CN111194223B - 与白蛋白具有较佳结合亲和力的药物分子 - Google Patents

与白蛋白具有较佳结合亲和力的药物分子 Download PDF

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Abstract

本揭示内容提出多种分子构建体，其具有复数个脂肪酸以及一功能性元件。亦揭示使用此种分子构建体来治疗各种疾病的用途。

Description

与白蛋白具有较佳结合亲和力的药物分子
技术领域
本揭示内容是关于新颖的药学构建体；更明确地说，是关于经二或更多个脂肪酸或二元脂肪酸分子修饰的药学构建体，因而能够提高其对白蛋白的结合亲和力以及改善其血清中寿命。
背景技术
具备多重功效的药物开发已成为相关领域的主流研发方向。举例来说，国际专利申请公开案WO 2016/112870(A1)所述的多臂接合单元以及相关申请案提出了重要的化学实体，其能够用以建构具有二或更多功能性部位的分子。然而，WO 2016/112870公开案使用具有特殊官能基(如四嗪基、环辛烯基与环辛炔基)的氨基酸来进行链接化学反应(clickchemistry reaction)；然而，无法在固态肽合成反应中加入此类氨基酸。更有甚者，根据WO2016/112870公开案，需使用一端带有顺丁烯二酰亚胺基、另一端带有四嗪基、环辛烯基或环辛炔基的异双官能基(heterobifunctional)连接物，以透过半胱氨酸残基(cysteine，C)的硫醇基和上述异双官能基连接物的顺丁烯二酰亚胺基之间的反应，而加入带有四嗪基、环辛烯基或环辛炔基的耦合臂(coupling arm)。已知硫醇与顺丁烯二酰亚胺基反应的产物较不稳定，可能会发生逆向反应(reverse reaction)或和邻近带有硫醇基的分子发生交换反应，进而可能影响耦接的接合单元的储存稳定性。此外，如WO 2016/112870公开案所述，当多肽中心核带有半胱氨酸残基时，若连接臂带有可和多肽核上的硫醇反应的功能基，就无法进行此种连接臂(linking arm)的连续固态合成(多肽分支)。再者，多肽中心核N-端的α-氨基需要额外的阻断步骤，此一步骤会降低多肽中心核或接合单元的产率与纯度。
此外，在某些临床应用中，需要延长药品的半衰期，而使得所需的给药频率可以降低并减少药物在血液中的浓度波动，这些功效能够降低治疗成本且可提升患者对疗程医嘱的遵从性。
目前已利用多种方法来延长药物的半衰期。譬如可改变肽或蛋白药物分子的结构(如透过氨基酸残基突变)，而不需使用特殊的制剂或与其他化学实体接合。举例来说，利用氨基酸取代来降低其对蛋白酶的敏感性、改变其等电点以及增加脂溶性等，可以延长某些药物的半衰期。透过遗传工程制备的组织血浆蛋白原活化因子—替奈普酶(tenecteplase)有数个定点突变，且可抵抗血浆蛋白原活化因子抑制剂，且因此相较于野生型活化酶有较长的半衰期。甘精胰岛素(insulin glargine)是一种商业销售的人类胰岛素，其将一个天冬酰胺残基取代为甘氨酸，因此可降低其在中性pH下的溶解度，且当透过皮下注射注入患者体内时会聚集在一起。这种聚集的胰岛素会慢慢地溶解并进入血液循环中，因此其半衰期比起一般的野生型胰岛素来得长。
有效药物则是和会形成基质的物质(如聚乳酸甘醇酸)混合，或是包载于微脂体或其他类型的微球/纳米粒子中。当将此类药物制剂施用于患者后，可展现较缓慢的释放动力。已将数种化疗药物(如，紫杉醇与阿霉素)以及荷尔蒙药物(如，体抑素类似物(如奥曲肽乙酯(octreotide acetate))与促性腺素释放激素类似物(如柳菩林(leuprorelin))制成微球注射液以供长时间缓释。
还有许多蛋白药物经聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰，以改善其药动学活性与稳定性，并减低免疫源性，上述药物如干扰素-α、干扰素-β、红血球生成素、人类生长激素、颗粒性白血球群落刺激因子、腺苷脱氨酶与天冬酰氨酸酶。使用PEG修饰的缺点之一在于复合产物的异质性。长链PEG也可能包绕蛋白分子，因而抑制蛋白药物的活性。长链PEG亦可抵抗降解，故会积累于患者体内。
另一种改善蛋白药物药动学特性的方法是将蛋白和IgG的Fc部分的CH2-CH3结构域融合。可将蛋白药物与CH2-CH3片段以连续重组肽的形式表现，而两个此类多肽就可以形成二聚物构型。目前已开发出数种细胞介素受体以及细胞表面蛋白的Fc融合蛋白并于临床上广泛使用，譬如针对细胞毒性T细胞蛋白4(cytotoxic T-cell protein 4，CTLA-4)的贝拉西普(belatacept)、针对肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的依那西普(etanercept)、针对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的阿柏西普(aflibercept)以及针对介白素-1(interleukin-1，IL-1)的列洛西普(rilonacept)。许多细胞介素与细胞介素受体的血清半衰期短于1天。将其与IgG的Fc部分接合能够将其半衰期延长到1周以上。
与白蛋白融合也是另一种延长肽或蛋白药物半衰期的方法。白蛋白在血液循环中的半衰期为19天。因为白蛋白是单一多肽蛋白，可利用重组多肽来制备白蛋白与一多肽或蛋白的融合蛋白。举例来说，阿必鲁肽(albiglutide)是将白蛋白与对二肽基肽酶-4(dipeptideyl peptidese-4)具抗性的类升糖素肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)二聚物融合所得的蛋白，其已经许可用以治疗第二型糖尿病。阿必鲁肽的血清半衰期为4-7天，相较之下，一般的GLP-1只有1-2小时。爱必凝是由白蛋白与第九凝血因子融合的蛋白。此药物每14天施用一次，可用以防止患有B型血友病的儿童或成人出血。
即便如此，既有用以提升药物血清半衰期的方法仍欠缺弹性。亦即，无法经调整而适用于有不同药动学特性需求的各种药物。因此，在药物研究与开发领域中，具有较佳或可调整的药动学特性的药物仍是极为重要的课题。
发明内容
本揭示内容的第一方面是关于一种接合单元的平台技术，此种接合单元可提升药物的血清半衰期。具体来说，所述接合单元至少包含二或更多个脂肪酸衍生物或二元脂肪酸衍生物，其可透过点击反应与药物(药物本身或以载药束的形式)耦接。如此一来，接合单元中的多个脂肪酸链可插入一单一人类血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的不同疏水性凹口或不同HAS的疏水性凹口，因而增加接合单元(且因而增加，接合单元-药物耦合物整体)与一或多HAS间的结合强度。再者，利用本技术平台能够轻易地调整脂肪酸链的长度、数目以及二脂肪酸链间的距离。如此一来，就能够视需要而透过改变脂肪酸链的长度与数目以及二脂肪酸链间的距离来调整药物的药动学特性。
根据本揭示内容某些实施方式，所述接合单元至少包含一中心核以及二至五个第一元件。根据本揭示内容多个实施方式，所述中心核至少包含：
(1)二至五个赖氨酸((lysine，K)残基；
(2)视需要地，一或多填充物，其中任两个所述K残基彼此相邻或由该填充物隔开；
(3)视需要地，一末端间隔物，其中该末端间隔物为连接至该第一K残基的N-端的一N-端间隔物或连接至该最后K残基的C-端的一C-端间隔物；以及
(4)一复合部分，藉由与该末端K残基形成酰胺键，或当存有该末端间隔物时，藉由与末端间隔物的末端氨基酸残基形成酰胺键，而与其连接，其中该复合部分具有选自以下群组的一复合基：叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基与环辛炔基。
一般来说，中心核可有2、3、4或5个K残基。于不同的实施方式中，任两个所述K残基可彼此相邻(即，两者间并无填充物)或以一填充物隔开。当有多个填充物时，每一填充物的组合可以彼此不同。
在结构方面，该些填充物的每一者与末端间隔物至少独立地包含：(i)1到12个氨基酸残基，每一个独立选自于K残基以外的氨基酸残基，或(ii)具有2至12个乙二醇(ethylene glycol，EG)重复单元的一聚乙二醇化氨基酸(PEGylated amino acid)。根据某些例示性的实施方式，所述填充物或末端间隔物可至少包含一或多甘氨酸(G)及/或丝氨酸(serine，S)残基。于某些实施例中，所述填充物或末端间隔物由2至10个氨基酸残基所组成；较佳为，2至5个氨基酸残基。于某些实施方式中，填充物或末端间隔物至少包含2至5个EG重复单元。
根据本揭示内容某些实施方式，中心核至少包含一N-端间隔物，其连接到N-端起第一个连接氨基酸残基的N-端。额外地或替代性地，中心核至少包含一C-端间隔物，其连接到N-端起最后一个连接氨基酸残基的C-端。
根据本揭示内容某些视需要而采用的实施方式，接合单元至少包含两个复合部分(如，一第一复合部分与一第二复合部分)。
在某些视需要而采用的实施方式中，复合部分可具有一官能基，其能够与末端氨基酸残基(即，第一个连接氨基酸残基或N-端间隔物的N-末端氨基酸残基)的α-氨基(-NH2)或末端氨基酸残基(即，最后一个连接氨基酸残基或C-端间隔物的C-末端氨基酸残基)的羧基(-COOH)形成共价键，以便将复合部分与其连接。在一些实施方式中，中心核可仅具有N-与C-端间隔物其中一个，并具有第一与第二复合部分，两者分别连接到末端氨基酸残基(可以是末端连接氨基酸残基或末端间隔物的末端氨基酸残基)。在其他实施方式中，中心核至少包含N-与C-端间隔物两者，且两个复合部分分别连接到二末端间隔物的末端氨基酸残基。在较佳实施方式中，形成于复合部分与末端氨基酸残基间的共价键为酰胺键。当可想见，为了确保所得接合单元的均质性，应使一复合部分仅含有一个能和α-氨基或羧基其中一者反应的官能基。
于选择上述两个复合基时，较佳应使这两个复合基无法进行点击化学反应。根据某些实施方式，当第一复合基为叠氮基、炔基或环辛炔基时，第二复合基不能是叠氮基、炔基或环辛炔基，以避免二复合基进行反应；此时，所述第二复合基可以是四嗪基或环辛烯基。在另一些实施方式中，当第一复合基为四嗪基或环辛烯基时，第二复合基不能是四嗪基或环辛烯基；反之，第二复合基可以是叠氮基、炔基或环辛炔基。当可想见，若欲使两个二复合部分和同一种功能元件耦合时，二复合部分的复合基可以相同或可用以进行相同的点击化学反应。
每一该第一元件可独立地为C8-28脂肪酸衍生物或C8-28二元脂肪酸衍生物，且透过K残基的ε-氨基而连接到一个K残基。根据本揭示内容多种实施方式，第一元件为脂肪酸衍生物，其衍生自：辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸、二十四酸、棕榈油酸、油酸、亚麻油酸、蓖麻油酸、异柠檬酸、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)或二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。根据本揭示内容某些实施方式，第一元件为二元脂肪酸衍生物，其衍生自：1,8-辛二酸、1,7-庚二甲酸、1,10-癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸或十八烷二酸。于某些实施方式中，第一元件衍生自肉豆蔻酸或棕榈酸。于其他实施方式中，第一元件衍生自十四烷二酸或十六烷二酸。
在一些实施方式中，脂肪酸(或二元脂肪酸)衍生物为经化学修饰的脂肪酸(或二元脂肪酸)分子。举例来说，所述脂肪酸分子的羧基(或二元脂肪酸分子的其中一个羧基)可和具有两个官能基的化学部分反应，上述官能基其中一个为羧基-反应性官能基(因此能够和该(二元)脂肪酸分子形成共价键)，而另一个官能基可以和赖氨酸残基的侧链氨基反应。根据本揭示内容视需要而采用的实施方式，用以修饰(二元)脂肪酸分子的化学实体为谷氨酸残基、天冬氨酸残基、氨基-EG2-酸、γ丁胺酸或与其相似者；然而，本揭示内容不限于此。
根据本揭示内容多个实施方式，连接至中心核的二或更多个第一元件可以相同或不同。当可想见，在多肽中心核的固态合成过程中，除了在合成中心核之后才将第一元件连接至中心核之外，也可以将经修饰带有特定第一元件的K氨基酸残基引入多肽链中。因此，根据多种实施方式，可在固态合成过程中，依序加入经不同第一元件修饰的K残基，以便得到均质的接合单元，其中每一接合单元可接有二或更多个不同的第一元件。
根据本揭示内容的某些实施方式，本接合单元至少更包含一第二元件，其透过以下反映连接至复合基：铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(copper catalyzed azide-alkynecycloaddition，CuAAC)反应、应力促进的叠氮化物-炔羟链接化学(strain-promotedazide-alkyne click chemistry，SPAAC)反应或逆电子需求狄尔斯-阿德(inverseelectron demand Diels–Alder，iEDDA)反应。第二元件可已是任何能够治疗一疾病或症状的疾病分子。在较佳的情形中，第二元件为肽类药物，譬如：胰岛素、类胰岛素生长因子、类升糖素肽-1促效剂、体抑素与体抑素类似物、降钙素、生长激素、红血球生成素、促性腺素释放激因子、颗粒性白血球群落刺激因子、腺苷脱氨酶、天冬酰胺酸酶、干扰素-α、干扰素-β、TNF-α受体、IL-1受体、EGF受体、半乳糖苷酶β、半乳糖苷酶α、拉罗尼酶(laronidase)、移粘宝酶(idursulphase)、阿葡糖苷酶α(alglucosidaseα)以及加硫酶，或其衍生物或变异物。
当可想见，第二分子可经修饰带有与复合基相对应的反应基，而使得第二元件与中心核的复合基连接。于某些实施方式中，肽类药物可仅带有一个赖氨酸或一个不成对的半胱氨酸残基，且此一赖氨酸或半胱氨酸残基不会显著影响该肽类药物的生物活性或治疗功效；在此类情形中，赖氨酸或不成对的半胱氨酸残基经修饰带有所述反应基。举例来说，可将带有所述反应基的化学部分和赖氨酸残基的ε-氨基或半胱氨酸残基的SH基反应。于某些实施方式中，带有反应基的化学部分可以是双功交联物，其一端的官能基可和ε-氨基或SH基反应，而另一端则带有反应基。再者，对于不带有赖氨酸或半胱氨酸残基的肽类药物，可将蛋白分子表面上溶剂可达且非该蛋白生物活性必要的氨基酸残基突变为赖氨酸或半胱氨酸残基。在一些实施方式中，肽类药物可能带有对药物生物活性具关键地位的赖氨酸或半胱氨酸残基，又或者是该肽类药物可带有一个以上的赖氨酸残基或多个不成对的半胱氨酸残基。在这些情形中，也可将蛋白分子表面上溶剂可达且非该蛋白生物活性必要的氨基酸残基突变为半胱氨酸残基。在另一个例子中，可利用反应基修饰肽类药物N-端氨基酸残基的α-氨基；此种情形特别适用于利用固态合成技术来制备肽的情形。当可想见，上述策略仅为修饰肽类药物的例示性方法，经修饰后的药物带有可和中心核复合基进行点击反应的反应基，然本发明不限于此。
在某些视需要而采用的实施方式中，可将第二元件制备为载药束的形式，其至少包含两个以上的第二元件。举例来说，载药束的结构可如下列国际专利申请公开案中所述：WO 2016/112870、WO 2016/184426、WO 2017/036255以及WO 2017/036407；此处将这些公开案的内容整体纳入作为参照。或者是，载药束的结构与本揭示内容所述的接合单元相似，不同之处在于以上述第二元件取代第一元件(即，脂肪酸或二元脂肪酸衍生物)。简言之，所述载药束至少包含一第二中心核、一第二复合部分、复数个视需要而采用的第二连接臂、一或多个视需要而采用的填充物以及一或二个视需要而采用的末端间隔物，且第二元件透过第二中心核的赖氨酸残基的侧链氨基或第二连接臂而连接于中心核。
在较佳的情形中，当接合单元至少包含二复合基(即，第一与第二复合基)时，其中一个复合基为叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基或环辛炔基，而另一个复合基为四嗪基或环辛烯基。
视需要地，所述接合单元可至少更包含一第二与第三元件分别连接到上述复合基(即，第一与第二复合基)，其中第二元件透过CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA反应连接至第一复合基；且第三元件透过CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA反应连接到第二复合基，且此处所用的反应和第二元件与第一复合基间的反应不同。
一般来说，环辛烯基为降莰烯(norbornene)基或反式-环辛烯(trans-cyclooctene，TCO)基；且环辛炔基为二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO或DIBO)基、二氟化环辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)基、二环壬炔(bicyclononyne，BCN)基或二苯并杂氮环辛炔(dibenzoazacyclooctyne，DIBAC)基。四嗪基为1,2,3,4-四嗪基、1,2,3,5-四嗪基或1,2,4,5-四嗪基，或其衍生物。叠氮基可以是吡啶甲基叠氮或–N3基。
附图说明
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
图1A至1H为根据本揭示内容某些实施方式的中心核示意图。
图2A至2C为根据本揭示内容某些实施方式的接合单元示意图。
图3A至3C为根据本揭示内容某些实施方式的T-E接合单元示意图。
图4A与4B分别为根据本揭示内容一实验例，含叠氮基GLP-1促效剂的反相分析HPLC图谱与MALDI-TOF分析结果。
图5为根据本揭示内容一实验例，带有两个棕榈酰(palmitoyl)链的含炔基接合单元的MALDI-TOF分析结果。
图6A与6B分别为根据本揭示内容一实验例，与三个体抑素类似物复合的含DBCO多臂接合单元的反相分析HPLC图谱与MALDI-TOF分析结果。
图7为根据本揭示内容一实验例，带有两个十八酰(palmityl)链的含炔基接合单元的MALDI-TOF分析结果。
图8A与图8B分别为根据本揭示内容一实验例，GLP-1-Ala8-EG4-2FA-C16促效剂的反相分析HPLC图谱与MALDI-TOF分析结果。
图9A与图9B分别为根据本揭示内容一实验例，GLP-1-Ala8-EG4-2E-2FA-C16的反相分析HPLC图谱与MALDI-TOF分析结果。
图10A与图10B分别为根据本揭示内容一实验例，GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16促效剂的反相分析HPLC图谱与MALDI-TOF分析结果。
图11A与图11B分别为根据本揭示内容一实验例，GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16-酸促效剂的反相分析HPLC图谱与MALDI-TOF分析结果。
图12A与图12B分别为根据本揭示内容一实验例，GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C16-酸促效剂的反相分析HPLC图谱与MALDI-TOF分析结果。
图13A与图13B分别为根据本揭示内容一实验例，GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C18-酸促效剂的反相分析HPLC图谱与MALDI-TOF分析结果。
图14为根据本揭示内容一实验例的ELISA分析结果，图中显示2FA-GLP-1促效剂对GLP-1受体的结合亲和力，其中GLP-1R-IgG.Fc融合蛋白涂布于微量多孔盘上，接着添加最终浓度为1或10μg/ml的含叠氮基GLP-1促效剂(GLP-1-叠氮基)、2FA-GLP-1促效剂(2FA-GLP-1)、利拉鲁肽(liraglutide)以及对照多肽(P1-P2多肽，GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQQQGLPRAAGGSVPHPR，SEQ ID NO:3)。
图15为根据本揭示内容一实验例的ELISA分析结果，图中显示2FA-GLP-1促效剂对人类血清白蛋白(HSA)的结合亲和力，中系将HAS涂布于微量多孔盘上，接着添加含叠氮基GLP-1促效剂(GLP-1-叠氮基)、利拉鲁肽，2FA-GLP-1促效剂(2FA-GLP-1)与含炔基2FA(炔基-2FA)。
图16A与16B分别为根据本揭示内容一实验例的ELISA分析结果以及2FA-GLP-1促效剂与利拉鲁肽和HAS结合的百分比，在ELISA图中显示利用透析平衡分析的2FA-GLP-1促效剂对HAS的结合亲和力。
图17为根据本揭示内容一实验例，与所合成的GLP-1类似物一起培养的INS-1细胞的cAMP测量结果。
图18A与18B分别为根据本揭示内容一实验例，所合成的GLP-1类似物对INS-1细胞中活化的半胱天冬酶-3(activated caspase-3)的抑制分析结果。
图19为根据本揭示内容一实验例，与所合成的GLP-1类似物一起培养的INS-1细胞的细胞增生分析结果。
根据惯常的作业方式，图中各种特征与元件并未依比例绘制，其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与元件。此外，在不同图式间，以相同或相似的元件符号来指称相似的元件/部件。
实施方式
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方面与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
为了便于说明，此处整理了说明书、实施例与附随权利要求书中所用的某些词汇。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。
在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。具体来说，此处与权利要求书中，所用的单数形，如一(“a”或”an”)包含其复数形，除非与上下文冲突。此外，在本说明书与权利要求书中，「至少一」与「一或更多」等表述方式的意义相同，两者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本说明书与权利要求书中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」指涵盖了仅有A、仅有B、仅有C、A与B两者、B与C两者、与C两者、以及A、B与C三者。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，「约」通常指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，「约」一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考量而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过「约」的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一段点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。
本揭示内容一般关于多种接合单元，每一接合单元至少包含二至五个疏水性链(一脂肪酸束)，其可增加或改变药物的血清半衰期。接合单元至少更包含一效应元件或至少包含多个效应元件的载药束。所述效应元件或载药束可透过点击反应而连接到脂肪酸束。所述接合单元可更包含一标的元件，其能够将接合单元导引至患者体内的疾病部位或附近。
在此处，「标的元件(targeting element)」一词指接合单元能够直接或间接结合到一目标标的(如，一细胞表面上的受体或一组织中的蛋白质)的部分，因而能够协助将本发明接合单元递送到目标标的。在某些例子中，标的元件可将所述接合单元导引至邻近目标细胞处。在其他情形中，标的元件可专一地结合到目标细胞表面上的分子；或标的元件可和第二分子专一地结合，而此一第二分子能够专一地结合到目标细胞表面上的分子。在某些例子中，一旦标的元件与目标对象接合之后，标的元件可将本发明接合单元内化，而使其移动到目标细胞的细胞质内。标的元件可以是细胞表面受体的抗体或配体；或者是可和上述抗体或配体结合的分子，因而能够间接地将本发明接合单元标的到目标部位(譬如所选定的细胞表面)。相较于没有标的功能的治疗药物，利用本发明接合单元能够加强或有利于效应元件(治疗药剂)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一种程度或相对的比例，而不是让效应元件在疾病部位绝对或完全的局部化。
根据本发明，「效应元件(effector element)」一词指一旦接合单元到达目标部位后，所述接合单元中能够发挥生物活性(譬如，诱发或压抑免疫活性、发挥细胞毒性、抑制酶活性及与其相似者)或其他功能活性(譬如招募免疫细胞或其他经半抗原标记的治疗用分子)的部分。「效应」可指治疗性或诊断性的效果。效应元件包含能够和细胞和/或细胞外免疫调节因子结合的元件。上述效应元件包含如蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、糖蛋白、药物部分(包含小分子药与生物制剂)、化合物元素及同位素等物质，也包含上述物质的片段。
虽然在此处利用「第一」、「第二、「第三」等词汇来描述多种元件、部件、区域和/或区段，这些元件(以及部件、区域和/或区段)不受上述修饰词的限制。此外，除非上下文有明示的说明，使用这些序数并未隐含序列或顺序。反之，这些词汇仅是用来区分各元件。因此，亦可将下文所述的第一元件命名为第二元件，而不会悖离例示性实施方式所揭示的内容。
在此处，「连接(link)」、「耦接(couple)」以及「复合(conjugate)」等词可互换使用，且都是用来指称透过直接或间接的连接关系，将两个元件连接在一起。
「多肽(polypeptide)」一词在此指具有至少两个氨基酸残基的聚合物。一般来说，多肽包含2到200个氨基酸残基；在较佳的情形中，是2到50个残基。在本说明书中所提及的氨基酸序列涵盖了此种序列的L-、D-或β-氨基酸等形式。多肽亦包括氨基酸聚合物，其中有一或多个氨基酸残基是与一天然氨基酸相应的人工化学类似物，当然也包括天然产生的氨基酸聚合物。此外，此一词汇亦涵盖以多肽链或其他方式连接的氨基酸，上述其他方式如经修饰的连接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫酰胺(thioamide)、磷酰胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羟基酯(hydroxylate)键、以及与其相似者来取代多肽键。于本揭示内容中，「多肽药物」或「肽类药物」等词应做广义解释，其涵盖任何主要包含氨基酸残基的治疗性分子，譬如免疫球蛋白、抗体、抗体片段、酶、生长因子、受体、细胞介素等等。
于一些实施方式中，本发明范围亦涵盖了其他相较于所述序列具有保守性置换的蛋白。于多种实施方式中，有一、二、三、四或五个不同的残基经过置换。在此处，「保守性置换(conservative substitution)」一词是指所述氨基酸置换不会明显地改变分子活性(譬如生物或功能活性和/或专一性)。一般来说，保守性氨基酸置换是利用另一种具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的氨基酸来取代某一氨基酸。某些保守性置换包括「类似物置换」，亦即以非标准(如罕见或合成等)氨基酸来取代标准氨基酸，而上述非标准氨基酸和被取代的原有氨基酸之间的差异极小。可由标准氨基酸经人工修饰而在不会大幅改变原有氨基酸结构的前提下，得到所述的氨基酸类似物，譬如异构物或代谢前驱物等皆属之。于本揭示内容中，认为以下氨基酸残基分属四种独特的氨基酸类别：(1)赖氨酸，其侧链带有氨基；(2)半胱氨酸，其侧链带有硫醇基；(3)丝氨酸与苏氨酸(threonine)，其侧链带有羟基；以及(4)天冬氨酸与谷氨酸，其侧链带有羧基。这四大类氨基酸的侧链各自带有独特的官能基，可以用来和不同的化学成分复合。也可使用带有此类官能基的非天然氨基酸，以达到类似目的。应注意到，天冬氨酸或谷氨酸的羧基可和一元件的氨基反应而形成酰胺键。此反应化学类似赖氨酸残基的氨基和带有羧基的元件间的酰胺键形成反应。因此，可利用天冬氨酸或谷氨酸残基来取代中心核中的赖氨酸残基，而第一元件则同样可透过形成酰胺键的相同反应化学而与中心核连接。
于一些实施方式中，本案的范围亦涵盖和任何所述序列具有至少80％序列相似度的任何序列，上述序列相似度较佳为至少85％或90％、更佳为至少95％或98％。
此处针对多肽序列所述的「氨基酸序列相似度百分比(Percentage(％)aminoacid sequence identity)」指候选序列的氨基酸残基与参考多肽序列的氨基酸残基完全相同的百分比；于进行上述比对时，可将所述的候选多肽片段与所述的特定多肽片段并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在计算相似度时，保守性置换的氨基酸残基视为不同的残基。相关领域已有多种方法可用以进行上述并排，譬如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中具有通常知识者在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，二多肽序列间的序列比较是采用美国国家生物科技资讯中心(Nation Center forBiotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白质-蛋白质BLAST分析资料库Blastp来进行。候选多肽序列A相较于参考多肽序列B的氨基酸序列相似度(在本说明书中亦称之为多肽序列A与多肽序列B具有特定百分比(％)的氨基酸序列相似度)的计算方式如下：
其中X是利用BLAST序列并排程式对序列A、B进行排列后所得到的相同氨基酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短者的氨基酸残基总数。
「聚乙二醇化氨基酸(PEGylated amino acid)」一词在此指带有一个氨基(aminogroup)与一个羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链。一般来说，聚乙二醇化氨基酸的结构式为NH2-(CH2CH2O)n-COOH。在本揭示内容中，n值介于1到20之间；较佳是介于2至12。
在此处一多肽的「端」指位于该多肽N-端或C-端点的氨基酸残基。在描述一聚合物(譬如此处所述的聚乙二醇)的组成单元时，「端」则是指在聚合物骨架末端的部分。在本说明书与权利要求书中，「自由端」一词是用来指称并未与另一个分子形成化学键结的末端氨基酸残基或构成单元。
「治疗(treatment)」一词指预防性(如，预防用药)、疗愈性或缓和性的处置，藉以达到所欲的药学和/或生理学效果；而治疗的行为在此包括上述预防性、疗愈性或缓和性的处置。具体来说，治疗在此指对于可能患有一医疗疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常、或易于罹患一疾患的个体施用或投予本发明接合单元或包含此接合单元的药学组合物，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻特定异常和/或病症的一或多种症状或特征，或是延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对尚未表出现疾病、异常和/或病症征兆的个体和/或出现早期征兆的个体进行治疗，以期降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关的病理变化的风险。
在此处，「有效量(effective amount)」一词指本发明接合单元的用量足以招致所欲的治疗反应。药剂的有效量不必然能够治愈疾病或病症，但能够延缓、阻碍或防止该疾病或病症的发生，或是可缓减与疾病或病症相关的病征。可将治疗有效量可分成一、二或更多剂，而以适当的剂型在指定期间内施用一次、二次或更多次。具体的治疗有效量取决于多种因素，例如欲治疗的特定状况、个体的生理条件(如，个体体重、年龄或性别)、接受治疗的个体类型、治疗持续时间、并行治疗(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将治疗有效量表示成活性成分的总重量，譬如以克、毫克或微克来表示；或表示成活性成分重量相对于体重的比例，譬如表示为每公斤体重若干毫克(mg/kg)。
所述「施用(application)」与「投予(administration)」等词在此可交替使用，其指将本发明的接合单元或药学组合物提供给需要治疗的个体。
在此处，对于本揭示内容的K残基而言，「连续」一词指两个K残基彼此相邻，即，两者间没有其他氨基酸残基。在本揭示内容某些实施例中，中心核中二相邻的K残基间以至少一个本揭示内容所述的填充物隔开，譬如，中心核中二相邻的K残基间可由GS、GGS或GSG隔开。
「个体(subject)」或「患者(patient)」等词在此可交互使用，且是指可接受本揭示内容的接合单元、药学组合物和/或方法处置的动物(包含人类)。除非另有指明，「个体」或「患者」一般包含雄性与雌性。「个体」或「患者」包含任何可因本揭示内容的处置而获益的哺乳类动物。所述「个体」或「患者」的例示包含，但不限于：人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、猪、山羊、牛、马、狗、猫、鸟和禽类。在一实例中，所述患者为人类。所述哺乳类动物涵盖哺乳动物纲的所有成员，包括人类、灵长类动物、家畜和农畜(如兔子、猪、绵羊和牛)、动物园动物或竞赛用动物、宠物，以及啮齿类动物(如，小鼠和大鼠)。「非人类哺乳动物」一词则涵盖除了人类以外的所有哺乳动物纲成员。
白蛋白是血清中的主要单白，含量约为35-50g/L。白蛋白可作为许多物质的运输蛋白与积存区(depot)，包括某些脂肪酸、代谢物、药物分子等。每一个白蛋白分子有至少七个囊袋(或疏水性空腔)，而脂肪酸链可紧紧插入囊袋中。因此，透过与白蛋白结合能够改变药物的药动学特性。已有数种经过长链脂肪酸修饰的药物，使得这些药物能和白蛋白以非共价的方式结合，进而延长其半衰期。
地特胰岛素(insulin detemir)是一种商业销售的胰岛素，其带有结合到赖氨酸残基(B链上的第29个氨基酸残基)的氨基上的脂肪酸(即，肉豆蔻酸)链。利拉鲁肽是一种GLP-1促效剂，其带有与谷氨酸残基结合的脂肪酸(棕榈酰基)链，而上述谷氨酸残基又结合到赖氨酸残基(第25个氨基酸残基)的氨基；且原本位在第33个位点的赖氨酸残基则经突变为精氨酸。经修饰的胰岛素与GLP-1受体促效剂可和白蛋白结合，因而可达到较长的作用药动学。
使用白蛋白作为药物的积存区可广泛运用于多种药物。对于许多既有的药物与发展中的新药物，若能拓展用于修饰药物使其具有对白蛋白的结合亲和力的方法，应或能够开发出用于多种临床适应症的新用途。
目前已将酶替代疗法(enzyme replacement therapy)用于多种罕见遗传疾病的治疗。通常是用重组蛋白的方式来制造治疗用酶。譬如，治疗法布瑞氏症(Fabry'sdisease)用的半乳糖苷酶β与半乳糖苷酶α、治疗贺勒氏症候群(Hurler–Scheie syndrome，亦称为第一型黏多糖症(mucopolysaccharidosis type 1，MPS-I))用的拉罗尼酶(laronidase)；治疗杭特氏症(Hunter's disease，亦称为MPS-II)用的移粘宝酶(idursulphase)；治疗庞贝氏症(Pompe's disease)用的阿葡糖苷酶α(alglucosidaseα)；治疗马洛托-拉米氏症候群(Maroteaux–Lamy syndrome)用的加硫酶。目前都没有此类治疗用酶的长效版本，故需经常施用此类药物。因为这些疾病的临床症状通常都较为严重，因此若能减低药物施用次数，除了能够帮助患者之外，也能减少使用此类药物的支出。因此，此类药物的半衰期亟待提升。
本揭示内容基于一种创新的平台，其提供了一种弹性且便利的方式能够建构脂肪酸束，所述脂肪酸束可与药物(即，效应元件)复合，以改变(或在较佳的情形中，提升)效应元件的药动学特性(如，血清半衰期)。本平台的优点在于可藉由调整中心核K残基的数目而改变脂肪酸(与脂肪二酸；除非另有说明，在此处脂肪酸一词涵盖一元脂肪酸与二元脂肪酸)链的数目。再者，可经由改变中心核二K残基间的填充物长度来改变二K残基间的距离。当可想见，本接合单元所携带的脂肪酸链数目越多，接合单元就有较高的机率可和单一个HAS的多个囊袋或不同HAS的囊袋形成非共价结合。再者，二脂肪酸链间的距离可能会影响脂肪酸链与相同或不同HAS间的结合动能。
第I部分用以治疗特定疾病的多臂接合物
I-(i)用于多臂接合物的多肽中心核
人类血液中含量最丰富的成分就是蛋白质，以下为一些常见的蛋白质及其在成年人血液中的含量：白蛋白(35-50g/L)、免疫球蛋白G(IgG)(7-18g/L)，IgA(0.8-6g/L)、IgM(0.4-4g/L)与纤维蛋白原(2-4.5g/L)。已知这些蛋白质比起其他蛋白质有较长的半衰期。举例来说，白蛋白的循环半衰期为19天，而IgG(IgG1、IgG2与IgG4)的半衰期超过20天。基于此种药动学特性，这些蛋白质可作为药物分子的过渡性港口或暂时接口，因而能够延长其半衰期。
因此，本揭示内容的第一种方面是关于一接合单元，其至少包含：(1)一中心核，其至少包含2-5个赖氨酸(K)残基；以及(2)2-5个第一元件，分别连接到中心核的K残基。此处提出的中心核特征在于具有连接到其N-及/或C-端的一或二个复合基。根据本揭示内容的实施方式，复合基是用以有效地将功能性元件(如，效应元件)耦接到中心核，而每一该第一元件为脂肪酸(或二酸)，其对于白蛋白或对白蛋白、IgG、IgA或IgM专一的单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)具有结合亲和力。本接合单元提出了延长功能性元件半衰期的方法，因此能够改善其疗效。
根据本揭示内容某些实施方式，该2至5个第一元件中的每一者为脂肪酸或二酸或其衍生物。于制备本接合单元时，第一元件透过在脂肪酸(或二酸)的羧基与K残基的氨基间形成酰胺键而连接到K残基的ˊ侧链。于某些实施方式中，所述脂肪酸或二酸经一化学实体修饰，故此种脂肪酸或二酸衍生物可透过该化学实体的官能基而连接到K残基的侧链氨基。举例来说，根据本揭示内容某些实施方式，所述脂肪酸或二酸经谷氨酸修饰。
根据本揭示内容多种实施方式，第一元件为脂肪酸衍生物，其衍生自：辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、二十二酸、二十三酸、二十四酸、棕榈油酸、油酸、亚麻油酸、蓖麻油酸或异柠檬酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)。根据本揭示内容某些实施方式，第一元件为二元脂肪酸衍生物，其衍生自：1,8-辛二酸、1,7-庚二甲酸、1,10-癸二酸、十一烷二酸、十二烷二酸、十三烷二酸、十四烷二酸、十五烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸或十八烷二酸。于某些实施方式中，本第一元件衍生自肉豆蔻酸或棕榈酸。于其他实施方式中，本第一元件衍生自十四烷二酸或十六烷二酸。
根据本揭示内容多个实施方式，中心核是长度为5-120个氨基酸残基的多肽，且至少包含2至5个K残基，其中每一个K残基和其下一个K残基(即，两个连续K残基)间彼此相邻或以一填充物间隔开来。
当可想见，连接到中心核的第一元件数目主要取决于中心核中所含K残基的数目。由于此处提出的中心核中有至少两个K残基，本接合单元可至少包含复数个第一元件。
由中心核所含的K残基可知，填充物的氨基酸残基可分别且独立地选自以下组成的群组：甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、精氨酸(R)、组胺酸(H)、苏氨酸(T)、天冬酰胺酸(N)、麸酰胺酸(Q)、脯胺酸(P)、丙胺酸(A)、缬胺酸(V)、异白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、苯基丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)与色胺酸(W)残基。
根据本揭示内容某些实施方式，填充物的氨基酸残基可分别且独立地选自以下组成的群组：G、S、R与H残基。于替代性的实施方式中，填充物的氨基酸残基分别为R或H残基。
置于K残基间的填充物可以是所述氨基酸残基的变形，譬如可随机排列其序列及/或改变程度。对于带有K残基较少的多肽链，可使用较长的填充物，而对于有较多K残基者则可以使用较短的填充物。可在填充物中连同G、S而加入亲水性的氨基酸残基，譬如N、Q、R与H。除了由G与S残基组成的填充物之外，可选用常见人类血清蛋白质如白蛋白与免疫球蛋白中有弹性、可溶性环片段作为替代性的填充物。
或者是，填充物可以是带有2到12个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸。
一般来说，中心核中的多个填充物可以相同或不同。具体而言，每一该填充物可至少包含相同或不同的氨基酸残基/EG重复单元。或者是，中心核的某些填充物可以是带有3个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，而中心核的其他填充物则可以是带有5-7个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸。
除了填充物以外，本中心核至少更包含一或二个视需要而采用的末端间隔物，其具有一复合基的连接。所述末端间隔物至少包含(i)二或更多个氨基酸残基，其分别且独立地选自K残基以外的其他氨基酸残基；或(ii)具有2至12个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸。根据本揭示内容多个实施方式，所述复合基结合到末端间隔物的α-氨基(即，位于末端间隔物N-端的氨基酸残基/聚乙二醇化氨基酸的α-氨基)，或结合到末端间隔物的羧基(即，位于末端间隔物C-端的氨基酸残基/聚乙二醇化氨基酸的羧基)。
根据本揭示内容一实施方式，所述中心核至少包含一个末端间隔物，其位于N-端K残基的上游；于本实施方式中，所述复合基结合于末端间隔物的α-氨基。根据本揭示内容另一实施方式，所述中心核至少包含一个末端间隔物，其位于C-末端K残基的下游；于本实施方式中，所述复合基结合于末端间隔物的羧基。根据本揭示内容又一实施方式，所述中心核至少包含两个末端间隔物，其中一个末端间隔物设于N-端K残基的上游且有连接于其α-氨基的第一复合基；而另一个末端间隔物设于C-末端K残基的下游且有连接于其羧基的第二复合基。
所述复合基选自由以下所组成的群组：叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基、环辛炔基、顺丁烯二酰亚胺基、乙烯砜基、单砜基、甲磺酰苯并噻唑基、碘基与碘乙酰胺基。根据本揭示内容较佳实施例，所述复合基为叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基、四嗪、环辛烯基或环辛炔基。当可理解，当中心核有两个与之连接的复合基时，两个复合基可以相同或不同。在较佳的情形中，两个复合基不同；举例来说，一个复合基可以是叠氮基、炔基或环辛炔基，而另一个复合基可以是四嗪基或环辛烯基。
一般来说，环辛烯基可以是降莰烯或TCO基；且环辛炔基可以是DBCO/DIBO、DIFO、BCN或DIBAC基。置于四嗪基，可以是1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪或其衍生物。根据本揭示内容一实施方式，四嗪基为6-甲基-四嗪。
参照图1A-1E，其中每一个中心核10a、10b、10c、10d与10e上连接有一复合基。在图1A至1D中，一四嗪基、TCO基、叠氮基与炔基分别连接到中心核10a、10b、10c与10d的N-端间隔物的α-氨基。图1E是另一种替代性的实施例，其中作为保护基团的乙酰(acetyl)基和多肽中心核10e的N-端间隔物的α-氨基键结，而作为复合基的DBCO基则和中心核10e的C-端间隔物的羧基键结。
于本揭示内容中某些实施方式，中心核至少包含两个复合基。图1F绘示了其中一例，其中四嗪基与DBCO基分别结合到多肽中心核10f的N-端间隔物的α-氨基以及C-端间隔物的羧基。图1G为另外一例，其中TCO基与DBCO基分别结合到多肽中心核10g的N-端间隔物的α-氨基与C-端间隔物的羧基。在替代性的具体实施例中，多肽中心核10h的N-端间隔物的α-氨基与C-端间隔物的羧基分别与炔基以及DBCO基结合(图1H)。
反应式1-3例示了接有一或两个所述复合基的中心核的合成方式。
相较于使用常规氨基酸(譬如G与S残基)做间隔物，使用聚乙二醇化氨基酸来合成多肽所涉及的步骤较少。此外，聚乙二醇化氨基酸可具有不同的长度(即，不同数目的EG重复单元)，对于中心核中相邻的K残基提供了较为理想的弹性与可溶性。除了聚乙二醇化氨基酸之外，亦可建构中心核使其带有人工氨基酸，譬如D-型氨基酸、高氨基酸(homo-aminoacid)、N-甲基氨基酸等。在较佳的情形中，使用带有不同PEG长度的聚乙二醇化氨基酸来建构中心核，因为氨基酸分子中的PEG部分提供了构型上的弹性且可使复合基之间有适当的间隔、提升水溶性，此外，PEG分子的免疫源性通常较弱。含聚乙二醇化氨基酸的中心核的合成方式与常规多肽合成相似。
基于稳定性的目的，当中心核的N-端并未与复合部分结合时，该N-端较佳与一乙酰基键结。
于本揭示内容中，在各图式中以x表示中心核的α-氨基和复合基间的反应或中心核的羧基和复合基间的反应。
<<反应式1N-端带有四嗪基或TCO基的中心核的制备>>
<<反应式2C-端带有DBCO基的中心核的制备>>
<<反应式3N-端与C-端分别带有复合基的中心核的制备>>
参照图2A。如图所示，接合单元20A至少包含一中心核20a，其带有三个K残基，彼此间以一填充物(图中以点线标示)隔开。在第一个K残基的上游有一个末端间隔物(图中以～标示)，且有一四嗪基25连接于其α-氨基。于本实施例中，有三个第一元件21a-21c分别连接到K残基。
根据本揭示内容另一实施方式，图2B所示的接合单元至少包含两个复合基。中心核20b至少包含四个K残基。第一与第二末端间隔物分别位于中心核的N-端与C-端，其中DBCO基28连接于第一末端间隔物的α-氨基，而TCO基26则连接于第二末端间隔物的羧基。于本实施例中，K残基分别连接有第一元件21a-21d。
或者是，第一元件可以是对白蛋白、IgG、IgA或IgM专一的scFv。于此种情形中，第一元件可透过连接臂而连接于中心核。具体而言，对于一端带有NH2-反应基(如，N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)基)而另一端带有一官能基的PEG链，可透过PEG链的NH2-反应基和K残基的氨基间形成的酰胺键而连接到中心核的任一个K残基。于本揭示内容中，将连接于K残基的PEG链称为连接臂，其自由端有一官能基。一般来说，上述官能基选自由以下所组成的群组：羟基、三级丁基二甲硅基(tert-Butyldimethylsilyl，TBDMS)、NHS、顺丁烯二酰亚胺基、乙烯砜基(vinyl sulfone)、单砜基(mono-sulfone)、甲磺酰苯并噻唑基(methylsulfonyl benzothiazole)、碘基(iodo)、碘乙酰胺基(iodoacetamide)、叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基、环辛炔基、四嗪基与环辛烯基。随着所欲的目的不同，所述顺丁烯二酰亚胺基可以是经取代的顺丁烯二酰亚胺基，譬如，芳基顺丁烯二酰亚胺基、3-溴顺丁烯二酰亚胺基与3,4-二溴顺丁烯二酰亚胺基。在较佳的情形中，当复合基为叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基或环辛炔基时，功能基不是叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基或环辛炔基的任一种。或者是，当中心核的复合基为四嗪基或环辛烯基时，官能基不是四嗪基也不是环辛烯基。
因此，带有相应官能基的第一元件可以透过以下任一种化学反应而连接到连接臂的自由端：
(1)于其间形成酰胺键：在此种情形中，连接臂的自由端带有NHS基，而第一元件则带有氨基；
(2)于其间形成酯键：在此种情形中，连接臂的自由端带有羟基或TBDMS基，而第一元件则带有羟基-反应基(如，甲苯磺酰-O基)；
(3)硫醇–顺丁烯二酰亚胺基(或乙烯砜)反应：在此种情形中，连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基、乙烯砜基、单砜基或甲磺酰苯并噻唑基，而第一元件则带有硫醇基；
(4)SN2反应：在此种情形中，连接臂的自由端带有碘基或碘乙酰胺基，而第一元件则带有硫醇基；
(5)铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(CuAAC)反应：连接臂自由端与第一元件其中之一带有叠氮基或吡啶甲基叠氮(picolyl azide)基，而另一个则带有炔基；例示性的CuAAC反应如反应式4、5；
(6)逆电子需求狄尔斯-阿德(iEDDA)反应：连接臂自由端与第一元件其中之一带有四嗪基，而另一个则带有TCO或降莰烯基；例示性的iEDDA反应如反应式6、7；或
(7)应力促进的叠氮化物-炔羟链接化学(SPAAC)：连接臂自由端与第一元件其中之一带有叠氮基，而另一个则带有环辛炔基；例示性的SPAAC反应如反应式8。
<<反应式4叠氮基与炔基间的CuAAC反应>>
<<反应式5吡啶甲基叠氮基与炔基间的CuAAC反应>>
<<反应式6TCO与四嗪基间的iEDDA反应>>
<<反应式7降莰烯与四嗪基间的iEDDA反应>>
<<反应式8叠氮基与DBCO基之间的SPAAC反应>>
接着参照图2C，所示的接合单元20C与接合单元20A的结构类似，不同之处在于有三个第一元件(23a、23b与23c)分别透过三个连接臂(22a、22b与22c)而连接于K残基。
根据本揭示内容某些实施方式，所述中心核至少包含两个复合基分别连接于中心核的N-端间隔物的α-氨基以及C-端间隔物的羧基。在这些实施方式中，其中一个复合基为叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基或环辛炔基，而另一个复合基则为四嗪基或环辛烯基；在较佳的情形中，所述连接臂的官能基为羟基、TBDMS、NHS、顺丁烯二酰亚胺基、乙烯砜基、单砜基、甲磺酰苯并噻唑基、碘基或碘乙酰胺基。
在较佳的情形中，所述连接臂为带有2-20个EG重复单元的PEG链。或者是，连接臂为具有2-20个EG重复单元的PEG链，且其未与中心核连接的一端有一双硫键。当可理解，可适用的连接臂不限于PEG链。亦可使用多肽链(譬如至少包含甘氨酸、丝氨酸与其他亲水性氨基酸残基者)以及多糖类，还有其他生物相容的线性高分子，这些材料都可以经过修饰而带有适当的官能基(如，NHS、顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)。
当可想见，上文针对接合单元20A-20C或其他下述接合单元所讨论的某些特征亦适用于其他所述的接合单元，因此除非另有相反的说明，某些或全部的特征亦适用于下列的实施例。为求简洁，下文可能省略某些重复的特征。
本接合单元可至少更包含一或两个连接于复合基(如，叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基)的功能性元件。具体而言，功能性元件可视需要地先与短的PEG链(较佳为带有2-12个EG重复单元)复合，其后再连接到复合基。
根据本揭示内容某些实施方式，中心核至少包含一个复合基(即，叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基)；且相对应地，带有叠氮基-反应基(如，炔基或DBCO基)、炔基-反应基(如，叠氮基或吡啶甲基叠氮基)、四嗪-反应基(如，TCO基或降莰烯基)、环辛烯基-反应基(如，叠氮基)或环辛炔基-反应基(如，四嗪基)的功能性元件(即，第二元件)就可以透过CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应连接于中心核的复合基。
参照图3A，其中接合单元30A的结构与接合单元20A类似，不同之处在于第二元件33连接于末端间隔物上的四嗪基。图3A中的实心圆点27代表四嗪基与第二元件间因iEDDA反应而形成的化学键结。
根据本揭示内容其他实施方式，中心核至少包含两个复合基。如上所述，当第一复合基为叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基或环辛炔基时，第二复合基较佳为四嗪基或环辛烯基。因此，两个功能性元件(即，第二与第三元件)可分别透过SPAAC与iEDDA反应、或透过CuAAC与iEDDA反应而连接至中心核。举例来说，带有环辛炔基-反应基(如，叠氮基)的第二元件可透过SPAAC反应而连接到第一复合基；而带有炔基-反应基(如，叠氮基或吡啶甲基叠氮基)、四嗪基-反应基(如，TCO基或降莰烯基)或环辛烯基-反应基(如，四嗪基)的第三元件则可以透过CuAAC或iEDDA反应而连接到第二复合基。或者是，带有四嗪基-反应基(如，TCO基或降莰烯基)或环辛烯基-反应基(如，四嗪基)的第二元件可透过iEDDA反应连接至第一复合基；而带有叠氮基-反应基(如，炔基或DBCO基)、炔基-反应基(如，叠氮基或吡啶甲基叠氮基)或环辛炔基-反应基(如，叠氮基)的第三元则可透过CuAAC或SPAAC反应而连接至第二复合基。
图3B为根据本揭示内容实施例的接合单元30B，其至少包含分别与第二、第三元件连接的两个复合基。接合单元30B的结构和接合单元20B相似，不同之处在于第一元件第二元件33连接于DBCO基，而第三元件35则连接于TCO基。图3B中的实心三角29代表DCO基与第二元件间因SPAAC反应而形成的化学键结；而图3B中的实心圆点27则代表TCO基与第三元件间因iEDDA反应而形成的化学键结。
图3C是此处提出的接合单元的另一种替代性实实施例。接合单元30C至少包含两种功能性元件(即，第二与第三元件)，其中第二元件33与连接于中心核20a的N-端间隔物上的四嗪基接合，而第三元件35则与连接于中心核20a的C-端间隔物的叠氮基接合。图3C中的实心圆点27代表四嗪基与第二元件间因iEDDA反应而形成的化学键结；而图3C中的菱形代表叠氮与间因CuAAC反应而形成的化学键结。
随着所欲的目的不同，与中心核的复合基连接的功能性元件可以是能够在疾病或症状治疗中产生治疗效益的任何分子。例示性的功能性元件包括但不限于：胰岛素、类胰岛素生长因子、类升糖素肽-1促效剂、体抑素与体抑素类似物、降钙素、生长激素、红血球生成素、促性腺素释放激因子、颗粒性白血球群落刺激因子、腺苷脱氨酶、天冬酰胺酸酶、干扰素-α、干扰素-β、TNF-α受体、IL-1受体、EGF受体、半乳糖苷酶β、半乳糖苷酶α、拉罗尼酶、移粘宝酶、阿葡糖苷酶α以及加硫酶，或其衍生物或变异物。
I-(ii)多臂接合物的用途
本揭示内容亦揭示了利用适当的接合单元来治疗各种疾病的方法。一般而言，所述方法至少包含对需要治疗的个体投予有效量的本发明接合单元。
相较于既有的治疗性构建体，第I部分所述的接合单元至少有以下三种优点：
(1)可以视需求和/或用途来调整第一元件(即，脂肪酸或对白蛋白、IgG、IgA或IgM专一的scFv)的数目。根据不同用途的需求，本发明接合单元可包含一种功能性元件(即，第二元件)或两种功能性元件(即，第二与第三元件)，上述需求包括欲治疗的疾病、接合单元的给药方法、接合单元所携抗体的结合力与亲和力等等。举例来说，当要将接合单元直接投递到特定组织/器官时，可以只使用作为效应元件的第二元件，而不需加入作为标的元件的第三元件。然而，当透过周边给药途径来投递接合单元时，譬如经口服、肠胃道、鼻腔、局部或粘膜给药、或以肌肉内、静脉内或腹膜内注射，所述接合单元就需要同时包含能够将接合单元专一地标的到病灶部位标的元件、以及可在病灶部位发挥治疗效果的效应元件。为了要提高接合单元的标的或治疗效果或提升其稳定度，本发明接合单元还可进一步包含第三元件；所述的第三元件可以是第二种标的元件、第二种效应元件或PEG链。
(2)第一元件是以成束(bundle)的形式存在。如上文所述，第一元件(即，脂肪酸)的数目取决于中心核所包含的K残基数目。由于中心核中的K残基数目是2到5，故每一接合单元可带有至少两个第一元件，进而可有效地提升功能性元件(即，第二及/或第三元件)的半衰期与治疗效果。
(3)可透过所述接合单元上的复合基将其和一功能性元件或另一分子构建体(如下文第II部分所述)连接。可利用商业方法合成此处提出的中心核。或者是，可利用反应式4-8提出的反应式而轻易地由合成多肽制得此处提出的中心核，其中以复合基(即，叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基)取代了作为保护性基团来保护α-氨基的N-端9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethoxycarbonyl，Fmoc)。额外地或替代性地，上述复合基也可和多肽的羧基反应而与多肽连接。所制得的中心核至少包含一或两个复合基，此复合基可用于将功能性元件(如，此处提出的第二及/或第三元件)连接到中心核，而不需额外的处理步骤。
第II部分联合接合物构型分子构建体及其治疗特定疾病的用途
本揭示内容的另一方面是关于包含至少两个接合单元的分子构建体，其中一个接合单元带有多个脂肪酸(即，脂肪酸束)，而另一个接合单元带有多个效应元件(即，载药束)。于本揭示内容中，此种至少包含二或更多个接合单元的分子构建体亦称为联合接合物分子构建体。根据本揭示内容多种实施方式，所述联合接合物分子构建体至少包含两个第I部分所述的接合单元。
II-(i)联合接合物构型的分子构建体的结构
根据本揭示内容某些实施方式，所述分子构建体至少包含两个接合单元，且所述接合单元透过CuAAC、SPAAC或iEDDA反应而彼此连接。于某些实施方式中，第一接合单元至少包含(1)中心核、(2)分别连接于中心核K残基的复数个第一元件，以及(3)结合于中心核N-或C-端的复合基，所述复合基选自由以下所组成的群组：叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基与环辛炔基。相似地，第二接合单元至少包含(1)中心核、(2)分别连接于中心核K残基的复数个第二元件，以及(3)结合于中心核N-或C-端的复合基，所述复合基选自由以下所组成的群组：叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基与环辛炔基。第一与第二接合单元可透过复合基间的CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA反应而彼此连接。
根据某些实施方式，每一上述第一元件为脂肪酸或对白蛋白、IgG、IgA或IgM专一的scFv；且每一上述第二元件为能够在疾病或症状治疗中产生治疗效益的任何分子，譬如胰岛素、类胰岛素生长因子、类升糖素肽-1促效剂、体抑素与体抑素类似物、降钙素、生长激素、红血球生成素、促性腺素释放激因子、颗粒性白血球群落刺激因子、腺苷脱氨酶、天冬酰胺酸酶、干扰素-α、干扰素-β、TNF-α受体、IL-1受体、EGF受体、半乳糖苷酶β、半乳糖苷酶α、拉罗尼酶、移粘宝酶、阿葡糖苷酶α以及加硫酶，或其衍生物或变异物。对于仅带有一个赖氨酸残基的多肽或较小的蛋白质，且所述赖氨酸残基对其生物活性并非关键时，此一赖氨酸残基的ε-氨基可用于和带有氨基-反应基的异型双功交联物反应，譬如上述交联物的一端为NHS而另一端为可供进行化学反应的官能基。由于许多蛋白有多个赖氨酸残基，且其半胱氨酸残基经常成对地形成双硫键，这类赖氨酸与半胱氨酸残基不适合接上可进行点击化学反应的官能基。对于此类蛋白质，可将其表面上溶剂可达且非该蛋白生物活性必要的氨基酸残基突变为半胱氨酸残基。此一半胱氨酸残基带有的SH基可和带有SH基-反应基的官能基的异型双功交联物反应，譬如上述交联物的一端为顺丁烯二酰亚胺而另一端为可供进行化学反应的官能基。
或者是，所述第一接合单元至少包含分别连接到其N-端与C-端的两个复合基，其中一个复合基连接有功能性元件，而另一个复合基则为叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基。
又或者是，第一与第二接合单元皆至少包含分别连接到其N-端与C-端的两个复合基，其中一个复合基连接有功能性元件，而另一个复合基为叠氮基、吡啶甲基叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基。在此种情形中，第一与第二接合单元的功能性元件可以相同或不同。
II-(iii)联合接合物分子构建体的用途
本揭示内容亦揭示了利用适当的联合接合物分子构建体来治疗各种疾病的方法。一般而言，所述方法至少包含对需要治疗的个体投予有效量的所述联合接合物分子构建体。
实验例
实验例1：含叠氮基GLP-1促效剂的合成
人类活化升糖素肽-1(GLP-1)是一种由胰高血糖素(proglucagon)肽(1-37)经处理后得到的肽荷尔蒙。人类GLP-1(7-36)酰胺以及GLP-1(7-37)两者为截断的等效生物活性形式。
于本实验例中，制备含叠氮基GLP-1促效剂，其中叠氮基透过与谷氨酸残基连接而接合于GLP-1促效剂分子(SEQ ID NO:1)。具体而言，将谷氨酸残基的γ-羧基和GLP-1促效剂分子(SEQ ID NO:1)的赖氨酸残基的ε-氨基连接，并修饰谷氨酸残基的α-氨基使其带有叠氮乙酰基(如下所示)。
含叠氮基GLP-1促效剂是由本案发明人设计并委由药明康德新药开发有限公司(上海，中国)制造。合成使用逐步芴甲氧羰(Fmoc)固态肽合成(solid phase peptidesynthesis，SPSS)法，进行O-苯并三唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐/N,N-二异丙基乙基胺/N,N-二甲基甲酰胺(O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate/N,N-diiso-propylethylamine/N,N-dimethylformamide，HBTU/DIEA/DMF)耦合化学，其中HBTU作为受Fmoc保护的氨基酸的原位活化试剂，而DIEA则作为耦合过程中的有机碱。合成中使用经过Nα-Fmoc侧链保护的氨基酸以及2-氯化氯三苯甲基(2-chlorotrityl chloride，CTC)树脂。采用以下的侧链保护策略：Arg(Pbf)、Trp(Boc)、Thr(OtBu)、Lys(N-Dde)、Tyr(OtBu)、Glu(OtBu)、Gln(Trt)、Ser(OtBu)、His(Trt)。在每一个耦合循环中，除了第一个循环之外，使用3mmole的Nα-Fmoc-氨基酸、6mmole的DIEA以及2.85mmole当量的HBTU。以含20％哌啶的DMF溶液(三倍肽树脂体积)来移除α-氨基上的Fmoc保护基。
在步骤(i)，肽合成一开始是将第一个氨基酸共价连接到树脂上，使氨基酸Fmoc-Gly-OH(1.0mmol，297.5mg)与CTC树脂(1.0mmole，取代＝1.0mmole/g，1.0g)溶解于二氯甲烷(dichloromethane，DCM)中，之后加入DIEA(4.0mmole)并使所得的混合物在氮气气泡下反应膨胀。接着，将作为封端试剂(capping reagent)的甲醇(MeOH，1.0mL)加入Fmoc-保护的肽树脂并混合0.5小时，以使其与CTC树脂上未反应的碳阳离子共价结合。
在步骤(ii)，排干含甲醇的封端溶液，之后以DMF冲洗3次。在步骤(iii)，于冲洗树脂后，加入含20％哌啶的DMF溶液反应30分钟，以移除CTC树脂上的Fmoc保护基。在步骤(iv)，排干所得溶液并以DMF清洗5次。在步骤(v)，在氮气气泡下将Fmoc-Arg(Pbf)-OH(3当量)与活化剂(HBTU)加入树脂上反应3小时，以进行第二个氨基酸的人工耦接。接着，重复步骤(ii)至(v)，每次根据肽序列而加入另一个氨基酸。对于每一个耦接循环步骤，以茚三酮(ninhydrin)试验来监控耦接反应。
欲于CTC树脂上切下侧链受保护的肽时，制备40.0mL的裂解缓冲液(5％TIS/5％H2O/90％TFA)，并在搅拌下将其加入至含有树脂的烧瓶中反应2小时。以冷的甲基三级丁酯(tert-butyl methyl ether)使粗肽析出并以6000rpm离心3分钟。以甲基三级丁酯再将粗肽冲洗两次(共400.0mL)并真空干燥2小时。
利用Agilent SB-苯基制备型HT管柱(250mm x 30mm；7μm)进行反相高效能液态层析(HPLC)来纯化含叠氮基GLP-1促效剂，流动相使用乙腈与0.075％三氟乙酸，乙腈线性梯度为0％至60％乙腈、60分钟，流速为20mL/min、管柱温度25℃。
利用反相分析级HPLC来分析纯化的含叠氮基GLP-1促效剂样本，使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为0％至100％、30分钟，流速为1.0ml/min、管柱温度25℃。图4A含叠氮基GLP-1促效剂的反相分析级HPLC图谱，于OD254下在滞留时间约23.153分钟出现含叠氮基GLP-1促效剂的波峰。
利用MALDI-TOF质谱分析样本。此处的质谱分析所用的设备为Bruker AutoflexIII MALDI-TOF/TOF质谱(购自Bruker Daltonics，Bremen，德国)。
图4B为所合成的含叠氮基GLP-1促效剂的质谱分析结果，由图中可以看出此分子构建体的分子量约为3,595.037道尔顿。缩写：Pbf，五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰氯(2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl chloride)；Boc，三级丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl)；tBu，三级丁基醚(tert-butyl ether)；Dde，1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己亚基)乙基(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl)；Trt，三苯甲基(triphenylmethyl)；TIS，三异丙基硅烷(triisopropylsilane)；TFA，四氟乙酸(trifluoroacetic acid)。
实验例2：经Aib取代的含叠氮基GLP-1促效剂的合成
于本实验例中，制备含叠氮基且带有一个ε-异丁胺酸(ε-aminoisobutyric acid，Aib)取代基的GLP-1促效剂(SEQ ID NO:2，如下所示)，其中以Aib残基(一码简写为U)取代了SEQ ID NO:1中第8个位置的丙胺酸残基，使其较能抵抗二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidase IV，DPP 4)引发的降解。于本实验例中，将谷氨酸残基的γ-羧基和GLP-1促效剂分子(SEQ ID NO:2)的赖氨酸残基的ε-氨基连接，并修饰谷氨酸残基的α-氨基使其带有叠氮乙酰基(如下所示)。
与实验例1类似，所述的经Aib取代的含叠氮基GLP-1促效剂是由本案发明人设计并委由药明康德新药开发有限公司(上海，中国)制造。采用上文实验所述的合成步骤。
利用反相分析级HPLC来分析纯化的经Aib取代的含叠氮基GLP-1促效剂样本，使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为0％至100％、30分钟，流速为1.0ml/min、管柱温度25℃。利用MALDI-TOF质谱分析样本(资料未示出)。
实验例3：带有可用于耦接反应的半胱氨酸残基的体抑素类似物的合成
如下所示，设计带有未成对半胱氨酸残基的体抑素类似物(SEQ ID NO:3)，以供与多臂接合物的连接臂上的顺丁烯二酰亚胺基耦接。所述体抑素类似物采用标准固态合成法合成，并委由浙江鸿拓生物技术有限公司(杭州，中国)生产。所制得的体抑素类似物纯度高于95％。
利用质谱MALDI-TOF来鉴定所合成的肽。图5显示的质谱MALDI-TOF分析结果指出本分子构建体的分子量约为1,493.587道尔顿。
实验例4：耦接三个体抑素类似物的含DBCO多臂接合单元的合成
合成含DBCO多臂接合物的方法如下：在步骤(i)，将合成的肽2(SEQ ID NO:4；上海强曜生物科技，上海，中国)溶解于100％无水DMSO中，最终浓度为10mM。将肽与顺丁烯二酰亚胺-PEG3-DBCO以1/1的比例混合并于室温下培育16小时，以使半胱氨酸残基SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-DBCO(购自Conju-probe Inc.，圣地牙哥，美国)耦接，而使其带有功能性的连接基团DBCO。
利用质谱MALDI-TOF来鉴定所合成含DBCO肽2(如下所示)。
在步骤(ii)，将所合成的含DBCO肽2溶解于100％DMSO中，最终浓度为10mM。将含DBCO肽2与有机碱DABCO以1/5的摩尔比混合于100％DMSO中。接着，将NHS-PEG12-Mal交联物加入含DBCO肽2溶液中，最终摩尔比为1/6(含DBCO肽2：NHS-PEG12-Mal)，于100％无水DMSO中。使反应混合物在室温下反应一晚。
利用反相HPLC来分析耦接有三个PEG12-Mal连接臂的含DBCO肽2(如下所示)，使用Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为0％至100％、30分钟，流速为3.0ml/min、管柱温度25℃。
对所合成的耦接有三个PEG12-Mal连接臂的含DBCO肽2进行质谱分析，结果显示所述分子构建体的分子量约为4,480.89道尔顿。
在步骤(iii)，使实验例3制得的体抑素类似物的硫醇基和耦接有三个PEG12-Mal连接臂的含DBCO肽2反应。将体抑素类似物溶解于100％DMSO中，最终浓度为25mM，并将耦接有三个连接臂的含DBCO肽2溶解于100％DMSO中，最终浓度为1mM。将耦接有三个PEG12-Mal连接臂的含DBCO肽2加入体抑素溶液中使其最终浓度为3.6mM(对于1Mm的含DBCO肽2多臂接合物溶液为3.6-倍摩尔过剩)。使反应混合物在室温下反应一晚。
利用反相高效能HPLC(RP-HPLC)来纯化耦接三个体抑素类似物的含DBCO多臂接合单元(下称3-体抑素DBCO载药束)，使用Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为0％至100％、30分钟，流速为3.0mL/min、管柱温度25℃。3-体抑素DBCO载药束的反相HPLC洗提图谱显示在侦测OD254紫外光吸收度时，洗脱峰的滞留时间约22.38分钟，如图6A所示。
图6B为所合成的3-体抑素DBCO载药束(如下所示)的质谱分析结果，由图可知此分子构建体的分子量约为9,005道尔顿。
实验例5：含叠氮基多臂接合单元的合成，其以肽3为多肽中心核(SEQ ID NO:5)且连接臂与奥曲肽(SEQ ID NO:6)共价接合
于本实验例中，利用标准Fmoc化学以人工合成来制备3-奥曲肽叠氮基-载药束。载药束是一个含叠氮基接合单元，其以肽3为多肽中心核(SEQ ID NO:5)并有三个连接臂，分别与一个奥曲肽(SEQ ID NO:6)共价连接。此一接合单元(3-奥曲肽叠氮基-载药束)由本案发明人设计，并委由药明康德新药开发有限公司(上海，中国)。
所合成的分子，如下所示，是由与三个奥曲肽共价接合且带有一个自由叠氮基的多臂接合单元所组成。利用质谱MALDI-TOF来鉴定样本。
实验例6：脂肪酸束的合成，其带有两个棕榈酰链的含炔基接合单元
于本实验例中，制备含炔基且带有两个棕榈酰链的脂肪酸束(如下所示)。
多肽中心核(炔基-乙基-Xaa4-K-Xaa4-K-OMe，SEQ ID NO:7)带有两个K残基，且在其N-端有炔丙酰基。在两个K残基间设有一间隔物，而炔基与第一个K残基间有一N-端间隔物，这些间隔物都是带有4个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸。两条棕榈酰链分别透过在棕榈酸的羧基以及K残基的氨基间形成酰胺键，而连接到多肽中心核的K残基(如下所示)。此一新分子为炔基-EG4-2FA-C16(简称为炔基-2FA)委由合成药明康德新药开发有限公司合成。
在步骤(i)，肽合成一开始是将第一个氨基酸共价连接到树脂上，使氨基酸Fmoc-Lys(Dde)-OH(6.0mmol)与CTC树脂(3.0mmole)溶解于二氯甲烷(DCM)中，之后加入DIEA(12.0mmole)并使所得的混合物在氮气气泡下反应膨胀2小时。
在步骤(ii)，排干肽-树脂混合物溶液，之后以DMF冲洗3次。在步骤(iii)，于冲洗树脂后，加入含20％哌啶的DMF溶液反应30分钟，以移除CTC树脂上的Fmoc保护基。在步骤(iv)，排干经处理的溶液并以DMF清洗5次。在步骤(v)，在氮气气泡下将Fmoc-PEG4-OH(2当量)与活化剂(HBTU)加入树脂上反应1小时，以进行第二个氨基酸的人工耦接。接着，重复步骤(ii)至(v)，每次根据肽序列而加入另一个氨基酸。将3％的N2H4/DMF溶液加入到肽树脂溶液并反应20分钟，以移除两个赖氨酸残基上的Dde保护基。在最后的合成循环中，在氮气气泡下将棕榈酸(1.0当量)与活化剂(HBTU)加到树脂上反应约1小时。
欲于CTC树脂上切下侧链受保护的肽时，制备裂解缓冲液(95％TFA/2.5％TIPS/2.5％H2O)，并在搅拌下将其加入至含有肽-树脂溶液的烧瓶中在室温下反应1小时。以冷的甲基三级丁酯使粗肽析出并以5000rpm离心2分钟。以甲基三级丁酯再将粗肽冲洗两次并真空干燥2小时。于制备C-端甲基酯时，将粗肽溶解于4N的HCl的MeOH溶液。使溶液反应约2小时并以液态层析质谱(LCMS)监控。在反应完成后，加入DIEA并将pH值调整为7.0以淬灭反应。将所得溶液真空干燥。
以反相HPLC纯化含炔基且带有两个棕榈酰链的接合单元，使用Luna制备型C4管柱(250mm x 25mm；10μm)，流动相使用乙腈与0.075％三氟乙酸，乙腈线性梯度为55％至90％、60分钟，流速为20mL/min、管柱温度25℃。含炔基且带有两个脂肪酸链的接合单元的质谱分析结果如图7所示，此分子构建体的分子量约为1,340.104道尔顿。缩写：TIPS，三异丙基硅烷(triisopropylsilane)。
实验例7：四种含炔基脂肪酸束的合成，其在多肽中心核的Lys残基与脂肪酸链间有一额外的谷氨酸间隔基
于本实验例中，制备另外四种含炔基脂肪酸束。
制备带有两个棕榈酰链的脂肪酸束「炔基-EG4-2E-2FA-C16」(如下所示)。多肽中心核(炔基-乙基-Xaa4-K-Xaa4-K-OMe，SEQ ID NO:7)有两个K残基，且在其N-端有炔基。在两个K残基之间以及在炔基与相邻的K残基之间的间隔物都是带有4个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸。两条棕榈酰链分别与外加的谷氨酸间隔基形成两个酰胺键而连接到多肽中心核的K残基，其中一个酰胺键形成于谷氨酸的γ-羧基和K残基的氨基间，另一个形成于谷氨酸残基的α-氨基和棕榈酸的羧基间。
制备「炔基-EG4-2E-2FA-C16-酸」脂肪酸束(如下所示)。多肽中心核(炔基-乙基-Xaa4-K-Xaa4-K-OMe，SEQ ID NO:7)带有两个K残基，且在其N-端有炔基。在两个K残基之间以及在炔基与相邻的K残基之间的间隔物都是带有4个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸。两个带有二酸基的棕榈酰链(即，十六烷二酸或普塔酸)分别透过和外加的谷氨酸间隔基形成两个酰胺键而连接到多肽中心核的K残基，其中一个酰胺键形成于谷氨酸的γ-羧基和K残基的氨基间，另一个形成于谷氨酸残基的α-氨基和十六烷二酸的其中一个羧基间。
制备「炔基-EG2-2E-2FA-C16-酸」脂肪酸束(如下所示)。多肽中心核(炔基-乙基-Xaa2-K-Xaa2-K-OMe，SEQ ID NO:8)带有两个K残基，且在其N-端有炔基。在两个K残基之间以及在炔基与相邻的K残基之间的间隔物都是带有2个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸。两个带有二酸基的棕榈酰链分别透过和外加的谷氨酸间隔基形成两个酰胺键而连接到多肽中心核的K残基，其中一个酰胺键形成于谷氨酸的γ-羧基和K残基的氨基间，另一个形成于谷氨酸残基的α-氨基和十六烷二酸的其中一个羧基间。
制备「炔基-EG2-2E-2FA-C18-酸」脂肪酸束(如下所示)。多肽中心核(炔基-乙基-Xaa2-K-Xaa2-K-OMe，SEQ ID NO:8)带有两个K残基，且在其N-端有炔基。在两个K残基之间以及在炔基与相邻的K残基之间的间隔物都是带有2个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸。两个带有二酸基的硬脂酰链链(即，十八烷二酸)分别透过和外加的谷氨酸间隔基形成两个酰胺键而连接到多肽中心核的K残基，其中一个酰胺键形成于谷氨酸的γ-羧基和K残基的氨基间，另一个形成于谷氨酸残基的α-氨基和十八烷二酸的其中一个羧基间。
与实验例6类似，此处四种脂肪酸束分子，即，炔基-EG4-2E-2FA-C16、炔基-EG4-2E-2FA-C16-酸、炔基-EG2-2E-2FA-C 16-酸与炔基-EG2-2E-2FA-C18-酸皆委由药明康德新药开发有限公司制备。
实验例8：由一个GLP-1促效剂与两条脂肪酸链组成的分子构建体(GLP-1-Ala8-EG4-2FA-C16促效剂)的合成
于本实验例中，使来自实验例1的含叠氮基GLP-1促效剂和来自实验例6的带有两条棕榈酰链的含炔基接合单元透过叠氮基与炔基间的CuAAC反应耦接而得到如下所示的「GLP-1-Ala8-EG4-2FA-C16促效剂」(简称GLP-1-2FA促效剂)。
上述合成委由药明康德新药开发有限公司进行。简言之，将来自实验例1的含叠氮基GLP-1促效剂(850.0mg，236.4umol，1.0当量)与来自实验例6的带有两条棕榈酰链的含炔基接合单元(158.4mg，118.2μmol，0.5当量)混合于于DMSO(30.0Ml)中，以氮气去除气体3次，加入CuI(22.5mg，118.2μmol，0.5当量)以及DIEA(61.1mg，472.8μmol，82.4μL，2.0当量)，并于氮气环境中将混合物在25℃下搅拌1小时。以液态层析质谱分析(LC-MS)确认反应完全。
以反相HPLC纯化GLP-1-2FA促效剂，使用串联的Luna C18管柱(200mm x 25mm；10μm)与Gemini C18管柱(150mm x 30mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.075％三氟乙酸，乙腈线性梯度为40％至70％、60分钟，流速为20mL/min、管柱温度25℃。将产物冻干以得到白色固态最终产物(33.2mg，产率2.85％)。
图8A为纯化GLP-1-2FA促效剂的反相HPLC洗提图谱，观察OD 215nm时，GLP-1-2FA促效剂波峰出现的滞留时间约为11.037分钟。对所合成的GLP-1-Ala8-EG4-2FA-C16促效剂进行质谱分析，图8B的分析结果显示GLP-1-Ala8-EG4-2FA-C16促效剂分子构建体的分子量约为4,937道尔顿。
实验例9：由一个GLP-1促效剂与两条棕榈酰链以及额外谷氨酸间隔基组成的分子构建体(GLP-1-Ala8-EG4-2E-2FA-C16促效剂)的合成
于本实验例中，使来自实验例1的含叠氮基GLP-1促效剂和来自实验例7的一个含炔基脂肪酸束(炔基-EG4-2E-2FA-C16)透过叠氮基与炔基间的CuAAC反应耦接而得到如下所示的「GLP-1-Ala8-EG4-2E-2FA-C16促效剂」。
与实验例8类似，所述合成委由药明康德新药开发有限公司进行。
图9A为纯化GLP-1-Ala8-EG4-2E-2FA-C16促效剂的反相HPLC洗提图谱，观察OD215nm时，GLP-1-Ala8-EG4-2E-2FA-C16促效剂波峰出现的滞留时间约为34.53分钟，波峰如图中箭头所示。
对所合成的GLP-1-EG4-2E-2FA-C16促效剂进行质谱分析，图9B的分析结果显示GLP-1-EG4-2E-2FA-C16促效剂分子构建体的分子量约为5,194道尔顿。
实验例10：由一个经Aib取代的GLP-1促效剂与两条棕榈酰链以及额外谷氨酸间隔基组成的分子构建体(GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16促效剂)的合成
于本实验例中，使来自实验例2的经Aib取代的含叠氮基GLP-1促效剂和来自实验例7的一个含炔基脂肪酸束(炔基-EG4-2E-2FA-C16)透过叠氮基与炔基间的CuAAC反应耦接而得到如下所示的「GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16促效剂」。
与实验例8类似，所述合成委由药明康德新药开发有限公司进行。
图10A为纯化GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16促效剂的反相HPLC洗提图谱，观察OD215nm时，GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16促效剂波峰出现的滞留时间约为34.635分钟，波峰如图中箭头所示。
对所合成的GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16促效剂进行质谱分析，图10B的分析结果显示GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16促效剂分子构建体的分子量约为5,208道尔顿。
实验例11：由一个经Aib取代的GLP-1促效剂与两条棕榈酰二酸链以及额外谷氨酸间隔基组成的分子构建体(GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16酸促效剂)的合成
于本实验例中，使来自实验例2的经Aib取代的含叠氮基GLP-1促效剂和来自实验例7的一个含炔基脂肪酸束(炔基-EG4-2E-2FA-C16酸)透过叠氮基与炔基间的CuAAC反应耦接而得到如下所示的「GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16酸促效剂」。
与实验例8类似，所述合成委由药明康德新药开发有限公司进行。
图11A为纯化GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16酸促效剂的反相HPLC洗提图谱，观察OD215nm时，GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16酸促效剂波峰出现的滞留时间约为25.988分钟，波峰如图中箭头所示。
对所合成的GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16酸促效剂进行质谱分析，图11B的分析结果显示GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16酸促效剂分子构建体的分子量约为5,267道尔顿。
实验例12：由一个经Aib取代的GLP-1促效剂与两条棕榈酰二酸链以及额外谷氨酸间隔基组成的分子构建体(GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C16酸促效剂)的合成
于本实验例中，使来自实验例2的经Aib取代的含叠氮基GLP-1促效剂和来自实验例7的一个含炔基脂肪酸束(炔基-EG2-2E-2FA-C16酸)透过叠氮基与炔基间的CuAAC反应耦接而得到如下所示的「GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C16酸促效剂」。
与实验例8类似，所述合成委由药明康德新药开发有限公司进行。
图12A为纯化GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C16酸促效剂的反相HPLC洗提图谱，观察OD215nm时，GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C16酸促效剂波峰出现的滞留时间约为26.0分钟，波峰如图中箭头所示。
对所合成的GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C16酸促效剂进行质谱分析，图12B的分析结果显示GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C16酸促效剂分子构建体的分子量约为5,091道尔顿。
实验例13：由一个经Aib取代的GLP-1促效剂与两条硬脂酰二酸链以及额外谷氨酸间隔基组成的分子构建体(GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C18酸促效剂)的合成
于本实验例中，使来自实验例2的经Aib取代的含叠氮基GLP-1促效剂和来自实验例7的一个含炔基脂肪酸束(炔基-EG2-2E-2FA-C18酸)透过叠氮基与炔基间的CuAAC反应耦接而得到如下所示的「GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C18酸促效剂」。
与实验例8类似，所述合成委由药明康德新药开发有限公司进行。
图13A为纯化GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C18酸促效剂的反相HPLC洗提图谱，观察OD215nm时，GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C18酸促效剂波峰出现的滞留时间约为27.815分钟，波峰如图中箭头所示。
对所合成的GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C18酸促效剂进行质谱分析，图13B的分析结果显示GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C18酸促效剂分子构建体的分子量约为5,148道尔顿。
实验例14：由耦接有三个奥曲肽的多臂接合单元和二条脂肪酸链组成的分子构建体的合成
于本实验例中，使来自实验例5的耦接有三个奥曲肽的含叠氮基多臂接合单元和来自实验例7的一个含炔基脂肪酸束(炔基-EG4-2E-2FA-C16)透过叠氮基与炔基间的CuAAC反应耦接而得到如下所示的耦接有三个奥曲肽的多臂接合单元和二条脂肪酸链组成的分子构建体。
本分子构建体的合成步骤与上文参照实验例8所述的步骤类似。简言之，将来自实验例5的耦接有三个奥曲肽的含叠氮基多臂接合单元(1.0当量)与来自实验例7的带有两条棕榈酰链的含炔基接合单元(炔基-EG4-2E-2FA-C16；0.5当量)混合于于DMSO(30.0Ml)中，以氮气去除气体3次，加入CuI(0.5当量)以及DIEA(2.0当量)，并于氮气环境中将混合物在25℃下搅拌1小时。以液态层析质谱分析(LC-MS)确认反应完全。
如下所示，所合成的分子是由耦接有三个奥曲肽的多臂接合单元和二条脂肪酸链所组成。
实验例15：GLP-1-EG4-2FA-C16促效剂对GLP-1受体的结合分析
于本实验例中，利用ELISA分析来探究GLP-1-Ala8-EG4-2FA-C16促效剂(简称为GLP-1-2FA)对GLP-1受体的结合能力。
简言之，在96孔微量多孔盘上涂覆重组人类GLP-1R-IgG.Fc融合蛋白(GLP-1R)(购自图尔斯生物科技股份有限公司)，浓度为10μg/ml、每孔50μl。在冲洗掉多余的重组GLP-1受体蛋白之后，以1％BSA的PBS溶液(pH7.4，含0.1％NaN3)将各孔阻断1小时，之后在每孔加入50μl不同浓度(1μg/ml或10μg/ml)的以下成分：GLP-1-EG4-2FA-C16促效剂、带有两条棕榈酰链的含炔基接合单元(炔基-EG4-2FA-C16，以下简称炔基-2FA)、含叠氮基GLP-1促效剂(GLP-1-叠氮基)以及利拉鲁肽中国台湾大学基因体暨蛋白体医学研究所张以承博士赠送)。以PBS冲洗后，加入最终浓度2μg/ml的小鼠单株抗体IgG抗-hGLP-1(购自Abcam，Bristol，UK)，并于37℃下培育1小时。以PBS(pH7.4)清洗后，采用以下步骤侦测与hGLP-1结合的抗体：加入1:10,000的HRP-复合山羊抗小鼠IgG(H+L)(购自JacksonImmunoResearch)，于37℃下培育30分钟，接着和TMB基质(购自Clinical ScienceProducts，Mansfield，USA)一起培育。加入50μl的1M HCl使反应停止。以盘式分析仪测定450nm的吸光度。每一长条代表二重复样本的平均OD450值。实现结果显示，GLP-1-2FA促效剂能够专一地结合到重组GLP-1受体(参见图14)。P1-P2肽为人类膜结合IgE的CεmX结构域片段，在此处作为阴性对照组。
实验例16：GLP-1-Ala8-EG4-2FA-C16促效剂对人类血清白蛋白(HSA)的结合分析
于本实验例中，利用ELISA分析来探究GLP-1-Ala8-EG4-2FA-C16促效剂(简称为GLP-1-2FA)对HSA的结合能力。
简言之，在96孔微量多孔盘上涂覆HSA蛋白，浓度为10μg/ml、每孔50μl、于1x PBS中、pH7.4，并置于37℃下1小时。接着以1％酪蛋白的PBS溶液(pH7.4，含0.1％NaN3)将各孔阻断1小时，之后最终浓度为1μg/ml或10μg/ml的以下成分并于37℃下培育1小时：含叠氮基GLP-1促效剂(GLP-1-叠氮基)、炔基-EG4-2FA-C16(炔基-2FA)、利拉鲁肽或GLP-1-2FA促效剂。以PBS(pH7.4)冲洗后，加入最终浓度10μg/ml的小鼠单株抗体IgG抗-hGLP-1(购自Abcam)，并于37℃下培育1小时。以PBS(pH7.4)清洗后，采用以下步骤侦测与hGLP-1结合的抗体：加入1:10,000的HRP-复合山羊抗小鼠IgG(H+L)(购自Jackson ImmunoResearch)，于37℃下培育30分钟，接着和TMB基质(购自Clinical Science Products，Mansfield，USA)一起培育。加入50μl的1M HCl使反应停止。以盘式分析仪测定450nm的吸光度。每一长条代表二重复样本的平均OD450值。实现结果显示，比起利拉鲁肽，GLP-1-2FA对HAS有更高的结合活性(参见图15)。GLP-1-叠氮基、炔基-2FA以及二级抗体在此处作为阴性对照组。
实验例17：利用透析平衡分析探讨GLP-1-Ala8-EG4-2FA-C16促效剂对HSA的白蛋白结合力
为了进一步探究GLP-1-Ala8-EG4-2FA-C16促效剂(GLP-1-2FA)在水溶液中对HAS的结合能力，进行透析平衡分析，使用Float-A-Lyzer G2Dialysis Device CE(购自SpectrumEurope B.V.，Breda，Netherlands)，其含有150μM的0.2ml HAS培育溶液并添加30μM的利拉鲁肽或GLP-1-2FA促效剂。透析袋直径5mm、内部体积1ml，且分子量截断值约20kDa，因此，利拉鲁肽(分子量约3,751.2道尔顿)或GLP-1-2FA促效剂(分子量约4,937道尔顿)可自由进出透析袋。将透析装置放置于装填了4ml缓冲培育溶液的腔室中，并在震荡器上于室温下放置一夜。将十分之一的培育溶液和透析前对照(pre-dialysis control)载入经修饰的三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)SDS-PAGE上。以考马斯蓝(Coomassie-blue)染色来观察平衡时与HAS结合的GLP-1-2FA促效剂或利拉鲁肽，以比较GLP-1-2FA促效剂对HAS以及利拉鲁肽对HAS的相对结合能力。
试验结果显示，在水溶液中，GLP-1-2FA促效剂比起利拉鲁肽对HAS有更好的结合能力(图16A)。箭头#1为与HAS结合的利拉鲁肽；箭头#2为与HAS结合的GLP-1-2FA促效剂；箭头#3为HSA。图16B的SDS-PAGE图显示在平衡时，与HAS结合的GLP-1-2FA促效剂或利拉鲁肽的百分比。资料表示为三重复样本的平均值±SEM。
实验例18：类似物于大鼠INS-1细胞中对GLP-1R介导的cAMP产生的功能性分析
已知当摄入食物时，小肠会释放肠促胰液素，而β细胞会随之产生环状AMP(cyclicAMP，cAMP)。荷尔蒙肽GLP-1会透过活化特定G蛋白耦合蛋白受体(即，GLP-1受体)而增加cAMP含量，进而刺激会回应G蛋白的穿膜腺苷酸环化酶(transmembrane adenylylcyclases)家族中的蛋白。
于本实验例中，为了评估所制备的GLP-1类似物对β细胞上GLP-1受体的功能活性，于INS-1细胞中进行cAMP分析。
使用商用套组cAMP ELISA Kit(购自Cayman Chemicals，Ann Arbor，USA)并根据制造商的说明来测量五种GLP-1类似物诱导的细胞内cAMP改变，所用的GLP-1类似物包括：GLP-1-Ala8-EG4-2E-2FA-C16、GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16、GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16酸、GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C16酸以及GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C18酸促效剂。简言之，在第一天，将2x105个INS-1细胞连同500μL/孔的培养基播于24孔盘的每一孔中(ThermoFisher Scientific，Waltham，USA)。在第三天，加入100nM的GLP-1类似物与2.5mM葡萄糖，并于37℃下培育20分钟。以100nM的利拉鲁肽作为cAMP产生的阳性对照组，将其加入对照孔中并同样于37℃下培育20分钟。低浓度葡萄糖(2.5mM)为阴性对照组，而高浓度葡萄糖(16mM)则用作葡萄糖诱导的cAMP产生的对照组。在经过20分钟培育之后，抽出培养基，并将200μL的0.1N HCl加入每一孔中。利用细胞刮板刮除表面的细胞，并1,000x g在4℃下离心10分钟。将上清液转移到新的试管中并在96孔盘中进行后续试验。利用SpectraMax M2微量分析仪(购自Molecular devices，San Jose，USA)在420nm下测量细胞中cAMP含量。
图17为INS-1细胞与五种GLP-1类似物(即，GLP-1-Ala8-EG4-2E-2FA-C16(简称为Ala8-EG4-C16)、GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16(简称为Aib8-EG4-C16)、GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16酸(简称为Aib8-EG4-C16酸)、GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C16酸(简称为Aib8-EG2-C16酸)以及GLP-1-Aib8-EG2-2E-2FA-C18酸(简称为Aib8-EG2-C18酸)促效剂)共同培养后的cAMP测量结果。实验结果显示，在所观测的时间点(20分钟)，于INS-1细胞中加入这些合成的GLP-1类似物与利拉鲁肽，都能引发预期的细胞cAMP含量升高。
实验例19：利用Western印迹分析侦测INS-1细胞中经活化半胱天冬酶-3的表达
经裂解的半胱天冬酶-3是细胞雕亡过程中的关键成分。于本实验例中，利用Western印迹分析来侦测半胱天冬酶-3的表达。
在多孔盘中培养将经GLP-1类似物处理的INS-1细胞以及葡萄糖、500μL培养基。进行免疫墨点分析时，利用SDS-PAGE将蛋白质分离，之后将其转移到聚二氟亚乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。以抗半胱天冬酶-3抗体(购自Cell SignalingTechnology，Danvers，USA)处理膜，接着再以辣根过氧化物酶(HRP)-复合二级抗体(购自Epitomics，Burlingame，USA)处理。利用强化的化学冷光系统(购自GE Healthcare LifeSciences，Buckinghamshire，USA)使膜呈色。以β-肌动蛋白的表达量将蛋白表达量标准化。
经GLP-1类似物处理后的半胱天冬酶-3表达量摘要整理于图18A。图18B为在经过GLP-1类似物处理后，INS-1细胞上半胱天冬酶-3表达量降低的程度。图18A与18B的结果显示，某些GLP-1类似物(包括GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16(Aib8-EG4-C16)与GLP-1-Ala8-EG4-2E-2FA-C16(Ala8-EG4-C16))，能够有效降低上半胱天冬酶-3在INS-1细胞上的表达量。
实验例20：利用阿尔玛蓝分析探讨INS-1细胞的存活率
将培养的INS-1细胞以2x104个细胞/孔的密度播于96孔盘中，使用含10％胎牛血清的培养基。48小时后，再将细胞培养24小时以进行血清饥饿。当细胞处于同步状态(synchronization state)时，将细胞培养于含30mM葡萄糖的培养基中，并以100nM的GLP-1类似物或利拉鲁肽处理。以培养于正常培养基中的细胞作为对照组。在培养24、48与72小时后，利用商用套组Alamar Blue cell viability reagent kit(购自Invitrogen)依制造商的建议测定细胞活率。
细胞增殖率(参见图19)指相较于0小时，在多个时点的细胞存活率。结果显示，相较于利拉鲁肽，某些GLP-1类似物(包括GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16酸(Aib8-EG4-C16酸)、GLP-1-Aib8-EG4-2E-2FA-C16(Aib8-EG4-C16)与GLP-1-Ala8-EG4-2E-2FA-C16(Ala8-EG4-C16))可显著提升细胞存活率。
实验例21：对第二型糖尿病db/db小鼠进行活体内分析以探讨GLP-1类似物对降低血糖的效果
8周大BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/(db/db)小鼠购自中国台湾实验研究院中国台湾实验动物中心。在实验过程中，于受控制的大气环境下每笼饲养四只，动物可自由取用引用水与食物。
于初步测试经GLP-1类似物处理的db/db小鼠的血糖值时，先进行前测试。将小鼠分为三只一组，分别给予每公斤体重100nmole的样本。对小鼠进行单次的皮下注射，以投予GLP-1类似物、利拉鲁肽或媒剂(PBS)。
隅测定血糖值时，由尾部静脉采集血液，并立刻以商用酶电极ACCU-CHEK Active(购自Roche，Germany)测量血糖。初步分析的结果显示，相较于投予利拉鲁肽的组别，某些GLP-1类似物可在96小时的时间中显著降低经GLP-1类似物处理的db/db小鼠体内的血糖值。
当可理解，上文的具体实验例仅为例示，且本发明所属技术领域中具有通常知识者可对其进行各种修饰。以上的说明书、实验例与数揭示成了本发明的例示性实验例的结构与应用。虽然上文以特定的方式或参照一或多个别实验例描本案的多种实施方式，本发明所属技术领域中具有通常知识者可在不悖离本发明的原理与精神的情形下，对其进行各种更动与修饰。
序列表
<110> 张子文
<120> 与白蛋白具有较佳结合亲和力的药物分子
<130> 1P3063-1-PCT
<150> PCT/CN2017/102242
<151> 2017-09-19
<160> 8
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2
<223> Aib
<400> 2
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Leu Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25 30
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Cys Ser Gly Gly Gly Gly Phe Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
Gly Ser Lys
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
Glu Gly Ser Gly Ser Gly Phe Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Xaa is a PEGylated amino acid with four EG units Xaa is coupled
with an alkynylpropionyl group
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Xaa is a PEGylated amino acid with four EG units
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> esterification
<400> 7
Xaa Lys Xaa Lys
1
<210> 8
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Xaa is a PEGylated amino acid with two EG units Xaa is coupled
with an alkynylpropionyl group
<220>
<223> 合成
<220>
<221> MOD_RES
<222> 3
<223> Xaa is a PEGylated amino acid with two EG units
<220>
<221> MOD_RES
<222> 4
<223> esterification
<400> 8
Gly Leu Ala Gly Gly Ser Ala Gln Ser Gln Arg Ala Pro Asp Arg Val
1 5 10 15
Leu Cys His Ser Gly Gln Gln Gln Gly Leu Pro Arg Ala Ala Gly Gly
20 25 30
Ser Val Pro His Pro Arg
35

Claims (10)

1.一种接合单元，包含一中心核以及2个第一元件，其中该第一元件为棕榈酸或十八烷二酸，且该中心核包含：
2个赖氨酸残基，其为K残基，其中该K残基的ε-氨基是藉由谷氨酸残基与一所述第一元件连接，其中该谷氨酸残基的γ-羧基和该K残基的ε-氨基形成一酰胺键而连接，且该谷氨酸残基的α氨基和该棕榈酸或十八烷二酸的羧基形成一酰胺键而连接；
一或多填充物，其中任两个所述K残基由一所述填充物隔开；
一末端间隔物，其中该末端间隔物为连接至N端的K残基的一N-端间隔物或连接至C端K残基的一C-端间隔物，且
该填充物与该末端间隔物彼此独立地至少包含：(1)1至12个除K残基以外的其它氨基酸残基，或(2)具有2至
12个乙二醇重复单元的一聚乙二醇化氨基酸；以及
一复合部分，藉由与末端间隔物的末端氨基酸残基形成酰胺
键，而与其连接，其中该复合部分具有选自以下群组的一复合基：叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基与环辛炔基。
2.如权利要求1所述的接合单元，其中所述接合单元还包含一第二元件，其系通过以下反应而连接至该复合基：铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反应、应力促进的叠氮化物-炔烃链接化学(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反应或逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反应。
3.如权利要求2所述的接合单元，其中该第二元件为类升糖素肽-1促效剂、体抑素或体抑素类似物。
4.如权利要求3所述的接合单元，其中该体抑素类似物为奥曲肽。
5.如权利要求2所述的接合单元，其中该第二元件为一载药束，其包含复数个药物分子。
6.如权利要求1所述的接合单元，其中该环辛烯基为降莰烯基或反式-环辛烯基；该环辛炔基为二苯并环辛炔基、二氟化环辛炔基、二环壬炔基或二苯并杂氮环辛炔基。
7.如权利要求1所述的接合单元，其中该四嗪基为1,2,3,4-四嗪基、1,2,3,5-四嗪基或1,2,4,5-四嗪基。
8.如权利要求1所述的接合单元，其中该叠氮基为吡啶甲基叠氮基。
9.如权利要求1所述的接合单元，其中该中心核至少包含该N-端间隔物与该C-端间隔物两者，且
当该N-端间隔物的复合基为叠氮基、炔基或环辛炔基时；该C-端间隔物的复合基为四嗪基或环辛烯基；或
当该N-端间隔物的复合基为四嗪基或环辛烯基时，该C-端间隔物的复合基为叠氮基、炔基或环辛炔基。
10.如权利要求9所述的接合单元，其中所述接合单元还包含一第二元件与一第三元件，其中：
该第二元件是通过CuAAC反应或SPAAC反应而连接至该N-端间隔物的复合基，且该第三元件是通过iEDDA反应而连接至该C-端间隔物的复合基；或
该第二元件是通过iEDDA反应而连接至该N-端间隔物的复合基，且该第三元件是通过CuAAC反应或SPAAC反应而连接至该C-端间隔物的复合基。
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