JP6602958B2 - 標的化成分及びエフェクター成分を有する分子構築物、並びにそれらの使用 - Google Patents

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Description

本開示は、医薬品分野に関し、特に、エフェクター(例えば、治療薬)を標的部位に送達するための標的化成分及びエフェクター成分を有するような多機能分子構築物に関する。
標的化抗原に対するモノクローナル抗体(mAb)の広範な選別及び選択方法の継続的な発展は、数年前に治療できないと考えられた多くの疾患に対する多くの治療用抗体の開発に寄与してきた。治療用抗体のデータベースに基づいて、約2,800種類の抗体が研究されているか、又はヒト臨床試験のために計画されており、約80種類の抗体の臨床応用が政府の薬物規制当局により承認されている。抗体の治療効果に関する大量のデータは、抗体が治療薬として作用する薬理学的メカニズムに関する情報を提供している。
抗体が治療薬として作用する1つの主要な薬理学的メカニズムは、抗体が、血液循環、間質腔、又はリンパ節に存在するサイトカイン又は免疫成分であり得る疾患を引き起こすメディエーターを中和又は捕捉できることである。中和活性は、疾患を引き起こすメディエーターとそれらの受容体との相互作用を阻害する。サイトカインの可溶性受容体又は受容体の細胞外部分及びIgGのFc部分からの融合タンパク質は、抗体による中和と同様に、サイトカイン又は免疫因子を中和することができるため、治療剤として開発されている。
臨床応用が承認されているか、又は臨床開発に供されているいくつかの治療用抗体は、受容体との結合により薬理学的効果を発揮することで、受容体とそのリガンドとの相互作用を遮断する。これらの抗体薬物では、抗体依存性細胞毒性(ADCC)及び補体媒介性細胞溶解(CMC)等のFc媒介性メカニズムは、主要なメカニズムではない。
いくつかの治療用抗体は、標的細胞上の特定の表面抗原に結合することにより、標的細胞でFc媒介性機能及び他のメカニズムを発揮する。最も重要なFc媒介性メカニズムは、抗体依存性細胞毒性(ADCC)、及び補体媒介性細胞溶解(CMC)であり、いずれも抗体結合標的細胞の溶解を引き起こす。特定の細胞表面抗原に結合するいくつかの抗体は、結合した標的細胞のアポトーシスを誘導することができる。
二重特異性を有する抗体を調製する概念及び方法が生まれたのは、30年以上前のことである。近年、組換え抗体工学方法の発展、及び改良医薬品の開発の推進に伴い、種々の構造を有する二重特異性抗体が開発されてきた。
例えば、二価又は多価抗体は、2つ以上の抗原結合部位を含み得る。接続構造を介して3つ又は4つのFab断片を共有結合することにより多価抗体を調製する方法は、多く報告されている。例えば、組換え工学により、タンデムの3つ又は4つのFab繰り返し単位を発現できる抗体が調製されている。
合成架橋剤を用いて異なる抗体又は結合断片を化学的に結合することにより、多価抗体を調製するいくつかの方法は開示されている。上記方法の1つとして、異なるリンカーを用いて、3つ、4つ、又はそれ以上の別々のFab断片を化学的に架橋する方法がある。別の方法として、複数のFabを有する構築物を調製し、それを一次元DNA足場に組み立てる方法が提供されている。標的分子への結合のために設計されたそれらの種々の多価Ab構築物は、サイズ、半減期、構造の可撓性、及び免疫系を調節する能力において互いに異なる。
以上のことから、一定数のエフェクター成分を有する分子構築物、又は2つ以上の異なる種類の機能成分(例えば、少なくとも1つの標的化成分及び少なくとも1つのエフェクター成分)を有する分子構築物の調製に関する報告が成されている。しかし、通常、化学合成又は組換え技術により、標的化成分とエフェクター成分との特定の組み合わせを有する分子構築物を構築することは、困難である。従って、従来技術において、幅広い疾患に適用されるより汎用性の高い分子を構築するための新たな分子プラットフォームを提供する必要がある。
以下は、読者に基本的な理解を提供するために本開示の簡略化された概要を提示する。この概要は、開示の広範な概要ではなく、本開示の重要な／決定的な要素を特定するものでも、本開示の範囲を描写するものでもない。その唯一の目的は、後に提示されるより詳細な説明の前置きとして、本明細書に開示されるいくつかの概念を簡略化した形で提示することである。
<I> ペプチドコアに基づくマルチアームリンカー
第1の態様において、本開示は、少なくとも2つの異なる機能成分が結合されたリンカーユニットに関する。例えば、該リンカーユニットには、2つの異なるエフェクター成分、1つの標的化成分及び1つのエフェクター成分、又は1つのエフェクター成分及びリンカーユニットの循環時間を延長可能なポリエチレングリコール(PEG)鎖が結合され得る。
本発明のリンカーユニットは、少なくとも2つの異なる官能基を有するように設計されることにより、機能成分が各官能基と反応することでリンカーユニットに結合されることができる。従って、本発明のリンカーユニットは、2つ以上の機能成分を有する分子構築物を調製するためのプラットフォームとして機能することができる。
本開示の様々な実施形態によれば、上記リンカーユニットは、中心コア及び複数のリンクアームを含む。中心コアは、(1)複数のリジン(K)残基、又は(2)(Xaa-K)n配列を含むポリペプチドコアである。複数のリジン(K)残基において、各K残基とその次のK残基との間がグリシン(G)及びセリン(S)残基を含む充填配列により区切られ、K残基の数が2〜15である。(Xaa-K)n配列において、 Xaaが2〜12個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、nが2〜15の整数である。上記充填配列は、2〜20個のアミノ酸残基から構成され得る。様々な実施形態において、上記充填配列は、GS、GGS、GSG、又は配列番号:1-16の配列を含み得る。
本開示のいくつかの実施形態によれば、中心コアは、2-15単位の配列G1-5SKを含み、好ましくは、中心コアは、(GSK)2-15配列を含む。各リンクアームは、K残基とリンクアームとの間にアミド結合を形成することにより、中心コアのK残基に結合される。中心コアに結合されたリンクアームは、その遊離末端にマレイミド基、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)基、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基、又はシクロオクチン基を有する。また、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基又はアルキン基を有する。或いは、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン(C)残基である。アミノ酸残基のチオール基は、遊離末端にアジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基、又はシクロオクチン基を有するカップリングアームに結合される。
本開示のいくつかの実施形態によれば、リンクアームの遊離末端がアジド基、アルキン基、又はシクロオクチン基である場合に、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、カップリングアームの遊離末端は、テトラジン基、又はシクロオクテン基である。本開示の他の実施形態によれば、リンクアームの遊離末端がテトラジン基又はシクロオクテン基である場合に、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基若しくはアルキン基を有し、又は、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、カップリングアームの遊離末端は、アジド基、アルキン基、又はシクロオクチン基である。
いくつかの実施形態において、リンクアームは、PEG鎖であり、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であることが好ましい。或いは、リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有し、且つ遊離末端(即ち、中心コアのK残基に結合されていない末端)にジスルフィド結合を有するPEG鎖である。いくつかの実施形態において、カップリングアームは、PEG鎖であり、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であることが好ましい。
アジド基を有するアミノ酸残基として、L-アジドホモアラニン(AHA)、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、及び6-アジド-D-リジン等が挙げられる。アルキン基を有するアミノ酸残基として、例えば、L-ホモプロパギルグリシン(L-HPG)、D-ホモプロパギルグリシン(D-HPG)、及びβ-ホモプロパギルグリシン(β-HPG)が挙げられる。
中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基がシステイン残基である場合に、カップリングアームの遊離末端にあるシクロオクテン基は、トランス-シクロオクテン(TCO)基であり、カップリングアームの遊離末端にあるシクロオクチン基は、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)基、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)基、ビシクロノニン(BCN)基、又はジベンゾシクロオクチン(DICO)基であり得る。或いは、カップリングアームの遊離末端にあるテトラジン基は、1, 2, 3, 4-テトラジン、1, 2, 3, 5-テトラジン、1, 2, 4, 5-テトラジン、及びそれらの誘導体、例えば、6-メチルテトラジンを含むが、これらに制限されない。
本開示の様々な実施形態によれば、リンカーユニットは、複数の第１成分をさらに含む。いくつかの実施形態において、各第１成分は、リンクアームと第１成分との間にアミド結合を形成することにより１つのリンクアームに結合される。他の実施形態において、各第１成分は、リンクアームと第１成分との間で起きる銅触媒型アジド-アルキン環化付加(CuAAC)反応、歪み促進型アジド-アルキンクリックケミストリー(SPAAC)反応、又は逆電子要請型ディールス・アルダー(iEDDA)反応により、１つのリンクアームに結合される。
必要に応じて、本発明のリンカーユニットは、それぞれCuAAC反応、SPAAC反応、又はiEDDA反応により複数のリンクアームに結合される複数の連結アームをさらに含む。本開示の実施形態によれば、各複数の連結アームは、その成分結合末端(即ち、リンクアームに結合されていない末端)にマレイミド基又はNHS基を有する。従って、各第１成分は、連結アームと第１成分との間で起きるチオール-マレイミド反応により１つの連結アームに結合される。或いは、各第１成分は、連結アームと第１成分との間にアミド結合を形成することにより１つの連結アームに結合される。いくつかの実施形態において、各連結アームは、PEG鎖であり、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であることが好ましい。他の実施形態において、各連結アームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有し、且つ成分結合末端にジスルフィド結合を有するPEG鎖である。
本開示の様々な任意の実施形態によれば、上記第１成分は、被験体において所望の効果(例えば、治療効果)を発揮するのに適したエフェクター成分である。或いは、上記第１成分は、リンカーユニットを目的部位に案内する標的化成分であり得る。本開示の実施形態によれば、上記第１成分は、フィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩、インターフェロン-β、又はインテグリン-α4、β-アミロイド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質に特異的な一本鎖可変領域断片(scFv)である。
必要に応じて、上記リンカーユニットは、上記第１成分と異なる第２成分をさらに含む。いくつかの実施形態において、上記第２成分は、アジド基又はアルキン基を有することにより、CuAAC反応で、中心コア又はカップリングアームの対応するアルキン基若しくはアジド基に結合されることで中心コア又はカップリングアームに結合される。或いは、いくつかの実施形態において、アジド基又はシクロオクチン基を有する第２成分は、SPAAC反応により、中心コア又はカップリングアームの対応するシクロオクチン基若しくはアジド基に結合されることで、中心コア又はカップリングアームに結合される。或いは、特定の実施形態において、テトラジン基若しくはシクロオクテン基を有する第２成分は、iEDDA反応により、中心コア又はカップリングアームの対応するシクロオクテン基若しくはテトラジン基に結合されることで、中心コア又はカップリングアームに結合される。いくつかの実施形態によれば、上記リンカーユニットは、連結アームを含む。該連結アームは、CuAAC反応又はSPAAC反応によりリンクアームに結合される。これらの実施形態において、中心コアのN末端若しくはC末端、又はカップリングアームの遊離末端は、テトラジン基若しくはシクロオクテン基を有することにより、対応するシクロオクテン基若しくはテトラジン基を有する第2成分は、iEDDA反応により中心コア又はカップリングアームに結合される。他の実施形態によれば、上記リンカーユニットは、連結アームを含む。該連結アームは、iEDDA反応によりリンクアームに結合される。この場合には、中心コアのN末端若しくはC末端又はカップリングアームの遊離末端は、アジド基、アルキン基若しくはシクロオクチン基を有することにより、対応する化学基を有する第2成分は、CuAAC反応又はSPAAC反応により中心コア又はカップリングアームに結合される。
本開示の任意の実施形態において、上記第１成分がエフェクター成分である場合に、上記第２成分は、上記第１成分と相加的若しくは相乗的、又は第１成分と独立して作用する別のエフェクター成分であり得る。或いは、上記第２成分は、標的化成分、又はリンカーユニットの溶解性、クリアランス、半減期、及び生物学的利用能等の薬物動態学的特性を改善させる成分であってもよい。いくつかの他の任意の実施形態において、上記第１成分が標的化成分である場合に、上記第２成分は、エフェクター成分、又はリンカーユニットの薬物動態学的特性を改善させる成分であることが好ましい。
特定の実施形態において、リンカーユニットは、必要に応じて第１成分及び第２成分と異なる第３成分をさらに含む。第２成分が中心コアに直接結合される場合に、中心コアのもう一方の末端(即ち、第２成分に結合されていない遊離末端)は、必要に応じて、第３成分の導入に用いられることができるシステイン残基であってもよい。具体的には、システイン残基のチオール基をPEG鎖のマレイミド基と反応させ、このように結合されたPEG鎖は、カップリングアームと呼ばれ、その遊離末端にテトラジン基又はシクロオクテン基を有する。従って、第３成分は、iEDDA反応によりカップリングアームに結合される。リンカーユニットが第２成分と第３成分の両方を含む場合に、好ましくは、第１成分及び第２成分のうちの少なくとも1つは、上述したようなエフェクターである一方、第３成分は、リンカーユニットの薬物動態学的特性を改善させる成分であり得る。薬物動態学的特性を改善させる成分の一例として、分子量約20,000〜50,000ダルトンの長いPEG鎖である。
<II> ペプチドコアに基づくマルチアームリンカーの使用
本開示の第１の態様に係るリンカーユニットは、臨床医学において、種々の疾患の治療に適用される。 そのため、本開示の第２の態様は、これらの疾患の治療方法に関する。本開示の種々の実施形態によれば、特定の疾患の治療方法は、治療を必要とする被験体に治療有効量の本開示の上述した態様及び実施形態に係るリンカーユニットを投与するステップを含む。 理解され得るように、上記リンカーユニットは、医薬製剤として投与され得る。該医薬製剤には、本発明のリンカーユニットに加えて、所望の投与経路に適した薬学的に許容される賦形剤を含む。
以下、本開示のいくつかの実施形態の理解を容易にするために、いくつかの特定の疾患を治療するための本発明のリンカーユニットの、第１成分と第２成分の種々の例示的な組み合わせを説明する。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のリンカーユニットは、中枢神経系（CNS）疾患、例えば、多発性硬化症及びアルツハイマー病を治療するのに有用である。多発性硬化症の治療において、上記第１成分は、フィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩、インターフェロン-β、又はインテグリン-α4に特異的なscFvであり得る。アルツハイマー病の治療において、上記成分は、β-アミロイドに特異的なscFvである。
本開示の他の実施形態によれば、感染症の治療に適用されるリンカーユニットは、ウイルスタンパク質又は細菌タンパク質に特異的なscFvを第１成分として有する。好ましい一実施形態において、上記ウイルスタンパク質は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のFタンパク質、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)のgp120タンパク質、A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンA（HA）タンパク質、又はサイトメガロウイルスの糖タンパク質であり、上記細菌タンパク質は、グラム陰性菌のエンドトキシン、クロストリジウム・ディフィシルの表面抗原、黄色ブドウ球菌のリポテイコ酸、炭疽菌の炭疽毒素、又は大腸菌の志賀毒素I型若しくはII型である。
<III> 標的化部分及びエフェクター部分を有する分子構築物
第３の態様において、本開示は、直接的又は間接的に互いに結合される2つのリンカーユニットを含む分子構築物に関する。1つのリンカーユニットのコアは、少なくとも1つの標的化成分に結合されるように構成され、もう1つのリンカーユニットのコアは、少なくとも1つのエフェクター成分に結合されるように構成される。本発明の分子構築物は、2つのリンカーユニットが、iEDDA反応、SPAAC反応、又はCuAAC反応により互いに結合されている利点を有する。このような設計により、複雑な構造を有する分子構築物を容易に合成することができる。本開示の原則及び精神によれば、異なる数及び/又はタイプの機能成分をそれぞれ有する2つのリンカーユニットを、独立して調製し、さらに結合することができる。このようにして、当業者であれば、異なる機能成分をそれぞれ有する分子構築物のライブラリーを構築し、そして、必要及び/又は所望の用途に応じて、該ライブラリーから分子構築物(又は、リンカーユニット)を選択して組合せることで、所望の構築物を生成することができる。さらに、リンカーユニットあたりの機能成分の数は、コアの特定の官能基の数を調整することにより制御することができる。
本開示の一実施形態によれば、分子構築物は、第１リンカーユニット及び第2リンカーユニットを含む。具体的には、第１リンカーユニットは、(1)第1中心コア；(2)第1中心コアに結合される1つ以上のリンクアーム(以下、第１リンクアーム)；(3)必要に応じて、第1 中心コアに結合されるカップリングアーム(以下、第１カップリングアーム)；及び(4)必要に応じて、それぞれ1つ以上の第１リンクアームに結合される1つ以上の連結アーム(以下、第１連結アーム)を含む。第2リンカーユニットは、(1)第２中心コア；(2)第２中心コアに結合される1つ以上のリンクアーム(以下、第2リンクアーム)；(3)必要に応じて、第２中心コアに結合されるカップリングアーム(以下、第２カップリングアーム)；及び(4)必要に応じて、それぞれ1つ以上の第2リンクアームに結合される1つ以上の連結アーム(以下、第2連結アーム)を含む。第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、第１中心コアと第２中心コア、第１カップリングアームと第２中心コア、第１カップリングアームと第２カップリングアーム、又は、第１中心コアと第２カップリングアームのいずれかの間で起きるiEDDA、SPAAC、又はCuAAC反応により、互いに結合される。
本開示の実施形態によれば、第1中心コア及び第２中心コアは、両方とも複数のアミン基を有する。各リンクアームは、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)基とアミン基との間に、アミド結合を形成することにより中心コアに結合される。中心コアに結合された後、リンクアームは、その遊離末端にNHS、マレイミド、アジド、アルキン、テトラジン、シクロオクテン又はシクロオクチン基を有する。
NHS基の存在下で、第１標的化成分及び第１エフェクター成分は、該成分(即ち、第１標的化成分又は第１エフェクター成分)とリンクアーム(即ち、第１リンクアーム又は第2リンクアーム)との間にアミド結合を形成することにより、それぞれ第１リンクアーム及び第2リンクアームに結合される。リンクアームがその遊離末端にマレイミド、アジド、アルキン、テトラジン、シクロオクテン、又はシクロオクチン基を有する場合に、第１標的化成分及び第１エフェクター成分はそれぞれ、該成分(即ち、第１標的化成分又は第１エフェクター成分)とリンクアーム(即ち、第１リンクアーム又は第2リンクアーム)との間で起きるチオール-マレイミド、CuAAC、iEDDA、又はSPAAC反応により、第１リンクアーム及び第2リンクアームに結合される。
必要に応じて、本発明の分子構築物のリンカーユニット(即ち、第1リンカーユニット又は第2リンカーユニット)は、CuAAC、iEDDA、又はSPAAC反応によりそれぞれ1つ以上のリンクアームに結合される1つ以上の連結アーム(即ち、第１連結アーム又は第2連結アーム)を含む。本実施形態によれば、各連結アームは、その遊離末端にNHS基又はマレイミド基を有する。このように、各成分(即ち、第１標的化成分又は第１エフェクター成分)は、該成分と連結アームとの間にアミド結合を形成することにより、又は、該成分と連結アームとの間で起きるチオール-マレイミド、CuAAC、iEDDA若しくはSPAAC反応により、各連結アームに結合される。
本開示のいくつかの実施形態によれば、各リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。或いは、各リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有し、且つ遊離末端(即ち、中心コアに結合されていない末端)にジスルフィド結合を有するPEG鎖である。本開示のいくつかの実施形態によれば、各カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。本開示のいくつかの実施形態によれば、各連結アームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。或いは、各連結アームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有し、且つ成分結合末端(即ち、リンクアームに結合されていない末端)にジスルフィド結合を有するPEG鎖である。
本開示の種々の実施形態によれば、第１中心コア及び第２中心コアのそれぞれは、化合物コア又はポリペプチドコアであり得る。いくつかの例において、第１中心コア及び第２中心コアは両方とも、同一又は異なる化合物の化合物コアである。特定の好ましい実施形態において、第１中心コア及び第２中心コアは両方とも、同一又は異なる配列を有するポリペプチドコアである。或いは、該２つのコアのうちの一方は化合物コアであり、他方はポリペプチドコアである。
本発明の化合物コアとして適用される化合物の非限定的な例として、ベンゼン-1,3,5-トリアミン、2-(アミノメチル)-2-メチルプロパン-1,3-ジアミン、トリス(2-アミノエチル)-アミン、ベンゼン-1,2,4,5-テトラアミン、3,3',5,5'-テトラアミン-1,1'-ビフェニル、テトラキス-(2-アミノエチル)メタン、テトラキス(エチルアミン)-ヒドラジン、N,N,N',N',-テトラキス-(アミノエチル)-エチレンジアミン、ベンゼン-1,2,3,4,5,6-ヘキサアミン、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-ヘキサキス-(メチルアミン)-ベンゼン-1,3,5-トリアミン、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N-オクタキス-(メチルアミン)-ベンゼン-1,2,4,5-トリアミン、及びN,N-ビス[(1-アミノ-3,3-ジアミノエチル)-ペンチル]メタン-ジアミンを含む。
中心コアが化合物コアである場合に、カップリングアームは、カップリングアームと中心コアとの間にアミド結合を形成することにより中心コアの複数のアミン基の１つに結合される。一方、カップリングアームの遊離末端には、アジド基、アルキン基、シクロオクテン基、シクロオクチン基、又はテトラジン基を有する。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明のポリペプチドコアとして適用されるポリペプチドは、複数のリジン(K)残基、必要に応じて、2〜15個のK残基を含む。また、各K残基とその次のK残基との間が充填配列により区切られ、該充填配列は、グリシン(G)及びセリン(S)残基を含み、必要に応じて、該充填配列は、2〜20個のアミノ酸残基からなる。種々の実施形態において、上記充填配列は、GS、GGS、GSG、配列番号:1-16の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、2-15単位のG1-5SK配列、例えば、(GSK)2-15配列を含む。一実施形態において、上記ポリペプチドコアは、配列番号:17、18、19、21、22、23、又は24の配列を含む。
或いは、ポリペプチドコアは、(Xaa-K)nを含み得る。Xaaは、2〜12個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、nは、2〜15の整数である。一実施形態において、ポリペプチドコアは、配列番号:25又は26の配列を含む。
中心コアは、ポリペプチドコアである場合に、そのN末端若しくはC末端にシステイン残基を含み得る。これらの場合において、カップリングアームは、チオール-マレイミド反応により、中心コアのシステイン残基に結合される。システイン残基に結合されるカップリングアームは、その遊離末端にアジド基、アルキン基、シクロオクテン基、シクロオクチン基、又はテトラジン基を有する。
第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、以下に詳細に説明するように、第１カップリングアームと第２カップリングアームの有無に応じて、種々の構造により結合され得る。化合物コアを有するリンカーユニットの場合に、カップリングアーム(即ち、第１カップリングアーム又は第２カップリングアーム)を介してもう1つのリンカーユニットに結合されることが好ましい一方、ポリペプチドコアを有するリンカーユニット場合に、カップリングアームの必要性は任意となる。
第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットがそれぞれカップリングアームを含む場合に、一方のカップリングアーム(例えば、第１カップリングアーム)は、その遊離末端にテトラジン基を有し、他方のカップリングアーム(この場合に、第２カップリングアーム)は、その遊離末端にシクロオクテン基を有することにより、２つのリンカーユニットは、２つのカップリングアーム(即ち、第１カップリングアームと第２カップリングアーム)の間で起きるiEDDA反応により結合される。好ましくは、テトラジン基は、1, 2, 3, 4-テトラジン、1, 2, 3, 5-テトラジン、1, 2, 4, 5-テトラジン又はそれらの誘導体、例えば、6-メチルテトラジンであり、シクロオクテン基は、TCOである。両方のカップリングアーム遊離末端がそれぞれアジド基及びアルキン基を有する場合にも同様である。この場合に、２つのリンカーユニットは、２つのカップリングアーム(即ち、第１カップリングアームと第２カップリングアーム)の間で起きるCuAAC反応により結合される。或いは、一方のカップリングアーム(例えば、第１カップリングアーム)は、アジド基を有し、他方のカップリングアーム(この場合に、第２カップリングアーム)は、シクロオクチン基(好ましくは、DBCO、DIFO、BCN、又はDICO基)を有する。従って、２つのカップリングアームは、SPAAC反応により結合されることができる。これらの構成は、２つのリンカーユニットの間に形成されることができる。ここで、２つのユニットは両方とも、化合物コア若しくはポリペプチドコアを有し、又は、場合によって、一方のリンカーユニットは化合物コアを有し、他方はポリペプチドコアを有する。
１つのリンカーユニットのみがカップリングアーム(例えば、第１カップリングアームを有する第１リンカーユニット)を有する場合に、もう1つのリンカーユニットの中心コア(例えば、第２中心コア)は、ポリペプチドコアである。この場合に、１つの第２中心コアのN末端又はC末端にある第１アミノ酸残基は、アジド基又はアルキン基を有するアミノ酸残基である。いくつかの実施形態において、アジド基又はアルキン基を有するアミノ酸残基は、第１リンカーユニットの第１カップリングアームの対応するアルキン又はアジド基とCuAAC反応を起こすことにより、第１リンカーユニットと第２リンカーユニットとを結合する。或いは、１つの第２中心コアのN末端又はC末端にある第１アミノ酸残基は、アジド基を有するアミノ酸残基であり、且つSPAAC反応により、第１リンカーユニットのカップリングアームに結合され得る。該カップリングアームの遊離末端にシクロオクチン基(好ましくは、DBCO、DIFO、BCN、又はDICO)を有する。この構成は、２つのリンカーユニットの間に形成されることができる。ここで、２つのユニットは両方とも、ポリペプチドコアを有し、又は、場合によって、一方のリンカーユニットは化合物コアを有し、他方はポリペプチドコアを有する。
第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、カップリングアーム(即ち、第１カップリングアーム及び第２カップリングアーム)が存在しなくても、結合されることも可能である。言い換えると、第１カップリングアームと第２カップリングアームは、互いに直接結合される。この構成は、主に２つのポリペプチドコアの間に形成される。具体的には、２つの中心コアのうちの一方(例えば、第１中心コア)は、そのN末端又はC末端にアジド基を有するアミノ酸残基を含み、他方の中心コア(例えば、第２中心コア)は、そのN末端又はC末端にアルキン基を有するアミノ酸残基を含む。このようにして、第１中心コアのアジド基と第２中心コアのアルキン基との反応により、第１リンカーユニットと第２リンカーユニットとが結合する。
アジド基を有するアミノ酸残基の非限定的な例として、L-アジドホモアラニン(AHA)、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、及び6-アジド-D-リジンが挙げられる。アルキン基を有するアミノ酸残基の例示的な例として、L-ホモプロパギルグリシン(L-HPG)、D-ホモプロパギルグリシン(D-HPG)、及びβ-ホモプロパギルグリシン(β-HPG)が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のいくつかの実施形態によれば、分子構築物の第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットのうちの一方は、第１リンカーユニット又は第２リンカーユニットに結合される追加のリンクアーム(以下、第３リンクアーム)をさらに含む。
第１リンクアーム及び第2リンクアームと同様に、第３リンクアームは、アミド結合を形成することにより、又は、チオール-マレイミド、CuAAC、iEDDA若しくはSPAAC反応により、１つの成分に結合されるように構成される。いくつかの実施形態において、別の成分は、第２標的化成分又は第２エフェクター成分であり、本発明の分子構築物の標的効果又は治療効果を向上させるのに使用される。或いは、分子量20,000〜50,000ダルトンの長いPEG鎖は、上記別の成分として使用することにより、本発明の分子構築物の安定性を向上させる。
他の実施形態において、本発明の分子構築物は、第3リンカーユニットをさらに含む。第3リンカーユニットは、(1)第3中心コア；(2)第3中心コアに結合される1つ以上のリンクアーム(以下、第３リンクアーム)；(3)必要に応じて、第3中心に結合されるコアカップリングアーム(以下、第3カップリングアーム)；及び(4)必要に応じて、1つ以上の連結アーム(以下、第3連結アーム)。この場合に、第3リンカーユニットは、第１カップリングアーム又は第２カップリングアームと第3カップリングアーム、第１中心コア又は第２中心コアと第3カップリングアーム、第１中心カップリングアーム又は第２中心カップリングアームと第3中心コア、或いは第１中心又は第２中心コアと第3中心コアのいずれかの間で起きるCuAAC反応、iEDDA反応、又はSPAAC反応により、第1リンカーユニット又は第2リンカーユニットに結合される。
第3リンカーユニットの第３リンクアームは、その遊離末端にNHS、マレイミド、アジド、アルキン、シクロオクテン、シクロオクチン、又はテトラジン基を有し得る。従って、第３リンクアームは、直接、或いは、アミド結合を形成することにより、又は、チオール-マレイミド、CuAAC、iEDDA若しくはSPAAC反応により第２エフェクター成分若しくは標的化成分に結合され得る。或いは、第３リンクアームは、CuAAC、iEDDA又はSPAAC反応により第3連結アームに結合される。第２エフェクター成分又は第２標的化成分は、アミド結合を形成することにより、又はチオール-マレイミド反応により第3連結アームに結合される。
理解され得るように、NHS基を有する標的化成分/エフェクター成分(例えば、薬物)は、リンクアーム(即ち、第１リンクアー、第２リンクアーム、又は第３リンクアーム)が存在しない場合に、NHS基とK残基との間にアミド結合を形成することにより、第１中心コア、第２中心コア、及び/又は第３中心コアのK残基に直接結合されることができる。
本開示の種々の実施形態によれば、第１中心コア、第２中心コア、及び必要に応じて第３中心コアは、同一でも異なっていてもよい。
<IV> 標的化部分及びエフェクター部分を有する分子構築物の使用
本開示の第３の態様に係る分子構築物は、臨床医学において、種々の疾患の治療に適用される。そのため、本開示の第４の態様は、これらの疾患の治療方法に関する。本開示の種々の実施形態によれば、特定の疾患の治療方法は、治療を必要とする被験体に治療有効量の本開示の上述した態様及び実施形態に係る分子構築物を投与するステップを含む。理解され得るように、上記分子構築物は、医薬製剤として投与され得る。該医薬製剤には、本発明の分子構築物に加えて、所望の投与経路に適した薬学的に許容される賦形剤を含む。
以下、本開示のいくつかの実施形態の理解を容易にするために、いくつかの特定の疾患を治療するための本発明の分子構築物の第１成分及び第２成分の種々の例示的な組み合わせを説明する。
本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明の分子構築物は、CNS疾患、例えば、多発性硬化症及びアルツハイマー病の治療に有用である。多発性硬化症の治療において、第１成分は、トランスフェリン受容体に特異的なscFvであり、第2成分は、IFN-β、フィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩又は、インテグリンα4に特異的なscFvである。アルツハイマー病の治療において、トランスフェリン受容体に特異的なscFv及びβ-アミロイドに特異的なscFvは、それぞれ第１成分及び第2成分として使用される。
本開示の他の実施形態によれば、本発明の分子構築物は、感染症の治療に有用である。一実施形態において、感染症はウイルスにより引き起こされ、第１成分は、ウイルスタンパク質に特異的なscFvであり、第2成分は、CD16b又はCD32に特異的なscFvである。ウイルスタンパク質の非限定的な例として、RSVのFタンパク質、HIV-1のgp120タンパク質、A型インフルエンザウイルスのHAタンパク質、及びサイトメガロウイルスの糖タンパク質を含む。別の実施形態において、感染症は、細菌によって引き起こされ、第１成分は、細菌タンパク質に特異的なscFvであり、第2成分は、CD16b又はCD32に特異的なscFvである。細菌タンパク質の例は、グラム陰性菌のエンドトキシン、クロストリジウム・ディフィシルの表面抗原、黄色ブドウ球菌のリポテイコ酸、炭疽菌の炭疽毒素、又は大腸菌の志賀毒素I型若しくはII型を含むが、これらに限定されない。
<V>中枢神経系疾患を治療するための分子構築物及びその使用
第５の態様において、本開示は、本開示は、免疫グロブリンのCH2-CH3ドメインに直接的又は間接的に結合される少なくとも1つの標的化成分及び少なくとも1つのエフェクター成分を有する結晶化可能断片(Fc)に基づく分子構築物に関する。本発明のFcに基づく分子構築物の標的化成分及びエフェクター成分は、これらのFcに基づく分子構築物が中枢神経系（CNS）疾患の治療、又はCNS疾患を治療するための医薬の製造に適されるように特異的に選択される。理解され得るように、このFcに基づく分子構築物を使用するCNS疾患の治療方法も本開示の態様に含まれる。
本開示の特定の実施形態によれば、Fcに基づく分子構築物は、IgG.Fcの1対のCH2-CH3セグメント、1対のエフェクター成分、及び1対の標的化成分を含む。１対のエフェクター成分は、インターフェロンβ1a(INF-β1a)、INF-β1b、又はインテグリンα4若しくはβ-アミロイドに特異的な抗体断片であり、１対の標的化成分は、ヒトトランスフェリン受容体又はヒトインスリン受容体に特異的な抗体断片である。
１対のエフェクター成分が１対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合される場合に、 １対の標的化成分は、１対のCH2-CH3セグメントのC末端に結合され、その逆もまた然りである。或いは、１対のエフェクター成分及び１対の標的化成分は、両方とも一本鎖可変領域断片(scFv)の形態である場合に、１対の標的化成分は、タンデム又はダイアボディ構造で１対のエフェクター成分のN末端に結合されることにより、１対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合される1対の二重特異性scFvを形成する。
特定の実施形態において、１対のCH2-CH3セグメントは、ヒトIgG 重鎖γ4又はヒトIgG 重鎖γ1に由来する。
いくつかの例において、１対のエフェクター成分又は１対の標的化成分は、Fab構造(即ち、VH-CH1ドメイン及びVL-Cκドメインを含む)を取る。このFab断片が第１重鎖及び第２重鎖のN末端に結合されることにより、Fcに基づく分子構築物は、IgG構造を採用する。この場合に、Fab構造ではない１対の成分は、１対のCH2-CH3セグメントのC末端に結合される。
特定の任意の実施形態によれば、エフェクター成分は、INF-β1a、INF-β1b、又はインテグリンα4に特異的なscFvであり、標的化成分は、ヒトトランスフェリン受容体に特異的なscFvである。特に、この分子構築物は、多発性硬化症の治療に適用される。
他の任意の実施形態によれば、エフェクター成分は、β-アミロイドに特異的なscFvであり、標的化成分は、ヒトトランスフェリン受容体に特異的なscFvである。特に、この分子構築物は、アルツハイマー病の治療に適用される。
治療を必要とする被験体のCNS疾患を治療する方法は、該被験体に有効量の本態様の分子構築物を投与するステップを含む。この方法によって治療可能なCNS疾患は、多発性硬化症及びアルツハイマー病を含む。
<VI>感染症を治療するための分子構築物
第６の態様において、本開示は、免疫グロブリンのCH2-CH3ドメインに直接的又は間接的に結合される少なくとも1つの標的化成分及び少なくとも1つのエフェクター成分を有する結晶化可能断片(Fc)に基づく分子構築物に関する。本発明のFcに基づく分子構築物の標的化成分及びエフェクター成分は、これらのFcに基づく分子構築物がウイルス若しくは細菌感染に関連する疾患/病状の治療、又はこのような疾患/病状を治療するための医薬の製造に適されるように特異的に選択される。理解され得るように、ウイルス又は細菌感染に関する疾患/病状の治療方法も本開示の態様に含まれる。
本開示の特定の実施形態によれば、Fcに基づく分子構築物は、IgG.Fcの1対のCH2-CH3セグメント、1対のエフェクター成分、及び1対の標的化成分を含む。１対のエフェクター成分は、CD32又はCD16bに特異的な抗体断片であり、１対の標的化成分は、ウイルスタンパク質又は細菌タンパク質に特異的な抗体断片である。
１対のエフェクター成分が１対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合される場合に、１対の標的化成分は、１対のCH2-CH3セグメントのC末端に結合され、その逆もまた然りである。或いは、１対のエフェクター成分及び１対の標的化成分は、両方とも一本鎖可変領域断片(scFv)の形態である場合に、１対の標的化成分は、タンデム又はダイアボディ構造で１対のエフェクター成分のN末端に結合されることにより、１対のCH2-CH3セグメントのN末端に結合される1対の二重特異性scFvを形成する。
特定の実施形態において、１対のCH2-CH3セグメントは、ヒトIgG重鎖γ4又はヒトIgG重鎖γ1に由来する。
いくつかの例において、１対のエフェクター成分又は１対の標的化成分は、Fab構造(即ち、VH-CH1ドメイン及びVL-Cκドメインを含む)を取る。このFab断片が第１重鎖及び第２重鎖のN末端に結合されることにより、Fcに基づく分子構築物は、IgG構造を採用する。この場合に、Fab構造ではない１対の成分は、１対のCH2-CH3セグメントのC末端に結合される。
特定の任意の実施形態によれば、エフェクター成分は、CD32又はCD16bに特異的なscFvであり、標的化成分は、ウイルスタンパク質に特異的なscFvである。例えば、ウイルスタンパク質は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のFタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスI型(HIV-1)のgp120タンパク質、A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンA（HA）タンパク質、又はサイトメガロウイルスの糖タンパク質であり得る。特に、この分子構築物は、ウイルス感染の治療に適用される。
他の任意の実施形態によれば、エフェクター成分は、CD32又はCD16bに特異的なscFvであり、標的化成分は、細菌タンパク質に特異的なscFvである。細菌タンパク質の例は、グラム陰性菌のエンドトキシン、クロストリジウム・ディフィシルの表面抗原、黄色ブドウ球菌のリポテイコ酸、炭疽菌の炭疽毒素、又は大腸菌の志賀毒素I型若しくはII型を含むが、これらに限定されない。特に、この分子構築物は、細菌感染の治療に適用される。
治療を必要とする被験体の感染(例えば、ウイルス又は細菌感染)に関連する疾患/病状を治療する方法は、該被験体に有効量の本態様の分子構築物を投与するステップを含む。
本説明は、以下に簡単に説明する添付図面に照らして読まれた以下の詳細な説明からよりよく理解されるであろう。
図1A〜1Nは、本開示の特定の実施形態に係るリンカーユニットを説明する模式図である。
図２は、化合物コアを有するリンカーユニットを説明する模式図である。
図3A〜3Dは、本開示のいくつかの実施形態に係るT-E分子構築物を説明する模式図である。
図４は、本開示のいくつかの実施形態に係る分子構築物を構築するためのライブラリーを説明する模式図である。
図5A〜5Bは、本開示のいくつかの実施形態に係る分子構築物を説明する模式図である。
図６は、本開示のいくつかの実施形態に係る分子構築物を説明する模式図である。
図7A〜7Bは、本開示の種々の実施形態に係る分子構築物を説明する模式図である。
図8A〜8Cは、本開示の種々の実施形態に係るFcに基づく分子構築物を説明する模式図である。
図9は、本開示の種々の実施形態に係るFcに基づく分子構築物を説明する模式図である。
本開示の種々の実施形態に係るFcに基づく分子構築物を説明する模式図である。
図11は、テトラジン基を有する１つのリンクアーム、及びマレイミド基を有する３つのPEGリンクアームを含むペプチドコアに基づくリンカーユニットの質量分析MALDI-TOF結果を示す。
図12は、NHS-PEG5結合フィンゴリモドの質量分析MALDI-TOF結果を示す。
図13は、遊離TCO官能基及び１つのセットの5つのフィンゴリモド分子を有するリンカーユニットから構成される薬物バンドルの質量分析MALDI-TOF結果を示す。
図14は、遊離TCO官能基及び１つのセットの10個のフィンゴリモド分子を有するリンカーユニットから構成される薬物バンドルの質量分析MALDI-TOF結果を示す。
図15は、遊離TCO官能基及び１つのセットの５つのフィンゴリモドリン酸塩分子を有するリンカーユニットから構成される薬物バンドルの質量分析MALDI-TOF結果を示す。
図16は、精製されたヒトCD32aの細胞外ドメインのSDS-PAGE分析結果を示す。
図17は、精製されたヒトTfR1の細胞外ドメインのSDS-PAGE分析結果を示す。
図18Aは、精製されたRSVのタンパク質Fに特異的なscFvのSDS-PAGE分析結果を示す。図18Bは、精製されたRSVのタンパク質Fに特異的なscFvのELISA分析結果を示す。図18Cは、精製されたエンドトキシンに特異的なscFvのSDS-PAGE分析結果を示す。図18Dは、精製されたエンドトキシンに特異的なscFvのELISA分析を示す。図18Eは、精製されたCD32aの細胞外ドメインに特異的なscFvのSDS-PAGE分析結果を示す。図18Fは、精製されたCD32aの細胞外ドメインに特異的なscFv ELISA分析を示す。
図19Aは、精製されたラットTfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvのSDS-PAGE分析結果を示す。図19Bは、精製されたラットTfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvのELISA分析結果を示す。図19Cは、精製されたβ-アミロイドに特異的なscFvのSDS-PAGE分析結果を示す。図19Dは、精製されたβ-アミロイドに特異的なscFvのELISA分析を示す。
図20Aは、ヒトCD32aの細胞外ドメインに特異的なscFvを有するファージの力価データを示す。図20Bは、ヒトCD32aの細胞外ドメインに特異的なファージディスプレイのシングルコロニーELISA分析結果を示す。
図21Aは、ヒトTfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvを有するファージの力価データを示す。図21Bは、ヒトTfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvファージディスプレイのシングルコロニーELISA分析を示す。
図22A〜22Bは、それぞれTCO結合CD32aに特異的なscFvのELISA分析結果及び質量分析結果を示す。
図23A〜23Bは、それぞれテトラジン結合TfR1に特異的なscFvのELISA分析結果及び質量分析結果を示す。
図24Aは、合成された標的化リンカーユニットの、サイズ排除カラムS75により得られたFPLC溶出プロファイルを示し、該合成された標的化リンカーユニットは、遊離テトラジン官能基及び１つのセットのエンドトキシンに特異的な３つのscFv（標的化成分）を有するリンカーユニットから構成される。図24B〜24Cは、それぞれ図24Aの合成された標的化リンカーユニットのSDS-PAGE分析結果結果及び質量分析結果を示す。
図25は、合成された標的化リンカーユニットの質量分析結果を示す。該合成された標的化リンカーユニットは、遊離テトラジン官能基及び１つのセットのRSVのタンパク質Fに特異的な３つのscFv（標的化成分）を有するリンカーユニットから構成される。
図26Aは、合成された標的化リンカーユニットの、陽イオン交換カラムにより得られたFPLC 溶出プロファイルを示し、該合成された標的化リンカーユニットは、遊離TCO官能基及び１つのセットのβ-アミロイドに特異的な３つのscFv（標的化成分）を有するリンカーユニットから構成される。図26B〜26Cは、それぞれ図26Aの合成された標的化リンカーユニットのSDS-PAGE分析結果及びELISA結果を示す。
図27Aは、単一のリンカーユニット分子構築物の質量分析結果を示し、該単一のリンカーユニット分子構築物は、標的化成分としてエンドトキシンに特異的な３つのscFv、及びエフェクター成分としてCD32aの細胞外ドメインに特異的な1つのscFvを有する。図27Bは、単一のリンカーユニット分子構築物の質量分析結果を示し、該単一のリンカーユニット分子構築物は、標的化成分としてエンドトキシンに特異的な３つのscFv、及びエフェクター成分としてCD32aの細胞外ドメインに特異的な1つのscFvを有する。図27Cは、単一のリンカーユニット分子構築物の質量分析結果を示し、該単一のリンカーユニット分子構築物は、標的化成分としてTfR1の細胞外ドメインに特異的な1つのscFv、及びエフェクター成分としてβ-アミロイドに特異的な３つのscFvを有する。
図28A〜28Bは、それぞれ分子構築物のSDS-PAGE分析結果及び質量分析結果を示す。該分子構築物は、TfR1の細胞外ドメインに特異的な1つのscFv、及び５つのフィンゴリモド分子を有する１つの薬物バンドルを含む。
図29Aは、S1P1受容体発現ヒトB細胞の染色分析結果を示す。図29Bは、リンクアームを介してペプチドコアに結合されたフィンゴリモドのトランスウェル遊走分析結果を示す。
図30Aは、精製された組換え二本鎖(scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32)融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果を示す。図30B〜30Cは、それぞれ図30Aの精製された組換え融合タンパク質の、RSVのタンパク質F(図30B)及びCD32aの細胞外ドメイン(図30C)に対する結合活性を示すELISA分析結果を提供する。
図31Aは、精製された組換え二本鎖(scFv α エンドトキシン)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32)融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果を示す。図31B〜31Cは、それぞれ図31Aの精製された組換え融合タンパク質の、エンドトキシン(図31B)及びCD32aの細胞外ドメイン(図31C)に対する結合親和性を示すELISA分析結果を提供する。
図32A〜32Bは、それぞれ精製された組換え二本鎖(インターフェロン-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1)融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果及びELISA結果を示す。
図33A〜33Bは、それぞれ精製された組換え二本鎖(scFv α インテグリンα4)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1)融合タンパク質のSDS-PAGE分析結果及び染色結果を示す。
図34は、精製された組換え二本鎖(scFv α エンドトキシン)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a)融合タンパク質のTNF-α分泌阻害効果のELISA分析結果を示す。
一般的な実施に従って、説明された種々の特徴/要素は、縮尺通りに描かれておらず、代わりに、本発明に関連する特定の特徴/要素を最もよく例示するために描かれている。また、種々の図面における同様の参照番号及び名称は、可能な場合には、同様の要素/部品を示すために使用される。
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例が構築又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。この説明は、この実施例の機能と、この実施例を構成し動作させるための一連のステップを示す。しかし、同じ又は同等の機能及び順序は、異なる実施例によって達成されてもよい。
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。 本明細書中で他に定義されない限り、本開示において使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解され使用される意味を有するものとする。
文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数の形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。具体的には、本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、文脈が明らかに他に示されない限り、単数形「a」及び「an」は複数の言及を含む。また、本明細書及び特許請求の範囲で使用する「少なくとも1つの」及び「1つ以上の」という用語は、同じ意味を有し、1,2,3又はそれ以上を含む。さらに、「A、B及び/又はCの少なくとも1つ」、「A、B又はCの少なくとも1つ」、及び「A、B及び/又はCの少なくとも1つ」という表現は、本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、A単独、B単独、C単独、AとB、BとC、AとC、及びAとBとC、をカバーすることを意図している。
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の10％、5％、1％又は0.5％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合、平均の許容可能な標準誤差内にあることを意味する。操作例／実施例以外で、又は特に明記しない限り、本明細書中に開示される材料の量、時間、温度、操作条件、量の比などについての、数値範囲、量、値及びパーセンテージの全てが、すべての場合において、用語「約」により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、本開示及び添付の請求項に記載される数値パラメーターは、所望に応じて変化することのできる近似値である。少なくとも、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。範囲は、本明細書では、1つのエンドポイントから別のエンドポイントまで、又は2つのエンドポイント間で表現することができる。特に明記しない限り、本明細書中に開示される全ての範囲は、エンドポイントを包含する。
本開示は、一般に分子構築物に関する。各分子構築物は、標的化成分(T)及びエフェクター成分(E)を含む。本明細書において、これらの分子構築物は、「T-E分子」、「T-E医薬品」又は「T-E薬物」と呼ばれる場合がある。
本明細書において、用語「標的化成分」とは、対象となる標的(例えば、細胞表面上の受容体、又は組織内のタンパク質)に直接的又は間接的に結合することにより、本発明の分子構築物の対象となる標的への輸送を容易にする分子構築物の部分を指す。いくつかの例において、標的化成分は、分子構築物を標的細胞の近傍に誘導する。他の場合には、標的化成分は、標的細胞表面に存在する分子、又は細胞表面に存在する分子に特異的に結合する第２分子に特異的に結合する。いくつかの場合において、標的化成分は、対象となる標的に結合されると、本発明の分子構築物とともに内部に移行することができることにより、標的細胞の細胞質基質に移転される。標的化成分は、細胞表面の受容体に対する抗体若しくはリガンドであり得るか、又は、そのような抗体若しくはリガンドに結合する分子であることで、本発明の分子構築物を標的部位(例えば、選択した細胞の表面)に標的化してもよい。標的化機能を有しない治療薬に比べて、本発明の分子構築物は、疾患部位でのエフェクター(治療剤)の局在化を強化でき、又は該局在化に有利である。上記局在化は、程度又は相対的な割合をいい、疾患部位へのエフェクターの全体的又は完全な局在化を意味しない。
本発明によれば、用語「エフェクター成分」とは、分子構築物が標的部位に誘導されると、生物学的活性(例えば、免疫応答、細胞毒性効果の発揮等を含む)又は他の機能的活性(例えば、他のハプテンタグ付き治療分子の動員)を誘発する分子構築物の部分を意味する。「エフェクト」は、治療的又は診断的であり得る。エフェクター成分は、細胞、及び/又は、 細胞外免疫調節因子に結合するものを包含する。エフェクター成分は、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、糖ペプチド、薬物部分(小分子薬物及び生物製剤の両方)、化合物、元素、及び同位体、並びにそれらの断片等の薬剤を含む。
使用される第１、第２、第３等の用語は、本明細書において、種々の成分、構成要素、領域、及び/又は、セクションを説明するために使用することができるが、これらの成分(並びに、構成要素、領域、及び/又は、セクション)は、これらの用語によって制限されない。また、そのような順序番号の使用は、文脈によって明白に示されない限り、順番や順序を意味するものではない。むしろ、これらの用語は、単にある要素を別の要素と区別するために使用される。従って、以下に説明する第１成分は、例示的な実施形態の教示から逸脱することなく、第2成分と呼ぶことができる。
ここで、用語「リンク」、「カップル」及び「接合」は、交換可能に使用され、直接結合又は間接結合により２つの要素を結合することを指すものである。
ここで使用される用語「ポリペプチド」とは、少なくとも2つのアミノ酸残基を有するポリマーを意味する。典型的には、ポリペプチドは、2〜約200残基、好ましくは2〜50残基の長さのアミノ酸残基を含む。本明細書でいうアミノ酸配列は、該配列の、L-、D-、又はβ-アミノ酸の構成を含む。ポリペプチドは、アミノ酸ポリマーも含む。該アミノ酸ポリマーにおいて、１つ又は複数のアミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸に対応する人工化学類似体、又は天然に存在するアミノ酸ポリマーである。さらに、該用語は、ペプチド結合、又は他の「修飾された結合」、例えば、ペプチド結合がα-エステル、β-エステル、チオアミド、ホスホラミド、カーボネート、ヒドロキシレート等に置換されたものにより結合されたアミノ酸に適用される。
特定の実施形態において、本明細書に記載された配列を含むアミノ酸の保存的置換も含まれる。種々の実施形態において、１、２、３、４、又は５つの異なる残基が置換される。用語「保存的置換」とは、アミノ酸の置換が分子の活性(例えば、生物学的若しくは機能的活性、及び/又は、特異性)を実質的に変更しないことをいう。典型的には、保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の化学的性質(例えば、電荷又は疎水性)を有する他アミノ酸で置換することである。ある保存的置換は、標準アミノ酸が親残基と僅かに異なる非標準アミノ酸(例えば、希アミノ酸、合成アミノ酸等)に置換された「類似体置換」を含む。アミノ酸類似体は、親アミノ酸の構造を大幅に変化させず、標準アミノ酸から合成的に得ることができ、異性体、又は代謝産物前駆体である。
特定の実施形態において、本明細書に記載されている配列のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％又は90％、より好ましくは少なくとも95％又は98％の配列同一性を有するポリペプチドも含む。
本明細書でいうポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセンテージ(%)」は、特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるポリペプチド残基のパーセンテージとして定義される。上記配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入することにより、最大パーセント配列同一性が得られる。なお、保存的置換は、配列同一性の一部として考慮されていない。配列同一性パーセンテージを決定するためのアライメントは、当分野内の様々な方法、例えば、公然に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はガリン(DNASTAR)ソフトウェアにより達成することができる。当業者であれば、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。上記パラメータは、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要である任意のアルゴリズムを含む。本明細書の目的を達成するために、2つのポリペプチド配列間の配列比較は、国立生物工学情報センター(NCBI)によってオンラインで提供されるコンピュータプログラムBlastp(タンパク質-タンパク質BLAST)により実施される。所与のポリペプチド配列Bに対する所与のポリペプチド配列Aのアミノ酸配列同一性パーセンテージ(本明細書において、所与のポリペプチド配列Bと特定の％アミノ酸配列同一性を有する所与のポリペプチド配列Aとも呼ばれる)は、以下の式により計算される。
ここで、Xは、配列アライメントプログラムBLASTにより、配列A、Bをアライメントすることで同一のマッチとして得られたアミノ酸残基の数である。Yは、配列A又はBのいずれか短い方のアミノ酸残基の総数である。
本明細書で使用される用語「PEG化アミノ酸」は、1つのアミノ基及び1つのカルボキシル基を有するポリエチレングリコール(PEG)鎖である。一般的には、PEG化アミノ酸の一般式は、NH2-(CH2CH2O)n-COOHである。本開示において、nの値は、1〜20、好ましくは、2〜12である。
本明細書において、ポリペプチドについては、用語「末端」は、ポリペプチドのN端又はC端にあるアミノ酸残基を指す。ポリマーについては、用語「末端」は、ポリマー(例えば、本開示のポリエチレングリコール)におけるポリマー骨格の端に位置する構成単位を指す。本明細書及び特許請求の範囲において、用語「遊離末端」は、他の分子に化学的に結合していない末端アミノ酸残基又は構成単位を指す。
本明細書において、用語「抗原」又は「Ag」は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、分泌性、体液性、及び/又は、細胞性抗原-特異的応答を含む。本開示において、用語「抗原」は、タンパク質、ポリペプチド(その変異型又は生物学的活性断片を含む)、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、又はそれらの組合せでありえる。
本明細書及び特許請求の範囲において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、完全に集合した抗体、抗原に結合する抗体断片、例えば、抗原結合断片(Fab/Fab')、F(ab')2断片(互いにジスルフィド結合により結合された2つの抗原結合Fab部分を有する)、可変断片(Fv)、一本鎖可変断片(scFv)、二重特異的性一本鎖可変領域断片(bi-scFv)、ナノボディ、ユニボディ及びダイアボディを包含する。「抗体断片」は、完全抗体の一部、好ましくは、完全抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。典型的には、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。よく知られている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、並びに、ミリアド免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパ又はラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類される。これにより、免疫グロブリン：IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEをそれぞれ定義する。典型的な免疫グロブリン(抗体)の構造単位は四量体である。各四量体は、2つの同一の1対のポリペプチド鎖から構成される、各1対のポリペプチド鎖は、1本の「軽」鎖(約25kDa)及び1本の「重」鎖(約50-70kDa)を含む。各鎖のN末端は、抗原認識主に関与する約100〜110又はそれ以上のアミノ酸を含む可変領域を定義する。用語可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)は、それぞれ上述した軽鎖及び重鎖を指す。本開示の実施形態によれば、抗体断片は、天然抗体を改変することによって、又は組換えDNA技術を使用して新規合成によって調製され得る。本開示の特定の実施形態において、抗体、及び/又は、抗体断片は、二重特異性であり得、且つ様々な構造であり得る。例えば、二重特異性抗体は、2つの異なる抗原結合部位(可変領域)を含み得る。種々の実施形態において、二重特異性抗体は、ハイブリドーマ技術又は組換えDNA技術によって調製されることができる。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対し結合特異性を有する。
本明細書において、用語「特異的に結合」は、抗体又はその抗原結合断片が、約1×10-6 M、1×10-7 M、1×10-8 M、1×10-9 M、1×10-10 M、1×10-11 M、1×10-12 M以下の解離定数(Kd)で抗原に結合する能力、及び/又は、非特異的抗原に対する親和性よりも少なくとも2倍大きい親和性で抗原に結合する能力を指す。
本明細書において、用語「治療」は、予防的(例えば、予防薬)、治癒的又は緩和的治療を含む。本明細書で使用される「治療」行為も、予防的(例えば、予防薬)、治癒的又は緩和的治療を含む。特に、本明細書において、用語「治療」は、本発明の分子構築物又はそれを含む医薬組成物を、症状、症状に関連した病状、症状に関連した二次的な疾患若しくは障害、又は症状を引き起こす素因を有する被験体に、上記特定の疾患、障害及び/又は症状の１つ以上の病状又は特徴の、部分的若しくは完全な緩和、改善、軽減、発症の遅延、進行の阻害、重症度の軽減、及び/又は、罹患率の低減を達成する目的で、適用又は投与することを指す。治療は、疾患、障害及び/又は症状の徴候を示していない被験体、及び/又は、疾患、障害及び/又は症状の初期徴候のみを示す被験体にも、疾患、障害及び/又は症状に関連した病理学変化の発展リスクを減少させる目的で施すことができる。
本明細書において、用語「有効量」とは、所望の治療応答を生じるのに十分な本発明の組換えタンパク質の量を指す。薬剤の有効量は、疾患又は症状を治癒する必要はないが、疾患若しくは症状の発症を遅延、妨害又は予防し、又は疾患若しくは症状を緩和し、疾患若しくは症状を治療することができる。有効量は、適切な投薬形態で1回、2回又はそれ以上の用量に分割されることで、所定の期間内で1回、2回又はそれ以上で投与されることができる。具体的な有効量又は十分量は、処置される特定の病状、患者の身体的条件(例えば、患者の体重、年齢、又は性別)、治療を受けている被験体のタイプ、治療期間、併用療法の性質（存在する場合）、採用される特定の処方、化合物の構造又はその誘導体などの要因によって変化する。有効量は、例えば、有効成分の総質量(例えば、グラム、ミリグラム又はマイクログラム)、又は体重に対する活性成分の質量比、例えば、ミリグラム/キログラム（mg / kg）として表すことができる。
用語「適用」及び「投与」は、本明細書において互換的に使用され、本発明の分子構築物又は医薬組成物を、治療を必要とする被検体に適用することを意味する。
用語「被験体」及び「患者」は、本明細書では互換的に使用され、本発明の分子構築物、医薬組成物及び/又は方法によって治療可能な人類を含む動物を意味する。用語「被験体」又は「患者」は、１つの性別が特定されていない限り、オスとメスの両方の性別を指すことが意図される。従って、用語「被験体」又は「患者」は、本開示の治療方法から利益を得ることができる任意の哺乳動物を含む。「被験体」又は「患者」の例は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及びニワトリを含むがこれらに限定されない。例示的な実施形態において、患者はヒトである。 用語「哺乳動物」は、ヒト、霊長類、家畜、及び、農場動物、例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ又は牛;動物園、スポーツ又はペット動物；及びマウス及びラットのようなげっ歯類を含む哺乳綱のすべてのメンバーを指す。用語「非ヒト哺乳動物」は、ヒト以外の哺乳綱のすべてのメンバーを指す。
本開示は、少なくとも、T-E医薬品の構築に基づいている。このようなT-E医薬品は、標的細胞、標的組織又は器官に、血液循環、リンパ系、及び他の細胞、組織又は器官よりも相対的に高い割合で送達できる。この場合に、医薬品の治療効果は増加する一方、副作用及び毒性の範囲、重症度は低下する。標的成分を含まない形態よりも低い用量でT-E分子の形態で治療エフェクターを投与することもできる。従って、より低い投薬量で治療エフェクターを投与しても、効力を失うことなく、副作用及び毒性を低下させることができる。
より良い薬物標的から恩恵を受けることができる疾患
多くの疾患に使用される薬物は、疾患部位を標的とすることができれば、すなわち正常組織又は器官よりも有利に疾患部位に局在化又は分配できれば、より良い効力及び安全性を有するように改善されることができる。特定の抗体薬物は、感染性微生物又はそれらの毒性生成物を標的とし、免疫細胞を動員して抗体結合粒子を貪食して消失させる能力を持たせると、治療効果を向上できる。以下は疾患の主要な例であり、薬物を疾患部位又は細胞に優先的に分布させることができれば、又は貪食免疫細胞を摂取することができれば、これらの薬物を改善することができる。
I 中枢神経系疾患
中枢神経系(CNS)の疾患の治療において、治療剤を血液脳関門(BBB)を通過してCNSに入られせる必要がある場合が多い。いくつかの治療剤は、CNSに入ることなく、周辺の特定の活性、例えば、免疫活性を調節することにより、CNSにおける病的状態を調節する。BBBは、CNSにおける血管の毛細血管を覆う内皮細胞によって形成される。末梢組織及び器官の毛細血管とは異なり、BBBにおける毛細血管内皮細胞は、オクルディン、クローディン、及び接合部接着分子によって形成される密着接合によって接続される。
β-アミロイドは、アルツハイマー病を引き起こす原因である。現在、少なくとも６つの、β-アミロイドに特異的な抗体、即ち、アジヌマブ、バピネルマブ、クレネズマブ、ガンテネルマブ、ポネズマブ、及びソラネズマブは、開発され、臨床に使用されている。これらの抗体は、一般に、アルツハイマー病の改善に対して治療効果が十分ではない。治療効果を達成するためには、非常に大量の抗体がBBBを通過してCNS内の損傷部位に入ることを必要とすると考えられている。しかし、ごくわずかなこれらの抗体のみがBBBを通過する。
インターフェロン-β-1a(IFN-β-1a)及びインターフェロン-β-1b(IFN-β-1b)は、多発性硬化症(MS)の治療に適用されている。これらの医薬品（哺乳動物細胞で産生されたIFN-β-1a、及び大腸菌で産生されたIFN-β-1b）は、166個のアミノ酸残基を含む一本鎖タンパク質であり、１つのジスルフィド結合を有する。これらの治療剤は、治療された患者のMSの再発を18-38％に減少させると言われている。IFN-β-1a及びIFN-β-1bの作用機序は、抗炎症性免疫細胞及び因子のアップレギュレーション及び炎症誘発性細胞及び因子のダウンレギュレーションに関するため、非常に複雑であり、まだ完全に理解されていない。MS患者に対するIFN-β治療もBBBを通過する炎症誘発性T細胞を減少させることを引き起こす場合がある。IFN-β-1a及びIFN-β-1bがCNS内の損傷部位に入ることによって、その薬理学的効果を部分的に媒介するかどうかは未だに解明されていない。
抗体又はタンパク質治療薬が生体の末梢に投与された場合に、ごくわずかなタンパク質治療薬がBBBを通過するため、非常に微量（約0.1％）しかCNSに到達しない。しかし、アルツハイマー病及び多発性硬化症を含む数多くのCNS疾患において、疾患部位における炎症がBBBを破壊させ、浸透性を増加させることも見出されている。したがって、投与されたβ-アミロイド又はIFN-β-1a及びIFN-β-1bに特異的な抗体の大部分をBBBに導かれるなら、より多い治療剤がBBBを通過し、より良い治療効果が達成され得る。
さらに、炎症性免疫細胞がBBBを通過することを阻害するためのいくかの治療剤が開発されている。注目すべき例は、細胞接着分子インテグリンα4に特異的なナタリズマブである。この抗体は、炎症性免疫細胞がBBBを覆う上皮層に付着して通過するのを阻害することによって機能する。ナタリズマブは治療効果があることが示されているが、重篤な免疫抑制副作用を有する。特に、ジョンカニンガムウイルス（JCウィルス）によって引き起こされる日和見感染である進行性多巣性白質脳症を引き起こす。従って、インテグリンα4に特異的な抗体の大部分がBBBに動員されれば、より少ない用量が必要とされ、より良い治療効果が達成され、副作用がより少なくなると考えられている。
BBBを形成する毛細血管の内皮細胞は、トランスフェリン受容体及びインスリン受容体を発現する。これらの受容体は、それぞれトランスフェリン及びインスリン分子のトランスサイトーシスを媒介することにより、脳実質に到達する。トランスフェリン受容体をフェリーとして使用する際に、少量は通過するのに対し、大部分はトラップされ又は分解される。脈管構造の他の部分において毛細血管を覆う内皮細胞がトランスフェリン受容体を発現しないため、BBBの内皮細胞上のトランスフェリン受容体は、部位特異的抗原として投与された治療薬を動員することができる。治療薬がBBBに集中すると、より大きい割合の治療薬が毛細血管を通過する。
また、発明者らは、医薬品をBBBに導くメカニズムが確立されると、抗炎症薬の様々なCNS疾患に対する治療効果を調べるべきであると合理的に考える。上記抗炎症薬は、例えば、抗TNF-α、抗IL12/IL-23、抗IL17、及び抗CD3である。
インテグリンα4に特異的な抗体治療薬について、トランスフェリン受容体は、標的部位リクルーターとして使用される。アルツハイマー病の治療において、エフェクター部分は、β-アミロイドに特異的な数コピーのscFvであり得る。多発性硬化症の治療において、エフェクター部分は、IFN-β-1a若しくはIFN-β-1b、又はインテグリンα4に特異的な数コピーのscFvであり得る。
本開示の実施形態は、それぞれ単一のマルチアームリンカーユニット又はジョイント-リンカー構造であり、且つ、標的化成分としてトランスフェリン受容体に特異的なscFv、及びエフェクター成分としてIFN-β-1a若しくはIFN-β-1b、又はインテグリンα-4に特異的なscFvを有する複数のT-E分子を開示する。別の実施形態は、それぞれ単一のリンカーユニット又はジョイント-リンカー構造であり、且つ標的化成分としてトランスフェリン受容体に特異的なscFv、及びエフェクター成分としてβ-アミロイドに特異的なscFvを有するT-E分子を開示する。
フィンゴリモドは、元々特定の真菌から単離された天然産物であるミリオシンに由来する免疫抑制薬である。フィンゴリモドは、再発寛解型多発性硬化症の再発を減少させるために承認されている。フィンゴリモドはインビボでリン酸化されてフィンモリドホスフェートを形成する。該フィンモリドホスフェートは、構造が天然に存在するスフィンゴシン-1-リン酸（S1P）に似ており、細胞外脂質メディエーターであり、５つのS1P受容体のうちの４つに結合できる。S1P受容体はリンパ球上に発現され、リンパ球遊走に関与する。フィンゴリモドの一般的な薬理学的メカニズムは、リンパ球がリンパ組織から出て循環（ひいては、CNS）に入るのを阻害することである。フィンゴリモドは、BBBを通過してCNSに入ることができ、CNSにおける数多くの細胞型は、S1P受容体を発現する。S1P受容体は、細胞増殖、細胞形態、及び細胞遊走において役割を果たす。フィンゴリモドはCNSに直接作用すると考えられている。フィンゴリモドの投与は、頭痛及び疲労の一般的な副作用、ならびに皮膚癌、黄斑浮腫及び致命的な感染（例えば、出血性局所性脳炎）の重篤な副作用を引き起こす。
フィンゴリモド分子は、NH2基を有し、NHS基を有する二機能性リンカーに結合するために官能基を提供する。本発明の1つの好ましい実施形態において、BBBへ送達するための標的化成分及びフィンゴリモドの薬物バンドル（エフェクター成分）を含むT-E構築物を調製する。フィンゴリモドのバンドルにおいて、切断可能なリンカー又は非切断可能なリンカーを用いてフィンゴリモド分子をリンカーユニットのリンクアームに結合させることにより、5-10分子のフィンゴリモドをリンカーユニットに組み込むことができる。フィンゴリモドは、患者に投与された後、活性化されフィンゴリモドリン酸塩（スフィンゴシン-1-リン酸に類似する）になるため、フィンゴリモドリン酸塩で薬物バンドルを調製することもできる。フィンゴリモド又はフィンゴリモドリン酸塩バンドルを有するリンカーユニットは、1つ又は2つの、トランスフェリン受容体Iに特異的なscFvに結合される。上記分子構築物を投与した後、その一部がBBBに運ばれる。切断可能なリンカーから放出されたフィンゴリモド分子は、BBBを通過してCNSに入る。或いは、構築物全体の一部がCNSに入る。切断可能なリンカーは、切断メカニズムを使用して設計され得る。S-Sジスルフィド結合が標的組織部位で還元反応により切断されることができるため、S-S結合の導入は良く利用されている。多くのリンカー設計において、アミノ酸の間の、プロテアーゼ（例えば、多くの組織におけるマトリックスメタロプロテアーゼ、及び標的細胞のエンドソーム内のカテプシン）に敏感なペプチド結合も、切断可能な結合として一般に使用されている。
いくつかの例示的なT-E分子は、それぞれ単一のリンカーユニット又はジョイント-リンカー構造であり、且つ標的化成分として１つ又は２つの、トランスフェリン受容体に特異的なscFv、及びエフェクター成分としてフィンゴリモドを含む。全てのこれらの分子構築物において、リンクアームとエフェクター成分との間の結合は、非切断可能な結合又は切断可能な結合であり得る。CNS疾患を治療する際の様々な用途のための本発明の分子構築物プラットフォームの適用において、標的化部分は、トランスフェリン受容体又はインスリン受容体に特異的なscFvの１つ又は２つのコピーを用いて導入することができる。１つ又は２つの、トランスフェリン受容体又はインスリン受容体に特異的なscFvを使用する。scFv比較的高い親和性(Kd<1x10-9)を有する場合に、1つのscFvを使用する。scFvが中程度の親和性(Kd <5x10-8且つ> 1x10-9)を有する場合に、2つのscFvを使用する。結合した薬物の受容体架橋及びエンドサイトーシスを避けるために、トランスフェリン受容体又はインスリン受容体に特異的なscFvの2コピー以下を使用することが好ましい。
II 感染症
ヒトや動物に深刻な感染を引き起こす様々なウイルス、細菌、及び真菌の成分に対して多数のモノクローナル抗体が調製されているが、少数のモノクローナル抗体が感染に対抗するための予防的治療又は治療剤に開発されている。これらの問題は、いくつかの主要な要因に起因する。1つの主な要因は、感染性微生物及びそれらの生成物が異なる血清型を有し、且つ特定の抗体に対して異なる可変反応性を有することである。別の原因は、標的とされた微生物に変異が発生することで、特定の抗体の標的化から逃げることである。
本発明のT-E分子設計は、感染症の予防及び治療にも適用することができる。複数のリンクアームは、標的感染性微生物又はそれらの生成物との結合の活性及び特異性を向上させるとともに、微生物及びそれらの生成物のクリアランスを容易にする免疫機能を誘発することができる。発明者らは、結合力の強化及び免疫クリアランス機能の動員は、血清型の差及び変異の問題をある程度に克服することができると考えている。そのような改善により、感染性疾患の予防及び治療のための候補抗体の有効性を増加させるはずである。臨床試験において期待に合致しなかった多くの抗体は、本発明に基づいて再設計、再検討することができる。
本発明の好ましい一組の実施形態において、標的化するための１つのリンカーユニット及びエフェクター機能を動員するための１つのリンカーユニットを有するジョイント-リンカー構造を使用する。好ましい別の組の実施形態において、標的化成分のための複数のリンクアーム及びエフェクター成分のための１つのカップリングアームを有する単一のリンカーユニットを使用する。標的化成分は、以下の２種類のいずれかであり得る。即ち、(1)微生物の表面成分又は微生物の生成物に特異的なscFv又はsdAb、例えば、ヒト免疫不全ウイルスI型(HIV-1)のエンベロープタンパク質gp120、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のFタンパク質、クロストリジウム・ディフィシル若しくは黄色ブドウ球菌の表面抗原、グラム陰性菌のエンドトキシン、又は大腸菌の志賀毒素；(2)ウイルスの細胞表面受容体の細胞外部分、例えば、HIV-1 gp120-結合CD4ドメイン。
エフェクター成分は、1つ又は2つの、IgGのFc受容体に特異的なscFv又はsdAb（例えば、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIB(CD16b)、又はFcγRI(CD64)）であり得る。これらの受容体は、好中球、マクロファージ、及び好酸球上に発現され、抗体結合微生物の食作用を媒介する重要な分子である。FcγRIIA及びFcγRIIIBは、低親和性(Kd：10-6〜10-7)でIgGに結合し、FcγRIは、高親和性(Kd：10-9)でIgG1及びIgG3に結合する。FcγRIIA又はFcγRIIIBに特異的なscFv又はsdAbは、受容体との結合においてIgGと有利に競合することができるので、有利である。
細菌表面上の糖質抗原に特異的な抗体は、通常、結合親和性が弱く、IgGではなくIgMで発現される。IgM分子は10個のFv（抗原結合部位）を有する。しかし、約1000kdの分子量を有するIgM分子は、毛細血管を通過して血管外の空間に到達することができない。本発明の構成によれば、6個のscFv又は10個のsdAbを有する分子構築物は約150kdの分子量を有する。
抗体に基づく治療薬を用いてウイルスを除去する際に、治療剤がウイルス感染のFcR媒介増強をもたらさないことが重要である。この場合には、結合されたウイルス粒子は、貪食されず消化されない。デング熱ウイルスのようないくつかのウイルスは食細胞中で増殖することができる。したがって、ウイルス粒子が破壊されずに細胞に接近し結合細胞に入る場合、ウイルスは感染細胞内で増殖することができる。したがって、本発明の好ましい一組の実施形態において、分子構築物は、2つ以上の、Fcγ受容体に特異的なscFvを含み、食細胞表面上の複数の Fcγ受容体分子に結合することができることにより、結合したウイルス粒子が食作用経路に入ることになる。
臨床試験中のウイルス、細菌、又はそれらの生成物に特異的な多くの抗体の中で、RSVに特異的な抗体のみが臨床用途のために認可されている。RSVに対する抗体であっても、予防のみが承認されており、進行中の感染の治療には使用できない。既に感染した被験体を治療可能な抗RSV抗体の開発が望ましい。他の抗体は依然として臨床開発中であるか、又は臨床試験で失敗している。本発明の分子構築物プラットフォームによれば、これらの抗体のすべては、有効性が改善されるため、使用できるようになる。これらの抗体の部分的なリストは以下に示す。
(1) RSV Fタンパク質に特異的なパリビズマブ及びフェルビズマブ
(2) HIV-1 gp120に特異的なスヴィズマブ
(3)HBVの肝炎B表面抗原(HBsAg)ofに特異的なリビビルマブ、エビビルマブ、ツビルマブ
(4) A型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素Aに特異的なCR6261 mAb、ジリダバマブ、及びフィリブマブ
(5)サイトメガロウイルスの糖タンパク質に特異的なレガビルマブ及びセビルマブ
(6) 狂犬病ウイルスの糖タンパク質に特異的なラムシルマブ
(7) クロストリジウム・ディフィシルの表面抗原に特異的なアクトックスマブ及びベズロトキサブ
(8)炭疽菌炭疽に特異的なオビルトキサキシマブ及びラクシバクマブ
(9)シュードモナス・アエルギノーザ血清型IATS O11に特異的なパナバクマブ(ヒトIgM モノクローナル抗体)
(10)黄色ブドウ球菌の凝集因子Aに特異的なテフィバズマブ及びトサトキシマブ
(11)敗血症を治療するためのグラム陰性菌に特異的なエドバコマブのエンドトキシン
(12)ブドウ球菌敗血症を治療するための黄色ブドウ球菌のリポテイコ酸に特異的なパギバキシマブ
(13)炭疽毒素に特異的なラクシバクマブ(ヒトモノクローナル抗体)
(14) 大腸菌の志賀毒素I型若しくはII型に特異的なフリトキサキシマブ、セトキサキシマブ、及びウルトキサズマブ
本開示のいくつかの実施形態によれば、感染症を治療するためのジョイント-リンカー構造であるT-E 分子は、標的化/捕獲成分として呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のFタンパク質又はヒト免疫不全ウイルスI型(HIV-1) のgp120に特異的なscFv、及びエフェクター/クリアランス成分としてFcγRIIA(CD32)又はFcγRIIIB(CD16b)に特異的なscFvを含む。本開示の実施形態によれば、単一のリンカーユニット又はジョイント-リンカー構造であるいくつかのT-E 分子は、標的化/捕獲成分としてグラム陰性菌のエンドトキシン又は黄色ブドウ球菌のリポテイコ酸に特異的なscFv、及びエフェクター/クリアランス成分としてCD32又はCD16bに特異的なscFvを含む。グラム陰性菌感染中のエンドトキシンの迅速な除去は、生命を脅かす敗血症状態におけるTNF-α、IL-1などのサイトカイン放出（すなわち、サイトカインストーム）を大幅に減少させるはずである。感染症の治療における様々な用途に本発明の分子構築物プラットフォームを適用する場合、エフェクター部分は、CD32又はCD16bに特異的な１つ又は２つのscFvを含み得る。CD32(CD32a又はCD32b)又はCD16bに特異的な１つ又は２つのscFvを使用することができる。scFvが比較的高い親和性(Kd<1x10-9) を有する場合、1つのscFvを使用し、scFvが中程度の親和性(Kd<5x10-8且つ>1x10-9)を有する場合、2つのscFvを使用する。結合した薬物の受容体架橋及びエンドサイトーシスを避けるために、CD32又はCD16b に特異的な2コピー以下のscFvを使用することが好ましい。
パートI：特定疾患の治療に使用されるマルチアームリンカー
I-(i)マルチアームリンカーに使用されるペプチドコア
本開示の第１態様は、リンカーユニットに関する。該リンカーユニットは、(1)2-15個のリジン(K)残基を含む中心コアと、(2)中心コアのK残基にそれぞれ結合される2-15個のリンクアームとを含む。本発明の中心コアは、そのN末端若しくはC末端に、アジド基、アルキン基、テトラジン基若しくは歪んだアルキン基を有する、又は結合していることを特徴とする。
本発明のリンカーユニットの調製において、一端にN-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)基を有し、他端に官能基(例えば、NHS、マレイミド、アジド、アルキン、テトラジン、又は歪んだアルキン基)を有するPEG鎖は、PEG鎖のNHS基とK残基のアミン基との間にアミド結合を形成することにより、中心コアのK残基に結合される。本開示において、K残基に結合されるPEG鎖は、リンクアームと呼ばれ、その遊離末端に官能基を有する。
本開示の実施形態によれば、上記中心コアは、長さが8-120個のアミノ酸残基を含むポリペプチドであり、2〜15個のリジン(K)残基を含み、各K残基とその次のK残基との間が充填配列により区切られる。
本開示の実施形態によれば、上記充填配列は、グリシン(G)及びセリン(S)残基を含み、好ましくは、上記充填配列は、G、S、及びそれらの組合せから選択される2-15残基からなる。例えば、上記充填配列は、
GS,
GGS,
GSG,
GGGS(配列番号:1),
GSGS(配列番号:2),
GGSG(配列番号:3),
GSGGS(配列番号:4),
SGGSG(配列番号:5),
GGGGS(配列番号:6),
GGSGGS(配列番号:7),
GGSGGSG(配列番号:8),
SGSGGSGS(配列番号:9),
GSGGSGSGS(配列番号:10),
SGGSGGSGSG(配列番号:11)
GGSGGSGGSGS(配列番号:12),
SGGSGGSGSGGS(配列番号:13),
GGGGSGGSGGGGS(配列番号:14),
GGGSGSGSGSGGGS(配列番号:15),又は
SGSGGGGGSGGSGSG(配列番号:16)であり得る。
2つのリジン残基間にある充填配列は、グリシン及びセリン残基のランダムな配列及び/又は長さが様々でありえる。長い充填配列は、より少ないリジン残基を有するポリペプチドに使用され得る一方、短い充填配列は、多くのリジン残基を有するポリペプチドに使用され得る。親水性アミノ酸残基、例えばアスパラギン酸及びヒスチジンは、グリシン及びセリンと共に充填配列に挿入され得る。充填配列は、グリシン及びセリン残基で構成されたものに加えて、アルブミン及び免疫グロブリンのような一般的なヒト血清タンパク質における可撓性、可溶性のループを採用することもできる。
本開示の好ましい実施形態によれば、中心コアは、2-15単位のG1-5SK配列を含む。或いは、ポリペプチドは、(GSK)2-15配列を含む。即ち、ポリペプチドは、少なくとも2つの連続した、GSK配列の単位を含む。例えば、本発明の中心コアは、
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSK(配列番号:17)、
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK(配列番号:18)、又は
Ac-CGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSK(配列番号:19)を含み得る。
ここで、Acは、アセチル基を示す。
本開示の特定の実施形態によれば、上記中心コアは、(Xaa-K)n配列を含むポリペプチドである。ここで、Xaaは、2〜12個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、nは、2〜15の整数である。
上述したように、本発明の中心コアは、そのN末端若しくはC末端に、アジド基、アルキン基、テトラジン基若しくは歪んだアルキン基を有する、又は結合していることを特徴とする。本開示のいくつかの実施形態によれば、本発明の中心コアは、そのN末端又はC末端にアジド基又はアルキン基を有するアミノ酸残基を含む。アジド基を有するアミノ酸残基は、L-アジドホモアラニン(AHA)、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、又は6-アジド-D-リジンであり得る。例えば、本発明の中心コアは、以下の配列を含み得る。即ち、
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-AAH-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、
Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-AAH, 、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C、又は
Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAHである。
ここで、Xaaは、特定のEGの繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、Acは、アセチル基を示し、AAHは、AHA残基を示す。
アルキン基を有するアミノ酸の例は、L-ホモプロパギルグリシン(L-HPG)、D-ホモプロパギルグリシン(D-HPG)、又はβ-ホモプロパギルグリシン(β-HPG)を含むが、これらに限定されない。この場合に、本発明の中心コアは、以下の配列を含み得る。即ち、
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-GHP-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、
Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-GHP、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C、又は
Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHPである。
ここで、Xaaは、特定のEGの繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、Acは、アセチル基を示し、GHPは、HPG残基を示す。
なお、側鎖にアジド基又はアルキン基を含む多くのアミノ酸、及びPEG化アミノ酸は、市販されている。これらのアミノ酸は、t-boc（tert-ブチルカルボニル）-又はFmoc（9-フルオレニルメチルオキシカルボニル）の保護基を有し、固相ペプチド合成に容易に適用可能である。
本開示のいくつかの実施例によれば、中心コアは、下記の配列を含み得る。即ち、
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSK(配列番号:21)、
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSK(配列番号:22)、
Ac-AAHGGSGGSGGSKGSGSKGSK(配列番号:23)、
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSGSC(配列番号:24)、
Ac-C-Xaa2-K-Xaa2-K-Xaa2-K(配列番号:25)、又は
Ac-C-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K(配列番号:26)である。
ここで、Xaaは、特定のEGの繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、Acは、アセチル基を示し、AAHは、AHA残基を示し、GHPは、HPG残基を示す。
或いは、本発明の中心コアは、カップリングアームに結合される。該カップリングアームは、その遊離末端(即ち、中心コアに結合されていない末端)に、官能基(例えば、アジド基、アルキン基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基)を有する。この場合に、本発明の中心コアは、そのN末端又はC末端にシステイン残基を有する。カップリングアームに結合されるリンカーユニットを調製するためには1つの末端にマレイミド基を有し、もう1つの末端に官能基を有するPEG鎖を、PEG鎖のマレイミド基とシステイン残基のチオール基との間で起きるチオール-マレイミド反応により、中心コアのシステイン残基に結合する。本開示において、中心コアのシステイン残基に結合されるPEG鎖は、カップリングアームと呼ばれる。該カップリングアームは、その遊離末端に官能基を有する。
好ましくは、その遊離末端にカップリングアームは、テトラジン基又は歪んだアルキン基(例えば、シクロオクテン基又はシクロオクチン基)を有する。これらのカップリングアームは、2-12個のEG単位を有する。本開示の実施形態によれば、テトラジン基は、1, 2, 3, 4-テトラジン、1, 2, 3, 5-テトラジン、1, 2, 4, 5-テトラジン、又はそれらの誘導体である。歪んだアルキン基は、シクロオクテン基又はシクロオクチン基であり得る。本開示の実施例によれば、シクロオクテン基は、トランス-シクロオクテン(TCO)基であり、シクロオクチン基の例は、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)、ビシクロノニン(BCN)、及びジベンゾシクロオクチン(DICO)を含むが、これらに限定されない。本開示のいくつかの実施形態によれば、テトラジン基は、6-メチル-テトラジンである。
カップリングアームに結合するように構成される本発明の中心コアの例は、
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-テトラジン、
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-歪んだアルキン、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-テトラジン、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-歪んだアルキン、
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、及び
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4を含むが、これらに限定されない。
或いは、上記中心コアは、その1つの末端にアジド基又はアルキン基を有し、1つの末端にテトラジン基又は歪んだアルキン基を有するカップリングアームに結合される。その例は、
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-テトラジン、
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-歪んだアルキン、
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-テトラジン、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-歪んだアルキン、
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH、
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-テトラジン、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-歪んだアルキン、
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(AC)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-テトラジン、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-歪んだアルキン、
テトラジン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP、及び
歪んだアルキン-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHPである。
ポリペプチドは、組換え技術を用いて、細菌又は哺乳動物の宿主細胞において、設計された遺伝子セグメントを発現させることにより合成することもできる。コアが数多くのリジン残基を有し、且つかなり長い場合に、組換えタンパク質としてポリペプチドを調製することが好ましい。固相合成が採用される場合に、ポリペプチドの長さが増加するにつれて、エラーの発生確率が増加する一方、純度及び/又は収率が低下する。細菌又は哺乳動物宿主細胞においてポリペプチドを調製する際に、数個のアミノ酸残基から10-20残基の範囲の充填配列を2つのK残基間に配置することができる。さらに、AHA及びHPGは遺伝暗号によりコードされる天然アミノ酸ではないため、それらの組換えポリペプチドのN末端又はC末端残基はシステインである。組換えタンパク質を発現させ、精製した後、末端システイン残基を短い二官能性架橋剤と反応させる。該二官能性架橋剤は、その1つの末端にシステイン残基のSH基と反応可能なマレイミド基を有し、もう1つの末端にアルキン基、アジド基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基を有する。
PEG化アミノ酸を用いてポリペプチドを合成することは、グリシン及びセリンのような通常のアミノ酸を用いることよりも、少ない工程を必要とする。さらに、異なる長さ(即ち、異なる数のエチレングリコールの繰り返し単位)を有するPEG化アミノ酸を使用することにより、可撓性及び可溶性を提供するとともに、リジン残基の隣接するアミノ基の間に空間を提供することができる。PEG化アミノ酸以外、中心コアは、D型アミノ酸、ホモアミノ酸、N-メチルアミノ酸等の人工アミノ酸を含むように構築されてもよい。アミノ酸分子に含まれるPEG部分が構造的可撓性及び結合基間の適切な間隔を提供し、水溶性を増強し、且つ、その免疫原性が弱いため、ポリエチレングリコール(PEG)の様々な長さを有するPEG化アミノ酸を用いて中心コアを構築することが好ましい。PEG化アミノ酸含有中心コアの合成は、通常のポリペプチドの合成方法と類似する。
場合により、安定性を達成するため、本発明の中心コアは、そのN末端にあるアミノ基を保護するアセチル基を有する。
理解され得るように、中心コアに結合されるリンクアームの数は、主に、中心コアに含まれるリジン残基の数によって決定される。本発明の中心コアに少なくとも2つのリジン残基が含まれるため、本発明のリンカーユニットは、複数のリンクアームを含み得る。
図1Aに示すように、リンカーユニット10Aは、1つのHPG(GHP)残基及びそれぞれ充填配列(図面において、点線で示される)によって区切られる４つのリジン(K)残基を有する中心コア11aを含む。HPG残基とK残基との間、又はいずれの２つのK残基の間にある充填配列は、同一又は異なるアミノ酸配列を含み得る。この例において、４つのリンクアーム20a-20dは、それぞれNHS基とリジン残基のアミン基との間にアミド結合を形成することによりリジン残基に結合される。理解され得るように、上述したリンカーユニット10A又は後述のリンカーユニットのある特徴は、ここで開示される他のリンカーユニットと共通であるため、具体的な実施形態の文脈に矛盾しない限り、これらの特徴のいくつか又はすべては、以下の実施例においても適用される。しかし、簡潔のために、以下、これらの共通特徴を繰り返して説明しないこともある。
図1Bは、本開示の別の実施形態に係るリンカーユニット10Bを提供する。中心コア11bは、１つのシステイン(C)残基及びそれぞれ充填配列により区切られる６つのリジン(K)残基を含む。この例において、リンカーユニット10 Bは、それぞれリジン残基に結合される６つのリンクアーム20a-20fを含む。本開示の実施形態によれば、リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。
図1Aのリンカーユニット10Aと異なり、リンカーユニット10Bは、カップリングアーム60をさらに含む。上述したように、1つの末端にマレイミド基を有し、もう1つの末端に官能基を有するPEG鎖は、カップリングアーム60の形成に用いられる。このようにして、カップリングアーム60は、チオール-マレイミド反応により中心コア11bのシステイン残基に結合される。この例において、カップリングアーム60の遊離末端にある官能基は、テトラジン基72である。本開示の実施形態によれば、カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。
標的部位にあるエフェクター成分の放出を必要となる場合に、リンクアームに切断可能な結合を導入することができる。このような結合は、酸/アルカリ加水分解、還元/酸化、又は酵素によって切断される。カップリングアームの形成に適用される切断可能なPEG鎖の一実施形態は、NHS-PEG2-20-S-S-マレイミドであり、ここで、S-Sはゆっくりと還元され得るジスルフィド結合であり、NHS基は中心コアのアミン基と結合することにより、PEG鎖が中心コアに結合される。リンクアームの遊離末端にあるマレイミド基は、アジド基、アルキン基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基で置換されてもよい。本開示のいくつかの実施形態によれば、リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であり、且つその遊離末端(即ち、中心コアに結合されていない末端)にジスルフィド結合を有する。図1Cに示すように、５つのリンクアーム21a-21fは、それぞれ中心コア11bのK残基に結合され、リンクアームの遊離末端にあるジスルフィド結合を有するPEG鎖である。
本開示の実施形態によれば、中心コアのK残基に結合されるリンクアームは、その遊離末端に官能基(即ち、マレイミド、NHS、アジド、アルキン、テトラジン、又は歪んだアルキン基)を有する。好ましくは、リンクアームの遊離末端がアジド,アルキン基又はシクロオクチン基である場合に、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、カップリングアームの遊離末端は、テトラジン又はシクロオクテン基である。或いは、リンクアームの遊離末端は、テトラジン基又はシクロオクテン基である場合に、中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基若しくはアルキン基を有し、又は中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、カップリングアームの遊離末端は、アジド基、アルキン基、又はシクロオクチン基である。
リンクアームの遊離末端にある官能基(即ち、マレイミド、NHS、アジド、アルキン、テトラジン又は歪んだアルキン基)によって、対応する官能基を有する機能成分(例えば、標的化成分、エフェクター成分、又は薬物動態学的特性を改善させる成分)を設計することにより、機能成分は、以下のいずれかの化学反応によりリンクアームの遊離末端に結合され得る。
(1)アミド結合の形成:この場合に、リンクアームは、その遊離末端にNHS基を有し、機能成分は、アミン基を有する。
(2)チオール-マレイミド反応:この場合に、リンクアームは、その遊離末端にマレイミド基を有し、機能成分は、チオール基を有する。
(3)銅(I)触媒型アルキン-アジド環化付加反応(CuAAC反応、又は「クリック」反応と略称する):リンクアームの遊離末端と機能成分のうちの１つは、アジド基を有し、もう１つは、アルキン基を有する。CuAAC反応をスキーム1に示す。
(4)逆電子要請型ディールス・アルダー(iEDDA)反応:リンクアームの遊離末端と機能成分のうちの１つは、テトラジン基を有し、もう１つは、シクロオクテン基を有する。iEDDA反応をスキーム2に示す。
(5)歪み促進型アジド-アルキンクリックケミストリー(SPAAC)反応:リンクアームの遊離末端と機能成分のうちの１つは、アジド基を有し、もう1つは、シクロオクチン基を有する。SPAAC反応をスキーム3に示す。
<<スキーム1 CuAAC反応>>
<<スキーム2 iEDDA反応>>
<<スキーム3 SPAAC反応>>
CuAAC反応により、1,5-二置換-1,2,3-トリアゾールが得られる。アルキンとアジドとの間の反応は、非常に選択的であり、天然の生体分子の中にアルキン基及びアジド基は存在しない。さらに、この反応は迅速かつpH非感受性である。クリック反応を触媒するために、臭化第一銅又はヨウ化第一銅のような銅(I)を使用する代わりに、銅(II)と、還元剤、例えば、アスコルビン酸ナトリウムとの混合物を使用して、反応混合物中のその場で銅（I）を生成することがより好ましい。或いは、第２成分は、銅フリー反応により、本発明の中心コアのN末端又はC末端に結合され得る。この銅フリー反応において、ペンタメチルシクロペンタジエニルルテニウムクロライド錯体を触媒として使用して、アジド-アルキンクリックケミストリーを触媒する。
説明の便宜上、リンクアームに結合される機能成分を第１成分と呼ぶ。理解され得るように、本発明のリンカーユニットが有する第１成分の数は、中心コアのK残基の数(そのため、リンクアームの数)により決定される。従って。当業者であれば、必要に応じて、例えば、所望の標的化又は治療効果を達成するために、リンカーユニットの第１成分の数を調整することができる。
第１成分を有するリンカーユニット10Dの例を図1Dに示す。後述の特徴以外、図1Dは図1Bと同様である。第一に、中心コア11dに5つのK残基があり、5つのリンクアーム20a-20eがそれぞれそれらのK残基に結合される。第二に、リンカーユニット10Dは各リンクアーム20a-20eに結合される5つの第１成分30a-30eを有する。以下に述べるように、必要に応じて使用されるテトラジン基72は、追加の機能成分、別の分子構築物(以下のパートII又はパートIIIを参照)との結合を可能にする。
図1Eは、別の例を提供する。ここで、リンカーユニット10Eは、リンクアーム21a-21eは、それぞれその成分結合末端(即ち、第１成分30a-30eのそれぞれに結合される末端)にジスルフィド結合を有する以外、リンカーユニット1Dに類似する構造を有する。
或いは、本発明のリンカーユニットは、複数の連結アームをさらに含む。各連結アームは、一端に官能基(即ち、マレイミド、NHS、アジド、アルキン、テトラジン、又は歪んだアルキン基)を有し、他端にNHS基又はマレイミド基を有する。第１成分とリンクアームとの間で起きる反応に類似する反応により、連結アームは、対応する官能基を介して、アミド結合を形成すること、又はチオール-マレイミド、CuAAC、iEDDA若しくはSPAAC反応によりリンクアームに結合され得る。従って、リンクアームに結合される連結アームは、その遊離末端(又は、成分結合末端；即ち、リンクアームに結合されていない末端)にNHS基又はマレイミド基を有する。第１成分は、アミド結合を形成すること、又はチオール-マレイミド反応により連結アームの成分結合末端に結合される。
図1Fにおいて、図1Dに示すように、リンクアームは、中心コア11dのK残基に結合される。リンカーユニット10Dと比較して、リンカーユニット10Fは、SPAAC反応によりリンクアーム22に結合される連結アーム25をさらに含む。第１成分30は、アミド結合の形成又はチオール-マレイミド反応により連結アーム25に結合される。図1Fのダイヤモンド90は、リンクアーム22と連結アーム25との間で起きるSPAAC反応から生じる化学結合を表す。
本開示のいくつかの実施形態によれば、連結アームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。或いは、連結アームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であり、且つその成分結合末端(即ち、リンクアームに結合されていない遊離末端)にジスルフィド結合を有する。
一実施例において、連結アームは、３つのEGの繰り返し単位を有し、且つ連結アームの遊離末端(成分結合末端とも呼ばれる)にジスルフィド結合を有する。この場合に、連結アームの成分結合末端に結合される第１成分は、還元剤の処理により、本発明のリンカーユニットから効率的に遊離させることができる。
本開示のいくつかの好ましい実施形態によれば、第１成分は、フィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩、インターフェロン-β、又はインテグリン-α4、β-アミロイド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質に特異的な一本鎖可変領域断片(scFv)である。
ウイルスタンパク質は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のFタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスI型(HIV-1)のgp120タンパク質、A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンA（HA）タンパク質、及びサイトメガロウイルスの糖タンパク質を含むが、これらに限定されない。
細菌タンパク質の例は、グラム陰性菌のエンドトキシン、クロストリジウム・ディフィシルの表面抗原、黄色ブドウ球菌のリポテイコ酸、炭疽菌の炭疽毒素、又は大腸菌の志賀毒素I型若しくはII型を含むが、これらに限定されない。
所望の効果(例えば、治療効果)を向上させるために、本発明のリンカーユニットは、上記第１成分に加えて、第２成分をさらに含み得る。例えば、第２成分は、標的化成分又はエフェクター成分であり得る。本開示の任意の実施形態において、第１成分は、エフェクター成分であり、第２成分は、第１成分と相加的若しくは相乗的、又は第１成分と独立して作用する別のエフェクター成分であり得る。必要に応じて、第１成分及び第２成分は、異なる特性を示す。例えば、第１成分は、標的化成分であり、第２成分は、エフェクター成分であり、その逆もまた然りである。或いは、第１成分は、エフェクター成分であり、第２成分は、リンカーユニットの溶解性、クリアランス、半減期、及び生物学的利用能等の薬物動態学的特性を改善させる成分である。特定の第１成分及び/又は第2成分の選択は、本発明のリンカーユニット(又はマルチアームリンカー)が使用される予定の用途に依存する。これらの機能成分の例は、本明細書のパートI（iii）で後述する。
構造上、第２成分は、中心コアのN末端又はC末端にあるアジド基、アルキン基、テトラジン基若しくは歪んだアルキン基に結合される。具体的には、必要に応じて、第２成分を短いPEG鎖(好ましくは、2-12個のEGの繰り返し単位を有する)に結合した後、アジド基若しくはアルキン基を有するN末端又はC末端アミノ酸残基(例えば、AHA残基又はHPG残基)に結合してもよい。或いは、必要に応じて、第２成分を短いPEG鎖に結合した後、中心コアのカップリングアームに結合してもよい。
本開示のいくつかの実施形態によれば、中心コアは、そのN末端又はC末端に、アジド基(例えば、AHA残基)を有するアミノ酸残基を含む。従って、アルキン基を有する第２成分は、CuAAC反応により中心コアのN末端又はC末端に結合される。本開示の他の実施形態によれば、中心コアは、そのN末端又はC末端に、アルキン基(例えば、HPG残基)を有するアミノ酸残基を含む。それにより、アジド基を有する第２成分は、CuAAC反応により中心コアのN末端又はC末端に結合可能となる。
図1Gは、複数の第１成分及び1つの第２成分を有する本発明のリンカーユニット10Gの例を示す。この例において、中心コア11cは、1つのHPG(GHP)残基及び5つのリジン(K)残基を含む。5つのリンクアーム20a-20eは、それぞれ中心コア11cの5つのK残基に結合される。5つの第１成分30a-30eは、それぞれチオール-マレイミド反応により上記5つのリンクアーム20a-20eに結合される。上記第１成分に加えて、リンカーユニット10Gは、短いPEG鎖62の1つの末端に結合される1つの第２成分50をさらに含む。中心コア11cとの結合前に、短いPEG鎖62のもう1つの末端にアジド基を有する。このように、アジド基は、CuAAC反応により、アルキン基を有するHPG残基と反応できることにより、第２成分50は、中心コア11cに結合される。図1Gにおけるソリッドドット40は、HPG残基とアジド基との間で起きるCuAAC反応から生じる化学結合を表す。
或いは、第２成分は、カップリングアームを介して中心コアに結合される。本開示の特定の実施形態によれば、カップリングアームは、iEDDA反応によりTCO基を有する第２成分に効率的に結合可能なテトラジン基を有する。本開示の他の実施形態によれば、カップリングアームは、iEDDA反応によりテトラジン基を有する第２成分に結合可能なTCO基を有する。iEDDA反応において、末端アルキン基よりも、活性化エネルギーが顕著に低い歪んだシクロオクテン基を採用するため、外因性触媒を使用する必要がない。
図1Hに示すように、リンカーユニット10Hの中心コア11dは、末端システイン(C)残基及び５つのリジン(K)残基を含む。また、図1Hに示すように、５つのリンクアーム20a-20eは、それぞれ中心コア11dの５つのK残基に結合され、且つ、５つの第１成分30a-30eは、それぞれチオール-マレイミド反応により５つのリンクアーム20a-20eに結合される。システイン残基は、カップリングアーム60に結合される。該システイン残基は、第２成分と結合する前に、その遊離末端にテトラジン基又はTCO基を有する。この例において、対応するTCO基又はテトラジン基を有する短いPEG鎖62に結合される第２成分50は、iEDDA反応によりカップリングアーム60に結合され得る。図1Hにおける楕円70は、カップリングアーム60と短いPEG鎖62との間で起きるiEDDA反応から生じる化学結合を表す。
本開示の他の実施形態によれば、第２成分と結合する前に、カップリングアームは、アジド基を有する。そのように、カップリングアームは、SPAAC反応(スキーム3を参照)により、短いPEG鎖の遊離末端にシクロオクチン基(例えば、DBCO、DIFO、BCN、又はDICO基)を有する第２成分に結合されることができ、その逆もまた然りである。
図1Iにおいて、リンカーユニット10Iは、カップリングアーム60が、テトラジン基又はTCO基の代わりに、アジド基又はシクロオクチン基(例えば、DBCO基、DIFO基、BCN基、又はDICO基)を有する以外、図1Hのリンカーユニット10Hと類似する構造を有する。従って、短いPEG鎖62に結合される第２成分50は、対応するシクロオクチン基(例えば、DBCO基、DIFO基、BCN基、又はDICO基)又はアジド基を有することで、SPAAC反応によりカップリングアーム60に結合することができる。図1Iにおけるダイヤモンド90は、カップリングアーム60と短いPEG鎖62との間で起きるSPAAC反応から生じる化学結合を表す。
スキーム4は、本発明のリンカーユニットの調製プロセスの例示である。ステップ1において、中心コアを調製する。該中心コアは、(GSK)3のアミノ酸配列を含み、且つ中心コアのC末端にL-アジドホモアラニン(AHA)残基を有する。ステップ2において、NHS基とアミン基との間にアミド結合を形成することにより、3つのリンクアームをそれぞれ中心コアのリジン(K)残基に結合する。中心コアに結合されるリンクアームは、その遊離末端にマレイミド(Mal)基を有する。ステップ3において、チオール-マレイミド反応により、3つの抗A抗原scFv(scFv α A)を第１成分として、それぞれリンクアームに結合する。ステップ4において、1つの抗B抗原scFv(scFv α B)を第２成分として短いPEG鎖に結合する。該短いPEG鎖は、4つのEGの繰り返し単位を含み、且つその遊離末端にDBCO基を有する。最後に、ステップ5において、SPAAC反応により第２成分を中心コアのAHA残基に結合する。
<<スキーム4 リンクアーム及びC末端アミノ酸残基を介して2つの異なるscFvを結合するリンカーユニットの調製>>
スキーム5は、本発明のリンカーユニットの調製プロセスの別の例を例示する。ステップ1において、中心コアを調製する。該中心コアは、(K-Xaa)3のアミノ酸配列を含み、且つ中心コアのC末端にシステイン残基を有する。ステップ2において、チオール-マレイミド反応によりPEG鎖を（カップリングアームとして)システイン残基に結合する。該PEG鎖は、その1つの末端にマレイミド(Mal)基を有し、もう1つの末端にテトラジン基を有する。ステップ3において、3つのリンクアームをそれぞれ中心コアのリジン(K)残基に結合する。さらに、ステップ4で説明したように、チオール-マレイミド反応により、3つの抗A抗原scFv(scFv α A)を第１成分としてそれぞれリンクアームに結合する。ステップ5において、1つの抗B抗原scFv(scFv α B)を第２成分として短いPEG鎖に結合する。該短いPEG鎖は、3つのEGの繰り返し単位を含み、且つPEG鎖の遊離末端にTCO基を有する。最後に、ステップ6において、iEDDA反応により第２成分をカップリングアームに結合する。
<<スキーム 5 リンクアーム及びカップリングアームを介して2つの異なるscFvを結合するリンカーユニットの調製>>
PEG化は、PEG鎖を分子（例えば、薬物又はタンパク質）に結合又は連結するプロセスである。PEG化は、未修飾形態よりもいくつかの有意な薬理学的利点、例えば、溶解性の改善、安定性の向上、循環寿命の延長、及びタンパク質分解の減少を与えることが知られている。本開示の一実施形態によれば、第２成分は、分子量が約20,000〜50,000ダルトンのPEG鎖である。
図1Jは、本発明のリンカーユニット(リンカーユニット10J)の別の例を示す。ここで、5つの第１成分30は、それぞれリンクアーム20を介してリジン残基に結合される。中心コア11eのHPG (GHP)残基は、CuAAC反応によりPEG鎖80に結合される。図1Jにおけるソリッドドット40は、HPG残基とPEG鎖80との間で起きるCuAAC反応から生じる化学結合を表す。
図1Kは、本開示の別の例を提供する。ここで、中心コア11dのN末端は、カップリングアーム60に結合されるシステイン残基である。iEDDA反応により、PEG鎖80をカップリングアーム60に効率的に結合することができる。リンカーユニット10Kの楕円70は、カップリングアーム60とPEG鎖80との間で起きるiEDDA反応から生じる化学結合を表す。
図1Lは、本発明のリンカーユニットの別の例を提供する。ここで、リンカーユニット10Lは、PEG鎖80がSPAAC反応によりカップリングアーム60に結合される以外、図1Jのリンカーユニット10Jと類似する構造を有する。図1Lにおけるダイヤモンド90は、カップリングアーム60とPEG鎖80との間で起きるSPAAC反応から生じる化学結合を表す。
本開示のいくつかの実施形態によれば、第１成分及び第２成分に加えて、本発明のリンカーユニットは、第３成分をさらに含む。この場合に、中心コアのN末端及びC末端のうちの一方は、アジド基又はアルキン基を有するアミノ酸であり、中心コアのN末端及びC末端のうちの他方は、システイン残基である。中心コアのリジン残基は、ぞれぞれリンクアームに結合される。各リンクアームは、その遊離末端にマレイミド基を有する。中心コアのシステイン残基は、カップリングアームに結合される。該カップリングアームは、その遊離末端にテトラジン基又は歪んだアルキン基を有する。それにより、上述したように、第１成分は、チオール-マレイミド反応によりリンクアームに結合され、第２成分は、iEDDA反応によりカップリングアームに結合される。さらに、第３成分は、CuAAC反応又はSPAAC反応によりアジド基又はアルキン基を有する末端アミノ酸に結合される。
図1Mのリンカーユニット10Mにおいて、中心コア11fは、そのN末端にHPG(GHP)残基を有し、そのC末端にシステイン残基を有する。リンクアーム20及びカップリングアーム60は、それぞれ中心コア11fのリジン(K)残基及びシステイン(C)残基に結合される。さらに、５つの第１成分30は、それぞれ５つのリンクアーム20に結合され、第２成分(即ち、PEG鎖)80は、カップリングアーム60に結合され、第３成分50は、短いPEG鎖62を介してHPG残基に結合される。ソリッドドット40は、HPG残基と短いPEG鎖62との間で起きるCuAAC反応から生じる化学結合を表す。楕円70は、カップリングアーム60とPEG鎖80との間で起きるiEDDA反応から生じる化学結合を表す。
図1Nは、本開示の別の実施形態を提供する。ここで、リンカーユニット10Nは、iEDDA反応の代わりに、SPAAC反応により短いPEG鎖62がHPG残基に結合される以外、図1Mのリンカーユニット10Mと類似する構造を有する。図1Nにおけるダイヤモンド90は、短いPEG鎖62とHPG残基との間で起きるSPAAC反応から生じる化学結合を表す。
本開示の好ましい実施形態において、リンクアームは、チオール-マレイミド反応によりスルフヒドリル基を有する第１成分に結合するために、遊離末端にマレイミド基を有する。また、第２成分に結合するために、ペプチドコアの1つの末端にシステイン残基、又はアジド基若しくはアルキン基を有するアミノ酸残基があることで、カップリングアームに結合される。
当業者であれば、上述した構造について様々な変更を施すことができる。リンクアームの遊離末端に、マレイミド基以外の連結基、例えば、アジド基、アルキン基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基を使用することにより、CuAAC、iEDDA、又はSPAAC反応により第１成分と結合することができる。また、ペプチドコアのシステイン残基(又は、アジド基若しくはアルキン基を有するアミノ酸残基)をN末端又はC末端に位置させる必要がない。さらに、2つ以上の上記残基をペプチドコアに導入することにより、複数のカップリングアームを結合することができ、それにより、複数の第２成分と結合する。
I-(ii)マルチアームリンカーに使用される化合物コア
本明細書において、本開示のパートI-(i)で説明したリンカーユニットに加えて、ポリペプチドの代わりに、化合物を中心コアとして用いた別のリンカーユニットも開示する。具体的には、該化合物は、ベンゼン-1,3,5-トリアミン、2-(アミノメチル)-2-メチルプロパン-1,3-ジアミン、トリス(2-アミノエチル)アミン、ベンゼン-1,2,4,5-テトラアミン、3,3',5,5'-テトラアミン-1,1'-ビフェニル、テトラキス(2-アミノエチル)メタン、テトラキス-(エチルアミン)ヒドラジン、N,N,N',N',-テトラキス(アミノエチル)エチレンジアミン、ベンゼン-1,2,3,4,5,6-ヘキサアミン、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-ヘキサキス(メチルアミン)-ベンゼン-1,3,5-トリアミン、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-オクタキス(メチルアミン)-ベンゼン-1,2,4,5-トリアミン、ベンゼン-1,2,3,4,5,6-ヘキサアミン、又はN,N-ビス[(1-アミノ-3,3-ジアミノエチル)ペンチル]-メタンジアミンである。各化合物は、同一又は対称的な立体配置で３つ以上のアミン基を有する。従って、化合物の１つのアミン基がカップリングアームに結合された場合に、化合物の分子のすべては、同一の立体配置を有する。
本開示のパートI-(i)に記載の連結のメカニズムと同様に、上記の化合物が複数のアミン基を含むため、NHS基を有する複数のPEG鎖は、アミン基とNHS基との間にアミド結合を形成することにより該化合物に結合することができる。このように結合されるPEG鎖は、その遊離末端に官能基(例えば、NHS、マレイミド、アジド、アルキン、テトラジン、シクロオクテン、又はシクロオクチン基)を有し、リンクアームとされる。一方、化合物コアの少なくとも1つのアミン基は、１つの末端にNHS基を有し、もう1つの末端に官能基(例えば、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基又はシクロオクチン基)を有する他のPEG鎖に結合される。このように結合されるPEG鎖は、その遊離末端に官能基を有し、カップリングアームとされる。
従って、第１成分は、(1)アミド結合を形成すること；(2)チオール-マレイミド反応；(3)CuAAC反応；(4)iEDDA反応：又は(5)SPAAC反応によりリンクアームに結合され得る。一方、第2成分は、CuAAC、iEDDA又はSPAAC反応によりカップリングアームに結合され得る。
本開示のいくつかの実施形態によれば、リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。好ましくは、リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であり、且つその遊離末端(即ち、中心コアに結合されていない末端)にジスルフィド結合を有する。カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位のを有するPEG鎖である。一実施形態において、リンクアーム及びカップリングアームは、両方とも12個のEGの繰り返し単位を有する。ここで、カップリングアームの一端は、NHS基であり、カップリングアームの他端は、アルキン基である。
本開示の別の実施形態によれば、リンカーユニットは、複数の連結アームをさらに含む。各連結アームは、各リンクアームに結合される。複数の第１成分は、それぞれ複数の連結アームに結合される。一実施形態において、連結アームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。別の実施形態において、連結アームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であり、且つリンクアームに結合されていない成分結合末端にジスルフィド結合を有する。
スキーム6、7は、それぞれ中心化合物コアとリンクアーム、及び中心化合物コアとカップリングアームとの間の結合を示す。スキーム6、7において、NHSエステルを示し、Malは、マレイミド基を示し、azideは、アジド基を示し、alkyneは、アルキン基を示す。
中心コアとなる化合物において、複数のNH2基が対称で同一の方向で存在することを必要とするのは、 以下の理由による。即ち、1つのNH2基を用いてN-ヒドロキシスクシンイミジル基(NHS)、エステル基及びアルキン基、アジド基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基を介して二官能性リンクアームと結合する場合に、生成物であるアルキン基、アジド基、テトラジン基又は歪んだアルキン基を有するカップリングアームを含む中心コアは、均質であり、且つ精製され得る。このような生成物を用いて、さらにマルチアームリンカーユニットを調製することができる。該マルチアームリンカーユニットの他のすべてのNH2基は、他の末端にマレイミド基又は他のカップリング基を有するリンクアームに結合される。非対称方向で複数のNH2基を有する化合物の場合に、1つの二官能性リンクアーム/カップリングアームを有する生成物は、均質ではない。
<<スキーム 6 それぞれマレイミド基及びアジド基を有するリンクアーム及びカップリングアームの中心コアへの結合>>
<<スキーム 7 それぞれマレイミド基及びアルキン基を有するリンクアーム及びカップリングアームの中心コアへの結合>>
これらの対称化合物のいくつは、より多くのリンクアーム/カップリングアームを有する中心コアを提供するようにさらに修飾されることができる。例えば、通常の化合物から合成、又は商業的に入手可能なテトラキス(2-アミノエチル)メタンをコアとして用いて、4つのリンクアーム/カップリングアームを有するリンカーユニットを構築することができる。テトラキス(2-アミノエチル)メタンをビス(スルホスクシンイミジル)スベレートと反応させることにより、2つのテトラキス(2-アミノエチル)メタン分子の縮合生成物を生成することができる。該縮合生成物をコアとして用いて、6つのリンクアーム/カップリングアームを有するリンカーユニットを構築することができる。それぞれ3つのリンクアーム/カップリングアーム、4つのリンクアーム/カップリングアーム及び6つのリンクアーム/カップリングアームを有するリンカーユニットは、ジョイント-リンカー構成を有する標的化/エフェクター分子の構築に対する要求の大部を満たすことができる。
理解され得るように、リンクアーム及び/又はカップリングアーム、並びにそれに結合される成分は、中心コアに含まれるアミン基の数によって変化できる。いくつかの好ましい実施形態において、リンクアーム/カップリングアーム、及びそれに結合される結合成分の数は、約1-7である。
図2に、4つのアミン基を有するベンゼン-1,2,4,5-テトラアミンが示される。これらのアミン基の3つは、それぞれリンクアーム20に結合され、これらのアミン基の1つは、遊離末端にアジド基を有するカップリングアーム60に結合される。3つの第１成分30は、それぞれチオール-マレイミド反応により3つのリンクアーム20に結合される。1つの第２成分50は、CuAAC反応によりカップリングアーム60に結合される。図2におけるソリッドドット40は、カップリングアーム60と第２成分50との間で起きるCuAAC反応から生じる化学結合を表す。
I-(iii)マルチアームリンカーに適用される機能成分
リンカーユニット(又はマルチアームリンカー)が第２及び/又は第3成分を含まず、第１成分のみを含む場合に、第１成分は、被験体において治療効果を発揮できるエフェクター成分である。一方、本発明のリンカーユニットは、第１成分に加えて別の成分を含む場合に、少なくとも1つの該成分は、エフェクター成分であり、他の成分は、別のエフェクター成分、標的化成分、又はリンカーユニットの1つ以上の薬物動態特性(例えば、溶解性、クリアランス、半減期、及び生物学的利用能)を向上できる成分であり得る。例えば、リンカーユニットは、2つの異なる種類のエフェクター成分；１つのエフェクター成分及び１つの標的化成分又は１つの薬物動態特性向上成分；2つの異なる種類の標的化成分及び１種類のエフェクター成分；2つの異なる種類のエフェクター成分及び１種類の標的化成分；又は１種類の標的化成分、１種類のエフェクター成分、及び１種類のリンカーユニットの薬物動態特性を改善できる成分を含み得る。
本開示の特定の実施形態によれば、標的化成分又はエフェクター成分は、フィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩、インターフェロン-β、又はインテグリン-α4、β-アミロイド、ウイルスタンパク質若しくは細菌タンパク質に特異的な一本鎖可変領域断片(scFv)である。
ウイルスタンパク質の例は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のFタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスI型(HIV-1)のgp120タンパク質、A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンA（HA）タンパク質、及びサイトメガロウイルスの糖タンパク質を含むが、これらに限定されない。
細菌タンパク質の例示的な例は、グラム陰性菌のエンドトキシン、クロストリジウム・ディフィシルの表面抗原、黄色ブドウ球菌のリポテイコ酸、炭疽菌の炭疽毒素、及び大腸菌の志賀毒素I型若しくはII型を含む。
リンカーユニットの1つ以上の薬物動態特性を向上させる成分は、分子量20,000〜50,000ダルトンの長いPEG鎖であり得る。
特定疾患を治療するための本発明のマルチアームリンカーに導入される機能成分の特定の例は、後述する。
CNS疾患、例えば、多発性硬化症を治療するために、１つの例示的なリンカーユニットは、フィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩、インターフェロン-β、又はインテグリン-α4に特異的なscFvを第１成分(エフェクター成分)として使用することができる。アルツハイマー病を治療するために、本発明のリンカーユニットは、β-アミロイドに特異的なscFvを第１成分(エフェクター成分)として使用することができる。必要に応じて、多発性硬化症、アルツハイマー病、又は他のCNS疾患を治療するためのリンカーユニットは、第2成分であるトランスフェリン受容体に特異的なscFvを標的化成分としてさらに含み得る。
同様に、ウイルス又は細菌に引き起こされる感染を治療するために、ウイルス又は細菌タンパク質に特異的なscFvを標的化成分(第１成分)として使用することができる。この場合に、リンカーユニットは、必要に応じて第2成分、例えば、CD32又はCD16bに特異的なscFvをエフェクター成分として含み得る。
I-(iv)マルチアームリンカーの使用
本開示は、また、適切な リンカーユニットを用いて様々な疾患を治療するための方法に関する。一般的に、該方法は、治療を必要とする被験体に有効量の本開示の実施形態に係るリンカーユニットを投与するステップを含む。
従来の治療用構築物と比較して、パートIで説明した本発明のリンカーユニットは、2点で有利である。
(1)機能成分の数は、必要又は用途に応じて調整することができる。本発明のリンカーユニットは、適用要件(例えば、治療される疾患、本発明のリンカーユニットの投与経路、本発明のリンカーユニットが有する抗体の結合活性及び/又は親和性)に応じて、2つの成分(即ち、第１成分及び第２成分)又は３つの成分(即ち、第１成分、第２成分、及び第３成分)を含むことができる。例えば、本発明のリンカーユニットを組織/器官(例えば、目の治療)に直接送達する場合に、化標的成分としての第２成分を必要とせず、エフェクター成分だけで十分である。しかし、本発明のリンカーユニットを周辺的に（例えば、経口、経腸、鼻、局所、経粘膜、筋肉内、静脈内、又は腹腔内注射）送達する場合に、本発明のリンカーユニットは、本発明のリンカーユニットを病変部位に標的化する標的化成分、及び病変部位で治療効果を発揮するエフェクター成分を同時に含む必要がある。本発明のリンカーユニットの標的化効果若しくは治療効果、又は安定性を向上させるために、本発明のリンカーユニットに、第３成分(例えば、第２標的化成分、第２エフェクター成分、又はPEG鎖)をさらに含むことができる。
(2)第１成分は、バンドルの形で提供される。上述したように、第１成分の数は、中心コアに含まれるリジン残基の数によって変化する。中心コアにおけるリジン残基の数が2〜15である場合に、各リンカーユニットに少なくとも2つの第１成分を含み得る。このように、従来の治療用構築物又は方法のように単一分子(例えば、細胞毒性薬物及び抗体)を提供する代わりに、本発明のリンカーユニットは、一度により多くの機能成分(標的化成分又はエフェクター成分)を提供することができ、それによって、治療効果が大きく改善される。
特定の治療用途において、シングルコピーの標的化成分又はエフェクター成分を有することが望ましい。例えば、シングルコピーの標的化成分は、過度に緊密な結合による望ましくない影響を避けるために使用することができる。この考察は、scFvが標的抗原に対して比較的高い親和性を有する場合、及び標的抗原が標的細胞ではない正常細胞上の細胞表面抗原である場合に関連する。一例において、CD3又はCD16に特異的なscFvを用いて、T細胞又はNK細胞を標的細胞（例えば、グレーブス病患者の甲状腺細胞）を殺すように動員する場合に、CD3又はCD16aに特異的なシングルコピーのscFvが望ましい。 それにより、CD3又はCD16aの架橋による望ましくない影響を回避することができる。同様に、CD32又はCD16bに特異的なscFvを用いて、抗体結合ウイルス若しくは細菌粒子、又はそれらの生成物を除去するように貪食好中球及びマクロファージを動員する場合に、シングルコピーのscFvが望ましい。また、トランスフェリン受容体に特異的なscFvを用いてエフェクター薬物分子をBBBに運んでCNS疾患を治療する場合に、シングルコピーのトランスフェリン受容体に特異的なscFvが望ましい。別の例では、薬物動態特性を高めるために長鎖PEGをシングルコピーだけ有することが望ましい。2つ以上の長いPEG鎖は、もつれを引き起こし、標的化成分又はエフェクター成分の結合特性に影響を与える恐れがある。
パートII：特定疾患を治療するためのジョイント-リンカー分子構築物
本開示の別の態様は、少なくとも2つのリンカーユニットを含む分子構築物に関する。ここで、１つのリンカーユニットは、1つ以上の標的化成分を担持し、別のリンカーユニットは、1つ以上のエフェクター成分又は薬物動態特性向上成分を担持する。本開示において、標的化部分及びエフェクター部分(治療的又は薬物動態学的なもの)の両方を有する分子構築物は、ジョイント-リンカー分子構築物と呼ばれる。本開示の様々な実施形態によれば、このようなジョイント-リンカー分子構築物に含まれる各リンカーユニットは、本開示のパートIに記載されているペプチドコアに基づくマルチアームリンカー又は化合物コアに基づくマルチアームリンカーであり得る。本開示の特定の実施形態によれば、本発明の分子構築物の少なくとも1つのリンカーユニットは、ポリペプチドコアを含む。好ましくは、本発明の分子構築物の少なくとも2つのリンカーユニットは、ポリペプチドコアを含む。さらに好ましくは、本発明の分子構築物のすべてのリンカーユニットは、それぞれポリペプチドコアを含む。
II-(i)ジョイント-リンカー分子構築物の構造
本開示のいくつかの実施形態によれば、分子構築物は、2つのリンカーユニットを含む。該リンカーユニットは、CuAAC反応(銅又はクロロペンタメチルシクロペンタジエニルルテニウム複合体を触媒として使用する)、SPAAC反応、又はiEDDA反応により互いに結合される。この実施形態において、1つのリンカーユニットは、標的化成分となる複数の第１成分に結合される。他のリンカーユニットは、エフェクター成分となる複数の第２成分に結合される。
本開示の他の実施形態によれば、分子構築物は、３つのリンカーユニットを含む。ここで、第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、iEDDA反応により互いに結合され、第３リンカーユニットは、CuAAC反応により第１リンカーユニット又は第２リンカーユニットに結合される。或いは、第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、iEDDA反応により互いに結合され、第３リンカーユニットは、SPAAC反応により第１リンカーユニット又は第２リンカーユニットに結合される。この実施形態において、第１、第２及び第３リンカーユニットは、それぞれ複数の第１、第２及び第３成分を有する。ここで、第１、第２及び第３成分は異なる。一実施形態によれば、３つの成分(即ち、第１、第２及び第３成)のうちの２つは、標的化成分であり、１つは、エフェクター成分である。別の実施形態によれば、３つの成分のうちの２つは、エフェクター成分であり、１つは、標的化成分である。別の実施形態によれば、３つの成分のうちの１つは、標的化成分であり、１つはエフェクター成分であり、もう１つは分子構築物の溶解性、クリアランス、半減期、及び生物学的利用能等の薬物動態学的特性を改善することができる成分である。
図3A-3Dは、２つのリンカーユニット間の結合を示す。 図3Aは、iEDDA反応により互いに結合される２つのリンカーユニット(100A、200A)を含む分子構築物を示す。第１リンカーユニット100Aは、第１中心コア110a、リンクアーム120(第１リンクアームとして)、及びカップリングアーム 130a(第１カップリングアームとして)を有し、リンクアーム及びカップリングアームは、それぞれ１つの末端が第１中心コア110aに結合される。同様に、第２リンカーユニット200Aは、第２中心コア 210a、リンクアーム 220(第２リンクアームとして)、及びカップリングアーム230a(第２カップリングアームとして)を有し、リンクアーム及びカップリングアームは、それぞれ１つの末端が第２中心コア210aに結合される。カップリングアーム130a、230aの１つは、その遊離末端にテトラジン基を有し、カップリングアーム130a、230aのもう１つは、TCO基を有する。具体的には、カップリングアーム130aがその遊離末端(即ち、第１中心コア110aに結合されていない末端)にテトラジン基152を有する場合に、カップリングアーム230aは、その遊離末端(即ち、第２中心コア210aに結合されていない末端)にTCO基154を有する。その逆もまた然りである。従って、２つのリンカーユニット(100A、200A)は、カップリングアーム130a、230aのそれぞれの遊離末端の間で起きるiEDDA反応により互いに結合される。図3Aにおける楕円156は、カップリングアーム130a、230aの間で起きるiEDDA反応から生じる化学結合を表す。
図示の実施形態において、リンクアーム120、220のそれぞれは、その遊離末端にマレイミド基を有する。従って、第１標的化成分140及び第１エフェクター成分240は、それぞれチオール基を有し、チオール-マレイミド反応によりリンクアーム120、220に結合される。
一実施形態によれば、図3Aにおける第１中心コア110a及び第２中心コア210は、両方ともポリペプチドコアである。別の実施形態によれば、図3Aにおける第１中心コア110a及び第２中心コア210aは、化合物コアである。別の実施形態によれば、図3Aにおける第１中心コア110a及び第２中心コア210の１つは、ポリペプチドコアであり、図3Aにおける第１中心コア110a及び第２中心コア210aのもう１つは、化合物コアである。
図3Bは、本開示の代替の実施形態を提供する。図３Bにおいて、第１中心コア110b及び第２中心コア210bは、両方ともポリペプチドコアであり、それぞれリンクアーム120、220により第１標的化成分140及び第１エフェクター成分240に結合される。この実施形態のユニークな特徴は、中心コア110b、210bの１つがN末端又はC末端にアジド基(例えば、AHA残基)を有するアミノ酸残基を含み、中心コア110b、210bのもう１つは、N末端又はC末端にアルキン基(例えば、HPG残基)を有するアミノ酸残基を含むことである。このような構成により、中心コア110a、210が互いに直接結合されることを可能にする。即ち、図3Aに示すようにカップリングアームを介せず結合される。具体的には、中心コア110bがN末端又はC末端にアジド基162を有するアミノ酸残基を含む場合に、中心コア210bは、N末端又はC末端にアルキン基164を有するアミノ酸残基を含み、その逆もまた然りである。したがって、リンカーユニット100B、200Bは、中心コア110b、210bのN末端又はC末端アミノ酸残基の間で起きるCuAAC反応により互いに直接結合されることができる。図3Bにおけるソリッドドット166は、N末端又はC末端アミノ酸残基の間で生じる化学結合を表す。
図3Cは、本開示の別の実施形態である。リンカーユニット100C、200Cは、カップリングアーム130b、230bが、図3Aのリンカーユニット100A、200Aに示すようなアジド基152及びアルキン基154の代わりに、それぞれアジド基162及びDBCO基172を有する以外、リンカーユニット100A、200Aと類似する構造を有する。具体的には、中心コア110aは、遊離末端にアジド基162を有するカップリングアーム130b(第１カップリングアームとして)に結合され、中心コア210aは、遊離末端にDBCO基172を有するカップリングアーム 230b(第２カップリングアームとして)に結合される。リンカーユニット100C、200Cは、さらに、カップリングアーム130b、230bの間で起きるSPAAC反応により連結され、ダイアモンドに示される化学結合182を形成する。
一実施形態において、図3Cにおける第１中心コア110a及び第２中心コア210aは、共にポリペプチドコアである。別の実施形態において、図3Cにおける第１中心コア110a及び第２中心コア210aは、共に化合物コアである。別の実施形態において、図3Cにおける第１中心コア110a及び第２中心コア210aの１つは、ポリペプチドコアであり、図3Cにおける第１中心コア110a及び第２中心コア210aのもう１つは、化合物コアである。
理解され得るように、２つのリンカーユニットは、中心コアとカップリングアームとの間で起きるCuAAC反応により、互いに結合されることができる。図3Dにおいて、中心コア110bは、アジド基 162(例えば、AHA残基)を有するN末端又はC末端アミノ酸残基を含み、中心コア210aは、遊離末端にTCO基172を有するカップリングアーム230bに結合される。従って、リンカーユニット100B、200Cは、中心コア110bとカップリングアーム230bとの間で起きるSPAAC反応により連結され、化学結合182を形成する。
一実施形態によれば、図3Dにおけるリンカーユニット100B、200Cは、それぞれポリペプチドコアを含む。別の実施形態によれば、図3D における中心コア100Bは、ポリペプチドコアであり、図3Dにおける中心コア200Cは、化合物コアである。
或いは、アルキン基 (例えば、HPG残基)を有するN末端又はC末端アミノ酸残基を含むリンカーユニット、及び遊離末端にアジド基を有するカップリングアームを含むリンカーユニットは、中心コアとカップリングアームとの間で起きるアジド-アルキン環化付加により、一緒に連結されることができる。
理解されるように、本発明の分子構築物の少なくとも1つのリンカーユニットは、連結アームをさらに含み得る。ここで、パートIに記載されるように、連結アームの一端は、リンクアームに結合され、他端は、機能成分(標的化成分又はエフェクター成分)に結合される。例えば、本発明の分子構築物は、２つのリンカーユニットを含み得る。ここで、第１成分は、第１リンクアームに直接結合され、第2成分は、連結アームを介して第2リンクアームに結合される。或いは、本発明の分子構築物は、２つのリンカーユニットを含み得る。ここで、第１成分及び第2成分は、それぞれ第１連結アーム及び第2連結アームを介して第１リンクアーム及び第2リンクアームに結合される。
好ましくは、第１リンクアーム及び第2リンクアームの少なくとも1つがCuAAC又はSPAAC反応により連結アーム/機能成分に結合される場合に、第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットは、iEDDA反応により互いに結合される。或いは、第１リンクアーム及び第2リンクアームの少なくとも1つがiEDDA反応により連結アーム/機能成分に結合される場合に、第1リンカーユニット及び第2リンカーユニットは、CuAAC又はSPAAC反応により互いに結合される。
いくつかの実施形態によれば、連結アームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である。他の実施形態によれば、連結アームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であり、且つ、リンクアームに結合されていない成分結合末端にジスルフィド結合を有する。
本開示の一実施形態によれば、第１成分は、トランスフェリン受容体に特異的なscFvであり、第2成分は、インターフェロン-β(IFN-β)、フィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩、又はインテグリンα4若しくはβ-アミロイドに特異的なscFvである。本開示の別の実施形態によれば、第１成分は、ウイルスタンパク質又は細菌タンパク質に特異的なscFvであり、第2成分は、CD16b又はCD32に特異的なscFvである。
他の治療用構築物に比べて、本発明の分子構築物は、少なくとも以下の３点で有利である。
(1)特定の数及び/又は種類の標的化/エフェクター成分を有するリンカーユニットは、独立して調製し、次いでCuAAC反応、iEDDA反応、又はSPAAC反応により一緒に結合されることができる。
(2)標的化成分及び/又はエフェクター成分の数及び種類は、適用要求(例えば、治療される疾患、結合活性、標的成分及び/又はエフェクター成分の親和性)に応じて変化し得る。標的化成分とエフェクター成分の組合せは、具体的な需要及び/又は用途に応じて調整することができる。本発明の各標的化成分及びエフェクター成分は、治療される特定の症状、患者の身体状態、及び/又は治療される疾患の種類などの要因によって変化し得る。臨床開業医は、最良の治療効果を達成するために、最も適切な標的化成分と最も適切なエフェクター成分とを組み合わせることができる。本開示の実施形態によれば、標的化成分は、成長因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、又は抗体断片であり得る。エフェクター成分は、免疫調節物質、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、細胞毒性薬物、サイトカイン、可溶性受容体、又は断片であり得る。
(3)他のカップリング反応と比較して、CuAAC反応、iEDDA反応、又はSPAAC反応は、任意の2つのリンカーユニットを結合する点でより効率的である。
図4において、６つのライブラリーが図示され、独立して調製される。この実施形態において、ライブラリー1〜6は、それぞれ機能成分に結合される複数のリンカーユニット300A、300B、300C、400A、400B、400Cを含む。リンカーユニット300A、300B、300Cのそれぞれは、構造が類似し、リンカーユニット300A、300B、300Cは、それぞれ１つの中心コア 310、１つのカップリングアーム330、及び特定の数のリンクアーム 320を含む。該カップリングアーム330は、中心コア 310に結合され、且つその遊離末端にテトラジン基350を有する。例えば、リンカーユニット300Aは、４つのリンクアーム320を含み、そのため、４つの標的化成分340aは、それぞれ４つのリンクアーム320に結合され得る。同様に、2つの標的化成分340b及び５つの標的化成分340cは、それぞれリンカーユニット300B、300Cに結合され得る。標的化成分340a、340b、及び340cは、同一であってもよいが、異なってもよい。リンカーユニット400A、400b及び400Cにおいて、これらのリンカーユニットのそれぞれは、１つの中心コア410、１つのカップリングアーム430、及び特定の数のリンクアーム420を含む。該カップリングアーム430は、中心コア410に結合され、且つその遊離末端に歪んだアルキン基450を有する。図示のように、３つのエフェクター成分440a、５つのエフェクター成分440b、及び８つのエフェクター成分440cは、それぞれリンカーユニット400A、400B、400Cに結合され得る。エフェクター成分440a、440b、440cは、同一であってもよいが、異なってもよい。ライブラリー1〜6は、独立して調製されることができる。当業者であれば、ライブラリー 1、2、3から第１リンカーユニット、ライブラリー 4、5、6から第２リンカーユニットを選んで、テトラジン基350と歪んだアルキン基450との間で起きるiEDDA反応により第１リンカーユニットと第２リンカーユニットとを結合することで、特定の数の標的化成分及びエフェクター成分を有する分子構築物を調製することができる。
ライブラリーの概念に基づいて、本発明の分子構築物は、選択されたライブラリーに応じて異なる構成で調製され得る。図5Aは、本発明の分子構築物の実施例を提供する。ここで、第１中心コアと第２中心コア(310、410)のそれぞれは、３つのリンクアーム(320、420)及び１つのリングアーム(330、430)に結合される。３つの標的化成分340は、それぞれリンクアーム320に結合され、３つの第１エフェクター成分440は、それぞれリンクアーム420に結合される。２つのリンカーユニットは、２つのカップリングアーム330、430の間で起きるiEDDA反応により互いに結合され、化学結合356を形成する。この構成により、等しい数の複数の標的化成分及び/又はエフェクター成分が１つの分子構築物に含まれ得る。
図5Bは、本発明の分子構築物の実施例を提供する。この実施例において、第１中心コアと第２中心コアは、それぞれ異なる数のアミン基(例えば、リジン残基)を含み、それにより、分子構築物は、等しくない標的化成分及びエフェクター成分を含む。図示の例では、第１中心コア310は、１つのカップリングアーム 330、及び２つのリンクアーム320に結合される。第２中心コア410は、１つのカップリングアーム430、及び５つのリンクアーム420に結合される。従って、2つの標的化成分340は、それぞれリンクアーム320に結合され、５つのエフェクター成分440は、それぞれリンクアーム420に結合される。図5Bにおける楕円356は、２つのカップリングアーム330、430の間の結合を表す。
任意の実施形態では、本発明の分子構築物は、第１中心コア又は第２中心コアに結合される比較的長いPEG鎖をさらに含むことができる。それにより、本発明の分子構築物が細網内皮系からさらに分離されることができ、被験体に投与された後により長い半減期を得る。PEG鎖によりタンパク質を修飾することで、その薬物動態学的特性を改善させ、及び/又は、免疫原性を低下させる場合に、長さが20,000-50,000 ダルトンのPEGが好ましい。従って、本発明の好ましい実施形態において、比較的短いリンクアームを用いて標的化成分とエフェクター成分を結合し、本発明の分子構築物のインビボ半減期を増加させる目的で、20,000〜50,000ダルトンのPEG鎖をリンカーユニットのいずれかに結合する。
いくつかの実施形態において、複数のscFv断片を標的化成分及び/又はエフェクター成分として用いて本発明の分子構築物を構築する。scFv断片を含む分子構築物に基づく標的化成分/エフェクター成分医薬品は、個々の抗体断片よりも長いインビボ半減期を有すべきである。いくつかの臨床用途において、医薬品のはるかに長い半減期が望まれている。それによって、薬物を頻繁に投与する必要がない。それらの用途で用いられる分子構築物において、重量が20,000〜50,000ダルトンのPEG鎖をリンクアームとして用いて、標的化成分又はエフェクター成分としてのscFv断片と結合することができる。これらの長さのPEGは、多数の治療用タンパク質を改変してそれらの半減期を増加させることに使用されている。
本開示のいくつかの実施形態によれば、リンカーユニットは、それぞれ異なる機能成分に結合される複数のリンクアームを含み得る。図6において、分子構築物は、２つのリンカーユニット100A、200Dを含む。第１機能成分 140及び第２機能成分240(１つは標的化成分、もう１つはエフェクター成分である)は、それぞれリンクアーム120、220を介して第１中心コア110a及び第２中心コア210cに結合される。２つの中心コア110a、210cは、カップリングアーム130a、230aの間で起きるiEDDA反応により互いに結合される。楕円156は、カップリングアーム130a、230aの間に形成する化学結合を表す。機能成分240に加えて、第２中心コア210cは、さらにPEG鎖260に結合される。具体的には、第２中心コア210cは、AHA残基を含む。該AHA残基は、SPAAC反応により歪んだアルキン基を有するPEG鎖260と反応してそれに結合することができる。ダイヤモンド182は、SPAAC反応から生じる化学結合を表す。所望の用途に応じて、第３成分は、第２標的化成分、第２エフェクター成分、又は分子構築物の医薬品特性を改善できる成分であり得る。本開示の実施形態によれば、PEG鎖260の分子量は、約20,000〜50,000ダルトンである。
上記の概念に基づいて、リンカーユニットは、複数の機能成分に結合可能な複数のリンクアームを含み得る。例えば、リンカーユニットは、5-12個の機能成分に結合可能な5-12個のリンクアームを含み得る。これは、機能成分が治療薬又はトール様受容体アゴニストのような小分子である場合に特に有用である。本明細書において、治療薬の複数の分子を担持するリンカーユニットが薬物バンドルと呼ばれる。
さらに、ポリペプチドコアを用いて３つのリンカーユニットを含む分子構築物を調製することができる。従って、本開示の別の態様は、３つのリンカーユニットを含む分子構築物に関する。この３つのリンカーユニットのうちの２つは、iEDDA反応により互いに結合され得る一方、第３リンカーユニットは、SPAAC反応又はCuAAC反応により上記の２つのリンカーユニットのいずれかに結合され得る。マルチリンカーユニット(例えば、３つのリンカーユニット)を構築する根拠は、2つの異なるセットの標的化成分又は2つの異なるセットのエフェクター成分をその中に組み込むことができることである。
図7において、分子構築物は、３つのリンカーユニット(500、600、700A)を含む。リンカーユニット 500、600、700Aは、それぞれ中心コア(510、610、710)、及び中心コア(510、610、710)に結合される機能成分(540、640、740)を有するリンクアーム(520、620、720)を含む。リンカーユニット600は、カップリングアーム630に結合される１つのN末端又はC末端にあるシステイン残基、及びもう１つのN末端又はC末端にアジド基又はアルキン基を有するアミノ酸残基を含むことを特徴とする。カップリングアーム530、630の一方は、その遊離末端にテトラジン基を有し、カップリングアーム530、630のうちの他方は、 その遊離末端に歪んだアルキン基を有する。従って、リンカーユニット500、600は、図3Aに示めす結合方式のように、カップリングアーム530、630の間で起きるiEDDA反応により互いに結合され得る。リンカーユニット700の結合において、中心コア610のN末端又はC末端アミノ酸残基は、アジド基(例えば、AHA残基)を有する場合に、中心コア710は、そのN末端又はC末端に、アルキン基(例えば、HPG残基)を有するアミノ酸を含む。或いは、中心コア610のN末端又はC末端アミノ酸残基にアルキン基(例えば、HPG残基)を有する場合に、中心コア710は、そのN末端又はC末端に、アジド基(例えば、AHA残基)を有するアミノ酸を含む。このように、図3Bに示す結合方式のように、リンカーユニット600、700Aは、カップリングアームが存在しなくても、中心コア610、710のN末端又はC末端アミノ酸残基の間で起きるCuAAC反応により互いに直接結合され得る。図7における楕円560及びソリッドドット670は、それぞれiEDDA反応及びCuAAC反応から生じる化学結合を表す。
或いは、上記の３つのリンカーユニットのうちの２つは、iEDDA反応により互いに結合され得る一方、第３リンカーユニットは、SPAAC反応により上記の２つのリンカーユニットのいずれかに結合され得る。図7Bにおいて、リンカーユニット500、600は、図7Aに示すように、iEDDA反応により互いに結合される一方、リンカーユニット700Bは、中心コア610とカップリングアーム730の間で起きるSPAAC反応によりリンカーユニット600に結合される。図7Bにおけるダイヤモンド672は、SPAAC反応から生じる化学結合を表す。
理解され得るように、リンカーユニット500、600、700A又は700Bにそれぞれ結合される機能成分540、640、740の数は、所望の用途に応じて異なる。図4に示すライブラリーの概念では、異なる数及び/又は種類の機能成分をそれぞれ有するリンカーユニットは、異なるライブラリーとして別々に調製することができ、当業者であれば、種々の用途に応じてライブラリーから所望のリンカーユニットを選択して組み合わせることができる。
基本的に、上述した態様及び/又は本開示の実施形態で説明した本発明の分子構築物のカップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖として設計される。上記カップリングアームは、末端にアジド基、アルキン基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基を有する。リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖として設計される。好ましくは、リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であり、且つ中心コアに結合されていない遊離末端にジスルフィド結合を有する。
ポリペプチドを中心コアとして採用することにより、本発明の分子構築物に多様性を提供することができる。該分子構築物では、１つの構築物に複数のコピー又は種類の標的化/エフェクター成分が存在し得る。それにより、薬物送達の特異性の増強、及び標的部位に対する効力が達成される。複数のリンカーユニットを含む分子構築物を用いることにより、多数の構成が採用されることができる。例えば、3つのscFv標的化成分を有する第１リンカーユニット、及び５つの治療薬を有する第２リンカーユニット；3つのscFv標的化成分を有する第１リンカーユニット、及び3つのscFvエフェクター成分を有する第２リンカーユニット；第１セットの標的化成分の２つのscFvを有する第１リンカーユニット 、第２セットの標的化成分の２つのscFvを有する第２リンカーユニット、及び５つの治療薬を有する第３リンカーユニット；２つのbi-scFv標的化成分を有する第１リンカーユニット、及び２つのscFvエフェクター成分を有する第２リンカーユニット；又は3つのscFv標的化成分を有する第１リンカーユニット、２つのscFvエフェクター成分を有する第２リンカーユニット、薬物動態学的特性の向上の目的で20,000-50,000ダルトンの長いPEGを導入したリンクアームである。
本発明のいくつかの実施形態において、リンクアームとしての二機能性 PEGを用いて、標的化成分又はエフェクター成分としての抗体の抗原結合断片をポリペプチドコアにあるアミン基に結合する。各PEGは、１つの末端にNHS基、もう１つの末端にマレイミド基を有することができる。NHS基は、ポリペプチドコアにあるアミン基と結合可能であり、マレイミド基は、抗体のscFv、bi-scFv、又はFab断片のシステイン残基のスルフヒドリル基に結合可能である。scFv及びbi-scFvは、C末端に末端システイン残基を有するポリペプチドリンカーを含むように設計される。Fabは、IgG全体にペプシン切断を行うことにより得ることができ、遊離のスルフヒドリル基は、穏やかな還元反応により鎖間ジスルフィド結合に由来する。
スキーム8-12は、特定のリンカーユニットの結合及び調製を示すいくつかの実施例を提供する。
スキーム8は、本開示の一実施形態に係る本発明の分子構築物の調製を示す模式図である。ここで、NHSは、NHSエステルを示し、Malは、マレイミド基を示し、AAHは、L-アジドホモアラニン(AHA)残基を示し、GHPは、ホモプロパギルグリシン(HPG)残基を示し、Acは、アセチル基を示し、scFvは、一本鎖可変領域断片を示す。ステップ1において、第１中心コア及び第２中心コアをそれぞれ調製する。該第１中心コアは、 (GSK)3のアミノ酸配列を含み、且つそのC末端にL-アジドホモアラニン(AHA)残基を有する。該第２中心コアは、(GSK)5のアミノ酸配列を含み、且つそのC末端にホモプロパギルグリシン(HPG)残基を有する。ポリペプチドを安定化するために、第１中心コアと第２中心コアのN末端をそれぞれアセチル基で修飾する。ステップ2において、リンクアームをそれぞれ第１中心コアと第２中心コアにおけるリジン残基に、それらの間にアミド結合を形成することで結合する。中心コアに結合されるリンクアームは、遊離末端にマレイミド基を有する。ステップ3において、チオール-マレイミド反応により、チオール基(例えば、システイン残基)を有する第１標的化成分(即ち、抗体)を第１中心コアに結合されるリンクアームに結合する。同様に、チオール-マレイミド反応により、チオール基を有するエフェクター成分(即ち、薬物)を第２中心コアに結合されるリンクアームに結合する。ステップ4において、AHA残基とHPG残基との間で起きるCuAAC反応により２つのリンカーユニットを結合する。
<<スキーム8：末端アミノ酸残基によるリンカーユニットの結合>>
必要に応じて、別の方法において、標的化/エフェクター成分は、中心コアに結合され得る。スキーム9は、エフェクター成分とポリペプチドコアとの結合を示す。スキーム9において、まず、リンクアームが中心コアに結合され、次いで、エフェクター成分(即ち、薬物)がチオール-マレイミド反応によりリンクアームに結合される。
<<スキーム9：リンクアームへの結合によりエフェクター成分をポリペプチドコアに結合する方法>>
スキーム10の上記別の方法において、エフェクター成分(即ち、薬物)をリンクアームに結合することにより、リンクアーム-エフェクター複合体(即ち、PEG-drug)を調製する。次に、リジン残基とNHSエステルとの間にアミド結合を形成することでリンクアーム-エフェクター複合体を中心コアに結合する。
<<スキーム10：まず、PEG鎖に結合し、そしてリジン残基のアミノ基に結合することで、エフェクター成分をポリペプチドコアに結合する別の方法>>>
或いは、ジョイント-リンカー構成のためのリンクアームは、二重特異性scFvを結合することに使用され得る。該二重特異性scFvは、標的化成分又はエフェクター成分である。これらの構成は、標的化の特異性及び/又はエフェクターメカニズムの効力を向上させることができる。
スキーム11は、本発明の分子構築物の調製の例を提供する。該分子構築物は、２つのリンカーユニットを含み、リンカーユニットは、両方とも (K-Xaa4)3のアミノ酸配列を含み、そのC末端にシステイン(C)残基を有する。
<<スキーム11：カップリングアームの間で起きるiEDDA反応による分子構築物の調製>>
ステップ1において、２つのカップリングアームをそれぞれリンカーユニットのC残基に結合する。そのうち１つのカップリングアームは、１つの末端にマレイミド(Mal)基を有し、もう１つの末端にテトラジン基を有する。もう１つのカップリングアームは、１つの末端にMal基を有し、もう１つの末端にTCO基を有する。ステップ2において、リンクアームとK残基との間にアミド結合を形成することでリンクアームをそれぞれリジン(K)残基に結合する。さらに、ステップ3において、チオール-マレイミド反応により３つの抗A抗原scFv(scFv α A)及び３つの抗B抗原scFv(scFv α B)をそれぞれリンカーユニットのリンクアームに結合する。最後に、ステップ4において、テトラジン基とTCO基との間で起きるiEDDA反応により２つのリンカーユニットを互いに結合する。
スキーム12は、分子構築物の調製の例を提供する。該分子構築物は、３つのリンカーユニットを含む。そのうち２つのリンカーユニットは、それぞれscFv α A及びscFv α Bに結合され、且つスキーム11で説明したようにiEDDA反応により互いに結合される。第３リンカーユニットは、CuAAC反応により第２リンカーユニットに結合される。
<<スキーム12：３つの機能成分を有するリンカーユニットを含む分子構築物の調製>>
この例において、第３リンカーユニットは、薬物バンドルである。しかし、この反応スキームは、他の成分、例えば、scFvを有する第３リンカーユニットにも適用される。本発明の例において、中心リンカーユニット(即ち、第２リンカーユニット)は、そのN末端にHPG(GHP)残基を有し、それにより、HPG残基とAHA残基との間で起きるCuAAC反応によりAHA(AAH)残基に結合される薬物バンドルを第２リンカーユニットに結合することができる。或いは、中心リンカーユニットは、そのN末端又はC末端にAHA残基を含み得、且つSPAAC反応によりDBCO基又は他の歪んだアルキン基を有するカップリングアームを含む第３リンカーユニットに結合され得る。このようにして形成されたスキーム12の分子構築物は、３つの機能成分、即ち、scFv α A、scFv α B、及び薬物分子を有する。３つのリンカーユニットを有する分子構築物は、３つのセットのscFvを含み得る。そのうちの２つのセットを標的化成分、１つのセットをエフェクター成分とし、又は１つのセットを標的化成分、２つのセットをエフェクター成分とする。
標的化成分及びエフェクター成分は、すべてscFvであり、且つ600ダルトン(12単位のEG)のリンクアームを使用する場合に、合計６つのscFvを有する分子構築物は、分子量が約170,000ダルトンである。7つのscFvを有する分子構築物は、分子量が約200,000ダルトンである。8つのscFvを有する分子構築物は、分子量が約230,000ダルトンである。本発明の分子構築物のほとんどは、分子量が200,000ダルトン未満である一方、いくつかの分子構築物は、分子量が200,000-250,000ダルトンである。
4つの異なるセットのscFvが１つの分子構築物に含まれる場合に、結合された一本鎖、scFv1-scFv2(例えば、HER2及びHER3に特異的なもの)等の二重特異性scFv(bi-scFv)を含む１つのリンカーユニット、及びそれぞれscFv(即ち、それぞれscFv3及びscFv4)を含む他の２つのリンカーユニットを有することが好ましい。二重特異性scFv1-scFv2の構築に２つの方法がある。「タンデム」構成において、VL1-VH1-VL2-VH2又はVH1-VL1-VH2-VL2が配置され、「ダイアボディー」構成において、VL2-VL1-VH1-VH2又はVH2-VH1-VL1-VL2が配置される。GGGGS(配列番号:6)繰り返し単位又は他の配列を有する適切なポリペプチドリンカーは、免疫グロブリンドメインの間に配置される。
発明者の経験では、マレイミド及びアジド基を含むペプチド又はPEGリンカーは、マレイミド基とアジド基との間の自動結合反応により、長期間保存すると重合することがある。そのため、新しくかつ独立して各リンカーユニットを調製し、さらに、遅延なく標的化成分又はエフェクター成分をリンカーユニットに結合し、クリック反応によりリンカーユニットを結合するように処理することが好ましい。別の好ましい実施形態は、標的化成分及びエフェクター成分を両方ともアルキン基を介してリンカーユニットに結合し、１つのリンカーユニットにおけるアルキン基を、両端にアジド基を有する短いホモ二機能性リンカーを用いてアジド基に変更することである。そして、リンカーユニット（１つはアルキン基を有し、もう１つはアジド基を有する）をクリック反応により結合する。
本発明の好ましいリンクアームは PEGである。リンクアームの長さはいくつかの考慮事項にとって重要である。リンクアームの長さは、可撓性がある結合scFv又は他の種類の機能成分が、立体的制約なしに標的細胞表面上の標的抗原部位に到達することを可能にするのに十分な長さであって、リンクアーム及びそれらのscFv断片若しくは機能成分の分子内及び分子間の絡み合いを引き起こすに至らない長さ、又は組織浸透を防げるために分子構築物全体のサイズを不必要に増加させるに至らない長さである。リンクアームが長すぎると、圧縮されたクラスタがアポトーシス又は他の細胞効果のための信号伝達プロセスを開始するために必要とされる場合に、抗原分子を引っ張って圧縮されたクラスタを形成することができない。標的抗原とその結合剤との異なる種類の組み合わせに対するリンクアームの最適長さは、過度の実験をすることなく当業者によって決定され得る。本発明のいくつかの分子構築物においては、NHS-(PEG)12-マレイミド(約500ダルトン)のリンクアームが好ましい。完全に伸張した(PEG)12の長さは40-50オングストロームである。
適用可能なリンクアーム及びカップリングアームは、PEG鎖に制限されない。グリシン、セリン及び他のアミノ酸親水性残基を含むペプチド、及び多糖類、並びに、NHS及びマレイミド基を含むように修飾された他の生体適合性線状ポリマーを使用することができる。
特定の治療用途では、本開示の分子構築物におけるエフェクター成分がリンクアームから放出され、標的部位の細胞（標的化成分又は周囲細胞によって結合された細胞を含む）に到達して薬理学的効果を引き起こすことができることが望ましい。この場合に、切断可能な結合がリンクアームに導入されている。加水分解、酸暴露、還元、及び酵素により切断されやすい切断可能な結合が、開発されている。例えば、炎症組織に存在するマトリックスメタロプロテイナーゼに敏感なペプチドセグメントは、治療用構築物の構築に使用されている。 本発明の一実施形態において、マレイミド基に隣接するS-S結合を有するPEGリンカー、即ちNHS-PEG2-12-S-S-マレイミドを使用する。ここで、S-Sジスルフィド結合であり、緩徐に還元することができる。
本開示のいくつかの実施形態によれば、上記の実施形態で説明した標的化成分は、成長因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、及び抗体からなる群から選択され、エフェクター成分は、免疫調節物質、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、治療薬、サイトカイン、可溶性受容体、又は抗体である。
これらの実施形態において、抗体は、抗原結合断片(Fab)、可変断片(Fv)、一本鎖可変領域断片(scFv)、単一ドメイン抗体(sdAb)、又は二重特異性一本鎖可変領域断片(bi-scFv)の形態である。一実施形態によれば、bi-scFvは、二重特異性タンデムscFv又は二重特異性ダイアボディscFvである。
分子構築物の拡散能力を保持するために、250,000ダルトン未満の分子サイズが好ましい。したがって、scFv断片は、ほとんどの実施形態にとって好ましい。DNAレベルでは、グリシン及びセリンを主要残基として有する10-25個のアミノ酸残基のペプチドリンカーを介して、いずれかの順序(VL-VH又はVH-VL)でVL及びVHが単一のポリペプチドとして結合されるように、遺伝子が構築される。C末端には、グリシン、セリン、及び末端残基システインを有する短い延伸部が設計されている。 組換えscFv及びbi-scFvは、大腸菌及びシュードモナス・プチダなどの細菌、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母、又はCHO及びHEK293細胞株などの哺乳類細胞で調製することができる。
本発明者らの研究室では、HEK293及びCHO細胞の細胞株において、インビトロシステム及び動物モデルにおける実験のために、数多くのIgG 抗体、Fab、scFv及び種々の抗体断片、Fcに基づくタンパク質、並びに他の組換え抗体が調製された。本発明者らの研究室では、ヒト臨床試験用の抗体を調製するための細胞株も開発されている。HEK293一過性発現系は、研究室で複数の1〜2Lのフラスコを用いて1gまでのIgG又は抗体断片を調製することに便利に使用することができる。本発明の分子構築物に使用されるscFv断片は、一般に、炭水化物修飾を有さず、且つ、炭水化物修飾は、scFvの、その抗原性標的に対する結合活性には必要とされない。さらに、scFvフラグメントには、１つのジスルフィド結合及び１つの末端システインしか存在しない。従って、小規模細菌発現系がscFv調製の代替手段として開発されている。大腸菌を用いて細胞内封入体、ペリプラズム及び分泌型でscFvを回収するための発現系が用いられている。scFvは、ほとんどの場合に、ほとんどのκ軽鎖のVHと相互作用するプロテインLを有するアフィニティーカラムで精製することができ、又は他の場合に、イオン交換カラムで精製することができる。
ジョイント-リンカープラットフォームに基づく本発明の例は、主にscFv及びFabを標的化成分及び/又はエフェクター成分を使用する。しかし、特異的結合分子は、sdAb又は他の抗体断片に基づく結合分子の大きなライブラリーから選別されることもできる。免疫グロブリンドメインに基づいていないが、選択された標的分子に特異的結合親和性を有する抗体に似ている結合分子のライブラリーは、(1)標的分子と結合するために選択されたオリゴヌクレオチド又は短いペプチドであるアプタマー；(2)ヒトFyn SH3ドメインに由来する小さな結合タンパク質であるフィノマー；(3)シスタチンのシステインタンパク質阻害剤ファミリーに由来の結合タンパク質であるアフィマー；及び(4)天然のアンキリンタンパク質に由来する構造を有する遺伝子組み換えタンパク質であって、これらのタンパク質の3、4又は5個の繰り返しモチーフからなるダルピン（設計されたアンキリンリピートタンパク質）。これらの抗体模倣物の分子量が約10K〜20Kダルトンである。
II-(ii)ジョイント-リンカー分子構築物に適用される機能成分
上記のように、本発明のジョイント-リンカー少なくとも2つのリンカーユニットを含む。ここで、第１リンカーユニットは、1つ以上の標的化成分を担持し、第2リンカーユニットは、1つ以上のエフェクター成分又は薬物動態特性向上成分を担持し、その逆もまた然りである。特定疾患を治療するための本発明のジョイント-リンカー分子構築物に導入される機能成分の特定の例は、後述する。
中枢神経系（CNS）疾患を治療するために、特定のCNS疾患に適切なエフェクター成分と共に、トランスフェリン受容体に特異的なscFvを本発明のジョイント-リンカー分子構築物の標的化成分として使用することができる。例えば、多発性硬化症を治療するためのジョイント-リンカー分子構築物は、フィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩、インターフェロン-β、又はインテグリン-α4に特異的なscFvをエフェクター成分として使用することができる。アルツハイマー病の場合に、例示的なジョイント-リンカー分子構築物は、β-アミロイドに特異的なscFvをエフェクター成分として使用することができる。
感染に関連する疾患又は病状の治療において、CD16b又はCD32に特異的なscFvをエフェクター成分として使用することができ、標的化成分は、感染の原因に依存する。具体的には、感染がウイルスにより引き起こされる場合に、ウイルスタンパク質に特異的なscFvを標的化成分として使用し、感染が細菌により引き起こされる場合に、細菌タンパク質に特異的なscFvを標的化成分として使用する。ウイルスタンパク質の例示的な例は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のFタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスI型(HIV-1)のgp120タンパク質、A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンA（HA）タンパク質、及びサイトメガロウイルスの糖タンパク質を含むが、これらに限定されない。細菌タンパク質の非限定的な例は、グラム陰性菌のエンドトキシン、クロストリジウム・ディフィシルの表面抗原、黄色ブドウ球菌のリポテイコ酸、炭疽菌の炭疽毒素、及び大腸菌の志賀毒素I型若しくはII型を含む。
II-(iii)：ジョイント-リンカー分子構築物の使用
本開示は、また、適切なジョイント-リンカー分子構築物を用いて様々な疾患を治療すうための方法に関する。一般的に、該方法は、治療を必要とする被験体に有効量の本開示の実施形態に係るジョイント-リンカー分子構築物を投与するステップを含む。
パートIII：中枢神経系疾患又は感染症を治療するためのFcに基づく分子構築物
III-(i)：Fcに基づく分子構築物の構造
Fcに基づく構成の広い意味では、免疫グロブリン抗体を、標的化成分又はエフェクター成分の基礎として使用し、その2つのγ重鎖のC末端にその対応するエフェクター又は標的化成分をscFvドメインの形態で導入することができる。典型的な「Fcに基づく」構成の場合、二本鎖IgG.Fcを分子プラットフォームの基礎を使用することができる。ポリペプチド鎖の各々は、各鎖に合計２〜3個の成分を有するように、1つ又は２つの標的成分及び１つ又は2つのエフェクター成分と融合することができる。Fcに基づく構成を有するT-E分子は、合計４〜６個の成分(例えば、scFv、又は他の抗体断片)を有する。必要に応じて、分子構築物のFc部分も、Fc媒介エフェクター機能、ADCC及び/又は補体媒介活性化機能を有する。特定の他の用途では、そのFc媒介エフェクター機能が望ましくない。
Fcに基づく分子構築物を設計する際に、標的化成分をN末端若しくはC末端に位置させる。エフェクター成分は、細胞表面成分に結合することにより機能する場合に、末端に配置されるべきである。エフェクター成分は、可溶性因子に結合し、その機能を中和することにより機能する場合に、末端標的化成分又はエフェクター成分とCH2-CH3との間に配置されることができる。
本発明のFcに基づく分子構築物のT-E成分を選択することにより、分子構築物は、中枢神経系（CNS）疾患又は感染症の治療に適用され得る。本開示は、以下の点にも有利である。即ち、いくつかの実施形態において、本開示の第１態様に係るリンカーユニットを利用し、本発明のFcに基づく分子構築物の標的化成分及びエフェクター成分の数を制御するための容易な手段を提供する。選択される標的化及び/又はエフェクター成分に応じて、本発明のFcに基づく分子構築物は、以下にそれぞれ説明する異なる構成であり得る。
本発明のFcに基づく分子構築物において、標的化成分及びエフェクター成分は、共に抗体又はその断片である。
図8Aは、本開示の特定の実施形態に係るFcに基づく分子構築物800Aを説明する模式図である。図示のように、Fcに基づく分子構築物800Aは、同一のCH2-CH3鎖810、CH2-CH3鎖810のN末端に結合される１対のエフェクター成分E1、及びCH2-CH3鎖810のC末端に結合される１対の標的化成分T1を含む。この例示的な構成において、標的化成分T1及びエフェクター成分E1はscFvである。
図8Bに示すFcに基づく分子構築物800Bは、2つのエフェクター成分E1がそれぞれCH2-CH3鎖810のC末端に結合され、２つの標的化成分T1がそれぞれCH2-CH3鎖810のN末端に結合される以外、図8AのFcに基づく分子構築物800Aの構造と非常に類似する。
特定の実施形態によれば、エフェクター成分及び標的化成分は、両方ともCH2-CH3鎖のN末端に結合される。例えば、エフェクター成分及び標的化成分が両方とも一本鎖可変領域断片(scFv)の形態である場合に、エフェクター成分及び標的化成分をタンデム又はダイアボディ構造で結合して、CH2-CH3鎖のN末端に結合される二重特異性scFvを形成することができる。
Fcに基づく分子構築物800C(図8C)がFc部分を含むため、各CH2-CH3鎖810は、そのN末端にT1-E1二重特異性scFvを有する。
いくつかの例において、１対のエフェクター成分又は１対の標的化成分は、Fab構造(即ち、VH-CH1ドメイン及びVL-Cκドメインからなる)を採用する。このFab断片は、CH2-CH3鎖のN末端に結合されることにより、Fcに基づく分子構築物はIgG構造となる。この場合に、Fab構造でない１対の成分は、１対のCH2-CH3セグメントのC末端に結合され得る。
例えば、図9のFcに基づく分子構築物900において、2つの標的化成分T1の各々は、VH-CH1ドメイン820及びVL-Cκドメイン825を含むため、CH2-CH3鎖810のN末端に結合されるFab構造830を形成する。それにより、Fcに基づく分子構築物900は、IgG構造となる。この場合に、１対のエフェクター成分E1は、１対のCH2-CH3鎖810のC末端に結合される。
いくつかの実施形態によれば、本発明のFcに基づく分子構築物は、ペプチドであるエフェクター成分を有する。
例えば、本開示の特定の実施形態によれば、エフェクター成分は、特定の治療効果を有するペプチドであり、標的化成分は、抗体又はその断片であり得る(図10A、10B)。図示のように、図10AのFcに基づく分子構築物1000Aは、１対のCH2-CH3セグメント1210のN末端に結合される1対の標的化成分T1(scFv)、及び１対のCH2-CH3セグメント1210のC末端に結合される1対のエフェクター成分E1(治療用ペプチドの形態である)を含む。
同様に、図10BのFcに基づく分子構築物1000Bにおいて、１対の標的化成分T1(scFv)は、１対のCH2-CH3セグメント1210のC末端に結合され、１対のエフェクター成分E1(治療用ペプチドの形態である)は、１対のCH2-CH3セグメント1210のNの末端に結合される。
理解できるように、ペプチドをエフェクター成分として使用するFcに基づく分子構築物において、標的化成分は、分子構築物がIgG構成をとるように、Fab断片に構築されることができる。
図8A〜10Bに示す構成において、CH2-CH3鎖は、ヒト免疫グロブリンγ1又はγ4からである。一般には、Fc媒介性機能、例えば、抗体依存性細胞毒性(ADCC)及び補体媒介活性(炎症活性化又は標的細胞溶解)が必要である場合に、γ1を選択する。Fc媒介性機能が望ましくない場合に、γ4を用いて本発明のFcに基づく分子構築物を構築する。
III-(ii)：Fcに基づく分子構築物との使用に適した機能成分
以上、抗炎症Fcに基づく分子構築物の基本的な構造的配置を説明した。以下、エフェクター成分及び標的化成分の特定の組合せを説明する。
中枢神経系（CNS）疾患を治療するために、特定のCNS疾患の治療に適切なエフェクター成分と共に、トランスフェリン受容体に特異的な抗体(又はその断片)を標的化成分として使用することができる。例えば、多発性硬化症を治療するためのFcに基づく分子構築物は、インテグリン-α4に特異的なscFvをエフェクター成分として使用することができる。アルツハイマー病の場合に、例示的なFcに基づく分子構築物は、β-アミロイドに特異的なscFvをエフェクター成分として使用することができる。上記のCNS疾患を治療するためのFcに基づく分子構築物は、図8A〜8C、及び図9のいずれかに関連して記載された構成をとることができる。
多発性硬化症を治療するためのFcに基づく分子構築物は、INF-β1a又はINF-β1bをエフェクター成分として使用することもできる。この場合に、Fcに基づく分子構築物は、図10A、10Ｂに関連して記載された構成をとることができる。
感染(例えば、ウイルス感染又は細菌感染)に関連する疾患/病状を治療するためのFcに基づく分子構築物の構築において、ウイルスタンパク質又は細菌タンパク質に特異的な抗体(又はその断片)を標的化成分として使用することができる。感染を治療するためのエフェクター成分において、CD32又はCD16bに特異的な抗体(又はその断片)を使用することができる。これらのFcに基づく分子構築物は、図8A〜8C、及び図9のいずれかに関連して記載された構成をとることができる。
本発明の本質は、標的化成分とエフェクター成分との特定の組合せ又はペアリングの合理化及び概念である。好ましい実施形態において、分子構築物についてFc融合構成を採用する。当業者であれば、他の分子プラットフォームを用いて本発明の１対の標的化成分及びエフェクター成分を結合することを想到できる。上記の分子プラットフォームは、例えば、ペプチド、タンパク質(例えば、アルブミン)、多糖類、ポリエチレングリコール、及び他の種類のポリマーであり、複数の分子成分を結合する構造基礎として機能する。
III-(iii)：Fcに基づく分子構築物の使用
本開示は、また、適切なFcに基づく分子構築物を用いてCNS疾患を治療するための方法に関する。一般的に、該方法は、治療を必要とする被験体に有効量の本開示の実施形態に係るFcに基づく分子構築物を投与するステップを含む。
本開示は、さらに、適切なFcに基づく分子構築物を用いて感染を治療するための方法に関する一般的に、該方法は、治療を必要とする被験体に有効量の本開示の実施形態に係るFcに基づく分子構築物を投与するステップを含む。
実施例
実施例1:ペプチドコアとしてのペプチド1(配列番号:18)、ペプチド2(配列番号:27)、及びペプチド3(配列番号:19)の合成、並びに、システイン残基のSH基とカップリングアームとしてのマレイミド-PEG3-トランスシクロオクテン(TCO)との結合
合成したペプチド1、2、3(Chinapeptide Inc., Shanghai, China)を同様に処理した。各ペプチドを最終濃度2mMとなるように50mMのNaCl及び5mMのEDTAを含む100mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に溶解した。溶解したペプチドを、1mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を用いて25°Cで2時間還元させた。ペプチドとマレイミド-PEG3-TCOを1/7.5の割合で混合し、pH7.0、25°Cで18時間反応させることにより、システイン残基のSH基とマレイミド-PEG3-TCO(Conju-probe Inc.、San Diego、USA)を結合して機能的連結基TCOを形成した。逆相HPLC（カラム：Supelco C18カラム(250mmX10mm;5μm)；移動相：アセトニトリル及び0.1%トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：0%〜100%；30分間、流速：1.0mL/min；カラム温度：25°C）によりTCO結合ペプチドを精製した。
MALDI-TOF質量分析法により合成された３種類のTCO-ペプチド(以下に示される)を確認した。質量分析は、中央研究院分子生物学研究所のマスコア施設(IMB)（台湾、台北）で行った。測定は、ブルカー・オートフレックスIII MALDI-TOF/TOF質量分析計(ブルカー・ダルトニクス、ブレーメン、ドイツ)で行った。
以下に示す合成したTCO-ペプチド1は、分子量(m.w.)が2,078.9ダルトンである。
以下に示す合成したTCO-ペプチド2は、m.w.が2,020.09ダルトンである。
以下に示すTCO-ペプチド3は、m.w.が3,381.85ダルトンである。
実施例2:ペプチドコアとしてのペプチド1の合成、並びに、システイン残基のSH基とカップリングアームとしてのマレイミド-PEG4-テトラジンとの結合
合成したペプチド1(Chinapeptide Inc., Shanghai, China)を2mMの最終濃度となるように50mMのNaCl及び5mMのEDTAを含む100mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に溶解した。溶解したペプチドを1mMのトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)により25℃で2時間還元させた。システイン残基のSH基とマレイミド-PEG4-テトラジン(Conju-probe Inc., San Diego, USA)とを結合して、機能的連結基であるテトラジンを形成した。ペプチド及びマレイミド-PEG4-テトラジンを1/5の比例で混合し、pH7、4℃で18時間インキュベートした。テトラジン結合ペプチドを逆相HPLC（カラム：Supelco C18カラム(250mmX10mm;5μm)；移動相：アセトニトリル及び0.1%トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：0%〜100%；30分間以上、流速：1.0mL/min；カラム温度：25°C）により精製した。
以下に示す合成したテトラジン-ペプチド1は、m.w.が2,185.2ダルトンである。
実施例3:リンクアームとしてのNHS-PEG12-MalとTCO-ペプチド1のNH2基との結合によるリンカーユニットの合成
PEG12-マレイミドの３つのリンクアームをペプチドコアであるTCO-ペプチド1に連結した。Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham、USA)から、架橋剤であるNHS-PEG12-マレイミド(スクシンイミジル-[(N-マレイミド-プロピオンアミド)-ドデカエチレングリコール]エステルを購入した。製造業者の指示に従って、結合手順を行った。簡単に言えば、リジン残基を有するペプチドを100mMで結合緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.5)）に溶解した。NHS-PEG12-マレイミド架橋剤を1mMの最終濃度(0.1mMのペプチド溶液に対してモルで10倍過剰)となるようにペプチドに添加した。反応混合物を室温で18時間インキュベートした。マレイミド-PEG12結合TCO-ペプチド1を逆相HPLC（カラム：Supelco C18カラム(250mmX4.6mm;5μm)；移動相：アセトニトリル及び0.1%トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：0%〜100%；30分間以上、流速：1.0mL/min；カラム温度：25°C）により精製した。
質量分析法MALDI-TOFにより、マレイミド-PEG12結合TCO-ペプチド1を確認した。
合成したマレイミド-PEG12結合TCO-ペプチド1は、m.w.が4,332ダルトンである。以下に示すように、上記マレイミド-PEG12結合TCO-ペプチド1は、１つのTCO基、及びマレイミド基を有する３つのPEGリンクアームを含むペプチドコアに基づくリンカーユニットである。
実施例4:リンクアームとしてのNHS-PEG12-Malと、テトラジン-ペプチド1のNH2基との結合によるリンカーユニットの合成
３つのPEG12-マレイミドのリンクアームをペプチドコア、テトラジン-ペプチド1に連結した。架橋剤であるNHS-PEG12-マレイミド(スクシンイミジル-[(N-マレイミド-プロピオンアミド)-ドデカエチレングリコール]をThermo Fisher Scientific Inc.(Waltham, USA)からエステルを購入した。製造業者の指示に従って、結合手順を行った。簡単に言えば、リジン残基を有するペプチドを100mMで結合緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水(pH7.5)）に溶解した。その後、NHS-PEG12-マレイミド（架橋剤）を1mMの最終濃度(0.1mMのペプチド溶液に対してモルで10倍過剰)となるように溶解したペプチドに添加した。反応混合物を室温で18時間インキュベートした。逆相HPLC（カラム：Supelco C18カラム(250mmX4.6mm;5μm)；移動相：アセトニトリル及び0.1%トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：0%〜100%；30分間以上、流速：1.0mL/min；カラム温度：25°C）によりマレイミド-PEG12結合テトラジン-ペプチド1を精製した。
以下に示すように、合成したマレイミド-PEG12結合テトラジン-ペプチド1は、１つのテトラジン基、及びマレイミド基を有する３つのPEGリンクアームを含むペプチドコアに基づくリンカーユニットである。図11のMALDI-TOF結果は、上記構築物のm.w.が4,461ダルトンである。
実施例5:フィンゴリモド及びフィンゴリモドリン酸塩分子とNHS-PEG5-NHS架橋剤との結合
フィンゴリモドをBiotang Inc.(Lexington, USA)から購入し、フィンゴリモドリン酸塩をKM3 Scientific Corporation(New Taipei City, Taiwan)から購入した。スキーム13に示すように、フィンゴリモド分子のNH2基をホモ二機能性架橋剤（NHS-PEG5-NHS）と反応させた。フィンゴリモドを最終濃度10mMで100％DMSOに溶解し、NHS-PEG5-NHSを最終濃度250 mMで100％DMSOに溶解した。フィンゴリモドのNH2基を活性化するために、6％(v/v)の塩基性リン酸ナトリウム緩衝液(pH12.7)をフィンゴリモド溶液に添加し、さらに10分間インキュベートした。NHS-PEG5-NHS架橋剤を最終濃度30mM(10mMのフィンゴリモド溶液に対してモルで3倍過剰)で溶解したフィンゴリモド溶液に添加した。反応混合物を室温で3時間インキュベートした。
<<スキーム13：フィンゴリモド分子とNHS-PEG5-NHS架橋剤との結合>>
フィンゴリモドリン酸塩を最終濃度5mMで100％DMSOに溶解し、NHS-PEG5-NHS架橋剤を最終濃度250 mMで100％DMSOに溶解した。NHS-PEG5-NHS架橋剤を最終濃度15mM(5mMのフィンゴリモドリン酸塩に対してモルで3倍過剰)で溶解したフィンゴリモドリン酸塩溶液に添加した。反応混合物を室温で３時間インキュベートした後、18％(v/v)の酸性リン酸ナトリウム緩衝液(pH＝0.88)を添加して反応を停止させた。溶媒を真空下で蒸発させた。
NHS-PEG5結合フィンゴリモド及びNHS-PEG5結合フィンゴリモドリン酸塩を30％アセトニトリルに溶解した後、逆相HPLC（カラム：Supelco C18カラム(250mmX4.6mm;5μm)；移動相：アセトニトリル及び0.1%トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：30%〜100%；30分間以上、流速：1.0mL/min；カラム温度：25°C）により精製した。
図12は、合成したNHS-PEG5結合フィンゴリモド（スキーム13に示すように）のm.w.が725.41ダルトンであることを示す。
以下に示す合成したNHS-PEG5結合フィンゴリモドリン酸塩は、m.w.が803.3ダルトンである。
実施例6:フィンゴリモド分子とNHS-S-S-PEG3-アジドリンクアームとの結合
フィンゴリモド分子のNH2基をヘテロ二官能性切断可能リンカーであるNHS-S-S-PEG3-アジド(Conju-probe Inc.)と1: 3のモル比で反応させた。アジド-PEG3-S-S-フィンゴリモドをHPLCにより精製して過剰で未反応のフィンゴリモド分子を除去した。結合及び精製の手順は、上記の実施例と同様である。
以下に示す合成したアジド-PEG3-S-S結合フィンゴリモドは、m.w.が629.33ダルトンである。
実施例7:アジド-PEG3-S-S結合フィンゴリモド分子とNHS-PEG4-ジベンジルシクロオクチン(DBCO)架橋剤との結合
アジド-PEG3-S-S結合フィンゴリモド分子を最終濃度10mMで100％DMSOに溶解し、NHS-PEG4-DBCO架橋剤を最終濃度250mMで100％DMSOに溶解した。100mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）において、5μlのNHS-PEG4-DBCO架橋剤をモル比1：3.2(NHS-PEG4-DBCO:アジド-PEG3-S-S結合フィンゴリモド)で400μlの溶解したアジド-PEG3-S-S結合フィンゴリモド溶液に添加した。反応混合物を室温で3時間インキュベートした。
以下に示す合成したNHS-PEG4-PEG3-S-S結合フィンゴリモドは、m.w.が1,278.61ダルトンである。MSスペクトルにおいて、1,279.64及び1,280.635に、[M+H+1]+及び[M+H+2]+に対応する2つの同位体ピークが示された。
実施例8: NHS-PEG5結合フィンゴリモド分子とTCO-ペプチド2、3との結合
TCO-ペプチド2を濃度20mMとなるように100mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）に溶解し、NHS-PEG5結合フィンゴリモドを濃度50mMとなるように100％DMSOに溶解した。TCO-ペプチド2とNHS-PEG5結合フィンゴリモドを1/42モル比で100％DMSOにおいて混合し、室温で3時間インキュベートした。次いで、100％DMSOにおいて、最終モル比1：13.5(TCO-ペプチド2: NHS PEG5結合フィンゴリモド)で追加のTCO-ペプチド2を反応溶液に添加した。混合物をさらに室温で3時間インキュベートした。図13に示すように、TCO-ペプチド2及びフィンゴリモドから構成された薬物バンドルは、m.w.が5,069ダルトンである。
TCO-ペプチド3を濃度10mMとなるように100mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）に溶解し、NHS-PEG5結合フィンゴリモドを濃度50mMとなるように100％DMSOに溶解した。TCO-ペプチド3とPEG5-N HS結合フィンゴリモドとを1/42モル比で混合し、室温で一晩反応させた。図14に示すように、TCO-ペプチド3及びフィンゴリモドから構成された薬物バンドルは、m.w.が9,479ダルトンであり、10個のフィンゴリモド分子がTCO-ペプチド3リンカーユニットに結合されたことを示す。
以下に示すように、合成した薬物バンドルは、１つの遊離TCO官能基及び1つのセットの５つのフィンゴリモド分子を有するリンカーユニットから構成される。
以下に示すように、第２の合成した薬物バンドルは、１つの遊離TCO官能基及び１つのセットの10個のフィンゴリモド分子を有するリンカーユニットから構成される。
実施例9:NHS-PEG5結合フィンゴリモドリン酸塩分子とTCO-ペプチド2との結合
TCO-ペプチド2とN HS-PEG5結合フィンゴリモドリン酸塩とを1/42のモル比で100mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）に混合し、室温で3時間反応させた。質量分析は、TCO-ペプチド2及びフィンゴリモドリン酸塩から構成された薬物バンドルのm.w.が5,379.16ダルトンであることを示す(図15)。
以下に示すように、合成した薬物バンドルは、１つの遊離TCO官能基、及び１つのセットの５つのフィンゴリモドリン酸塩分子（エフェクター成分）を有するリンカーユニットから構成される。
実施例10:NHS-PEG4-PEG3-S-S結合フィンゴリモド分子とTCO-ペプチド2との結合
５つのNHS-PEG4-PEG3-S-S結合フィンゴリモド分子をTCO-ペプチド2に連結した。上記の実施例と同様に、NHS-PEG4-PEG3-S-S結合フィンゴリモド分子とTCO-ペプチド2のリジン残基のNH2基とを結合した。質量分析MALDI-TOFにより同定した。
以下に示す合成した薬物バンドルは、m.w.が7,815ダルトンであり、１つの遊離TCO官能基、及び１つのセットの５つのフィンゴリモド分子を有するリンカーユニットから構成される。
実施例11: HEK293F過剰発現システムによる組換えヒトCD32a細胞外ドメインの調製
遺伝子をコードする配列をpG1K発現カセットに入れた。ヒトCD32aの細胞外部分のアミノ酸配列は、配列番号:28に記載され、ヒスチジンタグを有する組換えタンパク質として発現された。ヒトCD32aの組換え細胞外ドメインをFreeStyle 293F懸濁培養細胞発現システム及び培地(Invitrogen, Carlsbad, USA)で発現した。FreeStyle 293F細胞を1.0×106個の生存細胞/mlの密度で600ml培地に接種し、トランスフェクションの際に細胞が活発な分裂の状態にあることを確保するために、18〜24時間維持した後トランスフェクションした。トランスフェクションの際に、1.0×107個の細胞を入れた96ml培地を2Lのエルレンマイヤーシェーカーフラスコに入れ、平均分子量25kDaの線状ポリエチレンイミン(Polysciences, Warrington, USA)をトランスフェクション試薬として使用した。トランスフェクション後、オービタルシェーカー(125 rpm)において、トランスフェクションされた細胞を37℃で4時間インキュベートし、新しい培地で細胞密度を2.5×106細胞/mlに調整し、4〜5日インキュベートした。培養上清液を回収し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより培地におけるタンパク質を精製した。図16は、ヒトCD32aの細胞外ドメインの精製されたタンパク質のSDS-PAGE分析を示す。
実施例12: HEK293F過剰発現システムによる組換えヒトトランスフェリン-1受容体(TfR)の細胞外ドメインの調製
遺伝子をコードする配列をpG1K発現カセットに入れた。ヒトTfR1の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号:29に記載され、ヒスチジンタグを有する組換えタンパク質として発現された。ヒトTfR1の組換え細胞外ドメインをFreeStyle 293F懸濁培養細胞発現システム及び培地(Invitrogen, Carlsbad, USA)で発現した。FreeStyle 293F細胞を1.0×106個の生存細胞/mlの密度で600ml培地に接種し、トランスフェクションの際に細胞が活発な分裂の状態にあることを確保するために、18〜24時間維持した後トランスフェクションした。トランスフェクションの際に、1.0×107個の細胞を入れた96ml培地を2Lのエルレンマイヤーシェーカーフラスコに入れ、平均分子量25kDaの線状ポリエチレンイミン(Polysciences, Warrington, USA)をトランスフェクション試薬として使用した。トランスフェクション後、オービタルシェーカー(125 rpm)において、トランスフェクションされた細胞を37℃で4時間インキュベートし、新しい培地で細胞密度を2.5×106細胞/mlに調整し、4〜5日インキュベートした。培養上清液を回収し、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより培地におけるタンパク質を精製した。図16は、ヒトTfR1の細胞外ドメインの精製されたタンパク質のSDS-PAGE分析を示す。
実施例13: Expi293F過剰発現システムによる、RSVのタンパク質Fに特異的なmAbのscFv、エンドトキシンに特異的なmAbのscFv、CD32aの細胞外ドメインに特異的なmAbのscFvの調製
RSVのタンパク質Fに特異的なscFvのVL及びVHは、モノクローナル抗体であるパリビズマブに由来し、エンドトキシンに特異的なscFvのVL及びVHは、モノクローナル抗体であるWN1 222-5(特許US 5858728)に由来し、CD32aの細胞外ドメインに特異的なscFvのVL及びVHは、MDE-8(US公開US2007/0253958)に由来した。それらの抗体に由来のscFvを、C末端に可撓性リンカー（GGGGSGGGGS）及び末端システイン残基を有するように設計した。システイン残基は、種々のリンカーユニットのリンクアームの遊離末端に存在するマレイミド基との結合のために、スルフヒドリル基を提供する。RSVのタンパク質Fに特異的なmAbのscFv、エンドトキシンに特異的なmAbのscFv、及びCD32aの細胞外成分に特異的なmAbのscFvを調製するために、これらの３つの抗体のVL及びVHのDNA配列をさらにコドン最適化した。VL-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH-(GGGGS)2-CをコードするDNA配列を合成した。本発明の実験で調製した、RSVのタンパク質Fに特異的なmAbのscFv、エンドトキシンに特異的なmAbのscFv、及びCD32aの細胞外ドメインに特異的なmAbのscFvのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:30〜32に記載されている。
哺乳動物発現システムを用いてscFvタンパク質を調製する際に、実験においてExpi293FTM細胞株に基づく過剰発現システムを用いた。該システムは、Expi293FTM細胞株、カチオン性脂質系ExpiFectamineTM293試薬、ExpiFectamineTM293トランスフェクションエンハンサー1、2、及び発現システムの一部である培地(Gibco、New York、USA)を含むExpiFectamineTM293トランスフェクションキット(Life Technologies、Carlsbad、USA)を使用した。
scFvをコードする配列をpG1K発現カセットに入れた。Expi293F細胞を2.0×106生存細胞/mlの密度でExpi293F発現培地に接種した後、トランスフェクションの際に細胞が活発な分裂の状態にあることを確保するために、18〜24時間維持した後トランスフェクションした。トランスフェクション際に、7.5×108個の細胞を入れた255mlの培地を2Lのエルレンマイヤーシェーカーフラスコに入れた後、ExpiFectamineTM293トランスフェクション試薬でトランスフェクションした。トランスフェクション後、オービタルシェーカー(125 rpm)においてトランスフェクションされた細胞を37℃で16〜18時間インキュベートし、次いで、そこにExpiFectamineTM293トランスフェクションエンハンサー1及びエンハンサー2を加えた後、引き続き、5-6日間インキュベートした。培養上清液を回収し、プロテインLアフィニティークロマトグラフィーにより培地におけるscFvタンパク質を精製した。
図18A、18Bは、RSVのタンパク質Fに特異的なmAbのscFvを精製したSDS-PAGE及びELISAの分析結果を示し、図18C、18Dは、エンドトキシンに特異的なmAbのscFvを精製したSDS-PAGE及びELISAの分析結果を示し、図18E、18Fは、CD32aの細胞外ドメインに特異的なmAbのscFvを精製したSDS-PAGE及びELISAの分析結果を示す。96ウェルELISAプレート(Greiner Bio-one)をそれぞれ5μg/mlのRSVのタンパク質F、10μg/mlのエンドトキシン、及び5μg/mlのCD32aの細胞外ドメインでコーティングした。HRP結合プロテインLにより1:5000の比で精製scFvを検出した。
ELISA結果は、各精製scFvタンパク質がその抗原(RSVのタンパク質F、エンドトキシン、又はCD32aの細胞外ドメイン)に特異的に結合されたことを示す。ここで、アダリムマブscFv(抗-TNF-α scFv)を陰性対照として使用した。
実施例14: Expi293F 過剰発現システムによる、TfR1の細胞外ドメインに特異的なmAbのscFv、及びβ-アミロイドに特異的なmAbのscFvの調製
TfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvのVL及びVHは、モノクローナル抗体OX26に由来し、β-アミロイドに特異的なscFvのVL及びVHは、モノクローナル抗体であるバピネツズマブに由来する。それらの抗体に由来のscFvを、C末端に可撓性リンカー（GGGGSGGGGS）及び末端システイン残基を有するように設計した。システイン残基は、種々のリンカーユニットのリンクアームの遊離末端に存在するマレイミド基との結合のために、スルフヒドリル基を提供する。TfR1の細胞外ドメインに特異的なmAbのscFv、及びβ-アミロイドに特異的なmAbのscFvを調製するために、これらの2つの抗体のVL及びVHのDNA配列をさらにコドン最適化した。VL-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH-(GGGGS)2-CをコードするDNA配列を合成した。本発明の実験で調製した、TfR1の細胞外ドメインに特異的なmAbのscFv、及びβ-アミロイドに特異的なmAbのscFvのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号:33、34に記載されている。
哺乳動物発現システムを用いてscFvタンパク質を調製する際に、後続の実験のために、Expi293FTM細胞株に基づく過剰発現システムを使用した。該システムは、Expi293FTM細胞株、カチオン性脂質系ExpiFectamineTM293試薬、ExpiFectamineTM293トランスフェクションエンハンサー1、2、及び培地(Gibco、New York、USA)を含むExpiFectamineTM293トランスフェクションキット(Life Technologies、Carlsbad、USA)を使用した。
scFvをコードする配列をpG1K発現カセットに入れた。Expi293F細胞を2.0×106個の生存細胞/mlの密度でExpi293F発現培地に接種した後、トランスフェクションの際に細胞が活発な分裂の状態にあることを確保するために、18〜24時間維持した後トランスフェクションした。トランスフェクション際に、7.5×108個の細胞を入れた255mlの培地を2Lのエルレンマイヤーシェーカーフラスコに入れた後、ExpiFectamineTM293トランスフェクション試薬でトランスフェクションした。トランスフェクション後、オービタルシェーカー(125 rpm)においてトランスフェクションされた細胞を37℃で16〜18時間インキュベートし、次いで、そこにExpiFectamineTM293トランスフェクションエンハンサー1及びエンハンサー2を加えた後、引き続き、5〜6日間インキュベートした。
培養上清液を回収し、プロテインLアフィニティークロマトグラフィーにより培地におけるscFvタンパク質を精製した。図19A、19Bは、それぞれTfR1の細胞外ドメインに特異的なmAbのscFvを精製したSDS-PAGE及びELISAの分析結果を示した。図19C、19Dは、それぞれβ-アミロイドに特異的なmAbのscFvを精製したSDS-PAGE及びELISAの分析結果を示した。ELISAプレートをそれぞれ5μg/mlのTfR1の細胞外ドメイン及び5μg/mlのβ-アミロイドでコーティングした。HRP結合プロテインLにより1:5000の比で精製scFvを検出した。
ELISA結果は、各精製scFvタンパク質がその抗原(TfR1の細胞外ドメイン、又はβ-アミロイド)に特異的に結合されたことを示す。ここで、HRP結合プロテインL単独を陰性対照として使用した。
実施例15:ヒトCD32aの細胞外ドメインに特異的なファージディスプレイscFvの構築及び選択
ヒトCD32aの細胞外ドメインに特異的なscFvを有するファージクローンは、中央研究院ゲノミクス研究センター（台湾、台北）のDr. An-Suei Yangの研究室と結約を結んで得た。G6抗VEGF Fab(タンパク質バンクコード：2FJG)に由来のGH2 scFvライブラリーのフレームワーク配列を、ファージミドベクターpCANTAB5E(GE Healthcare)の制限部位SfiIとNotIにクローン化した。該ファージミドベクターは、アンピシリン耐性、lacZプロモーター、scFv断片を培養上清液に分泌させるためのpelBリーダー配列、及び検出用のE-タグを有する。オリゴヌクレオチド指向性変異誘発法により、scFvテンプレートのVH及びVLドメインを別々に多様化し、各可変ドメインにおける３つのCDRを同時に多様化した。 109を超えたクローンを有するscFvライブラリーを用いてCD32aの細胞外ドメインの選択を行った。
組換えCD32aタンパク質でコーティングしたマキシソープ96-ウェルプレート(Nunc)( 1μg/100μL PBS/ウェル)を用いて、抗CD32a抗体をパニングした。簡単に言えば、室温でウェルにおけるコーティング溶液を2時間振とうすることにより、ウェルをヒトCD32aでコーティングした。その後、室温で、CD32aコーティングウェルをブロッキングバッファー(5％スキムミルク含有PBST(0.1％トゥイーン20を含むリン酸緩衝生理食塩水))で1時間処理した。ブロッキングバッファーにおける組換えファージを8x1011CFU（コロニー形成単位）/mlに希釈した後、CD32aコーティングウェルに添加し、1時間静かに振とうした。次いで、ウェルをPBSTで10回激烈に洗浄し、続いてPBSで6回洗浄して非特異的結合ファージを除去した。0.1M HCl/グリシン緩衝液（pH 2.2）で結合したファージを溶出した直後、溶出液を2M トリス塩基緩衝液（pH 9.0）で中和した。大腸菌株ER2738(OD600＝〜0.6)を用いて、37℃で30分間ファージ感染した。アンピシリンで30分間処理して感染していない大腸菌を除去した。アンピシリン処理後、カナマイシン耐性を有するヘルパーファージM13KO7を添加し、さらに1時間インキュベートした。大腸菌培地からヘルパーファージにより救出されたファージを選択し、37℃でカナマイシンの存在下で、一晩激烈に振とうして増幅させた。増幅されたファージをPEG/NaClで沈殿させ、次の選択-増幅サイクルのためにPBSに再懸濁させた。この選択増幅-手順を繰り返すことにより、CD32aの細胞外ドメインに対して計3回の連続的パンニングラウンドを行った。
ファージ感染ER2738コロニーのプレートを段階的に希釈した後、計数し、ファージ力価を計算し、各パンニングラウンド後の出力力価/ml(CFU/ml)を得た。3ラウンドのパンニング後に、ファージ出力力価が1.6E+04 CFU/ウェルから2.2E+07 CFU/ウェルに1000倍増加した。各ラウンドのファージ出力/入力力価比を図20Aに示す。各パンニングラウンドにおいて、ファージ出力/入力力価比をy軸に示す。3ラウンドのパンニング後に、陽性クローンが明確に富化した。3回目のパニングラウンドのファージ出力/入力力価は1回目の100倍であり、結合クローンがライブラリーにおいて支配的になった。
典型的な選択手順では、ヒトCD32aコーティングELISAプレートウェルに対して3ラウンドの抗原パニングを行った後、コーティングされたCD32aを有するELISAにおいて、約80％の結合したファージ粒子が特異的にCD32aに結合した。
実施例16:ヒトCD32aの細胞外ドメインに特異的なファージディスプレイscFvに対するシングルコロニーELISA分析
シングルクローンファージで感染した大腸菌株ER2738のそれぞれは、そのファージミドに選択scFv遺伝子を持っている。深いウェルに2YTブロス(16g/Lトリプトン、10g/L酵母エキス、5g/L NaCl、pH7.0)及び100μg/mlアンピシリンを添加し、37℃で振とうし、これらの大腸菌を中間対数期まで成長させた。ブロスのOD600が1.0に達した後、IPTGを最終濃度1μg/mlとなるように添加した。該プレートを37℃で一晩激烈に振とうしながらインキュベートした。その後、該プレートを4000g、4℃で15分間遠心分離した。
ELISAにより、可溶性scFv結合試験を行った。簡単に言えば、マキシソープ96-ウェルプレート(Nunc)をCD32aの細胞外ドメイン(0.5μg/100μl PBS/ウェル)又はヒトトランスフェリン-1受容体（陰性対照抗原）でコーティングし、4℃で18時間振とうした。300μlのブロッキングバッファーで1時間処理した後、分泌scFvを含む上清100μlを100μlのブロッキングバッファーに混合し、コーティングされたプレートに添加しさらに1時間処理した。ヤギ抗Eタグ抗体(HRP結合、1:4000, Cat. No. AB19400, Abcam)をプレートに添加し、さらに1時間処理した。ウェルにTMB基質(50μl/ウェル)を添加し、1N HCl(50 μl/ウェル)の添加により反応を停止した後、450nmにおける吸光度を測定した。
3回目のパニング後に、計192個のファージクローンを本分析に供した。そのうち、10を超えるOD450の差異を有するCD32aに結合した12個のscFvクローンを、これらのscFvをコードする遺伝子の配列決定によってさらに特徴付けた。6つの異なるDNA配列が同定された。図20Bは、scFvクローン22D1のELISA結果を示す。0.8のOD450でヒトCD32に結合したscFVクローン22D1のアミノ酸配列を配列番号:35に示す。
実施例17: ヒトTfR1の細胞外ドメインに特異的なファージディスプレイscFvの構築及び選択
ヒトTfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvを有するファージクローンは、中央研究院ゲノミクス研究センター（台湾、台北）のDr. An-Suei Yangの研究室と結約を結んで得た。G6抗VEGF Fab(タンパク質バンクコード：2FJG)に由来のGH2 scFvライブラリーのフレームワーク配列を、ファージミドベクターpCANTAB5E(GE Healthcare)の制限部位SfiIとNotIにクローン化した。該ファージミドベクターは、アンピシリン耐性、lacZプロモーター、scFv断片を培養上清液に分泌させるためのpelBリーダー配列、及び検出用のE-タグを有する。オリゴヌクレオチド指向性変異誘発法により、scFvテンプレートのVH及びVLドメインを別々に多様化し、各可変ドメインにおける３つのCDRを同時に多様化した。 109を超えたクローンを有するscFvライブラリーを用いてCD32aの細胞外ドメインの選択を行った。
組換えTfR1タンパク質でコーティングしたマキシソープ96-ウェルプレート(Nunc)(1μg/100μL PBS/ウェル)を用いて、抗CD32a抗体をパニングした。簡単に言えば、室温でウェルにおけるコーティング溶液を2時間振とうすることにより、ウェルをヒトTfR1でコーティングした。その後、室温で、TfR1コーティングウェルをブロッキングバッファー(5％スキムミルク含有PBST(0.1％トゥイーン20を含むリン酸緩衝生理食塩水))で1時間処理した。ブロッキングバッファーにおける組換えファージを8x1011CFU（コロニー形成単位）/mlに希釈した後、TfR1コーティングウェルに添加し、1時間静かに振とうした。次いで、ウェルをPBSTで10回激烈に洗浄し、続いてPBSで6回洗浄して非特異的結合ファージを除去した。0.1M HCl/グリシン緩衝液（pH 2.2）で結合したファージを溶出した直後、溶出液を2M トリス塩基緩衝液（pH 9.0）で中和した。大腸菌株ER2738(OD600＝〜0.6)を用いて、37℃で30分間ファージ感染した。アンピシリンで30分間処理して感染していない大腸菌を除去した。アンピシリン処理後、カナマイシン耐性を有するヘルパーファージM13KO7を添加し、さらに1時間インキュベートした。大腸菌培地からヘルパーファージにより救出されたファージを選択し、37℃でカナマイシンの存在下で、一晩激烈に振とうして増幅させた。増幅されたファージをPEG/NaClで沈殿させ、次の選択-増幅サイクルのためにPBSに再懸濁させた。この選択増幅-手順を繰り返すことにより、TfR1の細胞外ドメインに対して計3回の連続的パンニングラウンドを行った。
ファージ感染ER2738コロニーのプレートを段階的に希釈した後、計数し、ファージ力価を計算し、各パンニングラウンド後の出力力価/ml(CFU/ml)を得た。3ラウンドのパンニング後に、ファージ出力力価が3.74E+03 CFU/ウェルから1.5E+08 CFU/ウェルに104倍増加した。各ラウンドのファージ出力/入力力価比を図21Aに示す。各パンニングラウンドにおいて、ファージ出力/入力力価比をy軸に示す。3ラウンドのパンニング後に、陽性クローンが明確に富化した。3回目のパニングラウンドのファージ出力/入力力価は1回目の104倍であり、結合クローンがライブラリーにおいて支配的になった。
典型的な選択手順では、ヒトTfR1コーティングELISAプレートウェルに対して3ラウンドの抗原パニングを行った後、コーティングされたTfR1を有するELISAにおいて、約80％の結合したファージ粒子が特異的にTfR1に結合した。
実施例18: ヒトTfR1の細胞外ドメインに特異的なファージディスプレイscFvに対するシングルコロニーELISA分析
シングルクローンファージで感染した大腸菌株ER2738のそれぞれは、そのファージミドに選択scFv遺伝子を持っている。深いウェルに2YTブロス(16g/Lトリプトン、10g/L酵母エキス、5g/L NaCl、pH7.0)及び100μg/mlアンピシリンを添加し、37℃で振とうし、これらの大腸菌を中間対数期まで成長させた。ブロスのOD600が1.0に達した後、IPTGを最終濃度1μg/mlとなるように添加した。該プレートを37℃で一晩激烈に振とうしながらインキュベートした。その後、該プレートを4000g、4℃で15分間遠心分離した。
ELISAにより、可溶性scFv結合試験を行った。簡単に言えば、マキシソープ96-ウェルプレート(Nunc)をTfR1の細胞外ドメイン(0.5μg/100μl PBS/ウェル)又はCD16b（陰性対照抗原）でコーティングし、4℃で18時間振とうした。300μlのブロッキングバッファーで1時間処理した後、分泌scFvを含む上清100μlを100μlのブロッキングバッファーに混合し、コーティングされたプレートに添加しさらに1時間処理した。ヤギ抗Eタグ抗体(HRP結合、1:4000, Cat. No. AB19400, Abcam)をプレートに添加し、さらに1時間処理した。ウェルにTMB基質(50μl/ウェル)を添加し、1N HCl(50 μl/ウェル)の添加により反応を停止した後、450nmにおける吸光度を測定した。
3回目のパニング後に、計192個のファージクローンを本分析に供した。そのうち、10を超えるOD450の差異を有するTfR1に結合した23個のscFvクローンを、これらのscFvをコードする遺伝子の配列決定によってさらに特徴付けた。16つの異なるDNA配列が同定された。図21Bは、scFvクローン12A1のELISA結果を示す。1.7のOD450でヒトTfR1に結合したscFVクローン12A1のアミノ酸配列を配列番号:36に示す。
実施例19: CD32aの細胞外ドメインに特異的なTCO-scFvの調製
上記の実施例と同様に、配列番号:32をコードするDNA配列を合成し、発現した。Mal-PEG3-TCO(Conju-probe,Inc.)との結合において、5mMのジチオスレイトール(DTT)と共に静かに振とうしながら室温で4時間インキュベートすることによって、抗CD32a mAbの精製scFvのC末端におけるシステイン残基を還元した。NAP-10 Sephadex G-25カラムを用いて、還元型scFvタンパク質を含む緩衝液を、リン酸ナトリウム緩衝液(100mMリン酸ナトリウム、pH7.0、50 mM NaCl、及び5 mM EDTA)に置換した。室温でMal-PEG3-TCOとscFvとを10:1のモル比で一晩反応させることにより結合を行った。余分な架橋剤を脱塩カラムで除去し、TCO結合scFv生成物を分析した。
質量分析MALDI-TOFの結果は、TCO結合CD32aに特異的なscFvのサンプルのm.w.が27,337ダルトンであることを示した。TCO結合CD32aに特異的なscFvの純度を、12%SDS-PAGEのクーマシーブルーによって分析した。図22A及び図22Bは、それぞれTCO結合CD32aに特異的なscFvのELISA分析及び質量分析を示し、ここで、未修飾のCD32aに特異的なscFvを陽性対照とした。ELISAの結果から分かるように、TCO結合CD32aに特異的なscFvがヒトCD32aの組換え細胞外ドメインに結合された。
実施例20: TfR1の細胞外ドメインに特異的なテトラジン-scFvの調製
上記の実施例と同様に、配列番号:33をコードするDNA配列を合成し、発現した。Mal-PEG4-テトラジン(Conju-probe,Inc.)との結合において、5mMのDTTと共に静かに振とうしながら室温で4時間インキュベートすることによって、TfR1に特異的なmAbの精製scFvのC末端におけるシステイン残基を還元した。NAP-10 Sephadex G-25カラムを用いて、還元型scFvタンパク質を含む緩衝液を、リン酸ナトリウム緩衝液(100mMリン酸ナトリウム、pH7.0、50mM NaCl、及び5mM EDTA)に置換した。4℃でMal-PEG4-テトラジンとscFvとを10:1のモル比で一晩反応させることにより結合を行った。余分な架橋剤を脱塩カラムで除去し、テトラジン結合scFv生成物を分析した。
質量分析MALDI-TOFの結果は、テトラジン結合TfR1に特異的なscFvのサンプルのm.w.が27,086ダルトンであることを示した。テトラジン結合TfR1に特異的なscFvの純度を、12%SDS-PAGEのクーマシーブルーによって分析した。図23A及び図23Bは、それぞれテトラジン結合TfR1に特異的なscFvのELISA分析及び質量分析を示し、ここで、未修飾のTfR1に特異的なscFvを陽性対照とした。ELISAの結果から分かるように、テトラジン結合TfR1に特異的なscFvがTfR1の組換え細胞外ドメインに結合された。
実施例21:エンドトキシンに特異的な３つのscFvの、テトラジン-ペプチド1に基づく３つのマレイミド-PEG12リンクアームへの結合
本実施例は、3つのscFvをテトラジン-ペプチド1に基づく３つのPEG12-マレイミドリンクアームに結合できることを説明する。３つのPEG12-マレイミドリンクアームを有するテトラジン-ペプチド1に結合する前に、DTTとエンドトキシンに特異的なscFvとを2:1([DTT]:[scFv])のモル比で、25°Cで静かに振とうしながら4時間インキュベートすることにより、そのC末端システインを還元状態に維持した。その後、NAP-10 Sephadex G-25カラム(GE Healthcare)を用いて、還元型エンドトキシンに特異的なscFvを含む緩衝液を、マレイミド-SH結合反応緩衝液(100 mM リン酸ナトリウム、pH7.0、50mM NaCl及び5mM EDTA)に置換した。還元反応及び緩衝液交換の後、4°Cで、1:4([リンカー]:[タンパク質])のモル比で、３つのPEG12-マレイミドリンクアームを有するテトラジン-ペプチド1との結合を一晩行った。
エンドトキシンに特異的な3つのscFvに結合されたPEG12-マレイミド結合テトラジン-ペプチド1を、サイズ排除クロマトグラフィーカラムS75により、遊離scFv、遊離PEG12-マレイミド結合テトラジン-ペプチド1及びエンドトキシンに特異的な1つ又は２つのscFvに結合されPEG12-マレイミド結合テトラジン-ペプチド1から分離した。
図24Aは、合成した標的化リンカーユニットのFPLC溶出プロファイル（保持容量9.5ml）である。該リンカーユニットは、遊離のテトラジン官能基、及び１つのセットのエンドトキシンに特異的な3つのscFv（標的化成分）から構成される。該生成物(即ち、遊離のテトラジン官能基を有し、且つ１つのセットのエンドトキシンに特異的な3つのscFvが結合されたPEG12-マレイミド結合テトラジン-ペプチド1)を溶出フラクションにより精製し、図24Bに示す10%SDS-PAGE分析のレーン4（矢印）に示した。
実施例22: テトラジン-ペプチド1に基づく３つのマレイミド-PEG12リンクアームに結合されたエンドトキシンに特異的な3つのscFvを含む標的化リンカーユニットのMALDI-TOFによる分析
テトラジン-ペプチド1に基づく３つのマレイミド-PEG12リンクアームに結合されたエンドトキシンに特異的な３つのscFvを有する標的化リンカーユニットのサンプルをMALDI-TOFにより分析した。実験的分子量の中央値は、３つのマレイミド-PEG12リンクアームを有するテトラジン-ペプチド1に結合されたエンドトキシンに特異的な３つの理論分子量の中央値と一致した。図24Cの質量分析プロファイルから分かるように、本発明の標的化リンカーユニットの平均分子量は、81,727ダルトンである。
以下に示す合成した標的化リンカーユニットは、遊離テトラジン官能基及び１つのセットのエンドトキシンに特異的な３つのscFvを標的化成分として有するリンカーユニットから構成される。
実施例23: RSVのタンパク質Fに特異的な３つのscFvを有するテトラジン-ペプチド1に基づく標的化リンカーユニットの調製
scFvのリンカーユニットへの結合、生成物の精製及び分析は、先の実施例と同じである。
図25は、合成した標的化リンカーユニットの質量分析を示す。該合成した標的化リンカーユニットは、遊離テトラジン官能基及び１つのセットのRSVのタンパク質Fに特異的な３つのscFvを標的化成分として有するリンカーユニットから構成される(以下に示す)。図25に示すように、標的化リンカーユニットの分子量は、81,978ダルトンである。
実施例24:β-アミロイドに特異的な３つのscFvの、TCO-ペプチド1に基づく３つのマレイミド-PEG12 リンクアームへの結合
本実施例は、3つのscFvをTCO-ペプチド1に基づく３つのマレイミド-PEG12リンクアームに結合できることを説明する。３つのマレイミド-PEG12リンクアームを有するTCO -ペプチド1に結合する前に、DTTとβ-アミロイドに特異的なscFvとを2:1([DTT]:[scFv])のモル比で、室温で静かに振とうしながら4時間インキュベートすることにより、そのC末端システインを還元状態に維持した。その後、NAP-10 Sephadex G-25カラム(GE Healthcare)を用いて、還元型β-アミロイドに特異的なscFvを含む緩衝液を、マレイミド-SH結合反応緩衝液(100 mM リン酸ナトリウム、pH7.0、50mM NaCl及び5mM EDTA)に置換した。還元反応及び緩衝液交換の後、室温で、1:4([リンカー]:[タンパク質])のモル比で、３つのマレイミド-PEG12リンクアームを有するTCO-ペプチド1との結合を一晩行った。
上記実施例の反応混合物をpH5.0に調整し、予め平衡化した(5mM EDTA、50mM 酢酸ナトリウム、pH5.0)陽イオン交換カラムSP Sepharose FF(GE Healthcare)に適用した。β-アミロイドに特異的な３つのscFvに結合されたマレイミド-PEG12結合TCO-ペプチド1を溶出した（線形勾配：0-500mM塩化ナトリウム；100分間、流速：0.5ml/min）。陽イオン交換カラムSP Sepharose FFにより、β-アミロイドに特異的な３つのscFvに結合されたマレイミド-PEG12結合TCO-ペプチド1を、遊離scFv、遊離マレイミド-PEG12結合TCO-ペプチド1、及びβ-アミロイドに特異的な１つ及び２つのscFvに結合されたマレイミド-PEG12結合TCO-ペプチド1から分離した。精製した生成物、β-アミロイドに特異的な３つのscFvに結合されたマレイミド-PEG12結合TCO-ペプチド1を濃縮し、緩衝液をクリック反応緩衝液（100mM リン酸カリウム；pH 7.0）に交換した。
図26Aは、合成したエフェクターリンカーユニットのFPLC溶出プロファイル（陽イオン交換カラムSP Sepharose FF）である。該合成したエフェクターリンカーユニットは、遊離TCO官能基及び１つのセットのβ-アミロイドに特異的な３つのscFvをエフェクター成分として有するリンカーユニットから構成される。記号 #1及び#2は、それぞれβ-アミロイドに特異的な２つ及び３つのscFvに結合されたマレイミド-PEG12結合TCO-ペプチド1の溶出ピークを示す。生成物（遊離TCO官能基及びβ-アミロイドに特異的な３つのscFvを有するマレイミド-PEG12結合TCO-ペプチド1）を精製し、図26Bに示す8%SDS-PAGE分析のレーン2に示した。
実施例25: TCO-ペプチド1に基づく３つのマレイミド-PEG12リンクアームに結合されたβ-アミロイドに特異的な３つのscFvを含むエフェクターリンカーユニットのMALDI-TOFによる分析
TCO-ペプチド1に基づく３つのマレイミド-PEG12リンクアームに結合されたβ-アミロイドに特異的な３つのscFvを有するエフェクターリンカーユニットのサンプルをMALDI-TOFにより分析した。実験的分子量の中央値は、３つのマレイミド-PEG12リンクアームを有するTCO-ペプチド1に結合されたβ-アミロイドに特異的な３つの理論分子量の中央値と一致した。図26Cの質量分析プロファイルから分かるように、合成したエフェクターリンカーユニットの平均分子量は、87, 160ダルトンである。
以下に示す合成したエフェクターリンカーユニットは、遊離TCO官能基及び１つのセットのβ-アミロイドに特異的な３つのscFvを標的化成分として有するリンカーユニットから構成される。
実施例26: 標的化成分としてRSVのタンパク質Fに特異的な３つのscFv、及びエフェクター成分としてCD32aの細胞外ドメインに特異的な１つのscFvを有する分子構築物の調製
この実施例において、上記実施例の標的化リンカーユニットと、TCO-CD32aの細胞外ドメインに特異的なscFvとをテトラジン-TCOiEDDA反応により結合した。具体的には、標的化リンカーユニットは、RSVのタンパク質Fに特異的な３つのscFv及び１つの遊離テトラジン基を有する。
製造者(Jena Bioscience GmbH、Jena、Germany)の指示に従って、テトラジン-TCOライゲーションを行った。簡単に言えば、100μlの標的化リンカーユニット(0.3mg/ml)をエフェクターユニットを含む溶液に1:2([テトラジン]:[TCO])のモル比で加えた。室温で反応混合物を1時間インキュベートした。生成物について質量分析を行った結果、分子量が113036ダルトンであることを示した(図27A)。
生成物である、標的化成分としてRSVのタンパク質Fに特異的な3つのscFv、及びエフェクター成分としてCD32aの細胞外ドメインに特異的な１つのscFvを有する単一のリンカーユニット分子構築物を以下に示す。
実施例27: 標的化成分としてエンドトキシンに特異的な３つのscFv、及びエフェクター成分としてCD32aに特異的な細胞外ドメイン１つのscFvを有する分子構築物の調製
上記の実施例で得られた標的化リンカーユニットと、CD32aの細胞外ドメインに特異的なTCO-scFvとを、テトラジン-TCO iEDDA反応により結合した。
上記の実施例と同様に、テトラジン-TCOライゲーションを行った。生成物は、以下に示すように、標的化成分としてエンドトキシンに特異的な3つのscFv、及びエフェクター成分としてCD32aの細胞外ドメインに特異的な１つのscFvを有する単一のリンカーユニット分子構築物である。図27Bの質量分析は、分子構築物の分子量が113,761ダルトンであることを示した。
実施例28: 標的化成分としてTfR1の細胞外ドメインに特異的な１つのscFv、及びエフェクター成分としてβ-アミロイドに特異的な３つのscFvを有する分子構築物の調製
上記の実施例で得られた標的化リンカーユニットと、テトラジン- TfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvとを、テトラジン-TCO iEDDA反応により結合した。
製造者(Jena Bioscience GmbH、Jena、Germany)の指示に従って、テトラジン-TCO ライゲーション を行った。簡単に言えば、12.6μlの標的化成分(5.65mg/ml)を、エフェクター成分を有するリンカーユニットを含む溶液に10:1([テトラジン]:[TCO])のモル比で加えた。室温で反応混合物を3時間インキュベートした。生成物について質量分析を行った結果、分子量が114,248ダルトンであることを示した(図27C)。
ここで示す生成物は、標的化成分としてTfR1の細胞外ドメインに特異的な１つのscFv、及びエフェクター成分としてβ-アミロイドに特異的な３つのscFvを有する単一のリンカーユニット分子構築物である。
実施例29:標的化成分としてTfR1の細胞外ドメインに特異的な1つのscFv、及びエフェクター成分として５つのフィンゴリモド分子を有する分子構築物の調製
この実施例において、TfR1の細胞外ドメインに特異的な1つのscFv、及び５つのフィンゴリモド分子の薬物バンドルを有する分子構築物を構築した。TCO-テトラジン iEDDA反応により分子構築物を調製した。製造者(Jena Bioscience GmbH、Jena、Germany)の指示に従って、テトラジン-TCOライゲーションを行った。簡単に言えば、277μlのエフェクターリンカーユニット(0.126μmole)を標的化成分であるTfR1の細胞外ドメインに特異的な1つのscFvを含む溶液に5:1([TCO]:[テトラジン])のモル比で加えた。反応混合物を室温で3時間インキュベートした。
以下に示す生成物は、TfR1の細胞外ドメインに特異的な1つのscFv、及び５つのフィンゴリモド分子を含む１つの薬物バンドルを有する分子構築物である。図28A、28Bは、それぞれ本発明の分子構築物のSDS-PAGE及び質量分析を示す。図28Aにおいて、主要なバンド,矢印#1は、TfR1の細胞外ドメインに特異的な1つのscFv、及び５つのフィンゴリモド分子を含む薬物バンドルを有する分子構築物を示す。矢印#2は、非結合のTfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvを示す。
質量分析は、TfR1の細胞外ドメインに特異的な1つのscFv、及び５つのフィンゴリモド分子の薬物バンドルを有する分子構築物の分子量は、32,105ダルトンである。
実施例30: リンクアームを介してペプチドコアに結合されたフィンゴリモドの生物学的活性分析
上記の実施例と同様に、修飾されたフィンゴリモド分子(NHS-PEG5結合フィンゴリモド、並びに遊離TCO官能基及び５つのフィンゴリモド分子を有する薬物バンドル)を合成した。ヒトPBMC(末梢血単核細胞)から単離されたヒト初代B細胞により、S1P駆動型トランスウェル遊走分析を行うことにより、３つの化合物の生物学的活性を調べた。
ヒト初代B細胞の調製において、B細胞分離キット(Myltenyi Biotech)によりヒトB細胞をヒトPBMC(末梢血単核細胞)から単離した。その後、単離されたB細胞を15cmのディッシュに接種し、10％ウシ胎仔血清(Gibco)及び20 ng/ml IL2(Peprotech Inc.)を添加したIMDM培地に維持した。
図29Aは、単離されたS1P1発現ヒトB細胞の染色分析を示す。2x105個のB細胞を10μg/mlの抗S1P1受容体抗体(AbD Serotec)とともに、1％BSA含有PBSにより氷上で30分間インキュベートした。細胞を洗浄し、PBS/BSAで1:200に希釈したFITC結合ヤギ抗マウスIgGにより、暗所、氷上で30分間インキュベートした。次いで、該細胞をFACS(FACSCanto II, BD Biosciences)により分析した。
走化性分析において、100μlの維持されたヒトB細胞(4x105個の細胞)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移転し、フィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩、NHS-PEG5結合フィンゴリモド、又は遊離TCO官能基と５つのフィンゴリモド分子を有する薬物バンドルをそれぞれ最終濃度が1及び10μMとなるように添加し、37℃で4時間反応させた。その後、100μlの処理されたB細胞を、5μm細孔ポリエステル膜インサート(Corning)を有する6.5mmのトランスウェルの上部チャンバーに添加し、トランスウェルの下部チャンバーに最終濃度10nMのスフィンゴシン-1-リン酸分子を有する500μlのIMDM培地を含む。3時間後、下部チャンバーにおける遊走した細胞を収集し、さらにトリパンブルーで染色し、血球計数器により計数した。各測定において、以下のように比遊走率を計算した。即ち、[(下部チャンバーにおける細胞数)/(上部+下部チャンバーにおける細胞数)x100]-(0nM誘引物質での細胞遊走百分率)]である。比細胞遊走百分率を図29Bに示す。
図29Bは、NHS-PEG5結合フィンゴリモド、及び１つの遊離TCO官能基と５つのフィンゴリモド分子を有する薬物バンドルの生物学的活性の分析結果を示す。この結果は、リンクアームと結合したフィンゴリモド分子がB細胞遊走を阻止する上に、非修飾フィンゴリモドと類似する生物学的活性を有することを示した。
実施例31: RSVのタンパク質Fに特異的なscFv及びCD32aの細胞外ドメインに特異的なscFvを含む二本鎖IgG1.Fc融合タンパク質をコードする遺伝子セグメントの構築
２つのscFvを融合することにより、scFv1-CH2-CH3-scFv2(ヒトγ1)組換え鎖を構築した。そのうち、RSVのタンパク質Fに特異的な第１のscFvを可撓性のヒンジ領域を介してIgG1.FcのCH2ドメインのN末端に融合し、CD32aの細胞外ドメインに特異的な第２のscFvを可撓性リンカー(GGGGS)3を介してCH3ドメインのC末端に融合した。
２つのscFvは、両方ともVL-リンカー-VH配向を有する。上記の２つのscFvのそれぞれにおけるVL及びVHは、親水性リンカーであるGSTSGSGKPGSGEGSTKGを介して結合された。IgG1.Fc融合タンパク質分子構築物における組換え鎖の配列を配列番号:37に示す。
以下は、調製した二本鎖(scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a)分子構築物の構成である。
実施例32:組換え二本鎖(scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32)融合タンパク質の発現及び精製
本実施例において、遺伝子をコードする配列をpcDNA3発現カセットに入れた。Expi293F細胞を2.0×106生存細胞/mlの密度でExpi293F発現培地に接種した後、トランスフェクションの際に細胞が活発な分裂の状態にあることを確保するために、18〜24時間維持した後トランスフェクションした。トランスフェクションの際に、7.5×108個の細胞を入れた255mlの培地を2Lのエルレンマイヤーシェーカーフラスコに入れた後、ExpiFectamineTM293トランスフェクション試薬でトランスフェクションした。トランスフェクション後、オービタルシェーカー(125 rpm)においてトランスフェクションされた細胞を37℃で16〜18時間インキュベートし、次いで、そこにExpiFectamineTM293トランスフェクションエンハンサー1及びエンハンサー2を加えた後、７日間インキュベートした。培養上清液を回収し、プロテインAクロマトグラフィーにより培地における組換え二本鎖(scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a)融合タンパク質を精製した。緩衝液をPBSに交換した後、12％SDS-PAGEにより(scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a)タンパク質の濃度を測定し分析した。その結果を図30Aに示した。Fc融合分子構築物の主要なバンドが約85kDa（予想サイズと同じ）に観察された。
実施例33:組換え二本鎖(scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a)融合タンパク質の結合活性のELISA分析
ELISAにより組換え二本鎖(scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a)融合タンパク質の、RSVのタンパク質F及びCD32aの細胞外ドメインの両方に対する結合活性を分析した。ELISAプレートを2 μg/mLのRSVのタンパク質F(Sino biological Inc.)でコーティングした。組換え二本鎖(scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a)融合タンパク質及び(scFv α RSV)-hIgG1.Fcを、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG1.Fcにより検出した。図30BのELISA結果は、組換え二本鎖(scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a)融合タンパク質がRSVのタンパク質Fに結合できることを示す。ここで、アダリムマブscFvを対照scFvとして使用した。
図30Cは、組換えFc融合タンパクの、CD32aの細胞外ドメインに対する結合活性を示す。5μg/mLの組換えCD32a細胞外ドメインでELISAプレートをコーティングした。組換え二本鎖(scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a)融合タンパク質を、HRP結合ヤギ抗ヒトIgG1.Fcにより検出した。図30Cは、組換え二本鎖(scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a)Fc融合タンパクが組換えCD32a細胞外ドメインに対する結合活性を有することを示す。ここで、組換え二本鎖(scFv α エンドトキシン)-IgG1.Fcタンパク質を対照抗体として使用した。
実施例34:エンドトキシンに特異的なscFv 及びCD32aの細胞外ドメインに特異的なscFvを含む二本鎖IgG1.Fc融合タンパク質の調製
２つのscFvを融合することにより、scFv1-CH2-CH3-scFv2(ヒトγ1)組換え鎖を構築した。そのうち、エンドトキシンに特異的な第１のscFvを可撓性のヒンジ領域を介してIgG1.FcのCH2ドメインのN末端に融合した。細胞外ドメインに特異的な第２のscFvを可撓性リンカー(GGGGS)3を介してCH3ドメインのC末端に融合した。
２つのscFvは、両方ともVL-リンカー-VH配向を有する。上記の２つのscFvのそれぞれにおけるVL及びVHは、親水性リンカーであるGSTSGSGKPGSGEGSTKGを介して結合された。
IgG1.Fc融合タンパク質分子構築物における組換え鎖の配列を配列番号:38に示す。上記の実施例と同様に、Expi293F細胞において構築された遺伝子の発現及び発現された融合タンパク質の精製を行った。新しい構築物についてSDS-PAGE及びELISAにより定性分析を行った。図31AのSDA-PAGE結果は、新しい構築物の組換え鎖が約85kDaのサイズ（予想サイズと同じ）を有することを示した。
図31BのELISA結果は、組換え二本鎖(scFv α エンドトキシン)-(scFv α CD32a)-hIgG1.Fcが大腸菌LPS 0111: B4(Sigma Aldrich)に結合できることを示す。ELISAプレートを50μg/mlのポリ-L-リジンでコーティングした。その後、ポリ-L-リジンコーティングプレートをさらに10 μg/mlの大腸菌LPS 0111: B4でコーティングした。組換え融合タンパク質をHRP結合ヤギ抗ヒトIgG.Fcにより検出した。ELISA結果は、本発明の組換えFc融合タンパクが大腸菌LPS 0111: B4(Sigma Aldrich)に対する結合活性を有することを示す。図31Cは、組換えFc融合タンパクがCD32aの細胞外ドメインに対する結合活性を有することを示す。
このようにして調製した二本鎖(scFv α エンドトキシン)-(scFv α CD32)-hIgG 1.Fc分子構築物の構造を以下に示す。
実施例35:インターフェロン-β-1a及びTfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvを含む二本鎖IgG4.Fc融合タンパク質をコードする遺伝子セグメントの構築
組換え鎖に(インターフェロン-β-1a)-CH2-CH3-(scFv α TfR1)(ヒトγ4)を構築することにより、二本鎖IgG.Fc融合タンパク質を調製した。インターフェロン-β-1aのC末端をリンカー（GGGGSGGGASGGS）を介してCH2のN末端に融合した。TfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvを可撓性リンカー(GGGGS)3を介してCH3ドメインのC末端に融合した。
(TfR1の細胞外ドメインに特異的な)scFvは、VL-リンカー-VHの配向を有する。scFv におけるVL及びVHは、親水性リンカーであるGSTSGSG KPGSGEGSTKGを介して結合された。IgG4.Fc融合タンパク質分子構築物における組換え鎖の配列を配列番号:39に示す。
以下は、調製した二本鎖(インターフェロン-β-1a)-IgG4.Fc-(scFv α TfR1)分子構築物の構成である。
実施例36:組換え二本鎖(インターフェロン-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1)融合タンパク質の発現及び精製
本実施例において、遺伝子をコードする配列をpcDNA3発現カセットに入れた。Expi293F細胞を2.0×106生存細胞/mlの密度でExpi293F発現培地に接種した後、トランスフェクションの際に細胞が活発な分裂の状態にあることを確保するために、18〜24時間維持した後トランスフェクションした。トランスフェクションの際に、7.5×108個の細胞を入れた255mlの培地を2Lのエルレンマイヤーシェーカーフラスコに入れた後、ExpiFectamineTM293トランスフェクション試薬でトランスフェクションした。トランスフェクション後、オービタルシェーカー(125 rpm)においてトランスフェクションされた細胞を37℃で16〜18時間インキュベートし、次いで、そこにExpiFectamineTM293トランスフェクションエンハンサー1及びエンハンサー2を加えた後、７日間インキュベートした。培養上清液を回収し、プロテインAクロマトグラフィーにより培地における組換え二本鎖(インターフェロン-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1)融合タンパク質を精製した。緩衝液をPBSに交換した後、8％SDS-PAGEにより(インターフェロン-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1)タンパク質の濃度を測定し分析した。その結果を図32Aに示した。Fc融合分子構築物の主要なバンドが約80kDa（予想サイズと同じ）に観察された。
実施例37:ELISA及びフローサイトメトリーによる、組換え二本鎖(インターフェロン-β-1a)-hIgG1.Fc-(scFv α TfR1)融合タンパク質の結合活性分析
ELISAにより組換え(インターフェロン-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1)の結合活性を分析した。組換え(インターフェロン-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1)タンパク質で96-ウェルプレートをコーティングした（濃度：5μg/ml；100μl/ウェル）。TfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvは、陰性対照である。HRP結合ウサギ抗ヒトインターフェロン-βポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA)により組換え二本鎖(インターフェロン-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1)を検出した。次いで、50μlのTMB基質を添加して発色させた。50μlの1M HClで反応を停止した。450nmでの吸光度をプレートリーダーで測定した。各バーは、重複サンプルの平均OD450値を表している。
図32Bは、本発明の分子構築物のELISA分析を示す。ELISA結果は、(インターフェロン-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1)融合タンパク質が組換えTfR1の細胞外ドメインに特異的に結合されることを示した。
実施例38:インテグリンα4に特異的なscFv及びTfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvを含む二本鎖IgG4.Fc融合タンパク質の調製
インテグリンα4に特異的なscFvのVL及びVHは、モノクローナル抗体ナタリズマブに由来する。組換え鎖に(scFv α インテグリンα4)-CH2-CH3-(scFv α TfR1)(ヒトγ4)を構築することにより、二本鎖IgG.Fc融合タンパク質を調製した。インテグリンα4に特異的なscFvのC末端をリンカーであるGGGGSGGGASGGSを介してCH2のN末端に融合した。TfR1の細胞外ドメインに特異的なscFvを可撓性リンカー(GGGGS)3を介してCH3ドメインのC末端に融合した。図33Aの8％SDA-PAGEの結果は、新しい構築物の組換え鎖が約85kDaのサイズ（予想サイズと同じ）を有することを示した。
２つのscFvは、VL-リンカー-VHの配向を有する。上記の２つのscFvのそれぞれにおけるVL及びVHは、親水性リンカーであるGSTSGSGKPGSGEGSTKGを介して結合された。IgG4.Fc融合タンパク質 分子構築物における組換え鎖の配列を配列番号:40に示す。
ここに、調製した二本鎖(scFv α インテグリンα4)-IgG4.Fc-(scFv α TfR1)分子構築物の構造を示す。
フローサイトメトリーを用いて細胞結合分析をすることにより、組換え二本鎖(scFv α インテグリンα4)-IgG4.Fc-(scFv α TfR1)タンパク質の、インテグリンα4発現Jurkat T細胞に対する結合活性を調べた。
1x106個のJurkat T細胞を1x105の密度で、10％FBSを添加したRPMI1640培地に維持した。37℃で細胞を5％CO2を含む加湿チャンバーで保持した。結合緩衝液(0.1％FBS、2mM EDTA、及び20ng/ml NaN3を含むリン酸緩衝食塩水)で1x106個のJurkat T細胞を2回清浄した。10μg/mlのヒトBD Fc blockTM (BD Biosciences, San Jose, US)を洗浄されたJurkat T細胞に添加してFc受容体媒介を阻止した。細胞を洗浄し、10μg/mlの組換え(scFv αインテグリンα4) -IgG4. Fc- (scFv α TfR1)タンパク質と共に氷上で15分間インキュベートした。ここで、組換え二本鎖(インターフェロン-β-1a) -IgG4. Fc- (scFv α TfR1)を陰性対照として使用した。細胞をさらに洗浄し、ブロッキング緩衝液で1: 200に希釈したFITC結合ヤギ抗ヒトIgG.Fc(Caltag, Buckingham, UK)により、暗所、氷上で15分間インキュベートした。FACSCanto IIフローサイトメーター(BD Biosciences)により染色された細胞を分析した。
図33Bは、組換え二本鎖(scFv α インテグリンα4)-IgG4.Fc-(scFv α TfR1)タンパク質の、インテグリンα4発現Jurkat T細胞上の細胞染色分析結果を示す。構築物は、実質的に、Jurkat T細胞に積極的に結合され得る。
実施例39:エンドトキシンに特異的なscFv、及びCD32aの細胞外ドメインに特異的なscFvを含む二本鎖IgG1.Fcの、マクロファージ様U937細胞上の生物学的活性分析
組換え二本鎖(scFv α エンドトキシン)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a)融合タンパク質のTNF-α分泌抑制効果を確認するために、ELISAにより、マクロファージ様U937細胞により上清に分泌されたTNF-αの量を確定した。
U937細胞をRPMI1640（10％ウシ胎仔血清(Gibco)及び100U/mlのペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)添加；密度：3x105〜2x106細胞/ml）に維持した。細胞を37℃で5％CO2の加湿チャンバーで保持した。1x106細胞/mlのU937を10 ng/mlのホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA,Sigma Aldrich)でインキュベートすることにより、U937をマクロファージ様細胞に分化した。48時間後、非連結T細胞を除去し、連結T細胞を洗浄し、96-ウェルプレートに接種した。
分析の前日、5x104細胞/ウェルの分化したU937を96-ウェルプレートに接種した。細胞を1μg/ml大腸菌LPS 0111:B4(Sigma Aldrich)単独、又はLPS、10μg/mlの(scFv α エンドトキシン)-hIgG1Fcと、15μg/mlの(scFv α エンドトキシン)-hIgG1Fc-(scFv α CD32a)若しくは2.5μg/mlの抗CD32a scFvとのプレミックスで刺激した。2時間の刺激後、上清を収集した。市販のELISAキットによりTNF-αの収量を測定した。
R&D Systems製ELISAキットを用いてU937上清におけるTNF-αレベルを測定した。ELISAプレート(Greiner Bio-One)のウェルを4μg/mLの捕獲抗体（PBS）により4℃で一晩コーティングした。その後、ウェルを0.5％のPBSに1時間放置して反応を停止させた後、希釈培養上清液とともに2時間インキュベートした。まず、400ng/mLのビオチン標識検出抗体、次いで、ストレプトアビジン-HRPを用いて、結合TNF-αを検出した。TMB基質(Clinical Science Products)を用いて発色反応を行い、1N HClを添加して反応を停止させた。450nmでプレートの吸光度を測定した。製造業者の提供した標準タンパク質希釈液から4パラメータロジスティックフィット標準曲線を得、さらに、外挿法によりTNF-αの濃度を確定した。
図34は、対照抗体である二本鎖(scFv α エンドトキシン)-hIgG1Fcタンパク質及び抗CD32a scFv、又は培地単独と比較して、組換え二本鎖(scFv α エンドトキシン)-hIgG1Fc-(scFv α CD32a)が大腸菌LPS 0111:B4の刺激によるTNF-α分泌を顕著に減少したことを示す。
実施形態の上記の説明が単なる例として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるだろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度具体的に、又は１又は複数の個々の実施形態を参照して、上述されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。

Claims (15)

  1. 中心コアと、複数のリンクアームと、必要に応じてカップリングアームを含むリンカーユニットであって、
    前記中心コアは、(1)第1ポリペプチド、又は(2)第2ポリペプチドを含み、前記第1ポリペプチドが複数のリジン（K）残基を有し、各K残基とその次のK残基との間がグリシン(G)及びセリン(S)残基を有する充填配列により区切られ、前記K残基の数が2〜15であり、前記第2ポリペプチドが(Xaa-K)n配列を有し、各Xaaが2〜12個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、前記nが2〜15の整数であり、
    前記複数のリンクアームは、それぞれ前記中心コアのK残基に結合され、
    各前記複数のリンクアームは、その遊離末端にN-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)基、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基、又はシクロオクチン基を有し、
    前記中心コアのN末端若しくはC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基若しくはアルキン基を有し、又は、前記中心コアのN末端若しくはC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、該システイン残基のチオール基は、前記カップリングアームに結合され、前記カップリングアームは、前記カップリングアームの遊離末端にアジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基、又はシクロオクチン基を有し、
    前記リンクアームの遊離末端がアジド基、アルキン基、又はシクロオクチン基である場合に、前記中心コアN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、前記カップリングアームの遊離末端は、テトラジン又はシクロオクテン基であり、
    前記リンクアームの遊離末端がテトラジン基又はシクロオクテン基である場合に、前記中心コアのN末端若しくはC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基若しくはアルキン基を有し、又は、前記中心コアのN末端若しくはC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、前記のカップリングアーム遊離末端は、アジド基、アルキン基、若しくはシクロオクチン基であるリンカーユニット。
  2. 各前記リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であり、前記カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であり、前記リンクアームのPEG鎖は、必要に応じてジスルフィド結合を有し、前記NHS基、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基、又はシクロオクチン基は、ジスルフィド結合を介して前記リンクアームのPEG鎖に結合される請求項１に記載のリンカーユニット。
  3. 前記アジド基を有するアミノ酸残基は、L-アジドホモアラニン(AHA)、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、又は6-アジド-D-リジンであり、
    前記アルキン基を有するアミノ酸残基は、L-ホモプロパギルグリシン(L-HPG)、D-ホモプロパギルグリシン(D-HPG)、又はβ-ホモプロパギルグリシン(β-HPG)であり、
    前記シクロオクテン基は、トランス-シクロオクテン(TCO)であり、前記シクロオクチン基は、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)、ビシクロノニン(BCN)、又はジベンゾシクロオクチン(DICO)であり、
    前記テトラジン基は、1, 2, 3, 4-テトラジン、1, 2, 3, 5-テトラジン若しくは1, 2, 4, 5-テトラジン、又はそれらの誘導体である請求項１に記載のリンカーユニット。
  4. 複数の第１成分、必要に応じて第2成分、及び必要に応じて複数の連結アームをさらに含み、
    前記複数の第１成分は、アミド結合を形成することにより前記複数のリンクアームに結合され、又は、 via 銅触媒型アジド-アルキン環化付加(CuAAC)反応、歪み促進型アジド-アルキンクリックケミストリー(SPAAC)反応、若しくは逆電子要請型ディールス・アルダー(iEDDA)反応により前記複数のリンクアームに結合され、
    前記第2成分は、アジド基又はアルキン基と前記第2成分との間で起きるCuAAC反応、アジド基又はシクロオクチン基と第2成分との間で起きるSPAAC反応、シクロオクテン基又はテトラジン基と第2成分との間で起きるiEDDA反応のいずれかにより中心コアに結合され、
    前記複数の連結アームは、CuAAC反応、SPAAC反応、又はiEDDA反応により前記複数のリンクアームにそれぞれ結合され、各前記複数の連結アームは、その遊離末端にマレイミド基又はNHS基を有する請求項１に記載のリンカーユニット。
  5. 前記複数の第１成分は、アミド結合を形成することにより前記複数のリンクアームにそれぞれ結合され、前記第2成分は、CuAAC反応により、中心コアのN末端又はC末端にあるアジド基又はアルキン基に結合され、前記リンカーユニットは、必要に応じて第3成分をさらに含み、該第3成分は、iEDDA反応により前記カップリングアームに結合され、
    前記複数の第１成分は、アミド結合を形成することにより前記複数のリンクアームにそれぞれ結合され、前記第2成分は、SPAAC反応により中心コアのN末端又はC末端にあるアジド基に結合され、前記リンカーユニットは、必要に応じて第3成分をさらに含み、該第3成分は、iEDDA反応により前記カップリングアームに結合される請求項4に記載のリンカーユニット。
  6. 複数の連結アームをさらに含み、
    前記複数の連結アームは、CuAAC反応、SPAAC反応、又はiEDDA反応により前記複数のリンクアームにそれぞれ結合され、各前記複数の連結アームは、その遊離末端にマレイミド基又はNHS基を有する請求項１又は２に記載のリンカーユニット。
  7. 複数の第１成分、及び、必要に応じて第2成分をさらに含み、
    前記複数の第１成分は、チオール-マレイミド反応、又はアミド結合を形成することにより、複数のリンクアームにそれぞれ結合され、
    前記第2成分は、アジド基又はアルキン基と前記第2成分との間で起きるCuAAC反応、アジド基又はシクロオクチン基と前記第2成分との間で起きるSPAAC反応、シクロオクテン基又はテトラジン基と前記第2成分との間で起きるiEDDA反応のいずれかにより前記中心コアに結合される請求項6に記載のリンカーユニット。
  8. 前記１成分は、フィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩、インターフェロン-β、又はインテグリン-α4、β-アミロイド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質に特異的な一本鎖可変領域断片(scFv)である請求項4又は７に記載のリンカーユニット。
  9. 前記第１成分がウイルスタンパク質又は細菌タンパク質に特異的なscFvである場合に、前記第2成分は、CD32又はCD16bに特異的なscFvであり、
    前記ウイルスタンパク質は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のFタンパク質、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)のgp120タンパク質、A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンA（HA）タンパク質、又はサイトメガロウイルスの糖タンパク質であり、
    前記細菌タンパク質は、グラム陰性菌のエンドトキシン、クロストリジウム・ディフィシルの表面抗原、黄色ブドウ球菌のリポテイコ酸、炭疽菌の炭疽毒素、又は、大腸菌の志賀毒素I型若しくはII型である請求項4又は７に記載のリンカーユニット。
  10. 中心コアと、複数のリンクアームと、必要に応じて複数の連結アームと、複数の第１成分と、必要に応じて第2成分を含むリンカーユニットであって、
    前記中心コアは、(1)第1ポリペプチド又は(2)第2ポリペプチドを含み、前記第1ポリペプチドは、複数のリジン（K）残基を有し、各K残基とその次のK残基がグリシン(G)及びセリン(S)残基を有する充填配列により区切られ、前記K残基の数が2〜15であり、前記第2ポリペプチドは、(Xaa-K)n配列を有し、前記Xaaが2〜12個のエチレングリコール(EG)の繰り返し単位を有するPEG化アミノ酸であり、前記nが2〜15の整数であり、前記中心コアのN末端及びC末端アミノ酸残基の少なくとも1つは、アジド基若しくはアルキン基を有するアミノ酸、又はシステイン残基であり、前記N末端及びC末端アミノ酸残基の1つがシステイン残基である場合に、前記リンカーユニットは、必要に応じてカップリングアームをさらに含み、該カップリングアームは、システイン残基のチオール基によりシステイン残基に結合され、且つ該カップリングアームの遊離末端にアジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基、又はシクロオクチン基を有し、
    前記複数のリンクアームは、それぞれ前記中心コアのK残基に結合され、
    前記複数の連結アームは、それぞれCuAAC反応、SPAAC反応、又はiEDDA反応により、前記複数のリンクアームに結合され、
    前記複数の第１成分は、それぞれアミド結合を形成すること、又は、チオール-マレイミド反応、CuAAC反応、SPAAC反応若しくはiEDDA反応により前記複数のリンクアームに結合され、或いは、それぞれアミド結合を形成すること、又はチオール-マレイミド反応により複数の連結アームに結合され、
    各前記第１成分は、フィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩、インターフェロン-β、又はインテグリン-α4、β-アミロイド、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質に特異的な一本鎖可変領域断片(scFv)であり、
    前記複数のリンクアームがCuAAC反応又はSPAAC反応により前記複数の連結アーム又は前記複数の第１成分に結合される場合に、前記中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、前記カップリングアームの遊離末端は、テトラジン基又はシクロオクテン基であり、
    前記複数のリンクアームがiEDDA反応により複数の連結アーム又は複数の第１成分に結合される場合に、前記中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、アジド基又はアルキン基を有し、或いは、前記中心コアのN末端又はC末端にあるアミノ酸残基は、システイン残基であり、前記カップリングアームの遊離末端は、アジド基、アルキン基、又はシクロオクチン基であり、
    前記第2成分は、アジド基又はアルキンと前記第2成分との間で起きるCuAAC反応、アジド基又はシクロオクチン基と前記第2成分との間で起きるSPAAC反応、及びシクロオクテン基又はテトラジン基と前記第2成分との間で起きるiEDDA反応のいずれかにより前記中心コアに結合されるリンカーユニット。
  11. 各前記リンクアームは、2-20個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖であり、前記カップリングアームは、2-12個のEGの繰り返し単位を有するPEG鎖である請求項10に記載のリンカーユニット。
  12. 前記アジド基を有するアミノ酸残基は、L-アジドホモアラニン(AHA)、4-アジド-L-フェニルアラニン、4-アジド-D-フェニルアラニン、3-アジド-L-アラニン、3-アジド-D-アラニン、4-アジド-L-ホモアラニン、4-アジド-D-ホモアラニン、5-アジド-L-オルニチン、5-アジド-d-オルニチン、6-アジド-L-リジン、又は6-アジド-D-リジンであり、
    前記アルキン基を有するアミノ酸残基は、L-ホモプロパギルグリシン(L-HPG)、D-ホモプロパギルグリシン(D-HPG)、又はβ-ホモプロパギルグリシン(β-HPG)であり、
    前記シクロオクテン基は、トランス-シクロオクテン(TCO)であり、前記シクロオクチン基は、ジベンゾシクロオクチン(DBCO)、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)、ビシクロノニン(BCN)、又はジベンゾシクロオクチン(DICO)であり、
    前記テトラジン基は、1, 2, 3, 4-テトラジン、1, 2, 3, 5-テトラジン若しくは1, 2, 4, 5-テトラジン、又はそれらの誘導体である請求項10に記載のリンカーユニット。
  13. 前記第１成分がウイルスタンパク質又は細菌タンパク質に特異的なscFvである場合に、前記第2成分は、CD32又はCD16bに特異的なscFvであり、
    前記ウイルスタンパク質は、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)のFタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスI型(HIV-1)のgp120タンパク質、A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンA（HA）タンパク質、又はサイトメガロウイルスの糖タンパク質であり、
    前記細菌タンパク質は、グラム陰性菌のエンドトキシン、クロストリジウム・ディフィシルの表面抗原、黄色ブドウ球菌のリポテイコ酸、炭疽菌の炭疽毒素、又は大腸菌の志賀毒素I型若しくはII型である請求項10に記載のリンカーユニット。
  14. 前記第１成分がフィンゴリモド、フィンゴリモドリン酸塩、インターフェロン-β、又はインテグリン-α4若しくはβ-アミロイドに特異的なscFvである場合に、前記第2成分は、トランスフェリン受容体に特異的なscFvである請求項10に記載のリンカーユニット。
  15. 前記複数の第１成分がそれぞれアミド結合を形成すること、又はチオール-マレイミド反応により前記複数のリンクアームに結合され、前記第2成分がCuAAC反応により、前記中心コアのN末端又はC末端アミノ酸残基のアジド基又はアルキン基に結合される場合に、前記リンカーユニットは、必要に応じて第3成分をさらに含み、該第3成分は、iEDDA反応により前記カップリングアームに結合され、
    前記複数の第１成分がそれぞれアミド結合を形成すること、又はチオール-マレイミド反応により、前記複数のリンクアームに結合され、前記第2成分は、SPAAC反応により、前記の中心コアのN末端又はC末端アミノ酸残基のアジド基若しくはシクロオクチン基に結合される場合に、前記リンカーユニットは、必要に応じて第3成分をさらに含み、該第3成分は、iEDDA反応により前記カップリングアームに結合される請求項10に記載のリンカーユニット。
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