CN108431045B - 用以预防血栓形成及/或治疗血栓的分子构建体 - Google Patents

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Abstract

本揭示提出了多种分子构建体，这些分子构建体具有一靶向组件与一效应组件。此处亦揭示了利用所述分子构建体来治疗多种疾病的方法。

Description

用以预防血栓形成及/或治疗血栓的分子构建体
技术领域
本揭示涉及药学领域；更明确地说，是涉及多功能的分子构建体，譬如具有靶向组件与效应组件以将效应组件(如治疗药物)递送至靶位的分子构建体。
背景技术
近年来，本领域发展出多种筛检与选择以抗原为靶点的单抗(monoclonalantibodies，mAbs)的方法，进而带动许多治疗用抗体的研发，为一些不久前还被认为是不治之症的疾病带来曙光。根据治疗性抗体数据库(Therapeutic Antibody Database)的统计，有多达2,800种左右的抗体已经或即将投入人体临床试验。从与抗体疗效相关的大量数据中可以得知抗体是基于何种药理机制而发挥其疗效。
以抗体作为治疗药剂时，其主要的药理机制是利用抗体来中和或诱捕造成疾病的介质；所述介质可能是存在于血液循环、间质空间(interstitial space)或淋巴结中的细胞因子或免疫成分。中和所述介质的活性可抑制造成疾病的介质和其受体之间的互动。此外，可将细胞因子的可溶性受体或受体的细胞外部分和免疫球蛋白IgG的Fc部分制成融合蛋白，此种融合蛋白可利用类似中和抗体的机制来中和上述细胞因子或免疫因子；因此目前也开发出多种融合蛋白治疗剂。
另外，某些取得临床使用许可或正在进行临床研究的治疗性抗体则是采用了与上述主要抗体机制不同的机制，来发挥其药理作用，譬如可藉由和受体结合以阻断这些受体和其配体之间的互动。对此类抗体药物来说，其主要的药理机制并非由Fc-介导的机制(如抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)或是补体介导的细胞溶解(complement-mediated cytolysis，CMC)等)。
另一些治疗性抗体可和目标细胞上的某些表面抗原结合，并藉此在目标细胞上发挥Fc介导的功能以及其它机制。最重要的Fc介导的机制为抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体介导的细胞溶解(CMC)，这两种机制都会将与抗体结合的目标细胞溶解。这些抗体和特定的细胞表面抗原结合后，可使得与其结合的目标细胞发生细胞凋亡。
制备具有双重特异性的抗体的概念与方法，早在三十年前就已萌芽。近年来，随着重组抗体工程方法的进步、以及对于更好药物的需求驱使下，发展出了多种具有不同结构构形的双特异性抗体。
举例来说，双价或多价抗体可能带有两种或更多种抗原结合位。已知有多种方法可用以制备多价抗体，这些方法通常利用连接结构将三或四种抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)共价地连接在一起。举例来说，已通过重组工程制备出能表达三或四个串联(tandem)的Fab重复片段的抗体。
此外，利用合成的交联物(crosslinker)，通过化学方法将不同的抗体或结合部位连接在一起，以制造出多价抗体的方法也是本领域公知的技术。其中一种方式是利用不同的接合物(linker)，将三、四或更多个分离的Fab片段，通过化学交联的方式彼此接合。另一种方式是先制备一个具有多个Fab的构建体，将这些Fab组装成一维的DNA支架(one-dimensional DNA scaffold)。这些经设计可和目标分子结合的各种多价抗体构建体彼此之间的尺寸、半衰期、构形弹性以及调节免疫系统的能力各不相同。基于以上说明，已有部分研究着眼于制备效应组件数目固定的分子构建体或具有两种或更多种不同功能性组件(譬如至少一靶向组件与至少一效应组件)的分子构建体。然而，通常很难利用化学合成或重组技术等方法，来建立具有特定靶向与效应组件组合的分子构建体。因此，本领域亟需一种新颖的分子平台，其可用以建构适用于多种疾病的各种分子。
发明内容
<I>基于肽核的多臂接合物
本揭示的第一种方面是关于一种接合单元，其上连接了至少两种不同的功能性组件。举例来说，所述接合单元可连接有：两种不同的效应组件、一种靶向组件与一种效应组件、或一种效应组件与可延长接合单元的生命周期的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链。本发明接合单元经设计成带有至少两种不同的官能团，使得这些功能性组件能够和对应的官能团反应而与接合单元相连接。因此，本发明接合单元可作为用以制备带有两种或更多种功能性组件的分子构建体的平台。
根据本揭示多种实施方式，所述接合单元包含一中心核及多个连接臂。中心核为多肽核，其包含2至15个赖氨酸(lysine，K)残基，其中每一个K残基和下一个K残基之间由一填充序列所隔开，所述填充序列包含甘氨酸(glycine，G)与丝氨酸(serine，S)残基；或者是，所述多肽核的序列为(Xaa-K)n，其中Xaa是具有2至12个乙二醇(ethylene glycol，EG)重复单元的聚乙二醇化氨基酸(PEGylated amino acid)，且n为2至15的整数。在视需要而实施的实施方式中，填充序列是由2至20个氨基酸残基所组成。于多种实施方式中，填充序列可具有以下任一种序列：GS、GGS、GSG或序列编号1-16所示序列。根据本揭示某些实施方式，中心核包含2至15个单元的G1-5SK序列；在较佳的情形中，中心核的序列为(GSK)2-15。每一连接臂藉由和K残基形成酰胺键而连接于中心核的K残基。连接臂的自由端(即，未连接于中心核的一端)有一顺丁烯二酰亚胺基(maleimide group)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)基、叠氮基(azide group)、炔基(alkyne group)、四嗪基(tetrazine group)、环辛烯基(cyclooctene group)或环辛炔基(cyclooctyne group)。此外，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基有一叠氮基或炔基；或者是或额外地，令位于中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸(C)残基，氨酸其中氨基酸残基的巯基与一其自由端具有一叠氮基、炔基、四嗪基或环辛烯基或环辛炔基的耦合臂相连。
根据本揭示多种实施方式，所述接合单元还包含多个第一组件。于某些实施方式中，藉由在连接臂和第一组件之间形成酰胺键，而将每一第一组件连接至连接臂。在其它实施方式中，通过发生在连接臂与第一组件之间的硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应、铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反应、应力促进的叠氮化物-炔羟点击化学(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反应或逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反应，而将每一第一组件连接至连接臂。
根据本揭示某些实施方式，当多个所述第一组件是通过CuAAC或SPAAC反应而分别连接至多个所述连接臂时，则位于中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端是四嗪基或环辛烯基。根据本揭示其它实施方式，当多个所述第一组件是通过iEDDA反应而分别连接至多个所述连接臂时，则位于中心核N-或C-端的氨基酸残基具有所述叠氮基或炔基；或位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端为叠氮基、炔基或环辛炔基。
在某些实施方式中，所述连接臂为一PEG链；在较佳情形中，其具有2至20个EG重复单元。于某些其他实施方式中，所述耦合臂为一PEG链；在较佳情形中，其具有2至12个EG重复单元。
带有叠氮基的氨基酸残基实例包括：L-叠氮高丙氨酸(L-azidohomoalanine，AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸(4-azido-L-phenylalanine)、4-叠氮-D-苯丙氨酸(4-azido-D-phenylalanine)、3-叠氮-L-丙氨酸(3-azido-L-alanine)、3-叠氮-D-丙氨酸(3-azido-D-alanine)、4-叠氮-L-高丙氨酸(4-azido-L-homoalanine)、4-叠氮-D-高丙氨酸(4-azido-D-homoalanine)、5-叠氮-L-鸟氨酸(5-azido-L-ornithine)、5-叠氮-D-鸟氨酸(5-azido-D-ornithine)、6-叠氮-L-赖氨酸(6-azido-L-lysine)以及6-叠氮-D-赖氨酸(6-azido-D-lysine)。例示性的带有炔基的氨基酸残基包括：L-高炔丙基甘氨酸(L-homopropargylglycine，L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-homopropargylglycine，D-HPG)以及β-高炔丙基甘氨酸(beta-homopropargylglycine、β-HPG)。
当位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基时，位于耦合臂自由端的环辛烯基可以是反式-环辛烯(trans-cyclooctene，TCO)基，而位于耦合臂自由端的环辛炔基则可以是二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化环辛炔(difluorinatedcyclooctyne，DIFO)、二环壬炔(bicyclononyne，BCN)或二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)基。或者，位于耦合臂自由端的四嗪基包括，但不限于：1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及1,2,4,5-四嗪基，以及其衍生物，譬如6-甲基四嗪基。
根据本揭示的多种视需要而实施的实施方式，第一组件是可在个体体内发挥预期效果(如，治疗效果)的效应组件；或者是，第一组件是能够将接合单元导引至目标部位的靶向组件。根据本发明实施方式，第一组件是对纤维素特异的单链可变片段(single-chainvariable fragment，scFv)。
在有需要的情形中，接合单元还包含与第一组件不同的第二组件。在某些实施方式中，第二组件带有叠氮基或炔基，使得其可和中心核或耦合臂的对应炔基或叠氮基进行CuAAC反应，进而与中心核或耦合臂耦接。或者是，在某些实施方式中，第二组件带有叠氮基或环辛炔基，使得其可和中心核或耦合臂的对应环辛炔基或叠氮基进行SPAAC反应，进而与中心核或耦合臂耦接。又或者是，于一些实施方式中，第二组件带有四嗪基或环辛烯基，而使得其可和中心核或耦合臂的对应环辛烯基或四嗪基进行iEDDA反应，进而与中心核或耦合臂耦接。根据本揭示某些实施方式，所述第二组件是组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogen activator)、第Xa型凝血因子抑制剂或凝血酶抑制剂。组织型纤溶酶原激活剂的例示性实施方式包括：阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase)与拉诺普酶(lanoteplase)。第Xa型凝血因子抑制剂系选自由以下组成的群组：阿哌沙班(apixaban)、伊度沙班(edoxaban)与利伐沙班(rivaroxaban)。凝血酶抑制剂可以是阿加曲班(argatroban)或美拉加群(melagatran)。
于一些特定的实施方式中，所述接合单元还包含视需要而加入的第三组件，此种第三组件和第一、第二组件不同。在第二组件直接与中心核连接的情形中，所述中心核的另一端(即，未与第二组件连接的自由端)可视需要而为半胱氨酸残基，该残基可用以引入非必要的第三组件。具体来说，半胱氨酸残基的硫氢基可和一PEG链上的顺丁烯二酰亚胺基反应，而该与中心核连接的PEG链在此称为“耦合臂”；上述耦合臂的自由端带有四嗪基或环辛烯基。如此一来，第三组件即可通过iEDDA反应而与耦合臂连接。在较佳的情形中，第三组件是能够改善接合单元药动学性质的组件。分子量为20,000至50,000道耳顿(daltons)的长PEG链就是能改善接合单元药动学性质的组件的一个例子。
<II>基于肽核的多臂接合物的用途
在临床医学领域中，根据本揭示第一方面的接合单元可用于治疗多种疾病。因此，本揭示的第二种方面是关于治疗这些疾病的方法。根据本揭示多种实施方式，用以治疗特定疾病的方法包含以下步骤：对有需要的个体投予治疗有效量的接合单元，所述接合单元可以是根据本揭示上述方面与实施方式的任一种接合单元。可理解的是，可将所述接合单元以药学配方的形式施用，此种药学配方除了包含本发明接合单元外，还包含适用于所欲给药方式的药学上可接受的赋型剂。
根据本揭示某些实施方式，此处提出的接合单元可用以预防血栓形成。在这些实施方式中，第一组件是对纤维素特异的scFv，而第二组件是第Xa型凝血因子抑制剂或凝血酶抑制剂。所述第Xa型凝血因子抑制剂系选自由阿哌沙班、伊度沙班与利伐沙班所组成的群组。所述凝血酶抑制剂可以是阿加曲班或美拉加群。
根据本揭示其它实施方式，所述接合单元可用以治疗血管栓塞，此种接合单元包含对纤维素特异的scFv(作为第一组件)以及组织型纤溶酶原激活剂(作为第二组件)。组织型纤溶酶原激活剂的例示性实施例包括：阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶与拉诺普酶。
<III>具有靶向部分及效应部分的分子构建体
在第三方面中，本揭示是关于一种分子构建体，其包含两个彼此直接或间接耦接的接合单元，其中一接合单元的中心核能够与至少一靶向组件连接，而另一接合单元的中心核则能够与至少一效应组件连接。本发明分子构建体的优点在于上述两个接合单元可通过iEDDA、SPAAC或CuAAC反应而彼此耦接。此设计使得开发人员能够便捷地合成具有复杂结构的分子构建体。根据本揭示的原理与精神，可以独立地制备两种接合单元，其分别携带不同数目和/或类型的功能性组件，之后再将两者耦接到一起。如此一来，本发明所属技术领域的普通技术人员能够建构多个分子构建体库，所述分子构建体分别携带不同功能性组件，而后再视需求和/或所欲的应用，从这些库中选择并结合两种分子构建体(或接合单元)，以得到所需的构建体。更可藉由调整中心核内特定官能团的数目，来控制每一接合单元所携带的功能性组件的数目。
根据本揭示的一实施方式，所述分子构建体包含一第一接合单元以及一第二接合单元。具体来说，第一接合单元包含(1)一第一中心核、(2)分别连接于第一中心核的一或多个连接臂(下文称为第一连接臂)、(3)分别连接于上述第一连接臂的一或多个组件(下文称为第一组件)、以及(4)视需要而加入的一耦合臂(下文称为第一耦合臂)；第二接合单元包含(1)一第二中心核、(2)分别连接于第二中心核的一或多个连接臂(下文称为第二连接臂)、(3)分别连接于上述第二连接臂的一或多个组件(下文称为第二组件)、以及(4)视需要而加入的一耦合臂(下文称为第二耦合臂)。第一与第二接合单元通过发生在以下任一种情形中的iEDDA、SPAAC或CuAAC反应而彼此耦接：第一与第二中心核之间、第一耦合臂与第二中心核之间、第一与第二耦合臂之间或第一中心核与第二耦合臂之间。
根据本揭示的实施方式，第一与第二中心核都具有多个氨基。每一连接臂藉由在其间形成酰胺键，而连接于中心核；举例来说，可在N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)基和氨基之间形成。当连接于中心核之后，上述连接臂的自由端因此具有带有NHS基、顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基。
当连接臂的自由端带有NHS基时，第一组件与第二组件藉由形成于组件(即，第一组件或第二组件)与连接臂(即，第一连接臂或第二连接臂)之间的酰胺键而分别连接于第一与第二连接臂。当连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基时，第一组件与第二组件可通过组件(即，第一组件或第二组件)与连接臂(即，第一连接臂或第二连接臂)间的以下反应而分别连接于第一与第二连接臂：硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应、CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应。
根据本揭示某些实施方式，每一连接臂是一条具有2至20个EG重复单元的PEG链。根据本揭示其他实施方式，每一耦合臂是一条具有2至12个EG重复单元的PEG链。
根据本揭示多种实施方式，第一或第二中心核可以是化合物核或多肽核。在某些例子中，第一与第二中心核都是化合物核，且两者可以采用相同或不同的化合物作为核心。在某些较佳的实施方式中，第一与第二中心核都是多肽核，且两者具有相同或不同的序列。或者是，两个核心其中一个是化合物核，而另一个是多肽核。
适合作为本发明化合物核的化合物包括但不限于：苯-1,3,5-三胺(benzene-1,3,5-triamine)、2-(氨甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺(2-(aminomethyl)-2-methylpropane-1,3-diamine)、三(2-氨乙基)胺(tris(2-aminoethyl)amine)、苯-1,2,4,5-四胺(benzene-1,2,4,5-tetraamine)、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-联苯(3,3’,5,5’-tetraamine-1,1’-biphenyl)、四(2-氨乙基)甲烷(tetrakis(2-aminoethyl)methane)、四(乙胺)肼(tetrakis(ethylamine)hydrazine)、N,N,N’,N’,-四(氨乙基)乙二胺(N,N,N’,N’,-tetrakis(aminoethyl)ethylene-diamine)、苯-1,2,3,4,5,6-六胺(benzene-1,2,3,4,5,6-hexaamine)、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺(1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-hexakis(methylamine)-benzene-1,3,5-triamine)、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺(1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-octakis(methylamine)-benzene-1,2,4,5-triamine)以及N,N-二[(1-氨基-3,3-二氨乙基)戊基]甲烷二胺(N,N-bis[(1-amino-3,3-diaminoethyl)pentyl]methanediamine)。
在中心核为化合物核的例子中，耦合臂可藉由和中心核的多个氨基的其中之一形成酰胺键，而连接到中心核。同时，耦合臂的自由端带有叠氮基、炔基、环辛烯基、环辛炔基或四嗪基。
根据本揭示某些实施方式，可作为本发明多肽核的多肽可包含多个赖氨酸(K)残基，可选地为2至15个。此外，每一个K残基和下一个K残基之间由一填充序列所隔开，所述填充序列包含甘氨酸(G)与丝氨酸(S)残基；在非必要的实施方式中，填充序列系由2至20个氨基酸残基所组成。于多种实施方式中，填充序列可具有任一种以下序列：GS、GGS、GSG或序列编号1-16所示序列。在某些实施方式中，上述多肽包含2-15个单元的G1-5SK序列；譬如(GSK)2-15。或者是，所述多肽核具有(Xaa-K)n序列，其中Xaa为具有2至12个乙二醇(EG)重复单元的聚乙二醇化氨基酸，且n为2至15的整数。
在中心核为多肽核的情形中，其N-或C-端可以是半胱氨酸残基。在这些例子中，耦合臂通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而连接于中心核的半胱氨酸残基。上述耦合臂的自由端带有叠氮基、炔基、环辛烯基、环辛炔基或四嗪基。
第一与第二接合单元可通过多种构形而彼此耦接，端视第一与第二耦合臂是否存在，下文将进一步说明这些构形。对于采用化合物核的接合单元，较佳应通过耦合臂(即，第一或第二耦合臂)而和另一接合单元耦接；而对于采用多肽核的接合单元，耦合臂则不是必要的组件。
当第一与第二接合单元分别包含耦合臂时，一耦合臂(举例来说，第一耦合臂)的自由端带有四嗪基，而另一耦合臂(在本例中，第二耦合臂)的自由端带有环辛烯基，而使得两个接合单元可通过发生于两个耦合臂(即，第一与第二耦合臂)之间的iEDDA反应而彼此耦接。在较佳的情形中，上述四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及1,2,4,5-四嗪基或其衍生物，譬如6-甲基四嗪基；而环辛烯基为TCO基。同样的情形亦适用于两个耦合臂的自由端分别带有叠氮基与炔基的例子；此时，两个二接合单元是通过发生于两个耦合臂(即，第一与第二耦合臂)之间的CuAAC反应而彼此耦接。或者是，一耦合臂(譬如，第一耦合臂)带有叠氮基，而另一耦合臂(在本实施例中，第二耦合臂)带有环辛炔基(在较佳的情形中，带有DBCO、DIFO、BCN或DICO基)；因此，两个耦合臂可通过SPAAC反应而耦接。当两个单元都是化合物核或多肽核时，或是当一接合单元为化合物核而另一单元为多肽核时，就可采用上述构形。
当只有一个接合单元具有耦合臂(譬如，第一接合单元带有第一耦合臂时)时，另一接合单元的中心核(譬如第二中心核)则为多肽核。在本例中，位于第二中心核N-或C-端的第一个氨基酸残基是带有叠氮基或炔基的氨基酸残基。在某些实施方式中，上述带有叠氮基或炔基的氨基酸残基会和第一接合单元的第一耦合臂所带的相应炔基或叠氮基进行CuAAC反应，因而将第一与第二接合单元接合在一起。或者是，第二中心核N-或C-端的第一个氨基酸残基带有叠氮基，其可位于第一接合单元的耦合臂自由端上的环辛炔基(在较佳的情形中，为DBCO、DIFO、BCN或DICO基)进行SPAAC反应而相连接。此种构形可发生在两个单元都是多肽核或者是两者分别是化合物核和多肽核的情形中。
第一与第二接合单元也有可能不通过任何耦合臂(即，第一与第二耦合臂)而耦接。换句话说，第一与第二耦合臂彼此直接连接。此种构形主要发生在两个多肽核之间。具体来说，两个中心核其中之一(譬如第一中心核)的N-或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基，而另一个中心核(如第二中心核)的N-或C-端则是带有炔基的基酸残基。如此一来，第一中心核的叠氮基会和第二中心核的炔基反应，进而将第一与第二接合单元耦接在一起。
带有叠氮基的氨基酸残基包括，但不限于：L-叠氮高丙氨酸(AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸以及6-叠氮-D-赖氨酸。带有炔基的氨基酸残基包括，但不限于：L-高炔丙基甘氨酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-HPG)以及β-高炔丙基甘氨酸(β-HPG)。
根据本揭示某些实施方式，所述分子构建体的第一与第二接合单元其中之一还包含一额外的连接臂(下文称为第三连接臂)，连接于第一或第二接合单元。
和第一与第二连接臂相似，第三连接臂和一组件间能够形成一酰胺键或可进行硫氢–顺丁烯二酰亚胺、CuAAC、iEDDA或SPAAC反应，进而与该组件连接。于某些实施方式中，该额外的组件是第二靶向组件或第二效应组件，其可用以促进所述分子构建体的靶向或治疗效果。或者是，所述额外组件可以是分子量约为20,000至50,000道耳顿的长PEG链，以便提升所述分子构建体的稳定性。
在其它实施方式中，本发明分子构建体还包含一第三接合单元。第三接合单元包含(1)一第三中心核、(2)分别连接于第三中心核的一或多个连接臂(下文称为第三连接臂)、(3)分别连接于上述第三连接臂的一或多个组件(下文称为第三组件)、以及(4)视需要而加入的一耦合臂(下文称为第三耦合臂)，其系连接至第三中心核。在本例中，第三接合单元通过发生在以下任一种情形中的CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应而与第一或第二接合单元连接：发生在第一或第二耦合臂与第三耦合臂之间、第一或第二中心核与第三耦合臂之间、第一或第二耦合臂与第三中心核之间、或第一或第二中心核与第三中心核之间。
第三接合单元的第三连接臂在自由端可带有NHS基、顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、环辛烯基、环辛炔基或四嗪基。因此，第三连接臂与第三组件间可藉由形成酰胺键或进行硫氢–顺丁烯二酰亚胺、CuAAC、iEDDA或SPAAC反应而直接连接。
根据本揭示多种实施方式，第一、第二以及非必要的第三中心核可以相同或不同。
<IV>具有靶向部分及效应部分的分子构建体的用途
在临床医学领域中，根据本揭示第三方面的分子构建体可用以治疗多种疾病。因此，本揭示的第四种方面是关于治疗这些疾病的方法。根据本揭示多种实施方式，治疗特定疾病的方法包含以下步骤：对有需要的个体投予治疗有效量的分子构建体，所述分子构建体可以是根据本揭示第三方面与其实施方式的任一种分子构建体。可以理解的是，可将所述分子构建体以药学配方的形式施用，此种药学配方除了包含本发明分子构建体之外，还包含适用于所欲给药方式的药学上可接受的赋型剂。
为了让本发明所属技术领域的普通技术人员能够理解本揭示的某些实施方式，下文举例说明可用以治疗某些特定疾病之分子构建体所含的第一与第二组件的组合。
根据本揭示某些实施方式，此处所述的分子构建体可用于预防血栓形成。在这些实施方式中，第一组件是对纤维素特异的scFv，而第二组件则是第Xa型凝血因子抑制剂或凝血酶抑制剂。所述的第Xa型凝血因子抑制剂是选自由阿哌沙班、伊度沙班与利伐沙班所组成的群组。所述凝血酶抑制剂可以是阿加曲班或美拉加群。
根据本揭示其它实施方式，所述分子构建体适用于治疗血管栓塞，且包含对纤维素特异的scFv(作为第一组件)以及组织型纤溶酶原激活剂(作为第二组件)。组织型纤溶酶原激活剂的例示性实施例包括：阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶与拉诺普酶。
<V>用以预防血栓形成与治疗血管栓塞的Fc型分子构建体及其用途
本揭示的第五方面是关于以可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)为基础的分子构建体(下文称为Fc型分子构建体)，其具有直接或间接连接到免疫球蛋白CH2-CH3区域的至少一靶向组件与至少一效应组件。藉由审慎选择所述Fc型分子构建体的靶向与效应组件，所得到的Fc型分子构建体可用以预防血栓形成及治疗血管栓塞，或可用以制备用于上述用途的药物。当可想见，利用此种Fc型分子构建体来预防血栓形成或治疗血管栓塞的方法亦属于本揭示的一种方面。
根据本揭示某些实施方式，Fc型分子构建体包含一对IgG.Fc的CH2-CH3区段、一对效应组件及一对靶向组件。成对的效应组件可以是组织型纤溶酶原激活剂或一载药束(drug bundle)，此载药束包含多个第Xa型凝血因子抑制剂或凝血酶抑制剂分子，而成对的靶向组件可以是对纤维素特异的抗体片段。
当成对效应组件是组织型纤溶酶原激活剂(如：阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶与拉诺普酶)时，该成对的效应组件连接于成对CH2-CH3区段的N-端，而成对的靶向组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端，反之亦然。或者是，当成对的效应组件是载药束时，则成对的效应组件连接于成对CH2-CH3区段的C-端，而成对的靶向组件则连接到成对CH2-CH3区段的N-端。
于一些实施方式中，该成对CH2-CH3区段衍生自人类IgG重链γ4或人类IgG重链γ1。
在某些例子中，成对的靶向组件形成抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)的构形(即，由VH-CH1区域以及VL-Cκ区域所组成)；此种Fab片段连接于第一与第二重链的N-端，而使得Fc型分子构建体形成IgG构形。在这些情形中，成对的效应组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端。
根据某些视需要而实施的实施方式，效应组件为以接合单元为基础的载药束。此种载药束的优点至少在于可在将载药束和抗体分子缀合之前先单独制备此种载药束，因而能够避免在严苛的化学条件下将药物分子直接与抗体分子缀合的问题。根据本揭示的多种实施方式，载药束包括多个与血液凝结相关的抑制剂，譬如第Xa型凝血因子抑制剂(如：阿哌沙班、伊度沙班与利伐沙班)以及凝血酶抑制剂(如：阿加曲班、美拉加群)。作为例示而非限制，这些Fc-型分子构建体可用于预防血栓形成。
根据某些实施方式，此处提出的Fc-型分子构建体还包含一肽延伸段及一耦合臂。具体来说，肽延伸段的序列为(G2-4S)2-8C，且连接于成对CH2-CH3区段的其中之一的C-端。在这种情形中，耦合臂通过发生在其间的硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而连接于肽延伸段的C-端。此外，在和载药束缀合之前，耦合臂的自由端(即，未连接于肽延伸段的半胱氨酸残基的一端)经修饰带有炔基、叠氮基、高应力炔基或四嗪基，而使得载药束可通过逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反应、应力促进的叠氮化物-炔羟点击化学(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反应或铜(I)催化的叠氮化物-炔羟环加成(copper(I)catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反应而与耦合臂缀合。
根据某些视需要而实施的实施方式，所述载药束包含一中心核、多个连接臂。根据本揭示多种实施方式，中心核可以是具有多个氨基的化合物或包含多个赖氨酸(K)残基的多肽。每一连接臂的一端藉由和化合物核的氨基或多肽核的K残基反应，而与中心核连接。此外，上述连接臂在其自由端带有顺丁烯二酰亚胺基，而每一药物分子(譬如与凝血相关的抑制剂分子)则藉由和顺丁烯二酰亚胺基反应，进而通过第一连接臂而与中心核连接。
在中心核是多肽核的情形中，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基或带有叠氮基或炔基。
当多肽中心核的末端氨基酸残基带有叠氮基或炔基时，载药束可以通过发生于上述末端残基与肽延伸段C-端之间的CuAAC反应而和肽延伸段连接。
用以对有需要的个体预防血栓形成和/或治疗血管栓塞的方法包含以下步骤：对所述个体投予有效量的本方面的分子构建体。
附图说明
为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，兹将所附图做如下简单说明：
图1A至图1K为根据本揭示某些实施方式的接合单元的示意图；
图2为包含化合物核的接合单元的示意图；
图3A至图3D为根据本揭示某些实施方式的T-E分子构建体的示意图；
图4为根据本揭示某些实施方式，用以建构分子构建体的库的示意图；
图5A与图5B为根据本揭示某些实施方式的分子构建体的示意图；
图6为根据本揭示某些实施方式的分子构建体的示意图；
图7A与图7B为根据本揭示多种实施方式的分子构建体的示意图；
图8A至8C为根据本揭示多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图；
图9A与9B为根据本揭示多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图；
图10为根据本揭示一实验例的基于肽核的接合单元的质谱MALDI-TOF结果，所述肽核接合单元有一条带有一TCO基的耦合臂基与5条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG6连接臂；
图11为根据本揭示一实验例所合成的阿哌沙班-PEG3-S-S-PEG3-阿哌沙班的质谱MALDI-TOF结果；
图12为根据本揭示一实验例所合成的阿加曲班-PEG3-S-S-PEG3-阿加曲班的质谱MALDI-TOF结果；
图13A、13B与13C分别是根据本揭示一实验例，经纯化的对人类纤维素特异的102-10scFv的SDS-PAGE、MALDI-TOF与ELISA分析结果；
图14A与图14B分别是根据本揭示一实验例，对人类纤维素特异的噬菌体-呈现scFv的病毒效价分析与单菌落ELISA分析果；
图15A与图15B分别是根据本揭示一实验例，纯化的瑞替普酶的SDS-PAGE与MALDI-TOF分析结果；
图16是根据本揭示一实验例，TCO-瑞替普酶缀合物的质谱分析结果；
图17是根据本揭示一实验例的靶向接合单元的SDS-PAGE分析结果，上述靶向接合单元有一自由的四嗪基与三个一组的对人类纤维素特异的scFv；
图18是根据本揭示一实验例的的单一接合单元分子构建体的MS分析结果，上述分子构建体有三个对人类纤维素特异的scFv(作为靶向组件)以及一个瑞替普酶分子(作为效应组件)；
图19是根据本揭示一实验例的阿哌沙班-PEG3-SH分子的抑制分析结果；
图20是根据本揭示一实验例，经纯化的重组双链(瑞替普酶)-hIgG4.Fc融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；
图21是根据本揭示一实验例，经纯化的重组双链(瑞替普酶)-hIgG4.Fc-(scFvα纤维素)融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；
图22是根据本揭示一实验例，经纯化的重组双链(瑞替普酶)-(scFvα纤维素)融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；
图23是根据本揭示一实验例，经纯化的重组双链(TNK-tPA)-IgG4.Fc融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；
图24是根据本揭示一实验例，重组双链(瑞替普酶)-hIgG4.Fc、双链(瑞替普酶)-hIgG4.Fc-(scFvα纤维素)与(瑞替普酶)-(scFvα纤维素)的蛋白质酶活性分析结果。
根据惯常的作业方式，图中各种特征与组件并未依比例绘制，其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与组件。此外，在不同附图间，尽可能以相同或相似的组件符号来指称相似的组件/部件。
具体实施方式
为了使本揭示的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方面与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
为了便于说明，此处整理了说明书、实施例与附随申请专利范围中所用的某些词汇。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中的普通技术人员所理解与惯用的意义相同。
在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。此外，在本说明书与申请专利范围中，“至少一”与“一或更多”等表述方式的意义相同，两者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本说明书与申请专利范围中，“A、B及C其中至少一者”、“A、B或C其中至少一者”以及“A、B和/或C其中至少一者”系指涵盖了仅有A、仅有B、仅有C、A与B两者、B与C两者、A与C两者、以及A、B与C三者。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常系指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中的普通技术人员的考虑而定。当可理解，除了实验例之外，或除非另有明确的说明，此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一端点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。
本揭示一般系关于多种分子构建体，其中每一分子构建体包含一靶向组件(T)与一效应组件(E)，在本说明书中有时将这些分子构建体称为“T-E分子”、“T-E药物”或“T-E药品”。
在此处，“靶向组件(targeting element)”一词系指分子构建体能够直接或间接结合到一目标靶点(如，一细胞表面上的受体或一组织中的蛋白质)的部分，因而能够协助将本发明分子构建体递送到目标靶点。在某些例子中，靶向组件可将所述分子构建体导引至邻近目标细胞处。在其它情形中，靶向组件可特异地结合到目标细胞表面上的分子；或靶向组件可和第二分子特异地结合，而该第二分子能够特异地结合到目标细胞表面上的分子。在某些例子中，一旦靶向组件与目标靶点接合之后，靶向组件可将本发明分子构建体内化，而使其移动到目标细胞的细胞质内。靶向组件可以是细胞表面受体的抗体或配体；或者是可和上述抗体或配体结合的分子，因而能够间接地将本发明分子构建体靶向到目标部位(譬如所选定的细胞表面)。相较于没有靶向功能的治疗药物，利用本发明分子构建体能够加强或有利于效应组件(治疗药剂)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一种程度或相对的比例，而不是让效应组件在疾病部位绝对或完全的局部化。
根据本发明，“效应组件(effector element)”一词系指一旦分子构建体到达目标部位后，所述分子构建体中能够发挥生物活性(譬如，诱发免疫反应、发挥细胞毒性及与其相似者)或其它功能活性(譬如招募其它经半抗原标记的治疗用分子)的部分。“效应”可指治疗性或诊断性的效果。效应组件包含能够和细胞和/或细胞外免疫调节因子结合的组件。上述效应组件包含如蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、糖蛋白、药物部分(包含小分子药与生物制剂)、化合物、元素及同位素等物质，也包含上述物质的片段。
虽然在此处利用“第一”、“第二、“第三”等词汇来描述多种组件、部件、区域和/或区段，这些组件(以及部件、区域和/或区段)不受上述修饰词的限制。此外，除非上下文有明示的说明，使用这些序数并未隐含序列或顺序。反之，这些词汇仅是用来区分各组件。因此，亦可将下文所述的第一组件命名为第二组件，而不会悖离例示性实施方式所揭示的内容。
在此处，“连接(link)”、“耦接(couple)”以及“缀合(conjugate)”等词可互换使用，且都是用来指称通过直接或间接的连接关系，将两个组件连接在一起。
“多肽(polypeptide)”一词在此系指具有至少两个氨基酸残基的聚合物。一般来说，多肽包含2到200个氨基酸残基；在较佳的情形中，是2到50个残基。在本说明书中所提及的氨基酸序列涵盖了此种序列的L-、D-或β-氨基酸等形式。多肽亦包括氨基酸聚合物，其中有一或多个氨基酸残基是与一天然氨基酸相应的人工化学类似物，当然也包括天然产生的氨基酸聚合物。此外，该词汇亦涵盖以肽键或其它方式连接的氨基酸，上述其它方式如经修饰的连接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫酰胺(thioamide)、磷酰胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羟基酯(hydroxylate)键、以及与其相似者来取代肽键。
于一些实施方式中，本发明范围亦涵盖了本文所述任何序列的氨基酸的保守性置换。于多种实施方式中，有一、二、三、四或五个不同的残基经过置换。在此处，“保守性置换(conservative substitution)”一词是指所述氨基酸置换不会明显地改变分子活性(譬如生物或功能活性和/或特异性)。一般来说，保守性氨基酸置换是利用另一种具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的氨基酸来取代某一氨基酸。某些保守性置换包括“类似物置换”，亦即以非标准(如罕见的或合成的等)氨基酸来取代标准氨基酸，而上述非标准氨基酸和被取代的原有氨基酸之间的差异极小。可由标准氨基酸经人工修饰而在不会大幅改变原有氨基酸结构的前提下，得到所述的氨基酸类似物，譬如异构物或代谢前驱物等皆属之。
于一些实施方式中，本案的范围亦涵盖和任何所述序列具有至少80％序列相似度的任何序列，上述序列相似度较佳为至少85％或90％、更佳为至少95％或98％。
此处针对多肽序列所述的“氨基酸序列相似度百分比(Percentage(％)aminoacid sequence identity)”系指候选序列的氨基酸残基与参考多肽序列的氨基酸残基完全相同的百分比；于进行上述比对时，可将所述的候选多肽片段与所述的特定多肽片段并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在计算相似度时，保守性置换的氨基酸残基视为不同的残基。相关领域已有多种方法可用以进行上述并排，譬如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中的普通技术人员在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，二多肽序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心(Nation Centerfor Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白质-蛋白质BLAST分析数据库Blastp来进行。候选多肽序列A相较于参考多肽序列B的氨基酸序列相似度(在本说明书中亦称之为多肽序列A与多肽序列B具有特定百分比(％)的氨基酸序列相似度)的计算方式如下：
Figure GDA0003577147960000221
其中X是利用BLAST序列并排程序对序列A、B进行排列后所得到的相同氨基酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短者的氨基酸残基总数。
“聚乙二醇化氨基酸(PEGylated amino acid)”一词在此系指带有一个胺基(amino group)与一个羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链。一般来说，聚乙二醇化氨基酸的结构式为NH2-(CH2CH2O)n-COOH。在本揭示中，n值介于1到20之间；较佳是介于2至12。
在此处一多肽的“端”系指位于该多肽N-或C-端点的氨基酸残基。在描述一聚合物(譬如此处所述的聚乙二醇)的组成单元时，“端”则是指在聚合物骨架末端的部分。在本说明书与申请专利范围中，“自由端”一词是用来指称并未与另一个分子形成化学键的末端氨基酸残基或构成单元。
“抗原(antigen或Ag)”一词系指能够导致免疫反应的分子。此种免疫反应可能涉及分泌性(secretory)、荷尔蒙性(humoral)和/或细胞级(cellular)的抗原特异反应。在本揭示中，“抗原”一词系指蛋白质、多肽(包括其突变株或具有生物活性的片段)、多糖、糖蛋白、糖脂质、核酸或上述之组合。
在本说明书与申请专利范围中，“抗体(antibody)”一词应以广义方式解释，且包含完整组装的抗体、可和抗原结合的抗体片段，譬如抗原结合片段(Fab/Fab’)、F(ab’)2片段(具有彼此以双硫键连接的两个Fab部分)、可变片段(variable fragment，Fv)、单链可变片段(scFv)、双特异性单链可变片段(bi-scFv)、纳米抗体(nanobodies)、单抗体(unibodies)以及双体抗体(diabodies)。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，较佳为包括完整抗体的抗原结合区域或可变区域。在典型的例子中，“抗体”系指实质上由免疫球蛋白基因或其片段所编码的一或多种多肽所组成的蛋白质。习知的免疫球蛋白基因包括κ(kappa)、λ(lambda)、α(alpha)、γ(gamma)、δ(gamma)、ε(epsilon)与μ(mu)等恒定区基因(constant region gene)、以及无数的免疫球蛋白可变区基因(variable region genes)。轻链通常归类为κ(kappa)或λ(lambda)。重链通常归类为γ(gamma)、μ(mu)、α(alpha)、δ(gamma)或ε(epsilon)，基于这些结构，定义出了以下类型的免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白抗体结构是一种四聚物(tetramer)。每一个四聚物是由两条相同的多肽链所组成，且每一对分别有一“轻”链(约25kDa)与一“重”链(约50-70kDa)。每一链的N-端界定了一个可变区域，包含约100至110个或更多的氨基酸，其主要负责抗原辨识。可变轻链(variable light chain，VL)与可变重链(variable heavy chain，VH)等词就是分别指上述的轻链与重链。根据本揭示的实施方式，可藉由改变天然抗体或利用重组DNA方式重新合成上述抗体片段。于本揭示一些实施方式中，上述抗体和/或抗体片段可具有双特异性，且可有多种不同的构形。举例来说，双特异性抗体可包含两个不同的抗原结合部位(可变区域)。于多种实施方式中，可利用融合瘤(hybridoma)技术或重组DNA技术来制备双特异性抗体。于一些实施方式中，双特异性抗体对至少两种不同的表位(epitope)有结合特异性。
“特异地结合(specifically bind)”一词在此处系指抗体或其抗原结合片段能够和抗原结合的能力，上述结合的解离常数(dissociation constant，Kd)小于约1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或1×10-12M；或者是或额外地，相较于其对于非特异性抗原的结合亲和力，上述抗体或其抗原结合片段与抗原结合的亲和力为两倍以上。
“治疗(treatment)”一词系指预防性(如，预防用药)、疗愈性或缓和性的处置，藉以达到所欲的药学和/或生理学效果；而治疗的行为在此包括上述预防性、疗愈性或缓和性的处置。具体来说，治疗在此系指对于可能患有医疗疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常、或易于罹患疾患的个体施用或投予本发明分子构建体或包含此分子构建体的药学组合物，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻特定异常和/或病症的一种或多种症状或特征，或是延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对尚未表出现疾病、异常和/或病症征兆的个体和/或出现早期征兆的个体进行治疗，以期降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关的病理变化的风险。
在此处，“有效量(effective amount)”一词系指本发明分子构建体的用量足以产生所欲的治疗反应。药剂的有效量不必然能够治愈疾病或病症，但能够延缓、阻碍或防止该疾病或病症的发生，或是可缓减与疾病或病症相关的病征。可将治疗有效量可分成一剂、两剂或更多剂，而以适当的剂型在指定期间内施用一次、二次或更多次。具体的治疗有效量取决于多种因素，例如欲治疗的特定状况、个体的生理条件(如，个体体重、年龄或性别)、接受治疗的个体类型、治疗持续时间、并行治疗(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将治疗有效量表示成活性成分的总重量，譬如以克、毫克或微克来表示；或表示成活性成分重量相对于体重的比例，譬如表示为每公斤体重多少毫克(mg/kg)。
所述“施用(application)”与“投予(administration)”等词在此可交替使用，其系指将本发明的分子构建体或药学组合物提供给需要治疗的个体。
“个体(subject)”或“患者(patient)”等词在此可交互使用，且是指可接受本揭示的分子构建体、药学组合物和/或方法处置的动物(包含人类)。除非另有指明，“个体”或“患者”一般包含雄性与雌性。“个体”或“患者”包含任何可因本揭示的处置而获益的哺乳类动物。所述“个体”或“患者”的例示包含，但不限于：人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、猪、山羊、牛、马、狗、猫、鸟和禽类。在一实例中，所述患者为人类。所述哺乳类动物涵盖哺乳动物纲的所有成员，包括人类、灵长类动物、家畜和农畜(如兔子、猪、绵羊和牛)、动物园动物或竞赛用动物、宠物，以及啮齿类动物(如，小鼠和大鼠)。“非人类哺乳动物”一词则涵盖除了人类以外的所有哺乳动物纲成员。
本揭示至少部分是基于建构出了T–E药物，此种T-E药物可被递送至目标细胞、目标组织或器官，且其在这些部位的比例相对高于在血液循环、淋巴系统以及其它细胞、组织和器官中的比例。当实现上述情境时，即可提升T-E药物的疗效，且其副作用与毒性的范围和严重性都会降低。相较于不含靶向组件的药物，以T-E分子的形式来投递药物时，发挥疗效的效应物所用的浓度能够较低。因此，可在较低的剂量下施用治疗用的效应物而不会减损其有效性，但却能同时降低其副作用与毒性。
可因较佳药物靶向而获益的疾病
若是能够将药物靶向到疾病部位，即若是能够使药物在疾病部位(相对于在正常组织或器官)局部化或有较优势的浓度，就能够改善用以治疗许多疾病的药物，使其具备较佳的疗效与安全性。某些抗体药物是以感染性微生物或其毒素产物为靶点，若使这些抗体药物具备招募免疫细胞的能力，以吞噬或清除与抗体结合的粒子，就能够提升其疗效。下文提出一些主要的例示性疾病，若是能使得这些疾病所用药物在疾病部位或细胞有较佳的分布比例或能够招募可吞噬细胞的免疫细胞，就可以改善这些药物。
与血栓相关的疾病/症状
在处理与血栓(blood clotting或coagulation)相关的病理问题时，药物开发主要涉及两大面向：其一是处预防或抑制病理性血栓的形成或在血栓核形成后防止其体积增大；其二则是及时溶解已形成的病理性血栓。目前临床上已有针对这两种面向开发的药物。然而，仍有许多相关研究希望开发更优良的药物，也有一些药物正在进行临床试验。
患者常因为多种并发症(如：由心脏血管、内分泌或其它与身体调节相关症状所致、使用药物或其它原因)而容易发展出血栓。血栓可能会导致出血性中风(hemorrhagicstrokes)、头部创伤(head trauma)、心肌梗塞(myocardial infarction)、肺栓塞(pulmonary embolism)或深层血管栓塞(deep vein thrombosis)，这些症状经常会导致严重的且可能造成生命威胁的临床症状。
凝血作用通常会涉及一系列依序强化的由蛋白质酶催化的事件。在较为后段的步骤中，第Xa型凝血因子可将前凝血酶(prothrombin)剪切为凝血酶(thrombin)，而凝血酶又可将纤维蛋白原(fibrinogen)剪切得到纤维素；纤维素和血小板可共同形成血块的筛状架构。血块的溶解涉及了纤维蛋白溶酶(plasmin)，其由纤溶酶通过包括组织型纤溶酶原激活剂的几种酶之一而产生。
(A)使用T-E分子来预防血栓形成
目前已开发并使用了多种间接的第Xa型凝血因子抑制剂。在过去数十年间，最主要的抑制剂为肝素(heparin)、小分子量肝素与肝素类化合物；肝素是指分子量介于5,000至30,000道耳顿不等的糖胺聚糖(glycosaminoglycan)的天然存在多糖类混合物。这些物质可结合至肝素-结合蛋白(包括抗-凝血酶)进而使得此类物质能够抑制第Xa型凝血因子，并进一步抑制血栓形成。组织因子路径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)是一种单链血清蛋白，随着蛋白溶解程度的不同，其分子量介于34,000至40,000道耳顿之间，TFPI能够抑制第Xa型凝血因子。然而，目前并未利用重组DNA技术来生此类因子做为药物。
临床上也开发并使用了多种凝血酶抑制剂。由医学用水蛭所取得的天然水蛭素以及重组水蛭素可以和凝血酶结合，过去临床上曾使用此类物质，但由于相继开发出更佳的药品，近年来已不再使用。
近年来，开发出多种第Xa型凝血因子或凝血酶的小分子抑制剂，并已取得核准而可用于在多种临床症状中预防凝血。在某些临床应用中，所用的小分子是第Xa型凝血因子的直接抑制剂，譬如：阿哌沙班(apixaban)、伊度沙班(edoxaban)与利伐沙班(rivaroxaban)。另外有些小分子属于凝血酶的直接抑制剂，譬如：阿加曲班(argatroban)或达比加群(dabigatran)。希美加群(ximelagatran)也是一种直接凝血酶抑制剂，其具有较佳的药动学特性，且施用剂量极低，但其会造成肝毒性，故已不再使用。希美加群是一种前驱药物，口服的希美加群在肝脏中会被转换成美拉加群(melagatran)，该活性形式会和凝血酶结合并抑制其活性。因此，极有可能通过降低美拉加群相对于希美加群的剂量，以及避免希美加群在肝脏中的转换，来避免使用希美加群时所发生的肝脏毒性副作用。
本案发明人体认到，要处理血栓形成的有效方法是抑制血栓核使其无法长成到病理性血栓的大小。因此，若能提升在血栓核处的第Xa型凝血因子抑制剂和/或凝血酶抑制剂的含量，就可避免血栓体积成长至病变状态。此处可使用抗-纤维素抗体的IgG或scFv将带有第Xa型凝血因子抑制剂或凝血酶抑制剂或两者的组合之载药束带到新近形成的血栓核处。第Xa型凝血因子抑制剂分子(譬如：阿哌沙班、伊度沙班与利伐沙班)以及凝血酶抑制剂分子(譬如：阿加曲班与美拉加群)都带有氨基，可利用该氨基将其和此处提出的接合单元缀合。
因为使用抗-纤维素抗体将第Xa型凝血因子抑制剂和/或凝血酶抑制剂携带到血栓部位，相对于不使用抗-纤维素抗体的情形，可使用较少剂量的抑制剂。更有甚者，由于血管中血液的流动，只有当血栓核成长到一定体积后，被携带到血栓附近的抑制剂才会有明显的聚集效应(concentration effects)。因而，当体内出现轻微内伤时，生理上必须进行的血液凝结作用不会受到影响。正因如此，利用抗-纤维素抗体将第Xa型凝血因子与凝血酶抑制剂携带到血栓处的策略，应当具有较佳的治疗效果，且可降低内出血的副作用。
根据本揭示的实施方式，联合接合物构形的T-E分子可使用对纤维素特异的scFv作为靶向组件，并使用第Xa型凝血因子抑制剂(阿哌沙班、伊度沙班或利伐沙班)和/或凝血酶抑制剂(阿加曲班与美拉加群)作为效应组件。
(B)使用T-E分子来加速血栓溶解
为了适时施用能够溶解病理性血栓的适当药物，必须严格控制时程，这是本领域面临的重大挑战之一。已开发出多种重组人类组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogen activator，tPA)，包括：阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase)与拉诺普酶(lanoteplase)；这些重组tPA解决了血管栓塞问题的大部分问题。然而，在许多情形中，使用tPA不足以溶解血栓和/或可能会造成严重内出血。tPA的剂量控制与给药时程仍是当前的研发重点。也有许多临床研究着眼于比较不同重组tPA形式的药效。从与tPA、其变异株与医疗用途相关的大量文献可以得知，tPA对纤维素的结合亲和力、半衰期、肝细胞降解敏感性、对纤溶酶原激活剂抑制剂的抗性等各种性质和tPA在特定临床症状下的特定息息相关。
完整tPA的分子结构相当复杂，包含具备不同功能或活性的多个结构域，然而并非所有结构域都是用于溶解血栓的血栓溶解产品所必须的。全长tPA分子(阿替普酶)共有527个氨基酸残基，其包括(i)纤连蛋白手指区域(fibronectin finger domain)，其可和纤维素结合；(2)表皮生长因子区域，其可和肝细胞结合并有助于廓清tPA；(3)Kringle 1区域，其可和肝内皮细胞结合并有助于廓清tPA；(4)Kringle 2区域，其可和纤维素结合并可活化丝氨酸蛋白酶；以及(5)蛋白酶区域，其可剪切纤溶酶原并受到第I型纤溶酶原激活剂抑制剂(plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1)的抑制。可利用哺乳类细胞、CHO细胞来制备阿替普酶、替奈普酶与拉诺普酶，而瑞替普酶则是由细菌细胞所制备。
瑞替普酶全长共355个氨基酸残基，不含纤连蛋白手指区域、上皮生长因子区域、与Kringle 1区域。瑞替普酶是利用细菌系统所制备，且因此不含有转译后糖类修饰。虽然瑞替普酶对纤维素的亲和力较低，且其蛋白质酶活性也比不上阿替普酶，但瑞替普酶的血浆半衰期为14至18分钟；相较之下，阿替普酶在血浆中的半衰期只有3至4分钟。瑞替普酶可采多次推注(boli)形式施用，而阿替普酶是在单次推注(bolus)后进行灌注(infusion)。
替奈普酶的全长和阿替普酶一样是527个氨基酸残基，但带有三个突变位点。将第103位的苏氨酸取代为天门冬酰氨酸，以利进行糖化修饰；将第117位的天门冬酰氨酸取代为麸酰氨酸，以避免该处的糖化。这些突变可抑制替奈普酶被肝细胞清除。此外，在第296至299位的赖氨酸-组氨酸-精氨酸-精氨酸四个氨基酸残基则被取代为4个丙氨酸残基，该突变使得其对PAI-1的抗性提升了80倍。替奈普酶的血浆半衰期为18分钟。
在拉诺普酶中，删除了纤连蛋白手指区域与上皮生长因子区域，且在第117位的天门冬酰氨酸被取代为麸酰氨酸。拉诺普酶的血浆半衰期长达45分钟，大幅改善了给药方式的限制。
在诸多临床试验中，上述四种tPA的疗效不相上下，而每一种药物在特定的临床症状下，各有其优缺点。
本案发明人认为，略微提升瑞替普酶纤维素的结合力同时略微延长其血浆半衰期，可望改善瑞替普酶的疗效。这些分子构建体提升了其和血栓的结合特异性，故因而能够降低给药剂量与减少副作用。若这些药物不适用与溶解血栓相关的所有临床症状，至少可适用其中某些症状。因此，本发明一较佳的实施方式是关于一种可用于溶解血栓之经改良的tPA，其采用联合接合物构形，带有了1至3个抗-纤维素抗体的scFv(作为靶向组件)以及1至2个瑞替普酶分子(作为效应组件)。在一种替代性的构建体中，将瑞替普酶的C-端与接合单元缀合，以使得位于N-端的Kringe 2区域能够有弹性地与血栓中的纤维素筛状架构相接触。瑞替普酶的C-端延伸有譬如(GGGGS)2和半胱氨酸残基的接合物氨酸。在又一实施方式中，采用Fc-融合蛋白构建体，将tPA或其片段和对纤维物特异的scFv相连接；此种构建体亦适用于促进病理性血栓的溶解。
第一节 用以治疗特定疾病的多臂接合物
(i)用于多臂接合物的肽核
本揭示的第一方面是关于一种接合单元，其包含：(1)一中心核，其包含2-15个赖氨酸(K)残基；以及(2)2-15个连接臂，分别连接于中心核的各K残基。本发明中心核的特征在于其N-或C-端带有叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。
在制备本发明接合单元时，将一端带有N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimydil，NHS)基且另一端带有一官能团(如，NHS基、顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)的PEG链连接到K残基上；具体来说，利用上述NHS基和K残基上的氨基形成酰胺键，进而将PEG链连接到中心核上。在本揭示中，将连接到K残基之后的PEG链称为连接臂，此连接臂的自由端带有官能团。
根据本揭示的实施方式，上述中心核是多肽，其长度为8-120个氨基酸残基，且包含2至15个赖氨酸(K)残基，其中每一个K残基和下一个K残基之间以一填充序列隔开。
根据本揭示的实施方式，填充序列包含甘氨酸(glycine，G)与与丝氨酸(serine，S)残基；在较佳的情形中，填充序列是由选自G、S及其组合的2-15个残基所组成。举例来说，填充序列可以是：
GS、
GGS、
GSG、
GGGS(序列编号1),
GSGS(序列编号2)、
GGSG(序列编号3)、
GSGGS(序列编号4)、
SGGSG(序列编号5)、
GGGGS(序列编号6)、
GGSGGS(序列编号7)、
GGSGGSG(序列编号8)、
SGSGGSGS(序列编号9)、
GSGGSGSGS(序列编号10)、
SGGSGGSGSG(序列编号11)、
GGSGGSGGSGS(序列编号12)、
SGGSGGSGSGGS(序列编号13)、
GGGGSGGSGGGGS(序列编号14)、
GGGSGSGSGSGGGS(序列编号15)或
SGSGGGGGSGGSGSG(序列编号16)。
两个赖氨酸残基之间的填充序列可以由一定程度上随机的长度和组合的甘氨酸与丝氨酸残基所组成。在赖氨酸残基数目较少的多肽中，可使用较长的填充序列；在赖氨酸残基数目较多的多肽中，则可使用较短的填充序列。除了甘氨酸与丝氨酸之外，可在填充序列中插入亲水性氨基酸残基，如天冬氨酸与组氨酸。除了由甘氨酸与丝氨酸残基组成的填充序列之外，也可使用其它填充序列，譬如可使用常见人类血清蛋白(如白蛋白与免疫球蛋白)中的柔性可溶性环。
基本上，赖氨酸残基之间的填充序列覆盖具有甘氨酸与丝氨酸残基的肽。然而，他们也可以是由任何侧链不带有氨基的氨基酸所组成的肽。这些氨基酸大部分可以是亲水性的，但不需要全部都是亲水性的。所述氨基酸也不必然是天然存在的。
根据本揭示某些较佳的实施方式，中心核包含2-15个单元的G1-5SK序列。或者是，此多肽的序列为(GSK)2-15；即，多肽包含至少两个连续的GSK单元。举例来说，本发明中心核可包含下列氨基酸序列：
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSK(序列编号17)、
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK(序列编号18)或
Ac-CGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSK(序列编号19)，其中Ac代表乙酰基。
根据本揭示某些实施方式，中心核是序列为(Xaa-K)n的多肽，其中Xaa是聚乙二醇化氨基酸，其具有2至12个乙二醇(EG)重复单元，且n是2至15的整数。
当可理解，本案所述中心核的赖氨酸残基也可置换任何侧链带有氨基的氨基酸；譬如：带有(CH2-)nNH2侧链(n＝1-3或5)的α-氨基酸、带有(CH(OH)-)nCH2-NH2侧链(n＝1-5)的α-氨基酸、带有(CH2-CH(OH)-)nCH2-NH2侧链(n＝1-3)的α-氨基酸以及带有(CH2-CH2-O-)nCH2-NH2侧链(n＝1-2)的α-氨基酸。这些氨基酸不必然是天然存在的氨基酸。
如上文所述，本发明中心核的特征在于其N-或C-端带有叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。根据本揭示某些实施方式，本发明中心核的N-或C-端氨基酸残基带有叠氮基或炔基。带有叠氮基的氨基酸残基可以是：L-叠氮高丙氨酸(AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸。举例来说，本发明中心核可具有以下序列：
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-AAH-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、
Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-AAH、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C或
Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH，
其中Xaa是带有所述数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，Ac代表乙酰基，而AAH代表AHA残基。
带有炔基的氨基酸的例子包括，但不限于：L-高炔丙基甘氨酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-HPG)、或β-高炔丙基甘氨酸(β-HPG)。在本例中，本发明中心核可具有以下序列：
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-GHP-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、
Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-GHP、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C或
Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP，
其中Xaa是带有所述数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，Ac代表乙酰基，而GHP代表HPG残基。
当可理解，目前已可通过商业管道取得多种侧链带有叠氮基或炔基的氨基酸与聚乙二醇化氨基酸，这些氨基酸可以带有保护基团，如叔-丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl，t-boc)或9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)，故可轻易用于固态的肽合成。
根据本揭示某些实验例，所用的中心核可包含以下序列：
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSK(序列编号21)、
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSK(序列编号22)、
Ac-AAHGGSGGSGGSKGSGSKGSK(序列编号23)、
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSGSC(序列编号24)、
Ac-C-Xaa2-K-Xaa2-K-Xaa2-K(序列编号25)或
Ac-C-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K(序列编号26)、其中Xaa为带有指定数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸、Ac代表乙酰基、AAH代表AHA残基且GHP代表HPG残基。
或者是，本发明中心核可和耦合臂连接，此耦合臂的自由端(即，未和中心核连接的一端)带有一官能团(如，叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)。在这些情形中，本发明中心核的N-或C-端为半胱氨酸残基。在制备与耦合臂连接的接合单元时，将一端带有顺丁烯二酰亚胺基且另一端带有上述官能团的PEG链与上述半胱氨酸残基连接；具体来说，通过PEG链的顺丁烯二酰亚胺基和半胱氨酸残基的硫氢基之间的硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将两者连接在一起。在本揭示中，连接到中心核的半胱氨酸残基上的PEG链称为耦合臂，且其自由端带有上述官能团。
当可理解，本案所述中心核的半胱氨酸残基可取代成任何侧链带有硫氢基的氨基酸；譬如：带有(CH(OH)-)nCH2-SH侧链(n＝1-5)的α-氨基酸、带有(CH2-CH(OH)-)nCH2-SH侧链(n＝1-3)的α-氨基酸以及带有(CH2-CH2-O-)nCH2-SH侧链(n＝1-2)的α-氨基酸。这些氨基酸不必然是天然存在的氨基酸。此外，半胱氨酸残基也不必然要设于多肽核的N-或C-端。举例来说，可将半胱氨酸残基设于肽中间的位置，而使得赖氨酸残基位于半胱氨酸残基的两侧。
在较佳的情形中，耦合臂的自由端带有四嗪基或高应力炔基(如，环辛烯基或环辛炔基)。这些耦合臂具有2-12个EG单元。根据本揭示的实施方式，上述四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪1,2,4,5-四嗪或其衍生物。高应力炔基可以是环辛烯基或环辛炔基。根据本揭示的实验例，所述环辛烯基可以是反式-环辛烯(TCO)基；而环辛炔基的实施例包括，但不限于：二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、二环壬炔(BCN)与二苯并环辛炔(DICO)。根据本揭示某些实施方式，四嗪基为6-甲基-四嗪。
根据多种实施例，用以与耦合臂连接的中心核包括，但不限于：
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4以及
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4。
或者是，中心核的一端带有叠氮基或炔基，而另一端则接上了带有四嗪基或高应力炔基的耦合臂，兹举例如下：
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH、
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
高应力炔基-Xaa2-12-C(AC)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP以及
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP。
也可利用重组技术来合成上述多肽，再利用细菌或哺乳类宿主细胞来表达指定的基因区段。如果核的赖氨酸残基数目较多且长度较长，利用重组蛋白技术来制备多肽是较佳的。这是因为当多肽长度变长时，使用固态合成法发生错误的机率会增加，且其纯度和/或产量会降低。要运用细菌或哺乳类宿主细胞来产生多肽时，可在两个K残基之间插入长度为几个到10-20个氨基酸残基的填充序列。此外，由于AHA和HPG并非可由遗传密码子编码的天然氨基酸，这些重组多肽的N-端或C-端残基可以是半胱氨酸。在表达出重组蛋白并将其纯化之后，可使末端的半胱氨酸残基和短的双官能团交联物反应；上述双官能团交联物的一端带有可和半胱氨酸残基的SH基反应的顺丁烯二酰亚胺基，另一端则带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基。
相较于利用常规氨基酸(如甘氨酸与丝氨酸残基)来合成多肽，使用聚乙二醇化氨基酸来合成多肽的步骤较少。此外，可采用不同长度的聚乙二醇化氨基酸(即，带有不同EG重复单元者)，一方面可提供柔性与可溶性，另一方面亦可在相邻的赖氨酸残基之间提供间隔。除了聚乙二醇化氨基酸之外，中心核也可包含人工氨基酸，如D-构形氨基酸、高氨基酸、N-甲基氨基酸等。在较佳的情形中，可使用带有不同长度聚乙二醇(PEG)的聚乙二醇化氨基酸来建构中心核，因为氨基酸分子中所含的PEG部分可提供构形上的柔性，并在用以缀合的基团间提供了适当的间隔，还可以提升其水溶性；另外，一般来说，PEG的免疫源性较低。合成带有聚乙二醇化氨基酸的中心核的方法和合成常规多肽相似。
视需要，本发明中心核可更带有一乙酰基，以保护位于N端的氨基酸残基，进而提升其稳定性。
当可理解，连接于中心核的连接臂的数目主要取决于中心核中所含赖氨酸残基的数目。由于本发明中心核包含至少两个赖氨酸残基，所述接合单元可包含多个连接臂。
参照图1A。如图所示，接合单元10A包含中心核11a，其带有一个HPG(GHP)残基以及四个赖氨酸(K)残基，其间分别以填充序列(以下各附图中以“···”表示)隔开。HPG残基和K残基之间或任两个K残基之间的填充序列可以是相同或不同的氨基酸序列。在本实施例中，四个连接臂20a-20d藉由NHS基和赖氨酸残基的氨基间所形成的酰胺键而连接到各个赖氨酸残基。当可理解，本说明书所述的多种接合单元间可能有一些共通的特征，因此针对上述接合单元10A或下述各接合单元所述的某些或全部特征可能也适用于下文提出的实施例，除非其明显有悖于特定实施方式的脉络。为求简洁，下文可能不会重复说明这些共通特征。
图1B绘示了根据本揭示另一种实施方式的接合单元10B。中心核11b有一个半胱氨酸(C)残基以及六个赖氨酸(K)残基，这些残基之间分别以填充序列隔开。在本实施例中，接合单元10B包含连接到各个赖氨酸残基的六个连接臂20a-20f。根据本揭示的实施方式，连接臂是具有2至20个EG重复单元的PEG链。
接合单元1B与图1A的接合单元10A不同之处在于接合单元1B还包含耦合臂60。如上文所述，可利用一端带有顺丁烯二酰亚胺基而另一端带有一官能团的PEG链来形成耦合臂60。如此一来，耦合臂60可通过硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应而连接到中心核11b的半胱氨酸残基。在本实施例中，耦合臂60的自由端带有的官能团是四嗪基72。根据本揭示的实施方式，耦合臂是具有2至12个EG重复单元的PEG链。
当需要在靶位释放效应组件时，可以在连接臂中加入一个可裂解键；上述裂解键可经酸/碱水解、还原/氧化或酶作用而裂解。举例来说，可利用NHS-PEG2-20-S-S-顺丁烯二酰亚胺形成此处所述的耦合臂，这是一种可裂解PEG链，其中的S-S双硫键会被缓慢的还原，而NHS基可用来和中心核的氨基缀合，进而将PEG链连接到中心核上。另外，可利用叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基来取代位在连接臂自由端的顺丁烯二酰亚胺基。
根据本发明实施方式，连接到中心核的K残基的连接臂在自由端带有一官能团(即，顺丁烯二酰亚胺基、NHS基、叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)。在较佳的情形中，当连接臂的自由端是叠氮基、炔基或环辛炔基时，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端是四嗪基或环辛烯基。或者是，当连接臂的自由端是四嗪基或环辛烯基时，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基带有叠氮基或炔基；或者是位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端带有叠氮基、炔基或环辛炔基。
随着位于连接臂自由端上的官能团(即，顺丁烯二酰亚胺基、NHS基、叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)的不同，可以设计带有相应官能团的功能性组件(譬如，靶向组件、效应组件或用以改善药动学性质的组件)，而使得所述功能性组件可通过任一种下列化学反应而连接到连接臂的自由端：
(1)形成酰胺键：在此情形中，连接臂的自由端有一NHS基，且功能性组件有一氨基；
(2)硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应：在此情形中，连接臂的自由端有一顺丁烯二酰亚胺基，且功能性组件有一硫氢基；
(3)一价铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(copper(I)-catalyzed azide-alkynecycloaddition；CuAAC，或简称为“点击”反应)：连接臂的自由端和功能性组件其中之一带有叠氮基，而另一个则带有炔基；CuAAC反应如反应式1所示；
(4)逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)：连接臂的自由端和功能性组件其中之一带有四嗪基，而另一个则带有环辛烯基；iEDDA反应如反应式2所示；或
(5)应力促进的叠氮化物-炔羟点击化学(strain-promoted azide-alkyne clickchemistry，SPAAC)：连接臂的自由端和功能性组件其中之一带有叠氮基，而另一个则带有环辛炔基；SPAAC反应如反应式3所示。
<<反应式1 CuAAC反应>>
Figure GDA0003577147960000401
<<反应式2 iEDDA反应>>
Figure GDA0003577147960000411
<<反应式3 SPAAC反应>>
Figure GDA0003577147960000412
CuAAC反应会产生1,5-二取代1,2,3-三唑(1,5-disubstituted1,2,3-triazole)。炔基和叠氮基之间的反应选择性极高，且天然生物分子不含炔基和叠氮基。再者，上述反应快速且对pH值不敏感。已知除了利用一价铜(如溴化铜(I)或碘化铜(I))来催化点击反应之外，较佳可使用二价铜和还原剂(如抗坏血酸钠)的混合物以在反应系统中原位(in situ)产生一价铜。或者是，可利用不含铜的反应，将第二组件连接到中心核的N-或C-端，此反应可利用五甲基环戊二烯基氯化钌复合物(pentamethylcyclopentadienyl rutheniumchloride complex)作为催化剂，以催化叠氮基-炔环加成反应。
为了方便说明，和连接臂相连的功能性组件称为第一组件。当可理解，本发明接合单元可携带的第一组件的数目取决于中心核的K残基的数目(且因此，取决于连接臂的数目)。因此，本发明所属技术领域的普通技术人员可调整所述接合单元中第一组件的数目，以达到所欲的靶向或治疗效果。
如图1C所示，例示性的接合单元10C包含第一组件。除了下文所述的特征之外，图1C所示结构与图1B相似。首先，中心核11d有五个K残基，且因此有五个连接臂20a-20e分别与这些K残基相连。其次，接合单元10C有五个第一组件30a-30e，分别连接于每一连接臂20a-20e。如下文所述，视需要加入的四嗪基72使得所述接合单元可和额外的功能性组件或另一个分子构建体(参见下文第二节或第三节)缀合。
为了要进一步增加所需的效果(如，疗效)，本发明接合单元除了第一组件之外还可以包含第二组件。举例来说，第二组件可以是靶向组件或效应组件。在本揭示可任选的实施方式中，第一组件是效应组件，而第二组件可以是另一种效应组件，两者可以加成地或协同地作用，亦可独立作用。在另一种例子中，第一与第二组件可发挥不同的性质；譬如，第一组件是靶向组件，而第二组件是效应组件，反之亦然。或者是，第一组件是效应组件，而第二组件则能够改善接合单元的药动学特性，如可溶性、廓清率、半衰期与生物可用率。在选择所述接合单元(或多臂接合物)所含的特定第一组件和/或第二组件时，需考虑所欲的应用。下文第一节第(iii)部分讨论了这些功能性组件的实施例。
在结构上，第二组件可连接到中心核N-或C-端的叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。具体来说，当有需要时，可将第二组件和短PEG链(较佳为具有2至12个EG重复单元)缀合，之后再将其连接到位在N-或C-端的带有叠氮基或炔基的氨基酸残基(譬如AHA残基或HPG残基)。或者是，当有需要时，可将第二组件和短PEG链缀合，且之后再将其连接于中心核的耦合臂。
根据本揭示某些实施方式，中心核的N-或C-端是带有叠氮基(譬如AHA残基)的氨基酸残基；且因此，带有炔基的第二组件就可以通过CuAAC反应而连接到中心核的N-或C-端。根据本揭示其它实施方式，上述中心核的N-或C-端是带有炔基(譬如HPG残基)的氨基酸；而带有叠氮基的第二组件就可以通过CuAAC反应而连接到中心核的N-或C-端。
图1D绘示根据本发明实施例的另一种接合单元10D，其携带了多个第一组件与一个第二组件。在本实施例中，中心核11c包含一个HPG(GHP)残基以及五个赖氨酸(K)残基。五个连接臂20a-20e分别连接到中心核11c的五个K残基；而五个第一组件30a-30e则通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应连接到各个连接臂20a-20e。除了第一组件之外，所述接合单元10D还包含一个第二组件50，其系连接于短PEG链62的一端。在和中心核11c缀合之前，短PEG链62的另一端带有叠氮基。如此一来，叠氮基可和带有炔基的HPG残基进行CuAAC反应，而使得第二组件50连接至中心核11c。图1D所示的实心圆点40代表HPG残基和叠氮基间因为CuAAC反应所形成的化学键。
或者是，第二组件通过耦合臂而和中心核连接。根据本揭示某些实施方式，耦合臂带有四嗪基，因此可通过iEDDA反应而有效率地连接到带有TCO基的第二组件。根据本揭示其它实施方式，耦合臂带有TCO基，而第二组件可带有四嗪基，故两者可通过iEDDA反应而互相连接。相较于位在端点的炔基，iEDDA反应中所采用的高应力环辛烯基的活化能明显较低，且因此iEDDA反应不需使用额外催化剂。
接着参照图1E，其中接合单元10E的中心核11d包含位于N端的半胱氨酸(C)残基和五个赖氨酸(K)残基。如图1E所示，这五个连接臂20a-20e分别连接到中心核11d的五个K残基，而五个第一组件30a-30e则通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而分别连接到五个连接臂20a-20e。半胱氨酸残基连接于耦合臂60；在缀合有第二组件之前，耦合臂60的自由端带有四嗪基或TCO基。在本实施例中，第二组件50可和带有相应TCO或四嗪基的短PEG链62连接，再通过iEDDA反应而连接到耦合臂60。图1E所示的椭圆点70代表耦合臂60和短PEG链62间进行iEDDA反应所产生的化学键。
根据本揭示其它实施方式，在和第二组件缀合之前，耦合臂带有叠氮基；当第二组件和自由端带有高应力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)的短PEG链连接时，耦合臂和第二组件就可以通过SPAAC反应(参见反应式3)而连接，反之亦然。
接着参照图1F，其中接合单元10F的结构和图1E的接合单元10E相近，不同之处在于耦合臂60带有叠氮基或高应力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)而不是四嗪基或TCO基。因此，第二组件50要和带有相应的高应力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO)或叠氮基的短PEG链62连接，而使得第二组件50和耦合臂60可通过SPAAC反应而连接。图1F所示的菱形点90代表耦合臂60与短PEG链62之间因为SPAAC反应所形成的化学键。
反应式4为制备本发明接合单元的例示性流程。在步骤1，先制备中心核，其氨基酸序列包含(GSK)3，且C端为L-叠氮高丙氨酸(AHA)残基。在步骤2，通过在NHS基与氨基间形成酰胺键，而将三个连接臂分别连接到中心核的赖氨酸(K)残基，连接到中心核的连接臂在其自由端带有顺丁烯二酰亚胺(Mal)基。在步骤3，通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将三个抗-纤维素抗原scFv(scFvα纤维素)分别连接到各连接臂上，此处的抗-纤维素抗原scFv即为第一组件。同时，在步骤4，将一个tPA类似物和自由端带有DBCO基的短PEG链连接，上述短PEG链有4个EG重复单元，此处的tPA类似物即为第二组件。最后，在步骤5，通过SPAAC反应将第二组件连接到中心核的AHA残基。
<<反应式4通过连接臂与C-端氨基酸残基连接两种不同scFv的接合单元的制备方法>>
Figure GDA0003577147960000451
反应式5图解了制备本发明接合单元的另一种例示性流程。在步骤1，先制备中心核，其氨基酸序列包含(K-Xaa)3且C-端有一半胱氨酸残基。在步骤2，将一端带有顺丁烯二酰亚胺(Mal)基另一端带有四嗪基的PEG链(作为耦合臂)通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应连接到半胱氨酸残基。之后，在步骤3，将三个连接臂分别连接到中心核的赖氨酸(K)残基。接着，如步骤4所示，通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将三个抗-纤维素scFv(scFvα纤维素)分别连接到各连接臂上，此处的抗-纤维素scFv即为第一组件。同时，在步骤5，将一个tPA类似物和自由端带有TCO基的短PEG链连接，上述短PEG链有3个EG重复单元，此处的tPA类似物即为第二组件。最后，在步骤6，通过iEDDA反应将第二组件连接到耦合臂。
<<反应式5通过连接臂与耦合臂连接两种不同scFv的接合单元的制备方法>>
Figure GDA0003577147960000471
聚乙二醇化(PEGylation)是将PEG链附接或连接到分子(如，药物或蛋白)的方法。聚乙二醇化可以改善多种重要的药理学特性，譬如提升可溶性、延长生命周期以及减少蛋白质水解降解。根据本揭示一实施方式，第二组件是PEG链，其分子量约为20,000到50,000道耳顿。
图1G绘示了另一种例示性的接合单元10G，其中五个第一组件30分别通过连接臂20连接到赖氨酸残基，且中心核11e的HPG(GHP)残基通过CuAAC反应与PEG链80连接。图1G所示的实心圆点40代表HPG残基与PEG链80间因为CuAAC反应所形成的化学键。
图1H是本揭示的另一种实施例，接合单元10H的中心核11d的N-端是与耦合臂60相连接的半胱氨酸残基。可通过iEDDA反应而有效率地将PEG链80连接到耦合臂60。接合单元10H的椭圆点70代表耦合臂60与PEG链80之间因为iEDDA反应所形成的化学键。
图1I是本发明接合单元的另一种实施例，所示的接合单元10I结构与图1G的接合单元10G相似，不同之处在于PEG链80是通过SPAAC反应连接到耦合臂60。图1I所绘示的菱形点90代表耦合臂60与PEG链80之间因为SPAAC反应所形成的化学键。
根据本揭示某些实施方式，除了第一与第二组件之外，本发明接合单元还包含第三组件。在此种实施例中，中心核的N-或C-端是带有叠氮基或炔基的氨基酸残基，而另一端是半胱氨酸残基。中心核的赖氨酸残基分别和连接臂相连接，且每一条连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基；而中心核的半胱氨酸残基则和自由端带有四嗪基或高应力炔基的耦合臂相连。如此一来，第一组件因此通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应连接于连接臂，而第二组件则可通过iEDDA反应和耦合臂相连接。另外，第三组件则是通过CuAAC反应或SPAAC反应而连接到带有叠氮基或炔基的末端氨基酸残基。
接着参照图1J的接合单元10J，其中心核11f的N-端为HPG(GHP)残基，而C-端是半胱氨酸残基。连接臂20和耦合臂60分别连接到中心核11f的赖氨酸(K)残基以及半胱氨酸(C)残基。此外，五个第一组件30分别连接到五个连接臂20，第二组件(即，PEG链)80和耦合臂60连接，而第三组件50则通过短PEG链62连接到HPG残基。实心圆点40代表HPG残基和短PEG链62之间因为CuAAC反应所形成的化学键；而椭圆点70代表耦合臂60与PEG链80之间因为iEDDA反应所形成的化学键。
图1K绘示了本揭示的另一种实施方式；接合单元10K的结构与图1J所示的接合单元10J相似，不同之处在于短PEG链62是通过SPAAC反应而连接到HPG残基，而非通过iEDDA反应。图1K的菱形点90代表短PEG链62和HPG残基之间因为SPAAC反应所形成的化学键。
在本揭示较佳的实施方式中，连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基，以便和带有硫氢基的第一组件通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而缀合。此外，肽核的一端可以是半胱氨酸残基或带有叠氮基或炔基的氨基酸残基，以供和耦合臂接合，进而连接第二组件。
本发明所属技术领域的普通技术人员当可想见，可对上述结构进行各种修改。举例来说，在连接臂的自由端可采用顺丁烯二酰亚胺基以外的官能团(譬如叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)，以便通过CuAAC、iEDDA或SPAAC反应来连接第一组件。此外，半胱氨酸残基(或带有叠氮基或炔基的氨基酸残基)可以位在肽核N-或C-端以外的位置。更有甚者，可在肽核中加入两个或更多个上述残基，以供接合多个耦合臂，并进一步连接多个第二组件。
(ii)用于多臂接合物的化合物核
除了本揭示第一节第(i)部分所述的述接合单元之外，此处亦揭示了另一种接合单元，其使用化合物(而非多肽)作为中心核。具体来说，所述化合物可以是苯-1,3,5-三胺、2-(氨甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺、三(2-氨乙基)胺、苯-1,2,4,5-四胺、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-联苯、四(2-氨乙基)甲烷、四(乙胺)肼、N,N,N’,N’,-四(氨乙基)乙二胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺或N,N-二[(1-氨基-3,3-二氨乙基)戊基]甲烷二胺。上述化合物均带有至少三个相等或对称构形的氨基。因此，当一化合物的其中一个氨基与一耦合臂缀合时，所有由该化合物形成的分子都具有相同的构形。
此处所述的化合物和本揭示第一节第(i)部分所述的接合单元相似，都分别包含多个氨基，且因此，可将多个带有NHS基的PEG链通过氨基和NHS基之间所形成的酰胺键而连接到化合物核上；利用此方式接上来的PEG链即为本案所述的连接臂，此连接臂的自由端带有一官能团(如，NHS基、顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基)。同时，所述化合物核有至少一个氨基连接到另一PEG链，此PEG链一端带有NHS基且另一端带有一官能团(如，叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基)；化合物核与此种PEG链同样通过酰胺键结来连接，接上后的该PEG链称为耦合臂，其自由端带有上述官能团。
因此，可藉由以下方式将第一组件连接到连接臂上：(1)在两者间形成酰胺键；(2)通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应；(3)通过CuAAC反应；(4)通过iEDDA反应；或(5)通过SPAAC反应。同时，可通过CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应将第二组件连接到耦合臂上。
根据本揭示某些实施方式，连接臂是具有2至20个EG重复单元的PEG链；而耦合臂则是具有2至12个EG重复单元的PEG链。
反应式6、7分别图解了中心化合物核和连接臂之间以及中心化合物核和耦合臂之间的连接关系。在反应式6和7中，NHS代表NHS酯类、Mal代表顺丁烯二酰亚胺基、azide代表叠氮基且alkyne代表炔基。
作为中心核的化合物应有多对称且有相同方向的氨基，其理由如下：当利用其中一个氨基来连接一个双官能团接合臂(即，带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基并且带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基)时，可以得到均质的产物(也就是接有耦合臂的中心核，且耦合臂带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基)，故可将其纯化。之后可利用此种产物来制备多臂接合单元，将其剩余的氨基都接上自由端带有顺丁烯二酰亚胺基或其它耦合基团的连接臂。若带有多个氨基的化合物是不对称的化合物，此种化合物和双官能团接合臂/耦合臂接合后所得到的产物就不是均质的产物。
<<反应式6将分别带有顺丁烯二酰亚胺基与叠氮基的连接臂与耦合臂连接到中心核>>
Figure GDA0003577147960000511
<<反应式7将分别带有顺丁烯二酰亚胺基与炔基的连接臂与耦合臂连接到中心核>>
Figure GDA0003577147960000512
可进一步修饰上述对称化合物，以使得其可和更多的连接臂/耦合臂连接。举例来说，四(2-氨乙基)甲烷是可从一般化合物合成或商业购得的化合物，可利用此种化合物作为核来建构连接了四个连接臂/耦合臂的接合单元。四(2-氨乙基)甲烷能够和二(磺基琥珀酸亚酰胺)辛二酸酯(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)进行反应生成两个四(2-氨乙基)甲烷分子的缩合产物其可作为核而用以连接六个连接臂/耦合臂。此处所述的接合单元分别带有三个、四个与六个连接臂/耦合臂，对于建构具有靶向/效应分子的联合接合物来说，上述连接臂/耦合臂的数目应相当充足。
当可理解，连接臂和/或耦合臂的数目还有与其连接的组件数目都取决于中心核中所含的氨基数目。在某些较佳的实施方式中，连接臂/耦合臂的数目还有与其连接的组件数目是1到7个。
参照图2，其中示出了带有四个氨基的苯-1,2,4,5-四胺；其中三个氨基分别和连接臂20相连，而另一个氨基则和耦合臂60相连，且耦合臂60的自由端带有叠氮基。之后，通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将三个第一组件30分别连接到三个连接臂20上，并通过CuAAC反应将一个第二组件50连接到耦合臂60上。图2中所示的实心圆点40代表耦合臂60与第二组件50之间因为CuAAC反应所形成的化学键。
(iii)适用于多臂接合物的功能性组件
当接合单元(或多臂接合物)仅包含第一组件而不带有第二和/或第三组件时，第一组件是一效应组件，其可于患者体内发挥治疗的效果。另一方面，当此处提出的接合单元包含除了第一组件以外的其它组件时，则这两种组件中应有至少一种是效应组件，而另一者可以是另一效应组件、一靶向组件或能够改善接合单元药动学特性(如，溶解度、廓清率、半衰期与生物可用率)的组件。譬如，接合单元可带有两种不同的效应组件、一效应组件与一靶向组件或一提升药动学特性的组件、两种不同的靶向组件与一种效应组件、两种不同的效应组件与一种靶向组件；或是可带有一种靶向组件、一种效应组件以及一种可改善接合单元药动学特性的组件。
根据本揭示某些实施方式，本案所述的接合单元可用于预防血栓形成。在这些实施方式中，本案提出的接合单元之第一组件为对纤维素特异的scFv(作为靶向组件)，其第二组件为第Xa型凝血因子抑制剂或凝血酶抑制剂(作为效应组件)。在较佳的情形中，所述第Xa型凝血因子抑制剂是选自由阿哌沙班、伊度沙班与利伐沙班所组成的群组；且所述凝血酶抑制剂是阿加曲班或美拉加群。
用于治疗血管栓塞的接合单元之第一组件是对纤维素特异的scFv(作为靶向组件)，且其第二组件是组织型纤溶酶原激活剂(作为效应组件)，譬如阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶与拉诺普酶。
(iv)多臂接合物的用途
本揭示亦关于利用适当接合单元来治疗各种疾病的方法。一般来说，所述方法包含以下步骤：对需要治疗个体投予有效量的根据本揭示实施方式的接合单元。
相较于既有的治疗性构建体，第一节段落所述的接合单元至少有以下的优点：
(1)可以视需求和/或用途来调整功能性组件的数目。根据不同用途的需求，本发明接合单元可包含二种组件(即，第一与第二组件)或三种组件(即，第一、第二与第三组件)，上述需求包括欲治疗的疾病、接合单元的给药方法、接合单元所携抗体的结合力与亲和力等等。举例来说，当要将接合单元直接投递到特定组织/器官(譬如，治疗眼睛)时，可以只使用一种组件作为效应组件，而不需加入作为靶向组件的第二组件。然而，当通过周边给药途径来投递接合单元时，譬如经口服、肠胃道、鼻腔、局部或黏膜给药、或以肌肉内、静脉内或腹膜内注射，本发明接合单元就需要包含靶向组件，以便将接合单元特异地靶向到病灶部位；此外，接合单元还应该包含效应组件，以便在病灶部位发挥治疗效果。为了要提高接合单元的靶向或治疗效果或提升其稳定度，本发明接合单元还可进一步包含第三组件；所述的第三组件例如可以是第二靶向组件、第二效应组件或PEG链。
(2)第一组件是以成束(bundle)的形式存在。如上文所述，第一组件的数目取决于中心核所包含的赖氨酸残基的数目。如果中心核中赖氨酸残基的数目是2到15，则每一接合单元可带有至少两个第一组件。因此，相较于传统治疗性构建体仅能携带单一个分子(譬如单一个细胞毒性药物或抗体分子)，本发明接合单元可同时提供更多的功能性组件(不论是靶向组件或效应组件)，进而可大幅提升疗效。
在某些治疗应用中，可能想要采用单一份的靶向或效应组件。譬如，可使用单一份靶向组件来避免因为靶向组件结合力太强而导致不理想的副作用；当所用的scFv对靶点抗原有相对较高的亲和力，且当靶点抗原是正常细胞(而非所靶向的染病细胞)上的细胞表面抗原时，上述考虑更显重要。作为例子，当使用对CD3或CD16a特异的scFv来招募T细胞或NK细胞以消灭所靶向之细胞(譬如葛瑞夫兹氏症患者的甲状腺细胞)时，较佳可使用单一份对CD3或CD16a特异的scFv，因而能够避免因为CD3或CD16a交联而产生的不良副作用。相似地，在使用对CD3或CD16b特异的scFv来招募吞噬性嗜中性白血球与巨噬细胞来清除与抗体结合的病毒或细菌粒子或其产物时，较佳可使用单一份scFv。此外，在使用对运铁蛋白受器特异的scFv来携带效应药物分子至BBB以治疗CNS疾病时，较佳可使用单一份对运铁蛋白受器特异的scFv。在又一种例子中，可能想要加入单一份的长链PEG，以提升接合单元的药动学特性；因为使用两个或更多的长PEG链可能会使得PEG链缠结而影响靶向或效应组件的结合力。
第二节 用以治疗特定疾病的联合接合物分子构建体
本揭示的另一方面是关于包含至少两个接合单元的分子构建体，其中一接合单元带有一个或多个靶向组件，而另一接合单元带有一个或多个效应组件或可提升药动学特性的组件。在本揭示中，将带有靶向与效应部分(可以是治疗效果或药动学效果)的分子构建体称为联合接合物分子构建体。根据本揭示各种实施方式，此种联合接合物分子构建体中所含的每一接合单元可以是基于肽核或基于化合物核的多臂接合物，如上文第一节所述。根据本揭示某些实施方式，本发明分子构建体的至少一个接合单元包含多肽核。在较佳的情形中，本发明分子构建体的至少两个接合单元包含多肽核。在更佳的情形中，本发明分子构建体的所有接合单元分别包含多肽核。
(i)联合接合物分子构建体的结构
根据本揭示某些实施方式，所述分子构建体包含两个接合单元，且这些接合单元间通过CuAAC反应(以铜或五甲基环戊二烯基氯化钌复合物为催化剂)、SPAAC反应或iEDDA反应彼此连接。在一些实施方式中，两个接合单元中其中一个连接有多个第一组件(作为靶向组件)，而另一个连接有多个第二组件(作为效应组件)。
根据本揭示其它实施方式，所述分子构建体包含三个接合单元，其中第一与第二接合单元彼此通过iEDDA反应而连接，而之后再通过CuAAC反应将第三接合单元接合到第一或第二接合单元。或者是，第一与第二接合单元彼此通过iEDDA反应连接，而第三接合单元则通过SPAAC反应而接到第一或第二接合单元。在一些实施方式中，第一、第二与第三接合单元分别带有多个第一、第二与第三组件，其中第一、第二与第三组件彼此不同。根据一实施方式，上述三种组件(即，第一、第二与第三组件)中的其中两种是靶向组件，而另一种则是效应组件。根据另一实施方式，三种组件组件中有两种是效应组件，而另一种是靶向组件。根据又另一种实施方式，三种组件中有一种是靶向组件、第二种组件是效应组件，而另一种组件则可改善所述分子构建体的药动学特性，如可溶性、廓清率、半衰期与生物可用率。
首先参照图3A至3D，这些附图分别绘示了两个接合单元之间的连接方式。图3A所示的分子构建体包含两个接合单元(100A、200A)，彼此间通过iEDDA反应连接。第一接合单元100A包含第一中心核110a、连接臂120(下称第一连接臂)以及耦合臂130a(下称第一耦合臂)，其中所述连接臂与耦合臂分别以一端连接于第一中心核110a。相似地，第二接合单元200A包含第二中心核210a、连接臂220(下称第二连接臂)以及耦合臂230a(下称第二耦合臂)，其中所述连接臂与耦合臂分别以一端连接于第二中心核210a。耦合臂130a、230a其中之一的自由端带有四嗪基，而另一个的自由端则带有TCO基。具体来说，若耦合臂130a的自由端(即，未连接到第一中心核110a的一端)带有四嗪基152，则耦合臂230a的自由端(即，未连接到第二中心核210a的一端)就带有TCO基154，反之亦然。因此，这两个接合单元(100A与200A)就会通过发生在耦合臂130a与230a的自由端间的iEDDA反应而彼此连接。图3A所示的椭圆点156代表耦合臂130a与230a间因为iEDDA反应而产生的化学键。
在所绘示的实施方式中，连接臂120、220的自由端各带有顺丁烯二酰亚胺基。因此，各自带有硫氢基的第一靶向组件140与第一效应组件240就可通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应分别连接到连接臂120、220。
根据一实施方式，图3A所示的第一与第二中心核110a、210a都是多肽核。根据另一实施方式，图3A所示的第一与第二中心核110a、210a都是化合物核。根据又一实施方式，图3A所示的第一与第二中心核110a、210a其中之一是多肽核，而另一个则是化合物核。
图3B绘示根据本揭示的替代性实施方式，其中第一与第二中心核110b、210b都是多肽核，且分别通过连接臂120、220分别和第一靶向组件140与第一效应组件240相连。本实施方式的特点在于，中心核110b、210b其中之一的N-或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基(譬如AHA残基)，而另一者的N-或C-端则是带有炔基的氨基酸残基(譬如HPG残基)，此种构形使得中心核110a、210a能够直接地彼此连接，亦即，不需通过图3A所示的耦合臂来连接。具体来说，若中心核110b的N-或C-端为带有叠氮基162的氨基酸残基，则中心核210b的N-或C-端为带有炔基164的氨基酸残基，反之亦然。因此，接合单元100B与200B可通过发生在中心核110b、210b的上述N-或C-端氨基酸残基间的CuAAC反应而直接连接。图3B所示的实心圆点166代表上述N-或C-端氨基酸残基间形成的化学键。
图3C是本揭示的另一种实施方式。接合单元100C与200C的结构和接合单元100A与200A类似，不同之处在于耦合臂130b、230b分别带有叠氮基162与DBCO基172，而非如图3A的接合单元100A、200A一般带有叠氮基152与炔基154。具体来说，中心核110a和自由端带有叠氮基162的耦合臂130b(下称第一耦合臂)连接；而中心核210a则和自由端带有DBCO基172的耦合臂230b(下称第二耦合臂)连接。接着，所述接合单元100C与200C可透过发生在耦合臂130b、230b之间的SPAAC反应相连接；两者间形成的化学键182以菱形表示。
在一实施方式中，图3C所示的第一与第二中心核110a、210a都是多肽核。在另一实施方式中，图3C所示的第一与第二中心核110a、210a都是化合物核。在又一实施方式中，图3C所示的第一与第二中心核110a、210a其中之一是多肽核，而另一个则是化合物核。
当可理解，两个接合单元也可通过发生在中心核与耦合臂之间的CuAAC反应而彼此连接。接着参照图3D，中心核110b的N-或C-端是带有叠氮基162的氨基酸残基(譬如AHA残基)，而中心核210a与自由端带有DBCD基172的耦合臂230b连接。因此，接合单元100B与200C可通过发生在中心核110b与耦合臂230b之间的SPAAC反应而彼此连接；两者间形成的化学键182以菱形表示。
根据一实施方式，图3D所示的接合单元100B、200C分别包含多肽核。根据另一实施方式，图3D所示的中心核100B为多肽核，而中心核200C则为化合物核。
或者是，一接合单元的N-或C-端为带有炔基的氨基酸残基(譬如HPG残基)，且另一接合单元包含自由端带有叠氮基的耦合臂，故两者可通过中心核与耦合臂之间的CuACC反应而连接。
与其它治疗性构建体相较之下，本发明分子构建体至少有以下三种优点：
(1)可独立制备带有特定数目和/或类型之靶向/效应组件的接合单元，之后再通过CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应将这些接合单元彼此连接在一起；
(2)可基于特定应用的需求(譬如欲治疗的疾病、以及靶向和/或效应组件的结合亲和力(binding avidity)和/或亲和力(affinity)等)，来改变靶向和/或效应组件的数目与种类。可根据具体的需求与应用来调整靶向与效应组件。可随着各种因素，譬如欲治疗的症状、患者的生理状况和/或欲治疗的疾病种类等，来改变本发明靶向与效应组件。临床治疗时，可结合最适当的靶向组件与最适当的效应组件，以便达到最理想的治疗效果。根据本揭示的实施方式，靶向组件可以是生长因子、肽类激素、细胞因子或抗体片段；而效应组件可以是免疫调节剂、与放射性核种复合的螯合剂、细胞毒性药物、细胞因子、可溶性受体或抗体；以及
(3)在接合任两个接合单元时，此处提出的CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应的接合效率优于其它接合反应。
接着参照图4，可单独制备图中绘示的六个库。在本实施方式中，库1-6分别包含多个连接有功能性组件的接合单元300A、300B、300C、400A、400B与400C。每个接合单元300A、300B与300C在结构上类似；其中接合单元300A、300B与300C各自包含一个中心核310、一条与中心核连接的耦合臂330，且耦合臂330的自由端带有四嗪基350，还有不同数目的连接臂320。举例来说，接合单元300A有四条连接臂320，且因此，有四个分别连接到这四条连接臂320的靶向组件340a。相似地，两个靶向组件340b与五个靶向组件340c则分别连接到接合单元300B与300C。靶向组件340a、340b与340c可以相同或不同。至于接合单元400A、400B与400C则分别有一中心核410、一条与其相连的耦合臂430，且耦合臂430的自由端带有高应力炔基450，另外还有不同数目的连接臂420。如图所示，三个效应组件440a、五个效应组件440b以及八个效应组件440c分别连接到接合单元400A、400B与400C。效应组件440a、440b与440c可以相同或不同。可独立地制备库1-6。本发明所属技术领域的普通技术人员可以从库1、2与3中选择第一接合单元，并从库4、5与6中选择第二接合单元，接着再通过发生在四嗪基350与高应力炔基450之间的iEDDA反应，而将第一与第二接合单元连接在一起，因此，所得到的分子构建体即具有指定数目的靶向与效应组件。
从上述库的概念出发，可基于所选的库得到具有不同构形的分子构建体。图5A是所述分子构建体的一种实施例，其中第一与第二中心核(310、410)各自连接了三条连接臂(320、420)与一条耦合臂(330、430)。三个第一靶向组件340分别连接到每一连接臂320；而三个第一效应组件440则分别连接到连接臂420。这两个接合单元透过耦合臂330、430间因为iEDDA反应所形成的化学键356而彼此连接。通过这种构形，所得到的分子构建体可带有多个相同数目的靶向和/或效应组件。
图5B是上述分子构建体的另一种实施例，其中第一与第二中心核分别带有不同数目的氨基(譬如赖氨酸残基)，且因此，所述分子构建体带有不同数目的靶向与效应组件。在图中所示的实施例中，第一中心核310连接有一条耦合臂330与两条连接臂320。第二中心核410则接有一条耦合臂430与五条连接臂420。因此，有两个靶向组件340分别连接到两条连接臂320上；并有五个效应组件440分别连接到五条连接臂420上。图5B中的椭圆点356代表耦合臂330、430之间的键结。
在可选的实施方式中，本发明分子构建体可还包含相对较长的PEG链，该长PEG链和第一或第二中心核连接，而使得在施用至一个体后，本发明分子构建体可远离网状内皮(reticuloendothelial)系统而能有较长的半衰期。在利用PEG链修饰蛋白质以改善其药动学特性和/或降低免疫源性的时候，较佳可使用分子量最高为20,000-50,000道耳顿的PEG。因此，在本发明较佳的实施方式中，会使用相对较短的PEG链作为连接靶向与效应组件所用的连接臂，而要提升分子构建体在活体内的半衰期时，则会将分子量为20,000到50,000道耳顿的PEG链连接到任一接合单元。
在某些实施方式中，可利用多个作为靶向和/或效应组件的scFv片段，以建构本发明分子构建体。对于以含有scFv片段的分子构建体为基础的靶向组件/效应组件药物，其所含的scFv片段的活体内半衰期应该比单独的抗体片段来得长。在某些临床应用中，药物的半衰期越长越好，因此就不需要经常施用这些药物，此时可利用分子量为20,000到50,000道耳顿的PEG链作为连接臂，以连接作为靶向或效应组件的scFv片段。可利用上述长度的PEG来修饰多种治疗性蛋白，以延长其半衰期。
根据本揭示某些实施方式，所述接合单元可包含分别连接了不同功能性组件的两条连接臂。参照图6，其中所述分子构建体包含两个接合单元100A与200D。第一与第二功能性组件140、240(一个作为靶向组件，而另一个作为效应组件)分别通过连接臂120与220连接到第一中心核110a与第二中心核210c；而两个中心核110a与210c则通过发生在耦合臂130a与230a间的iEDDA反应彼此连接，其中椭圆点156代表上述反应所形成的化学键。除了功能性组件240之外，第二中心核210c还连接了一条PEG链260。具体来说，第二中心核210c带有一AHA残基，其可通过SPAAC反应和带有高应力炔基的PEG链260反应并与其相连，其中菱形点182代表由SPAAC反应所形成的化学键。随着实际应用的情形，第三组件可以是第二靶向组件、第二效应组件或能够改善分子构建体药学特性的组件。根据本揭示的一实施方式，PEG链260的分子量约为20,000到50,000道耳顿。
基于以上的概念，一个接合单元可包含多条连接臂，而这些连接臂可和功能性组件连接。举例来说，接合单元可包含5-到12条连接臂，因此可以连接5到12个功能性组件。以小分子(如细胞毒性药物或类铎受体(toll-like receptor，TLR)促效剂)作为功能性组件时，上述特性的优势更为突出。下文将带有多个细胞毒性药物分子的接合单元称为载药束。
此外，可利用多肽中心核来制备包含三个接合单元的分子构建体。因此，本揭示的另一方面是关于包含三个接合单元的分子构建体。在所述的三个接合单元中，其中两个接合单元彼此通过iEDDA反应连接，而第三接合单元则可通过SPAAC反应或CuAAC反应连接到另两个接合单元其中任一单元。建构多接合单元(譬如三个接合单元)的主要考虑是可以结合两种不同的靶向组件或两种不同的效应组件。
接着参照图7，图中所示的分子构建体包含三个接合单元(500、600与700A)。接合单元500、600与700A各自有一个中心核(510、610、710)，而带有功能性组件(540、640、740)的连接臂(520、620、720)则分别与这些中心核相连。接合单元600的特征在于其N-或C-端的半胱氨酸残基和耦合臂630相接，而另一端则是带有叠氮基或炔基的氨基酸残基。在接合前，耦合臂530、630其中之一的自由端带有四嗪基，另一者的自由端则带有高应力炔基。因此，接合单元500、600可通过发生在耦合臂530与630间的iEDDA反应而彼此连接，其连接方式如图3A所示。关于接合单元700A的连接方式，当中心核610的N-或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基(譬如AHA残基)时，中心核710的N-或C-端是带有炔基的氨基酸残基(譬如HPG残基)；或者是，当中心核610的N-或C-端是带有炔基的氨基酸残基(譬如HPG残基)时，则中心核710的N-或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基(譬如AHA残基)。因此，接合单元600、700A可通过发生在中心核610与710的N-或C-端氨基酸残基间的CuAAC反应直接彼此连接，而不需通过耦合臂，如图3B所示的连接方式。图7A所示的椭圆点560与实心圆点670分别代表因iEDDA反应与CuAAC反应所形成的化学键。
或者是，三个接合单元中的两个接合单元可透过iEDDA反应彼此连接，而第三接合单元则是通过SPAAC反应连接到另两个单元其中一单元。以图7B为例，接合单元500、600是通过iEDDA反应而彼此连接，其连接方式类似图7A所示；而接合单元700B则是通过中心核610与耦合臂730间的SPAAC反应而连接到接合单元600。图7B所示的菱形点672代表因SPAAC反应而产生的化学键。
当可理解，随着所欲的应用不同，连接到接合单元500、600与700A或700B上的功能性组件540、640、740的数目也可以随之改变。利用图4提出的库的概念，可将带有不同数目和/或类型的功能性组件的接合单元分别制备成不同的库，而本发明所属技术领域的普通技术人员就可以根据不同的需求，从多个库中选择适当的两个或多个接合单元并将其结合。
基本上，可将上述方面和/或实施方式中所讨论的分子构建体的“一端带有叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基的耦合臂”设计成一条有2至12个EG重复单元的PEG链；而所述的连接臂则是有2至20个EG重复单元的PEG链。
使用多肽作为中心核使得本发明分子构建体具有更大的设计弹性，因为可在单一构建体中携带多份或多种靶向/效应组件；因此能够提升药物递送的特异性以及其在预定靶位的功效。可利用包含多个接合单元的分子构建体而得到多种不同的构形。举例来说：第一接合单元可携带三个scFv靶向组件，而第二接合单元可携带五个细胞毒性药物；第一接合单元可携带三个scFv靶向组件，而第二接合单元可携带三个scFv效应组件；第一接合单元可携带两个scFv以作为第一组靶向组件、第二接合单元可携带两个scFv以作为第二组靶向组件，而第三接合单元可携带五个细胞毒性药物；第一接合单元可携带两个双特异性scFv靶向组件，而第二接合单元可携带两个scFv效应组件；或第一接合单元可携带三个scFv靶向组件、第二接合单元可携带两个scFv效应组件以及通过连接臂而连接的用以提升其药动学特性的分子量为20,000-50,000道耳顿的长PEG。
在本发明的某些实施方式中，可利用双官能团PEG作为连接臂，以将作为靶向或效应组件的抗体的抗原结合片段连接到位于多肽核中的氨基。每一条PEG的一端可带有NHS基，另一端则带有顺丁烯二酰亚胺基。NHS基可和多肽核中的氨基耦接，而顺丁烯二酰亚胺基则可和抗体的scFv、双特异性scFv或Fab片段的半胱氨酸残基的硫氢基耦接。可设计scFv与双特异性scFv使其C-端带有一末端为半胱氨酸残基的多肽接合物。可利用胃蛋白酶(pepsin)裂解完整IgG以得到Fab片段，且可利用温和的还原反应将链间的双硫键反应产生自由硫氢基。
反应式8-12提供了多种耦接与制备所述接合单元的实施例。
反应式8是描绘了根据本揭示一实施方式来制备分子构建体的示意图，其中NHS代表NHS酯、Mal代表顺丁烯二酰亚胺基、AAH代表L-叠氮高丙氨酸(AHA)残基，GHP代表高炔丙基甘氨酸(HPG)残基、Ac代表乙酰基且scFv代表单链可变片段。
在步骤1，分别制备第一中心核与第二中心核，其中第一中心核包含(GSK)3序列且其C-端为AHA残基；而第二中心核序列为(GSK)5且其C-端为HPG。为了使多肽更为稳定，利用乙酰基来修饰第一与第二中心核的N-端。在步骤2，通过形成酰胺键，将每一连接臂分别连接到第一与第二中心核中的赖氨酸残基；连接于中心核的连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基。在步骤3，通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应，将带有硫氢基(如，半胱氨酸残基)的第一靶向组件(即，对纤维素特异的scFv)连接到与第一中心核连接的连接臂；相似地，通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应，将带有硫氢基的效应组件(即，药物，如第Xa型凝血因子抑制剂或凝血酶抑制剂)连接到和第二中心核相连的连接臂。在步骤4，通过发生在AHA与HPG残基间的CuAAC反应，将两个接合单元耦接在一起。
<<反应式8通过C-端氨基酸残基来耦接接合单元>>
Figure GDA0003577147960000641
可视需要而利用不同方法将靶向/效应组件连接到中心核上。如反应式9所示，先将连接臂连接到中心核，之后再通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将效应组件(即，药物)连接到连接臂上，从而实现效应组件与多肽核的耦接。
<<反应式9通过连接臂将效应组件与多肽核耦接>>
Figure GDA0003577147960000651
反应式10则是另一种替代方式，先将效应组件(即，药物)和连接臂相接，以得到连接臂-效应组件缀合物(即，PEG-药物)；接着，通过形成于赖氨酸残基与NHS酯之间的酰胺键，将连接臂-效应组件缀合物连接到中心核。
<<反应式10先将效应组件和PEG链接合后再连接到多肽核中赖氨酸残基的氨基>>
Figure GDA0003577147960000652
或者是，联合接合物构形的连接臂也可以用来连接双特异性scFv，其可作为靶向组件或效应组件。这些构形可提升靶向组件的特异性和/或效应器机制的效力。
反应式11是制备本发明分子构建体的一种实施例，此分子构建体包含两个接合单元；每一个接合单元的序列包含(K-Xaa4)3，且其C-端为半胱氨酸(C)残基。
<<反应式11通过耦合臂间的iEDDA反应来制备分子构建体>>
Figure GDA0003577147960000661
在步骤1，将两条耦合臂分别连接到这两个接合单元末端的C残基，其中一条耦合臂一端带有顺丁烯二酰亚胺(Mal)基且另一端带有四嗪基，而另一条耦合臂的两端分别带有Mal基和TCO基。在步骤2，通过在连接臂与K残基间形成酰胺键，将连接臂分别连接到赖氨酸(K)残基。之后，在步骤3，通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应，将三个抗-纤维素scFv(scFvα纤维素)与三个tPA类似物分别连接到这两个接合单元的连接臂。最后，在步骤4，通过发生在四嗪基与TCO基间的iEDDA反应，将两个接合单元彼此耦接。
当靶向与效应组件都是scFv，且使用600道耳顿(12个EG单元)的PEG链作为连接臂时，带有六个scFv的分子构建体的总分子量约为170,000道耳顿。带有七个scFv的分子构建体的分子量约为200,000道耳顿，而带有八个scFv的分子构建体的分子量为230,000道耳顿。根据本揭示所制备的大多数分子构建体的分子量小于200,000道耳顿，有一小部分的分子构建体的分子量介于200,000-250,000道耳顿之间。
当想要建构带有四组不同的scFv的分子构建体时，较佳可使一个接合单元带有接合的单链双特异性scFv(bi-scFv)，譬如scFv1-scFv2，而另外两个接合单元则分别带有一种scFv(即，分别带有scFv3与scFv4)。有两种方法能够建构上述双特异性的scFv1-scFv2。在“串联(tandem)”构形中，抗体片段的排列方式为VL1-VH1-VL2-VH2或VH1-VL1-VH2-VL2；在“双抗体(diabody)”构形中，抗体片段则是排列成VL2-VL1-VH1-VH2或VH2-VH1-VL1-VL2。可在免疫球蛋白区域间加入合适的多肽接合物，如GGGGS(序列编号6)重复或其它序列。
由发明人的经验推知，在经过长时间储存后，带有顺丁烯二酰亚胺与叠氮基的多肽或PEG接合物可能会因为顺丁烯二酰亚胺与叠氮基间自发的接合反应而形成聚合物。因此，在较佳的情形中，最好分别制备新鲜的各种接合单元，接着再实时将靶向或效应组件连接到所述接合单元上，并通过点击反应将这些接合单元连接到一起。另一种较佳的实施方式是将靶向组件和效应组件都接合到带有炔基的接合单元上，而后再将其中一种接合单元的炔基转变为叠氮基，譬如可利用一条两端都带有叠氮基的短同型双官能团接合物。之后就可将分别带有炔基与叠氮基的两种接合单元透过点击反应而耦接。
适用于本发明的连接臂较佳为PEG链。出于几方面的考虑，连接臂的长度很重要。连接臂的长度应足以对所连接的scFv或其它类型的功能性组件提供适当的弹性，使其能够在不受到立体结构限制的情形下，接近目标细胞表面上的靶点抗原位置；但连接臂的长度又不应过长，以免造成连接臂和其上连接的scFv片段或功能性组件发生分子间与分子内缠结，或使得分子构建体的分子量过大而无法轻易穿透组织。过长的连接臂可能无法拉动抗原分子以形成较密实的团簇，但在某些细胞凋亡或其它细胞层次的效应中可能会需要此种团簇以启动讯息传导过程。本发明所属技术领域的普通技术人员可在不需过度实验的前提下，针对靶点抗原和其结合剂的不同组合类型，决定理想的连接臂长度。在根据本揭示的多种分子构建体中，较佳的连接臂是NHS-(PEG)12-顺丁烯二酰亚胺(约500道耳顿)。完全伸展后的(PEG)12链长度约为
Figure GDA0003577147960000681
适用于本发明的连接臂与耦合臂不限于PEG链。举例来说，可使用包含甘氨酸、丝氨酸以及其它亲水性氨基酸残基的多肽、多糖与其它生物可兼容的线性聚合物，这些高分子经修饰带有NHS基与顺丁烯二酰亚胺基。
在某些治疗应用中，可能需要将分子构建体的效应组件从连接臂释放出来，而使得效应组件能够进入靶位的细胞(包括与靶向组件结合的细胞或其周围的细胞)，以引发药学效应。在这些情形中，可在连接臂中加入可裂解键。目前已开发出多种可裂解键，这些可裂解键会因为水解、酸解、还原裂解或酶裂解等作用而被切开。举例来说，在发炎组织中会出现基质金属蛋白酶，已设计出会受此种酶作用而裂解的多肽片段，并将其用于建构治疗用构建体。本发明的一实施方式中使用的PEG接合物为NHS-PEG2-12-S-S-顺丁烯二酰亚胺，在邻近顺丁烯二酰亚胺基处设有会被缓慢还原而裂解的S-S双硫键。
根据本揭示某些实施方式，上文实施方式中所述的靶向组件可选自以下物质所组成的群组：生长因子、肽类激素、细胞因子与抗体片段；而效应组件可以是免疫调节剂、与放射性核种复合的螯合剂、细胞毒性药物、细胞因子、可溶性受体或抗体。
在一些实施方式中，所述抗体可采用以下任一种形式：抗原结合片段(Fab)、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、单一区域抗体(sdAb)或双特异性单链可变片段(bi-scFv)。根据一实施方式，bi-scFv是双特异性串联scFv或双特异性双抗体scFv。
为了保持分子构建体的扩散能力，其分子量以小于250,000道耳顿为宜。因此，在大多数的实施方式中较佳应采用scFv片段。在DNA层级，可建构基因序列以将VL与VH连接成单一多肽，其顺序为VL-VH或VH-VL，且两者间以一多肽接合物连接，所述多肽连接物以甘氨酸与丝氨酸为主要残基，且其长度为10-25个氨基酸残基。此外，在上述多肽接合物的C-端加入一段短的延伸物，其包括甘氨酸与丝氨酸，且末端为半胱氨酸。可用以生产上述重组scFv与双特异性scFv的宿主细胞包括：细菌，如大肠杆菌与恋臭假单胞菌(Pseudomonasputida)；酵母菌，如毕氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)；与哺乳动物细胞，如CHO与HEK293细胞系。
本案发明人已利用HEK293与CHO细胞系产制出大量的IgG抗体、Fab、scFv与各种抗体片段、Fc构型蛋白与其它重组抗体，以供活体外系统与动物模型试验用。本案发明人亦已开发出多种细胞系，以产制用于人类临床试验的抗体。在实验室研究阶段，只要使用几个1-2公升的烧瓶，即可轻易地制备HEK293暂时表达系统，进而生产1克左右的IgG或抗体片段。一般来说，适用于本发明所述分子构建体的scFv片段通常不带有糖类修饰，而且糖类修饰也不是scFv与其抗原靶点结合所必须的。更有甚者，所述的scFv片段中只有一个双硫键以及一个位在末端的半胱氨酸残基。因此，也可利用小规模的细菌表达系统来制备scFv。使用大肠杆菌时，可选用能从细胞内包涵体(intracellular inclusion bodies)或细胞周质(periplasm)中收取scFv或可收取分泌性scFv的表达系统。在大多数的情形中，可利用蛋白L(Protein L)以亲和柱法来纯化scFv，上述蛋白L可和大多数κ轻链的VH相互作用；而在其它情形中则可使用离子交换柱。
根据本发明多个实施例，所述的联合接合物平台主要运用scFv与Fab作为靶向和/或效应组件。然而，亦可从基于sdAb或其它抗体片段的大型抗体库中筛选出特定的结合分子。有些结合分子并不是以免疫球蛋白区域为基础，但其针对所选的靶点分子有特异结合亲和力，因而有和抗体类似的功能，这些结合分子包括以下类型：(1)适配体(aptamer)，包含可和目标分子结合的寡核苷酸或短肽；(2)Fyn激酶衍生物(fynomer)，包含衍生自人类Fyn激酶SH3区域的小的结合蛋白；(3)黏合素(affimer)，包含衍生自胱抑素(cystatin)的半胱氨酸蛋白抑制剂家族的结合蛋白；以及(4)经设计的锚蛋白重复蛋白(designedankyrin repeat protein，DARPin)，此类蛋白是利用遗传工程设计，设计出包含三、四或五个由天然锚蛋白衍生的结构的重复区段。上述这些抗体拟似物的分子量约约为10K至20K道耳顿。
(ii)适用于联合接合物分子构建体的功能性组件
如上文所述，本发明提出的联合接合物包含至少两个接合单元，其第一接合单元带有一个或多个靶向组件，而第二接合单元带有一个或多个效应组件或促进药动学特性的组件，反之亦然。下文举例说明可用以治疗某些特定疾病之联合接合物分子构建体的所含的功能性组件。
在建构用以治疗与血栓相关的疾病/症状的联合接合物分子构建体时，可使用对纤维素特异的scFv作为靶向组件。在以预防血栓形成为主要目的之应用中，所述联合接合物分子构建体可使用第Xa型凝血因子抑制剂或凝血酶抑制剂作为效应组件。例示性的第Xa型凝血因子抑制剂包括阿哌沙班、伊度沙班与利伐沙班。非限制性的凝血酶抑制剂的实施例包括阿加曲班与美拉加群。用以治疗血管栓塞的联合接合物分子构建体则可以使用组织性纤溶酶原激活剂作为效应组件，譬如阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶与拉诺普酶。
(iii)联合接合物分子构建体的用途
本揭示亦关于使用适当的联合接合物分子构建体来预防血栓形成与治疗血管栓塞的方法。一般来说，所述方法包含以下步骤：对需要治疗的个体投予有效量的根据本揭示实施方式的联合接合物分子构建体。
第三节 用以预防血栓形成与治疗血管栓塞的Fc型分子构建体及其用途
以广义的Fc构形来看，可利用免疫球蛋白抗体作为一靶向或效应组件的基础，并将与其搭配的效应或靶向组件以scFv区域的形式引入其两条γ重链的C-端。以传统的“Fc”构形来看，可利用双链IgG.Fc作为分子平台的基础。每一多肽链可和一或两个靶向组件以及一个或两个效应组件融合，使得每一链共带有两个至三个组件。具有Fc构形的T-E分子总计可带有四至六个组件(譬如scFv、生长因子或细胞因子)。在可任选的实施方式中，所述分子构建体的Fc部分亦带有Fc介导的效应功能，ADCC，和/或补体介导的活化作用。然而在某些其它应用中，不会出现此种Fc介导的效应功能。
藉由挑选本案Fc型分子构建体的T-E组件，所得到的分子构建体可用于预防和/或治疗与血液凝集相关的疾病，包括血栓形成与血管栓塞。在某些实施方式中，本揭示的优点还包括使用了本揭示提出的接合单元，因而提供了一种能够用于控制本发明的基于Fc的分子构建体的细胞毒性药物有效载荷的量的简便方法。随着所选用的靶向和/或效应组件不同，本Fc型分子构建体可采用不同的构形，兹分述如下。
在第一类的Fc型分子构建体中，靶向组件是抗体或其片段，而效应组件则为一肽。
图8A绘示了根据本揭示某些实施方式的Fc型分子构建体1200A包含连接于成对CH2-CH3链1210之N-端的一对靶向组件T1(此组件为一scFv)，以及连接于成对CH2-CH3链1210之C-端的一对效应组件E1(此组件为治疗性肽)。或者是，在图8B的Fc型分子构建体1200B中，成对的靶向组件T1(此组件为一scFv)系连接于CH2-CH3链1210之C-端；而成对的效应组件E1(此组件为治疗性肽)则是连接于成对CH2-CH3链1210之N-端。
在某些实施方式中，CH2-CH3链是来自人类免疫球蛋白γ1或γ4。一般来说，当想要发挥Fc介导的功能(如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体介导活性(发炎活化或目标细胞溶解))时，可以选择γ1。当想要避免Fc介导的功能时，可以选用γ4来建构本发明Fc型分子构建体。
在某些实施方式中，成对的靶向组件采用Fab构形(即，由VH-CH1区域与VL-Cκ区域组成)；此种Fab片段系连接于CH2-CH3链的N-端，而使得Fc型分子构建体成为IgG构形。在这些情形中，成对的效应组件可连接于成对CH2-CH3区段的C-端
举例来说，在图8C所示的Fc型分子构建体1200C中，两个靶向组件T1中的每个包含VH-CH1区域820与VL-Cκ区域825，因而形成连接于CH2-CH3链810的N-端的Fab构形830，而使得Fc型分子构建体1200C成为IgG构形。在本例中，成对的效应组件E1连接于成对CH2-CH3链810的C-端。
在第二类的Fc型分子构建体中，靶向组件是抗体或其片段，而效应组件则为载药束。
在此类情形中，用以治疗患病细胞的Fc型分子构建体的构形如图9A的分子构建体1000A或图9B的分子构建体1000B所示。在图9A中，效应组件E1(如载药束)系连接于成对CH2-CH3区段1010的C-端，而靶向组件T1(于本例中，scFv)则是连接到成对CH2-CH3区段1010的N-端。根据替代性的实施方式，分子构建体1000B(参见图9B)的成对靶向组件T1采用Fab 1030的构形。具体来说，Fab 1030构形包括VH-CH1区域1020以及VL-Cκ区域1025，其系连接至成对CH2-CH3区段1010的N-端，而使得Fc-型分子构建体1000A成为IgG构形。在本例中，成对的效应组件E1连接至成对CH2-CH3区段1010的C-端。
在某些实施方式中，CH2-CH3链是来自人类免疫球蛋白γ1或γ4。一般来说，当想要发挥Fc介导的功能(如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体介导活性(发炎活化或目标细胞溶解))时，可以选择γ1。当想要避免Fc介导的功能时，可以选用γ4来建构本发明Fc型分子构建体。
当可想见，效应组件E1(即载药束)时能够作为本揭示所述的接合单元(参见，如第1A至第1C)而提供。根据本揭示的原理与精神，可分别制备靶向构建体(包含成对CH2-CH3区段1010以及靶向组件T1)与载药束(作为效应组件E1)，之后再将两者缀合。
根据本揭示多个实施方式，上述载药束包含一中心核、多个连接臂以及视需要而加入的耦合臂。根据本揭示多种实施方式，中心核可以是具有多个氨基的化合物或包含多个赖氨酸(K)残基的多肽。每一连接臂的一端藉由和化合物核的氨基或多肽核的K残基的氨基侧链反应，而与中心核连接。连接臂在其自由端带有顺丁烯二酰亚胺基，而每一药物分子则藉由和顺丁烯二酰亚胺基反应以通过连接臂而与中心核连接。在视需要而采用的实施方式中，每一效应组件E1是带有3至5个细胞毒性分子的载药束。
在中心核是多肽核的情形中，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基或带有叠氮基或炔基。根据某些实施方式，当多肽中心核的末端氨基酸残基带有叠氮基时，载药束可以通过发生于上述末端残基与肽延伸段C-端之间的SPAAC或CuAAC反应而与其连接。或者是，当多肽中心核的末端氨基酸残基带有炔基时，载药束可以通过发生于上述末端残基与肽延伸段C-端之间的CuAAC反应而与其连接。又或者是，当多肽中心核的末端残基是半胱氨酸或中心核是化合物核时，载药束还包含上述耦合臂。耦合臂的一端藉由和多肽核的半胱氨酸残基反应或和化合物核的一氨基反应，而与中心核连接。耦合臂的自由端亦带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基，而使得载药束可通过iEDDA反应(耦合臂带有四嗪基或环辛烯基时)、SPAAC反应(耦合臂带有叠氮基或环辛炔基时)、或CuAAC反应(耦合臂带有炔基或叠氮基时)而连接到肽延伸段的C-端。
根据某些实施方式，所述用以治疗疾病的Fc-型分子构建体还包含一段肽延伸段1050(参见，图9A与9B)，其序列为(G2-4S)2-8C。如图所示，成对的肽延伸段1050连接到成对CH2-CH3区段1010的C-端。肽延伸段C-端的半胱氨酸残基通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而和耦合臂1055相连接。此外，在将其和效应组件E1(此处为一载药束)缀合之前，耦合臂的自由端(即，并未和半胱氨酸残基相连的一端)经过炔基、叠氮基、高应力炔基或四嗪基的修饰，而使得载药束可通过iEDDA反应(参见图9A)、SPAAC(参见图9B)或CuAAC反应(未绘示)而与其相连。
举例来说，在图9A中，效应组件E1(此处为一载药束)的耦合臂1040通过iEDDA反应而连接于CH2-CH3区段1010。图9A所示的椭圆点1045代表肽延伸段1050与效应组件E1间，因为iEDDA反应而产生的化学键。当可理解，iEDDA反应通常发生于四嗪基与环辛烯基(如反式-环辛烯(transcyclooctene，TCO)基)之间。
或者是，在图9B中，效应组件E1通过SPAAC反应而连接到CH2-CH3区段1010。图9B所示的菱形点1045代表肽延伸段1050与效应组件E1间，因为SPAAC反应而产生的化学键。具体来说，SPAAC反应通常发生在叠氮基与高应力炔基(如，环辛炔基，包括：二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化环辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二环壬炔(bicyclononyne，BCN)以及二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)基)之间。
在第三类的Fc型分子构建体中，靶向组件与效应组件其中一种是肽。
当可想见，上文关于Fc型分子构建体的Fc区域与载药束的叙述亦适用于此，此处为求简洁不再赘述。
(ii)适用于Fc型分子构建体的功能性组件
在讨论了本案Fc型分子构建体的基本结构之后，下文进一步说明某些由特定效应组件(们)与靶向组件(们)所形成的组合。
在建构用于预防和/或治疗与血栓相关的疾病/症状的Fc型分子构建体时，可使用对纤维素特异的抗体或其片段作为靶向组件。
在以预防血栓形成为主要目的之应用中，所述Fc型分子构建体可使用带有多个第Xa型凝血因子抑制剂或凝血酶抑制剂分子的载药束作为效应组件。例示性的第Xa型凝血因子抑制剂包括阿哌沙班、伊度沙班与利伐沙班。非限制性的凝血酶抑制剂的实施例包括阿加曲班与美拉加群。用以预防血栓形成的Fc型分子构建体可具备如图9A或图9B所示的构形。
用以治疗血管栓塞的Fc型分子构建体则可以使用组织性纤溶酶原激活剂作为效应组件，譬如阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶与拉诺普酶，此类效应组件为单链多肽。用以治疗血管栓塞的Fc型分子构建体可具备如图8A至8C所示的构形。
本发明的精髓在于采用特定靶向与效应组件的组合或搭配。在较佳的实施方式中，所述分子构建体采用了Fc融合构形。本发明所属技术领域的普通技术人员当可想见，亦可利用其它分子平台来连接此处提出的靶向与效应组件的组合；上述分子平台诸如肽、蛋白质(譬如白蛋白)、聚糖、聚乙二醇以及其它类型的聚合物，只要其能够作为连接多个分子组件的结构基础即可。
(iii)Fc型分子构建体的用途
本揭示亦涉及了利用适当Fc型分子构建体来多种疾病的方法。一般来说，上述方法涉及了对需要该治疗的个体投予治疗有效量的Fc型分子构建体，所述Fc型分子构建体可以是根据本揭示各实施方式所述的任一种Fc型分子构建体。
实验例
实验例1：合成作为肽核的肽1(序列编号18)，并将半胱氨酸残基的SH基和作为耦合臂的顺丁烯二酰亚胺-PEG4-四嗪缀合
将将合成肽1(Chinapeptide Inc.，上海，中国)溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0；含50mM NaCl与5mM EDTA)，使其最终浓度为2mM。利用1mM TCEP使溶解的肽还原，反应温度25℃、时间2小时。将肽和顺丁烯二酰亚胺-PEG4-四嗪(Conju-probe Inc.)以1/5的比例混合，并在pH 7、4℃的条件下反应24小时，以使半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG4-四嗪缀合而带有功能性连接基团四嗪。利用反相HPLC来纯化四嗪-肽缀合物；使用Supelco C18柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、柱温度25℃。
所述合成四嗪-肽1(如下所示)的分子量为2,185.2道耳顿。
Figure GDA0003577147960000761
实验例2：合成作为肽核的肽2(序列编号26)，并将半胱氨酸残基的SH基和作为耦合臂的顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO缀合
利用与上文相似的方法来处理合成肽2(Chinapeptide Inc.，上海，中国)。简言之，将肽溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0；含50mM NaCl与5mM EDTA)，最终浓度2mM。利用1mM三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)使溶解的肽还原，反应温度25℃、时间2小时。将肽和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO(Conju-probe Inc.)以1/7.5的摩尔比混合，并在pH 7.0、25℃的条件下反应18小时，以使半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO缀合而带有功能性连接基团TCO。利用反相HPLC来纯化TCO-肽缀合物；使用Supelco C18柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、柱温度25℃。
以MALDI-TOF质谱分析来确认所合成的TCO-肽(如下所示)。由台湾地区“中央研究院”分子生物研究所(中国台湾台北)的核心设施单位进行质谱分析。以Bruker AutoflexIII MALDI-TOF/TOF质谱分析仪(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)进行测量。
所合成的TCO-肽2(如下所示)的分子量为2,020.09道耳顿。
Figure GDA0003577147960000771
实验例3：将作为连接臂的NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和四嗪-肽1的氨基缀合以合成接合单元
将三个PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂连接到肽核四嗪-肽1。交联物NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺(琥珀酰亚胺-[(N-顺丁烯二酰亚胺基-丙酰胺基)-十二乙二醇]酯(succinimidyl-[(N-maleimido-propionamido)-dodecaethyleneglycol]ester)系购自Conju-probe Inc。根据制造商的指示进行缀合。将带有赖氨酸残基的肽溶解于作为缀合缓冲液的磷酸盐缓冲液(PBS；pH 7.5)中，浓度100mM。在溶解的肽中加入NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺交联物，最终浓度1mM(其摩尔数为0.1mM肽溶液的10倍)。使反应混合物在室温下反应18小时。以反相HPLC纯化PEG12-顺丁烯二酰亚胺-四嗪-肽1缀合物；使用Supelco C18柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、柱温度25℃。
如下所示，所述合成PEG12-顺丁烯二酰亚胺-四嗪-肽1缀合物接有一条带有四嗪基的耦合臂以及三条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂，其分子量为4,461道耳顿。
Figure GDA0003577147960000781
实验例4：将作为连接臂的NHS-PEG6-顺丁烯二酰亚胺和TCO-肽2的氨基缀合以合成接合单元
利用上文实验例所述的方式，将NHS-PEG6-Mal和TCO-肽2的氨基缀合。简言之，将NHS-PEG6-顺丁烯二酰亚胺交联物加入溶解的肽中，最终浓度40mM(其摩尔数为2mM的肽溶液的20倍)。在室温下使反应混合物反应3小时。
此处合成的PEG6-顺丁烯二酰亚胺-肽2缀合物(如下所示)是一种基于肽核的接合单元，其上接有一个TCO基以及五条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂，其分子量为4,478道耳顿(图10)。
Figure GDA0003577147960000791
实验例5：将阿哌沙班羧酸分子与NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交联物缀合
阿哌沙班羧酸系购自KM3 Scientific Inc.(新北市，中国台湾)。使阿哌沙班羧酸分子上经活化的羧基和同型双官能团(homo-bifunctional)可剪切交联物NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2反应，参见反应式12。
将阿哌沙班羧酸溶于100％DMSO中，最终浓度20mM；而同型双官能团可剪切交联物NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2则溶于PBS中，最终浓度10mM。将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC；购自KM3Scientific Inc.)以1:2的摩尔比([阿哌沙班]:[EDC])加入阿哌沙班羧酸溶液中，并反应15分钟，以活化阿哌沙班羧酸的羧基。
将活化的阿哌沙班羧酸溶液加入NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交联物中，最终浓度2mM(其摩尔数为0.4mM的NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交联物溶液的5倍)。使反应混合物在室温下反应3小时。
<<反应式12两个阿哌沙班羧酸分子与NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交联物的缀合>>
Figure GDA0003577147960000801
以反相HPLC纯化阿哌沙班-PEG3-S-S-PEG3-阿哌沙班；使用Supelco C18柱(250mmX 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、柱温度25℃。
本实验例所合成的阿哌沙班-PEG3-S-S-PEG3-阿哌沙班的质谱分析结果(参见，图11)显示此分子构建体的分子量为1,301.64与1,323.68道耳顿，分别与[M+H]+与[M+Na]+相对应。
实验例6：将两个阿加曲班分子和NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交联物缀合
阿加曲班系购自KM3 Scientific Inc.(新北市，中国台湾)。利用上文实验例所述的方式，将NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2缀合至阿加曲班分子的COOH官能团。简言之，将阿加曲班溶于100％DMSO，最终浓度20mM。将EDC溶液加入至阿加曲班溶液并反应15分钟，以活化阿加曲班的COOH基。将经活化的阿加曲班溶液加入NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交联物溶液中，最终浓度2mM(其摩尔数是0.4mM的NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交联物溶液的5倍)。(参见反应式13)。
<<反应式13阿加曲班分子与NH2-PEG3-S-S-PEG3-NH2交联物的缀合>>
Figure GDA0003577147960000811
图12的MALDI-TOF结果显示，本实验例所合成的阿加曲班-PEG3-S-S-PEG3-阿加曲班分子量为1,378.61道耳顿。
实验例7：将阿哌沙班-PEG3-SH和阿加曲班-PEG3-SH缀合至顺丁烯二酰亚胺-PEG6-TCO-肽2缀合物
在和带有五条顺丁烯二酰亚胺-PEG6连接臂的TCO-肽2缀合之前，先将上文实验例所制备的阿哌沙班-PEG3-S-S-PEG3-阿哌沙班和阿加曲班-PEG3-S-S-PEG3-阿加曲班和4mMTCEP以3:1的摩尔比([TCEP]:[药物-交联物])在室温下轻微摇晃使其反应90分钟，以得到带有自由硫氢基的阿哌沙班-PEG3-SH与阿加曲班-PEG3-SH分子。
所合成的载药束(如下所示)是带有一自由TCO基以及一组五个阿哌沙班分子(作为效应组件)的接合单元。该分子构建体的分子量为7,713道耳顿，对应于[M+H]+。
Figure GDA0003577147960000821
此处合成的另一种载药束(如下所示)是带有一自由TCO基以及一组五个阿加曲班分子(作为效应组件)的接合单元。该分子构建体的分子量为8,112.8道耳顿，对 应 于[M+H]+。
Figure GDA0003577147960000822
实验例8：利用Expi293F过表达系统制备对人类纤维素特异单抗的小鼠scFv
对人类纤维素特异的scFv的VL与VH系来自小鼠单株抗体102-10(日本专利申请公开案第2012-72号)。衍生自上述抗体的scFv经过特殊设计而在C-端带有柔性接合物(GGGGSGGGGS)与末端的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基的硫氢基可和位于各接合单元连接臂自由端的顺丁烯二酰亚胺基合。于制备对人类纤维素特异的mAb的scFv时，使用所述102-10mAb的VL与VH的DNA序列并进行密码子优化(codon optimization)。合成编码VL-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH-(GGGGS)2-C的DNA序列。本发明实验例中所制备的102-10mAb的scFv之氨基酸序列如序列编号27所示。
于利用哺乳类动物表达系统来制备scFv蛋白时，使用以Expi293FTM细胞系为基础的过表达系统来制备。此系统使用ExpiFectamineTM 293转染套组(Life Technologies,Carlsbad,USA)，其包含Expi293FTM细胞系、阳离子脂质系ExpiFectamineTM 293试剂、ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与2、以及表达系统所用的培养基(Gibco,New York,USA)。
将编码scFv的序列置于pG1K表达盒中。将Expi293F细胞以每毫升2.0×106个活细胞的密度播于Expi293F表达培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染当日，将带有7.5×108个细胞的255毫升培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入ExpiFectamineTM 293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨振荡器(125rpm)培育16至18小时；之后在振荡烧瓶中加入ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育5到6天。收集培养上清液，并使用蛋白L亲和层析法纯化培养基中的scFv蛋白。图13A与13B分别是纯化对人类纤维素特异的mAb的scFv之SDS-PAGE与ELISA分析结果。对人类纤维素特异的mAb的scFv在SDS-PAGE中移动到26kDa与30kDa的两个主要电泳条。利用MALDI-TOF进一步分析同一个蛋白溶液，结果显示对人类纤维素特异的102-10scFv的分子量为26,838道耳顿，与计算所得的分子量相符。
实验例9：经纯化的对人类纤维素特异的小鼠scFv的ELISA分析
利用美国专利申请公开案US 2016/0011217 A1中所述的方法来制备涂覆纤维蛋白原的孔盘。简言之，将100μl的人类纤维蛋白原(Sigma)的PBS溶液以1μg/孔的量加入至96孔平底盘(Nunc)，密封平底盘并在4℃下放置一晚。
纤维素盘的制备方式如下。移除纤维蛋白原溶液，之后将100μL的TBS(含0.05U/ml凝血酶(Sigma)、2mM CaCl2与7mM L-半胱氨酸(Sigma))加入孔盘。将经凝血酶处理的孔盘在37℃下培育1小时，以使纤维素形成。接着移除凝血酶溶液，并以10％脱脂牛奶在室温下处理1小时以使反应中止。
接着，将100μl的102-10scFv溶液加入纤维蛋白原盘与纤维素盘，并在室温下摇晃1小时。其后，以TBS-T清洗每一孔盘，再加入50μl的TMB(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,USA)并进行比色分析。加入50μl的1N HCl以使反应中止。接着，利用盘式分析仪测量在450nm下的吸光值(O.D.)。
图13C的ELISA分析结果显示经纯化的102-10scFv可特异地和人类纤维素结合，但不会和纤维蛋白原结合。
实验例10：构建与选择对人类纤维素特异的噬菌体-呈现人类scFv
GH2 scFv库的框架序列(framework sequence)衍生自人类IgG抗体片段G6抗-VEGF Fab(蛋白库编码：2FJG)，并被克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E(GE Healthcare)的限制性位点SfiI与NotI间，上述噬菌粒载体带有氨苄青霉素(ampicillin)抗性基因、lacZ启动子、有助于将scFv片段分泌至培养上清液中的pelB引导序列(leader sequence)以及用于侦测的E-标签。基于寡核苷酸定点诱变(oligonucleotide-directed mutagenesis)技术将scFv模板的VH与VL域多样化；将每一可变区域中的三个CDR同时多样化。使用带有超过109个选殖株的scFv库在人类纤维素上进行筛选。
利用上文实验例所述的方法制备经凝血酶处理的纤维素盘(每孔1μg/100μl)。使用纤维素盘来淘选抗-纤维素抗体。简言之，在室温下以阻隔缓冲液处理经纤维素涂覆的孔盘，阻隔缓冲液是以5％脱脂牛奶溶于PBST(带有0.1％tween-20的磷酸盐缓冲液)，处理时间1小时。将阻隔缓冲液中的重组噬菌体稀释到8x1011菌落形成单元(colony-formingunit，CFU)/mL的浓度后，加入经涂覆纤维素的孔盘中，并温和摇晃1小时。接着以PBST剧烈地清洗孔盘十次，再以PBS冲洗六次，以移除未特异结合的噬菌体。利用0.1M HCl/甘氨酸缓冲液(pH 2.2)来洗提结合的噬菌体，并立刻以2M三碱(Tris-base)缓冲液(pH 9.0)中和被洗提的部分。利用大肠杆菌品系ER2738(OD600＝～0.6)在37℃下进行噬菌体感染，处理时间30分钟；利用氨苄青霉素处理30分钟，以移除未受感染的大肠杆菌。在氨苄青霉素处理后，加入带有康霉素抗性的辅助噬菌体M13KO7继续培育1小时。从大肠杆菌培养物中选择可被辅助噬菌体拯救的噬菌体，将其在带有康霉素的环境中于37℃下剧烈摇晃一晚，以扩增所选的噬菌体。在PEG/NaCl中使扩增的噬菌体析出，之后再重新悬浮于PBS中，以用于下一次的选择-扩增循环。重复上述选择-扩增循环，以在人类纤维素上连续进行三次淘选。
经噬菌体感染的ER2738菌落盘于系列稀释后，计算其数目与噬菌体效价，以得到每一淘选回合后每毫升的输出效价(output titer/ml)(CFU/ml)。经过三回合淘选后，噬菌体输出效价由2.5E+06CFU/孔提升了超过1千倍而达到4.3E+09CFU/孔。图14A显示每一回合的噬菌体输出/输入效价比。Y轴显示每一淘选回合的噬菌体输出/输入效价比。经过三回合的淘选后，阳性菌落的比例明显提升。相较于第一回合，第三回合的输出/输入效价比提高了500倍，而结合的菌落也逐渐成为库中的优势族群。
在一般的选择程序中，于涂覆人类纤维素的ELISA孔盘上进行三回合的抗原淘选后，约有80％与纤维素结合的噬菌体粒子在ELISA分析中可特异地与所涂覆的纤维素结合。
实验例11：对人类纤维素特异的噬菌体-呈现人类scFv的单菌落ELISA分析
大肠杆菌品系ER2738经在其噬菌粒内带有所选的scFv基因的单一菌落噬菌体感染后，在加入了2YT培养液(含16g/L胰化蛋白、10g/L酵母抽出物以及5g/L NaCl；pH 7.0)以及100μg/ml氨苄青霉素的深孔中培养到中对数期(mid-log phase)，期间在37℃下佐以摇晃。在培养液的OD600达到1.0时，加入IPTG，使其最终浓度为1μg/ml。在剧烈摇晃、37℃下将孔盘培育一晚；其后，以4,000g在4℃下将孔盘离心15分钟。
利用ELISA来进行可溶性scFv结合试验。简言之，将Maxisorp96-孔盘(Nunc)涂覆纤维素(每孔1μg/100μl PBS)或人类纤维蛋白原(作为阴性对照组)，在4℃下摇晃18小时。在以300μl的阻隔缓冲液处理1小时后，将100μl含可溶性scFv的上清液和100μl的阻隔缓冲液混合，而后将此混和物加入经涂覆的孔盘再处理1小时。将山羊抗-E-标签抗体(与HRP缀合，1：4000，型录编号AB19400，Abcam)加入孔盘处理1小时。将TMB基质(每孔50μl)加入孔盘，并于加入1N HCl(每孔50μl)使反应停止后，测量在450nm下的吸光值。
在经过三轮淘选后，共选出960株噬菌体进行本实验例的分析。其中有6株scFv和纤维素结合后的OD450差异大于10(相较于人类纤维蛋白原)，进一步对编码这6株scFv的基因进行DNA测序，并识别出4种不同的DNA序列。图14B是scFv株D10的ELISA分析结果。scFv株D10和人类纤维素结合的OD450为1.09，其氨基酸序列如序列编号29所示。
实验例12：利用Expi293F过表达系统制备重组瑞替普酶
瑞替普酶的氨基酸序列来自DrugBank。本案所用的重组蛋白经过特殊设计而在C-端带有柔性接合物(GGGGSGGGGS)与末端的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基的硫氢基可和位于各接合单元连接臂自由端的顺丁烯二酰亚胺基缀合。本发明实验例中所制备的瑞替普酶之氨基酸序列如序列编号28所示。
于本实验例中，将编码瑞替普酶的序列置于pcDNA3表达盒中。于利用哺乳类动物表达系统来制备瑞替普酶蛋白时，使用以Expi293FTM细胞系为基础的过表达系统并根据上文实验例所述的方法来制备。
图15A与15B分别是经纯化的瑞替普酶的SDS-PAGE与ELISA分析结果。重组瑞替普酶在SDS-PAGE中移动到43kDa与48kDa的两个主要电泳条。利用MALDI-TOF进一步分析同一个蛋白溶液，结果显示重组瑞替普酶的分子量为43,415道耳顿，与计算所得的分子量相符。
实验例13：制备TCO-瑞替普酶缀合物
将瑞替普酶和5mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)在室温下以温和摇晃培育4小时，以使位于经纯化的瑞替普酶的C-端的半胱氨酸残基还原来与Mal-PEG3-TCO(Conju-probe,Inc.)缀合。利用NAP-10Sephadex G-25柱，将经还原蛋白的缓冲液置换为磷酸钠缓冲液(100mM磷酸钠(pH7.0)、50mM NaCl与5mM EDTA)。在还原反应与缓冲液交换后，使摩尔比10：1([Mal-PEG3-TCO]：[蛋白])的反应物于室温下反应一晚以进行缀合。利用去盐柱移除过量的交联物，并分析TCO-蛋白缀合产物。
MALDI-TOF质谱分析结果指出TCO-瑞替普酶缀合物的分子量为45,055道耳顿。用10％SDS-PAGE以考玛斯蓝(Coomassie blue)染色来分析TCO-瑞替普酶缀合物的纯度。图16是TCO-瑞替普酶缀合物的质谱分析结果。
实验例14：将三个对人类纤维素特异的scFv与带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的四嗪-肽1缀合
如上文实验例所示，合成序列编号27编码的DNA序列并使其表达。将对人类纤维素特异的102-10mAb的纯化scFv和5mM DTT在室温下以温和摇晃培育4小时，以使位于C-端的半胱氨酸残基还原，以利之后与带有三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂的四嗪-肽1缀合。接着，利用NAP-10Sephadex G-25柱(GE Healthcare)，将经还原的102-10scFv缓冲液置换为顺丁烯二酰亚胺-SH耦合反应缓冲液(100mM磷酸钠(pH7.0)、50mM NaCl与5mM EDTA)。在还原反应与缓冲液交换后，使摩尔比1：4([接合物]：[蛋白])的反应物于4℃下反应一晚，以使其与带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的四嗪-肽1核缀合。
对反应混合物采用排阻色谱柱S75。使得与三个对人类纤维素特异的102-10scFv缀合的PEG12-顺丁烯二酰亚胺-四嗪-肽1缀合物和游离的scFv、游离的PEG12-顺丁烯二酰亚胺-四嗪-多1缀合物以及与一个或两个对人类纤维素特异的102-10scFv缀合的PEG12-顺丁烯二酰亚胺-四嗪-肽1缀合物互相分离。利用10％SDS-PAGE来纯化产物，即，带有一个自由四嗪官能团且和与一组三个对人类纤维素特异的102-10scFv缀合的PEG12-顺丁烯二酰亚胺-四嗪-肽1缀合物，结果如图17所示。
实验例15：靶向接合单元的MALDI-TOF分析；此靶向接合单元带有连接于四嗪-肽1核的三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂上的三个对人类纤维素特异的scFv
所用的靶向接合单元基于四嗪-肽1核心，其上接有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂，并有三个对人类纤维素特异的102-10scFv连接于上述连接臂；对此靶向接合单元样本进行MALDI-TOF分析。实验所得的中位数分子量和三个对人类纤维素特异的102-10scFv与带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的四嗪-肽1核的耦合产物的理论中位数分子量相符。根据图18所示的质谱分析结果，该靶向接合单元的中位数分子量为84,974道耳顿。
如下图所示，此处合成的靶向接合单元带有一个自由四嗪官能团和作为靶向组件的一组三个对人类纤维素特异的102-10scFv。
Figure GDA0003577147960000891
实验例16：制备分子构建体；此分子构建体带有作为靶向组件的三个对人类纤维素特异的scFv以及作为效应组件的一个瑞替普酶分子
于本实验例中，使上述实验例所制得之靶向接合单元的四嗪基和TCO-瑞替普酶蛋白缀合物的TCO基进行iEDDA反应，而将两者接合。具体来说，所述靶向接合单元带有三个对人类纤维素特异的102-10scFv以及一个自由四嗪基。
根据制造商(Jena Bioscience GmbH,Jena,Germany)的说明进行四嗪-TCO接合。简言之，将100μl的靶向接合单元(0.3mg/ml)加入含有效应组件的溶液中，两者的摩尔比为1：1.2([四嗪]：[TCO])。在室温下将反应混合物培育1小时。
该产物(如下所示)是一种联合接合单元分子构建体，其具有作为靶向组件的三个对人类纤维素特异的102-10scFv以及作为效应组件的一个瑞替普酶分子。以8％SDS-PAGE来分析反应混合物；可观察到大小约180kDa的电泳条。
Figure GDA0003577147960000892
实验例17：制备分子构建体；此分子构建体带有作为靶向组件的三个对人类纤维素特异的scFv以及作为效应组件的五个阿哌沙班或阿加曲班分子
本实验例建构了一种联合接合物分子构建体，其包括三个对人类纤维素特异的102-10scFv以及含有五个阿哌沙班分子的载药束。所述分子构建体是利用上文实验例所述的TCO-四嗪iEDDA反应而制得。简言之，将100μl的靶向接合单元(0.3mg/ml)加入含有效应组件的溶液中，两者摩尔比为1:1.2([四嗪]:[TCO])。使反应混合物在室温下反应1小时。
所得到的联合接合物分子构建体(如下所示)带有作为靶向组件的三个对人类纤维素特异的102-10scFv以及作为效应组件的含有五个阿哌沙班分子的载药束。以10％SDS-PAGE来分析反应混合物；可观察到大小约160kDa的电泳条。
Figure GDA0003577147960000901
下文所示的联合接合物分子构建体带有三个对人类纤维素特异的102-10scFv(作为靶向组件)以及含有五个阿加曲班分子的载药束(作为效应组件)。以10％SDS-PAGE来分析反应混合物；可观察到大小约165kDa的电泳条。
Figure GDA0003577147960000902
实验例18：阿哌沙班-PEG3-SH分子的抑制活性分析
第Xa型凝血因子催化不具活性的前凝血酶转换为具活性的凝血酶。阿哌沙班是一种第Xa型凝血因子抑制剂，其可间接地减少由凝血酶所导致的血栓形成。上文实验例揭示了经修饰阿哌沙班分子(阿哌沙班-PEG3-SH)的合成方式。进行第Xa型凝血因子抑制分析(BioVision,Milpitas,USA)，以评价经修饰阿哌沙班分子(阿哌沙班-PEG3-SH)的抑制活性。第Xa型凝血因子抑制分析运用第Xa型凝血因子能够剪切合成受质的能力，使其释放出荧光团，进而可用荧光仪侦测此荧光团。当存在第Xa型凝血因子抑制剂时，由第Xa型凝血因子催化的活性会降低或完全抑制。
在本实验例中，将50μl的第Xa型凝血因子酶溶液(制造商提供)加入96孔平底盘(Nunc)中，将10μl的1μM阿哌沙班-PEG3-SH和阿哌沙班羧酸加入含有第Xa型凝血因子酶溶液的盘中，并在室温下培育15分钟。接着，将40μl的第Xa型凝血因子受质溶液(制造商提供)加入盘中，并在37℃中培育30分钟。通过使用盘式荧光测量仪在350nmm激发下测量荧光团450nm的发射来测定荧光团的相对荧光强度(relative fluorescence units，RFU)。
图19是阿哌沙班-PEG3-SH抑制活性的分析结果。在加入合成受质时，不加入第Xa型凝血因子抑制剂而直接测量第Xa型凝血因子的活性(仅有受质)。结果显示，和连接臂缀合的阿哌沙班分子对于抑制第Xa型凝血因子的生物活性和未经修饰的阿哌沙班羧酸相近。使用第Xa型凝血因子抑制剂(二盐酸GGACK盐，制造商提供)作为对照抑制剂。
实验例19：重组瑞替普酶的生物活性分析
瑞替普酶是一种重组人类组织型纤溶酶原激活剂，负责催化纤溶酶原转换为纤维蛋白溶酶的反应；该反应是血栓分解反应的一部分。为了了解重组瑞替普酶的生物活性，利用96孔平底盘进行显色分析(chromogenic assay)。
简言之，将1μl的1μM重组瑞替普酶、25μl的10μM人类纤溶酶原(Cat.No.7549-1,Biovision)以及62.5μl的100mM Tris缓冲液(pH 8.5)加入孔盘中，并在37℃下培育30分钟。接着，将1μl的50mM显色受质D-缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸-对-硝基苯胺二盐酸盐(D-Val-Leu-Lys-p-Nitroanilide dihydrochloride；Cat.No.V7127,Sigma)加入孔盘中并在25℃下反应30分钟；上述显色受质是一种合成的纤维蛋白溶酶受质。之后将31.5μl的10％柠檬酸加入每一孔中，以终止反应。在重组瑞替普酶的催化下，可使纤溶酶原变为纤维蛋白溶酶，而纤维蛋白溶酶又可进一步剪切显色受质而释放出黄色的对-硝基苯胺，并可用盘式分析仪侦测其在405nm下的吸光度。
蛋白酶活性分析结果显示，重组瑞替普酶的OD405为1.8，而正对照组蛋白(即，可商业取得的tPA蛋白；Cat.No.T0831,Sigma)的OD405为1.5。
实验例20：建构编码含有瑞替普酶的双链IgG4.Fc融合蛋白的基因片段
将瑞替普酶通过柔性铰链区域融合到IgG4.Fc的CH2域N-端，以得到瑞替普酶-CH2-CH3(人类γ4)重组链。IgG4.Fc融合蛋白分子构建体中重组链的序列如序列编号30所示。
上述制备的双链(瑞替普酶)-hIgG4.Fc的分子构建体的构形如下图所示。
Figure GDA0003577147960000921
实验例21：含瑞替普酶的双链IgG4.Fc融合蛋白的表达与纯化
在本实验例中，将编码的基因序列置于pcDNA3表达盒中。将Expi293F细胞以每毫升2.0×106个活细胞的密度播于Expi293F表达培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有7.5×108个细胞的255毫升培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入ExpiFectamineTM 293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育7天。收集培养上清液，并使用蛋白A层析法纯化培养基中的重组双链(瑞替普酶)-hIgG4.Fc融合蛋白。将缓冲液置换为PBS，之后利用8％SDS-PAGE测定(瑞替普酶)-hIgG4.Fc蛋白的浓度并进行分析；参见图20。在约74kDa的位置观察到含Fc-融合分子构建体的主要电泳条，其大小与预期相符。
实验例22：构建编码含有瑞替普酶以及对人类纤维素特异的scFv的双链IgG4.Fc融合蛋白的基因片段
将瑞替普酶通过柔性铰链区域融合到IgG4.Fc的CH2域N-端，并通过柔性接合物((GGGGS)3)将对人类纤维素特异的102-10scFv连接到CH3域C-端，以得到瑞替普酶-CH2-CH3-scFv(人类γ4)重组链。
上述scFv的方向是VL-接合物-VH。scFv中的VL与VH是通过亲水性接合物GSTSGSGKPGSGEGSTKG而连接。IgG4.Fc融合蛋白分子构建体中重组链的序列如序列编号31所示。利用上文实验例所述的方法，在Expi293F细胞中表达所建构的基因并纯化所表达的融合蛋白。利用SDS-PAGE分析来定性所制备的新构建体。图21的8％SDA-PAGE结果显示新构建体的重组链大小约为100kDa，和预期大小相符。
上述制备的双链(瑞替普酶)-hIgG4.Fc-(scFvα纤维素)分子构建体的构形如下图所示。
Figure GDA0003577147960000941
实验例23：建构编码含有瑞替普酶以及对人类纤维素特异的scFv之融合蛋白的基因片段
通过柔性接合物(GGGGS)3将瑞替普酶融合到对人类纤维素特异的102-10scFv之N-端，以得到(瑞替普酶)-scFv重组链。
上述scFv的方向是VL-接合物-VH。scFv中的VL与VH是通过亲水性接合物GSTSGSGKPGSGEGSTKG而连接。重组融合蛋白分子构建体的序列如序列编号32所示。利用SDS-PAGE分析来定性所制备的新构建体。图22的8％SDA-PAGE结果显示新构建体的重组链大小约为72kDa，和预期大小相符。
上述制备的(瑞替普酶)-(scFvα纤维素)分子构建体的构形如下图所示。
Figure GDA0003577147960000942
实验例24：建构编码有含替奈普酶(TNK-tPA)的双链IgG4.Fc融合蛋白的基因片段
将TNK-tPA通过柔性铰链区域融合到IgG4.Fc的CH2域N-端，以得到(TNK-tPA)-CH2-CH3(人类γ4)重组链。IgG4.Fc融合蛋白分子构建体中重组链的序列如序列编号33所示。图23的8％SDA-PAGE结果显示新构建体的重组链大小约为98kDa，和预期大小相符。
上述制备的双链(TNK-tPA)-hIgG4.Fc分子构建体的构形如下图所示。
Figure GDA0003577147960000951
实验例25：建构编码含有TNK-tPA以及对人类纤维素特异的scFv之双链IgG4.Fc融合蛋白的基因片段
将TNK-tPA通过柔性铰链区域融合到IgG4.Fc的CH2域N-端，并通过柔性接合物(GGGGS)3将对人类纤维素特异的人类D10 scFv连接到CH3域C-端，以得到(TNK-tPA)-CH2-CH3-scFv(人类γ4)重组链。
上述scFv的方向是VL-接合物-VH。scFv中的VL与VH是通过亲水性接合物GSTSGSGKPGSGEGSTKG而连接。IgG4.Fc融合蛋白分子构建体中重组链的序列如序列编号34所示。
为了侦测表达量较低的重组双链(TNK-tPA)-hIgG4.Fc-(scFvα纤维素)，对利用胶体电泳分离的蛋白进行胶体内水解(In-gel digestion)，再对经胰蛋白酶水解的双链(TNK-tPA)-hIgG4.Fc-(scFvα纤维素)进行级联质谱分析，以便确认分子构建体。所有质谱分析是利用Bruker Autoflex III MALI TOF/TOF质谱仪(Bremen,Germany)进行，其配备有200Hz Smart Bean Laser，使用正离子模式且在反射模式中使用延迟撷取。利用FlexControl 3.4进行人工数据撷取，并以Flex-Analysis 3.4进行数据处理(皆来自BrukerDalton)。
在Mascot搜寻引擎中，利用蛋白质片段在蛋白质数据库内进行分子质量搜寻，以辨识所述肽；经比对，在MS/MS光谱中m/z值分别对应于1,617.8223与1,053.5074道耳顿的两个蛋白片段和两个TNK-tPA片段的氨基酸序列VYTAQNPSAQALGLGK与QYSQPQFR相符。经比对，在MS/MS光谱中m/z值对应于830.4496道耳顿的蛋白片段和人类IgG4.Fc区域的肽片段GLPSSIEK相符。经比对，在MS/MS光谱中m/z值分别对应于737.3866与620.3044道耳顿的两个蛋白片段和D10 scFv区域的两个肽片段的氨基酸序列NTAYLR与MNSLR相符。
上述制备的双链(TNK-tPA)-hIgG4.Fc-(scFvα纤维素)分子构建体的构形如下图所示。
Figure GDA0003577147960000961
实验例26：建构编码含有TNK-tPA以及对人类纤维素特异的scFv之融合蛋白的基因片段
通过柔性接合物(GGGGS)3将TNK-tPA融合到对人类纤维素特异的人类D10 scFv之N-端，以得到(TNK-tPA)-(scFvα纤维素)重组链。
上述scFv的方向是VL-接合物-VH。scFv中的VL与VH是通过亲水性接合物GSTSGSGKPGSGEGSTKG而连接。重组融合蛋白分子构建体的序列如序列编号35所示。为了侦测表达量较低的重组(TNK-tPA)-(scFvα纤维素)，对利用胶体电泳分离的蛋白进行胶体内水解(In-gel digestion)，再对经胰蛋白酶水解的(TNK-tPA)-(scFvα纤维素)进行级联质谱分析，以便确认分子构建体(参见上文实验例)。
上述制备的(TNK-tPA)-(scFvα纤维素)分子构建体的构形如下图所示。
Figure GDA0003577147960000971
实验例27：含瑞替普酶以及对人类纤维素特异scFv的融合蛋白的生物活性分析
瑞替普酶是一种重组人类组织型纤溶酶原激活剂，参与了血栓分解反应。为了了解含瑞替普酶以及对人类纤维素特异的102-10scFv的融合蛋白的生物活性，利用涂覆纤维素的孔盘来进行显色分析(反应式14)。
<<反应式14含瑞替普酶以及对人类纤维素特异scFv的融合蛋白之显色分析>>
Figure GDA0003577147960000981
简言之，于制备纤维蛋白原盘时，将100μl的人类纤维蛋白原(Sigma)的PBS溶液以10μg/孔的量加入至96孔平底盘(Nunc)，密封平底盘并在4℃下放置一晚。纤维素盘的制备方式如下。移除纤维蛋白原溶液，之后将100μL的TBS(含0.05U/ml凝血酶(Sigma)、2mMCaCl2与7mM L-半胱氨酸(Sigma))加入孔盘。将经凝血酶处理的孔盘在37℃下培育1小时，以使纤维素形成。接着移除凝血酶溶液，并以10％脱脂牛奶在室温下处理1小时以使反应中止。
接着，将100μl的样本溶液加入纤维蛋白原盘与纤维素盘，并在室温下摇晃1小时。其后，以PBST清洗每一孔盘两次，再以PBS清洗一次，以移除未特异结合的蛋白。将25μl的10μM人类纤溶酶原(Cat.No.7549-1,Biovision)加入纤维蛋白原与纤维素孔盘的每一孔中，并在37℃下培育30分钟。接着，将62.5μl的100mM Tris缓冲液(pH 8.5)、1μl的50mM显色受质D-缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸-对-硝基苯胺二盐酸盐(D-Val-Leu-Lys-p-Nitroanilidedihydrochloride；Cat.No.V7127,Sigma)加入孔盘中并在25℃下反应30分钟；上述显色受质是一种合成的纤维蛋白溶酶受质。之后将31.5μl的10％柠檬酸加入每一孔中，以终止反应。在含瑞替普酶蛋白的催化下，可使纤溶酶原变为纤维蛋白溶酶，而纤维蛋白溶酶又可进一步剪切显色受质而释放出黄色的对-硝基苯胺，并可用盘式分析仪侦测其在405nm下的吸光度。
图24的蛋白酶活性分析结果显示，重组双链(瑞替普酶)-hIgG4.Fc、双链(瑞替普酶)-hIgG4.Fc-(scFvα纤维素)以及(瑞替普酶)-(scFvα纤维素)的蛋白酶活性和正对照组蛋白(即，重组瑞替普酶以及可商业取得的tPA蛋白(Cat.No.T0831,Sigma))相近。以hIgG4.Fc与抗-纤维素102-10scFv作为负对照组。结合分析结果显示TPA和瑞替普酶皆可和纤维素结合。此外，瑞替普酶以及对纤维素特异的scFv的融合蛋白，特别是具有G4S连接物者，则展现了较佳的结合活性。
当可理解，上文实施方式的说明仅为例示，且本发明所属技术领域的普通技术人员可对其进行各种修饰。上文的说明、实验例与数据完整地说明了本发明例示性实施方式的结构与用途。虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中的普通技术人员，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明之保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。
Figure IDA0001606999140000011
Figure IDA0001606999140000021
Figure IDA0001606999140000031
Figure IDA0001606999140000041
Figure IDA0001606999140000051
Figure IDA0001606999140000061
Figure IDA0001606999140000071
Figure IDA0001606999140000081
Figure IDA0001606999140000091
Figure IDA0001606999140000101
Figure IDA0001606999140000111
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Figure IDA0001606999140000141
Figure IDA0001606999140000151
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Figure IDA0001606999140000171
Figure IDA0001606999140000181
Figure IDA0001606999140000191
Figure IDA0001606999140000201
Figure IDA0001606999140000211
Figure IDA0001606999140000221

Claims (17)

1.一种接合单元，包含：一中心核、多个连接臂、多个第一组件，以及一耦合臂，其中：
所述中心核的氨基酸序列是由序列编号18或26所组成；
多个所述连接臂分别连接于所述中心核的K残基，其中多个所述连接臂中的每一个连接臂为聚乙二醇(PEG)链，其具有6或12个EG重复单元；
多个所述第一组件是通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而连接于多个所述连接臂，其中多个所述第一组件中的每一个第一组件为对纤维素特异的单链可变片段(scFv)；以及
所述耦合臂是与位于所述中心核N端的半胱氨酸残基的硫氢基连接，其中所述耦合臂为一具有3或4个EG重复单元的PEG链，且所述耦合臂的自由端有四嗪基或环辛烯基。
2.如权利要求1所述的接合单元，其中所述环辛烯基为反式-环辛烯(TCO)；且所述环辛炔基为二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、二环壬炔(BCN)或二苯并环辛炔(DICO)。
3.如权利要求1所述的接合单元，其中所述四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪基、或6-甲基四嗪基。
4.如权利要求1所述的接合单元，还包含一第二组件，其通过发生于所述环辛烯基或四嗪基与所述第二组件间的iEDDA反应而连接于所述中心核，其中所述第二组件是瑞替普酶、替奈普酶、阿哌沙班或阿加曲班。
5.一种接合单元于制备药物的用途，该药物用以预防一有需要个体的血栓形成，其中该接合单元如权利要求4所述。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述第二组件为阿哌沙班或阿加曲班。
7.一种接合单元于制备药物的用途，该药物用以治疗一有需要个体的血管栓塞，其中该接合单元如权利要求4所述。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述第二组件为瑞替普酶或替奈普酶。
9.一种分子构建体，包含一第一接合单元与一第二接合单元，其中：
所述第一接合单元包含：
一第一中心核，其是权利要求1所述的中心核，
一第一连接臂，连接于所述第一中心核的多个所述K残基，
一第一组件，其通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而连接于所述第一连接臂，以及
一第一耦合臂，其连接于所述第一中心核的所述半胱氨酸残基的硫氢基；
所述第二接合单元包含：
一第二中心核，其是权利要求1所述的中心核，
一第二连接臂，其连接于所述第二中心核的多个所述K残基，
一第二组件，其通过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而连接于所述第二连接臂，以及
一第二耦合臂，其连接于所述第二中心核的所述半胱氨酸残基的硫氢基；其中
所述第一耦合臂和所述第二耦合臂中的一个的自由端有四嗪基，且另一个的自由端有环辛烯基；
所述第一接合单元与所述第二接合单元通过发生于所述四嗪基与所述环辛烯基之间的逆电子需求狄尔斯-阿德(iEDDA)反应而彼此连接；其中
所述第一连接臂和所述第二连接臂为一具有6或12个EG重复单元的PEG链；
所述第一耦合臂和所述第二耦合臂是一具有3或4个EG重复单元的PEG链；
所述第一组件为一对纤维素特异的scFv，且所述第二组件为瑞替普酶、替奈普酶、阿哌沙班或阿加曲班。
10.如权利要求9所述的分子构建体，其中所述第一接合单元与所述第二接合单元分别包含与其连接的多个第一连接臂与第二连接臂。
11.如权利要求10所述的分子构建体，还包含多个第一组件与第二组件，分别连接于所述第一连接臂与所述第二连接臂。
12.如权利要求9所述的分子构建体，其中所述四嗪为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪或6-甲基四嗪基。
13.如权利要求9所述的分子构建体，其中所述第一中心核与所述第二中心核的N-端均经过一乙酰基修饰。
14.一种分子构建体于制备药物的用途，该药物用以抑制一个体体内血栓形成，其中该分子构建体如权利要求9所述。
15.如权利要求14所述的用途，其中：
所述第一组件为对纤维素特异的所述scFv；以及
所述第二组件为阿哌沙班或阿加曲班。
16.一种分子构建体于制备药物的用途，该药物用以治疗一有需要个体的血管栓塞，其中该分子构建体如权利要求9所述。
17.如权利要求16所述的用途，其中：
所述第一组件为对纤维素特异的所述scFv；以及
所述第二组件为瑞替普酶或替奈普酶。
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