RU2073011C1 - Линкер для твердофазного синтеза пептидов - Google Patents
Линкер для твердофазного синтеза пептидов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2073011C1 RU2073011C1 RU93048604A RU93048604A RU2073011C1 RU 2073011 C1 RU2073011 C1 RU 2073011C1 RU 93048604 A RU93048604 A RU 93048604A RU 93048604 A RU93048604 A RU 93048604A RU 2073011 C1 RU2073011 C1 RU 2073011C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptides
- linker
- phase synthesis
- polymer
- peptide
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к органической химии, в частности, к области синтеза пептидов в гетерогенных системах жидкость/твердое тело (твердофазного синтеза пептидов). Основная идея твердофазного синтеза пептидов заключается в том, что синтезируемый пептид на всех этапах синтеза (присоединение аминокислот, деблокирование, удаление непрореагировавших компонентов и т.д.) остается присоединенным к нерастворимому носителю (обычно полимеру) через группу, называемую линкер (linker). К линкеру предъявляются требования, которые зачастую бывают взаимоисключающими. Например, высокая химическая устойчивость (на всех этапах синтеза) и в то же время лабильность (т.е. возможность его расщепления по окончании синтеза в мягких условиях, не затрагивающих лабильные аминокислоты и другие защитные группы, если требуется получить пептид с сохранением защитных групп).
В настоящее время предложено большое количество вариантов линкеров [1,2] Тем не менее проблема не считается исчерпывающе решенной.
Недавно нами был предложен способ мягкого и селективного удаления фенилгидразидной группы, блокирующей карбоксильную функцию [3-6] Способ включает каталитическое окисление фенилгидразидной группы до высокоактивной и неустойчивой фенилдиимидной с последующим самопроизвольным гидролитическим разложением последней:
Мы предположили, что фенилгидразидная группа также может защищать карбоксильную функцию, будучи присоединенной к нерастворимому полимеру, т.е. выполнять функцию линкера для твердофазного синтеза пептидов. На основании этого предположения был разработан новый линкер для твердофазного синтеза пептидов.
Мы предположили, что фенилгидразидная группа также может защищать карбоксильную функцию, будучи присоединенной к нерастворимому полимеру, т.е. выполнять функцию линкера для твердофазного синтеза пептидов. На основании этого предположения был разработан новый линкер для твердофазного синтеза пептидов.
В качестве нерастворимого полимера при этом может быть использован гидрофильный (сферон), гидрофобный (полистирол) или любой другой полимер, устойчивый в условиях твердофазного синтеза пептидов.
Заявляемое техническое решение является новым, т.к. ранее не были описаны линкеры, расщепляемые в мягких окислительных условиях. Оно имеет изобретательский уровень, т.к. оно явным образом не следует из уровня техники. Кроме того, является промышленно применимым, т.к. фенилгидразидный линкер позволяет осуществлять препаративный твердофазный синтез пептидов.
Пример 1. Получение носителя, содержащего фенилгидразин, на основе Сферона.
Носитель, содержащий фенилгидразидные группы, был получен путем модификации гидроксиэтилметакрилатного геля Spheron ArA 1000, "La Chema", Брно, Чехословакия (0,25-0,40 ммк, диаметр пор 37-50 нм). Исходный полимер содержал связанные 2-(4-аминофенил)сульфэтоксильные группы (0,85±15 ммоль/г полимера). Модификацию осуществляли по следующей схеме:
К охлажденной до 0oC суспензии 5 г сферона ArA 1000 в 250 мл 2 М HCl добавляли 200 мл охлажденного льдом 2%-ного раствора NaNO2 и интенсивно перемешивали в течение 4 ч при 0oC. Диазотированный полимер отделяли фильтрацией, промывали на фильтре 100 мл охлажденной льдом конц. HCl и переносили в колбу. К полимеру добавляли коллоидный раствор 5 г SnCl2 в 100 мл конц. HCl. Суспензию перемешивали 2 ч при комнатной температуре и затем нагревали в течение 1 ч до 50-60oC. Полимер отделяли фильтрацией горячего раствора, промывали 500 мл воды и сушили в вакууме. Выход: 4,87 г.
К охлажденной до 0oC суспензии 5 г сферона ArA 1000 в 250 мл 2 М HCl добавляли 200 мл охлажденного льдом 2%-ного раствора NaNO2 и интенсивно перемешивали в течение 4 ч при 0oC. Диазотированный полимер отделяли фильтрацией, промывали на фильтре 100 мл охлажденной льдом конц. HCl и переносили в колбу. К полимеру добавляли коллоидный раствор 5 г SnCl2 в 100 мл конц. HCl. Суспензию перемешивали 2 ч при комнатной температуре и затем нагревали в течение 1 ч до 50-60oC. Полимер отделяли фильтрацией горячего раствора, промывали 500 мл воды и сушили в вакууме. Выход: 4,87 г.
Пример 2. Синтез пептида на полимерном носителе (сфероне).
Синтез пептида проводили по стандартному протоколу, описанному в [7] изложенному в табл.1. Все стадии выполняли в стеклянном реакторе объемом 50 мл для твердофазного синтеза пептидов в ручном варианте. Использовали следующие реактивы: производные аминокислот ("Bachem", Швейцария), триэтиламин, диизопропилкарбодиимид, анизол, гидроксибензотриазол ("Fluka", Швейцария), трифторуксусная кислота и органические растворители ("Мосреактив", Россия).
Пример 3. Удаление частично защищенного пептида BOC-Trp-Met-Cys(Asm)-OH с полимерного носителя (сферона).
1 г пептидил-полимера, полученного согласно Примера 2, суспендировали в 20 мл смеси, содержащей 8 мл DMF, 2 мл 1 М раствора пиридинацетатного буфера в DMF, 9 мл 20%-ного водного раствора уксусной кислоты и 1 мл 0,5 М водного раствора CuSO4. За протеканием реакции следили методом офВЭЖХ. Через 16 ч площадь пика, соответствующего целевому продукту, достигла максимального значения и составила 83% (от суммы площадей всех пиков, наблюдаемых методом офВЭЖХ). После этого полимер отфильтровали, промыли на фильтре DMF уксусной кислотой и водой. Объединенные фильтрат и промывные жидкости нанесли на препаративную колонку C18 2,5 x 25 см и элюировали градиентом метанола в 0,005 М аммоний-ацетатном буфере, рН 4,0. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили, упарили до небольшого объема и лиофилизовали. Выход пептида 9 мг. Структуру пептида подтвердили методом 1H-ЯМР-спектроскопии (ЯМР-спектрометр Bruker, 500 MHz, DMSO-d6, стандарт тетраметилсилан), величины химических сдвигов протонов приведены ниже.
δH (500 MHz; DMSO-d6; Me4Si) 1,29 (9H, 1), 6,83 (1H, 2), 4,21 (1H, 3), 3,09 (2H, 4), 7,13 (1H, 5), 10,76 (1H, 6), 7,31 (1H, 7), 7,04 (1H, 8), 6,96 (1H, 9), 7,58 (1H, 10), 7,98 (1H, 11), 4,46 (1H, 12), 1,94 (2H, 13), 2,44 (2H, 14), 2,02 (3H, 15), 8,35 (1H, 16), 4,45 (1H, 17), 2,85-3,00 (2H, 18), 4,22 (2H, 19), 8,51 (1H, 20), 1,83 (3H, 21).
Пример 4. Синтез полимерного носителя, содержащего фенилгидразин, на основе хлорметилированного сшитого полистирола (смола Меррифилда).
Синтез полимерного носителя проводили по следующей схеме:
BOC-NHNH-C6H4-CONH-CH2-COOH. 2,52 г N-трет-бутилоксикарбонил-пара-карбоксифенилгидразина (коммерческий продукт научно-производственной фирмы "ДиОс") (10 ммоль) растворили в 10 мл диметилформамида, добавили 1,38 мл (10 ммоль) триэтиламина и раствор охладили до -10oC. При перемешивании добавили 1,3 мл (10 ммоль) изобутилхлорформиата. Через 2 мин к реакционной смеси добавили раствор 900 мг (12 ммоль) глицина в смеси 3 мл диметилформамида и 3 мл 4 н NaOH. Реакционную смесь перемешивали 24 ч, упарили, остаток растворили в 300 мл этилацетата и промыли последовательно 1 н серной кислотой и водой до нейтральной реакции. Этилацетат упарили досуха и остаток кристаллизовали из смеси этилацетат/гексан. Выход 2,47 г (80%).
BOC-NHNH-C6H4-CONH-CH2-COOH. 2,52 г N-трет-бутилоксикарбонил-пара-карбоксифенилгидразина (коммерческий продукт научно-производственной фирмы "ДиОс") (10 ммоль) растворили в 10 мл диметилформамида, добавили 1,38 мл (10 ммоль) триэтиламина и раствор охладили до -10oC. При перемешивании добавили 1,3 мл (10 ммоль) изобутилхлорформиата. Через 2 мин к реакционной смеси добавили раствор 900 мг (12 ммоль) глицина в смеси 3 мл диметилформамида и 3 мл 4 н NaOH. Реакционную смесь перемешивали 24 ч, упарили, остаток растворили в 300 мл этилацетата и промыли последовательно 1 н серной кислотой и водой до нейтральной реакции. Этилацетат упарили досуха и остаток кристаллизовали из смеси этилацетат/гексан. Выход 2,47 г (80%).
BOC-β-Ala-COO-CH2polymer. 10 г сшитого хлорметилированного полистирола (смола Меррифилда (Fluka, 2% сшивки, 3,5 ммоль хлора/1 г смолы) суспендировали в 20 мл диоксана. К суспензии добавили 7,52 г (9,4 ммоль) тетрабутиламмония и 1,78 г (9,4 ммоль) BOC-b-Ala-OH. Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником 8 ч, смолу отфильтровали, промыли диоксаном, метанолом, водой, метанолом и высушили в вакуумном эксикаторе до постоянного веса. Выход 10,315 г, что составляет 0,2 ммоль присоединившейся аминокислоты на 1 г смолы.
BOC-NHNH-C6H4-CONH-CH2-CONH-β-Ala-COO-CH2-polymer. 1 г BOC-β-Ala-COO-CH2-polymer поместили в реактор для твердофазного синтеза пептидов в ручном варианте объемом 50 мл. Добавили смесь трифторуксусная кислота/хлороформ/анизол 1: 2,5: 0,5 (v/v/v) и инкубировали 40 мин. По окончании реакции смолу промыли хлороформом, смесью хлороформ/триэтиламин 9:1, хлороформом и диметилформамидом. Добавлии 20 мл диметилформамида, 309 мг (1 ммоль) BOC-NHNH-C6H4-CONH-CH2-COOH, 135 мг (1 ммоль) HOBt и 126 мг (1 ммоль) диизопропилкарбодиимида. Реакцию проводили 24 ч при перемешивании на шейкере. По окончании реакции смолу промыли диметилформамидом и хлороформом.
Пример 5. Синтез пептида на полимерном носителе (смола Меррифилда).
1 г смолы Меррифилда, содержащей фенилгидразин в качестве линкера (получен в примере 4) использовали для синтеза пептида BOC-Trp-Met-Cys(Acm)-OH. Синтез проводили аналогично примеру 2.
Пример 6. Удаление частично защищенного пептида BOC-Trp-Met-Cys(Acm)-OH с полимерного носителя (смолы Меррифилда) в растворах разного состава.
Смола Меррифилда ограниченно набухает в присутствие воды, поэтому было проведено предварительное исследование влияния состава среды на выход пептида. По 10 мг пептидил-полимера, полученного в примере 5, поместили в пробирки. Добавили диметилформамид, 20% -ную уксусную кислоту, 0,5 М CuSO4 (раствор в воде) и воду в пропорциях, приведенных в таблице 2. Через 24 ч методом количественной ВЭЖХ определили содержание пептида (в условных единицах площади пика). Результаты приведены в табл.2.
Из табл. 2 видно, что оптимальной по составу является среда, содержащая 90% диметилформамида. Очевидно, что в среде этого состава смола Меррифилда набухает достаточно эффективно и в то же время количество воды достаточно для участия в реакции отщепления пептида.
Пример 7. Удаление частично защищенного пептида BOC-Trp-Met-Cys(Acm)-OH с полимерного носителя (смолы Меррифилда).
1 г пептидил-полимера, полученного в примере 6, суспендировали в смеси, содержащей 17 мл диметилформамида, 1 мл 1 М пиридинийацетата в диметилформамиде, 1 мл 20%-ной водной уксусной кислоты и 1 мл 0,5 М CuSO4. Через 24 ч смолу отфильтровали и пептид выделяли из фильтрата аналогично примеру 3. Выход 2,5 мг.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93048604A RU2073011C1 (ru) | 1993-10-20 | 1993-10-20 | Линкер для твердофазного синтеза пептидов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93048604A RU2073011C1 (ru) | 1993-10-20 | 1993-10-20 | Линкер для твердофазного синтеза пептидов |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU93048604A RU93048604A (ru) | 1996-04-27 |
RU2073011C1 true RU2073011C1 (ru) | 1997-02-10 |
Family
ID=20148413
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU93048604A RU2073011C1 (ru) | 1993-10-20 | 1993-10-20 | Линкер для твердофазного синтеза пептидов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2073011C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2753880C1 (ru) * | 2017-09-19 | 2021-08-24 | Иммунворк Инк. | Фармацевтические конструкции с повышенной аффинностью связывания с альбумином |
US20220185841A1 (en) * | 2019-09-12 | 2022-06-16 | Fujifilm Corporation | Method for producing peptide compound, reagent for forming protective group, and hydrazine derivative |
-
1993
- 1993-10-20 RU RU93048604A patent/RU2073011C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. G.Barany, N.Kneib - Cordomier, D.G.Mullen. Int. J. Pept.Prot.Res, 1987, v.30, р.705. 2. G.B.Fields and other. Int. J. Peptide Prot. Res., 1990, v.35, р.161. 3. A.N. Semenov and other. Peptide Res., 1992, v.5, р.300. 4. Семенов А.Н., Ломоносова И.В., Титов М.И. Биоорганическая химия, 1993, т.19, с.66. 5. Семенов А.Н., Ломоносова И.В. Биоорганическая химия. - 1993, т.19, с.182. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2753880C1 (ru) * | 2017-09-19 | 2021-08-24 | Иммунворк Инк. | Фармацевтические конструкции с повышенной аффинностью связывания с альбумином |
US20220185841A1 (en) * | 2019-09-12 | 2022-06-16 | Fujifilm Corporation | Method for producing peptide compound, reagent for forming protective group, and hydrazine derivative |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Fridkin et al. | Use of polymers as chemical reagents. I. Preparation of peptides | |
US8299225B2 (en) | Amidite for synthesizing modified nucleic acid and method for synthesizing modified nucleic acid | |
US4102877A (en) | Cyclization of peptides | |
KR102337328B1 (ko) | 용액상 gap 펩타이드 합성을 위한 시스템 및 방법 | |
ZA200600584B (en) | Preparation of somatostatin peptides | |
JPS6317839B2 (ru) | ||
JP2960257B2 (ja) | ビオチン導入試薬およびそれを用いる合成ペプチド精製法 | |
RU2073011C1 (ru) | Линкер для твердофазного синтеза пептидов | |
US5166394A (en) | Coupling reagent for peptide synthesis | |
EP2210882A1 (en) | Synthesis of new protected azahistidine, their processes and their use in synthesises | |
JP2989007B2 (ja) | N―置換ケテンイミン活性化物質を用いるアミノ酸チオヒダントインの生成方法 | |
JP4514330B2 (ja) | 超分子ペアリングシステムその製造及び使用 | |
EP0680955B1 (en) | PROCESS FOR PRODUCING N-tert-BUTYL-2-PYRAZINECARBOXAMIDE AND N-tert-BUTYL-2-PIPERAZINECARBOXAMIDE | |
JP4878031B2 (ja) | 固相ペプチド合成法 | |
PL167504B1 (pl) | Sposób wytwarzania peptydów za pomoca syntezy w fazie stalej PL PL | |
JP2003508408A (ja) | 環状偽ペプチッドの製造方法 | |
BE898650A (fr) | Synthese d'aspartame | |
JP2000510839A (ja) | 触媒イミダゾール(例えばヒスチジン)機能を有する触媒を使用した安定化変遷複合体を用いたアシル移行 | |
CA2323678A1 (en) | Process for the preparation of a tetrapeptide | |
CN111378009A (zh) | 一种奥曲肽的制备方法 | |
JP2748897B2 (ja) | 新規なアルギニン誘導体およびこれを用いるペプチドの製造方法 | |
JPS624276A (ja) | 架橋試薬 | |
US4035348A (en) | Tetrapeptides and methods for their production | |
RU1781226C (ru) | Способ получени пироглутамилсодержащих субстратов | |
JPH08511258A (ja) | 保護基及びアンカー基用の化合物とその使用 |