CN107106683A - 含靶向与效应组件的分子构建体 - Google Patents

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Abstract

本公开提出了多种分子构建体，这些分子构建体具有一靶向组件与一效应组件。此处亦揭示了利用所述分子构建体来治疗多种疾病的方法。具有靶向部分及效应部分的分子构建体。具有组织靶向功能的抗发炎分子。用以治疗肿瘤的分子构建体。

Description

含靶向与效应组件的分子构建体
【相关申请的交叉参考】
本申请涉及并要求2015年1月16日提交的美国临时申请号62/104405、2015年2月10日提交的美国临时申请号62/114427以及2015年3月24日提交的美国临时申请号62/137737的益处，这些申请的内容都以全文引用的方式纳入本文。
【发明背景】
1、发明领域
本公开是关于药学领域；更明确地说，是关于多功能的分子构建体，譬如具有靶向组件与效应组件以将效应组件(如治疗药物)递送至目标部位的分子构建体。
2、先前技术的描述
近年来，本领域发展出多种筛检与选择以抗原为靶标的单克隆抗体(mAbs)的方法，进而带动许多治疗用抗体的研发，为一些不久前还被认为是不治之症的疾病带来曙光。根据治疗性抗体数据库(Therapeutic Antibody Database)的统计，有多达2,800种左右的抗体已经或即将投入人体临床试验研发，而由政府药物管理机构核准可用于临床治疗的抗体则约有80种。从与抗体疗效相关的大量数据中可知抗体是基于何种药理机制而发挥疗效。
以抗体作为治疗药剂时，其主要的药理机制是以抗体来中和或诱捕造成疾病的介质；所述介质可能是存在于血液循环、间质空间或淋巴结中的细胞因子或免疫成分。中和所述介质的活性可抑制造成疾病的介质和其受体之间的互动。此外，可将细胞因子的可溶性受体或受体的细胞外部分和免疫球蛋白IgG的Fc部分制成融合蛋白，此种融合蛋白可利用类似中和抗体的机制来中和上述细胞因子或免疫因子；因此目前也开发出多种融合蛋白治疗剂。
另外，某些取得临床使用许可或正在进行临床研究的治疗性抗体则是采用了与上述主要抗体机制不同的机制，来发挥其药理作用，譬如可藉由和受体结合以阻断这些受体和其配体之间的互动。对此类抗体药物来说，其主要的药理机制并非由Fc-介导的机制(如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或是补体介导的细胞溶解(CMC)等)。
另一些治疗性抗体可和目标细胞上的某些表面抗原结合，并藉此在目标细胞上发挥Fc介导的功能以及其他机制。最重要的Fc介导的机制为抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体介导的细胞溶解(CMC)，这两种机制都会将与抗体结合的目标细胞溶解。这些抗体和特定的细胞表面抗原结合后，可使得与其结合的目标细胞发生细胞凋亡。
有些抗体也可以作为载体，用来携带细胞毒性分子或其他治疗药剂，而抗体本身则没有显著的治疗效果。一般来说，此类抗体可结合至目标细胞上的“肿瘤相关”抗原，但其本身不会使细胞溶解。本领域已知有多种B淋巴瘤上的CD19与CD22的特异性抗体。在过去许多年间，大半的研究着重于探究如何以这些抗体作为载体来携带细胞毒性药物，包括半衰期极短的放射性核种，如90Y、131I以及177Lu。某些抗体也可作为载药微脂体的靶向药剂，上述载药微脂体载有细胞毒性药物，如阿霉素、紫衫醇以及两性霉素B(amphotericin B)。近年来，抗体药物复合体(ADC)的研发成长快速，这主要可归因于具有极高细胞毒性的药物(如奥里斯他汀(auristatin)、美登木素(maytansine)、卡奇霉素(calicheamicin)以及喜树碱(camptothecin)等)、以及将细胞毒性分子复合至抗体分子上的方法等的发展。这些ADC经过设计可靶向表达一或多种独特的CD标记的血液、淋巴系统与骨髓中的扩散性(或液态)肿瘤，包括多种类型的淋巴瘤与白血病。也有某些针对实体瘤所开发出的ADC。此类新一代的抗体药物复合体中，已有少数经核准可用于临床治疗，也有许多ADC正在进行临床试验。
然而，在第一代ADC中，细胞毒性药物分子是透过非选择性的方式连接到抗体中的半胱氨酸(C)或赖氨酸(K)残基，因此会得到异质性的ADC混合物，其中每一个ADC分子所携带的药物分子数可能不同。此现象会导致安全性与有效性上的疑虑。举例来说，美国食品药品管理局(FDA)核准的首例ADC—吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)—可用以治疗急性骨髓性白血病，但在上市后却因毒性过高而在FDA的要求下退出市场。
制备具有双特异性的抗体的概念与方法，早在三十年前就已萌芽。近年来，随着重组抗体工程方法的进步、以及对于更好药物的需求驱使下，发展出多种具有不同结构构型的双特异性抗体。
举例来说，双价或多价抗体可能带有两种或更多种抗原结合位。已知有多种方法可用以制备多价抗体，这些方法通常利用连接结构将三或四种抗原结合片段(Fab)共价连接在一起。举例来说，已透过重组工程制备出能表达三或四个串联的Fab重复片段的抗体。
此外，利用合成的交联物，透过化学方法将不同的抗体或结合部位连接在一起，以制造出多价抗体的方法也是本领域公知的技术。其中一种方式是利用不同的接合物，将三、四或更多个分离的Fab片段，透过化学交联的方式彼此接合。另一种方式是先制备一个具有多个Fab的构建体，将这些Fab组装成一维的DNA支架(one-dimensional DNA scaffold)。这些经设计可和目标分子结合的各种多价抗体构建体彼此的尺寸、半衰期、构型弹性以及调节免疫系统的能力各不相同。基于以上说明，已有部分研究着眼于制备效应组件数目固定的分子构建体或具有二或更多种不同功能性组件(譬如至少一靶向组件与至少一效应组件)的分子构建体。然而，通常很难利用化学合成或重组技术等方法，来建立具有特定靶向与效应组件组合的分子构建体。因此，本领域亟需一种新颖的分子平台，其可用以建构适用于多种疾病的各种分子。
【发明内容】
发明内容旨在提供本公开的简化摘要，以使阅读者对本公开具备基本的理解。此发明内容并非本公开的完整概述，且其用意并非在指出本发明具体实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。发明内容的唯一目的在于对此处揭示的某些概念提供简化的说明，以利理解后文所述的实施方式。
<I>含肽核的多臂接合物
本公开第一方面是关于一种接合单元，其上连接了至少两种不同功能性组件。举例来说，所述接合单元可连接有：两种不同的效应组件、一种靶向组件与一种效应组件、或一种效应组件与可延长接合单元生命周期的聚乙二醇(PEG)链。本发明接合单元设计成带有至少两种不同的官能基，使得这些功能性组件能够和各自的官能基反应而连接到接合单元。因此，本发明接合单元可作为用以制备带有二或更多种功能性组件的分子构建体的平台。
根据本公开多种实施方式，所述接合单元包含一中心核及多个连接臂。中心核可以是多肽，其包含2至15个赖氨酸(K)残基，其中每一个K残基和次一个K残基之间由一填充序列所隔开，所述填充序列包含甘氨酸(G)与丝氨酸(S)残基；或者是，所述多肽的序列为(Xaa-K)n，其中Xaa是具有2至12个乙二醇(EG)重复单元的聚乙二醇化氨基酸，且n为2至15的整数。在视需要而实施的实施方式中，填充序列是由2至20个氨基酸残基所组成。于多种实施方式中，填充序列可具有任一种以下序列：GS、GGS、GSG或SEQ ID NO:1-16所示序列。根据本公开某些实施方式，中心核包含2至15个单元的G1-5SK序列；在较佳的情形中，中心核的序列为(GSK)2-15。每一连接臂藉由和K残基形成酰胺键而连接于中心核的K残基。连接臂的自由端(即，未连接于中心核的一端)有一顺丁烯二酰亚胺基(maleimide group)。此外，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基有一叠氮基(azide group)或一炔基(alkyne group)；或者是或额外地，令位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸(C)残基，且有一耦合臂透过此半胱氨酸残基的巯基巯基而与其连接，且所述耦合臂未和中心核连接的自由端有一叠氮基、炔基、四嗪基(tetrazine group)或高应力炔基(strained alkyne group)。
在某些实施方式中，所述连接臂为一PEG链；在较佳情形中，其具有2至20个EG重复单元。此外，所述耦合臂为一PEG链；在较佳情形中，其具有2至12个EG重复单元。
带有叠氮基的氨基酸残基实例包括：L-叠氮高丙氨酸(azidohomoalanine，AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸(4-azido-L-phenylalanine)、4-叠氮-D-苯丙氨酸(4-azido-D-phenylalanine)、3-叠氮-L-丙氨酸(3-azido-L-alanine)、3-叠氮-D-丙氨酸(3-azido-D-alanine)、4-叠氮-L-高丙氨酸(4-azido-L-homoalanine)、4-叠氮-D-高丙氨酸(4-azido-D-homoalanine)、5-叠氮-L-鸟氨酸(5-azido-L-ornithine)、5-叠氮-D-鸟氨酸(5-azido-D-ornithine)、6-叠氮-L-赖氨酸(6-azido-L-lysine)以及6-叠氮-D-赖氨酸(6-azido-D-lysine)。例示性的带有炔基的氨基酸残基包括：L-高炔丙基甘氨酸(L-homopropargylglycine，L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-homopropargylglycine，D-HPG)以及β-高炔丙基甘氨酸(beta-homopropargylglycine、β-HPG)。
当位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基时，位于耦合臂自由端的高应力炔基可以是环辛烯基(如，反式-环辛烯(trans-cyclooctene，TCO)基)或环辛炔基(如，二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化环辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二环壬炔(bicyclononyne，BCN)以及二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)基)。另一方面，位于耦合臂自由端的四嗪基包括但不限于：1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及1,2,4,5-四嗪基，以及其衍生物，譬如6-甲基四嗪基。
根据本公开多种实施方式，所述接合单元还包含多个第一组件。每一第一组件透过巯基–顺丁烯二酰亚胺反应而与一连接臂连接。根据本公开多种视需要而实施的实施方式，第一组件是可在个体体内发挥欲求效果(如，治疗效果)的效应组件；或者是，第一组件是能够将接合单元导引至目标部位的靶向组件。
在有需要的情形中，接合单元还可包含与第一组件不同的第二组件。在某些实施方式中，第二组件带有叠氮基或炔基，使得其可和中心核或耦合臂的对应炔基或叠氮基在一价铜Cu(I)的催化下进行“铜催化的叠氮化物-炔环加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)”反应，进而与中心核或耦合臂偶联。或者是，在某些实施方式中，第二组件带有叠氮基或环辛炔基，使得其可和中心核或耦合臂的对应环辛炔基或叠氮基进行“应力促进的叠氮化物-炔点击化学(strain-promoted azide-alkyne clickchemistry，SPAAC)”反应，进而与中心核或耦合臂偶联。又或者是，于一些实施方式中，第二组件带有四嗪基或环辛烯基，而使得其可和中心核或耦合臂的对应环辛烯基或四嗪基进行“逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)”反应，进而与中心核或耦合臂偶联。在本公开可任选的实施方式中，当第一组件为一效应组件时，第二组件可以是另一种效应组件，其可和第一组件累加、协同或独立作用；或者是，第二组件可以是靶向组件或能改善接合单元药动学性质(如溶解度、清除率、半衰期与生物利用率)的组件。在其他可任选的实施方式中，当第一组件为靶向组件时，第二组件较佳为效应组件或能改善接合单元药动学性质的组件。
于一些实施方式中，所述接合单元还包含一视需要而加入的第三组件，此种第三组件和第一、第二组件不同。在第二组件直接与中心核连接的情形中，所述中心核的另一端(即，未与第二组件连接的自由端)可视需要而为半胱氨酸残基，此一残基可用以引入非必要的第三组件。具体来说，半胱氨酸残基的巯基和PEG链上的顺丁烯二酰亚胺基反应，而此与中心核连接的PEG链在此称为“耦合臂”；上述耦合臂的自由端带有四嗪基或高应力炔基。如此一来，第三组件即可透过iEDDA反应而与耦合臂连接。在所述接合单元包含第二与第三组件的情形中，第一与第二组件中至少一种较佳为效应组件，而第三组件则可以是能改善接合单元药动学性质的组件。分子量为20,000至50,000道尔顿的长PEG链是一种能改善接合单元药动学性质的组件。
<II>含肽核的多臂接合物的用途
在临床医学领域中，根据本公开第一方面的接合单元可用于治疗多种疾病。因此，本公开的第二方面是关于治疗这些疾病的方法。根据本公开多种实施方式，用以治疗特定疾病的方法包含以下步骤：对有需要的个体投予治疗有效量的接合单元，所述接合单元可以是根据本公开上述方面与实施方式的任一种接合单元。当可理解，可将所述接合单元以药学配方的形式施用，此种药学配方除了包含本发明接合单元外，还包含适用于所欲给药方式的药学上可接受的赋型剂。
为了让本发明所属技术领域具有通常知识者能够理解本公开的某些实施方式，下文举例说明可用以治疗某些特定疾病的接合单元所含的第一与第二组件的组合。
根据本公开某些实施方式，本发明分子构建体可用以治疗免疫疾病，其中第一组件为细胞因子或细胞因子的受体的特异性单链可变片段(single-chain variablefragment，scFv)、或细胞因子的可溶性受体，而第二组件为对组织相关细胞外基质蛋白(tissue-associated extracellular matrix protein)的特异性scFv。在这些情形中，第一组件是用以治疗一或多种免疫疾病的效应组件，而第二组件是有助于将所述接合单元递送至疾病部位的靶向组件。
细胞因子的非限制性实施例包括：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23以及B细胞活化因子(BAFF)；而细胞因子受体的非限制性实施例有IL-6的特异性受体(即，IL-6R)或IL-17的特异性受体(即，IL-17R)。至于细胞因子的可溶性受体，其实施例包括但不限于：TNF-α或IL-1等细胞因子的特异性可溶性受体。组织相关细胞外基质蛋白的例示性实施例包括但不限于：α-聚集蛋白聚糖(α-aggrecan)、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白以及XI型胶原蛋白。
根据一些具体的例示性实施例，所述接合单元适用于治疗牛皮癣；此时第一组件为TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或IL-17R的特异性scFv，而第二组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。
在某些视需要而实施的实施例中，所述接合单元适用于治疗免疫疾病，如全身性红斑狼疮(SLE)、皮肤狼疮(cutaneous lupus)或干燥综合症(Sjogren’s syndrome)，此类接合单元包含BAFF的特异性scFv以作为第一组件，以及I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv以作为第二组件。
在治疗类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎时，例示性的接合单元所包含的第一组件是TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、IL-17、IL-6R或IL-17R的特异性scFv，而其所含的第二组件则是II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性scFv。
所述接合单元亦适用于治疗炎性肠病，譬如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎及其他。在这些情形中，本发明接合单元使用TNF-α的特异性scFv以作为第一组件，并使用III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv以作为第二组件。
可由本发明接合单元所治疗的另一类疾病是扩散性肿瘤，包括，但不限于：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤以及骨髓瘤。在这些实施方式中，第一组件可以是靶向组件(譬如第一细胞表面抗原的特异性scFv)；而第二组件可以是效应组件(譬如第二细胞表面抗原的特异性scFv)。
可作为用以治疗扩散性肿瘤的靶向组件的第一细胞表面抗原包括，但不限于：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138以及CD319。另一方面，适合作为效应组件的第二细胞表面抗原的非限制性实施例包括CD3以及CD16a。
在治疗B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病时，例示性的第一组件为CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b的特异性scFv，而例示性的第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
欲治疗浆细胞瘤或多发性骨髓瘤时，例示性的第一组件为CD38、CD78、CD138或CD319的特异性scFv，而例示性的第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
关于衍生自T细胞的淋巴瘤或白血病的治疗，例示性的第一组件为CD5、CD30或CD43的特异性scFv，而第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
于治疗骨髓性白血病时，例示性的第一组件为CD33或CD34的特异性scFv，而例示性的第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
另一类可利用本发明接合单元来治疗的疾病是实体瘤，包括，但不限于：黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌以及头颈部鳞状细胞癌。此外，本发明接合单元亦适用于治疗晚期、恶性或转移性的实体瘤。
在建构用于治疗实体瘤的接合单元时，第一组件(即，靶向组件)可选自肽类激素、生长因子及肿瘤相关抗原的特异性第一scFv；而第二组件(即，效应组件)可以是细胞表面抗原的特异性第二scFv。
举例来说，肽类激素可以是分泌素、胆囊收缩素(cholecystokinin，CCK)、生长抑素或促甲状腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)。至于上述生长因子则可以是上皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、突变型EGF、表皮调节素(epiregulin)、肝素结合上皮生长因子(heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor，VEGF-A)、碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblast growth factor，bFGF)或肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)。肿瘤相关抗原的例示性实施例包括人类上皮生长因子受体1(human epidermal growthfactor receptor-1，HER1)、HER2、HER3、HER4、糖抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9)、糖抗原125(CA 125)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、黏蛋白1(mucin 1，MUC 1)、神经节苷脂GD2、黑色素瘤相关抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)、前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)、前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)、间皮素(mesothelin)、黏蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、Globo H、阶段特异性胚胎抗原(stage-specific embryonicantigen-4，SSEA-4)以及上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)。细胞表面抗原可以是CD3或CD16a。
在某些例子中，肿瘤相关抗原会由个体的实体瘤脱落而进入其循环系统中。在这些情形中，本发明用以治疗实体瘤的方法包含以下步骤：(a)对该个体进行血液透析程序，此程序使用一或多种肿瘤相关抗原的特异性抗体，以移除由肿瘤脱落并进入个体循环中的上述一或多种肿瘤相关抗原；以及(b)投予本发明用以治疗实体瘤的接合单元。
另一种可由本发明接合单元来治疗的代表性疾病是骨质疏松症。适用于治疗骨质疏松症的例示性的接合单元是以细胞核因子κB受体激活剂配体RANKL)的特异性第一scFv作为第一组件(在本例中，为效应组件)；以及以I型胶原蛋白或骨结合素的特异性第二scFv作为第二组件(或靶向组件)。
老年性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是另一种可利用本发明接合单元来治疗的疾病。适用于治疗AMD的例示性的接合单元则是以VEGF-A的特异性scFv作为第一组件以及以分子量为20,000至50,000道尔顿的长PEG链作为第二组件。在本例中，第一组件是用来治疗AMD的效应组件，而第二组件则是用来提升所述接合单元的药动学性质。
<III>具有靶向部分及效应部分的分子构建体
在第三方面中，本公开是关于一种分子构建体，其包含二个彼此直接或间接偶联的接合单元，其中一接合单元的中心核可和至少一靶向组件连接，而另一接合单元的中心核则可和至少一效应组件连接。本发明分子构建体的优点在于上述二接合单元可透过iEDDA、SPAAC或CuAAC反应而彼此偶联。此一设计使得开发人员能够便捷地合成具有复杂结构的分子构建体。根据本公开的原理与精神，可以独立地制备两种接合单元，其分别携带不同数目和/或类型的功能性组件，之后再将两者偶联到一起。如此一来，本发明所属技术领域具有通常知识者能够建构多个构建体库，其分别由携带不同功能性组件的分子构建体所组成，而后再视需求和/或所欲的应用，由这些构建体库中选择并结合两种分子构建体(或接合单元)，以得到所需的构建体。更可藉由调整中心核内特定官能基的数目，来控制每一接合单元所携带的功能性组件的数目。
根据本公开的一实施方式，所述分子构建体包含一第一接合单元以及一第二接合单元。具体来说，第一接合单元包含一第一中心核、以及分别连接于第一中心核的一或多个连接臂(下文称为第一连接臂)与视需要而加入的一耦合臂(下文称为第一耦合臂)；第二接合单元包含一第二中心核、以及分别连接于第二中心核的一或多个连接臂(下文称为第二连接臂)与视需要而加入的一耦合臂(下文称为第二耦合臂)。第一与第二接合单元透过发生在以下任一种情形间的iEDDA、SPAAC或CuAAC反应而彼此偶联：第一与第二中心核之间、第一耦合臂与第二中心核之间、第一与第二耦合臂之间或第一中心核与第二耦合臂之间。
根据本公开的实施方式，第一与第二中心核都具有多个氨基。每一连接臂藉由和中心核的氨基形成酰胺键，而连接于中心核；举例来说，可利用N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)和上述氨基反应。当连接于中心核之后，上述连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基。如此一来，第一靶向组件与第一效应组件可透过巯基–顺丁烯二酰亚胺反应而分别连接于第一与第二连接臂。
根据本公开某些实施方式，每一连接臂是一条具有2至20个EG重复单元的PEG链。此外，每一耦合臂是一条具有2至12个EG重复单元的PEG链。
根据本公开多种实施方式，第一或第二中心核可以是化合物核或多肽。在某些例子中，第一与第二中心核都是化合物核，且两者可以采用相同或不同的化合物作为核心。在某些较佳的实施方式中，第一与第二中心核都是多肽，且两者具有相同或不同的序列。或者是，两个核心其中一个是化合物核，而另一个是多肽。
适合作为本发明化合物核的化合物包括但不限于：苯-1,3,5-三胺(benzene-1,3,5-triamine)、2-(氨基甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺(2-(aminomethyl)-2-methylpropane-1,3-diamine)、三(2-氨基乙基)胺(tris(2-aminoethyl)amine)、苯-1,2,4,5-四胺(benzene-1,2,4,5-tetraamine)、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-联苯(3,3’,5,5’-tetraamine-1,1’-biphenyl)、四(2-氨基乙基)甲烷(tetrakis(2-aminoethyl)methane)、四(乙胺)肼(tetrakis(ethylamine)hydrazine)、N,N,N’,N’,-四(氨基乙基)乙二胺(N,N,N’,N’,-tetrakis(aminoethyl)ethylene-diamine)、苯-1,2,3,4,5,6-六胺(benzene-1,2,3,4,5,6-heXaamine)、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺(1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-hexakis(methylamine)-benzene-1,3,5-triamine)、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺(1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-octakis(methylamine)-benzene-1,2,4,5-triamine)以及N,N-二[(1-氨基-3,3-二氨基乙基)戊基]甲二胺(N,N-bis[(1-amino-3,3-diaminoethyl)pentyl]methanediamine)。
在中心核为化合物核的例子中，耦合臂可藉由和中心核的多个氨基其中之一形成酰胺键，而连接到中心核。同时，耦合臂的自由端带有叠氮基、炔基、高应力炔基或四嗪基。
根据本公开某些实施方式，可作为本发明多肽的多肽可包含2至15个赖氨酸(K)残基。此外，每一个K残基和次一个K残基之间由一填充序列所隔开，所述填充序列包含甘氨酸(G)与丝氨酸(S)残基；在非必要的实施方式中，填充序列系由2至20个氨基酸残基所组成。于多种实施方式中，填充序列可具有任一种以下序列：GS、GGS、GSG或SEQ ID NO:1-16所示序列。在某些实施方式中，上述多肽包含2-15个单元的G1-5SK序列；譬如(GSK)2-15。在一实施方式中，多肽的序列如SEQ ID NO:17、18、19、21、22、23或24所示。
或者是，所述多肽具有(Xaa-K)n序列，其中Xaa为具有2至12个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，且n为2至15的整数。在一实施方式中，多肽的序列如SEQ ID NO:25或26所示。
在中心核为多肽的情形中，其N-或C-端可以是半胱氨酸残基。在这些例子中，耦合臂透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应而连接于中心核的半胱氨酸残基。上述耦合臂的自由端带有叠氮基、炔基、高应力炔基或四嗪基。
第一与第二接合单元可透过多种构型而彼此偶联，端视第一与第二耦合臂是否存在，下文将进一步说明这些构型。对于采用化合物核的接合单元，较佳应透过耦合臂(即，第一或第二耦合臂)而和另一接合单元偶联；而对于采用多肽的接合单元，耦合臂则不是必要的组件。
当第一与第二接合单元分别包含耦合臂时，一耦合臂(举例来说，第一耦合臂)的自由端带有四嗪基，而另一耦合臂(在本例中，第二耦合臂)的自由端带有高应力炔基，而使得二接合单元可透过发生于二耦合臂(即，第一与第二耦合臂)之间的iEDDA反应而彼此偶联。在较佳的情形中，上述四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及1,2,4,5-四嗪基或其衍生物，譬如6-甲基四嗪基；而高应力炔基为TCO。同样的情形亦适用于二耦合臂的自由端分别带有叠氮基与炔基的例子；此时，二接合单元是透过发生于二耦合臂(即，第一与第二耦合臂)之间的CuAAC反应而彼此偶联。或者是，一耦合臂带有叠氮基，而另一耦合臂带有高应力炔基(在较佳的情形中，带有DBCO、DIFO、BCN或DICO基)；因此，二耦合臂可透过SPAAC反应而偶联。当两个单元都是化合物核或多肽时，或是当一接合单元为化合物核而另一单元为多肽时，就可采用上述构型。
当只有一个接合单元具有耦合臂(譬如，第一接合单元带有第一耦合臂时)时，另一接合单元的中心核(譬如第二中心核)则为多肽。在本例中，位于第二中心核N-或C-端的第一个氨基酸残基是带有叠氮基或炔基的氨基酸残基。在某些实施方式中，上述带有叠氮基或炔基的氨基酸残基会和第一接合单元的第一耦合臂所带的相应炔基或叠氮基进行CuAAC反应，因而将第一与第二接合单元接合在一起。或者是，第二中心核N-或C-端的第一个氨基酸残基带有叠氮基，其可位于第一接合单元的耦合臂自由端上的高应力炔基(在较佳的情形中，为DBCO、DIFO、BCN或DICO基)进行SPAAC反应而相连接。此种构型可发生在两个单元都是多肽或者是两者分别是化合物核和多肽的情形中。
第一与第二接合单元也有可能不透过任何耦合臂(即，第一与第二耦合臂)而偶联。换句话说，第一与第二耦合臂彼此直接连接。此种构型主要发生在二个多肽之间。具体来说，两个中心核其中之一(譬如第一中心核)的N-或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基，而另一个中心核(如第二中心核)的N-或C-端则是带有炔基的基酸残基。如此一来，第一中心核的叠氮基会和第二中心核的炔基反应，进而将第一与第二接合单元偶联在一起。
带有叠氮基的氨基酸残基包括，但不限于：L-叠氮高丙氨酸(AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸以及6-叠氮-D-赖氨酸。带有炔基的氨基酸残基包括，但不限于：L-高炔丙基甘氨酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-HPG)以及β-高炔丙基甘氨酸(β-HPG)。
根据本公开某些实施方式，所述分子构建体的第一与第二接合单元其中之一还包含一额外的连接臂(下文称为第三连接臂)，连接于第一或第二接合单元。
在某些实施方式中，上述第三连接臂可透过巯基–顺丁烯二酰亚胺反应而和一长PEG链(分子量为20,000至50,000道尔顿)连接。在可任选的实施方式中，上述第三连接臂用以连接单一个scFv，其可作为靶向组件或效应组件。在某些例子中，第一与第二连接臂分别连接了两种不同的效应组件，而第三连接臂则与靶向组件连接；所述靶向组件如I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖或骨结合素的特异性scFv。在其他例子中，第一与第二连接臂分别连接了两种不同的靶向组件，而第三连接臂则与效应组件(譬如CD3或CD16a的特异性scFv)连接。
在其他实施方式中，本发明分子构建体还包含一第三接合单元。第三接合单元包含一第三中心核、一连接臂(下文称为第三连接臂)、以及视需要而加入的一耦合臂(下文称为第三耦合臂)。在本例中，第三接合单元透过发生在以下任一种情形的CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应而与第一或第二接合单元连接：发生在第一或第二耦合臂和第三耦合臂之间、第一或第二中心核和第三耦合臂之间、第一或第二耦合臂和第三中心核之间、或第一或第二中心核和第三中心核之间。
第三接合单元的第三连接臂在自由端可带有顺丁烯二酰亚胺基，此官能基可透过巯基–顺丁烯二酰亚胺反应而和第二效应组件或靶向组件连接。
当可理解，带有NHS官能基的靶向/效应组件(譬如药物)可以透过NHS基和K残基之间形成酰胺键，而直接连接到第一、第二和/或第三中心核的K残基，而不需使用连接臂(即，第一、第二或第三连接臂)。
根据本公开多种实施方式，第一、第二以及非必要的第三中心核可以相同或不同。
<IV>具有靶向部分及效应部分的分子构建体的用途
在临床医学领域中，根据本公开第三方面的分子构建体可用以治疗多种疾病。因此，本公开的第四方面是关于治疗这些疾病的方法。根据本公开多种实施方式，治疗特定疾病的方法包含以下步骤：对有需要的个体投予治疗有效量的分子构建体，所述分子构建体可以是根据本公开第三方面与其实施方式的任一种分子构建体。当可理解，可将所述分子构建体以药学配方的形式施用，此种药学配方除了包含本发明分子构建体之外，还包含适用于所欲给药方式的药学上可接受的赋型剂。
为了让本发明所属技术领域具有通常知识者能够理解本公开的某些实施方式，下文举例说明可用以治疗某些特定疾病的分子构建体所含的第一与第二组件的组合。
在某些实施方式中，第一组件是细胞因子或细胞因子受体的特异性scFv、或细胞因子的可溶性受体，而第二组件是组织相关细胞外基质蛋白的特异性scFv。在这些情形中，第一组件是用以治疗一或多种免疫疾病的效应组件，而第二组件则是有助于将所述接合单元递送至疾病部位的靶向组件。
细胞因子的非限制性实施例包括：TNF-α、IL-17、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23与BAFF；而细胞因子受体的非限制性实施例包括IL-6的特异性受体(即，IL-6R)或IL-17的特异性受体(即，IL-17R)。至于细胞因子的可溶性受体，其实施例包括，但不限于：TNF-α或IL-1等细胞因子的特异性可溶性受体。组织相关细胞外基质蛋白的例示性实施例包括，但不限于：α-聚集蛋白聚糖、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白与XI型胶原蛋白。
根据一些具体的例示性实施例，所述分子构建体适用于治疗牛皮癣；此时第一组件为TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或IL-17R的特异性scFv，而第二组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。
在某些视需要而实施的实施例中，所述分子构建体适用于治疗免疫疾病，如全身性红斑狼疮、皮肤狼疮或干燥综合症，此类分子构建体包含BAFF的特异性scFv以作为第一组件，且包含I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv以作为第二组件。
在治疗类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎时，例示性的分子构建体所包含的第一组件是TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、IL-17、IL-6R或IL-17R的特异性scFv，而第二组件则是II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性scFv。
所述分子构建体亦适用于治疗炎性肠病，譬如克罗恩氏病与溃疡性结肠炎及其他。在这些情形中，本发明分子构建体使用TNF-α的特异性scFv以作为第一组件，以及使用III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv以作为第二组件。
可由本发明分子构建体所治疗的另一类疾病是扩散性肿瘤，包括，但不限于：急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤以及骨髓瘤。在这些实施方式中，第一组件可以是靶向组件(譬如第一细胞表面抗原的特异性scFv)；而第二组件可以是效应组件(譬如第二细胞表面抗原的特异性scFv)。
可作为用以治疗扩散性肿瘤的靶向组件的第一细胞表面抗原包括，但不限于：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138以及CD319。另一方面，适合作为效应组件的第二细胞表面抗原的非限制性实施例包括CD3以及CD16a。或者是，第一与第二细胞表面抗原为分别CD79a与CD79b。适用于治疗扩散性肿瘤的细胞毒性药物包括，但不限于：奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素以及喜树碱。
在治疗B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病时，例示性的第一组件为CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b的特异性scFv，而例示性的第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
欲治疗浆细胞瘤或多发性骨髓瘤时，例示性的第一组件为CD38、CD78、CD138或CD319的特异性scFv，而例示性的第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
关于衍生自T细胞的淋巴瘤或白血病的治疗，例示性的第一组件为CD5、CD30或CD43的特异性scFv，而第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
于治疗骨髓性白血病时，例示性的第一组件为CD33或CD34的特异性scFv，而例示性的第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
另一类可利用本发明分子构建体来治疗的疾病是实体瘤，包括，但不限于：黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌以及头颈部鳞状细胞癌。此外，本发明分子构建体亦适用于治疗晚期、恶性或转移性的实体瘤。
在建构用于治疗实体瘤的分子构建体时，第一组件(即，靶向组件)可选自肽类激素、第一生长因子及肿瘤相关抗原的特异性第一scFv；而第二组件(即，效应组件)可以是细胞毒性药物、类铎受体(toll-like receptor，TLR)激动剂、与放射性核种复合的螯合剂、细胞因子，或为第二生长因子、细胞表面抗原、半抗原或细胞因子的特异性第二scFv。
举例来说，肽类激素是分泌素、胆囊收缩素、生长抑素或促甲状腺素。至于上述第一生长因子则可以是EGF、突变型EGF、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF以及HGF。肿瘤相关抗原的例示性实施例包括：HER1、HER2、HER3、HER4、CA 19-9、CA 125、CEA、MUC 1、神经节苷脂GD2、MAGE、PSMA、PSCA、间皮素、黏蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原、Globo H、SSEA-4以及EpCAM。
在适用于治疗扩散性肿瘤的分子构建体中，可使用的细胞毒性药物包括，但不限于：奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素以及喜树碱。TLR激动剂的非限制性例示包括：脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、单磷酰脂A(monophosphoryl lipid A)、莫托立莫特(motolimod)、咪喹莫特(imiquimod)、瑞西喹莫特(resiquimod)、加德喹莫特(gardiquimod)、CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG DON)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid)、β-葡聚糖(β-glucan)以及酵母聚糖(zymosan)。所述螯合剂可选自以下物质所组成的群组：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，NOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4-diacetic acid，NODA)以及二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)；而放射性核种可以是111In、131I或177Lu。适当的细胞因子可选自以下群组：IL-2、IFN-α、IFN-γ以及TNF-α。第二scFv能够特异性地识别并结合到以下所述的第二生长因子：EGF、突变型EGF、VEGF-A、bFGF或HGF。第二scFv能够特异性地识别并结合到以下的细胞表面抗原：CD3、CD16a、CD28、CD134、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4或CD152)、程序性细胞死亡因子1(programmed cell death 1，PD-1或CD279)或程序性细胞死亡因子1配体1(programmed cell death 1ligand 1，PD-L1或CD274)。第二scFv能够特异性地识别并与结合到以下的细胞因子：IL-2、IFN-α、IFN-γ或TNF-α；在这些情形中，第二scFv是非中和性scFv。
在某些例子中，某些肿瘤相关抗原会由个体的实体瘤脱落而进入其循环系统中。在这些情形中，本发明用以治疗实体瘤的方法包含以下步骤：(a)对该个体进行血液透析程序，此程序使用一或多种肿瘤相关抗原的特异性抗体，以移除由肿瘤脱落并进入个体循环中的上述一或多肿瘤相关抗原；以及(b)投予本发明用以治疗实体瘤的分子构建体。
根据本公开某些实施方式，当第二组件是半抗原的特异性第二scFv时，所述方法还包含以下步骤：对所述个体投予经相同半抗原标记的一免疫调节效应物。在一些实施方式中，上述半抗原是选自以下群组：二硝苯酚(dinitrophenol，DNP)、三硝苯酚(trinitropheno，TNP)以及序列为WADWPGPP(SEQ ID NO:20)的短肽；而上述免疫调节效应物为IFN-α、IL-2、TNF-α或IFN-γ，或是PD-1、PD-L1、CTLA-4或CD3的特异性IgG抗体。
另一种可由本发明分子构建体来治疗的代表性疾病是骨质疏松症。适用于治疗骨质疏松症的例示性的分子构建体是以RANKL的特异性第一scFv作为第一组件(在本例中，为效应组件)；以及以I型胶原蛋白或骨结合素的特异性第二scFv作为第二组件(或靶向组件)。
<V>具有组织靶向功能的抗发炎分子
本公开的第五方面是关于以可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)为基础的分子构建体(下文称为Fc型分子构建体)，其具有直接或间接连接到免疫球蛋白CH2-CH3区域的至少一靶向组件与至少一效应组件。本发明Fc型分子构建体让开发人员能够进行各种靶向与效应组件的组合。因此，本发明Fc型分子构建体可作为建构多价分子的平台。
根据本公开某些实施方式，Fc型分子构建体包含IgG.Fc的一对CH2-CH3区段、第一对效应组件及第一对靶向组件。
在某些实施方式中，本发明Fc型分子构建体可用以治疗免疫疾病(特别是自体免疫疾病)或骨质疏松症。在本例中，第一对效应组件由两个效应组件所组成，这两个效应组件是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)、IL-17受体(IL-17R)、IL-1、IL-6、IL-6R、IL-12/IL-23、B细胞活化因子(BAFF)或细胞核因子κB受体激活剂配体(RANKL)的特异性抗体片段；或TNF-α或IL-1的可溶性受体。再者，第一对靶向组件是由两个靶向组件所组成，这两个靶向组件是α-聚集蛋白聚糖、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或骨结合素的特异性抗体片段。当第一对效应组件连接于成对CH2-CH3区段的N-端时，第一对靶向组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端，反之亦然。或者是，当第一对效应组件与第一对靶向组件为都是单链可变片段(scFv)的形式时，则第一对靶向组件以串联或双抗体的构型而连接于第一对效应组件的N-端，因而形成一对连接于成对CH2-CH3区段N-端的双特异性scFv。
于一些实施方式中，该成对CH2-CH3区段衍生自人IgG重链γ4或人类IgG重链γ1。
在某些例子中，第一对效应组件或第一对靶向组件形成抗原结合片段(Fab)的构型(即，由VH-CH1区域以及VL-Cκ区域所组成)；此种Fab片段连接于第一与第二重链的N-端，而使得Fc型分子构建体形成IgG构型。在这些情形中，未采用Fab构型的该对组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端。
根据其他实施方式，所述的Fc型分子构建体还包含第二对效应组件，其系由两个额外的效应组件所组成，这些额外的效应组件同样选自上文所述的效应组件。根据多种实施方式中，第二对效应组件所选用的组件和第一对效应组件不同。在这些实施方式中，第二对效应组件连接于CH2-CH3区段的自由C-端。
或者是，本发明Fc型分子构建体还包含第二对靶向组件，其所含的两个靶向组件同样选自上文所述的靶向组件。根据多种实施方式中，第二对靶向组件所选用的组件和第一对靶向组件不同。在这些实施方式中，第二对靶向组件连接于CH2-CH3区段的自由C-端。
根据多种视需要的实施方式，可视需求来组合上文所述的靶向组件与效应组件，进而达到所欲的疗效。附随的权利要求书以及下文会进一步说明用以治疗免疫疾病的一些例示性的效应组件与靶向组件的组合。
<VI>具有组织靶向功能的抗发炎分子的用途
本公开的第六方面是关于用以治疗多种疾病的方法。一般来说，上述方法涉及了对需要此一治疗的个体投予治疗有效量的Fc型分子构建体，所述Fc型分子构建体可以是根据本公开第五方面与相关实施方式的任一种Fc型分子构建体。
于一些实施方式中，本发明方法是关于治疗免疫疾病；特别是自体免疫疾病。
根据本公开某些实施方式，上述自体免疫疾病为类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎。在本例中，效应组件为TNF-α、IL-12/IL-23、IL-1、IL-17或IL-6的特异性抗体片段，而靶向组件可以是II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性抗体片段。
根据多种实施方式中，上述自体免疫疾病为牛皮癣。在本例中，效应组件为TNF-α、IL-12/IL-23或IL-17的特异性抗体片段，而靶向组件是I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性抗体片段。
根据一些其他实施方式，上述自体免疫疾病为全身性红斑狼疮(SLE)、皮肤狼疮或干燥综合症。在本例中，效应组件为BAFF的特异性抗体片段，而靶向组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性抗体片段。
根据某些实施方式，上述自体免疫疾病为炎性肠病，譬如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。在本例中，效应组件为TNF-α的特异性抗体片段，而靶向组件为III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性抗体片段。
此处所提出的方法还可以用于治疗骨质疏松症。根据本公开的实施方式，用于治疗骨质疏松症的效应组件包含RANKL的特异性抗体片段，而靶向组件则包含I型胶原蛋白或骨结合素的特异性抗体片段。
<VII>用以治疗肿瘤的分子构建体
本公开的第七方面是关于一种Fc型分子构建体，与本公开第五方面所述的分子构建体相似，此种Fc型分子构建体亦具有直接或间接地连接到免疫球蛋白的CH2-CH3区域的至少一靶向组件与至少一效应组件。藉由选择本发明Fc型分子构建体的效应组件与靶向组件，所述分子构建体可用于治疗多种细胞增殖疾病，包括扩散性肿瘤及实体瘤。在某些实施方式中，本公开的优点还包括使用了本公开第一方面所述的接合单元，因而提供了一种能够轻易控制处提出的Fc型分子构建体的药物(譬如细胞毒性药物)有效负载(payload)量的方法。在此处，将携带了多个药物分子的接合单元称为载药束(drug bundle)。可在将载药束和抗体分子偶联之前先单独制备此种载药束，因而能够避免在严苛的化学条件下将药物分子直接与抗体分子接合的问题。
根据本公开多种实施方式，所述Fc型分子构建体包含IgG.Fc的一对CH2-CH3区段、第一对效应组件及第一对靶向组件。
在根据本方面第一类Fc型的分子构建体中，第一对效应组件的每一个效应组件是一个载药束，而第一对靶向组件的每一靶向组件是细胞表面抗原的特异性抗体片段。在这些情形中，第一对效应组件连接于成对CH2-CH3区段的C-端，而第一对靶向组件则连接于成对CH2-CH3区段的N-端。根据本公开多种实施方式，载药束包含多个细胞毒性药物分子，譬如奥里斯他汀(auristatin)、美登木素(maytansine)、阿霉素(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)以及喜树碱(camptothecin)；这些Fc型分子构建体可靶向以下细胞表面抗原：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD78、CD79a、CD79b、CD138或CD319。作为例示而非限制，这些Fc型分子构建体可用于治疗多种扩散性肿瘤。
在根据本方面第二类Fc型的分子构建体中，第一对效应组件的每一个效应组件是一个载药束，而第一对靶向组件的每一靶向组件是对肿瘤相关抗原的特异性抗体片段。在这些情形中，第一对效应组件连接于成对CH2-CH3区段的C-端，而第一对靶向组件则连接于成对CH2-CH3区段的N-端。根据本公开多种实施方式，载药束包含多个细胞毒性药物分子、类铎受体激动剂或与放射性核种复合的螯合剂分子；这些Fc型分子构建体可靶向以下肿瘤相关抗原：人类上皮生长因子受体1(HER1)、HER2、HER3、HER4、糖抗原19-9(CA 19-9)、糖抗原125(CA 125)、癌胚抗原(CEA)、细胞表面相关黏蛋白1(MUC 1)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、黏蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原、Globo H、阶段特异性胚胎抗原(SSEA-4)、神经节苷脂GD2或上皮细胞黏附分子(EpCAM)。作为例示而非限制，这些Fc型分子构建体可用于治疗多种实体瘤，包括恶性和/或转移性实体瘤。
在根据本方面第三类Fc型的分子构建体中，第一对效应组件的每一个效应组件是一个载药束、或是细胞表面抗原、生长因子或半抗原的特异性抗体片段；而第一对靶向组件的每一靶向组件是生长因子或肽类激素。当效应组件为载药束时，第一对效应组件分别连接于成对CH2-CH3区段的C-端，而靶向组件分别连接于成对CH2-CH3区段的N-端。或者是，当效应组件是抗体片段时，效应组件分别连接于成对CH2-CH3区段的N-端，而靶向组件分别连接于成对CH2-CH3区段的C-端，反之亦然。
藉由选择效应组件与靶向组件，所述第三类的Fc型分子构建体亦可用于治疗多种实体瘤，包括恶性和/或转移性实体瘤；然而，本公开不限于此。
根据本公开的实施方式，适合作为效应组件的细胞毒性药物可以是为奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素或喜树碱。TLR激动剂的例示性实施例包括：脂多糖(LPS)、单磷酰脂A、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡聚脱氧核苷酸(CpGDON)、脂磷壁酸、β-葡聚糖以及酵母聚糖。适用于此处的螯合剂包括，但不限于：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸(NODA)与二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。能够和上述螯合剂复合的放射性核种的非限制性实施例可以是90Y、111In或177Lu。
某些可作为效应组件的抗体片段是对细胞表面抗原的特异性抗体片段，上述细胞表面抗原如程序性细胞死亡因子1(PD-1)、程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、CD3、CD16a、CD28以及CD134。另一类例子是生长因子的特异性抗体片段，上述生长因子如上皮生长因子(EGF)、突变型EGF、表皮调节素、肝素结合上皮生长因子(HB-EGF)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及肝细胞生长因子(HGF)。此处亦可使用半抗原的特异性抗体片段，而半抗原的例示性实施例包括：二硝苯酚(DNP)、三硝苯酚(TNP)、丹磺酰、盘尼西林、对胺苯甲酸以及具有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的多肽。
适用于本类Fc型分子构建体的靶向组件可以是生长因子，如EGF、突变型EGF、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF以及HGF。或者是，所述靶向组件可以是肽类激素，如胆囊收缩素(CCK)、生长抑素与促甲状腺素(TSH)。
根据本公开此一方面的各种Fc型分子构建体间有一些共通的特征，下文先讨论这些共通特征。
于一些实施方式中，上述成对的CH2-CH3区段是衍生自人类IgG重链γ4或人类IgG重链γ1。
在某些例子中，第一对效应组件(譬如用于上述第三类Fc型分子构建体中的组件)或第一对靶向组件(譬如用于第一与第二类Fc型分子构建体中的组件)形成抗原结合片段(Fab)的构型(即，包含VH-CH1区域以及VL-Cκ区域)；此一Fab片段连接于第一与第二重链的N-端，而使得Fc型分子构建体形成IgG构型。在这些情形中，未采用Fab构型的另一对组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端。
根据某些实施方式，本发明Fc型分子构建体还包含一多肽延伸段及一耦合臂。具体来说，多肽延伸段的序列为(G2-4S)2-8C，且连接于成对CH2-CH3区段其中之一的C-端。在这种情形中，耦合臂透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应而连接于多肽延伸段的C-端。此外，在和载药束偶联之前，耦合臂的自由端(即，未连接于多肽延伸段的半胱氨酸残基的一端)经修饰带有炔基、叠氮基、高应力炔基或四嗪基，而使得载药束可透过逆电子需求狄尔斯-阿德(iEDDA)反应、应力促进的叠氮化物-炔点击化学(SPAAC)反应或铜催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)反应而与耦合臂偶联。
当效应组件是载药束时，可利用本公开第一方面所述的接合单元作为载药束。具体来说，载药束包含一中心核、多个第一连接臂以及视需要而加入的一第二连接臂。根据本公开多种实施方式，中心核可以是具有多个氨基的化合物或包含多个赖氨酸(K)残基的多肽。每一第一连接臂的一端藉由和化合物核的氨基或多肽的K残基反应，而与中心核连接。第一连接臂在其自由端带有顺丁烯二酰亚胺基，而每一药物分子(譬如细胞毒性药物、TLR激动剂或螯合剂/放射性核种复合物的分子)则藉由和顺丁烯二酰亚胺基反应以透过第一连接臂而与中心核连接。
在中心核是多肽的情形中，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基或带有叠氮基或炔基。
当多肽中心核的末端氨基酸残基带有叠氮基或炔基时，载药束可以透过发生于上述末端残基与耦合臂C-端之间的CuAAC反应而和耦合臂连接。
当多肽中心核的末端残基是半胱氨酸或中心核是化合物核时，载药束还包含第二连接臂。第二连接臂的一端藉由和多肽的半胱氨酸残基反应或和化合物核的一氨基反应，而与中心核连接。第二连接臂的自由端亦带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基，而使得载药束可透过CuAAC反应或iEDDA反应而连接到耦合臂的C-端。
根据本公开某些视需要而实施的实施方式，上述Fc型分子构建体可还包含第二对效应组件或第二对靶向组件。
对于第二类的Fc型分子构建体，第二对靶向组件可分别连接于第一对靶向组件。举例来说，于一些实施方式中，第一对效应组件的每一效应组件是包含多个细胞毒性药物分子的载药束，第一对靶向组件的每一靶向组件是HER2的特异性scFv，而第二对靶向组件的每一靶向组件则是HER1的特异性scFv。
对于第三类的Fc型分子构建体，在成对CH2-CH3区段的N-端已有一对组件，此时，第二对效应组件可以用串联或双抗体的构型连接到上述位于N-端的该对组件的N-端，因而形成连接于成对CH2-CH3区段的N-端的一对双特异性scFv。或者是，第三类的Fc型分子构建体还可包含第二对靶向组件，第二对靶向组件以串联或双抗体的构型连接到位于成对CH2-CH3区段N-端的该对组件的N-端，因而形成连接于成对CH2-CH3区段的N-端的一对双特异性scFv。
<VIII>用以治疗肿瘤的分子构建体的用途
本公开的第八方面是关于治疗多种细胞增殖性疾病的方法。一般来说，上述方法涉及了对需要此一治疗的个体投予治疗有效量的Fc型分子构建体，所述Fc型分子构建体可以是根据本公开第七方面与相关实施方式的任一种Fc型分子构建体。
于一些实施方式中，本发明方法是关于扩散性肿瘤的治疗方法，如B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、衍生自T细胞的淋巴瘤或白血病以及骨髓性白血病。如上文所述，本公开第七方面所述的第一类Fc型分子构建体可用于治疗扩散性肿瘤。附随的权利要求书以及下文会进一步举例说明用以治疗特定扩散性肿瘤的Fc型分子构建体所靶向的细胞表面抗原。
如上文所述，本发明方法亦适用于治疗个体的实体瘤。实体瘤的实施例包括，但不限于：黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌以及头颈部鳞状细胞癌。如上文所述，根据本公开第七方面的第二与第三类Fc型分子构建体可用于治疗实体瘤。附随的权利要求书以及下文会进一步说明用以治疗治疗实体瘤的一些例示性的效应组件与靶向组件的组合。
根据本公开某些视需要而实施的实施方式，在治疗实体瘤时，所述方法包含以下步骤：(a)对该个体进行血液透析程序，此程序使用一或多种肿瘤相关抗原的特异性抗体，以移除由肿瘤脱落并进入个体循环中的上述一或多种肿瘤相关抗原；以及(b)投予本发明用以治疗实体瘤的分子构建体。
当所述Fc型分子构建体使用对半抗原的特异性抗体片段作为效应组件时，本发明方法还包含下步骤：在投予本发明Fc型分子构建体之后，对所述个体投予经相同半抗原标记的一免疫调节效应物。上述免疫调节效应物的非限制性实施例为IFN-α、IL-2、TNF-α或IFN-γ、或为PD-1、PD-L1、CTLA-4或CD3的特异性IgG抗体。
根据本公开某些实施方式，肿瘤相关抗原会由个体的恶性肿瘤脱落而进入其循环系统中。在这些情形中，本发明方法还包含在投予本发明Fc型分子构建体之前，对该个体进行血液透析程序，此程序使用一或多种肿瘤相关抗原的特异性抗体，以移除由恶性肿瘤脱落并进入个体循环中的上述一或多种肿瘤相关抗原。
【附图简单说明】
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，兹将所附图式简单说明如下。
图1A图至1K为根据本公开某些实施方式的接合单元的示意图。
图2为包含化合物核的接合单元的示意图。
图3A至3D为根据本公开某些实施方式的T-E分子构建体的示意图。
图4为根据本公开某些实施方式，用以建构分子构建体的分子构建体库的示意图。
图5A与5B为根据本公开某些实施方式的分子构建体的示意图。
图6为根据本公开某些实施方式的分子构建体的示意图。
图7A与7B为根据本公开多种实施方式的分子构建体的示意图。
图8A至8F为根据本公开多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图。
图9A与9B为根据本公开多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图。
图10A至10C为根据本公开多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图。
图11为根据本公开一实施方式的Fc型分子构建体的示意图。
图12A至12C为根据本公开多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图。
图13为以反相高效液相层析(HPLC)分析纯化TCO-多肽2的溶析曲线图；多肽2的序列如SEQ ID NO:18所示。
图14为以反相HPLC纯化(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽2)复合物的曲线图。
图15为(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽2)复合物的基质辅助雷射脱附飞行时间质谱分析(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight massspectrometry，MALDI-TOF MS)结果。
图16A与16B分别为(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(四嗪基-多肽2)复合物以及(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(DBCO-多肽2)复合物的MALDI-TOF质谱分析结果。
图17为(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(四嗪基-多肽8)复合物的电喷洒离子化飞行时间质谱分析(electrospray ionization-time of flight mass spectrometry，ESI-TOF)结果。
图18为(PEG6-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽9)复合物的ESI-TOF质谱分析结果。
图19是带有一个NHS-PEG12-炔基耦合臂和两个NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺基连接臂的1,3,5-三苯胺的ESI-TOF质谱分析结果。
图20为以反相HPLC纯化带有五个DM1-SMCC分子的TCO-多肽9的曲线图。
图21为带有五个DM1-SMCC分子的TCO-多肽9的质谱分析结果。
图22为荧光分光亮度分析结果，图中显示LPS和丹磺酰肼(dansyl hydrazine)反应后的最大发射波长为495nm。
图23为和咪喹莫特复合的PEG5-NHS的质谱分析结果。
图24A为DOTA-(TCO-多肽9)复合物的ESI-TOF质谱分析结果；图24B为与Y3+-螯合的DOTA-(TCO-多肽9)复合物的质谱分析结果。
图25A、25B分别是抗CD79b抗体1F10的纯化scFv蛋白的SDS-PAGE与ELISA分析结果；图25C、25D分别是抗VII型胶原蛋白抗体LH7.2的纯化scFv蛋白的SDS-PAGE与ELISA分析结果。
图26A是曲妥珠单抗(trastuzumab)及阿达木单抗(adalimumab)的纯化scFv的SDS-PAGE分析结果；图26B、26C分别是曲妥珠单抗及阿达木单抗的纯化scFv的ELISA分析结果；图26D、26E分别是西妥昔单抗(centuximab)的纯化scFv的SDS-PAGE及ELISA分析结果。
第27A是阿达木单抗的纯化scFv的SDS-PAGE分析结果；第27B是阿达木单抗的纯化scFv的ELISA分析结果。
图28A、28B分别是TCO-抗CD3 scFv复合物以及DBCO-抗CD3 scFv复合物的ELISA分析结果。
图29A、29B及29C分别是根据一实施例的合成接合单元的FPLC溶析曲线图、SDS-PAGE分析结果以及MALDI-TOF质谱分析结果，上述合成接合单元含有一个自由四嗪基官能基和一组共三个人CD79b的特异性scFv。
图30A、30B分别是四嗪基-多肽2和三个HER2/neu的特异性scFv形成的复合物的SDS-PAGE与质谱分析结果；图30C是TCO-多肽2和三个TNF-α的特异性scFv复合物的质谱分析结果；图30D、30E分别是TCO-多肽2和三个PD-1的特异性scFv形成的复合物的SDS-PAGE与质谱分析结果。
图31是四嗪基-多肽2和三个CCK肽形成的复合物的质谱分析结果。
图32是TCO-多肽7和两个CD20的特异性scFv形成的复合物的质谱分析结果。
图32是TCO-多肽7和两个CD20的特异性scFv形成的复合物的质谱分析结果。
图33是TCO-多肽1和两个VEGF-A的特异性scFv形成的复合物的质谱分析结果。
图34A是具有三个CD79b的特异性scFv和一个CD3的特异性scFv的分子构建体的质谱分析结果；图34B是具有三个HER2/neu的特异性scFv和一个CD3的特异性scFv的分子构建体的质谱分析结果。
图35是TCO-多肽1与抗VEGF-A scFv复合后再进一步和四嗪基-20kDa PEG复合所得之反应混合物的SDS-PAGE分析结果。
图36A与36B分别是一分子构建体的SDS-PAGE与质谱分析结果，上述分子构建体有一靶向接合单元、三个CD79b的特异性scFv和一个带有五个DM1分子的载药束。
图37是一分子构建体的ELISA分析结果，上述分子构建体具有一靶向接合单元、三个CD79b的特异性scFv和一个带有五个DM1分子的载药束。
图38是一分子构建体的SDS-PAGE结果，上述分子构建体具有一靶向接合单元、三个HER2/neu的特异性scFv和一个带有五个DM1分子的载药束。
图39是一分子构建体的质谱分析结果，上述分子构建体具有一靶向接合单元、三个CCK8肽和一个带有五个DM1分子的载药束。
图40是分子构建体的质谱分析结果，上述分子构建体具有一靶向接合单元、三个CCK8肽和一个带有五个DOTA官能基的载药束。
图41是一反应混合物的SDS-PAGE分析结果；上述反应混合物含有由四嗪基-多肽2和三个CD79b的特异性scFv组成的接合单元、由TCO-多肽7和两个CD20的特异性scFv组成的接合单元以及带有五个DM1的载药束。
图42是LPS经丹磺酰肼修饰之前与之后的生物活性分析结果。
图43是咪喹莫特与PEG连接臂复合后的生物活性分析结果。
图44是带有三个VEGF-A的特异性scFv和一条20kDa PEG的分子构建体在小鼠体内的药动学模式分析结果。
图45是一分子构建体的细胞毒性分析结果，上述分子构建体带有三个CD79b的特异性scFv和一个带有五个DM1的载药束。
图46是(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc的SDS-PAGE分析结果。
图47A、47B分别是(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc对II型胶原蛋白以及TNF-α的结合力的ELISA分析结果。
图48A、48B分别是双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc-(scFvαIL-17)的SDS-PAGE与ELISA分析结果。
图49A、49B分别是双链(可溶性TNF-α受体)-IgG1.CH2-CH3-(scFvαCII)的SDS-PAGE与ELISA分析结果。
图50是含有完整抗人类TNF-α抗体与II型胶原蛋白的特异性scFv的双链融合蛋白的SDS-PAGE分析结果。
图51A、51B分别是含有完整抗人类IL-17抗体与VII型胶原蛋白的特异性scFv的双链融合蛋白的SDS-PAGE与ELISA分析结果。
图52A、52B分别是(scFvαCVII)-IgG4.CH2-CH3-(scFvαBAFF)的SDS-PAGE与ELISA分析结果。
图53A、53B分别是含有完整抗人类BAFF抗体与VII型胶原蛋白的特异性scFv的双链融合蛋白的SDS-PAGE与ELISA分析结果。
图54A、54B分别是双链(scFvαSPARC)-(scFvαRANKL)-hIgG4.Fc分子构建体的SDS-PAGE与ELISA分析结果。
图55A、55B分别是含有完整抗人类RANKL抗体与人类骨结合素的特异性scFv的双链融合蛋白的SDS-PAGE与ELISA分析结果。
图56A至56E是(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc以及双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc-(scFvαIL-17)于小鼠骺骨的免疫染色图。
图57A至C是双链(可溶性TNF-α受体)-IgG1.CH2-CH3-(scFvαCII)于小鼠骺骨的免疫染色图。
图58A至C是经荧光标记的(scFvαSPARC)-(scFvαRANKL)-hIgG4.Fc在BALB/c小鼠体内的生物分布分析结果。
图59A是带有C-端延伸段(末端为半胱氨酸残基)的双链EGF-CH2-CH3和双链EGF-CH2-CH3-(scFvαPD1)的SDS-PAGE分析结果。图59B是上述双链IgG1.Fc融合蛋白和带有两个LPS分子的接合单元形成的复合物的SDS-PAGE分析结果。
图60A、60B是EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)对多种PD-1以及ERBB！的结合力的ELISA分析结果。
图61A是双链EGF-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)分子构建体的SDS-PAGE分析结果。图第61B是双链EGF-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)对ERBB！、ERBB2和ERBB3的结合力的ELISA分析结果。
图62A是带有C-端延伸的EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)和EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)的SDS-PAGE分析结果；图62B-62E是EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)以及EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)对PD-1或CD3、以及对ERBB1、ERBB2和ERBB3的结合力的ELISA分析结果。
图63是生长抑素-hIgG1.Fc、生长抑素-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)以及生长抑素-hIgG1.Fc-(scFvαPD-1)的SDS-PAGE分析结果。
图64是EGF-IgG1.Fc、EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)、EGF-IgG1.Fc-(scFvαCD3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc与EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)在表达EGFR的A431细胞上的细胞染色分析结果。
图65是EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)与抗PD-1mAb(对照组)在T细胞上的细胞染色分析结果(图框A至C)；以及EGF-IgG1.Fc-(scFvαCD3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)与抗CD3mAb(对照组)在T细胞上的细胞染色分析结果(图框D至F)。
图66A、66B呈现了表达EGFR的A431细胞在经过EGF-hIgG.Fc-(scFvαCD3)以及EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)处理后的T细胞介导的细胞溶解(T cell–mediatedcytolysis)；图66C、66D呈现了MDA-MB-231细胞在经过EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)处理后的细胞溶解程度。
图67A-67C是A431细胞经EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)处理后在不同时间点的T细胞介导的细胞溶解程度。
图68是A431细胞经双链EGFw2v3-IgG1.Fc-(scFvαPD-1)处理后由人类PBMC引发的细胞溶解程度。
根据惯常的作业方式，图中各种特征与组件并未依比例绘制，其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与组件。此外，在不同图式间，尽可能以相同或相似的组件符号来指称相似的组件/部件。
【描述】
为了使本公开的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方面与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
为了便于说明，此处整理了说明书、实施例与附随权利要求书中所用的某些词汇。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。
在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。此外，在本说明书与权利要求书中，“至少一”与“一或更多”等表述方式的意义相同，两者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本说明书与权利要求书中，“A、B及C其中至少一者”、“A、B或C其中至少一者”以及“A、B和/或C其中至少一者”系指涵盖了仅有A、仅有B、仅有C、A与B两者、B与C两者、与C两者、以及A、B与C三者。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常系指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。当可理解，除了实验例之外，或除非另有明确的说明，此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而改动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一端点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。
本公开一般系关于多种分子构建体，其中每一分子构建体包含一靶向组件(T)与一效应组件(E)，在本说明书中有时将这些分子构建体称为“T-E分子”、“T-E药物”或“T-E药品”。
在此处，“靶向组件(targeting element)”一词指分子构建体能够直接或间接结合到感兴趣的目标(如，细胞表面上的受体或组织中的蛋白质)的部分，因而能够协助将本发明分子构建体递送到该感兴趣目标。在某些例子中，靶向组件可将所述分子构建体导引至邻近目标细胞处。在其他情形中，靶向组件可特异性地结合到目标细胞表面上的分子；或靶向组件可和第二分子特异性地结合，而此一第二分子能够特异性地结合到目标细胞表面上的分子。在某些例子中，一旦靶向组件与感兴趣的目标接合之后，靶向组件可将本发明分子构建体内化，而使其移动到目标细胞的细胞质内。靶向组件可以是细胞表面受体的抗体或配体；或者是可和上述抗体或配体结合的分子，因而能够间接地将本发明分子构建体靶向目标部位(譬如所选定的细胞表面)。相较于没有靶向功能的治疗药物，利用本发明分子构建体能够加强或有利于效应组件(治疗药剂)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一种程度或相对的比例，而不是让效应组件在疾病部位绝对或完全的局部化。
根据本发明，“效应组件(effector element)”一词指一旦分子构建体到达目标部位后，所述分子构建体中能够发挥生物活性(譬如，诱发免疫反应、发挥细胞毒性及与其相似者)或其他功能活性(譬如招募其他经半抗原标记的治疗用分子)的部分。“效应”可指治疗性或诊断性的效果。效应组件包含能够和细胞和/或细胞外免疫调节因子结合的组件。上述效应组件包含如蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、糖蛋白、药物部分(包含小分子药与生物制剂)、化合物元素及同位素等物质，也包含上述物质的片段。
虽然在此处利用“第一”、“第二、“第三”等词汇来描述多种组件、部件、区域和/或区段，这些组件(以及部件、区域和/或区段)不受上述修饰词的限制。此外，除非上下文有明示的说明，使用这些序数并未隐含序列或顺序。反之，这些词汇仅是用来区分各组件。因此，亦可将下文所述的第一组件命名为第二组件，而不会悖离例示性实施方式所揭示的内容。
在此处，“连接(link)”、“偶联(couple)”以及“复合(conjugate)”等词可互换使用，且都是用来指称透过直接或间接的连接关系，将两个组件连接在一起。
“多肽”一词在此系指具有至少两个氨基酸残基的聚合物。一般来说，多肽包含2到200个氨基酸残基；在较佳的情形中，是2到50个残基。在本说明书中所提及的氨基酸序列涵盖了此种序列的L-、D-或β-氨基酸等形式。多肽亦包括氨基酸聚合物，其中有一或多个氨基酸残基是与一天然氨基酸相应的人工化学类似物，当然也包括天然产生的氨基酸聚合物。此外，此一词汇亦涵盖以多肽链或其他方式连接的氨基酸，上述其他方式如经修饰的连接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫酰胺(thioamide)、磷酰胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羟基酯(hydroxylate)键、以及与其相似者来取代多肽键。
于一些实施方式中，本发明范围亦涵盖了其他相较于所述序列具有保守性置换的蛋白。于多种实施方式中，有一、二、三、四或五个不同的残基经过置换。在此处，“保守性置换”一词是指所述氨基酸置换不会明显地改变分子活性(譬如生物或功能活性和/或特异性)。一般来说，保守性氨基酸置换是利用另一种具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的氨基酸来取代某一氨基酸。某些保守性置换包括“类似物置换”，亦即以非标准(如罕见或合成等)氨基酸来取代标准氨基酸，而上述非标准氨基酸和被取代的原有氨基酸之间的差异极小。可由标准氨基酸经人工修饰而在不会大幅改变原有氨基酸结构的前提下，得到所述的氨基酸类似物，譬如异构物或代谢前驱物等皆属之。
于一些实施方式中，本案的范围亦涵盖和任何所述序列具有至少80％序列相似度的任何序列，上述序列相似度较佳为至少85％或90％、更佳为至少95％或98％。
此处针对多肽序列所述的“氨基酸序列相似度百分比”指候选序列的氨基酸残基与参考多肽序列的氨基酸残基完全相同的百分比；于进行上述比对时，可将所述的候选多肽片段与所述的特定多肽片段并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在计算相似度时，保守性置换的氨基酸残基视为不同的残基。相关领域已有多种方法可用以进行上述并排，譬如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中具有通常知识者在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，二多肽序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白质-蛋白质BLAST分析数据库Blastp来进行。候选多肽序列A相较于参考多肽序列B的氨基酸序列相似度(在本说明书中亦称之为多肽序列A与多肽序列B具有特定百分比(％)的氨基酸序列相似度)的计算方式如下：
其中X是利用BLAST序列并排程序对序列A、B进行排列后所得到的相同氨基酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短者的氨基酸残基总数。
“聚乙二醇化氨基酸(PEGylated amino acid)”一词在此指带有一个氨基与一个羧基的聚乙二醇链。一般来说，聚乙二醇化氨基酸的结构式为NH2-(CH2CH2O)n-COOH。在本公开中，n值介于1到20之间；较佳是介于2至12。
在此处一多肽的“端”指位于该多肽N-或C-端的氨基酸残基。在描述一聚合物(譬如此处所述的聚乙二醇)的组成单元时，“端”则是指在聚合物骨架末端的部分。在本说明书与权利要求书中，“自由端”一词是用来指称并未与另一个分子形成化学键结的末端氨基酸残基或构成单元。
“抗原”或“Ag”指能够导致免疫反应的分子。此种免疫反应可能涉及分泌性、体液和/或细胞级的抗原特异性反应。在本公开中，“抗原”一词指蛋白质、多肽(包括其突变株或具有生物活性的片段)、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸或上述的组合。
在本说明书与权利要求书中，“抗体”一词应以广义方式解释，且包含完整组装的抗体、可和抗原结合的抗体片段，譬如抗原结合片段(Fab/Fab’)、F(ab’)2片段(具有彼此以双硫键连接的两个Fab部分)、可变片段(variable fragment，Fv)、单链可变片段(scFv)、双单一性单链可变片段(bi-scFv)、奈米抗体(nanobodies)、单抗体(unibodies)以及双体抗体(diabodies)。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，较佳为包括完整抗体的抗原结合区域或可变区域。在典型的例子中，“抗体”系指实质上由免疫球蛋白基因或其片段所编码的一或多种多肽所组成的蛋白质。习知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε与μ等恒定区基因、以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链通常归类为κ或λ。重链通常归类为γ、μ、α、δ或ε，基于这些结构，定义出了以下类型的免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白抗体结构是一种四聚物。每一个四聚物是由两条相同的多肽链所组成，且每一对分别有一“轻”链(约25kDa)与一“重”链(约50-70kDa)。每一链的N-端界定了一个可变区域，包含约100至110个或更多的氨基酸，其主要负责抗原辨识。可变轻链(VL)与可变重链(VH)等词就是分别指上述的轻链与重链。根据本公开的实施方式，可藉由改变天然抗体或利用重组DNA方式重新合成上述抗体片段。于本公开一些实施方式中，上述抗体和/或抗体片段可具有双特异性，且可有多种不同的构型。举例来说，双特异性抗体可包含二个不同的抗原结合部位(可变区域)。于多种实施方式中，可利用融合瘤技术或重组DNA技术来制备双特异性抗体。于一些实施方式中，双特异性抗体对至少两种不同的表位有结合特异性。
“特异性结合”一词在此处指抗体或其抗原结合片段能够和抗原结合的能力，上述结合的解离常数(Kd)小于约1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或1×10-12M；或者是或额外地，相较于其对于非特异性抗原的结合亲合力，上述抗体或其抗原结合片段与抗原结合的亲合力为两倍以上。
“免疫疾病”一词在此处是指涉及体液免疫缺失、细胞介导免疫缺失、综合免疫缺失、不明免疫缺失以及自体免疫疾病的相关疾病。
“肿瘤”一词在此指所有肿瘤性的细胞生长与增殖，不论是恶性还是良性的，也涵盖所有癌前期与癌细胞与组织。在本说明书与权利要求书中，“肿瘤”一词涵盖包含实体瘤与扩散性肿瘤。
“实体瘤”一词是通常不含囊肿或液体区域的不正常组织团块。各种类型的实体瘤通常是以形成肿瘤的细胞来命名。实体瘤的例子包括，但不限于：肉瘤与癌。一般来说，“肉瘤”是源自于结缔组织或支持组织(如骨头或肌肉)的肿瘤。“癌”则是源自于腺体细胞与位于身体组织边衬的上皮细胞的肿瘤。
“扩散性肿瘤”一词在此指白血病和/或血液方面的疾病，此类疾病通常源自造血细胞以及受到影响的血液、骨髓或淋巴结。扩散性肿瘤的例子包括，但不限于：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤以及骨髓瘤。
“肿瘤相关抗原(TAA)”一词指任何相关领域已知的抗原，且包括在癌细胞表面上发现的抗原，也包括从癌细胞表面脱落而变成可溶性的抗原(即，可溶性癌抗原)。许多位在肿瘤或正常细胞上的细胞表面抗原也有可溶性的对应物。此种抗原包括，但不限于：在癌相关成纤维细胞(CAF)、肿瘤内皮细胞(TEC)以及肿瘤相关巨噬细胞(TAM)上发现的抗原。
“治疗”一词指预防性(如，预防用药)、疗愈性或缓和性的处置，藉以达到所欲的药学和/或生理学效果；而治疗的行为在此包括上述预防性、疗愈性或缓和性的处置。具体来说，治疗在此系指对于可能患有一医疗疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常、或易于罹患一疾患的个体施用或投予本发明分子构建体或包含此分子构建体的药学组合物，，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻特定异常和/或病症的一或多种症状或特征，或是延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对尚未表出现疾病、异常和/或病症征兆的个体和/或出现早期征兆的个体进行治疗，以期降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关的病理变化的风险。
在此处，“有效量”一词指本发明分子构建体的用量足以招致所欲的治疗反应。药剂的有效量不必然能够治愈疾病或病症，但能够延缓、阻碍或防止该疾病或病症的发生，或是可缓减与疾病或病症相关的病征。可将治疗有效量可分成一、二或更多剂，而以适当的剂型在指定期间内施用一次、二次或更多次。具体的治疗有效量取决于多种因素，例如欲治疗的特定状况、个体的生理条件(如，个体体重、年龄或性别)、接受治疗的个体类型、治疗持续时间、并行治疗(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将治疗有效量表示成活性成分的总重量，譬如以克、毫克或微克来表示；或表示成活性成分重量相对于体重的比例，譬如表示为每公斤体重多少毫克(mg/kg)。
所述“施用”与“投予”等词在此可交替使用，其指将本发明的分子构建体或药学组合物提供给需要治疗的个体。
“个体”或“患者”等词在此可交互使用，且是指可接受本公开的分子构建体、药学组合物和/或方法处置的动物(包含人类)。除非另有指明，“个体”或“患者”一般包含雄性与雌性。“个体”或“患者”包含任何可因本公开的处置而获益的哺乳类动物。所述“个体”或“患者”的例示包含，但不限于：人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、猪、山羊、牛、马、狗、猫、鸟和禽类。在一实例中，所述患者为人类。所述哺乳类动物涵盖哺乳动物纲的所有成员，包括人类、灵长类动物、家畜和农畜(如兔子、猪、绵羊和牛)、动物园动物或竞赛用动物、宠物，以及啮齿类动物(如，小鼠和大鼠)。“非人类哺乳动物”一词则涵盖除了人类以外的所有哺乳动物纲成员。
本公开至少部分是基于建构出了T–E药物，此种T-E药物可被递送至目标细胞、目标组织或器官，且其在这些部位的比例相对高于在血液循环、淋巴系统以及其他细胞、组织和器官中的比例。当实现上述情境时，即可提升T-E药物的疗效，且其副作用与毒性的数目和严重性都会降低。相较于不含靶向组件的药物，以T-E分子的形式来投递药物时，发挥疗效的效应物所用的浓度可能较低。因此，可在较低的剂量下施用治疗用的效应物而不会减损其有效性，但却能同时降低其副作用与毒性。
可因较佳药物靶向而获益的疾病
若是可将药物靶向疾病部位，亦即若是可使药物在疾病部位(相对于在正常组织或器官)局部化或有较优势的浓度，就能够改善用以治疗许多疾病的药物，使其具备较佳的疗效与安全性。下文提出一些主要的例示性疾病，若是能使得这些疾病所用药物在疾病部位或细胞有较佳的分布比例，就可以改善这些药物。
I 免疫疾病
可利用本发明方法而以本公开的分子构建体来治疗的疾病、病症和/或异常可以是免疫疾病；例如，自体免疫疾病；所述的自体免疫疾病包括，但不限于：牛皮癣、全身性红斑狼疮、皮肤狼疮、干燥综合症、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎关节黏连性脊椎炎以及炎性肠病。
大多数的自体免疫疾病(如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮，干燥综合症、牛皮癣、克罗恩氏病、炎性肠病及其他)都会影响结缔组织。自体免疫疾病有多种致病机制，譬如可能是由环境、遗传、表观遗传(epigenetic)等因素或其组合所造成，但不论其致病本质为何，受影响的组织都会因为长时间的发炎过程而受到损伤。本发明合理推论，可利用细胞外基质作为目标抗原，将抗发炎治疗剂(如抗TNF-α、抗IL-17、抗BAFF、抗IL-6、抗IL-12/IL-23等)带到发病的结缔组织所在处。适当的目标抗原可包括许多种类的胶原蛋白、层链接蛋白(laminins)、弹性蛋白(elastins)、小纤维蛋白(fibrillins)、纤网蛋白(fibronectins)以及生腱蛋白(tenascins)。结缔组织填充于人体几乎所有部分。然而，由于在不同位置对于结构组织的结构性与功能性要求不同，这些细胞外基质成分的种类也不一样，因此这些细胞外基质成分具有极佳的组织靶向特异性。
相较于选用细胞表面抗原来作为抗发炎治疗剂的靶向对象，选用细胞外基质成分的优点在于在多样的基质蛋白间类型提供了不同的选择性，而且细胞外基质蛋白的含量非常丰富。更有甚者，由于并未使用细胞作为抗原靶标，也可避免抗发炎治疗剂直接与细胞结合可能带来的危害。
I-(i) 类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎
已有多种抗TNF-α抗体(譬如英夫利昔单抗(infliximab)与阿达木单抗)以及TNF-α受体和IgG.Fc融合蛋白(如依那西普(etanercept))经核准可用于类风湿性关节炎、关节黏连性脊椎炎以及其他自体免疫疾病的人体临床试验。白介素-1(IL-1)受体的细胞外部分—阿那白滞素(anakinra)—则经核准可用以治疗类风湿性关节炎。针对IL-12以及IL-23共有的p40蛋白的抗体，譬如优特克单抗(ustekinumab)以及贝伐珠单抗(briakinumab)，则经核准可用以治疗牛皮癣性关节炎或用于类风湿性关节炎的临床试验。抗IL-6受体的抗体(托珠单抗(tocilizumab))经核准可用于类风湿性关节炎与全身幼年性自发关节炎(systemic juvenile idiopathic arthritis)；而多种抗IL-6抗体，譬如沙里鲁单抗(sarilumab)与奥洛珠单抗(olokizumab)，则正在进行治疗类风湿性关节炎的临床试验。IL-17的特异性抗体—苏金单抗(secukinumab)—经核准可用以治疗牛皮癣，且也已用于类风湿性关节炎与关节黏连性脊椎炎的临床试验。
虽然上述治疗药剂比起先前所用的药剂更能够减缓较为严重的症状，但却会在接受治疗的患者体内引发一系列的副作用。举例来说，英夫利昔单抗会导致严重的血液疾病(如白血球减少症(leukopenia)以及血小板减少症(thrombocytopenia))、严重的感染、淋巴瘤与其他实体瘤、B型肝炎病毒再活化与结核病、以及其他严重的问题。阿那白滞素经常会造成感染，且会对肠胃道、呼吸道与造血器官造成严重的副作用。降低这些广泛使用的治疗药剂的严重副作用，且同时保持甚至提升其疗效，是非常重要的议题。
类风湿性关节炎患者的膝盖、手指、脚趾关节与其他关节会受到影响，而关节黏连性脊椎炎患者的脊椎关节与骨盆的荐髂关节(sacroiliac joint)会受到影响。在发病的关节处，骨头的表面还有衬接骨头表面的关节软骨会遭受关节中的发炎性免疫成分攻击。关节中的关节软骨是含有细胞外基质的平滑软骨。软骨没有血管，水分占了约60％的重量，而其他成分则是由胶原蛋白与α-聚集蛋白聚糖(一种蛋白多糖)以及其他基质分子所组成。II型胶原蛋白形成了软骨中的主要纤维。聚集蛋白聚糖是软骨中含量第二高的成分。XI型胶原蛋白可结合到II型胶原蛋白原纤维(fibril)表面，以利形成原纤维网络，且IX型胶原蛋白与II型胶原蛋白和XI型胶原蛋白相关联。软骨有较大的表面积，而α-聚集蛋白聚糖的结构与形状则和羽毛相近。除了软骨形成之外，关节处还有负责连接相邻骨骼的韧带，如十字韧带以及连接肌肉和骨骼的肌腱。韧带和肌腱是由第I、II与III型胶原蛋白还有弹性蛋白与小纤维蛋白1、2组成的纤维网络所形成。
本发明合理推论可利用II型胶原蛋白、α-聚集蛋白聚糖、XI型胶原蛋白或IX型胶原蛋白的特异性抗体片段(如scFv)、或者是I型胶原蛋白弹性蛋白或小纤维蛋白1的特异性抗体片段(如scFv)作为靶向成分，以将TNF-α、IL-1以及IL-12/IL-23的拮抗剂递送到疾病部位。较佳的抗II型胶原蛋白抗体可结合至关节中的原生II型胶原蛋白，但不会和在原纤维组装过程中会被切除的N-端与C-端原肽(propeptide)结合。较佳的抗聚集蛋白聚糖抗体可结合至整个原生的α-聚集蛋白聚糖分子，而不会和其被切除并进入血液循环中的片段结合。藉由采用本发明分子构建体，以抗II型胶原蛋白的scFv作为靶向成分，相较于传统的抗TNF-α、抗IL-1与抗IL12/IL-23的IgG，本发明治疗剂在疾病部位的比例应该较高，而在不相关的正常组织(特别是淋巴器官)的比例则较低，故因此副作用较少。
I-(ii) 牛皮癣
大多数的牛皮癣或斑块状牛皮癣患者主要会在皮肤出现发炎症状，而不会出现在其他组织与器官。牛皮癣患者最主要的症状是皮肤某些部分的细胞出现角质化的现象。全身性地投予抗TNF-α、抗IL-12/IL-23与抗IL-17或抗IL-17受体(抗IL-17R)的单克隆抗体或其他抗发炎药剂(如抗IL-6)，会导致上文所讨论的多种副作用。已有许多文献记录了这些免疫调解抗体的严重副作用。
许多膜蛋白或细胞外蛋白(如丝聚合蛋白(filaggrin)、I型胶原蛋白)在皮肤组织的表达量远高于在其他组织的表达量，因此想要将治疗剂运送到皮肤部位时，可以考虑用这些蛋白作为目标蛋白。丝聚合蛋白存在于细胞间的紧密接合处，而当抗体进到罹病组织内时，就可以接触到这些蛋白。虽然I型胶原蛋白也存在于骨基质以及许多身体部位中，其在皮肤真皮层中的含量极高。
患病的角质细胞所造成的发炎反应会导致牛皮癣的症状，想要缓减此类发炎反应，不一定要让抗发炎抗体药物和角质细胞接触。角质细胞位于皮肤最外层的表皮层中；血管、汗腺以及胶原纤维位于皮肤中层的真皮层中，而最里层的下皮层主要是脂肪组织。上述三层构成了厚度约2至3厘米的人类皮肤。若利用I型胶原蛋白的特异性scFv将抗发炎抗体运送到真皮层，抗体就可以扩散至其他层中。或者是，抗体可以将发炎性细胞因子困在上述三种皮肤层中。
亦可利用存在于真皮-上皮接面的某些蛋白作为靶标，以将治疗剂携带至皮肤。这些蛋白包括VII型胶原蛋白、第XVII型胶原蛋白以及层连结蛋白第5、6或10型。真皮-上皮接面是将皮肤的表皮层与真皮层接合的组织区域。表皮基底层中的基底细胞透过半胞小体(hemidesmosomes)的丝状纤维固定到基底膜。真皮的乳突层细胞藉由锚原纤维连接至基底膜，锚原纤维是由VII型胶原蛋白所组成。XVII型胶原蛋白是表达在角质细胞上的跨膜蛋白(亦称为BP180)，属于半胞小体的结构成分，半胞小体是位于真皮-上皮基底膜区域的多蛋白复合物，其可介导角质细胞与下方膜的连接。层连结蛋白存在于是基底膜中，属于结构性的非胶原蛋白糖蛋白。在多种层连结蛋白中，第5、6与10型对位于分层上皮下方的基底层有特异性。
I-(iii) 全身性红斑狼疮、皮肤狼疮或干燥综合症
全身性红斑狼疮(SLE)是一种自体免疫疾病，涉及多种自体抗原，譬如核酸、组织蛋白以及其他核蛋白。干燥综合症也是自体免疫疾病，患者的免疫系统攻击外分泌腺(特别是用以产生唾液与泪液的唾腺与泪腺)造成眼睛干燥或口干等症状，进而导致感染与多种其他问题。这些疾病好发于女性，特别是处于生育年龄(即，15至30岁)的女性；一般来说女性的发生率比男性高出九倍。SLE是全身性的免疫结缔组织疾病，且会影响许多器官与组织。一般来说，这些组织与器官(如心脏、肺、膀胱与肾脏)具有弹性且可扩张与收缩，也都含有胶原蛋白网络。在多种类型的SLE中，皮肤都会出现明显的发炎症状。
在BAFF的特异性人单克隆抗体-贝利木单抗(belimumab)核准问世前，有长达50年以上的期间，都没有任一种单一的制剂能够治疗SLE。然而，贝利木单抗对SLE的疗效非常有限。此外，贝利木单抗会导致一系列副作用，包括严重感染的感染率较高，且治疗组的死亡率也高于安慰剂组。值得注意的是，在以贝利木单抗治疗干燥综合症的第二期临床试验中，其疗效优于对SLE的疗效。
除了BAFF之外，研究人员也一直在寻找其他的SLE治疗剂。虽然目前还无法在SLE的病理过程中找出任一种主要的发炎性细胞因子，但已有许多研究观察到，受到干扰素刺激而引发的一系列下游事件中，涉及一群基因的表达，又称为第一型干扰素标志(type 1interferon signature)。已知SLE的致病机转和类铎受体7与9(TLR7与TLR9)有关，上述TLR会诱导一群基因的标表达，这些基因与受到IFN-α活化的基因相近。
SLE的临床试验中使用了几种IFN-α的特异性单克隆抗体，包括隆利珠单抗(rontalizumab)、西法木单抗(sifalimumab)以及阿利弗鲁单抗(anifrolumab)。由于IFN-α涉及到多种生理功能，全身性地投予抗IFN-α抗体而没有将其靶向疾病部位可能会导致严重的副作用。
I-(iv) 炎性肠病
抗TNF-α抗体(如阿达木单抗)亦经许可用于治疗克罗恩氏病与溃疡性结肠炎(炎性肠病的一种形式)。然而，如上文所述，施用抗TNF-α抗体会导致多种副作用，包括严重的感染性疾病以及B细胞淋巴瘤。因此，在以抗TNF-α抗体治疗罹患克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的患者时，较理想的状况应该是让所投予的抗TNF-α抗体主要分布在小肠与结肠处。已知第III型与V型胶原蛋白在小肠与大肠的结缔组织中含量非常丰富。
II 肿瘤
目前已针对不同临床阶段的恶性肿瘤(包括液态与实体瘤以及原发或转移性肿瘤)开发出多种不同类型的治疗剂，其中有些已用于动物模型实验，另外有些则正在进行人体临床试验；还有一些已经取得政府主管机关的核准而可用于治疗患者。上述治疗剂包括(1)多种化合物，这些化合物主要针对重要的细胞调控路径或结构组件，或可破坏DNA或重要的细胞机器(cellular machinery)；(2)某些类型的细胞的表面抗原的特异性抗体或某些肿瘤相关抗原的特异性抗体，且上述抗体可介导目标细胞的细胞凋亡、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体介导的细胞溶解(CMC)；(3)某些肿瘤相关抗原的特异性抗体，其可和强力细胞毒性药物复合；(4)免疫调节性细胞因子，如干扰素-α(IFN-α)、白介素-2(IL-2)或IFN-γ，其能够活化免疫系统以对抗恶性细胞；(5)靶向B、T淋巴细胞某些细胞表面标记的抗体，譬如抗CD20抗体—立妥昔单抗(rituximab)；(6)靶向生长因子受体的抗体，譬如抗HER2/Neu抗体—曲妥珠单抗以及抗EGFR抗体—西妥昔单抗(cetuximab)；(7)靶向血管内皮生长因子-A(VEGF-A)以抑制血管新生的抗体，譬如贝伐单抗(bevacizumab)；以及(8)结合至免疫检查点的抗体，譬如抗PD-1(CD279)抗体—如尼伏鲁单抗(nivolumab)、抗PD-L1(CD274)抗体—如MPDL3280A、抗CTLA4(CD152)抗体—如伊匹木单抗(ipilimumab)，这类抗体可抑制免疫反应的负向反馈，且能够让进行中的免疫反应保持持续活化的状态。
用来治疗癌症以及多种其他疾病的治疗剂的疗效常常受限于治疗剂本身的毒性，因为这些药剂也可能在正常细胞上发会某种程度的效果。因此，许多治疗剂的治疗窗口非常有限，而为了要控制药物的毒性，许多患者仅能接受次优剂量的治疗；就药物疗效的角度而言，这种次优剂量无法达到令人满意的治疗效果。
目前本领域正积极研究以抗体药物复合体的方式来治疗这些疾病，采用此种方式时，利用靶向抗体来辨识表达肿瘤相关抗原的细胞，且需使靶向抗体连同其所携带的细胞毒性药物一起内化进入上述细胞内。此一条件使得抗体药物复合体的应用受到了限制，因为一个肿瘤内的各个细胞所表达的肿瘤相关抗原密度可能不同；而在治疗过程中，目前的抗体药物复合体可能无法毒杀表达量较低的细胞，而一旦治疗停止后，这些细胞就会再次生长。
II-(i) 扩散性肿瘤
II-(i)-A 以源自于白血球的癌细胞为靶标
在所有类型的癌症中，有相当高比例是因淋巴样与骨髓样细胞系的细胞发生恶性转化所衍生的癌症。一般来说，此类肿瘤是扩散性的，而不是实体瘤。因此，要靶向由白血球衍生的肿瘤时，需要针对个别的肿瘤细胞进行靶向。因此，对于由白血球衍生的肿瘤，关键之一在于找出肿瘤细胞上表达的细胞表面抗原。
一般可将衍生自白血球细胞(白血球)的肿瘤分成三类：(1)发生在血液与骨髓中的白血病、(2)发生在淋巴系统中的淋巴瘤、以及(3)发生在骨髓许多部分中以及血液中的骨髓瘤。
白血病又有四大类：(1)急性淋巴细胞性白血病(ALL)、(2)慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、(3)急性骨髓性白血病(AML)、以及(4)慢性骨髓性白血病(CML)。然而，随着检验与分析法的进步，又出现的新的白血病类型，譬如目前已知有B细胞CLL、T细胞CLL、B细胞前淋巴细胞性白血病(prolymphocytic leukemia)、多毛细胞白血病(Hairy cell leukemia)以及其他类型。
淋巴瘤则可分为两类：(1)霍奇金氏淋巴瘤以及(2)非霍奇金氏淋巴瘤。罹患淋巴瘤的患者约有12％是霍奇金氏淋巴瘤患者，而其他则属于非霍奇金氏淋巴瘤患者。非霍奇金氏淋巴瘤大多是衍生自B细胞，且因此有许多B细胞非霍奇金氏淋巴瘤亚型。其他的非霍奇金氏淋巴瘤则是T细胞淋巴瘤。
骨髓瘤是衍生自可产生抗体的浆细胞，故亦称为浆细胞瘤。骨髓瘤细胞可见于骨髓中，也可能进入血液循环并在骨头的许多部分中开始生长，所以骨髓瘤亦称为多发性骨髓瘤。
虽然白血病、淋巴瘤以及骨髓瘤是衍生自骨髓样细胞、淋巴样细胞以及浆细胞，肿瘤类型的诊断却非常复杂，通常要检视组织与细胞，并对采样的肿瘤细胞进行组织学、免疫组织学、型态学以及细胞标记等分析。由于骨髓样细胞系以及淋巴样细胞系属于多能干细胞，前者可分化成颗粒细胞(如嗜中性白血球(neutrophils)、嗜酸性白血球(eosinophils)和嗜碱性白血球(basophils))、单核球(monocytes)与巨噬细胞(macrophages)、以及血小板；而后者则可分化为B细胞与T细胞；这些细胞会经过许多分化与成熟步骤，而在任一个分化过程中都可能发生恶性转化。此外，癌性转化可能会助长或新增某些性状，也可能减轻或失去某些性状。
在先天性与后天性免疫的研究中，要辨别多种白血球细胞与免疫细胞时，常常会运用或必须用到各种表面标记或分化抗原，特别是被指派了分化丛集(cluster ofdifferentiation，CD)编号的标记或抗原。在多数情形中，会使用一组标记来辨识一特定的细胞类型。
在运用抗体来治疗源于白血球细胞的癌症时，需要辨识欲靶向的肿瘤的表面标记。然而，即便是在经诊断罹患同一类肿瘤的患者间，表面标记的密度也可能有极大的差异。
II-(i)-B 衍生自B细胞的淋巴性白血病与淋巴瘤上的表面标记
ALL和CLL都不是实体瘤。ALL是衍生自淋巴母细胞、前驱B细胞、前驱T细胞或B细胞。ALL是由以下免疫表型亚型所组成：(1)前驱B细胞急性淋巴母细胞性白血病与前驱T细胞急性淋巴母细胞性白血病，前者会表达与B细胞前驱细胞相关的细胞表面标记，而后者则会表达前驱T细胞的标记；(2)伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)，此种淋巴瘤是衍生自生发中心(germinal center)的B细胞，且会表达与B细胞相关的细胞表面标记；以及(3)急性双表型白血病(acute biphenotypic lymphoma)，此种白血病会表达淋巴样以及骨髓样细胞两者的标记。
CLL亦称为B细胞CLL(B-CLL)，因为CLL大多衍生自B细胞。因此，ALL和CLL间在细胞起源上的主要差异为ALL是衍生自淋巴母细胞(淋巴母细胞是B细胞与T细胞间的共同前驱细胞)，而CLL则是衍生自B细胞。一患者体内所有的CLL都是源自于可表达特定VH与VL的单一个B细胞。CLL细胞可表达CD19与CD20，且特别是CD5与CD23。
霍奇金氏淋巴瘤的特征之一是里德-史登堡氏细胞(Reed-Sternberg cells)，此类细胞是衍生自B细胞的多核巨型细胞。基于里德-史登堡氏细胞的型态以及淋巴结生物检体样本中反应性细胞浸润的组成，可将霍奇金氏淋巴瘤分成以下四种亚型：(1)结节硬化型(nodular sclerosing)、(2)混合细胞型(mixed-cellularity)、(3)淋巴细胞优势型(lymphocyte-rich or lymphocytic predominance)以及(4)淋巴细胞削减型(lymphocytedepleted)。已知霍奇金氏淋巴瘤是衍生自成熟B细胞。随着免疫表型的不同，霍奇金氏淋巴瘤细胞可表达以下一或多种分化丛集标记：CD15、CD20、CD30、CD79a与CD138。非霍奇金氏淋巴瘤绝大多数是衍生自B细胞。已知有至少14种B-细胞非霍奇金氏淋巴瘤亚型。
B淋巴细胞是抗原-特异性抗体的来源，也是后天免疫系统抵抗感染性病原的关键之一。然而，B细胞也可能导致多种疾病。B细胞产生不需要的免疫球蛋白会造成自体免疫与过敏性疾病；而当B细胞的增殖失控时则会导致淋巴瘤或白血病。已证实可利用B细胞作为靶标，来治疗多种自体免疫疾病以及B-细胞系相关的癌症。许多研究采用削减B-细胞的策略来治疗B细胞疾病和抗体诱发的疾病，其中有些已取得初步成果或正在积极进行相关试验。举例来说，有些治疗性抗体可靶向人类B-细胞表面抗原，如CD19、CD20、CD22、CD37、CD79a/CD79b和同型特异性Ig受体(isotype-specific Ig receptor)。这类抗体中有一些能够造成B细胞溶解，另外还有一些抗体和细胞毒性药物复合后会导致B细胞溶解。
多发性骨髓瘤亦称为浆细胞骨髓瘤，是排在非霍奇金氏淋巴瘤后第二常见的血液疾病，其发生率占所有癌症的1％，死亡率则占所有癌症的2％。多发性骨髓瘤会产生大量的骨髓瘤蛋白并占据骨髓而导致一连串的症状，包括骨头疼痛、贫血、肾衰竭、感染以及神经方面的问题。多发性骨髓瘤是衍生自恶性转化的浆细胞，而浆细胞又是从B淋巴细胞分化而来。然而，多发性骨髓瘤细胞却不会表达最常见的B细胞标记，如CD19、CD20与CD22等。
目前已有一些实验性或已核准的疗法与药物可用以治疗多发性骨髓瘤；包括皮质类固醇、化疗、蛋白酶体抑制剂与免疫调节化合物等。
II-(i)-C 以独特B细胞抗原Igα、Igβ与migis-δ作为抗体靶标
成组的Igα(CD79a)/Igβ(CD79b)表达在B-细胞系的细胞表面上，以形成B细胞受体(BCR)复合体。Igα/Igβ是一种异二聚体穿膜蛋白，它是由两条不同的Igα与Igβ链所组成，两者间以双硫键形成稳定的结构。Igα/Igβ会和BCR形成复合体，而当BCR复合体识别抗原之后，就会产生信号。在B细胞成熟的发展过程中，在前-B细胞期中就会表达Igα/Igβ，这个时间点比和B-细胞系上表达型态相关的CD20的表达来得早。由于Igα/Igβ是在B细胞上表达，且也会在大多数非霍奇金氏淋巴瘤上表达，本领域已将Igα/Igβ视为使用B细胞削减疗法来治疗非霍奇金氏淋巴瘤的理想靶标。
mIgD与mIgM会共同表达在成熟B细胞的表面上并可作为BCR的一部分。mIgD带有独特的migis-δ肽区段(27个氨基酸)，这是mIgD膜锚定区段的细胞外部分，且位于CH3区域和穿膜区段之间。某些研究指出migis-δ多肽提供了一种抗原部位，可用以靶向表达mIgD的B细胞。此部位仅见于表达mIgD的B细胞，而不会出现在分泌的IgD上。
II-(i)-D T细胞肿瘤
各种类型的T淋巴细胞藉由其表面分子与分泌因子而介导非常复杂的免疫调节活动，这些免疫调节活动所构成的网络影响了诸多体液与细胞级免疫功能，包括制造不同类型的抗体、分泌多种细胞因子以及产生细胞毒性T细胞与其他细胞溶解性细胞。许多自体免疫疾病的根源来自T细胞针对自身成分或细胞的异常反应。以I型糖尿病为例，自体免疫T细胞会攻击胰脏兰氏小岛中负责产生胰岛素的β细胞并导致细胞死亡。破坏性较强的自体免疫疾病主要是由T细胞所造成的，上述疾病如全身性红斑狼疮、多发性硬化与炎性肠病。另外，对于器官或组织移植的排斥反应主要也是由T细胞所造成。
另外还有一些T细胞相关的疾患形式。因此，也有些研究着重于透过调节T细胞活性或移除T细胞来研发药物。目前在动物模型或人类临床试验中，已运用多种针对T细胞表面抗原(包括CD3、CD4、CD8、CD25与CD28)的抗体及其修饰物来治疗多种上述人类疾病。有些抗体单独或和细胞毒性药物复合后可造成特定类型的目标T细胞溶解。另外则有些抗体可导致T细胞进入闲置、不活动的状态，而不会溶解细胞。
T淋巴细胞对于调控先天性与后天性免疫反应中多种免疫细胞与多种其他细胞类型非常重要。在针对目标淋巴细胞开发治疗药剂时，以T细胞为靶标而成功开发出来的药剂少于以B细胞为靶标的药物。然而，已研发出越来越多以不同T细胞表面抗原为靶标的治疗性抗体。可利用针对T细胞表面抗原进行靶向的抗体来治疗衍生自T细胞的恶性肿瘤。也可以利用抗体来抑制或促进T细胞活性来进行调控。
II-(i)-E 骨髓性白血病
急性骨髓性白血病(AML)是衍生自骨髓样干细胞骨髓性母细胞，此类细胞是成熟颗粒细胞以及单核细胞的前驱细胞。有许多AML亚型都是突变剂所造成的，这些突变剂会导致某些基因区段的转位或缺失。衍生自不同分化阶段的AML细胞会表达一或多种下列表面标记：CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD36、CD41、CD61、CD64、CD65与CD11c。衍生自早期前驱骨髓样阶段的AML细胞会表达CD34与CD33，这两种标记分别是多能干细胞的表面标记以及未成熟骨髓样细胞的标记。衍生自多种骨髓样分化阶段的AML细胞会表达CD15，这是成熟母髓样细胞的标记。CML是纯系骨髓干细胞(clonal bone marrow stem cell)疾病，这是由干细胞或骨髓样干细胞的恶性转化所造成的，此类恶性转化通常和染色体易位(又称为费城染色体易位)有关。
II-(ii) 实体瘤
II-(ii)-A 实体瘤与肿瘤相关抗原
相较于正常细胞，不同类型的肿瘤细胞在其细胞表面会大量表达某些抗原。这些抗原称为肿瘤相关抗原。举例来说，胰脏癌患者和多种消化道癌症(包括大肠结肠癌、食道癌与肝细胞癌)患者的血清样本中含有CA19-9抗原(糖抗原19-9，又称Sialyl LewisA抗原)。此类肿瘤细胞会在细胞表面上的细胞外基质表达CA19-9。相似地，卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌与其他癌症患者的血清样本中会有高量的CA125(糖抗原125，又称黏蛋白16)，而这些肿瘤细胞会表达CA125。与细胞表面相关的糖蛋白黏蛋白1(MUC1)的过表达通常和结肠癌、乳癌、肺癌和胰脏癌有关。
衍生自神经外胚层的肿瘤与肉瘤会大量表达神经节苷脂GD2，此类肿瘤包括神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、黑色素瘤、小细胞肺癌、脑瘤，骨肉瘤、横纹肌肉瘤、儿童与青少年的尤英氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)以及纤维肉瘤、平滑肌肉瘤与其他成人的软组织肉瘤。
虽然正常间皮细胞上也会表达间皮素，在多种人类癌症患者的肿瘤细胞也会表达间皮素；上述癌症如间皮瘤、胰脏癌、卵巢癌、肺癌与胃癌、胆管癌与三阴性乳癌。
Tn抗原是糖蛋白上的结构成分，其中的N-乙酰半乳胺糖(N-acetylgalactosamine，GalNAc)会透过醣苷键而连接到丝氨酸或苏胺酸而形成O-聚糖。在此类抗原上加入单一个单醣基团即可得到双醣抗原；譬如以半乳糖取代为(Gal(b1-3)GalNAc)，可得到汤姆森-弗里德里基抗原(Thomsen-Friedenreich antigen，又称TF抗原或T抗原)；以唾液酸取代为(Neu5Ac(a2-6)GalNAc则得到唾液酸-Tn抗原(STn抗原)。TN与唾液酸通常不会出现在健康的细胞表面，但会出现在癌细胞上。
目前有许多研究着重于以肿瘤相关抗原作为肿瘤标记或免疫疗法的靶标，这些肿瘤相关抗原包括(1)上皮生长因子受体(EGFR)，如人类上皮生长因子1(EGFR或HER1)、HER2、HER3、HER4或其变异株；(2)糖蛋白，如CA19-9(带有Sialyl LewisA抗原)、CA125(带有黏蛋白16或MUC 16)、细胞表面相关黏蛋白1(MUC1)或癌胚抗原、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)或间皮素；(3)黏蛋白关联Tn或唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)；(4)血型Lewis相关LewisY、Sialyl LewisY、Sialyl LewisA或LewisX；(5)醣神经脂质，如Globo H或阶段特异性胚胎抗原(SSEA-4)；或(6)神经节苷脂，如GD2、GD3、GM2、岩藻糖基化GM1或Neu5GcGM3。
II-(ii)-B 以生长因子、肽类激素与细胞因子作为过表达受体的细胞的靶向试剂
许多生长因子、肽类激素与调控性细胞因子可调控人体内一些重要的生理作用。这些物质藉由和不同类型T细胞上的受体互动而发挥作用。其中最重要的是位于器官、身体部位或带有特定功能受体的器官中的内分泌与外分泌细胞，这些细胞可对生长因子、激素或细胞因子做出回应。举例来说，胰脏的外分泌细胞带有特定受体，在进食与消化过程中，这些受体可对来自十二指肠与胃部的分泌素、胃泌素与胆囊收缩素做出反应。
当带有受体的细胞发生恶性转化时，肿瘤细胞仍会表达这些受体。事实上，在许多情形中，由于细胞发生某些突变，可能会导致受体大量表达，而在正常细胞中则不会表达如此大量的受体。因此，受影响的细胞会发生恶性转化。肿瘤细胞上的受体过表达(譬如在大多数的神经内分泌肿瘤上会表达大量的生长抑素受体)以及利用这些受体来进行治疗与诊断(譬如放射性显影)都是相关领域研究的重点之一。神经内分泌肿瘤通常较罕见，但其范围涵盖非常多种源自不同细胞的肿瘤，包括胃肠胰神经内分泌肿瘤、甲状腺肿瘤、默克细胞癌(Merkel cell carcinoma)、肾上腺髓质肿瘤以及许多其他肿瘤。
此一领域的研发方向很多，多项研究证实上皮生长因子受体(EGFR)家族会过表达在乳癌、肺癌、结肠癌以及多种其他上皮癌(carcinoma)细胞上。举例来说，HER2/Neu受体的特异性单克隆抗体—曲妥珠单抗已广泛地用于治疗HER2-阳性乳癌。EGFR的特异性西妥昔单抗则已用于治疗转移性结肠癌、转移性非小细胞肺癌以及头颈部癌。小分子抑制剂，诸如吉非替尼(gefitinib)与厄罗替尼(erlotinib)，可以扰乱EGFR中的酪胺酸激酶区域，因此可以用来治疗多种类型的癌症。
胰脏癌是最难缠的癌症。虽然胰管上皮细胞仅占了所有胰脏细胞的10％，但衍生自外分泌细胞的胰腺(胰管或侵略性的)癌占了各类型胰脏癌中的85％。外分泌细胞可表达肽类激素受体，例如由胃部与十二指肠细胞分泌的胃泌素、分泌素或胆囊收缩素；上述外分泌细胞会回应这些激素，并分泌碳酸氢根离子与消化酵素。针对胰脏癌以及其他许多癌症，可利用CCK与胃泌素受体的过量表达作为放射性显影靶标。目前的研究重点还包括其他激素与受体，譬如生长抑素与释放胃泌素的多肽。在这类放射性显影方法中，会将CCK或胃泌素的多肽类似物和作为放射性核种的螯合基团复合。由于原位或转移性肿瘤会带有可表达相应受体的细胞，于显影过程中，显影剂会和这些细胞结合。目前也有一些实验将带有放射性核种(如177Lu、90Yt或111In)的肽类激素或其类似物用于肿瘤治疗。
II-(ii)-C 以免疫检查点作为靶标
CTLA-4是一种可向下调控免疫系统的蛋白受体。CTLA-4存在于T细胞表面，而当其和带有CD80(B7-1)或CD86(B7-2)等表面抗原的细胞结合时，就无法和负责活化免疫反应的CD28结合，因此可“关闭”免疫反应。CTLA-4的特异性人类IgG1抗体—伊匹木单抗已经核准可用于治疗黑色素细胞瘤，目前也有一些临床试验将其用于治疗其他类型的癌症。由于伊匹木单抗会促进T细胞活性与增殖，已知伊匹木单抗疗法会引发一些严重且可能致命的免疫副作用。
活化的T细胞表面上会表达PD-1。当PD-1和其配体PD-L1结合后，T细胞会失去活性。这是身体调控免疫系统，以防止过度免疫反应的机制。许多癌细胞会产生PD-L1，且因而使T细胞失效进而使T细胞无法攻击癌细胞。已有两种抗PD-1的人类抗体(派姆单抗(pembrolizumab)与尼伏鲁单抗)取得上市许可，能够用于治疗对其他药物没有反应且无法切除或转移性的黑色素母细胞瘤与非小细胞肺癌。MPDL3280A也是抗PD-L1抗体，目前正在进行治疗三阴性乳癌、转移性非小细胞肺癌、膀胱癌与肾细胞癌的二期或三期临床试验。目前正在研发或进行早期临床试验的抗PD-1与抗PD-L1抗体数目也非常多。
许多研究人员也在探索其他靶标，以期能够使失去活性的T细胞再度发挥功用，上述靶标譬如经活化T细胞上的OX40、CD137与CD27及其相应的配体，如OX40L、CD137L与带有CD137抗原的细胞或肿瘤细胞。一般认为这些路径对T-细胞活化的强度低于CTLA-4与PD-1等路径。
虽然PD-1或PD-L1的特异性抗体似乎可以用来治疗多种癌症，目前的临床研发显示这些抗体需要搭配化疗、其他抗体或标靶治疗。此外，这些抗体也会导致许多严重的副作用。本发明人认为，若可将免疫检查点的特异性抗体携带至目标肿瘤位置，可以达到较佳的疗效且副作用也会减少。
II-(ii)-D 以血管内皮生长因子作为靶标
当肿瘤生长时，需要血管内皮生长因子A(VEGF-A)才能进行血管生成作用(angiogenesis)。氧气与养分的供应、废弃物排出以及多种其他生理功能都需要血液循环。VEGF-A的特异性抗体(如贝伐单抗)可单独用于治疗某些癌症，或可和化疗并用。然而，贝伐单抗会产生多种副作用，包括高血压以及高出血风险、肠穿孔与坏死性筋膜炎。
II-(ii)-E 以免疫调节细胞因子作为癌症治疗剂
在本说明书中，免疫调节细胞因子系指已知能够刺激或驱动免疫反应的成分。所述的细胞因子包括(IL-2、IFN-α)、IFN-γ与TNF-α；其中IFN-α是一种较强的T细胞活化物，IFN-α已取得核准可用于治疗多毛细胞白血病、与后天免疫不全症候群相关的卡波西氏肉瘤(AIDS-related Kaposi's sarcoma)、滤泡淋巴瘤、慢性骨髓样白血病以及黑色素母细胞瘤。然而，目前并没有临床试验结果显示这些免疫调节细胞因子能有效治疗实体瘤，这主要是因为当全身性给药时，这些细胞因子的给药剂量会受限于细胞因子的副作用。一般来说，细胞因子主要会在淋巴样系统的微环境中作用
III 骨质疏松症
RANKL又称CD254，是细胞核因子κB受体激活剂(RANK)的配体；地诺单抗(denosumab)是RANKL的特异性抗体，经核准可用于治疗骨质疏松症。地诺单抗的研发是骨质疏松症治疗的一大进步。然而，投予地诺单抗会导致一些常见的副作用，诸如尿道与呼吸道感染、白内障、便秘、红疹与关节疼痛等等。因此需要将此一治疗药剂主要带往骨头的位置。
RANKL是一种膜蛋白，属于肿瘤坏死因子配体家族成员之一。在肺部、胸腺与淋巴结可侦测到大量的RANKL。在骨髓、胃、周边血、脾脏、胎盘、白血球、心脏、甲状腺与骨骼肌中的含量则较低。由于抗RANKL IgG，如地诺单抗，可作为骨质疏松症的治疗药剂，本发明所述的分子构建体应该会是比传统抗RANKL IgG更为优异的治疗药剂。
由SOST基因编码的硬化蛋白(sclerostin)也可以作为开发治疗骨质疏松症抗体的靶标。这是一种由骨细胞制造与分泌的糖蛋白，会负向调控骨母细胞骨骼生成(osteoblastic bone formation)。SOST基因的缺失或缺陷性突变会导致渐进式的骨骼增厚。另一种形式的SOST基因缺陷性突变会促进骨骼生成作用。抗硬化蛋白抗体也会促进骨骼生成作用、提升骨质密度，而使得骨骼更为强壮。布索珠单抗(blosozumab)与罗莫珠单抗(romosozumab)都是人源化抗硬化蛋白单克隆抗体，这两种抗体的第一期与第二期临床试验显示，抗体治疗可提升骨质密度与骨骼生长作用，且会降低骨再吸收作用。
有鉴于上述说明，本公开提出了两大类的分子平台，其可用以建构本发明所述的T-E分子。第一大类是以“接合单元”构型为基础(参见下文第一至第四节)；另一大类是以“Fc”构型为基础(参见下文第五至第八节)。下文提供了与这两种构型结构相关的叙述，也讨论了这些分子构建体实际的应用潜力。
第一节 含肽核的多臂接合物
本公开的第一方面是关于一种接合单元，其包含：(1)一中心核，其包含2-15个赖氨酸(K)残基；以及(2)2-15个连接臂，分别连接于中心核的各K残基。本发明中心核的特征在于其N-或C-端带有叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。
在制备本发明接合单元时，将一端带有N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimydil，NHS)基且另一端带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG链连接到K残基上；具体来说，利用上述NHS基和K残基上的氨基形成酰胺键，进而将PEG链连接到中心核上。在本公开中，将连接到K残基之后的PEG链称为连接臂，此连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基。
根据本公开的实施方式，上述中心核是多肽，其长度为8-120个氨基酸残基，且包含2至15个赖氨酸(K)残基，其中每一个K残基和下一个K残基之间以一填充序列隔开。
根据本公开的实施方式，填充序列包含甘氨酸(G)与与丝氨酸(S)残基；在较佳的情形中，填充序列是由选自G、S及其组合的2-15个残基所组成。举例来说，填充序列可以是：
GS、
GGS、
GSG、
GGGS(SEQ ID NO:1),
GSGS(SEQ ID NO:2)、
GGSG(SEQ ID NO:3)、
GSGGS(SEQ ID NO:4)、
SGGSG(SEQ ID NO:5)、
GGGGS(SEQ ID NO:6)、
GGSGGS(SEQ ID NO:7)、
GGSGGSG(SEQ ID NO:8)、
SGSGGSGS(SEQ ID NO:9)、
GSGGSGSGS(SEQ ID NO:10)、
SGGSGGSGSG(SEQ ID NO:11)、
GGSGGSGGSGS(SEQ ID NO:12)、
SGGSGGSGSGGS(SEQ ID NO:13)、
GGGGSGGSGGGGS(SEQ ID NO:14)、
GGGSGSGSGSGGGS(SEQ ID NO:15)或
SGSGGGGGSGGSGSG(SEQ ID NO:16)。
两个赖氨酸残基之间的填充序列可以由各种长度和组合的甘氨酸与丝氨酸残基所组成。在赖氨酸残基数目较少的多肽中，可使用较长的填充序列；在赖氨酸残基数目较多的多肽中，则可使用较短的填充序列。除了甘氨酸与丝氨酸之外，可在填充序列中加入亲水性氨基酸残基，如天冬胺酸与组胺酸。除了由甘氨酸与丝氨酸残基组成的填充序列之外，也可使用其他填充序列，譬如可使用常见人类血清蛋白(如白蛋白与免疫球蛋白)中的可挠性、可溶性环。
根据本公开某些较佳的实施方式，中心核包含2-15个单元的G1-5SK序列。或者是，此多肽的序列为(GSK)2-15；即，多肽包含至少两个连续的GSK单元。举例来说，本发明中心核可包含下列氨基酸序列：
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSK(SEQ ID NO:17)、
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK(SEQ ID NO:18)或
Ac-CGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSK(SEQ ID NO:19)，
其中Ac代表乙酰基。
根据本公开某些实施方式，中心核是序列为(Xaa-K)n的多肽，其中Xaa是聚乙二醇化氨基酸，其具有2至12个乙二醇(EG)重复单元，且n是2至15的整数。
如上文所述，本发明中心核的特征在于其N-或C-端带有叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。根据本公开某些实施方式，本发明中心核的N-或C-端氨基酸残基带有叠氮基或炔基。带有叠氮基的氨基酸残基可以是：L-叠氮高丙氨酸(AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸。举例来说，本发明中心核可具有以下序列：
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-AAH-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、
Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-AAH、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C或
Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH，
其中Xaa是带有所述数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，Ac代表乙酰基，而AAH代表AHA残基。
带有炔基的氨基酸的例子包括，但不限于：L-高炔丙基甘氨酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-HPG)、或β-高炔丙基甘氨酸(β-HPG)。在本例中，本发明中心核可具有以下序列：
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-GHP-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、
Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-GHP、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C或
Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP，
其中Xaa是带有所述数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，Ac代表乙酰基，而GHP代表HPG残基。
当可理解，目前已可透过商业管道取得多种侧链带有叠氮基或炔基的氨基酸与聚乙二醇化氨基酸，这些氨基酸可以带有保护基团，如叔丁氧羰基(t-boc)或茀甲氧羰基(Fmoc)，故可轻易用于固态多肽合成。
根据本公开某些实验例，所用的中心核可包含以下序列：
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSK(SEQ ID NO:21)、
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSK(SEQ ID NO:22)、
Ac-AAHGGSGGSGGSKGSGSKGSK(SEQ ID NO:23)、
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSGSC(SEQ ID NO:24)、
Ac-C-Xaa2-K-Xaa2-K-Xaa2-K(SEQ ID NO:25)或
Ac-C-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K(SEQ ID NO:26)、
其中Xaa为带有指定数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸、Ac代表乙酰基、AAH代表AHA残基且GHP代表HPG残基。
或者是，本发明中心核可和耦合臂连接，此耦合臂的自由端(即，未和中心核连接的一端)带有一官能基(如，叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)。在这些情形中，本发明中心核的N-或C-端为半胱氨酸残基。在制备与耦合臂连接的接合单元时，将一端带有顺丁烯二酰亚胺基且另一端带有上述官能基的PEG链与上述半胱氨酸残基连接；具体来说，可透过PEG链的顺丁烯二酰亚胺基和半胱氨酸残基的巯基之间的巯基-顺丁烯二酰亚胺反应将两者连接在一起。在本公开中，连接到中心核末端半胱氨酸残基上的PEG链称为耦合臂，且其自由端带有上述官能基。
在较佳的情形中，耦合臂的自由端带有四嗪基或高应力炔基。这些耦合臂具有2-12个EG单元。根据本公开的实施方式，上述四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪1,2,4,5-四嗪或其衍生物。高应力炔基的实施例包括，但不限于：反式-环辛烯(TCO)、二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、二环壬炔(BCN)与二苯并环辛炔(DICO)。根据本公开某些实施方式，四嗪基为6-甲基-四嗪。
根据多种实施例，与耦合臂连接后的中心核包括，但不限于：
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4以及
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4。
或者是，中心核的一端带有叠氮基或炔基，而另一端则接上了带有四嗪基或高应力炔基的耦合臂，兹举例如下：
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH、
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
高应力炔基-Xaa2-12-C(AC)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP以及
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP。
也可利用重组技术来合成上述多肽，再利用细菌或哺乳类宿主细胞来表达指定的基因区段。如果多肽的赖氨酸残基数目较多且长度较长，利用重组蛋白技术较佳。这是因为当多肽长度变长时，使用固态合成法发生错误的机率会增加，且其纯度和/或产量会降低。要运用细菌或哺乳类宿主细胞来产生多肽时，可在两个K残基之间插入长度为2至20个氨基酸残基的填充序列。此外，由于AHA和HPG并非可由遗传密码子编码的天然氨基酸，这些重组多肽的N-端或C-端残基可以是半胱氨酸。在表达出重组蛋白并将其纯化之后，可使末端的半胱氨酸残基和短的双功交联物反应；上述双功交联物的一端带有可和半胱氨酸残基的SH基反应的顺丁烯二酰亚胺基，另一端则带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基。
相较于利用常规氨基酸(如甘氨酸与丝氨酸残基)来合成多肽，使用聚乙二醇化氨基酸来合成多肽的步骤较少。此外，可采用不同长度的聚乙二醇化氨基酸(即，带有不同EG重复单元者)，一方面可提供可挠性与水溶性，另一方面亦可在相邻的赖氨酸残基之间提供间隔。除了聚乙二醇化氨基酸之外，中心核也可包含人工氨基酸，如D-构型氨基酸、高氨基酸、N-甲基氨基酸等。在较佳的情形中，可使用带有不同长度聚乙二醇(PEG)的聚乙二醇化氨基酸来建构中心核，因为氨基分子中所含的PEG部分可提供构型上的可挠性，并在用以接合的基团间提供了适当的间隔，还可以提升其水溶性；另外，一般来说，PEG的免疫源性较低。合成带有聚乙二醇化氨基酸的中心核的方法和合成常规多肽相似。
视需要，本发明中心核还可带有一乙酰基，以保护位于N端的氨基酸残基，进而提升其稳定性。
当可理解，连接于中心核的连接臂的数目主要取决于连接于中心核中所含赖氨酸残基的数目。由于本发明中心核包含至少两个赖氨酸残基，所述接合单元可包含多个连接臂。
参照图1A。如图所示，接合单元10A包含中心核11a，其带有一个HPG(GHP)残基以及四个赖氨酸(K)残基，其间分别以填充序列(以下各图式中以“···”表示)隔开。HPG残基和K残基之间或任两个K残基之间的填充序列可以是相同或不同的氨基酸序列。在本实施例中，四个连接臂20a-20d藉由NHS基和赖氨酸残基的氨基间所形成的酰胺键而连接到各个赖氨酸残基。当可理解，本说明书所述的多种接合单元间可能有一些共通的特征，因此针对上述接合单元10A或下述各接合单元所述的某些或全部特征可能也适用于下文提出的实施例，除非其明显有悖于特定实施方式的脉络。为求简洁，下文可能不会重复说明这些共通特征。
图1B绘示了根据本公开另一种实施方式的接合单元10B。中心核11b有一个半胱氨酸(C)残基以及六个赖氨酸(K)残基，这些残基之间分别以填充序列隔开。在本实施例中，接合单元10A包含连接到各个赖氨酸残基的六个连接臂20a-20f。根据本公开的实施方式，连接臂是具有2至20个EG重复单元的PEG链。
接合单元10B与图1A的接合单元10A不同之处在于接合单元10B还包含耦合臂60。如上文所述，可利用一端带有顺丁烯二酰亚胺基而另一端带有一特殊官能基的PEG链来形成耦合臂60。如此一来，耦合臂60可透过巯基–顺丁烯二酰亚胺反应而连接到中心核11b的半胱氨酸残基。在本实施例中，耦合臂60的自由端带有的特殊官能基是四嗪基72。根据本公开的实施方式，耦合臂是具有2至12个EG重复单元的PEG链。
当需要在目标部位释放效应组件时，可以在连接臂中加入一个可裂解键；上述裂解键可经酸/碱水解、还原/氧化或酵素作用而裂解。举例来说，可利用NHS-PEG2-20-S-S-顺丁烯二酰亚胺作为此处所述的耦合臂，这是一种可裂解PEG链，其中的S-S双硫键会被缓慢的还原，而NHS基可用来和中心核的氨基接合，进而将PEG链连接到中心核上。另外，可利用叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基来取代位在连接臂自由端的顺丁烯二酰亚氨基。
根据本公开某些实施方式，连接到中心核的K残基的连接臂在自由端带有顺丁烯二酰亚胺基。如此一来，带有巯基的功能性组件(譬如、靶向组件或效应组件)就可以和连接臂的顺丁烯二酰亚胺基进行巯基–顺丁烯二酰亚胺反应，进而将功能性组件连接于连接臂。为了方便说明，和连接臂相连的功能性组件称为第一组件。当可理解，本发明接合单元可携带的第一组件的数目取决于中心核的K残基的数目(且因此，取决于连接臂的数目)。因此，本发明所属技术领域具有通常知识者可调整所述接合单元中第一组件的数目，以达到所欲的目标或治疗效果。
图1C绘示了带有第一组件的接合单元10C。除了下文所述的特征之外，图1C和图1B非常相似。首先，中心核11d带有五个K残基，且因此有五个连接臂20a-20e分别与这些K残基相连。其次，接合单元10C有五个第一组件30a-30e，分别连接于各个连接臂20a-20e。如下文所述，视需要加入的四嗪基72使得所述接合单元可和一额外的功能性组件或另一个分子构建体(参见下文第三或第七节)复合。
为了要进一步增加所需的效果(如，疗效)，本发明接合单元除了第一组件之外还可以包含第二组件。举例来说，第二组件可以是靶向组件或效应组件。在本公开可任选的实施方式中，第一组件是效应组件，而第二组件可以是另一种效应组件，两者可以累加地或加乘地作用，亦可独立作用。在另一种例子中，第一与第二组件可发挥不同的性质；譬如，第一组件是靶向组件，而第二组件是效应组件，反之亦然。或者是，第一组件是效应组件，而第二组件则能够改善接合单元的药动学特性，如水溶性、清除率(clearance)、半衰期与生物利用率(bioavailability)。
根据本公开的一实施方式，第一组件是靶向组件，其能够将本发明接合单元特异性地靶向病灶部位；第二组件是效应组件，一旦本发明接合单元到达病灶部位后，其可发挥治疗效果。举例来说，在治疗扩散性肿瘤时，本发明接合单元可含有多个靶向组件(即，第一组件)与一个效应组件(即，第二组件)。在本例中，上述靶向组件可特异性地靶向扩散性肿瘤上所表达的细胞表面抗原(譬如CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b)；而所述效应组件(譬如，CD3或CD16a的特异性抗体片段)则可招募T细胞或NK细胞以毒杀肿瘤细胞。
根据本公开的替代性实施方式，第一组件是效应组件且第二组件是靶向组件。举例来说，在治疗自体免疫疾病时，本发明接合单元可包含一个靶向组件与多个效应组件，其中靶向组件能够特异性靶向组织相关细胞外基质蛋白(譬如α-聚集蛋白聚糖、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白与XI型胶原蛋白)，而效应组件可在病灶部位发挥治疗效果。
在结构上，第二组件可连接到中心核N-或C-端的叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。具体来说，当有需要时，可将第二组件和短PEG链(较佳为具有2至12个EG重复单元)复合，之后再将其连接到位在N-或C-端的带有叠氮基或炔基的氨基酸残基(譬如AHA残基或HPG残基)。或者是，当有需要时，可将第二组件和短PEG链复合，且之后再将其连接于中心核的耦合臂。
根据本公开某些实施方式，中心核的N-或C-端是带有叠氮基(譬如AHA残基)的氨基酸残基；且因此，带有炔基的第二组件就可以透过“铜催化的叠氮化物-炔环加成反应”(CuAAC，又称为点击反应)而连接到中心核的N-或C-端。根据本公开其他实施方式，上述中心核的N-或C-端是带有炔基(譬如HPG残基)的氨基酸残基；而带有叠氮基的第二组件就可以透过CuAAC反应而连接到中心核的N-或C-端。CuAAC反应如反应式1所示。
《反应式1 CuAAC反应》
CuAAC反应会产生1,5-二取代1,2,3-三唑。炔基和叠氮基之间的反应选择性极高，且天然生物分子不含炔基和叠氮基。再者，上述反应快速且对pH值不敏感。已知除了利用一价铜(如溴化铜(I)或碘化铜(I))来催化链接反应之外，较佳可使用二价铜和还原剂(如抗坏血酸钠)的混合物以在反应系统中原位(in situ)产生一价铜。或者是，可利用不含铜的反应，将第二组件连接到中心核的N-或C-端，此反应可利用五甲基环戊二烯基氯化钌复合物(pentamethylcyclopentadienyl ruthenium chloride complex)作为催化剂，以催化叠氮基-炔环加成反应。
图1D绘示根据本发明实施例的另一种接合单元，其携带了多个第一组件与一个第二组件。在本实施例中，中心核11c包含一个HPG(GHP)残基以及五个赖氨酸(K)残基。五个连接臂20a-20e分别连接到中心核11c的五个K残基；而五个第一组件30a-30e则透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应连接到各个连接臂20a-20e。除了第一组件之外，所述接合单元10D还包含一个第二组件50，其系连接于短PEG链62的一端。在和中心核11c复合之前，短PEG链62的另一端带有叠氮基。如此一来，叠氮基可和带有炔基的HPG残基进行CuAAC反应，而使得第二组件50连接至中心核11c。图1D所示的实心圆点40代表HPG残基和叠氮基间因为CuAAC反应所形成的化学键结。
或者是，第二组件透过耦合臂而和中心核连接。根据本公开某些实施方式，耦合臂带有四嗪基，因此可透过逆电子需求狄尔斯-阿德(iEDDA)反应(参见反应式2)而有效率地连接到带有TCO的第二组件。根据本公开其他实施方式，耦合臂带有TCO基，而第二组件可带有四嗪基，故两者可透过iEDDA反应而互相连接。相较于位在端点的炔基，iEDDA反应中所采用的应变环辛烯基的活化能明显较低，且因此iEDDA反应不需使用额外催化剂。
接着参照图1E，其中中心核11d包含位于N端的半胱氨酸(C)残基和五个赖氨酸(K)残基。如图1E所示，这五个连接臂20a-20e分别连接到中心核11d的五个K残基，而五个第一组件30a-30e则透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应而分别连接到五个连接臂20a-20e。半胱氨酸残基连接于耦合臂60；在接上第二组件之前，耦合臂60的自由端带有四嗪基或TCO基。在本实施例中，第二组件50可和带有相应TCO或四嗪基的短PEG链62连接，再透过iEDDA反应而连接到耦合臂60。图1E所示的椭圆点70代表耦合臂60和短PEG链62间进行iEDDA反应所产生的化学键结。
《反应式2 iEDDA反应》
根据本公开其他实施方式，在和第二组件接合之前，耦合臂带有叠氮基；当第二组件和自由端带有高应力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)的短PEG链连接时，耦合臂和第二组件就可以透过SPAAC反应(参见反应式3)而连接，反之亦然。
接着参照图1F，其中接合单元10F的结构和图1E的接合单元10E相近，不同之处在于耦合臂60带有叠氮基或高应力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)而不是四嗪基或TCO基。因此，第二组件50要和带有相应高应力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO)或叠氮基的短PEG链62连接，而使得第二组件50和耦合臂60可透过SPAAC反应而连接。图1F所示的菱形点90代表耦合臂60与短PEG链62之间因为SPAAC反应所形成的化学键结。
《反应式3 SPAAC反应》
反应式4为制备本发明接合单元的例示性流程。在步骤1，先制备中心核，其氨基酸序列包含(GSK)3，且C端为L-叠氮高丙氨酸(AHA)残基。在步骤2，透过在NHS基与氨基间形成酰胺键，而将三个连接臂分别连接到中心核的赖氨酸(K)残基，连接到中心核的连接臂在自由端带有顺丁烯二酰亚胺(Mal)基。在步骤3，透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应将三个抗A抗原scFv(scFvαA)连接到各连接臂上，此处的scFvαA即为第一组件。同时，在步骤4，将一个抗B抗原scFv(scFvαB)和自由端带有DBCO基的短PEG链连接，上述短PEG链有4个EG重复单元，此处的scFvαB即为第二组件。最后，在步骤5，透过SPAAC反应将第二组件连接到中心核的AHA残基。
《反应式4 透过连接臂与C-端氨基酸残基连接两种不同scFv的接合单元的制备方法》
反应式5绘示制备本发明接合单元的另一种例示性流程。在步骤1，先制备中心核，其氨基酸序列包含(K-Xaa)3且C-端有一半胱氨酸残基。在步骤2，将一端带有顺丁烯二酰亚胺(Mal)基另一端带有四嗪基的PEG链(作为耦合臂)透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应连接到半胱氨酸残基。之后，在步骤3，将三个连接臂分别连接到中心核的赖氨酸(K)残基。接着，如步骤4所示，透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应将三个抗A抗原scFv(scFvαA)连接到各连接臂上，此处的scFvαA即为第一组件。同时，在步骤5，将一个抗B抗原scFv(scFvαB)和自由端带有TCO基的短PEG链连接，上述短PEG链有3个EG重复单元，此处的scFvαB即为第二组件。最后，在步骤6，透过iEDDA反应将第二组件连接到耦合臂。
《反应式5 透过连接臂与耦合臂连接两种不同scFv的接合单元的制备方法》
聚乙二醇化(PEGylation)是将PEG链附接或连接到分子(如，药物或蛋白)的方法。聚乙二醇化可以改善多种重要的药理学特性，譬如提升水溶性、延长生命周期以及减少蛋白质分解降解。根据本公开一实施方式，第二组件是PEG链，其分子量约为20,000到50,000道尔顿。
图1G绘示了另一种例示性的接合单元10G，其中五个第一组件30分别透过连接臂20连接到赖氨酸残基，且中心核11e的AHA(AAH)HPG(GHP)残基透过CuAAC反应与PEG链80连接。图1G所示的实心圆点40代表AHA残基与PEG链80间因为CuAAC反应所形成的化学键结。
图1H是本公开的另一种实施例，接合单元10H的中心核13的N-端是与耦合臂60相连接的半胱氨酸残基。可透过iEDDA反应而有效率地将PEG链80连接到耦合臂60。接合单元10H的椭圆点70代表耦合臂60与PEG链80之间因为iEDDA反应所形成的化学键结。
图1I是本发明接合单元的另一种实施例，所示的接合单元10I结构与图1G的接合单元10G相似，不同之处在于PEG链80是透过SPAAC反应连接到耦合臂60。图1I所绘示的菱形点90代表耦合臂60与PEG链80之间因为SPAAC反应所形成的化学键结。
根据本公开某些实施方式，除了第一与第二组件之外，本发明接合单元还包含第三组件。在此种实施例中，中心核的N-或C-端是带有叠氮基或炔基的氨基酸残基，而另一端是半胱氨酸残基。中心核的赖氨酸残基分别和连接臂相连接，且每一条连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基；而中心核的半胱氨酸残基则和自由端带有四嗪基或高应力炔基的耦合臂相连。如此一来，第一组件可透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应连接于连接臂，而第二组件则可透过iEDDA反应和耦合臂相连接。另外，第三组件则是透过CuAAC反应或SPAAC反应而连接到带有叠氮基或炔基的末端氨基酸残基。
第一、第二与第三组件可以彼此相同或不同，端视设计者的需求。根据本公开一实施方式，所述接合单元可带有两种不同的靶向组件与一种效应组件、两种不同的效应组件与一种靶向组件；或是一种靶向组件、一种效应组件和一种能够提升接合单元药动学特性(水溶性、清除率、半衰期与生物利用率)的组件。
接着参照图1J的接合单元10J，其中心核11f的N-端为HPG(GHP)残基，而C-端是半胱氨酸残基。连接臂20和耦合臂60分别连接到中心核11f的赖氨酸(K)残基以及半胱氨酸(C)残基。此外，五个第一组件30分别连接到五个连接臂20，第二组件(即，PEG链)80透过短PEG链62和耦合臂60连接，而第三组件50则连接到HPG残基。实心圆点40代表HPG残基和短PEG链62之间因为CuAAC反应所形成的化学键结；而椭圆点70代表耦合臂60与PEG链80之间因为iEDDA反应所形成的化学键结。
图1K绘示了本公开的另一种实施方式；接合单元10K的结构与图1J所示的接合单元10J相似，不同之处在于短PEG链62是透过SPAAC反应而连接到HPG残基，而非透过iEDDA反应。图1K的菱形点90代表短PEG链62和HPG残基之间因为SPAAC反应所形成的化学键结。
在本公开较佳的实施方式中，连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基，以便和带有巯基的第一组件透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应而连接。此外，多肽的一端可以是半胱氨酸残基或带有叠氮基或炔基的氨基酸残基，以供和耦合臂接合，进而连接第二组件。
本发明所属技术领域具有通常知识者当可想见，可对上述结构进行各种修改。举例来说，在连接臂的自由端可采用顺丁烯二酰亚胺基以外的官能基(譬如叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)，以便透过CuAAC、iEDDA或SPAAC反应来连接第一组件。此外，半胱氨酸残基(或带有叠氮基或炔基的氨基酸残基)可以位在多肽N-或C-端以外的位置。更有甚者，可在多肽中加入二或更多个上述残基，以供接合多个耦合臂，并进一步连接多个第二组件。
第二节 含肽核的多臂接合物的用途
相较于既有的治疗性构建体，第一节所述的接合单元至少有以下的优点：
(1)可以视需求和/或用途来调整功能性组件的数目。根据不同用途的需求，本发明接合单元可包含二种组件(即，第一与第二组件)或三种组件(即，第一、第二与第三组件)，上述需求包括欲治疗的疾病、接合单元的给药方法、接合单元所携抗体的结合力与亲合力等等。举例来说，当要将接合单元直接投递到特定组织/器官(譬如，治疗眼睛)时，可以只使用一种组件作为效应组件，而不需加入靶向组件。然而，当透过周边给药途径来投递接合单元时，譬如经口服、肠胃道、鼻腔、局部或黏膜给药、或以肌肉内、静脉内或腹膜内注射，本发明接合单元就需要包含靶向组件，以便将接合单元特异性地靶向病灶部位；此外，接合单元还应该包含效应组件，以便在病灶部位发挥治疗效果。为了要提高接合单元的靶向或治疗效果或提升其稳定度，本发明接合单元还可进一步包含第三组件；所述的第三组件可以是第二种靶向组件、第二种效应组件或PEG链。
(2)第一组件是以成束(bundle)的形式存在。如本公开第一节所述，第一组件的数目取决于中心核所包含的赖氨酸残基的数目。如果中心核中赖氨酸残基的数目是2到15，则每一接合单元可带有至少两个第一组件。因此，相较于传统治疗性构建体仅能携带单一个分子(譬如单一个细胞毒性药物或抗体分子)，本发明接合单元可同时提供更多的功能性组件(不论是靶向组件或效应组件)，进而可大幅提升疗效。
在某些治疗应用中，可能想要采用单一份的靶向或效应组件。举例来说，可以使用细胞外基质蛋白的scFv作为靶向组件，并由其携带由多个可中和促发炎性细胞因子的scFv所构成的药束，此时，可能仅需要单一份细胞外基质蛋白的特异性scFv，以避免因为靶向组件结合力太强而导致不理想的副作用。在另一个例子中，当使用CD3或CD16a的特异性scFv来招募T细胞或NK细胞以毒杀肿瘤细胞时，可利用多个肿瘤相关抗原的特异性scFv所组成的药束作为靶向组件，当这些肿瘤相关抗原的特异性scFv结合到目标肿瘤细胞的表面时，仅需要一份的效应组件(如，CD3或CD16a的特异性scFv)即可达到治疗效果，这也避免因为CD3或CD16a交联而产生的不良副作用。在又一种例子中，可能想要加入单一份的长链PEG，以提升接合单元的药动学特性；因为使用两个或更多的长PEG链可能会使得PEG链缠结而影响靶向或效应组件的结合力。
有鉴于上述优点，本公开的第二方面是关于本发明接合单元的应用。具体来说，本公开提供了可治疗多种疾病(包括免疫疾病、扩散性肿瘤、实体瘤、骨质疏松症与老年性黄斑变性)的方法；所述方法包含对有需要的个体投予治疗有效量的上述接合单元。
本发明接合单元可治疗的第一类疾病是免疫疾病。适用于治疗免疫疾病的例示性接合单元所所含的第一组件是促发炎细胞因子或细胞因子受体的特异性抗体片段、或细胞因子的特异性可溶性受体；而其所含的第二组件是组织特异性细胞外基质蛋白的特异性抗体片段。
根据一实施方式，本发明接合单元适用于治疗牛皮癣，此接合单元所含的第一组件是TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或IL-17受体的特异性scFv；而其所含的第二组件是I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。
根据另一实施方式，本发明接合单元适用于治疗全身性红斑狼疮(SLE)、皮肤狼疮或干燥综合症，此类接合单元所含的第一组件是BAFF的特异性scFv；而其所含的第二组件是I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。
某些皮肤疾病会在皮肤出现明显的发炎症状，如异位性皮肤炎(atopicdermatitis)、寻常性天疱疮(pemphigus vulgaris)与多种荨麻疹(urticaria)等，但一般不会用TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或BAFF的特异性抗体来治疗这些疾病，因为这些抗体的治疗效果不佳。当可想见，若是使得上述抗发炎抗体能聚集在皮肤部位，这些抗发炎抗体就能够治疗所述皮肤疾病。
根据另一种实施方式，本发明接合单元可用以治疗类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎。在某些实施方式中，第一组件是TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、IL-17、IL-6R或IL-17E的特异性scFv；而第二组件是II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性scFv。
根据进一步的实施方式，本发明接合单元适用于治疗炎性肠病(譬如克罗恩氏病与溃疡性结肠炎)，此种接合单元所包含的第一组件是TNF-α的特异性scFv；所含的第二组件是III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv。
在治疗扩散性肿瘤(如，急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤与骨髓瘤)时，本发明接合单元的第一组件是与扩散性肿瘤相关或于其上表达的细胞表面抗原的特异性抗体片段；而本发明接合单元的第二组件是细胞表面抗原CD3或CD16a的特异性抗体片段。根据本公开的实施方式，与扩散性肿瘤相关或于其上表达的细胞表面抗原是CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138或CD319。
在治疗B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病时，所用的第一组件是CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b的特异性scFv，而第二组件是CD3或CD16a的特异性scFv。
于治疗浆细胞瘤或多发性骨髓瘤时，可使用CD38、CD78、CD138或CD319的特异性scFv作为第一组件，且可使用CD3或CD16a的特异性scFv作为第二组件。
衍生自T细胞的淋巴瘤或白血病的治疗可使用CD5、CD30或CD43的特异性scFv作为第一组件，且可使用CD3或CD16a的特异性scFv作为第二组件。
于治疗骨髓性白血病时，第一组件是CD33或CD34的特异性scFv，而第二组件是CD3或CD16a的特异性scFv。
本发明接合单元可治疗的另一类疾病是实体瘤，譬如黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌或头颈部鳞状细胞癌。根据本公开的实施方式，本发明接合单元的第一组件可以是肽类激素、生长因子或是肿瘤相关抗原的特异性scFv，而第二组件是细胞表面抗原CD3或CD16a的特异性scFv。
根据本公开的实施方式，肽类激素为分泌素、胆囊收缩素(CCK)、生长抑素或促甲状腺素(TSH)。
在本公开的实施方式中，生长因子可选自以下物质组成的群组：上皮生长因子(EGF)、突变型EGF、表皮调节素、肝素结合上皮生长因子(HB-EGF)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及肝细胞生长因子(HGF)。
根据一实施方式，肿瘤相关抗原可选自以下物质组成的群组：人类上皮生长因子受体-1(HER1)、HER2、HER3、HER4、糖抗原19-9(CA 19-9)、糖抗原125(CA 125)、癌胚抗原(CEA)、黏蛋白1(MUC 1)、神经节苷脂GD2、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、间皮素、黏蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原、Globo H、阶段特异性胚胎抗原(SSEA-4)以及上皮细胞黏附分子(EpCAM)。
在某些例子中，某些肿瘤相关抗原会由个体的实体瘤脱落而进入其循环系统中。在这些情形中，本发明用以治疗实体瘤的方法包含以下步骤：(a)对该个体进行血液透析程序，此程序使用一或多种肿瘤相关抗原的特异性抗体，以移除由肿瘤脱落并进入个体循环中的上述一或多种肿瘤相关抗原；以及(b)投予本发明用以治疗实体瘤的接合单元。
在治疗骨质疏松症时，本公开的第一组件是细胞核因子κB受体激活剂配体(RANKL)的特异性scFv，而第二组件则是I型胶原蛋白或骨结合素的特异性scFv。
根据本公开的实施方式，本发明接合单元可用以治疗老年性黄斑变性(AMD)，此接合单元所含的第一组件是VEGF-A的特异性scFv，而第二组件则是分子量为20,000至50,000道尔顿的长PEG链。
第三节 具有靶向部分及效应部分的分子构建体
本公开的另一种方面是关于包含至少两个接合单元的分子构建体。除了本公开第一节所述的含肽核的多臂接合单元之外，所述分子构建体亦可使用一或多个具有化合物核(参见下文)的接合单元作为其接合单元。根据本公开某些实施方式，本发明分子构建体的至少一个接合单元包含多肽。在较佳的情形中，本发明分子构建体的至少两个接合单元包含多肽。在更佳的情形中，本发明分子构建体的所有接合单元分别包含多肽。
(i)具有化合物核的接合单元
除了本公开第一节所述的述接合单元之外，此处亦揭示了另一种接合单元，其使用化合物(而非多肽)作为中心核。具体来说，所述化合物可以是苯-1,3,5-三胺、2-(氨基甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺、三(2-氨基乙基)胺、苯-1,2,4,5-四胺、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-联苯、四(2-氨基乙基)甲烷、四(乙胺)肼、N,N,N’,N’,-四(氨基乙基)乙二胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺或N,N-二[(1-氨基-3,3-二氨基乙基)戊基]甲二胺。上述化合物均带有至少三个相等或对称构型的氨基。因此，当一化合物的其中一个氨基与一耦合臂复合时，所有由该化合物形成的分子都具有相同的构型。
此处所述的化合物和本公开第一节所述的接合单元相似，都分别包含多个氨基，且因此，可将多个带有NHS基的PEG链透过氨基和NHS基之间所形成的酰胺键而连接到化合物核上；利用此方式接上来的PEG链即为本案所述的连接臂，此连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基。同时，所述化合物核有至少一个氨基连接到另一PEG链，此PEG链一端带有NHS基且另一端带有一特殊官能基(如，叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)；化合物核与此种PEG链同样透过酰胺键结来连接，接上后的此一PEG链称为耦合臂，其自由端带有上述特殊官能基。
因此，可透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应将一种组件连接到连接臂上，并透过CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA反应将另一种组件连接到耦合臂上，进而将两种不同的组件分别连接到连接臂和/或耦合臂上。
根据本公开某些实施方式，连接臂是具有2至20个EG重复单元的PEG链，而耦合臂则是具有2至12个EG重复单元的PEG链。在一实施方式中，连接臂和耦合臂都具有12个EG重复单元，其中在接合前，耦合臂的一端是NHS基，而另一端是炔基。
反应式6、7分别绘示了中心核和连接臂之间以及中心核和耦合臂之间的连接关系，其中NHS代表NHS酯类、Mal代表顺丁烯二酰亚胺基、azide代表迭氮基且alkyne代表炔基。
《反应式6 将分别带有顺丁烯二酰亚胺基与叠氮基的连接臂与耦合臂连接到中心核》
《反应式7将分别带有顺丁烯二酰亚胺基与炔基的连接臂与耦合臂连接到中心核》
作为中心核的化合物应有多对称且有相同方向的氨基，其理由如下：当利用其中一个氨基来连接一个双功接合臂(即，一端带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基且另一端带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基)时，可以得到均质的产物(也就是接有耦合臂的中心核，且耦合臂带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基)，故可轻易将其纯化。之后可利用此种产物来制备多臂接合单元，将剩余的氨基都接上自由端带有顺丁烯二酰亚氨基或其他耦合基团的连接臂。若带有多个氨基的化合物是不对称的化合物，此种化合物和双功接合臂/耦合臂接合后所得到的产物就不是均质的产物。
可进一步修饰上述对称化合物，以使得其可和更多的连接臂/耦合臂连接。举例来说，四(2-氨基乙基)甲烷是可从一般化合物合成或商业购得的化合物，可利用此种化合物来建构连接了四个连接臂/耦合臂的接合单元。将四(2-氨基乙基)甲烷和双硫代琥珀酰亚胺辛二酸酯(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)进行缩合反应，所得到的产物是N,N-二[(1-氨基-3,3-二氨基乙基)戊基]甲二胺，此一产物有两个四(2-氨基乙基)甲烷单元，并可用以连接六个连接臂/耦合臂。此处所述的接合单元分别带有三个、四个与六个连接臂/耦合臂，对于建构具有靶向/效应分子的联合接合物(joint-linker)来说，上述连接臂/耦合臂的数目应相当充足。
当可理解，连接臂和/或耦合臂的数目还有与其连接的组件数目都取决于中心核中所含的氨基数目。在某些较佳的实施方式中，连接臂/耦合臂的数目还有与其连接的组件数目是1到7个。
参照图2，其中绘示了带有四个氨基的苯-1,2,4,5-四胺；其中三个氨基分别和连接臂20相连，而另一个氨基则和耦合臂60相连，且耦合臂60的自由端带有叠氮基。之后，透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应将三个第一组件30分别连接到三个连接臂20上，并透过CuAAC反应将一个第二组件50连接到耦合臂60上。图2中所示的实心圆点40代表耦合臂60与第二组件50之间因为CuAAC反应所形成的化学键结。
(ii)由联合接合物构型组成的分子构建体
根据本公开某些实施方式，所述分子构建体包含两个接合单元，且这些接合单元间透过CuAAC反应(以铜或环戊烷基环戊二烯基氯化钌复合物为催化剂)、SPAAC反应或iEDDA反应彼此连接。在一些实施方式中，两个接合单元中其中一个连接有多个第一组件(作为靶向组件)，而另一个连接有多个第二组件(作为效应组件)。
根据本公开其他实施方式，所述分子构建体包含三个接合单元，其中第一与第二接合单元彼此透过iEDDA反应而连接，而之后再透过CuAAC反应将第三接合单元接合到第一或第二接合单元。或者是，第一与第二接合单元彼此透过iEDDA反应连接，而第三接合单元则透过SPAAC反应而接到第一或第二接合单元。在一些实施方式中，第一、第二与第三接合单元分别带有多个第一、第二与第三组件，其中第一、第二与第三组件彼此不同。根据一实施方式，上述三种组件(即，第一、第二与第三组件)中的其中两种是靶向组件，而另一种则是效应组件。根据另一实施方式，三种组件组件中有两种是效应组件，而另一种是靶向组件。根据又另一种实施方式，三种组件中有一种是靶向组件、第二种组件是效应组件，而另一种组件则可改善所述分子构建体的药动学特性，如水溶性、清除作用、半衰期与生物利用率。
首先参照图3A至3D，这些图分别绘示了两个接合单元之间的连接方式。图3A所示的分子构建体包含两个接合单元(100A、200A)，彼此间透过iEDDA反应连接。第一接合单元100A包含第一中心核110a、连接臂120(下称第一连接臂)以及耦合臂130a(下称第一耦合臂)，其中连接臂与耦合臂分别以一端连接于第一中心核110a。相似地，第二接合单元200A包含第二中心核210a、连接臂220(下称第二连接臂)以及耦合臂230a(下称第二耦合臂)，其中连接臂与耦合臂分别以一端连接于第二中心核210a。耦合臂130a、230a其中之一的自由端带有四嗪基，而另一个的自由端则带有TCO基。具体来说，若耦合臂130a的自由端(即，未连接到第一中心核110a的一端)带有四嗪基152，则耦合臂230a的自由端(即，未连接到第二中心核210a的一端)就带有TCO基154，反之亦然。因此，这两个接合单元(100A与200A)就会透过发生在耦合臂130a与230a的自由端间的iEDDA反应而彼此连接。图3A所示的椭圆点156代表耦合臂130a与230a间因为iEDDA反应而产生的化学键结。
在所绘示的实施方式中，连接臂120、220的自由端各带有顺丁烯二酰亚胺基。因此，各自带有巯基的第一靶向组件140与第一效应组件240就可透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应分别连接到连接臂120、220。
根据一实施方式，图3A所示的第一与第二中心核110a、210a都是多肽。根据另一实施方式，图3A所示的第一与第二中心核110a、210a都是化合物核。根据又一实施方式，图3A所示的第一与第二中心核110a、210a其中之一是多肽，而另一个则是化合物核。
图3B绘示根据本公开的替代性实施方式，其中第一与第二中心核110b、210b都是多肽，且分别透过连接臂120、220跟第一靶向组件140与第一效应组件240相连。本实施方式的特点在于，中心核110b、210b其中之一的N-或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基(譬如AHA残基)，而另一者的N-或C-端则是带有炔基的氨基酸残基(譬如HPG残基)，此种构型使得中心核110a、210a能够直接地彼此连接，亦即，不需透过图3A所示的耦合臂来连接。具体来说，若中心核110b的N-或C-端为带有叠氮基162的氨基酸残基，则中心核210b的N-或C-端为带有炔基164的氨基酸残基，反之亦然。因此，接合单元100B与200B可透过发生在中心核110b、210b的上述N-或C-端氨基酸残基间的CuAAC反应而直接连接。图3B所示的实心圆点166代表上述N-或C-端氨基酸残基间形成的化学键结。
图3C是本公开的另一种实施方式。接合单元100C与200C的结构和接合单元100A与200A类似，不同之处在于耦合臂130b、230b分别带有叠氮基162与DBCO基172，而非如图3A的接合单元100A、200A一般带有叠氮基152与炔基154。具体来说，中心核110a和自由端带有叠氮基162的耦合臂130b(下称第一耦合臂)连接；而中心核210a则和自由端带有DBCO基172的耦合臂230b(下称第二耦合臂)连接。接着，所述接合单元100C与200C可透过发生在耦合臂130b、230b之间的SPAAC反应相连接；两者间形成的化学键结182以菱形表示。
在一实施方式中，图3C所示的第一与第二中心核110a、210a都是多肽。在另一实施方式中，图3C所示的第一与第二中心核110a、210a都是化合物核。在又一实施方式中，图3C所示的第一与第二中心核110a、210a其中之一是多肽，而另一个则是化合物核。
当可理解，两个接合单元也可透过发生在中心核与耦合臂之间的CuAAC反应而彼此连接。接着参照图3D，中心核110b的N-或C-端是带有叠氮基162的氨基酸残基(譬如AHA残基)，而中心核210a与自由端带有TCO基172的耦合臂230b连接。因此，接合单元100B与200C可透过发生在中心核110b与耦合臂230b之间的SPAAC反应而彼此连接；两者间形成的化学键结182以菱形表示。
根据一实施方式，图3D所示的接合单元100B、200C分别包含多肽。根据另一实施方式，图3D所示的中心核100B为多肽，而中心核200C则为化合物核。
或者是，一接合单元200B的N-或C-端为带有炔基的氨基酸残基160b(譬如HPG残基)，且另一接合单元100C包含自由端带有叠氮基160a的耦合臂130b，故两者可透过中心核210b与耦合臂130b之间的CuACC反应而连接。
与其他治疗性构建体相较之下，本发明分子构建体至少有以下三种优点：
(1)可独立制备带有特定数目和/或类型的靶向/效应组件的接合单元，之后再透过CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应将这些接合单元彼此连接在一起；
(2)可基于特定应用的需求(譬如欲治疗的疾病、以及靶向和/或效应组件的结合亲合力和/或亲合力等)，来调整靶向和/或效应组件的数目与种类。可根据具体的需求与应用来调整靶向与效应组件。可随着各种因素，譬如欲治疗的症状、患者的生理状况和/或欲治疗的疾病种类等，来改变本发明靶向与效应组件。临床治疗时，可结合最适当的靶向组件与最适当的效应组件，以便达到最理想的治疗效果。根据本公开的实施方式，靶向组件可以是生长因子、肽类激素、细胞因子或抗体片段；而效应组件可以是免疫调节剂、与放射性核种复合的螯合剂、细胞毒性药物、细胞因子、可溶性受体或抗体片段；以及
(3)在接合任两个接合单元时，此处提出的CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应的接合效率优于其他接合反应。
接着参照图4，可单独制备图中绘示的六个构建体库。在本实施方式中，构建体库1-6分别包含多个接合单元300A、300B、300C、400A、400B与400C，而每一种接合单元连接有不同数目和/或种类的功能性组件。接合单元300A、300B与300C的结构类似；其中接合单元300A、300B与300C各自包含一个中心核310、一条与中心核连接的耦合臂330，且耦合臂330的自由端带有四嗪基350，还有不同数目的连接臂320(如图所示)。举例来说，接合单元300A有四条连接臂320，且因此，有四个靶向组件340a分别连接到这四条连接臂320。相似地，两个靶向组件340b与五个靶向组件340c则分别连接到接合单元300B与300C。靶向组件340a、340b与340c可以相同或不同。至于接合单元400A、400B与400C则分别有一中心核410、一条与其相连的耦合臂430，且耦合臂430的自由端带有高应力炔基450，另外还有不同数目的连接臂420。如图所示，三个效应组件440a、五个效应组件440b以及八个效应组件440c分别连接到接合单元400A、400B与400C。效应组件440a、440b与440c可以相同或不同。可分别制备构建体库1-6。本发明所属技术领域具有通常知识者可以从构建体库1、2与3中选择第一接合单元，并从构建体库4、5与6中选择第二接合单元，接着再透过发生在四嗪基350与高应力炔基450之间的iEDDA反应，而将第一与第二接合单元连接在一起，因此，所得到的分子构建体即具有指定数目的靶向与效应组件。
从上述构建体库的概念出发，可基于所选的构建体库得到具有不同构型的分子构建体。图5A是所述分子构建体的一种实施例，其中第一与第二中心核(310、410)各自连接了三条连接臂(320、420)与一条耦合臂(330、340)。三个第一靶向组件340分别连接到每一连接臂320；而三个第一效应组件440则分别连接到连接臂420。这两个接合单元透过耦合臂330、430间因为iEDDA反应所形成的化学键结356而彼此连接。透过这种构型，所得到的分子构建体可带有多个相同数目的靶向和/或效应组件。
图5B是上述分子构建体的另一种实施例，其中第一与第二中心核分别带有不同数目的氨基(譬如赖氨酸残基)，且因此，所述分子构建体带有不同数目的靶向与效应组件。在图中所示的实施例中，第一中心核310连接有一条耦合臂330与两条连接臂320。第二中心核410则接有一条耦合臂430与五条连接臂420。因此，有两个靶向组件340分别连接到两条连接臂320上；并有五个效应组件440分别连接到五条连接臂420上。图5B中的椭圆点356代表耦合臂330、430之间的键结。
在可选的实施方式中，本发明分子构建体可还包含相对较长的PEG链，此一长PEG链和第一或第二中心核连接，而使得在施用至一个体后，本发明分子构建体可远离网状内皮细胞(reticuloendothelial)系统而能有较长的半衰期。在利用PEG链修饰蛋白质以改善其药动学特性和/或降低免疫源性的时候，较佳可使用分子量最高为20,000-50,000道尔顿的PEG。因此，在本发明较佳的实施方式中，会使用相对较短的PEG链作为连接靶向与效应组件所用的连接臂，而要提升分子构建体在活体内的半衰期时，则会将分子量为20,000到50,000道尔顿的PEG链连接到任一接合单元。
在某些实施方式中，可利用多个scFv片段作为靶向和/或效应组件，以建构本发明分子构建体。对于以含有scFv片段的分子构建体为基础的靶向组件/效应组件药物，其所含的scFv片段的活体内半衰期应该比个别的抗体片段来得长。在某些临床应用中，譬如利用抗TNF-α抗体与抗IL-12/IL-23抗体来治疗类风湿性关节炎、利用抗RANKL抗体来治疗骨质疏松症、以及利用抗VEGF-A抗体来治疗眼部疾病(如老年性黄斑变性)时，药物的半衰期越长越好，因此就不需要经常施用这些药物。对于用于上述适应症的分子构建体，可利用分子量为20,000到50,000道尔顿的PEG链作为连接臂，以连接作为靶向或效应组件的scFv片段。可利用上述长度的PEG来修饰多种治疗性蛋白，以延长其半衰期。
根据本公开某些实施方式，所述接合单元可包含分别连接了不同功能性组件的两条连接臂。参照图6，其中所述分子构建体包含两个接合单元100A与200D。第一与第二功能性组件140、240(一个作为靶向组件，而另一个作为效应组件)分别透过连接臂120与220连接到第一中心核110a与第二中心核210c；而两个中心核110a与210c则透过发生在耦合臂130a与230a间的iEDDA反应彼此连接，其中椭圆点156代表上述反应所形成的化学键结。除了功能性组件240之外，第二中心核210c还连接了一条PEG链260。具体来说，第二中心核210c带有一AHA残基，其可透过SPAAC反应和带有高应力炔基的PEG链260反应并与其相连，其中菱形点182代表由SPAAC反应所形成的化学键结。随着实际应用的情形，第三组件可以是第二靶向组件、第二效应组件或能够改善分子构建体药学特性的组件。根据本公开的一实施方式，PEG链260的分子量约为20,000到50,000道尔顿。
基于以上的概念，一个接合单元可包含复数条连接臂，而这些连接臂可分别和功能性组件连接。举例来说，接合单元可包含5-到12条连接臂，因此可以连接5到12个功能性组件。以小分子药物(如细胞毒性药物或类铎受体(TLR)激动剂)作为功能性组件时，上述特性的优势更为突出。下文将带有多个细胞毒性药物分子的接合单元称为载药束。
此外，可利用多肽中心核来制备包含三个接合单元的分子构建体。因此，本公开的另一方面是关于包含三个接合单元的分子构建体。在所述的三个接合单元中，其中两个接合单元彼此透过iEDDA反应连接，而第三接合单元则可透过SPAAC反应或CuAAC反应连接到另两个接合单元其中任一单元。建构多接合单元(譬如三个接合单元)的主要考虑是可以纳入两种不同的靶向组件或二种不同的效应组件。
接着参照图7，图中所示的分子构建体包含三个接合单元(500、600与700A)。接合单元500、600与700A各自有一个中心核(510、610、710)，而带有功能性组件(540、640、740)的连接臂(520、620、720)则分别与这些中心核相连。接合单元600的特征在于其N-或C-端的半胱氨酸残基和耦合臂630相接，而另一端则是带有叠氮基或炔基的氨基酸残基。在接合前，耦合臂530、630其中之一的自由端带有四嗪基，另一者的自由端则带有高应力炔基。因此，接合单元500、600可透过发生在耦合臂530与630间的iEDDA反应而彼此连接，其连接方式如图3A所示。关于接合单元300的连接方式，当中心核610的N-或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基(譬如AHA残基)时，中心核710的N-或C-端是带有炔基的氨基酸残基(譬如HPG残基)；或者是，当中心核610的N-或C-端是带有炔基的氨基酸残基(譬如HPG残基)时，则中心核710的N-或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基(譬如AHA残基)。因此，接合单元600、700A可透过发生在中心核610与710的N-或C-端氨基酸残基间的CuAAC反应直接彼此连接，而不需透过耦合臂，如图3B所示的连接方式。图7所示的椭圆点560与实心圆点670分别代表因iEDDA反应与CuAAC反应所形成的化学键结。
或者是，三个接合单元中的两个接合单元可透过iEDDA反应彼此连接，而第三接合单元则是透过SPAAC反应连接到另两个单元其中一单元。以图7B为例，接合单元500、600是透过iEDDA反应而彼此连接，其连接方式类似图7A所示；而接合单元700B则是透过中心核610与耦合臂730间的SPAAC反应而连接到接合单元600。图7B所示的菱形点672代表因SPAAC反应而产生的化学键结。
当可理解，随着所欲的应用不同，连接到接合单元100、200、300上的功能性组件540、640、740的数目也可以随之改变。利用图4提出的构建体库概念，可将带有不同数目和/或类型的功能性组件的接合单元分别制备成不同的构建体库，而本发明所属技术领域具有通常知识者就可以根据不同的需求，从多个构建体库中选择适当的二或多个接合单元并将其结合。
基本上，可将上述方面和/或实施方式中所讨论的分子构建体的“一端带有叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基的耦合臂”设计成一条有2至12个EG重复单元的PEG链；而所述的连接臂则是有2至20个EG重复单元的PEG链。
使用多肽作为中心核使得本发明分子构建体具有更大的设计弹性，因为可在单一构建体中携带多份或多种靶向/效应组件；因此能够提升药物递送的特异性以及其在预定目标部位的功效。可利用包含多个接合单元的分子构建体而得到多种不同的构型。举例来说：第一接合单元可携带三个scFv靶向组件，而第二接合单元可携带五个细胞毒性药物；第一接合单元可携带三个scFv靶向组件，而第二接合单元可携带三个scFv效应组件；第一接合单元可携带两个scFv以作为第一组靶向组件、第二接合单元可携带两个scFv以作为第二组靶向组件，而第三接合单元可携带五个细胞毒性药物；第一接合单元可携带两个双特异性scFv靶向组件，而第二接合单元可携带两个scFv效应组件；或第一接合单元可携带三个scFv靶向组件、第二接合单元可携带两个scFv效应组件，并透过连接臂而连接分子量为20,000-50,000道尔顿的长PEG以提升其药动学特性。
在本发明的某些实施方式中，可利用双功PEG作为连接臂，以将作为靶向或效应组件的抗体或其抗原结合片段连接到位于多肽中的氨基。每一条PEG的一端可带有NHS基，另一端则带有顺丁烯二酰亚胺基。NHS基可和多肽中的氨基偶联，而顺丁烯二酰亚胺基则可和抗体的scFv、双特异性scFv或Fab片段的半胱氨酸残基的巯基偶联。可设计scFv与双特异性scFv使其C-端带有一多肽接合链且最末端为半胱氨酸残基。可利用胃蛋白酶(pepsin)裂解完整IgG以得到Fab片段，且可利用温和的还原反应将链间的双硫键反应产生自由巯基。
反应式8-12提供了多种偶联与制备所述接合单元的实施例。
反应式8是根据本公开一实施方式来制备分子构建体的概要反应式，其中NHS代表NHS酯、Mal代表顺丁烯二酰亚胺基、AAH代表L-叠氮高丙氨酸(AHA)残基，AAH代表高炔丙基甘氨酸(HPG)残基、Ac代表乙酰基且scFv代表单链可变片段。在步骤1，分别制备第一中心核与第二中心核，其中第一中心核包含(GSK)3序列且其C-端为AHA残基；而第二中心核序列为(GSK)5且其C-端为HPG。为了使多肽更为稳定，利用乙酰基来修饰第一与第二中心核的N-端。在步骤2，透过形成酰胺键，将每一连接臂分别连接到第一与第二中心核中的赖氨酸残基；连接于中心核的连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基。在步骤3，透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应，将带有巯基(如，半胱氨酸残基)的第一靶向组件(即，抗体)连接到与第一中心核连接的连接臂；相似地，透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应，将带有巯基的效应组件(即，药物)连接到和第二中心核相连的连接臂。在步骤4，透过发生在AHA与HPG残基间的CuAAC反应，将两个接合单元偶联在一起。
《反应式8 透过C-端氨基酸残基来偶联接合单元》
可视需要而利用不同方法将靶向/效应组件连接到中心核上。如反应式9，先将连接臂连接到中心核，之后再透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应将效应组件(即，药物)连接到连接臂上，进而使效应组件与中心核偶联。反应式10则是另一种替代方式，先将效应组件(即，药物)和连接臂相接，以得到连接臂-效应组件复合物(即，PEG-药物)；接着，透过形成于赖氨酸残基与NHS酯之间的酰胺键，将连接臂-效应组件复合物连接到中心核。
《反应式9 透过连接臂将效应组件与多肽偶联》
《反应式10 先将效应组件和PEG链接合后再连接到多肽中赖氨酸残基的氨基》
或者是，联合接合物构型的连接臂也可以用来连接双特异性scFv，其可作为靶向组件或效应组件。这些构型可提升靶向组件的特异性和/或效应组件的有效性。
反应式11是制备本发明分子构建体的一种实施例，此分子构建体包含两个接合单元；每一个接合单元的序列包含(K-Xaa4)3，且其C-端为半胱氨酸(C)残基。在步骤1，将两条耦合臂分别连接到这两个接合单元末端的C残基，其中一条耦合臂一端带有顺丁烯二酰亚胺(Mal)基且另一端带有四嗪基，而另一条耦合臂的两端分别带有Mal基和TCO基。在步骤2，透过在连接臂与K残基间形成酰胺键，将连接臂分别连接到赖氨酸(K)残基。之后，在步骤3，透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应，将三个抗A抗原scFv(scFvαA)与三个抗B抗原scFv(scFvαB)分别连接到这两个接合单元的连接臂。最后，在步骤4，透过发生在四嗪基与TCO基间的iEDDA反应，将两个接合单元彼此偶联。
《反应式11 透过耦合臂间的iEDDA反应来制备分子构建体》
反应式12是制备包含三个接合单元的分子构建体的实施例，其中两个接合单元分别连接了scFvαA与scFvαB，且这两个接合单元彼此透过iEDDA反应而偶联，如反应式11所述；而第三接合单元则透过CuAAC反应和第二接合单元偶联。在本实施例中，第三接合单元是一个载药束。然而，此一反应式也可以适用于选用其他组件(如scFv)的第三接合单元。在本发明例子中，位在中心的接合单元(即，第二接合单元)在其N-端为HPG残基(GHP)，且因此，可透过发生于HPG与AHA残基之间的CuAAC反应，将带有AHA残基(AAH)的载药束连接到第二接合单元。或者是，中心接合单元的N-或C-端可带有AHA残基，若第三接合单元的耦合臂带有DBCO或其他高应力炔基，两者就可以透过SPAAC反应而偶联。反应式12中所示的分子构建体有三种功能性组件：scFvαA、scFvαB与药物分子。此种由三个接合单元组成的分子构建体亦可携带三组scFv，其中两组作为靶向组件而一组作为效应组件，或其中一组作为靶向组件而另两组作为效应组件。
《反应式12 制备由带有三种功能性组件的三个接合单元组成的分子构建体》
当靶向与效应组件都是scFv，且使用600道尔顿(12个EG单元)的PEG链作为连接臂时，此种分子构建体共有六个scFv，且其总分子量约为170,000道尔顿。带有七个scFv的分子构建体的分子量约为200,000道尔顿，而带有八个scFv的分子构建体的分子量为230,000道尔顿。根据本公开所制备的大多数分子构建体的分子量小于200,000道尔顿，有一小部分的分子构建体的分子量介于200,000-250,000道尔顿之间。
当想要建构带有四组不同的scFv的分子构建体时，较佳可使一个接合单元带有接合的单链双特异性scFv(bi-scFv)，譬如scFv1-scFv2(如抗HER2与HER3)，而另外两个接合单元则分别带有一种scFv(即，分别带有scFv3与scFv4)。有两种方法能够建构上述双特异性的scFv1-scFv2。在“串联(tandem)”构型中，抗体片段的排列方式为VL1-VH1-VL2-VH2或VH1-VL1-VH2-VL2；在“双抗体(diabody)”构型中，抗体片段则是排列成VL2-VL1-VH1-VH2或VH2-VH1-VL1-VL2。可在免疫球蛋白区域间加入多肽接合链，如GGGGS(SEQ ID NO:6)重复或其他序列。
由发明人的经验推知，在经过长时间储存后，带有顺丁烯二酰亚胺与叠氮基的多肽或PEG接合链可能会因为顺丁烯二酰亚胺与叠氮基间自发的接合反应而形成聚合物。因此，在较佳的情形中，最好分别制备新鲜的各种接合单元，接着再实时将靶向或效应组件连接到所述接合单元上，并透过链接反应将这些接合单元连接到一起。另一种较佳的实施方式是将靶向组件和效应组件都接合到带有炔基的接合单元上，而后再将其中一种接合单元的炔基转变为叠氮基，譬如可利用一条两端都带有叠氮基的短同型双功接合物。之后就可将分别带有炔基与叠氮基的两种接合单元透过链接反应而偶联。
适用于本发明的连接臂较佳为PEG链。连接臂的长度取决于多种因素。连接臂的长度应足以对所连接的scFv或其他类型的功能性组件提供适当的弹性，使其能够在不受到立体结构限制的情形下，接近目标细胞表面上的目标抗原位置；但连接臂的长度又不应过长，以免造成连接臂和其上连接的scFv片段或功能性组件发生分子间与分子内缠结，或使得分子构建体的分子量过大而无法轻易穿透组织。过长的连接臂可能无法拉动抗原分子以形成较密实的团簇，但在某些细胞凋亡或其他细胞层次的效应中可能会需要此种团簇以启动讯息传导过程。本发明所属技术领域具有通常知识者可在不需过度实验的前提下，针对目标抗原和其结合剂的不同组合类型，决定理想的连接臂长度。依本发明人的经验，以CD20为目标抗原时，可将抗CD20(立妥昔单抗)的Fab片段接合到4-臂PEG接合链上，此时使用约1,000至1,200道尔顿(约25-30个EG单元)的PEG臂即可有效引发细胞凋亡。因此，基于本发明的目的，可使用100至1,000道尔顿的PEG接合链。在根据本公开的多种分子构建体中，较佳的连接臂是NHS-(PEG)12-顺丁烯二酰亚胺(约500道尔顿)。完全伸展后的(PEG)12链长度约为
适用于本发明的连接臂与耦合臂不限于PEG链。举例来说，可使用包含甘氨酸、丝氨酸以及其他亲水性氨基酸残基的多肽、多糖与其他生物可兼容的线性聚合物，并修饰上述高分子使其带有NHS基与顺丁烯二酰亚胺基。
在某些治疗应用中，可能需要将分子构建体的效应组件从连接臂释放出来，而使得效应组件能够进入目标位置的细胞(包括与靶向组件结合的细胞或其周围的细胞)，以引发药学效应。在这些情形中，可在连接臂中加入可裂解键。目前已开发出多种可裂解键，这些可裂解键会因为水解、酸解、还原裂解或酵素裂解等作用而被切开。举例来说，在发炎组织中会出现基质金属蛋白酶，已设计出会受此种酵素作用而裂解的多肽片段，并将其用于建构治疗用构建体。本发明的一实施方式中使用的PEG接合链为NHS-PEG2-12-S-S-顺丁烯二酰亚胺，在邻近顺丁烯二酰亚胺基处设有会被缓慢还原而裂解的S-S双硫键。
根据本公开某些实施方式，上文实施方式中所述的靶向组件可选自以下物质所组成的群组：生长因子、肽类激素、细胞因子与抗体；而效应组件可以是免疫调节剂、与放射性核种复合的螯合剂、细胞毒性药物、细胞因子、可溶性受体或抗体。
在一些实施方式中，所述抗体可采用以下任一种形式：抗原结合片段(Fab)、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、单一区域抗体(sdAb)或双特异性单链可变片段(双特异性scFv)。根据一实施方式，双特异性scFv是双特异性串联scFv或双特异性双抗体scFv。
为了保持分子构建体的扩散能力，其分子量以小于250,000道尔顿为宜。因此，在大多数的实施方式中较佳应采用scFv片段。在DNA层级，可建构基因序列以将VL与VH连接成单一多肽链，其顺序为VL-VH或VH-VL，且两者间以一多肽连接链连接，上述多肽延伸物以甘氨酸与丝氨酸为主要残基，且其长度为10-25个氨基酸。此外，在上述多肽链的C-端加入一段短的延伸物，其包括甘氨酸与丝氨酸，且末端为半胱氨酸。可用以生产上述重组scFv与双特异性scFv的宿主细胞包括：细菌，如大肠杆菌(E.coli)与恋臭假单胞菌(Pseudomonasputida)；酵母菌，如毕氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)；与哺乳动物细胞，如CHO与HEK293细胞系。
本发明人已利用HEK293与CHO细胞产制出大量的IgG抗体、Fab、scFv与各种抗体片段、Fc构型蛋白与其他重组抗体，以供活体外系统与动物模型试验用。本发明人亦已开发出多种细胞系，以产制用于人类临床试验的抗体。在实验室研究阶段，只要使用几个1-2公升的烧瓶，即可轻易地制备HEK293暂时表达系统，进而生产1克左右的IgG或抗体片段。一般来说，适用于本发明所述分子构建体的scFv片段通常不带有糖类修饰，而且糖类修饰也不是scFv与其抗原靶标结合所必须的。更有甚者，所述的scFv片段中只有一个双硫键以及一个位在末端的半胱氨酸残基。因此，也可利用小规模的细菌表达系统来制备scFv。使用大肠杆菌时，可选用能从细胞内包涵体(intracellular inclusion bodies)或周质(periplasm)中收取scFv或可收取分泌性scFv的表达系统。在大多数的情形中，可利用蛋白L(ProteinL)以亲和管柱法来纯化scFv，上述蛋白L可和大多数κ轻链的VH互动；而在其他情形中则可使用离子交换管柱。
根据本发明多个实施例，所述的联合接合物平台主要运用scFv与Fab作为靶向和/或效应组件。然而，亦可从sdAb或其他抗体片段所组成的大型抗体库中筛选出特定的结合分子。有些结合分子并不是以免疫球蛋白区域为基础，但其针对所选的靶标分子有特异性结合亲合力，因而有和抗体类似的功能，这些结合分子包括以下类型：(1)适配体(aptamer)，包含可和目标分子结合的寡核苷酸或短肽；(2)Fyn激酶衍生物(fynomer)，包含衍生自人类Fyn激酶SH3区域的小的结合蛋白；(3)黏合素(affimer)，包含衍生自半胱氨酸蛋白抑制剂(cystatin)家族的结合蛋白；以及(4)经设计的锚蛋白重复蛋白(designedankyrin repeat protein，DARPin)，此类蛋白是利用遗传工程设计，设计出包含三、四或五个由天然锚蛋白衍生的结构的重复区段。上述这些抗体拟似物的分子量约约为10K至20K道尔顿。
也可利用细胞因子、生长因子、肽类激素或其天然物片段或合成类似物来作为靶向或效应组件。亦可使用小分子药作为效应组件，以将其携带到染病的目标细胞或组织；上述小分子药譬如细胞毒性药物(如奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素与喜树碱)和免疫刺激药物(如莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特与加德喹莫特)。CpG寡聚脱氧核苷酸、衍生自某些格兰氏阴性细菌的脂多糖以及衍生自真菌(特别是曲菌属(Aspergillus)与伞菌属(Agaricus)的物种)的葡聚糖(如酵母聚糖与β-D-葡聚糖)具有较强的免疫刺激活性，且亦可作为效应组件。此类免疫刺激物质通常会和多种免疫细胞上的类铎受体结合，并因此活化免疫系统。
在本公开某些实施方式中，所述分子构建体的靶向组件与效应组件中至少一种是细胞表面抗原的特异性抗体片段。具体来说，当靶向组件是细胞表面抗原的特异性抗体片段时，本发明构建体能够特异性地靶向表达此种细胞表面抗原的细胞/组织/器官。当利用细胞表面抗原的特异性抗体作为所述构建体的效应组件时，所述构建体可透过和细胞表面抗原结合，进而活化或抑制其信号传导路径，并因此能够调控表达这些细胞表面抗原的细胞/组织/器官的生长/存活/功能。根据不同实施方式，上述细胞表面抗原可选自以下物质所组成的群组：细胞核因子κB受体激活剂配体(RANKL)、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16a、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD41、CD43、CD52、CD56、CD61、CD64、CD65、CD74、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD134、CD137、CD138、CD319、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4或CD152)、程序性细胞死亡因子1(PD-1或CD279)以及程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1或CD274)。根据一实验例，本发明分子构建体可用以治疗扩散性肿瘤，其中靶向组件是CD19、CD20、CD38或CD138的特异性抗体片段；且效应组件是CD3或CD16a的特异性抗体片段。根据另一实验例，本发明分子构建体可用以治疗实体瘤，其中效应组件为PD1的特异性抗体片段。根据又一实验例，本发明分子构建体可用以治疗扩散性肿瘤，其中靶向组件为CD79a的特异性抗体片段；且效应组件为CD79b的特异性抗体片段。根据又一实验例，本发明分子构建体可用以治疗扩散性肿瘤，其中靶向组件为CD79b的特异性抗体片段；且效应组件为CD79a的特异性抗体片段。
在本公开某些实施方式中，本发明分子构建体的靶向组件是肿瘤相关抗原的特异性抗体片段，其可选自以下物质组成的群组：人类上皮生长因子受体1(HER1)、人类上皮生长因子受体2(HER2)、人类上皮生长因子受体3(HER3)、人类上皮生长因子受体(HER4)、糖抗原19-9(CA 19-9)、糖抗原125(CA125)、黏蛋白1(MUC 1)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、岩藻糖基化GM1、Neu5GcGM3、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、间皮素、黏蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原(SialylTn)、LewisY、Sialyl LewisY、LewisA、Lewisx、肝素结合上皮生长因子(HB-EGF)、Globo H、阶段特异性胚胎抗原(SSEA-4)、以及转移酶受体(transferring receptor)。根据一实验例，本发明分子构建体可用以治疗乳房肿瘤或乳癌，其中靶向组件是HER1或HER2的特异性抗体片段。根据另一实验例，本发明分子构建体可用以治疗前列腺肿瘤/癌，其中靶向组件为PSMA的特异性抗体片段。
在本公开某些实施方式中，本发明分子构建体的靶向组件是组织特异性细胞外基质蛋白的特异性抗体片段，上述组织特异性细胞外基质蛋白可以是骨结合素、α-聚集蛋白聚糖、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白或XI型胶原蛋白。根据一实验例，本发明分子构建体可用以治疗类风湿性关节炎，其中靶向组件是IX型胶原蛋白的特异性抗体片段。根据另一实验例，本发明分子构建体可用以治疗牛皮癣，其中靶向组件是VII型的特异性抗体片段。根据又一实验例，本发明分子构建体可用以治疗关节黏连性脊椎炎，其中靶向组件是α-聚集蛋白聚糖的特异性抗体片段。
在本公开某些实施方式中，本公开的靶向组件与效应组件中至少有一种是细胞因子。在本公开其他实施方式中，本公开的靶向组件与效应组件中至少有一种是细胞因子的特异性抗体片段。在一些实施方式中，上述细胞因子为B细胞活化因子(BAFF)、白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-6、IL-12/IL23、IL-17、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)。具体来说，当靶向组件是细胞因子(譬如TGF-β)时，本发明分子构建体能够特异性地靶向表达相关受体的细胞/组织/器官(譬如于细胞上表达TGF-β受体的肿瘤细胞)。在以细胞因子作为所述分子构建体的效应组件时，分子构建体可藉由结合到细胞因子受体而活化与细胞因子相关的讯息传导途径，并因此可产生疗效(譬如以可结合至IFN-α受体的IFN-α作为效应组件以产生促发炎或抗肿瘤的效果)。以细胞因子的特异性抗体片段作为效应组件时，其可捕捉并中和细胞因子，故因此能够抑制与细胞因子相关的信号传导通路(譬如可中和IL-6并抑制IL-6相关发炎反应的抗体)。根据实验例，本发明分子构建体可用以治疗自体免疫疾病，其中效应组件是TNF-α或IL-17的特异性抗体片段。根据另一实验例，本发明分子构建体可用以治疗实体瘤，其中效应组件为IFN-γ或IL-2。根据又一实验例，本发明分子构建体可用以治疗实体瘤，其中效应组件是IFN-α或IL-2的特异性非中和性抗体片段。根据又另一实验例，本发明分子构建体可用以治疗自体免疫疾病，其中效应组件是BAFF的特异性抗体片段。
根据本公开某些实施方式，所述的可溶性受体是TNF-α或IL-1的特异性受体。在一些实施方式中，利用可溶性受体来捕捉或中和细胞因子，而不会引发相关的信号传导通路。
在本公开某些实施方式中，本发明分子构建体的靶向组件是生长因子。在本公开其他实施方式中，本发明靶向组件与效应组件其中至少一种是生长因子的特异性抗体片段。在一些实施方式中，生长因子是选自以下物质所组成的群组：上皮生长因子(EGF)、突变型EGF、表皮调节素、肝素结合上皮生长因子(HB-EGF)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及肝细胞生长因子(HGF)。与上文所述的概念类似，当靶向组件是生长因子(譬如EGF)时，本发明分子构建体能够特异性地靶向表达其受体的细胞/组织/器官(譬如其上表达EGF受体的肿瘤细胞)。当效应组件是生长因子(譬如VEGF-A)的特异性抗体片段，其可捕捉并中和与生长因子相关的信号传导通路(譬如VEGF-A-诱发的血管生成)。根据一实验例，本发明分子构建体可用以治疗实体瘤，其中效应组件是VEGF-A的特异性抗体片段。
在本公开某些实施方式中，本发明分子构建体的靶向组件是肽类激素。在本公开其他实施方式中，本发明靶向组件与效应组件其中至少一种是肽类激素的特异性抗体片段。在一些实施方式中，肽类激素是选自以下物质所组成的群组：分泌素、胆囊收缩素(CCK)、胃泌素、胃泌素释放肽、似升糖素多肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)、神经介素(neuromedin)、肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、促甲状腺素(TSH)、促性腺素释素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)及生长抑素。根据一实验例，本发明分子构建体可用以治疗实体瘤，其中靶向组件为CCK或生长抑素。
在本公开某些实施方式中，本发明分子构建体的效应组件可以是对半抗原的特异性抗体片段，上述半抗原可选自以下物质组成的群组：二硝苯酚(DNP)、三硝苯酚(TNP)、丹磺酰、盘尼西林、对胺苯甲酸以及具有SEQ ID NO:20所示序列的短肽。具体来说，当效应组件是半抗原的特异性抗体片段时，可将其和经相同半抗原标记的免疫调节效应物一起施用。
在本公开某些实施方式中，本发明分子构建体的效应组件是免疫调节剂。根据某些实施方式，所述免疫调节剂是类铎受体(TLR)激动剂。在一些实施方式中，类铎受体激动剂可选自以下物质组成的群组：脂磷壁酸、葡聚糖、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG DON)、脂多糖(LPS)、单磷酰脂A以及酵母聚糖。根据一实验例，本发明分子构建体可用以治疗实体瘤，其中效应组件为LPS或咪喹莫特。
在本公开某些实施方式中，本发明分子构建体的效应组件是细胞毒性药物，其可选自以下物质组成的群组：奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素以及喜树碱。
在本公开某些实施方式中，本发明分子构建体的效应组件是与放射性核种复合的螯合剂。根据本公开某些实施方式，上述放射性核种是111In、131I或177Lu。根据本公开其他实施方式，螯合剂是选自以下物质所组成的群组：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸(NODA)以及二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。于一实验例中，放射性核种为90Y或111In且螯合剂为DOTA。在另一实验例中，放射性核种为111In而螯合剂是NOTA。于又一实验例中，放射性核种是111In而螯合剂是NODA。在又另一实验例中，放射性核种是90Y、111In或177Lu，且螯合剂是DTPA。
在本发明多个分子构建体中，较佳的靶向或效应组件是Fab、Fv、单链可变片段(scFv)、单一区域抗体(sdAb)或抗体的其他抗原结合片段。使用scFv时，可在VL与VH之间或VH与VL之间加入包含(GGGGS)2-5序列的多肽接合链。亦可使用其他本质上具有可挠性且不会形成刚硬二级结构的序列，譬如人类同型免疫球蛋白的CH1与CH2区域间或CH2与CH3区域间的连接序列。可在scFv或其他抗体片段、生长因子、激素或细胞因子的C端加入序列为(GGGGS)1-3且末端为半胱氨酸残基的多肽延伸链。由接合单元延伸出的连接臂在自由端带有顺丁烯二酰亚胺基，而半胱氨酸残基的巯基即可与其结合。
近年来，各界广泛地使用抗体-药物复合体(ADC)治疗策略，此一策略的前提是能够将有效量的细胞毒性药物携带到目标细胞。然而，传统的ADC制备方式是将链间的双硫键(特别是位于抗体分子绞链区域内)还原，此时药物/抗体比例(DAR)不固定，每个与药物复合的抗体分子通常带有1到8个不等的药物。已知对于传统的ADC，平均DAR大于4或5时会导致分子不稳定，且因此抗体分子会出现聚集或析出等问题。在传统的ADC构建体中，靶向部分仅限于使用两个Fab或Fv抗原结合片段。在本发明中，靶向组件除了多种抗体片段之外可以选用生长因子、细胞因子、激素等；而效应组件则可选用各式各样的效应组件，包括小分子药物(如细胞毒性药物、类铎受体激动剂、与放射性核种复合的螯合剂)与蛋白质(如对各种免疫因子、细胞和/或细胞因子的特异性scFv)。在本发明所述的分子构建体中，可藉由调整特定靶向组件的数目和/或采用两种不同的靶向组件，以提升靶向特异性。
可单独制备包含细胞毒性药物负载的接合单元，之后再将其和不同的IgG抗体复合，以制备抗体-药物复合体。在较佳的实施方式中，使用某些目标抗原的特异性IgG分子作为靶向组件，且可将带有效应组件的接合单元复合到上述IgG分子CH3区域的C-端，所述效应组件可以是：三或更多个细胞毒性药物(可称为细胞毒性药物药束)、二或更多个类铎受体激动剂(如LPS分子；可称为LPS分子药束)、二或更多个与放射性核种复合的螯合剂(可称为螯合剂药束)。上述药束可供学术与产业研究单位用于产制抗体-药物复合体，以供实验室实验、临床试验或商业配销。
根据本公开的实施方式，对于靶向组件与效应组件的选择有非常大的弹性，因此可以达到较高的靶向特异性与效应活性。可以在接合之前，分别制备靶向组件的接合单元以及效应组件的接合单元。在制备ADC时，可独立制备含有细胞毒性药物、LPS分子或与放射性核种复合的螯合剂或其他小分子的药束，而不需让抗体处于严苛的化学反应环境下。利用本发明方式，可将药物直接复合到抗体分子上，故能更妥善地控制药物与抗体比例(DAR)。采用这种联合接合物平台即可制备多种靶标/效应药物分子。此处的另一个优点在于所述分子构建体中不含IgG.Fc，所以能够尽可能地降低不必要的Fc-介导效应，如补体-介导活化作用。
第四节 具有靶向部分及效应部分的分子构建体的用途
许多用以治疗肿瘤的免疫治疗抗体或用以治疗自体免疫疾病的抗发炎抗体会作用在免疫系统上。虽然此类抗体预期的药理学效果是可以活化或抑制在目标肿瘤部位或染病部位的免疫系统或免疫活动，所施用的抗体所产生的效果会导致全身性的免疫促进或抑制效果，进而造成多种副作用。因此，本发明的一个主要原理是将治疗性的效应物携带到疾病部位(如，肿瘤、发炎部位等)且同时尽可能将低整体的全身性免疫促进或免疫抑制效果。
本发明分子构建体(如上文第三节所述者)同时具备靶向与效应组件；因此，靶向组件可将效应组件所携带的药物分子携带到所欲的目标部位。因此，可藉由选择适当的靶向与效应组件，进而针对任何疾病、症状和/或异常进行标靶治疗。因此，本发明的另一方面是关于利用本发明分子构建体(包括联合接合物构型或Fc型的构建体)来治疗多种疾病、症状和/或异常。本发明方法可用以治疗的疾病、症状和/或异常包括：自体免疫疾病(类风湿性关节炎、牛皮癣、SLE、干燥综合症与克罗恩氏病)、骨质疏松症、扩散性肿瘤(多种淋巴瘤与白血病)、实体瘤、以及干式与湿式老年性黄斑变性。具体来说，上述方法都包含将根据本发明上述任一方面/实施方式的分子构建体，以治疗有效量施用予一个体或患者。
在建构用以治疗上述疾病的靶标/效应药物时，所用的靶向组件包括以下物质的特异性scFv：(1)I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白、α-聚集蛋白聚糖、骨结合素及关节、皮肤或骨骼中的细胞外基质的其他成分；(2)CD19、CD20、CD22、CD30、CD52、CD79a、CD79b、CD38、CD56、CD74、CD78、CD138、CD319、CD5、CD4、CD7、CD8、CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD36、CD37、CD41、CD61、CD64、CD65、CD11c及淋巴样细胞系、骨髓样细胞系与浆细胞的其他细胞表面抗原；(3)在实体瘤上过表达的EGFR、HER2/Neu、HER3、TN、Globo H、GD-2、CA125、CA19-9、与CEA。肿瘤细胞或其他患病细胞上会表达某些激素、生长因子或细胞因子的受体，所以靶向组件也可以是此类激素、生长因子或细胞因子的抗体。应注意到，许多自体免疫疾病属于结缔组织疾病，故可以使用多种类型的胶原蛋白作为目标抗原，以将靶标/效应药物递送到目标结缔组织。
本发明的T-E药物可选用的效应组件涵盖多种分子，包括(1)发炎性细胞因子的特异性scFv，上述发炎性细胞因子如TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17、IL-1、IL-6或BAFF；(2)RANKL的特异性scFv，(3)表达在T细胞与NT细胞上的CD3与CD16a的特异性scFv；(4)PD-1、PD-L1、CTLA-4及其他免疫检查点分子的特异性scFv；(5)促进免疫反应的细胞因子，如IFN-α、IFN-γ、IL-2、TNF-α；(6)细胞毒性分子；(7)TLR激动剂，如LPS、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡核苷酸、β-葡聚糖、酵母聚糖；以及(9)与放射性核种复合的螯合剂。
本发明体认到，在不同的情形下，靶向组件和目标分子间所需的结合强度可能不同。以位于目标肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原为靶向对象时，譬如以CD19、CD38、HER2/Neu、EGFR、CA125的特异性scFv作为靶向组件时，一般会希望靶向组件和所靶向的肿瘤相关抗原间有较高的结合亲合力。如此一来，可以提升针对目标细胞(相对于未表达所述抗原的其他细胞)的特异性结合。更有甚者，当亲合力与结合亲合力较高时，靶向/效应药物仍然会结合到目标抗原表达量相对较低的目标细胞。因此，效应组件的负载(譬如细胞毒性药物或免疫促进效应组件的有效负载)有较高的机率发挥其效应功能。
要将抗发炎剂(如抗TNF-α、抗IL-17、抗IL12/IL23与抗BAFF)递送到染病关节、皮肤或肠胃时，所用的靶向组件可以是II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、I型胶原蛋白或骨结合素的特异性scFv，此时不希望让靶向组件和染病部位中细胞外基质内的目标抗原过于紧密地结合。因为当结合力过强时，会引发不理想的免疫效果或影响细胞外基质的整体性。当可想见，细胞外蛋白的含量较为丰富，因此即便靶向部分和其目标分子间的结合亲合力不高，细胞外蛋白还是能够捕获带有靶向部分的治疗性分子。T-E药物的靶向组件在结合与不结合间的平衡状态可以提高T-E药物在局部区域的浓度。
本发明人体认到，以II型胶原蛋白、I型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白或骨结合素的特异性scFv作为靶向组件时，结合亲合力不宜过高。在较佳的实施方式中，若靶向IgG抗体与目标抗原结合的亲和常数(Kd)为Kd<1x10-9时，在药物中可仅使用单一个scFv，且当要使用两个此类scFv作为靶向组件时，靶向IgG抗体与目标抗原结合的亲和常数应较低，譬如1x10-8>Kd>1x10-9。要提升抗TNF-α抗体靶向关节部位的特异性或抗IL17抗体或抗BAFF抗体靶向皮肤的特异性时，可采用分别针对不同结合抗原的两种靶向组件。一般来说，正常的组织或细胞可能只会表达两种目标抗原中的一种，故采用此种方法可以提升针对目标组织的结合效果。
(i)免疫疾病
在设计用于治疗自体免疫疾病的分子构建体时，主要考虑的是若利用促发炎细胞因子的特异性抗体将其携带到被这些促发炎细胞因子影响的染病组织时，可以强化治疗效果并降低副作用。细胞因子与激素不同；一般来说细胞因子不会在血液循环中循环并作用在位于远程的目标细胞上。位于淋巴结中的细胞透过输出淋巴管(efferent lymphvessel)移动并进入淋巴循环。淋巴细胞的产物不会以逆着血流进入淋巴结的方向，离开淋巴结。事实上，所施用的抗体可透过血液循环进入淋巴结。然而，大多数的细胞因子分子不会透过血液循环离开淋巴结。局部淋巴结分泌的细胞因子可作用在淋巴结微环境内的细胞上。因此，若能将较多的标定到促发炎细胞因子的抗体导向染病的发炎组织，并降低进入淋巴结中的抗体量，就可以降低副作用，且会有更多抗体进到染病组织以提升疗效。
以抗TNF-α抗体为例，在施用此种分子构建体或含有此种分子构建体的药物时，所用的分子构建体是以II型胶原蛋白的特异性scFv作为靶向组件并以TNF-α的特异性scFv作为效应组件；此时，所施用的分子构建体可携带过量的效应组件；亦即，TNF-α的特异性scFv的用量高于循环于血液中的TNF-α量。当血液中的TNF-α中和了小部分治疗药剂时，剩余的治疗药剂还是会优先聚集在富含胶原蛋白的组织(包括关节)区域。与许多细胞因子(亦称为白介素或淋巴介质)相似，TNF-α主要作用在免疫系统的微环境中。TNF-α的半衰期非常短，约只有1小时，且在血液循环中的量非常少。施用上述含抗TNF-α抗体的构建体时，此种构建体不会大量出现在类淋巴系统内进而中和类淋巴系统中的TNF-α。因此，传统上使用抗TNF-α抗体所导致的感染等副作用可望减轻。
在一实施方式中，本发明方法可用以治疗自体免疫，其中第一靶向组件为α-聚集蛋白聚糖、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白或XI型胶原蛋白的特异性scFv；且第一效应组件为TNF-α、IL-17、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、BAFF、IL-6受体(IL-6R)或IL-17受体(IL-17R)的特异性scFv、或是TNF-α或IL-1的可溶性受体。
(i)-A 牛皮癣
在根据本发明一系列较佳实施例的分子构建体中，以I型胶原蛋白与VII型胶原蛋白的特异性scFv作为靶向组件，并以TNF-α、IL-12/IL-23或IL-17的特异性scFv作为效应组件。在本公开的一实施方式中，多种基于“联合接合物”构型的T-E分子包含的靶向组件是I型胶原蛋白和/或VII型胶原蛋白的特异性scFv，而效应组件则是IL-17的特异性scFv。
在较佳的实施方式中，本发明方法可用以治疗牛皮癣，其中第一靶向组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv；且第一效应组件为TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或IL-17R的特异性scFv。
(i)-B 全身性红斑狼、皮肤狼疮或干燥综合症
在本发明中，可利用靶向组件将BAFF或IFN-α特异性抗体的scFv携带到皮肤处，上述靶向组件可为I型胶原蛋白以及VII型胶原蛋白的特异性scFv。在本公开一实施方式中，多种基于“联合接合物”构型的T-E分子包含的靶向组件是I型胶原蛋白和/或VII型胶原蛋白的特异性scFv，而效应组件则是BAFF的特异性scFv。
在另一较佳的实施方式中，本发明方法适用于治疗全身性红斑狼(SLE)、皮肤狼疮或干燥综合症，其中第一靶向组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv；且第一效应组件为BAFF的特异性scFv。
(i)-C 类风湿性关节炎，牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎
在又一较佳的实施方式中，本发明方法可治疗的疾病为类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎，其中第一靶向组件为II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性scFv；且第一效应组件为TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、IL-17、IL-6R或IL-17R的特异性scFv。
(i)-D 炎性肠病
已知小肠与结肠中富含第I、III与V型胶原蛋白。但由于I型胶原蛋白亦广泛见于多种组织中，较佳宜使用III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv作为靶向组件，以将TNF-α的特异性scFv携带到克罗恩氏病或溃疡性结肠炎患者的小肠或结肠中。在本公开一实施方式中，多种基于“联合接合物”构型的T-E分子所含的靶向组件是III型胶原蛋白和/或V型胶原蛋白的特异性scFv，且效应组件是TNF-α的特异性scFv。
在又另一较佳的实施方式中，本发明方法可用以治疗炎性肠病，其中第一靶向组件是III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv；且第一效应组件是TNF-α的特异性scFv。根据实施方式中，炎性肠病为克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
(ii)肿瘤
本发明在设计较佳的药物靶标时，有两层考虑。其一是增加靶向试剂的结合亲合力与特异性，而使得靶向试剂仍会结合到抗原表达量相对较低的目标细胞。其次，仅需将治疗剂带到染病肿瘤组织，而不需使治疗剂进入表达特定肿瘤相关抗原的细胞内。此类治疗剂的例子包括可招募T细胞与NK细胞以使目标细胞溶解的scFv。此类治疗剂的另一组例子包括类铎受体激动剂(如LPS)分子、以及免疫检查点的特异性scFv(如PD-1、PD-L1与CTLA-4的特异性scFv)；这些治疗剂可在局部部位引发免疫反应。另一类治疗剂包括由与放射性核种复合的螯和剂所形成的药束。使用上述治疗剂时，可以对组织部位的染病细胞与周遭细胞造成细胞溶解效应，不论肿瘤细胞上肿瘤相关抗原的表达量为何。
因此，本发明涵盖了多种可提升治疗剂集中在染病部位的相对量的方法。上述将治疗剂特异性地递送至染病部位的方法不限于标定到癌症的治疗剂，也可用于标定到受其他疾病影响的组织的治疗剂。对目标专一的递送不必然是绝对的。换句话说，不需要将所有所施用的药物分子都带到所欲的染病部位。相较于未使用靶向组件来投递相同药物时，只要能够提升对目标部位的递送效率，即可提升药物的疗效并降低副作用。
(ii)-A 扩散性肿瘤
在一些较佳的实施方式中，本发明的T-E药物利用联合接合物构型来携带细胞毒性载药束。强效的细胞毒性药物包括奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素、喜树碱与其他药物。在较佳的实施方式中，一接合单元携带5-10个细胞毒性分子。相较之下，目前经许可或正在进行临床试验的的IgG抗体-药物复合体通常携带两个Fab片段以进行靶向，并带有平均3或4个分子的细胞毒性药物以使目标细胞溶解。在根据本发明的分子构建体中，可带有3至5个目标抗原的特异性scFv以作为靶向组件，以及5至10个细胞毒性分子以作为效应组件。相较于传统的抗体-药物复合体，本发明分子构建体的靶向特异性与药学效果皆可大幅提升。更有甚者，也可利用针对目标细胞上两种不同抗原的两组scFv作为靶向组件，以提升靶向特异性以及目标细胞对抗体-药物复合体的吸收或内化。在本发明所述的分子构建体中，细胞毒性分子是透过PEG或多肽连接臂而复合，以增加其水溶性。可单独制备带有细胞毒性药物负载的接合单元，而后再将其连接到与靶向组件复合的接合单元。如此一来，接合单元与整个分子构建体的水溶性就不会造成太大的问题。
相较于经核准可用于临床治疗或仍在进行临床试验的传统抗体-药物复合体，本节所述的分子构建体对于目标细胞上的表面抗原有较高的结合亲合力，但其毒性药物负载量也较高。使用细胞毒性药物负载所形成的药束可实质上提升所述分子构建体的有效性，且因而提高了可靶向治疗剂的特异性。当可想见，在治疗扩散性肿瘤与实体瘤时，可降低此类治疗剂的施用剂量，并能达到较佳的疗效以及减低其毒性。此方法不仅适用于衍生自B细胞、T细胞与其他白血球细胞的各种淋巴瘤与白血病；某些肿瘤的细胞表面分子可作为抗体靶标，上述方法亦适用于这类肿瘤，譬如许多类型的肿瘤上，都会过表达属于人类上皮生长因子受体(EGFR)家族的抗原。
在制备针对肿瘤细胞的T-E分子时，亦可将抗CD3抗体的scFv片段偶联于接合单元上以作为效应组件。采用CD3的特异性scFv有助于招募T细胞，以及将肿瘤目标细胞贴附至细胞毒性T细胞。抗CD3的scFv与细胞结合后会引发T细胞的活化，进而导致相接触或邻近的目标细胞溶解。在许多例子中，将抗CD3抗体和特定抗原(CD20、CD30与EGFR)的特异性抗体片段结合以得到双特异性抗体，这些双特异性抗体能够有效地溶解表达上述抗原的目标细胞。
对于具备靶向功能的分子构建体构，上文已揭示多种可与其搭配的效应机制。这些效应机制包括细胞毒性药物负载以及CD3或CD16a的特异性scFv。衍生自B细胞的肿瘤、衍生自T细胞的肿瘤以及其他类型的白血病大多属于扩散性肿瘤，针对这些扩散性肿瘤的效应物的分类和实体瘤不同。举例来说，对于以实体瘤为目标的分子构建体，可使用免疫提升制剂(如LPS)作为效应组件。可使用强效免疫提升IgG与抗CD28抗体，并使其前往局部肿瘤部位以刺激免疫活动。此类强效免疫提升物就不适合作为治疗白血病与扩散性肿瘤的治疗效应物。
要达到细胞凋亡的效果，结合剂必须使所标定的细胞表面分子(如B-细胞受体或CD20)有效地交联并聚集成团。本发明认为，让表面分子交联时，应使其成为以中心为主的交联分子团簇，而非在所标定的细胞表面上形成众多的小型集合物。本发明进一步提出，有许多因素会影响结合剂发挥其细胞凋亡作用。使结合剂具备多价结合能力可提升其交联能力。然而，若有太多结合臂，又会导致结合剂的体积过大且可能影响其穿透进入组织中的能力。结合剂结合到目标细胞表面时，应能有效地结合到细胞的平面表面。因此，结合臂(如PEG-scFv)应具有某种程度的可挠性，且可在不受到立体限制的情况下到达目标抗原部位。另一方面，若结合臂太长，可能无法达到最理想的交联与团聚效果，或结合臂会接触到邻近细胞上的细胞表面分子。本发明亦体认到，若在多臂接合单元中有足够的连接臂，则Fab或scFv片段所带来的弹性高于完整IgG或F(ab’)2。
本发明较佳的实施方式衡量了上述多种因素。虽然此处提出的设计方法适用于不同细胞类型上的不同抗原的特异性抗体，下文实施例采用B细胞或B细胞上的抗原的特异性抗体，所述的B细胞上的抗原如CD20、CD79a/CD79b(亦称为Igα/β))以及免疫球蛋白同型特异性表位；免疫球蛋白同型特异性表位又称为migis-α与migis-β，是指由α与δ膜结合疫球蛋白链的C端延伸的膜锚定多肽的细胞外部分。
CD20属于穿膜蛋白，其可作为治疗B细胞相关疾患的治疗靶标。从前B细胞时期到最终分化的浆细胞，有超过95％的B淋巴细胞在其分化与成熟过程中都会表达CD20，但CD20不会出现在造血干细胞上。已知CD20主要以四聚体的形式存在于细胞表面上。目前为止，立妥昔单抗是以B细胞为靶靶向抗体药物中最常用的一种，它是抗CD20的嵌合IgG1单克隆抗体。越来越多的数据显示，立妥昔单抗仅对约50％的B细胞淋巴瘤患者有效。经核准可用于临床治疗或人类临床试验的抗CD20抗体包括嵌合C2B8单克隆抗体(立妥昔单抗)、单克隆抗体1F5以及嵌合2H7抗体。
其他B细胞表面抗原(如CD19与CD22)的特异性抗体，通常不会对B细胞衍生的肿瘤细胞造成溶解效应。本发明体认到，若使用B细胞表面抗原(如CD19)的特异性scFv并结合CD20的特异性scFv，能够有效地提升结合特异性与结合亲合力，且可导致目标细胞溶解。在此种应用中，CD20的特异性scFv兼具了靶向组件与效应组件两种身分。B细胞上有大量的CD标记，基于上述思路，这些标记都可以和CD20搭配使用，只要在目标B细胞衍生肿瘤上有某种程度的CD20表达即可。在本公开一实施方式中，多种基于“联合接合物”构型的T-E分子带有CD20与CD19的特异性scFv以作为靶向组件，并带有CD3或CD16a的特异性scFv与细胞毒性药物药束以作为效应组件。
虽然在各种多发性骨髓瘤间，表面抗原的表达差异极大，对个别患者进行全身性的表面标记剖析仍可作为选择靶标的参考。近年来，大量的抗体-药物复合体或双特异性抗体主要是针对少数CD标记，如CD38、CD138、CD78与CD319，其他还有多种正在研发中的表面抗原。本发明体认到，若能提升靶向抗体的结合亲合力与效应机制，则治疗的特异性与疗效都会提高。在本发明较佳的实施方式中，用以治疗多发性骨髓瘤的分子构建体以CD38、CD78、CD138或CD319的一或两种特异性抗体的三个以上scFv作为靶向组件，并以载有5到10个细胞毒性药物分子的药物负载作为效应组件。亦可使用其他效应组件，譬如CD3或CD16a的特异性scFv。在本公开一实施方式中，多种基于“联合接合物”构型的T-E分子带有CD38与CD138的特异性scFv以作为靶向组件，并带有CD3或CD16a的特异性scFv与细胞毒性药物药束以作为效应组件。
为了让细胞表面上的目标蛋白能有效地交联而形成大型团簇，蛋白必须带有两个以上的抗原部位以供结合剂结合，而不需使用次级交联物。举例来说，因为每一个Igα/Igβ-BCR复合物只有一个Igα与一个Igβ，一个结合剂即使带有多对Igα或Igβ的特异性Fab或scFv，也无法让Igα/Igβ-BCR有效地交联而形成团簇。换句话说，带有四个Igα的特异性Fab(或scFv)的4-臂接合物顶多只能形成许多由4个BCR组成的小单元，但无法形成较大的交联复合物。因此，要使Igα/Igβ-BCR交联时，应使用4-6-臂接合物，其中一接合单元带有2至3个Igα的特异性scFv，另一接合单元则带有2至3个Igβ的特异性scFv。或者是，对患者共同施用带有Igα的特异性scFv的4-臂接合物以及带有Igβ的特异性scFv的4-臂接合物。
根据本公开某些实施方，所述T-E分子类似用于治疗B-细胞衍生肿瘤的药物。在这些构建体中，利用T细胞CD标记的特异性scFv作为靶向组件，而效应组件则与上文针对B细胞肿瘤所述者相同。本发明也关于设计以抗CD3抗体为基础的分子构建体，上述抗CD3抗体片段可使T细胞完全或部分失去功能，而不会引发T细胞活化与细胞因子风暴。因此，此种构建体可用以治疗T细胞媒介的自体免疫疾病，包括第一型糖尿病、SLE、多发性硬化、炎性肠病等等。由下文的讨论可知，当分子构建体利用各种对肿瘤相关抗原的特异性scFv作为靶向组件时，可使用CD3的特异性scFv作为效应组件，以招募T细胞来消除目标肿瘤细胞。
根据本公开某些实施方式，所述T-E分子类似用于治疗B-细胞衍生肿瘤的药物。在这些构建体中，利用骨髓样细胞系CD标记的特异性scFv作为靶向组件，而效应组件则与上文针对B细胞肿瘤所述者相同。
根据本公开其他实施方式，本发明方法可用以治疗肿瘤，包括扩散性肿瘤或实体瘤。在这些实施方式中，扩散性肿瘤可以是急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或骨髓瘤。
在本公开一实施方式中，本发明方法可用以治疗扩散性肿瘤，其中第一靶向组件是CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD41、CD43、CD56、CD61、CD64、CD65、CD74、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD138或CD319的特异性scFv；且第一效应组件是细胞毒性药物或CD3或CD16a的特异性scFv。在本公开另一实施方式中，第一靶向组件与第一效应组件其中之一是CD79a的特异性scFv；而另一个则是CD79b的特异性scFv。在可任选的实施方式中，细胞毒性药物是选自以下物质所组成的群组：奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素与喜树碱。
在较佳的实施方式中，本发明方法可用以治疗B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病，其中第一靶向组件是CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b的特异性scFv；且第一效应组件是细胞毒性药物或CD3或CD16a的特异性scFv。
在另一较佳的实施方式中，本发明方法可用于治疗B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病，其中第一靶向组件与第一效应组件其中之一是CD79a的特异性scFv；而另一个则是CD79b的特异性scFv。
在又一较佳的实施方式中，本发明方法可治疗的疾病为浆细胞瘤或多发性骨髓瘤，其中第一靶向组件是CD38、CD78、CD138或CD319的特异性scFv；且第一效应组件是细胞毒性药物或CD3或CD16a的特异性scFv。
在又一较佳的实施方式中，本发明方法系针对衍生自T细胞的淋巴瘤或白血病，其中第一靶向组件是CD5、CD30或CD43的特异性scFv；而第一效应组件是细胞毒性药物或CD3或CD16a的特异性scFv。
在较佳的实施方式中，本发明方法可用于治疗骨髓性白血病，其中第一靶向组件是CD33或CD34的特异性scFv；且第一效应组件是细胞毒性药物或CD3或CD16a的特异性scFv。
(ii)-B 实体瘤
可将上述肿瘤相关抗原的特异性抗体片段接合至本发明所述的多臂接合物。本发明可使用多种肿瘤相关抗原的特异性抗体，如抗HER2/NEU抗体(曲妥珠单抗)、抗CA19-9抗体(衍生自1116-NS-19-9株)、抗CA125抗体(衍生自OC125株)、抗GD2抗体(ch14.18单克隆抗体)以及抗Globo H抗体(VK9株)。本发明是关于将上述肿瘤相关抗原的特异性抗体的scFv或双特异性scF与多臂接合物接合，以将治疗剂携带到肿瘤部位。
在本发明某些实施方式中，“联合接合物”构型的T-E分子经设计可接合多份的配体、生长因子、细胞因子或激素，故可将一或多份的治疗药剂携带到肿瘤部位，肿瘤部位的染病细胞表达了可与配体结合的受体。相较于单独使用治疗剂，本发明药物递送方式可以提升特异性，且因此可达到较佳的疗效与减少副作用。
适用于此模式的配体包括上皮生长因子(EGF)及其突变株、表皮调节素、肝素结合上皮生长因子(HB-EGF)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胃泌素、胆囊收缩素(CCK)、分泌素、胃泌素释放肽、似升糖素多肽1(GLP-1)、神经介素、促甲状腺素(TSH)、肾上腺皮质激素(ACTH)、促性腺素释素(GnRH)及生长抑素。
VEGF至少可分为以下四类：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C与VEGF-D。其中VEGF-A与血管内皮细胞的血管生成有关。VEGF-A可和VEGF受体1、2(VEGFR1与VEGFR2)结合。已知当位于EGF的N-端的Ser2-Asp3突变为Trp2-Val3或Trp2-Arg3时，突变的EGF不仅可和HER1结合，也会和HER2与HER3结合(参见Stortelers C.等，Biochemistry 41:8732-8741,2002)。因此，相较于EGF或VEGF-A受体的特异性抗体，以EGF(W2V3)、EGF(W2R3)或VEGF-A作为靶标时，可以标定更多类型的肿瘤细胞。
上述多肽或蛋白的分子量通常很小，EGF有53个氨基酸残基、生长抑素有14与28个氨基酸残基、分泌素有27个氨基酸残基、胃泌素有14-34个氨基酸残基、CCK有8-58个氨基酸残基、胃泌素释放肽有27个氨基酸残基、GLP-1有37个氨基酸残基、促甲状腺素的受体结合β链有118个氨基酸残基、神经介素有10个氨基酸残基、ACTH有39个氨基酸残基、而GnRH有10个氨基酸残基。VEGF-A是由两条约120-188个氨基酸残基的多肽所组成的二聚体。在放射显影中，已证实激素或生长因子的截断片段或人工设计的多肽能够保有与各别受体相近或更佳的结合能力。举例来说，由八个氨基酸残基组成的多肽经证实可显影表达生长抑素受体的肿瘤。
某些细菌、病毒与其他微生物的产物可以引发很强的免疫反应。举例来说，超级抗原，如葡萄球菌肠内毒素(staphylococcal enterotoxins)可藉由同时结合到MHC第二型抗原与T细胞受体，以活化大量T细胞。许多微生物产物可以和类铎受体(TLR)结合，并能活化多种免疫活动。
目前FDA已核准三种TLR激动剂在某些癌症与感染性疾病的应用。卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin)可活化TLR2与TLR4，可作为结核病疫苗。目前卡介苗已经核准可用于原位膀胱癌的免疫疗法。咪喹莫特，是小分子咪唑喹啉，原本是作为局部抗病毒药物，其可和TLR7结合，目前已经核准可用于日旋光性角化症(actinic keratosis)以及浅基底细胞癌(superficial basal cell carcinoma)。单磷酰脂A是一种来自明尼苏达沙门氏杆菌(Salmonella minnesota)的脂多糖(LPS)，其可和TLR2与TLR4结合，目前已核准可作为乳突病毒疫苗的辅剂，而大多数子宫颈癌都是由乳突病毒感染所造成的。
其他可能具有治疗性免疫刺激性的TLR激动剂包括：(1)葡聚糖，包括衍生自某些真菌(特别是曲菌属与伞菌属)细胞壁的β-D-葡聚糖，以及衍生自某些真菌(如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))细胞壁的酵母聚糖，这些葡聚糖可和TLR2以及其他免疫细胞的受体结合；(2)莫托立莫特，可和TLR8结合的小分子化合物；(3)咪喹莫特，如上文所述；以及(4)CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG DON)，是一种单链合成DNA分子，其C核苷后接有G核苷，可和TLR9结合。一般来说，这些TLR结合剂可活化树状细胞、巨噬细胞、天然杀手细胞、嗜中性白血球以及其他与先天性免疫相关的免疫细胞，并可导致多种发炎性细胞因子的产生，进而强化后天性免疫。先天性免疫和后天性免疫可通力合作将病原逐出人体。
衍生自格兰氏阴性菌的LPS亦称为内毒素或外源性致热原(exogenous pyrogen)，是一种强效的免疫刺激物。LPS可和单核球细胞、树状细胞与巨噬细胞上的CD14/TLR4/MD2受体复合物结合，以引发先天免疫反应，并导致发炎性细胞因子的产生。在人类中，1μg/kg的LPS即可引发休克，故LPS是很强的免疫刺激物。全身性投予未经修饰的LPS会产生极高的风险。
本发明体认到若将LPS结合到载体上并携带到肿瘤部位，LPS就可以在原位引发强烈的局部免疫反应，进而导致发炎性细胞因子的释放、提高血管通透率，并招募多种效应细胞至该部位。这有助于溶解发炎组织中的肿瘤细胞。由于肿瘤中的细胞对肿瘤相关抗原的表达量不一，本发明策略可对位于肿瘤部位的所有细胞引发免疫活动，不论这些细胞的肿瘤相关抗原密度为何。
本发明体认到LPS强大的发炎活性大多仅限于目标肿瘤部位。因此，在较佳的实施方式中，可将三个肿瘤相关抗原的特异性scFv负复合到接合单元上作为靶向组件，并将2-3个LPS或单磷酰脂A分子复合到另一接合单元以作为效应组件。此外，可分别将两组不同肿瘤相关抗原的特异性scFv复合到两个接合单元上，再将两者连接以形成靶向组件。
已知可透过连接物将LPS与蛋白复合。举例来说，先利用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟化硼(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate，CDAP)活化LPS，再将LPS和蛋白的一级氨基偶联。实验结果证实，将LPS和蛋白复合后仍能保持约70％的原有内毒素活性。可利用类似的方式，将LPS复合到本发明提出的接合单元。可在水溶液中于温和的环境下，利用CDAP来活化LPS的碳水化合物成分中的羟基。接着，将经过CDAP活化的LPS和NH2----SH交联物反应，而后再和接合单元之连接臂的顺丁烯二酰亚胺基反应。
本发明体认到若可将治疗剂更特异性地局限于染病部位，就可达到较大的治疗窗，且可提升治疗效果与减少副作用。在本发明中，T-E分子经设计可携带免疫检查点的特异性scFv作为效应组件，以导致摧毁癌细胞的免疫机制；上述免疫检查点如胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4或CD152)、程序性细胞死亡因子1(PD-1或CD279)以及程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1、CD274或B7-H1)。
本发明体认到，若将这些细胞因子招募到肿瘤部位，就能够在局部引发强烈的免疫活动或发炎活动，进而能够消除肿瘤。因此，本发明所用的多臂接合物其上接合了免疫调节细胞因子的特异性scFv或双特异性scFv，而非使用免疫调节细胞因子本身。此一设计逻辑是利用scFv来招募已经存在于体内并在血液中循环的免疫调节细胞因子，并使其集中到肿瘤部位。所述分子构建体所用的细胞因子的特异性scFv不会中和这些细胞因子的活性。所用的scFv对细胞因子也不会有很高的亲合力。对于个别的scFv片段，较适当的Kd值为1-5x10-8。在较佳的实施方式中，每一scFv有潜力招募一免疫调节细胞因子的多个分子，进而提升疗效。
某些肿瘤带有两种过表达的肿瘤相关标记，譬如在某些肠胃道与神经内分泌肿瘤中的CA19-9与CCK/胃泌素受体；或是在某些乳癌中的Globo H与HER2/Neu。本发明体认到使用两种导引机制，分别携带不同的效应剂(譬如，一种携带细胞毒性药物负载而另一种携带LPS)，可提升疗效并降低副作用。在较佳的治疗方式中，先施用带有LPS以及抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗TNF-α、抗IFN-γ或抗IFN-α抗体的分子复合物，以在“原位”引发发炎或免疫活化作用，使得血管通透性提升。若局部发炎或免疫活化不足以使肿瘤或染病细胞发生完全的细胞溶解反应，后续可施用携带细胞毒性药物负载的分子构建体，以提升带有目标肿瘤相关抗原的细胞的细胞溶解反应。
可利用下述靶向成分，将治疗用的效应物携带到目标实体瘤部位：(1)细胞毒性药物，其可毒杀结合后的细胞；(2)抗CD16a或抗CD3抗体，其可引发ADCC或细胞毒性活性；(3)LPS或其他TLR激动剂、抗IL-2、抗TNF-α、抗IFN-γ或抗IFN-α抗体，其可活化免疫活性；(4)抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4抗体或其他免疫检查点抑制剂，其可释放免疫检查点并可压抑抑制性回馈活动。对于带有所述配体受体的肿瘤细胞，这些制剂的治疗目标是引发其细胞溶解。
举例来说，多种采用联合接合物构型的T-E分子可单独使用HER2/neu的特异性scFv、或将其与HER1的特异性scFv搭配以作为靶向组件，并使用细胞毒性药物、LPS、或CD3、CD16a、PD1或VEGF-A的特异性scFv作为效应组件。多种采用联合接合物构型的T-E分子单独使用GD2的特异性scFv、或将其与Globo H的特异性scFv搭配以作为靶向组件，并使用细胞毒性药物、LPS、或CD3、CD16a、PD1或VEGF-A的特异性scFv作为效应组件。多种采用联合接合物构型的T-E分子单独使用胆囊收缩素(CCK)的特异性scFv、或将其与生长抑素的特异性scFv搭配以作为靶向组件，并使用细胞毒性药物、LPS、或CD3、CD16a、PD1或VEGF-A的特异性scFv作为效应组件。多种采用联合接合物构型的T-E分子使用前列腺特异性膜抗原(PSMA)的特异性scFv作为靶向组件，并使用IL-2、TNF-α、IFN-α或IFN-γ的特异性非中和性scFv作为效应组件。
上文讨论了以多臂接合单元为基础的分子构建体，其使用生长因子、肽类激素或细胞因子为靶向组件，并揭示了较佳的实施方式。亦可将这些非免疫球蛋白多肽或蛋白设计为似IgG分子构建体或双链IgG.Fc融合蛋白。具体来说，可利用生长因子作为靶向组件；上述生长因子如EGF或其变形株、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、FGF、HGF、胃泌素、CCK、分泌素、胃泌素释放肽、GLP-1、神经介素、促甲状腺素(TSH)的β链、ACTH、GnRH或生长抑素。从表达上述生长因子或激素的受体的细胞所衍生的肿瘤通常也会表达这些受体。在本公开一实施方式中，所述分子构建体使用EGF作为IgG.Fc融合蛋白构型中的靶向组件。效应组件包括带有细胞毒性分子或LPS分子的接合单元，这些分子可透过C-端多肽接合链而连接。效应物也可以是CD3、CD16a、PD-1或VEGF-A的特异性scFv。也可以使用免疫调节细胞因子作为效应组件，譬如IFN-α、TNF-α、IL-2与IFN-γ。可将scFv或免疫调节细胞因子表达为重组多肽链的一部分。
在本发明某些较佳的实施方式中，所述T-E分子使用肿瘤相关抗原的特异性scFv作为靶向组件，并使用半抗原的特异性scFv作为效应组件。所述半抗原包括二硝苯酚(DNP)、三硝苯酚(TNP)、丹磺酰、盘尼西林、对胺苯甲酸或已经有既有抗体的衍生自人类细胞、病毒或细菌蛋白的短肽。举例来说，由8个氨基酸残基WADWPGPP序列所组成的多肽系位于人类B淋巴细胞上的膜结合IgE的CεmX区域中，此一片段在整个蛋白质数据库中是独特的序列，且B细胞表面的抗体无法与其接触。当一患者的肿瘤表达一肿瘤相关抗原时，可对该患者投予以靶向该肿瘤相关抗原的T-E分子，此时所述T-E分子会结合到肿瘤细胞，其后可施用以相同半抗原标记的免疫调节抗体、细胞因子或其他蛋白，此时先施用的T-E分子可在肿瘤部位招募后续施用的药物。
要将半抗原标记到治疗用分子上时，可透过遗传工程在治疗性抗体或免疫调节细胞因子的C-端加上多肽接合链(如GGGGS或(GGGGS)2)；上述治疗性抗体例如PD-1、PD-L1、CTLA4、VEGF-A、CD3、CD28的特异性IgG抗体；上述免疫调节细胞因子如IL-2、TNF-α、INF-α或INF-γ。可将多肽接合链和多肽半抗原表达成完整重组蛋白的一部分。半抗原也可透过连接臂标记到以接合单元形式制备的细胞毒性药物载药束上，而后此种载药束再被招募到肿瘤部位。此种治疗策略可以提高治疗剂在肿瘤部位的相对分布量，并可提升疗效以及降低毒性与副作用。
CD3或CD28的特异性IgG是非常强的T细胞活化物。全身性地投予此类抗体会导致剧烈的细胞因子风暴。然而，欲活化T细胞时，若可降低所投予的抗CD3或抗CD28抗体量并使其集中在肿瘤组织，所产生的药性就能很有效地在局部产生免疫活动与发炎反应，并可招募多种免疫细胞来对抗肿瘤细胞。因此，在本发明的较佳实施方式中，利用半抗原来标记这些抗体。之后就可以投予非常低量的经标记的抗CD3或CD28抗体。
某些肿瘤相关抗原(如CA19-9、CA125)以及癌胚抗原(CEA)会从肿瘤细胞脱落而进入血液循环中。定性与定量血清样本中的上述抗原已是许多健康检查中，用来初步侦测肿瘤的常规试验。在治疗后，这些试验可以用来监控疗效与肿瘤状态。虽然血清中其他肿瘤相关抗原的侦测并非常规检验内容，血液循环中也可能带有浓度不一的这些肿瘤相关抗原。
要使药物-肿瘤靶向复合药物发挥疗效的关键之一是要将治疗剂特异性地携带到目标肿瘤部位，且毒性治疗剂进入其他分子与组织中的量则应越低越好。亦可利用循环性肿瘤相关抗原—如CA19-9、CA125或CEA—作为本发明T-E药物中靶向组件的抗原靶标，此时，本发明的方法亦可自血液中清除这些肿瘤相关抗原。进行血液透析程序时，可将目标肿瘤相关抗原的特异性抗体和树脂复合，再将此树脂填充于亲和性管柱中，而后使患者的血浆通过亲和性管柱，以清除血液中的肿瘤相关抗原；其后，再对患者施用本发明提出的目标肿瘤相关抗原的特异性药物。
当抗体和目标细胞的细胞表面抗原结合后，有多种潜在的机制会导致目标细胞溶解。上述机制包括细胞凋亡、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、以及补体介导的细胞溶解(CMC)。这三种机制间相对的重要性取决于所标定的抗原以及与该抗原结合的抗体为何。当以Igα或Igβ作为抗体的靶标，以引发B细胞溶解时，Igα或Igβ的特异性IgG抗体不会造成有效的细胞溶解，这意味着抗体无法引发所有上述三种细胞溶解机制。如上文所述，此时抗体不会将Igα或Igβ有效交联以引发细胞凋亡。抗体也无法介导有效的ADCC与CMC机制。因此，有研究单位开发了能够有效导致细胞凋亡的毒素-复合抗Igβ。关于本质上属于肽聚醣或黏蛋白等肿瘤相关抗原的特异性抗体，此类抗体不能引发抗体及其所携带的细胞毒性药物的内化作用。
本发明亦关于一种新的治疗模式，此一模式涉及依序施用经PEG修饰的结合剂与药物-抗PEG抗体复合物。经PEG修饰的结合剂包括和PEG复合的蛋白治疗剂，上述复合可改善其药动学特性；经PEG修饰的结合剂还包括运用多臂接合物的治疗剂，其可运用本发明提出的PEG连接臂。由于所标定的表面抗原密度过低、交联程度不足、无力引发细胞凋亡或其他种种原因，经PEG修饰的结合剂可能无法有效造成标定细胞溶解，此时可利用药物-抗PEG抗体复合物或F(ab’)2来提升或诱发细胞溶解效应。可将多个抗PEG IgG或F(ab’)2分子接到每一条PEG链上，且每一个抗PEG IgG或F(ab’)2分子可以携带多个细胞毒性药物分子。使用双价抗PEG IgG或F(ab’)2可以使得所标定的表面抗原和与PEG连接的结合剂经过交联形成复合体。双价抗PEG IgG或F(ab’)2的结合会产生大型复合物(由标定的表面抗原加上与PEG连接的结合剂再加上药物-二价抗PEG IgG或F(ab’)2复合物)的聚集，且会导致目标细胞将这种复合物内化。其后，经内化的药物会造成目标细胞的细胞溶解。此种治疗策略应可有效配合以肿瘤相关抗原为靶向对象的分子构建体一起使用。
此一策略能够提升以肿瘤为靶向对象的结合物的结合能力与特异性，经过抗PEG抗体结合的强化后，因而有较高且更为特异的药物负载。于制备药物-抗PEG IgG复合物时，可利用遗传工程在IgG的γ重链C-端加入(GGGGS)2接合链与一半胱氨酸残基，并透过巯基巯基与两个含细胞毒性药物负载的接合单元复合，每一结合单元分别带有3到5个细胞毒性药物分子。
本发明亦关于一种新的治疗模式，此一模式涉及依序施用与PEG结合的抗体的抗原结合片段以及LPS-抗PEG抗体复合物，所述抗体为肿瘤相关抗原(如CEA、Globo H或SSEA4)的特异性抗体。使用LPS-抗PEG IgG或F(ab’)2复合物可在标定的肿瘤部位引发强烈的免疫反应。举例来说，当患者的癌细胞会表达Globo H或SSEA4时，先对患者施用偶联了四个scFv片段的4-臂PEG接合物，当经过一段时间之后，再给予LPS-抗PEG IgG或F(ab’)2复合物。
于本公开一些实施方式中，本发明方法可用于治疗实体瘤。
在一些实施方式中，第一靶向组件为肽类激素、生长因子或对肿瘤相关抗原的特异性抗体片段；且第一效应组件为细胞毒性药物、类铎受体(TLR)激动剂、与放射性核种复合的螯合剂、细胞因子、或生长因子、细胞表面抗原、半抗原或细胞因子的特异性抗体片段。
根据本公开某些视需要而实施的实施方式，当效应组件为半抗原的特异性抗体时，所述方法还包含以下步骤：在施用本发明分子构建体之前、之后或同时，对所述对象施用以相同半抗原标记的免疫调节效应物。
根据一实施例，本发明方法可用以治疗以下的实体瘤：黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌或头颈部鳞状细胞癌。
根据另一实施例，肿瘤相关抗原可选自以下物质组成的群组：人类上皮生长因子受体1(HER1)、人类上皮生长因子受体2(HER2)、人类上皮生长因子受体3(HER3)、人类上皮生长因子受体4(HER4)、糖抗原19-9(CA 19-9)、糖抗原125(CA 125)、黏蛋白1(MUC 1)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、岩藻糖基化GM1、Neu5GcGM3、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、间皮素、黏蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、LewisY、Sialyl LewisY、LewisA、Lewisx、肝素结合上皮生长因子(HB-EGF)、Globo H、以及阶段特异性胚胎抗原(SSEA-4)。
根据又一实施例，肽类激素是选自以下物质所组成的群组：分泌素、胃泌素、胆囊收缩素(CCK)、胃泌素释放肽、似升糖素多肽1(GLP-1)、神经介素、促甲状腺素(TSH)、肾上腺皮质激素(ACTH)、促性腺素释素(GnRH)及生长抑素。
根据又一实施例，上述生长因子是选自以下物质所组成的群组：上皮生长因子(EGF)、突变型EGF、表皮调节素、肝素结合上皮生长因子(HB-EGF)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、以及肝细胞生长因子(HGF)。在一实验例中，第一靶向组件为EGF、突变型EGF、HB-EGF、VEGF-A、bFGF或HGF。在另一实验例中，第一效应组件是EGF、突变型EGF、VEGF-A、bFGF或HGF的特异性scFv。
于一实施例中，上述细胞表面抗原是PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD3、CD16a、CD28或CD134。
于另一实施例中，半抗原为二硝苯酚(DNP)、三硝苯酚(TNP)、丹磺酰、盘尼西林、对胺苯甲酸或具有SEQ ID NO:20所示序列的短肽。
在又一实验例中，细胞因子为IL-2、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-γ、TGF-β或TNF-α。根据一实施方式，第一效应组件是选自以IL-2、IFN-α、IFN-γ或TNF-α等细胞因子为对象的非中和性scFv。
当可理解，可对肿瘤细胞发会细胞毒杀效果的细胞毒性药物可以是：抗雌性素(anti-estrogen，如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)及甲地孕酮(megestrol))、黄体释素激动剂(LHRH agonist，如戈舍瑞林(goscrclin)及醋酸亮丙瑞林(leuprolide))、抗雄性素(anti-androgen，如氟他胺(flutamide)及比卡鲁胺(bicalutamide))、光动力治疗剂(photodynamic therapies，如维替泊芬(vertoporfin)、酞菁(phthalocyanine)、光敏剂Pc4(photosensitizer Pc4)及去甲氧基竹红菌素(demethoxy-hypocrellin A))、氮芥(nitrogen mustard，如环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氯乙环磷酰胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雌莫司汀(estramustine)及美法仑(melphalan))、亚硝基尿素(nitrosoureas，如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、烷基磺酸(alkylsulphonate，如白消安(busulfan)及苏消安(treosulfan))、三氮烯(triazene，如达卡巴嗪(dacarbazine)及替莫唑胺(temozolomide))、含铂化合物(如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)及奥沙利铂(oxaliplatin))、长春花生物碱(vinca alkaloid，如长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)及长春瑞滨(vinorelbine))、类紫杉醇(taxoid，如紫杉醇(paclitaxel)及欧洲紫杉醇(docetaxeal))、表鬼臼毒素(epipodophyllin，如依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposidephosphate)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、9-氨基喜树咸(9-aminocamptothecin)、康托替康(camptoirinotecan)、伊立替康(irinotecan)、甲磺酸(crisnatol)及丝裂霉素C(mytomycin C)、抗代谢药物(anti-metabolite)、二氢叶酸还原酶抑制剂(DHFR inhibitor，如胺甲喋呤(methotrexate)、二氯甲胺蝶呤(dichloromethotrexate)、三甲蝶呤(trimetrexate)及依达曲沙(edatrexate))、肌苷-5'-单磷酸去氢酶抑制剂(IMP dehydrogenase inhibitor，如霉酚酸(mycophenolic acid)、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韦林(ribavirin)及EICAR))、核糖核苷酸还原酶抑制剂(ribonuclotide reductase inhibitor，如羟基尿素(hydroxyurea)及去铁胺(deferoxamine))、尿嘧啶类似物(如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、氟尿苷(floxuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、雷替曲塞(ratitrexed)、替加氟尿嘧啶(tegafur-uracil)及卡培他滨(capecitabine))、胞嘧啶类似物(如阿糖胞苷(cytarabine，又称ara C)、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosine arabinoside)及氟达拉滨(fludarabine))、嘌呤类似物(如巯基嘌呤(mercaptopurine)及硫鸟嘌呤(Thioguanine))、维生素D3类似物(如EB1089、CB 1093及KH 1060)、异戊二烯抑制剂(isoprenylation inhibitor，如洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神经毒素(dopaminergic neurotoxin，如1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion))、细胞周期抑制剂(如星形孢菌素(staurosporine))、放线菌素(actinomycin，如放线菌素D)、博莱霉素(bleomycin，如博莱霉素A2、博莱霉素B2及培洛霉素(peplomycin))、蒽环类药物(anthracycline，如柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone))、多重抗药性抑制剂(MDR inhibitor，如维拉帕米(verapamil))、钙离子三磷酸腺苷酶抑制剂(Ca2+ATPase inhibitor，如毒胡萝卜素(thapsigargin))、伊马替尼(imatinib)、沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、酪胺酸激酶抑制剂(tyrosine kinaseinhibitor，如阿西替尼(axitinib)、波舒替尼(bosutinib)、西地尼布(cediranib)、达沙替尼(dasatinib)、厄罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来他替尼(lestaurtinib)、那替尼(neratinib)、尼洛替尼(nilotinib)、索拉非尼(sorafenib)、依维莫司(everolimus)、西罗莫司(temsirolimus)、蛋白酶抑制剂(如硼替佐米(bortezomib))、哺乳类斥消灵目标蛋白抑制剂(mTOR inhibitor，例如雷帕霉素(rapamycin)、西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、及雷帕霉素衍生物(ridaforolimus)、奥利默森(oblimersen)、吉西他滨(gemcitabine)、洋红霉素(carminomycin)、亚叶酸钙(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甲基芐肼(procarbizine)、泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、喜树碱(campathecin)、普卡霉素(plicamycin)、天门冬酰胺酶(asparaginase)、胺基蝶呤(aminopterin)、甲胺蝶呤(methopterin)、紫菜霉素(porfiromycin)、美法仑(melphalan)、异长春碱(leurosidine)、环氧长春碱(leurosine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、曲贝替定(trabectedin)、丙卡巴肼(procarbazine)、海绵内酯(discodermolide)、洋红霉素(carminomycin)、胺基蝶呤(aminopterin)或六甲基三聚氰胺(hexamethyl melamine)。根据本公开一具体实施方式，细胞毒性药物为奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素或喜树碱。
根据某些实施方式，类铎受体(TLR)激动剂可以是脂磷壁酸、葡聚糖、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡聚脱氧核苷酸、脂多糖、单磷酰脂A或酵母聚糖。
(iv)骨质疏松症
在骨头的细胞外基质网络中，主要的组织特异性蛋白是骨结合素，亦称为富含半光胺酸的分泌性酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)。I型胶原蛋白是骨基质中主要的蛋白质，但也会出现在衬接皮肤的结缔组织中。
在治疗骨质疏松症时，根据本发明所建构的T-E分子是以骨结合素和/或I型胶原蛋白的特异性scFv作为靶向组件，并以RANKL或硬化蛋白的特异性scFv作为效应组件。本发明体认到若可将抗RANKL或抗硬化蛋白抗体优势地局限在骨骼部位，则可降低投予剂量并可提升疗效。在本公开一实施方式中，多种基于“联合接合物”构型的T-E分子带有骨结合素(SPARC)的特异性scFv以及I型胶原蛋白的特异性scFv以作为靶向组件，并带有RANKL的特异性scFv以作为效应组件。
根据本公开某些实施方式，本发明方法可用以治疗骨质疏松症，其中第一靶向组件是I型胶原蛋白或骨结合素的特异性scFv；且第一效应组件是细胞核因子κB受体激活剂配体(RANKL)的特异性scFv。
第五节 具有组织靶向功能的抗发炎分子
以广义的Fc构型来看，可利用免疫球蛋白抗体作为一靶向或效应组件的基础，并将与其搭配的效应或靶向组件以scFv区域的形式引入其两条γ重链的C-端。以传统的“Fc”构型来看，可利用双链IgG.Fc作为分子平台的基础。每一多肽链可和一或两个靶向组件以及一或两个效应组件融合，使得每一链共带有二至三个组件。具有Fc构型的T-E分子总计可带有四至六个组件(譬如scFv，生长因子或细胞因子)。在可任选的实施方式中，所述分子构建体的Fc部分亦带有Fc介导的效应功能，如ADCC和/或补体介导的活化作用。然而在某些其他应用中，不会出现此种Fc介导的效应功能。
在设计Fc型分子构建体时，靶向组件可位于N-或C-端。若效应组件透过和细胞表面组件(如CD3、CD16a、PD-1、PD-L1或CTLA-4)结合而发挥功用，应使其设于构建体的末端。若效应组件是透过和可溶性因子(如VEGF、TNF-α、IL-17或BAFF)结合并中和其功效而发挥作用，则其可位于末端的靶向或效应组件和CH2-CH3之间。
在本公开某些实施方式中，CH2-CH3区段(或称CH2-CH3链)所携带的效应组件与靶向组件几乎都是由氨基酸所组成，而为了方便讨论，亦将这些分子构建体称为具有组织靶向功能的抗发炎分子或抗发炎Fc型分子构建体。举例来说，所述效应组件可以是抗体片段或可溶性受体，而靶向组件也是抗体片段。本节将进一步讨论Fc型分子构建体的例示性结构。
图8A绘示了根据本公开某些实施方式的Fc型分子构建体800A。如图所示，Fc型分子构建体800A包含两条相同的CH2-CH3链810、连接于CH2-CH3链810的N-端的第一对效应组件E1、以及连接于CH2-CH3链810的C-端的第一对靶向组件T1。在此一例示性的构型中，靶向组件T1与效应组件E1都是抗体片段。
在某些实施方式中，CH2-CH3链是来自人免疫球蛋白γ1或γ4。一般来说，当想要发挥Fc介导的功能(如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体介导活性(发炎活化或目标细胞溶解))时，可以选择γ1。当不想要发挥Fc介导的功能时，可以选用γ4来建构本发明Fc型分子构建体。
图8B所示的Fc型分子构建体800B与图8A的Fc型分子构建体800A结构非常相似，不同之处在于两个效应组件E1分别连接于CH2-CH3链810的C-端，而两个靶向效应物则分别连接于CH2-CH3链810的C-端。
根据某些实施方式，效应组件和靶向组件两者皆连接于CH2-CH3链的N-端。举例来说，当效应组件与靶向组件都是单链可变片段(scFv)时，可将效应组件与靶向组件以串联双抗体(tandem)或双抗体(diabody)的构型连接，因而形成连接于CH2-CH3链N-端的双特异性scFv。
Fc型分子构建体800C(图8C)包含一Fc部分，且因此，每一CH2-CH3链810的N-端上接有T1-E1双特异性scFv。
如上文所述，在某些实施方式中，抗发炎Fc型分子构建体亦可使用可溶性受体(譬如TNF-α或IL-1的可溶性受体)作为效应组件。在这些情形中，Fc型分子构建体800D(图8D)可带有分别连接于CH2-CH3链810的N-端的两个效应组件E1，以及分别连接于CH2-CH3链810的C-端的两个靶向组件T1。也可将效应组件与靶向组件分别设于CH2-CH3链的C-端与N-端；譬如，图8E的Fc型分子构建体800E。
在某些例子中，第一对效应组件或第一对靶向组件形成Fab构型(即，由VH-CH1区域与VL-Cκ区域组成)；此种Fab片段系连接于CH2-CH3链的N-端，而使得Fc型分子构建体成为IgG构型。在这些情形中，不具备Fab构型的该对组件可连接于成对CH2-CH3区段的C-端。
举例来说，在图8F所示的Fc型分子构建体800F中，两个靶向组件T1分别包含VH-CH1区域820与VL-Cκ区域825，因而形成连接于CH2-CH3链810的N-端的Fab构型830，而使得Fc型分子构建体800F成为IgG构型。在本例中，成对的效应组件E1是连接于成对CH2-CH3链810的C-端。
如上文所述，本发明Fc型分子构建体最多可带有共六个组件。此一额外的组件可以是第二对效应组件或第二对靶向组件。
根据其他实施方式，Fc型分子构建体900A(图9A)包含第二对靶向组件T2。在这些情形中，靶向组件T1与T2是以串联双抗体或双抗体的构型连接，而形成双特异性scFv并连接于CH2-CH3链910的N-端，而效应组件E1则连接于CH2-CH3链910的C-端。
根据图9B所例示的实施方式，Fc型分子构建体900B包含第二对效应组件E2。在这些情形中，效应组件E1与E2是以串联双抗体或双抗体的构型连接，而形成双特异性scFv并连接于CH2-CH3链910的N-端，而靶向组件T1则连接于CH2-CH3链910的C-端。
在讨论了抗发炎Fc型分子构建体的基本结构之后，下文进一步说明某些由特定效应组件(们)与靶向组件(们)所形成的组合。
根据某些实施方式，效应组件为TNF-α的特异性scFv，且靶向组件是II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性scFv。根据某些实施方式，二效应组件分别是IL-17的特异性scFv，而靶向组件是I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。又或者是，二效应组件分别是BAFF的特异性scFv，且靶向组件是I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。在某些实施方式中，每一效应组件是TNF-α的特异性scFv，而靶向组件是III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv。在某些其他实施方式中，二效应组件形成RANKL的特异性Fab，且靶向组件是I型胶原蛋白或骨结合素的特异性scFv。举例来说，此种分子构建体可采用图8A至8C以及8F任一者所示的构型。
在某些实施方式中，第一对效应组件包括TNF-α的特异性scFv或IL-17的特异性scFv，而第一对靶向组件包括一II型胶原蛋白的特异性scFv或IX型胶原蛋白的特异性scFv。在某些替代性的实施方式中，第一对效应组件包括TNF-α的特异性scFv或IL-17的特异性scFv，而第一对靶向组件包括I型胶原蛋白的特异性scFv或VII型胶原蛋白的特异性scFv。或者是，二效应组件分别是BAFF的特异性scFv，而靶向组件是I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。又或者是，二效应组件分别是RANKL的特异性scFv，而靶向组件是I型胶原蛋白或骨结合素的特异性scFv。这些分子构建体可采用图8B、8D、以及8F任一者所示的构型。
于一些实施方式中，二效应组件为TNF-α的特异性Fab抗体，而靶向组件是II型胶原蛋白或IX型胶原蛋白的特异性scFv。在某些实施方式中，二效应组件是IL-17的特异性Fab抗体，而靶向组件是I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。或者是，二效应组件是BAFF的特异性Fab抗体，而靶向组件是I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。又或者是，二效应组件是TNF-α的特异性Fab抗体，且靶向组件是III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv。
本发明的精髓在于采用特定靶向与效应组件的组合或搭配。在较佳的实施方式中，所述分子构建体采用了Fc融合构型。本发明所属技术领域具有通常知识者当可想见，亦可利用其他分子平台来连接本发明靶向与效应组件的组合；上述分子平台诸如多肽、蛋白质(譬如白蛋白)、聚醣、聚乙二醇以及其他类型的聚合物，只要其能够作为连接多个分子组件的结构基础即可。
第六节 具有组织靶向功能的抗发炎分子的用途
本公开的另一方面是关于上文第五节所述的抗发炎Fc型分子构建体的用途。
当可理解，上文第4节(i)部分中关于选择适当靶向与效应组件为的论述亦适用于本节。举例来说，用以治疗多种免疫疾病的抗发炎Fc型分子构建体可含有II型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性抗体片段(譬如scFv、Fab及与其相似者)以作为靶向组件，并含有TNF-α或IL-17的特异性抗体片段(譬如scFv、Fab及与其相似者)以作为效应组件。
根据本公开多种实施方式，本发明治疗方法涉及对需要治疗的个体投予适当的抗发炎Fc型分子构建体。下文讨论了用以治疗多种免疫疾病(特别是自体免疫疾病)的抗发炎Fc型分子构建体的具体例子。
根据某些实施方式，本发明方法可用以治疗类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎。在这些情形中，抗发炎Fc型分子构建体的每一效应组件可以是TNF-α、IL-12/IL-23、IL-1、IL-17或IL-6的特异性抗体片段，而每一靶向组件可以是II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性抗体片段。举例来说，第一对效应组件的每一效应组件是TNF-α的特异性scFv，而第一对靶向组件的每一靶向组件则是II型胶原蛋白的特异性抗体片段。在其他实施方式中，效应组件是TNF-α的特异性scFv，而靶向组件是IX型胶原蛋白的特异性抗体片段。或者是，效应组件是TNF-α的特异性scFv，而靶向组件是α-聚集蛋白聚糖的特异性抗体片段。根据多种实施方式，此种抗发炎Fc型分子构建体可具有上文所述的800A、800B或800C构型。
在另一种用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎的抗发炎Fc型分子构建体中，两个效应组件形成了TNF-α的特异性Fab抗体。在这些情形中，第一对靶向组件的两个靶向组件都是II型胶原蛋白的特异性scFv或IX型胶原蛋白的特异性scFv。这些Fc型分子构建体的构型如图8F所示。
本发明方法亦可用于治疗牛皮癣。举例来说，抗发炎Fc型分子构建体可包含TNF-α、IL-12/IL-23或IL-17的特异性抗体片段以作为效应组件，并包含I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性抗体片段以作为靶向组件。根据某些实施方式，效应组件是IL-17的特异性scFv，而靶向组件是I型胶原蛋白的特异性scFv。或者是，效应组件是IL-17的特异性scFv，而靶向组件是VII型胶原蛋白的特异性scFv。这些抗发炎Fc型分子构建体的构型如上文800A、800B或800C所示。
在另一种用于治疗牛皮癣的抗发炎Fc型分子构建体中，成对的效应组件形成了IL-17的特异性Fab抗体。在这些情形中，第一对靶向组件的两个靶向组件都是I型胶原蛋白的特异性scFv或VII型胶原蛋白的特异性scFv。这些Fc型分子构建体的构型如图8F所示。
另一组可利用本发明抗发炎Fc型分子构建体来治疗的疾病是全身性红斑狼疮、皮肤狼疮或干燥综合症。在这些实施方式中，每一效应组件是BAFF的特异性抗体片段，而每一靶向组件是I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性抗体片段。这些抗发炎Fc型分子构建体的构型如图8A至8C所示。当可理解，成对的效应组件也可以是BAFF的特异性Fab抗体，而成对的靶向组件则可以是I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv，其构型如图8F所示的分子构建体800F。
在其他实施方式中，本发明方法可用以治疗炎性肠病，如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。在这些情形中，每一效应组件是TNF-α的特异性抗体片段，而每一靶向组件是III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性抗体片段。这些Fc型分子构建体的构型如图8A至8C所示。当可想见，成对的效应组件也可以是TNF-α的特异性Fab抗体，而成对的靶向组件则可以是III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv，因而形成如图8F所示的构型。
本发明抗发炎Fc型分子构建体亦可用于治疗骨质疏松症。举例来说，效应组件可以是RANKL的特异性抗体片段，而靶向组件则是I型胶原蛋白或骨结合素的特异性抗体片段。当可理解，RANKL的特异性抗体片段可以是scFv，而使得Fc型分子构建体具有图8A至8C所示的构型；或可以形成Fab的形式，而使得Fc型分子构建体具有图8F所示的构型。
当可想见，上述例子仅为说明，且利用本发明发炎Fc型分子构建体并搭配其他的T-E组合来治疗疾病亦属于本公开的范围。
第七节 用以治疗肿瘤的分子构建体
本公开的另一方面是关于一种Fc型分子构建体，其与上文第五节所述的分子构建体类似，包括直接或间接连接到免疫球蛋白的CH2-CH3区域的至少一对靶向组件以及至少一对效应组件。藉由选择本发明Fc型分子构建体的T-E组件，所述分子构建体可用于治疗多种细胞增生疾病，包括扩散性肿瘤与实体瘤。本公开的优点在于，在某些实施方式中，可利用根据本公开第一方面所述的接合单元，因而提供了一种简便的方式能够控制本发明Fc型分子构建体的细胞毒性药物负载，下文将分别讨论。
(i)以抗体作为靶向组件并以载药束作为效应组件的分子构建体
根据本公开某些实施方式，第一对效应组件的每一效应组件为一载药束，而第一对靶向组件的每一靶向组件是细胞表面抗原或肿瘤相关抗原的特异性抗体片段。在这些情形中，用以治疗肿瘤的Fc型分子构建体的构型如图10A的分子构建体1000A或图10B的分子构建体1000B所示。如图10A所示，效应组件E1(如载药束)系连接于成对CH2-CH3区段1010的C-端，而靶向组件T1(在本例中，如scFv)则是连接于成对CH2-CH3区段1010的N-端。根据替代性的实施方式，所述分子构建体1000B(参见图10B)中成对的靶向组件T1形成了Fab 1030的形式。具体来说，Fab构型1030包含VH-CH1区域1020以及VL-Cκ区域1025，此种Fab构型1030连接于成对CH2-CH3区段1010的N-端，而使得Fc型分子构建体1000A具有IgG构型。在本例中，成对的效应组件E1则连接到成对的CH2-CH3链1010的C-端。
在某些实施方式中，CH2-CH3链是来自人类免疫球蛋白γ1或γ4。一般来说，当想要发挥Fc介导的功能(如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体介导活性(发炎活化或目标细胞溶解))时，可以选择γ1。当不想要发挥Fc介导的功能时，可以选用γ4来建构本发明Fc型分子构建体。当可理解，上文第七部分中所述的Fc型分子构建体的Fc区域结构亦适用于此此处。
可将载药束制备为本公开第一节所述的接合单元(例如，参见图1A至1C)。简单来说，载药束可包含一中心核、多个连接臂以及视需要而加入的耦合臂。根据本公开多种实施方式，中心核可以是带有多个氨基的化合物或包含多个赖氨酸(K)残基的多肽。每一连接臂的一端藉由和化合物核的氨基或多肽K残基的氨基侧链反应而连接于中心核。连接臂的自由端上带有顺丁烯二酰亚胺基，其中每一分子(譬如此处所用的细胞毒性药物分子，和/或下文所述的TLR激动剂或螯合剂/放射性核种复合物分子)藉由和顺丁烯二酰亚胺基反应，以透过连接臂而与中心核连接。根据本公开视需要而实施的实施方式，每一效应组件E1为带有3至5个细胞毒性分子的载药束。
当中心核是多肽的时候，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基可以是半胱氨酸残基、或可具有叠氮基或炔基。根据某些实施方式，当多肽中心核的末端氨基酸残基带有叠氮基时，载药束可透过所述末端残基和多肽延伸C-端之间发生的SPAAC反应或CuAAC反应，而与多肽延伸相连接。或者是，当多肽中心核的末端氨基酸残基带有炔基时，载药束则透过所述末端残基和多肽延伸C-端之间发生的CuAAC反应，而与多肽延伸相连接。又或者是，当多肽中心核的末端残基为半胱氨酸时，或当采用化合物核时，载药束还包含耦合臂。具体来说，耦合臂的一端藉由和多肽的半胱氨酸残基或化合物核中的一个氨基反应，而与中心核相连接。所述耦合臂的自由端亦带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基，而使得载药束的耦合臂和耦合臂的C-端可透过发生于两者间的iEDDA反应(对于带有四嗪基或环辛烯基的耦合臂)、SPAAC(对于带有叠氮基或环辛炔基的耦合臂)反应或CuAAC反应(对于带有炔基或叠氮基的耦合臂)，而彼此连接。
根据某些实施方式，本发明用以治疗肿瘤的Fc型分子构建体还包含一对多肽延伸段1050(参见图10A与10B)，其序列为(G2-4S)2-8C。如图所示，成对的多肽延伸段1050连接到成对CH2-CH3区段1010的C-端。多肽延伸段C-端的半胱氨酸残基透过巯基-顺丁烯二酰亚胺反应而和耦合臂1055相连接。此外，在将其和效应组件E1(此处为一载药束)耦合之前，耦合臂的自由端(即，并未和半胱氨酸残基相连的一端)经过炔基、叠氮基、高应力炔基或四嗪基的修饰，而使得载药束可透过iEDDA反应、SPAAC或CUAAC反应而与其相连。
举例来说，在图10A中，效应组件E1(此处为一载药束)的耦合臂1040透过iEDDA反应而连接于CH2-CH3区段1010。图10A所示的椭圆点1045代表多肽延伸1050与效应组件E1间因为iEDDA反应而产生的化学键结。当可理解，iEDDA反应通常发生于四嗪基与环辛烯基(如反式-环辛烯(transcyclooctene，TCO)基)之间。
或者是，在图10B中，效应组件E1透过SPAAC反应而连接到CH2-CH3区段1010。图10B所示的菱形点1045代表多肽延伸1050与效应组件E1间因为SPAAC反应而产生的化学键结。具体来说，SPAAC反应通常发生在叠氮基与高应力炔基(如，环辛炔基，包括：二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、二环壬炔(BCN)以及二苯并环辛炔(DICO)基)之间。
根据本公开某些视需要而实施的实施方式，用以治疗肿瘤的Fc型分子构建体可进一步包含第二对靶向组件。举例来说，图10C所示的分子构建体1000C包含第一对靶向组件T1、第二对效应组件T2、以及效应组件E1。具体来说，组件T1连接到成对CH2-CH3区段1010的N-端，而第二对靶向组件T2则是以串联或双抗体的构型连接到T1的N-端，因而形成了连接于成对CH2-CH3区段1010的N-端的双特异性scFv。此外，成对的效应组件E1则是藉由耦合臂1055与效应组件E1间的iEDDA反应，连接到CH2-CH3区段1010。然而，本公开不限于此；事实上，在其他实施方式中，效应组件E1也可透过SPAAC反应或CuAAC反应而连接于CH2-CH3区段1010。
根据本公开多种实施方式，具有图10A至图10C所示构型的Fc型分子构建体可用于治疗扩散性肿瘤。举例来说，此种Fc型分子构建体的载药束包含多个细胞毒性药物分子，譬如奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素以及喜树碱。此外，此种Fc型分子构建体的靶向组件可以是细胞表面抗原的特异性抗体片段(譬如scFv、Fab或与其相似者)；上述细胞表面抗原系选自CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD78、CD79a、CD79b、CD138与CD319所组成的群组。
根据本公开其他实施方式，具有图10A至图10C所示构型的Fc型分子构建体可用于治疗实体瘤，包括恶性和/或转移性实体瘤。在某些例子中，适合作为效应组件的载药束可包含多个细胞毒性药物分子，譬如奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素以及喜树碱。或者是，所述载药束可包含多个TLR激动剂，譬如LPS、单磷酰脂A、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG DON、脂磷壁酸、β-葡聚糖以及酵母聚糖。又或者是，载药束可包含多个由螯合剂(如DOTA、NOTA、NODA与DTPA)和放射性核种(譬如90Y、111In与177Lu)所形成的复合分子。另一方面，此种Fc型分子构建体的靶向组件可以是HER1、HER2、HER3、HER4、CA19-9、CA125、CEA、MUC1、MAGE、PSMA、PSCA、黏蛋白关联Tn、唾液酸Tn抗原、Globo H、SSEA-4、神经节苷脂GD2或EpCAM的特异性抗体片段(譬如scFv、Fab或与其相似者)。
当Fc型分子构建体具有第二对靶向组件时，第一对效应组件的效应组件是包含多个细胞毒性药物分子的载药束，而第一与第二对靶向组件分别是HER2的特异性scFv以及HER1的特异性scFv。
(ii)以生长因子/肽类激素作为靶向组件并以载药束作为效应组件的分子构建体
根据本公开某些实施方式，第一对效应组件的每一效应组件为载药束，而第一对靶向组件的每一靶向组件则是生长因子或肽类激素。在这些情形中，适用于治疗实体瘤(包括恶性和/或转移性实体瘤)的Fc型分子构建体可具有图11所示的分子构建体1100的构型。如图11所示，效应组件E1连接到成对CH2-CH3区段1110的C-端，而靶向组件T则连接到成对CH2-CH3区段1110的N-端。
本发明分子构建体1100和与Fc型分子构建体1000A或1000B相似；亦即，还包含一对多肽延伸段1150；此多肽延伸段连接于成对CH2-CH3区段1110的C-端，且其序列为(G2- 4S)2-8C。相似地，为了便于和载药束耦合，多肽延伸段中的半胱氨酸残基可和耦合臂1155连接，而载药束就可以透过发生于其间的iEDDA反应、SPAAC反应或CuAAC反应而和耦合臂1155相连接(请参见上文图10A的相关说明)。举例来说，在图11中，效应组件E1的耦合臂1140透过iEDDA反应而和耦合臂1155相连接，其中椭圆点1145代表耦合臂1155和效应组件E1之间因为iEDDA反应而产生的化学键结。然而，本公开不限于此；事实上，在其他实施方式中，效应组件E1可透过SPAAC反应或CuAAC反应而连接到CH2-CH3区段1110。
当可理解，上文第七节第(i)点关于Fc型分子构建体的Fc区域与载药束的相关描述亦适用于本方面，为求简洁，此处不再赘述。
由于本发明分子构建体(譬如所述分子构建体1100)可用于治疗实体瘤，根据某些实施方式，适合作为效应组件的载药束可包含多个细胞毒性药物分子，譬如奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素以及喜树碱。或者是，所述载药束可包含多个TLR激动剂，譬如LPS、单磷酰脂A、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG DON、脂磷壁酸、β-葡聚糖以及酵母聚糖。又或者是，载药束可包含多个由螯合剂(如DOTA、NOTA、NODA与DTPA)和放射性核种(譬如90Y、111In与177Lu)所形成的复合分子。
另一方面，可采用生长因子作为靶向组件，以搭配上述载药束；适当的生长因子包括但不限于：EGF、突变型EGF、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF与HGF。肽类激素也可作为靶向组件，并与上述载药束搭配使用；肽类激素的例示性实施例包括CCK、生长抑素与TSH。
(iii)以生长因子/肽类激素作为靶向组件并以抗体作为效应组件的分子构建体
根据本公开其他实施方式，Fc型分子构建体可包含一抗体片段以作为效应组件，并包含一生长因子或肽类激素以作为靶向组件。此种分子构建体可用于治疗实体瘤(包括恶性和/或转移性实体瘤)。
在图12A绘示的Fc型分子构建体1200A中，成对的效应组件E1(此处为scFv)连接到成对CH2-CH3区段1210的N-端，而成对的靶向组件T1则是连接到成对CH2-CH3区段1210的C-端。至于图12B所示的Fc型分子构建体1200B，其效应组件E1与靶向组件T1则分别连接到成对CH2-CH3区段1210的C-端与N-端。
当可理解，根据本公开某些实施方式，所述的抗体片段也可采用Fab的形式。举例来说，图12C的Fc型分子构建体1200A包含一对效应组件E1，其形式为Fab构型1230。具体来说，Fab构型1230包含VH-CH1区域1220以及VL-Cκ区域1225；Fab构型1230系连接于成对CH2-CH3区段1210的N-端，而使得Fc型分子构建体1200C具有IgG构型。在本例中，成对的靶向组件T1则连接到成对的CH2-CH3链1210的C-端。
根据本公开多种实施方式，适合作为效应组件的抗体片段是细胞表面抗原的特异性抗体片段；上述细胞表面抗原如PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD3、CD16a、CD28与CD134。另一类的效应组件是生长因子的特异性抗体片段；所述生长因子如EGF、突变型EGF、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF与HGF。也可使用半抗原的特异性抗体片段作为效应组件；例示性的半抗原包括DNP、TNP、丹磺酰、盘尼西林、对胺苯甲酸以及如SEQ ID NO:20所示的多肽。
至于适用于本系列Fc型分子构建体的靶向组件，其可以是如EGF、突变型EGF、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF与HGF等生长因子。或者是，所述靶向组件可以是如CCK、生长抑素与TSH等肽类激素。
本发明的精髓在于采用特定靶向与效应组件的组合或搭配。在较佳的实施方式中，所述分子构建体采用了Fc融合构型。本发明所属技术领域具有通常知识者当可想见，亦可利用其他分子平台来连接此处提出的靶向与效应组件的组合；上述分子平台诸如多肽、蛋白质(譬如白蛋白)、聚醣、聚乙二醇以及其他类型的聚合物，只要其能够作为连接多个分子组件的结构基础即可。
第八节 用以治疗肿瘤的分子构建体的用途
藉由选择一或多种效应组件与靶向组件，上文第七节所述的Fc型分子构建体可用于治疗多种肿瘤，包括扩散性肿瘤与实体瘤。有鉴于此，本公开亦涵盖了利用第七节所述的Fc型分子构建体来治疗肿瘤的方法。根据本公开的实施方式，所述方法包含对需要治疗的个体投予有效量的本发明Fc型分子构建体或包含此Fc型分子构建体的药物。
对于以肿瘤细胞为靶向对象的分子构建体标，譬如以EGFR、HER2/neu或CD20为目标者，其药理学目的在于使表达这些抗原的目标细胞溶解。一般来说，此类分子构建体较佳应具有Fc介导的功能，如ADCC或补体介导的细胞溶解。然而，若可将所述分子构建体和能够引发强烈免疫破坏作用的效应组件(如CD3或CD16a的特异性scFv)或具有免疫调节功能的效应组件(如PD-1、PD-L1、CTLA-4的特异性scFv)相连，此种Fc介导的功能可能就并非关键。IgG分子两条重链的末端可以接上由细胞毒性分子、LPS分子或与放射性核种复合的螯合基形成的载药束。
人类IgG1的Fc区域(成对的CH2-CH3区域)可介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体介导的细胞溶解(CMC)。本发明体认到，可以维持此类Fc介导的功能，并提升抗体结合的结合亲合力。已知肿瘤中会有一定比例的细胞对于目标抗原的表达量较低，故对标靶治疗抗体产生抗性。举例来说，曲妥珠单抗或立妥昔单抗可能无法杀灭乳癌肿瘤中HER2/Neu表达量较低的细胞或B细胞淋巴瘤中CD20表达量较低的细胞。本发明提出的分子耦合物具有明显较高的结合亲合力，因此能够有效率且强力地和这些细胞结合，并能介导这些细胞的细胞溶解机制。
针对不同亚型的IgG的各种Fc受体位于不同类别的效应细胞上，这些受体搭配特定IgG亚型能够介导不同类别的免疫机制。FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)与FcγRIIIb(CD16b)位于巨噬细胞、嗜中性白血球以及嗜酸性白血球上，并可介导覆有IgG的粒子与微生物的吞噬作用(phagocytosis)。FcγRIIIa(CD16a)主要位于NK细胞上，也会出现在某些组织中的巨噬细胞上，其可介导ADCC。当NK细胞上的FcγRIIIa和IgG1结合后并聚集成群，NK细胞会分泌细胞毒性颗粒与致死因子，以使得与IgG结合的细胞溶解。根据本发明较佳的实施方式，可将FcγRIIIa的特异性scFv抗体接合到多臂接合物上，再将其和针对多种抗原目标(如CD20、EGFR)以及表达于多种细胞目标上的肿瘤相关抗原的scFv偶联。近来有研究指出，具有HER2/Neu的特异性Fab及FcγRIIIa的特异性Fab的双特异性抗体对于HER2抗原表达量较低的肿瘤细胞的细胞溶解效果优于抗HER2/Neu抗体(曲妥珠单抗)。本发明所述的分子构建体对于HER2/Neu两者皆有较佳的结合亲合力，且对于HER2/Neu表达量非常低的肿瘤细胞应有较佳的细胞溶解活性。
对于扩散性肿瘤(如B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、衍生自T细胞的淋巴瘤或白血病以及骨髓性白血病)的治疗，所使用的Fc型分子构建体可利用包含多个细胞毒性药物分子的载药束作为效应组件，并利用对适当细胞表面抗原的特异性抗体片段作为靶向组件。
根据某些实施方式，本发明方法可用以治疗B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病。在这些情形中，所用的Fc型分子构建体是以人类B淋巴细胞上的细胞表面抗原为靶标；譬如CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD43、CD79a与CD79b。
在其他实施方式中，本发明方法可用以治疗如浆细胞瘤或多发性骨髓瘤等扩散性肿瘤；在这些情形中，可利用人类浆细胞上的细胞表面抗原(包括CD38、CD78、CD138与CD319)作为靶标。
或者是，本发明方法可用以治疗衍生自T细胞的淋巴瘤或白血病，所用的分子构建体可以利用人类T细胞上的细胞表面抗原(如CD5、CD30与CD43)作为靶标。
根据某些实施方式，当用于治疗骨髓性白血病时，所使用的分子构建体可以利用人类骨髓细胞系淋巴细胞上的细胞表面抗原(如CD33与CD34)作为靶标。
根据某些实施方式，本发明Fc型分子构建体使用载药束作为效应组件，并使用对适当肿瘤相关抗原的特异性抗体片段作为靶向组件，其可用以治疗例如以下的实体瘤：黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌以及头颈部鳞状细胞癌。在这些实施方式中，所述分子构建体可具有上文第七节(ii)所述的构型。
根据某些视需要而实施的实施方式，用以治疗实体瘤的方法还包含以下步骤：在投予所述分子构建体之前，对所述个体进行血液透析程序，上述程序使用一或多种肿瘤相关抗原的特异性抗体片段，以移除从肿瘤进入个体血液循环中的肿瘤相关抗原。
或者是，用以治疗实体瘤的方法所用的Fc型分子构建体是以载药束或细胞表面抗原、生长因子或半抗原的特异性抗体片段作为效应组件，并以生长因子或肽类激素作为靶向组件。此种分子构建体的例示性实施例包括上文第七节(iii)所述者。可利用这些分子构建体来治疗的实体瘤有黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌或头颈部鳞状细胞癌。
根据某些实施方式，所述分子构建体使用含细胞毒性药物分子的载药束作为效应组件，并使用EGF或其突变株作为靶向组件。
根据其他实施方式，所述分子构建体使用CD3、CD16a、PD-1或VEGF的特异性scFv作为效应组件，并使用EGF或其突变株作为靶向组件。
根据某些实施方式，所述的效应组件是半抗原的特异性抗体片段。在这些情形中，上述方法还包含以下步骤：在投予所述分子构建体之后，对该个体投予以相同半抗原标记的免疫调节效应物。举例来说，上述免疫调节效应物可以是IFN-α、IL-2、TNF-α、IFN-γ、以及PD-1、PD-L1、CTLA-4或CD3的特异性IgG抗体。
在某些实施方式中，成对的CH2-CH3区段是衍生自人类IgG重链γ1，且所述分子构建体使用含细胞毒性药物分子或LPS分子的载药束作为效应组件，并使用EGF或其突变株、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、FGF、HGF、CCK、生长抑素或TSH作为靶向组件。
在某些实施方式中，成对的CH2-CH3区段是衍生自人IgG重链γ1，且所述分子构建体使用人CD3、CD16a、PD-1，PD-L1或VEGF-A的特异性scFv作为效应组件，并使用EGF或其突变株、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、FGF、HGF、CCK、生长抑素或TSH作为靶向组件。
实验例
实验例1：合成作为多肽的多肽1(SEQ ID NO:17)、多肽2(SEQ ID NO:18)以及多肽3(SEQ ID NO:19)，并将半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-反式-环辛烯(TCO)复合以作为耦合臂
利用固态多肽合成法来合成多肽1-3，并利用反相高效液相层析(HPLC)纯化以得到至少95％的纯度。反相HPLC使用Shimadzu Nexera-i LC-2040C 3D HPLC系统与Kromasil100-5C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、乙腈线性梯度为10％至45％、15分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。
将纯化的多肽溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0；含50mM NaCl与5mM EDTA)，最终浓度2mM。利用1mM三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，简称TCEP)使溶解的多肽还原，反应温度25℃、时间2小时。将多肽和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO(Conju-probeInc.,San Diego,USA)以1/10的比例混合，并在pH 7.0、25℃的条件下反应24小时，以使半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO复合而带有功能性连接基团TCO。利用反相HPLC来纯化TCO-多肽复合物；使用Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。图13为纯化TCO-多肽2的反相HPLC溶析曲线图；图中以箭头标示TCO-多肽2的峰值。
以MALDI-TOF质谱分析来确认所合成的三种TCO-多肽(如下所示)。由中研院分子生物研究所(台湾台北)的核心设施单位进行质谱分析。以Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF质谱分析仪(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)进行测量。
所述TCO-多肽1(如下所示)的分子量为1,807.0道尔顿。
所述TCO-多肽2(如下所示)的分子量为2,078.9道尔顿。
所述TCO-多肽3(如下所示)的分子量为3,380.8道尔顿。
实验例2：合成作为多肽的多肽1以及多肽2，并将半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG4-四嗪复合以作为耦合臂
利用实验例1所制备的多肽1与多肽2，将其溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0；含50mM NaCl与5mM EDTA)，最终浓度2mM。利用1mM TCEP使溶解的多肽还原，反应温度25℃、时间2小时。将多肽和顺丁烯二酰亚胺-PEG4-四嗪(Conju-probe Inc.)以1/5的比例混合，并在pH 7.0、4℃的条件下反应24小时，以使半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG4-四嗪复合而带有功能性连接基团四嗪基。利用反相HPLC来纯化四嗪基-多肽复合物；使用Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。利用上文实施例所述的方式，以MALDI-TOF质谱分析来确认所合成的两种四嗪基-多肽。
所述四嗪基-多肽1(如下所示)的分子量为1,912.7道尔顿。
所述四嗪基-多肽2(如下所示)的分子量为2,185.2道尔顿。
实验例3：合成作为多肽的多肽1以及多肽2，并将半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG5-DBCO复合以作为耦合臂
利用上文实验例所制备的多肽1与多肽2，将其溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0；含50mM NaCl与5mM EDTA)，最终浓度2mM。利用1mM TCEP使溶解的多肽还原，反应温度25℃、时间2小时。
将多肽和顺丁烯二酰亚胺-PEG5-DBCO(Conju-probe Inc.)以1/5的比例混合，并在pH 7.0、室温下反应24小时，以使半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG5-DBCO复合而带有功能性连接基团DBCO基。利用反相HPLC来纯化DBCO-多肽复合物；使用SupelcoC18管柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。利用上文实施例所述的方式，以MALDI-TOF质谱分析来确认所合成的两种DBCO-多肽。
所述DBCO-多肽1(如下所示)的分子量为1,941.8道尔顿。
所述DBCO-多肽2(如下所示)的分子量为2,213.9道尔顿。
实验例4：合成作为多肽中心核的多肽4(SEQ ID NO:21)、多肽5(SEQ ID NO:22)以及多肽6(SEQ ID NO:23)
利用固态多肽合成法来合成多肽4-6，并利用反相HPLC纯化以得到至少95％的纯度。高炔丙基甘氨酸(GHP)与迭氮高丙氨酸(AAH)等非天然氨基酸分别带有炔基与叠氮基。反相HPLC使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、乙腈线性梯度为2％至90％、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。
利用MALDI-TOF质谱分析来确认所合成的三种多肽。所述多肽4(Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSK；SEQ ID NO:21)的分子量为1,317.0道尔顿；所述多肽5(Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSK；SEQ ID NO:22)的分子量为1,589.9道尔顿；而所述多肽6(Ac-AAHGGSGGSGGSKGSGSKGSK；SEQ ID NO:23)的分子量为1,634.66道尔顿。
实验例5：合成作为多肽的多肽7(SEQ ID NO:24)，并将半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO或顺丁烯二酰亚胺-PEG4-四嗪复合以作为耦合臂
利用上文实验例所述方法合成多肽7(Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSGSC；SEQ ID NO:24)，并使其和交联物复合。利用MALDI-TOF来确认所合成的TCO-多肽7与四嗪基-多肽7。
所述TCO-多肽7(如下所示)的分子量为1,736.78道尔顿。
Ac-GHP-GGSGGSGGSKGSGSKGSGSC-PEG3-TCO
所述四嗪基-多肽7(如下所示)的分子量为1,820.62道尔顿。
Ac-GHP-GGSGGSGGSKGSGSKGSGSC-PEG3-四嗪基
实验例6：合成作为多肽的多肽8(SEQ ID NO:25)，并将半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO、顺丁烯二酰亚胺-PEG4-四嗪或顺丁烯二酰亚胺-PEG5-DBCO复合以作为耦合臂
利用固态多肽合成法来合成多肽8(Ac-C-Xaa-K-Xaa-K-Xaa-K；其中Xaa为具有两个EG单元的聚乙二醇化氨基酸；SEQ ID NO:25)，并利用反相HPLC纯化以得到至少95％的纯度。反相HPLC使用Kromasil 100-5C18管柱(250mm X 4.6 mm；5μm)，流动相使用水与0.1％TFA、乙腈线性梯度为10％至40％、12分钟，流速1.0 mL/min、管柱温度25℃。
利用质谱分析ESI-MS来确认所合成的多肽8。利用LTQ Orbitrap XL ETD质谱分析仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)并搭配标准ESI离子源，进行高分辨率与高质量精度实验。由中研院(台湾台北)基因体研究中心的核心设施单位进行质谱ESI-TOF分析。所合成的多肽样本在981.9有较强的分子离子峰，与[M-H]-相应，表示PEG化多肽的实际分子量为983.0道尔顿。
利用上文实验例的方法使多肽和交联物复合，并利用质谱分析ESI-MS来确认产物(如下所示，其中Xaa2表示有两个EG单元的聚乙二醇化氨基酸)。
所述TCO-多肽8(如下所示)的分子量为1,478.87道尔顿。
TCO-PEG3-C-(Xaa2-K)3
所述四嗪基-多肽8(如下所示)的分子量为1,584.92道尔顿。
四嗪基-PEG4-C-(Xaa2-K)3
本发明DBCO-多肽8(如下所示)的分子量为1,613.8道尔顿
DBCO-PEG5-C-(Xaa2-K)3
实验例7：合成作为多肽的多肽9(SEQ ID NO:26)，并将半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO复合以作为耦合臂
利用上文实验例所述的方法制备多肽9(Ac-C-Xaa-K-Xaa-K-Xaa-K-Xaa-K-Xaa-K；其中Xaa为具有六个EG单元的聚乙二醇化氨基酸；SEQ ID NO:26)。利用质谱分析ESI-MS来确认所合成的多肽9。所合成的多肽样本在828.0有较强的分子离子峰，与[M+3H]3+相应，表示PEG化多肽的实际分子量为2,480.7道尔顿。
利用上文实验例的方法使多肽和交联物复合，并利用质谱分析ESI-MS来确认产物。所述TCO-多肽9(如下所示)的分子量为2,975道尔顿。
TCO-PEG3-C-(Xaa6-K)5
实验例8：将NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和TCO-多肽1及TCO-多肽2的氨基复合以合成接合单元
将两个PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂连接到多肽TCO-多肽1；并将三个PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂连接到多肽TCO-多肽2。交联物NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺(琥珀酰亚胺-[(N-顺丁烯二酰亚胺基-丙酰胺基)-十二乙二醇]酯；succinimidyl-[(N-maleimido-propionamido)-dodecaethyleneglycol]ester)系购自Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham,USA)。根据制造商的指示进行接合；将带有赖氨酸残基的多肽溶解于复合缓冲液(磷酸盐缓冲液(PBS)、pH 7.5)中，浓度100mM。在溶解的多肽中加入NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺交联物，最终浓度1mM(比起0.1mM多肽溶液，莫耳数过量20倍)。使反应混合物在室温下反应18小时。以反相HPLC纯化(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽1)复合物与(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽2)复合物；使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。图14为纯化(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽2)复合物的反相HPLC曲线图；图中以箭头标示峰值。
利用MALDI-TOF质谱分析来确认所合成的(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽1)复合物以及(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽2)复合物。
上述(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽1)复合物(如下所示)是一种采用多肽的接合单元，其上接有一条带有TCO基的耦合臂以及两条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。MALDI-TOF质谱分析的结果显示上述分子构建体的分子量为3,330.7道尔顿。
上述(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽2)复合物(如下所示)是一种采用多肽的接合单元，其上接有一条带有TCO基的耦合臂以及三条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。图15为其MALDI-TOF质谱分析结果，图中数据显示上述分子构建体的分子量为4,332道尔顿((ESI-TOF)m/z(z＝4):[M+4H]+；C185H313N31O83S1计算值：1083.7829；实际值1083.7833),对应于[M+Na]+)。
实验例9：将NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和四嗪基-多肽2以及DBCO-多肽1的氨基复合以合成接合单元
将三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂连接到四嗪基-多肽2，并将两条上述连接臂连接到DBCO-多肽1。NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和多肽中心核中赖氨酸残基的氨基之间的复合方式，如上文实验例所述，并利用MALDI-TOF质谱分析来确认产物。
如下所示，上述(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(四嗪基-多肽2)复合物上接有一条带有四嗪基的耦合臂以及三条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。图16A为MALDI-TOF质谱分析结果，图中显示此构建体的分子量为4,461道尔顿。
如下所示，上述(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(DBCO-多肽1)复合物上接有一条带有DBCO基的连接臂以及两条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。图16B为MALDI-TOF质谱分析结果，结果显示此构建体的分子量为3,445道尔顿。
实验例10：将NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和多肽4至多肽6的氨基复合以合成接合单元
将两条PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂连接到多肽4；并将三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂连接到多肽5与多肽6。NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和多肽中心核中赖氨酸残基的氨基之间的复合方式，如上文实验例所述，并利用MALDI-TOF质谱分析来确认产物。
上述(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-多肽4复合物(如下所示)的分子量为2,817.3道尔顿；此分子构建体是以多肽为基础的接合单元，带有一个炔基与两条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。
上述(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-多肽5复合物(如下所示)的分子量为3,839.2道尔顿；此分子构建体是以多肽为基础的接合单元，带有一个炔基与三条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。
(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-多肽6复合物(如下所示)的分子量为3,811.5道尔顿；此分子构建体是以多肽为基础的接合单元，带有一个叠氮基与三条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。
实验例11：将NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和TCO-多肽7以及四嗪基-多肽7的氨基复合以合成接合单元
将两条PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂接到上文实验例制备的多肽7上。NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和多肽中心核中赖氨酸残基的氨基之间的复合方式，如上文实验例所述，并利用MALDI-TOF质谱分析来确认产物。
上述(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽7)复合物(如下所示)的分子量为3,237.63道尔顿；此分子构建体是以多肽为基础的接合单元，带有一个炔基、一条带有TCO基的耦合臂、以及两条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。
上述(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(四嗪基-多肽7)复合物(如下所示)的分子量为3,342.98道尔顿；此分子构建体是以多肽为基础的接合单元，带有一个炔基、一条带有四嗪基的耦合臂、以及两条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。
实验例12：将NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和TCO-多肽8以及四嗪基-多肽8的氨基复合以合成接合单元
将三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂连接到作为多肽的TCO-多肽8与四嗪基-多肽8上。NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和多肽中心核中赖氨酸残基的氨基之间的复合方式，如上文实验例8所述，并利用MALDI-TOF质谱分析来确认产物。
上述(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽8)复合物(如下所示)的分子量为3,774.9道尔顿；此分子构建体是以聚乙二醇化氨基酸与赖氨酸为基础的接合单元；其上接有一条带有TCO基的耦合臂、以及三条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。
上述(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(四嗪基-多肽8)复合物(如下所示)的分子量为3,856.94道尔顿，参见图17((ESI-TOF)m/z(z＝4):[M+4H]+C171H287N23O71S1H3Na计算值964.7363；实测值964.7324)；此分子构建体是以聚乙二醇化氨基酸与赖氨酸为基础的接合单元；其上接有一条带有四嗪基的耦合臂、以及三条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。
实验例13：将NHS-PEG6-顺丁烯二酰亚胺和TCO-多肽9的氨基复合以合成接合单元
将五条PEG6-顺丁烯二酰亚胺连接臂连接到作为多肽的TCO-多肽9上。NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和多肽中心核中赖氨酸残基的氨基之间的复合方式，如上文实验例8所述，并利用MALDI-TOF质谱分析来确认产物。
(PEG6-顺丁烯二酰亚胺)-(TCO-多肽9)复合物(如下所示)的分子量为5,543.78道尔顿，参见图18((ESI-TOF)m/z(z＝6):[M+6H]+C244H421N29O101S1计算值Na 924.297；实测值924.299)；此分子构建体是以聚乙二醇化氨基酸与赖氨酸为基础的接合单元；其上接有一条带有TCO基的耦合臂、以及五条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。
实验例14：将1,3,5-三苯胺和一条NHS-PEG12-炔连接臂与两条NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺基连接臂复合以合成接合单元
1,3,5-三苯胺购自BOC Sciences(Creative Dynamics Inc.,NY,USA)，而NHS-PEG12-炔连接臂与NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺则是购自Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham,MA,USA)。采用反应式13所述的两步法将连接臂彼此复合。在步骤(i)，将1,3,5-三苯胺溶解于接合缓冲液(磷酸盐缓冲液(PBS)、pH 7.2)、浓度1mM，并将NHS-PEG12-炔交联物以1mM的最终浓度加入1,3,5-三苯胺溶液(以莫耳比1：1比例混合)中。其后，将4μl的250mM NHS-PEG12-炔的储备原液加入1ml的1,3,5-三苯胺溶液中。使反应混合物在室温下反应1小时。在步骤(ii)，将NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺交联物以10mM的最终浓度加入至步骤(i)的反应溶液(以莫耳比1：30比例混合)中。其后，将30μl、250mM的NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺储备原液加入125毫升的反应溶液中；接着再加入845μl接合缓冲液，使最终溶液体积达到1ml。使反应混合物在室温下反应2小时。
使反应混合物通过反相HPLC管柱并收集含有所述接合单元的部分，以纯化反应产物并得接有一条NHS-PEG12-炔基耦合臂以及两条NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺基连接臂的1,3,5-三苯胺。以ESI质谱技术来分析产物，参见图19((ESI-TOF)m/z:[M+H]+-C104H180N7O46计算值2263.1955；实测值2263.1920)。在MS图谱中，可在2264.1934、2265.1938与2266.1927观察到三个同位素峰，分别对应于[M+H+1]+、[M+H+2]+与[M+H+3]+。
实验例15：将五个DM1-SMCC分子复合至TCO-多肽9
DM1-SMCC是经过琥珀酰亚胺-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基-甲基)环己烷羧酸酯(succinimidyl-4-(N-maleimido-methyl)cyclohexan-1-carboxylate，简称SMCC)接合物修饰的N2’-脱乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登木素(N2’-Deacetyl-N2’-(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytansine，简称DM1)；本实验例所用的DM1-SMCC系购自ALBTechnology Inc.(中国，香港)。将带有自由胺基的TCO-多肽9溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中。在每毫升带有NH2基的TCO-多肽9溶液中，加入4μl的250mM DM1-SMCC，并使DM1-SMCC的最终浓度为1mM，混合液中DM1-SMCC和TCO-多肽9(0.04mM)的莫耳比为25：1。使反应混合物在室温下反应24小时。利用HPLC分离反应产物并将其冻干。利用反相HPLC来纯化带有五个DM1-SMCC分子的TCO-多肽9；使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸，乙腈线性梯度为30％至100％、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。
《反应式13 1,3,5-三苯胺和一条NHS-PEG12-炔连接臂与两条NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺基连接臂复合所用的两步合成法》
图20为纯化带有五个DM1-SMCC分子的TCO-多肽9(亦称为载药束)的反相HPLC曲线图；图中以箭头标示其峰值。对所合成的载药束进行质谱分析，结果如图21所示，所述分子构建体的分子量为7,803道尔顿。
上述载药束(如下所示)系由带有一个自由TCO官能基和一组五个DM1分子(作为效应组件)的接合单元所组成。
实验例16：将LPS分子复合至TCO-多肽1
在Explorer FPLC系统中，利用Superdex 200 10/300Tricon管柱(HR,GEHealthcare)以层析法纯化来自肠道沙门氏菌(Salmonella enterica sv.Minnesota)的LPS(购自Sigma，型录编号L2137)。冲提缓冲液为50mM HEPES(pH7.5)。将样本以0.5mL/min速率注入管柱进行等度冲提(eluted isocratically)，并收集成1-mL的冲提馏分。之后使用3500MWCO膜，将含有LPS的冲提馏分在MilliQ水中于4℃下透析一晚。冻干透析所得的LPS，以供后续使用。
在接合前，利用以下方法活化纯化的LPS。将1ml的LPS水溶液(2mg/ml)震荡3分钟，并在25℃下以音波处理15分钟。之后，加入1ml的4.5mM脱氧胆酸钠(s简称NaDC)；再加入100μl的2.5mM EDTA溶液。在37℃下将混合物搅拌30分钟、音波处理15分钟，之后再于37℃下搅拌30分钟。加入40μl的100mg/ml四氟硼酸1-氰-4-二甲基氨基吡啶(简称CDAP)(于乙腈中)。30秒后，加入40μl的0.2M三乙胺(简称TEA)水溶液。将混和物保持在25℃下并搅拌150秒，以使得CDAP将LPS活化。
将上述LPS和丹磺酰肼反应，以引入肼基，以供后续和接合单元上的氨基反应。简言之，将1ml的2.0mg/ml丹磺酰肼(于0.1M硼酸钠缓冲液中，pH 9.3)加入经CDAP活化的LPS中。在黑暗中于25℃下搅拌混合物，使其反应一晚。加入100μl的乙醇胺使反应中止。利用3,500MWCO透析膜在Milli-Q水中于暗室、4℃下透析24小时，以移除未反应的丹磺酰肼。利用荧光光谱分析来确认产物，测量产物在325nm下的发射光谱。图22的荧光分光亮度分析显示当LPS和丹磺酰肼反应后，其最大发射波长为495nm。
利用MALDI-TOF质谱分析来确认经纯化的LPS以及经丹磺酰肼活化的LPS。经纯化的LPS分子量为3,143道尔顿；经丹磺酰肼活化的LPS分子量为3,651道尔顿，显示一个LPS分子复合了两个丹磺酰肼分子；一个丹磺酰肼分子的分子量为265道尔顿。
将LPS分子复合到TCO-多肽1中赖氨酸残基的氨基。简言之，将0.67莫耳经丹磺酰肼活化的LPS和0.067莫耳TCO-多肽1(于0.1M碳酸氢钠缓冲液中、pH 9.5)混合，在室温下反应一晚。
所得到的载药束(如下所示)是由带有一个自由TCO官能基以及一组两个LPS分子(作为效应组件)的接合单元所组成。
实验例17：将咪喹莫特分子复合至NHS-PEG6-顺丁烯二酰亚胺-(TCO-多肽9)复合物
将咪喹莫特分子和NHS-PEG5-NHS(Conju-probe Inc.)以1：3.5的莫耳比混合，以使咪喹莫特分子的氨基和上述同型双官能交联物反应。质谱分析结果显示和咪喹莫特接合的PEG5-NHS的分子量为658.36道尔顿(图23)。
利用HPLC纯化产物(即，咪喹莫特-PEG5-NHS)，以移除多余、未反应的交联物。之后在100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中混合TCO-多肽9和咪喹莫特-PEG5-NHS，并在25℃下反应18小时。质谱分析结果显示，带有咪喹莫特的载药束的分子量为5,135道尔顿。
此一载药束(如下所示)是由带有一个自由TCO官能基以及一组五个咪喹莫特分子(IQ，作为效应组件)的接合单元所组成
实验例18：将DOTA-NHS接合至TCO-多肽9
N-羟基琥珀酰亚胺-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸酯(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid N-hydroxysuccinimide ester，简称DOTA-NHS)系购自Macrocyclics,Inc.(Dallas,USA)。利用反应式14所示的两步骤法，将DOTA-NHS接合到TCO-多肽9。在第一步中，将TCO-多肽9溶解于接合缓冲液(磷酸延缓冲液(PBS)，含5mM EDTA、pH 7.0)，浓度为1mM。将反应混合物在室温下反应一晚。在第二步中，将DOTA-NHS酯加入反应溶液中，最终浓度为100mM(以1：100的莫耳比混合或1：20的当量比混合)。由于DOTA-NHS酯带有TFA而呈酸性，将溶液的pH值调整为8.0，以便活化NHS酯-NH2的接合反应。使反应混合物在室温下反应一晚。
由图24A的数据可以看出，上述分子构建体的分子量为4907.685((ESI-TOF)m/z(z＝5):[M+3H]+；C214H38N39O86S1计算值982.5358；实测值982.5370)。
《反应式14DOTA-NHS与TCO-多肽9复合所用的两步合成法》
实验例19：将钇原子螯合至以TCO-多肽9为基础的DOTA-复合接合单元
反应式15说明了以DOTA-(TCO-多肽9)复合物和五个Y3+离子螯合。在此处，将Y(NO3)3溶液以莫耳比1：100的比例加入至反应混合物中，并在室温下反应2小时。利用NAP-10Sephadex G-25管柱将来移除反应混合物中游离的DOTA-NHS与Y3+离子。
《反应式15以DOTA-(TCO-多肽9)复合物螯合钇原子》
利用MALDI-TOF质谱分析法来分析带有Y3+离子的DOTA-(TCO-多肽9)复合物。质谱分析结果显示带有Y3+离子的DOTA-(TCO-多肽9)复合物样本的分子量为5,355道尔顿(图24B)。
此一载药束(如下所示)是由带有一个自由TCO官能基以及一组五个与Y3+离子螯合的DOTA基团(作为效应组件)的接合单元所组成。
实验例20：从分别产生人CD79a、CD79b与VII型胶原蛋白的特异性单克隆抗体的融合瘤细胞株分离VH以及VL序列以制备scFv
利用标准融合瘤制备方法，于实验室中制备可产生抗CD79a抗体的小鼠B细胞融合瘤24C10以及可产生抗CD79b抗体的小鼠融合瘤1F10。可产生人VII型胶原蛋白特异性抗体的小鼠融合瘤系细胞株LH7.2是英国邓迪大学(University of Dundee)Irene M.Leigh教授所赠。利用SuperScript III RT-PCR系统(Invitrogen,Carlsbad,USA)进行Poly(A)+RNA反转录，并合成第一股cDNA。利用Ig-primer Sets(Novagen,Madison,USA)提供的DNA引子组并根据制造商的操作说明进行PCR，进而扩增VH与VL的cDNA，以便决定24C10、1F10与LH7.2的可变区域的序列。决定每一株的VH与VL序列。
小鼠抗人类CD79a单克隆抗体株24C10的VH与VL的cDNA序列分别如SEQ ID NO:27与SEQ ID NO:28所示；小鼠抗人类CD79b株抗体株1F10的VH与VL的cDNA序列分别如SEQ ID NO:29与SEQ ID NO:30所示；小鼠抗人类VII型胶原蛋白单克隆抗体株LH7.2的VH与VL的cDNA序列分别如SEQ ID NO:31与SEQ ID NO:32所示。
实验例21：制备人CD79b或VII型胶原蛋白的特异性scFv
于制备抗CD79b抗体1F10的scFv(SEQ ID NO:33)以及抗人类VII型胶原蛋白抗体LH7.2的scFv(SEQ ID NO:34)时，合成编码VL-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH-(GGGGS)2-C的DNA序列。在scFv的C-端加入可挠性接合物GGGGSGGGGS以及半胱氨酸残基，而使得之后可将经修饰的scFv连接到本发明各种接合单元的连接臂所携带的顺丁烯二酰亚胺基。
将编码scFv的序列置入pG1K表达盒中。将Expi293F细胞以每毫升2.0×106个活细胞的密度播于Expi293F表达培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有7.5×108个细胞的255ml培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入ExpiFectamineTM 293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育6天。收集培养上清液，并使用蛋白L亲合力层析法纯化培养基中的scFv蛋白。图25A与25B分别是纯化的抗CD79b抗体1F10的scFv蛋白的SDS-PAGE与ELISA分析结果。图25C与25D分别是纯化的抗VII型胶原蛋白抗体LH7.2的scFv蛋白的SDS-PAGE与ELISA分析结果。
实验例22：利用HEK293过表达系统制备曲妥珠单抗、立妥昔单抗、西妥昔单抗、尼伏鲁单抗、伊匹木单抗、雷珠单抗、阿达木单抗与突变替利珠单抗的scFv
衍生自上述抗体的scFv经过特殊设计而在C-端带有可挠性接合物(GGGGSGGGGS)与末端的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基的巯基可和位于各接合单元连接臂自由端的顺丁烯二酰亚胺基接合。于制备曲妥珠单抗、立妥昔单抗、西妥昔单抗、尼伏鲁单抗、伊匹木单抗、雷珠单抗(ranibizumab)、阿达木单抗与突变替利珠单抗(teplizumab)的scFv时，直接使用上述人源化抗体的VH与VL的DNA序列，而未进一步进行密码子优化。合成编码以下序列的的DNA序列：VL-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH-(GGGGS)2-C。替利珠单抗抗体分子VH的CDR3中带有半胱氨酸残基，这会干扰上文所述的SH-顺丁烯二酰亚胺复合。故本实验例制备了突变的替利珠单抗，将半胱氨酸残基取代为丝氨酸残基。本发明各实验例中所制备的曲妥珠单抗、立妥昔单抗、西妥昔单抗、尼伏鲁单抗、伊匹木单抗、雷珠单抗、阿达木单抗与突变替利珠单抗的scFv的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:35至42所示。
于利用哺乳类动物表达系统来制备scFv蛋白时，使用以Expi293FTM细胞为基础的过表达系统来制备10-500mg的scFv，以供后续实验。各scFv的产量足供制备多种构建体，以用于活体外试验与啮齿类动物模型试验。所用系统使用ExpiFectamineTM 293转染套组(Life Technologies,Carlsbad,USA)，其包含Expi293FTM细胞株、阳离子脂质系ExpiFectamineTM 293试剂、ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与2、以及培养基(Gibco,NewYork,USA)。
将编码scFv的序列置于pG1K表达盒中。将Expi293F细胞以每毫升2.0×106个活细胞的密度播于Expi293F表达培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有7.5×108个细胞的255ml培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入ExpiFectamineTM 293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育5到6天。收集培养上清液，并使用蛋白L亲合力层析法纯化培养基中的scFv蛋白。据经验，从1升的培养物中可以收集到超过300mg的阿达木单抗与曲妥珠单抗的纯化scFv蛋白。图26A是纯化的曲妥珠单抗scFv(电泳线1)与阿达木单抗scFv(电泳线2)的SDS-PAGE(10％)分析结果；而图26B与26C分别是纯化的曲妥珠单抗scFv与阿达木单抗scFv的ELISA分析结果。图26D与26E分别是纯化的西妥昔单抗scFv的SDS-PAGE与ELISA分析结果，其中曲妥珠单抗scFv(抗HER2 scFv)作为阴性对照组。
实验例23：利用毕赤酵母表达系统制备阿达木单抗scFv
目标scFv构建体与上文实验例所述相同，但所用的讯息肽不同。
利用带有XhoI与NotI限制位的正向引子(5’-GTATCTCTCGAGAAAAGAGATATTCAGATGACGCAATCCCC-3’；SEQ ID NO:43)与反向引子(5’-GTATCTGCGGCCGCTTAACAGGAGCCACCGCCAC-3’；SEQ ID NO:44)来合成阿达木单抗scFv的DNA序列并将其次选殖到pPICZα表达载体中，其中Kex2讯息肽使得阿达木单抗scFv会被分泌到细胞外。之后利用电穿孔法将表达质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)中。进行ELISA分析来测定阿达木单抗scFv的表达量，以筛选出高产量选殖株。在480个转型株中，选出五株进行后续蛋白诱导并利用SDS-PAGE进一步检验。选用选殖株scFv_1-A2进行后续大规模发酵生产。
将高产量选殖株scFv_1-A2接种于100ml的缓冲型甘油复合培养基(bufferedglycerol-complex medium，简称BMGY，含有1％酵母抽出物、2％蛋白胨、100mM K3PO4、1.34YNB、0.4mg/L生物素以及1％甘油，pH 6.0)中，并在30℃下以200rpm的转速培养24小时。第二天，将培养物更换到发酵状态下，保持在30℃、30％溶解氧以及pH 6.0条件下。发酵24小时后，引入氮源(YE，蛋白胨)以及甲醇(0.5％，v/v)以诱发蛋白表达。收集培养上清液并进行蛋白纯化。
质谱分析结果显示scFv的分子量为27,296.28道尔顿。图27A是纯化的阿达木单抗scFv的SDS-PAGE分析结果，而图27B是纯化的阿达木单抗scFv的ELISA分析结果。scFv的分子量和预期相符，且酵母产生的阿达木单抗scFv和人类TNF-α的结合能力与Expi-293F产生的阿达木单抗scFv不相上下。
实验例24：制备CCK类似物
CCK的肽类似物(CGGGGSDY(SO4H)L(N)GWL(N)DF-NH2；SEQ ID NO:45)是由含8个氨基酸片段的CCK(其中有三个非天然氨基酸)以及6个氨基酸残基(CGGGGS)组成的连续N-端延伸段(末端为半胱氨酸残基)所组成。酪胺酸残基(Y)芳香环上的OH基经硫酸化，而X是正白胺酸残基。半胱氨酸残基上的SH基可和根据本公开的接合单元的PEG-顺丁烯二酰亚胺基连接臂复合。此一肽类似物是由Kelowna Inc.(台湾台北)特制。
实验例25：制备TCO-抗CD3 scFv与DBCO-抗CD3 scFv
根据上文实验例所述，合成并表达编码SEQ ID NO:42蛋白的DNA序列。CD3的特异性scFv的VL与VH序列为上述突变替利珠单抗的VL与VH。欲将Mal-PEG3-TCO与Mal-PEG5-DBCO(Conju-probe,Inc.)复合时，将纯化的突变替利珠单抗scFv和5mM DTT在室温下温和摇晃，使其反应4小时，以还原位于C-端的半胱氨酸残基。利用NAP-10Sephadex G-25管柱，将含还原抗CD3 scFv的缓冲液置换为磷酸钠缓冲液(100mM磷酸钠、pH7.0，含50mM NaCl以及5mMEDTA)。在还原反应与缓冲液置换后，使Mal-PEG3-TCO或Mal-PEG5-DBCO和scFv以1：1的莫耳比在室温下反应一晚，以进行复合反应。利用去盐管柱移除过量的交联物，接着分析TCO-scFv复合物与DBCO-scFv复合物产物。
MALDI-TOF质谱分析结果显示TCO-抗CD3 scFv复合物样本的分子量为28,053道尔顿；而DBCO-抗CD3 scFv复合物样本的分子量为28,178道尔顿。用12％SDS-PAGE以考玛斯(Coomassie)染色来分析TCO-抗CD3 scFv复合物的纯度(数据未显示)。图28A与28B分别显示TCO-抗CD3 scFv复合物与DBCO-抗CD3 scFv复合物的ELISA分析结果，其中分别以抗PD1scFv与抗CD3 scFv作为阴性对照组与阳性对照组。由ELISA结果可以看出，TCO-抗CD3 scFv复合物与DBCO-抗CD3 scFv复合物都会和CD3-Fc-融合蛋白结合。
实验例26：将三个CD79b的特异性scFv接合到带有三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺基连接臂的四嗪基-多肽2分子构建体
本实验例的目的在于展示可将三个scFv复合到带有三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺基连接臂的四嗪基-多肽2分子构建体。在将其和带有三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺基连接臂的四嗪基-多肽2接合之前，将DTT和1F10 scFv以2：1的莫耳比混合，并在25℃、温和摇晃下反应4小时，以使其C-端半胱氨酸保持还原状态。之后，利用NAP-10 Sephadex G-25管柱(GEHealthcare)，将含还原1F10 scFv的缓冲液置换为顺丁烯二酰亚胺-SH耦合反应缓冲液(100mM磷酸钠、pH 7.0，含50mM NaCl与5mM EDTA)。在还原反应与缓冲液置换后，使接合物和蛋白以1：4的莫耳比例混合，并在4℃下反应一晚，以使四嗪基-多肽2接上三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺基连接臂。
实验例27：纯化靶向接合单元(带有三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺基连接臂并接合了三个抗CD79b scFv的四嗪基-多肽2接合单元)
将上一实验例的反应混合物注入粒径筛析(size exclusion)层析管柱S75。利用粒径筛析层析管柱S75将复合了三个CD79b特异性scFv的(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(四嗪基-多肽2)复合物和未复合的scFv、未复合的(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(四嗪基-多肽2)复合物以及复合了一个或两个CD79b特异性scFv的(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(四嗪基-多肽2)复合物分开。图29A是所合成的靶向接合单元的FPLC溶析曲线图；此一靶向接合单元是带有一个自由四嗪基官能基以及一组三个人CD79b的特异性scFv(作为靶向组件)的接合单元。所得到的产物(即，(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(四嗪基-多肽2)复合物，其带有一个自由四嗪基官能基并接合了一组三个人CD79b的特异性scFv)透过析出馏分而纯化，图29B为10％SDS-PAGE分析照片，其中电泳线5至7即为纯化的产物。
实验例28：靶向接合单元(带有三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺基连接臂并接合了三个抗CD79b scFv的四嗪基-多肽2接合单元)的MALDI-TOF质谱分析
利用MALDI-TOF质谱分析来确认靶向接合单元(即，复合了三个CD79b特异性scFv的(PEG12-顺丁烯二酰亚胺)-(四嗪基-多肽2)复合物接合单元)样本。实验所得的分子量中位数和三个1F10scFv与带有三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺基连接臂的四嗪基-多肽2复合后的理论分子量中位数相符；由图29C的质谱分析图可知，上述靶向接合单元的平均分子量为85,996道尔顿。下图所示的靶向接合单元是由带有一个自由四嗪基官能基以及一组三个人CD79b的特异性scFv(作为靶向组件)的接合单元所组成。
实验例29：制备靶向接合单元(带有三个HER2/neu的特异性scFv的四嗪基-多肽2接合单元)
利用上述实验例所述的方法，将scFv复合到上文实验例所制备的接合单元上，并进行纯化与分析。图30A为所合成产物的SDS-PAGE分析结果，由图中可以看出制备所得的产物纯度颇高。然而，一般来说，带有相当PEG成分的分子在SDS-PAGE上的移动速度会比相同分子量的蛋白来得慢。图30B的质谱分析结果显示经纯化的接合单元的分子量为86,120道尔顿。下图所示的靶向接合单元是由带有一个自由四嗪基官能基以及一组三个人HER2/neu的特异性scFv(作为靶向组件)的接合单元所组成。
实验例30：制备效应接合单元(带有三个TNF-α或PD-1的特异性scFv的TCO-多肽2接合单元)
利用上述实验例所述的方法，将scFv复合到上文实验例所制备的接合单元上，并进行纯化与分析。
图30C是上述效应接合单元的质谱分析结果；此一效应接合单元是由带有一个自由TCO官能基以及一组三个TNF-α的特异性scFv(作为效应组件)的接合单元所组成(如下所示)。由图30C的结果可以看出，此一效应接合单元的分子量为86,134道尔顿。
图30D与30E图分别显示另一效应接合单元的SDS-PAGE与质谱分析结果；此一效应接合单元带有一个自由TCO官能基以及一组三个人PD-1的特异性scFv(作为效应组件)；其结构如下图所示。由图30E的结果可知，此一效应接合单元的分子量为88,431道尔顿。
实验例31：制备靶向接合单元(带有三个CCK多肽分子的四嗪基-多肽2接合单元)
CCK多肽的制备方式如上文所述。利用上文实验例所述的方式将多肽接合至3-臂接合物。质谱分析结果显示，带有三个CCK多肽的接合单元的分子量为8,801道尔顿(图31)。具体来说，此一靶向接合单元是由带有一个自由四嗪基官能基以及一组三个CCK多肽(作为靶向组件)的接合单元所组成。
实验例32：制备靶向接合单元(带有两个CD20的特异性scFv的TCO-多肽7接合单元)
在本实施例中制备带有两种官能基的接合单元，此一接合单元可和两个不同的接合单元复合。在具有三个接合单元的分子构建体中，可将此一靶向接合单元作为中心接合单元，此种三个接合单元的分子构建体可包含两个靶向接合单元以及一个效应接合单元。在本案的设计中，两个靶向接合单元可透过四嗪基和TCO基之间的iEDDA反应而接合；而中心接合单元与效应接合单元则可透过炔基和叠氮基之间的CuAAC反应而接合。
利用上述实验例所述的方法，将scFv复合到上文实验例所制备的接合单元上，并进行纯化与分析。所得到的靶向接合单元(如下所示)是带有一个自由TCO官能基、一个自由炔基以及一组两个类CD20的特异性scFv(作为靶向组件)的接合单元。图32的质谱分析结果显示此种靶向接合单元的分子量是56,949道尔顿(箭头所指处)。
实验例33：将两个VEGF-A的特异性scFv复合到带有一个自由TCO基以及两条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂的接合单元
利用上述实验例所述的方法，将scFv复合到上文实验例所制备的接合单元上，并进行纯化与分析。
所得到的接合单元(如下所示)是一种效应接合单元，其包括一个自由TCO官能基以及一组两个类VEGF-A的特异性scFv(作为效应组件)。质谱分析结果显示，此一接合单元的分子量为59,187道尔顿(图33)。
实验例34：制备含三个CD79b的特异性scFv(作为靶向组件)与一个CD3的特异性scFv(作为效应组件)的分子构建体
在本实施例中，将上文实验例所制备的靶向接合单元以及TCO-抗CD3 scFv复合物透过四嗪基-TCO之间的iEDDA反应而接合在一起。具体来说，靶向接合单元带有三个CD79b的特异性scFv以及一个自由四嗪基。
依照制造商(Jena Bioscience GmbH,Jena,Germany)的使用说明进行四嗪基-TCO复合。简言之，将113μl的靶向接合单元(12.4mg/ml)加入含有效应单元的溶液中，混合莫耳比为1：2([四嗪基]：[TCO])。使反应混合物在室温下反应3小时。对产物进行质谱分析，结果指出其分子量为114,025道尔顿(图34A)。
所得到的产物(如下所示)是单一接合单元的分子构建体，其具有三个CD79b的特异性scFv(作为靶向组件)与个一个CD3的特异性scFv(作为效应组件)。
实验例35：制备含三个HER2/neu的特异性scFv(作为靶向组件)与一个CD3的特异性scFv(作为效应组件)的分子构建体
将上文实验例所制备的靶向接合单元以及TCO-抗CD3 scFv复合物透过四嗪基-TCO之间的iEDDA反应而接合在一起。
依照上文实验例所述的方式进行四嗪基-TCO复合。所得到的产物(如下所示)是单一接合单元的分子构建体，其具有三个HER2/neu的特异性scFv(作为靶向组件)与个一个CD3的特异性scFv(作为效应组件)。图34B的质谱分析结果显示本分子构建体的分子量为112,046道尔顿。
实验例36：制备具有效应接合单元的分子构建体(含两个VEGF-A的特异性scFv与长链PEG)
一端带有四嗪基的长链PEG(线性，20kDa)系购自Click Chemistry Tools(Scoottsdale,PA,USA)。利用与上文实验例相似的步骤，进行iEDDA反应，以接合效应接合单元与四嗪基-长链PEG。图35的SDS-PAGE分析结果显示TCO-多肽1与抗VEGF-A scFv接合后的反应混合物(电泳线2)以及进一步和四嗪基-20kDa PEG接合后的反应混合物(电泳线2)。箭头#1与#2分别是TCO-多肽1和一个及两个抗VEGF-A scFv的接合产物；箭头#3与#4分别是TCO-多肽1和一个及两个抗VEGF-A scFv、再和一个四嗪基-20kDa PEG链的接合产物。
下图所示的分子构建体带有两个抗VEGF-A scFv与一个20kDa的PEG链。
实验例37：制备含三个CD79b的特异性scFv(靶向接合单元)与五个DM1分子(效应接合单元)的联合接合物分子构建体
在本实施例中，建构带有CD79b的特异性scFv以及一个PEG-(SMCC-DM1)5载药束的联合接合物分子构建体。利用与上文实验例相似的步骤，进行TCO-四嗪间的iEDDA反应，以制备此一分子构建体。所得产物(如下所示)是带有三个CD79b的特异性scFv与一带有五个DM1分子的载药束所组成的联合接合物分子构建体。图36A、36B以及37分别显示上述联合接合物分子构建体的SDS-PAGE、图谱分析(分子量为91,144道尔顿)及ELISA分析结果。箭头#1是带有三个抗CD79b scFv的接合单元；箭头2是带有三个抗CD79b scFv和一个带有五个DM1分子的载药束的联合接合物分子构建体。ELISA结果显示，所述带有三个抗CD79b scFv的接合单元以及带有三个抗CD79b scFv和一个带有五个DM1分子的载药束的联合接合物分子构建体可特异性地结合到CD79b-Fc融合蛋白。
实验例38：制备含三个HER2/neu的特异性scFv(靶向接合单元)与五个DM1分子(效应接合单元)的联合接合物分子构建体
在本实施例中，建构带有HER2/ne的特异性scFv以及带有五个DM1分子的载药束的联合接合物分子构建体(如下所示)。图38为此一产物的SDS-PAGE分析结果。左侧为带有三个抗HER2/neu scFv(不含载药束)的述接合单元的SDS-PAGE图样，以供对照。接上带有五个DM1分子的载药束会使所述分子构建体的体积变大。
实验例39：制备含三个CCK8类似物分子(靶向接合单元)与五个DM1分子(效应接合单元)的联合接合物分子构建体
在本实施例中，透过上文实验例所述的iEDDA反应，将靶向接合单元(带有三个CCK多肽类似物分子与一个自由四嗪基)和效应接合单元(即载药束；带有五个DM1分子与一个自由TCO基)接合在一起。所得到的联合接合物分子构建体(如下所示)，带有三个CCK8肽与一带有五个DM1分子的载药束。图39的质谱分析结果显示所述分子构建体的分子量为16,381道尔顿。
实验例40：制备含三个CCK8类似物分子(靶向接合单元)与五个DOTA螯合基(效应接合单元)的联合接合物分子构建体
在本实施例中，透过上文实验例所述的iEDDA反应，将靶向接合单元(带有三个CCK多肽类似物分子与一个自由四嗪基)和效应接合单元(即载药束；带有五个与Y+3螯合的DOTA基与一个自由TCO基)接合在一起。所得到的联合接合物分子构建体(如下所示)，带有三个CCK8肽与一带有五个与Y+3螯合的DOTA基的载药束。图40的质谱分析结果显示所述分子构建体的分子量为12,654道尔顿。
实验例41：制备含三个HER2/neu的特异性scFv(靶向接合单元)与三个CTLA-4的特异性scFv(效应接合单元)的联合接合物分子构建体
在本实施例中，透过上文实验例所述的iEDDA反应，将靶向接合单元(带有三个HER2/neu的特异性scFv与一个自由四嗪基)和效应接合单元(带有三个CTLA-4的特异性scFv与一个自由TCO基)接合在一起。所得到的联合接合物分子构建体(如下所示)，带有三个HER2/neu的特异性scFv与三个CTLA-4的特异性scFv。对反应混合物进行SDS-PAGE分析，可看到大小约230kDa的电泳带。
实验例42：制备含三个CD79b的特异性scFv(靶向接合单元1)、两个CD20的特异性scFv(靶向接合单元2)与五个DM1分子(效应接合单元)的联合接合物分子构建体
在本实施例中，利用上文实验例制备的带有两个CD20的特异性scFv的靶向接合单元(靶向接合单元2)作为中心接合单元，并藉由第一靶向接合单元的四嗪基和中心接合单元的TCO基两者间的iEDDA反应，而将中心接合单元(靶向接合单元2)和第一靶向单元(靶向接合单元1)接合在一起。此外，中心接合单元与效应接合单元则是透过中心接合单元的炔基和效应接合单元的叠氮基两者间的CuAAC反应而连接在一起。图41是在不同反应时间点，反应物与反应混合物的分析结果。电泳线1中深色的电泳带是纯化的抗CD20 scFv；电泳线2中的箭头1是带有两个抗CD20 scFv、一个TCO基与一个炔基的接合单元(靶向接合单元2)；电泳线3中的箭头#2是带有三个抗CD79b scFv与一个四嗪基的接合单元(靶向接合单元1)；箭头#3则是包含靶向接合单元1与2的联合接合物。
上述联合接合物分子构建体(如下所示)包含三个CD79b的特异性scFv(来自第一靶向接合单元)、两个CD20的特异性scFv(来自中心或第二靶向接合单元)以及五个DM1分子(来自效应接合单元)。
实验例43：LPS透过连接臂与多肽复合后的生物活性分析
利用HEK-blueTM侦测套组(InvivoGen,San Diego,USA)根据制造商的说明进行TLR4刺激细胞分析，以测试与LPS复合的接合单元中LPS的生物活性。HEK-blueTM hTLR4细胞可表达两种人类基因—TLR4与MD-2/CD14共受体基因、以及分泌性胚胎碱性磷酸酶(secretedembryonic alkaline phosphatase，简称SEAP)报导基因，以供监控核因子(NF)-κB活化。在和TLR4激动剂互动后，TLR4可转导一讯号以启动NF-κB的活化，并表达分泌性碱性磷酸酶，接着利用侦测培养基(HEK-blueTM侦测，用以对分泌性碱性磷酸酶进行定性分析的培养基；InvivoGen)侦测其活化，并以分光亮度计测量。
简言之，将HEK-hTLR4细胞以2.5×10 4细胞的密度播于96孔盘中，并保持在含选择性抗生素(NORMOCINTM)的完全DMEM培养基中。以不同浓度(由100μg/ml进行2-倍连续稀释)的粗LPS、纯化LPS、以丹磺酰肼修饰的LPS以及与多肽复合的LPS来刺激细胞，反应时间18小时。利用分光亮度计在620nm的波长下测量培养基中的SEAP，以分析TLR4的活化。
图42的分析结果显示LPS在经过修之前与之后的活性。将生物活性和粗LPS相近的LPS馏分纯化，并进行丹磺酰肼修饰。经丹磺酰肼修饰的LPS以及与多肽复合的LPS具有相近的部分活性。
实验例44：咪喹莫特透过连接臂与多肽复合后的生物活性分析
利用HEK-blueTM侦测套组(InvivoGen,San Diego,USA)根据制造商的说明进行TLR7刺激细胞分析，以测试与咪喹莫特复合的PEG5-NHS的生物活性。HEK-blueTM hTLR7细胞可表达两种人类基因—TLR7受体基因以及分泌性胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报导基因，以供监控核因子(NF)-κB活化。在和TLR7激动剂互动后，TLR7可转导一讯号以启动NF-κB的活化，并表达分泌性碱性磷酸酶，接着利用侦测培养基(HEK-blueTM侦测，用以对分泌性碱性磷酸酶进行定性分析的培养基；InvivoGen)侦测其活化，并以分光亮度计测量。
简言之，将HEK-hTLR7细胞以4×10 4细胞的密度播于96孔盘中，并保持在含选择性抗生素(NORMOCINTM)的完全DMEM培养基中。以不同浓度(由20μg/ml进行2-倍连续稀释)的咪喹莫特以及与咪喹莫特复合的PEG5-NHS来刺激细胞，反应时间18小时。利用分光亮度计在620nm的波长下测量培养基中的SEAP，以分析TLR7的活化。
图43的分析结果显示咪喹莫特在和连接臂复合之前与之后的活性；结果显示咪喹莫特分子与连接臂复合后的生物活性和未修饰的咪喹莫特相近。
实验例45：带有两个抗VEGF-A scFv与一个20kDa PEG的分子构建体在Balb/c小鼠体内的药动学特性
本实验例使用Balb/c小鼠(雌性；10周龄)。所述分子构建体中所含的scFv系衍生自雷珠单抗，其制备方式如上文实验例所述。简言之，将100μg抗VEGF-A scFv以及带有两个抗VEGF-A scFv和一个20kDa PEG的接合单元分别加入100ml PBS中，之后透过小鼠尾部血管进行注射。在注射后2、4、24、48与72小时，透过眼窝窦放血取得血液样本。带血液凝结后，收取血清。进行ELISA分析来测定抗VEGF-A的活性；将96孔盘覆上huVEGF-A重组蛋白(浓度2μg/ml、每孔50μl)；在每孔中加入100μl以PBS(含1％BSA与1％脱脂牛奶)稀释的血清，并于37℃下培育2小时。之后加入100μl以PBS稀释的HRP-复合蛋白L(稀释比例1：2000)，并于37℃下培育1小时。接着，加入50μl的TMB受质以进行显色。加入50μl的1M HCl使反应终止。利用盘式分析仪来测定样本在450nm下的吸亮度。
图44的结果显示，当施用带有三个VEGF-A的特异性scFv与一条20kDa PEG链的分子构建体时，即便经过了72小时，血清中仍有相当浓度的上述分子构建体。
实验例46：带有三个抗CD79b scFv以及五个DM1细胞毒性分子的联合接合物分子构建体对Ramos细胞的细胞毒性
将Ramos细胞(2x104/well)播于96孔盘中，盘中含有RPMI1640培养基(含10％胎牛血清)。经过2小时后，使细胞接触不同浓度(由20nM进行2-倍连续稀释)的以下成分：抗CD79scFv、带有三个抗CD79b scFv(不含载药束)的接合单元、带有五个DM1分子(即，载药束)的接合单元、以及带有三个抗CD79b scFv以及五个DM1分子的分子构建体。在培育6小时之后，以300g离心5分钟，以移除培养基；加入新鲜培养基后，再将细胞培育24小时。根据制造商的操作说明，以AlamarBlue细胞存活性试剂套组(Invitrogen)进行细胞存活性分析。
图45显示四种处理组别中Ramos细胞的存活性分析结果。带有三个抗CD79b scFv以及五个DM1分子的分子构建体导致约50％的RAMOS细胞发生细胞溶解。
实验例47：建构编码双链IgG4.Fc融合蛋白(含有人II型胶原蛋白的特异性scFv与TNF-α的特异性scFv)的基因片段
可产生抗II型胶原蛋白抗体的小鼠B细胞融合瘤II-II6B3系购自艾荷华大学Developmental Studies Hybridoma Bank。利用SuperScript III RT-PCR系统(Invitrogen,Waltham,USA)进行Poly(A)+RNA反转录，并合成第一股cDNA。II-II6B3的VH与VL核苷酸序列与氨基酸序列尚未公开；因此，利用Ig-primer Sets(Novagen,Madison,USA)提供的DNA引子组并根据制造商的操作说明进行PCR，以决定II-II6B3可变区域的序列。II型胶原蛋白(CII或COL2)的特异性II6B3单克隆抗体VH与VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:46与47所示。TNF-α的特异性scFv的VL与VH序列即为阿达木单抗的VL与VH序列。
双链IgG4.Fc融合蛋白分子构建体的构型如下所示。在scFv1-scFv2-CH2-CH3(人类γ4)重组链中，透过可挠性铰链区将两个二scFv融合到IgG4.Fc的CH2区域N-端；上述两个scFv一个是人II型胶原蛋白的特异性scFv，而另一个是人TNF-α的特异性scFv。第一scFv(II型胶原蛋白特异性)的方向是VL-接合物-VH，而第二scFv(TNF-α特异性)的方向是VH-接合物-VL。这两个scFv中各别的VL与VH是透过亲水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而连接。两个scFv之间则是透过可挠性接合物((GGGGS)3)而连接。下图所示的IgG4.Fc融合蛋白分子构建体中的重组链序列如SEQ ID NO:48所示。
上述双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc分子构建体的构型如下图所示。
实验例48：重组双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc融合蛋白的表达与纯化
在本实施例中，将编码的基因序列置于pcDNA3表达盒中。将Expi293F细胞以每毫升2.0×106个活细胞的密度播于Expi293F表达培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有7.5×108个细胞的255ml培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入ExpiFectamineTM 293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育7天。收集培养上清液，并使用蛋白A亲合力层析法纯化培养基中的重组双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc融合蛋白。将缓冲液置换为PBS，之后利用SDS-PAGE测定(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc蛋白的浓度并进行分析；参见图46；以10％SDS-PAGE来分析II-II6B3(电泳线1)与(scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-hIgG4.Fc(电泳线2)。在约80kDa的位置观察到含Fc-融合分子构建体的主要电泳条，其大小与预期相符。
实验例49：重组双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc融合蛋白结合力的ELISA分析
透过ELISA来分析重组双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc融合蛋白对II型胶原蛋白的结合能力，并以阿达木单抗与小鼠亲本单克隆抗体II-II6B3作为对照。以5μg/mL的人类II型胶原蛋白(人类COL2)、小鼠II型胶原蛋白(小鼠COL2)、以及鸡II型胶原蛋白(鸡COL2)分别涂覆在ELISA盘上。1D11是人类抗尘螨IgG1抗体，用作同型控制。分别利用HRP标记的山羊抗人类IgG4.Fc、山羊抗小鼠IgG.Fc以及山羊抗人类IgG1.Fc来侦测重组双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc融合蛋白、纯化的抗II型胶原蛋白抗体(II-II6B3)以及阿达木单抗。ELISA结果如图47A所示。
透过ELISA来分析重组双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc融合蛋白对人类TNF-α的结合能力，并以阿达木单抗与小鼠亲本单克隆抗体II-II6B3作为对照。以1μg/mL的人类TNF-α与1μg/mL的人类血清白蛋白(控制组)涂覆在ELISA盘上。分别利用HRP标记的山羊抗人类IgG4.Fc、山羊抗小鼠IgG.Fc以及山羊抗人类IgG1.Fc来侦测重组双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc融合蛋白、纯化的抗II型胶原蛋白抗体(II-II6B3)以及阿达木单抗。图47B的ELISA结果显示，重组双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc融合蛋白对于人类TNF-α有明显的结合活性；HSA(人类血清白蛋白)为控制组。
实验例50：制备带有人II型胶原蛋白的特异性scFv、TNF-α的特异性scFv以及人IL-17的特异性scFv的双链IgG4.Fc融合蛋白
scFv1-scFv2-CH2-CH3-scFv3(人类γ4)重组链透过可挠性铰链区将两个二scFv融合到IgG4.Fc的CH2区域N-端；上述两个scFv一个是人II型胶原蛋白的特异性scFv，而另一个是人TNF-α的特异性scFv；另外，将第三个scFv(IL-17特异性)融合到CH3区域的C-端。
II型胶原蛋白的特异性scFv的VH与VL和II6B3单克隆抗体相同；TNF-α的特异性scFv的VL与VH和阿达木单抗相同；IL-17的特异性scFv的VH与VL和苏金单抗相同。第一scFv(II型胶原蛋白特异性)的方向是VL-接合物-VH、第二scFv(TNF-α特异性)的方向是VH-接合物-VL、且第三scFv(IL-17特异性)的方向是VL-接合物-VH。这三个scFv中各别的VL与VH是透过亲水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而连接。第一和第二scFv之间则是透过可挠性接合物((GGGGS)3)而连接。
下图所示的IgG4.Fc融合蛋白分子构建体中的重组链序列如SEQ ID NO:49所示。利用上文实验例所述的方法，在Expi293F细胞中表达所建构的基因并纯化所表达的融合蛋白。利用SDS-PAGE与ELISA分析来定性所制备的新构建体。苏金单抗(Cosentyx)系购自长庚医院(台北，台湾)；人类IL-17抗体系购自Peprotech(NJ,USA)。图48A的SDA-PAGE结果显示新构建体的重组链大小约为110kDa，和预期大小相符。图48B的ELISA结果则显示上述重组Fc-融合蛋白对人类II型胶原蛋白、人类TNF-α与人类IL-17有结合活性。
上述双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc-(scFvαIL-17)分子构建体的构型如下图所示。
实验例51：制备带有TNF-α可溶性受体以及II型胶原蛋白的特异性scFv的双链IgG1.Fc融合蛋白
藉由融合人类TNF-α受体、IgG1.Fc、以及II型胶原蛋白的特异性scFv，以建构(TNF-α受体)-CH2-CH3-(scFvαCII)(人类γ1)重组链。TNF-α受体与IgG1.Fc的受体与依那西普相同。依那西普和scFv则透过可挠性接合物((GGGGS)3)而融合。IgG4.Fc融合蛋白分子构建体中重组链的序列如SEQ ID NO:50所示。
利用上文实验例所述的方法，在Expi293F细胞中表达所建构的基因并纯化所表达的融合蛋白。利用SDS-PAGE与ELISA分析来定性所制备的新构建体。依那西普(Enbrel)系购自长庚医院(台北，台湾)。图49A的SDS-PAGE结果显示此一新分子构建体的重组链大小约为100kDa，与预期大小相符(一个依那西普分子的分子量为150kDa，故其中一条链的大小约为75kDa；scFv的大小则约为27kDa)。图49B的ELISA结果显示上述分子构建体可结合至人类TNF-α、人类II型胶原蛋白以及小鼠II型胶原蛋白。
上述双链(可溶性TNF-α受体)-IgG1.CH2-CH3-(scFvαCII)分子构建体的构型如下图所示。
实验例52：制备带有抗人类TNF-α完整抗体以及II型胶原蛋白的特异性scFv的双链融合蛋白
藉由融合人TNF-α的特异性完整抗体以及II型胶原蛋白的特异性scFv，来建构IgG-scFv(人类γ1)重组链(如下所示)。完整抗体的序列即阿达木单抗序列。阿达木单抗和scFv间透过可挠性接合物((GGGGS)3)而融合。
将两个基因插入具有多个选殖位的pG1K表达盒中，以建构重组基因的重链与轻链。利用上文实验例所述的方法，将表达载体转染至Expi293F细胞中，以制备带有完整抗人类TNF-α抗体以及II型胶原蛋白的特异性scFv的双链融合蛋白。带有完整抗人类TNF-α抗体以及II型胶原蛋白的特异性scFv的双链融合蛋白的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示，其轻链序列如SEQ ID NO:52所示。
图50的SDS-PAGE结果显示，上述延伸型IgG分子构建体重组重链的大小约为75kDa，与预期大小相符。
上述C-端带有人II型胶原蛋白的特异性scFv的抗人类TNF-α延伸IgG分子构建体的构型如下图所示。
实验例53：制备带有抗人类IL-17完整抗体以及VII型胶原蛋白的特异性scFv的双链融合蛋白
藉由融合人IL-17的特异性完整抗体以及VII型胶原蛋白的特异性scFv，来建构IgG-scFv(人类γ1)重组链(如下所示)。完整抗体的序列即苏金单抗序列。苏金单抗和scFv间透过可挠性接合物((GGGGS)3)而融合。
将两个基因插入具有多个选殖位的pG1K表达盒中，以建构重组基因的重链与轻链。利用上文实验例所述的方法，将表达载体转染至Expi293F细胞中，以制备带有完整抗人类IL-17抗体以及VII型胶原蛋白的特异性scFv的双链融合蛋白。带有完整抗人类IL-17抗体以及VII型胶原蛋白的特异性scFv的双链融合蛋白的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示，其轻链序列如SEQ ID NO:54所示。
图51A的SDS-PAGE结果显示，上述延伸型IgG分子构建体重组重链的大小约为75kDa，与预期大小相符。图51B的ELISA结果显示，上述分子构建体可结合至人类IL17与人类VII型胶原蛋白。对VII型胶原蛋白的结合力相对较低可能是因为用来涂覆ELISA盘的抗原浓度较低的关系。
上述C-端带有人类VII型胶原蛋白的特异性scFv的抗人类IL-17延伸IgG分子构建体的构型如下图所示。
实验例54：制备带有人VII型胶原蛋白的特异性scFv以及BAF的特异性FscFv的双链IgG4.Fc融合蛋白
利用小鼠B细胞融合瘤LH7.2mAb的cDNA来制备抗VII型胶原蛋白抗体，上述cDNA是伦敦大学玛莉皇后学院英国皮肤与癌症研究所皮肤肿瘤研究室Dr.Purdie所赠。在上文的实验例中，决定了LH7.2单克隆抗体的VH与VL序列，分别如SEQ ID NO:29与30所示。BAFF的特异性scFv的VH与VL序列分别和贝利木单抗的VL与VH的序列相同。
于建构scFv1-CH2-CH3-scFv2(人类γ4)重组链(SEQ ID NO:55)时，将两个scFv融合到IgG4.Fc的两端；如下图所示，其中一个scFv是VII型胶原蛋白的特异性scFv；另一个是BAFF的特异性scFv，透过可挠性接合物((GGGGS)3)连接到IgG4.Fc的CH3区域的C-端。第一scFv(VII型胶原蛋白特异性)的方向是VL-接合物-VH；而第二scFv(BAFF特异性)的方向是VH-接合物-VL。这两个scFv中各别的VL与VH是透过亲水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而连接。
利用上文实验例所述的方法，在Expi293F细胞中表达所建构的基因并纯化所表达的融合蛋白。利用SDS-PAGE与ELISA分析来定性所制备的新构建体。抗体贝利木单抗(Belynsta)系购自长庚医院(台北，台湾)；人类抗BAFF抗体系购自GenScript(NJ,USA)。图52A的SDS-PAGE结果显示此一新分子构建体的重组链大小约为80-90kDa，与预期大小相符或略大于预期大小。图52B的ELISA结果显示上述分子构建体可特异性地结合至人类BAFF与人类VII型胶原蛋白。
上述双链Fc-融合分子构建体(scFvαCVII)-IgG4.CH2-CH3-(scFvαBAFF)的构型如下图所示。
实验例55：制备带有抗人类BAFF完整抗体与人VII型胶原蛋白的特异性scFv的双链IgG4.Fc融合蛋白
藉由融合抗人类BAFF完整抗体以及VII型胶原蛋白的特异性scFv来建构IgG-scFv(人类γ1)重组链。完整抗体的序列即贝利木单抗序列。贝利木单抗和scFv间透过可挠性接合物((GGGGS)3)而融合。
将两个基因插入具有多个选殖位的pG1K表达盒中，以建构重组基因的重链与轻链。利用上文实验例所述的方法，将表达载体转染至Expi293F细胞中，以制备带有完整抗人类BAFF抗体以及VII型胶原蛋白的特异性scFv的双链融合蛋白。
带有完整抗人类BAFF抗体以及VII型胶原蛋白的特异性scFv的双链融合蛋白的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示，其轻链序列如SEQ ID NO:57所示。图53A的SDS-PAGE结果显示此一新分子构建体的重组重链的大小约为80kDa，与预期大小相符。图53B的ELISA结果显示此一新颖延伸型IgG构建体可特异性地结合至人类BAFF与人类VII型胶原蛋白。
上述C-端带有人VII型胶原蛋白的特异性scFv的抗人BAFF延伸IgG分子构建体的构型如下图所示。
实验例56：制备带有人类骨结合素的特异性scFv以及RANKL的特异性scFv的双链IgG4.Fc融合蛋白
可产生抗骨结合素(SPARC)抗体的小鼠B细胞融合瘤AON-1系购自艾荷华大学的发育研究融合瘤库(Developmental Studies Hybridoma Bank)。利用SuperScript III RT-PCR系统(Invitrogen)进行Poly(A)+RNA反转录，并合成第一股cDNA。AON-1的VH与VL核苷酸序列与氨基酸序列尚未公开；因此，利用Ig-primer Sets(Novagen)提供的DNA引子组并根据制造商的操作说明进行PCR，以决定AON-1可变区域的序列。骨结合素的特异性AON-1单克隆抗体VH与VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:58与59所示。RANKL的特异性scFv的VL与VH序列即为地诺单抗的VL与VH序列。
scFv1-scFv2-CH2-CH3(人类γ4)重组链透过可挠性铰链区将两个二scFv融合到IgG4.Fc的CH2区域N-端；上述两个scFv一个是骨结合素的特异性scFv，而另一个是RANKL的特异性scFv；其序列如SEQ ID NO:60所示，结构如下图所示。第一scFv(骨结合素特异性)的方向是VL-接合物-VH，而第二scFv(RANKL特异性)的方向是VH-接合物-VL。这两个scFv中各别的VL与VH是透过亲水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而连接。两个scFv之间则是透过可挠性接合物((GGGGS)3)而连接。下图所示的IgG4.Fc融合蛋白分子构建体中的重组链序列如SEQ ID NO:48所示。
利用上文实验例所述的方法，在Expi293F细胞中表达所建构的基因并纯化所表达的融合蛋白。利用SDS-PAGE与ELISA分析来定性所制备的新构建体。利用上文实验例所述的方法，以ELISA分析此融合蛋白和人类骨结合素与RANKL的结合能力。利用SDS-PAGE与ELISA进行此一新颖构建体的分析。抗体地诺单抗(Prolia)系购自长庚医院；人类RANKL与人类骨结合素(SPARC)则是购自GenScript。图54A的SDS-PAGE结果显示此一新分子构建体的重组链大小约为80kDa。图54B的ELISA结果显示上述新颖Fc-融合构建体可特异性地结合至人类SPARC与人类RANKL。
上述双链(scFvαSPARC)-(scFvαRANKL)-hIgG4.Fc分子构建体的构型如下图所示。
实验例57：制备带有抗人类RANKL完整抗体与人骨结合素的特异性scFv的双链融合蛋白
藉由融合抗人类RANKL完整抗体以及人骨结合素的特异性scFv来建构IgG-scFv(人类γ1)重组链。完整抗体的序列即地诺单抗序列。地诺单抗和scFv间透过可挠性接合物((GGGGS)3)而融合。
将两个基因插入具有多个选殖位的pG1K表达盒中，以建构重组基因的重链与轻链。利用上文实验例所述的方法，将表达载体转染至Expi293F细胞中，以制备带有完整抗人类RANKL抗体以及人骨结合素的特异性scFv的双链融合蛋白。
带有完整抗人类RANKL抗体以及人骨结合素的特异性scFv的双链融合蛋白的重链氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示，其轻链序列如SEQ ID NO:62所示。图55A的SDS-PAGE结果显示此一新分子构建体的重组重链的大小约为80kDa。图55B的ELISA结果显示此一新颖延伸型IgG构建体可特异性地结合至人类SPARC与人类BAFF。
上述C-端带有人骨结合素的特异性scFv的抗人类RANKL延伸IgG分子构建体的构型如下图所示。
实验例58：带有人II型胶原蛋白的特异性scFv以及TNF-α的特异性scFv的双链IgG4.Fc融合蛋白与关节软骨结合的免疫组织化学分析
由中研院基因体研究中心的核心设施单位进行免疫组织分析，以评估所述分子构建体(即上一实验例所述的双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc)与软骨结合的亲合力。利用二氧化碳牺牲FVB/N小鼠，并取得小鼠骨骼与软骨样本。取得与胫骨以及膝股骨端相连的股骨，并利用10％中性缓冲甲醛在室温下放置48小时以固定样本。之后，将样本在10％EDTA(pH 7.4)中放置七天，并每天更换溶液，以将样本去钙。去钙完成后，在室温下将样本置于10％中性缓冲甲醛中24小时以进行后固定，并在ASP6025 Tissue Processor(Leica)中，以70％乙醇在4℃下进行脱水，再进行石蜡包埋。
根据Schmitz等人于2010年提出的方式，进行番红(safranin O)。于进行免疫染色时，利用Leica AutoStainer XL将厚度3μm的切片脱蜡并复水，之后根据酪胺讯号放大生物素套组(Tyramide Signal Amplification Biotin kit)(PerkinElmer)的染色流程进行染色。简言之，加入3％H2O2处理15分钟以淬灭切片中的内源性过氧化酶活性；接着进行抗原修复，加入1mg/mL玻尿酸酶(Sigma Aldrich)在37℃下处理20分钟，并加入20μg/mL蛋白酶k(TOOLS)在室温下处理10分钟。之后利用TSA套组中的TNB缓冲液，将切片封闭。以小鼠II-II6B3抗体进行染色时，在TNB封闭之前先加入额外的小鼠IgG封闭试剂(VectorLaboratories)。初级抗II-II6B3抗体以及(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc的使用量为50μg/mL。引入HRP时，山羊抗小鼠IgG Fc以及山羊抗人类IgG Fc(JacksonImmunoResearch)的用量为1.6μg/mL，使其和后续加入的生物素-酪胺反应。接着以b卵白素-HRP来标定生物素标记，并以二氨基联苯胺(diaminobenzidine)受质(BioGenex)显色。以苏木素将切片对比染色，并装载于Leica CV5030 Coverslipper上。
图56A至56C是小鼠骺骨的免疫染色结果，进行免疫染色时，先将小鼠骺骨和单克隆抗体II-II6B3(图56(A))、阿达木单抗(图56(B))或上文实验例所制得的(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc(图56(C))反应后，再加入HRP-标记的山羊抗小鼠或山羊抗人类次级抗体并进行酪胺扩增。在图56的图框(A)与(C)中，可在骺关节软骨(AC)与生长板(GP)处观察到II型胶原蛋白。结果显示，抗II型胶原蛋白单克隆抗体II-II6B3可明显地将AC与GP部位染色(图56(A))，而阿达木单抗则没有明显的染色效果(图56(B))。本案所制备的构建体亦可将将AC与GP部位染色(图56(C))。原始染色图中，正向的染色结果呈棕色，此处将其转换为灰阶色彩；比例尺代表250μm。
实验例59：带有II型胶原蛋白的特异性scFv、TNF-α的特异性scFv以及IL-17的特异性scFv的双链IgG1.Fc融合蛋白与关节软骨结合的免疫组织化学分析
利用上文实验例所述的方式，制备组织薄切片，并以上文实验例制备的双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc-(scFvαIL-17)分子构建体与对照组抗体进行染色。
图56D、E为小鼠骺骨经II型胶原蛋白免疫染色的结果。以单株康体将厚度3-μm的小鼠膝股端切片染色，所用抗体分别是抗IL17a小鼠抗体(购自PeproTech,NJ,USA)(图56(D))以及上文制备的双链(scFvαCII)-(scFvαTNF-α)-hIgG4.Fc-(scFvαIL-17)构建体(图56(E))，接着再加入HRP-标记的山羊抗小鼠或山羊抗人类次级抗体进行酪胺扩增。结果显示。抗IL17单克隆抗体没有明显的染色效果，而本案制备的构建体则可观察到中等程度的染色。
实验例60：带有TNF-α可溶性受体以及II型胶原蛋白的特异性scFv的双链IgG1.Fc融合蛋白与关节软骨结合的免疫组织化学分析
利用上文实验例所述的方式，制备组织薄切片，并以上文实验例制备的双链(可溶性TNF-α受体)-IgG1.CH2-CH3-(scFvαCII)分子构建体与对照组抗体进行染色。
染色程序与上文实验例相同。小鼠骺骨组织切片样本系来自同一批处理。结果显示，阳性对照组II-II6B3有很明显的染色(图57(A))、依那西普则没有明显的(图57(B))，而含有II型胶原蛋白成分的AC与GP部分经过本案所制备的构建体染色后，可观察到正向的染色结果(图57(C))。
实验例61：利用活体内显影系统分析带有人骨结合素的特异性scFv(SPARC)以及RANKL的特异性scFv的重组双链IgG4.Fc融合蛋白的生物分布
根据制造商的说明，利用Dylight 680Antibody Labeling Kit(ThermoScientific)来标记地诺单抗与(scFvαSPARC)-(scFvαRANKL)-hIgG4.Fc(实验例60)。将PBS或40μg经标记的抗体以静脉内注射的方式注入8至10周大的BALB/c小鼠体内。在不同的时间点，利用在氧气中的异氟烷将小鼠麻醉并以仰卧位置放置于IVIS Spectrum In VivoImaging System(PerkinElmer)中。使用Living Image Software V3.2在ex/em＝675/720的条件下拍摄荧光照片。
藉由观察并比较腹部的荧光信号，来探究小鼠体内抗体的组织分并情形，以了解(scFvαSPARC)-(scFvαRANKL)-hIgG4.Fc的靶向效果。在注射与DyLight 680复合的抗体后30分钟、3小时与28小时，分别撷取BALB/c小鼠的荧光照片。在注射后30分钟，抗SPARC抗体、(scFvαSPARC)-(scFvαRANKL)-hIgG4.Fc还有BoneTag渗透进入四肢的比例高于地诺单抗的比例。除了膀胱累积之外，在注射后3小时，地诺单抗、抗SPARC抗体以及(scFvαSPARC)-(scFvαRANKL)-hIgG4.Fc的分布范围较广，而，而BoneTag则主要限于四肢。在施用抗体后28小时，经抗SPARC抗体处处理的小鼠仍可清楚观察到骨骼结构。
图58为经过荧光标记的抗体在活体内的生物分布情形。BALB/c小鼠经静脉注射以下成分：PBS(1)、地诺单抗(2)、抗SPARC mAb(3)、(scFvαSPARC)-(scFvαRANKL)-hIgG4.Fc(4)、以及BoneTag(5)。在图中所示时间点，利用IVIS Spectrum显影装置撷取影像，并以Living Image software分析。进行光谱解混(Spectral unmixing)以区隔组织自身荧光与DyLight 680信号。结果显示，在处理后30分钟，相较于地诺单抗，本案所制备的构建体的分布情形较贴近抗SPARC单克隆抗体的分布情形。随着时间过去，分布情形会受到试剂半衰期的影响而有所不同。抗SPARC抗体与地诺单抗都是抗体，故其血清半衰期相近。
实验例62：制备带有EGF(作为靶向组件)以及细胞毒性分子载药束(作为效应组件)的双链IgG1.Fc融合蛋白分子构建体
建构EGF-CH2-CH3(人类γ1)重组链，以制备如下图所示的双链IgG1.Fc融合蛋白。透过接合物(ASGGGGSGGGGS)将EGF C-端的53个氨基酸残基接到CH2的N-端。以GGGDC序列来延伸CH3的C-端。位在C-端的半胱氨酸残基可用以和带有细胞毒性药物负载的载药束接合单元复合。重组多肽链的序列如SEQ ID NO:63所示。利用蛋白A亲合力层析法在4℃下纯化重组蛋白，并利用12％SDS-PAGE进行考玛斯染色，以分析蛋白纯度。图59A是带有C-端延伸与半胱氨酸残基的双链EGF-CH2-CH3以及双链EGF-CH2-CH3-(scFvαPD1)的SDS-PAGE分析结果；结果显示带有C-端延伸与半胱氨酸残基的双链EGF-CH2-CH3的大小约为38kDa，而EGF-CH2-CH3-(scFvαPD1)的大小约为60-65kDa，与预期大小相符。
上述带有C-端延伸与半胱氨酸残基的双链EGF-hIgG1.Fc分子构建体的构型如下图所示。
实验例63：透过SPACC反应将双链EGF-CH2-CH3融合蛋白与带有两个LPS分子的载药束复合
将四嗪基-PEG4-Mal复合至双链EGF-CH2-CH3的C-端半胱氨酸残基。在室温下，将含0.6莫耳与LPS复合的接合单元的分液和0.06莫耳双链EGF-IgG1.Fc融合蛋白于0.1M磷酸钠缓冲液中(pH 7.0)中以10：1的莫耳比混合([接合物]：[蛋白])。位于末端的半胱氨酸的SH基会和顺丁烯二酰亚胺-PEG4-四嗪复合。进行MALDI-TOF质谱分析以确认透过SH-顺丁烯二酰亚胺反应而形成了四嗪基-双链IgG1.Fc融合蛋白复合物。质谱分析结果显示，四嗪基-双链IgG1.Fc融合蛋白复合物的分子量为68,852。
进一步将带有一个自由TCO基以及两个LPS分子的载药束(接合单元)和双链EGF-CH2-CH3的自由四嗪基复合。将100μl浓度1mg/ml的载药束加入至带有四嗪基-双链EGF-CH2-CH3复合物的溶液中，以2：1([四嗪基]：[TCO])的莫耳比混合。将反应混合物在室温下反应16小时。
图59B是双链IgG1.Fc融合蛋白和带有两个LPS分子的接合单元的复合物的SDS-PAGE分析结果。电泳条1中的电泳带为带有C-端接合物与半胱氨酸残基的EGF-CH2-CH3，而电泳条2的箭头所指处为与带有两个LPS分以的载药束复合的EGF-CH2-CH3。
上述与LPS接合单元复合的双链IgG1.Fc融合蛋白的构型如下图所示。
实验例64：制备带有EGF(作为靶向组件)以及PD1的特异性scFv(作为效应组件)的双链IgG1.Fc融合蛋白分子构建体
带有EGF(作为靶向组件)以及PD-1的特异性scFv(作为效应组件)的双链IgG1.Fc融合蛋白分子构建体的构型如下所示。藉由建构EGF-CH2-CH3-(scFvαPD1)(人类γ1)重组链，以制备双链EGF-hIgG1.Fc-(scFvαPD1)(SEQ ID NO:64)双链IgG1.Fc融合蛋白。CH2-CH3系源自人类γ1，且scFv是人PD1特异性的。PD1的特异性scFv的VL与VH和尼伏鲁单抗的VL与VH相同。CH3的C-端透过可挠性接合物((GGGGS)3)而和抗PD1 scFv融合。利用蛋白A亲合力层析法在4℃下纯化重组蛋白。
对重组双链EGF-IgG1.Fc融合蛋白以及EGF-IgG1Fc-(scFvαPD1)融合蛋白进行ELISA分析，以探究重组双链EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)融合蛋白对ERBB1的结合能力。以1μg/mL、2μg/mL与4μg/mL的重组ERBB1蛋白涂覆于ELISA盘上。西妥昔单抗是抗人类EGFR的人类IgG1抗体，故使用西妥昔单抗scFv作为阳性对照组。图60A的ELISA结果显示，EGF-IgG1.Fc融合蛋白以及EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)融合蛋白两者皆可结合至ERBB1胞外区域，且其结合能力和西妥昔单抗scFv不相上下。柱状图中每一直条表示两次重复试验的平均OD450值。
在ELISA盘上涂覆1μg/mL的重组人类PD-1蛋白，以探究重组双链EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)融合蛋白对PD-1的结合能力。曲妥珠单抗(Herceptin)是抗ERBB2的人类IgG1抗体，故使用曲妥珠单抗scFv以作为阴性对照组。柱状图中每一直条表示两次重复试验的平均OD450值。图60B˙ELISA结果显示EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)融合蛋白可正向结合至人类PD-1蛋白。
实验例65：制备带有EGF(作为靶向组件)以及CD3的特异性scFv(作为效应组件)的双链IgG1.Fc融合分子构建体
在本实施例中，藉由建构EGF-CH2-CH3-(scFvαCD3)重组链(SEQ ID NO:65)，双链IgG.Fc融合蛋白。CH2-CH3系源自人类γ1，且scFv是人CD3特异性的。CD3的特异性scFv的VL与VH和替利珠单抗的VL与VH相同。CH3的C-端透过可挠性接合物((GGGGS)3)而和抗CD3 scFv融合。图61A为双链EGF-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)分子构建体(如下图所示)的SDS-PAGE分析结果。
进行ELISA分析，以探究f重组双链EGF-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)融合蛋白对ERBB1、ERBB2与ERBB3的结合能力。以1μg/mL、2μg/mL与4μg/mL的重组ERBB1、ERBB2或ERBB3蛋白涂覆于ELISA盘上。图61A的ELISA结果显示，EGF-IgG1.Fc融合蛋白以及EGF-IgG1.Fc-(scFvαCD3)融合蛋白两者皆可结合至ERBB1胞外区域，且其结合能力和西妥昔单抗scFv不相上下。柱状图中每一直条表示两次重复试验的平均OD450值。
上述双链EGF-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)的构型如下图所示。
实验例66：制备带有EGF突变株EGF(S2W/D3V)(作为靶向组件)的双链EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)以及EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)
仅需将EGF线性N-端区域中的两个氨基酸进行置换(Ser-2置换为Trp以及Asp-3置换为Val)，就足以使EGF能够结合至ERBB2/ERBB3异型二聚体与ERBB3同型二聚体。EGF(S2W/D3V)表示EGF的N-端区域中有两个氨基酸置换(Ser-2置换为Trp以及Asp-3置换为Val)。制备以下带有EGF突变型EGF(S2W/D3V)融合蛋白的构建体：双链EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)与EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)；并分析其对ERBB1同型二聚体、ERBB2/ERBB3异型二聚体与ERBB3同型二聚体的结合能力。
重组双链EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc的序列如SEQ ID NO:66所示。透过可挠性接合物((GGGGS)3)，将抗PD-1以及抗CD3 scFv分别连接到EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc的CH3的C-端，以得到如SEQ ID NO:67所示的EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)以及如SEQ ID NO:68所示的EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)。图62A是带有C-端延伸的EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc(电泳条1、3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)(电泳条2)、以及EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)(电泳条4)的SDS-PAGE分析结果。各产物的大小与预期相符。图62B与62C为EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)对重组PD-1、ERBB1、ERBB2与ERBB3的结合能力的ELISA分析结果，而图62D与62E为EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)对重组CD3-Fc融合蛋白、ERBB1、ERBB2与ERBB3的结合能力的ELISA分析结果。结果显示EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)可结合至重组PD-1、ERBB1与ERBB3，而EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)可结合至重组CD3、ERBB1与ERBB3。
上述双链EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFvαPD-1)的构型如下图所示。
上述双链EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)的构型如下图所示。
实验例67：制备带有生长抑素(作为靶向组件)的双链IgG1.Fc融合蛋白分子构建体
建构生长抑素-CH2-CH3(人类γ1)重组链，以制备如下图所示的双链IgG1.Fc融合蛋白。透过接合物(ASGGGGSGGGGS)将生长抑素C-端的14个氨基酸残基接到CH2的N-端。以GGGDC序列来延伸CH3的C-端。位在C-端的半胱氨酸残基可用以和载药束耦合。带有生长抑素与IgG.Fc的重组多肽链的序列如SEQ ID NO:69所示。亦制备了带有scFvαPD-1或scFvαCD3的两种分子构建体。图63是生长抑素-hIgG1.Fc(电泳条1)、生长抑素-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)(电泳条2)以及生长抑素-hIgG1.Fc-(scFvαPD-1)(电泳条3)的SDS-PAGE(10％)分析结果。结果显示，这三种构建体的大小和预期相符。
由于生长抑素的分子较小，SDS-PAGE分析不适合用于确定Fc-融合蛋白是否加入了生长抑素。对经胰蛋白酶分解的双链生长抑素-hIgG1.Fc-(scFvαPD-1)与双链生长抑素-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)进行串联质谱分析，以确认所述分子构建体中是否带有生长抑素。质谱分析实验使用Bruker Autoflex III MALDI TOF/TOF质谱分析仪(Bremen,Germany)并配有200Hz SmartBean Laser，分析采用阳离子反射模式的延迟提取。利用FlexControl 3.4(Bruker Daltonik)手动获取信息，并以Flex-Analysis 3.4(Bruker Daltonik)进行数据处理。
此处采用Mascot检索引擎，利用分子量搜寻，在蛋白质数据库中搜寻蛋白质片段以进行多肽的确认；有一蛋白片段在MS/MS质谱中的m/z值对应于741.37道尔顿，此一大小和生长抑素片段的序列(NFFWK)大小相符。另外有两个蛋白片段在MS/MS质谱中的m/z值分别对应于835.45与1,286.69道尔顿，这和人类IgG Fc区域中的两个多肽片段的氨基酸序列(分别是DTLMISR与EPQVYTLPPSR)相符。
上述双链生长抑素-hIgG1.Fc-(scFvαPD-1)(SEQ ID NO:70)的构型如下图所示。
上述双链生长抑素-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)(SEQ ID NO:71)的构型如下图所示。
实验例68：双链EGF-IgG1.Fc、双链EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)、双链EGF-IgG1.Fc-(scFvαCD3)、双链EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)以及双链EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)融合蛋白和表达EGFR的肿瘤细胞系的结合的染色分析
分析上述五种分子构建体和A431肿瘤细胞上的EGFR的结合能力。A431是人类上皮细胞癌细胞系，此种细胞的EGFR表达很高。分析方法如下：将1x105个表达EGFR的A431细胞和10μg/ml的每一种构建体(于PBS中)在1％BSA于冰浴中反应30分钟，此处使用西妥昔单抗scFv-FITC作为阳性对照组。清洗细胞后，以FITC-标记山羊抗人类IgG.Fc(Caltag,Buckingham,UK)(以PBS/BSA以1：200的比例稀释)在4℃下于黑暗中培育20分钟。利用a20(人类与膜结合的IgE的膜锚定区段的特异性小鼠单克隆抗体)以及OKT3(人CD3的特异性小鼠单克隆抗体)作为阴性对照组。以FITC-标记兔抗小鼠IgG或FITC-标记山羊抗人类IgG.Fc将细胞染色，并使用FACSCanto II(BD Biosciences)进行分析。
图64是以下五种分子构建体对于表达EGFR的A431细胞的细胞染色分析结果：EGF-IgG1.Fc、EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)、EGF-IgG1.Fc-(scFvαCD3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc以及EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)。这五种构建体都可以实质地和A431细胞结合。
实验例69：双链EGF-IgG1.Fc、双链EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)、双链EGF-IgG1.Fc-(scFvαCD3)、双链EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)以及双链EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)和人类T淋巴细胞的结合的染色分析
利用分级分离的人类周边血T淋巴细胞来探究多种EGF-IgG.Fc-scFv构建体和表达CD3与PD-1的人类T淋巴细胞结合的能力。利用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)密度梯度离心法，从健康捐赠者的血沉棕黄层(buffy coat)(Taiwan Blood ServiceFoundation)中分离出周边血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，简称PBMC)，并冷冻保存于90％FBS/10％DMSO中。利用人类Pan T cell Isolation kit(Miltenyl Biotech,Auburn,CA,USA)套组，剔除非T细胞(负向选择)，以制得人类T细胞。将10μg/ml的EGF-IgG1.Fc、EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)、EGF-IgG1.Fc-(scFvαCD3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)以及EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)和1x 105个T细胞(于PBS中)，在1％BSA、冰浴下培育20分钟。以抗PD-1抗体与OKT3作为阳性对照组，而EGF-IgG1.Fc与EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc则作为阴性对照组。清洗细胞后，以FITC-标记山羊抗人类IgG.Fc(Caltag)或兔抗小鼠IgG.Fc(AbD Serotec)(以PBS/BSA以1：200的比例稀释)在4℃下于黑暗中培育20分钟。使用FACSCanto II(BD Biosciences)分析样本。图65(A)至(C)显示EGF-IgG1.Fc-(scFvαPD1)与EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD1)跟抗PD-1抗体一样，可与T细胞结合。图65(D)至(F)显示EGF-IgG1.Fc-(scFvαCD3)与EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)跟OKT3抗体一样，可与T细胞结合。
实验例70：双链EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)对MDA-MB-231与A431种肿瘤细胞系的T细胞介导的细胞毒性分析
利用人类周边血T细胞作为T细胞来源。T细胞的制备方式如上文实施例所述。培养T细胞时，加入10μ/ml的重组人类IL-2(PeproTech,Rocky Hill,USA)。使用抗DNP AN02 mAb作为同型匹配对照组。
以重组EGF-hIgG.Fc-Cys、EGF-hIgG.Fc-(scFvαCD3)、EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)或同型匹配对照组涂覆于5,000个A431目标细胞分量(于100μl的完全RPMI培养基中)，并在含5％二氧化碳的空气、37℃下培育30分钟，之后再以不同的E：T比例(20：1、10：1或5：1)与人类T细胞混合。培育24小时后，使用aCella-Tox kit(Cell Technology,Mountain View,CA)根据制造商的说明测定亮度，以近行细胞毒性分析。利用亮度计(multi-detection microplate reader，购自DS Pharma,Osaka,Japan)来读取细胞盘。
利用MDA-MB-231肿瘤细胞以及A431肿瘤细胞来探究EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)对于表达EGFR的肿瘤细胞所造成的T细胞介导的细胞溶解。MDA-MB-231系源自于欲有胸腔积液转移的原发浸润性导管癌，广泛地用于肿瘤模型研究。于进行此种细胞毒性分析时，T细胞的来源非常重要。选用从第56号与第59号捐赠者所分离的人类T淋巴细胞来探究T细胞介导细胞毒性。将MDA-MB-231细胞和10μg/mL的EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc或EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)在37℃下培育1小时，之后再和人类T淋巴细胞以不同的E：T比例(20：1、10：1或5：1)混合并培育24小时。使用西妥昔单抗mAb作为对照组。利用aCella-Tox kit来分析细胞溶解。此处所示的数据显示，携带scFvαCD3的EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc招募效应细胞以展现细胞溶解活性的效率较高。
图66A与66B的的结果显示，表达EGFR的A431细胞经过EGF-hIgG1.Fc-Cys、EGF-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)或EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)处理后的细胞溶解程度；图66C与66D的结果显示，MDA-MB-231在经过EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)处以后，在来自第56号(图66C)与第59号(图66D)捐赠者的人类T淋巴细胞的作用下的细胞溶解程度。这些结果显示，EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)在活体外可透过ADCC机制而介导表达EGFR的MDA-MB-231细胞的细胞溶解。
进一步探究A431细胞经EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)处理后，因人类T淋巴细胞作用而导致的细胞溶解是否具有时间相依性；将A431细胞和10μg/mL的EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc、EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFvαCD3)或抗HER1mAb(对照组)在37℃下培育1小时，之后再和分离自人类PBMC的人类T淋巴细胞以不同的E：T比例(20：1、10：1或5：1)混合并培育2小时(图67A)、9小时(图67B)或24小时(图67C)小时。图67A至67C的结果指出，经EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαCD3)处理后，人类T淋巴细胞引发的细胞溶解具有时间相依性。
实验例71：双链EGF(S2W/D3V)-IgG1.Fc-(scFvαPD-1)融合蛋白对A431肿瘤细胞的T细胞介导的细胞毒性分析
EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc和EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFvαPD-1)在活体外可透过ADCC机制而介导表达EGFR的A431细胞的细胞溶解。分析方式和上文实施例所述相同。在37℃下，将A431细胞和10μg/mL的EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc、EGF(S2W/D3V)-hIgG1.Fc-(scFvαPD-1)或抗HER1mAb(对照组)培育1小时，之后再和分离自人类PBMC的人类T淋巴细胞以不同的E：T比例(20：1、10：1或5：1)混合并培育24小时。使用aCella-Tox kit(CellTechnology Inc)来分析ADCC。
图68显示人类PBMC对经双链EGFw2v3-IgG1.Fc-(scFvαPD-1)处理的A431细胞造成的细胞溶解程度。
实验例72：重组双链EGFw2v3-IgG1.Fc-(scFvαPD-1)与EGFw2v3-IgG1.Fc-(scFvαCD3)融合蛋白的活体内肿瘤模型
三至四周龄的NOD-SCID小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/IcrCrlBltw)系购自BioLasco(Taipei,Taiwan)。先以腹膜内注射的方式以每只小鼠1×106个A431细胞的量将细胞注入小鼠体内，经过两周后，分别以EGF(S2W/D3V)-hIgG.Fc-Cys、EGF(S2W/D3V)-hIgG.Fc-(scFvαPD-1)(反应式72)、EGF(S2W/D3V)-hIgG.Fc-(scFvαCD3)或同型匹配对照组重组蛋白处理小鼠。每组5只小鼠，并以腹腔内注射的方式分别注入5mg/kg的处理蛋白(于50ml的PBS中)，每周注射三次。在第一次蛋白处理时，对每一小鼠以腹腔内注射给予2×107个人类PBMC细胞。PBMC的分离方式如下：利用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)密度梯度离心法，从健康捐赠者的血沉棕黄层(buffy coat)(Taiwan Blood Service Foundation)中分离出PBMC，并冷冻保存于90％FBS/10％DMSO中。在使用前，将PBMC解冻并以每毫升2x106个细胞的浓度在IMDM培养基(Invitrogen)中培养一夜；上述培养基含10％热去活化FBS、4mM L-麸酰胺酸、25mM HEPES、50mg/ml盘尼西林以及100mg/ml链霉素(完全IMDM培养基)。用卡尺每隔三至四天测量肿瘤生长情形。在第35天牺牲小鼠，并将皮下肿瘤肿瘤移除、秤重并进行分析。
当可理解，上文实施方式的说明仅为例示，且本发明所属技术领域具有通常知识者可对其进行各种修饰。上文的说明、实验例与数据完整地说明了本发明例示性实施方式的结构与用途。虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种改动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随权利要求书所界定者为准。
序列表
<110> 张子文
<120> 含靶向与效应组件的分子构建体
<130> P2896-PCT
<160> 71
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 填充序列-1
<400> 1
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 填充序列-2
<400> 2
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 填充序列-3
<400> 3
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 填充序列-4
<400> 4
Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 填充序列-5
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Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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1 5
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<212> PRT
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<220>
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Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 填充序列-10
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Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser
1 5 10
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 填充序列-14
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 填充序列-15
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Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 填充序列-16
<400> 16
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> ACETYLATION
<220>
<223> 多肽核-1
<400> 17
Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
<210> 18
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> ACETYLATION
<220>
<223> 多肽核-2
<400> 18
Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
Gly Ser Lys
<210> 19
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> ACETYLATION
<220>
<223> 多肽核-3
<400> 19
Cys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys
1 5 10 15
Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys
20 25 30
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 半抗原
<400> 20
Trp Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Xaa是高炔丙基甘氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> ACETYLATION
<220>
<223> 多肽核-4
<400> 21
Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Xaa是高炔丙基甘氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> ACETYLATION
<220>
<223> 多肽核-5
<400> 22
Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
Gly Ser Lys
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Xaa是L-叠氮丙氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> ACETYLATION
<220>
<223> 多肽核-6
<400> 23
Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
Gly Ser Lys
<210> 24
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> Xaa是高炔丙基甘氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> ACETYLATION
<220>
<223> 多肽核-7
<400> 24
Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Cys
20
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> ACETYLATION
<220>
<223> 多肽核-8
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2,4,6
<223> Xaa是聚乙二醇氨基酸，兩個EG單元
<400> 25
Cys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys
1 5
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> ACETYLATION
<220>
<223> 多肽核-9
<220>
<221> MOD_RES
<222> 2,4,6,8,10
<223> Xaa是聚乙二醇氨基酸，六個EG單元
<400> 26
Cys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys
1 5 10
<210> 27
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 24C10-VH
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Phe Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Trp Gly Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Val Tyr Ser Gly Asn Asn Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 24C10-VL
<400> 28
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F10-VH
<400> 29
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Tyr Tyr Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
100 105 110
<210> 30
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F10-VL
<400> 30
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Gly Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Leu Lys Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 31
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LH7.2-VH
<400> 31
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Arg Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Glu Ile Gly Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 32
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LH7.2-VL
<400> 32
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 33
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1F10 scFv
<400> 33
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Gly Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Leu Lys Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly
130 135 140
Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Lys Trp
165 170 175
Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp
180 185 190
Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
210 215 220
Cys Tyr Tyr Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys
245 250
<210> 34
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CVII scFv
<400> 34
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
115 120 125
Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr
165 170 175
Ile Thr Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Ser Ser Arg Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
His Gly Glu Ile Gly Tyr Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Cys
260
<210> 35
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠單抗scFv
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg
165 170 175
Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg
210 215 220
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Cys
<210> 36
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 立妥昔單抗scFv
<400> 36
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
130 135 140
Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
145 150 155 160
Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile
165 170 175
Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys
180 185 190
Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu
195 200 205
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
210 215 220
Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr
225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Cys
<210> 37
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 西妥昔單抗scFv
<400> 37
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val
115 120 125
Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu
130 135 140
Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val
165 170 175
Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg
180 185 190
Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met
195 200 205
Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala
210 215 220
Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys
245 250 255
<210> 38
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 尼伏魯單抗scFv
<400> 38
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val
165 170 175
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr
210 215 220
Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys
245 250
<210> 39
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 伊匹木單抗scFv
<400> 39
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Thr Phe
165 170 175
Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys
245 250 255
<210> 40
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 雷珠單抗scFv
<400> 40
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met
145 150 155 160
Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp
165 170 175
Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg
180 185 190
Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
210 215 220
Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Cys
260
<210> 41
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗scFv
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
165 170 175
Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
210 215 220
Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Cys
<210> 42
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變替利珠單抗scFv
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile
165 170 175
Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met
195 200 205
Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr
210 215 220
Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys
245 250 255
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗scFv-正向引子
<400> 43
gtatctctcg agaaaagaga tattcagatg acgcaatccc c 41
<210> 44
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阿達木單抗scFv-反向引子
<400> 44
gtatctgcgg ccgcttaaca ggagccaccg ccac 34
<210> 45
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CCK類似物
<220>
<221> MOD_RES
<222> 8
<223> SO4H modification
SULFATATION
<220>
<221> MOD_RES
<222> 9,12
<223> Xaa是正白胺酸
<400> 45
Cys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Xaa Gly Trp Xaa Asp Phe
1 5 10
<210> 46
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> II6B3-VH
<400> 46
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Ser Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
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65 70 75 80
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<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
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180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
195 200 205
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg
210 215 220
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
275 280 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
325 330 335
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly
465 470 475 480
Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala
485 490 495
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr
500 505 510
Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Asp
515 520 525
Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
530 535 540
Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Arg Arg Ser
545 550 555 560
Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Glu Ile Gly Tyr
565 570 575
Gly Ser Ser Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
580 585 590
Val Ser Ala Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu
595 600 605
Gly Ser Thr Lys Gly Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu
610 615 620
Ala Ala Ser Pro Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys
625 630 635 640
Ser Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr
645 650 655
Asn Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro
660 665 670
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
675 680 685
Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His
690 695 700
Asn Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
705 710 715 720
Arg
<210> 54
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Cys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 55
<211> 742
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 55
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
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Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
115 120 125
Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr
165 170 175
Ile Thr Ser Gly Gly Asp Tyr Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Ser Ser Arg Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Gly Gly Ser Pro Pro
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
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Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
305 310 315 320
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
325 330 335
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
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Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
355 360 365
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Phe Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp
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Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser
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Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
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Ser Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 56
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130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
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Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
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Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
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Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
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Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
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Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
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Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
485 490 495
Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg
500 505 510
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515 520 525
Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
530 535 540
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Arg Arg Ser Glu Asp Thr Ala
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580 585 590
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
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Gly Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro
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Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro
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Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<210> 57
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 57
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
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Thr Val Arg Val Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
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Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
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Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 58
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SPARC VH
<400> 58
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His
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Thr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
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65 70 75 80
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Ala Arg Leu Ala Phe Gly Ile Ile Thr Thr Val Val Arg Tyr Phe Asp
100 105 110
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Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Leu
130 135 140
<210> 59
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SPARC VL
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Lys Leu Gly
115 120 125
<210> 60
<211> 751
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Thr Ile
145 150 155 160
His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
165 170 175
Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly
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Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
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Leu Ala Phe Gly Ile Ile Thr Thr Val Val Arg Tyr Phe Asp Val Trp
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Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
260 265 270
Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
275 280 285
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
290 295 300
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Ser Thr Ser Gly
385 390 395 400
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Ile Val
405 410 415
Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
420 425 430
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg Tyr Leu Ala
435 440 445
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly
450 455 460
Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
465 470 475 480
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485 490 495
Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Arg Thr Phe
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515 520 525
Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
545 550 555 560
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
565 570 575
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
580 585 590
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
595 600 605
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
610 615 620
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
645 650 655
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
725 730 735
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
740 745 750
<210> 61
<211> 721
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 61
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
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100 105 110
Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
115 120 125
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
130 135 140
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg
145 150 155 160
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
165 170 175
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
180 185 190
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
195 200 205
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
210 215 220
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
225 230 235 240
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr
260 265 270
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
275 280 285
Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
290 295 300
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile
305 310 315 320
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
325 330 335
Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
340 345 350
Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
355 360 365
Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
370 375 380
Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val
385 390 395 400
Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr
405 410 415
Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
420 425 430
Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr
435 440 445
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
450 455 460
Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
465 470 475 480
Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser
500
<210> 71
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Somatostatin-hIgG1.Fc-anti-CD3
<400> 71
Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys Ala Ser
1 5 10 15
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20 25 30
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
35 40 45
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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405 410 415
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485 490 495
Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
500 505

Claims (214)

1.一种接合单元，包含：一中心核、多个连接臂，以及视需要而加入的一耦合臂，其中：
该中心核包含：(1)一第一多肽，包含多个赖氨酸(K)残基，其中每一个K残基和其下一个K残基间是由一填充序列所隔开，该填充序列包含甘氨酸(G)以及丝氨酸(S)残基，且该K残基的数目为2至15；或(2)一第二多肽，包含(Xaa-K)n序列，其中Xaa为一具有2至12个乙二醇(EG)重复单元的聚乙二醇化氨基酸，且n为2至15的整数；
所述多个连接臂分别连接于该中心核的该K残基，且所述多个连接臂中的每一个的自由端有一顺丁烯二亚酰胺基；以及
位于该中心核N-或C-端的氨基酸残基有一叠氮基或炔基、或位于该中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基，且该半胱氨酸残基的巯基与该耦合臂连接，其中该耦合臂的自由端有该叠氮基、炔基、一四嗪基或一高应力炔基。
2.如权利要求1所述的接合单元，其中该填充序列的序列为GS、GGS、GSG，或如SEQ IDNO:1-16所示。
3.如权利要求1所述的接合单元，其中该第一多肽包含2-15单元的G1-5SK序列。
4.如权利要求3所述的接合单元，其中该第一多肽包含(GSK)2-15序列。
5.如权利要求1所述的接合单元，其中所述多个连接臂中的每一个为一具有2至20个EG重复单元的聚乙二醇链。
6.如权利要求1所述的接合单元，其中该耦合臂为一具有2至12个EG重复单元的聚乙二醇链。
7.如权利要求1所述的接合单元，其中具有叠氮基的该氨基酸残基为L-叠氮高丙氨酸(AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸、或6-叠氮-D-赖氨酸。
8.如权利要求1所述的接合单元，其中具有炔基的该氨基酸残基为L-高炔丙基甘氨酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-HPG)或β-高炔丙基甘氨酸(β-HPG)。
9.如权利要求1所述的接合单元，其中该高应力炔基为反式-环辛烯(TCO)、二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、二环壬炔(BCN)或二苯并环辛炔(DICO)。
10.如权利要求1所述的接合单元，其中该四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪基、或其衍生物。
11.如权利要求1所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含多个第一组件，其分别透过巯基–顺丁烯二亚酰胺反应而连接于该些连接臂。
12.如权利要求11所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含一第二组件，其透过以下任一种方式连接：
透过铜催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)反应或应力促进的叠氮化物-炔点击化学(SPAAC)反应而连接于该叠氮基；
透过CuAAC反应而连接于该炔基；
透过逆电子需求狄尔斯-阿德(iEDDA)反应或SPAAC反应而连接于该高应力炔基；或
透过iEDDA反应而连接于该四嗪基。
13.如权利要求12所述的接合单元，其中该第二组件透过CuAAC反应而连接于该中心核N-或C-端的该叠氮基或炔基。
14.如权利要求13所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含一第三组件，该第三组建透过iEDDA反应而连接于该耦合臂。
15.如权利要求14所述的接合单元，其中该第三组件为一长PEG链，其分子量为20,000至50,000道尔顿。
16.如权利要求12所述的接合单元，其中该第二组件透过SPAAC反应而连接于该中心核N-或C-端的该叠氮基。
17.如权利要求16所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含一第三组件，该第三组件透过iEDDA反应而连接于该耦合臂。
18.如权利要求17所述的接合单元，其中该第三组件为一长PEG链，其分子量为20,000至50,000道尔顿。
19.如权利要求12所述的接合单元，其中：该第一组件为细胞因子或该细胞因子的受体的特异性第一单链可变片段(scFv)，或为该细胞因子的一可溶性受体；以及该第二组件为组织相关细胞外基质蛋白的特异性第二scFv。
20.如权利要求19所述的接合单元，其中该组织相关细胞外基质蛋白选自：α-聚集蛋白聚糖、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白以及XI型胶原蛋白。
21.如权利要求19所述的接合单元，其中该细胞因子选自：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23以及B细胞活化因子(BAFF)。
22.如权利要求19所述的接合单元，其中该细胞因子的受体为IL-6或IL-17特异性的。
23.如权利要求19所述的接合单元，其中该细胞因子的可溶性受体是TNF-α或IL-1特异性的。
24.如权利要求12所述的接合单元，其中：该第一组件为一第一细胞表面抗原的特异性第一scFv；以及该第二组件为一第二细胞表面抗原的特异性第二scFv。
25.如权利要求24所述的接合单元，其中该第一细胞表面抗原选自：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138以及CD319。
26.如权利要求24所述的接合单元，其中该第二细胞表面抗原为CD3或CD16a。
27.如权利要求12所述的接合单元，其中：该第一组件为一肽类激素、一生长因子、或一肿瘤相关抗原的特异性第一scFv；以及该第二组件为一细胞表面抗原的特异性第二scFv。
28.如权利要求27所述的接合单元，其中该肽类激素为分泌素、胆囊收缩素(CCK)、生长抑素或促甲状腺素(TSH)。
29.如权利要求27所述的接合单元，其中该生长因子选自：上皮生长因子(EGF)、突变型EGF、表皮调节素、肝素结合上皮生长因子(HB-EGF)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及肝细胞生长因子(HGF)。
30.如权利要求27所述的接合单元，其中该肿瘤相关抗原选自：人类上皮生长因子受体(HER1)、HER2、HER3、HER4、糖抗原19-9(CA 19-9)、糖抗原125(CA 125)、癌胚抗原(CEA)、黏蛋白1MUC 1)、神经节苷脂GD2、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原PSCA)、间皮素、黏蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原、Globo H、阶段特异性胚胎抗原(SSEA-4)以及上皮细胞黏附分子(EpCAM)。
31.如权利要求27所述的接合单元，其中该细胞表面抗原是CD3或CD16a。
32.如权利要求12所述的接合单元，其中：该第一组件为细胞核因子κB受体激活剂(RANKL)的特异性第一scFv；以及该第二组件为I型胶原蛋白或骨结合素的特异性第二scFv。
33.如权利要求12所述的接合单元，其中：该第一组件为VEGF-A的特异性scFv；以及该第二组件为一长PEG链，其分子量为20,000至50,000道尔顿。
34.一种治疗罹患或可能罹患免疫疾病的个体的方法，包含：对该个体投予一治疗有效量的如权利要求19所述的接合单元。
35.如权利要求34所述的方法，其中：该免疫疾病为牛皮癣；该第一组件为TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或IL-17R的特异性scFv；以及该第二组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。
36.如权利要求34所述的方法，其中：该免疫疾病为全身性红斑狼疮(SLE)、皮肤狼疮或干燥综合症；该第一组件为BAFF的特异性scFv；以及该第二组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。
37.如权利要求34所述的方法，其中：该免疫疾病为类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎；该第一组件为TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、IL-17、IL-6R或IL-17R的特异性scFv；以及该第二组件为II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性scFv。
38.如权利要求34所述的方法，其中：该免疫疾病为炎性肠病；该第一组件为TNF-α的特异性scFv；以及该第二组件为III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv。
39.如权利要求38所述的方法，其中该炎性肠病为克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
40.一种治疗罹患或可能罹患扩散性肿瘤的个体的方法，包含：对该个体投予一治疗有效量的如权利要求24所述的接合单元。
41.如权利要求40所述的方法，其中该扩散性肿瘤为急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或骨髓瘤。
42.如权利要求40所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病；该第一组件为CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b的特异性scFv；以及该第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
43.如权利要求40所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为浆细胞瘤或多发性骨髓瘤；该第一组件为CD38、CD78、CD138或CD319的特异性scFv；以及该第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
44.如权利要求40所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为衍生自T细胞的淋巴瘤或白血病；该第一组件为CD5、CD30或CD43的特异性scFv；以及该第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
45.如权利要求40所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为骨髓性白血病；该第一组件为CD33或CD34的特异性scFv；以及该第二组件为CD3或CD16a的特异性scFv。
46.一种治疗罹患或可能罹患实体瘤的个体的方法，包含：对该个体投予一治疗有效量的如权利要求27所述的接合单元。
47.如权利要求46所述的方法，其中该实体瘤为黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌或头颈部鳞状细胞癌。
48.如权利要求46所述的方法，其中该肿瘤相关抗原选自：HER1、HER2、HER3、HER4、CA19-9、CA 125、CEA、MUC 1、神经节苷脂GD2、MAGE、PSMA、PSCA、间皮素、黏蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原、Globo H、SSEA-4以及EpCAM。
49.如权利要求46所述的方法，其中该肽类激素为分泌素、胆囊收缩素、生长抑素或促甲状腺素。
50.如权利要求46所述的方法，其中该生长因子选自：EGF、突变型EGF、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF以及HGF。
51.如权利要求46所述的方法，其中该细胞表面抗原选自：CD3或CD16a。
52.一种治疗罹患或可能罹患骨质疏松症的个体的方法，包含：对该个体投予一治疗有效量的如权利要求32所述的接合单元。
53.一种治疗罹患或可能罹患老年性黄斑变性(AMD)的个体的方法，包含：对该个体投予一治疗有效量的如权利要求33所述的接合单元。
54.一种分子构建体，包含一第一接合单元以及一第二接合单元，其中：
该第一接合单元包含：一第一中心核，其包含多个氨基；以及分别连接于该第一中心核的一第一连接臂以及视需要而加入的一第一耦合臂；
该第二接合单元包含：一第二中心核，其包含多个氨基；以及分别连接于该第二中心核的一第二连接臂以及视需要而加入的一第二耦合臂；以及
该第一与第二接合单元透过铜催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)反应、应力促进的叠氮化物-炔点击化学(SPAAC)反应或逆电子需求狄尔斯-阿德(iEDDA)反应而彼此偶联，且上述反应发生于下列任一种情形中：该第一与第二中心核之间、该第一耦合臂与该第二中心核之间、该第一与第二耦合臂之间或该第一中心核与该第二耦合臂之间。
55.如权利要求54所述的分子构建体，其中该第一与第二接合单元分别包含与其相连的多个第一与第二连接臂，其中所述第一与第二连接臂中的每一个连接于该第一与第二接合单元的所述氨基。
56.如权利要求54所述的分子构建体，其中所述第一与第二连接臂中的每一个的自由端有一顺丁烯二亚酰胺基。
57.如权利要求56所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含：一第一靶向组件及一第一效应组件，分别透过巯基–顺丁烯二亚酰胺反应而连接于所述第一与第二连接臂。
58.如权利要求54所述的分子构建体，其中：每一个所述第一与第二连接臂为一PEG链，其具有2至20个EG重复单元；且每一个所述第一与第二耦合臂为一PEG链，其具有2至12个EG重复单元。
59.如权利要求54所述的分子构建体，其中：该第一与第二耦合臂其中之一在其自由端有一叠氮基，而在另一者的自由端则有一炔基或高应力炔基；以及该第一与第二中心核透过发生于该第一与第二耦合臂之间的CuAAC反应或SPAAC反应而彼此偶联。
60.如权利要求59所述的分子构建体，其中该高应力炔基为二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、二环壬炔(BCN)或二苯并环辛炔(DICO)。
61.如权利要求54所述的分子构建体，其中：该第一与第二耦合臂其中之一在其自由端有一四嗪基，而在另一者的自由端则有一反式-环辛烯(TCO)；且该第一与第二中心核透过发生于该第一与第二耦合臂之间的iEDDA反应而彼此偶联。
62.如权利要求61所述的分子构建体，其中该四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪基或其衍生物。
63.如权利要求54所述的分子构建体，其中该第一与第二中心核至少其中之一为一化合物核，其中与该化合物核连接的耦合臂是透过和该化合物核的多个氨基中的一个形成一酰胺键而连接，且其自由端有一叠氮基、炔基、高应力炔基或四嗪基。
64.如权利要求63所述的分子构建体，其中该化合物核选自：苯-1,3,5-三胺、2-(氨基甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺、三(2-氨基乙基)胺、苯-1,2,4,5-四胺、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-联苯、四(2-氨基乙基)甲烷、四(乙胺)肼、N,N,N’,N’,-四(氨基乙基)乙二胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺以及N,N-二[(1-氨基-3,3-二氨基乙基)戊基]甲二胺。
65.如权利要求63所述的分子构建体，其中：
该第一与第二中心核其中之一为该化合物核，其中与该化合物核连接的耦合臂是透过和该化合物核的多个氨基中的一个形成一酰胺键而连接，且其自由端有一DBCO、DIFO、BCN或DICO基；
该第一与第二中心核中的另一者为一多肽，其N-或C-端的氨基酸残基为L-叠氮高丙氨酸(AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸；以及
该第一与第二中心核透过发生于该耦合臂以及该N-或C-端氨基酸残基之间的SPAAC反应而彼此偶联。
66.如权利要求54所述的分子构建体，其中该第一与第二中心核其中至少之一为一多肽，其包含多个赖氨酸(K)残基。
67.如权利要求66所述的分子构建体，其中该K残基的数目为2至15，且每一个K残基和其下一个K残基间是由一填充序列所隔开，该填充序列包含甘氨酸(G)以及丝氨酸(S)残基。
68.如权利要求67所述的分子构建体，其中该填充序列的序列为GS、GGS、GSG或如SEQID NO:1-16所示。
69.如权利要求67所述的分子构建体，其中该多肽包含2-15单元的G1-5SK序列。
70.如权利要求69所述的分子构建体，其中该多肽包含(GSK)2-15序列。
71.如权利要求66所述的分子构建体，其中该多肽包含(Xaa-K)n序列，其中Xaa为一具有2至12个乙二醇(EG)重复单元的聚乙二醇化氨基酸，且n为2至15的整数。
72.如权利要求66所述的分子构建体，其中该第一与第二中心核皆为该多肽。
73.如权利要求72所述的分子构建体，其中该第一与第二中心核的N-端皆经过一乙酰基修饰。
74.如权利要求72所述的分子构建体，其中：
该第一与第二中心核其中之一的N-或C-端的第一个氨基酸残基为L-叠氮高丙氨酸、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸；
该第一与第二中心核中的另一者的N-或C-端的第一个氨基酸残基为L-高炔丙基甘氨酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-HPG)或β-高炔丙基甘氨酸(β-HPG)；以及
该第一与第二中心核透过发生于所述第一个氨基酸残基间的CuAAC反应而彼此偶联。
75.如权利要求72所述的分子构建体，其中该第一与第二中心核各自的N-或C-端有一半胱氨酸残基；且该第一与第二耦合臂分别透过巯基–顺丁烯二亚酰胺反应而连接于该第一与第二中心核的所述半胱氨酸残基。
76.如权利要求72所述的分子构建体，其中：
该第一与第二中心核其中之一的N-或C-端的第一个氨基酸残基为L-叠氮高丙氨酸、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸；
该第一与第二中心核中的另一者的N-或C-端有一半胱氨酸残基，其中该第一或第二耦合臂透过巯基–顺丁烯二亚酰胺反应而连接于该半胱氨酸残基，且其自由端有一DBCO、DIFO、BCN或DICO基；以及
该第一与第二中心核透过发生于该第一中心核与该第二耦合臂或该第二中心核与该第一耦合臂间的SPAAC反应而彼此偶联。
77.如权利要求54所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含一第三连接臂，该第三连接臂连接于该第一或第二接合单元。
78.如权利要求77所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含一分子量为20,000至50,000道尔顿的长PEG链，其中该长PEG链透过巯基–顺丁烯二亚酰胺反应而连接于该第三连接臂。
79.如权利要求57所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含一第三接合单元，该第三接合单元包含一第三中心核以及分别连接于该第三中心核的一第三连接臂及一第三耦合臂，其中该第三接合单元透过发生在以下任一种情形的CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应而连接于该第一或第二接合单元：该第一或第二耦合臂与该第三耦合臂间、该第一或第二中心核与该第三耦合臂间、该第一或第二耦合臂与该第三中心核间或该第一或第二中心核与该第三中心核间。
80.如权利要求79所述的分子构建体，其中该第一、第二与第三中心核彼此不同。
81.如权利要求79所述的分子构建体，其中该第三连接臂的自由端有一顺丁烯二亚酰胺基，且还包含一第二靶向组件或一第二效应组件透过巯基-顺丁烯二亚酰胺反应而连接于该第三连接臂。
82.如权利要求81所述的分子构建体，其中该第二靶向组件以及该第二效应组件分别与该第一靶向组件以及该第一效应组件不同。
83.如权利要求57所述的分子构建体，其中：该第一靶向组件为一组织相关细胞外基质蛋白的特异性第一单链可变片段(scFv)；以及该第一效应组件为一细胞因子或该细胞因子的受体的特异性第二scFv、或为该细胞因子的一可溶性受体。
84.如权利要求83所述的分子构建体，其中该组织相关细胞外基质蛋白选自：α-聚集蛋白聚糖、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白以及XI型胶原蛋白。
85.如权利要求83所述的分子构建体，其中该细胞因子选自：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23以及B细胞活化因子(BAFF)。
86.如权利要求83所述的分子构建体，其中该细胞因子的受体是IL-6或IL-17特异性的受体。
87.如权利要求83所述的分子构建体，其中该细胞因子的可溶性受体是TNF-α或IL-1特异性的可溶性受体。
88.如权利要求57所述的分子构建体，其中：该第一靶向组件为一第一细胞表面抗原的特异性第一scFv；以及该第一效应组件为一细胞毒性药物或为一第二细胞表面抗原的特异性第二scFv。
89.如权利要求88所述的分子构建体，其中该第一细胞表面抗原选自：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138以及CD319。
90.如权利要求88所述的分子构建体，其中该细胞毒性药物选自：奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素以及喜树碱。
91.如权利要求88所述的分子构建体，其中该第二细胞表面抗原是CD3或CD16a。
92.如权利要求88所述的分子构建体，其中：该第一与第二细胞表面抗原其中之一是CD79a，而另一者是CD79b。
93.如权利要求57所述的分子构建体，其中：该第一靶向组件为一肽类激素、第一生长因子或为一肿瘤相关抗原的特异性第一scFv；以及该第一效应组件为一细胞毒性药物、类铎受体(TLR)激动剂、与一放射性核种复合的螯合剂、细胞因子，或为一第二生长因子、细胞表面抗原、半抗原或该细胞因子的特异性第二scFv。
94.如权利要求93所述的分子构建体，其中该肽类激素为分泌素、胆囊收缩素(CCK)、生长抑素或促甲状腺素(TSH)。
95.如权利要求93所述的分子构建体，其中该第一生长因子选自：上皮生长因子(EGF)、突变型EGF、表皮调节素、肝素结合上皮生长因子(HB-EGF)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及肝细胞生长因子(HGF)。
96.如权利要求93所述的分子构建体，其中该肿瘤相关抗原选自：人类上皮生长因子受体(HER1)、HER2、HER3、HER4、糖抗原19-9(CA 19-9)、糖抗原125(CA 125)、癌胚抗原(CEA)、黏蛋白1(MUC 1)、神经节苷脂GD2、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、间皮素、黏蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原、Globo H、阶段特异性胚胎抗原(SSEA-4)以及上皮细胞黏附分子(EpCAM)。
97.如权利要求93所述的分子构建体，其中该细胞毒性药物选自：奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素以及喜树碱。
98.如权利要求93所述的分子构建体，其中该TLR激动剂选自：脂多糖(LPS)、单磷酰脂A、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG DON)、脂磷壁酸、β-葡聚糖以及酵母聚糖。
99.如权利要求93所述的分子构建体，其中该螯合剂选自：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸(NODA)以及二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。
100.如权利要求93所述的分子构建体，其中该放射性核种为111In、131I或177Lu。
101.如权利要求93所述的分子构建体，其中该细胞因子选自：IL-2、IFN-α、IFN-γ以及TNF-α。
102.如权利要求93所述的分子构建体，其中该第二生长因子为EGF、突变型EGF、VEGF-A、bFGF或HGF。
103.如权利要求93所述的分子构建体，其中该细胞表面抗原选自：CD3、CD16a、CD28、CD134、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、程序性细胞死亡因子1(PD-1)以及程序性细胞死亡因子1配体1(PD-L1)。
104.如权利要求93所述的分子构建体，其中该半抗原选自：二硝苯酚(DNP)、三硝苯酚(TNP)及具有SEQ ID NO:20所示序列的短肽。
105.如权利要求93所述的分子构建体，其中该第二scFv为选自IL-2、IFN-α、IFN-γ与TNF-α的该细胞因子的特异性非中和性scFv。
106.如权利要求57所述的分子构建体，其中：该第一靶向组件为I型胶原蛋白或骨结合素的特异性scFv；以及该第一效应组件为细胞核因子κB受体激活剂(RANKL)的特异性scFv。
107.一种治疗罹患或可能罹患免疫疾病的个体的方法，包含：对该个体投予一治疗有效量的如权利要求83所述的分子构建体。
108.如权利要求107所述的方法，其中：该免疫疾病为一自体免疫疾病；该第一靶向组件为α-聚集蛋白聚糖、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白或XI型胶原蛋白的特异性scFv；以及该第一效应组件为TNF-α、IL-17、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23，BAFF、IL-6受体(IL-6R)或IL-17受体(IL-17R)的特异性scFv、或为TNF-α或IL-1的可溶性受体。
109.如权利要求107所述的方法，其中：该自体免疫疾病为牛皮癣；该第一靶向组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv；以及该第一效应组件为TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或IL-17R的特异性scFv。
110.如权利要求107所述的方法，其中：该自体免疫疾病为全身性红斑狼疮(SLE)、皮肤狼疮或干燥综合症；该第一靶向组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv；以及该第一效应组件为BAFF的特异性scFv。
111.如权利要求107所述的方法，其中：该自体免疫疾病为类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎；该第一靶向组件为II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性scFv；以及该第一效应组件为TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、IL-17、IL-6R或IL-17R的特异性scFv。
112.如权利要求107所述的方法，其中：该自体免疫疾病为炎性肠病；该第一靶向组件为III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv；以及该第一效应组件为TNF-α的特异性scFv。
113.如权利要求112所述的方法，其中该炎性肠病为克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
114.一种治疗罹患或可能罹患扩散性肿瘤的个体的方法，包含：对该个体投予一治疗有效量的如权利要求88所述的分子构建体。
115.如权利要求114所述的方法，其中该扩散性肿瘤为急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或骨髓瘤。
116.如权利要求114所述的方法，其中：该第一靶向组件与该第一效应组件其中之一为CD79a的特异性scFv，而另一者为CD79b的特异性scFv。
117.如权利要求114所述的方法，其中：该第一靶向组件为CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138以及CD319的特异性scFv；以及该第一效应组件为该细胞毒性药物或为CD3或CD16a的特异性scFv。
118.如权利要求117所述的方法，其中该细胞毒性药物选自：奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素以及喜树碱。
119.如权利要求117所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病；该第一靶向组件为CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b的特异性scFv；以及该第一效应组件为该细胞毒性药物或为CD3或CD16a的特异性scFv。
120.如权利要求117所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病；该第一靶向组件与该第一效应组件其中之一为CD79a的特异性scFv，而另一者为CD79b的特异性scFv。
121.如权利要求117所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为浆细胞瘤或多发性骨髓瘤；该第一靶向组件为CD38、CD78、CD138或CD319的特异性scFv；以及该第一效应组件为该细胞毒性药物或为CD3或CD16a的特异性scFv。
122.如权利要求117所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为衍生自T细胞的淋巴瘤或白血病；该第一靶向组件为CD5、CD30或CD43的特异性scFv；以及该第一效应组件为该细胞毒性药物或为CD3或CD16a的特异性scFv。
123.如权利要求117所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为骨髓性白血病；该第一靶向组件为CD33或CD34的特异性scFv；以及该第一效应组件为该细胞毒性药物或为CD3或CD16a的特异性scFv。
124.一种治疗罹患或可能罹患实体瘤的个体的方法，包含：对该个体投予一治疗有效量的如权利要求93所述的分子构建体。
125.如权利要求124所述的方法，其中该实体瘤为黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌或头颈部鳞状细胞癌。
126.如权利要求124所述的方法，其中该肽类激素为分泌素、胆囊收缩素、生长抑素或促甲状腺素。
127.如权利要求124所述的方法，其中该第一生长因子选自：EGF、突变型EGF、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF以及HGF。
128.如权利要求124所述的方法，其中该肿瘤相关抗原选自：HER1、HER2、HER3、HER4、CA19-9、CA 125、CEA、MUC 1、神经节苷脂GD2、MAGE、PSMA、PSCA、间皮素、黏蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原、Globo H、SSEA-4以及EpCAM。
129.如权利要求124所述的方法，其中该细胞毒性药物选自：奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素以及喜树碱。
130.如权利要求124所述的方法，其中该TLR激动剂选自：脂多糖、单磷酰脂A、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡聚脱氧核苷酸、脂磷壁酸、β-葡聚糖以及酵母聚糖。
131.如权利要求124所述的方法，其中该螯合剂选自：DOTA、NOTA、NODA以及DTPA。
132.如权利要求124所述的方法，其中该放射性核种为111In、131I或177Lu。
133.如权利要求124所述的方法，其中该细胞因子选自：IL-2、IFN-α、IFN-γ以及TNF-α。
134.如权利要求124所述的方法，其中该第二生长因子为EGF、突变型EGF、VEGF-A、bFGF或HGF。
135.如权利要求124所述的方法，其中该细胞表面抗原选自：CD3、CD16a、CD28、CD134、CTLA-4、PD-1以及PD-L1。
136.如权利要求124所述的方法，其中该第一效应组件为该半抗原的特异性scFv，且该方法还包含对该个体投予经该相同半抗原标记的一免疫调节效应物。
137.如权利要求136所述的方法，其中：该半抗原选自：DNP、TNP及具有SEQ ID NO:20所示序列的短肽；以及该免疫调节效应物为IFN-α、IL-2、TNF-α和IFN-γ，以及PD-1、PD-L1、CTLA-4或CD3的特异性IgG抗体。
138.如权利要求124所述的方法，其中该第二scFv为选自IL-2、IFN-α、IFN-γ与TNF-α的该细胞因子的特异性非中和性scFv。
139.一种治疗罹患或可能罹患骨质疏松症的个体的方法，包含：对该个体投予一治疗有效量的如权利要求106所述的分子构建体。
140.一种分子构建体包含：
IgG.Fc的一对CH2-CH3区段；
一第一对效应组件，其中该效应组件对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17(IL-17)、IL-17受体(IL-17R)、IL-1、IL-6、IL-6R、IL-12、IL-23、B细胞活化因子BAFF)或细胞核因子κB受体激活剂配体(RANKL)的特异性抗体片段、或为TNF-α或IL-1的可溶性受体；以及
一第一对靶向组件，其中该靶向组件为α-聚集蛋白聚糖、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或骨结合素的特异性抗体片段，其中：
当该第一对效应组件连接于该对CH2-CH3区段的N-端，则该第一对靶向组件连接于该对CH2-CH3区段的C-端，反之亦然；或
当该第一对效应组件与该第一对靶向组件都是单链可变片段(scFv)的形式时，则该第一对靶向组件以串联构型或双抗体构型连接于该第一对效应组件的N-端，因而形成连接于该对CH2-CH3区段的N-端的一对双特异性scFv。
141.如权利要求140所述的分子构建体，其中该对CH2-CH3区段衍生自人γ4或γ1免疫球蛋白。
142.如权利要求140所述的分子构建体，其中当该第一对效应组件为一抗原结合片段(Fab)的形式且当该第一对靶向组件为scFv的形式时，反之亦然，则该Fab以及scFv分别连接于该CH2-CH3区段的N-与C-端，而使得该分子构建体形成一延伸IgG构型。
143.如权利要求140所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含一第二对效应组件或一第二对靶向组件，其中该第二对效应或靶向组件连接于该CH2-CH3区段的自由C-端。
144.如权利要求140所述的分子构建体，其中：该效应组件为TNF-α的特异性scFv；以及该靶向组件为II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性scFv。
145.如权利要求140所述的分子构建体，其中：该二效应组件为TNF-α的特异性Fab；以及该靶向组件为II型胶原蛋白或IX型胶原蛋白的特异性scFv。
146.如权利要求140所述的分子构建体，其中：该效应组件为IL-17的特异性scFv；以及该靶向组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。
147.如权利要求140所述的分子构建体，其中：该二效应组件为IL-17的特异性Fab；以及该靶向组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。
148.如权利要求140所述的分子构建体，其中：该效应组件为BAFF的特异性scFv；以及该靶向组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。
149.如权利要求140所述的分子构建体，其中：该二效应组件为BAFF的特异性Fab；以及该靶向组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性scFv。
150.如权利要求140所述的分子构建体，其中：该效应组件为TNF-α的特异性scFv；以及该靶向组件为III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv。
151.如权利要求140所述的分子构建体，其中：该二效应组件为TNF-α的特异性Fab；以及该靶向组件为III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性scFv。
152.如权利要求140所述的分子构建体，其中：该效应组件为RANKL的特异性scFv；以及该靶向组件为I型胶原蛋白或骨结合素的特异性scFv。
153.如权利要求140所述的分子构建体，其中：该二效应组件为RANKL的特异性Fab；以及该靶向组件为I型胶原蛋白或骨结合素的特异性scFv。
154.一种治疗免疫疾病的方法，包含以下步骤：对有需要的一个体投予一治疗有效量的如权利要求140所述的分子构建体。
155.如权利要求154所述的方法，其中该免疫疾病为一自体免疫疾病。
156.如权利要求155所述的方法，其中：该自体免疫疾病为类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎或关节黏连性脊椎炎；该效应组件为TNF-α、IL-12/IL-23、IL-1、IL-17或IL-6的特异性抗体片段；以及该靶向组件为II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白或α-聚集蛋白聚糖的特异性抗体片段。
157.如权利要求155所述的方法，其中：该自体免疫疾病为牛皮癣；该效应组件为TNF-α、IL-12/IL-23或IL-17的特异性抗体片段；以及该靶向组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性抗体片段。
158.如权利要求155所述的方法，其中：该自体免疫疾病为全身性红斑狼疮(SLE)、皮肤狼疮或干燥综合症；该效应组件为BAFF的特异性抗体片段；以及该靶向组件为I型胶原蛋白或VII型胶原蛋白的特异性抗体片段。
159.如权利要求155所述的方法，其中：该自体免疫疾病为炎性肠病；该效应组件为TNF-α的特异性抗体片段；以及该靶向组件为III型胶原蛋白或V型胶原蛋白的特异性抗体片段。
160.如权利要求159所述的方法，其中该炎性肠病为克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
161.一种治疗骨质疏松症的方法，包含以下步骤：对有需要的一个体投予一治疗有效量的如权利要求140所述的分子构建体。
162.如权利要求161所述的方法，其中：该效应组件为RANKL的特异性抗体片段；以及该靶向组件为I型胶原蛋白或骨结合素的特异性抗体片段。
163.一种分子构建体，包含：
IgG.Fc的一对CH2-CH3区段；
一第一对效应组件，其中该效应组件为一载药束，其包含多个细胞毒性药物分子，且该第一对效应组件连接于该对CH2-CH3区段的C-端；以及
一第一对靶向组件，其中该靶向组件为一细胞表面抗原的特异性抗体片段，其中该细胞表面抗原选自：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD78、CD79a、CD79b、CD138以及CD319，且该第一对靶向组件连接于该对CH2-CH3区段的N-端。
164.如权利要求163所述的分子构建体，其中该对CH2-CH3区段衍生自人γ4或γ1免疫球蛋白。
165.如权利要求163所述的分子构建体，其中该第一对靶向组件为一抗原结合片段(Fab)的形式，而使得该分子构建体形成一IgG构型。
166.如权利要求163所述的分子构建体，其中该细胞毒性药物为奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素或喜树碱。
167.如权利要求163所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含具有(G2-4S)2-8C序列的一多肽延伸段以及一耦合臂，其中：
该多肽延伸段连接于该对CH2-CH3区段的C-端；
该耦合臂透过巯基-顺丁烯二亚酰胺反应而连接至该多肽延伸段的C-端；以及
该载药束透过逆电子需求狄尔斯-阿德(iEDDA)反应、应力促进的叠氮化物-炔点击化学(SPAAC)反应或铜催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)反应而与该耦合臂连接。
168.如权利要求167所述的分子构建体，其中该载药束包含：
一中心核，其为包含多个氨基的一化合物或包含多个赖氨酸(K)残基的一多肽；以及
多个连接臂，分别藉由和一个所述氨基或一个所述K残基反应，而以其一端连接于该中心核，且其自由端有一顺丁烯二亚酰胺基，其中每一个所述细胞毒性药物分子藉由与该顺丁烯二亚酰胺基反应以透过该连接臂而连接于该中心核。
169.一种治疗扩散性肿瘤的方法，包含以下步骤：对有需要的一个体投予一治疗有效量的如权利要求163所述的分子构建体。
170.如权利要求169所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为B淋巴细胞衍生的淋巴瘤或白血病；且该细胞表面抗原为人类B淋巴细胞上的细胞表面抗原。
171.如权利要求170所述的方法，其中该人类B淋巴细胞上的细胞表面抗原为CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD43、CD79a或CD79b。
172.如权利要求169所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为浆细胞瘤或多发性骨髓瘤；且该细胞表面抗原为人类浆细胞上的细胞表面抗原。
173.如权利要求172所述的方法，其中该人类浆细胞上的细胞表面抗原为CD38、CD78、CD138或CD319。
174.如权利要求169所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为衍生自T细胞的淋巴瘤或白血病；且该细胞表面抗原为人类T细胞上的细胞表面抗原。
175.如权利要求174所述的方法，其中该人类T细胞上的细胞表面抗原为CD5、CD30或CD43。
176.如权利要求169所述的方法，其中：该扩散性肿瘤为骨髓性白血病；且该细胞表面抗原为人类骨髓细胞系淋巴细胞上的细胞表面抗原。
177.如权利要求176所述的方法，其中该人类骨髓细胞系淋巴细胞上的细胞表面抗原为CD33或CD34。
178.一种分子构建体，包含：
IgG.Fc的一对CH2-CH3区段；
一第一对效应组件，其中该效应组件为一载药束，其包含多个细胞毒性药物分子、类铎受体(TLR)激动剂或与一放射性核种复合的螯合剂分子，且该第一对效应组件连接于该对CH2-CH3区段的C-端；以及
一第一对靶向组件，其中该靶向组件为一肿瘤相关抗原的特异性抗体片段，且该第一对靶向组件连接于该对CH2-CH3区段的N-端。
179.如权利要求178所述的分子构建体，其中该对CH2-CH3区段衍生自人γ4或γ1免疫球蛋白。
180.如权利要求178所述的分子构建体，其中该第一对靶向组件为Fab形式，而使得该分子构建体形成一IgG构型。
181.如权利要求178所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含具有(G2-4S)2-8C序列的一多肽延伸段及一耦合臂，其中：
该多肽延伸段连接于该对CH2-CH3区段的C-端；
该耦合臂透过巯基-顺丁烯二亚酰胺反应而连接至该多肽延伸段的C-端；以及
该载药束透过iEDDA反应、SPAAC反应或CuAAC反应而与该耦合臂连接。
182.如权利要求181所述的分子构建体，其中该载药束包含：
一中心核，其为包含多个氨基的一化合物或包含多个赖氨酸(K)残基的一多肽；以及
多个连接臂，分别藉由和一个所述氨基或一个所述K残基反应，而以其一端连接于该中心核，且其自由端有一顺丁烯二亚酰胺基，其中每一该些细胞毒性药物分子藉由与该顺丁烯二亚酰胺基反应以透过该连接臂而连接于该中心核。
183.如权利要求178所述的分子构建体，还包含一第二对靶向组件，其分别以串联构型或双抗体构型连接于该第一对靶向组件的N-端，以形成连接于该对CH2-CH3区段N-端的一对双特异性scFv。
184.如权利要求178所述的分子构建体，其中该细胞毒性药物为奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素或喜树碱。
185.如权利要求178所述的分子构建体，其中该TLR激动剂为脂多糖(LPS)、单磷酰脂A、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG DON)、脂磷壁酸、β-葡聚糖或酵母聚糖。
186.如权利要求178所述的分子构建体，其中该螯合剂为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸(NODA)或二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。
187.如权利要求178所述的分子构建体，其中该放射性核种为90Y、111In或177Lu。
188.如权利要求178所述的分子构建体，其中该肿瘤相关抗原为人类上皮生长因子受体(HER1)、HER2、HER3、HER4、糖抗原19-9(CA 19-9)、糖抗原125(CA 125)、癌胚抗原(CEA)、细胞表面相关黏蛋白1(MUC 1)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、黏蛋白关联Tn抗原、唾液酸Tn抗原、Globo H、阶段特异性胚胎抗原(SSEA-4)、神经节苷脂GD2或上皮细胞黏附分子(EpCAM)。
189.如权利要求178所述的分子构建体，其中：该效应组件为包含该些细胞毒性药物分子的载药束；且该靶向组件为HER2的特异性scFv。
190.如权利要求178所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含一第二对靶向组件，分别连接于该第一对靶向组件，其中：该第一对效应组件的每一效应组件为包含该些细胞毒性药物分子的载药束；该第一对靶向组件的每一靶向组件为HER2的特异性scFv；以及该第二对靶向组件的每一靶向组件为HER1的特异性scFv。
191.一种治疗实体瘤的方法，包含以下步骤：对有需要的一个体投予一治疗有效量的如权利要求178所述的分子构建体。
192.如权利要求191所述的方法，其中该实体瘤为黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌或头颈部鳞状细胞癌。
193.如权利要求191所述的方法，其中，所述方法还包含以下步骤：在投予该分子构建体之前，对该个体进行一血液透析程序，其使用一或多种肿瘤相关抗原的特异性抗体片段，以移除由该肿瘤脱落并进入该个体循环中的该一或多肿瘤相关抗原。
194.一种分子构建体，包含：
IgG.Fc的一对CH2-CH3区段；
一第一对效应组件，其中该效应组件为一载药束，其包含多个细胞毒性药物分子、TLR激动剂或与一放射性核种复合的螯合剂分子；或一细胞表面抗原、一生长因子或一半抗原的特异性抗体片段；以及
一第一对靶向组件，其中该靶向组件为该生长因子或一肽类激素；其中：
当该效应组件为该载药束时，该第一对效应组件分别连接于该对CH2-CH3区段的C-端，且该靶向组件分别连接于该对CH2-CH3区段的N-端；以及
当该效应组件为该抗体片段时，该效应组件分别连接于该对CH2-CH3区段的N-端，且该靶向组件分别连接于该对CH2-CH3区段的C-端，反之亦然。
195.如权利要求194所述的分子构建体，其中该对CH2-CH3区段衍生自人γ4或γ1免疫球蛋白。
196.如权利要求194所述的分子构建体，其中该第一对靶向组件为Fab形式，而使得该分子构建体形成IgG构型。
197.如权利要求194所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含具有(G2-4S)2-8C序列的一多肽延伸段及一耦合臂，其中：
该多肽延伸段连接于该对CH2-CH3区段的C-端；
该耦合臂透过巯基-顺丁烯二亚酰胺反应而连接至该多肽延伸段的C-端；以及
该载药束透过iEDDA反应、SPAAC反应或CuAAC反应而与该耦合臂连接。
198.如权利要求197所述的分子构建体，其中该载药束包含：
一中心核，其为包含多个氨基的一化合物或包含多个K残基的一多肽；以及
多个连接臂，分别藉由和一个所述氨基或一个所述K残基反应，而以其一端连接于该中心核，且其自由端有一顺丁烯二亚酰胺基，其中每一该些细胞毒性药物分子藉由与该顺丁烯二亚酰胺基反应以透过该连接臂而连接于该中心核。
199.如权利要求194所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含一第二对效应组件或一第二对靶向组件，其中该第二对效应或靶向组件分别以串联或双抗体的构型连接于连接至该对CH2-CH3区段N-端的该对组件，以形成连接于该对CH2-CH3区段N-端的一对双特异性scFv。
200.如权利要求194所述的分子构建体，其中该细胞毒性药物为奥里斯他汀、美登木素、阿霉素、卡奇霉素或喜树碱。
201.如权利要求194所述的分子构建体，其中该TLR激动剂为脂多糖、单磷酰脂A、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡聚脱氧核苷酸、脂磷壁酸、β-葡聚糖或酵母聚糖。
202.如权利要求194所述的分子构建体，其中该螯合剂为DOTA、NOTA、NODA或DTPA。
203.如权利要求194所述的分子构建体，其中该放射性核种为90Y、111In或177Lu。
204.如权利要求194所述的分子构建体，其中该细胞表面抗原是PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD3、CD16a、CD28或CD134。
205.如权利要求194所述的分子构建体，其中该生长因子为上皮生长因子(EGF)、突变型EGF、表皮调节素、肝素结合上皮生长因子(HB-EGF)、VEGF-A、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或肝细胞生长因子(HGF)。
206.如权利要求194所述的分子构建体，其中该半抗原为二硝苯酚(DNP)、三硝苯酚(TNP)、丹磺酰、盘尼西林、对胺苯甲酸或具有SEQ ID NO:20所示序列的多肽。
207.如权利要求194所述的分子构建体，其中该肽类激素为胆囊收缩素(CCK)、生长抑素或促甲状腺素(TSH)。
208.如权利要求194所述的分子构建体，其中：该效应组件为包含该些细胞毒性药物分子的载药束；且该靶向组件为EGF。
209.如权利要求194所述的分子构建体，其中：该效应组件为CD3、CD16a、PD-1或VEGF的特异性scFv；且该靶向组件为EGF。
210.一种治疗实体瘤的方法，包含以下步骤：对有需要的一个体投予一治疗有效量的如权利要求194所述的分子构建体。
211.如权利要求210所述的方法，其中该实体瘤为黑色素瘤、食道癌、胃癌、脑瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰脏癌、结肠癌、大肠癌、大肠结肠癌、肾癌、肝细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、睪丸癌或头颈部鳞状细胞癌。
212.如权利要求210所述的方法，其中当该效应组件为半抗原的特异性抗体片段时，该方法还包含以下步骤：在投予该分子构建体之后，对该个体投予经该相同半抗原标记的一免疫调节效应物，其中该免疫调节效应物为IFN-α、IL-2、TNF-α或IFN-γ，或为PD-1、PD-L1、CTLA-4或CD3的特异性IgG抗体。
213.如权利要求210所述的方法，其中该实体瘤为恶性肿瘤，其中：
该对CH2-CH3区段衍生自人IgG重链γ1；
该效应组件为包含所述细胞毒性药物分子或所述LPS分子的载药束；以及
该靶向组件为EGF、突变型EGF、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、FGF、HGF、CCK、生长抑素或TSH。
214.如权利要求210所述的方法，其中该实体瘤为恶性肿瘤，其中：
该对CH2-CH3区段衍生自人IgG重链γ1；
该效应组件为人类CD3、CD16a、PD-1、PD-L1或VEGF-A的特异性scFv，且该第一对效应组件连接于该对CH2-CH3区段的C-端；以及
该靶向组件为EGF、突变型EGF、表皮调节素、HB-EGF、VEGF-A、FGF、HGF、胆囊收缩素、生长抑素或促甲状腺素，且该第一对靶向组件连接于该对CH2-CH3区段的N-端。
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108152489A (zh) * 2017-12-19 2018-06-12 长沙维世尔生物科技有限公司 一种用于软骨骨质免疫组化抗原修复的方法
CN108727504A (zh) * 2018-04-16 2018-11-02 中国科学院生物物理研究所 一种ifn与抗pd-l1抗体的融合蛋白及其应用
CN109762068A (zh) * 2018-08-09 2019-05-17 源道隆（苏州）医学科技有限公司 一种可靶向ctla4和pd-1的单基因双特异性抗体及其应用
CN109957023A (zh) * 2017-12-25 2019-07-02 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd22的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN110124020A (zh) * 2019-05-05 2019-08-16 海南医学院 基于胞外诱捕网原理制成的肿瘤细胞疫苗及其制备方法
CN111194223A (zh) * 2017-09-19 2020-05-22 免疫功坊股份有限公司 与白蛋白具有较佳结合亲和力的药物分子
CN112368021A (zh) * 2018-06-14 2021-02-12 蓝鸟生物公司 Cd79a嵌合抗原受体
CN113784989A (zh) * 2019-03-25 2021-12-10 免疫功坊股份有限公司 带有金属结合区的复合多肽及其分子构建体
CN113906052A (zh) * 2019-06-04 2022-01-07 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途
CN114206936A (zh) * 2019-06-14 2022-03-18 2赛文缇生物公司 用于治疗癌症的组合物和方法
CN114230666A (zh) * 2021-12-20 2022-03-25 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种t7 rna聚合酶的单克隆抗体及其制备方法
WO2024022237A1 (zh) * 2022-07-28 2024-02-01 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种含氨基酸残基的三臂聚乙二醇衍生物

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT2992017T (lt) 2013-05-02 2021-02-25 Anaptysbio, Inc. Antikūnai nukreipti prieš programuotos žūties baltymą-1 (pd-1)
CA2968141C (en) * 2015-01-16 2020-08-04 Hsing-Mao CHU Molecular constructs with targeting and effector elements
EP3268392A2 (en) 2015-03-13 2018-01-17 CytomX Therapeutics, Inc. Anti-pdl1 antibodies, activatable anti-pdl1 antibodies, and methods of use thereof
RU2703952C2 (ru) * 2015-05-20 2019-10-22 Иммунворк Инк. Молекулярные конструкции с нацеливающими и эффекторными элементами и способы их применения
SG10201913303XA (en) 2015-07-13 2020-03-30 Cytomx Therapeutics Inc Anti-pd-1 antibodies, activatable anti-pd-1 antibodies, and methods of use thereof
CN108431045B (zh) * 2015-09-01 2022-05-13 免疫功坊股份有限公司 用以预防血栓形成及/或治疗血栓的分子构建体
MA44334A (fr) 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
US11583593B2 (en) 2016-01-14 2023-02-21 Synthis Therapeutics, Inc. Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses
JP7011764B2 (ja) 2016-07-07 2022-01-27 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 抗体アジュバント複合体
CA3032794A1 (en) * 2016-08-03 2018-02-08 The Feinstein Institute For Medical Research C1q and hmgb1 fusion proteins and uses thereof
AU2017345574A1 (en) 2016-10-19 2019-05-23 United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs Compositions and methods for treating cancer
KR20190101364A (ko) 2016-11-01 2019-08-30 테사로, 인코포레이티드 예정 사멸-1(pd-1)에 대한 항체
AU2017375460A1 (en) * 2016-12-15 2019-07-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Tissue-based biologics for the treatment of inflammatory and autoimmune disorders
DK3565844T3 (da) 2017-01-09 2023-05-01 Tesaro Inc Fremgangsmåder til behandling af cancer med anti-PD-1-antistoffer
JP2020510097A (ja) * 2017-03-16 2020-04-02 イミュンワーク インク．Ｉｍｍｕｎｗｏｒｋ Ｉｎｃ． リンカーユニット及びリンカーユニットを含む分子構築物
EP3600302A4 (en) 2017-03-29 2020-12-30 United States Government as Represented by The Department of Veterans Affairs METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER
AU2018250641A1 (en) 2017-04-11 2019-10-31 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained CD3 binding and methods of using the same
AU2018278327B2 (en) 2017-06-01 2023-03-16 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-pdl1 antibodies and methods of use thereof
CN111201242A (zh) * 2017-06-22 2020-05-26 财团法人生物技术开发中心 不对称异二聚fc-scfv融合抗globo h及抗cd3双特异性抗体及其在癌症治疗上的用途
CN110799538B (zh) * 2017-08-28 2023-08-01 西雅图免疫公司 抗cd3抗体及其制备和使用方法
EP3703676A4 (en) * 2017-11-04 2021-12-15 Advanced Proteome Therapeutics, Inc. COMPOSITION AND PROCESS FOR MODIFYING POLYPEPTIDES
EP3762429A4 (en) * 2018-03-09 2022-03-23 University of Pittsburgh - Of the Commonwealth System of Higher Education DELIVERY OF BIOLOGICAL AGENTS TO TISSUE
CN112368051A (zh) * 2018-03-23 2021-02-12 马萨诸塞大学 用于治疗骨病的基因治疗剂
CA3097381A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Endocyte, Inc. Methods of treating cancer
CN114679910A (zh) * 2018-11-21 2022-06-28 免疫功坊股份有限公司 用于治疗病理性血栓的多肽
US11027260B2 (en) 2019-02-13 2021-06-08 Uchicago Argonne, Llc Low pressure nanowire membrane for catalytic reactions and methods of making and using the same
KR20220004634A (ko) 2019-03-15 2022-01-11 볼트 바이오테라퓨틱스 인코퍼레이티드 Her2를 표적으로 하는 면역접합체
WO2020256721A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Synthis, Llc Antib0dy-alk5 inhibitor conjugates and their uses
EP4106793A4 (en) * 2020-02-19 2024-03-20 Us Gov Veterans Affairs INHIBITION OF EGFR TRIGGERING AN ADAPTIVE RESPONSE BY COOPTATION OF ANTIVIRAL SIGNALING PATHWAYS IN LUNG CANCER
WO2021193951A1 (ja) * 2020-03-26 2021-09-30 公益財団法人野口研究所 ポリエチレングリコール鎖を有する糖化合物、及び抗体薬物複合体の前駆体
US11654036B2 (en) 2020-05-26 2023-05-23 Elixir Medical Corporation Anticoagulant compounds and methods and devices for their use
WO2022056326A1 (en) * 2020-09-11 2022-03-17 Elixir Medical Corporation Anticoagulant compounds, methods and devices for ophthalmic use
US11617767B2 (en) 2020-11-20 2023-04-04 Simcere Innovation, Inc. Armed dual CAR-T compositions and methods for cancer immunotherapy
JP2024500847A (ja) 2020-12-18 2024-01-10 センチュリー セラピューティクス，インコーポレイテッド 適合可能な受容体特異性を有するキメラ抗原受容体システム
CN113717874B (zh) * 2021-09-27 2023-04-11 四川大学 一种耐高温、耐高糖的酿酒酵母菌株及其构建方法和应用
WO2023244517A1 (en) * 2022-06-16 2023-12-21 Merck Sharp & Dohme Llc Interleukin-2 prodrugs
CN116284429B (zh) * 2023-01-12 2023-12-08 浙江大学 一种双特异性肽聚合物及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101400698A (zh) * 2006-03-15 2009-04-01 诺沃-诺迪斯克有限公司 胰岛淀粉样多肽衍生物
WO2011029008A2 (en) * 2009-09-04 2011-03-10 Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University Synbodies to akt1
CN102448494A (zh) * 2009-02-13 2012-05-09 免疫医疗公司 具有胞内可裂解的键的免疫共轭物
CN103242451A (zh) * 2005-12-16 2013-08-14 Ibc医药公司 基于免疫球蛋白的多价生物活性装配体
CN103429616A (zh) * 2010-09-27 2013-12-04 詹森生物科技公司 结合人胶原ii的抗体
WO2014153164A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 The California Institute For Biomedical Research Targeting agent antibody conjugates and uses thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003300380B2 (en) * 2002-12-30 2008-11-06 Nektar Therapeutics Multi-arm polypeptide-poly(ethylene glycol) block copolymers as drug delivery vehicles
US8372399B2 (en) * 2006-08-31 2013-02-12 Cardiac Pacemakers, Inc. Bispecific antibodies and agents to enhance stem cell homing
RU2474433C2 (ru) * 2007-08-15 2013-02-10 ЙЕДА РЕСЕАРЧ ЭНД ДЕВЕЛОПМЕНТ КО. ЛТД, эт ве Вайзманн Институте оф Сайнсе Регуляторы ммр-9 и их применение
US9527925B2 (en) * 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
EP2800586A1 (en) * 2012-01-03 2014-11-12 Invictus Oncology Pvt. Ltd. Ligand-targeted molecules and methods thereof
EP3456741B1 (en) * 2012-05-22 2020-12-16 Bristol-Myers Squibb Company Il-17a/f il-23 bispecific antibodies and their uses
CN103509117B (zh) * 2013-05-06 2016-03-09 江苏匡亚生物医药科技有限公司 抗人her2和人igf-ir的双特异性抗体及其制备方法和用途
CA2968141C (en) * 2015-01-16 2020-08-04 Hsing-Mao CHU Molecular constructs with targeting and effector elements
RU2703952C2 (ru) * 2015-05-20 2019-10-22 Иммунворк Инк. Молекулярные конструкции с нацеливающими и эффекторными элементами и способы их применения
CN108431045B (zh) * 2015-09-01 2022-05-13 免疫功坊股份有限公司 用以预防血栓形成及/或治疗血栓的分子构建体

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103242451A (zh) * 2005-12-16 2013-08-14 Ibc医药公司 基于免疫球蛋白的多价生物活性装配体
CN101400698A (zh) * 2006-03-15 2009-04-01 诺沃-诺迪斯克有限公司 胰岛淀粉样多肽衍生物
CN102448494A (zh) * 2009-02-13 2012-05-09 免疫医疗公司 具有胞内可裂解的键的免疫共轭物
WO2011029008A2 (en) * 2009-09-04 2011-03-10 Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University Synbodies to akt1
CN103429616A (zh) * 2010-09-27 2013-12-04 詹森生物科技公司 结合人胶原ii的抗体
WO2014153164A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 The California Institute For Biomedical Research Targeting agent antibody conjugates and uses thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IAN W. HAMLEY: ""PEG-Peptide Conjugates"", 《BIOMACROMOLECULES》 *
NATE LARSON ET AL.: ""Polymeric conjugates for drug delivery"", 《CHEM MATER.》 *
VLIJAY K.CHAUDHARY ET AL.: ""A rapid method of cloning functional variable-region antibody genes in Escherichia coli as single-chain immunotoxins"", 《PROC. NADL. ACAD. SCI.》 *
李文丽 等: ""双特异性抗体在肿瘤治疗中的研究"", 《生命的化学》 *

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111194223B (zh) * 2017-09-19 2023-10-24 免疫功坊股份有限公司 与白蛋白具有较佳结合亲和力的药物分子
CN111194223A (zh) * 2017-09-19 2020-05-22 免疫功坊股份有限公司 与白蛋白具有较佳结合亲和力的药物分子
CN108152489A (zh) * 2017-12-19 2018-06-12 长沙维世尔生物科技有限公司 一种用于软骨骨质免疫组化抗原修复的方法
CN109957023A (zh) * 2017-12-25 2019-07-02 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向cd22的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN108727504A (zh) * 2018-04-16 2018-11-02 中国科学院生物物理研究所 一种ifn与抗pd-l1抗体的融合蛋白及其应用
CN108727504B (zh) * 2018-04-16 2021-08-27 泉州向日葵生物科技有限公司 一种ifn与抗pd-l1抗体的融合蛋白及其应用
CN112368021A (zh) * 2018-06-14 2021-02-12 蓝鸟生物公司 Cd79a嵌合抗原受体
CN109762068A (zh) * 2018-08-09 2019-05-17 源道隆（苏州）医学科技有限公司 一种可靶向ctla4和pd-1的单基因双特异性抗体及其应用
CN113784989A (zh) * 2019-03-25 2021-12-10 免疫功坊股份有限公司 带有金属结合区的复合多肽及其分子构建体
CN110124020A (zh) * 2019-05-05 2019-08-16 海南医学院 基于胞外诱捕网原理制成的肿瘤细胞疫苗及其制备方法
CN110124020B (zh) * 2019-05-05 2023-03-14 海南医学院 基于胞外诱捕网原理制成的肿瘤细胞疫苗及其制备方法
CN113906052A (zh) * 2019-06-04 2022-01-07 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途
CN113906052B (zh) * 2019-06-04 2024-02-13 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途
CN114206936A (zh) * 2019-06-14 2022-03-18 2赛文缇生物公司 用于治疗癌症的组合物和方法
CN114230666A (zh) * 2021-12-20 2022-03-25 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种t7 rna聚合酶的单克隆抗体及其制备方法
CN114230666B (zh) * 2021-12-20 2022-09-02 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种t7 rna聚合酶的单克隆抗体及其制备方法
WO2024022237A1 (zh) * 2022-07-28 2024-02-01 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种含氨基酸残基的三臂聚乙二醇衍生物

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