JP4638035B2 - ヒト抗−IX/IXa因子抗体 - Google Patents
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Description
(発明の背景)
(発明の分野)
本発明は、因子IX(FIX)/因子IXa(FIXa)、特にFIX/FIXaのGlaドメインと反応性の抗体の単離、同定、合成、発現及び精製に関する。特別な態様では、本発明はヒトFIX/FIXaGlaドメインと反応性のヒト抗体を提供する。さらに本発明は、FIX/FIXaの活性化を阻害する及びFIX/FIXa依存性凝血を阻害する組成物、特に医薬品組成物、製造品、及び方法にも関する。
【0002】
(関連する開示の説明)
因子IXaはビタミンK依存性血漿セリンプロテアーゼであり、血液凝固の内因性及び外因性経路の両方に参画している。因子IXaのNH2末端43アミノ酸(Glaドメイン)及びそのチモーゲン因子IXはGlu残基のビタミンK依存性カルボキシル化によって形成される12Gla残基を含む。Glaドメインには2つの上皮増殖因子(EGF)型ドメインが続き、次いでカルボキシ末端セリンプロテアーゼドメインが続く。
FIX/FIXaのGlaドメインは、血管内皮細胞及び血小板上の高親和性結合部位との相互作用のための重要な構造決定因子を含む(Heimark等, (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 111: 723-7331; Ahmad等, (1994) Biochem. 33: 12048-12055; Ryan等, (1989) J. Biol. Chem. 264: 20283-20287; Toomey等, (1992) Biochemistry 31: 1806-1808; Cheung等, (1992) J. Bio. Chem. 267: 20529-20531; Rawala-Sheikh等, (1992) Blood 79: 398-405; Cheung等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11068-11073; Prokok等, (1996) Int. J. Pept. Res. 48: 281-285; Ahmad等, (1998) Biochemistry 37: 1671-1679)。Ca++及びMg++の存在下で、FIX/FIXaGlaドメインは異なるコンホメーションをとる。凝血反応、例えばFXのFIX/FIXa媒介活性化などは、活性化された血小板表面上で高効率で進行する(Ahmad及びWalsh (1994) Trends Cardiovasc. Med., 4: 271-277)。
【0003】
FIX/FIXaGlaドメインに結合する抗体は、細胞結合(Cheung等, (1996) 上掲)、凝固活性(Sugo等, (1990) Thromb. Res. 58: 603-614)及びFXIによるFIX/FIXaの活性化(Sugo等, (1990) 上掲; Leibman等, (1987) J. Bio. Chem. 262: 7605-7612)等のFIX/FIXa機能を阻害することが示された。FIX/FIXaに対するウサギ及びマウス抗体は、GlaドメインのC-及びN-末端領域に結合することが示された(Leibman等, (1993) Eur. J. Biochem. 212: 339-345及びSugo等, (1990) Thromb. Res. 58: 603-614)。ヒトFIX/IXaと反応性の抗体は、FIXからFIXaへの活性化を阻害し、FIXa依存性アッセイにおける凝血を阻害することが示された(Blackburn等, (1997) Blood 90: Suppl. 1: 424a-425a)。活性部位阻害されたFIXaはインビボで血栓症を緩和する(Wong等, (1997) Thromb. Haemost. 77: 1143-1147; Benedict等, (1991) J. Clin. Invest. 88: 1760-1765; Springer等, (1998) Am. J. Thoracic Cardiovasc. Surgery 115: 1179-1188)。
【0004】
(発明の概要)
本発明は、因子IX又は因子IXaのGlaドメインと反応性の、単離された抗体、抗体断片、特にヒト抗体及び抗体断片に関する。好ましい態様では、抗体又は抗体断片は、血液凝固因子IX又はIXaに関連する活性を阻害する。有利には、本発明の抗体は、抗体を含む強力な医薬品組成物の調製を提供する。これらの医薬品組成物は、通常の止血剤を含まない急性又は慢性の血栓性疾患の治療のための低用量の医薬品製剤を提供する。
【0005】
一実施態様では、本発明は、ヒトFIX/FIXa、特にヒトFIX/FIXaのGlaドメインと反応する抗体又は抗体断片を提供する。代表的な抗体断片は、Fv、scFv、Fab、F(ab')2断片、並びにダイアボディ(diabody)及び線形抗体を含む。これらの断片は、例えば「ロイシンジッパー」又はその他の配列といった他の配列に融合していてもよく、半減期を向上又は変調させるのに用いられるペギレート(pegylated)配列又はFc変異体を含んでもよい。代表的な抗体又は抗体断片は、ここでCDR1、CDR2及びCDR3と呼ばれる3つの相補性決定領域(CDRs)を含む。CDRポリペプチドのアミノ酸配列は、例示的な抗体断片10C12、11C5、11G9、13D1、13H6及び14H9及びこれらの変異体のものから選択される。好ましい抗体は、Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5及びAb6からなる群から選択され、ここでAb1−Ab6のDCRは、各々10C12、11C5、11G9、13D1、13H6及び14H9のものに対応す。
【0006】
一実施態様では、本発明の組成物は抗体ポリペプチドであり、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸、好ましくはDNAを含む物質の組成物を含む。この態様によると、本発明は、当該DNA分子に作用可能に結合した発現制御配列、当該DNAを含む発現ベクター、好ましくはプラスミドであって、前記制御配列はそのベクターを含む 宿主細胞に認識されるもの、並びにそのベクターを含む宿主細胞をさらに含む。
【0007】
さらに本発明は、ここに記載する抗体組成物の治療的応用にまで拡張される。よって本発明は、製薬的に許容される賦形剤及び本発明の抗体又は抗体断片を含む医薬品組成物も包含する。本発明は、本発明の抗体組成物を含むキット及び製造品を含む。キット及び製造品は、好ましくは:
(a)容器;
(b)前記容器上のラベル;及び
(c)前記容器内に収容された本発明の抗体又は抗体断片を含む組成物を含んでなり、当該組成物が、凝血疾患の治療に有効であり、前記容器上の任意のラベルが当該組成物が凝固障害疾患の治療に使用できることを表示する。キットは、場合によっては、製薬的に許容されるバッファーを収容した第二の容器及び凝血関連疾患の治療のために組成物を使用するための指示といった付属的成分を含む。
【0008】
抗体又は抗体断片を含む医薬品組成物は、血栓性又は凝固障害疾患又は障害の治療及び予防に使用することができ、例えば、FIX/FIXa媒介事象の阻害が示される哺乳動物の治療方法を含む。この方法は、本発明の医薬品組成物の治療的有効量を哺乳動物に投与することを含む。このような適応症は、深部静脈血栓症、動脈血栓症、不安定アンギナ、心筋梗塞後、術後血栓症、冠動脈バイパス移植(CABG)、経皮経管冠動脈形成術(PTCA)、脳卒中、腫瘍増殖、浸潤又は転移、炎症、敗血性ショック、高血圧、ARDS、心房性細動、及びDICを含む。また本発明の組成物は、血栓溶解療法におけるアジュバントとしても使用できる。
【0009】
(好適な実施態様の詳細な説明)
定義
特許請求の範囲及び明細書で使用する用語は、特に断らない限り以下に記載するように定義される。
説明を通して使用される略語は次のものを含む:IX因子についてのFIX;IXa因子についてのFIXa;XIa因子についてのFXIa;Xa因子についてのFXa;組織因子についてのTF;チモーゲンVII因子についてのFVII;VIIa因子についてのFVIIa;プロトロンビン時間についてのPT;活性化部分トロンボプラスチン時間についてのAPTT。
ここで用いられる場合のアミノ酸又はアミノ酸残基という用語は、変異体について以下でさらに説明するように、天然発生Lアミノ酸又はDアミノ酸を意味する。共通して使用される一及び三文字略語が、アミノ酸についてここで用いられる(Bruce Alberts等, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (3d ed. 1994))。
【0010】
FIX/FIXa媒介または関連過程または事象、あるいはこれと同等に、血漿FIX/FIXaに関連する活性は、本発明によればFIX/IXaの存在を必要とする任意の事象である。凝血塊形成の一般的機構は、Medical Physiology, 13th ed., Lange, Los Altos CA, pp411-414 (1987)の総説においてGanongにより、Bach (1988) CRC Crit. Rev. Biochem. 23(4): 359-368及びDavie等, (1991) Biochemistry 30: 10363;及びLimentoni等, (1994) Hemostasis and Thrombosis Basic Principles and Clinical practice, Third Edition, Coleman等編, Lippincott Company, PhiladelphiaのFIXの速度に概説されている。血液凝固には、血小板凝集を誘発するトロンビン生成及び血小板プラグを安定化するフィブリン形成という2つの経路の合流が必要とされる。この過程は、各々が別々のプロ酵素およびプロ補因子の存在を必要とする幾つかの段階を含む。この過程は、フィブリンの架橋および血栓形成で終了する。フィブリノーゲンはトロンビンの作用でフィブリンに変換される。一方トロンビンは、プロトロンビンのタンパク質分解的切断によって形成される。このタンパク質分解は活性化された血小板表面に結合するFXaによって、FVaとカルシウムの存在下で行われてプロトロンビンを切断する。TF−FVIIaは凝固の外部経路によるFXのタンパク質分解的活性化のために必要である。FIXは2つの異なる酵素、FXIa(Fujekawa等, (1974) Biochemistry, 13: 4508-4516; Di Scipio等, (1978) J. Clin. Invest., 61: 1526-1538;及びOsterud等, (1978) J. Biol. Chem. 253: 5946-5951)及び組織因子:因子VIIa(TF:FVIIa)複合体(Osterud及びPapaport (1977) Proc. Nattl. Acad. Sci. USA 74: 5260-5264)によって活性化される。形成されたFIXaはその補因子と複合して血小板や内皮細胞などの細胞表面上の内因性Xase複合体に組み込まれ、基質FXをFXaに変換する(Mann等, (1992) Semin. Hemotol. 29: 213-226)。FXa酵素活性によって生成したトロンビンは、フィブリノーゲンを切断してフィブリン形成を導くとともに血小板を活性化し、血小板凝集をもたらす。従って、FIX/IXaが媒介または関連する過程またはFIXaに関連する活性は、外部又は内部経路におけるFIXの誘発からフィブリン血小板凝塊形成まで及び最初にFIX/IXaの存在を含む凝固カスケードにおける任意の段階を含む。FIX/FIXa媒介または関連プロセス又はFIXa活性は、ここに記載するもののような標準的な検定法を使用して簡便に測定できる。
【0011】
FIX/FIXa関連疾患または障害は、深部脈管血栓症、動脈血栓症、脳卒中、腫瘍転移、血栓溶解、動脈硬化症及び血管形成術後の再狭窄のような脈管病、炎症、敗血症ショック、毒血症、低血圧、成人呼吸困難症候群(ARDS)、汎発性血管内血液凝固(DIC)及びその他の疾患のような急性および慢性の徴候を含むフィブリン形成に関連する慢性血栓塞栓性疾患または障害を意味する。
「FIX」なる用語は、天然発生哺乳動物因子IX又は以下に記載する組換えIXに対応するアミノ酸配列を持つポリペプチドを指すのに用いられる。天然発生FIXは、ヒト種並びに他の動物種、例えばウサギ、ラット、ブタ、非ヒト霊長類、馬、マウス、及びウシFIXを含む(例えば、Yoshitake等, (1985) Biochemistry 24: 3736 (ヒト)参照)。哺乳動物因子IX/IXaタンパク質のアミノ酸配列は、一般に知られているか、又は従来技術を通して入手可能である。ヒト、イヌ、マウス及びウサギFIXの43アミノ酸γ-カルボキシグルタミン酸(Gla)ドメインをFIG1に列挙した。
【0012】
本発明の文脈内で使用される「治療」とは、疾患又は障害のための治療的処理並びに予防的又は抑制的手段を意味する。よって、例えば、この用語の及び処理は、疾患又は障害の罹患の前又は後に薬剤を投与し、それにより疾患又は障害の全ての徴候を防止又は除去することを含む。他の例として、疾患の徴候に抗するために臨床的顕現の後に薬剤を投与することは疾患の「治療」を包含する。さらに、罹患後及び臨床的顕現が進行した後の薬剤の投与において、その投与が疾患及び障害の臨床的パラメータ及びおそらく疾患の寛解に影響するものは疾患の「治療」を包含する。
「治療を必要とする」ものは、既に疾患又は障害に罹った哺乳動物、例えばヒトを含み、疾患又は障害を予防すべきものを含む。
【0013】
抗体及び免疫グロブリンは、最も通常には、2つの同一な軽(L)鎖及び2つの同一な重(H)鎖を有する約150,000ダルトンの異種三量体糖タンパク質である。各軽鎖は重鎖に1つのジスルフィド共有結合で結合し、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また、各重鎖及び軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を持つ。各重鎖は一方の末端に可変ドメイン(VH)を持ち、それに多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は一方の末端に可変ドメイン(VL)そして他方の末端に定常ドメインを持ち、軽鎖の定常ドメインは重鎖の第1の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている(Clothia等, (1985), J. Mol. Biol. 186: 651; Novotny及びHaber (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 4592)。
【0014】
「可変」という用語は、可変ドメインの或る部分が抗体間の配列で大きく相違し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用されるという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインを通して均一に分布してはいない。それは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方において、相補的決定領域(CDR)又は高頻度可変領域と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク(FR)と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、各々4つのFR領域を含み、大きくはβ-シート配置をとり、3つのCDRに接続し、それらはループ接続を構成するが、β-シート構造の一部を構成する場合もある。各鎖のCDRは、FR領域の直近に他の鎖からのCDRとともに保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat等, (1991), Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD参照)。定常領域は抗体の抗原への結合に直接含まれないが、抗体依存性細胞毒性での抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有するFab断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りのFc断片が生成される。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋させ得るF(ab')2断片が得られる。
【0015】
Fvは、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。二本鎖Fv種において、この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Fv種(scFv)においては、一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインは、可撓性のペプチドリンカーによって共有結合し、軽鎖と重鎖は二本鎖Fv種に類似する「二量体」構造において結合しうる。各可変ドメインの3つのCDRが相互作用してVH-VL二量体表面に抗原結合部位を決定するのはこの配置である。集合的に、6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。scFvの概説については、Pluckthum, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。
【0016】
またFab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でFab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているFab'に対するここでの命名である。F(ab')2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の軽鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには5つの主なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらのいくつかはさらにサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4、IgA1及びIgA2に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、各々α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び3次元配置はよく知られている。
【0017】
「抗体」という用語は最も広義に使用され、特に単一のモノクローナル抗体(アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む)及びポリペプチド特異性を持つ抗体組成物を包含する。
「抗体断片」には、無傷の抗体の一部、一般的には無傷の抗体の抗原結合部位又は可変領域が含まれる。抗体断片の例には、Fab、Fab'、Fab-SH、F(ab')2及びFv断片;ダイアボディー(diabodies);隣接アミノ酸残基の一つの非中断配列からなる一次構造を持つポリペプチドである任意の抗体断片(ここで、「一本鎖抗体断片」又は「一本鎖ポリペプチド」と称する)であって、これらの限られないが(1)一本鎖Fv(scFv)分子(2)唯一の軽鎖可変ドメインを含む一本鎖ポリペプチド、又は軽鎖可変ドメインの3つのCDRを有するその断片及び(3)唯一の重鎖可変ドメインを含む一本鎖ポリペプチド、又は結合した軽鎖を持たず重鎖可変領域の3つのCDRを有するその断片を含むもの;及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【0018】
ここで使用される「モノクローナル抗体」(mAb)という用語は、実質的に均一な抗体の集団すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一な集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養から合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。
【0019】
「ダイアボディー」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味するもので、断片は軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を同じポリペプチド鎖(VH-VL)に含有する。同じ鎖上での二つのドメイン間の対形成ができないほど短いリンカーを使用することにより、ドメインが、他の鎖の相補的ドメインとの対形成を強いられ、二つの抗原結合部位が生成される。ダイアボディーは、例えば、欧州特許404097;国際公開93/11161号;及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)にさらに詳しく記載されている。
この出願を通して用いられる場合の「直鎖状抗体」なる表現は、Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を指す。簡単に言えば、これらの抗体は一対の抗原結合部位を形成する一対のタンデムFdセグメント(VH-CH1-VH-CH1)を含む。直鎖状抗体は二重特異性又は単一特異性とすることができる。
【0020】
「変異」抗体又は抗体断片は、「親」抗体又は抗体断片のアミノ酸配列から、親抗体又は抗体断片配列の一又は複数のアミノ酸残基の付加、欠失及び/又は置換によってアミノ酸配列が異なっている分子を意味する。例えば、変異体は親抗体又は抗体断片の一又は複数のCDRに一又は複数のアミノ酸置換を含んでいてもよい。例えば、変異体は親抗体又は抗体断片の一又は複数のCDRに少なくとも一つ、約1から約10、好ましくは約2から約5のアミノ酸置換を含んでいてもよい。通常は、変異体は親抗体重鎖又は軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも75%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、好ましくは95%のアミノ酸配列同一性を持つ。この配列に関する同一性及び相同性は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後の、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとしてここに定義される。抗体配列へのN-末端、C-末端、又は内部の伸展、欠失、又は挿入は、配列同一性及び相同性に影響しないと解釈される。変異体は、ヒトFIXGlaドメインに結合する能力を保持し、好ましくは親抗体より優れた特性を有する。例えば、変異体は親抗体、即ちそれが誘導された抗体に比較したときに、ヒトFIXGlaドメインに対してより高い結合親和性を有していてもよい。そのような特性の分析において、変異抗体又は抗体断片、例えば異体のFab形態などは、親抗体又は抗体断片の同じ断片、例えばFab形態と比較される。さらなる例として、変異体の全長抗体形態は、親抗体の全長形態と比較するべきであり、それは抗体又は抗体断片の様式がここに記載する生物学的アッセイにおける活性に影響することがわかったからである。ここで特に興味深い変異抗体又は抗体断片は、親抗体と比較した場合に、生物学的活性において2から10倍、好ましくは少なくとも約10倍、好ましくは少なくとも約20倍、より好ましくは少なくとも約50倍の向上を示すものである。変異体なる用語は、少なくとも親抗体又は抗体断片と共通する定性的な生物学的活性を有し、FIG2に記載した例示的CDRの少なくとも一つのCDRにおいて少なくとも一つのアミノ酸置換を持つ抗体及び抗体断片を含むことを意味する。参照される定性化生物学的活性は、限定されないが、(i)ヒトFIX/FIXaGlaドメインとの反応性、(ii)FIXaによるFIXの活性化阻害、(iii)組織因子:因子VIIa複合体によるFIXの活性化阻害、及び(iv)FX活性化阻害からなる群から選択される一つの活性である。FIX及びFX活性化阻害の測定のためのアッセイ系は当該分野で知られている。好ましい実施態様では、本発明の変異体は、ヒトFIX/IXaGlaドメイン結合について親抗体又は抗体断片と競合する。従って、如何なる理論に限定されるものではないが、定性化生物学的活性は、親抗体又は抗体断片と競合する能力と定義してもよく、好ましい実施態様では、それによりFIXに関連する活性、例えばその活性化又はFXの活性化が阻害される。以上から理解されるように、「競合する」及び「競合する能力」という用語は相対的な用語である。即ち、変異体の活性を記載するために用いられる場合、この用語は、標準的な結合アッセイにおいて親抗体又は断片に10倍モル過剰で添加したとき、親抗体又は断片の結合の少なくとも50%の阻害を生ずる変異体を意味する。好ましくは、変異体は5倍モル過剰、最も好ましくは少なくとも2倍モル過剰で結合の少なくとも50%阻害を生ずる。本発明の好ましい変異体は、親子約対又は抗体断片と1:1の化学量論的比率で存在する場合に少なくとも50%の結合阻害を生ずる。
ここで「親」抗体又は抗体断片とは、変異体の調製に使用されるアミノ酸配列によってコードされるものである。好ましくは、親抗体又は抗体断片は、ヒトフレームワーク領域を有し、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体又は抗体は、好ましくは単離されたヒト抗体又はその断片である。
【0021】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から、同定され分離され及び/又は回収されたものである。その自然環境における汚染成分は、抗体についての診断又は治療用途を妨害する物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(1)ラウリー(Lowry)法により測定して抗体の95重量%以上、最も好ましくは99重量%以上、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、N-末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに充分な程度に;あるいは(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元あるいは非還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性が得られるまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツ抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。
【0022】
「エピトープタグされた」なる用語は、ここで用いられるときは、「エピトープタグ」に融合した抗体を意味する。エピトープタグポリペプチドは、それに対する抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、抗体の活性を阻害しないよう充分に短い。また、エピトープタグは、好ましくは、それに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜50のアミノ酸残基(好ましくは約9〜30の残基)を有する。例としては、fluHAタグポリペプチド及びその抗体12CA5(Field等, (1988), Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165);c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体(Evan等 (1985), Mol. Cell. Biol. 5(12): 3610-3616);及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体(Poborsky等 (1990), Protein Engineering 3(6): 547-553 (1990))が含まれる。或る実施態様では、エピトープタグは「サルベージレセプター結合エピトープ」である。ここで用いられる場合、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、IgG分子のインビボ血清半減期を向上させ原因となるIgG分子のFc領域のエピトープ(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4)を意味する。
【0023】
(発明の実施の形態)
本発明は、FIG2の重鎖CDRアミノ酸配列の任意のもののCDRアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗体又は抗体断片を提供する。本発明は、任意の付加的アミノ酸配列を持つ又は持たない、任意の重鎖CDR配列を含む一本鎖抗体断片を包含する。例としては、本発明は、如何なる結合した軽鎖可変ドメインアミノ酸配列も持たないCDR1、CDR2及びCDR3を含む重鎖を含む一本鎖抗体断片、即ち、Fv断片の1/2を構成する一本鎖種を提供する。
【0024】
さらにここで提供されるのは、上記の任意の重鎖CDR配列を含み、さらにFIG2の軽鎖CDRアミノ酸配列のアミノ酸配列を含む軽鎖CDRアミノ酸配列を含む抗体又は抗体断片である。例としては、一実施態様では、本発明は、CDR1、CDR2及びCDR3を含む任意の重鎖及びλc-CDR1、λc-CDR2及びλc-CDR3を含む軽鎖(λc)が一本鎖ポリペプチド種に含まれている一本鎖抗体断片を提供する。例として、これに限られないが、一本鎖抗体断片は、特別な実施態様では、可撓性ペプチドリンカー配列によって軽鎖に結合した重鎖を含み、重鎖及び軽鎖可変ドメインが二本鎖Fv種で形成されるものに類似した「二量体」構造で結合できるscFv種である。他の実施態様では、一本鎖抗体断片は、二つの可変ドメイン間の対形成ができないほど短いリンカーによって軽鎖に結合した重鎖を含む種、即ち他のモノマーとの二量体化でダイアボディを形成する一本鎖ポリペプチドモノマーである。
【0025】
さらに他の実施態様では、本発明は、複数のポリペプチド鎖を含み、一つのポリペプチド鎖がFIG2の任意の重鎖CDRを含み第2のポリペプチド鎖がFIG2の任意の軽鎖CDRを含み、そして2つのポリペプチド鎖が一又は複数の鎖間ジスルフィド結合によって共有結合している抗体断片を提供する。好ましい実施態様では、前記の二本鎖抗体断片は、Fab、Fab'、Fab'-SH、Fv、及びF(ab')2からなる群から選択される。
【0026】
また本発明は、FIG2の任意のCDRを含む重鎖可変ドメインを含み、場合によってはFIG2の任意の軽鎖CDRを含む軽鎖可変ドメインをさらに含み、重鎖可変ドメイン、及び場合によっては軽鎖可変ドメインが免疫グロブリン定常ドメイン等の付加的部分に融合した抗体又は抗体断片を提供する。定常ドメイン配列は、重鎖及び/又は軽鎖配列に付加し、全長又は部分長の重鎖及び/又は軽鎖を持つ種を形成することができる。IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEを含む任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使用できること、及びそのような定常領域が任意のヒト又は動物種から得られることが理解されるであろう。好ましくは、定常ドメイン配列はヒト由来である。好ましいヒト定常ドメイン配列は、Kabat等(上掲)から得ることができる。
【0027】
好ましい実施態様では、抗体又は抗体断片は、可変ドメインにFIG2の任意の重鎖CDRアミノ酸配列を含み、それはロイシンジッパー配列を含む重鎖定常ドメインに融合している。ロイシンジッパーは、対象とする抗体又は抗体断片の親和性及び/又は産生効率を向上させ得る。好ましいロイシンジッパー配列は、Kostelney等 (1992), J. Immunol., 148: 1547-1553に教示されているjun及びfosロイシンジッパー、及び下記の実施例に記載されるGCN4ロイシンジッパーである。好ましい実施態様では、抗体又は抗体断片は、そのC-末端においてGCN4ロイシンジッパーに融合した可変ドメインを含む。
【0028】
さらに本発明は、変異抗体又は抗体断片を含む抗体及び抗体断片を包含する。変異抗体又は抗体断片は、FIG2に記載したCDRの少なくとも1つが他のアミノ酸に置換された前記の抗体又は抗体断片の任意のものを含む。当業者は、FIG2に記載されたCDRの或るアミノ酸が置換、修飾及び或る場合には欠失され、向上した又は変更された生物学的活性を持つ抗体又は抗体断片を提供できることを認めるであろう。FIG2のCDRを含み、親抗体又は抗体断片よりもFIXGlaドメインに対して高い親和性を示し及び/又は組換え生産過程において高い効率を生ずる特性を持つ相補性決定領域の変異体又は可変ドメインの変異体が、本発明の文脈内で好ましい。
【0029】
製造方法
本発明の抗体又は抗体断片をコードする核酸は、バクテリオファージ上に表示される一本鎖抗体のライブラリから調製できる。そのようなライブラリの調製は、この分野の当業者に良く知られている。好ましいライブラリは、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438及びWO 95/15388に記載された方法によって調製してよい。好ましい実施態様では、一本鎖抗体(scFv)のライブラリは、ヒトドナーからのヒトB細胞の様々な集団から生成されうる。VH及びVL抗体鎖に対応するmRNAは、標準的な技術を用いて単離及び精製され、逆転写されてcDNAの集団を生成する。PCR増幅の後、一本鎖抗体をコードするDNAは、Gly4Ser(配列番号:1)のようなリンカーを用いて組み立てられ、適切な発現ベクターにクローニングされる。次いでファージライブラリが調製され、そこでは一本鎖抗体の集団がファージの表面に表示される。ファージライブラリ調製のための適切な方法は、Winter等, (1994), Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55; Soderlind等 (1992), Immunological Reviews 130: 109-123; Hoogenboom, Tibtech (2月1997), Vol. 15; Neri等, (1995), Cell Biophysics 27: 47-61, 及びsそれらに記載された参考文献に概説され記載されている。
【0030】
本発明の抗体は、FIXGlaドメインを固定化し、次いで上記のように調製したヒトscFvのライブラリを固定化したFIXGlaドメインを用いてパンニングして抗体に結合させることにより選択される。Griffiths等 (1993), EMBO-J 12: 725-734。特定のクローンの特異性及び活性は、公知のアッセイを用いて評価できる。Griffiths等; Clarkson等 (1991), Nature 352: 642-648。最初のパンニング工程の後、向上した結合性を有するファージ上に表示された複数の異なる一本鎖抗体を含むファージのライブラリを得る。続くパンニング工程は、より高い結合親和性を持つ更なるライブラリを提供する。親和性効果が問題である場合は、ファージの20%未満、好ましくは10%未満、より好ましくは1%未満がファージの表面に一以上の抗体を表示する一価の抗体を用いてもよい。一価の表示は、例えばLowman等 (1991), Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3(3): 205-216に記載されたようなファージミド及びヘルパーファージを用いて実施することができる。好ましいファージはM13であり、表示は好ましくは上掲のLowman等に記載されたような被覆プロテイン3との融合タンパク質としてである。他の好ましいファージは、f1及びfd繊維状ファージを含む。他のウイルス被覆タンパク質での融合タンパク質表示も知られており、本発明で使用してもよい。米国特許第5,223,409号参照。
【0031】
抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗体DNAに導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような変異体は、例えば、ここの例の抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数の変化などの変異抗体の翻訳後過程を変更しうる。
【0032】
突然変異居誘発に適した抗体の或る残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells (1989), Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン)に置換され、アミノ酸とFIXGlaドメインとの相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における性能を分析するために、alaスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【0033】
アミノ酸配列挿入は、1残基から100以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び/又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、N-末端メチオニル残基を持つ抗体又はエピトープタグに融合した抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素又はポリペプチド又はPEGの抗体のN-又はC-末端への融合物を含む。
【0034】
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。置換突然変異について最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、FR交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表1に示す。これらの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表Aに「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、、生成物をスクリーニングしてよい。
【0035】
【0036】
抗体の生物学的活性における実質的な改変は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
変異抗体の正しい配置の維持に含まれない任意のシステイン残基は、一般的にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、抗体にシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい(特に、抗体がFv断片などの抗体断片である場合)。
【0037】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体(例えば、ヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために得られた変異体は、それらが生成された親抗体に比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法は、この分野で公知の方法を用いるファージを使用する親和性突然変異である。簡潔に言えば、高頻度可変領域部位(例えば、3−7部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたM13の遺伝子III産物への融合物として表示される。ファージ表示変異体は、次いで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。改変の候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とFIXGlaドメインとの接点を同定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
【0038】
抗体のアミノ酸変異の他の型は、元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体に見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失、及び/又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、N-結合又はO-結合の何れかである。N-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン(ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸)というトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。O-結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
【0039】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(N-結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。この変化は、元の抗体への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(O-結合グリコシル化部位の場合)。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、これらに限られないが、天然源からの単離(天然発生アミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介(又は部位指向性)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による初期調製された変異体又は抗体の非変異体の調製を含む。
好ましくは、抗体は標準的な組換え手法によって調製され、それは(典型的には細胞の発現ベクターにより形質転換により)抗体核酸を発現するように形質移入された細胞の培養による抗体の産生及び細胞又は細胞培地からの抗体の回収を含む。
【0040】
上記のように選択された抗体をコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、さらなるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。多くのベクターが入手可能であり、適切なベクターの選択は(1)それがDNA増幅に使用されるかDNA発現に使用されるか、(2)ベクターに挿入される核酸のサイズ、及び(3)ベクターで形質転換される宿主細胞に依存する。各ベクターは、その機能(DNAの増幅又はDNAの発現)及びそれが適合する宿主細胞に応じて種々の成分を含む。ベクター成分は一般に、これらに限られないが、以下のものの一又は複数を含む:シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、及び転写終結配列。
【0041】
(i) シグナル配列成分
本発明の抗体は直接的に発現されるだけではなく、好ましくはシグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合物としても発現される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、又はベクターに挿入される抗体DNAの一部である。選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。原核生物宿主細胞については、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列。酵母の分泌に関しては、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開された国際特許出願第WO 90/13646号に記載されているシグナルで置換されてよい。哺乳動物細胞の発現においては、天然シグナル配列で十分であるが、
同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、単純ヘルペスgDシグナルのようなウイルス分泌リーダーのような他の哺乳動物のシグナル配列が適する場合もある。
【0042】
(ii)複製開始点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体DNAとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は種々の細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(SV40開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる)。
【0043】
殆どの発現ベクターは「シャトル」ベクターである、すなわち、それらは少なくとも一つのクラスの生物において複製可能であるが、発現のために他の生物に形質移入され得る。例えば、大腸菌においてベクターがクローン化され、その同じベクターが酵母あるいは哺乳動物細胞に形質移入され、宿主細胞染色体を独立して複製することはできないとしても、発現する。
DNAは宿主ゲノムに挿入することによって増幅され得る。これは、例えばベクターにバシラス(Bacillus)ゲノムDNAに見られる配列と相補的なDNA配列を含めることにより、宿主としてバシラス種を用いて容易に達成される。このベクターを用いたバシラスの形質移入は、ゲノムとの相同的組換え及び抗体DNAの挿入をもたらす。しかし、抗体をコードするゲノムDNAの回収は、抗体DNAを切断するために制限酵素による消化を必要とするために、外来的に複製したベクターの場合よりも複雑である。
【0044】
(iii)選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択的培地で増殖させた形質転換宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターと共に形質転換されていない宿主細胞は培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードD-アラニンラセマーゼのような複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択スキームの一例においては、宿主細胞の増殖を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、抗薬物性を付与し、選択工程で生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン[Southern等, J. Molec. Appl. Genet., 1:327(1982)]、ミコフェノール酸[Mulligan等, Science, 209:1422(1980)]又はハイグロマイシン[Sugden等, Mol. Cell. Biol., 5:410-413(1985)]が使用される。上述した3つの例は、真核生物のコントロール下で細菌遺伝子を用いて、適切な薬物G418又はネオマイシン(ジェネテシン)、xgpt(ミコフェノール酸)、又はハイグロマイシンにそれぞれ耐性を付与する。
【0045】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ジヒドロフォレートデヒドロゲナーゼ(DHFR)あるいはチミジンキナーゼのように、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるものである。哺乳動物細胞の形質転換細胞は、マーカーを捕捉することによって当該形質転換細胞のみが生存できるように独特に適応化された淘汰圧下に置かれる。淘汰圧は、培地中の選択剤の濃度が次第に変化する条件下で形質転換細胞を培養することにより課し、選択遺伝子と抗体をコードするDNAの双方を増幅させる。増幅は、増殖に重要なタンパク質の生産に対する要求度が高い遺伝子が、組換え細胞の後の世代の染色体内に直列に反復されるプロセスである。増幅されたDNAから増大した抗体量が合成される。
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系である。形質転換した細胞は次に高レベルのMtxに接触させる。これによりDHFR遺伝子の複数コピーが合成され、同時に、抗体をコードするDNAのような発現ベクターを含む他のDNAの複数コピーが作られる。この増幅方法は、もしMtxに高度に耐性である変異体DHFR遺伝子が使用されたような場合には内在性DHFRの存在にかかわらず、任意の他の適切な宿主、例えば、ATCC番号CCL61 CHO-K1を使用することができる(EP117,060)。あるいは、抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選べるマーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選べるマーカーの選択試薬を含む培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第4,965,199号を参照。
【0046】
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcomb等, Nature, 282:39(1979);Kingman等, Gene, 7:141(1979);Tschemper等, Gene, 10:157(1980)]。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で増殖する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, (1979) Genetics, 85:12]。酵母宿主細胞ゲノムにtrp1破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Leu2欠陥酵母株(ATCC 20,622あるいは 38,626)は、Leu2遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【0047】
(iv)プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、抗体核酸配列に作用可能に結合したプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合した抗体核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺伝子(一般的に約100ないし1000塩基対)の開始コドンの上流側(5')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘発的及び構成的の2つのクラスに属する。誘発的なプロモーターは、養分の存在あるいは不存在、温度変化等の培養条件のある変化に対応してその制御の下でDNAからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多数の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源DNAからプロモーターを除去し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、抗体をコードするDNAに作用的に結合している。天然の抗体プロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれも抗体DNAの直接増幅及び/又は発現に用いることができる。
【0048】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Cahng 等(1978), Nature, 275:615, Goeddel 等 (1979), Nature, 281:544]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel (1980), Nucleic Acids Res., 8:4057; 及びEP 36,776]、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター[deBoer 等 (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25]を含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、よって当業者は、任意の所望の制限部位を提供するためにリンカーあるいはアダプターを使用することで抗体をコードするDNA[Siebenlist 等 (1980), Cell, 20:269]にそれらを作用可能に結合させることが可能である。細菌系で使用するプロモータもまた抗体をコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ25ないし30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流に見出される他の配列は、Xが任意のヌクレオチドであるCXCAAT領域である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【0049】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3-ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman 等 (1980), J. Biol. Chem., 255:2073]又は他の糖分解酵素[Hess 等 (1968), J. Adv. Enzyme Reg., 7:149; Holland (1978), Biochemistry, 17:4900]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、増殖条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
【0050】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及び最も好ましくはサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱衝撃プロモーター、そして抗体配列に通常付随するプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点をさらに含むSV40制限断片として簡便に得られる[Fiers等 (1978), Nature, 273:113; Mulligan及びBerg (1980), Science, 209:1422-1427; Pavlakis等 (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7398-7402]。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。Greenaway等 (1982), Gene, 18:355-360。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主でDNAを発現する系が、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の修飾は米国特許第4,601,978号に開示されている。また、サル細胞での免疫インターフェロンをコードしているcDNAの発現について、Gray等 (1982), Nature, 295:503-508を;単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンcDNAの発現について、Reyes等 (1982), Nature, 297:598-601を;培養されたマウス及びウサギの細胞におけるヒトインターフェロンβ1遺伝子の発現について、Canaani及びBerg (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:5166-5170を;プロモーターとしてラウス肉腫ウィルスの長い末端反復を用いたCV-1サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、及びマウスNIH-3T3細胞における細菌CAT配列の発現について、Gorman等 (1982), Proc. Natl. Acas. Sci. USA, 79:6777-6781を参照のこと。
【0051】
(v)エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明の抗体をコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。エンハンサーは、相対的に配向及び位置が独立しており、転写ユニットの5'[Laimins等 (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993]及び 3'[Lusky等 (1983), Mol. Cell Bio., 3:1108]、イントロン内部[Banerji等 (1983), Cell, 33:729]並びにコード配列自身の内部[Osborne等 (1984), Mol. Cell Bio., 4:1293]に見出されている。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインシュリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100-270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv (1982), Nature, 297:17-18もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体コード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
【0052】
(vi)転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【0053】
(vii)ベクターの作成と分析
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの作成には標準的なライゲーション技術を用いる。分離されたプラスミド又はDNA断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌K12菌株294(ATCC 31,446)を形質転換し、適切な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び/又はMessing等 (1981), Nucleic Acids Res., 9:309の方法又はMaxam等 (1980), Methods in Enzymology, 65:499の方法によって配列決定する。
【0054】
(viii)一過性発現ベクター
抗体をコードしているDNAの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む。Sambrook等, 上掲, pp.16.17-16.22。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたDNAによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、抗体ポリペプチドの生物学的活性を持つ抗体ポリペプチドの類似物及び変異体を同定する目的のために特に有用である。
【0055】
(ix)適切な例示的脊椎動物細胞ベクター
組換え脊椎動物細胞培養での抗体の合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等 (1981), Nature, 293:620-625; Mantei等 (1979), Nature, 281:40-46; EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。抗体の哺乳動物細胞培養発現に特に適したプラスミドは、pRK5[EP 307,247; 米国特許第5,258,287号]又はpSVI6B[PCT公報番号WO 91/08291]である。
【0056】
ここに記載のベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、グラム陰性又はグラム陽性生物体といった真正細菌、例えば、大腸菌、B.サチリス等の桿菌、P.エールギノーサ、サルモネラ・チフィムリウム、セラチア・マルセスセンス等のシュードモナス種を含む。1つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌294(ATCC31446)であるが、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC31537)、及び大腸菌W3110(ATCC27325)も適している。これらの例は、限定的でなく、例示的である。好ましくは、宿主細胞は最小量の原核生物酵素を分泌する。あるいは、クローニングのインビトロ方法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。
原核生物に加えて、糸状菌や酵母のような真核性微生物が抗体コード化ベクターの好適な宿主である。一般のパン酵母であるサッカロミセス・セレビシエは、下等真核宿主微生物の中で最もよく利用される。しかし、多くの他の属、種、及び株も一般に利用でき、ここで有用であり、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ(Beach及びNurse (1981), Nature 290: 140; 1985年5月2日発行のEP 139,383);例えばK.ラクチス(Louvencourt等 (1983), J. Bacteriol. 737)、K.フラジリス、K.ブルガリクス、K.サーモトレランス及びK.マルキシアナスのようなクルイベロミセス宿主(米国特許第4,943,529号);ヤロービア(EP 402,226);ピチア・パストリス(EP 183,070; Sreekrishna等 (1988), J. Basic Microbiol. 28: 265-278);カンジダ、トリコデルマ・リーシア(EP 244,234);ニューロスポラ・クラッサ(Case等 (1979), Procc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5259-5263);及び例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(1991年1月10日発行のWo 91/00357)のような糸状菌、及びA.ニジュランス(Ballance等 (1983), Biochem. Biophys. Res. Commun. 112: 284-289; Tilburn等 (1983), Gene 26: 205-221; Yelton等 (1984), Proc. Natl. Aca. Sci. USA 81: 1470-1474 )及びA.ニガー(Kelly及びHynes (1985), EMBO J. 4: 475-479)のようなアスペルギルス宿主である。
【0057】
グリコシル化抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は、複雑なプロセシング及びグリコシル化活動が可能である。原則的には、脊椎動物であろうと無脊椎動物培養であろうと、任意のより高等の真核生物細胞培養が使用できる。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。例えば、Luckow等, (1988) Bio/Technology, 6:47-55; Miller等, Genetic Engineering, Setlow等 (1986), eds., Vol. 8 (Plenum Publishing), pp.277-279; 及びMaeda等 (1985), Nature, 315:592-594を参照のこと。形質移入のための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカNPVのL-1変異体とボンビクス・モリ NPVのBm-5株が公に利用でき、それらのウイルスは、特に本発明に従ってスポドプテラフルジペルダ細胞の形質移入のために、本発明に従うウイルスとして使用できる。
【0058】
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの、既に抗体コード化DNAを含むように操作された或る菌株と共にインキュベートすることによって形質移入される。A.トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、抗体をコードするDNAが、植物細胞宿主にそれが形質移入されるよう移され、そして適切な条件下で抗体DNAが発現される。加えて、例えば、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞と適合しうる調節及びシグナル配列が利用できる。Depicker等 (1982), J. Mol. Appl. Gen., 1:561。また、T-DNA780遺伝子の上流領域から分離されるDNAセグメントは、組換えDNAを含む植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化又は増強しうる。1989年6月21日発行のEP 321,196。
【0059】
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培地(組織培地)中での脊椎細胞の増殖が近年のルーチン作業となった(Tissue Culture (1973), Academic Press, Kruse及びPatterson, 編集者)。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、SV40(COS−7,ATCC CRL 1651)で形質転換させたサル腎CV1細胞株;ヒト胚腎細胞系(293又は懸濁培養で生長するようにサブクローン化された293細胞、Graham等 (1977), J. Gen Virol. 36:59);ベビーハムスター腎細胞(BHK,ATCC CCL10);チヤイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO,Urlaub及びChasin等 (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216);マウスセルトリ細胞(TM4,Mather (1984), Biol. Reprod. 23: 243-251);サル腎細胞(CV1 ATCC CCL70);アフリカミドリザル腎細胞(VERO−76,ATCC CRL-1587);ヒト頚管腫瘍細胞(HELA,ATCC CCL2);イヌ腎細胞(MDCK,ATCC CCL34);バッファローラット肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138,ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2,HB 8065);マウス乳房腫瘍細胞(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等 (1982), Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68);MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌細胞(Hep G2)である。
宿主細胞は、形質移入され、好ましくは上述の本発明の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【0060】
形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数の形質移入の方法が当業者に知られており、例えば、CaPO4及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作の任意の徴候が宿主細胞内で生じたときに成功した形質移入が一般に認められる。
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、DNAが複製可能であるように生物体中にDNAを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等の1.82節に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等 (1983), Gene, 23:315及び1989年6月29日発行のWO 89/05859に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、1991年1月10日に発行されたWO 91/00358に記載されているように、超音波処理を用いて植物を形質移入することもできる。このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb (1978), Virology, 52:456-457のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は、Axelにより米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van solingen等 (1977), J. Bact. 130: 946及びHsiao等 (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829の方法によって実施する。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核インジェクション、エレクトロポレーション、又は細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。
【0061】
本発明の抗体ポリペプチドを生成るために用いられる原核細胞は、前掲のSambrook等により一般的に記載されているような適切な培地で培養される。
本発明の抗体の産生に用いられる哺乳動物の宿主細胞は種々の培地において培養することができる。ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地(「MEM」,シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)等の市販の培地は宿主細胞の培養に適している。さらに、それらの開示を全て参考として取り入れるHam及びWallance (1979), Meth. Enz. 58: 44, Barnes及びSato (1980), Anal. Biochem. 102: 255, 米国特許第4,767,704号;米国特許第4,657,866号;米国特許第4,927,762号;又は米国特許第4,560,655号;WO 87/00195;又は米国特許Re. 30,985号に記載された全ての培地は、宿主細胞の培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び/又は他の増殖因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名)薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
この明細書において言及される宿主細胞は、インビトロ培養中の細胞並びに宿主動物内の細胞を包含する。
【0062】
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に32Pである。しかしながら、他の技術、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドもまた使用することができる。このビオチンは、次いで例えば放射性ヌクレオチド、蛍光剤又は酵素のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位として作用する。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク質二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識してアッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果表面の二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量するための、組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培地又は体液のアッセイといった免疫学的方法によって測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能なもの、例えば酵素的標識、蛍光標識、又はルミネセンス標識である。本発明での使用に適した特に感受性の染色技術は、Hsu等 (1980), Am. J. Clin. Path. 75: 734-738に記載されている。
【0063】
抗体は、好ましくは培養培地から分泌されたポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナル無しで直接発現される場合は宿主細胞溶解液から回収してもよい。
抗体がヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられるときは、抗体はヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含んでいない。しかしながら、リガンド自体に関して実質的に相同である調製物を得るには、他の組換え細胞タンパク又はポリペプチドから抗体を精製する必要がある。第一段階として、培地又は溶解液を遠心分離して粒状の細胞細片を除去する。ついで、膜及び可溶性タンパク質画分を分離する。あるいは、市販のタンパク質濃縮フィルター(例えば、アミコン又はミリポアPELLOCON限外濾過ユニット)を使用してもよい。その後、塩析及び交換又は種々のゲルマトリクスを用いたクロマトグラフ法により汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから抗体を精製する。これらのマトリクスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース及びタンパク質及びタンパク質精製に一般的なタンパク質及びものを含む。タンパク質精製に適したクロマトグラフ法の例は、免疫親和性、FIXGlaドメイン親和性(例えば、-IgG又はプロテインAセファロース)、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)(例えば、エーテル、ブチル、又はフェニルトヨパール)、レクチンクロマトグラフィー(例えば、ConA-セファロース、レンチル-レクチン-セファロース)、サイズ排除(例えば、セファロースG-75)、カチオン-及びアニオン-交換カラム(例えば、DEAE又はカルボキシメチル-及びスルホプロピル-セルロース)、及び逆相高速液体クロマトグラフィー(PR-HPLC)(例えば、組換えヒトIL-2の精製に2つの連続するRP-HPLC工程が使用されているUrdal等 (1984), J. Chromatog. 296: 171を参照)を含む。他の精製工程は、場合によっては、エタノール沈殿;硫酸アンモニウム沈殿;クロマトフォーカシング;調製的SDS-PAGE等を含む。
【0064】
残基が欠失され、挿入され、又は置換された抗体変異体は、その変異によってしばしば惹起される実質的な特性変化を考慮に入れて、同様にして回収される。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原と抗体との融合体の調製は精製を容易にし;抗原に対する抗体を含む免疫親和性カラムを、融合ポリペプチドを吸着するために使用することができる。ウサギポリクローナル抗-抗体カラムなどの免疫親和性カラムは、それを少なくとも1つの残りの免疫エピトープに結合することにより抗体変異体を吸着させるのに用いることができる。あるいは、当業者に知られた手段によって、(好ましくは)AFFI-ゲル10(Bio-Rad, Richmond, CA)等の固定化樹脂にカップリングした精製FIXGlaドメイン-IgGを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより、抗体を精製してもよい。フェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の増殖を防止するために抗生物質を含めることができる。天然抗体に適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際における抗体又はその変異体の特性の変化の原因となる改変が必要となることは、当業者であれば理解するであろう。
【0065】
用途
ここに開示した抗体は、FIXa依存性アッセイでの凝固の阻害においてFIXaによる又はTF-FVIIaによるFIXからFIXaへの活性化の阻害についてのインビトロ診断アッセイに有用である。
本発明の組成物は、限定するものではないが、血栓溶解療法と組み合わせた動脈再血栓症を含むFIXa媒介疾患又は障害の治療及び予防で使用できる。FIXは、深部脈管血栓症、動脈血栓症、脳卒中、DIC、敗血性ショック、心肺バイパス手術、成人呼吸困難症候群、先天性血管浮腫、並びに腫瘍増殖及び転移を含む種々の臨床的容体において重要な役割を果たすことが示唆されている。従って、FIXの阻害薬は、炎症及び/又は血栓症疾患の調節において重要な役割を果たしうる。
よって本発明は、ヒトにおけるFIX/FIXa媒介事象を抑制する方法を包含し、その方法は、本発明の抗体組成物の治療的有効量を必要とする患者に投与することを含んでなる。本発明の抗体分子の治療的有効量は、所望の効果を達成するように予め決定される。治療に用いられる量は治療対象、投与経路および処置すべき病状に応じて変化する。従って、投与すべき用量は存在するFIX/FIXaに結合して不活性な複合体を形成し、処置される患者において血液凝固を低下させるのに十分な量である。
【0066】
治療的有効性は、FIXa依存性凝固に関連する一又は複数の症状の改善によって測定される。このような治療的有効用量は、当業者によって決定でき、処置すべき患者の年齢条件、性および病状に応じて変化する。全身投与についての適当な用量範囲は、典型的には約1μg/kgから約100mg/kg又はそれ以上であり、投与経路に依存する。本発明によれば、好適な治療的用量は約1μg/kg体重から約5mg/kg体重の間である。例えば、適当な措置は、意図する治療に特定された範囲の血中濃度を維持するに十分な静脈注射または点滴を包含する。
本発明の抗体又は抗体断片を含む医薬品組成物は、非経口、局所、経口、または局所(例えばエアロゾルまたは経皮)、又はこれらの組合せを含む任意の適当な様式で投与してよい。また適当な措置には、最初の静脈内ボーラス及びそれに続く1回または複数回の間隔をおいた反復投与が含まれる。
【0067】
例えば、血栓溶解療法の過程で血栓閉塞の再形成を予防するために、本発明の組成物を血栓溶解剤と組合せて投与する場合には、血栓溶解の治療的有効用量は従来の用量範囲の約80から100%の間である。血栓溶解剤の通常の用量範囲は、治療で使用される日用量であって、治療担当医には容易に入手可能である(Physicians Desk References (1994), 50th Edition, Edward R. Barnhart出版)。典型的な用量範囲は、用いる血栓溶解剤に依存し、組織プラスミノーゲン活性化剤(t-PA)では0.5から約5mg/kg体重;ストレプトキナーゼでは患者当たり140,000から2,500,0000単位;ウロキナーゼでは患者当たり500,000から6,250,00単位;そしてアニソール化ストレプトキナーゼ・プラスミノーゲン活性化剤複合体(ASPAC)では0.1から約10単位/kg体重となるであろう。
ここで使用される組み合わせという用語は、少なくとも本発明の分子及び少なくとも1種の血栓溶解剤を含む単一投与形態を含む。またこの用語は、本発明の分子が別々に投与されるが、順次投与のように別々の投与2回によって同時発生的に投与される多数回投与形態も含むことを意味する。これらの組合せ及び組成物は、閉塞血栓の溶解を起こす閉塞血栓を溶解するかまたは形成を予防するように作用する。インビボ投与に用いられる場合、抗体製剤は無菌でなければならない。これは凍結乾燥又は再構成の前又は後に滅菌濾過膜を通すことにより容易に達成される。抗体は通常は凍結乾燥形態又は溶液で保存される。
治療的抗体組成物は一般的に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿通可能なストッパーを具備するバイアルに配される。
【0068】
抗体投与の経路は公知の方法により、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、鞘内、吸入又は病変部内経路の注射又は注入、又は下記のような徐放系による。抗体は、好ましくは注入により連続的に又はボーラス注射により投与される。
本発明の抗体は製薬的に許容される担体と混合して調製してもよい。この治療用組成物は、静脈内に又は鼻又は肺を通して、好ましくは液体又は粉末エアロゾル(凍結乾燥物)として投与できる。また組成物は、必要ならば非経口又は皮下投与してもよい。全身投与される場合、治療用組成物は無菌であり、発熱物質を含まず、pH、等張性及び安定性について非経口に許容される溶液でなければならない。これらの条件は、当業者には知られている。簡潔に言えば、本発明の化合物の投与製剤は、所定の純度を持つ化合物を生理学的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤と混合することにより調製され保存又は投与される。このような材料は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、トリスHCl、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩及び他の有機酸塩等のバッファー;アスコルビン酸等の酸化防止剤;ポリアルギニン、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等の低分子量(約10残基未満)のペプチド;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸又はアルギニン等のアミノ酸;セルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、又はデキストリン等の単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の対イオン及び/又はTWEEN、PLURONICS又はポリエチレングリコール等の非イオン性界面活性剤を含む。
【0069】
注射用の無菌組成物は、従来の製薬実務に従って製剤できる。例えば、水又はゴマ、ピーナッツ、又はナタネ油等の天然発生植物油又はオレイン酸エチル等の合成脂肪媒体といった媒体中での活性化合物の溶解又は懸濁が望ましい。バッファー、防腐剤、酸化防止剤等を許容される製薬実務に従って含有せしめることもできる。
徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、Langer等 (1981), J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277及びLanger (1982), Chem. Tech. 12: 98-105に記載されたポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP 58,481)、L-グルタミン酸とガンマ-エチル-L-グルタメートのコポリマー(Sidman等 (1983), Biopolymers 22: 547-556)、非分解性エチレン-酢酸ビニル(Langer等, 上掲)、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(商品名)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能な微小球)、及びポリ-D-(−)-3-ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)が含まれる。
【0070】
エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは100日以上分子を放出できるが、或る種のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化したタンパク質が長時間体内に保持されると、37℃の水分に曝されることで変性又は凝集し、生物学的活性の喪失や免疫原生の変化のおそれがある。関連するメカニズムに応じて安定性を得るための合理的な方法が案出できる。例えば、凝集機構がジスルフィド交換による分子間S-S結合形成であることが見出されたら、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使用し、及び特定のポリマーマトリクス組成物を開発することで安定化を達成することができる。以下の実施例は、例示のためのものであり何ら限定するものではない。本明細書中の全ての引用文献の開示は参考のためにここに取り入れるものとする。
【0071】
(実施例)
実施例1
試薬。FIX及びFIXaはHaematologic Technologies社(Essex Jct., VT)からのものである。FXはEnzyme Research Laboratories Inc. (South Bend, IN)から、ジオレイル1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-(ホスホ-L-セリン)(PS)及びオレイル1,2-ジアシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PC)はAvanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL)からのものである。FIXa色素生産性基質#299はAmerican Diagnostica(Greenwich, CT)からのものである。アクチンFS及びイノビンはDade International Inc. (Miami, FL)から得た。セファロース樹脂及びカラムはAmersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ)からのものである。ジアエチレングリコール(分析等級)及びFeCl3(試薬等級)はMallinckrodt Inc. (Paris, KY)からのものである。脂肪酸無しのBSAはCalbiochem (La Jolla, CA)からのものである。注射用のヘパリンナトリウムはElkins Sinn Inc. (Cherry Hill, NJ)からのものである。注射用の無菌塩水はBaxter Healthcare Corp. (Deerfield, IL)から購入した。大腸菌からの精製TF(1-243)及び組換えF.VIIaはロバートF.ケリー(Genentech, Inc.)から親切に提供された。
【0072】
方法
Glaペプチドの合成及びビオチニル化:Glaペプチド合成は、ABI431ペプチド合成機で標準的なFmoc化学プロトコールを用いて0.25mmolスケールで実施した。カップリングはHBTU[2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート]、HOBT(N-ヒドロキシベンゾトリアゾール)、及びDIPEA(ジイソプロピルエチルアミン)で1時間実施した。 Fmocアミノ酸側鎖保護基は以下である:Tyr(tBut)、Thr(tBut)、Ser(tBut)、Lys(Boc)、Arg(pbf)、Asn(trt)、Gln(trt)、Gla(OtBut)2、Cys(acm)及びTrp(Boc)。酸化は、樹脂上に残ったペプチドで、樹脂を10当量のヨウ化物とともにDMF中で4℃において1時間撹拌することにより実施した。ペプチドは、70:30:0.1のTFA:ジクロロメタン:トリイソプロピルシランを用いて30分間室温で切断し、エーテルで倍散し、30mMのNH4OHで樹脂を抽出除去して凍結乾燥した。物質の同一性はエレクトロスプレーマススペクトルで確認し、ペプチド配列決定及びアミノ酸分析をした。Fmoc-L-Gla(OtBut)2はpeninsula Labs (Belmont CA)から、及びFmoc-Lys(alloc)はPerseptive Biosystems (Framingham MA)から得た。触媒Pd(0)及びビオチン-NHSは各々Fluka (Ronkonkoma NY)及びSigma (St Louis MO)から得た。
【0073】
ビオチニル化Glaペプチドの合成は、上記の手法から以下のように修正した。ペプチド合成は、位置40のFmoc-Lys(alloc)を用いて実施し、ペプチドのN-末端上の最後のFmoc基を除去した。alloc(アリルオキシカルボニル)基の除去は、パラジウム触媒で、クロロホルム中に5%の酢酸及び2.5%のN-メチルモルホリンを含むテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)の0.1M溶液を用いて3時間行った。ビオチン-NHS(N-ヒドロキシスクシンイミドビオチン)は、DMF/DCM中においてDIPEAで終夜リジン(40)の側鎖にカップリングさせた。次いで、最後のFmoc基を20%ピペリジン/DMFで除去し、ペプチドを樹脂上で酸化し、樹脂を切断し
、上記のパラグラフに記載したように樹脂を抽出除去した。
結果
合成したGlaペプチドのアミノ酸配列をFIG1(ヒト)に示す。
【0074】
実施例2
方法
バイオパンニング方法−1010scFvの大きなライブラリ(Cambridge Antibody Technology, Cambridgeshire, UK)(Vaughan等 (1996) Nature Biotechnology 14: 309-314)を、2ラウンドのビオチニル化ペプチドに対する富化を通してパンニングした。親和性推進選択(Hawkins等 (1992), J. Mol. Biol. 226: 889-896)を、続く各ラウンドのパンニングの抗原量を減少させることにより実施した(ラウンド1及び2は、各々100nM及び10nM)。Glaペプチドの正しい配置を確実にするために、特に断らない限り、パンニング方法及び続く全てのアッセイ中に塩化カルシウム(2mM)を全ての溶液に添加した。各選択について、3%の脱脂乳、0.1%のTWEEN及び2mMのCaCl2を添加したTBS(MTBST/Ca)の1mlでブロックした約1012の滴定単位のファージを、ビオチニル化ペプチドとともに室温(RT)で1時間インキュベートした。MTBS中でブロックしたストレプトアビジン-抱合ビーズ(DYNABEADS, Dynal, Oslo Norway)を、ファージ-ビオチニル化抗原混合物にRTで15分間添加した。DYNABEADSの300μlの容積をラウンド1に使用し、ラウンド2では100μlに減少させた。DYNABEADSを各々以下の溶液:TBST/Ca、MTBST/Ca、及びTBS/Caで、DYNAL MPC (磁気粒子濃縮剤)を用いて3回洗浄した。結合したファージを、4MのMgCl2、1mMのテトラ-エチルアミン(TEA)、及び100mMのHClで順番に溶離した。各溶離は室温で5分間実施し、溶離した画分を50mMのトリス-HCl、pH7.5で中和した。各ラウンドのパンニング後に回収したファージを細菌性サプレッサ株TG1で増殖させた。
【0075】
scFvのヒトFIXへの単離及び特徴付け−潜在的な抗血栓活性を持つヒトFIXに特異的な抗体を単離する試みにおいて、ヒトFIXのGlaドメインに対応するペプチドを持つヒトscFv抗体のファージ表示ライブラリをスクリーニングした。Ca++のFIXGlaドメインへの結合はリン脂質及び細胞表面との相互作用に重要な立体配置変化を誘発することが示されたので、全てのパンニング選択工程は2mMのCaCl2存在下で実施した。各々100nM及び10nMのビオチニル化ペプチドを含む溶液中で2ラウンドのパンニングを実施した。パンニングの第2のラウンドの後、スクリーニングした800クローン中の96(12%)を、ファージELISAによりFIXGlaペプチドに特異的に結合する能力において選択した(Griffiths等 (1993), EMBO J. 12: 725-734)。
【0076】
実施例3
方法
クローン特徴付け−MAXISORPのElisaプレート(Nunc)をHEPES緩衝塩水(HBS)中のGlaペプチド(5μg/ml)で4℃において終夜被覆した。プレートを、0.1%のTWEEN及び3%の粉乳を含むHBSでブロックした。ファージ培養上清(50μl)をプレートに直接適用した。次いでセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)-抱合抗-M13(Pharmacia, Uppsala, Sweden)を添加した。選択したクローンから精製したDNAをBstNI消化及び配列決定(ABI377、Perkin Elmer, Foster City, CA)により特徴付けた。
scFvタンパク質ELISA−ELISAプレートを、炭酸塩バッファー中の抗-c myc抗体9E10(フォーマットI)、2mMのCaCl2を含むHBS(HBSCa)中のFIX又はFIX関連因子(フォーマットII)のいずれかで被覆した。プレートを0.1%のTWEENを含むHBSCa(HBST/Ca)でブロックした。scFvを5μg/mlの濃度で添加した。フォーマットIでは、ビオチニル化FIX(1μg)、次いでストレプトアビジン-HRPを適用した。フォーマットIIでは、抗c myc mAb及びHRP-抱合ヤギ抗-マウスFc-特異的mAb(Zymed, South San Francisco, CA)を用いてscFvの検出を実施した。全ての試薬希釈は、ブロッキングバッファーHBST/Ca中で調製し、プレートは0.05%のTWEENを含むHBS/Caで洗浄した。
【0077】
結果
選択したクローンの生殖系列の多様性を更に評価するために、個々のクローンからDNAを精製し、BstNIフィンガープリント(Clarkson等, (1991) Nature 352: 624-628)を施した。96クローンを24の異なるフィンガープリントファミリーに分類した。scFvを、モノクローナル抗体9E10(Griffiths等, (1993) EMBO J. 12: 725-734)及びポリペプチドヒスチジンタグ(his6)によって認識されるc-mycタグ配列を含むエピトープタグタンパク質として発現させ、製造者(Qiagen, Chatworth, CA)の推奨によりNi-NTA上でイミダゾール溶離で精製した。各フィンガープリントファミリーから一つのクローンをscFvの発現のために選択した。次いで精製したscFvを、それらのGlaペプチド及び全長FIXに対する反応性をELISAによって試験した。試験した24クローンの中の6クローン(10C12、11C5、11G9、13D1、13H6、及び14H9)は、Glaペプチド及び全長FIXの両方に様々な程度で交差反応することがELISAで示され(FIG4)、他の全てはGlaペプチドのみと反応した。クローン10C12、13D1及び13H6が、クローン11G9、11C5、及び14H9よりFIXに対して強い結合性を示した。 これら6つのクローンを、DNA配列決定により更に特徴付けてセグメント利用の分析をした(FIG2)。4つのクローン(10C12、11C5、11G9、及び13D1)は、同一のCDR領域を持つ同じ軽鎖(Vλ1)を示した。クローン13H6及び14H9軽鎖は独特であり、他のものとは異なり、CDR領域に相同性は見られなかった。重鎖の配列決定は、クローン10C12及び13D1の間に、1つはCDR2に位置し2つはフレームワーク領域に位置する3残基においてのみ相違する強い相同性を明らかにした。クローン11C5重鎖は10C12及び13D1とほぼ同一のCDR1及びCDR2を有するが、CDR3領域は相違する。クローン13H6及び14H9重鎖は他のクローンとの相同性を殆ど示さなかった。これらの結果は、10C12、11C5、11G9、及び13D1は密接に関連しており、11D5重鎖CDR3領域に最も顕著な相違が残っていることを示す。全体の相同性は、これらの抗体がFIX-Glaドメインの同一のエピトープに結合することを示唆している。Ca++及びMg++の存在下で、FIXGlaドメインは異なる立体配置をとり、異なる抗体エピトープを露出する。(13H6を除いて)CDRにおいて高い相同性を示す抗体10C12、13D1、11C5及び13H6は、GlaドメインのCa++誘発立体配置に排他的に結合し、それらが共通のエピトープを認識するという見方に一致する。これに対して、クローン
13H6及び14H9は、ともに独特な重鎖及び軽鎖を有する。クローン14H9はCDRドメイン、特にCDR3に、顕著に荷電した残基を持つことがわかった。
6つの抗体の内の4つを、強いFIXa阻害活性(10C12、13D1、及び13H6)及びDNA生殖系列多様性(14H9)に基づいて、F(ab')2分子の再構成に選択した。
【0078】
種々の血液凝固因子に対するscFv及びF(ab')2の結合特異性−異なる血液凝固因子(FVII、FIX、FX、プロトロンビン、及びプロテインC)のGlaドメインの間には高度な相同性がある(FIG1B参照)。FIXGlaドメインへの結合の為に選択した抗体の特異性を決定するために、種々の因子(FVII、FIX、FX、プロトロンビン、及びプロテインC)をプレート上に被覆し、5μg/ml(F(ab')2については0.02μg/ml)の濃度でscFv(FIG6A)及びF(ab')2(FIG6B)とともにインキュベートすることによりELISA実験を行った。結果は、クローン10C12、13D1、及び13H6からのscFv及びF(ab')2の両方はFIXのみと反応するが、14H9は試験した全ての因子を認識することを示した。さらに、クローン10C12、13D1及び13H6からのscFvのFIXへの結合性は、scFvをFIX欠失血清とプレインキュベートした場合に低下せず、これらのクローンの血清中に存在するFIX以外の因子との如何なる相互作用も認められない。これに対して、クローン14H9からのscFvの結合性は、同じ血清でのscFvのインキュベーション後に大きく低下した。これらの結果は、クローン14H9に認識されるエピトープは独特であり、他の3抗体に見られる配列とは異なることを示している。
抗-FIXF(ab')2のFIXへの結合のカルシウム及びマグネシウム依存性−この研究に記載したscFvの選択は、Ca++イオンの存在下で実施した。FIXは2つの金属依存性立体配置転位を受けることが示され、一方の金属依存性はカチオン以外で非選択的であり、第2のものはCa++又はSr++について金属選択的であった。抗-FIX抗体の結合性に対する金属イオンの影響を試験するために、全てのバッファーに添加したCa++、Mg++、又はEDTA(Ca++イオンをキレートする)でELISAを実施した。結果は、クローン10C12、13D1及び13H6はCa++の存在下でFIXのみを認識し、結合性は2mMのEDTA存在下で一部又は全部が阻害されることを示した。これに対して、クローン14H9はMg++又はCa++いずれかの存在下でFIXに結合した。EDTAの存在下で阻害は観察されず、Ca++イオンは結合を起こすのに必要とされないことを示している。
【0079】
実施例4
方法
抗-FIXF(ab')2親和性のBIAcore評価−幾つかの(Fab')2の「ロイシン-ジッパー」断片の抗原結合親和性を、BIAcore-2000(商品名)表面プラスモン共鳴系(Pharmacia Biosensor)を用いて測定した結合及び解離速度定数から計算した(Lofas & Johnsson (1990), J. Chem. Soc. Commun. 21: 1526-1528)。バイオセンサーチップを、供給者(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)の指示に従って、N-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド(EDC)及びN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を用いて活性化した。因子IX、及びネガティブ対照としての因子Xを、10mMの酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5)中で約30μg/mlに希釈した。アリコートを注入し、約519反応単位(RU)のカップリングFIX、及び2330RU又は13,590RUのカップリングFXとした。最後に、1Mのエタノールアミンをブロッキング剤として注入した。
【0080】
速度論的測定のために、ランニングバッファー(0.05%のTween-20、150mMのNaCl、2mMのCaCl2、10mMのHepes pH7.4)中での抗体の2倍希釈物(10μl)を25℃で10μL/分の流速を用いて注入した。再生は4.5MのMgCl2、次いで洗浄バッファー(50mMのEDTA、150mMのNaCl、0.05%のTWEEN-20)で達成した。SPR測定からの平衡解離定数Kdをkoff/konとして計算した。解離データは単純な1:1ラングミア結合モデルにあてはめた。疑一次速度定数(Ks)は、各結合曲線から計算し、タンパク質濃度の関数としてプロットし、kon+/−s.e.(フィットの標準誤差)を得た。計算したKdにおいて得られる誤差e[K]は次のように計算した:
e[K]=[(kon)−2(Soff)2+(koff)2(kon)ー4(Son)2]1/2
ここで、Soff及びSonは各々kon及びkoffの標準誤差である。
結果
抗-FIX(Fab')2のFIXに対する親和性測定−SPR結合実験において、10C12、13D1及び13H6の(Fab')2-ジッパー形態は、(F.X、又はブランクフローセルに対して)FIXへの特異的結合性を示した。これらの実験のために、低密度(519RU)の固定化抗原(FIX)を使用した。抗体の二価形態は、抗原への結合において結合活性効果をもたらし、観察された結合速度は結合及び解離の単純な1:1モデルと一致した。3つの抗体は全て類似の経理速度定数(koff)を持ち、約50-70分の解離半減期に相当する(FIG3)。しかし、13H6についての結合速度(kon)は10C12又は13D1より有意に速かった。従って、13H6の平衡解離定数(Kd)は、10C12(Kd=1.6nM)又は13D1(2.9nM)より低い(Kd=0.45nM)。
【0081】
実施例5
方法
FIXのウシ内皮細胞に対する結合性−一次的なウシ大動脈内皮細胞を記載されているように(Marcum等 (1986), J. Biol. Chem. 261: 7507)4日間増殖させた。細胞を、10mMのHEPES, pH7.2、137mMのNaCl、4mMのKCl、11mMのグルコース、5mg/mlのBSA及び2mMのCaCl2を含むHEPESバッファーで洗浄した、次いで細胞をビオチニル化FIX、及び/又は種々の量の冷FIX、scFv又は(Fab')2タンパク質と1時間プレオンキュベートしたビオチニル化FIXとともに4℃で2時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン-HRP抱合体をRTで1時間、次いでTMB/H2O2基質を添加した。プレートを、プレートリーダー上で620nmで分析した。
血小板依存的凝固アッセイ−ミクロタイタープレート(Linbro #76-232-05)を、PBS中の4μg/mlのヒトコラーゲンIII(GibcoBRL #12167-011)、1mMのCaCl2、1mMのMgCl2で、4℃において終夜被覆した。PBSで洗浄した後、プレートをTyrodeのBSA、2mMのCaCl2とともに60分間37℃で更にインキュベートした後に使用した。
洗浄した血小板を、記載されているようにヒトクエン酸化全血から調製した(Dennis等 (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2471-2475)。洗浄血小板をTyrodeのBSA中で約6x108血漿板/mlの濃度に調節し、37℃で120分間静置した。1mMのCaCl2及び1mMのMgCl2を添加した後、血小板をADP(10μMの最終濃度)で活性化した。。60μlの血小板懸濁物をウェル毎に添加し、プレートを60xgで5分間遠心分離し、次いで血小板をコラーゲン被覆ウェルに室温で60分間強固に接着させた。非接着血小板を優しくデカントし、プレートを1mMのCaCl2及び1mMのMgCl2を含むPBSで2回洗浄した。次いで、コラーゲン接着血小板層をTyrodeのBSA-2mMのCaCl2(40μl/ウェル)中の抗体と共に10分間インキュベートした。CaCl2(11mM最終濃度まで)で再ミネラル化した60μlのヒトクエン酸化血漿(Penisula Blood Bankからの血漿プール)を各ウェルに添加した。動力学的ミクロプレートリーダー(SLT Lab Instruments, モデルEAR 340AT)で405nmにおける光学密度の増加を監視することにより凝固を定量化した
【0082】
結果
内皮細胞へのFIX結合性及び血小板依存的凝固に対するタンパク質阻害効果−FIXのGlaドメインはFIXとリン脂質及び細胞表面との相互作用に必要であることが知られているので(Ryan等, (1989), J. Biol. Chem. 264: 20283-20287; Toomey等 (1992), Biochemistry 31: 1806-1808; Cheung等 (1992), J. Biol. Chem. 267: 20529-20531; Ahmad等 (1994), Biochem. 33: 12048-12955)、FIXGlaドメインに対して生成したscFvを、それらがFIXの内皮細胞への結合を阻害する能力について更に試験した。ウシ大動脈内皮細胞を用いた競合的アッセイにおいて、ビオチニル化FIXの細胞への接着性を、クローン10C12、11C5、11G9、13D1、13H6、14H9、6E11又は非標識FIXのいずれかからのscFvの存在又は不存在下で測定した。この実験の結果をFIG5Aに示した。クローン10C12、13D1、13H6及び11G9からのscFvは、FIX結合性に対して最も強力な蘇我以降かを示し、非標識FIXと類似していた(20-50nMに等価なIC50)。クローン11C5、6E11及び14H9からのscFvは非常に弱い阻害を示した(IC50>300nM)。
またFIXGlaドメインは、血小板への結合についての主要な決定因子を含む(Ahmad等 (1994), 上掲)。ヒト血小板依存的血漿凝固アッセイは、種々のscFvのFIX活性阻害剤としての能力の評価に使用された。このアッセイにおいて、洗浄したヒト血小板を活性化し、コラーゲンに接着させ、血小板を含まない再ミネラル化ヒト血漿を添加した。進行中の凝固を光学密度の変化として90分まで監視した。血小板の排除又は血小板存在下でのFIX欠失血漿の使用は、この時間に渡って吸収の有意な変化を及び導かなかった。これらの発見は、このインビトロ系での凝固が血小板及びFIXa活性に依存していることを示す。FIG5Bに示すように、クローン10C12、11G9、13H6、及び13D1からのscFvは、500nMの濃度で凝血塊形成を完全に阻害した。この濃度では、14H9は効果が無かったが、11C5は中程度の反応を示した。より高い濃度(2μM)では、これらのscFvともに完全な阻害性であった。この系における試験したscFvのFIXa機能を阻害する能力は、内皮細胞結合アッセイと同じオーダーに位置した。これは、Glaドメインの類似の構造的成分が内皮細胞及び血小板に認識されることを示しているかもしれない。
【0083】
実施例6
方法
異なる種からの血漿の血漿凝固アッセイ−活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)及びプロトロンビン時間(PT)を、アクチンFS(Dade Diagnostics, PR)及びヒト再脂肪化組織因子試薬イノビン(Innovin)(Dade International Inc., Miami, FL)を凝固開始剤として用いてACL 300(Coulter Corp., Miami, FL)上で測定した。ウサギPTについては、ウサギトロンボプラスチンCプラス(Dade Dignostics, PR)を使用した。イノビンは、ここで試験した全ての種に渡る秒湖の強力な開始材であり、ヒト再脂肪化組織因子が異なる動物種型の血漿を有効に凝固させるというJonson等 (1084) Haemostasis 14: 440-444の発見に符合する。ニュージーランド白ウサギ、C-57マウス、Sprague-Dawleyラット及びイヌのクエン酸化血液から誘導した血漿は、標準的な方法で調製して-80℃で保存した。ヒトのプール血漿は、Peninsula Blood Bank (Burlingame, CA)から得た。抗-FIX抗体をインキュベートしてクエン酸化血漿で10倍希釈し、アクチンFS及びCaCl2(APTTについて)又はイノビン(PTについて)の添加で凝固を開始させる前に10分間
インキュベートした。抗体の効果は、抗体の存在下及び不存在下(対照)における凝固時間の比率であるx-倍の延長として表示した。
FVIIIaによるFX活性化:リン脂質上のFIXa複合体−0.5nMの因子IXa、0.7U/mlのF.VIII、200μMのリン脂質小胞(PC:PS=7:3)及び10mMのCaCl2のHBSAバッファー(0.1MのHepes, pH7.5、0.14MのNaCl、0.5mg/mlの脂肪酸無しBSA)中の混合物を、α-トロンビン(2.8nM)とともに1分間室温でインキュベートしてFVIIIを活性化した。トロンビン活性は、23.3nMのヒルビンの添加により中和した。抗体を混合物に添加して、RTで20分間インキュベートした後に0.8μMのFXを添加した。この最後の反応混合物において、反応物の濃度は:0.25nMのFIXa、0.35U/mlのF.VIIIa、25μMのpリン脂質、100nMのFX及び5mMのCaCl2であった。異なる時点で50μlのアリコートを150μlの20mMEDTAに加えて反応を停止させた。試料中のFXa濃度を測定するために、50μlの1.5mMS-2765を各ウェルに添加し、吸収の変化を動力学的ミクロプレートリーダー(Molecular Devices, Menlo Park, CA)で監視した。FXaの生成速度は、時間に対するFXa濃度の線形回帰分析を用いて決定した。
【0084】
結果
10C12及び13H6F(ab')2によるFIX機能の選択的阻害−10C12及び13H6によって観察されたFIXへの特異的結合性がFIX/IXa機能の特異的阻害に翻訳されるか否かを実験するために多数の異なる機能的アッセイを用いた。13D1は10C12への同一性のために、14H9は非特異的結合パターンのために、これらはともに更に続けることはしなかった。第1に、我々は、ヒト血漿におけるFIX依存的APTT及びFIX依存的PTに対する10C12及び13H6の効果を測定した。対照F(ab')2(抗-ネウロツリン)は、APTTもPTも延長しなかった。第2に、10C12及び13H6F(ab')2は血小板依存的凝固を強く阻害し、それらの一本鎖形態で得られた結果に類似していた。10C12は13H6より強力であり、173±43nMに比較して59.0±3nMのIC50を有する(FIG7)。
10C12F(ab')2の種交差反応性−異なる動物種のFIX-Glaドメインのアミノ酸配列は多くが保存されており(FIG1A)、ヒトFIX-Glaに結合する抗体も種々の動物の血漿FIX/FIXaを認識することを示唆している。従って、異なる種からの血漿において10C12F(ab')2がAPTTを阻害する能力を試験した、FIG9Bに示すように、10C12F(ab')2はイヌにおいてAPTTを最も強力に延長し、ラット及びウサギ血漿では程度が低かった。FIX/FIXaに対する抗体効果の特異性は、同種血漿におけるPTに対する効果が無いことによって証明された。
【0085】
抗体を、リン脂質小胞(PCPS)を用いたFVIIIa:FIXa媒介FX活性化アッセイにおいて評価した(FIG8)。FX活性化速度の濃度依存的阻害が観察され、半最大速度阻害は10C12については3.5±1.8nMであり13H6については7.3±1.3nMであった。ネウロツリン(α-NTN)に対する無関係な対照F(ab')2は、活性化速度に影響を与えなかった。さらに抗体は、新たに形成されたFXaの濃度を決定するためのアッセイの第2段階で使用される色素生産性基質S2765を切断するFXa活性に対して効果を持たなかった。従って、抗体の効果は固有のXase機能の妨害のみによる。これらの結果を合わせると、10C12及び13H6F(ab')2はFIX/FIXa機能を特異的に阻害し、それらがELISA型アッセイで示した結合特異性に符合することが示された。
【0086】
実施例7
10C12の阻害メカニズム
方法
FIXaによるFIXの活性化。抗体を、ミクロタイターチューブ(8.8x45mm、OPS、Petaluma, CA)を用いて20mMのhepes, pH7.5、0.15MのNaCl、5mMのCaCl2、0.05%のBSA(HBSAバッファー)中でインキュベートした。20分間のインキュベーション時間の後、FIXaを添加して反応を開始させた。この反応混合物中のFIX及びFIXaの濃度は、各々400nM及び1nMであった。100μlのアリコートを30分間隔で取り、125μlの30mMEDTAバッファー-60%(v/v)エチレングリコールを含む96ウェルのコスタープレート(Corning Inc., Corning, NY)中でクエンチした。エチレングリコールは、そのFIXaアムジオリチック(amdiolytic)活性に対する促進効果により含有せしめた(Sturzebecher等, (1997) FEBS lett., 412: 295-300; Neuenschwander等,, (1997) Thromb. Haemostatsis 78: (suppl.): 428)。5mMのFIX基質#299を25μl添加した後、FIXaアムジオリチック活性を、動力学的ミクロプレートリーダー(Molecular Devices, Menlo Park, CA)上において405nmで測定した。試験した抗体による阻害は、FIXa生成の速度分率(vi/vo)として表示した。
【0087】
組織因子:F.VIIa複合体によるFIXの活性化。細胞質ドメインを欠くTF(1-243)(Paborsky等 (1989), Biochemistry 28: 8072; Paborsky等 (1991), J. Biol. Chem. 266: 21911-21916)を、Mimms等 (1981), Biochemistry 20: 833-840に従ってPC/PS(モル比7:3)で再脂肪化した。膜TF(mTF)は、全長TF(1-263)(Kelley等, (1997), 上掲)を発現するヒト胚腎臓細胞系(293)から調製した。細胞をPBSで洗浄し、10mMのEDTAで脱着し、そして2回遠心分離(2500rpmで10分間)した。細胞ペレット(4-5x107細胞/ml)をTris、pH7.5中に再懸濁し、ペーストホモジナイザーを用いてPBS中に均質化し、次いで4℃で40分間遠心分離(Beckman GSAで2500rpm)した。細胞膜分画のタンパク質濃度を測定し、膜をアリコート中に-80℃で使用するまで保存した。
抗体をHBSAバッファー中でFIXとともに20分間ミクロタイターチューブ内でインキュベートした。再脂肪化TF(1-243)(20nM)及びFVIIa(5nM)の複合体を、FIX/抗体インキュベーション溶液に添加する少なくとも10分前に予め形成した。この反応混合物において、再脂肪化TF(1-243)、FVIIa及びFIXの濃度は、各々4nM、1nM及び400nMであった。mTFでの実験のために、mTF(750μg/mlの膜タンパク質濃度)及び5nMのFVIIaの複合体を予め形成した。この濃度のmTFは最大のFVIIa活性を与え、再脂肪化TF(1-243)で見られたものと等しかった。反応混合物中のmTF及びFVIIaの濃度は、各々150μg/ml(膜タンパク質濃度)及び1nMであった。反応混合物の100μlアリコートを30分間隔で取り、125μlの30mMEDTAバッファー-60%(v/v)エチレングリコールを含む96ウェルのプレート(コスター)中でクエンチした。5mMのFIX基質#299を25μl添加した後、FIXaアムジオリチック活性を、動力学的ミクロプレートリーダー(Molecular Devices, Menlo Park, CA)上において405nmで測定した。試験した抗体による阻害は、FIXa生成の速度分率(vi/vo)として表示した。FIXabでの標準曲線を用いて、TF:FVIIa及びFXIaアッセイの両方において、反応時間中にチモーゲンFIXの15%未満が変換されたことが示された。
【0088】
結果
10C12の阻害メカニズム
FXIa及びTF:FVIIa複合体に媒介されたFIX活性化に対する10C12の効果を試験した。近年、Stuerzebecher等 (1997), Febs lett. 412: 295-300, 及びNeuenschwander等 (1997), Thromb. Haemostasis 78: (suppl.): 428は、エチレングリコールが或る型の色素生産性基質へのFIXaアミドリチック活性を向上させることを報告した。新たに生成されたFIXaのアミドリチック活性を向上させるためのエチレングリコールを用いたFIX活性化アッセイが導かれた。FIG10Aに示すように、10C12は、FXIaによるFIXのFIXaへの変換を濃度依存的方式で阻害した(IC5028.8±1.7μg/ml; ±SD)。ロイシンジッパーF(ab')2としてフォーマットした対照抗体である抗-ネウロツリン(NTN)は効果が無かった。10C12はFIX及びFIXaのGlaドメインに結合するので、10C12は、アッセイにおける生成されたFIXaの濃度を測定するために使用される小さな色素生産性基質を切断するFIXaの能力を妨害することが予測された。この仮定を確認するために、FIXaの濃度を上げて100μg/mlの10C12とともにインキュベートし、FIXa基質でアッセイした。10C12はFIXaによる基質切断速度を変化させず、10C12はFIXのFXIa依存的活性化のみを阻害し、FIXaアミドリチック活性を阻害しないことをしめしている。
【0089】
さらに、10C12のFIXの外因性活性化に対する効果を、再脂肪化TF(1-243)とFVIIaの複合体を用いて測定した。10C12はFIXの変換を34.2±1.6μg/mlの半最大阻害で阻害したが、対照抗体(NTN)は効果が無かった(FIG10B)。次いで、膜TF(mTF)を再脂肪化TF(1-243)に代えて使用した。再脂肪化TF(1-243)でのアッセイに関しては、使用した又はTFの濃度はFVIIa酵素活性に対して飽和していた。結果は、10C12によるFIX活性化の阻害は、再脂肪化TF(1-243)に比較して幾分低いIC50濃度(15.4±0.7μg/ml; ±SD)で同様に阻害されることを示した(FIG10B)。FIXに対する10C12の特異性を更に評価するために、他の2つのGla含有凝固因子であるFVIIa及びFXの機能の阻害を試験した。再脂肪化TF(1-243):FVIIa(0.2nM/0.04nM)によるFX(200nM)活性加速度は、10C12をFVIIa又は基質FXとともに20分間インキュベートした後に測定した。10C12は、200μg/mlまで、何れの実験設定においてもFXa生成を阻害せず、10C12抗体の特異性が確認された。
モルモット/ラット血漿におけるFIX-依存的凝固の特異的阻害。10C12によるヒトFIXの特異的阻害がモルモット及びラットにおいて維持されるか否かを試験した。10C12をラット及びモルモットのクエン酸化血漿からの血小板欠乏血漿とともにインキュベートし、APTT及びPTに対する影響を測定した。10C12は、モルモット及びラット血漿の両方においてAPTTを特異的に延長させた(FIG11)。2倍のAPTT延長は、モルモット及びラットで各々65μg/ml(650nM)及び60μg/ml(600nM)であった。これらの能力は、10C12が60μg/mlで2倍延長を与えるヒト血漿におけるものと殆ど同一であった。対照抗体(NTN)はAPTTにもPTにも効果が無かった。これらのデータは、10C12がモルモット及びラットの血漿中でFIX/IXaに結合して中和するが、不変のPTによって示されているように、その特異性を維持することを示唆している。10C12の観察された種交差反応性及び特異性により、我々は、モルモット及びラットにおける確立された血栓形成モデルでの抗血栓活性を試験した。
【0090】
実施例8
抗-IX/IXaの投与は、凝固又は出血パラメータに影響することなく、損傷頸動脈における還流変化を防止する。
方法
ロイシンジッパー10C12F(ab')2抗体の産生及び精製。クローン10C12の可変重鎖及び軽鎖をコードするcDNAをPCRにより増幅し、当量重鎖(Fd')及び軽鎖(ラムダ)定常領域(Carter等 (1992) Bio/Technology 10:163-167)並びに定常重鎖配列の3'末端に付加されたロイシンジッパー配列(Kostelny等 (1992), J. Immunol. 148: 1547-1553)の両方を含む発現ベクターにサブクローニングした。このベクターを、株W3110から誘導された大腸菌K12株33B6(fhuA phoA-delta-E15delta(argF-lac)169 deoC2 degP41(deltaPstI-kanR) IN(rrnDrrnE)1 ilvG2096)中で発現させた。細胞を、通気した60リットル発酵器において、最初に12mg/lのテトラサイクリン、12g/lの消化カゼイン、5mMのグルコース、47mMの(NH4)2SO4、250mMのFeCl3、及び各40mMのZnSO4、MnSO2、CuSO4、CoCl2、H3BO3、及びNaMoO4を含む媒体中で30℃において46時間増殖させた。発酵は、アンモニア:ロイシン(モル比35:1)の自動化供給を受けてpHを7.0に維持され、グルコースで最高速度に調節されて酢酸塩の蓄積を防止した。操作条件は、3mmol/l-分での酸素供給に十分であった。発現は、リン酸塩飢餓により誘発した。最終細胞密度は160OD550であった。回収した大腸菌細胞ペレットは、-70℃で凍結保存した。凍結ペレットを木槌で小片に破砕し、5容量の20mMのMES(2-{N-モルホリノ}エタン-スルホン酸)/2Mの尿素/5mMのEDTA/0.25MのNaCl、pH5.0(抽出バッファー)と、ウルトラツラクス(ultraturax)組織ホモジナイザーを用いて均質な懸濁物になるまで混合した。次いで細胞懸濁物をホモジナイザー(Model 15M, Gaulin Corp. Everett, MA)に通して細胞を破壊した。混合物のpHを6NのHClで3.5に調節することにより抽出物を透明化し、6000xgで20分間遠心分離した。上清のpHをNaOHを用いて再度調節した。上清を、4部の20mMのMES/2Mの尿素、pH5.0で希釈してクロマトグラフィー用の条件付けをし、0.2ミクロンフィルター(Millipore Corp., Bedford, MA)を通して濾過し、希釈バッファーで平衡化したSP-セファロース急速カチオン交換樹脂に適用した。カラムを同じバッファー、次いで20mMのMES、pH5.0で入念に洗浄した。カラムを、20mMのMES中の0.5MのNaCl及び1MのNaClを用いて2段階で溶離した。10C12ロイシンジッパーF(ab')2を、1MのNaCl/20mMのMES分画中で回収した。SP-セファロースプールを、プロテインG−セファロース急速カラムに多数サイクルで負荷した。カラムを20mMのTris/0.5MのNaCl、pH7.5で平衡化して洗浄した。溶離は0.1Mの酢酸/0.15MのNaCl、pH3.0で行い、各サイクル後に20mMのTris/2MのグアニジンHCl、pH7.5でカラムを再生した。合わせたプロテインGプールを、YM30膜を具備するアミコン撹拌細胞システム(Amicon Inc., Beverly, MA)を用いて約20倍に濃縮した。濃縮したプールを、20mMのNaPO4/0.15MのNaCl、pH7.0で走らせたセファデックスG25を用いてバッファー交換した。G25プールを、20mMのNaPO4/0.15MのNaCl、pH7.0中でQ-セファロース急速カラムに通しでエンドトキシンを除去した。最終的なプールは、12.5EU/mgのタンパク質を含み、0.22ミクロンフィルターを通した。
全ての実験についての対照抗体として、抗ネウロツリンロイシンジッパーF(ab')2抗体(NTN)を使用した。また、この抗体を大腸菌で産生させ、プロテインG急速カラムで精製した。ロイシンジッパー対照F(ab')2及びロイシンジッパー10C12F(ab')2は、単に抗-ネウロツリン抗体(NTN)及び10C12抗体と称する。両方の抗体の分子量は100,000と計算された。
【0091】
モルモットにおける動脈血栓形成モデル。実験は、Carteaux等 (1995), Circulation 91: 1568-1574に記載されているように実施した。GOHI雄モルモット(350-450g, BRL, Fullinsdorf, スイス)を、40mg/kgのケタミンHCl(Ketasol 100(登録商標), Graub AG, Bern, スイス)及び5mg/kgのキシラジン2%(Rompun(登録商標), Bayer AG, Leverkusen, ドイツ)のi.m.注射により麻酔した。カテーテル圧トランデューサ(Millar 2F Mikro-Tip SPC-320 Millar Instr. Inc. Houston, TX)を、血圧及び心拍測定のために右側の大腿動脈に挿入した。左側の大腿動脈には、血液サンプリング用のカテーテル(TriCath In 22G, Codan, Espergaerde, DK)を配置した。左側の頸静脈カテーテル(TriCath In 22G)も薬物投与のために挿入した。右側頸動脈を切開し、0.8mm径のシリコーンカフ型ドップラー流速プローブ(タイプD-20-0.8, Iowa Doppler Products, IA)を20MHzのパルス化ドップラー流速計モジュール(システム6-モデル 202、Triton technology, Inc. Sandiego CA)に接続して血液流速を監視した。血圧(mmHg)、心拍(拍/分)及び頸動脈血液流速(ボルト)を、グラフテック線形レコーダーVII(モデル WR 3101, Hugo Sachs, March-Hugstetten, ドイツ)に記録した。
【0092】
モルモットには、食塩水、10C12又は対照抗体(NTN)の一回ボーラスを、左側頸静脈カテーテルを通して受容させ、15分後に血管損傷を開始した。既に記載されているように(Carteaux等 (1995), 上掲; Roux等 (1994), Haemostasis 71: 252-256)、ドップラー流速プローブから2ミリメートルで、介した頸動脈の1mmセグメントをゴム被覆した鉗子で10秒間挟み込むことにより内皮下に損傷を誘導した。損傷後、頸動脈血液流速は典型的には低下して完全な閉塞となるが、損傷領域を優しく揺すって血栓を遊離させると流動が回復した。還流変化(CFV)のパターンは、イヌ冠動脈血栓モデルにおいてGolts (1991), Circulation 83: Supple. IV: 3-14)に記載されたものと同様に確立した。5分間にCFVが観察されなかった場合、第1の損傷の頂点に追加の挟み込みを実施した。同じ方法を、CFVが起こるまで5分ごとに繰り返した。最後に、CFVを生じるのに要した挟み込みの数を40分の観察時間に渡って数えた。幾つかの挟み込みは、頸動脈の内皮下層の血栓原性を増大させると仮定され、よって血栓指数は挟み込みの数に対するCFVの数の比率として計算した(Carteaux等 (1995), 上掲)。これらの実験条件下で、計算した頸動脈の剪断速度は、およそ1500-2800s−1であった(Roux等 (1994), 上掲)。
阻害剤投与の前(前値)及び薬物投与の60分後(後値)に、活性凝固時間(ACT)
、プロトロンビン時間(PT)活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)及び血液細胞計数のために血液を回収した。これらの動物において、前-及び後-実験時間において爪角質出血時間も測定した。血栓開始及び試料回収時間は、試験的な薬物動態学実験に基づいており、そこでは、APTTの延長がIVボーラス投与(5mg/kg、n=2)の15分以内に最大に達し、続く2時間に渡って実質的に不変でいじされた。試料の取扱い、凝固アッセイ及び出血時間法は以下に説明する。
【0093】
モルモットにおける角質出血時間測定。角質出血法は、凝固依存的出血のイヌ(Giles等 (1982), Blood 60: 727-731)及びウサギ(9)kelley等 (1997), Blood 89: 3219-3227; Himber等 (1997), Haemostasis 78: 1142-1149)モデルから採用した。爪角質の頂点においてハサミを用いて普通に切断した。手足を38℃の水面に接触させることにより、血液を流れるままにしておいた。角質出血時間は、切開した角質からの血流が続く時間量と定義した。この方法は、投与前及び後(60分)測定の両方で3回実施した。処理前に対する処理後の比率を、処理後値の平均を処理前値の平均で除することにより計算した。
結果
モルモットにおける10C12の抗血栓及び止血効果。10C12のインビボでの抗血栓力を評価するために、既に確立されている還流変化(CFV)のモルモット動脈血栓モデルを使用した。食塩水を受容した12の対照動物では、40分の測定時間中のCFV数は11.2±1(±SEM)であり、計算した血栓指数は9.3±1.5であった。対照抗体(NTN)の投与は、13.7±1.8CFV及び12.5±2.11の血栓指数を与えた。これらの血栓形成及び止血の終点は対照食塩水と有意に相違していた。従って、食塩水及びNTN対照データは、続く10C12処理との比較のためにプールした。プールした対照の平均(±SEM)血栓指数は10.4±1.2であった。FIG12に示すように、10C12濃度を上げながらのボーラス投与は、CFVの用量依存的減少をもたらし、6μg/kgで高い有意な減少(p<0.01)及び60μg/kgでCFVの完全な阻害に達した。1000μg/kgを含む試験した全ての用量で、血圧、心拍、ヘマトクリット、及び血液細胞数は不変で維持された(データは示さず)。同様に10C12は、1000μg/kgまではAPTT、ACT又はPTに対して有意な効果(クラスカル-ワリス試験でp>0.05)は無かった(表I)。しかし、PTではなくAPTT及びACTにおいて用量依存的増加があり、個々の用量群を対照に比較するのに2-テイルt-試験を用いた場合、1000μg/kgにおいて統計的有意性(p≦0.01)に達した。
【0094】
A 測定は、Rx投与の前(処理前)及び60分後(処理後)に行った。
B 食塩水対照及び対照抗体(NTN)実験からのプールしたデータ。
正常な止血に対する10C12の効果を、イヌ及びウサギにおいて凝固依存的であることが既に示されている角質出血時間の測定により評価した。出血時間は、10C12投与前(前値)及び実験の終了時(後値;ボーラス投与の60分後)に測定した。潜在的な抗抗血栓効果に関わらず、10C12は角質出血時間を延長させなかった。1000μg/kgでさえも、角質出血時間は不変で維持された(表I)。初期野路店での角質出血時間に対する最高用量(1000μg/kg)の効果は、モルモットの別々の群で評価した。これらの実験において、角質出血時間、再出血の発生及び全血液損失を処理後60分ではなく1分で測定した。表IIに示すように、10C12処理群では、これらのパラメータが増大する傾向がある。しかし、満足に有意に増大した場合は無かった。さらに、殆どの場合(9対照のうち8及び6の10C12処理のうち4)で、一次的止血が完了した後に出血は完全に止まった。
【0095】
A 測定はRx投与後1分に行った。
B 出血に初期中止後に角質終結症状を持つ動物の数。
C 30分間に流れた全血液量(角質横断面から)。
D 食塩水対照及び対照抗体(NTN)実験からのプールしたデータ。
【0096】
実施例9
動脈血栓形成モデルにおいて抗-IX/IXaglaドメイン抗体の投与は凝血塊重量及び血管閉塞時間を減少させる。
方法
ラットにおけるFeCl3誘発動脈血栓形成モデル。Kutz等 (1990), Thromb. Res. 60: 269-280のモデルを次のように修正した。投与及びサンプリングカテーテル(PE 50ポリエチレンチューブ、Becton Dickinson and Co., Sparks, ML)を、イソフロラン麻酔したSprague Dawleyの雄ラット(Harlan Labs, Indianapolis, IND)の頸静脈及び動脈に配置した。ラット体重は420から460グラムであった。体温は、外科手術及び実験期間を通して37℃に維持した。頸動脈を周囲の組織を含まないように切開し、超音波流速プローブ(Transonic IR, Transonic Systems Inc., Itheca, NY)を心臓に近接した動脈に配置し、プローブに露出した頭側動脈の周囲に70%のFeCl3で飽和した3mm径の濾紙円盤を具備するスリットポリエチレンチューブを配置することにより血栓を誘発した。円盤の配置前及び60後に血流を監視した。10C12、NTN又はヘパリンを、注射用に無菌食塩水で適当な濃度に希釈した。10C12及びNTNの種々の用量を、1mlの一回ボーラスとして投与した。ヘパリンを負荷ボーラス(100U/kg)として投与し、次いで65分の定常注入をした(全容量2ml)。ヘパリン投与の対照は、同じ時間で同じ容量を投与する食塩水からなる。全ての処理は、静脈カテーテルを介して円盤配置の5分前に投与した、1分(NTN及び10C12処理)及び30分(食塩水及びヘパリン処理)の投与後の尾の出血時間を次のように測定した。60分において動脈を切除し、存在する全ての血栓を取り出し、濾紙にブロットして秤量した。記録した血栓形成終点は、閉塞の開始及び期間、及び血栓重量であった。血液試料を投与前及び投与後1、35及び65分に動脈カテーテルから取り出した。これらの試料を、PT、APTT及びACTについて記載したように分析した。
【0097】
ラット血栓形成モデルにおける尾の出血時間及び血液損失の測定。尾の出血時間は、Dejana等 (1982), Thromb. Haemostasis 48: 108-111に記載されたフリーハンド横切開法を修正して測定した。実験期間中、ラットを高架式のプラットフォームに仰臥位に固定してその尾を身体の面に垂直とした。温度制御した水再循環器(American Medical Systems, Cincinnati, OH)に接続した水ジャケットコンデンサー(Kontes Glass, Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL)の管腔内に通して尾を配置し、その温度を37℃に維持した。この配置で、約10mmの尾片を横切開用に入手可能である。尾の出血時間を、獣医用爪切り(#400の刃を具備するResco model 727, Tecla Co Inc, Walled Lake MI)で5mmの尾片を横切開した後に測定した。この方法を、投与後1分(NTN及び10C12処理)及び30分(食塩水及びヘパリン)に実施した。これらのサンプリング時間は、各々の試験紙薬の投与に用いられたボーラス及び注入計画について試験試薬の血液濃度、従って止血効果が最大に近いと仮定される時間に一致するように選択した。血液滴を30秒毎に予め秤量した極微菌チューブに回収した。出血時間を、出血が完全に抑止される前の時間又は形成するのに>30秒を要する滴として記録した。この時点で、第2のチューブを尾の下に配置して、尾の横切開後30分までに流れた更なる血液(二次的血液損失)を回収した。この30分の回収時間の後、傷を焼灼して更なる血液損失を防止した。30分間に失われた全血液量は、2本のチューブに回収した血液の重量を加算して決定した。
【0098】
モルモット及びラットにおける更なる角質出血時間尾血液損失実験。10C12処理に対するモルモット角質出血及びラットの尾の出血の仕方に相違があるので、この不一致の原因を同定するために更なる出血実験を実施した。これらの更なる実験において、モルモット及びラット両方における出血測定に同じ方法論を使用した。簡潔に言えば、各血栓形成モデルで記載したように動物を麻酔して投与カテーテルを配置した。しかし、血液試料、血圧又は血栓測定は行わなかった。対照(食塩水又はNTN)又は1000μg/kgの10C12をIVボーラスとして投与した1分後に、角質を横切開して出血時間、再出血及び全血液損失を上記のラットの尾の出血アッセイについて記載したように測定した。
【0099】
結果
ラットにおける10C12及びヘパリンの抗血栓及び止血効果。ラットのFeCl3誘発動脈血栓形成モデルにおける10C12及びヘパリンの効果を試験した。抗血栓形成効果は、FeCl3適用後60分間の間の血管閉塞の発生及び期間を測定することにより評価した。さらに、実験終了時に回収された血栓の重量を測定した。食塩水対照及び10C12処理ラットの代表的な頸動脈血流追跡をFIG13に示した。対照抗体(NTN2000μg/kg)のボーラス投与の後は、血栓形成及び止血終点は食塩水対照から有意な相違は無かった。従って、食塩水及びNTN対照のデータを、続く10C12及びヘパリン処理との比較のためにプールした。閉塞は、10の対照動物のうちの10で、14.1±1.5分の平均時間で生じた。再閉塞の前に動脈瘤が簡単に回復した1の動物を除いて、閉塞は実験の残り時間に渡って続いた。対照の凝血塊重量は2.8±0.2mgであり、血管閉塞の時間は44.7±2.6分であった(FIG14)。500μg/kgでの10C12の投与は、パラメータにも閉塞発生にも効果がなかった(5中の5)。1000μg/kgでは、閉塞の発生は5中の2に抑制し(対照に対してP≦0.05)、凝血塊重量を0.66±0.17mgに減少し(対照の23.6±6.1%)、血管閉塞の時間は9.6±8.9分に短縮した(対照の21.5±19.9%)(FIG14)。2000μg/kgの最高容量では、10C12は、閉塞の発生を5中の0に抑制し(対照に対してP≦0.001)、平均凝血塊重量を0.26±0.08mgに減少させた(対照の9.2±2.3%)(FIG14)。APTT/PT/ACTに対する効果は、薬物投与前及び後の複数の時点で取った血液試料での測定から決定した。これらのパラメータは、60分間の投与後時間中安定に維持されたので、投与後30分の値を投与前値との比較に選択した。10C12は、小幅な、濃度依存的はAPTT及びACTの延長を生じさせたが、PTは影響を受けず(表III)、インビボにおける10C12の特異性を示している。これに比較して、ヘパリン(100U/kgボーラス及び1U/kg/分の注入速度)の投与は、ACT及びPTへの影響に加えてAPTTに劇的に影響を与え(表III)、凝血塊重量の完全な減少及び血管開存性の回復は無かった(FIG14)。
【0100】
A 測定はRx投与前及び35分後に行った。
B 食塩水対照及び対照抗体(NTN)実験からのプールしたデータ。
* P=0.05、** P=0.01(クラスカル-ワリス試験後のマン-ホイットニーのポストhoc)
【0101】
表IVに示すように、抗血栓的に活性な用量の10C12は尾の出血時間を延長させた。しかし、全血液損失に対する10C12の主要な効果が観察された。対照動物では、横切開された尾での一次的止血は2.0±0.3分後に完了し、この時間中に回収された血液重量は31.1±9.4mgであった。横切開されたモルモットに対して、全ての対照の尾損傷は血液の滲出が続くか(0.5分当たりに1滴の血液未満の速度)、又は断続的な再出血が始まる場合もあった。滲出及び/又は再開した出血にも関わらず、この二次的時間中の平均血液損失は、血液が回収された時間(平均=48分)に対して少なかった(57.1±32.0mg)。10c12の投与は、この二次的血液損失を悪化させ、よって全血液損失を増加させる(表IV)。動物と動物の間の変動はかなりあったが、二次的血液損失は用量依存的に増加し、その増加は試験した全ての用量で統計的に有意であった。維持滴血液損失は有意に影響されなかった。ヘパリンも、累積血液損失を増加させた。しかし、10C12とは異なり、この増加した出血は主に止血プラグ形成の遅延により、延長した尾の出血時間尾増加した一次的血液損失に反映されている(表IV)。
【0102】
A 測定はRx投与前及び35分後に行った。
B 終結時間測定中に流れた血液の量。
C 初期出血の停止後から尾の横切開後30分までに流れた血液の量。
D 30分間に流れた全血液の量(尾の横断面から)。
E 食塩水対照及び対照抗体(NTN)実験からのプールしたデータ。
* P=0.05、** P=0.01(クラスカル-ワリス試験後のマン-ホイットニーのポストhoc)
【0103】
ラット角質出血。モルモット角質及びラットの尾における10C12投与後の血液損失のパターンが相違しているので、異なる角質出血実験を別々の群のラットで実施した。ラットの尾の出血実験におけるように、対照及び処理(1000μg/kgの用量の10C12)動物の両方で、横切開角質において滲出及び/又は再出血が生じた。しかし、尾の出血アッセイとは異なり、10C12はラットの角質で二次的出血を促進せず、角質終結時間、採出血の発生又は全血液損失は、対照及び10C12処理動物の間で相違しなかった(表II)。
【図面の簡単な説明】
【FIG1A及び1B】 Glaドメイン配列。様々な種:ヒト、配列番号:5;イヌ、配列番号:2;マウス、配列番号:3、ウサギ、配列番号:4(FIG1A)からのGlaドメイン、及び種々のヒト凝固タンパク質:因子IX、配列番号:5;因子X、配列番号:6;因子VII、配列番号:7;プロテインC、配列番号:8及びプロトロンビン、配列番号:9(FIG1B)のGlaドメインの間の配列相同性。非相同残基は太字のタイプフェイスで示した。
【FIG2】 V遺伝子セグメント用法及び選択したscFvのCDR配列。10C12のものと異なる残基は太字タイプで示した。10C12重鎖:CDR1、配列番号:10;CDR2、配列番号:11;CDR3、配列番号:12。10C12軽鎖:CDR1、配列番号:13;CDR2、配列番号:14;CDR3、配列番号:15。11C5重鎖:CDR1、配列番号:10;CDR2、配列番号:16;CDR3、配列番号:17。11C5軽鎖:CDR1、配列番号:13;CDR2、配列番号:14;CDR3、配列番号:15。11G9重鎖:CDR1、配列番号:10;CDR2、配列番号:18;CDR3、配列番号:19。11G9軽鎖:CDR1、配列番号:13;CDR2、配列番号:14;CDR3、配列番号:15。13D1重鎖:CDR1、配列番号:10;CDR2、配列番号:20;CDR3、配列番号:12。13D1軽鎖:CDR1、配列番号:13;CDR2、配列番号:14;CDR3、配列番号:15。13H6重鎖:CDR1、配列番号:21;CDR2、配列番号:22;CDR3、配列番号:23。13H6軽鎖:CDR1、配列番号:24;CDR2、配列番号:25;CDR3、配列番号:26。14H9重鎖:CDR1、配列番号:27;CDR2、配列番号:28;CDR3、配列番号:29。14H9軽鎖:CDR1、配列番号:30;CDR2、配列番号:31;CDR3、配列番号:32。
【FIG3】 選択した抗-FIX F(ab')2のヒトFIX/FIXaに対する親和性:ヒトFIXは、バイオセンサーチップに供給者の記載(BIAcore Inc., Piscataway NJ)に従ってカップリングした。親和性は、BIAcore-2000(商品名)表面プラスモン共鳴システム(Pharmacia Biosensor)を用いて測定した結合及び解離定数から計算した。
【FIG4】 scFvの全長FIXに対する結合。プレートを10μg/mlの9E10抗-C-myc mAbで被覆した。scFvの連続希釈物(10μg/ml〜5ng/ml)を各ウェルに1時間、次いでビオチニル化因子IX(1μg/ml)及びストレプトアビジン-HRPを添加した。
【FIG5A及び5B】 FIXのウシ大動脈内皮細への結合及び血小板依存性凝固に対する影響。FIG5Aにおいて、アッセイは、10mMHepes、137mMNaCl、4mMKCl、11mMグルコース、2mMCaCl2、5mg/mlウシ血清アルブミン、pH7.5(アッセイ用バッファー)100μl中、4℃において実施した。ウシ大動脈内皮(BAE)細胞の単層を、使用前にCaCl2を含まないアッセイ用バッファーで1回洗浄した。scFvを100μlバッファー中のビオチニル化ヒトFIXとともに1時間プレインキュベートし、次いでBAE細胞に2時間添加し、洗浄し、100μlの3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン/H2O2(Kirkgaard & Perry)基質とともに10分間インキュベートした。100μlの1MのH3PO4で反応を停止し、450nmで光学密度を読んだ。FIG5B−洗浄したヒト血小板をアデノシン二リン酸(ADP)によって活性化し、III型コラーゲンに接着させた後、scFv及びヒト再ミネラル化血小板欠乏血漿を添加した。凝固に対する影響は、405nmにおける光学密度の増加を測定することにより90分間に渡って監視した。示したのは、500nMの血漿密度におけるscFvの影響である。
【FIG6A及び6B】 抗-FIX scFv及びF(ab')2の結合特異性。Elisaプレートを因子IX、因子X、因子VII、プロトロンビン、又はプロテインCで1μg/mlにおいて被覆した。scFv(FIG6A)及びF(ab')2(FIG6B)を、各々5μg/ml及び0.02μg/mlで1時間添加した。この工程に続いてビオチニル化9E10抗-C-myc mAb(2μg/ml)、次いでストレプトアビジン-HRPを添加した。因子IX+血清:scFvをFIX欠失血清(因子IX残余活性1%未満)とともに氷上でプレインキュベートした後、プレートを被覆したFIXとともにインキュベートした。全てのELISAバッファーは2mMのCaCl2を含む。
【FIG7A及び7B】 血小板依存性凝固アッセイにおける2つの抗-FIX-F(ab')2-leuジッパー断片の比較。コラーゲン接着活性化ヒト血小板を異なる濃度の10C12F(ab')2-leuジッパー(FIG7A)及び13H6F(ab')2-leuジッパー(FIG7B)とともにインキュベートし、再ミネラル化したヒト血漿を添加して凝固過程を開始させた。抗体当たり6種の異なる濃度を試験し、そのうち3種を各グラフに示した。各値は、3つの独立した実験の平均±SDを示す。100分の時点におけるOD値を用いて対照値(非阻害凝固)を100%に設定して、阻害曲線からIC50値を計算した。10C12、IC50=59±3nM;13H6、IC50=173±43nM。白丸:1000nM、白四角:250nM、菱形:62.5nM、黒三角:15.6nM、黒丸:対照。
【FIG8】 抗-FIX F(ab')2-leuジッパーによるFXのFIXa依存的活性化の阻害。抗体をFIXa、FIIIa及びリン脂質とともに20分間インキュベートし、その後FXを添加した。FXaの生成速度は、異なる時点で色素生産性基質S2765を用いてFXa濃度を測定した後に計算した。抗体による阻害は、速度分率(FXa生成の阻害されない速度で除した阻害)で表した。抗体10C12(四角)、13H6(菱形)及び無関係な対照抗体抗-ネウルツリン(neurturin)(丸)の濃度は、FXを含む最終反応混合物のものである。
【FIG9A及び9B】 10C12F(ab')2-leuジッパーの活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)及びプロトロンビン時間(PT)に対する影響。FIG9Aにおいて、抗体をヒト血漿とともに37度で10分間インキュベートし、APTT及びPTをACL300上で測定した。示したのは、10C12F(ab')2-leuジッパー(四角)及び13H6F(ab')2-leuジッパー(丸)によるAPTT(黒印)PT(白印)である。図9Bにおいて、10C12F(ab')2-leuジッパーを異なる種の血漿とともに37℃で10分間インキュベートし、APTT及びPTをACL300上で測定した。示したのは、ヒト(丸)、ラット(菱形)、イヌ(四角)及びウサギ血漿(反転三角)のAPTT(黒印)及びPT(白印)である。
【FIG10A及び10B】 FXIa及び組織因子:因子VIIa(TF:FVIIa)複合体によるFIX活性化。FIX(400nM)を、10C12(黒印)又は対照抗体(NTN:抗-ネウルツリン)(白印)とともにHBSA-5mMCaCl2中でインキュベートした。FIG10A:1nMのFIXaを添加して反応を開始させた。FIG10B:再脂質化(relipidated)TF:FVIIa(4nM:1nM)(丸)又は膜TF:FVIIa(150μg/ml:1nM)(四角)を添加して反応を開始させた。所定時間間隔で反応アリコートをEDTA-エチレングリコール中に希釈し、FIXa基質#229を添加した後に各試料のFIXaアムジオリティック(amdiolytic)活性を測定した。FIXa生成速度の阻害は、3−4の独立した実験の速度分率(vi/vo)±SDで表した。
【FIG11】 モルモット及びラットの血漿における活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)及びプロトロンビン時間(PT)の測定。10C12をモルモット及びラットのクエン酸化血漿中に希釈した。10分間のインキュベーションの後、ヒト再脂質化組織因子(Innovin)又はアクチンFSを添加して、各々PR(白印)及びAPTT(黒印)反応を開始させた。凝固への影響は、対照血漿凝固時間延長の倍数により表した。菱形=モルモット;丸=ラット。
【FIG12】 10C12のモルモット動脈血栓症モデルにおける還流変化(CFVs)に対する影響。10C12及び対照を頸動脈のCFVs開始の15分前に静脈内ボーラス投与により与えた。40分間のCFVsの数を記録し、血栓症指標を適用したピンチの数で除したCFVsの割合として計算した。クラスカル-ワリス試験における複数群間の有意な差の測定に続くマン-ホイットニーU-検定による対照に対して**p≦0.01、***p≦0.001。
【FIG13】 ラットにおけるFeCl3処理の頸動脈血流に対する影響。FeCl3飽和円盤の配置前に食塩水又は10C12で処理したラットにおける代表的頸動脈血流追跡。閉塞血栓症は10の対照処理ラットの10匹で誘発され、2mg/kgの10C12のivボーラスで処理した5ラットでは0匹であった。
【FIG14A及び14B】 ラットにおけるFeCl3誘発動脈血栓症モデルでの血栓形成に対する10C12及びヘパリンの影響。10C12及び対照をボーラスとして、ヘパリンを100U/kgボーラスとして与え、次いで露出した動脈にFeCl3-円盤を配置する5分前に1U/kg/分の速度で注入した。FIG14A:凝塊重量に対する影響は、薬物投与開始の65分後に血栓を取り出して秤量することにより定量化した。FIG14B:血栓閉塞時間に対する影響は、FeCl3-円盤の配置に続いてゼロ流動が起こる時間を測定する事により決定した。クラスカル-ワリス試験における複数群間の有意な差の測定に続くマン-ホイットニーU-試験による対照に対して**p20.01。
Claims (15)
- 因子IX/IXaのGlaドメインと反応性のヒト抗体又は抗体断片を含む組成物であって、該抗体又は抗体断片が、
CDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、lc−CDR1、lc−CDR2及びlc−CDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む親抗体又は抗体断片であって、
CDR1のアミノ酸配列が配列番号:10を含み;CDR2のアミノ酸配列が配列番号:11を含み;CDR3のアミノ酸配列が配列番号:12を含み;
lc−CDR1のアミノ酸配列が配列番号:13を含み;lc−CDR2のアミノ酸配列が配列番号:14を含み;lc−CDR3のアミノ酸配列が配列番号:15を含む親抗体又は抗体断片である、組成物。 - 因子IX/IXaのGlaドメインと反応性のヒト抗体又は抗体断片を含む組成物であって、該抗体又は抗体断片が、
CDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、lc−CDR1、lc−CDR2及びlc−CDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む親抗体又は抗体断片であって、
CDR1のアミノ酸配列が配列番号:10を含み;CDR2のアミノ酸配列が配列番号:16を含み;CDR3のアミノ酸配列が配列番号:17を含み;
lc−CDR1のアミノ酸配列が配列番号:13を含み;lc−CDR2のアミノ酸配列が配列番号:14を含み;lc−CDR3のアミノ酸配列が配列番号:15を含む親抗体又は抗体断片である、組成物。 - 因子IX/IXaのGlaドメインと反応性のヒト抗体又は抗体断片を含む組成物であって、該抗体又は抗体断片が、
CDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、lc−CDR1、lc−CDR2及びlc−CDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む親抗体又は抗体断片であって、
CDR1のアミノ酸配列が配列番号:10を含み;CDR2のアミノ酸配列が配列番号:18を含み;CDR3のアミノ酸配列が配列番号:19を含み;
lc−CDR1のアミノ酸配列が配列番号:13を含み;lc−CDR2のアミノ酸配列が配列番号:14を含み;lc−CDR3のアミノ酸配列が配列番号:15を含む親抗体又は抗体断片である、組成物。 - 因子IX/IXaのGlaドメインと反応性のヒト抗体又は抗体断片を含む組成物であって、該抗体又は抗体断片が、
CDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、lc−CDR1、lc−CDR2及びlc−CDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む親抗体又は抗体断片であって、
CDR1のアミノ酸配列が配列番号:10を含み;CDR2のアミノ酸配列が配列番号:20を含み;CDR3のアミノ酸配列が配列番号:12を含み;
lc−CDR1のアミノ酸配列が配列番号:13を含み;lc−CDR2のアミノ酸配列が配列番号:14を含み;lc−CDR3のアミノ酸配列が配列番号:15を含む親抗体又は抗体断片である、組成物。 - 因子IX/IXaのGlaドメインと反応性のヒト抗体又は抗体断片を含む組成物であって、該抗体又は抗体断片が、
CDR1、CDR2及びCDR3アミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、lc−CDR1、lc−CDR2及びlc−CDR3アミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む親抗体又は抗体断片であって、
CDR1のアミノ酸配列が配列番号:21を含み;CDR2のアミノ酸配列が配列番号:22を含み;CDR3のアミノ酸配列が配列番号:23を含み;
lc−CDR1のアミノ酸配列が配列番号:24を含み;lc−CDR2のアミノ酸配列が配列番号:25を含み;lc−CDR3のアミノ酸配列が配列番号:26を含む親抗体又は抗体断片である、組成物。 - 請求項1ないし5の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片をコードする単離された核酸。
- 請求項6に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項7に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項8に記載の宿主細胞を、前記抗体又は抗体断片をコードする核酸が前記抗体又は抗体断片を発現する条件下で培養することを含んでなる抗体又は抗体断片の製造方法。
- (a)容器;
(b)前記容器上のラベル;及び
(c)前記容器内に収容された請求項1ないし5の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片を含む組成物を含んでなり、当該組成物が、凝血疾患の治療に有効であり、前記容器上の任意のラベルが当該組成物が凝固障害疾患の治療に使用できることを表示する製造品。 - 請求項1ないし5の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片を含む、哺乳動物における深部静脈血栓症、動脈血栓症、不安定狭心症、心筋梗塞後、術後血栓症、冠動脈バイパス移植(CABG)、経皮経管冠動脈形成術(PTCA)、脳卒中、及びDICの治療のための医薬。
- 請求項1ないし5の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片を含む医薬品組成物。
- 請求項1ないし5の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片を含む、血栓溶解療法におけるアジュバント。
- 請求項1ないし5の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片を含む抗血栓剤。
- 請求項1ないし5の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片を含む抗血液凝固剤。
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