmérő után a karotid artériába, a 3. példában ismertetett módon. Ebben a jól jellemzett modellben a vérrög képződése szokatlanul teljes 15 percen belül.

Az SB 249415 anti-IX-es faktor ellenanyagot bolusban adjuk be tPA-val kombinálva (Genentech, South San Francisco, CA), míg a heparint (Elkins-Sinn Inc., Cherry Hill, NJ) bolusként adjuk be, ezt követi az infúzió. Minden gyógyszerinfúzió a kísérleti periódus végéig tart - a véredény elzáródásától mért 60 percig. 1 ml-es vérmintákat veszünk az aPTT és PT esszéhez a 0., 30. és 60. percben (ez a vizsgálat vége) a combcsonti artériából, 3,8%-os citrátoldatba tesszük, majd centrifugáljuk. Az aPTT-t és a PT-t (protrombinidő) egy fibrométerrel követjük (BB1L, Bacter Dade vagy MLA Electra 800 Automatic Coagulation Timer), standardeljárások alkalmazásával. A kísérlet végén a vérrögöt extraháljuk a karotid artériából, és súlyát lemérjük.

Minden adatot átlagcsoportérték ±SEM formában adunk meg, az egyes csoportokban jelzett számú patkányra. A többszörös összehasonlításokhoz ANOVA és Bonferoni-teszteket használunk a csoportok közötti elemzésekhez, és egy p<0,05 értéket fogadunk el szignifikánsnak.

Egy elzáró vérrög körülbelül 15 perccel azután alakul ki, hogy az arteriális sérülést okozó FeCI₃-os tapaszt a patkány karotid artériájára alkalmazzuk. Amint az a 10. ábrán látható, csak a tPA-val az elzáródott véredény reperfúziója csak azután figyelhető meg, hogy 9 mg/kg tPA-t adunk be, és a kezelt véredények 67%ában a 60 perces protokoll alatt újra kialakul a véráram. Ennél a tPA-dózisnál 60 E/kg heparin vagy 3 mg/kg anti-IX-es faktor ellenanyag, az SB 249415 beadása nem eredményezi a reperfúzió gyakoribb előfordulását, ami arra utal, hogy a FeCI₃ sérülés modellben a vérrögöknek körülbelül 30%-a ellenáll a lízisnek.

A 10. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy a tPA alacsonyabb dózisaiban a reperfúzió előfordulása szignifikánsan függ attól, hogy a trombolitikummal együtt milyen antikoagulánst adtunk be. Amikor 60 E/kg heparint adunk be, akkor a reperfúziót mutató véredények százaléka drasztikusan csökkent, és 3, valamint 6 mg/kg tPA-val csak 12,5, illetve 40%-os reperfúzió volt megfigyelhető. Ha a tPA-val együtt 3 mg/kg SB 249415-öt adunk be, akkor viszont 3 mg/kg tPA esetében nagyobb mint 60%-os reperfúziót, és 6 mg/kg tPA esetében 79%-os reperfúziót kapunk. Tehát az anti-IX-es faktor ellenanyag szignifikánsan eltolja a trombolitikus dózis-hatás görbét, ami a trombolitikus ágensek alacsonyabb dózisaiban lehetővé teszi a reperfúziót.

A trombol ízis és a vérrög képződése dinamikus folyamat, és néha megfigyelhető az átjárhatóság időszaka, amit újraelzáródás követ. Mivel a karotid véráramlást folyamatosan követjük a 60 perces kísérleti protokoll során, ezért lehetséges, hogy mennyiségileg meghatározzuk a karotid átjárhatóságának összidejét. Amint az a 11. ábrán látható, a véredény átjárhatóságának összes ideje lényegesen megnő, ha 3 mg/kg anti-IX-es faktor ellenanyagot plusz tPA-t adunk be. Ez különösen evidens a tPA legalacsonyabb és közepes dózisaiban, azaz 3 és 6 mg/kg dózisokban. 3 mg/kg SB 249415 plusz 3 mg/kg tPA kombinált dózisa esetében az átjárhatóság teljes ideje 30,6+9,2 perc, amit a 60 E/kg heparin plusz 3 mg/kg tPA dózisával lehet összehasonlítani (7,1±7,1 perc). Az átjárhatóság ideje nulla volt csak 3 mg/kg tPA alkalmazásakor. 6 mg/kg tPA dózis esetében heparin egyidejű beadása csak enyhén növeli az átjárhatóság idejét (12,9±6,0 perc), míg a tPA-SB 249415 kombináció éri el a 38,7±8,4 perces maximális átjárhatósági időt. Csak a tPA legmagasabb dózisában (9 mg/kg) közelíti meg a heparin kombinációs megközelítési mód az SB 249415-tel kapott átjárhatósági időt, azaz 31,9±4,8 perc, illetve 38,0±8,4 perc értékeket.

Az artériás infarktus után a véráramlás gyors helyreállítása kritikus az ischaemiás szövet károsodása minimalizálására. A 12. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy az anti-IX-es faktor ellenanyag tPA-val való kombinálása a reperfúzió csökkent idejét eredményezi, a csak tPA-val, vagy heparin plusz tPA-val kapott eredményekhez viszonyítva, és ezt alacsonyabb

HU 225 874 Β1 tPA-dózissal lehet elérni. Ha a trombolízist 3 mg/kg SB 249415 plusz 3 mg/kg tPA kombinációval érjük el, akkor a trombolízis ideje 29,4±9,2 perc. Csak 3 mg/kg tPA esetében nem figyelhető meg reperfúzió. 60 E/kg heparin plusz 3 mg/kg tPA esetében a trombolízis ideje 52,8±7,1 perc. A tPA magasabb dózisaiban (6 és 9 mg/kg) az ellenanyag plusz tPA kezelési móddal 19,4±6,3 és 20,8±8,7 perc kiindulási trombolízist lehet elérni. A hozzáadott antikoaguláns hiányában a trombolízis ideje 60 perc (azaz a kísérleti protokoll korlátja), és 27,5±6,4 perc 6 és 9 mg/kg dózisban. 60 E/kg heparin hozzáadásával a trombolízis megfelelő ideje 44,0±7,1 és 27,0±4,9 perc. Tehát az SB 249415 hozzáadásával mindig korábbi reperfúziót lehet elérni, mint csak heparinnal vagy tPA-val.

12. példa

Az antl-IX-es faktor ellenanyag hatása a hemosztatikus funkcióra

Az anti-IX-es faktor vagy a heparin befolyását a hemosztatikus funkció fenntartására úgy határozzuk meg, hogy csak tPA-val, tPA plusz heparinnal és tPA plusz SB 249415-tel kezelt patkányokban követjük a fibrinogén, a plazminogén és az alfa-2-antiplazmín szintjeit, és az eredményeket a hordozóval kezelt állatokban kapott eredményekkel hasonlítjuk össze. Amint az a 13. ábrán látható, a növekvő dózisú tPA az egyes mért hemosztatikus markerek csökkent szintjét eredményezi. A tPAval nem kezelt állatokban az alfa-2-antiplazmin-szintek körülbelül 90%-ról körülbelül 20%-ra estek, ahogy a tPA dózisa 9 mg/kg-ra nőtt. A plazminogén szintek a tPA kezelés nélküli körülbelül 100%-os szintről körülbelül 40%-ra estek a 9 mg/kg-mal kezelt csoportban. Hasonlóképpen, a magas dózisú tPA-csoportban a fibrinogén szintek körülbelül 150 mg/dm³ szintről körülbelül 90 mg/dm³ szintre estek vissza. Érdekes módon úgy tűnik, hogy a járulékos kezelés megválasztása nem érinti szignifikánsan ezeket a markereket. Az egyes tPA-dózisokban hasonló alfa-2-antiplazmin, plazminogén és fibrinogén szintek voltak megfigyelhetők a hordozót, 30 vagy 60 E/kg heparint vagy 1 vagy 3 mg/kg SB 249415-öt kapott állatokban. A hemosztatikus markerek megfigyelt csökkenése csak a trombolitikus ágens, a tPA dózisától függ, és ezek a csökkenések, különösen a fibrinogén esetében különösen nagynak tűnnek a 6 mg/kg-nál nagyobb tPA-dózisok esetében, azaz a magas, 9 mg/kg dózisú csoportban.

A különböző kezelési módoknak a standard aPTT koagulációs esszére gyakorolt hatásait is követtük (14. ábra). A tPA növekvő dózisaival az aPTT 19,3 mp±0,6 mp-ről 30,0 mp±1,6 mp-re nőtt a hordozó és a 9 mg/kg tPA esetében. 3 mg/kg SB 249415 beadása az aPTT korlátozott növekedését okozza a kontrollállatokban, 49,6 mp±6,4 mp-re. Amikor az SB 249415-öt tPA-val együtt adjuk be, akkor a megfigyelt növekedés valamivel nagyobb volt, és a tPA dózisától függött. Ha az SB 249415-öt 3 mg/kg tPA-val kombináljuk, akkor ez 58,3 mp±5,2 mp aPTT-t eredményez, míg az SB 249415 9 mg/kg dózisú tPA-val való kombinálása az aPTT-t 77,3 mp±19,7 mp-re növeli. Akár a

E/kg, akár a 60 E/kg dózisú heparin beadása az aPTT nagy növekedését okozza. tPA nélkül az aPTT 300 és 600 másodperc között változott a 30 és 60 E/kg dózisok között. A tPA-val kezelt állatok esetében az aPTT körülbelül 800 másodperc volt.

A heparinnal kapott aPTT megemelkedése, különösen akkor, ha a hemosztatikus paraméterek megzavarásához kapcsolódik a tPA nagy dózisaira való igény miatt, azzal a céllal, hogy effektív reperfúziót kapjunk, valószínűleg hozzájárul a vérzésekhez. Ezzel szemben az SB 249415 nem növeli nagyon az aPTT-t, és lehetővé teszi, hogy alacsonyabb tPA-dózisokat használjunk, ezzel szignifikáns előnyöket biztosítva a szívinfarktus és a stroke trombolitikus terápiájában.

13. példa

Az SB 249415 fokozza a szöveti plazminogén aktivátor litikus potenciálját stroke-ban

Az ezekben a vizsgálatokban alkalmazott patkány tromboembolikus modell lényegében az, amit Busch és munkatársai írtak le [Busch és munkatársai: Brain Research 778, 16-24 (1997)]. A modell három lényeges lépése a vérrögök preparálása, a patkány preparálása a vérrögképződés után és a farmakológiai beavatkozás.

Egy donor patkányból teljes vért veszünk, egy citrátozott vacutainer csőbe. Az 500 μΙ citrátozott vért rögtön hozzáadjuk egy 1 egység humán trombint és 5 μΙ 1 mol/l CaCI₂-ot tartalmazó kémcsőhöz, amiben a CaCI₂ végkoncentrációja 10 mmol/l. 5-10 másodpercen belül ennek a koktélnak egy kis részét egy körülbelül 15 cm hosszú PE50 katéterbe visszük át, és hagyjuk, hogy egy óra hosszat szobahőmérsékleten megalvadjon. A periódus végén a vérrögfonalat kinyomjuk a katéterből, egy sóoldattal töltött Petri-csészébe, majd 1,5 mm-es darabokra vágjuk. Ezek közül a darabok közül (vérrögök) tizenkettőt átviszünk 0,04 mg/ml patkányalbumint tartalmazó sóoldatba, majd egy PE50 katéterbe visszük vissza körülbelül 60 μΙ térfogatban. A vérrögöket, amik egymáshoz érintkezve vannak a katéterben, használjuk patkány embolizálására.

Hím Sprague-DawIey-patkányokat (350-450 g) készítünk elő műtétileg, hogy 0,5 mg/kg szubkután atropindózist kapjanak, majd 5% isoflurane-nal anesztetizáljuk őket, amit 2%-os fenntartó dózis követ. A testhőmérsékletet 37-38 °C között tartjuk. Aszeptikus körülmények között a nyaki területen nyíl alakú középvonalbemetszést ejtünk, feltárva a jobb közös karotid artériát (CCA), a jobb belső karotid artériát (ICA), a jobb külső karotid artériát (ECA) és a pteryogopalatine artériát. A pteryogopalatine artériát kikötjük. Az ECA egy részét izoláljuk, majd kikötjük és vágjuk. A CCA-t és az ICA-t kampózzuk, és a vérrögöket tartalmazó PE450 katétert az ECA-csonkba inszertáljuk, majd az elágazásig előretoljuk. Az ICA-kampót eltávolítjuk, és a vérrögöket lassan az ICA-ba infundáltatjuk, miközben ezzel egy időben a CCA-kampót eltávolítjuk. 5 perccel a vérrög bevitele után egy farokvénán keresztül megkezdjük hordozó (sóoldat) vagy SB 249415 (2,0 mg/kg) és/vagy tPA (5,0 mg/kg) intravénás infúzióját. Az SB 249415-öt

HU 225 874 Β1 egyetlen bolus dózisban adjuk be, míg a tPA 5 mg/kg dózisát 10%-os bolusként infundáltatjuk, majd ezt követi a többi 90% beadása 30 perc alatt. A műtéti bemetszést lezárjuk, és hagyjuk, hogy a patkány rendbe jöjjön.

Az embolizálás után huszonnégy órával a patkányokat anesztetizáljuk és leöljük. Az agyat eltávolítjuk, és két milliméterenként hét harántmetszetet készítünk a frontális cerebrális pólusból. A metszeteket 20 percig 1%-os 2,3,5-trifenil-tetrazólium-kloridban inkubáljuk, majd formaiinban fixáljuk. A megfestett agyi metszeteket lefényképezzük, és egy képelemző rendszerrel (Optimus Inc., Bothell, Wash.) elemezzük. Kiszámítjuk az infarktus területét mm²-ben, oly módon, hogy a számítógép képernyőjén követjük az infarktus körvonalait. Az egyes kezelésekre az aggregált átlagos infarktust a 15. ábrán mutatjuk be [kontroll (n=20), tPA (n=7) és SB 249417 (n=6)]. Ha a patkányok a vérrög után 5,0 mg/kg dózisban kapnak tPA-t, akkor ez a keletkező átlagos infarktustérfogat körülbelül 33%-os csökkenését eredményezi. Csak az SB 249415 beadása esetén a kapott infarktus térfogata körülbelül 70%-ban lecsökkent. 5,0 mg/kg tPA és 2,0 mg/kg SB 249417 kombinációja további védelmet biztosít, a kapott átlagos infarktustérfogat körülbelül 88%-os csökkenését okozva (P=0,126). Ebben a modellben az infarktusok hasonló gyakorisággal fordulnak elő a striatumban és a neocortexben is. Az infarktusos szövet elhelyezkedése alapján az elzáródás leggyakoribb helye a középső agyi artéria (MCA). Bár kevésbé gyakran, a bizonyíték azt sugallja, hogy a koroidális, anterior és posterior agyi artériák is elzáródnak alkalmanként. Ha a koronális metszeten nézzük (nem közölt adatok), akkor az infarktus térfogatának a kezelés hatására való csökkenésének legnagyobb része a centrális MCA-perfúzió területén volt. Az infarktusos szövet eloszlása nem változott meg észrevehető módon a kezelések hatására.

Az eredmények azt mutatják, hogy egy anti-IX-es faktor ellenanyag, azaz például az SB 249417, ha a vérrögképződés után adjuk be, akkor képes csökkenteni az infarktusos agyszövet képződését, ha monoterápiaként használjuk, vagy egy trombolitikus ágens, azaz például a tPA mellett járulékosan használjuk. Az anti15 IX-es faktor ellenanyagoktól, azaz például az SB 249417-től azt várjuk, hogy klinikailag használható a tromboembóliás stroke-ban, akár önmagában, akár a trombolitikus ágensek mellett, járulékosan. A kombinációs terápia lehetővé teszi a trombolitikus ágens mennyiségének csökkentését, majd a haemorrhagiás stroke elősegítése kockázatának csökkentését.

A jelen találmány más módon is megvalósítható, anélkül hogy eltérnénk a találmány szellemétől és esszenciális attribútumaitól, és ennek megfelelően in25 kább hivatkozunk a csatolt igénypontokra, mint az előző leírásra, amikor a találmány oltalmi köréről beszélünk.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat.

SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ (i) : BENYÚJTÓ: Blackburn, Michael Feuerstein, Giora

Barone, Frank C.

Toomey, John R.

(ii) TALÁLMÁNY CÍME: Antitrombotikus ágensek (iii) SZEKVENCIÁK SZÁMA: 111 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) CÍMZETT: SmithKIine Beecham Corporation (B) UTCA: 709 Swedeland Road (C) VÁROS: King of Prussia (D) ÁLLAM: PA (E) ORSZÁG: USA (F) ZIP: 19406 (v) SZÁMÍTÓGÉPPEL OLVASHATÓ FORMA:

(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: flopi (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: DOS (D) Program: FastSEQ Version 1.5 (vi) A JELENLEGI BENYÚJTÁS ADATAI:

(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA: ismeretlen (B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA: ezennel (C) OSZTÁLYOZÁS:

(vii) A KORÁBBI BENYÚJTÁS ADATAI:

(A) A BENYÚJTÁS SORSZÁMA: 09/571,434 (B) A BENYÚJTÁS IDŐPONTJA: 15-MAY-2000 (viii) ÜGYVÉD/ÜGYNÖK INFORMÁCIÓ:

(A) NÉV: Baumeister, Kirk (B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 33,833

HU 225 874 Β1 (C) REFERENCIA/DOSSZIÉ SZÁMA: P50438-2 (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS INFORMÁCIÓ:

(A) TELEFON: 610-270-5096 (B) TELEFAX: 610-270-5090 (C) TELEX:

(2) INFORMÁCIÓ AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CATCCTAGAG TCACCGAGGA 20 (2) INFORMÁCIÓ A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 21 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (ív) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AGCTGCCCAA AGTGCCCAAG C 21 (2) INFORMÁCIÓ A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 36 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG 36 (2) INFORMÁCIÓ A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 21 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GATTTTCARG TGCAGATTTT C 21

HU 225 874 Β1 (2) INFORMÁCIÓ AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 363 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAGATCCAGT TGGTGCAGTC TGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60 TCCTGCAAGG CTTCTGGGTA CACCTTCACA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT 120 CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 180 GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTTGGAAA GCTCTGCCAG CACTGCCAAT 240 TTGCAGATCG ACAACCTCAA AGATGAGGAC ACGGCTACAT ATTTCTGTAC AAGAGAAGGG 300 AATATGGATG GTTACTTCCC TTTTACTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT CACTGTCTCT 360 GCA 363 (2) INFORMÁCIÓ A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 321 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACA 60 ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAAT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA 120 TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC 180 TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA 240 GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTATTAACC CACGGACGTT CGGTGGAGGC 300 ACCAAGCTGG AAATCAAACG G 321 (2) INFORMÁCIÓ A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 121 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: internál (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Gin 1

Ile Gin Leu Val 5

Gin

Ser

Gly Pro

Glu 10

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Alá

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

HU 225 874 Β1

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Alá

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Alá

Ser

Thr

Alá

Asn

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Thr

Alá

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Alá

115 120 (2) INFORMÁCIÓ A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 5 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: internál (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 (2) INFORMÁCIÓ A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 17 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys 15 10 15

Gly (2) INFORMÁCIÓ A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 12 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

HU 225 874 Β1 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr 15 10 (2) INFORMÁCIÓ A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK (A) HOSSZ: 107 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Gin 1

Ile

Val

Leu

Ser 5

Gin

Ser

Pro

Alá

Ile 10

Leu

Ser

Alá

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Alá

Glu

65

70

75

80

Asp

Alá

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) INFORMÁCIÓ A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Arg Alá Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His 15 10 (2) INFORMÁCIÓ A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM

HU 225 874 Β1 (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá Thr Ser Asn Leu Alá Ser 1 5 (2) INFORMÁCIÓ A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 9 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS.· 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr 1 5 (2) INFORMÁCIÓ A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(I) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 104 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAACTAGTGC AATCTGGGTC TGAGTTGAAG AAGCCTGGGG CCTCAGTGAA GGTTTCCTGC AAGGCCTCTG GATACACCTT CACTAACTAT GGAATGAACT GGGT (2) INFORMÁCIÓ A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 108 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TTGAAGTCAT CAACATATGT TGACTTTCCA TTTCTGGTGT TTATCCATCC CATCCACTCG AGCCCTTGTC CAGGGGCCTG TCGCACCCAG TTCATTCCAT AGTTAGTG (2) INFORMÁCIÓ A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 107 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM

104

108

HU 225 874 Β1 (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTiPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GTCAACATAT GTTGATGACT TCAAGGGGCG GTTTGTCTTC CCTCTGTCAG CACGGCATAT 60

CTACAGATCA GCAGCCTAAA GGCTGACGAC ACTGCAGTGT ATTACTG 107 (2) INFORMÁCIÓ A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 91 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTiPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGCACA 60

GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG G 91 (2) INFORMÁCIÓ A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 337 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTiPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 2...337 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

A CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG 49

Leu 1

Val

Gin

Ser

Gly 5

Ser

Glu

Leu

Lys

Lys 10

Pro

Gly

Alá

Ser

Val 15

Lys

GTT

TCC

TGC

AAG

GCC

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

ACT

AAC

TAT

GGA

ATG

AAC

97

Val

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

Gly

Met

Asn

20

25

30

TGG

GTG

CGA

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

GAG

TGG

ATG

GGA

TGG

ATA

145

Trp

Val

Arg

Gin

Alá

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

35

40

45

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

AAG

GGG

CGG

193

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

50

55

60

TTT

GTC

TTC

TCC

TTG

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

CTA

CAG

ATC

241

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Alá

Tyr

Leu

Gin

Ile

65

70

75

80

HU 225 874 Β1

AGC AGC

CTA AAG GCT

GAC Asp

GAC ACT

GCA GTG Alá Val 90

TAT Tyr

TAC Tyr

TGT Cys

GCG Alá

AGA Arg 95

GAA Glu

289

Ser

Ser

Leu

Lys

Alá 85

Asp

Thr

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

CAG

GGT

ACC

337

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

100

105

110

(2) INFORMÁCIÓ A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 112 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Leu 1

Val

Gin

Ser

Gly 5

Ser

Glu

Leu

Lys

Lys 10

Pro

Gly

Alá

Ser

Val 15

Lys

Val

Ser

Cys

Lys 20

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr 25

Phe

Thr

Asn

Tyr

Gly 30

Met

Asn

Trp

Val

Arg 35

Gin

Alá

Pro

Gly

Gin 40

Gly

Leu

Glu

Trp

Met 45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr 50

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser 55

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp 60

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe 65

Val

Phe

Ser

Leu

Asp 70

Thr

Ser

Val

Ser

Thr 75

Alá

Tyr

Leu

Gin

Ile 80

Ser

Ser

Leu

Lys

Alá 85

Asp

Asp

Thr

Alá

Val 90

Tyr

Tyr

Cys

Alá

Arg 95

Glu

Gly

Asn

Met

Asp 100

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe 105

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gin 110

Gly

Thr

(2) INFORMÁCIÓ A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 33 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (V) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GCTACTAGTG CAATCTGGGT CTGAGTTGAA GCC 33 (2) INFORMÁCIÓ A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 30 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú

HU 225 874 Β1 (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TGGGTACCCT GGCCCCAGTA AGTAAAAGGG 30 (2) INFORMÁCIÓ A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 97 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) LOCATION:27...95 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG

GTA

GCA

ACA

GCT

ACA

GGT

GTC

CAC

TCC

CAG

GTC

CAA

CTA GT

97

Leu

Val

Alá

Thr

Alá

Thr

Gly

Val

His

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

10

15

20

(2) INFORMÁCIÓ A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 23 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Alá Thr Alá Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Gin Val Gin Leu 20 (2) INFORMÁCIÓ A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 110 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM

HU 225 874 Β1 (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGAGACGCCA TCGAATTCTG AGCACACAGG ACCTCACCAT GGGATGGAGC TGTATCATCC TCTTCTTGGT AGCAACAGCT ACAGGTGTCC ACTCCCAGGT CCAACTGCAG (2) INFORMÁCIÓ A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGAGACGCCA TCGAATTCTG A (2) INFORMÁCIÓ A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 30 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GATTGCACTA GTTGGACCTG GGAGTGGACA (2) INFORMÁCIÓ A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 77 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CTAGAGTGGG TCGCAGAGAT CTCTGATGGT GGTAGTTACA CCTACTATCC AGACACTGTG ACGGGCCGGT TCACGAT (2) INFORMÁCIÓ A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 73 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

110

HU 225 874 Β1 (xi) SZEKVENCIALElRÁS: 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

ATCGTGAACC GGCCCGTCAC AGTGTCTGGA TAGTAGGTGT AACTACCACC ATCAGAGATC 60

TCTGCGACCC ACT 73 (2) INFORMÁCIÓ A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 363 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 1...363 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: F9HZHC 1-0 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAG GTG CAA CTA GTG

CAA Gin

TCT Ser

GGG TCT

GAG Glu 10

TTG Leu

AAG Lys

AAG Lys

CCT Pro

GGG Gly 15

GCC Alá

48

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gly

Ser

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

AAG

GCC

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

ACT

AAC

TAT

96

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

CGA

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

GAG

TGG

ATG

144

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Alá

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

192

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

AAG

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

TCC

TTG

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Alá

Tyr

65

70

75

80

CTA

CAG

ATC

AGC

AGC

CTA

AAG

GCT

GAC

GAC

ACT

GCA

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Alá

Asp

Asp

Thr

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

GCG

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

336

Alá

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

CAG

GGT

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

363

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

(2) INFORMÁCIÓ A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 121 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM

HU 225 874 Β1 (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser Gly

Ser Glu Leu 10

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Alá

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Alá

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Alá

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Alá

Asp

Asp

Thr

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Alá

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120 (2) INFORMÁCIÓ A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 165 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTIPUS: egyszáiú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AGTACTGACA CAGTCTCCAG CCACCCTGTC TTTGTCTCCA GGGGAAAGAG CCACCCTCTC 60

CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAACAGAGAC CTGGCCAGGC 120

TCCCAGGCTC CTCATCTATG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGCAT 165 (2) INFORMÁCIÓ A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 146 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTIPUS: egyszáiú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAACCGCA AAATCTTCAG GCTCTAGACT 60

GCTGATGGTG AGAGTGAAAT CTGTCCCAGA CCCGGATCCA CTGAACCTGG CTGGGATGCC 120

AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CATAGA 146

HU 225 874 Β1 (2) INFORMÁCIÓ A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 280 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATfPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 2...280 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

A GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA 49

Val Leu Thr Gin Ser Pro Alá Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg

10 15

GCC ACC

CTC Leu

TCC Ser 20

TGC Cys

AGG Arg

GCC Alá

AGC Ser

TCA Ser 25

AGT Ser

GTA Val

AAT Asn

TAC ATG

CAC His

TGG Trp

97

Alá

Thr

Tyr

Met 30

TAC

CAA

CAG

AGA

CCT

GGC

CAG

GCT

CCC

AGG

CTC

CTC

ATC

TAT

GCC

ACT

145

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Alá

Thr

35

40

45

AGT

AAC

CTG

GCT

TCT

GGC

ATC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

GGG

TCT

193

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Ile

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

GAG

CCT

GAA

GAT

TTT

241

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

65

70

75

80

GCG

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

280

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

85

90

(2) INFORMÁCIÓ A 35. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 93 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATfPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: internál (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 35. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Val 1

Leu

Thr

Gin

Ser 5

Pro

Alá

Thr

Leu

Ser 10

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu 15

Arg

Alá

Thr

Leu

Ser 20

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser 25

Ser

Val

Asn

Tyr

Met 30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Alá

Thr

40 45

HU 225 874 Β1

Ser

Asn 50

Leu

Alá

Ser

Gly

Ile 55

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser 60

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

65

70

75

80

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

85

90

(2) INFORMÁCIÓ A 36. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 36. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TCGAGTACTG ACACAGTCTC CAGCCAC (2) INFORMÁCIÓ A 37. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 37. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GACCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGA (2) INFORMÁCIÓ A 38. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 94 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 27...92 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 38. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG

GTA

GCA

ACA

GCT

ACA

GGT

GTC

CAC

TCC

GAG

ATA

GTA CT

94

Leu

Val

Alá

Thr

Alá

Thr

Gly

Val

His

Ser

Glu

Ile

Val

10

15

20

HU 225 874 Β1 (2) INFORMÁCIÓ A 39. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 22 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 39. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Alá Thr Alá Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Glu Ile Val 20 (2) INFORMÁCIÓ A 40. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 30 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 40. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GACTGTGTCA GTACTATCTC GGAGTGGACA 30 (2) INFORMÁCIÓ A 41. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 55 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 41. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACTGG GCGTCGACTA GGGAATCTGG GGTAC 55 (2) INFORMÁCIÓ A 42. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 51 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 42. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCAGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C 51

HU 225 874 Β1 (2) INFORMÁCIÓ A 43. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 321 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) LOCATION: 1...321 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: F9HZLC1-0 (xi) SZEKVENCIALElRÁS: 43. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GAA Glu 1

ATA Ile

GTA CTG ACA

CAG Gin

TCT Ser

CCA Pro

GCC Alá

ACC Thr 10

CTG Leu

TCT Ser

TTG Leu

TCT Ser

CCA Pro 15

GGG Gly

Val

Leu

Thr 5

GAA

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

Glu

Arg

Alá

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AGA

CCT

GGC

CAG

GCT

CCC

AGG

CTC

CTC

ATC

TAT

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACT

AGT

AAC

CTG

GCT

TCT

GGC

ATC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Ile

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

GAG

CCT

GAA

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

GAT

TTT

GCG

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

Asp

Phe

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAG

ATC

AAA

CGA

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) INFORMÁCIÓ A 44. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 107 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 44. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Alá Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

144

192

240

288

321

HU 225 874 Β1

Glu

Arg Alá

Thr 20

Leu

Ser

Cys

Arg

Alá 25

Ser

Ser

Ser Val Asn 30

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

35

40

45

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Ile

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

Phe

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) INFORMÁCIÓ A 45. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 134 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 45. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CCTGGACAAG GGCTCAAGTG GATGGGATGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 60

GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGTCTTC TCTCTAGACT CCTCTGTCAG CACGGCATAT 120

CTACAGATCA GCAG 134 (2) INFORMÁCIÓ A 46. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 134 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 46. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA 60

GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG GCTGCTGATC TGTAGATATG CCGTGCTGAC 120

AGAGGAGTCT AGAG 134 (2) INFORMÁCIÓ A 47. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 225 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

HU 225 874 Β1 (vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 1...225 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 47. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CCT Pro 1

GGA CAA GGG

CTC AAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT

GGA Gly

48

Gly

Gin

Gly

Leu 5

Lys

Trp

Met

Gly

Trp 10

Ile Asn

Thr

Arg

Asn 15

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

AAG

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

TCT

CTA

96

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

20

25

30

GAC

TCC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

CTA

CAG

ATC

AGC

AGC

CTA

AAG

GCT

144

Asp

Ser

Ser

Val

Ser

Thr

Alá

Tyr

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Alá

35

40

45

GAC

GAC

ACT

GCA

GTG

TAT

TAC

TGT

ACG

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

192

Asp

Asp

Thr

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

50

55

60

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

CAG

GGT

ACC

225

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

65

70

75

(2) INFORMÁCIÓ A 48. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 75 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 48. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Pro Gly 1

Gin

Gly

Leu 5

Lys

Trp

Met Gly

Trp 10

Ile

Asn Thr Arg Asn 15

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

20

25

30

Asp

Ser

Ser

Val

Ser

Thr

Alá

Tyr

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Alá

35

40

45

Asp

Asp

Thr

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

50

55

60

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

65

70

75

(2) INFORMÁCIÓ A 49. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS

HU 225 874 Β1 (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 49. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TTTCCTGGAC AAGGGCTCAA GTGGATG 27 (2) INFORMÁCIÓ AZ 50. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 24 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 50. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TTTGGTACCC TGGCCCCAGT AAGT 24 (2) INFORMÁCIÓ AZ 51. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 363 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 1...363 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: F9HZHC 1-1 (xi) SZEKVENCIALElRÁS: 51. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAG Gin 1

GTG Val

CAA Gin

CTA GTG Leu Val 5

CAA Gin

TCT Ser

GGG Gly

TCT Ser

GAG Glu 10

TTG Leu

AAG Lys

AAG Lys

CCT Pro

GGG Gly 15

GCC Alá

48

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

AAG

GCC

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

ACT

AAC

TAT

96

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

CGA

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

AAG

TGG

ATG

144

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Alá

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

192

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

AAG

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

TCT

CTA

GAC

TCC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Ser

Ser

Val

Ser

Thr

Alá

Tyr

65

70

75

80

CTA

CAG

ATC

AGC

AGC

CTA

AAG

GCT

GAC

GAC

ACT

GCA

GTG

TAT

TAC

TGT

288

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Alá

Asp

Asp

Thr

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

HU 225 874 Β1

ACG Thr

AGA GAA Arg Glu

GGG Gly 100

AAT Asn

ATG Met

GAT Asp

GGT Gly

TAC Tyr 105

TTC Phe

CCT Pro

TTT Phe

ACT Thr

TAC Tyr 110

TGG Trp

GGC Gly

336

CAG

GGT

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

363

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

120

(2) INFORMÁCIÓ AZ 52. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 121 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 52. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Gin 1

Val Gin

Leu Val 5

Gin

Ser

Gly

Ser

Glu 10

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Alá

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Alá

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Ser

Ser

Val

Ser

Thr

Alá

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Alá

Asp

Asp

Thr

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115 120 (2) INFORMÁCIÓ AZ 53. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 82 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 53. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAACAGAGAC CTGGCCAGGC TCCCAAGCCC TGGATCTATG CCACGAGTAA CCTGGCTAGC 60

GGCGTCCCAG CCAGGTTCAG TG 82

HU 225 874 Β1 (2) INFORMÁCIÓ AZ 54. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 90 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 54. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GATCCACTGA ACCTGGCTGG GACGCCGCTA GCCAGGTTAC TCGTGGCATA GATCCAGGGC 60

TTGGGAGCCT GGCCAGGTCT CTGTTGGTAC 90 (2) INFORMÁCIÓ AZ 55. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 27 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 55. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Gin Gin Arg Pro Gly Gin Alá Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Alá Thr Ser 15 10 15

Asn Leu Alá Ser Gly Val Pro Alá Arg Phe Ser 20 25 (2) INFORMÁCIÓ AZ 56. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 321 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 1...321 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: F9HZLC 1-1 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 56. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GAA ATA

GTA Val

CTG ACA

CAG TCT

CCA GCC

ACC Thr 10

CTG Leu

TCT Ser

TTG Leu

TCT Ser

CCA GGG

48

Glu 1

Ile

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Alá

Pro 15

Gly

GAA

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Glu

Arg

Alá

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AGA

CCT

GGC

CAG

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

144

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

HU 225 874 Β1

GCC Alá

ACG Thr 50

AGT Ser

AAC Asn

CTG Leu

GCT Alá

AGC Ser 55

GGC Gly

GTC Val

CCA GCC

AGG Arg 60

TTC Phe

AGT Ser

GGA Gly

TCC Ser

192

Pro

Alá

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGT

CTA

GAG

CCT

GAA

240

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

GAT

TTT

GCG

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

288

Asp

Phe

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAG

ATC

AAA

CGA

321

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) INFORMÁCIÓ AZ 57. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 107 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 57. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Glu 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Alá

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Alá

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

Phe

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) INFORMÁCIÓ AZ 58. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 41 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

HU 225 874 Β1 (xi) SZEKVENCIALElRÁS: 58. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GATCCGGGTC TGGGACAGAT TACACTCTCA CGATATCCAG T 41 (2) INFORMÁCIÓ AZ 59. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 41 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 59. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CTAGACTGGA TATCGTGAGA GTGTAATCTG TCCCAGACCC G 41 (2) INFORMÁCIÓ A 60. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 13 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 60. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser 15 10 (2) INFORMÁCIÓ A 61. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 321 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) LOCATION: 1...321 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: F9HZLC 1-2 (xi) SZEKVENCIALElRÁS: 61. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GAA Glu 1

ATA GTA Ile Val

CTG Leu

ACA Thr 5

CAG Gin

TCT Ser

CCA GCC

ACC Thr 10

CTG Leu

TCT Ser

TTG Leu

TCT Ser

CCA Pro 15

GGG Gly

48

Pro

Alá

GAA

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Glu

Arg

Alá

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AGA

CCT

GGC

CAG

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

144

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

HU 225 874 Β1

GCC Alá

ACG AGT

AAC Asn

CTG Leu

GCT Alá

AGC Ser 55

GGC Gly

GTC Val

CCA GCC AGG Pro Alá Arg 60

TTC Phe

AGT Ser

GGA Gly

TCC Ser

192

Thr 50

Ser

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TAC

ACT

CTC

ACG

ATA

TCC

AGT

CTA

GAG

CCT

GAA

240

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

GAT

TTT

GCG

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

288

Asp

Phe

Alá

Val

Tyr 85

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp 90

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg 95

Thr

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAG

ATC

AAA

CGA

321

Phe

Gly

Gly

Gly 100

Thr

Lys

Val

Glu

Ile 105

Lys

Arg

(2) INFORMÁCIÓ A 62. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 107 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 62. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Glu 1

Ile Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Alá

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Alá

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

Phe

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) INFORMÁCIÓ A 63. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 165 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

HU 225 874 Β1 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 63. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AGTACTCACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG CGCCAGCGTG GGTGACAGAG TGACCATCAC 60

CTGCAGGGCC AGCTCAAGTGTAAATTACAT GCACTGGTAC CAGCAGAAGC CAGGTAAGGC 120

TCCAAAGCCT TGGATCTACG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGTGT 165 (2) INFORMÁCIÓ A 64. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 161 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 64. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGGCAGTA GTAGGTGGCG ATATCCTCTG GCTGGAGGCT 60

GCTGATGGTG AAGGTGTAGT CTGTACCGCT ACCGGATCCG CTGAATCTGC TTGGCACACC 120

AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CGTAGATCCA AGGCTTTGGA G 161 (2) INFORMÁCIÓ A 65. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 280 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 2...280 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 65. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

A GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA 49

Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val Gly Asp Arg

10 15

GTG Val

ACC Thr

ATC ACC

TGC Cys

AGG Arg

GCC Alá

AGC Ser

TCA Ser 25

AGT Ser

GTA AAT

TAC Tyr

ATG Met 30

CAC His

TGG Trp

97

Ile

Thr 20

Val

Asn

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGT

AAG

GCT

CCA

AAG

CCT

TGG

ATC

TAC

GCC

ACT

145

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Alá

Thr

35

40

45

AGT

AAC

CTG

GCT

TCT

GGT

GTG

CCA

AGC

AGA

TTC

AGC

GGA

TCC

GGT

AGC

193

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGT

ACA

GAC

TAC

ACC

TTC

ACC

ATC

AGC

AGC

CTC

CAG

CCA

GAG

GAT

ATC

241

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

65

70

75

80

GCC

ACC

TAC

TAC

TGC

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

280

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

85

90

HU 225 874 Β1 (2) INFORMÁCIÓ A 66. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 93 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 66. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Val 1

Leu

Thr

Gin

Ser 5

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser 10

Alá

Ser

Val

Gly

Asp 15

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

20

25

30

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Alá

Thr

35

40

45

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

65

70

75

80

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

85

90

(2) INFORMÁCIÓ A 67. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 27 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 67. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TTTAGTACTC ACCCAGAGCC CAAGCAG 27 (2) INFORMÁCIÓ A 68. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 27 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 68. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TTCCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGG 27

HU 225 874 Β1 (2) INFORMÁCIÓ A 69. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(I) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 33 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (ív) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 69. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CTCGAGCAGT ACTATCTGGG AGTGGACACC TGT 33 (2) INFORMÁCIÓ A 70. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 17 aminosav (B) TlPUS aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: peptid (iii) HIPOTETIKUS: NEM (ív) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: N-terminális (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 70. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Alá 15 10 15

Alá (2) INFORMÁCIÓ A 71. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 48 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 71. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGACGTTCGG CCAAGGGACC AAGGTGGAAA TCAAACGGAC TGTGGCGG 48 (2) INFORMÁCIÓ A 72. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 52 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 72. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CGCCGCCACA GTCCGTTTGA TTTCCACCTT GGTCCCTTGG CCGAACGTCC GC 52

HU 225 874 Β1 (2) INFORMÁCIÓ A 73. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 321 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 1...321 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: F9HZLC 2-0 (xi) SZEKVENCIALElRÁS: 73. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAG Gin 1

ATA GTA CTC

ACC Thr 5

CAG AGC

CCA Pro

AGC Ser

AGC Ser 10

CTG Leu

AGC Ser

GCC Alá

AGC Ser

GTG Val 15

GGT Gly

48

Ile

Val

Leu

Gin

Ser

GAC

AGA

GTG

ACC

ATC

ACC

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGT

AAG

GCT

CCA

AAG

CCT

TGG

ATC

TAC

144

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACT

AGT

AAC

CTG

GCT

TCT

GGT

GTG

CCA

AGC

AGA

TTC

AGC

GGA

TCC

192

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGT

AGC

GGT

ACA

GAC

TAC

ACC

TTC

ACC

ATC

AGC

AGC

CTC

CAG

CCA

GAG

240

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

65

70

75

80

GAT

ATC

GCC

ACC

TAC

TAC

TGC

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

288

Asp

Ile

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

TTC

GGC

CAA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAA

ATC

AAA

CGG

321

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) INFORMÁCIÓ A 74. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 107 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 74. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val Gly 15 10 15

HU 225 874 Β1

Asp

Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Arg

Alá 25

Ser

Ser

Ser

Val

Asn 30

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

65

70

75

80

Asp

Ile

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

100

105

(2) INFORMÁCIÓ A 75. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 94 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: CDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 27...94 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 75. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG

GTA

GCA

ACA

GCT

ACA

GGT

GTC

CAC

TCC

CAG

ATA

GTA

CT

94

Leu

Val

Alá

Thr

Alá

Thr

Gly

Val

His

Ser

Gin

Ile

Val

Leu

10

15

20

(2) INFORMÁCIÓ A 76. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 23 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 76. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Alá Thr Alá Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Gin Ile Val Leu 20

HU 225 874 Β1 (2) INFORMÁCIÓ A 77. SZÁMÜ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 401 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 27...401 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: F9HZLC 1-3 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 77. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe 1 5

TTG Leu 10

GTA Val

GCA ACA GCT

ACA Thr 15

GGT Gly

GTC Val

CAC His

TCC Ser

CAG Gin 20

ATA GTA CTG ACA CAG

101

Alá

Thr

Alá

Ile

Val

Leu

Thr

Gin 25

TCT

CCA

GCC

ACC

CTG

TCT

TTG

TCT

CCA

GGG

GAA

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

149

Ser

Pro

Alá

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Alá

Thr

Leu

Ser

30

35

40

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

CAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AGA

197

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

45

50

55

CCT

GGC

CAG

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

GCC

ACG

AGT

AAC

CTG

GCT

245

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

60

65

70

AGC

GGC

GTC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TAC

293

Ser

Gly

Val

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

75

80

85

ACT

CTC

ACG

ATA

TCC

AGT

CTA

GAG

CCT

GAA

GAT

TTT

GCG

GTT

TAT

TAC

341

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Alá

Val

Tyr

Tyr

90

95

100

105

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

389

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

110

115

120

GTG GAG ATC AAA 401

Val Glu Ile Lys

125 (2) INFORMÁCIÓ A 78. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 125 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM

HU 225 874 Β1 (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 78. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Met 1

Gly

Trp

Ser

Cys 5

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu 10

Val

Alá

Thr

Alá

Thr 15

Gly

Val

His

Ser

Gin

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Alá

Thr

Leu

Ser

Leu

20

25

30

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Alá

Thr

Leu

Ser

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

35

40

45

Asn

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Alá

Pro

Lys

Pro

50

55

60

Trp

Ile

Tyr

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Alá

Arg

Phe

65

70

75

80

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

85

90

95

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Alá

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

100

105

110

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

115

120

125

(2) INFORMÁCIÓ A 79. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 81 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 79. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG GAATGAACTG GGTGCGACAG GCCCCTGGAC 60

AAGGGCTCGA GTGGATGGGA T 81 (2) INFORMÁCIÓ A 80. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 99 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 80. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TGTCTAGAGA GAAGACAAAC CGTCCCTTGA AGTCATCAAC ATATGTTGAC TTTCCATTTC 60

TGGTGTTTAT CCATCCCATC CACTCGAGCC CTTGTCCAG 99 (2) INFORMÁCIÓ A 81. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 87 bázispár

HU 225 874 Β1 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTiPUS:

(Vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 81. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGTTTGTCTT CTCTCTAGAC ACCTCTGTCA GCACGGCATA TCTACAGATC AGCAGCCTAA AGGCTGAGGA CACTGCAGTG TATTTCT (2) INFORMÁCIÓ A 82. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 86 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTiPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 82. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA GAAATACACT GCAGTGTCCT CAGCCT (2) INFORMÁCIÓ A 83. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 278 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTiPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 3...278 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 83. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA Alá Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg

10 15

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

GAG

TGG

ATG

GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

Gin

Alá

Pro

Gly

Gin 20

Gly

Leu

Glu

Trp

Met 25

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr 30

Arg

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

AAG

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

Asn

Gly

Lys

Ser 35

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp 40

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe 45

Val

Phe

TCT

CTA

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

CTA

CAG

ATC

AGC

AGC

CTA

Ser

Leu

Asp 50

Thr

Ser

Val

Ser

Thr 55

Alá

Tyr

Leu

Gin

Ile 60

Ser

Ser

Leu

143

191

HU 225 874 Β1

AAG Lys

GCT Alá 65

GAG Glu

GAC ACT

GCA GTG Alá Val 70

TAT Tyr

TTC Phe

TGT Cys

ACG Thr

AGA Arg 75

GAA GGG AAT

ATG Met

239

Asp

Thr

Glu

Gly

Asn

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

CAG

GGT

ACC

278

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

80

85

90

(2) INFORMÁCIÓ A 84. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 92 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszáiú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 84. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Alá 1

Ser

Gly Tyr

Thr 5

Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gin

10

15

Alá

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

20

25

30

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

35

40

45

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

Thr

Alá

Tyr

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

50

55

60

Alá

Glu

Asp

Thr

Alá

Val

Tyr

Phe

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

65

70

75

80

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

85

90

(2) INFORMÁCIÓ A 85. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 30 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszáiú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 85. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG 30 (2) INFORMÁCIÓ A 86. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 26 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszáiú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM

HU 225 874 Β1 (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 86. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAG (2) INFORMÁCIÓ A 87. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 37 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 87. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CCAGACTCGA CTAGTTGGAT CTGGGAGTGG ACACCTG (2) INFORMÁCIÓ A 88. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 446 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 27...446 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: F9HZHC 3-0 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 88. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

TTG GTA GCA ACA GCT

ACA GGT

GTC Val

CAC His

TCC Ser

CAG Gin 20

ATC Ile

CAA Gin

CTA Leu

GTG Val

CAA Gin 25

Leu Val 10

Alá

Thr

Alá

Thr 15

Gly

TCT

GGG

TCT

GAG

TTG

AAG

AAG

CCT

GGG

GCC

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly

Alá

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

30

35

40

AAG

GCC

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

ACT

AAC

TAT

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

CGA

Lys

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

45

50

55

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTC

GAG

TGG

ATG

GGA

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

Gin

Alá

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

60

65

70

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

AAG

GGA

CGG

TTT

GTC

TTC

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

75

80

85

101

149

197

245

293

HU 225 874 Β1

TCT Ser 90

CTA Leu

GAC ACC

TCT Ser

GTC AGC

ACG GCA Thr Alá

TAT Tyr

CTA CAG

ATC Ile

AGC AGC

CTA Leu 105

341

Asp

Thr

Val 95

Ser

Leu 100

Gin

Ser

Ser

AAG

GCT

GAG

GAC

ACT

GCA

GTG

TAT

TTC

TGT

ACG

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

389

Lys

Alá

Glu

Asp

Thr

Alá

Val

Tyr

Phe

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

110

115

120

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

CAG

GGT

ACC

CTG

GTC

ACC

437

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

125 130 135

GTC TCC TCT 446

Val Ser Ser

140 (2) INFORMÁCIÓ A 89. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 140 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 89. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Met 1

Gly

Trp

Ser

Cys 5

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu 10

Val

Alá

Thr

Alá

Thr 15

Gly

Val

His

Ser

Gin

Ile

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ser

Glu

Leu

Lys

Lys

20

25

30

Pro

Gly

Alá

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

35

40

45

Thr

Asn

Tyr

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Alá

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Met

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

65

70

75

80

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Val

Phe

Ser

Leu

Asp

Thr

Ser

Val

Ser

85

90

95

Thr

Alá

Tyr

Leu

Gin

Ile

Ser

Ser

Leu

Lys

Alá

Glu

Asp

Thr

Alá

Val

100

105

110

Tyr

Phe

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

115

120

125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

135

140

(2) INFORMÁCIÓ A 90. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 90 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú

HU 225 874 Β1 (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: CDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 90. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AGTACTGACA CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTT GGGGACAGAG TCACCATCAC TTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT (2) INFORMÁCIÓ A 91. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 108 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: CDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 91. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CTTGATGGGA CGCCGCTAGC CAGGTTACTC GTGGCATAGA TCCAGGGCTT GGGAGCTTTG CCAGGTTTCT GTTGGTACCA GTGCATGTAA TTTACACTTG AGCTGGCC (2) INFORMÁCIÓ A 92. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 108 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 92. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TAACCTGGCT AGCGGCGTCC CATCAAGGTT CAGTGGATCC GGGTCTGGGA CAGATTACAC TCTCACGATA TCCAGTCTAC AACCTGAAGA TTTTGCGACT TATTACTG (2) INFORMÁCIÓ A 93. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 102 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATiPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 93. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGCGCCGCCA CAGTTCGTTT GATCTCCAGC TTGGTCCCTC CGCCGAACGT CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAGTCGCA AAATCTTCAG GT (2) INFORMÁCIÓ A 94. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 330 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú

108

108

102

HU 225 874 Β1 (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (ív) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 2...328 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALEiRÁS: 94. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

A GTA CTG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA 49

Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Alá Ser Val Gly Asp Arg

10 15

GTC ACC

ATC Ile

ACT Thr 20

TGC AGG

GCC Alá

AGC Ser

TCA Ser 25

AGT Ser

GTA Val

AAT Asn

TAC ATG Tyr Met 30

CAC His

TGG Trp

97

Val

Thr

Cys

Arg

TAC

CAA

CAG

AAA

CCT

GGC

AAA

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

GCC

ACG

145

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Alá

Thr

35

40

45

AGT

AAC

CTG

GCT

AGC

GGC

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

GGG

TCT

193

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

ACA

GAT

TAC

ACT

CTC

ACG

ATA

TCC

AGT

CTA

CAA

CCT

GAA

GAT

TTT

241

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

65

70

75

80

GCG

ACT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

TTC

GGC

289

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

85

90

95

GGA

GGG

ACC

AAG

CTG

GAG

ATC

AAA

CGA

ACT

GTG

GCG

GCG

CC

330

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Alá

Alá

100 105 (2) INFORMÁCIÓ A 95. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 109 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 95. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Val 1

Leu

Thr

Gin

Ser 5

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser Alá 10

Ser

Val

Gly

Asp 15

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

20

25

30

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Alá

Thr

35

40

45

HU 225 874 Β1

Ser

Asn 50

Leu Alá

Ser Gly

Val 55

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser 60

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

65

70

75

80

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

85

90

95

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Alá

Alá

100

105

(2) INFORMÁCIÓ A 96. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 26 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 96. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAAGTACTGA CACAGTCTCC ATCCTC 26 (2) INFORMÁCIÓ A 97. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 26 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 97. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

AGGGCGCCGC CACAGTTCGT TTGATC 26 (2) INFORMÁCIÓ A 98. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 412 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 27...412 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ: F9HZLC 3-0 (xi) SZEKVENCIALElRÁS: 98. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC 53

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe

5

HU 225 874 Β1

101

TTG GTA

GCA Alá

ACA GCT ACA

GGT GTC

CAC TCC CAG ATA GTA

CTG ACA CAG

Leu 10

Val

Thr

Alá

Thr 15

Gly

Val

His

Ser

Gin 20

Ile

Val

Leu

Thr

Gin 25

TCT

CCA

TCC

TCC

CTG

TCT

GCA

TCT

GTT

GGG

GAC

AGA

GTC

ACC

ATC

ACT

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Alá

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

30

35

40

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

CAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

45

50

55

CCT

GGC

AAA

GCT

CCC

AAG

CCC

TGG

ATC

TAT

GCC

ACG

AGT

AAC

CTG

GCT

Pra

Gly

Lys

Alá

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

60

65

70

AGC

GGC

GTC

CCA

TCA

AGG

TTC

AGT

GGA

TCC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TAC

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

75

80

85

ACT

CTC

ACG

ATA

TCC

AGT

CTA

CAA

CCT

GAA

GAT

TTT

GCG

ACT

TAT

TAC

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Alá

Thr

Tyr

Tyr

90

95

100

105

TGT

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCG

CGG

ACG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

110

115

120

CTG

GAG

ATC

AAA

CGA

ACT

GTG

GC

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Val

125

(2) INFORMÁCIÓ A 99. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(0

SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 129 aminosav

(B) TÍPUS: aminosav

(C) SZÁLTÍPUS: egyszálú

(D) TOPOLÓGIA: lineáris

(ii) MOLEKULATlPUS: fehérje

(iii) HIPOTETIKUS: NEM

(iv) ANTISZENSZ: NEM

(v) FRAGMENSTÍPUS: belső

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS:

99. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu

Val

Alá

Thr

Alá

Thr

Gly

1

5

10

15

Val

His

Ser

Gin

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Alá

20

25

30

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

35

40

45

Asn

Tyr

Met

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Alá

Pro

Lys

Pro

50

55

60

Trp

Ile

Tyr

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

65

70

75

80

149

197

245

293

341

389

412

HU 225 874 Β1

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser 85

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr 90

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser 95

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

100

105

110

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

115

120

125

Val (2) INFORMÁCIÓ A 100. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 26 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 100. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAAATAGTAC TCTCCCAGTC TCCAGC 26 (2) INFORMÁCIÓ A 101. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 41 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 101. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

GGATAAGCTT GGCGCCGCAA CAGTCGGTTT GATTTCCAGC T 41 (2) INFORMÁCIÓ A 102. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 335 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 1...335 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 102. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG 48

Gin Ile Val Leu Ser Gin Ser Pro Alá Ile Leu Ser Alá Ser Pro Gly

10 15

HU 225 874 Β1

GAG Glu

AAG Lys

GTC Val

ACA Thr 20

ATG Met

ACT Thr

TGC Cys

AGG GCC Arg Alá 25

AGC Ser

TCA Ser

AGT Ser

GTA Val

AAT Asn 30

TAC Tyr

ATG Met

CAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGA

TCC

TCC

CCC

AAA

CCC

TGG

ATT

TAT

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

GTC

CCT

GCT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

ACA

ATC

AGC

AGA

GTG

GAG

GCT

GAA

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Alá

Glu

65

70

75

80

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCA

CGG

ACG

Asp

Alá

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG

ACT

GTT

GCG

GCG

CC

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Alá

Alá

Pro

100

105

110

(2) INFORMÁCIÓ A 103. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 112 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (ív) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 103. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

144

192

240

288

335

Gin Ile Val Leu Ser Gin Ser Pro Alá Ile Leu Ser Alá Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Alá Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45

Alá Thr Ser Asn Leu Alá Ser Gly Val Pro Alá Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Alá Glu

70 75 80

Asp Alá Alá Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr

90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Alá Alá Pro

100 105 110 (2) INFORMÁCIÓ A 104. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 318 bázispár

HU 225 874 Β1 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: Calling SZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 1...318 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 104. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAG ATA GTA CTC

TCC Ser 5

CAG Gin

TCT Ser

CCA GCA ATC

CTG Leu

TCT Ser

GCA Alá

TCT Ser

CCA Pro 15

GGG Gly

48

Gin 1

Ile

Val

Leu

Pro

Alá

Ile 10

GAG

AAG

GTC

ACA

ATG

ACT

TGC

AGG

GCC

AGC

TCA

AGT

GTA

AAT

TAC

ATG

96

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

20

25

30

CAC

TGG

TAC

CAG

CAG

AAG

CCA

GGA

TCC

TCC

CCC

AAA

CCC

TGG

ATT

TAT

144

His

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro

Trp

Ile

Tyr

35

40

45

GCC

ACA

TCC

AAC

CTG

GCT

TCT

GGA

GTC

CCT

GCT

CGC

TTC

AGT

GGC

AGT

192

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT

TAC

TCT

CTC

ACA

ATC

AGC

AGA

GTG

GAG

GCT

GAA

240

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Alá

Glu

65

70

75

80

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGC

CAG

CAG

TGG

AGT

ATT

AAC

CCA

CGG

ACG

288

Asp

Alá

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

GAA

ATC

AAA

318

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100 105 (2) INFORMÁCIÓ A 105. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 106 aminosav (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 105. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Gin 1

Ile

Val

Leu

Ser 5

Gin

Ser

Pro

Alá

Ile 10

Leu

Ser

Alá

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Met

Thr

Cys

Arg

Alá

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Tyr

Met

25 30

HU 225 874 Β1

His

Trp

Tyr 35

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 40

Ser

Ser

Pro

Lys

Pro 45

Trp

Ile

Tyr

Alá

Thr

Ser

Asn

Leu

Alá

Ser

Gly

Val

Pro

Alá

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Val

Glu

Alá

Glu

65

70

75

80

Asp

Alá

Alá

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Trp

Ser

Ile

Asn

Pro

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

(2) INFORMÁCIÓ A 106. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 30 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 106. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAGATCCAAC TAGTGCAGTC TGGACCTGAG 30 (2) INFORMÁCIÓ A 107. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 32 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 107. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

TTAAGCTTGC TAGCTGCAGA GACAGTGACC AG 32 (2) INFORMÁCIÓ A 108. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 369 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 1...369

HU 225 874 Β1 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 108. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAG Gin 1

ATC Ile

CAA CTA GTG

CAG Gin

TCT Ser

GGA Gly

CCT Pro

GAG Glu 10

CTG Leu

AAG Lys

AAG Lys

CCT Pro

GGA Gly 15

GAG Glu

Gin

Leu

Val 5

ACA

GTC

AAG

ATC

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGG

TAC

ACC

TTC

ACA

AAC

TAT

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

AAG

CAG

GCT

CCA

GGA

AAG

GGT

TTA

AAG

TGG

ATG

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Alá

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

GGC

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

AAG

GGA

CGG

TTT

GCC

TTC

TCT

TTG

GAA

AGC

TCT

GCC

AGC

ACT

GCC

AAT

Lys

Gly

Arg

Phe

Alá

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Alá

Ser

Thr

Alá

Asn

65

70

75

80

TTG

CAG

ATC

GAC

AAC

CTC

AAA

GAT

GAG

GAC

ACG

GCT

ACA

TAT

TTC

TGT

Leu

Gin

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Thr

Alá

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

ACA

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

CAA

GGG

ACT

CTG

GTC

ACT

GTC

TCT

GCA

GCT

AGC

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Alá

Alá

Ser

115

120

144

192

240

288

336

369 (2) INFORMÁCIÓ A 109. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 123 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 109. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Gin 1

Ile

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu 10

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Thr

Val

Lys

Ile 20

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Asn

Tyr

Gly

Met

Asn 35

Trp

Val

Lys

Gin

Alá 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Lys

Trp

Met

Gly

Trp 50

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn 55

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr 60

Val

Asp

Asp

Phe

Lys

Gly

Arg

Phe

Alá

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Alá

Ser

Thr

Alá

Asn

70 75 80

HU 225 874 Β1

Leu

Gin

Ile

Asp Asn 85

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp 90

Thr

Alá

Thr

Tyr

Phe 95

Cys

Thr

Arg

Glu

Gly Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu Val

Thr

Val

Ser

Alá

Alá

Ser

115 120 (2) INFORMÁCIÓ A 110. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA:

(i) SZEKVENCIAJELLEMZÖK:

(A) HOSSZ: 363 bázispár (B) TlPUS: nukleinsav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTÍPUS:

(vi) EREDETI FORRÁS:

(ix) TULAJDONSÁG:

(A) NÉV/KULCS: KÓDOLÓSZEKVENCIA (B) TALÁLHATÓ: 1...363 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓ:

(xi) SZEKVENCIALElRÁS: 110. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

CAG ATC

CAA CTA

GTG Val 5

CAG Gin

TCT Ser

GGA Gly

CCT Pro

GAG CTG

AAG Lys

AAG Lys

CCT Pro

GGA Gly 15

GAG Glu

48

Gin 1

Ile

Gin

Leu

Glu 10

Leu

ACA

GTC

AAG

ATC

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGG

TAC

ACC

TTC

ACA

AAC

TAT

96

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

GGA

ATG

AAC

TGG

GTG

AAG

CAG

GCT

CCA

GGA

AAG

GGT

TTA

AAG

TGG

ATG

144

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Alá

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

GGC

TGG

ATA

AAC

ACC

AGA

AAT

GGA

AAG

TCA

ACA

TAT

GTT

GAT

GAC

TTC

192

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

AAG

GGA

CGG

TTT

GCC

TTC

TCT

TTG

GAA

AGC

TCT

GCC

AGC

ACT

GCC

AAT

240

Lys

Gly

Arg

Phe

Alá

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Alá

Ser

Thr

Alá

Asn

65

70

75

80

TTG

CAG

ATC

GAC

AAC

CTC

AAA

GAT

GAG

GAC

ACG

GCT

ACA

TAT

TTC

TGT

288

Leu

Gin

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Thr

Alá

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

ACA

AGA

GAA

GGG

AAT

ATG

GAT

GGT

TAC

TTC

CCT

TTT

ACT

TAC

TGG

GGC

336

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

CAA

GGG

ACT

CTG

GTC

ACT

GTC

TCT

GCA

363

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Alá

115

120

(2) INFORMÁCIÓ A 111. SZÁMÚ SZEKVENCIÁRA: (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZ: 121 aminosav

HU 225 874 Β1 (B) TlPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) MOLEKULATlPUS: fehérje (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (v) FRAGMENSTlPUS: belső (vi) EREDETI FORRÁS:

(xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 111. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Gin 1

Ile

Gin Leu Val 5

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu 10

Leu

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Glu

Thr

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Alá

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

Gly

Met

Asn

Trp

Val

Lys

Gin

Alá

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Lys

Trp

Met

35

40

45

Gly

Trp

Ile

Asn

Thr

Arg

Asn

Gly

Lys

Ser

Thr

Tyr

Val

Asp

Asp

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Alá

Phe

Ser

Leu

Glu

Ser

Ser

Alá

Ser

Thr

Alá

Asn

65

70

75

80

Leu

Gin

Ile

Asp

Asn

Leu

Lys

Asp

Glu

Asp

Thr

Alá

Thr

Tyr

Phe

Cys

85

90

95

Thr

Arg

Glu

Gly

Asn

Met

Asp

Gly

Tyr

Phe

Pro

Phe

Thr

Tyr

Trp

Gly

100

105

110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Alá

115 120

Claims (3)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy ellenanyag vagy fragmense és egy tromboiitikus ágens alkalmazása, poszttromboembóliás ischaemia kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállításához, ahol az ellenanyag a következők közül van választva: i) SB 249413 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája a 31. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 44. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg; ii) SB 249415 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája az 57. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg; iii) SB 249416 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú 55 szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 62. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg; iv) SB 249417 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú 40 szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 74. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg; v) SB 257731 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája az 52. számú 45 szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 78. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg; vi) SB 257732 ellenanyag, ahol a nehéz lánc aminosavszekvenciája a 89. számú 50 szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg, és a könnyű lánc aminosavszekvenciája a 99. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciának felel meg; és a tromboiitikus ágens tPA, urokináz, sztreptokináz közül van választva.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az ellenanyag az SB 249417.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a tromboiitikus ágens a tPA.