CN1317015A - 人抗因子IX/IXa抗体 - Google Patents

人抗因子IX/IXa抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN1317015A
CN1317015A CN99810083A CN99810083A CN1317015A CN 1317015 A CN1317015 A CN 1317015A CN 99810083 A CN99810083 A CN 99810083A CN 99810083 A CN99810083 A CN 99810083A CN 1317015 A CN1317015 A CN 1317015A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antibody
variable region
heavy chain
idno
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN99810083A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1183160C (zh
Inventor
C·W·亚当斯
B·德沃
D·L·伊顿
P·E·哈斯
J·K·朱迪斯
D·基希霍弗
S·萨格特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of CN1317015A publication Critical patent/CN1317015A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1183160C publication Critical patent/CN1183160C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

针对因子Ⅸ和因子Ⅸa尤其是人因子Ⅸ和因子Ⅸa的γ－羧基谷氨酸(Gla)区的人抗体或其片段。分离的核酸，编码所述的抗体或其片段。所述抗体或其片段的制备方法。含所述抗体或其片段的药物组合物，用治疗有效量的所述药物组合物治疗哺乳动物的方法。

Description

人抗因子Ⅸ/Ⅸa抗体
                          发明背景
                          发明领域
本发明涉及分离，鉴定，合成，表达和纯化与因子Ⅸ(FⅨ)/因子Ⅸa(FⅨa)反应，尤其是与FⅨ/FⅨa的Gla区反应的抗体。具体地说，本发明提供与人FⅨ/FⅨa的Gla区反应的抗体。本发明还涉及抑制FⅨ/FⅨa活化和抑制FⅨ/FⅨa依赖性凝血的组合物尤其是药物组合物，产品和方法。
相关内容的描述
因子Ⅸa是一种维生素K依赖性血浆丝氨酸蛋白酶，参与血液凝固的内源性和外源性路径。因子Ⅸa的NH2末端的43个氨基酸(Gla区)及含12个Gla残基的其酶原因子Ⅸ是通过Glu残基的维生素K依赖性羧基化形成的。Gla区后是两个上皮生长因子(EGF)型区域，再其后是羧基末端的丝氨酸蛋白酶区。
FⅨ/FⅨa的Gla区具有重要的结构决定基，它们与血管内皮细胞和血小板上的高亲合力结合位点相互作用(Heimark等，(1993)，生物化学生物物理学研究通讯，111:723-731；Ahmad等(1994)，生物化学33:12048-12055；Ryan等(1989)，生物化学杂志264:20283-20287；Toomey等(1992)，生物化学31:1806-1808；Cheung等(1992)，生物化学杂志267:20529-20531；Rawala-Sheikh等(1992)，血液79:398-405；Cheung等(1996)，美国科学院院报93:11068-11073；Prokok等(1996)，国际肽研究杂志48:281-285；Ahmad等(1998)，生物化学37:1671-1670)。在Ca2+和Mg2+存在下，FⅨ/FⅨa的Gla区会采取不同的构型。凝血反应，例如FⅨ/FⅨa介导的F活化，在活化血小板的表面高效率地进行(Ahmad和Walsh(1994)，心血管医学趋势4:271-277)。
已知，结合FⅨ/FⅨa的Gla区的抗体能抑制FⅨ/FⅨa的功能，例如细胞结合功能(Cheung等(1996)，同上；凝血活性(Sugo等(1990)，凝血研究58:603-614)和FⅪ引起的FⅨ/FⅨa活化(Sugo等(1990)，同上；Leiman等(1987)，生物化学杂志262:7605-7612)。已知家兔和鼠FⅨ/FⅨa的抗体能结合Gla区的C-和N-末端区域(Leiman等(1993)，欧洲生物化学杂志212:339-345和Sugo等(1990)，凝血研究58:603-614)。已知，与人FⅨ/FⅨa反应的抗体能抑制FⅨ活化成为FⅨa，并在FⅨa依赖性试验中抑制凝血(Blackburn等(1997)，血液90：增刊1：424a-425a)。活性位点被抑制的FⅨa在体内减弱血栓的生成(Wong等(1997)，血栓形成血液学77:1143-1147；Benedict等(1991)，临床研究杂志88:1760-1765；Spanier等(1998)美国胸心血管外科杂志115:1179-1188)。
发明概述
本发明提供与因子Ⅸ或因子Ⅸa的Gla区反应的分离的抗体，抗体片段，尤其是人抗体和抗体片段。较好的是，所述抗体或抗体片段能抑制与凝血因子Ⅸ或Ⅸa相关的活性。较好的是，本发明的抗体可用于制备含该抗体的有效药物组合物。所述药物组合物可制备成低剂量制剂，用来治疗急/慢性血栓形成性疾病而不影响正常的止血机能。
实施例之一中，本发明提供一种与人因子FⅨ/FⅨa，特别是人FⅨ/FⅨa的Gla区反应的抗体或抗体片段。代表性的抗体片段包括Fv,scFv,Fab,F(ab′)2片段，二抗体(diabodies)和线性抗体。这些片段可与例如“亮氨酸拉链”等其他序列融合，并具有可改进半衰期的PEG化序列或Fc变异体。代表性抗体或抗体片段具有3个互补决定区(CDR)，即CDR1,CDR2和CDR3。这些CDR多肽的氨基酸序列选自范例性抗体片段10C12,11C5,11G9,13D1,13H6和14H9及它们变异体的氨基酸序列。优选的抗体选自Ab1,Ab2,Ab3,Ab4,Ab5和Ab6，其中Ab1-6的CDR分别与10C12,11C5,11G9,13D1,13H6和14H9的CDR相对应。
实施例之一中，本发明的组合物是一种抗体多肽，而且，本发明还包括含有编码本发明多肽的分离核酸(最好是DNA)的组合物。就此而言，本发明还包括与DNA分子操作性连接的表达调控序列，包含DNA分子的表达载体(以质粒为佳)，其中的调控序列能被载体所在的宿主细胞识别，还包括含所述载体的宿主细胞。
本发明还包括所述抗体组合物的治疗性应用。因此，本发明包括一种药物组合物，它含有药学上认可的赋形剂和本发明抗体或抗体片段。本发明包括含有本发明抗体组合物的试剂盒和产品。所述试剂盒和产品宜包括：
(a)一个容器；
(b)所述容器上的标签；和
(c)装于所述容器内的含本发明抗体或抗体片段的组合物；其中的组合物能治疗凝血性疾病，而所述容器上可能具有的标签则说明该组合物能用于治疗凝血性疾病。所述试剂盒可含第二个容器(含药学上认可的缓冲液)和说明书(说明该组合物能用于治疗凝血性疾病)等附属组件。
含所述抗体或抗体片段的药物组合物可用于治疗或预防血栓形成性疾病或凝血性疾病，例如用于抑制FⅨ/FⅨa介导的活动的哺乳动物治疗方法中。这些方法包括给予所述动物治疗有效量的本发明药物组合物。此类适应症包括深静脉血栓形成，动脉血栓形成，不稳定性心绞痛，心肌后梗死，术后血栓形成，冠状动脉搭桥移植(CABG)，血管腔移植(transluminal)冠状动脉血管成行术(PTCA)，中风，肿瘤生长、侵袭和转移，炎症，败血性休克，低血压，ARDS，心房纤颤和DIC。本发明的组合物还可用作溶栓治疗的辅助手段。
附图简述
图1A和1B:Gla区序列。不同物种的FⅨ的Gla区之间的序列同源性：人，SEQ ID NO:5；犬，SEQ ID NO:2；鼠，SEQ ID NO:3和家兔，SEQ ID NO:4(附图1A)，各种人凝血蛋白的Gla区之间的序列同源性：因子Ⅸ,SEQ ID NO:5；因子Ⅹ,SEQ ID NO:6；因子Ⅶ,SEQ ID NO:7蛋白C,SEQ ID NO:8和凝血酶原，SEQ ID NO:9(附图1B)。非同源残基以粗体表示。
图2:Ⅴ基因节段的用途和选定scFv的CDR序列。与10C12中不同的残基以粗体显示。10C12重链：CDR1,SEQ ID NO:10；CDR2,SEQ ID NO:11,CDR3,SEQ ID NO:12。10C12轻链：CDR1,SEQ ID NO:13；CDR2,SEQ ID NO:14,CDR3,SEQ ID NO:15。11C5重链：CDR1,SEQ ID NO:10；CDR2,SEQ ID NO:16,CDR3,SEQ ID NO:17。11C5轻链：CDR1,SEQ ID NO:13；CDR2,SEQ ID NO:14,CDR3,SEQ ID NO:15。11G9重链：CDR1,SEQ ID NO:10；CDR2,SEQ ID NO:18,CDR3,SEQ ID NO:19。11G9轻链：CDR1,SEQ ID NO:13；CDR2,SEQ ID NO:14,CDR3,SEO ID NO:15。13D1重链：CDR1,SEQ ID NO:10；CDR2,SEQ ID NO:20,CDR3,SEQ ID NO:12。13D1轻链：CDR1,SEQ ID NO:13；CDR2,SEQ ID NO:14,CDR3,SEQ ID NO:15。13H6重链：CDR1,SEQ ID NO:21；CDR2,SEQ ID NO:22,CDR3,SEQ ID NO:23。13H6轻链：CDR1,SEQ ID NO:24；CDR2,SEQ ID NO:25,CDR3,SEQ ID NO:26。14H9重链：CDR1,SEQ ID NO:27；CDR2,SEQ ID NO:28,CDR3,SEQ ID NO:29。14H9轻链：CDR1,SEQ ID NO:30；CDR2,SEQ ID NO:31,CDR3,SEQ ID NO:32。
图3：选定的人FⅨ/FⅨa的抗FⅨ F(ab′)2的亲合力：按照供应商的说明将FⅨ与生物传感芯片(BIAcore Inc.,Piscataway NJ)偶联。用BIAcore-200TM表面等离子体激光共振系统(Pharmacia Biosensor)测定结合常数和解离常数，由这些常数计算亲合力。
图4:scFv与全长FⅨ的结合。用10μg/ml的9E10抗C-myc mAb涂覆测试板。在每孔中加入连续稀释的scFv(10μg/ml至5ng/ml),1小时后加入生物素化的因子Ⅸ(1μg/ml)和链霉亲合素-HRP。
图5A和5B:scFv对FⅨ与牛主动脉内皮细胞结合的作用和对血小板依赖性凝血的作用。在图5A的中，试验在4℃，在100μl试验缓冲液(10mM Hepes,137mM NaCl,4mM KCl,11mM葡萄糖，2mM CaCl2,5mg/ml牛血清白蛋白，pH7.5)中进行。使用前，牛主动脉内皮(BAE)细胞单层用不含CaCl2的试验缓冲液洗涤一次。scFv与生物素化的人FⅨ在100μl缓冲液中预培养1小时，然后加到BAE细胞中培养2小时，洗涤，然后与100μl 3,3′,5,5′-四甲基联苯氨/H2O2(Kirkgaard& Perry)底物共培养10分钟。用100μl 1M H3PO4淬灭反应，在450nm处读取光密度。图5B-以二磷酸腺嘌呤(ADP)活化洗涤过的人血小板，让它们与Ⅲ型胶原蛋白粘合，然后加入scFv和重新钙化的缺血小板人血浆。在90分钟内，通过测定450nm处光密度的升高来监测对凝血的作用。图中所示的是500nM血浆浓度时scFv的作用。
图6A和6B：抗FⅨ的scFv和F(ab′)2的结合特异性。用1μg/ml的因子Ⅸ，因子Ⅹ，因子Ⅶ，凝血酶原或蛋白C涂覆Elisa板。分别加入5μg/ml的scFv(图6A)和0.02μg/ml的F(ab′)2(图6B)，反应1小时。然后加入生物素化的9E10抗C-mycmAb(2μg/ml)，接着加入链霉亲合素-HRP。因子Ⅸ+血清：scFv先与少FⅨ血清(因子Ⅸ残留活性低于1％)冰上预培养1小时，然后再与涂在测试板上的FⅨ共培养。所有ELISA缓冲液都含2mM CaCl2。
图7A和7B：两种抗FⅨ的F(ab′)2-Leu拉链片段在血小板依赖性凝血试验中的比较。胶原蛋白黏附激活的人血小板与不同浓度的10C12 F(ab′)2-Leu拉链(图7A)和13H6 F(ab′)2-Leu拉链(图7B)共培养，加入重新钙化的人血浆启动凝血过程。各种抗体测试6个浓度，图中分别显示了其中3个浓度。各值都是3次独立实验的平均值±SD。根据抑制曲线，用100分钟时的OD值计算IC50，对照值(不受抑制的凝血作用)设定为100％。10C12的IC50=59±3nM；13H6的IC50=173±43nM。空心圆：1000nM，空心方块：250nM；菱形：62.5nM；实心三角：15.6nM；实心圆：对照。
图8：抗FⅨ的F(ab′)2-Leu拉链对FⅨa依赖性FⅩ活化的抑制。抗体与FⅨa、FⅧa和磷脂共培养20分钟，然后加入FⅩ。用生色底物S2765测定不同时刻的FⅩa浓度，计算出FⅩa的产生速度。抗体的抑制作用表示为分数(受抑制的Fxa产生速度除以不受抑制的速度)。抗体10C12(方块)、13H6(菱形)和非相关对照抗体抗Neurturin(圆圈)的浓度是在与FⅩ最终反应混合物中的浓度。
图9A和9B:10C12 F(ab′)2-Leu拉链对部分活化的促凝血酶原激酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)的影响。图9A中，抗体与人血浆在37℃共培养10分钟，在ACL300上测定APTT和PT。显示的是10C12 F(ab′)2-Leu拉链(方块)和13H6F(ab′)2-Leu拉链(圆圈)作用下的APTT(空心方块)和PT(空心圆)。图9B中，10C12F(ab′)2-Leu拉链与不同动物的血浆37℃共培养10分钟，在ACL300上测定APTT和PT。显示的是人(圆圈)、大鼠(菱形)、狗(方块)和家兔(倒三角)血浆的APTT(实心)和PT(空心)。
图10A和10B:FⅨa和组织因子：组织因子Ⅶa(TF:FⅦa)复合物对FⅨ的活化作用。FⅨ(400nM)与10C12(实心)或对照抗体(NTN：抗Neurturin)(空心)在HBSA-5mM CaCl2中共培养。图10A：加入1nM FⅪa启动反应。图10B：加入重脂化的TF:FⅦa(4nM:1nM)(圆圈)或细胞膜TF:FⅦa(150μg/ml:1nM)(方块)启动反应。在确定时间间隔，在EDTA-乙二醇中淬灭各份反应，加入FⅨa底物#299后，测定各份样品中FⅨa的酰胺水解活性。对FⅨa生成速度的抑制作用表示为3-4个独立实验的速度分数(vi/vo)±SD。
图11：测定豚鼠和大鼠的血浆内部分活化的促凝血酶原激酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)。用柠檬酸化的豚鼠和大鼠血浆稀释10C12。培养10分钟后，加入重脂化人组织因子(Innovin)或肌动蛋白FS分别启动PT(空心标记)和APTT(实心标记)反应。对凝血的作用表示为相对对照血浆凝血时间的延长倍数。菱形=豚鼠；圆圈=大鼠。
图12:10C12在豚鼠动脉血栓形成模型中对循环血流变化(CFV)的影响。在颈动脉内启动CFV前15分钟，通过静脉推注给予10C12和对照。记录40分钟内的CFV次数，将CFV次数除以施加的收缩次数，计算该比数作为血栓形成指数。以Kruskal-Wallis检验确定不同组之间的显著差异，然后进行Mann-WhitneyU检验，**：与对照相比的p≤0.01,***:p≤0.001。
图13:FeCl3处理对大鼠颈动脉血流量的影响。在放置FeCl3饱和的圆片前，在以盐水或10C12处理的大鼠中测定代表性的颈动脉血流量。在全部10个对照处理的大鼠中诱导闭塞性血栓形成，5个大鼠接受静脉推注2mg/kg 10C12处理，都不诱导闭塞性血栓形成。
图14A和14B:10C12和肝素在FeCl3诱导的动脉血栓形成大鼠模型中对血栓形成的作用。将FeCl3圆片放到暴露的动脉上之前，先推注给予10C12和对照，肝素则先推注给予100U/kg，然后以1U/kg/min的速度输注给予。图14A：在给药开始后65分钟，取出血栓并称重，从而定量对血凝块重量的作用。14B：测定放置FeCl3圆片后至出现零流量的时间，从而确定对血管阻塞持续时间的作用。以Kruskal-Wallis检验确定不同组之间的显著差异，然后进行Mann-Whitney U检验，**：与对照相比的p≤0.01,***:p≤0.001。
优选实施例的详细描述
定义
若非另作说明，权利要求书和说明书的术语具有以下定义。
全文中使用的缩写有：FⅨ代表因子Ⅸ；FⅨa代表因子Ⅸa；FⅪa代表因子Ⅺa；FⅩa代表因子Ⅹa；TF代表组织因子；FⅦ代表酶原因子Ⅶ； FⅦa代表因子Ⅶa；PT代表凝血酶原时间；APTT代表部分活化的促凝血酶原激酶时间。
氨基酸或氨基酸残基在此表示天然L氨基酸或在变异体部分所述的D氨基酸。本文采用通用氨基酸单字母和三字母缩写(Bruce Alberts等，细胞分子生物学，Garland Publishing,Inc.,New York(第3版，1994))。
FⅨ/FⅨa介导的或相关的过程或活动，或与此相当的，与血浆FⅨ/FⅨa相关的活性，根据本发明，指任何需要FⅨ/FⅨa存在的活动。血凝块形成的普遍机制参见Ganong，医学生理学综述，第13版，Lange,Los Altos CA,pp411-414(1987)；Bach(1988)CRC生物化学回顾23(4):359-368和Davie等(1991)，生物化学30:10363；和FⅨ的速度，Limentoni等(1994)，血液凝固和血栓形成的基本原理和临产实践，第3版，Coleman等，Lippincott Company,Philadelphia。凝血需要两个过程相互汇合：包括诱导血小板凝聚的凝血酶产生，和令血小板凝块稳定的血纤蛋白形成。这个过程包括几个阶段，各自需要不同的酶原和前辅因子存在。凝血过程的最后结果是血纤蛋白交联和血栓形成。血纤蛋白原被凝血酶原活化成血纤蛋白。凝血酶则是凝血酶原被蛋白酶剪切而形成的。这一蛋白水解作用需要FⅩa的作用，它结合于活化血小板的表面，并在FⅤa和钙存在下剪切凝血酶原。通过外源性凝血路径蛋白水解活化的FⅩ需要TF-FⅦa。FⅨ由两种不同的酶活化：FⅪa(Fujekawa等，(1974)，生物化学13:4508-4516；Di Scipio等(1978)，临床研究杂志61:1526-1538；Qsterud等(1978)，生物化学杂志253:5946-5951)和组织因子：因子Ⅶa(TF:FⅦa)复合物(Qsterud和Papaport(1977)，美国科学院院报74:5260-5264)。在血小板和内皮细胞等细胞的表面，复合物中形成的FⅨa与它的辅因子FⅧa组装成内源性Xase复合物，并将底物FⅩ转化成FⅩa(Mann等(1992),Semin Hematol 29:213-226)。因FⅩa酶促活性而产生的凝血酶剪切血纤蛋白原，形成血纤蛋白，并激活血小板，从而引起血小板凝聚。所以，FⅨ/Ⅸa介导或与之相关的过程，或与FⅨa相关的活性包括凝血级联从FⅨ进入外源性或内源性路径至血纤蛋白血小板凝块形成的任一步骤，而且从一开始就需要FⅨ/FⅨa的存在。FⅨ/FⅨa介导或相关的过程，或FⅨa活性，可方便地用标准实验，例如本文所述的实验来测定。
与FⅨ/FⅨa相关的疾病包括与血纤蛋白形成相关的慢性血栓栓塞疾病，例如深静脉血栓形成，动脉血栓形成，中风，肿瘤转移，血栓溶解，动脉粥样硬化和脉管成形术后的再狭窄，急/慢性适应症，例如炎症，败血性休克，成人呼吸道窘迫综合征(ARDS)，弥漫性血管内凝血性疾病(DIC)等。
“FⅪ”指一种多肽，其氨基酸序列与天然哺乳动物因子Ⅸ或后文所述重组Ⅸ的相应。天然FⅨ包括人及其他动物，例如家兔、大鼠、猪、非人灵长类动物、马、鼠和牛的FⅨ(参见，例如，Yoshitake等(1985)，生物化学24:3736(人))。哺乳动物因子Ⅸ/Ⅸa蛋白的氨基酸序列是已知的，或可用常规技术测得。图1列出了人、狗、小鼠和家兔FⅨ的43个氨基酸的γ-羧基谷氨酸(Gla)区。
“治疗”在本发明中包括对疾病或紊乱的治疗，预防或抑制手段。因此，例如，治疗可能包括在疾病或因其引起的紊乱发生前或发生后给予某种药剂，用以防止或消除疾病或紊乱的所有表征。另一个例子是，在表现出临床症状后为抵抗疾病症状而给药也是对疾病的“治疗”。此外，在临床症状发作和发展后给药，作用于疾病或紊乱的临床情况，并可能缓解疾病，这也是对疾病的“治疗”。
“需要治疗”的包括患有疾病或紊乱的哺乳动物，例如人，还包括那些需要预防疾病或紊乱的个体。
抗体或免疫球蛋白多为四聚体的糖蛋白，分子量约150,000Da，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成。各轻链通过一个二硫共价键与一条重链连接，不同免疫球蛋白重链之间的二硫键个数互不相同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链间二硫键。每条重链在其一端有一个可变区(VH)，后面是一系列恒定区。每条轻链在其一端有一个可变区(VL)，另一端则有一个恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链可变区与重链可变区相对。据信，特定的氨基酸残基在轻/重链的可变区之间形成一个界面(Clothia等(1985)，分子生物学杂志186:651；Novotny和Haber(1985)，美国科学院院报82:4592)。
“可变”表示，抗体之间，可变区中的某些部分在序列上有广泛的不同，这些部分作用于各种特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。然而，这种变异性在抗体的可变区内并不是均匀分布的。变异性集中在称为互补决定区(CDR)或超变区的三个节段中，轻链和重链的可变区中都有。可变区中保守性较高的部分称为框架(FR)。天然轻链和重链的可变区各有4个FR区，大都采取β-平面构型，通过三个CDR相连，形成环连接，有时形成β-平面的一部分。各链中的CDR被FR彼此靠近在一起，并与另一链中的CDR靠近，从而形成抗体的抗原结合位点(参见，Kabat(1991)等，具有免疫学意义的蛋白质序列，第五版，National Institute ofHealth,Bethesda,MD)。恒定区与抗体与抗原的结合没有直接关联，但表现出不同的效应器功能，例如抗体在抗体依赖性细胞毒中的参与。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，各有一个抗原结合位点；并产生一个残余的Fc片段，此名称反映其易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生有两个抗原结合位点的F(ab′)2片段，它们能与抗原交联。
Fv是一种含有一个完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在一种双链Fv中，该区是一个重链可变区和一个轻链可变区通过紧密的非共价联合而成的二聚体。在一种单链Fv(scFv)中，一个重链可变区和一个轻链可变区可通过一个柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链结合成类似于双链Fv的“二聚体”结构。正是在这种构型中，各可变区的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚体的表面形成一个抗原结合位点。这6个CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变区(或只有3个某抗原特异性CDR的半个Fv)也能够识别和结合抗原，尽管亲合力低于完整的结合位点。有关scFv，参见Pluckthun，单克隆抗体的药理学，第113卷，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
Fab片段也含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段的区别在于重链CH1区的羧基末端多了几个残基，其中包括抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在此指恒定区的半胱氨酸残基带有一个游离巯基的Fab′。最早产生的F(ab′)2抗体片段是彼此间具有交联区半胱氨酸的一对Fab′片段。也已知道抗体片段的其他化学偶联方式。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的轻链，根据各自恒定区的氨基酸序列，都可以归入区别明显的K和λ两类。
根据各自重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体分成不同的类。有5个免疫球蛋白大类：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中几类还可以再分成亚类(同种型)，例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α,δ,ε,γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构及其三维构型都已为人所熟知。
“抗体”在此采用其最广义的意义，具体包括单克隆抗体(包括激动性抗体和拮抗性抗体)和具有多肽特异性的抗体组合物。
“抗体片段”含有完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合位点或可变区。“抗体片段”的例子包括Fab,Fab′,Fab′-SH,F(ab′)2和Fv片段；二抗体；如下抗体片段：它是一种肽，其一级结构是一段无间隔的连续氨基酸残基序列(在此称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，此类片段包括但不限于：(1)单链Fv(scFv)分子，(2)只有一个轻链可变区的单链多肽，或其含有轻链可变区的3个CDR的片段，且无重链部分与之结合，(3)只有一个重链可变区的单链多肽，或其含有重链可变区的3个CDR的片段，且无轻链部分与之结合；以及多段抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”(mAb)在此指从一群基本同质的抗体中获得的抗体，即，构成该抗体群的各抗体除了微量可能天然发生的突变之外均相同。单克隆抗体具有高度的特异性，只针对一个抗原性位点。而且，传统(多克隆)抗体制剂一般包含针对不同决定基(表位)的不同抗体，与此相反，各mAb只针对抗原上的一个决定基。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可由杂交瘤培养物合成，不会为其他免疫球蛋白所污染。修饰语“单克隆”表示抗体来自一个基本同质的抗体群这一特征，而不应理解成需要通过特殊的方法来产生抗体。
“二抗体”指有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段具有的一个重链可变区(Hv)和一个轻链可变区(VL)连接成同一条肽链(Hv和(VL)。使用一个短得令同链的两个区域无法彼此配对的接头，可迫使这些区域与其他链的互补区域配对，由此形成两个抗原结合位点。EP404,097,WO93/11161和Hollinger等(1993)，美国科学院院报90:6444-6448中有对二抗体更全面的描述。
“线性抗体”在此指Zapata等在(1995)蛋白质工程8(10)1057-1062中所述的抗体。简而言之，这些抗体有一对串联Fd节段(VH-CH1-VH-CH1)，它们形成一对抗原结合区。线性抗体可能是双特异性的，也可能是单特异性的。
“变异”抗体或抗体片段指这样的分子，其氨基酸序列因一个或多个氨基酸的插入、缺失和/或取代而区别于“亲代”抗体或抗体片段。例如，变异体可能是在亲代抗体或抗体片段的一个或多个CDR内有一处或多处氨基酸取代。例如，变异体可能在亲代抗体或抗体片段的一个或多个CDR内有至少一个，1-10个，最好2-5处氨基酸取代。一般，变异体与亲代抗体重链或轻链可变区序列的同源性至少75％，以至少80％为佳，至少85％更好，至少90％更好，至少95％还要好。这种序列一致性或同源性在此定义为将候选序列与亲代抗体序列排列对齐，必要时引入空隙，由此获得氨基酸残基相同的最大百分比。任何抗体序列N末端、C末端或内部的延长、缺失或插入都应认为不影响序列的一致性或同源性。变异体保留了结合人FⅨ Gla区的能力，而且最好具有比亲代抗体更好的性能。例如，与作为其来源的亲代抗体或抗体片段相比，变异体可能与人FⅨ Gla区具有更高的亲合力。在分析这些性能时，将变异抗体或抗体片段(例如Fab形式的变异体)与亲代抗体或抗体片段的相同片段(例如Fab形式的片段)相比。另一个例子是，全长的抗体变异体应与全长的亲代抗体比较，因为已经发现，抗体或抗体片段的形式在本发明所述的生物活性实验中影响它们的活性。本发明特别感兴趣的变异抗体或抗体片段与亲代抗体相比，生物活性增强2-10倍，较好的是至少10倍，更好的是至少20倍，再好的是至少50倍。“变异体”包括至少定性生物活性与亲代抗体或抗体片段相同，而至少一个图2所示的代表性CDR中有至少一处氨基酸取代的抗体或抗体片段。所谓定性生物活性选自但不限于以下活性之一：(ⅰ)与人FⅨ/FⅨa Gla区的反应性，(ⅱ)抑制FⅪa对FⅨ的活化；(ⅲ)抑制组织因子：因子Ⅶa复合物对FⅨ的活化和(ⅳ)抑制FⅩ活化。测定对FⅨ和FⅩ活化抑制作用的实验系统是本领域已知的。在优选实施例中，本发明的变异体与亲代抗体或抗体片段竞争与人FⅨ/Ⅸa Gla区的结合。所以，除理论所述之外，定性生物活性可定义为与亲代抗体或抗体片段竞争的能力，在优选实施例中，可能因此而抑制某种与FⅪ相关的活性，例如FⅨ活化或FⅩ活化。由此可见，“竞争”和“竞争的能力”是相关的。因此，用该术语描述变异体的活性时，表示在一标准结合实验中加入的变异体比亲代抗体或抗体片段过量10倍时，至少抑制亲代抗体或抗体片段结合的50％。较好的是，产生至少50％结合抑制所需的变异体过量5倍，过量至少2倍更好。本发明的一种优选变异体与亲代抗体或抗体片段以1∶1的化学计量比共存时可产生至少50％的结合抑制。
本发明的“亲代”抗体或抗体片段有一段氨基酸序列，用于制备变异体。较好的是，亲代抗体或抗体片段具有人的框架区和人抗体恒定区。例如，亲代抗体或抗体片段以分离的人抗体或其片段为佳。
“分离的”抗体即，从其天然环境中鉴定，并分离和/或回收得到的抗体。其天然环境中的污染成分是那些影响该抗体诊断或治疗用途的物质，包括酶、激素以及其他蛋白类或非蛋白类溶质。在优选实施例中，抗体被纯化至，(1)以Lowry法测定，按抗体重量计的纯度高于95％，最好超过99％，(2)其纯度足以用旋杯测序仪获得N末端或中间氨基酸序列的至少15个残基，或(3)在还原或非还原性条件下，以Coomassis蓝或更好的是银染色的SDS-PAGE测定为同质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为至少一种该抗体天然环境中的组分将不存在。然而，分离的抗体通常是经过至少一步纯化步骤制得的。
“带表位标签的”在此指与一个“表位标签”融合的抗体。该表位标签多肽具有足够多的残基，从而可制备针对它的抗体，同时又足够短，因此不影响抗体的活性。该表位标签最好具有足够的独特性，这样，其抗体基本上不会与其他表位起交叉反应。合适的标签多肽一般有至少6个氨基酸残基，通常有8-50个氨基酸残基(较好的是9-30个残基)。例子包括flu HA标签多肽及其抗体12C5(Field等(1988)，分子细胞生物学8:2159-2165)；c-myc标签及其抗体8F9,3C7,6E10,G4,B7和9E10(Evan等(1985)，分子细胞生物学5(12):3610-3616)；单纯性疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky等(1990)，蛋白质工程3(6):547-553(1990))。某些实施例中，表位标签是一种“拯救受体结合表位”。在此，“拯救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG1,IgG2,IgG3或IgG4)Fc区的一种表位，它负责延长IgG分子的体内血清半衰期。
本发明的实施方式
本发明提供一种抗体或抗体片段，它的重链可变区含图2所示重链多肽CDR氨基酸序列。本发明还包括一种单链抗体片段，它含有所述重链CDR序列，另外含或不含其他氨基酸序列。例如，本发明提供的单链抗体片段含有一段包含CDR1,CDR2和CDR3的重链，不与任何轻链可变区氨基酸序列结合，即，由Fv片段一半构成的单链。
本发明还提供一种抗体或抗体片段，它含有任意以上所述重链CDR序列，还含有图2所示的轻链CDR氨基酸序列。例如，实施例之一中，本发明提供如下单链抗体片段，其中的重链具有一个CDR1，一个CDR2和一个CDR3，轻链(λc)含有一个λc-CDR1，一个λc-CDR2和一个λc-CDR3，彼此连成一条单链肽。例如但非限定的是，在一特定实施例中，该单链抗体片段是scFv，其中的重链与轻链通过一段柔性肽接头序列相连，其中重链和轻链的可变区可以联合成类似双链Fv中的“二聚体”结构。另一实施例中，所述单链抗体是通过如下接头相连的重链和轻链，该接头很短而使得这两个可变区无法分子内配对，即，一段单链多肽单体通过与另一单体二聚而形成一个二抗体。
另一实施例中，本发明提供如下抗体片段，它含有多条多肽链，其中一条多肽链含有图2所示的重链CDR，第二条多肽链含有图2所示的轻链CDR。这两条多肽链通过一个或多个链间二硫键共价连接。在一优选实施例中，以上双链抗体片段选自Fab,Fab′,Fab′-SH,Fv和F(ab′)2。
本发明还提供如下抗体或抗体片段，它含有一段包含任意图2所示的重链CDR的重链可变区，可以另含一段包含任意图2所示的轻链CDR的轻链可变区，其中的重链可变区和可能有的轻链可变区与另一部分融合，该部分例如一段免疫球蛋白恒定区。可给重链和/或轻链序列加上恒定区序列，从而形成全长或部分长的重链和/或轻链。可以看出，任一同种型的恒定区都可用于此目的，这包括IgG,IgM,IgA,IgD和IgE的恒定区，而且，这些恒定区也可获自人或其他动物。较好的来源是人的恒定区序列。合适的人恒定区序列可根据Kabat等(同上)获得。
在一优选实施例中，抗体或抗体片段在可变区内含有图2所示重链CDR氨基酸序列，该区与含亮氨酸拉链的轻链恒定区融合。亮氨酸拉链可提高抗体或抗体片段的亲合力和/或产生效率。合适的亮氨酸拉链序列包括Kostelney等(1992)，免疫学杂志148:1547-1553中所述的jun和fos亮氨酸拉链和后文所述的GCN4亮氨酸拉链。在一优选实施例中，抗体或抗体片段的可变区在其C末端与GCN4亮氨酸拉链融合。
本发明还包括如下抗体和抗体片段的变异体。变异抗体或抗体片段包括以上所述抗体或抗体片段中图2所示CDR中至少一个氨基酸被另一氨基酸取代的产物。熟练技术人员可以看出，图2所示CDR中的某些氨基酸可以被取代、修饰和缺失，从而提供生物活性被改善或改变的抗体或抗体片段。本发明优选的互补性决定区的变异体或含图2所示CDR的可变区的变异体表现出对FⅨ Gla区更高的亲合力，而且/或具有某些特性，使其重组生产的效率比亲代抗体或抗体片段更高。
方法和制造
可从噬菌体上展示的单链抗体文库中制备编码本发明抗体或抗体片段的核酸。所述文库的制备是本领域所熟知的。合适的文库可用如下方法制备：WO92/01047,WO92/20791,WO93/06213,WO93/11236,WO93/19172,WO95/01438和WO95/15388。在一优选实施例着，可用来自人供体的多样性人B细胞群建立一个单链抗体(scFv)文库。用标准技术分离和纯化VH和VL抗体链的mRNA，并逆转录成eDNA群。经PCR扩增，用例如Gly4Ser(SEQ ID NO:1)接头组装成编码单链抗体的DNA，将其克隆到合适的表达载体内。然后制备一个噬菌体文库，其中噬菌体的表面展示单链抗体群。制备噬菌体文库的合适方法参见：Winter等(1994)，免疫学评论年报12:433-55；Soderlind等(1992)，免疫学回顾130:109-123；Hoogenboom,Tibtech(1997年2月)，第15卷；Neri等(1995)，细胞生物物理学27:47-61和其中引用的文献。
本发明抗体的选择可通过固定FⅨ Gla区，然后用固定化的FⅨ Gla区结合抗体来筛选如上制备的人scFv文库。Griffiths等(1993)，欧洲生物化学杂志12:725-734。特定克隆的特异性和活性可用已知试验来评价。Griffiths等；Clarkson等(1991)，自然352:642-684。第一筛选步骤后，可获得如下噬菌体文库，其中噬菌体展示的多种不同单链抗体与FⅨ Gla区具有更强的结合力。以后的筛选步骤得到结合亲合力更高的文库。考虑亲合力的作用时，可用如下单价噬菌体展示文库，其中少于20％，较好的是少于10％，更好的是少于1％的噬菌体表面展示某抗体一份以上的拷贝。可如文献所述，用噬菌粒和辅助噬菌体进行单价展示，例如Lowman等(1991)，方法：酶学方法比较3(3):205-216。优选的噬菌体是M13，而且展示的最好是与包膜蛋白3的融合蛋白，参见Lowman等，同上。其他合适的噬菌体包括fl和fd丝状噬菌体。与其他病毒包膜蛋白一起展示的融合蛋白也是已知的，也可用于本发明。参见美国专利5,223,409。
通过在抗体DNA中引入合适的核苷酸改变，或通过肽合成，制备抗体的氨基酸序列变异体。这样的变异体包括，例如，本文例举的抗体氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任意组合，以得到最终的结构，条件是最终的结构具有所需的特征。氨基酸改变还可能改变变异抗体的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量和位置。
鉴定抗体内适合进行诱变的特定残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，参见Cunningham和Wells(1989)，科学244:1081-1085(1989)。在此，鉴定一残基或靶残基组(例如带电残基arg,asp,his,lys和glu等)，取代以中性或负电荷氨基酸(最好是丙氨酸或聚丙氨酸)，从而影响氨基酸与FⅨ Gla区的相互作用。然后，在取代位点进一步或引入其他变异，由此进一步精确那些对取代表现出功能敏感性的氨基酸位置。因此，当引入氨基酸变异的位点是预定的时，突变本身的性质不必是预定的。例如，要分析在给定位点某一突变的作用，在靶密码子或靶区域进行ala扫描或随机诱变，对表达的抗体变异体进行所需活性的筛选。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合，长度从一个残基到100或更多个残基的多肽不等，还包括单个或多个氨基酸残基的序列间插入。末端插入的例子包括N末端带有甲硫酰氨残基的抗体，或与一个表位标签融合的抗体。其他抗体分子的插入变异体包括在抗体的N或C末端融合的酶或多肽或延长抗体半衰期的PEG。
另一种变异体是氨基酸取代变异体。这种变异体的抗体分子内至少有一个氨基酸残基缺失，而在该位置插入另一种不同的残基。最具有取代突变意义的位点包括超变区，也考虑FR变化。以下表1中的“优选取代”标题下列举了保守性取代。如果这样的取代改变了生物学活性，可引入更实质性的改变，例如表A中“范例性取代”所列举的，或后文氨基酸类别中所述的，并对产物进行筛选。
                                  表A
原残基 范例性取代 优选取代
 Ala(A) val,leu,ile  val
 Arg(R) lys,gln,asn  lys
 Asn(N) gln,his,asp,lys,arg  gln
 Asp(D) glu,asn  glu
 Cys ser,ala  ser
 Gln)Q) asn,glu  asn
 Glu(E) asp,gln  asp
 Gly(G) ala  ala
 His(H) asn,gln,lys,arg  arg
 Ile(I) leu,val,met,ala,phe，正亮氨酸  leu
 Leu(L) 正亮氨酸，ile,val,met,ala,phe  ile
 Lys(K) arg,gln,asn  arg
 Met(M) leu,phe,ile  leu
 Phe(F) leu,val,ile,ala,tyr  tyr
 Pro(P) ala  ala
 Ser(S) thr  thr
 Thr(T) ser  ser
 Trp(W) tyr,phe  tyr
 Tyr(Y) trp,phe,thr,ser  phe
 Val(V) ile,leu,met,phe,ala，正亮氨酸  leu
通过选择对于保留以下性质的作用具有显著差异的取代来进行抗体生物学活性的实质性修饰：(a)取代部位的多肽骨架结构，例如，平面或螺旋构型；(b)分子该靶位点的电荷或疏水性；或(c)侧链的大小。根据侧链的特性，天然残基可分为以下各组：
(1)疏水性：正亮氨酸，met,ala,val,leu,ile；
(2)中性亲水性：cys,ser,thr；
(3)酸性：asp,glu；
(4)碱性：asn,gln,his,lys,arg
(5)影响链取向的残基：gly,pro；和
(6)芳香性：trp,tyr,phe。
非保守性取代能将上述某些类别转化为另一类。
任何与维持变异抗体正确构象无关的半胱氨酸残基也可以被取代，通常以丝氨酸取代，以提高抗体分子的氧化稳定性和防止不当交连。相反，也可以为抗体增加半胱氨酸键以提高其稳定性(尤其是当抗体是Fv之类抗体片段时)。
一种特别优选的取代型变异体中，亲代抗体(例如人抗体)超变区中的一个或多个残基被取代。通常，选来进一步改造的所得抗体变异体应比作为其来源的亲代抗体有更好的生物学特性。产生此类取代型变异体的一种简便方法是用已知方法，用噬菌体进行的亲合性成熟。简而言之，对几个超变区位点(例如3-7个位点)进行诱变，在各个位点产生所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体变异体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，并与包裹在各颗粒内的M13的基因Ⅲ产物融合。然后，如本文所述，对该噬菌体展示的变异体进行生物学活性(例如结合亲合力)筛选。为了鉴定可供修饰的候选超变区位点，可用丙氨酸扫描来鉴定对于抗原结合具有显著贡献的超变区残基。另一种方法，或结合以上方法，通过分析抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与FⅨ Gla区的接触点可能有好处。这样的接触残基和相邻残基是进行本文所述取代的候选残基。上述变异体产生后，对整组变异体进行本文所述的筛选，选择在一项或多项试验中具有突出特性的抗体进行进一步的改造。
另一种抗体的氨基酸变异体改变抗体原来的糖基化方式。所谓“改变”是指删除一个或多个抗体中原有的糖基，和/或增加一个或多个抗体中原没有的糖基化位点。
通常，抗体的糖基化不是N连接的，就是O连接的。N连接指糖基连在天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中的X是除脯氨酸之外的任意氨基酸，是酶将糖基与天冬酰胺残基的侧链连接的识别序列。因此，多肽中若有以上三肽序列，就形成一个潜在的糖基化位点。O连接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与一个羟基氨基酸连接，最常见的是与丝氨酸或苏氨酸连接，虽然也可能用到5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列，使它含有一个或多个上述三肽序列(用于N连接的糖基化位点)，可方便地给抗体增加糖基化位点。所述改变也可以是在原抗体的序列内增加或取代以一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于O连接的糖基化位点)。
可用多种本领域已知的方法制备编码抗体变异体的核酸分子。这些方法包括但不限于：从天然来源中分离(天然氨基酸序列变异体)，或对某抗体的前变异体或非变异体进行通过寡核苷酸介导的(或定点)诱变，PCR诱变和盒式诱变来制备。
较好的是，用标准重组方法来制备抗体，这包括：培养经转染而表达抗体核酸(通常是用表达载体转化细胞)的细胞，和从细胞培养物中回收抗体。
将如前文所述挑选的抗体的编码核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入一复制载体，用于进一步克隆(扩增DNA)或表达。有许多载体可供使用，选择合适的载体取决于：(1)它是用于DNA扩增还是用于DNA表达，(2)要插入载体的核酸的大小，和(3)用该载体转化的宿主细胞。根据其功能(扩增DNA或表达DNA)和与之相容的宿主细胞，各载体含有不同的元件。载体元件一般包括但不限于以下之一或多个：信号序列，复制起点，一个或多个标记基因，增强元件，启动子，和转录终止序列。
(ⅰ)信号序列
本发明抗体可能不仅可直接表达，而且与一段异源肽形成融合体表达，所述异源肽最好是在成熟蛋白质或多肽N末端具有特定剪切位点的信号肽或其他多肽。通常，信号序列可以是载体的组成部分，或者是插入载体的抗体DNA的一部分。所选的异源信号序列应能被宿主细胞识别和加工(例如被信号肽酶剪切)。适合原核宿主细胞的原核信号序列选自，例如，碱性磷酸酶，青霉素酶，1pp或热稳定肠毒素Ⅱ前导序列。就酵母分泌而言，可用，例如，酵母转化酶、α因子、或酸性磷酸酶前导序列，C.albicans葡糖淀粉酶前导序列(EP362,179,1990年4月4日公开)，或1990年11月15日公开的WO90/13646中所述的信号序列取代天然信号序列。
在哺乳动物细胞表达中，天然信号序列就可以，虽然其他哺乳动物的信号序列可能也合适，例如，不同种动物的其他配体多肽或相同配体多肽的信号序列，同种或相关物种的配体的信号序列，和分泌的多肽的信号序列，以及病毒的分泌前导序列，例如单纯性疱疹病毒的gD信号。
(ⅱ)复制起点
表达载体和克隆载体都含有一段令载体能在一种或多种选定宿主细胞内复制的核酸序列。通常，在克隆载体内，该序列使载体能不依赖于宿主染色体DNA而复制，它包括复制或自主复制序列的起点。许多细菌、酵母和病毒的此类序列是已知的。质粒pBR322的复制起点适合大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒的起点适合酵母，各种病毒的起点(SV40，多瘤病毒、腺病毒，VSV或BPV)可用于在哺乳动物细胞内的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制元件的起点(使用SV起点一般只是因为它含有早期启动子)。
大多数表达载体是“穿梭”载体，即，它们能够在至少一种生物内复制，但可转染到另一种生物内表达。例如，将一载体克隆到大肠杆菌内，然后将该载体转染到酵母或哺乳动物细胞内进行表达，即使它不能独立于宿主细胞的染色体复制。
DNA还可以通过插入宿主基因组进行扩增。这可以用杆菌为宿主，例如在载体内包含一段与杆菌基因组DNA内一段序列互补的DNA序列来实现。用该载体转染杆菌引起基因组与插入的抗体DNA同源重组。然而，回收编码抗体的基因组DNA比回收异源复制的载体复杂，因为需要限制性酶消化来剪切抗体DNA。
(ⅲ)选择基因
表达和克隆载体应含有选择基因，又称可选标记。该基因编码一种被转化宿主细胞在选择培养基上存活或生长所必需的蛋白质。没有被含选择基因的载体转化的宿主细胞不能在这样的培养基上存活。典型的选择基因编码如下蛋白：(a)提供对氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素等抗生素或其他毒素的抗性，(b)补偿营养缺陷，或(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养素，例如编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的例子之一用一种药物来阻止宿主细胞的生长。那些被异源基因成功转化的细胞表达一种提供抗药性的蛋白质，因而在该选择方案中存活。此类显性选择的例子采用药物新霉素(Southern等(1982)，分子应用遗传学杂志1:327)，真菌酚酸(Mulligan等(1990)，科学209:1422)或潮霉素(Sugden等(1985)，分子细胞生物学5:410-413)。以上三个例子利用细菌基因在真核调控下提供对合适的药物G418或新霉素(庚他霉素)，xgpt(真菌酚酸)或潮霉素的抗性。
适合哺乳动物细胞的其他可选标记的例子是能够鉴定摄取抗体核酸的细胞的那些标记，例如二氢叶酸还原酶(DHGR)或胸苷激酶。将哺乳动物细胞转化子置于选择压力下，这样，只有转化子凭借摄取的标记而能够存活。连续改变培养基中选择剂的浓度，以致于只有选择基因和编码抗体的基因扩增，在这样的条件下培养转化子以施加选择压力。扩增是基因为产生需量较大的生长必需蛋白而在后代重组细胞的染色体内连续重复产生的过程。从扩增所得的DNA可合成更多的抗体。
例如，先将全部转化子培养在含甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中，以鉴定被DHFR选择基因转化的细胞。使用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是DHFR活性缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其制备和繁殖参见Urland和Chasin(1980)，美国科学院院报77:4216。然后让转化细胞接触更高水平的Mtx。这造成DHFR基因多拷贝的合成，附带含该表达载体的其他DNA，例如编码抗体的DNA的多拷贝的合成。这一扩增技术可用于任意其他合适的宿主，例如ATCC CCL61 CHO-K1，尽管使用高Mtx抗性突变DHFR基因时存在着内源性DHFR(EP117,060)。或者，可将细胞培养在含有针对可选标记的选择剂(例如氨基糖苷类抗生素，如卡那霉素、新霉素或G481)的培养基中，选择被编码抗体、野生型DHFR蛋白和另一选择标记如氨基糖苷3′转磷酸酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含内源性DHFR的野生型宿主)。参见美国专利4,965,199。
适用于酵母的选择基因是酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等(1979)，自然282:39；Kingsman等(1979)，基因7:141；或Tschemper等(1980)，基因10:157)。trp1是选择不能在色氨酸存在下生长的酵母突变株(例如ATCC44076或PEP4-1)的选择标记(Jones(1977)，遗传学85:12)。于是，酵母宿主细胞基因组内的trp1损伤提供了一个有效的检测环境，即根据无色氨酸存在下的生长来检测转化情况。类似的，可用已知带Leu2基因的质粒来补偿Leu2缺陷型酵母株(ATCC 20,622或38,626)。
(ⅳ)启动子
表达和克隆载体一般都含有一个启动子，它能被宿主识别，并与抗体的核酸操作性连接。启动子是非翻译序列，位于结构基因起始密码子的5′上游(一般约100-1000bp以内)，它控制与之操作性相连的特定核酸序列(例如抗体核酸序列)的转录和翻译。启动子一般分为诱导型和组成型两类。诱导型启动子应培养条件的改变(例如某种营养素的有无或温度变化)，提高受其控制的DNA的转录水平。目前已经知道许多可被多种潜在宿主识别的启动子。通过限制酶消化从其源DNA中分离出这些启动子，然后将此分离的启动子插入载体，从而使它们与抗体的编码DNA操作性连接。天然抗体的启动子序列和许多异源启动子都可用于指导抗体DNA的扩增和/或表达。但以异源启动子为佳，因为与天然启动子相比，它们常能得到更高水平的转录和表达。
适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等(1978)，自然275:615；和Goeddel等(1979)，自然281:544)，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel(1980)，核酸研究8:4057和EP36,776)和杂合启动子，例如tac启动子(deBoer等(1983)，美国科学院院报80:21-25)。但其他已知的细菌启动子也适用。它们的核酸序列已公开，因此，熟练技术人员可用提供各种所需限制性位点的接头或衔接子将它们与编码抗体的DNA操作性连接(Siebenlist等(1980)，细胞20:269)。用于细菌宿主的启动子还含有一段Shine-Dalgamo(SD)序列，它与编码抗体多肽的DNA操作性连接。
真核启动子的序列是已知的。几乎所有的真核基因都有一段位于转录起始点上游约25-30碱基的多AT区。另一段是许多基因转录起始点上游70-80碱基的CXCAAT区，其中的X可以是任意核苷酸。大多数真核基因的3′端是一段AATAAA序列，这可能是给编码序列的3′末端加上聚A尾的信号。以上序列都被适当的插入了真核表达载体。
用于酵母宿主的合适的启动子例如：3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等(1980)，生物化学杂志255:2073)或其他糖酵解酶(Hess等(1968)，高级酶调节杂志7:149；和Holland(1978)，生物化学17:4900)，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸歧化酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶的启动子。
以下其他酵母启动子属于诱导型，具有通过培养条件来控制转录的优点，它们是醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，氮代谢中的降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动区。用于酵母表达的合适的载体和启动子进一步的描述可参见Hitzeman等的EP73,657A。较好的是，还可以将酵母增强子与酵母启动子联用。
可用以下启动子来控制哺乳动物内载体上抗体的转录，例如病毒基因组的启动子，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒(UK2211504,1989年7月5日公开)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆病毒、B型肝炎病毒和最优选的猿病毒40(SV40)，异源哺乳动物的启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，热休克启动子，和一般情况下与抗体序列相结合的启动子，条件是这些启动子与宿主系统相容。
得到的SV40病毒早期启动子和晚期启动子一般是含有SV40病毒复制起点的一段SV40限制性片段。Fiers等(1978)，自然273:113；Mulligan和Berg(1980)，科学209:1422-1427；Pavlakis等(1981)，美国科学院院报78:7398-7402。得到的人巨细胞病毒立即早期启动子是一段HindⅢ E限制性片段。Greenaway等(1982)，基因18:355-360。美国专利4419446描述了一种在哺乳动物宿主内用牛乳头瘤病毒表达DNA的系统。美国专利4601978则是对该系统的改进。另外参见，Gray等(1982)，自然295:503-508，有关在猴细胞内表达编码免疫干扰素的DNA；Reyes等(1982)，自然297:598-601，有关在鼠细胞内在单纯性疱疹的胸苷激酶启动子控制下表达人β-干扰素；Canaani和Berg(1982)，美国科学院院报79:5166-5170，有关在培养的小鼠和家兔细胞中表达人干扰素β1基因；和Gorman等(1982)，美国科学院院报79:6777-6781有关在CV-1猴肾细胞、鸡胚胎成纤维细胞、中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞和鼠NIH-3T3细胞内用Rous肉瘤病毒长末端重复区作为启动子表达细菌CAT序列。
(ⅴ)增强子元件
在载体插入一增强子序列常能提高编码本发明抗体的DNA在高级真核宿主内的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，长约10-300bp，作用于启动子来提高转录。增强子的取向和位向相对独立，已发现，它们位于转录单元的5′(Laimins等(1981)，美国科学院院报78:993)和3′(Lusky等(1983)，分子细胞生物学3:1108)，在内含子内(Banerji等(1983)，细胞33:729)，以及位于编码序列本身之中(Osborne等(1984)，分子细胞生物学4:1293)。现在，已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲-胎蛋白和胰岛素)。然而，通常使用真核细胞病毒的增强子。例如：位于复制起点晚期侧的SV40增强子(100-270bp)，巨细胞病毒早期启动子增强子，位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。另外参见，Yaniv(1982)，自然291:17-18，有关激活真核启动子的增强元件。可将增强子拼接在抗体编码序列的5′或3′，但以位于启动子5′为佳。
(ⅵ)转录终止元件
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多核生物的有核细胞)的表达载体还含有转录终止和稳定mRNA所必需的序列。此类序列一般可从真核生物或病毒DNA或cDNA的5′或(有时)3′非翻译区获得。这些区域含有转录后形成的编码抗体的mRNA非翻译区内聚腺苷酸化片段的核苷酸节段。
(ⅶ)载体的构建和分析
用标准连接技术来构建含有一种或多种上述元件的合适载体。分离的质粒或DNA片段经过剪切、剪裁，然后以所需形式重新连接成所需的载体。
为了分析确认所构建的质粒内含有正确的序列，用连接混合物转化大肠杆菌K12菌株294(ATCC No.31,446)，适当选用氨苄青霉素或四环素挑选出成功的转化子。用限制性内切酶消化制备和分析转化子质粒，并/或用Messing等(1981)，核酸研究9:309或Maxam等(1980)，酶学方法65:499所述的方法测序。
(ⅷ)瞬时表达载体
在本发明实施中，特别有用的是在哺乳动物细胞内瞬时表达编码抗体多肽的DNA的瞬时表达载体。一般说来，瞬时表达使用这样的表达载体：它能够在宿主细胞内高效复制，使得宿主细胞累积大量该表达载体的拷贝，进而合成高水平的该表达载体所编码的所需多肽。Sambrook等，同上PP.16.17-16.22。瞬时表达系统包括合适的表达载体和宿主细胞，允许方便地阳性鉴定克隆DNA所编码的多肽，并允许对这些多肽进行有关所需生物学或生理学特性的快速筛选。因此，瞬时表达系统特别适合在本发明中用于鉴定具有抗体多肽生物活性的抗体多肽的类似物和变异体。
(ⅸ)脊椎动物细胞载体的合适例子
适合在重组脊椎动物细胞培养物内合成抗体的其他方法、载体和宿主细胞参见Gething等(1981)，自然293:620-625；Mantei等(1979)，自然281:40-46；Levinson等；EP117060；和EP117058。特别适用于哺乳动物细胞表达的质粒是pRK5(EP307,247，美国专利5258287)或pSVI68(WO91/08291)。
本发明中，适合克隆或表达载体的宿主细胞是原核细胞、酵母或上述高级真核细胞。合适的原核细胞包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性菌，如大肠杆菌，杆菌属的枯草杆菌，假单孢菌属的绿脓假单孢菌，鼠伤寒沙门氏菌或粘质沙雷氏菌。优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC No.31,446)，但也可使用其他大肠杆菌，例如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC No.31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC No.27,325)。这些例子是说明性的而非限定性的。宿主细胞应分泌最少的蛋白水解酶。另外，也可使用体外扩增方法，例如PCR等核酸聚合酶反应。
除原核生物之外，如丝状真菌或酵母等真核微生物也是抗体编码载体的合适宿主。酿酒酵母或普通发酵酵母是最常用的低级真核微生物宿主。但还有许多其他属、种或株可以得到并用于本发明，例如非洲裂殖酵母(Beach和Nurse(1981)，自然290:140；1985年5月2日公开的EP139383)，克鲁维酵母菌属宿主(美国专利4943529)，例如K.lactis(Louvencourt等(1983)，细菌学杂志737)，脆壁克鲁维酵母，保加利亚克鲁维酵母，耐热克鲁维酵母和马克思克鲁维酵母，yarrowia(EP402226)，巴斯德毕赤酵母(EP183,070；Streekrishna等(1988)，基础微生物学杂志28:265-278)，假丝酵母，reesia木霉(EP244234)，粗糙链孢菌(Case等(1979)，美国科学院院报76:5259-5263)和丝状真菌，例如链孢霉，青霉，Tolypocladium(1991年1月10日公开的WO91/00357)和曲霉，如构巢曲霉(Ballance等(1983)，生物化学生物物理学研究通讯112:284-289；Tilburn等(1983)，基因26:205-221；Yelton等(1984)，美国科学院院报81:1470-1474)和黑曲霉(Kelly和Hynes(1985)，欧洲生物学杂志4:475-479)。
适合表达糖基化抗体的合适宿主细胞来自多细胞生物。这样的宿主细胞能进行复杂的加工，并具有糖基化活性。原则上，不论是否来自脊椎动物，高级真核细胞培养物都可使用。非脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了多种杆状病毒株、其变异体和允许其生长的昆虫宿主细胞，所述宿主细胞来自例如草地夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、果蝇和家蚕等的宿主。参见Luckow等(1988)，生物技术6:47-55；Miller等，基因工程，Setlow等(1986)编辑，第8卷(Plenum Publishing),pp.277-279；和Maeda等(1985)，自然315:592-594。许多转染用病毒毒株是公众可以得到的，例如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1变异体和家蚕NPV的Bm-5株，这些病毒可以象本发明所用的病毒一样使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
可用棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养物作为宿主。通常，先将抗体DNA导入根癌土壤杆菌，然后通过植物细胞与根癌土壤杆菌的共培养来进行转染。在植物细胞与根癌土壤杆菌共培养期间，编码抗体的DNA转移到植物宿主细胞内，该细胞即被转染，然后，在合适的条件下，它将表达抗体DNA。此外，与植物细胞相容的调节序列和信号序列也是可以得到的，例如胭脂氨酸合成酶启动子和聚腺苷酸化信号序列。Depicker等(1982)，分子应用遗传学杂志1:561。此外，自T-DNA780基因上游分离的DNA节段能激活或提高植物表达基因在含DNA重组植物组织内的转录水平。1989年6月21日公开的EP321196。
然而，人们最感兴趣的是脊椎动物细胞，近年来，脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为一项常规操作(组织培养(1973),Academic Press,Kruse和Patterson，编辑)。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293或为进行悬浮培养亚克隆的293细胞，Graham等(1977)，遗传病毒学杂志36:59)；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaud和Chasin(1980)，美国科学院院报77:4216)；小鼠塞尔托利细胞(TM4,Mather(1980)，生物繁殖23:243-251)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞系(HELA,ATCC CCL 2)；狗肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)；水鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等(1982)，纽约科学协会年报383:44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
用本发明上述表达或克隆载体转染，最好是转化宿主细胞，将它们培养在为引入启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因当适当改变的常规营养培养基中。
转染指宿主细胞摄入表达载体，不管编码序列实际是否表达。多种转染方法是一般技术人员所熟知的，例如，CaPO4法和电穿孔。通常，当宿主细胞内表现出该载体活动的迹象时，就认为转染成功。
转化指将DNA引入生物体，使得DNA能够作为染色体外元件或染色体组分进行复制。根据所用的宿主细胞，用适合该细胞的标准方法进行转化。一般对原核细胞或其他具有细胞壁屏障的细胞采用以氯化钙进行的钙处理，例如Sambrook等，(同上)的1.82节所述。根癌土壤杆菌感染被用于转化植物细胞，例如Shaw等(1983)，基因23:315和1989年6月29日公开的WO89/05859所述。此外，可用超声波处理来转染植物，参见1991年1月10日公开的WO91/00358。对没有细胞壁的哺乳动物细胞来说，优选的是磷酸钙沉淀法，参见Graham和van derEb(1978)，病毒学52:456-457。哺乳动物宿主系统转化的总体内容参见Axel在1983年8月16日美国专利4399216中所述。通常按照Van Solingen等(1977)，细菌学杂志130:946，和Hsiao等(1979)，美国科学院院报76:3829中所述的方法转化酵母。然而，也可采用将DNA导入细胞的其他方法，例如核注射，电穿孔或原生质体融合等。
如Sambrook等(同上)所述，将用来生产本发明抗体的原核细胞培养在合适的培养基中。
可将用来生产本发明抗体的哺乳动物宿主细胞培养在多种培养基中。适合培养宿主细胞的培养基有市售的Ham′s F10(Sigma)，极限基础培养基((MEM),Sigma),RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco′s改进的Eagle′s培养基((DMEM),Sigma)。此外，本发明参考的以下文献中所述的培养基也可用做宿主细胞的培养基：Ham和Wallace(1979)，酶学方法58:44,Barnes和Sato(1980)，生物化学年报102:255，美国专利4767704,4657866,4927762或4560655,WO90/03430,WO87/00195或美国续展专利30985。可以根据需要在以上培养基中补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、运铁蛋白或上皮生长因子)，盐(如氯化钠，钙，镁和磷酸盐)，缓冲液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷)，抗生素(例如艮他霉素)，微量元素(即最终浓度仅几微摩尔的无机化合物)，和葡萄糖或与之相当的能源。还可以加入适当浓度的其他必需补充成分，这些都是本领域技术人员所知的。培养条件，例如温度、pH等，即过去为实现该宿主细胞内表达所选用的那些，本领域一般技术人员都知道。
本发明的宿主细胞既包括体外培养物中的细胞，也包括宿主动物体内的细胞。
可直接测定样品中基因的扩增和/或表达水平，例如通过传统的Southern印迹，定量mRNA转录产物的Northern印迹(Thomas(1980)，美国科学院院报77:5201-5205)，斑点印迹(DNA分析)，或根据在此提供序列用适当标记的探针进行原位杂交。可使用各种标记，最常用的是放射性同位素，特别是32p。然而，也可采用其他技术，例如将生物素修饰的核苷酸引入一聚核苷酸。然后将此生物素作为结合亲合素或抗体的位点，后者可用各种标记进行标记，例如放射性核素、荧光团、酶等。或者，可用识别DNA双链、RNA双链、DNA-RNA杂合双链或DNA-蛋白质双链等特定双链的抗体。然后标记该抗体进行试验，其中，双链结合在一表面上，这样，当双链在表面上形成时，就可以检测到与该双链结合的抗体。
或者，可用免疫学方法来测定基因的表达，例如免疫组织化学染色组织切片和细胞培养物或体液样品，用以直接定量测定基因产物的表达。用免疫组织化学染色技术，需制备细胞样品，一般通过脱水和固定来制备，然后与对偶联的基因产物具有特异性的标记抗体反应，这些标记一般是可以肉眼检测，例如酶标记，荧光标记，发光标记等。一种适用于本发明的特别灵敏的染色技术是Hsu等(1980)在美国临床病理学杂志75:734-738中所述的方法。
自培养基中回收的抗体最好是分泌多肽，然而，没有分泌信号而直接表达时，也可从细胞裂解液中回收。
当在重组细胞而不是人源细胞中表达抗体时，抗体完全没有来自人的蛋白质或多肽。然而，一般仍然需要纯化抗体以去除其他细胞蛋白或多肽杂质，以获得就配体本身而言基本均质的制剂。第一步，离心培养基或裂解液，去除细胞碎片。将细胞膜和可溶性蛋白质组分分开。或者，可用市售的蛋白质浓缩滤膜(例如，AMICON或Millipore PELLICON超滤单元)。然后，从可溶性蛋白质组分中纯化抗体。然后，通过盐析和使用各种凝胶基质的交换或层析来去除可溶性蛋白质或多肽杂质以纯化抗体。此类基质包括丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素和其他蛋白质纯化中常用的基质。适合蛋白质纯化的层析过程例如：免疫亲合层析，FⅨGla区亲合层析(例如，-IgG或蛋白A SEPHROSE)，疏水性相互作用层析(HIC)(例如，乙基、丁基或苯基Toyopearl)，凝集素层析(例如，Con A-SEPHROSE，小扁豆-卵磷脂-SEPHROSE)，大小排阻层析(例如，SEPHADEX G-75)，阳离子或阴离子交换柱(例如，DEAE或羧甲基和磺丙基纤维素)和反相高效液相层析(RP-HPLC)(参见，例如，Urdal等(1984)，层析学杂志296:171，其中，用连续两步RP-HPLC来纯化重组人IL-2)。可以另包括其他纯化步骤，例如乙醇沉淀、硫酸铵沉淀、层析聚焦、制备性SDS-PAGE等。
考虑各种变异所致的实质性特性改变，以相同的方式回收含有残基缺失、插入或取代的抗体变异体。例如，要制备抗体与协助纯化的其他蛋白质或多肽(例如细菌或病毒抗原)所成的融合体，可采用含有该抗原的抗体的免疫亲合柱来吸附该融合多肽。免疫亲合柱，例如家兔多克隆抗抗体柱，可通过与保留的至少一个免疫表位结合来吸附抗体变异体。或者，可用已知方法将纯化的FI Gla区-IgG与(最好是)固定化的树脂(例如AFFI-Gel 10(Bio-Rad,Richmond,CA)等)偶联，用这样的亲合性层析来纯化抗体。还可以在纯化过程中用例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)等蛋白酶抑制剂来抑制蛋白酶降解，并用抗生素防止偶然的杂菌生长。本领域熟练技术人员可以看出，适用于天然抗体的纯化方法需要修改以适应在重组细胞培养物中表达的抗体或其变异体性质上的改变。
用途
本发明的抗体可用于体外诊断试验，用于抑制FⅨ被FⅪa或TF-FⅦa活化成FⅨa，和用于在FⅨa依赖性试验中抑制凝血。
本发明的组合物可用于治疗或预防FⅨa介导的疾病或紊乱，这包括但不限于与溶栓治疗联合，预防动脉血栓再形成。已经提出，FⅨ在许多临床情况中起着重要作用，这些情况包括深静脉血栓形成，动脉血栓形成，中风，DIC，败血性休克，心肺搭桥手术，成人呼吸窘迫综合征，遗传性血管神经性水肿，以及肿瘤生长与转移。所以，FⅨ抑制剂可能在调节炎性和/或血栓形成性紊乱中起着重要作用。
因此，本发明包括给人预防FⅨ/FⅨa介导的疾病的方法，这包括给予有需要的患者治疗有效量的本发明抗体组合物。本发明抗体分子的治疗有效量是预先测定能够达到所需效果的量。治疗用量取决于治疗目的、给药途径和所治疾病等因素。所以，所给的剂量应足以结合产生的FⅨ/FⅨa，形成没有活性的复合物，从而减少所治患者体内的凝血。
根据与FⅨa依赖性凝血相关的一种或多种症状的改善来评定治疗效果。这样的治疗有效量可由熟练技术人员来确定，并根据年龄、性别和受治患者情况而不同。合适的全身性给药剂量一般约为1μg/kg至100mg/kg，或更多，这取决于给药途径。根据本发明，优选剂量是1μg/kg体重至5mg/kg体重。例如，合适的治疗方案包括，静脉注射或输液给予足量药物以将血液浓度维持在该疗法的指定范围内。
含本发明抗体或抗体片段的药物组合物可以各种合适的方式给予，这包括肠胃外，表面，口服或局部(例如气溶胶或透皮)，或以上方式的联合。合适的治疗还包括：最初进行静脉推注，然后间隔一次或多次注射重复剂量。
在溶栓治疗中，当本发明组合物与溶栓药联合给予(例如)以预防阻塞性血栓形成时，溶栓药的治疗有效量约为其常规剂量的80-100％。在治疗中，溶栓药的常规剂量是日用剂量，治疗医生很容易获知。(医师参考手册(1994)，第50版，Edward R.Barnhart,Publisher)。典型剂量取决于所用的溶栓药，如果是组织纤蛋白溶酶原活化剂(t-PA)，该剂量约为0.5-5mg/kg体重；如果是链激酶，则是140,000-2,500,000单位/人；如果是脲激酶，则是500,000-6,250,000单位/人；如果是分离的链激酶纤维蛋白溶酶原活化剂复合物(ASPAC)，则是0.1-10单位/公斤体重。
本文的“联合”指包含至少一种本发明分子和至少一种溶栓药的单剂量形式。它还包括通过多剂量形式，分开但同时给予患者，此时，本发明分子通过两次单独给药，例如连续给药。这样的联合和组合物具有溶解或防止阻塞性血栓形成的作用，引起阻塞性血栓的溶解。当用于体内给药时，抗体制剂必须是无菌的。这只要在冷冻干燥和重溶之前或之后通过除菌滤膜过滤既可。一般，抗体以冷冻干燥或溶液形式保存。
一般将治疗性抗体组合物放在具有无菌接口的容器内，例如静脉输液袋或输液瓶，它们具有一个塞子，可用皮下注射针将其刺穿。
抗体的给予途径根据已知方法，例如，静脉注射或输液，腹膜内，脑内，肌内，眼内，动脉内，鞘内，吸入或创伤内途径，或利用后文所述的缓释系统。抗体最好是通过输液或推注连续给予。
本发明抗体可与药学上认可的运载体制备成混合物。这样的治疗组合物可通过静脉、鼻或肺给予，最好是以液体或粉末气溶胶(冷冻干燥)的形式。组合物也可以通过肠胃外或皮下给予。当全身性给予时，治疗组合物应是无菌、无热原，且以pH、渗透性和稳定性适合肠胃外给药的溶液配制。这些条件是本领域技术人员所知的。简而言之，将达到所需纯度的本发明化合物与生理学上认可的运载体、赋形剂或稳定剂混合，制备成可供保存或给药的剂量制剂。这些物质在所用剂量和浓度对接受者是无毒的，包括TRIS HCl、磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其他有机酸盐等缓冲液；抗坏血酸等抗氧化剂；聚精氨酸之类小分子肽(少于10个残基)，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白之类蛋白质；聚乙烯吡咯烷酮之类亲水性聚合物；苷氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸等氨基酸；单糖、二糖或其他碳水化合物，例如纤维素及其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；钠等反离子和/或非离子性表面活性剂，例如TWEEN,PLURONICS或聚乙二醇。
可按照常规制药规程配制无菌注射组合物。例如，将活性化合物溶解或悬浮在载体中，例如水或天然植物油，如麻油、花生油或棉籽油，也可能需要使用油酸乙酯之类合成脂性载体。可按照认可的制药规程，掺入缓冲剂、保存剂、抗氧化剂等。
合适的缓释制剂的例子包括：包含多肽的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质呈膜或微囊等成型颗粒的形式。缓释基质的例子包括：聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，Langer等(1981)，生物医学材料研究杂志15:167-277和Langer(1982)，化学技术12:98-105，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利3773919,EP58481),L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等(1983)，生物聚合物22:547-556)，不可降解的乙烯乙酸乙酯(Langer等(同上))，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRON DepotTM(乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide乙酸酯构成的可注射微球)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133988)。
虽然乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸共聚物之类聚合物能够长达100天以上地释放分子，某些水凝胶释放蛋白质的时间却较短。当被包裹的蛋白质长期留在体内时，它们会因为处于37℃的潮湿环境而变性或凝聚，结果丧失生物学活性，还可能改变免疫原性。可根据涉及的机制，设计合理的方法来稳定蛋白质。例如，如果发现凝聚的机制因为二硫化物互变而形成了S-S键，就可以通过修饰巯基残基，用酸性溶液冷冻干燥，控制湿度，使用合适的添加剂和开发特殊的聚合物基质组合物来实现稳化。以下实施例用于说明而非限定。本说明书中引用的所有公开内容都在此作为参考。
                         实施例
                         实施例Ⅰ试剂
FⅨ和FⅨa购自Haematologic Technologies Inc.,(Essex Jct.,VT)。FⅩ购自Enzyme Research Laboratories Inc.(South Bend,IN)，二油酰基1,2-二乙酰基-sn-甘油-3-(磷酸-L-丝氨酸)(PS)和油酰基1,2-二乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PC)购自Avanti Polar Lipids Inc.(Alabaster,AL)。FⅨa生色底物#299购自AmericanDiagnostica(Greenwich,CT)。肌动蛋白FS和Innovin购自Dade InternationalInc.(Miami,FL)。SEPHAROSE树脂和柱购自Amersham PharmaciaBiotech(Piscataway,NJ)。二乙二醇(分析级)和FeCl3(试剂级)购自MallinckrodtInc.(Paris，KY)。无脂肪酸BSA购自Calbiochem(La Jolla,CA)。肝素钠注射剂购自Elkins Sinn Inc.(Cherry Hill,NJ)。无菌注射盐水购自Baxter HealthcareCorp.(Deerfield,IL)。纯化的大肠杆菌TF(1-243)和重组F.Ⅶa由RobertF.Kelley(Genetech,Inc)提供。方法
Gla肽的合成与生物素化：在ABI431肽合成仪上用标准Fmoc化学方法，进行0.25mmol规模的Gla肽合成。用HBTU([2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸])，HOBT(N-羟基苯并三唑)和DIPEA(二异丙基乙胺)偶联1小时。Fmoc氨基酸侧链的保护基如下：Tyr(tBut),Thr(tBut),Ser(tBut),Lys(Boc),Arg(pbf),Asn(trf),Gin(trf),Gla(otBut)2,Cys(acm)和Trp(Boc)。加入10当量碘的DMF溶液，与仍留在树脂上的肽4℃搅拌1小时，进行氧化。用70∶30∶0.1的TFA∶二氯甲烷∶三异丙基硅烷室温下反应3小时将肽切下，用乙醚研磨，用30mM NH4OH萃取树脂，并冷冻干燥。通过电喷质谱法，肽测序和氨基酸分析来鉴定该物质。Fmoc-L-Gla(OtBut)2购自Peninsula Labs(Balmont CA),Fmoc-Lys(alloc)购自Perseptive Biosystems(Framingham MA)。催化剂Pd(0)和生物素-NHS分别购自Fluka(Ronkonkoma NY)和Sigma(St.Louis MO)。
对以上方法进行如下修改来合成生物素化的Gla肽。用第40位的Fmoc-Lys(alloc)进行肽的合成，不去除肽N末端最后的Fmoc基团。在含0.5％乙酸和2.5％N-甲基吗啉的0.1M四三苯基膦钯(0)氯仿溶液中，用钯催化剂反应3小时去除alloc(烯丙基氧基羰基)。在DMF/DCM中，用DIPEA反应过夜，将生物素-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺生物素)与赖氨酸(40)的侧链偶联。然后，用20％哌啶/DMF去除最后的Fmoc基团，如前所述地在树脂上将肽氧化，从树脂上切下肽，并萃取。结果
所合成的Gla肽的氨基酸序列如图1所示(人)。
                            实施例2方法
生物筛选(Biopanning)方法-通过两轮用生物素化肽进行的富集，对一个1010的大型scFv文库(Cambridge Antibody Technology,Cambridgeshire,UK)(Vaughan等(1986)，自然生物技术14:309-314)进行筛选。在筛选中逐轮降低抗原量(第一轮是100nM，第二轮是10nM)，进行亲合性选择(Hawkins等(1992)，分子生物学杂志226:889-896)。为了确保Gla肽的正确构象，若非另作说明，在筛选和以后分析的所有溶液中都加氯化钙(2mM)。每一次筛选中，以含3％脱脂乳，0.1％TWEEN和2mM CaCl2的1ml TBS(MTBST/Ca)封闭的1012滴定单位噬菌体与生物素化的肽室温(RT)共培养1小时。将以MTBST封闭的链霉亲合素偶联的微珠(DYNABEANDS,Dynal,Oslo Norway)加入噬菌体-生物素化的抗原混合物，室温反应15分钟。第一轮使用300μl DYNABEANDS，第二轮减至100μl。用DynalMPC(磁力颗粒浓缩器)，用以下溶液将DYNABEANDS洗涤3次：TBST/Ca,MTBST/Ca,MTBS/Ca和TBS/Ca。用4M MgCl2,1mM四乙基胺(TEA)和100mMHCl逐步洗脱结合的噬菌体。每次洗脱在室温下进行5分钟，洗脱的组分用50mMpH7.5的Tris-HCl中和。每轮筛选所回收的噬菌体在细菌抑制株TGl中增殖。
结果
分离和鉴定人FⅨ的scFv-为了分离具有抗血栓形成潜力的人FⅨ特异性抗体，筛选带有人FⅨ Gla区对应肽的人scFv抗体的噬菌体展示文库。因为已知Ca++与FⅨ Gla区的结合诱导构象改变，而构象改变又对其与磷脂和细胞表面的相互作用至关重要，所以，所有筛选步骤都在2mM CaCl2存在下进行。分别用100nM和10nM生物素化的肽进行了两轮筛选。第二轮筛选后，用噬菌体ELISA(Griffiths等(1993)，欧洲生物化学杂志12:725-734)在800个筛选出的克隆中选出96个(12％)，它们具有特异性结合FⅨ Gla区的能力。
                           实施例3方法
克隆鉴定-MAXISORP Elisa测试板(Nunc)用Gla肽的HEPES缓冲盐水(HBS)溶液(5μg/ml)4℃涂覆，过夜。测试板用含0.1％TWEEN和3％奶粉的HBS缓冲液封闭。将噬菌体培养上清液(50μl)直接加到测试板上。然后加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗M13(Pharmacia,Uppsala,Sweden)。通过BsrNⅠ消化和测序鉴定自所选克隆中纯化的DNA(ABI37,Perkin Elmer,Foster City,CA)。
svFv蛋白ELISA-用抗c myc抗体9E10的碳酸钠缓冲液溶液(方式Ⅰ),FⅨ或FⅨ相关因子以含2mM CaCl2的HBS配制的溶液(方式Ⅱ)涂覆ELISA测试板。用含0.1％TWEEN的HBSCa(HBST/Ca)封闭测试板。加入5μg/ml的svFv。方式Ⅰ中，将生物素化的FⅨ(1μg/ml)加到板上，然后加链霉亲合素-HRP。方式Ⅱ中，用9E10抗c myc mAb和HRP偶联的山羊抗小鼠Fc特异性mAb(Zymed,South SanFrancisco,CA)来检测scFv。所有试剂都用封闭缓冲液HBST/Ca稀释，测试板用含0.05％Tween的HBS/Ca洗涤。结果
为了进一步评价所选克隆的种系差异，纯化各克隆的DNA，并进行BstNⅠ指纹分析(Clackson等(1991)，自然352:624-628)。这96个克隆被分为24个不同的指纹家族。所表达的scFv是带表位标签的蛋白质，含有单克隆抗体9E10识别的c-myc标签序列(Griffiths等(1993)，欧洲生物化学杂志12:725-734)和聚组胺酸尾(his6)，按照生产商(Qiagen,Chatsworth,CA)的推荐，在Ni-NTA上以咪唑洗脱来纯化。从每个指纹家族中挑选一个克隆进行scFv表达。然后，纯化scFv，用ELISA测定它们对Gla肽和全长FⅨ的反应活性。被测的24个克隆中，有6个(10C12,11C5,11G9,13D1,13H6和14H9)的ELISA显示与Gla肽和全长FⅨ不同程度的交叉反应性(图4)，其余只与Gla肽反应。克隆10C12,13D1和13H6与FⅨ的结合强于克隆11G9,11C5和14H9。
对这6个克隆进一步进行DNA测序以分析节段的使用(图2)。4个克隆(10C12,11C5,11G9和13D1)具有CDR区相同的轻链(Vλ1)。克隆13H6和14H9具有不同于其他克隆的独特轻链，它们的CDR区没有同源性。重链测序发现，克隆10C12和13D1之间具有强同源性，只有3个残基的差别，一个在CDR2内，两个在框架区内。克隆11C5重链的CDR1和CDR2几乎与10C12和13D1的相同，但CDR3不同。克隆13H6和14H9的重链与其他克隆只有极小的同源性。以上结果显示，10C12,11C5,11G9和13D1密切相关，最突出的差异在克隆11C5的重链CDR3内。这一总体同源性提示，这些抗体结合FⅨ-Gla区内的相同表位。Ca++和Mg++存在下，FⅨ Gla区具有不同的构象，各自露出不同的抗体表位。CDR具有高度同源性的抗体10C12,13D1,11C5和13H6(13H6例外)只结合Ca++诱导的Gla区构象，这与它们识别相同表位这一观点是一致的。相反，克隆13H6和14H9都具有独特的重链和轻链。克隆14H9的各CDR区似乎具有明显较多的带电残基，尤其是CDR3。
根据FⅨa抑制活性(10C12,13D1和13H6)和DNA种系差异(14H9)，从这6个抗体中选4个构成F(ab′)2分子。
scFv和F(ab′)2与各种凝血因子的结合特异性-各种凝血因子(FⅦ,FⅨ,FⅩ，凝血酶原和蛋白C)的Gla区之间具有高度的同源性(图1B)。用ELISA试验来测定选出的抗体结合FⅨ Gla区的特异性：将各种凝血因子(FⅦ,FⅨ,FⅩ，凝血酶原和蛋白C)涂到测试板上，与5μg/ml scFv(图6A)或0.02μg/ml F(ab′)2(图6B)共培养。结果显示，克隆10C12,13D1和13H6的scFv和F(ab′)2都只与FⅨ反应，而14H9却能识别所有被测因子。而且，scFv与无FⅨ血清预培养没有降低10C12,13D1和13H6的scFv与FⅨ的结合，这排除了这些克隆与血清中除FⅨ以外其他因子反应的可能性。相反，克隆14H9的scFv的结合却在与上述血清培养后显著减弱。以上结果显示，克隆14H9所识别的表位是独特的，不同于其他3种抗体所识别的序列。
抗FⅨ F(ab′)2与FⅨ结合的钙离子和镁离子依赖性-在Ca++存在下进行本发明scFv抗体的选择。已知FⅨ进行两种金属依赖性的构象转换，一种具有金属依赖性但没有阳离子选择性，另一种具有对Ca++或Sr++的金属选择性。为了测定金属离子对于抗FⅨ抗体结合的影响，在所有缓冲液中加入Ca++、Mg++或EDTA(螯合Ca++离子)，进行ELISA。结果显示，克隆10C12,13D1和13H6只在Ca++存在时识别FⅨ，而2mM EDTA的存在则部分或完全抑制这种结合。相反，Ca++或Mg++存在时，克隆14H9都结合FⅨ,EDTA的存在不导致抑制，这说明这种结合不需要Ca++离子。
                            实施例4方法
抗FⅨ F(ab′)2亲合力的BIAcore评价-用BIAcore-2000TM表面等离子共振系统(Pharmacia Biosensor)测定结合和解离的速度常数，由这些常数计算多个F(ab′)2“亮氨酸拉链”片段的抗原结合亲合力(Lofas&Johnsson(1990)，化学协会通讯杂志21:1526-1528)。按照供应商(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)的说明，用盐酸N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活生物传感器芯片。以Ⅸ因子和Ⅹ因子为阴性对照，在10mM乙酸钠缓冲液中稀释成约30μg/ml(pH4.5)。等份注入，以获得519应答单位(RU)的偶联FⅨ,2330RU或13,590RU的偶联FⅩ。最后，注入1M乙醇胺作为封闭剂。
为了进行动力学测定，在25℃，以10μl/min的流速注入以运行缓冲液(0.05％Tween-20,150mM NaCl,2mM CaCl2,10mM Hepes,pH7.4)配制的抗体的2倍系列稀释液(10μl)。用4.5M MgCl2进行再生，然后加入洗涤溶液(50mM,EDTA,150mM NaCl,0.05％TWEEN-20)。由测得的SPR计算平衡解离常数Kd′s,既k关/k开。将解离数据拟合成简单的1∶1Langmuir结合模型。计算各条解离曲线的拟一级速度常数(ks)，绘制蛋白质浓度函数曲线，计算kon+/-s.e.(标准拟合误差)。如下计算算得kd′s的误差e[K]：
               e[K]=[(k开)-2(s关)2+(k关)2(k开)-4(s开)2]1/2
其中的s关和s开分别是k开和k关的标准误差。结果
抗FⅨ F(ab′)2结合FⅨ的亲合力测定-在SPR结合实验中，10C12,13D1和13H6的F(ab′)2-拉链形式表现出与FⅨ的特异性结合(与F.Ⅹ.或空流速室相比)。这些实验采用低密度(519RU)固定化抗原(FⅨ)。虽然抗体的二价形式本可以对结合抗原产生亲合力效应，观察到的结合动力学却符合结合和解离的简单1∶1模式。三种抗体都具有相似的解离速度常数(k关)，相当于50-70分钟的解离半寿期(图3)。然而，13H6的结合速度(k开)明显比10C12或13D1快得多。所以，13H6的平衡解离常数(kd=0.45nM)小于10C12(kd=1.6nM)或13D1(2.9nM)。
                        实施例5方法
FⅨ与牛内皮细胞的结合-按已知方法培养原代牛主动脉内皮细胞4天(Marcum等(1986)，生物化学杂志261:7507)。细胞用含10mM的HEPES,pH7.2,137mM NaCl,4mM KCl,11mM葡萄糖，5mg/ml BSA和2mM CaCl2的HEPES缓冲液洗涤。然后，细胞与生物素化FⅨ，和/或事先与不同量冷FⅨ、scFv或F(ab′)2蛋白预培养了1小时的生物素化FⅨ，在4℃共培养2小时。洗涤测试板，加入链霉亲合素-HRP，室温反应1小时，然后加入TMB/H2O2底物。在测试板读数仪上，在620nm处分析测试板。
血小板依赖性凝血试验-用4μg/ml的人胶原Ⅲ(GibcoBRL#12167-011)PBS溶液，1mM CaCl2,1mM MgCl2涂覆微滴板(Linbro#76-232-05),4℃过夜。使用前，微滴板用PBS洗涤后，再与Tyrode′s BSA,2mM CaCl2 37℃共培养60分钟。
按已知方法(Dennis等(1989)，美国科学院院报87:2471-2475)，由柠檬酸化的人全血制备洗涤后的血小板。在Tyrode′s BSA中将洗涤后的血小板浓度调节至6×108血小板/ml，并在37℃放置120分钟。加入1mM CaCl2和1mM MgCl2后，用ADP(10μM最终浓度)激活血小板。在每孔中加入60μl血小板悬浮液，微滴板60×g离心5分钟，然后室温下放置60分钟，让血小板与涂有胶原的测试孔牢固贴附。轻轻倒去没有贴附的血小板，微滴板用含1mM CaCl2和1mM MgCl2的PBS洗涤两次。然后，胶原-贴附血小板层与Tyrode′s BSA-2mM CaCl2配制的抗体溶液(40μl/孔)共培养10分钟。各孔中加入以CaCl2(最终浓度为11mM)重钙化的人柠檬酸化血浆(得自Peninsula血库的合并血浆)。在动力学微滴板读数仪(SLT LabInstruments,EAR 340AT型)上，在405nm处监测光密度的升高，定量测定凝血反应。结果
scFv对FⅨ结合内皮细胞和对血小板依赖性凝血的强抑制作用-因为已知FⅨ的Gla区是FⅨ与磷脂和细胞表面相互作用所必需的(Ryan等(1989)，生物化学杂志264:20283-20287；Toomey等(1992)，生物化学31:1806-1808；Cheung等(1992)，生物化学杂志267:20529-20531；Ahmad等(1994)，生物化学33:12048-12055)，进一步测定了抗FⅨ Gla区的scFv阻断FⅨ结合内皮细胞的能力。在用牛主动脉内皮细胞进行的竞争试验中，在有或没有克隆10C12,11C5,11G9,13D1,13H6,14H9,6E11的scFv或非标记FⅨ存在下，测定生物素化FⅨ与细胞的结合。该实验的结果如图5A所示。克隆10C12,13D1,13H6和11G9的scFv对FⅨ结合的抑制作用最强，类似非标记FⅨ(IC50=20-50nM)。克隆11C5,6E11和14H9的scFv的抑制作用弱得多(IC50＞300nM)。
FⅨ Gla区还含有一个结合血小板的主要决定基(Ahmad等(1994)，同上)。用人血小板依赖性血浆凝聚试验来评价各种scFv作为FⅨ活性抑制剂的效力。在该试验中，激活洗涤后的人血小板，让它们与胶原贴附，加入无血小板的重新钙化的人血浆。监测90分钟的光密度改变，以监测凝血的进行。血小板缺失或在血小板存在下使用无FⅨ血浆在这段时间内没有引起吸光度任何明显改变。以上结果表明，该体外系统内的凝血反应具有对血小板和FⅨa活性的依赖性。如图5B所示，克隆10C12,11G9,13H6和13D1的scFv在浓度为500nM时完全抑制血凝块的形成。在此浓度，14H9没有作用，11C5表现出中等的应答。在一个较高的浓度(2μM)，这两种scFv都具有完全抑制性。该系统内被测scFv干扰FⅨa功能的效力与它们在内皮细胞结合试验中的相当。这说明，内皮细胞和血小板可能识别Gla区内相似的结构元件。
                        实施例6方法
血浆凝集试验-用肌动蛋白FS(Dade Diagnostics,PR)和人重脂化组织因子试剂Innovin(Dade International Inc.,Miami,FL)作为凝血引发剂，在ACL300(CoulterCorp.,Miami,FL)上测定不同物种血浆的部分活化的促凝血酶原激酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)。要测定家兔的PT，使用家兔促凝血酶原激酶C Plus(DadeDiagnostics,PR)。Innovin是在此检测的所有物种的一种强凝血引发剂，与Janson等(1984)在Haemostasis,14:440-444中的发现一致，即，人重脂化组织因子能够有效令不同动物的血浆凝聚。按标准方法从新西兰白兔，C57小鼠，Sprague-Dawley大鼠和狗的柠檬酸化血液中制备血浆，保存在-80℃。人混合血浆来自Peninsula血库(Burlingame,CA)。抗FⅨ抗体以柠檬酸化血浆稀释10倍，培养10分钟后加入肌动蛋白FS和CaCl2(测定APTT)或Innovin(测定PT)开始凝血。将抗体的作用表示为x倍延长，即有无(对照)抗体存在时，凝聚时间之比。
FⅩ被FⅧa激活:磷脂上的FⅨa复合物-0.5nM因子Ⅸa,0.7U/ml FⅧ,200μM磷脂囊泡(PC∶PS=7∶3)和10mM CaCl2在HBSA缓冲液(0.1M HEPES,pH7.5,0.14M NaCl,0.5mg/ml无脂肪酸BSA)中形成的混合物与α-凝血酶(2.8nM)室温下共培养1分钟以激活FⅧ。加入23.3nM水蛭素中和凝血酶活性。向混合物中加入抗体，室温下培养20分钟，然后加入0.8μM FⅩ。在此最后的反应混合物中，反应试剂的浓度为：0.25nM FⅨa,0.35U/ml FⅧa,25μMp磷脂，100nMFⅩ和5mM CaCl2。在不同时刻，取50μl加入150μl 20mM EDTA中终止反应。为了测定样品中的Fxa浓度，在各孔这加入50μl 1.5mM S-2765，在动力微滴板读数仪(Molecular Devices,Menlo Park,CA)上监测吸光度的变化。用Fxa浓度相对时间的线性回归分析，测定Fxa的生成速度。结果
10C12和13H6的F(ab′)2选择性抑制FⅨ的作用-用了许多不同的功能试验来确定10C12和13H6与FⅨ的特异性结合是否也意味着对FⅨ/Ⅸa功能的特异性抑制。因为13D1与10C12相同，14H9的结合没有特异性，所以不再对它们进一步研究。首先，我们测定了人血浆中10C12和13H6对FⅨ依赖性APTT和非FⅨ依赖性PT的作用。如图9A所示，两种抗体都特异性地延长APTT，但不改变PT。对照F(ab′)2(抗neurturin)既不延长APTT也不延长PT。其次，10C12和13H6的F(ab′)2都强烈干扰血小板依赖性凝血，结果与用它们单链形式所得的相似。10C12比13H6更强，它们的IC50分别是59.0±3nM和173±43nM(图7)。
10C12的F(ab′)2的种间交叉反应性-不同动物FⅨ-Gla区的氨基酸序列是高度保守的(图lA)，这提示：结合人FⅨ-Gla区的抗体可能也识别其他各种动物的血浆FⅨ/Ⅸa。所以，测定了10C12 F(ab′)2对不同物种血浆的抑制APTT的作用。如图9B所示，10C12 F(ab′)2对狗的延长APTT的作用最强，在大鼠和家兔的次之。对同样血浆的PT完全没有作用，这证明了抗体对FⅨ/Ⅸa作用的特异性。
在用磷脂囊泡(PCPS)的FⅧa∶FⅨa介导的FⅩ活化试验中评价抗体(图8)。我们观察到FⅩ活化速度的浓度依赖性抑制作用，10C12的最大速度半抑制是3.5±1.8nM,13H6是7.3±1.3nM。抗neurturin(α-NTN)的非相关性对照F(ab′)2对激活速度没有作用。然而，抗体对于FⅩa剪切生色底物S276的活性没有作用，该底物在试验第二阶段用于测定新形成FⅩa的浓度。所以，抗体的作用只是因为对内源性X酶功能的干扰。综合以上结果显示，10C12和13H6的F(ab′)2都特异性地抑制FⅨ/FⅨa功能，这与它们在ELISA型试验中表现出的结合特异性一致。
                        实施例710C12的抑制机制方法
FⅪa激活FⅨ。用微滴管，抗体与FⅨ在20mM hepes,pH7.5,0.15M NaCl,5mM CaCl2,0.05％BSA(HBSA缓冲液)中共培养。20分钟后，加入FⅪa启动反应。该反应混合物中FⅨ和FⅪa的浓度分别为400nM和1nM。每隔30秒取100μl在含125μl 30mM EDTA缓冲液-60％(v/v)乙二醇的96孔Costar板(Corning Inc.,Corning NY)中终止反应。加入乙二醇是因为它n5增强FⅨa的酰胺水解活性(Sturzebecher等(1997),FEBS lett.,412:295-300；Neuenschwander等(1997)，血栓与止血78(增刊)：428)。加入25μl 5mM FⅨ底物#299后，在动力微滴板读数仪(Molecular Devices,Menlo Park,CA)上，在405nm处测定FⅨa的酰胺水解活性。将被测抗体的抑制作用表示为FⅨa生成速度的分数(vi/vo)。
组织因子：FⅦa复合物激活FⅨ。按照Mimms等(1981)生物化学20:833-840所述，用PC/PS(7∶3摩尔比)重新脂化缺少细胞质区的TF(1-243)(Paborsky等(1989)，生物化学28:8072；Paborsky等(1991)，生物化学杂志266:21911-21916)。用表达全长TF(1-263)的人胚胎肾细胞系(293)制备膜TF(mTF)(Kelley等(1997)，同上)。以PBS洗涤细胞，用10mM EDTA解吸细胞，离心(2500rpm 10分钟)两次。将细胞沉淀重悬在Tris pH7.5中(4-5×107细胞/ml)，用棒式均质仪在PBS中均质化，然后4℃离心(2500rpm,Beckman GSA)40分钟。测定细胞膜组分的蛋白质浓度，将细胞膜分成等份，使用前保存在-80℃。
在微滴管中，抗体与FⅨ在HBSA缓冲液中共培养20分钟。使重新脂化的TF(1-243)(20mM)与FⅦa(5nM)事先形成复合物，至少10分钟。然后，将该复合物加入FⅨ/抗体培养溶液中。该反应混合物中，重新脂化的TF(1-243),FⅦa和FⅨ的浓度分别为4nM,1nM和400nM。为了mTF的实验，mTF(膜蛋白质浓度为750μg/ml)与50nM FⅦa事先形成复合物。这一浓度的mTF可以产生最大FⅦa活性，并等于用重新脂化TF(1-243)所见。该反应混合物中mTF和FⅦa的浓度分别为150μg/ml(膜蛋白质浓度)和1nM。每隔30秒取100μl反应混合物，在含125μl 30mM EDTA缓冲液-60％(v/v)乙二醇的96孔微滴板(Costar)中终止反应。加入25μl 5mM FⅨ底物#299后，在动力微滴板读数仪(Molecular Devices,MenloPark,CA)上，在405nm处测定FⅨa的酰胺水解活性。将被测抗体的抑制作用表示为FⅨa生成速度的分数(vi/vo)。根据FⅨab的标准曲线，测定在TF∶FⅦa和FⅪa试验中，反应期间被转化的酶原FⅨ不到15％。结果10C12的抑制机制
检测了10C12对FⅪa和TF∶FⅦa复合物介导的FⅨ活化的作用。最近，Struerzebecher等(1997),Febs lett.412:295-300和Neuenschwander等(1997)血栓和止血78(增刊)：428报道，乙二醇增强FⅨa对某些生色底物的酰胺水解活性。由此产生了一种用乙二醇增强新生FⅨa酰胺水解活性的FⅨ活化试验。如图10A所示，10C12以一种浓度依赖性方式抑制FⅪa将FⅨ转化为FⅨa(IC50=28.8±1.7μg/ml；±SD)。对照抗体即同样为亮氨酸拉链F(ab′)2形式的抗neurturin(NTN)没有作用。因为10C12结合FⅨ和FⅨa的Gla区，所以估计10C12不会干扰FⅨa剪切用来测定试验所产生FⅨa浓度的小生色底物的能力。为了验证这一假设，逐步升高FⅨa的浓度，与100μg/ml 10C12共培养，并用FⅨa底物进行测定。10C12不改变FⅨa剪切底物的速度，表明10C12只抑制FⅪa依赖性的FⅨ活化，而不抑制FⅨa的酰胺水解活性。
还用重新脂化的TF(1-243)与FⅦa的复合物测定了10C12对于FⅨ外源性活化的作用。10C12抑制FⅨ的转化，半最大抑制为34.2±1.6μg/ml，对照抗体(NTN)则没有作用(图10B)。然后，用膜TF(mTF)代替重新脂化的TF(1-243)。和用重脂化TF(1-243)进行的试验一样，所用的mTF浓度对于FⅦa的酶活性达到饱和。结果显示，10C12对FⅨ活化的抑制方式相同，IC50的浓度比重新脂化的TF(1-243)低(15.4±0.7μg/ml；±SD)(图10B)。为了进一步评价10C12对FⅨ的特异性，检测了它对另两种含Gla区凝血因子FⅦa和FⅩ的干扰。分别在10C12与FⅦa或底物FⅩ共培养20分钟后测定重新脂化TF(1-243)∶FⅦa(0.2nM/0.04nM)复合物激活FⅩ(200nM)的速度。在两种试验情况中，高达200μg/ml的10C12也不抑制FⅩa的产生，证实了10C12抗体的特异性。
豚鼠/大鼠内FⅨ-依赖性凝血的特异性抑制。我们检验了10C12对人FⅨ功能的特异性抑制是否对豚鼠和大鼠的FⅨ也同样有效。将10Cl2与柠檬酸化大鼠和豚鼠血液的低血小板血浆共培养，测定其对APTT和PT的作用。10C12特异性地延长豚鼠和大鼠血浆的APTT(图11)。对豚鼠的APTT两倍延长浓度是65μg/ml(650nM)，对大鼠是60μg/ml(600nM)。这样的效力几乎与在人血浆内的相同，其时，10C12两倍延长APTT的浓度是60μg/ml。对照抗体(NTN)对APTT和PT都没有作用。以上信息提示：10C12结合并中和豚鼠和大鼠血浆内的FⅨ/Ⅸa，而且因为PT不变，说明保持了其特异性。因为发现10C12具有种间交叉反应性和特异性，所以才能够在豚鼠和大鼠中建立的血栓形成模型中检验其抗血栓形成活性。
                              实施例8给予抗Ⅸ/Ⅸa Gla区抗体防止受伤颈动脉内的循环血流改变但不影响凝血或出血参数方法
带亮氨酸拉链10C12F(ab′)2抗体的生产与纯化。PCR扩增编码克隆10C12可变轻链和重链的cDNA，将其亚克隆到含人重链(Fd′)和轻链(λ)恒定区(Carter等(1992)，生物/技术10:163-167)，并在重链恒定区3′末端加有亮氨酸拉链序列(Kostelny等(1992)，免疫学杂志140:1547-1553)的表达载体内。在菌株W3110衍生的大肠杆菌K12菌株33B6(fhuA phoA-delta-E15delta(argF-lac)169 deoC2degP41(deltaPstI-kanR)IN(rrnDrrnE)lilvG2096)中表达该载体。细胞在一个通气的60L培养罐中，在培养基内30℃培养46小时，培养基起先含有12mg/l四环素，12g/l消化酪蛋白，5mM葡萄糖，47mM(NH4)2SO4,10mMNaH2PO4,18mMK2HPO4,4mM柠檬酸三钠，12mM MgSO4,250mM FeCl3和ZnSO4、CuSO4、CoCl2、H3BO3和NaMoO4各40mM。发酵过程中自动添加氨∶亮氨酸(35∶1摩尔比)以维持pH7.0和葡萄糖，将速度调至最大，以防止乙酸的积累。操作条件满足以3mmol/L-min供氧的要求。通过禁磷酸盐来诱导表达。最终的细胞密度为160OD550。收获大肠杆菌细胞沉淀，保存于-70℃。用锤将冷冻细胞沉淀粉碎成小块，用ultraturax组织匀浆仪将其与5倍体积20mM MES(2-{N-吗啉代}乙磺酸)/2M尿素/5mM EDTA/0.25M NaCl,pH5.0)(抽提缓冲液)混合，直至获得均匀的悬浮液。然后将细胞悬浮液通过匀浆仪(15M型，Gaulin Corp.,Everett,MA)以裂解细胞。用6N HCl将混合物调节至pH3.5，并6000×g离心20分钟，澄清抽提物。用NaOH重新将上清液的pH调至5.0。用4份20mM MES/2M尿素，pH5.0稀释上清液，用0.2微米滤膜(Millopore Corp.,Bedford,MA)过滤，将其上样到SP-SEPHAROSE快速阳离子交换树脂上，树脂事先以稀释缓冲液中平衡。先用同样缓冲液，然后用20mM MES,pH5.0彻底洗柱。分两步，用以20mM MES缓冲液pH5.0配制的0.5M NaCl和1M NaCl洗脱。在1M NaCl/20mM MES组份中回收10C12亮氨酸拉链F(ab′)2。将SP-SEPHAROSE合并液以多轮方式上样到蛋白G-SEPHAROSE快速柱上。该柱以20mM Tris/0.5M NaCl,pH7.5平衡和洗涤。用0.1M乙酸/0.15M NaCl,pH3.0洗脱，每轮运行后，柱用20mM Tris/2M盐酸胍，pH7.5再生。合并蛋白G洗脱混合物，用配有YM30膜的Amicon搅拌细胞系统(Amicon Inc.,Beverly,MA)浓缩约20倍。在SEPHADEX G25柱上以20mMNaPO4/0.15M NaCl,pH7.0对浓缩液进行缓冲液交换。将G25洗脱液通过20mMNaPO4/0.15M NaCl,pH7.0中的Q-SEPHAROSE快速柱，去除内毒素。最后的合并液含有12.5EU/mg蛋白质，将其通过0.22微米的滤膜。
用抗Neurturin的带亮氨酸拉链的F(ab′)2抗体(NTN)作为所有实验的对照抗体。该抗体也是在大肠杆菌内产生，并经蛋白G快速柱纯化的。以下将带亮氨酸拉链的对照F(ab′)2和带亮氨酸拉链的10C12 F(ab′)2简称为抗-neurturin抗体(NTN)和10C12抗体。两种抗体的分子量都算作100,000。
豚鼠动脉血栓形成模型。按照Carteaux等(1995)，循环91:1568-1574所述进行实验。用im.注射40mg/kg盐酸开他敏(Katasol-100R,Graub AG,Bem,Switzerland)和5mg/kg甲苯噻嗪2％(RompunR,Bayer AG,Leverkusen,Germany)来麻醉GOHI雄性豚鼠(350-450g,BRL,Fullinsdorf,Switzerland)。在右侧股动脉内插入导管压力转换器(Millar 2F Mikro-Tip SPC-320 MillarInstr.Inc.Houston,TX)，用来测定血压和心律。在左侧股动脉内插入导管(TriCath In 22G,Codan,Espergaerde,DK)用来取血样。另插入左颈静脉插管(TriCathIn 22G)用于给药。切开右颈动脉，将0.8mm直径的硅酮袖式多普勒流量探针(D-20-0.8型，Iowa Doppler Products,IA)与20MHz脉冲多普勒流速计模块(6-型202系统，Triton Technology,Inc.,SanDiego,CA)相连，用来监测血流速度。将血压(mmHg)，心律(跳/分钟)和颈动脉血流速(伏特)记录在一台Graphtec Linear记录仪Ⅶ(WR3101型，Hugo Sachs,March-Hugstetten,Germany)上。
通过左颈静脉插管给豚鼠推注一次盐水、10C12或对照抗体(NTN),15分钟后开始静脉损伤。按照现有技术(Carteaux等(1995)，同上；Roux等(1994)，止血71:252-256)用包有橡胶的镊子在切开的颈动脉上距多普勒流量探针2mm处夹住一段1mm的节段10秒钟，从而造成内皮下层损伤。损伤后，颈动脉血流速一般会下降，直至完全阻塞，然后轻轻振动受伤区松动血栓后，血流恢复。按照Folts(1991)，循环83：增刊IV3-14所述在狗冠状动脉血栓形成模型中建立循环血流变化(CFV)模式。如果5分钟内没有观察到CFV，就在第一次创伤的上端再夹一次。每隔5分钟重复同一过程，直到出现CFV。最后，记录40分钟观察期内产生CFV所需的钳夹次数。假设多次钳夹可能增加颈动脉内皮下层血栓形成性，计算CFV次数与钳夹次数之比，作为血栓形成指数(Carteaux等(1995)，同上)。在上述实验条件下，颈动脉的算得剪切率约1500-2800s-1(Roux等(1994)，同上)。
在给予抑制剂前(前-值)和给药60分钟后(后-值)收集血样，测定活化凝结时间(ACT)，凝血酶原时间(PT)，部分活化的促凝血酶原激酶时间(APTT)和血细胞数。还在实验前和实验后，测定了这些动物的指甲表皮出血时间。根据一次药物动力学中试实验确定引发血栓和采样的时间，中试中，静脉推注(5mg/kg,n=2)后15分钟内，APTT延长达到最大值，在此后的2小时内基本保持不变。样品的处理、凝血试验和出血时间方法如下所述。
豚鼠指甲表皮出血时间测定。指甲表皮出血法修改自狗(Giles等(1982)，血液学60:727-731)和家兔(Kelley等(1997)，血液学89:3219-3227,Himber等(1997)，止血78:1142-1149)凝血依赖性出血模型。用剪刀在指甲表皮尖处剪一个标准切口。爪子与38℃水的表面保持接触，让血自由流出。测定表皮出血时间，即血从切伤的表皮连续流出的时间。在给药前和给药后(60分钟)重复该过程3次。将治疗后值除以治疗前值，计算治疗后与治疗前之比。结果
10C12在豚鼠内的抗血栓形成和止血作用。为了评价10C12的体内抗血栓形成效力，使用先前建立的循环血流变化(CFV)豚鼠动脉血栓形成模型。在接受盐水的12只对照动物中，40分钟测量期内的变化次数(CFV)是11.2±1(±SEM)，算得血栓形成指数是9.3±1.5。给予对照抗体(NTN)的CFV是13.7±1.8，血栓形成指数是12.5±2.11。以上血栓形成和止血终点值与盐水对照都没有显著区别。所以，盐水和NTN对照的数据合用于后面与10C12治疗的比较。合并对照的平均血栓形成指数(±SEM)是10.4±1.2。如图12所示，推注的10C12浓度逐步提高引起剂量依赖性的CFV减少，在6μg/kg时出现十分显著的下降(p＜0.01)，在60μg/kg时CFV完全被抑制。在包括1000μg/kg在内的所有被测剂量，血压、心律、血细胞比容和血细胞数都保持不变(未给出数据)。同样，高达1000μg/kg,10C12也不明显影响APTT、ACT或PT(Kruskal-Wallis检验的p＞0.05)(表Ⅰ)。然而，如果用2-尾t-检验来比较各剂量组与对照，APTT和ACT出现剂量依赖性延长，在1000μg/kg时达到统计学显著性，而PT则没有。
表Ⅰ:10C12抗体对豚鼠内凝血参数的影响。数据为平均值±SEM
Rx    动物数    APTT延长      PT延长       ATC延长    指甲表皮出血时间延长
             (治疗后/前)A (治疗后/前)A (治疗后/前)A   (治疗后/前)A对照B      18    1.10±0.03    1.09±0.01    0.97±0.02    1.00±0.0310C12-3μg/kg     7    1.1 5±0.05   1.08±0.01    1.06±0.02    0.90±0.02-6μg/kg     7    1.07±0.03    1.08±0.02    0.97±0.03    0.92±0.06-10μg/kg    6    1.11±0.06    1.06±0.03    1.04±0.03    1.01±0.09-60μg/kg    3    1.18±0.10    1.10±0.01    1.01±0.09    0.78±0.04-1000μg/kg  3    1.31±0.07    1.04±0.02    1.23±0.14    0.97±0.05A：Rx给药前(治疗前)和给药后60分钟(治疗后)的测定值。B：盐水对照和对照抗体(NTN)试验的综合数据。
测定指甲表皮出血时间来评价10C12对正常止血的影响，此前在狗和家兔中，表皮出血时间表现为凝血依赖性。在给予10C12之前(治疗前值)和试验结束时(治疗后值；推注给药后60分钟)测定出血时间。虽然10C12具有强抗血栓形成作用，但它不延长出血时间。即使在1000μg/kg的浓度，指甲表皮出血时间仍然没有改变。在另一组豚鼠中评价最高剂量10C12(1000μg/kg)在早期对指甲表皮出血时间的作用。在这些实验中，在治疗后1分钟而不是60分钟后测定表皮出血时间、再出血发生率和总失血量。如表Ⅱ所示，10C12治疗组的以上参数有升高的倾向。然而，这些升高都不具备统计学上的显著性。而且，大多数情况下(9个对照中的8个，6个10C12治疗中的4个)，在第一次止血完成后，出血完全停止。
表Ⅱ:10C12抗体对豚鼠和大鼠内指甲表皮出血作用的比较。数据为平均值±SEM物种           动物数  指甲表皮出血时间A 再出血B   总失血量CRx                      (分钟)           (个数)       (mg)豚鼠对照D           9    3.1±0.4             1         90±2110C12-1000μg/kg 6    4.5±0.7             2         137±37大鼠对照D           10   2.5±0.4             10        494±10510C12-1000μg/kg 10   2.6±0.5             10        593±197
A：Rx给药后1分钟的测定值
B：在出血初次停止后再次指甲表皮出血的动物数
C：(指甲表皮横切后)30分钟内的出血总量
D：盐水对照和对照抗体(NTN)试验的综合数据。
                              实施例9给予抗Ⅸ/Ⅸa Gla区抗体在动脉血栓形成模型中减轻血块重量并缩短血管阻塞时间方法
FeCl3诱导的大鼠动脉血栓形成模型。如下修改Kurz等(1990)，凝血研究60:269-280的血栓形成模型。用异氟磷麻醉Sprague Dawley雄性大鼠(Harlan Labs,Indianapolis,IND)，在股静脉和股动脉内插入给药和取样导管(PE50聚乙烯管，Becton Dickinson and Co.,Sparks,ML)。大鼠体重为420-460g。手术和实验期间的体温保持在37℃。切开颈动脉，去除其周围组织，在近心脏动脉上放置一超声波流量探头(Transonic IR,Transonic Systems Inc.,Itheca,NY)。在探头上动脉周围放置一有缝聚乙烯管(PE205)，管中有一张以70％FeCl3饱和的3mm直径滤纸片。在放置滤纸片前和放置后的60分钟内监测血流量。用注射用无菌盐水将10C12、NTN或肝素稀释到适当的浓度。以单次推注1ml的方式给予不同剂量的10C12或NTN。肝素以负荷推注方式给予(100U/kg)后再进行65分钟的连续输注(1U/kg/min)(总体积为2m1)。肝素的对照是给予同样长时间和同样体积的注射用盐水。所有治疗都在放置滤纸片前5分钟通过静脉导管进行。在给药后1分钟(NTN和10C12)或30分钟(盐水和肝素)，如下所述测定尾出血时间。在第60分钟，切开动脉，取出所有血栓，用滤纸吸干，并称重。记录阻塞发生率和持续时间以及血栓重量作为血栓形成终点。在给药后第1、35和65分钟，从动脉导管抽取预定量的血样。如前所述分析这些血样的PT、APTT和ACT。
大鼠血栓形成模型中尾出血时间的失血量的测定。修改Dejana等((1982)，凝血与止血48:108-111所述的徒手尾部横切法，测定尾出血时间。实验期间，保持大鼠仰卧在一高台上，让它的尾巴与其身体所在平面垂直。将尾巴放入一个水夹套冷凝器(Kontes Glass,Baxter Healthcare Corp.,Deerfield,IL)的内腔，该冷凝器与一台恒温控制水循环器(American Medical System,Cincinnati,OH)相连，如此将尾巴的温度保持在37℃。在这种安排下，约10mm尾梢可供横切。用兽用指甲钳(Resco727型#400刀片，Tecla Co Inc.Walled Lake MI)横切5mm尾梢后测定出血时间。给药后1分钟(NTN和10C12)或30分钟(盐水和肝素)时进行以上过程。选择这些取样时间是为了与分别推注和输注相应的实验试剂后其浓度及其止血作用达到最大值的估计时间恰好相合。每隔30秒将血滴收集在一支事先称重的微量离心管中。记录出血完全停止，或滴血间隔开始大于30秒前的时间，作为出血时间。此时，将第二支试管放在尾巴下，收集其余的血(第二失血量)，直至尾横切后的30分钟。这30分钟的收集期后，灼烧伤口防止继续失血。将两支试管内的血液重量相加，计算出30分钟内的总失血量。
豚鼠和大鼠的其他指甲表皮出血时间和失血实验。因为豚鼠指甲表皮出血和大鼠尾出血对10C23治疗的应答方式之间有差异，为了确定差异的来源，进行了其他出血实验。在这些其他实验中，用同样的方法来测定豚鼠和大鼠的出血情况。简而言之，如相应的血栓形成模型中所述，麻醉动物插入给药导管。然而，不取血样，不测定血压或血栓形成。静脉推注给予对照(盐水或NTN)或给予1000μk/kg 10C12后1分钟，横切指甲表皮，如大鼠尾出血实验所述测定出血时间、再出血发生率和总失血量。结果
10C12和肝素在大鼠内的抗血栓形成和止血作用。检验了10C12和肝素对FeCl3-诱导的大鼠动脉血栓形成模型的作用。测定使用FeCl3后60分钟内血管阻塞的发生率和持续时间，评价抗血栓形成效力。此外，实验结束后回收血栓并称重。图13显示以盐水对照和10C12治疗的大鼠的代表性颈动脉血流曲线。推注对照抗体(2000μk/kg NTN)后，血栓形成和止血作用的终点值与盐水对照的都没有显著区别。所以，将盐水和NTN对照的数据综合起来用于与10C12和肝素治疗作比较。平均14.1±1.5分钟时，10个对照动物中都发生阻塞。只有一个动物的动脉血流在发生再阻塞之前大致恢复，在剩余实验时间内持续阻塞。对照的血块重量是2.8±0.2mg，血管阻塞时间是44.7±2.6分钟(图14)。给予500μk/kg 10C12对以上两参数和阻塞发生率都没有影响(5个全部)。在1000μg/kg,5个中2个的阻塞发生率降低(与对照相比的p≤0.05)，而血块重量降至0.66±0.17mg(对照的23.6±6.1)，血管阻塞时间降至9.6±8.9分钟(对照的1.5±19.9％)(图14)，在最高剂量2000μg/kg,10C12进一步缩短阻塞时间，5只大鼠中没有一只阻塞(与对照相比的p≤0.001)，平均血块重量降至0.26±0.08mg(是对照的9.2±2.3％)(图14)。在给药前和给药后的不同时刻抽取血样，测定对APTT/PT/ACT的作用。因为这些参数在给药后的60分钟内保持稳定，选用给药后30分钟的测定值与给药前的测定值比较。10C12中度、剂量依赖性地延长ATT和ACT，但不影响PT(表Ⅲ)，体现了10C12的体内特异性。相比之下，肝素(100U/kg推注和1U/kg/min输注)除影响ACT和PT之外还对APTT具有显著作用(表Ⅲ)，但不减轻血块重量或恢复血管通畅(图14)。
表Ⅲ:10C12抗体和肝素在对大鼠血浆凝血参数的作用。数据为平均值±SEMRx           动物数   APTT延长       PT延长         ACT延长
                 (治疗后/前)A  (治疗后/前)A  (治疗后/前)A对照B           10   1.00±0.02      0.98±0.01    0.90±0.0310C12-500μk/kg   5   1.13±0.14      0.97±0.01    1.06±0.02*
 -1000μk/kg  5   1.23±0.10      0.99±0.01    1.14±0.05**
 -2000μk/kg  5   1.67±0.15**   0.97±0.02    1.20±0.09**肝素-1U/kg/min    5   12.1±0.37**   1.24±0.09** 2.16±0.13**
A：给予Rx前和给予后35分钟的测定值
B：盐水对照和对照抗体(NTN)实验的综合数据
*p=0.05,**p=0.01(Kruskal-Wallis检验后的Mann-Whitney后几率)
如表Ⅳ所示，抗血栓形成活性剂量的10C12都没有延长尾出血时间。但却观察到了10C12对总失血量的明显作用。在对照动物中，尾横切处在2.0±0.3分钟后第一次止血完全，在此期间集得血液的重量是31.1±9.4mg。与横切开的豚鼠指甲表皮相比，所有对照动物尾部伤口有些持续渗血(速度低于半分钟一滴)，有些则开始间断地再出血。尽管持续渗血和/或再出血，第二期的平均失血量相对血液收集时间(平均48分钟)而言却较小(57.1±32.0mg)。给予10C12增加了第二期失血量，因此增加了总失血量(表Ⅳ)。虽然考虑了动物与动物之间的差异，但第二期失血以剂量依赖性方式增加，而且所有被测剂量的这种增加都具有统计学显著性。一期失血量没有受到显著影响。肝素也增加累计失血量。然而，与10C12相比，肝素增加的出血主要是因为延迟了止血栓的形成，这反映在尾出血时间的延长和一期失血量的增加上(表Ⅳ)。表Ⅳ:10C12抗体和肝素在大鼠内对出血时间和失血量的作用。数据为平均值±SEMRx           动物数 尾出血时间A一期失血量B二期失血量C 总失血量D
                   (分钟)      (mg)         (mg)        (mg)对照E          10    2.0±0.3    31.1±9.4 57.1±32.0   88.2±32.510C12-500μk/kg  5    2.0±0.4    78.8±41  424±216*   503±257
 -1000μk/kg 5    2.3±0.2    70.8±25  473±198**  544±209**
 -2000μk/kg 5    2.6±0.8    117±67   558±280**  674±343**肝素-1U/kg/min   5    16.5±5.6**319±195  178±77.2    497±142**
A：给予Rx后1分钟的测定值
B：测定出血时间期间的失血量
C：初次出血停止到横切后30分钟期间的失血量
D：(尾横切后)30分钟内的总失血量
E：盐水对照和对照抗体(NTN)实验的综合数据
*p=0.05,**p=0.01(Kruskal-Wallis检验后的Mann-Whitney后几率)
大鼠指甲表皮出血。因为在给予10C12后豚鼠指甲表皮和大鼠尾巴的失血方式如此不同，所以在另一组大鼠中进行指甲表皮出血实验。在大鼠尾出血实验中，对照和处理动物的指甲表皮横切处都发生渗血和/或再出血(1000μk/kg的10C12)。然而，与尾出血试验不同，10C12不增加大鼠指甲表皮的二期出血，因为对照和10C12治疗动物之间的之间表皮出血时间、再出血几率或总失血量没有差异(表Ⅱ)。
                      序列表<110>Genentech,Inc.<120>人抗因子Ⅸ/Ⅸa抗体<130>P1661R2PCT<141>1999-08-26<150>US 60/098,233<151>1998-08-28<150>US 60/122,767<151>1999-03-03<160>32<210>1<211>5<212>PRT<213>合成序列<220><223>用于组装信号链抗体的合成接头序列<400>1Gly Gly Gly Gly Ser1               5<210>2<211>43<212>PRT<213>犬属<400> 2Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Arg Gly Asn Leu Glu1               5                  10                  15Arg Glu Cys Ile Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu
              20                  25                  30Val Phe Glu Asn Thr Glu Lys Thr Thr Glu Phe Trp Lys
              35                  40<210>3<211>43<212>PRT<213>大鼠(Mus.musculus)<400>3Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Arg Gly Asn Leu Glu1               5                  10                  15Arg Glu Cys Ile Glu Glu Arg Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu
              20                  25                  30Val Phe Glu Asn Thr Glu Lys Thr Thr Glu Phe Trp Lys
              35                  40<210>4<211>43<212>PRT<213>家兔<400>4Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Ser Gly Asn Leu Glu1               5                  10                  15Arg Glu Cys Ile Glu Glu Arg Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu
              20                  25                  30Val Phe Glu Asn Thr Glu Lys Thr Thr Glu Phe Trp Lys
              35                  40<210>5<211>43<212>PRT<213>智人<400>5Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu1               5                  10                  15Arg Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu
              20                  25                  30Val Phe Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys
              35                  40<210>6<211>42<212>PRT<213>智人<400>6Ala Asn Ser Lys Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg1               5                  10                  15Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val
              20                  25                  30Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn
              35                  40<210>7<211>42<212>PRT<213>智人<400>7Ala Asn Ala Lys Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg1               5                  10                  15Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile
              20                  25                  30Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
              35                  40<210>8<211>42<212>PRT<213>智人<400>8Ala Asn Ser Lys Leu Glu Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg1               5                  10                  15Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile
              20                  25                  30Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser
              35                  40<210>9<211>42<212>PRT<213>智人<400>9Ala Asn Thr Lys Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg1               5                  10                  15Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala
              20                  25                  30Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala
              35                  40<210>10<211>5<212>PRT<213>智人<400>10Thr Tyr Ala Met His1               5<210>11<211>17<212>PRT<213>智人<400>11Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val1               5                 10                   15Lys Gly<210>12<211>11<212>PRT<213>智人<400>12Ala Ser Ile Ala Ala Ala Arg Val Leu Asp Tyr
   1                      5                     10<210>13<211>13<212>PRT<213>智人<400>13Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser1               5                  10<210>14<211>7<212>PRT<213>智人<400>14Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser1               5<210>15<211>11<212>PRT<213>智人<400>15Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Glu Phe Leu1               5                  10<210>16<211>17<212>PRT<213>智人<400>16Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val1               5                  10                  15Lys Gly<210>17<211>11<212>PRT<213>智人<220><221>不确定<222>7<223>未知氨基酸<400>17Ser Asp Tyr Gly Gly Asn Xaa Leu Gly Glu Phe1               5                  10<210>18<211>17<212>PRT<213>智人<400>18Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val1               5                  10                  15Lys Gly<210>19<211>11<212>PRT<213>智人<400>19Ala Ser Ile Ala Ala Gly Arg Val Leu Asp Tyr1               5                  10<210>20<211>17<212>PRT<213>智人<400>20Ile Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val1               5                  10                  15Lys Ser<210>21<211>5<212>PRT<213>智人<400>21Ser Tyr Ala Met His1               5<210>22<211>17<212>PRT<213>智人<400>22Val Ile Ser His Asp Gly Gly Lys Lys Glu Tyr Ala Asp Ser Val1               5                  10                  15Arg Gly<210>23<211>11<212>PRT<213>智人<400>23Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Thr Ile Ala Asp Asn1               5                  10<210>24<211>10<212>PRT<213>智人<400>24Thr Gly Ser Ser Arg Asp Val Asp Val Ser1               5                  10<210>25<211>7<212>PRT<213>智人<400>25Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser1               5<210>26<211>10<212>PRT<213>智人<400>26Ser Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Asn Val Val1               5                  10<210>27<211>5<212>PRT<213>智人<400>27Asp Tyr Ala Met His1               5<210>28<211>17<212>PRT<213>智人<400>28Thr Ile Ser Pro Ser Gly Arg Ser Thr Tyr Asn Ala Asp Ser Val1               5                  10                  15Lys Gly<210>29<211>11<212>PRT<213>智人<400>29Arg Gly Ile Gly Tyr Lys Gly Gly Phe Asp Val1               5                  10<210>30<211>13<212>PRT<213>智人<400>30Ser Gly Gly Arg Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Lys1               5                  10<210>31<211>7<212>PRT<213>智人<400>31Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser1               5<210>32<211>12<212>PRT<213>智人<400>32Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Arg Gly Ser Arg Val1              5                   10

Claims (22)

1．一种组合物，含有与因子Ⅸ/Ⅸa的Gla区反应的人抗体或抗体片段。
2．根据权利要求1所述的组合物，其中的抗体或抗体片段选自：
(a)亲代抗体或抗体片段，它具有：
    含CDR1,CDR2和CDR3氨基酸序列的重链可变区，其中CDR1的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:21；
    其中CDR2的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:16,SEQID NO:18,SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22；
    其中CDR3的氨基酸序列选自：SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:17,SEQID NO:19和SEQ ID NO:23；
    (b)(a)的变异体，对人因子Ⅸ/Ⅸa的Gla区具有至少相当于亲代抗体或抗体片段的亲合力；
    (c)(a)的变异体，与亲代抗体或抗体片段竞争结合人因子Ⅸ/Ⅸa的Gla区。
3．根据权利要求2所述的抗体组合物，其中的重链可变区具有SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。
4．根据权利要求2所述的抗体组合物，其中的重链可变区具有SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。
5．根据权利要求2所述的抗体组合物，其中的重链可变区具有SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
6．根据权利要求2所述的抗体组合物，其中的重链可变区具有SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:12。
7．根据权利要求2所述的抗体组合物，其中的重链可变区具有SEQ IDNO:21,SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。
8．根据权利要求2所述的抗体组合物，其中的亲代抗体或抗体片段还含有轻链(1c)可变区，该区包含lc-CDR1,lc-CDR2和lc-CDR3氨基酸序列，其中lc-CDR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:24；lc-CDR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:25；lc-CDR3的氨基酸序列选自SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:26。
9．根据权利要求8所述的抗体组合物，其中的轻链可变区具有SEQ IDNO:13,SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
10．根据权利要求8所述的抗体组合物，其中的轻链可变区具有SEQ IDNO:24,SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。
11．根据权利要求8所述的抗体组合物，其中的重链可变区具有SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，而其中的轻链可变区具有SEQ IDNO:13,SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
12．根据权利要求8所述的抗体组合物，其中的重链可变区具有SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，而其中的轻链可变区具有SEQ IDNO:13,SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
13．根据权利要求8所述的抗体组合物，其中的重链可变区具有SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19，而其中的轻链可变区具有SEQ IDNO:13,SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
14．根据权利要求8所述的抗体组合物，其中的重链可变区具有SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:12，而其中的轻链可变区具有SEQ IDNO:13,SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
15．根据权利要求8所述的抗体组合物，其中的重链可变区具有SEQ IDNO:21,SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23，而其中的轻链可变区具有SEQ IDNO:24,SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。
16．分离的核酸，它编码权利要求1所述的抗体或抗体片段。
17．一种载体，它含有权利要求16所述的核酸序列。
18．一种宿主细胞，它包含权利要求17所述的载体。
19．一种制备抗体或抗体片段的方法，它包括：在适合核酸表达的条件下培养权利要求18所述的宿主细胞。
20．一种产品，它包括：
    (a)一个容器；
    (b)所述容器上的标签；和
    (c)装在所述容器内含权利要求1所述抗体或抗体片段的组合物；其中的组合物可有效治疗凝血性疾病，而所述容器上可能具有的标签则说明该组合物可用于治疗凝血性疾病。
21．一种治疗哺乳动物的方法，它包括：给予该动物治疗有效量的含权利要求1所述抗体或抗体片段的组合物。
22．一种药物组合物，含有权利要求1所述抗体或抗体片段。
CNB998100838A 1998-08-28 1999-08-26 人抗因子IX/IXa抗体 Expired - Lifetime CN1183160C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9823398P 1998-08-28 1998-08-28
US60/098,233 1998-08-28
US12276799P 1999-03-03 1999-03-03
US60/122,767 1999-03-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1317015A true CN1317015A (zh) 2001-10-10
CN1183160C CN1183160C (zh) 2005-01-05

Family

ID=26794469

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB998100838A Expired - Lifetime CN1183160C (zh) 1998-08-28 1999-08-26 人抗因子IX/IXa抗体

Country Status (15)

Country Link
US (3) US6624295B1 (zh)
EP (1) EP1107996B1 (zh)
JP (1) JP4638035B2 (zh)
CN (1) CN1183160C (zh)
AT (1) ATE217889T1 (zh)
AU (1) AU766551C (zh)
BR (1) BR9913435A (zh)
CA (1) CA2341276C (zh)
DE (1) DE69901569T2 (zh)
DK (1) DK1107996T3 (zh)
ES (1) ES2177316T3 (zh)
IL (1) IL140917A0 (zh)
NZ (1) NZ509430A (zh)
PT (1) PT1107996E (zh)
WO (1) WO2000012562A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108431045A (zh) * 2015-09-01 2018-08-21 免疫功坊股份有限公司 用以预防血栓形成及/或治疗血栓的分子构建体
CN110325211A (zh) * 2016-12-23 2019-10-11 诺华股份有限公司 采用抗因子XI/XIa抗体治疗的方法
CN116333145A (zh) * 2023-04-14 2023-06-27 北京基科晟斯医药科技有限公司 结合活化凝血因子ix的抗体

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT411997B (de) * 1999-09-14 2004-08-26 Baxter Ag Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate
SE0000675D0 (sv) * 2000-03-02 2000-03-02 Protease Ab Monoclonal antibodies
DE10012732A1 (de) * 2000-03-18 2001-09-20 Aventis Behring Gmbh Thrombin-Zubereitungen und Verfahren zu ihrer Herstellung
WO2001087339A1 (en) * 2000-05-15 2001-11-22 Smithkline Beecham Corporation Antithrombotic agents
GB2378949B (en) * 2001-08-16 2005-09-07 Morten Steen Hanefeld Dziegiel Recombinant anti-plasmodium falciparum antibodies
DE10311248A1 (de) 2003-03-14 2004-09-30 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper
GB0309126D0 (en) * 2003-04-17 2003-05-28 Neutec Pharma Plc Clostridium difficile focussed antibodies
EP1531162A1 (en) * 2003-11-14 2005-05-18 Heinz Vollmers Adenocarcinoma specific antibody SAM-6, and uses thereof
DE10353175A1 (de) 2003-11-14 2005-06-16 Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. Humaner monoklonaler Antikörper mit fettsenkender Wirkung
GB0414886D0 (en) 2004-07-02 2004-08-04 Neutec Pharma Plc Treatment of bacterial infections
DK1905839T4 (da) * 2006-09-22 2019-10-07 Wacker Chemie Ag Fremgangsmåde til fermentativ fremstilling af proteiner
WO2010045388A2 (en) * 2008-10-14 2010-04-22 Dyax Corp. Use of mmp-9 and mmp-12 binding proteins for the treatment and prevention of systemic sclerosis
MX2012011065A (es) 2010-03-30 2012-10-10 Octapharma Ag Proceso para purificacion de proteina de factor de crecimiento.
RU2731720C2 (ru) * 2010-03-30 2020-09-08 Октафарма Аг Способ очистки витамин к-зависимых белков, таких как коагуляционный фактор vii
JP2013523179A (ja) * 2010-04-13 2013-06-17 メディミューン，エルエルシー フィブロネクチンタイプｉｉｉドメインに基づく多量体足場
JP6016789B2 (ja) * 2011-05-23 2016-10-26 積水メディカル株式会社 Ｐｉｖｋａ−ｉｉ測定試薬における非特異反応の抑制方法
US11220554B2 (en) 2018-09-07 2022-01-11 Novo Nordisk A/S Procoagulant antibodies

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3720983A1 (de) * 1987-06-25 1989-01-05 Hoechst Ag Immunometrisches bestimmungsverfahren
WO1991016353A1 (en) 1990-04-23 1991-10-31 Corvas International N.V. Thrombus-specific antibody derivatives
ATE204299T1 (de) 1993-03-05 2001-09-15 Bayer Ag Humane monoklonale anti-tnf alpha antikörper
PT699237E (pt) 1994-03-17 2003-07-31 Merck Patent Gmbh Fvs de cadeia anti-egfr e anticorpos anti-egfr
MA24512A1 (fr) 1996-01-17 1998-12-31 Univ Vermont And State Agrienl Procede pour la preparation d'agents anticoagulants utiles dans le traitement de la thrombose

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108431045A (zh) * 2015-09-01 2018-08-21 免疫功坊股份有限公司 用以预防血栓形成及/或治疗血栓的分子构建体
CN108431045B (zh) * 2015-09-01 2022-05-13 免疫功坊股份有限公司 用以预防血栓形成及/或治疗血栓的分子构建体
CN110325211A (zh) * 2016-12-23 2019-10-11 诺华股份有限公司 采用抗因子XI/XIa抗体治疗的方法
CN116333145A (zh) * 2023-04-14 2023-06-27 北京基科晟斯医药科技有限公司 结合活化凝血因子ix的抗体
CN116333145B (zh) * 2023-04-14 2023-11-07 北京基科晟斯医药科技有限公司 结合活化凝血因子ix的抗体

Also Published As

Publication number Publication date
ATE217889T1 (de) 2002-06-15
AU766551B2 (en) 2003-10-16
ES2177316T3 (es) 2002-12-01
DK1107996T3 (da) 2002-09-16
BR9913435A (pt) 2001-09-25
US7049411B2 (en) 2006-05-23
AU5692399A (en) 2000-03-21
US6624295B1 (en) 2003-09-23
US20060088534A1 (en) 2006-04-27
IL140917A0 (en) 2002-02-10
US20060193851A1 (en) 2006-08-31
EP1107996B1 (en) 2002-05-22
US7354585B2 (en) 2008-04-08
DE69901569D1 (de) 2002-06-27
PT1107996E (pt) 2002-10-31
WO2000012562A1 (en) 2000-03-09
NZ509430A (en) 2002-04-26
EP1107996A1 (en) 2001-06-20
JP4638035B2 (ja) 2011-02-23
DE69901569T2 (de) 2002-12-19
JP2002523081A (ja) 2002-07-30
CA2341276A1 (en) 2000-03-09
AU766551C (en) 2005-02-17
CN1183160C (zh) 2005-01-05
CA2341276C (en) 2005-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1317015A (zh) 人抗因子IX/IXa抗体
RU2426741C2 (ru) Антагонистические антитела к il-17
RU2636038C2 (ru) Композиции для ингибирования masp-2-зависимой активации комплемента
TW201417829A (zh) 預防及治療與補體相關之眼部病症
US20210246212A1 (en) Anti-gpiib/iiia antibodies and uses thereof
CN1575302A (zh) 人组织因子抗体
TW201831508A (zh) 紅血球標靶因子ｖｉｉｉ及其使用方法
US20220305133A1 (en) Soluble Complement Receptor Type 1 Variant Conjugates and Uses Thereof
TW201043693A (en) Anti-Rhesus D monoclonal antibody
WO2000001731A1 (fr) Proteine fusionnee avec liaison directe du recepteur il-6 a il-6
CN1931878A (zh) 抗血小板聚集的嵌合型单克隆抗体或/及其片段
CN1845937A (zh) 抗il－20抗体和结合伴侣以及在炎症中的使用方法
WO2023036774A1 (en) Antibodies binding to tetanus toxin and uses thereof
BE1009021A5 (fr) Thrombopoietine.
MXPA01001687A (en) HUMAN ANTI-FACTOR IX/IXa ANTIBODIES
ZA200100681B (en) Human anti-factor IX/IXA antibodies.
NZ619385B2 (en) Inhibitory anti -factor xii/xiia monoclonal antibodies and their uses

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20050105

CX01 Expiry of patent term