TW201835110A - 中心核構建體及其於組設藥物分子的用途 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容提出了多種中心核構建體。根據本揭示內容的多種實施方式，這些中心核構建體可用以組設多種藥物分子。舉例來說，所述中心核構建體可透過鏈接化學而與功能性元件複合。

Description

中心核構建體及其於組設藥物分子的用途
本揭示內容是關於藥學領域；更明確地說，是關於多功能的分子構建體，譬如具有標的元件與效應元件以將效應元件(如治療藥物)遞送至標的部位的分子構建體。
近年來，本領域發展出多種篩檢與選擇以抗原為標的之單株抗體(monoclonal antibodies，mAbs)的方法，進而帶動許多治療用抗體的研發，為一些不久前還被認為是不治之症的疾病帶來曙光。根據治療性抗體資料庫(Therapeutic Antibody Database)的統計，有多達2,800種左右的抗體已經或即將投入人體臨床試驗研發，而由政府藥物管理機構核准可用於臨床治療的抗體則約有80種。從與抗體療效相關的大量數據中可知抗體是基於何種藥理機制而發揮療效。
以抗體作為治療藥劑時，其主要的藥理機制是以抗體來中和或誘捕造成疾病的介質；所述介質可能是存在於血液循環、間質空間(interstitial space)或淋巴結中的細胞介素或免疫成分。中和所述介質的活性可抑制造成疾病的介質和其受體之間的互動。此外，可將細胞介素的可溶性受體或受體的細胞外部分和免疫球蛋白IgG的Fc部分製成融合蛋白，此種融合蛋白可利用類似中和抗體的機制來中和上述細胞介素或免疫因子；因此目前也開發出多種融合蛋白治療劑。
另外，某些取得臨床使用許可或正在進行臨床研究的治療性抗體則是採用了與上述主要抗體機制不同的機制，來發揮其藥理作用，譬如可藉由和受體結合以阻斷這些受體和其配體之間的互動。對此類抗體藥物來說，其主要的藥理機制並非由Fc-介導的機制(如抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)或是補體介導的細胞溶解(complement-mediated cytolysis，CMC)等)。
另一些治療性抗體可和目標細胞上的某些表面抗原結合，並藉此在目標細胞上發揮Fc介導的功能以及其他機制。最重要的Fc介導的機制為抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體介導的細胞溶解(CMC)，這兩種機制都會將與抗體結合的目標細胞溶解。這些抗體和特定的細胞表面抗原結合後，可使得與其結合的目標細胞發生細胞凋亡。
有些抗體也可以作為載體，用來攜帶細胞毒性分子或其他治療藥劑，而抗體本身則沒有顯著的治療效果。一般來說，此類抗體可結合至目標細胞上的「腫瘤相關」抗原，但其本身不會使細胞溶解。本領域已知有多種對B淋巴瘤上的CD19與CD22專一的抗體。在過去許多年間，大半的研究著重於探究如何以這些抗體作為載體來攜帶細胞毒性藥物，包括半衰期極短的放射性核種，如90 Y、131 I以及177 Lu。某些抗體也可作為載藥微脂體的標的藥劑，上述載藥微脂體載有細胞毒性藥物，如阿黴素(doxorubicin)、紫衫醇(paclitaxel)以及兩性黴素B (amphotericin B)。近年來，抗體藥物複合體(antibody drug conjugate，ADC)的研發成長快速，這主要可歸因於具有極高細胞毒性的藥物(如奧里斯他汀(auristatin)、美登木素(maytansine)、卡奇黴素(calicheamicin)以及喜樹鹼(camptothecin)等)、以及將細胞毒性分子複合至抗體分子上的方法等的發展。這些ADC經過設計可標的至表現一或多種獨特的CD標記的血液、淋巴系統與骨髓中的擴散性(或液態)腫瘤，包括多種類型的淋巴瘤與白血病。也有某些針對固態腫瘤所開發出的ADC。此類新一代的抗體藥物複合體中，已有少數經核准可用於臨床治療，也有許多ADC正在進行臨床試驗。
然而，在第一代ADC中，細胞毒性藥物分子是透過非選擇性的方式連接到抗體中的半胱胺酸(cysteine，C)或離胺酸(lysine，K)殘基，因此會得到異質性的ADC混合物，其中每一個ADC分子所攜帶的藥物分子數可能不同。此一現象會導致安全性與有效性上的疑慮。舉例來說，美國食品暨藥物管理局(US Food and Drug Administration，FDA)核准的首例ADC—吉妥單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)—可用以治療急性骨髓性白血病，但在上市後卻因毒性過高而在FDA的要求下退出市場。
製備具有雙重專一性的抗體的概念與方法，早在三十年前就已萌芽。近年來，隨著重組抗體工程方法的進步、以及對於更好藥物的需求驅使下，發展出多種具有不同結構構形的雙專一性抗體。
舉例來說，雙價或多價抗體可能帶有二或更多種抗原結合位。已知有多種方法可用以製備多價抗體，這些方法通常利用連接結構將三或四種抗原結合片段(antigen-binding fragment，Fab)共價連接在一起。舉例來說，已透過重組工程製備出能表現三或四個串聯(tandem)的Fab重複片段的抗體。
此外，利用合成的交聯物(crosslinker)，透過化學方法將不同的抗體或結合部位連接在一起，以製造出多價抗體的方法也是本領域公知的技術。其中一種方式是利用不同的接合物(linker)，將三、四或更多個分離的Fab片段，透過化學交聯的方式彼此接合。另一種方式是先製備一個具有多個Fab的構建體，將這些Fab組裝成一維的DNA支架(one-dimensional DNA scaffold)。這些經設計可和目標分子結合的各種多價抗體構建體彼此的尺寸、半衰期、構形彈性以及調節免疫系統的能力各不相同。
基於以上說明，已有部分研究著眼於製備效應元件數目固定的分子構建體或具有二或更多種不同功能性元件(譬如至少一標的元件與至少一效應元件)的分子構建體。然而，通常很難利用化學合成或重組技術等方法，來建立具有特定標的與效應元件組合的分子構建體。因此，本領域亟需一種新穎的分子平台，其可用以建構適用於多種疾病的各種分子。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明具體實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容的唯一目的在於對此處揭示的某些概念提供簡化的說明，以利理解後文所述的實施方式。
＜ I ＞ 含胜肽核的多臂接合物以及中心核構建體
本揭示內容的第一種態樣是關於一種接合單元，其上連接了至少兩種不同功能性元件。舉例來說，所述接合單元可連接有：兩種不同的效應元件、一種標的元件與一種效應元件、或一種效應元件與可延長接合單元生命週期的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈。本發明接合單元設計成帶有至少兩種不同的官能基，使得這些功能性元件能夠和各別的官能基反應而連接到接合單元。因此，本發明接合單元可作為用以製備帶有二或更多種功能性元件的分子構建體的平台。
根據本揭示內容多種實施方式，所述接合單元包含一中心核及複數個連接臂。中心核可以是多肽核，其包含2至15個離胺酸(K)殘基，其中每一個K殘基和次一個K殘基之間由一填充序列所隔開，所述填充序列包含甘胺酸(glycine，G)與絲胺酸(serine，S)殘基；或者是，所述多肽核的序列為(Xaa -K)n ，其中Xaa 是具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元的聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)，且n為2至15的整數。在視需要而實施的實施方式中，填充序列是由2至20個胺基酸殘基所組成。於多種實施方式中，填充序列可具有任一種以下序列：GS、GGS、GSG或序列編號：1-16所示序列。根據本揭示內容某些實施方式，中心核包含2至15個單元的G1-5 SK序列；在較佳的情形中，中心核的序列為(GSK)2-15 。每一連接臂藉由和K殘基形成醯胺鍵而連接於中心核的K殘基。連接臂的自由端(即，未連接於中心核的一端)有一順丁烯二醯亞胺基(maleimide group)。此外，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基有一疊氮基(azide group)或一炔基(alkyne group)；或者是或額外地，令位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸(C)殘基，且有一耦合臂透過此半胱胺酸殘基的硫氫基而與其連接，且所述耦合臂未和中心核連接的自由端有一疊氮基、炔基、四嗪基(tetrazine group)或高應力炔基(strained alkyne group)。
本發明此態樣亦關於一種中心核構建體，其帶有能用以進行鏈接反應的官能基。如此一來，可設計所述的中心核構建體使其攜帶至少一功能性元件（譬如，標的元件、效應元件或能夠提升藥動學特性的元件）或攜帶一具有多個功能性元件的分子構建體。
在本發明多種實施例中，所述的中心核構建體包含一中心核以及視需要而存在的耦合臂。於某些實施例中，所述中心核包含複數個離胺酸(lysine，K)殘基，其中每一個K殘基和其下一個K殘基間是由一填充序列所隔開，該填充序列包含甘胺酸(glycine，G)以及絲胺酸(serine，S)殘基，且該K殘基的數目為2至15。在視需要而實施的例子中，所述填充序列由2至20個氨基酸殘基所組成。於不同實施方式中，所述填充序列可具有任一種以下序列：GS、GGS、GSG或序列編號：1-16所示序列。根據本揭示內容某些實施方式，中心核包含2至15個單元的G1-5 SK序列；在較佳的情形中，中心核的序列為(GSK)2-15 。在替代性的實施方式中，所述中心核的序列為(Xaa -K)n ，其中Xaa 是具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元的聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)，且n為2至15的整數。再者，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基或具有疊氮基或炔基；或者是或額外地，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基。當中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基，該中心核構建體包含一耦合臂，其中耦合臂的一端透過半胱胺酸殘基的硫氫基而與其連接，而耦合臂的另一端(即，自由端)有疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基(strained alkyne)。在某些實施方式中，所述連接臂為一PEG鏈；在較佳情形中，其具有2至20個EG重複單元。此外，所述耦合臂為一PEG鏈；在較佳情形中，其具有2至12個EG重複單元。
帶有疊氮基的胺基酸殘基實例包括：L-疊氮高丙胺酸(azidohomoalanine，AHA)、4-疊氮-L-苯丙胺酸(4-azido-L-phenylalanine)、4-疊氮-D-苯丙胺酸(4-azido-D-phenylalanine)、3-疊氮-L-丙胺酸(3-azido-L-alanine)、3-疊氮-D-丙胺酸(3-azido-D-alanine)、4-疊氮-L-高丙胺酸(4-azido-L-homoalanine)、4-疊氮-D-高丙胺酸(4-azido-D-homoalanine)、5-疊氮-L-烏胺酸(5-azido-L-ornithine)、5-疊氮-D-烏胺酸(5-azido-D-ornithine)、6-疊氮-L-離胺酸(6-azido-L-lysine)以及6-疊氮-D-離胺酸(6-azido-D-lysine)。例示性的帶有炔基胺基酸殘基包括：L-高炔丙基甘胺酸(L-homopropargylglycine，L-HPG)、D-高炔丙基甘胺酸(D-homopropargylglycine，D-HPG)以及β-高炔丙基甘胺酸(beta-homopropargylglycine、β-HPG)。
當位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基時，位於耦合臂自由端的高應力炔基可以是環辛烯基(如，反式-環辛烯(trans-cyclooctene，TCO)基)或環辛炔基(如，二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化環辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二環壬炔(bicyclononyne，BCN)以及二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)基)。另一方面，位於耦合臂自由端的四嗪基包括，但不限於：1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及1,2,4,5-四嗪基，以及其衍生物，譬如6-甲基四嗪基。
根據本揭示內容多種實施方式，所述接合單元更包含複數個第一元件。每一第一元件透過硫氫–順丁烯二醯亞胺反應而與一連接臂連接。根據本揭示內容多種視需要而實施的實施方式，第一元件是可在個體體內發揮欲求效果(如，治療效果)的效應元件；或者是，第一元件是能夠將接合單元導引至目標部位的標的元件。
在有需要的情形中，接合單元更可包含與第一元件不同的第二元件。在某些實施方式中，第二元件帶有疊氮基或炔基，使得其可和中心核或耦合臂的對應炔基或疊氮基在一價銅Cu(I)的催化下進行「銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)」反應，進而與中心核或耦合臂耦接。或者是，在某些實施方式中，第二元件帶有疊氮基或環辛炔基，使得其可和中心核或耦合臂的對應環辛炔基或疊氮基進行「應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)」反應，進而與中心核或耦合臂耦接。又或者是，於一些實施方式中，第二元件帶有四嗪基或環辛烯基，而使得其可和中心核或耦合臂的對應環辛烯基或四嗪基進行「逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)」反應，進而與中心核或耦合臂耦接。在本揭示內容可任選的實施方式中，當第一元件為一效應元件時，第二元件可以是另一種效應元件，其可和第一元件累加(additively)、協同(synergistically)或獨立(independently)作用；或者是，第二元件可以是標的元件或能改善接合單元藥動學性質(如溶解度、廓清率半衰期與生體可用率)的元件。在其他可任選的實施方式中，當第一元件為標的元件時，第二元件較佳為效應元件或能改善接合單元藥動學性質的元件。
於一些實施方式中，所述接合單元更包含一視需要而加入的第三元件，此種第三元件和第一、第二元件不同。在第二元件直接與中心核連接的情形中，所述中心核的另一端(即，未與第二元件連接的自由端)可視需要而為半胱胺酸殘基，此一殘基可用以引入非必要的第三元件。具體來說，半胱胺酸殘基的硫氫基和一PEG鏈上的順丁烯二醯亞胺基反應，而此一與中心核連接的PEG鏈在此稱為「耦合臂」；上述耦合臂的自由端帶有四嗪基或高應力炔基。如此一來，第三元件即可透過iEDDA反應而與耦合臂連接。在所述接合單元包含第二與第三元件的情形中，第一與第二元件其中至少一種較佳為一效應元件，而第三元件則可以是能改善接合單元藥動學性質的元件。分子量為20,000至50,000道耳頓(daltons)的長PEG鏈就是一種能改善接合單元藥動學性質的元件。
＜ II ＞ 含胜肽核的多臂接合物的用途
在臨床醫學領域中，根據本揭示內容第一態樣的接合單元或中心核構建體可用於治療多種疾病。因此，本揭示內容的第二種態樣是關於治療這些疾病的方法。根據本揭示內容多種實施方式，用以治療特定疾病的方法包含以下步驟：對有需要的個體投予治療有效量的接合單元或中心核構建體，所述接合單元或中心核構建體可以是根據本揭示內容上述態樣與實施方式的任一種接合單元或中心核構建體。當可理解，可將所述接合單元以藥學配方的形式施用，此種藥學配方除了包含本發明接合單元或中心核構建體外，還包含適用於所欲給藥方式的藥學上可接受的賦型劑。
為了讓本發明所屬技術領域具有通常知識者能夠理解本揭示內容的某些實施方式，下文舉例說明可用以治療某些特定疾病之接合單元或中心核構建體(以下統稱分子構建體)所含的第一與第二元件的組合。
根據本揭示內容某些實施方式，本發明分子構建體可用以治療免疫疾病，其中第一元件為對細胞介素或細胞介素的受體專一的單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)、或細胞介素的可溶性受體(soluble receptor)，而第二元件為對組織相關細胞外基質蛋白(tissue-associated extracellular matrix protein)專一的scFv。在這些情形中，第一元件是用以治療一或多種免疫疾病的效應元件，而第二元件是有助於將所述接合單元遞送至疾病部位的標的元件。
細胞介素的非限制性實施例包括：腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、介白素-17 (interleukin-17，IL-17)、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23以及B細胞活化因子(B cell activating factor，BAFF)；而細胞介素受體的非限制性實施例有對IL-6專一的受體(即，IL-6R)或對IL-17專一的受體(即，IL-17R)。至於細胞介素的可溶性受體，其實施例包括，但不限於：對TNF-α或IL-1等細胞介素專一的可溶性受體。組織相關細胞外基質蛋白的例示性實施例包括，但不限於：α-蛋白聚糖(α-aggrecan)、第I型膠原蛋白(collagen I)、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白、第V型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白以及第XI型膠原蛋白。
根據一些具體的例示性實施例，所述接合單元適用於治療牛皮癬；此時第一元件為對TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或IL-17R專一的scFv，而第二元件為對第I型膠原蛋白或第VII型膠原蛋白專一的scFv。
在某些視需要而實施的實施例中，所述接合單元適用於治療免疫疾病，如全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、皮膚狼瘡(cutaneous lupus)或乾燥綜合症(Sjogren’s syndrome)，此類接合單元包含對BAFF專一的scFv以作為第一元件，以及對第I型膠原蛋白或第VII型膠原蛋白專一的scFv以作為第二元件。
在治療類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎或關節黏連性脊椎炎時，例示性的接合單元所包含的第一元件是對TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、IL-17、IL-6R或IL-17R專一的scFv，而其所含的第二元件則是對第II型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白、第XI型膠原蛋白或α-蛋白聚糖專一的scFv。
所述接合單元亦適用於治療發炎性腸症(inflammatory bowel diseases)，譬如克羅恩氏病(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)及其他。在這些情形中，本發明接合單元使用對TNF-α專一的scFv以作為第一元件，並使用對第III型膠原蛋白或第V型膠原蛋白專一的scFv以作為第二元件。
可由本發明接合單元所治療的另一類疾病是液態腫瘤，包括，但不限於：急性淋巴細胞性白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)以及骨髓瘤(myeloma)。在這些實施方式中，第一元件可以是標的元件(譬如對第一細胞表面抗原專一的scFv)；而第二元件可以是效應元件(譬如對第二細胞表面抗原專一的scFv)。
可作為用以治療液態腫瘤的標的元件的第一細胞表面抗原包括，但不限於：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138以及CD319。另一方面，適合作為效應元件的第二細胞表面抗原的非限制性實施例包括CD3以及CD16a。
在治療B淋巴細胞衍生的淋巴瘤或白血病時，例示性的第一元件為對CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b專一的scFv，而例示性的第二元件為對CD3或CD16a專一的scFv。
欲治療漿細胞瘤或多發性骨髓瘤時，例示性的第一元件為對CD38、CD78、CD138或CD319專一的scFv，而例示性的第二元件為對CD3或CD16a專一的scFv。
關於衍生自T細胞的淋巴瘤或白血病的治療，例示性的第一元件為對CD5、CD30或CD43專一的scFv，而第二元件為對CD3或CD16a專一的scFv。
於治療骨髓性白血病時，例示性的第一元件為對CD33或CD34專一的scFv，而例示性的第二元件為對CD3或CD16a專一的scFv。
另一類可利用本發明接合單元來治療的疾病是固態腫瘤，包括，但不限於：黑色素瘤、食道癌、胃癌、腦瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、結腸癌、大腸癌、大腸結腸癌、腎癌、肝細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌以及頭頸部鱗狀細胞癌。此外，本發明接合單元亦適用於治療晚期、惡性或轉移性的固態腫瘤。
在建構用於治療固態腫瘤的接合單元時，第一元件(即，標的元件)可選自肽類激素、生長因子及對腫瘤相關抗原專一的第一scFv；而第二元件(即，效應元件)可以是對細胞表面抗原專一的第二scFv。
舉例來說，肽類激素可以是胰泌素、膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)、體抑素或促甲狀腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)。至於上述生長因子則可以是上皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、突變型EGF、表皮調節素(epiregulin)、肝素結合上皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)、血管內皮生長因子A (vascular endothelial growth factor，VEGF-A)、鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)或肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)。腫瘤相關抗原的例示性實施例包括人類上皮生長因子受體1(human epidermal growth factor receptor-1，HER1)、HER2、HER3、HER4、醣類抗原19-9 (carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9)、醣類抗原125 (CA 125)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、黏蛋白1 (mucin 1，MUC 1)、神經節苷脂GD2、黑色素瘤相關抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)、前列腺專一膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)、前列腺幹細胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)、間皮素(mesothelin)、黏蛋白關聯Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、Globo H、階段專一性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)以及上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)。細胞表面抗原可以是CD3或CD16a。
在某些例子中，腫瘤相關抗原會由個體的固態腫瘤脫落而進入其循環系統中。在這些情形中，本發明用以治療固態腫瘤的方法包含以下步驟：(a)對該個體進行血液透析程序，此程序使用對一或多種腫瘤相關抗原專一的抗體，以移除由腫瘤脫落並進入個體循環中的上述一或多種腫瘤相關抗原；以及(b)投予本發明用以治療固態腫瘤的接合單元。
另一種可由本發明接合單元來治療的代表性疾病是骨質疏鬆症。適用於治療骨質疏鬆症的例示性的接合單元是以對細胞核因子κB受體活化因子配體(ligand of receptor activator of nuclear factor κB，RANKL)專一的第一scFv作為第一元件(在本例中，為效應元件)；以及以對第I型膠原蛋白或骨結合素專一的第二scFv作為第二元件(或標的元件)。
老年性黃斑部退化症(age-related macular degeneration，AMD)是另一種可利用本發明接合單元來治療的疾病。適用於治療AMD的例示性的接合單元則是以對VEGF-A專一的一scFv作為第一元件以及以分子量為20,000至50,000道耳頓的長PEG鏈作為第二元件。在本例中，第一元件是用來治療AMD的效應元件，而第二元件則是用來提升所述接合單元的藥動學性質。
＜ III ＞ 具有標的部分及效應部分的分子構建體
在第三態樣中，本揭示內容是關於一種分子構建體，其包含二個彼此直接或間接耦接的接合單元或中心核構建體(以下統稱分子構建體)，其中一接合單元或中心核構建體的中心核可和至少一標的元件連接，而另一接合單元或中心核構建體的中心核則可和至少一效應元件連接。本發明分子構建體的優點在於上述二接合單元可透過iEDDA、SPAAC或CuAAC反應而彼此耦接。此一設計使得開發人員能夠便捷地合成具有複雜結構的分子構建體。根據本揭示內容的原理與精神，可以獨立地製備兩種接合單元或中心核構建體，其分別攜帶不同數目和/或類型的功能性元件，之後再將兩者耦接到一起。如此一來，本發明所屬技術領域具有通常知識者能夠建構多個構建體庫，其分別由攜帶不同功能性元件的分子構建體所組成，而後再視需求和/或所欲的應用，由這些構建體庫中選擇並結合兩種分子構建體(即，接合單元或中心核構建體)，以得到所需的構建體。更可藉由調整中心核內特定官能基的數目，來控制每一接合單元或中心核構建體所攜帶的功能性元件的數目。
根據本揭示內容的一實施方式，所述分子構建體包含一第一接合單元或第一中心核構建體以及一第二接合單元或第二中心核構建體。具體來說，第一接合單元包含一第一中心核、以及分別連接於第一中心核的一或多個連接臂(下文稱為第一連接臂)與視需要而加入的一耦合臂(下文稱為第一耦合臂)；第二接合單元包含一第二中心核、以及分別連接於第二中心核的一或多個連接臂(下文稱為第二連接臂)與視需要而加入的一耦合臂(下文稱為第二耦合臂)。第一與第二接合單元透過發生在以下任一種情形間的iEDDA、SPAAC或CuAAC反應而彼此耦接：第一與第二中心核之間、第一耦合臂與第二中心核之間、第一與第二耦合臂之間或第一中心核與第二耦合臂之間。第一或中心核構建體之結構如上文所述。
根據本揭示內容的實施方式，第一與第二中心核都具有複數個胺基。每一連接臂藉由和中心核的胺基形成醯胺鍵，而連接於中心核；舉例來說，可利用N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)和上述胺基反應。當連接於中心核之後，上述連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基。如此一來，第一標的元件與第一效應元件可透過硫氫–順丁烯二醯亞胺反應而分別連接於第一與第二連接臂。
根據本揭示內容某些實施方式，每一連接臂是一條具有2至20個EG重複單元的PEG鏈。此外，每一耦合臂是一條具有2至12個EG重複單元的PEG鏈。
根據本揭示內容多種實施方式，第一或第二中心核可以是化合物核或多肽核。在某些例子中，第一與第二中心核都是化合物核，且兩者可以採用相同或不同的化合物作為核心。在某些較佳的實施方式中，第一與第二中心核都是多肽核，且兩者具有相同或不同的序列。或者是，兩個核心其中一個是化合物核，而另一個是多肽核。
適合作為本發明化合物核的化合物包括但不限於：苯-1,3,5-三胺(benzene-1,3,5-triamine)、2-(胺甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺(2-(aminomethyl)-2-methylpropane-1,3-diamine)、三(2-胺乙基)胺(tris(2-aminoethyl)amine)、苯-1,2,4,5-四胺(benzene-1,2,4,5-tetraamine)、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-聯苯(3,3’,5,5’-tetraamine-1,1’-biphenyl)、四(2-胺乙基)甲烷(tetrakis(2-aminoethyl)methane)、四(乙胺)肼(tetrakis(ethylamine)hydrazine)、N,N,N’,N’,-四(胺乙基)乙二胺(N,N,N’,N’,-tetrakis(aminoethyl)ethylene-diamine)、苯-1,2,3,4,5,6-六胺(benzene-1,2,3,4,5,6-heXaa mine)、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺(1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-hexakis(methylamine)-benzene- 1,3,5-triamine)、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N, 5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺(1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-octakis (methylamine)-benzene-1,2,4,5-triamine)以及N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺(N,N-bis[(1-amino-3,3- diaminoethyl)pentyl]methanediamine)。
在中心核為化合物核的例子中，耦合臂可藉由和中心核的多個胺基其中之一形成醯胺鍵，而連接到中心核。同時，耦合臂的自由端帶有疊氮基、炔基、高應力炔基或四嗪基。
根據本揭示內容某些實施方式，可作為本發明多肽核的多肽可包含2至15個離胺酸(K)殘基。此外，每一個K殘基和次一個K殘基之間由一填充序列所隔開，所述填充序列包含甘胺酸(G)與絲胺酸(S)殘基；在非必要的實施方式中，填充序列係由2至20個胺基酸殘基所組成。於多種實施方式中，填充序列可具有任一種以下序列：GS、GGS、GSG或序列編號：1-16所示序列。在某些實施方式中，上述多肽包含2-15個單元的G1-5 SK序列；譬如(GSK)2-15 。在一實施方式中，多肽核的序列如序列編號：17、18、19、21、22、23或24所示。
或者是，所述多肽核具有(Xaa -K)n 序列，其中Xaa 為具有2至12個EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸，且n為2至15的整數。在一實施方式中，多肽核的序列如序列編號：25或26所示。
在中心核為多肽核的情形中，其N-或C-端可以是半胱胺酸殘基。在這些例子中，耦合臂透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而連接於中心核的半胱胺酸殘基。上述耦合臂的自由端帶有疊氮基、炔基、高應力炔基或四嗪基。
第一與第二接合單元可透過多種構形而彼此耦接，端視第一與第二耦合臂是否存在，下文將進一步說明這些構形。對於採用化合物核的接合單元，較佳應透過耦合臂(即，第一或第二耦合臂)而和另一接合單元耦接；而對於採用多肽核的接合單元，耦合臂則不是必要的元件。
當第一與第二接合單元分別包含耦合臂時，一耦合臂(舉例來說，第一耦合臂)的自由端帶有四嗪基，而另一耦合臂(在本例中，第二耦合臂)的自由端帶有高應力炔基，而使得二接合單元可透過發生於二耦合臂(即，第一與第二耦合臂)之間的iEDDA反應而彼此耦接。在較佳的情形中，上述四嗪基為1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及1,2,4,5-四嗪基或其衍生物，譬如6-甲基四嗪基；而高應力炔基為TCO。同樣的情形亦適用於二耦合臂的自由端分別帶有疊氮基與炔基的例子；此時，二接合單元是透過發生於二耦合臂(即，第一與第二耦合臂)之間的CuAAC反應而彼此耦接。或者是，一耦合臂帶有疊氮基，而另一耦合臂帶有高應力炔基(在較佳的情形中，帶有DBCO、DIFO、BCN或DICO基)；因此，二耦合臂可透過SPAAC反應而耦接。當兩個單元都是化合物核或多肽核時，或是當一接合單元為化合物核而另一單元為多肽核時，就可採用上述構形。
當只有一個接合單元具有耦合臂(譬如，第一接合單元帶有第一耦合臂時)時，另一接合單元的中心核(譬如第二中心核)則為多肽核。在本例中，位於第二中心核N-或C-端的第一個胺基酸殘基是帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基。在某些實施方式中，上述帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基會和第一接合單元的第一耦合臂所帶的相應炔基或疊氮基進行CuAAC反應，因而將第一與第二接合單元接合在一起。或者是，第二中心核N-或C-端的第一個胺基酸殘基帶有疊氮基，其可位於第一接合單元的耦合臂自由端上的高應力炔基(在較佳的情形中，為DBCO、DIFO、BCN或DICO基)進行SPAAC反應而相連接。此種構形可發生在兩個單元都是多肽核或者是兩者分別是化合物核和多肽核的情形中。
第一與第二接合單元也有可能不透過任何耦合臂(即，第一與第二耦合臂)而耦接。換句話說，第一與第二耦合臂彼此直接連接。此種構形主要發生在二個多肽核之間。具體來說，兩個中心核其中之一(譬如第一中心核)的N-或C-端是帶有疊氮基的胺基酸殘基，而另一個中心核(如第二中心核)的N-或C-端則是帶有炔基的基酸殘基。如此一來，第一中心核的疊氮基會和第二中心核的炔基反應，進而將第一與第二接合單元耦接在一起。
帶有疊氮基的胺基酸殘基包括，但不限於：L-疊氮高丙胺酸(AHA)、4-疊氮-L-苯丙胺酸、4-疊氮-D-苯丙胺酸、3-疊氮-L-丙胺酸、3-疊氮-D-丙胺酸、4-疊氮-L-高丙胺酸、4-疊氮-D-高丙胺酸、5-疊氮-L-烏胺酸、5-疊氮-D-烏胺酸、6-疊氮-L-離胺酸以及6-疊氮-D-離胺酸。帶有炔基的胺基酸殘基包括，但不限於：L-高炔丙基甘胺酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘胺酸(D-HPG)以及β-高炔丙基甘胺酸(β-HPG)。
根據本揭示內容某些實施方式，所述分子構建體的第一與第二接合單元其中之一更包含一額外的連接臂(下文稱為第三連接臂)，連接於第一或第二接合單元。
在某些實施方式中，上述第三連接臂可透過硫氫–順丁烯二醯亞胺反應而和一長PEG鏈(分子量為20,000至50,000道耳頓)連接。在可任選的實施方式中，上述第三連接臂用以連接單一個scFv，其可作為標的元件或效應元件。在某些例子中，第一與第二連接臂分別連接了兩種不同的效應元件，而第三連接臂則與標的元件連接；所述標的元件如對第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白、第V型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白、第XI型膠原蛋白、蛋白聚糖或骨結合素專一的scFv。在其他例子中，第一與第二連接臂分別連接了兩種不同的標的元件，而第三連接臂則與效應元件(譬如對CD3或CD16a專一的scFv)連接。
在其他實施方式中，本發明分子構建體更包含一第三接合單元。第三接合單元包含一第三中心核、一連接臂(下文稱為第三連接臂)、以及視需要而加入的一耦合臂(下文稱為第三耦合臂)。在本例中，第三接合單元透過發生在以下任一種情形的CuAAC反應、iEDDA反應或SPAAC反應而與第一或第二接合單元連接：發生在第一或第二耦合臂和第三耦合臂之間、第一或第二中心核和第三耦合臂之間、第一或第二耦合臂和第三中心核之間、或第一或第二中心核和第三中心核之間。
第三接合單元的第三連接臂在自由端可帶有順丁烯二醯亞胺基，此官能基可透過硫氫–順丁烯二醯亞胺反應而和第二效應元件或標的元件連接。
當可理解，帶有NHS官能基的標的/效應元件(譬如藥物)可以透過NHS基和K殘基之間形成醯胺鍵，而直接連接到第一、第二和/或第三中心核的K殘基，而不需使用連接臂(即，第一、第二或第三連接臂)。
根據本揭示內容多種實施方式，第一、第二以及非必要的第三中心核可以相同或不同。
＜ IV ＞ 具有標的部分及效應部分的分子構建體的用途
在臨床醫學領域中，根據本揭示內容第三態樣的分子構建體可用以治療多種疾病。因此，本揭示內容的第四種態樣是關於治療這些疾病的方法。根據本揭示內容多種實施方式，治療特定疾病的方法包含以下步驟：對有需要的個體投予治療有效量的分子構建體，所述分子構建體可以是根據本揭示內容第三態樣與其實施方式的任一種分子構建體。當可理解，可將所述分子構建體以藥學配方的形式施用，此種藥學配方除了包含本發明分子構建體之外，還包含適用於所欲給藥方式的藥學上可接受的賦型劑。
為了讓本發明所屬技術領域具有通常知識者能夠理解本揭示內容的某些實施方式，下文舉例說明可用以治療某些特定疾病之分子構建體所含的第一與第二元件的組合。
在某些實施方式中，第一元件是對細胞介素或細胞介素受體專一的scFv、或細胞介素的可溶性受體，而第二元件是對組織相關細胞外基質蛋白專一的scFv。在這些情形中，第一元件是用以治療一或多種免疫疾病的效應元件，而第二元件則是有助於將所述接合單元遞送至疾病部位的標的元件。
細胞介素的非限制性實施例包括：TNF-α、IL-17、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23與BAFF；而細胞介素受體的非限制性實施例包括對IL-6專一的受體(即，IL-6R)或對IL-17專一的受體(即，IL-17R)。至於細胞介素的可溶性受體，其實施例包括，但不限於：對TNF-α或IL-1等細胞介素專一的可溶性受體。組織相關細胞外基質蛋白的例示性實施例包括，但不限於：α-蛋白聚糖、第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白、第V型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白與第XI型膠原蛋白。
根據一些具體的例示性實施例，所述分子構建體適用於治療牛皮癬；此時第一元件為對TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或IL-17R專一的scFv，而第二元件為對第I型膠原蛋白或第VII型膠原蛋白專一的scFv。
在某些視需要而實施的實施例中，所述分子構建體適用於治療免疫疾病，如全身性紅斑狼瘡、皮膚狼瘡或乾燥綜合症，此類分子構建體包含對BAFF專一的scFv以作為第一元件，且包含對第I型膠原蛋白或第VII型膠原蛋白專一的scFv以作為第二元件。
在治療類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎或關節黏連性脊椎炎時，例示性的分子構建體所包含的第一元件是對TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、IL-17、IL-6R或IL-17R專一的scFv，而第二元件則是對第II型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白、第XI型膠原蛋白或α-蛋白聚糖專一的scFv。
所述分子構建體亦適用於治療發炎性腸症，譬如克羅恩氏病與潰瘍性結腸炎及其他。在這些情形中，本發明分子構建體使用對TNF-α專一的scFv以作為第一元件，以及使用對第III型膠原蛋白或第V型膠原蛋白專一的scFv以作為第二元件。
可由本發明分子構建體所治療的另一類疾病是液態腫瘤，包括，但不限於：急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤以及骨髓瘤。在這些實施方式中，第一元件可以是標的元件(譬如對第一細胞表面抗原專一的scFv)；而第二元件可以是效應元件(譬如對第二細胞表面抗原專一的scFv)。
可作為用以治療液態腫瘤的標的元件的第一細胞表面抗原包括，但不限於：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138以及CD319。另一方面，適合作為效應元件的第二細胞表面抗原的非限制性實施例包括CD3以及CD16a。或者是，第一與第二細胞表面抗原為分別CD79a與CD79b。適用於治療液態腫瘤的細胞毒性藥物包括，但不限於：奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素以及喜樹鹼。
在治療B淋巴細胞衍生的淋巴瘤或白血病時，例示性的第一元件為對CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b專一的scFv，而例示性的第二元件為對CD3或CD16a專一的scFv。
欲治療漿細胞瘤或多發性骨髓瘤時，例示性的第一元件為對CD38、CD78、CD138或CD319專一的scFv，而例示性的第二元件為對CD3或CD16a專一的scFv。
關於衍生自T細胞的淋巴瘤或白血病的治療，例示性的第一元件為對CD5、CD30或CD43專一的scFv，而第二元件為對CD3或CD16a專一的scFv。
於治療骨髓性白血病時，例示性的第一元件為對CD33或CD34專一的scFv，而例示性的第二元件為對CD3或CD16a專一的scFv。
另一類可利用本發明分子構建體來治療的疾病是固態腫瘤，包括，但不限於：黑色素瘤、食道癌、胃癌、腦瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、結腸癌、大腸癌、大腸結腸癌、腎癌、肝細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌以及頭頸部鱗狀細胞癌。此外，本發明分子構建體亦適用於治療晚期、惡性或轉移性的固態腫瘤。
在建構用於治療固態腫瘤的分子構建體時，第一元件(即，標的元件)可選自肽類激素、第一生長因子及對腫瘤相關抗原專一的第一scFv；而第二元件(即，效應元件)可以是細胞毒性藥物、類鐸受體(toll-like receptor，TLR)促效劑、與放射性核種複合的螯合劑、細胞介素、或對第二生長因子、細胞表面抗原、半抗原或細胞介素專一的第二scFv。
舉例來說，肽類激素是胰泌素、膽囊收縮素、體抑素或促甲狀腺素。至於上述第一生長因子則可以是EGF、突變型EGF、表皮調節素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF以及HGF。腫瘤相關抗原的例示性實施例包括：HER1、HER2、HER3、HER4、CA 19-9、CA 125、CEA、MUC 1、神經節苷脂GD2、MAGE、PSMA、PSCA、間皮素、黏蛋白關聯Tn抗原、唾液酸Tn抗原、Globo H、SSEA-4以及EpCAM。
在適用於治療液態腫瘤的分子構建體中，可使用的細胞毒性藥物包括，但不限於：奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素以及喜樹鹼。TLR促效劑的非限制性例示包括：脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)、單磷醯脂A (monophosphoryl lipid A)、莫托立莫特(motolimod)、咪喹莫特(imiquimod)、瑞西喹莫特(resiquimod)、加德喹莫特(gardiquimod)、CpG寡聚去氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG DON)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid)、β-葡聚糖(β-glucan)以及酵母聚糖(zymosan)。所述螯合劑可選自以下物質所組成的群組：1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10- tetraacetic acid，DOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，NOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4-二乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4-diacetic acid，NODA)以及二乙烯三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)；而放射性核種可以是111 In、131 I或177 Lu。適當的細胞介素可選自以下群組：IL-2、IFN-α、IFN-γ以及TNF-α。第二scFv能夠專一性地識別並結合到以下所述的第二生長因子：EGF、突變型EGF、VEGF-A、bFGF或HGF。第二scFv能夠專一性地識別並結合到以下的細胞表面抗原：CD3、CD16a、CD28、CD134、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4或CD152)、程序性細胞死亡因子1 (programmed cell death 1，PD-1或CD279)或程序性細胞死亡因子1配體1 (programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1或CD274)。第二scFv能夠專一性地識別並與結合到以下的細胞介素：IL-2、IFN-α、IFN-γ或TNF-α；在這些情形中，第二scFv是非中和性scFv。
在某些例子中，某些腫瘤相關抗原會由個體的固態腫瘤脫落而進入其循環系統中。在這些情形中，本發明用以治療固態腫瘤的方法包含以下步驟：(a)對該個體進行血液透析程序，此程序使用對一或多種腫瘤相關抗原專一的抗體，以移除由腫瘤脫落並進入個體循環中的上述一或多腫瘤相關抗原；以及(b)投予本發明用以治療固態腫瘤的分子構建體。
根據本揭示內容某些實施方式，當第二元件是對半抗原專一的第二scFv時，所述方法更包含以下步驟：對所述個體投予經相同半抗原標記的一免疫調節效應物。在一些實施方式中，上述半抗原是選自以下群組：二硝苯酚(dinitrophenol，DNP)、三硝苯酚(trinitropheno，TNP)以及序列為WADWPGPP (序列編號：20)的短胜肽；而上述免疫調節效應物為IFN-α、IL-2、TNF-α或IFN-γ、或是對PD-1、PD-L1、CTLA-4或CD3專一的IgG抗體。
另一種可由本發明分子構建體來治療的代表性疾病是骨質疏鬆症。適用於治療骨質疏鬆症的例示性的分子構建體是以對RANKL專一的第一scFv作為第一元件(在本例中，為效應元件)；以及以對第I型膠原蛋白或骨結合素專一的第二scFv作為第二元件(或標的元件)。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
為了便於說明，此處整理了說明書、實施例與附隨申請專利範圍中所用的某些詞彙。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、與C兩者、以及A、B與C三者。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。當可理解，除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一端點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
本揭示內容一般係關於多種分子構建體，其中每一分子構建體包含一標的元件(T)與一效應元件(E)，在本說明書中有時將這些分子構建體稱為「T-E分子」、「T-E藥物」或「T-E藥品」。
在此處，「標的元件(targeting element)」一詞係指分子構建體能夠直接或間接結合到一目標標的(如，一細胞表面上的受體或一組織中的蛋白質)的部分，因而能夠協助將本發明分子構建體遞送到目標標的。在某些例子中，標的元件可將所述分子構建體導引至鄰近目標細胞處。在其他情形中，標的元件可專一地結合到目標細胞表面上的分子；或標的元件可和第二分子專一地結合，而此一第二分子能夠專一地結合到目標細胞表面上的分子。在某些例子中，一旦標的元件與目標標的接合之後，標的元件可將本發明分子構建體內化，而使其移動到目標細胞的細胞質內。標的元件可以是細胞表面受體的抗體或配體；或者是可和上述抗體或配體結合的分子，因而能夠間接地將本發明分子構建體標的到目標部位(譬如所選定的細胞表面)。相較於沒有標的功能的治療藥物，利用本發明分子構建體能夠加強或有利於效應元件(治療藥劑)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一種程度或相對的比例，而不是讓效應元件在疾病部位絕對或完全的局部化。
根據本發明，「效應元件(effector element)」一詞係指一旦分子構建體到達目標部位後，所述分子構建體中能夠發揮生物活性(譬如，誘發免疫反應、發揮細胞毒性及與其相似者)或其他功能活性(譬如招募其他經半抗原標記的治療用分子)的部分。「效應」可指治療性或診斷性的效果。效應元件包含能夠和細胞和/或細胞外免疫調節因子結合的元件。上述效應元件包含如蛋白質、核酸、脂質、碳水化合物、醣蛋白、藥物部分(包含小分子藥與生物製劑)、化合物元素及同位素等物質，也包含上述物質的片段。
雖然在此處利用「第一」、「第二、「第三」等詞彙來描述多種元件、部件、區域和/或區段，這些元件(以及部件、區域和/或區段)不受上述修飾詞的限制。此外，除非上下文有明示的說明，使用這些序數並未隱含序列或順序。反之，這些詞彙僅是用來區分各元件。因此，亦可將下文所述的第一元件命名為第二元件，而不會悖離例示性實施方式所揭示的內容。
在此處，「連接(link)」、「耦接(couple)」以及「複合(conjugate)」等詞可互換使用，且都是用來指稱透過直接或間接的連接關係，將兩個元件連接在一起。
「多肽(polypeptide)」一詞在此係指具有至少兩個胺基酸殘基的聚合物。一般來說，多肽包含2到200個胺基酸殘基；在較佳的情形中，是2到50個殘基。在本說明書中所提及的胺基酸序列涵蓋了此種序列的L-、D-或β-胺基酸等形式。多肽亦包括胺基酸聚合物，其中有一或多個胺基酸殘基是與一天然胺基酸相應的人工化學類似物，當然也包括天然產生的胺基酸聚合物。此外，此一詞彙亦涵蓋以多肽鏈或其他方式連接的胺基酸，上述其他方式如經修飾的連接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫醯胺(thioamide)、磷醯胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羥基酯(hydroxylate)鍵、以及與其相似者來取代多肽鍵。
於一些實施方式中，本發明範圍亦涵蓋了其他相較於所述序列具有保守性置換的蛋白。於多種實施方式中，有一、二、三、四或五個不同的殘基經過置換。在此處，「保守性置換(conservative substitution)」一詞是指所述胺基酸置換不會明顯地改變分子活性(譬如生物或功能活性和/或專一性)。一般來說，保守性胺基酸置換是利用另一種具有相似化學性質(如電荷或疏水性)的胺基酸來取代某一胺基酸。某些保守性置換包括「類似物置換」，亦即以非標準(如罕見或合成等)胺基酸來取代標準胺基酸，而上述非標準胺基酸和被取代的原有胺基酸之間的差異極小。可由標準胺基酸經人工修飾而在不會大幅改變原有胺基酸結構的前提下，得到所述的胺基酸類似物，譬如異構物或代謝前驅物等皆屬之。
於一些實施方式中，本案的範圍亦涵蓋和任何所述序列具有至少80%序列相似度的任何序列，上述序列相似度較佳為至少85%或90%、更佳為至少95%或98%。
此處針對多肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比(Percentage (%) amino acid sequence identity)」係指候選序列的胺基酸殘基與參考多肽序列的胺基酸殘基完全相同的百分比；於進行上述比對時，可將所述的候選多肽片段與所述的特定多肽片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在計算相似度時，保守性置換的胺基酸殘基視為不同的殘基。相關領域已有多種方法可用以進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二多肽序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp來進行。候選多肽序列A相較於參考多肽序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為多肽序列A與多肽序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下：% 其中X是利用BLAST序列並排程式對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。
「聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)」一詞在此係指帶有一個胺基(amino group)與一個羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈。一般來說，聚乙二醇化胺基酸的結構式為NH2 -(CH2 CH2 O)n -COOH。在本揭示內容中，n值介於1到20之間；較佳是介於2至12。
在此處一多肽的「端」係指位於該多肽N-或C-端點的胺基酸殘基。在描述一聚合物(譬如此處所述的聚乙二醇)的組成單元時，「端」則是指在聚合物骨架末端的部分。在本說明書與申請專利範圍中，「自由端」一詞是用來指稱並未與另一個分子形成化學鍵結的末端胺基酸殘基或構成單元。
「抗原(antigen或Ag)」一詞係指能夠導致免疫反應的分子。此種免疫反應可能涉及分泌性(secretory)、荷爾蒙性(humoral)和/或細胞級(cellular)的抗原專一反應。在本揭示內容中，「抗原」一詞係指蛋白質、多肽(包括其突變株或具有生物活性的片段)、多醣、醣蛋白、醣脂質、核酸或上述之組合。
在本說明書與申請專利範圍中，「抗體(antibody)」一詞應以廣義方式解釋，且包含完整組裝的抗體、可和抗原結合的抗體片段，譬如抗原結合片段(Fab/Fab’)、F(ab’)2 片段(具有彼此以雙硫鍵連接的兩個Fab部分)、可變片段(variable fragment，Fv)、單鏈可變片段(scFv)、雙單一性單鏈可變片段(bi-scFv)、奈米抗體(nanobodies)、單抗體(unibodies)以及雙體抗體(diabodies)。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，較佳為包括完整抗體的抗原結合區域或可變區域。在典型的例子中，「抗體」係指實質上由免疫球蛋白基因或其片段所編碼的一或多種多肽所組成的蛋白質。習知的免疫球蛋白基因包括κ (kappa)、λ (lambda)、α (alpha)、γ (gamma)、δ (gamma)、ε (epsilon)與μ (mu)等恆定區基因(constant region gene)、以及無數的免疫球蛋白可變區基因(variable region genes)。輕鏈通常歸類為κ (kappa)或λ (lambda)。重鏈通常歸類為γ (gamma)、μ (mu)、α (alpha)、δ (gamma)或ε (epsilon)，基於這些結構，定義出了以下類型的免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白抗體結構是一種四聚物(tetramer)。每一個四聚物是由兩條相同的多肽鏈所組成，且每一對分別有一「輕」鏈(約25 kDa)與一「重」鏈(約50-70 kDa)。每一鏈的N-端界定了一個可變區域，包含約100至110個或更多的胺基酸，其主要負責抗原辨識。可變輕鏈(variable light chain，VL )與可變重鏈(variable heavu chain，VH )等詞就是分別指上述的輕鏈與重鏈。根據本揭示內容的實施方式，可藉由改變天然抗體或利用重組DNA方式重新合成上述抗體片段。於本揭示內容一些實施方式中，上述抗體和/或抗體片段可具有雙專一性，且可有多種不同的構形。舉例來說，雙專一性抗體可包含二個不同的抗原結合部位(可變區域)。於多種實施方式中，可利用融合瘤技術或重組DNA技術來製備雙專一性抗體。於一些實施方式中，雙專一性抗體對至少兩種不同的表位(epitope)有結合專一性。
「專一地結合(specifically bind)」一詞在此處係指抗體或其抗原結合片段能夠和抗原結合的能力，上述結合的解離常數(dissociation constant，Kd)小於約1×10− 6 M、1×10− 7 M、1×10− 8 M、1×10− 9 M、1×10− 10 M、1×10− 11 M或1×10− 12 M；或者是或額外地，相較於其對於非專一性抗原的結合親和力，上述抗體或其抗原結合片段與抗原結合的親和力為兩倍以上。
「免疫疾病(immune disorder)」一詞在此處是指涉及體液免疫(humoral immunity)缺失、細胞介導免疫(cell-mediated immunity)缺失、綜合免疫缺失(combined immunity deficiency)、不明免疫缺失(unspecified immunity deficiency)以及自體免疫疾病的相關疾病。
「腫瘤(tumor)」一詞在此係指所有腫瘤性的細胞生長(neoplastic cell growth)與增殖(proliferation)，不論是惡性還是良性的，也涵蓋所有癌前期(pre-cancerous)與癌細胞與組織。在本說明書與申請專利範圍中，「腫瘤」一詞涵蓋包含固態腫瘤與液態腫瘤。
「固態腫瘤(solid tumor)」一詞是通常不含囊腫或液體區域的不正常組織團塊。各種類型的固態腫瘤通常是以形成腫瘤的細胞來命名。固態腫瘤的例子包括，但不限於：肉瘤(sarcomas)與癌(carcinomas)。一般來說，「肉瘤」是源自於結締組織或支持組織(如骨頭或肌肉)的腫瘤。「癌」則是源自於腺體細胞與位於身體組織邊襯的上皮細胞的腫瘤。
「液態腫瘤(diffused tumor)」一詞在此係指白血病和/或血液方面的疾病，此類疾病通常源自造血細胞(hematopoietic cells)以及受到影響的血液、骨髓或淋巴結。液態腫瘤的例子包括，但不限於：急性淋巴細胞性白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)以及骨髓瘤(myeloma)。
「腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，TAA)」一詞係指任何相關領域已知的抗原，且包括在癌細胞表面上發現的抗原，也包括從癌細胞表面脫落而變成可溶性的抗原(即，可溶性癌抗原)。許多位在腫瘤或正常細胞上的細胞表面抗原也有可溶性的對應物。此種抗原包括，但不限於：在癌相關纖維母細胞(cancer-associated fibroblast，CAF)、腫瘤內皮細胞(tumor endothelial cell，TEC)以及腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAM)上發現的抗原。
「治療(treatment)」一詞係指預防性(如，預防用藥)、療癒性或緩和性的處置，藉以達到所欲的藥學和/或生理學效果；而治療的行為在此包括上述預防性、療癒性或緩和性的處置。具體來說，治療在此係指對於可能患有一醫療疾患、症狀、疾病或與疾患相關的異常、或易於罹患一疾患的個體施用或投予本發明分子構建體或包含此分子構建體的藥學組合物，，以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵，或是延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對尚未表出現疾病、異常和/或病症徵兆的個體和/或出現早期徵兆的個體進行治療，以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關的病理變化的風險。
在此處，「有效量(effective amount)」一詞係指本發明分子構建體的用量足以招致所欲的治療反應。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病症，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病症的發生，或是可緩減與疾病或病症相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體體重、年齡或性別)、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成活性成分的總重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成活性成分重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重多少毫克(mg/kg)。
所述「施用(application)」與「投予(administration)」等詞在此可交替使用，其係指將本發明之分子構建體或藥學組合物提供給需要治療的個體。
「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞在此可交互使用，且是指可接受本揭示內容之分子構建體、藥學組合物和/或方法處置的動物(包含人類)。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。「個體」或「患者」包含任何可因本揭示內容的處置而獲益的哺乳類動物。所述「個體」或「患者」的例示包含，但不限於：人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。所述哺乳類動物涵蓋哺乳動物綱的所有成員，包括人類、靈長類動物、家畜和農畜(如兔子、豬、綿羊和牛)、動物園動物或競賽用動物、寵物，以及齧齒類動物(如，小鼠和大鼠)。「非人類哺乳動物」一詞則涵蓋除了人類以外的所有哺乳動物綱成員。
本揭示內容至少部分是基於建構出了T–E藥物，此種T-E藥物可被遞送至目標細胞、目標組織或器官，且其在這些部位的比例相對高於在血液循環、淋巴系統以及其他細胞、組織和器官中的比例。當實現上述情境時，即可提升T-E藥物的療效，且其副作用與毒性的數目和嚴重性都會降低。相較於不含標的元件的藥物，以T-E分子的形式來投遞藥物時，發揮療效的效應物所用的濃度可能較低。因此，可在較低的劑量下施用治療用的效應物而不會減損其有效性，但卻能同時降低其副作用與毒性。
可因較佳藥物標的而獲益的疾病
若是可將藥物標的到疾病部位，亦即若是可使藥物在疾病部位(相對於在正常組織或器官)局部化或有較優勢的濃度，就能夠改善用以治療許多疾病的藥物，使其具備較佳的療效與安全性。下文提出一些主要的例示性疾病，若是能使得這些疾病所用藥物在疾病部位或細胞有較佳的分布比例，就可以改善這些藥物。
I 免疫疾病
可利用本發明方法而以本揭示內容之分子構建體來治療的疾病、病症和/或異常可以是免疫疾病；例如，自體免疫疾病；所述的自體免疫疾病包括，但不限於：牛皮癬、全身性紅斑狼瘡、皮膚狼瘡、乾燥綜合症、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎關節黏連性脊椎炎以及發炎性腸症。
大多數的自體免疫疾病(如類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡，乾燥綜合症、牛皮癬、克羅恩氏病、發炎性腸症及其他)都會影響結締組織。自體免疫疾病有多種致病機制，譬如可能是由環境、遺傳、表觀遺傳(epigenetic)等因素或其組合所造成，但不論其致病本質為何，受影響的組織都會因為長時間的發炎過程而受到損傷。本發明合理推論，可利用細胞外基質作為標的抗原，將抗發炎治療劑(如抗TNF-α、抗IL-17、抗BAFF、抗IL-6、抗IL-12/IL-23等)帶到發病的結締組織所在處。適當的標的抗原可包括許多種類的膠原蛋白、層連結蛋白(laminins)、彈性蛋白(elastins)、小纖維蛋白(fibrillins)、纖網蛋白(fibronectins)以及生腱蛋白(tenascins)。結締組織填充於人體幾乎所有部分。然而，由於在不同位置對於結構組織的結構性與功能性要求不同，這些細胞外基質成分的種類也不一樣，因此這些細胞外基質成分具有極佳的組織標的專一性。
相較於選用細胞表面抗原來作為抗發炎治療劑的標的對象，選用細胞外基質成分的優點在於在多樣的基質蛋白間類型提供了不同的選擇性，而且細胞外基質蛋白的含量非常豐富。更有甚者，由於並未使用細胞作為抗原標的，也可避免抗發炎治療劑直接與細胞結合可能帶來的危害。
I-(i) 類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎或關節黏連性脊椎炎
已有多種抗TNF-α抗體(譬如英夫利昔單抗(infliximab)與阿達木單抗)以及TNF-α受體和IgG.Fc融合蛋白(如依那西普(etanercept))經核准可用於類風濕性關節炎、關節黏連性脊椎炎以及其他自體免疫疾病的人體臨床試驗。介白素-1(IL-1)受體的細胞外部分—阿那白滯素(anakinra)—則經核准可用以治療類風濕性關節炎。針對IL-12以及IL-23共有的p40蛋白的抗體，譬如優特克單抗(ustekinumab)以及貝伐珠單抗(briakinumab)，則經核准可用以治療牛皮癬性關節炎或用於類風濕性關節炎的臨床試驗。抗IL-6受體的抗體(托珠單抗(tocilizumab))經核准可用於類風濕性關節炎與全身幼年性自發關節炎(systemic juvenile idiopathic arthritis)；而多種抗IL-6抗體，譬如沙里魯單抗(sarilumab)與奧洛珠單抗(olokizumab)，則正在進行治療類風濕性關節炎的臨床試驗。對IL-17專一的抗體—蘇金單抗(secukinumab)—經核准可用以治療牛皮癬，且也已用於類風濕性關節炎與關節黏連性脊椎炎的臨床試驗。
雖然上述治療藥劑比起先前所用的藥劑更能夠減緩較為嚴重的症狀，但卻會在接受治療的患者體內引發一系列的副作用。舉例來說，英夫利昔單抗會導致嚴重的血液疾病(如白血球減少症(leukopenia)以及血小板減少症(thrombocytopenia))、嚴重的感染、淋巴瘤與其他固態腫瘤、B型肝炎病毒再活化與結核病、以及其他嚴重的問題。阿那白滯素經常會造成感染，且會對腸胃道、呼吸道與造血器官造成嚴重的副作用。降低這些廣泛使用的治療藥劑的嚴重副作用，且同時保持甚至提升其療效，是非常重要的議題。
類風濕性關節炎患者的膝蓋、手指、腳趾關節與其他關節會受到影響，而關節黏連性脊椎炎患者的脊椎關節與骨盆的薦髂關節(sacroiliac joint)會受到影響。在發病的關節處，骨頭的表面還有襯接骨頭表面的關節軟骨會遭受關節中的發炎性免疫成分攻擊。關節中的關節軟骨是含有細胞外基質的平滑軟骨。軟骨沒有血管，水分佔了約60%的重量，而其他成分則是由膠原蛋白與α-蛋白聚糖(一種蛋白多醣)以及其他基質分子所組成。第II型膠原蛋白形成了軟骨中的主要纖維。蛋白聚糖是軟骨中含量第二高的成分。第XI型膠原蛋白可結合到第II型膠原蛋白原纖維(fibril)表面，以利形成原纖維網絡，且第IX型膠原蛋白與第II型膠原蛋白和第XI型膠原蛋白相關聯。軟骨有較大的表面積，而α-蛋白聚糖的結構與形狀則和羽毛相近。除了軟骨形成之外，關節處還有負責連接相鄰骨骼的韌帶，如十字韌帶以及連接肌肉和骨骼的肌腱。韌帶和肌腱是由第I、II與III型膠原蛋白還有彈性蛋白與小纖維蛋白1、2組成的纖維網絡所形成。
本發明合理推論可利用對第II型膠原蛋白、α-蛋白聚糖、第XI型膠原蛋白或第IX型膠原蛋白專一的抗體片段(如scFv)、或者是對第I型膠原蛋白彈性蛋白或小纖維蛋白1專一的抗體片段(如scFv)作為標的成分，以將TNF-α、IL-1以及IL-12/IL-23的拮抗劑遞送到疾病部位。較佳的抗第II型膠原蛋白抗體可結合至關節中的原生第II型膠原蛋白，但不會和在原纖維組裝過程中會被切除的N-端與C-端原胜肽(propeptide)結合。較佳的抗蛋白聚糖抗體可結合至整個原生的α-蛋白聚糖分子，而不會和其被切除並進入血液循環中的片段結合。藉由採用本發明分子構建體，以抗第II型膠原蛋白的scFv作為標的成分，相較於傳統的抗TNF-α、抗IL-1與抗IL12/IL-23的IgG，本發明治療劑在疾病部位的比例應該較高，而在不相關的正常組織(特別是淋巴器官)的比例則較低，故因此副作用較少。
I-(ii) 牛皮癬
大多數的牛皮癬或斑塊狀牛皮癬患者主要會在皮膚出現發炎症狀，而不會出現在其他組織與器官。牛皮癬患者最主要的症狀是皮膚某些部分的細胞出現角質化的現象。全身性地投予抗TNF-α、抗IL-12/IL-23與抗IL-17或抗IL-17受體(抗IL-17R)的單株抗體或其他抗發炎藥劑(如抗IL-6)，會導致上文所討論的多種副作用。已有許多文獻記錄了這些免疫調解抗體的嚴重副作用。
許多膜蛋白或細胞外蛋白(如絲聚合蛋白(filaggrin)、第I型膠原蛋白)在皮膚組織的表現量遠高於在其他組織的表現量，因此想要將治療劑運送到皮膚部位時，可以考慮用這些蛋白作為標的蛋白。絲聚合蛋白存在於細胞間的緊密接合處，而當抗體進到罹病組織內時，就可以接觸到這些蛋白。雖然第I型膠原蛋白也存在於骨基質以及許多身體部位中，其在皮膚真皮層中的含量極高。
患病的角質細胞所造成的發炎反應會導致牛皮癬的症狀，想要緩減此類發炎反應，不一定要讓抗發炎抗體藥物和角質細胞接觸。角質細胞位於皮膚最外層的表皮層中；血管、汗腺以及膠原纖維位於皮膚中層的真皮層中，而最裡層的下皮層主要是脂肪組織。上述三層構成了厚度約2至3釐米的人類皮膚。若利用對第I型膠原蛋白專一的scFv將抗發炎抗體運送到真皮層，抗體就可以擴散至其他層中。或者是，抗體可以將發炎性細胞介素困在上述三種皮膚層中。
亦可利用存在於真皮-上皮接面的某些蛋白作為標的，以將治療劑攜帶至皮膚。這些蛋白包括第VII型膠原蛋白、第XVII型膠原蛋白以及層連結蛋白第5、6或10型。真皮-上皮接面是將皮膚的表皮層與真皮層接合的組織區域。表皮基底層中的基底細胞透過半胞小體(hemidesmosomes)的絲狀纖維固定到基底膜。真皮的乳突層細胞藉由錨原纖維連接至基底膜，錨原纖維是由第VII型膠原蛋白所組成。第XVII型膠原蛋白是表現在角質細胞上的跨膜蛋白(亦稱為BP180)，屬於半胞小體的結構成分，半胞小體是位於真皮-上皮基底膜區域的多蛋白複合物，其可介導角質細胞與下方膜的連接。層連結蛋白存在於是基底膜中，屬於結構性的非膠原蛋白醣蛋白。在多種層連結蛋白中，第5、6與10型對位於分層上皮下方的基底層有專一性。
I-(iii) 全身性紅斑狼瘡、皮膚狼瘡或乾燥綜合症
全身性紅斑狼瘡(SLE)是一種自體免疫疾病，涉及多種自體抗原，譬如核酸、組織蛋白以及其他核蛋白。乾燥綜合症也是自體免疫疾病，患者的免疫系統攻擊外分泌腺(特別是用以產生唾液與淚液的唾腺與淚腺)造成眼睛乾燥或口乾等症狀，進而導致感染與多種其他問題。這些疾病好發於女性，特別是處於生育年齡(即，15至30歲)的女性；一般來說女性的發生率比男性高出九倍。SLE是全身性的免疫結締組織疾病，且會影響許多器官與組織。一般來說，這些組織與器官(如心臟、肺、膀胱與腎臟)具有彈性且可擴張與收縮，也都含有膠原蛋白網絡。在多種類型的SLE中，皮膚都會出現明顯的發炎症狀。
在對BAFF專一的人類單株抗體--貝利木單抗(belimumab)核准問世前，有長達50年以上的期間，都沒有任一種單一的製劑能夠治療SLE。然而，貝利木單抗對SLE的療效非常有限。此外，貝利木單抗會導致一系列副作用，包括嚴重感染的感染率較高，且治療組的死亡率也高於安慰劑組。值得注意的是，在以貝利木單抗治療乾燥綜合症的第二期臨床試驗中，其療效優於對SLE的療效。
除了BAFF之外，研究人員也一直在尋找其他的SLE治療劑。雖然目前還無法在SLE的病理過程中找出任一種主要的發炎性細胞介素，但已有許多研究觀察到，受到干擾素刺激而引發的一系列下游事件中，涉及一群基因的表現，又稱為第一型干擾素標誌(type 1 interferon signature)。已知SLE的致病機轉和類鐸受體(toll-like receptor) 7與9 (TLR7與TLR9)有關，上述TLR會誘導一群基因的標表現，這些基因與受到IFN-α活化的基因相近。
SLE的臨床試驗中使用了幾種對IFN-α專一的單株抗體，包括隆利珠單抗(rontalizumab)、西法木單抗(sifalimumab)以及阿利弗魯單抗(anifrolumab)。由於IFN-α涉及到多種生理功能，全身性地投予抗IFN-α抗體而沒有將其標的到疾病部位可能會導致嚴重的副作用。
I-(iv) 發炎性腸症
抗TNF-α抗體(如阿達木單抗)亦經許可用於治療克羅恩氏病與潰瘍性結腸炎(發炎性腸症的一種形式)。然而，如上文所述，施用抗TNF-α抗體會導致多種副作用，包括嚴重的感染性疾病以及B細胞淋巴瘤。因此，在以抗TNF-α抗體治療罹患克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎的患者時，較理想的狀況應該是讓所投予的抗TNF-α抗體主要分布在小腸與結腸處。已知第III型與第V型膠原蛋白在小腸與大腸的結締組織中含量非常豐富。
II 腫瘤
目前已針對不同臨床階段的惡性腫瘤(包括液態與固態腫瘤以及原發或轉移性腫瘤)開發出多種不同類型的治療劑，其中有些已用於動物模型實驗，另外有些則正在進行人體臨床試驗；還有一些已經取得政府主管機關的核准而可用於治療患者。上述治療劑包括(1)多種化合物，這些化合物主要針對重要的細胞調控路徑或結構元件，或可破壞DNA或重要的細胞機器(cellular machinery)；(2)對某些類型的細胞的表面抗原專一的抗體或對某些腫瘤相關抗原專一的抗體，且上述抗體可介導標的細胞的細胞凋亡、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體介導的細胞溶解(CMC)；(3)對某些腫瘤相關抗原專一的抗體，其可和強力細胞毒性藥物複合；(4)免疫調節性細胞介素，如干擾素-α (interferon-α，IFN-α)、介白素-2 (IL-2)或IFN-γ，其能夠活化免疫系統以對抗惡性細胞；(5)標的至B、T淋巴細胞某些細胞表面標記的抗體，譬如抗CD20抗體—立妥昔單抗(rituximab)；(6)標的至生長因子受體的抗體，譬如抗HER2/Neu抗體—曲妥珠單抗以及抗EGFR抗體—西妥昔單抗(cetuximab)；(7)標的至血管內皮生長因子-A (VEGF-A)以抑制血管新生的抗體，譬如貝伐單抗(bevacizumab)；以及(8)結合至免疫檢查點(immune checkpoint)的抗體，譬如抗PD-1 (CD279)抗體—如尼伏魯單抗(nivolumab)、抗PD-L1 (CD274)抗體—如MPDL3280A、抗CTLA4 (CD152)抗體—如伊匹木單抗(ipilimumab)，這類抗體可抑制免疫反應的負向反饋，且能夠讓進行中的免疫反應保持持續活化的狀態。
用來治療癌症以及多種其他疾病的治療劑的療效常常受限於治療劑本身的毒性，因為這些藥劑也可能在正常細胞上發會某種程度的效果。因此，許多治療劑的治療窗口(therapeutic windows)非常有限，而為了要控制藥物的毒性，許多患者僅能接受次優劑量(suboptimal doses)的治療；就藥物療效的角度而言，這種次優劑量無法達到令人滿意的治療效果。
目前本領域正積極研究以抗體藥物複合體的方式來治療這些疾病，採用此種方式時，利用標的抗體來辨識表現腫瘤相關抗原的細胞，且需使標的抗體連同其所攜帶的細胞毒性藥物一起內化進入上述細胞內。此一條件使得抗體藥物複合體的應用受到了限制，因為一個腫瘤內的各個細胞所表現的腫瘤相關抗原密度可能不同；而在治療過程中，目前的抗體藥物複合體可能無法毒殺表現量較低的細胞，而一旦治療停止後，這些細胞就會再次生長。
II-(i) 液態腫瘤
II-(i)-A 以源自於白血球的癌細胞為標的
在所有類型的癌症中，有相當高比例是因淋巴樣與骨髓樣細胞系的細胞發生惡性轉化所衍生的癌症。一般來說，此類腫瘤是擴散性的，而不是固態腫瘤。因此，要標的由白血球衍生的腫瘤時，需要針對個別的腫瘤細胞進行標的。因此，對於由白血球衍生的腫瘤，關鍵之一在於找出腫瘤細胞上表現的細胞表面抗原。
一般可將衍生自白血球細胞(白血球)的腫瘤分成三類：(1)發生在血液與骨髓中的白血病、(2)發生在淋巴系統中的淋巴瘤、以及(3)發生在骨髓許多部分中以及血液中的骨髓瘤。
白血病又有四大類：(1)急性淋巴細胞性白血病(ALL)、(2)慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、(3)急性骨髓性白血病(AML)、以及(4)慢性骨髓性白血病(CML)。然而，隨著檢驗與分析法的進步，又出現的新的白血病類型，譬如目前已知有B細胞CLL、T細胞CLL、B細胞前淋巴細胞性白血病(prolymphocytic leukemia)、多毛細胞白血病(Hairy cell leukemia)以及其他類型。
淋巴瘤則可分為兩類：(1)霍奇金氏淋巴瘤以及(2)非霍奇金氏淋巴瘤。罹患淋巴瘤的患者約有12%是霍奇金氏淋巴瘤患者，而其他則屬於非霍奇金氏淋巴瘤患者。非霍奇金氏淋巴瘤大多是衍生自B細胞，且因此有許多B細胞非霍奇金氏淋巴瘤亞型。其他的非霍奇金氏淋巴瘤則是T細胞淋巴瘤。
骨髓瘤是衍生自可產生抗體的漿細胞，故亦稱為漿細胞瘤。骨髓瘤細胞可見於骨髓中，也可能進入血液循環並在骨頭的許多部分中開始生長，所以骨髓瘤亦稱為多發性骨髓瘤。
雖然白血病、淋巴瘤以及骨髓瘤是衍生自骨髓樣細胞、淋巴樣細胞以及漿細胞，腫瘤類型的診斷卻非常複雜，通常要檢視組織與細胞，並對採樣的腫瘤細胞進行組織學、免疫組織學、型態學以及細胞標記等分析。由於骨髓樣細胞系以及淋巴樣細胞系屬於多能幹細胞，前者可分化成顆粒細胞(如嗜中性白血球(neutrophils)、嗜酸性白血球(eosinophils)和嗜鹼性白血球(basophils))、單核球(monocytes)與巨噬細胞(macrophages)、以及血小板；而後者則可分化為B細胞與T細胞；這些細胞會經過許多分化與成熟步驟，而在任一個分化過程中都可能發生惡性轉化。此外，癌性轉化可能會助長或新增某些性狀，也可能減輕或失去某些性狀。
在先天性與後天性免疫的研究中，要辨別多種白血球細胞與免疫細胞時，常常會運用或必須用到各種表面標記或分化抗原，特別是被指派了分化叢集(cluster of differentiation，CD)編號的標記或抗原。在多數情形中，會使用一組標記來辨識一特定的細胞類型。
在運用抗體來治療源於白血球細胞的癌症時，需要辨識欲標的之腫瘤的表面標記。然而，即便是在經診斷罹患同一類腫瘤的患者間，表面標記的密度也可能有極大的差異。
II-(i)-B 衍生自 B 細胞的淋巴性白血病與淋巴瘤上的表面標記
ALL和CLL都不是固態腫瘤。ALL是衍生自淋巴母細胞、前驅B細胞、前驅T細胞或B細胞。ALL是由以下免疫表型亞型所組成：(1)前驅B細胞急性淋巴母細胞性白血病與前驅T細胞急性淋巴母細胞性白血病，前者會表現與B細胞前驅細胞相關的細胞表面標記，而後者則會表現前驅T細胞的標記；(2)伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)，此種淋巴瘤是衍生自生發中心(germinal center)的B細胞，且會表現與B細胞相關的細胞表面標記；以及(3)急性雙表型白血病(acute biphenotypic lymphoma)，此種白血病會表現淋巴樣以及骨髓樣細胞兩者的標記。
CLL亦稱為B細胞CLL (B-CLL)，因為CLL大多衍生自B細胞。因此，ALL和CLL間在細胞起源上的主要差異為ALL是衍生自淋巴母細胞(淋巴母細胞是B細胞與T細胞間的共同前驅細胞)，而CLL則是衍生自B細胞。一患者體內所有的CLL都是源自於可表現特定VH 與VL 的單一個B細胞。CLL細胞可表現CD19與CD20，且特別是CD5與CD23。
霍奇金氏淋巴瘤的特徵之一是里德-史登堡氏細胞(Reed-Sternberg cells)，此類細胞是衍生自B細胞的多核巨型細胞。基於里德-史登堡氏細胞的型態以及淋巴結生物檢體樣本中反應性細胞浸潤的組成，可將霍奇金氏淋巴瘤分成以下四種亞型：(1)結節硬化型(nodular sclerosing)、(2)混合細胞型(mixed-cellularity)、(3)淋巴細胞優勢型(lymphocyte-rich or lymphocytic predominance)以及(4)淋巴細胞削減型(lymphocyte depleted)。已知霍奇金氏淋巴瘤是衍生自成熟B細胞。隨著免疫表型的不同，霍奇金氏淋巴瘤細胞可表現以下一或多種分化叢集標記：CD15、CD20、CD30、CD79a與CD138。非霍奇金氏淋巴瘤絕大多數是衍生自B細胞。已知有至少14種B-細胞非霍奇金氏淋巴瘤亞型。
B淋巴細胞是抗原-專一抗體的來源，也是後天免疫系統抵抗感染性病原的關鍵之一。然而，B細胞也可能導致多種疾病。B細胞產生不需要的免疫球蛋白會造成自體免疫與過敏性疾病；而當B細胞的增殖失控時則會導致淋巴瘤或白血病。已證實可利用B細胞作為標的，來治療多種自體免疫疾病以及B-細胞系相關的癌症。許多研究採用削減B-細胞的策略來治療B細胞疾病和抗體誘發的疾病，其中有些已取得初步成果或正在積極進行相關試驗。舉例來說，有些治療性抗體可標的到人類B-細胞表面抗原，如CD19、CD20、CD22、CD37、CD79a/CD79b和對同型專一的Ig受體(isotype-specific Ig receptor)。這類抗體中有一些能夠造成B細胞溶解，另外還有一些抗體和細胞毒性藥物複合後會導致B細胞溶解。
多發性骨髓瘤亦稱為漿細胞骨髓瘤，是排在非霍奇金氏淋巴瘤後第二常見的血液疾病，其發生率佔所有癌症的1%，死亡率則佔所有癌症的2%。多發性骨髓瘤會產生大量的骨髓瘤蛋白並佔據骨髓而導致一連串的症狀，包括骨頭疼痛、貧血、腎衰竭、感染以及神經方面的問題。多發性骨髓瘤是衍生自惡性轉化的漿細胞，而漿細胞又是從B淋巴細胞分化而來。然而，多發性骨髓瘤細胞卻不會表現最常見的B細胞標記，如CD19、CD20與CD22等。
目前已有一些實驗性或已核准的療法與藥物可用以治療多發性骨髓瘤；包括皮質類固醇、化療、蛋白酶體抑制劑與免疫調節化合物等。
II-(i)-C 以獨特 B 細胞抗原 Igα 、 Igβ 與 migis-δ 作為抗體標的
成組的Igα (CD79a)/Igβ (CD79b)表現在B-細胞系的細胞表面上，以形成B細胞受體(B cell receptor，BCR)複合體。Igα/Igβ是一種異二聚體穿膜蛋白，它是由兩條不同的Igα與Igβ鏈所組成，兩者間以雙硫鍵形成穩定的結構。Igα/Igβ會和BCR形成複合體，而當BCR複合體識別抗原之後，就會產生訊號。在B細胞成熟的發展過程中，在前-B細胞期中就會表現Igα/Igβ，這個時間點比和B-細胞系上表現型態相關的CD20的表現來得早。由於Igα/Igβ是在B細胞上表現，且也會在大多數非霍奇金氏淋巴瘤上表現，本領域已將Igα/Igβ視為使用B細胞削減療法來治療非霍奇金氏淋巴瘤的理想標的。
mIgD與mIgM會共同表現在成熟B細胞的表面上並可作為BCR的一部分。mIgD帶有獨特的migis-δ胜肽區段(27個胺基酸)，這是mIgD膜錨定區段的細胞外部分，且位於CH3區域和穿膜區段之間。某些研究指出migis-δ多肽提供了一種抗原部位，可用以標的表現mIgD的B細胞。此部位僅見於表現mIgD的B細胞，而不會出現在分泌的IgD上。
II-(i)-D T 細胞腫瘤
各種類型的T淋巴細胞藉由其表面分子與分泌因子而介導非常複雜的免疫調節活動，這些免疫調節活動所構成的網絡影響了諸多荷爾蒙性與細胞級免疫功能，包括製造不同類型的抗體、分泌多種細胞介素以及產生細胞毒性T細胞與其他細胞溶解性細胞。許多自體免疫疾病的根源來自T細胞針對自身成分或細胞的異常反應。以第I型糖尿病為例，自體免疫T細胞會攻擊胰臟蘭氏小島中負責產生胰島素的β細胞並導致細胞死亡。破壞性較強的自體免疫疾病主要是由T細胞所造成的，上述疾病如全身性紅斑狼瘡、多發性硬化與發炎性腸症。另外，對於器官或組織移植的排斥反應主要也是由T細胞所造成。
另外還有一些T細胞相關的疾患形式。因此，也有些研究著重於透過調節T細胞活性或移除T細胞來研發藥物。目前在動物模型或人類臨床試驗中，已運用多種針對T細胞表面抗原(包括CD3、CD4、CD8、CD25與CD28)的抗體及其修飾物來治療多種上述人類疾病。有些抗體單獨或和細胞毒性藥物複合後可造成特定類型的目標T細胞溶解。另外則有些抗體可導致T細胞進入閒置、不活動的狀態，而不會溶解細胞。
T淋巴細胞對於調控先天性與後天性免疫反應中多種免疫細胞與多種其他細胞類型非常重要。在針對目標淋巴細胞開發治療藥劑時，以T細胞為標的而成功開發出來的藥劑少於以B細胞為標的的藥物。然而，已研發出越來越多以不同T細胞表面抗原為標的之治療性抗體。可利用針對T細胞表面抗原進行標的之抗體來治療衍生自T細胞的惡性腫瘤。也可以利用抗體來抑制或促進T細胞活性來進行調控。
II-(i)-E 骨髓性白血病
急性骨髓性白血病(AML)是衍生自骨髓樣幹細胞骨髓性母細胞，此類細胞是成熟顆粒細胞以及單核細胞的前驅細胞。有許多AML亞型都是突變劑所造成的，這些突變劑會導致某些基因區段的轉位或缺失。衍生自不同分化階段的AML細胞會表現一或多種下列表面標記：CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD36、CD41、CD61、CD64、CD65與CD11c。衍生自早期前驅骨髓樣階段的AML細胞會表現CD34與CD33，這兩種標記分別是多能幹細胞的表面標記以及未成熟骨髓樣細胞的標記。衍生自多種骨髓樣分化階段的AML細胞會表現CD15，這是成熟母髓樣細胞的標記。CML是純系骨髓幹細胞(clonal bone marrow stem cell)疾病，這是由幹細胞或骨髓樣幹細胞的惡性轉化所造成的，此類惡性轉化通常和染色體易位(又稱為費城染色體易位)有關。
II-(ii) 固態腫瘤
II-(ii)-A 固態腫瘤與腫瘤相關抗原
相較於正常細胞，不同類型的腫瘤細胞在其細胞表面會大量表現某些抗原。這些抗原稱為腫瘤相關抗原。舉例來說，胰臟癌患者和多種消化道癌症(包括大腸結腸癌、食道癌與肝細胞癌)患者的血清樣本中含有CA19-9抗原(醣類抗原19-9，又稱Sialyl LewisA 抗原)。此類腫瘤細胞會在細胞表面上的細胞外基質表現CA19-9。相似地，卵巢癌、子宮內膜癌、輸卵管癌與其他癌症患者的血清樣本中會有高量的CA125 (醣類抗原125，又稱黏蛋白16)，而這些腫瘤細胞會表現CA125。與細胞表面相關的醣蛋白黏蛋白1 (MUC1)的過度表現通常和結腸癌、乳癌、肺癌和胰臟癌有關。
衍生自神經外胚層的腫瘤與肉瘤會大量表現神經節苷脂GD2，此類腫瘤包括神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、黑色素瘤、小細胞肺癌、腦瘤，骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、兒童與青少年的尤英氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)以及纖維肉瘤、平滑肌肉瘤與其他成人的軟組織肉瘤。
雖然正常間皮細胞上也會表現間皮素(mesothelin)，在多種人類癌症患者的腫瘤細胞也會表現間皮素；上述癌症如間皮瘤、胰臟癌、卵巢癌、肺癌與胃癌、膽管癌與三陰性乳癌。
Tn抗原是醣蛋白上的結構成分，其中的N-乙醯半乳胺糖(N-acetylgalactosamine，GalNAc)會透過醣苷鍵而連接到絲胺酸或蘇胺酸而形成O-聚糖。在此類抗原上加入單一個單醣基團即可得到雙醣抗原；譬如以半乳糖取代為(Gal(b1-3)GalNAc)，可得到湯姆森-弗里德里基抗原(Thomsen-Friedenreich antigen，又稱TF抗原或T抗原)；以唾液酸取代為(Neu5Ac(a2-6)GalNAc則得到唾液酸-Tn抗原(STn抗原)。TN與唾液酸通常不會出現在健康的細胞表面，但會出現在癌細胞上。
目前有許多研究著重於以腫瘤相關抗原作為腫瘤標記或免疫療法的標的，這些腫瘤相關抗原包括(1)上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)，如人類上皮生長因子1 (EGFR或HER1)、HER2、HER3、HER4或其變異株；(2)醣蛋白，如CA19-9 (帶有Sialyl LewisA 抗原)、CA125 (帶有黏蛋白16或MUC 16)、細胞表面相關黏蛋白1 (MUC1)或癌胚抗原、黑色素瘤相關抗原(MAGE)、前列腺專一膜抗原(PSMA)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)或間皮素；(3)黏蛋白關聯Tn或唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)；(4)血型Lewis相關LewisY 、Sialyl LewisY 、Sialyl LewisA 或LewisX ；(5)醣神經脂質，如Globo H或階段專一性胚胎抗原(SSEA-4)；或(6)神經節苷脂，如GD2、GD3、GM2、岩藻糖基化GM1或Neu5GcGM3。
II-(ii)-B 以生長因子、肽類激素與細胞介素作為過度表現受體之細胞的標的劑
許多生長因子、肽類激素與調控性細胞介素可調控人體內一些重要的生理作用。這些物質藉由和不同類型T細胞上的受體互動而發揮作用。其中最重要的是位於器官、身體部位或帶有特定功能受體的器官中的內分泌與外分泌細胞，這些細胞可對生長因子、荷爾蒙或細胞介素做出回應。舉例來說，胰臟的外分泌細胞帶有特定受體，在進食與消化過程中，這些受體可對來自十二指腸與胃部的胰泌素、胃泌素與膽囊收縮素做出反應。
當帶有受體的細胞發生惡性轉化時，腫瘤細胞仍會表現這些受體。事實上，在許多情形中，由於細胞發生某些突變，可能會導致受體大量表現，而在正常細胞中則不會表現如此大量的受體。因此，受影響的細胞會發生惡性轉化。腫瘤細胞上的受體過度表現(譬如在大多數的神經內分泌腫瘤上會表現大量的體抑素受體)以及利用這些受體來進行治療與診斷(譬如放射性顯影)都是相關領域研究的重點之一。神經內分泌腫瘤通常較罕見，但其範圍涵蓋非常多種源自不同細胞的腫瘤，包括胃腸胰神經內分泌腫瘤、甲狀腺腫瘤、默克細胞癌(Merkel cell carcinoma)、腎上腺髓質腫瘤以及許多其他腫瘤。
此一領域的研發方向很多，多項研究證實上皮生長因子受體(EGFR)家族會過度表現在乳癌、肺癌、結腸癌以及多種其他上皮癌(carcinoma)細胞上。舉例來說，對HER2/Neu受體專一的單株抗體—曲妥珠單抗已廣泛地用於治療HER2-陽性乳癌。對EGFR專一的西妥昔單抗則已用於治療轉移性結腸癌、轉移性非小細胞肺癌以及頭頸部癌。小分子抑制劑，諸如吉非替尼(gefitinib)與厄羅替尼(erlotinib)，可以擾亂EGFR中的酪胺酸激酶區域，因此可以用來治療多種類型的癌症。
胰臟癌是最難纏的癌症。雖然胰管上皮細胞僅佔了所有胰臟細胞的10%，但衍生自外分泌細胞的胰腺(胰管或侵略性的)癌佔了各類型胰臟癌中的85%。外分泌細胞可表現肽類激素受體，例如由胃部與十二指腸細胞分泌的胃泌素、胰泌素或膽囊收縮素；上述外分泌細胞會回應這些荷爾蒙，並分泌碳酸氫根離子與消化酵素。針對胰臟癌以及其他許多癌症，可利用CCK與胃泌素受體的過量表現作為放射性顯影標的。目前的研究重點還包括其他荷爾蒙與受體，譬如體抑素與釋放胃泌素的多肽。在這類放射性顯影方法中，會將CCK或胃泌素的多肽類似物和作為放射性核種的螯合基團複合。由於原位或轉移性腫瘤會帶有可表現相應受體的細胞，於顯影過程中，顯影劑會和這些細胞結合。目前也有一些實驗將帶有放射性核種(如177 Lu、90 Yt或111 In)的肽類激素或其類似物用於腫瘤治療。
II-(ii)-C 以免疫檢查點作為標的
CTLA-4是一種可向下調控免疫系統的蛋白受體。CTLA-4存在於T細胞表面，而當其和帶有CD80 (B7-1)或CD86 (B7-2)等表面抗原的細胞結合時，就無法和負責活化免疫反應的CD28結合，因此可「關閉」免疫反應。對CTLA-4專一的人類IgG1抗體—伊匹木單抗已經核准可用於治療黑色素細胞瘤，目前也有一些臨床試驗將其用於治療其他類型的癌症。由於伊匹木單抗會促進T細胞活性與增殖，已知伊匹木單抗療法會引發一些嚴重且可能致命的免疫副作用。
活化的T細胞表面上會表現PD-1。當PD-1和其配體PD-L1結合後，T細胞會失去活性。這是身體調控免疫系統，以防止過度免疫反應的機制。許多癌細胞會產生PD-L1，且因而使T細胞失效進而使T細胞無法攻擊癌細胞。已有兩種抗PD-1的人類抗體(派姆單抗(pembrolizumab)與尼伏魯單抗)取得上市許可，能夠用於治療對其他藥物沒有反應且無法切除或轉移性的黑色素母細胞瘤與非小細胞肺癌。MPDL3280A也是抗PD-L1抗體，目前正在進行治療三陰性乳癌、轉移性非小細胞肺癌、膀胱癌與腎細胞癌的二期或三期臨床試驗。目前正在研發或進行早期臨床試驗的抗PD-1與抗PD-L1抗體數目也非常多。
許多研究人員也在探索其他標的，以期能夠使失去活性的T細胞再度發揮功用，上述標的譬如經活化T細胞上的OX40、CD137與CD27及其相應的配體，如OX40L、CD137L與帶有CD137抗原的細胞或腫瘤細胞。一般認為這些路徑對T-細胞活化的強度低於CTLA-4與PD-1等路徑。
雖然對PD-1或PD-L1專一的抗體似乎可以用來治療多種癌症，目前的臨床研發顯示這些抗體需要搭配化療、其他抗體或標靶治療。此外，這些抗體也會導致許多嚴重的副作用。本案發明人認為，若可將對免疫檢查點專一的抗體攜帶至標的腫瘤位置，可以達到較佳的療效且副作用也會減少。
II-(ii)-D 以血管內皮生長因子作為標的
當腫瘤生長時，需要血管內皮生長因子A (VEGF-A)才能進行血管生成作用(angiogenesis)。氧氣與養分的供應、廢棄物排出以及多種其他生理功能都需要血液循環。對VEGF-A專一的抗體(如貝伐單抗)可單獨用於治療某些癌症，或可和化療併用。然而，貝伐單抗會產生多種副作用，包括高血壓以及高出血風險、腸穿孔與壞死性筋膜炎。
II-(ii)-E 以免疫調節細胞介素作為癌症治療劑
在本說明書中，免疫調節細胞介素係指已知能夠刺激或驅動免疫反應的成分。所述的細胞介素包括 (IL-2、IFN-α)、IFN-γ與TNF-α；其中IFN-α是一種較強的T細胞活化物，IFN-α已取得核准可用於治療多毛細胞白血病、與後天免疫不全症候群相關的卡波西氏肉瘤(AIDS-related Kaposi's sarcoma)、濾泡淋巴瘤、慢性骨髓樣白血病以及黑色素母細胞瘤。然而，目前並沒有臨床試驗結果顯示這些免疫調節細胞介素能有效治療固態腫瘤，這主要是因為當全身性給藥時，這些細胞介素的給藥劑量會受限於細胞介素的副作用。一般來說，細胞介素主要會在淋巴樣系統的微環境中作用
III 骨質疏鬆症
RANKL又稱CD254，是細胞核因子κB受體活化因子(RANK)的配體；地諾單抗(denosumab)是對RANKL體專一的抗體，經核准可用於治療骨質疏鬆症。地諾單抗的研發是骨質疏鬆症治療的一大進步。然而，投予地諾單抗會導致一些常見的副作用，諸如尿道與呼吸道感染、白內障、便秘、紅疹與關節疼痛等等。因此需要將此一治療藥劑主要帶往骨頭的位置。
RANKL是一種膜蛋白，屬於腫瘤壞死因子配體家族(tumor necrosis factor ligand family)成員之一。在肺部、胸腺與淋巴結可偵測到大量的RANKL。在骨髓、胃、周邊血、脾臟、胎盤、白血球、心臟、甲狀腺與骨骼肌中的含量則較低。由於抗RANKL IgG，如地諾單抗，可作為骨質疏鬆症的治療藥劑，本發明所述的分子構建體應該會是比傳統抗RANKL IgG更為優異的治療藥劑。
由SOST基因編碼的硬化蛋白(sclerostin)也可以作為開發治療骨質疏鬆症抗體的標的。這是一種由骨細胞製造與分泌的醣蛋白，會負向調控骨母細胞骨骼生成(osteoblastic bone formation)。SOST基因的缺失或缺陷性突變會導致漸進式的骨骼增厚。另一種形式的SOST基因缺陷性突變會促進骨骼生成作用。抗硬化蛋白抗體也會促進骨骼生成作用、提升骨質密度，而使得骨骼更為強壯。布索珠單抗(blosozumab)與羅莫珠單抗(romosozumab)都是人源化抗硬化蛋白單株抗體，這兩種抗體的第一期與第二期臨床試驗顯示，抗體治療可提升骨質密度與骨骼生長作用，且會降低骨再吸收作用(bone resorption)。
有鑑於上述說明，本揭示內容提出了可用以建構本發明所述的T-E分子。下文提供了與這些分子構建體相關的敘述，也討論了這些分子構建體實際的應用潛力。
第一節 含胜肽核的多臂接合物
本揭示內容的第一態樣是關於一種接合單元，其包含：(1)一中心核，其包含2-15個離胺酸(K)殘基；以及(2) 2-15個連接臂，分別連接於中心核的各K殘基。本發明中心核的特徵在於其N-或C-端帶有疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。
在製備本發明接合單元時，將一端帶有N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimydil，NHS)基且另一端帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG鏈連接到K殘基上；具體來說，利用上述NHS基和K殘基上的胺基形成醯胺鍵，進而將PEG鏈連接到中心核上。在本揭示內容中，將連接到K殘基之後的PEG鏈稱為連接臂，此連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基。
根據本揭示內容的實施方式，上述中心核是多肽核，其長度為8-120個胺基酸殘基，且包含2至15個離胺酸(K)殘基，其中每一個K殘基和下一個K殘基之間以一填充序列隔開。
根據本揭示內容的實施方式，填充序列包含甘胺酸(glycine，G)與與絲胺酸(serine，S)殘基；在較佳的情形中，填充序列是由選自G、S及其組合的2-15個殘基所組成。舉例來說，填充序列可以是： GS、 GGS、 GSG、 GGGS (序列編號：1), GSGS (序列編號：2)、 GGSG (序列編號：3)、 GSGGS (序列編號：4)、 SGGSG (序列編號：5)、 GGGGS (序列編號：6)、 GGSGGS (序列編號：7)、 GGSGGSG (序列編號：8)、 SGSGGSGS (序列編號：9)、 GSGGSGSGS (序列編號：10)、 SGGSGGSGSG (序列編號：11)、 GGSGGSGGSGS (序列編號：12)、 SGGSGGSGSGGS (序列編號：13)、 GGGGSGGSGGGGS (序列編號：14)、 GGGSGSGSGSGGGS (序列編號：15)或 SGSGGGGGSGGSGSG (序列編號：16)。
兩個離胺酸殘基之間的填充序列可以由各種長度和組合的甘胺酸與絲胺酸殘基所組成。在離胺酸殘基數目較少的多肽核中，可使用較長的填充序列；在離胺酸殘基數目較多的多肽核中，則可使用較短的填充序列。除了甘胺酸與絲胺酸之外，可在填充序列中加入親水性胺基酸殘基，如天冬胺酸與組胺酸。除了由甘胺酸與絲胺酸殘基組成的填充序列之外，也可使用其他填充序列，譬如可使用常見人類血清蛋白(如白蛋白與免疫球蛋白)中的可撓性、可溶性環。
根據本揭示內容某些較佳的實施方式，中心核包含2-15個單元的G1-5 SK序列。或者是，此多肽核的序列為(GSK)2-15 ；即，多肽包含至少兩個連續的GSK單元。舉例來說，本發明中心核可包含下列胺基酸序列： Ac-CGGSGGSGGSKGSGSK (序列編號：17)、 Ac-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK (序列編號：18)或 Ac-CGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSK (序列編號：19)， 其中Ac代表乙醯基。
根據本揭示內容某些實施方式，中心核是序列為(Xaa -K)n 的多肽核，其中Xaa 是聚乙二醇化胺基酸，其具有2至12個乙二醇(EG)重複單元，且n是2至15的整數。
如上文所述，本發明中心核的特徵在於其N-或C-端帶有疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。根據本揭示內容某些實施方式，本發明中心核的N-或C-端胺基酸殘基帶有疊氮基或炔基。帶有疊氮基的胺基酸殘基可以是：L-疊氮高丙胺酸(AHA)、4-疊氮-L-苯丙胺酸、4-疊氮-D-苯丙胺酸、3-疊氮-L-丙胺酸、3-疊氮-D-丙胺酸、4-疊氮-L-高丙胺酸、4-疊氮-D-高丙胺酸、5-疊氮-L-烏胺酸、5-疊氮-D-烏胺酸、6-疊氮-L-離胺酸或6-疊氮-D-離胺酸。舉例來說，本發明中心核可具有以下序列： Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 Ac-AAH -(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 Ac-AAH -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C、 Ac-C-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -AAH 、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C或 Ac-C-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -AAH ， 其中Xaa 是帶有所述數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸，Ac代表乙醯基，而AAH 代表AHA殘基。
帶有炔基的胺基酸的例子包括，但不限於：L-高炔丙基甘胺酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘胺酸(D-HPG)、或β-高炔丙基甘胺酸(β-HPG)。在本例中，本發明中心核可具有以下序列： Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 Ac-GHP -(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 Ac-GHP -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C、 Ac-C-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -GHP 、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C或 Ac-C-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -GHP ， 其中Xaa 是帶有所述數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸，Ac代表乙醯基，而GHP 代表HPG殘基。
當可理解，目前已可透過商業管道取得多種側鏈帶有疊氮基或炔基的胺基酸與聚乙二醇化胺基酸，這些胺基酸可以帶有保護基團，如叔-丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl，t-boc)或茀甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)，故可輕易用於固態多肽合成。
根據本揭示內容某些實驗例，所用的中心核可包含以下序列： Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSK (序列編號：21)、 Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSKGSK (序列編號：22)、 Ac-AAH GGSGGSGGSKGSGSKGSK (序列編號：23)、 Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSKGSGSC (序列編號：24)、 Ac-C-Xaa 2 -K-Xaa 2 -K-Xaa 2 -K (序列編號：25)或 Ac-C-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K (序列編號：26)、 其中Xaa 為帶有指定數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸、Ac代表乙醯基、AAH 代表AHA殘基且GHP 代表HPG殘基。
或者是，本發明中心核可和耦合臂連接，此耦合臂的自由端(即，未和中心核連接的一端)帶有一官能基(如，疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)。在這些情形中，本發明中心核的N-或C-端為半胱胺酸殘基。在製備與耦合臂連接的接合單元時，將一端帶有順丁烯二醯亞胺基且另一端帶有上述官能基的PEG鏈與上述半胱胺酸殘基連接；具體來說，可透過PEG鏈的順丁烯二醯亞胺基和半胱胺酸殘基的硫氫基之間的硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將兩者連接在一起。在本揭示內容中，連接到中心核末端半胱胺酸殘基上的PEG鏈稱為耦合臂，且其自由端帶有上述官能基。
在較佳的情形中，耦合臂的自由端帶有四嗪基或高應力炔基。這些耦合臂具有2-12個EG單元。根據本揭示內容的實施方式，上述四嗪基為1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪1,2,4,5-四嗪或其衍生物。高應力炔基的實施例包括，但不限於：反式-環辛烯(TCO)、二苯并環辛炔(DBCO)、二氟化環辛炔(DIFO)、二環壬炔(BCN)與二苯并環辛炔(DICO)。根據本揭示內容某些實施方式，四嗪基為6-甲基-四嗪。
根據多種實施例，與耦合臂連接後的中心核包括，但不限於： Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 以及 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 。
或者是，中心核的一端帶有疊氮基或炔基，而另一端則接上了帶有四嗪基或高應力炔基的耦合臂，茲舉例如下： Ac-AAH -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-AAH -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -AAH 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -AAH 、 Ac-GHP -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-GHP -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(AC)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -GHP 以及 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -GHP 。
也可利用重組技術來合成上述多肽，再利用細菌或哺乳類宿主細胞來表現指定的基因區段。如果多肽核的離胺酸殘基數目較多且長度較長，利用重組蛋白技術較佳。這是因為當多肽長度變長時，使用固態合成法發生錯誤的機率會增加，且其純度和/或產量會降低。要運用細菌或哺乳類宿主細胞來產生多肽核時，可在兩個K殘基之間插入長度為2至20個胺基酸殘基的填充序列。此外，由於AHA和HPG並非可由遺傳密碼子編碼的天然胺基酸，這些重組多肽的N-端或C-端殘基可以是半胱胺酸。在表現出重組蛋白並將其純化之後，可使末端的半胱胺酸殘基和短的雙功交聯物反應；上述雙功交聯物的一端帶有可和半胱胺酸殘基的SH基反應的順丁烯二醯亞胺基，另一端則帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基。
相較於利用常規胺基酸(如甘胺酸與絲胺酸殘基)來合成多肽核，使用聚乙二醇化胺基酸來合成多肽核的步驟較少。此外，可採用不同長度的聚乙二醇化胺基酸(即，帶有不同EG重複單元者)，一方面可提供可撓性與水溶性，另一方面亦可在相鄰的離胺酸殘基之間提供間隔。除了聚乙二醇化胺基酸之外，中心核也可包含人工胺基酸，如D-構形胺基酸、高胺基酸、N-甲基胺基酸等。在較佳的情形中，可使用帶有不同長度聚乙二醇(PEG)的聚乙二醇化胺基酸來建構中心核，因為胺基分子中所含的PEG部分可提供構形上的可撓性，並在用以接合的基團間提供了適當的間隔，還可以提升其水溶性；另外，一般來說，PEG的免疫源性較低。合成帶有聚乙二醇化胺基酸的中心核的方法和合成常規多肽相似。
視需要，本發明中心核可更帶有一乙醯基，以保護位於N端的胺基酸殘基，進而提升其穩定性。
當可理解，連接於中心核的連接臂的數目主要取決於連接於中心核中所含離胺酸殘基的數目。由於本發明中心核包含至少兩個離胺酸殘基，所述接合單元可包含複數個連接臂。
參照第1A圖。如圖所示，接合單元10A包含中心核11a，其帶有一個HPG (GHP )殘基以及四個離胺酸(K)殘基，其間分別以填充序列(以下各圖式中以「···」表示)隔開。HPG殘基和K殘基之間或任兩個K殘基之間的填充序列可以是相同或不同的胺基酸序列。在本實施例中，四個連接臂20a-20d藉由NHS基和離胺酸殘基的胺基間所形成的醯胺鍵而連接到各個離胺酸殘基。當可理解，本說明書所述的多種接合單元間可能有一些共通的特徵，因此針對上述接合單元10A或下述各接合單元所述的某些或全部特徵可能也適用於下文提出的實施例，除非其明顯有悖於特定實施方式的脈絡。為求簡潔，下文可能不會重複說明這些共通特徵。
第1B圖繪示了根據本揭示內容另一種實施方式的接合單元10B。中心核11b有一個半胱胺酸(C)殘基以及六個離胺酸(K)殘基，這些殘基之間分別以填充序列隔開。在本實施例中，接合單元10B包含連接到各個離胺酸殘基的六個連接臂20a-20f。根據本揭示內容的實施方式，連接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈。
接合單元10B與第1A圖的接合單元10A不同之處在於接合單元10B更包含耦合臂60。如上文所述，可利用一端帶有順丁烯二醯亞胺基而另一端帶有一特殊官能基的PEG鏈來形成耦合臂60。如此一來，耦合臂60可透過硫氫–順丁烯二醯亞胺反應而連接到中心核11b的半胱胺酸殘基。在本實施例中，耦合臂60的自由端帶有的特殊官能基是四嗪基72。根據本揭示內容的實施方式，耦合臂是具有2至12個EG重複單元的PEG鏈。
當需要在標的部位釋放效應元件時，可以在連接臂中加入一個可裂解鍵；上述裂解鍵可經酸/鹼水解、還原/氧化或酵素作用而裂解。舉例來說，可利用NHS-PEG2-20 -S-S-順丁烯二醯亞胺作為此處所述的耦合臂，這是一種可裂解PEG鏈，其中的S-S雙硫鍵會被緩慢的還原，而NHS基可用來和中心核的胺基接合，進而將PEG鏈連接到中心核上。另外，可利用疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基來取代位在連接臂自由端的順丁烯二醯亞胺基。
根據本揭示內容某些實施方式，連接到中心核的K殘基的連接臂在自由端帶有順丁烯二醯亞胺基。如此一來，帶有硫氫基的功能性元件(譬如、標的元件或效應元件)就可以和連接臂的順丁烯二醯亞胺基進行硫氫–順丁烯二醯亞胺反應，進而將功能性元件連接於連接臂。為了方便說明，和連接臂相連的功能性元件稱為第一元件。當可理解，本發明接合單元可攜帶的第一元件的數目取決於中心核的K殘基的數目(且因此，取決於連接臂的數目)。因此，本發明所屬技術領域具有通常知識者可調整所述接合單元中第一元件的數目，以達到所欲的標的或治療效果。
第1C圖繪示了帶有第一元件的接合單元10C。除了下文所述的特徵之外，第1C圖和第1B圖非常相似。首先，中心核11d帶有五個K殘基，且因此有五個連接臂20a-20e分別與這些K殘基相連。其次，接合單元10C有五個第一元件25A-30e，分別連接於各個連接臂20a-20e。如下文所述，視需要加入的四嗪基72使得所述接合單元可和一額外的功能性元件或另一個分子構建體(參見下文第三節)複合。
為了要進一步增加所需的效果(如，療效)，本發明接合單元除了第一元件之外還可以包含第二元件。舉例來說，第二元件可以是標的元件或效應元件。在本揭示內容可任選的實施方式中，第一元件是效應元件，而第二元件可以是另一種效應元件，兩者可以累加地或加乘地作用，亦可獨立作用。在另一種例子中，第一與第二元件可發揮不同的性質；譬如，第一元件是標的元件，而第二元件是效應元件，反之亦然。或者是，第一元件是效應元件，而第二元件則能夠改善接合單元的藥動學特性，如水溶性、清除作用(clearance)、半衰期(half-life)與生物可用率(bioavailability)。
根據本揭示內容的一實施方式，第一元件是標的元件，其能夠將本發明接合單元專一地標的到病灶部位；第二元件是效應元件，一旦本發明接合單元到達病灶部位後，其可發揮治療效果。舉例來說，在治療液態腫瘤時，本發明接合單元可含有複數個標的元件(即，第一元件)與一個效應元件(即，第二元件)。在本例中，上述標的元件可專一地標的至液態腫瘤上所表現的細胞表面抗原(譬如CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b)；而所述效應元件(譬如，對CD3或CD16a專一的抗體片段)則可招募T細胞或NK細胞以毒殺腫瘤細胞。
根據本揭示內容的替代性實施方式，第一元件是效應元件且第二元件是標的元件。舉例來說，在治療自體免疫疾病時，本發明接合單元可包含一個標的元件與複數個效應元件，其中標的元件能夠專一標的到組織相關細胞外基質蛋白(譬如α-蛋白聚糖、第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白、第V型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白與第XI型膠原蛋白)，而效應元件可在病灶部位發揮治療效果。
在結構上，第二元件可連接到中心核N-或C-端的疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。具體來說，當有需要時，可將第二元件和短PEG鏈(較佳為具有2至12個EG重複單元)複合，之後再將其連接到位在N-或C-端的帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基(譬如AHA殘基或HPG殘基)。或者是，當有需要時，可將第二元件和短PEG鏈複合，且之後再將其連接於中心核的耦合臂。
根據本揭示內容某些實施方式，中心核的N-或C-端是帶有疊氮基(譬如AHA殘基)的胺基酸殘基；且因此，帶有炔基的第二元件就可以透過「銅催化的疊氮化物-炔羥環加成反應」(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC，又稱為鏈接反應(click reaction)而連接到中心核的N-或C-端。根據本揭示內容其他實施方式，上述中心核的N-或C-端是帶有炔基(譬如HPG殘基)的胺基酸殘基；而帶有疊氮基的第二元件就可以透過CuAAC反應而連接到中心核的N-或C-端。CuAAC反應如反應式1所示。＜＜ 反應式 1 CuAAC 反應 ＞＞
CuAAC反應會產生1,5-二取代1,2,3-三唑(1,5-disubstituted 1,2,3-triazole)。炔基和疊氮基之間的反應選擇性極高，且天然生物分子不含炔基和疊氮基。再者，上述反應快速且對pH值不敏感。已知除了利用一價銅(如溴化銅(I)或碘化銅(I))來催化鏈接反應之外，較佳可使用二價銅和還原劑(如抗壞血酸鈉)的混合物以在反應系統中原位(in situ )產生一價銅。或者是，可利用不含銅的反應，將第二元件連接到中心核的N-或C-端，此反應可利用環戊烷基環戊二烯基氯化釕複合物(pentamethylcyclopentadienyl ruthenium chloride complex)作為催化劑，以催化疊氮基-炔環加成反應。
第1D圖繪示根據本發明實施例的另一種接合單元10D，其攜帶了複數個第一元件與一個第二元件。在本實施例中，中心核11c包含一個HPG (GHP )殘基以及五個離胺酸(K)殘基。五個連接臂20a-20e分別連接到中心核11c的五個K殘基；而五個第一元件25A-30e則透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應連接到各個連接臂20a-20e。除了第一元件之外，所述接合單元10D更包含一個第二元件50，其係連接於短PEG鏈62的一端。在和中心核11c複合之前，短PEG鏈62的另一端帶有疊氮基。如此一來，疊氮基可和帶有炔基的HPG殘基進行CuAAC反應，而使得第二元件50連接至中心核11c。第1D圖所示的實心圓點40代表HPG殘基和疊氮基間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
或者是，第二元件透過耦合臂而和中心核連接。根據本揭示內容某些實施方式，耦合臂帶有四嗪基，因此可透過逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反應(參見反應式2)而有效率地連接到帶有TCO的第二元件。根據本揭示內容其他實施方式，耦合臂帶有TCO基，而第二元件可帶有四嗪基，故兩者可透過iEDDA反應而互相連接。相較於位在端點的炔基，iEDDA反應中所採用的應變環辛烯基的活化能明顯較低，且因此iEDDA反應不需使用額外催化劑。＜＜ 反應式 2 iEDDA 反應 ＞＞
接著參照第1E圖，其中接合單元10E的中心核11d包含位於N端的半胱胺酸(C)殘基和五個離胺酸(K)殘基。如第1E圖所示，這五個連接臂20a-20e分別連接到中心核11d的五個K殘基，而五個第一元件25A-30e則透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而分別連接到五個連接臂20a-20e。半胱胺酸殘基連接於耦合臂60；在接上第二元件之前，耦合臂60的自由端帶有四嗪基或TCO基。在本實施例中，第二元件50可和帶有相應TCO或四嗪基的短PEG鏈62連接，再透過iEDDA反應而連接到耦合臂60。第1E圖所示的橢圓點70代表耦合臂60和短PEG鏈62間進行iEDDA反應所產生的化學鍵結。
根據本揭示內容其他實施方式，在和第二元件接合之前，耦合臂帶有疊氮基；當第二元件和自由端帶有高應力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)的短PEG鏈連接時，耦合臂和第二元件就可以透過SPAAC反應(參見反應式3)而連接，反之亦然。＜＜ 反應式 3 SPAAC 反應 ＞＞
接著參照第1F圖，其中接合單元10F的結構和第1E圖的接合單元10E相近，不同之處在於耦合臂60帶有疊氮基或高應力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)而不是四嗪基或TCO基。因此，第二元件50要和帶有相應高應力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO)或疊氮基的短PEG鏈62連接，而使得第二元件50和耦合臂60可透過SPAAC反應而連接。第1F圖所示的菱形點90代表耦合臂60與短PEG鏈62之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
反應式4為製備本發明接合單元的例示性流程。＜＜ 反應式 4 透過連接臂與 C- 端胺基酸殘基連接兩種不同 scFv 的接合單元的製備方法 ＞＞
在步驟1，先製備中心核，其胺基酸序列包含(GSK)3 ，且C端為L-疊氮高丙胺酸(AHA)殘基。在步驟2，透過在NHS基與胺基間形成醯胺鍵，而將三個連接臂分別連接到中心核的離胺酸(K)殘基，連接到中心核的連接臂在自由端帶有順丁烯二醯亞胺(Mal)基。在步驟3，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將三個抗A抗原scFv (scFv α A)連接到各連接臂上，此處的scFv α A即為第一元件。同時，在步驟4，將一個抗B抗原scFv (scFv α B)和自由端帶有DBCO基的短PEG鏈連接，上述短PEG鏈有4個EG重複單元，此處的scFv α B即為第二元件。最後，在步驟5，透過SPAAC反應將第二元件連接到中心核的AHA殘基。
反應式5繪示製備本發明接合單元的另一種例示性流程。＜＜ 反應式 5 透過連接臂與耦合臂連接兩種不同 scFv 的接合單元的製備方法 ＞＞
在步驟1，先製備中心核，其胺基酸序列包含(K-Xaa )3 且C-端有一半胱胺酸殘基。在步驟2，將一端帶有順丁烯二醯亞胺(Mal)基另一端帶有四嗪基的PEG鏈(作為耦合臂)透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應連接到半胱胺酸殘基。之後，在步驟3，將三個連接臂分別連接到中心核的離胺酸(K)殘基。接著，如步驟4所示，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將三個抗A抗原scFv (scFv α A)連接到各連接臂上，此處的scFv α A即為第一元件。同時，在步驟5，將一個抗B抗原scFv (scFv α B)和自由端帶有TCO基的短PEG鏈連接，上述短PEG鏈有3個EG重複單元，此處的scFv α B即為第二元件。最後，在步驟6，透過iEDDA反應將第二元件連接到耦合臂。
聚乙二醇化(PEGylation)是將PEG鏈附接或連接到分子(如，藥物或蛋白)的方法。聚乙二醇化可以改善多種重要的藥理學特性，譬如提升水溶性、延長生命週期以及減少蛋白質分解降解。根據本揭示內容一實施方式，第二元件是PEG鏈，其分子量約為20,000到50,000道耳頓。
第1G圖繪示了另一種例示性的接合單元10G，其中五個第一元件30分別透過連接臂20連接到離胺酸殘基，且中心核11e的HPG (GHP )殘基透過CuAAC反應與PEG鏈80連接。第1G圖所示的實心圓點40代表AHA殘基與PEG鏈80間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
第1H圖是本揭示內容的另一種實施例，接合單元10H的中心核11d的N-端是與耦合臂60相連接的半胱胺酸殘基。可透過iEDDA反應而有效率地將PEG鏈80連接到耦合臂60。接合單元10H的橢圓點70代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為iEDDA反應所形成的化學鍵結。
第1I圖是本發明接合單元的另一種實施例，所示的接合單元10I結構與第1H圖的接合單元10H相似，不同之處在於PEG鏈80是透過SPAAC反應連接到耦合臂60。第1I圖所繪示的菱形點90代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
根據本揭示內容某些實施方式，除了第一與第二元件之外，本發明接合單元更包含第三元件。在此種實施例中，中心核的N-或C-端是帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基，而另一端是半胱胺酸殘基。中心核的離胺酸殘基分別和連接臂相連接，且每一條連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基；而中心核的半胱胺酸殘基則和自由端帶有四嗪基或高應力炔基的耦合臂相連。如此一來，第一元件可透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應連接於連接臂，而第二元件則可透過iEDDA反應和耦合臂相連接。另外，第三元件則是透過CuAAC反應或SPAAC反應而連接到帶有疊氮基或炔基的末端胺基酸殘基。
第一、第二與第三元件可以彼此相同或不同，端視設計者的需求。根據本揭示內容一實施方式，所述接合單元可帶有兩種不同的標的元件與一種效應元件、兩種不同的效應元件與一種標的元件；或是一種標的元件、一種效應元件和一種能夠提升接合單元藥動學特性(水溶性、清除作用、半衰期與生物可用率)的元件。
接著參照第1J圖的接合單元10J，其中心核11f的N-端為HPG (GHP )殘基，而C-端是半胱胺酸殘基。連接臂20和耦合臂60分別連接到中心核11f的離胺酸(K)殘基以及半胱胺酸(C)殘基。此外，五個第一元件30分別連接到五個連接臂20，第二元件(即，PEG鏈)80和耦合臂60連接，而第三元件50則透過短PEG鏈62連接到HPG殘基。實心圓點40代表HPG殘基和短PEG鏈62之間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結；而橢圓點70代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為iEDDA反應所形成的化學鍵結。
第1K圖繪示了本揭示內容的另一種實施方式；接合單元10K的結構與第1J圖所示的接合單元10J相似，不同之處在於短PEG鏈62是透過SPAAC反應而連接到HPG殘基，而非透過iEDDA反應。第1K圖的菱形點90代表短PEG鏈62和HPG殘基之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
在本揭示內容較佳的實施方式中，連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基，以便和帶有硫氫基的第一元件透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而連接。此外，多肽核的一端可以是半胱胺酸殘基或帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基，以供和耦合臂接合，進而連接第二元件。
本發明所屬技術領域具有通常知識者當可想見，可對上述結構進行各種修改。舉例來說，在連接臂的自由端可採用順丁烯二醯亞胺基以外的官能基(譬如疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)，以便透過CuAAC、iEDDA或SPAAC反應來連接第一元件。此外，半胱胺酸殘基(或帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基) 可以位在多肽核N-或C-端以外的位置。更有甚者，可在多肽核中加入二或更多個上述殘基，以供接合多個耦合臂，並進一步連接多個第二元件。
第二節 含胜肽核的多臂接合物的用途
相較於既有的治療性構建體，第一節所述的接合單元至少有以下的優點： (1)可以視需求和/或用途來調整功能性元件的數目。根據不同用途的需求，本發明接合單元可包含二種元件(即，第一與第二元件)或三種元件(即，第一、第二與第三元件)，上述需求包括欲治療的疾病、接合單元的給藥方法、接合單元所攜抗體的結合力與親和力等等。舉例來說，當要將接合單元直接投遞到特定組織/器官(譬如，治療眼睛)時，可以只使用一種元件作為效應元件，而不需加入標的元件。然而，當透過周邊給藥途徑來投遞接合單元時，譬如經口服、腸胃道、鼻腔、局部或黏膜給藥、或以肌肉內、靜脈內或腹膜內注射，本發明接合單元就需要包含標的元件，以便將接合單元專一地標的到病灶部位；此外，接合單元還應該包含效應元件，以便在病灶部位發揮治療效果。為了要提高接合單元的標的或治療效果或提升其穩定度，本發明接合單元還可進一步包含第三元件；所述的第三元件可以是第二種標的元件、第二種效應元件或PEG鏈。 (2)第一元件是以成束(bundle)的形式存在。如本揭示內容第一節所述，第一元件的數目取決於中心核所包含的離胺酸殘基的數目。如果中心核中離胺酸殘基的數目是2到15，則每一接合單元可帶有至少兩個第一元件。因此，相較於傳統治療性構建體僅能攜帶單一個分子(譬如單一個細胞毒性藥物或抗體分子)，本發明接合單元可同時提供更多的功能性元件(不論是標的元件或效應元件)，進而可大幅提升療效。
在某些治療應用中，可能想要採用單一份的標的或效應元件。舉例來說，可以使用針對細胞外基質蛋白的scFv作為標的元件，並由其攜帶由多個可中和促發炎性細胞介素的scFv所構成的藥束，此時，可能僅需要單一份對細胞外基質蛋白專一的scFv，以避免因為標的元件結合力太強而導致不理想的副作用。在另一個例子中，當使用對CD3或CD16a專一的scFv來招募T細胞或NK細胞以毒殺腫瘤細胞時，可利用多個對腫瘤相關抗原專一的scFv所組成的藥束作為標的元件，當這些對腫瘤相關抗原專一的scFv結合到目標腫瘤細胞的表面時，僅需要一份的效應元件(如，對CD3或CD16a專一的scFv)即可達到治療效果，這也避免因為CD3或CD16a交聯而產生的不良副作用。在又一種例子中，可能想要加入單一份的長鏈PEG，以提升接合單元的藥動學特性；因為使用兩個或更多的長PEG鏈可能會使得PEG鏈纏結而影響標的或效應元件的結合力。
有鑑於上述優點，本揭示內容的第二態樣是關於本發明接合單元的應用。具體來說，本揭示內容提供了可治療多種疾病(包括免疫疾病、液態腫瘤、固態腫瘤、骨質疏鬆症與老年性黃斑部退化症)的方法；所述方法包含對有需要的個體投予治療有效量的上述接合單元。
本發明接合單元可治療的第一類疾病是免疫疾病。適用於治療免疫疾病的例示性接合單元所所含的第一元件是對促發炎細胞介素或細胞介素受體專一的抗體片段、或對細胞介素專一的可溶性受體；而其所含的第二元件是對組織專一性細胞外基質蛋白專一的抗體片段。
根據一實施方式，本發明接合單元適用於治療牛皮癬，此接合單元所含的第一元件是對TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或IL-17受體專一的scFv；而其所含的第二元件是對第I型膠原蛋白或第VII型膠原蛋白專一的scFv。
根據另一實施方式，本發明接合單元適用於治療全身性紅斑狼瘡(SLE)、皮膚狼瘡或乾燥綜合症，此類接合單元所含的第一元件是對BAFF專一的scFv；而其所含的第二元件是對第I型膠原蛋白或第VII型膠原蛋白專一的scFv。
某些皮膚疾病會在皮膚出現明顯的發炎症狀，如異位性皮膚炎(atopic dermatitis)、尋常性天疱瘡(pemphigus vulgaris)與多種蕁麻疹(urticaria)等，但一般不會用對TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或BAFF專一的抗體來治療這些疾病，因為這些抗體的治療效果不佳。當可想見，若是使得上述抗發炎抗體能聚集在皮膚部位，這些抗發炎抗體就能夠治療所述皮膚疾病。
根據另一種實施方式，本發明接合單元可用以治療類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎或關節黏連性脊椎炎。在某些實施方式中，第一元件是對TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、IL-17、IL-6R或IL-17R專一的scFv；而第二元件是對第II型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白、第XI型膠原蛋白或α-蛋白聚糖專一的scFv。
根據進一步的實施方式，本發明接合單元適用於治療發炎性腸症(譬如克羅恩氏病與潰瘍性結腸炎)，此種接合單元所包含的第一元件是對TNF-α專一的scFv；所含的第二元件是對第III型膠原蛋白或第V型膠原蛋白專一的scFv。
在治療液態腫瘤(如，急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤與骨髓瘤)時，本發明接合單元的第一元件是對與液態腫瘤相關或於其上表現的細胞表面抗原專一的抗體片段；而本發明接合單元的第二元件是對細胞表面抗原CD3或CD16a專一的抗體片段。根據本揭示內容的實施方式，與液態腫瘤相關或於其上表現的細胞表面抗原是CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138或CD319。
在治療B淋巴細胞衍生的淋巴瘤或白血病時，所用的第一元件是對CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b專一的scFv，而第二元件是對CD3或CD16a專一的scFv。
於治療漿細胞瘤或多發性骨髓瘤時，可使用對CD38、CD78、CD138或CD319專一的scFv作為第一元件，且可使用對CD3或CD16a專一的scFv作為第二元件。
衍生自T細胞的淋巴瘤或白血病的治療可使用對CD5、CD30或CD43專一的scFv作為第一元件，且可使用對CD3或CD16a專一的scFv作為第二元件。
於治療骨髓性白血病時，第一元件是對CD33或CD34專一的scFv，而第二元件是對CD3或CD16a專一的scFv。
本發明接合單元可治療的另一類疾病是固態腫瘤，譬如黑色素瘤、食道癌、胃癌、腦瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、結腸癌、大腸癌、大腸結腸癌、腎癌、肝細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌或頭頸部鱗狀細胞癌。根據本揭示內容的實施方式，本發明接合單元的第一元件可以是肽類激素、生長因子或對腫瘤相關抗原專一的scFv，而第二元件是對細胞表面抗原CD3或CD16a專一的scFv。
根據本揭示內容的實施方式，肽類激素為胰泌素、膽囊收縮素(CCK)、體抑素或促甲狀腺素(TSH)。
在本揭示內容的實施方式中，生長因子可選自以下物質組成的群組：上皮生長因子(EGF)、突變型EGF、表皮調節素、肝素結合上皮生長因子(HB-EGF)、血管內皮生長因子A (VEGF-A)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)以及肝細胞生長因子(HGF)。
根據一實施方式，腫瘤相關抗原可選自以下物質組成的群組：人類上皮生長因子受體-1 (HER1)、HER2、HER3、HER4、醣類抗原19-9 (CA 19-9)、醣類抗原125 (CA 125)、癌胚抗原(CEA)、黏蛋白1 (MUC 1)、神經節苷脂GD2、黑色素瘤相關抗原(MAGE)、前列腺專一膜抗原(PSMA)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、間皮素、黏蛋白關聯Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、Globo H、階段專一性胚胎抗原(SSEA-4)以及上皮細胞黏附分子(EpCAM)。
在某些例子中，某些腫瘤相關抗原會由個體的固態腫瘤脫落而進入其循環系統中。在這些情形中，本發明用以治療固態腫瘤的方法包含以下步驟：(a)對該個體進行血液透析程序，此程序使用對一或多種腫瘤相關抗原專一的抗體，以移除由腫瘤脫落並進入個體循環中的上述一或多種腫瘤相關抗原；以及(b)投予本發明用以治療固態腫瘤的接合單元。
在治療骨質疏鬆症時，本揭示內容的第一元件是對細胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)專一的scFv，而第二元件則是對第I型膠原蛋白或骨結合素專一的scFv。
根據本揭示內容的實施方式，本發明接合單元可用以治療老年性黃斑部退化症(AMD)，此接合單元所含的第一元件是對VEGF-A專一的scFv，而第二元件則是分子量為20,000至50,000道耳頓的長PEG鏈。
第三節 具有標的部分及效應部分的分子構建體
本揭示內容的另一種態樣是關於包含至少兩個接合單元的分子構建體。除了本揭示內容第一節所述的含胜肽核的多臂接合單元之外，所述分子構建體亦可使用一或多個具有化合物核(參見下文)的接合單元作為其接合單元。根據本揭示內容某些實施方式，本發明分子構建體的至少一個接合單元包含多肽核。在較佳的情形中，本發明分子構建體的至少兩個接合單元包含多肽核。在更佳的情形中，本發明分子構建體的所有接合單元分別包含多肽核。
(i) 具有化合物核的接合單元
除了本揭示內容第一節所述的述接合單元之外，此處亦揭示了另一種接合單元，其使用化合物(而非多肽)作為中心核。具體來說，所述化合物可以是苯-1,3,5-三胺、2-(胺甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺、三(2-胺乙基)胺、苯-1,2,4,5-四胺、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-聯苯、四(2-胺乙基)甲烷、四(乙胺)肼、N,N,N’,N’,-四(胺乙基)乙二胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺或N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺。上述化合物均帶有至少三個相等或對稱構形的胺基。因此，當一化合物的其中一個胺基與一耦合臂複合時，所有由該化合物形成的分子都具有相同的構形。
此處所述的化合物和本揭示內容第一節所述的接合單元相似，都分別包含複數個胺基，且因此，可將複數個帶有NHS基的PEG鏈透過胺基和NHS基之間所形成的醯胺鍵而連接到化合物核上；利用此方式接上來的PEG鏈即為本案所述的連接臂，此連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基。同時，所述化合物核有至少一個胺基連接到另一PEG鏈，此PEG鏈一端帶有NHS基且另一端帶有一特殊官能基(如，疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)；化合物核與此種PEG鏈同樣透過醯胺鍵結來連接，接上後的此一PEG鏈稱為耦合臂，其自由端帶有上述特殊官能基。
因此，可透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將一種元件連接到連接臂上，並透過CuAAC反應、SPAAC反應或iEDDA反應將另一種元件連接到耦合臂上，進而將兩種不同的元件分別連接到連接臂和/或耦合臂上。
根據本揭示內容某些實施方式，連接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈，而耦合臂則是具有2至12個EG重複單元的PEG鏈。在一實施方式中，連接臂和耦合臂都具有12個EG重複單元，其中在接合前，耦合臂的一端是NHS基，而另一端是炔基。
反應式6、7分別繪示了中心核和連接臂之間以及中心核和耦合臂之間的連接關係，其中NHS代表NHS酯類、Mal代表順丁烯二醯亞胺基、azide代表疊氮基且alkyne代表炔基。＜＜ 反應式 6 將分別帶有順丁烯二醯亞胺基與疊氮基的連接臂與耦合臂連接到中心核 ＞＞ ＜＜ 反應式 7 將分別帶有順丁烯二醯亞胺基與炔基的連接臂與耦合臂連接到中心核 ＞＞
作為中心核的化合物應有多對稱且有相同方向的胺基，其理由如下：當利用其中一個胺基來連接一個雙功接合臂(即，一端帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯基且另一端帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基)時，可以得到均質的產物(也就是接有耦合臂的中心核，且耦合臂帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基)，故可輕易將其純化。之後可利用此種產物來製備多臂接合單元，將剩餘的胺基都接上自由端帶有順丁烯二醯亞胺基或其他耦合基團的連接臂。若帶有多個胺基的化合物是不對稱的化合物，此種化合物和雙功接合臂/耦合臂接合後所得到的產物就不是均質的產物。
可進一步修飾上述對稱化合物，以使得其可和更多的連接臂/耦合臂連接。舉例來說，四(2-胺乙基)甲烷是可從一般化合物合成或商業購得的化合物，可利用此種化合物來建構連接了四個連接臂/耦合臂的接合單元。將四(2-胺乙基)甲烷和雙硫代琥珀醯亞胺辛二酸酯(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)進行縮合反應，所得到的產物是N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺，此一產物有兩個四(2-胺乙基)甲烷單元，並可用以連接六個連接臂/耦合臂。此處所述的接合單元分別帶有三個、四個與六個連接臂/耦合臂，對於建構具有標的/效應分子的聯合接合物(joint-linker)來說，上述連接臂/耦合臂的數目應相當充足。
當可理解，連接臂和/或耦合臂的數目還有與其連接的元件數目都取決於中心核中所含的胺基數目。在某些較佳的實施方式中，連接臂/耦合臂的數目還有與其連接的元件數目是1到7個。
參照第2圖，其中繪示了帶有四個胺基的苯-1,2,4,5-四胺；其中三個胺基分別和連接臂20相連，而另一個胺基則和耦合臂60相連，且耦合臂60的自由端帶有疊氮基。之後，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將三個第一元件30分別連接到三個連接臂20上，並透過CuAAC反應將一個第二元件50連接到耦合臂60上。第2圖中所示的實心圓點40代表耦合臂60與第二元件50之間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
(ii) 由聯合接合物構形組成的分子構建體
根據本揭示內容某些實施方式，所述分子構建體包含兩個接合單元，且這些接合單元間透過CuAAC反應(以銅或環戊烷基環戊二烯基氯化釕複合物為催化劑)、SPAAC反應或iEDDA反應彼此連接。在一些實施方式中，兩個接合單元中其中一個連接有複數個第一元件(作為標的元件)，而另一個連接有複數個第二元件(作為效應元件)。
根據本揭示內容其他實施方式，所述分子構建體包含三個接合單元，其中第一與第二接合單元彼此透過iEDDA反應而連接，而之後再透過CuAAC反應將第三接合單元接合到第一或第二接合單元。或者是，第一與第二接合單元彼此透過iEDDA反應連接，而第三接合單元則透過SPAAC反應而接到第一或第二接合單元。在一些實施方式中，第一、第二與第三接合單元分別帶有複數個第一、第二與第三元件，其中第一、第二與第三元件彼此不同。根據一實施方式，上述三種元件(即，第一、第二與第三元件)中的其中兩種是標的元件，而另一種則是效應元件。根據另一實施方式，三種元件元件中有兩種是效應元件，而另一種是標的元件。根據又另一種實施方式，三種元件中有一種是標的元件、第二種元件是效應元件，而另一種元件則可改善所述分子構建體的藥動學特性，如水溶性、清除作用、半衰期與生物可用率。
首先參照第3A至3D圖，這些圖式分別繪示了兩個接合單元之間的連接方式。第3A圖所示的分子構建體包含兩個接合單元(100A、200A)，彼此間透過iEDDA反應連接。第一接合單元100A包含第一中心核110a、連接臂120 (下稱第一連接臂)以及耦合臂130A (下稱第一耦合臂)，其中連接臂與耦合臂分別以一端連接於第一中心核110a。相似地，第二接合單元200A包含第二中心核210a、連接臂220 (下稱第二連接臂)以及耦合臂230A (下稱第二耦合臂)，其中連接臂與耦合臂分別以一端連接於第二中心核210a。耦合臂130A、230A其中之一的自由端帶有四嗪基，而另一個的自由端則帶有TCO基。具體來說，若耦合臂130A的自由端(即，未連接到第一中心核110a的一端)帶有四嗪基152，則耦合臂230A的自由端(即，未連接到第二中心核210a的一端)就帶有TCO基154，反之亦然。因此，這兩個接合單元(100A與200A)就會透過發生在耦合臂130A與230A的自由端間的iEDDA反應而彼此連接。第3A圖所示的橢圓點156代表耦合臂130A與230A間因為iEDDA反應而產生的化學鍵結。
在所繪示的實施方式中，連接臂120、220的自由端各帶有順丁烯二醯亞胺基。因此，各自帶有硫氫基的第一標的元件140與第一效應元件240就可透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應分別連接到連接臂120、220。
根據一實施方式，第3A圖所示的第一與第二中心核110a、210a都是多肽核。根據另一實施方式，第3A圖所示的第一與第二中心核110a、210a都是化合物核。根據又一實施方式，第3A圖所示的第一與第二中心核110a、210a其中之一是多肽核，而另一個則是化合物核。
第3B圖繪示根據本揭示內容的替代性實施方式，其中第一與第二中心核110b、210b都是多肽核，且分別透過連接臂120、220跟第一標的元件140與第一效應元件240相連。本實施方式的特點在於，中心核110b、210b其中之一的N-或C-端是帶有疊氮基的胺基酸殘基(譬如AHA殘基)，而另一者的N-或C-端則是帶有炔基的胺基酸殘基(譬如HPG殘基)，此種構形使得中心核110a、210a能夠直接地彼此連接，亦即，不需透過第3A圖所示的耦合臂來連接。具體來說，若中心核110b的N-或C-端為帶有疊氮基162的胺基酸殘基，則中心核210b的N-或C-端為帶有炔基164的胺基酸殘基，反之亦然。因此，接合單元100B與200B可透過發生在中心核110b、210b的上述N-或C-端胺基酸殘基間的CuAAC反應而直接連接。第3B圖所示的實心圓點166代表上述N-或C-端胺基酸殘基間形成的化學鍵結。
第3C圖是本揭示內容的另一種實施方式。接合單元100C與200C的結構和接合單元100A與200A類似，不同之處在於耦合臂130B、230B分別帶有疊氮基162與DBCO基172，而非如第3A圖的接合單元100A、200A一般帶有疊氮基152與炔基154。具體來說，中心核110a和自由端帶有疊氮基162的耦合臂130B (下稱第一耦合臂)連接；而中心核210a則和自由端帶有DBCO基172的耦合臂230B (下稱第二耦合臂)連接。接著，所述接合單元100C與200C可透過發生在耦合臂130B、230B之間的SPAAC反應相連接；兩者間形成的化學鍵結182以菱形表示。
在一實施方式中，第3C圖所示的第一與第二中心核110a、210a都是多肽核。在另一實施方式中，第3C圖所示的第一與第二中心核110a、210a都是化合物核。在又一實施方式中，第3C圖所示的第一與第二中心核110a、210a其中之一是多肽核，而另一個則是化合物核。
當可理解，兩個接合單元也可透過發生在中心核與耦合臂之間的CuAAC反應而彼此連接。接著參照第3D圖，中心核110b的N-或C-端是帶有疊氮基162的胺基酸殘基(譬如AHA殘基)，而中心核210a與自由端帶有TCO基172的耦合臂230B連接。因此，接合單元100B與200C可透過發生在中心核110b與耦合臂230B之間的SPAAC反應而彼此連接；兩者間形成的化學鍵結182以菱形表示。
根據一實施方式，第3D圖所示的接合單元100B、200C分別包含多肽核。根據另一實施方式，第3D圖所示的中心核100B為多肽核，而中心核200C則為化合物核。
或者是，一接合單元的N-或C-端為帶有炔基的胺基酸殘基(譬如HPG殘基)，且另一接合單元包含自由端帶有疊氮基的耦合臂，故兩者可透過中心核與耦合臂之間的CuACC反應而連接。
與其他治療性構建體相較之下，本發明分子構建體至少有以下三種優點： (1)可獨立製備帶有特定數目和/或類型之標的/效應元件的接合單元，之後再透過CuAAC反應、iEDDA反應或SPAAC反應將這些接合單元彼此連接在一起； (2)可基於特定應用的需求(譬如欲治療的疾病、以及標的和/或效應元件的結合親和力(binding avidity)和/或親和力(affinity)等)，來調整標的和/或效應元件的數目與種類。可根據具體的需求與應用來調整標的與效應元件。可隨著各種因素，譬如欲治療的症狀、患者的生理狀況和/或欲治療的疾病種類等，來改變本發明標的與效應元件。臨床治療時，可結合最適當的標的元件與最適當的效應元件，以便達到最理想的治療效果。根據本揭示內容的實施方式，標的元件可以是生長因子、肽類激素、細胞介素或抗體片段；而效應元件可以是免疫調節劑、與放射性核種複合的螯合劑、細胞毒性藥物、細胞介素、可溶性受體或抗體片段；以及 (3)在接合任兩個接合單元時，此處提出的CuAAC反應、iEDDA反應或SPAAC反應的接合效率優於其他接合反應。
接著參照第4圖，可單獨製備圖中繪示的六個構建體庫。在本實施方式中，構建體庫1-6分別包含複數個接合單元300A、300B、300C、400A、400B與400C，而每一種接合單元連接有不同數目和/或種類的功能性元件。接合單元300A、300B與300C的結構類似；其中接合單元300A、300B與300C各自包含一個中心核310、一條與中心核連接的耦合臂330，且耦合臂330的自由端帶有四嗪基350，還有不同數目的連接臂320（如圖所示）。舉例來說，接合單元300A有四條連接臂320，且因此，有四個標的元件340a分別連接到這四條連接臂320。相似地，兩個標的元件340b與五個標的元件340c則分別連接到接合單元300B與300C。標的元件340a、340b與340c可以相同或不同。至於接合單元400A、400B與400C則分別有一中心核410、一條與其相連的耦合臂430，且耦合臂430的自由端帶有高應力炔基450，另外還有不同數目的連接臂420。如圖所示，三個效應元件440a、五個效應元件440b以及八個效應元件440c分別連接到接合單元400A、400B與400C。效應元件440a、440b與440c可以相同或不同。可分別製備構建體庫1-6。本發明所屬技術領域具有通常知識者可以從構建體庫1、2與3中選擇第一接合單元，並從構建體庫4、5與6中選擇第二接合單元，接著再透過發生在四嗪基350與高應力炔基450之間的iEDDA反應，而將第一與第二接合單元連接在一起，因此，所得到的分子構建體即具有指定數目的標的與效應元件。
從上述構建體庫的概念出發，可基於所選的構建體庫得到具有不同構形的分子構建體。第5A圖是所述分子構建體的一種實施例，其中第一與第二中心核(310、410)各自連接了三條連接臂(320、420)與一條耦合臂(330、430)。三個第一標的元件340分別連接到每一連接臂320；而三個第一效應元件440則分別連接到連接臂420。這兩個接合單元透過耦合臂330、430間因為iEDDA反應所形成的化學鍵結356而彼此連接。透過這種構形，所得到的分子構建體可帶有多個相同數目的標的和/或效應元件。
第5B圖是上述分子構建體的另一種實施例，其中第一與第二中心核分別帶有不同數目的胺基(譬如離胺酸殘基)，且因此，所述分子構建體帶有不同數目的標的與效應元件。在圖中所示的實施例中，第一中心核310連接有一條耦合臂330與兩條連接臂320。第二中心核410則接有一條耦合臂430與五條連接臂420。因此，有兩個標的元件340分別連接到兩條連接臂320上；並有五個效應元件440分別連接到五條連接臂420上。第5B圖中的橢圓點356代表耦合臂330、430之間的鍵結。
在可選的實施方式中，本發明分子構建體可更包含相對較長的PEG鏈，此一長PEG鏈和第一或第二中心核連接，而使得在施用至一個體後，本發明分子構建體可遠離網狀內皮細胞（reticuloendothelial）系統而能有較長的半衰期。在利用PEG鏈修飾蛋白質以改善其藥動學特性和/或降低免疫源性的時候，較佳可使用分子量最高為20,000-50,000道耳頓的PEG。因此，在本發明較佳的實施方式中，會使用相對較短的PEG鏈作為連接標的與效應元件所用的連接臂，而要提升分子構建體在活體內的半衰期時，則會將分子量為20,000到50,000道耳頓的PEG鏈連接到任一接合單元。
在某些實施方式中，可利用多個scFv片段作為標的和/或效應元件，以建構本發明分子構建體。對於以含有scFv片段的分子構建體為基礎的標的元件/效應元件藥物，其所含的scFv片段的活體內半衰期應該比個別的抗體片段來得長。在某些臨床應用中，譬如利用抗TNF-α抗體與抗IL-12/IL-23抗體來治療類風濕性關節炎、利用抗RANKL抗體來治療骨質疏鬆症、以及利用抗VEGF-A抗體來治療眼部疾病（如老年性黃斑部退化症）時，藥物的半衰期越長越好，因此就不需要經常施用這些藥物。對於用於上述適應症的分子構建體，可利用分子量為20,000到50,000道耳頓的PEG鏈作為連接臂，以連接作為標的或效應元件的scFv片段。可利用上述長度的PEG來修飾多種治療性蛋白，以延長其半衰期。
根據本揭示內容某些實施方式，所述接合單元可包含分別連接了不同功能性元件的兩條連接臂。參照第6圖，其中所述分子構建體包含兩個接合單元100A與200D。第一與第二功能性元件140、240 (一個作為標的元件，而另一個作為效應元件)分別透過連接臂120與220連接到第一中心核110a與第二中心核210c；而兩個中心核110a與210c則透過發生在耦合臂130A與230A間的iEDDA反應彼此連接，其中橢圓點156代表上述反應所形成的化學鍵結。除了功能性元件240之外，第二中心核210c更連接了一條PEG鏈260。具體來說，第二中心核210c帶有一AHA殘基，其可透過SPAAC反應和帶有高應力炔基的PEG鏈260反應並與其相連，其中菱形點182代表由SPAAC反應所形成的化學鍵結。隨著實際應用的情形，第三元件可以是第二標的元件、第二效應元件或能夠改善分子構建體藥學特性的元件。根據本揭示內容的一實施方式，PEG鏈260的分子量約為20,000到50,000道耳頓。
基於以上的概念，一個接合單元可包含複數條連接臂，而這些連接臂可分別和功能性元件連接。舉例來說，接合單元可包含5-到12條連接臂，因此可以連接5到12個功能性元件。以小分子藥物(如細胞毒性藥物或類鐸受體(TLR)促效劑)作為功能性元件時，上述特性的優勢更為突出。下文將帶有多個細胞毒性藥物分子的接合單元稱為載藥束。
此外，可利用多肽中心核來製備包含三個接合單元的分子構建體。因此，本揭示內容的另一態樣是關於包含三個接合單元的分子構建體。在所述的三個接合單元中，其中兩個接合單元彼此透過iEDDA反應連接，而第三接合單元則可透過SPAAC反應或CuAAC反應連接到另兩個接合單元其中任一單元。建構多接合單元(譬如三個接合單元)的主要考量是可以納入兩種不同的標的元件或二種不同的效應元件。
接著參照第7A圖，圖中所示的分子構建體包含三個接合單元(500、600與700A)。接合單元500、600與700A各自有一個中心核(510、610、710)，而帶有功能性元件(540、640、740)的連接臂(520、620、720)則分別與這些中心核相連。接合單元600的特徵在於其N-或C-端的半胱胺酸殘基和耦合臂630相接，而另一端則是帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基。在接合前，耦合臂530、630其中之一的自由端帶有四嗪基，另一者的自由端則帶有高應力炔基。因此，接合單元500、600可透過發生在耦合臂530與630間的iEDDA反應而彼此連接，其連接方式如第3A圖所示。關於接合單元700A的連接方式，當中心核610的N-或C-端是帶有疊氮基的胺基酸殘基(譬如AHA殘基)時，中心核710的N-或C-端是帶有炔基的胺基酸殘基(譬如HPG殘基)；或者是，當中心核610的N-或C-端是帶有炔基的胺基酸殘基(譬如HPG殘基)時，則中心核710的N-或C-端是帶有疊氮基的胺基酸殘基(譬如AHA殘基)。因此，接合單元600、700A可透過發生在中心核610與710的N-或C-端胺基酸殘基間的CuAAC反應直接彼此連接，而不需透過耦合臂，如第3B圖所示的連接方式。第7A圖所示的橢圓點560與實心圓點670分別代表因iEDDA反應與CuAAC反應所形成的化學鍵結。
或者是，三個接合單元中的兩個接合單元可透過iEDDA反應彼此連接，而第三接合單元則是透過SPAAC反應連接到另兩個單元其中一單元。以第7B圖為例，接合單元500、600是透過iEDDA反應而彼此連接，其連接方式類似第7A圖所示；而接合單元700B則是透過中心核610與耦合臂730間的SPAAC反應而連接到接合單元600。第7B圖所示的菱形點672代表因SPAAC反應而產生的化學鍵結。
當可理解，隨著所欲的應用不同，連接到接合單元500、600與700A或700B上的功能性元件540、640、740的數目也可以隨之改變。利用第4圖提出的構建體庫概念，可將帶有不同數目和/或類型的功能性元件的接合單元分別製備成不同的構建體庫，而本發明所屬技術領域具有通常知識者就可以根據不同的需求，從多個構建體庫中選擇適當的二或多個接合單元並將其結合。
基本上，可將上述態樣和/或實施方式中所討論的分子構建體的「一端帶有疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基的耦合臂」設計成一條有2至12個EG重複單元的PEG鏈；而所述的連接臂則是有2至20個EG重複單元的PEG鏈。
使用多肽作為中心核使得本發明分子構建體具有更大的設計彈性，因為可在單一構建體中攜帶多份或多種標的/效應元件；因此能夠提升藥物遞送的專一性以及其在預定標的部位的功效。可利用包含多個接合單元的分子構建體而得到多種不同的構形。舉例來說：第一接合單元可攜帶三個scFv標的元件，而第二接合單元可攜帶五個細胞毒性藥物；第一接合單元可攜帶三個scFv標的元件，而第二接合單元可攜帶三個scFv效應元件；第一接合單元可攜帶兩個scFv以作為第一組標的元件、第二接合單元可攜帶兩個scFv以作為第二組標的元件，而第三接合單元可攜帶五個細胞毒性藥物；第一接合單元可攜帶兩個雙專一性scFv標的元件，而第二接合單元可攜帶兩個scFv效應元件；或第一接合單元可攜帶三個scFv標的元件、第二接合單元可攜帶兩個scFv效應元件，並透過連接臂而連接分子量為20,000-50,000道耳頓的長PEG以提升其藥動學特性。
在本發明的某些實施方式中，可利用雙功PEG作為連接臂，以將作為標的或效應元件的抗體或其抗原結合片段連接到位於多肽核中的胺基。每一條PEG的一端可帶有NHS基，另一端則帶有順丁烯二醯亞胺基。NHS基可和多肽核中的胺基耦接，而順丁烯二醯亞胺基則可和抗體的scFv、雙專一性scFv或Fab片段的半胱胺酸殘基的硫氫基耦接。可設計scFv與雙專一性scFv使其C-端帶有一多肽接合鏈且最末端為半胱胺酸殘基。可利用胃蛋白酶（pepsin）裂解完整IgG以得到Fab片段，且可利用溫和的還原反應將鏈間的雙硫鍵反應產生自由硫氫基。
反應式8-12提供了多種耦接與製備所述接合單元的實施例。
反應式8是根據本揭示內容一實施方式來製備分子構建體的概要反應式，其中NHS代表NHS酯、Mal代表順丁烯二醯亞胺基、AAH 代表L-疊氮高丙胺酸(AHA)殘基，GHP 代表高炔丙基甘胺酸(HPG)殘基、Ac代表乙醯基且scFv代表單鏈可變片段。＜＜ 反應式 8 透過 C- 端胺基酸殘基來耦接接合單元 ＞＞
在步驟1，分別製備第一中心核與第二中心核，其中第一中心核包含(GSK)3 序列且其C-端為AHA殘基；而第二中心核序列為(GSK)5 且其C-端為HPG。為了使多肽更為穩定，利用乙醯基來修飾第一與第二中心核的N-端。在步驟2，透過形成醯胺鍵，將每一連接臂分別連接到第一與第二中心核中的離胺酸殘基；連接於中心核的連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基。在步驟3，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應，將帶有硫氫基(如，半胱胺酸殘基)的第一標的元件(即，抗體)連接到與第一中心核連接的連接臂；相似地，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應，將帶有硫氫基的效應元件(即，藥物)連接到和第二中心核相連的連接臂。在步驟4，透過發生在AHA與HPG殘基間的CuAAC反應，將兩個接合單元耦接在一起。
可視需要而利用不同方法將標的/效應元件連接到中心核上。如反應式9，先將連接臂連接到中心核，之後再透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將效應元件(即，藥物)連接到連接臂上，進而使效應元件與中心核耦接。＜＜ 反應式 9 透過連接臂將效應元件與多肽核耦接 ＞＞
反應式10則是另一種替代方式，先將效應元件(即，藥物)和連接臂相接，以得到連接臂-效應元件複合物(即，PEG-藥物)；接著，透過形成於離胺酸殘基與NHS酯之間的醯胺鍵，將連接臂-效應元件複合物連接到中心核。＜＜ 反應式 10 先將效應元件和 PEG 鏈接合後再連接到多肽核中離胺酸殘基的胺基 ＞＞
或者是，聯合接合物構形的連接臂也可以用來連接雙專一性scFv，其可作為標的元件或效應元件。這些構形可提升標的元件的專一性和/或效應元件的有效性。
反應式11是製備本發明分子構建體的一種實施例，此分子構建體包含兩個接合單元；每一個接合單元的序列包含(K-Xaa4 )3 ，且其C-端為半胱胺酸(C)殘基。在步驟1，將兩條耦合臂分別連接到這兩個接合單元末端的C殘基，其中一條耦合臂一端帶有順丁烯二醯亞胺(Mal)基且另一端帶有四嗪基，而另一條耦合臂的兩端分別帶有Mal基和TCO基。在步驟2，透過在連接臂與K殘基間形成醯胺鍵，將連接臂分別連接到離胺酸(K)殘基。之後，在步驟3，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應，將三個抗A抗原scFv (scFv α A)與三個抗B抗原scFv (scFv α B)分別連接到這兩個接合單元的連接臂。最後，在步驟4，透過發生在四嗪基與TCO基間的iEDDA反應，將兩個接合單元彼此耦接。＜＜ 反應式 11 透過耦合臂間的 iEDDA 反應來製備分子構建體 ＞＞
反應式12是製備包含三個接合單元的分子構建體的實施例，其中兩個接合單元分別連接了scFv α A與scFv α B，且這兩個接合單元彼此透過iEDDA反應而耦接，如反應式11所述；而第三接合單元則透過CuAAC反應和第二接合單元耦接。在本實施例中，第三接合單元是一個載藥束。然而，此一反應式也可以適用於選用其他元件（如scFv）的第三接合單元。在本發明例子中，位在中心的接合單元(即，第二接合單元)在其N-端為HPG殘基(GHP )，且因此，可透過發生於HPG與AHA殘基之間的CuAAC反應，將帶有AHA殘基(AAH )的載藥束連接到第二接合單元。或者是，中心接合單元的N-或C-端可帶有AHA殘基，若第三接合單元的耦合臂帶有DBCO或其他高應力炔基，兩者就可以透過SPAAC反應而耦接。反應式12中所示的分子構建體有三種功能性元件：scFv α A、scFv α B與藥物分子。此種由三個接合單元組成的分子構建體亦可攜帶三組scFv，其中兩組作為標的元件而一組作為效應元件，或其中一組作為標的元件而另兩組作為效應元件。＜＜ 反應式 12 製備由帶有三種功能性元件的三個接合單元組成的分子構建體 ＞＞
當標的與效應元件都是scFv，且使用600道耳頓(12個EG單元)的PEG鏈作為連接臂時，此種分子構建體共有六個scFv，且其總分子量約為170,000道耳頓。帶有七個scFv的分子構建體的分子量約為200,000道耳頓，而帶有八個scFv的分子構建體的分子量為230,000道耳頓。根據本揭示內容所製備的大多數分子構建體的分子量小於200,000道耳頓，有一小部分的分子構建體的分子量介於200,000-250,000道耳頓之間。
當想要建構帶有四組不同的scFv的分子構建體時，較佳可使一個接合單元帶有接合的單鏈雙專一性scFv (bi-scFv)，譬如scFv1-scFv2 (如抗HER2與HER3)，而另外兩個接合單元則分別帶有一種scFv(即，分別帶有scFv3與scFv4)。有兩種方法能夠建構上述雙專一性的scFv1-scFv2。在「串聯(tandem)」構形中，抗體片段的排列方式為VL 1-VH 1-VL 2-VH 2或VH 1-VL 1-VH 2-VL 2；在「雙抗體(diabody)」構形中，抗體片段則是排列成VL 2-VL 1-VH 1-VH 2或VH 2-VH 1-VL 1-VL 2。可在免疫球蛋白區域間加入多肽接合鏈，如GGGGS (序列編號：6)重複或其他序列。
由發明人的經驗推知，在經過長時間儲存後，帶有順丁烯二醯亞胺與疊氮基的多肽或PEG接合鏈可能會因為順丁烯二醯亞胺與疊氮基間自發的接合反應而形成聚合物。因此，在較佳的情形中，最好分別製備新鮮的各種接合單元，接著再即時將標的或效應元件連接到所述接合單元上，並透過鏈接反應將這些接合單元連接到一起。另一種較佳的實施方式是將標的元件和效應元件都接合到帶有炔基的接合單元上，而後再將其中一種接合單元的炔基轉變為疊氮基，譬如可利用一條兩端都帶有疊氮基的短同型雙功接合物。之後就可將分別帶有炔基與疊氮基的兩種接合單元透過鏈接反應而耦接。
適用於本發明的連接臂較佳為PEG鏈。連接臂的長度取決於多種因素。連接臂的長度應足以對所連接的scFv或其他類型的功能性元件提供適當的彈性，使其能夠在不受到立體結構限制的情形下，接近目標細胞表面上的標的抗原位置；但連接臂的長度又不應過長，以免造成連接臂和其上連接的scFv片段或功能性元件發生分子間與分子內纏結，或使得分子構建體的分子量過大而無法輕易穿透組織。過長的連接臂可能無法拉動抗原分子以形成較密實的團簇，但在某些細胞凋亡或其他細胞層次的效應中可能會需要此種團簇以啟動訊息傳導過程。本發明所屬技術領域具有通常知識者可在不需過度實驗的前提下，針對標的抗原和其結合劑的不同組合類型，決定理想的連接臂長度。依本案發明人的經驗，以CD20為標的抗原時，可將抗CD20 (立妥昔單抗)的Fab片段接合到4-臂PEG接合鏈上，此時使用約1,000至1,200道耳頓(約25-30個EG單元)的PEG臂即可有效引發細胞凋亡。因此，基於本發明的目的，可使用100至1,000道耳頓的PEG接合鏈。在根據本揭示內容的多種分子構建體中，較佳的連接臂是NHS-(PEG)12 -順丁烯二醯亞胺(約500道耳頓)。完全伸展後的(PEG)12 鏈長度約為40-50 Å。
適用於本發明的連接臂與耦合臂不限於PEG鏈。舉例來說，可使用包含甘胺酸、絲胺酸以及其他親水性胺基酸殘基的多肽、多醣與其他生物可相容的線性聚合物，並修飾上述高分子使其帶有NHS基與順丁烯二醯亞胺基。
在某些治療應用中，可能需要將分子構建體的效應元件從連接臂釋放出來，而使得效應元件能夠進入標的位置的細胞(包括與標的元件結合的細胞或其周圍的細胞)，以引發藥學效應。在這些情形中，可在連接臂中加入可裂解鍵。目前已開發出多種可裂解鍵，這些可裂解鍵會因為水解、酸解、還原裂解或酵素裂解等作用而被切開。舉例來說，在發炎組織中會出現基質金屬蛋白酶，已設計出會受此種酵素作用而裂解的多肽片段，並將其用於建構治療用構建體。本發明的一實施方式中使用的PEG接合鏈為NHS-PEG2-12 -S-S-順丁烯二醯亞胺，在鄰近順丁烯二醯亞胺基處設有會被緩慢還原而裂解的S-S雙硫鍵。
根據本揭示內容某些實施方式，上文實施方式中所述的標的元件可選自以下物質所組成的群組：生長因子、肽類激素、細胞介素與抗體；而效應元件可以是免疫調節劑、與放射性核種複合的螯合劑、細胞毒性藥物、細胞介素、可溶性受體或抗體。
在一些實施方式中，所述抗體可採用以下任一種形式：抗原結合片段(Fab)、可變片段(Fv)、單鏈可變片段(scFv)、單一區域抗體(sdAb)或雙專一性單鏈可變片段(雙專一性scFv)。根據一實施方式，雙專一性scFv是雙專一性串聯scFv或雙專一性雙抗體scFv。
為了保持分子構建體的擴散能力，其分子量以小於250,000道耳頓為宜。因此，在大多數的實施方式中較佳應採用scFv片段。在DNA層級，可建構基因序列以將VL 與VH 連接成單一多肽鏈，其順序為VL -VH 或VH -VL ，且兩者間以一多肽連接鏈連接，上述多肽延伸物以甘胺酸與絲胺酸為主要殘基，且其長度為10-25個胺基酸。此外，在上述多肽鏈的C-端加入一段短的延伸物，其包括甘胺酸與絲胺酸，且末端為半胱胺酸。可用以生產上述重組scFv與雙專一性scFv的宿主細胞包括：細菌，如大腸桿菌(E. coli )與戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida )；酵母菌，如畢氏巴斯德酵母(Pichia pastoris )；與哺乳動物細胞，如CHO與HEK293細胞系。
本案發明人已利用HEK293與CHO細胞產製出大量的IgG抗體、Fab、scFv與各種抗體片段、Fc構型蛋白與其他重組抗體，以供活體外系統與動物模型試驗用。本案發明人亦已開發出多種細胞系，以產製用於人類臨床試驗的抗體。在實驗室研究階段，只要使用幾個1-2公升的燒瓶，即可輕易地製備HEK293暫時表現系統，進而生產1克左右的IgG或抗體片段。一般來說，適用於本發明所述分子構建體的scFv片段通常不帶有醣類修飾，而且醣類修飾也不是scFv與其抗原標的結合所必須的。更有甚者，所述的scFv片段中只有一個雙硫鍵以及一個位在末端的半胱胺酸殘基。因此，也可利用小規模的細菌表現系統來製備scFv。使用大腸桿菌時，可選用能從細胞內包涵體(intracellular inclusion bodies)或胞外質(periplasm)中收取scFv或可收取分泌性scFv的表現系統。在大多數的情形中，可利用蛋白L (Protein L)以親和管柱法來純化scFv，上述蛋白L可和大多數κ輕鏈的VH 互動；而在其他情形中則可使用離子交換管柱。
根據本發明多個實施例，所述的聯合接合物平台主要運用scFv與Fab作為標的和/或效應元件。然而，亦可從sdAb或其他抗體片段所組成的大型抗體庫中篩選出特定的結合分子。有些結合分子並不是以免疫球蛋白區域為基礎，但其針對所選的標的分子有專一結合親和力，因而有和抗體類似的功能，這些結合分子包括以下類型：(1)適配體(aptamer)，包含可和目標分子結合的寡核苷酸或短胜肽；(2) Fyn激酶衍生物(fynomer)，包含衍生自人類Fyn激酶SH3區域的小的結合蛋白；(3)黏合素(affimer)，包含衍生自半胱胺酸蛋白抑制劑(cystatin)家族的結合蛋白；以及(4)經設計的錨蛋白重複蛋白(designed ankyrin repeat protein，DARPin)，此類蛋白是利用遺傳工程設計，設計出包含三、四或五個由天然錨蛋白衍生的結構的重複區段。上述這些抗體擬似物的分子量約約為10K至20K道耳頓。
也可利用細胞介素、生長因子、肽類激素或其天然物片段或合成類似物來作為標的或效應元件。亦可使用小分子藥作為效應元件，以將其攜帶到染病的目標細胞或組織；上述小分子藥譬如細胞毒性藥物(如奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素與喜樹鹼)和免疫刺激藥物(如莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特與加德喹莫特)。CpG寡聚去氧核苷酸、衍生自某些格蘭氏陰性細菌的脂多醣以及衍生自真菌(特別是麴菌屬(Aspergillus )與傘菌屬(Agaricus )的物種)的葡聚糖(如酵母聚糖與β-D-葡聚糖)具有較強的免疫刺激活性，且亦可作為效應元件。此類免疫刺激物質通常會和多種免疫細胞上的類鐸受體結合，並因此活化免疫系統。
在本揭示內容某些實施方式中，所述分子構建體的標的元件與效應元件中至少一種是對細胞表面抗原專一的抗體片段。具體來說，當標的元件是對細胞表面抗原專一的抗體片段時，本發明構建體能夠專一地標定到表現此種細胞表面抗原的細胞/組織/器官。當利用對細胞表面抗原專一的抗體作為所述構建體的效應元件時，所述構建體可透過和細胞表面抗原結合，進而活化或抑制其訊息傳導路徑，並因此能夠調控表現這些細胞表面抗原的細胞/組織/器官的生長/存活/功能。根據不同實施方式，上述細胞表面抗原可選自以下物質所組成的群組：細胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16a、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD41、CD43、CD52、CD56、CD61、CD64、CD65、CD74、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD134、CD137、CD138、CD319、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA-4或CD152)、程序性細胞死亡因子1 (PD-1或CD279)以及程序性細胞死亡因子1配體1 (PD-L1或CD274)。根據一實驗例，本發明分子構建體可用以治療液態腫瘤，其中標的元件是對CD19、CD20、CD38或CD138專一的抗體片段；且效應元件是對CD3或CD16a專一的抗體片段。根據另一實驗例，本發明分子構建體可用以治療固態腫瘤，其中效應元件為對PD1專一的抗體片段。根據又一實驗例，本發明分子構建體可用以治療液態腫瘤，其中標的元件為對CD79a專一的抗體片段；且效應元件為對CD79b專一的抗體片段。根據又一實驗例，本發明分子構建體可用以治療液態腫瘤，其中標的元件為對CD79b專一的抗體片段；且效應元件為對CD79a專一的抗體片段。
在本揭示內容某些實施方式中，本發明分子構建體的標的元件是對腫瘤相關抗原專一的抗體片段，其可選自以下物質組成的群組：人類上皮生長因子受體1 (HER1)、人類上皮生長因子受體2 (HER2)、人類上皮生長因子受體3 (HER3)、人類上皮生長因子受體(HER4)、醣類抗原19-9 (CA 19-9)、醣類抗原125 (CA 125)、黏蛋白1 (MUC 1)、神經節苷脂GD2、神經節苷脂GD3、神經節苷脂GM2、岩藻糖基化GM1、Neu5GcGM3、黑色素瘤相關抗原(MAGE)、前列腺專一膜抗原(PSMA)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、間皮素、黏蛋白關聯Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、LewisY 、Sialyl LewisY 、LewisA 、Lewisx 、肝素結合上皮生長因子(HB-EGF)、Globo H、階段專一性胚胎抗原(SSEA-4)、以及轉移酶受體(transferring receptor)。根據一實驗例，本發明分子構建體可用以治療乳房腫瘤或乳癌，其中標的元件是對HER1或HER2專一的抗體片段。根據另一實驗例，本發明分子構建體可用以治療前列腺腫瘤/癌，其中標的元件為對PSMA專一的抗體片段。
在本揭示內容某些實施方式中，本發明分子構建體的標的元件是對組織專一細胞外基質蛋白專一的抗體片段，上述組織專一細胞外基質蛋白可以是骨結合素、α-蛋白聚糖、第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白、第V型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白或第XI型膠原蛋白。根據一實驗例，本發明分子構建體可用以治療類風濕性關節炎，其中標的元件是對第IX型膠原蛋白專一的抗體片段。根據另一實驗例，本發明分子構建體可用以治療牛皮癬，其中標的元件是對第VII型膠原蛋白專一的抗體片段。根據又一實驗例，本發明分子構建體可用以治療關節黏連性脊椎炎，其中標的元件是對α-蛋白聚糖專一的抗體片段。
在本揭示內容某些實施方式中，本揭示內容的標的元件與效應元件中至少有一種是細胞介素。在本揭示內容其他實施方式中，本揭示內容的標的元件與效應元件中至少有一種是對細胞介素專一的抗體片段。在一些實施方式中，上述細胞介素為B細胞活化因子(BAFF)、介白素-1 (IL-1)、IL-2、IL-6、IL-12/IL23、IL-17、干擾素-α (IFN-α)、干擾素-β (IFN-β)、干擾素-γ (IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)或轉化生長因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)。具體來說，當標的元件是細胞介素(譬如TGF-β)時，本發明分子構建體能夠專一地標的到表現相關受體的細胞/組織/器官(譬如於細胞上表現TGF-β受體的腫瘤細胞)。在以細胞介素作為所述分子構建體的效應元件時，分子構建體可藉由結合到細胞介素受體而活化與細胞介素相關的訊息傳導途徑，並因此可產生療效(譬如以可結合至IFN-α受體的IFN-α作為效應元件以產生促發炎或抗腫瘤的效果)。以對細胞介素專一的抗體片段作為效應元件時，其可捕捉並中和細胞介素，故因此能夠抑制與細胞介素相關的訊息傳導路徑(譬如可中和IL-6並抑制IL-6相關發炎反應的抗體)。根據實驗例，本發明分子構建體可用以治療自體免疫疾病，其中效應元件是對TNF-α或IL-17專一的抗體片段。根據另一實驗例，本發明分子構建體可用以治療固態腫瘤，其中效應元件為IFN-γ或IL-2。根據又一實驗例，本發明分子構建體可用以治療固態腫瘤，其中效應元件是對IFN-α或IL-2專一的非中和性抗體片段。根據又另一實驗例，本發明分子構建體可用以治療自體免疫疾病，其中效應元件是對BAFF專一的抗體片段。
根據本揭示內容某些實施方式，所述的可溶性受體是對TNF-α或IL-1專一的受體。在一些實施方式中，利用可溶性受體來捕捉或中和細胞介素，而不會引發相關的訊息傳導路徑。
在本揭示內容某些實施方式中，本發明分子構建體的標的元件是生長因子。在本揭示內容其他實施方式中，本發明標的元件與效應元件其中至少一種是對生長因子專一的抗體片段。在一些實施方式中，生長因子是選自以下物質所組成的群組：上皮生長因子(EGF)、突變型EGF、表皮調節素、肝素結合上皮生長因子(HB-EGF)、血管內皮生長因子A (VEGF-A)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)以及肝細胞生長因子(HGF)。與上文所述的概念類似，當標的元件是生長因子(譬如EGF)時，本發明分子構建體能夠專一地標的到表現其受體的細胞/組織/器官(譬如其上表現了EGF受體的腫瘤細胞)。當效應元件是對生長因子(譬如VEGF-A)專一的抗體片段，其可捕捉並中和與生長因子相關的訊息傳導路徑(譬如VEGF-A-誘發的血管生成)。根據一實驗例，本發明分子構建體可用以治療固態腫瘤，其中效應元件是對VEGF-A專一的抗體片段。
在本揭示內容某些實施方式中，本發明分子構建體的標的元件是肽類激素。在本揭示內容其他實施方式中，本發明標的元件與效應元件其中至少一種是對肽類激素專一的抗體片段。在一些實施方式中，肽類激素是選自以下物質所組成的群組：胰泌素、膽囊收縮素(CCK)、胃泌素、胃泌素釋放肽、似升糖素多肽1 (glucagon-like peptide-1，GLP-1)、神經介素(neuromedin)、腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、促甲狀腺素(TSH)、促性腺素釋素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)及體抑素。根據一實驗例，本發明分子構建體可用以治療固態腫瘤，其中標的元件為CCK或體抑素。
在本揭示內容某些實施方式中，本發明分子構建體的效應元件可以是對半抗原專一的抗體片段，上述半抗原可選自以下物質組成的群組：二硝苯酚(DNP)、三硝苯酚(TNP)、丹磺醯、盤尼西林、對胺苯甲酸以及具有序列編號：20所示序列的短胜肽。具體來說，當效應元件是對半抗原專一的抗體片段時，可將其和經相同半抗原標記的免疫調節效應物一起施用。
在本揭示內容某些實施方式中，本發明分子構建體的效應元件是免疫調節劑。根據某些實施方式，所述免疫調節劑是類鐸受體(TLR)促效劑。在一些實施方式中，類鐸受體促效劑可選自以下物質組成的群組：脂磷壁酸、葡聚糖、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡聚去氧核苷酸(CpG DON)、脂多醣(LPS)、單磷醯脂A以及酵母聚糖。根據一實驗例，本發明分子構建體可用以治療固態腫瘤，其中效應元件為LPS或咪喹莫特。
在本揭示內容某些實施方式中，本發明分子構建體的效應元件是細胞毒性藥物，其可選自以下物質組成的群組：奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素以及喜樹鹼。
在本揭示內容某些實施方式中，本發明分子構建體的效應元件是與放射性核種複合的螯合劑。根據本揭示內容某些實施方式，上述放射性核種是111 In、131 I或177 Lu。根據本揭示內容其他實施方式，螯合劑是選自以下物質所組成的群組：1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4-二乙酸(NODA)以及二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。於一實驗例中，放射性核種為90 Y或111 In且螯合劑為DOTA。在另一實驗例中，放射性核種為111 In而螯合劑是NOTA。於又一實驗例中，放射性核種是111 In而螯合劑是NODA。在又另一實驗例中，放射性核種是90 Y、111 In或177 Lu，且螯合劑是DTPA。
在本發明多個分子構建體中，較佳的標的或效應元件是Fab、Fv、單鏈可變片段(scFv)、單一區域抗體(sdAb)或抗體的其他抗原結合片段。使用scFv時，可在VL 與VH 之間或VH 與VL 之間加入包含(GGGGS)2-5 序列的多肽接合鏈。亦可使用其他本質上具有可撓性且不會形成剛硬二級結構的序列，譬如人類同型免疫球蛋白的CH1與CH2區域間或CH2與CH3區域間的連接序列。可在scFv或其他抗體片段、生長因子、荷爾蒙或細胞介素的C端加入序列為(GGGGS)1-3 且末端為半胱胺酸殘基的多肽延伸鏈。由接合單元延伸出的連接臂在自由端帶有順丁烯二醯亞胺基，而半胱胺酸殘基的硫氫基即可與其結合。
近年來，各界廣泛地使用抗體-藥物複合體(ADC)治療策略，此一策略的前提是能夠將有效量的細胞毒性藥物攜帶到目標細胞。然而，傳統的ADC製備方式是將鏈間的雙硫鍵(特別是位於抗體分子絞鏈區域內)還原，此時藥物/抗體比例(drug/antibody ratio，DAR)不固定，每個與藥物複合的抗體分子通常帶有1到8個不等的藥物。已知對於傳統的ADC，平均DAR大於4或5時會導致分子不穩定，且因此抗體分子會出現聚集或析出等問題。在傳統的ADC構建體中，標的部分僅限於使用兩個Fab或Fv抗原結合片段。在本發明中，標的元件除了多種抗體片段之外可以選用生長因子、細胞介素、荷爾蒙等；而效應元件則可選用各式各樣的效應元件，包括小分子藥物(如細胞毒性藥物、類鐸受體促效劑、與放射性核種複合的螯合劑)與蛋白質(如對各種免疫因子、細胞和/或細胞介素專一的scFv)。在本發明所述的分子構建體中，可藉由調整特定標的元件的數目和/或採用兩種不同的標的元件，以提升標的專一性。
可單獨製備包含細胞毒性藥物負載的接合單元，之後再將其和不同的IgG抗體複合，以製備抗體-藥物複合體。在較佳的實施方式中，使用對某些標的抗原專一的IgG分子作為標的元件，且可將帶有效應元件的接合單元複合到上述IgG分子CH3區域的C-端，所述效應元件可以是：三或更多個細胞毒性藥物(可稱為細胞毒性藥物藥束)、二或更多個類鐸受體促效劑(如LPS分子；可稱為LPS分子藥束)、二或更多個與放射性核種複合的螯合劑(可稱為螯合劑藥束)。上述藥束可供學術與產業研究單位用於產製抗體-藥物複合體，以供實驗室實驗、臨床試驗或商業配銷。
根據本揭示內容的實施方式，對於標的元件與效應元件的選擇有非常大的彈性，因此可以達到較高的標的專一性與效應活性。可以在接合之前，分別製備標的元件的接合單元以及效應元件的接合單元。在製備ADC時，可獨立製備含有細胞毒性藥物、LPS分子或與放射性核種複合的螯合劑或其他小分子的藥束，而不需讓抗體處於嚴苛的化學反應環境下。利用本發明方式，可將藥物直接複合到抗體分子上，故能更妥善地控制藥物與抗體比例(DAR)。採用這種聯合接合物平台即可製備多種標的/效應藥物分子。此處的另一個優點在於所述分子構建體中不含IgG.Fc，所以能夠盡可能地降低不必要的Fc-介導效應，如補體-介導活化作用。
第四節 具有標的部分及效應部分的分子構建體的用途
許多用以治療腫瘤的免疫治療抗體或用以治療自體免疫疾病的抗發炎抗體會作用在免疫系統上。雖然此類抗體預期的藥理學效果是可以活化或抑制在目標腫瘤部位或染病部位的免疫系統或免疫活動，所施用的抗體所產生的效果會導致全身性的免疫促進或抑制效果，進而造成多種副作用。因此，本發明的一個主要原理是將治療性的效應物攜帶到疾病部位(如，腫瘤、發炎部位等)且同時盡可能將低整體的全身性免疫促進或免疫抑制效果。
本發明分子構建體(如上文第三節所述者)同時具備標的與效應元件；因此，標的元件可將效應元件所攜帶的藥物分子攜帶到所欲的目標部位。因此，可藉由選擇適當的標的與效應元件，進而針對任何疾病、症狀和/或異常進行標靶治療。因此，本發明的另一態樣是關於利用本發明分子構建體(包括聯合接合物構形或Fc型的構建體)來治療多種疾病、症狀和/或異常。本發明方法可用以治療的疾病、症狀和/或異常包括：自體免疫疾病(類風濕性關節炎、牛皮癬、SLE、乾燥綜合症與克羅恩氏病)、骨質疏鬆症、液態腫瘤(多種淋巴瘤與白血病)、固態腫瘤、以及乾式與濕式老年性黃斑部退化症。具體來說，上述方法都包含將根據本發明上述任一態樣/實施方式的分子構建體，以治療有效量施用予一個體或患者。
在建構用以治療上述疾病的標的/效應藥物時，所用的標的元件包括對以下物質專一的scFv：(1)第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白、第V型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白、第XI型膠原蛋白、α-蛋白聚糖、骨結合素及關節、皮膚或骨骼中的細胞外基質的其他成分；(2) CD19、CD20、CD22、CD30、CD52、CD79a、CD79b、CD38、CD56、CD74、CD78、CD138、CD319、CD5、CD4、CD7、CD8、CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD36、CD37、CD41、CD61、CD64、CD65、CD11c及淋巴樣細胞系、骨髓樣細胞系與漿細胞的其他細胞表面抗原；(3)在固態腫瘤上過度表現的EGFR、HER2/Neu、HER3、TN、Globo H、GD-2、CA125、CA19-9、與CEA。腫瘤細胞或其他患病細胞上會表現某些荷爾蒙、生長因子或細胞介素的受體，所以標的元件也可以是此類荷爾蒙、生長因子或細胞介素的抗體。應注意到，許多自體免疫疾病屬於結締組織疾病，故可以使用多種類型的膠原蛋白作為標的抗原，以將標的/效應藥物遞送到目標結締組織。
本發明之T-E藥物可選用的效應元件涵蓋多種分子，包括(1)對發炎性細胞介素專一的scFv，上述發炎性細胞介素如TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17、IL-1、IL-6或BAFF；(2)對RANKL專一的scFv，(3)對表現在T細胞與NT細胞上的CD3與CD16a專一的scFv；(4)對PD-1、PD-L1、CTLA-4及其他免疫檢查點分子專一的scFv；(5)促進免疫反應的細胞介素，如IFN-α、IFN-γ、IL-2、TNF-α；(6)細胞毒性分子；(7) TLR促效劑，如LPS、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡核苷酸、β-葡聚糖、酵母聚糖；以及(9)與放射性核種複合的螯合劑。
本發明體認到，在不同的情形下，標的元件和目標分子間所需的結合強度可能不同。以位於目標腫瘤細胞上的腫瘤相關抗原為標的對象時，譬如以對CD19、CD38、HER2/Neu、EGFR、CA125專一的scFv作為標的元件時，一般會希望標的元件和所標的腫瘤相關抗原間有較高的結合親和力。如此一來，可以提升針對標的細胞(相對於未表現所述抗原的其他細胞)的專一性結合。更有甚者，當親和力與結合親和力較高時，標的/效應藥物仍然會結合到標的抗原表現量相對較低的目標細胞。因此，效應元件的負載(譬如細胞毒性藥物或免疫促進效應元件的有效負載)有較高的機率發揮其效應功能。
要將抗發炎劑(如抗TNF-α、抗IL-17、抗IL12/IL23與抗BAFF)遞送到染病關節、皮膚或腸胃時，所用的標的元件可以是對第II型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第I型膠原蛋白或骨結合素專一的scFv，此時不希望讓標的元件和染病部位中細胞外基質內的目標抗原過於緊密地結合。因為當結合力過強時，會引發不理想的免疫效果或影響細胞外基質的整體性。當可想見，細胞外蛋白的含量較為豐富，因此即便標的部分和其目標分子間的結合親和力不高，細胞外蛋白還是能夠捕獲帶有標的部分的治療性分子。T-E藥物的標的元件在結合與不結合間的平衡狀態可以提高T-E藥物在局部區域的濃度。
本案發明人體認到，以對第II型膠原蛋白、第I型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白或骨結合素專一的scFv作為標的元件時，結合親和力不宜過高。在較佳的實施方式中，若標的IgG抗體與標的抗原結合的親和常數(affinity constant，Kd)為Kd＜1x10-9 時，在藥物中可僅使用單一個scFv，且當要使用兩個此類scFv作為標的元件時，標的IgG抗體與標的抗原結合的親和常數應較低，譬如1x10-8 ＞Kd＞1x10-9 。要提升標的抗TNF-α抗體對關節部位的專一性或抗IL17抗體或抗BAFF抗體對皮膚的專一性時，可採用分別針對不同結合抗原的兩種標的元件。一般來說，正常的組織或細胞可能只會表現兩種標的抗原其中一種，故採用此種方法可以提升針對目標組織的結合效果。
(i) 免疫疾病
在設計用於治療自體免疫疾病的分子構建體時，主要考量的是若利用對促發炎細胞介素專一的抗體將其攜帶到被這些促發炎細胞介素影響的染病組織時，可以強化治療效果並降低副作用。細胞介素與荷爾蒙不同；一般來說細胞介素不會在血液循環中循環並作用在位於遠端的目標細胞上。位於淋巴結中的細胞透過輸出淋巴管(efferent lymph vessel)移動並進入淋巴循環。淋巴細胞的產物不會以逆著血流進入淋巴結的方向，離開淋巴結。事實上，所施用的抗體可透過血液循環進入淋巴結。然而，大多數的細胞介素分子不會透過血液循環離開淋巴結。局部淋巴結分泌的細胞介素可作用在淋巴結微環境內的細胞上。因此，若能將較多的標定到促發炎細胞介素的抗體導向染病的發炎組織，並降低進入淋巴結中的抗體量，就可以降低副作用，且會有更多抗體進到染病組織以提升療效。
以抗TNF-α抗體為例，在施用此種分子構建體或含有此種分子構建體的藥物時，所用的分子構建體是以對第II型膠原蛋白專一的scFv作為標的元件並以對TNF-α專一的scFv作為效應元件；此時，所施用的分子構建體可攜帶過量的效應元件；亦即，對TNF-α專一的scFv的用量高於循環於血液中的TNF-α量。當血液中的TNF-α中和了小部分治療藥劑時，剩餘的治療藥劑還是會優先聚集在富含膠原蛋白的組織(包括關節)區域。與許多細胞介素(亦稱為介白素或淋巴介質)相似，TNF-α主要作用在免疫系統的微環境中。TNF-α的半衰期非常短，約只有1小時，且在血液循環中的量非常少。施用上述含抗TNF-α抗體的構建體時，此種構建體不會大量出現在類淋巴系統內進而中和類淋巴系統中的TNF-α。因此，傳統上使用抗TNF-α抗體所導致的感染等副作用可望減輕。
在一實施方式中，本發明方法可用以治療自體免疫，其中第一標的元件為對α-蛋白聚糖、第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白、第V型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白或第XI型膠原蛋白專一的scFv；且第一效應元件為對TNF-α、IL-17、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、BAFF、IL-6受體(IL-6R)或IL-17受體(IL-17R)專一的scFv、或是TNF-α或IL-1的可溶性受體。
(i)-A 牛皮癬
在根據本發明一系列較佳實施例的分子構建體中，以對第I型膠原蛋白與第VII型膠原蛋白專一的scFv作為標的元件，並以對TNF-α、IL-12/IL-23或IL-17專一的scFv作為效應元件。在本揭示內容的一實施方式中，多種基於「聯合接合物」構形的T-E分子包含的標的元件是對第I型膠原蛋白和/或第VII型膠原蛋白專一的scFv，而效應元件則是對IL-17專一的scFv。
在較佳的實施方式中，本發明方法可用以治療牛皮癬，其中第一標的元件為對第I型膠原蛋白或第VII型膠原蛋白專一的scFv；且第一效應元件為對TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17或IL-17R專一的scFv。
(i)-B 全身性紅斑狼、皮膚狼瘡或乾燥綜合症
在本發明中，可利用標的元件將對BAFF或IFN-α專一抗體的scFv攜帶到皮膚處，上述標的元件可為對第I型膠原蛋白以及第VII型膠原蛋白專一的scFv。在本揭示內容一實施方式中，多種基於「聯合接合物」構形的T-E分子包含的標的元件是對第I型膠原蛋白和/或第VII型膠原蛋白專一的scFv，而效應元件則是對BAFF專一的scFv。
在另一較佳的實施方式中，本發明方法適用於治療全身性紅斑狼(SLE)、皮膚狼瘡或乾燥綜合症，其中第一標的元件為對第I型膠原蛋白或第VII型膠原蛋白專一的scFv；且第一效應元件為對BAFF專一的scFv。
(i)-C 類風濕性關節炎，牛皮癬性關節炎或關節黏連性脊椎炎
在又一較佳的實施方式中，本發明方法可治療的疾病為類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎或關節黏連性脊椎炎，其中第一標的元件為對第II型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白、第XI型膠原蛋白或α-蛋白聚糖專一的scFv；且第一效應元件為對TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、IL-17、IL-6R或IL-17R專一的scFv。
(i)-D 發炎性腸症
已知小腸與結腸中富含第I、III與V型膠原蛋白。但由於第I型膠原蛋白亦廣泛見於多種組織中，較佳宜使用對第III型膠原蛋白或第V型膠原蛋白專一的scFv作為標的元件，以將對TNF-α專一的scFv攜帶到克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎患者的小腸或結腸中。在本揭示內容一實施方式中，多種基於「聯合接合物」構形的T-E分子所含的標的元件是對第III型膠原蛋白和/或第V型膠原蛋白專一的scFv，且效應元件是對TNF-α專一的scFv。
在又另一較佳的實施方式中，本發明方法可用以治療發炎性腸症，其中第一標的元件是對第III型膠原蛋白或第V型膠原蛋白專一的scFv；且第一效應元件是對TNF-α專一的scFv。根據實施方式中，發炎性腸症為克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎。
(ii) 腫瘤
本發明在設計較佳的藥物標的時，有兩層考量。其一是增加標的劑的結合親和力與專一性，而使得標的劑仍會結合到抗原表現量相對較低的目標細胞。其次，僅需將治療劑帶到染病腫瘤組織，而不需使治療劑進入表現特定腫瘤相關抗原的細胞內。此類治療劑的例子包括可招募T細胞與NK細胞以使目標細胞溶解的scFv。此類治療劑的另一組例子包括類鐸受體促效劑(如LPS)分子、以及對免疫檢查點專一的scFv(如對PD-1、PD-L1與CTLA-4專一的scFv)；這些治療劑可在局部部位引發免疫反應。另一類治療劑包括由與放射性核種複合的螯和劑所形成的藥束。使用上述治療劑時，可以對組織部位的染病細胞與周遭細胞造成細胞溶解效應，不論腫瘤細胞上腫瘤相關抗原的表現量為何。
因此，本發明涵蓋了多種可提升治療劑集中在染病部位的相對量的方法。上述將治療劑專一地遞送至染病部位的方法不限於標定到癌症的治療劑，也可用於標定到受其他疾病影響的組織的治療劑。對目標專一的遞送不必然是絕對的。換句話說，不需要將所有所施用的藥物分子都帶到所欲的染病部位。相較於未使用標的元件來投遞相同藥物時，只要能夠提升對目標部位的遞送效率，即可提升藥物的療效並降低副作用。
(ii)-A 液態腫瘤
在一些較佳的實施方式中，本發明的T-E藥物利用聯合接合物構形來攜帶細胞毒性藥束。強效的細胞毒性藥物包括奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素、喜樹鹼與其他藥物。在較佳的實施方式中，一接合單元攜帶5-10個細胞毒性分子。相較之下，目前經許可或正在進行臨床試驗的的IgG抗體-藥物複合體通常攜帶兩個Fab片段以進行標的，並帶有平均3或4個分子的細胞毒性藥物以使目標細胞溶解。在根據本發明的分子構建體中，可帶有3至5個對標的抗原專一的scFv以作為標的元件，以及5至10個細胞毒性分子以作為效應元件。相較於傳統的抗體-藥物複合體，本發明分子構建體的標的專一性與藥學效果皆可大幅提昇。更有甚者，也可利用針對目標細胞上兩種不同抗原的兩組scFv作為標的元件，以提升標的專一性以及標的細胞對抗體-藥物複合體的吸收或內化。在本發明所述的分子構建體中，細胞毒性分子是透過PEG或多肽連接臂而複合，以增加其水溶性。可單獨製備帶有細胞毒性藥物負載的接合單元，而後再將其連接到與標的元件複合的接合單元。如此一來，接合單元與整個分子構建體的水溶性就不會造成太大的問題。
相較於經核准可用於臨床治療或仍在進行臨床試驗的傳統抗體-藥物複合體，本節所述的分子構建體對於標的細胞上的表面抗原有較高的結合親和力，但其毒性藥物負載量也較高。使用細胞毒性藥物負載所形成的藥束可實質上提升所述分子構建體的有效性，且因而提高了可標的治療劑的專一性。當可想見，在治療液態與固態腫瘤時，可降低此類治療劑的施用劑量，並能達到較佳的療效以及減低其毒性。此方法不僅適用於衍生自B細胞、T細胞與其他白血球細胞的各種淋巴瘤與白血病；某些腫瘤的細胞表面分子可作為抗體標的，上述方法亦適用於這類腫瘤，譬如許多類型的腫瘤上，都會過度表現屬於人類上皮生長因子受體(EGFR)家族的抗原。
在製備針對腫瘤細胞的T-E分子時，亦可將抗CD3抗體的scFv片段耦接於接合單元上以作為效應元件。採用對CD3專一的scFv有助於招募T細胞，以及將腫瘤目標細胞貼附至細胞毒性T細胞。抗CD3的scFv與細胞結合後會引發T細胞的活化，進而導致相接觸或鄰近的目標細胞溶解。在許多例子中，將抗CD3抗體和對特定抗原(CD20、CD30與EGFR)專一的抗體片段結合以得到雙專一性抗體，這些雙專一性抗體能夠有效地溶解表現上述抗原的目標細胞。
對於具備標的功能的分子構建體構，上文已揭示多種可與其搭配的效應機制。這些效應機制包括細胞毒性藥物負載以及對CD3或CD16a專一的scFv。衍生自B細胞的腫瘤、衍生自T細胞的腫瘤以及其他類型的白血病大多屬於液態腫瘤，針對這些液態腫瘤的效應物的分類和固態腫瘤不同。舉例來說，對於以固態腫瘤為目標的分子構建體，可使用免疫提升製劑(如LPS)作為效應元件。可使用強效免疫提升IgG與抗CD28抗體，並使其前往局部腫瘤部位以刺激免疫活動。此類強效免疫提升物就不適合作為治療白血病與液態腫瘤的治療效應物。
要達到細胞凋亡的效果，結合劑必須使所標定的細胞表面分子(如B-細胞受體或CD20)有效地交聯並聚集成團。本發明認為，讓表面分子交聯時，應使其成為以中心為主的交聯分子團簇，而非在所標定的細胞表面上形成眾多的小型集合物。本發明進一步提出，有許多因素會影響結合劑發揮其細胞凋亡作用。使結合劑具備多價結合能力可提升其交聯能力。然而，若有太多結合臂，又會導致結合劑的體積過大且可能影響其穿透進入組織中的能力。結合劑結合到目標細胞表面時，應能有效地結合到細胞的平面表面。因此，結合臂(如PEG-scFv)應具有某種程度的可撓性，且可在不受到立體限制的情況下到達目標抗原部位。另一方面，若結合臂太長，可能無法達到最理想的交聯與團聚效果，或結合臂會接觸到鄰近細胞上的細胞表面分子。本發明亦體認到，若在多臂接合單元中有足夠的連接臂，則Fab或scFv片段所帶來的彈性高於完整IgG或F(ab’)2 。
本發明較佳的實施方式衡量了上述多種因素。雖然此處提出的設計方法適用於對不同細胞類型上的不同抗原專一的抗體，下文實施例採用對B細胞或B細胞上的抗原專一的抗體，所述的B細胞上的抗原如CD20、CD79a/CD79b (亦稱為Igα/β))以及免疫球蛋白同型專一表位；免疫球蛋白同型專一表位又稱為migis-α與migis-β，是指由α與δ膜結合疫球蛋白鏈的C端延伸的膜錨定多肽的細胞外部分。
CD20屬於穿膜蛋白，其可作為治療B細胞相關疾患的治療標的。從前B細胞時期到最終分化的漿細胞，有超過95%的B淋巴細胞在其分化與成熟過程中都會表現CD20，但CD20不會出現在造血幹細胞上。已知CD20主要以四聚體的形式存在於細胞表面上。目前為止，立妥昔單抗是以B細胞為標的的抗體藥物中最常用的一種，它是抗CD20的鑲嵌IgG1單株抗體。越來越多的資料顯示，立妥昔單抗僅對約50%的B細胞淋巴瘤患者有效。經核准可用於臨床治療或人類臨床試驗的抗CD20抗體包括鑲嵌C2B8單株抗體(立妥昔單抗)、單株抗體1F5以及鑲嵌2H7抗體。
對其他B細胞表面抗原(如CD19與CD22)專一的抗體，通常不會對B細胞衍生的腫瘤細胞造成溶解效應。本發明體認到，若使用對B細胞表面抗原(如CD19)專一的scFv並結合對CD20專一的scFv，能夠有效地提升結合專一性與結合親和力，且可導致目標細胞溶解。在此種應用中，對CD20專一的scFv兼具了標的元件與效應元件兩種身分。B細胞上有大量的CD標記，基於上述思路，這些標記都可以和CD20搭配使用，只要在目標B細胞衍生腫瘤上有某種程度的CD20表現即可。在本揭示內容一實施方式中，多種基於「聯合接合物」構形的T-E分子帶有對CD20與CD19專一的scFv以作為標的元件，並帶有對CD3或CD16a專一的scFv與細胞毒性藥物藥束以作為效應元件。
雖然在各種多發性骨髓瘤間，表面抗原的表現差異極大，對個別患者進行全身性的表面標記剖析仍可作為選擇標的的參考。近年來，大量的抗體-藥物複合體或雙專一性抗體主要是針對少數CD標記，如CD38、CD138、CD78與CD319，其他還有多種正在研發中的表面抗原。本發明體認到，若能提升標的抗體的結合親和力與效應機制，則治療的專一性與療效都會提高。在本發明較佳的實施方式中，用以治療多發性骨髓瘤的分子構建體以三個以上對CD38、CD78、CD138或CD319專一的一或兩種抗體的scFv作為標的元件，並以載有5到10個細胞毒性藥物分子的藥物負載作為效應元件。亦可使用其他效應元件，譬如對CD3或CD16a專一的scFv。在本揭示內容一實施方式中，多種基於「聯合接合物」構形的T-E分子帶有對CD38與CD138專一的scFv以作為標的元件，並帶有對CD3或CD16a專一的scFv與細胞毒性藥物藥束以作為效應元件。
為了讓細胞表面上的標的蛋白能有效地交聯而形成大型團簇，蛋白必須帶有兩個以上的抗原部位以供結合劑結合，而不需使用次級交聯物。舉例來說，因為每一個Igα/Igβ-BCR複合物只有一個Igα與一個Igβ，一個結合劑即使帶有多對Igα或Igβ專一的Fab或scFv，也無法讓的Igα/Igβ-BCR有效地交聯而形成團簇。換句話說，帶有四個對Igα專一的Fab (或scFv)的4-臂接合物頂多只能形成許多由4個BCR組成的小單元，但無法形成較大的交聯複合物。因此，要使Igα/Igβ-BCR交聯時，應使用4-6-臂接合物，其中一接合單元帶有2至3個對Igα專一的scFv，另一接合單元則帶有2至3個對Igβ專一的scFv。或者是，對患者共同施用帶有對Igα專一的scFv的4-臂接合物以及帶有對Igβ專一的scFv的4-臂接合物。
根據本揭示內容某些實施方，所述T-E分子類似用於治療B-細胞衍生腫瘤的藥物。在這些構建體中，利用對T細胞的CD標記專一的scFv作為標的元件，而效應元件則與上文針對B細胞腫瘤所述者相同。本發明也關於設計以抗CD3抗體為基礎的分子構建體，上述抗CD3抗體片段可使T細胞完全或部分失去功能，而不會引發T細胞活化與細胞介素風暴。因此，此種構建體可用以治療T細胞媒介的自體免疫疾病，包括第一型糖尿病、SLE、多發性硬化、發炎性腸症等等。由下文的討論可知，當分子構建體利用各種對腫瘤相關抗原專一的scFv作為標的元件時，可使用對CD3專一的scFv作為效應元件，以招募T細胞來消除標的腫瘤細胞。
根據本揭示內容某些實施方式，所述T-E分子類似用於治療B-細胞衍生腫瘤的藥物。在這些構建體中，利用對骨髓樣細胞系的CD標記專一的scFv作為標的元件，而效應元件則與上文針對B細胞腫瘤所述者相同。
根據本揭示內容其他實施方式，本發明方法可用以治療腫瘤，包括液態腫瘤或固態腫瘤。在這些實施方式中，液態腫瘤可以是急性淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或骨髓瘤。
在本揭示內容一實施方式中，本發明方法可用以治療液態腫瘤，其中第一標的元件是對CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD34、CD36、CD37、CD38、CD41、CD43、CD56、CD61、CD64、CD65、CD74、CD78、CD79a、CD79b、CD80、CD138或CD319專一的scFv；且第一效應元件是細胞毒性藥物或對CD3或CD16a專一的scFv。在本揭示內容另一實施方式中，第一標的元件與第一效應元件其中之一是對CD79a專一的scFv；而另一個則是對CD79b專一的scFv。在可任選的實施方式中，細胞毒性藥物是選自以下物質所組成的群組：奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素與喜樹鹼。
在較佳的實施方式中，本發明方法可用以治療B淋巴細胞衍生的淋巴瘤或白血病，其中第一標的元件是對CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD37、CD79a或CD79b專一的scFv；且第一效應元件是細胞毒性藥物或對CD3或CD16a專一的scFv。
在另一較佳的實施方式中，本發明方法可用於治療B淋巴細胞衍生的淋巴瘤或白血病，其中第一標的元件與第一效應元件其中之一是對CD79a專一的scFv；而另一個則是對CD79b專一的scFv。
在又一較佳的實施方式中，本發明方法可治療的疾病為漿細胞瘤或多發性骨髓瘤，其中第一標的元件是對CD38、CD78、CD138或CD319專一的scFv；且第一效應元件是細胞毒性藥物或對CD3或CD16a專一的scFv。
在又一較佳的實施方式中，本發明方法係針對衍生自T細胞的淋巴瘤或白血病，其中第一標的元件是對CD5、CD30或CD43專一的scFv；而第一效應元件是細胞毒性藥物或對CD3或CD16a專一的scFv。
在較佳的實施方式中，本發明方法可用於治療骨髓性白血病，其中第一標的元件是對CD33或CD34專一的scFv；且第一效應元件是細胞毒性藥物或對CD3或CD16a專一的scFv。
(ii)-B 固態腫瘤
可將上述對腫瘤相關抗原專一的抗體片段接合至本發明所述的多臂接合物。本發明可使用多種對腫瘤相關抗原專一的抗體，如抗HER2/NEU抗體(曲妥珠單抗)、抗CA19-9抗體(衍生自1116-NS-19-9株)、抗CA125抗體(衍生自OC125株)、抗GD2抗體(ch14.18單株抗體)以及抗Globo H抗體(VK9株)。本發明是關於將對上述腫瘤相關抗原專一的抗體的scFv或雙專一性scF與多臂接合物接合，以將治療劑攜帶到腫瘤部位。
在本發明某些實施方式中，「聯合接合物」構形的T-E分子經設計可接合多份的配體、生長因子、細胞介素或荷爾蒙，故可將一或多份的治療藥劑攜帶到腫瘤部位，腫瘤部位的染病細胞表現了可與配體結合的受體。相較於單獨使用治療劑，本發明藥物遞送方式可以提升專一性，且因此可達到較佳的療效與減少副作用。
適用於此一模式的配體包括上皮生長因子(EGF)及其突變株、表皮調節素、肝素結合上皮生長因子(HB-EGF)、血管內皮生長因子A (VEGF-A)、鹼性纖維母細胞生長因子(FGF)、肝細胞生長因子(HGF)、胃泌素、膽囊收縮素(CCK)、胰泌素、胃泌素釋放肽、似升糖素多肽1 (GLP-1)、神經介素、促甲狀腺素(TSH)、腎上腺皮質激素(ACTH)、促性腺素釋素(GnRH)及體抑素。
VEGF至少可分為以下四類：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C與VEGF-D。其中VEGF-A與血管內皮細胞的血管生成有關。VEGF-A可和VEGF受體1、2 (VEGFR1與VEGFR2)結合。已知當位於EGF的N-端的Ser2-Asp3突變為Trp2-Val3或Trp2-Arg3時，突變的EGF不僅可和HER1結合，也會和HER2與HER3結合(參見Stortelers C. et al., Biochemistry 41:8732-8741, 2002)。因此，相較於對EGF或VEGF-A受體專一的抗體，以EGF(W2V3)、EGF(W2R3)或VEGF-A作為標的時，可以標定更多類型的腫瘤細胞。
上述多肽或蛋白的分子量通常很小，EGF有53個胺基酸殘基、體抑素有14與28個胺基酸殘基、胰泌素有27個胺基酸殘基、胃泌素有14-34個胺基酸殘基、CCK有8-58個胺基酸殘基、胃泌素釋放肽有27個胺基酸殘基、GLP-1有37個胺基酸殘基、促甲狀腺素的受體結合β鏈有118個胺基酸殘基、神經介素有10個胺基酸殘基、ACTH有39個胺基酸殘基、而GnRH有10個胺基酸殘基。VEGF-A是由兩條約120-188個胺基酸殘基的多肽所組成的二聚體。在放射顯影中，已證實荷爾蒙或生長因子的截斷片段或人工設計的多肽能夠保有與各別受體相近或更佳的結合能力。舉例來說，由八個胺基酸殘基組成的多肽經證實可顯影表現體抑素受體的腫瘤。
某些細菌、病毒與其他微生物的產物可以引發很強的免疫反應。舉例來說，超級抗原，如葡萄球菌腸內毒素(staphylococcal enterotoxins)可藉由同時結合到MHC第二型抗原與T細胞受體，以活化大量T細胞。許多微生物產物可以和類鐸受體(TLR)結合，並能活化多種免疫活動。
目前FDA已核准三種TLR促效劑在某些癌症與感染性疾病的應用。卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin)可活化TLR2與TLR4，可作為結核病疫苗。目前卡介苗已經核准可用於原位膀胱癌的免疫療法。咪喹莫特，是小分子咪唑喹啉，原本是作為局部抗病毒藥物，其可和TLR7結合，目前已經核准可用於日光性角化症(actinic keratosis)以及淺基底細胞癌(superficial basal cell carcinoma)。單磷醯脂A是一種來自明尼蘇達沙門氏桿菌(Salmonella minnesota )的脂多醣(LPS)，其可和TLR2與TLR4結合，目前已核准可作為乳突病毒疫苗的輔劑，而大多數子宮頸癌都是由乳突病毒感染所造成的。
其他可能具有治療性免疫刺激性的TLR促效劑包括：(1)葡聚糖，包括衍生自某些真菌(特別是麴菌屬與傘菌屬)細胞壁的β-D-葡聚糖，以及衍生自某些真菌(如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))細胞壁的酵母聚糖，這些葡聚糖可和TLR2以及其他免疫細胞的受體結合；(2)莫托立莫特，可和TLR8結合的小分子化合物；(3)咪喹莫特，如上文所述；以及(4) CpG寡聚去氧核苷酸(CpG DON)，是一種單鏈合成DNA分子，其C核苷後接有G核苷，可和TLR9結合。一般來說，這些TLR結合劑可活化樹狀細胞、巨噬細胞、天然殺手細胞、嗜中性白血球以及其他與先天性免疫相關的免疫細胞，並可導致多種發炎性細胞介素的產生，進而強化後天性免疫。先天性免疫和後天性免疫可通力合作將病原逐出人體。
衍生自格蘭氏陰性菌的LPS亦稱為內毒素(endotoxin)或外源性致熱原(exogenous pyrogen)，是一種強效的免疫刺激物。LPS可和單核球細胞、樹狀細胞與巨噬細胞上的CD14/TLR4/MD2受體複合物結合，以引發先天免疫反應，並導致發炎性細胞介素的產生。在人類中，1 μg/kg的LPS即可引發休克，故LPS是很強的免疫刺激物。全身性投予未經修飾的LPS會產生極高的風險。
本發明體認到若將LPS結合到載體上並攜帶到腫瘤部位，LPS就可以在原位引發強烈的局部免疫反應，進而導致發炎性細胞介素的釋放、提高血管通透率，並招募多種效應細胞至該部位。這有助於溶解發炎組織中的腫瘤細胞。由於腫瘤中的細胞對腫瘤相關抗原的表現量不一，本發明策略可對位於腫瘤部位的所有細胞引發免疫活動，不論這些細胞的腫瘤相關抗原密度為何。
本發明體認到LPS強大的發炎活性大多僅限於目標腫瘤部位。因此，在較佳的實施方式中，可將三個對腫瘤相關抗原專一的scFv負複合到接合單元上作為標的元件，並將2-3個LPS或單磷醯脂A分子複合到另一接合單元以作為效應元件。此外，可分別將兩組對不同腫瘤相關抗原專一的scFv複合到兩個接合單元上，再將兩者連接以形成標的元件。
已知可透過連接物將LPS與蛋白複合。舉例來說，先利用1-氰基-4-二甲基胺基吡啶四氟化硼(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate，CDAP)活化LPS，再將LPS和蛋白的一級胺基耦接。實驗結果證實，將LPS和蛋白複合後仍能保持約70%的原有內毒素活性。可利用類似的方式，將LPS複合到本發明提出的接合單元。可在水溶液中於溫和的環境下，利用CDAP來活化LPS的碳水化合物成分中的羥基。接著，將經過CDAP活化的LPS和NH2 ----SH交聯物反應，而後再和接合單元之連接臂的順丁烯二醯亞胺基反應。
本發明體認到若可將治療劑更專一地侷限於染病部位，就可達到較大的治療窗，且可提升治療效果與減少副作用。在本發明中，T-E分子經設計可攜帶對免疫檢查點專一的scFv作為效應元件，以導致摧毀癌細胞的免疫機制；上述免疫檢查點如胞毒性T淋巴細胞相關蛋白(CTLA-4或CD152)、程序性細胞死亡因子1 (PD-1或CD279)以及程序性細胞死亡因子1配體1 (PD-L1、CD274或B7-H1)。
本發明體認到，若將這些細胞介素招募到腫瘤部位，就能夠在局部引發強烈的免疫活動或發炎活動，進而能夠消除腫瘤。因此，本發明所用的多臂接合物其上接合了對免疫調節細胞介素專一的scFv或雙專一性scFv，而非使用免疫調節細胞介素本身。此一設計邏輯是利用scFv來招募已經存在於體內並在血液中循環的免疫調節細胞介素，並使其集中到腫瘤部位。所述分子構建體所用的對細胞介素專一的scFv不會中和這些細胞介素的活性。所用的scFv對細胞介素也不會有很高的親和力。對於個別的scFv片段，較適當的Kd值為1-5 x10-8 。在較佳的實施方式中，每一scFv有潛力招募一免疫調節細胞介素的複數個分子，進而提升療效。
某些腫瘤帶有兩種過度表現的腫瘤相關標記，譬如在某些腸胃道與神經內分泌腫瘤中的CA19-9與CCK/胃泌素受體；或是在某些乳癌中的Globo H與HER2/Neu。本發明體認到使用兩種導引機制，分別攜帶不同的效應劑(譬如，一種攜帶細胞毒性藥物負載而另一種攜帶LPS)，可提升療效並降低副作用。在較佳的治療方式中，先施用帶有LPS以及抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA4、抗TNF-α、抗IFN-γ或抗IFN-α抗體的分子複合物，以在「原位」引發發炎或免疫活化作用，使得血管通透性提升。若局部發炎或免疫活化不足以使腫瘤或染病細胞發生完全的細胞溶解反應，後續可施用攜帶細胞毒性藥物負載的分子構建體，以提升帶有目標腫瘤相關抗原的細胞的細胞溶解反應。
可利用下述標的成分，將治療用的效應物攜帶到目標固態腫瘤部位：(1)細胞毒性藥物，其可毒殺結合後的細胞；(2)抗CD16a或抗CD3抗體，其可引發ADCC或細胞毒性活性；(3) LPS或其他TLR促效劑、抗IL-2、抗TNF-α、抗IFN-γ或抗IFN-α抗體，其可活化免疫活性；(4)抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4抗體或其他免疫檢查點抑制劑，其可釋放免疫檢查點並可壓抑抑制性回饋活動。對於帶有所述配體受體的腫瘤細胞，這些製劑的治療目標是引發其細胞溶解。
舉例來說，多種採用聯合接合物構形的T-E分子可單獨使用對HER2/neu專一的scFv、或將其與對HER1專一的scFv搭配以作為標的元件，並使用細胞毒性藥物、LPS或對CD3、CD16a、PD1或VEGF-A專一的scFv作為效應元件。多種採用聯合接合物構形的T-E分子單獨使用對GD2專一的scFv、或將其與對Globo H專一的scFv搭配以作為標的元件，並使用細胞毒性藥物、LPS或對CD3、CD16a、PD1或VEGF-A專一的scFv作為效應元件。多種採用聯合接合物構形的T-E分子單獨使用對膽囊收縮素(CCK)專一的scFv、或將其與對體抑素專一的scFv搭配以作為標的元件，並使用細胞毒性藥物、LPS或對CD3、CD16a、PD1或VEGF-A專一的scFv作為效應元件。多種採用聯合接合物構形的T-E分子使用對前列腺專一膜抗原(PSMA)專一的scFv作為標的元件，並使用對IL-2、TNF-α、IFN-α或IFN-γ專一的非中和性scFv作為效應元件。
上文討論了以多臂接合單元為基礎的分子構建體，其使用生長因子、肽類激素或細胞介素為標的元件，並揭示了較佳的實施方式。亦可將這些非免疫球蛋白多肽或蛋白設計為似IgG分子構建體或雙鏈IgG.Fc融合蛋白。具體來說，可利用生長因子作為標的元件；上述生長因子如EGF或其變形株、表皮調節素、HB-EGF、VEGF-A、FGF、HGF、胃泌素、CCK、胰泌素、胃泌素釋放肽、GLP-1、神經介素、促甲狀腺素(TSH)的β鏈、ACTH、GnRH或體抑素。從表現上述生長因子或荷爾蒙的受體的細胞所衍生的腫瘤通常也會表現這些受體。在本揭示內容一實施方式中，所述分子構建體使用EGF作為IgG.Fc融合蛋白構形中的標的元件。效應元件包括帶有細胞毒性分子或LPS分子的接合單元，這些分子可透過C-端多肽接合鏈而連接。效應物也可以是對CD3、CD16a、PD-1或VEGF-A專一的scFv。也可以使用免疫調節細胞介素作為效應元件，譬如IFN-α、TNF-α、IL-2與IFN-γ。可將scFv或免疫調節細胞介素表現為重組多肽鏈的一部分。
在本發明某些較佳的實施方式中，所述T-E分子使用對腫瘤相關抗原專一的scFv作為標的元件，並使用對半抗原專一的scFv作為效應元件。所述半抗原包括二硝苯酚(DNP)、三硝苯酚(TNP)、丹磺醯、盤尼西林、對胺苯甲酸或已經有既有抗體的衍生自人類細胞、病毒或細菌蛋白的短胜肽。舉例來說，由8個胺基酸殘基WADWPGPP序列所組成的多肽係位於人類B淋巴細胞上的膜結合IgE的CεmX區域中，此一片段在整個蛋白質資料庫中是獨特的序列，且B細胞表面的抗體無法與其接觸。當一患者的腫瘤表現一腫瘤相關抗原時，可對該患者投予以標定到該腫瘤相關抗原的T-E分子，此時所述T-E分子會結合到腫瘤細胞，其後可施用以相同半抗原標記的免疫調節抗體、細胞介素或其他蛋白，此時先施用的T-E分子可在腫瘤部位招募後續施用的藥物。
要將半抗原標記到治療用分子上時，可透過遺傳工程在治療性抗體或免疫調節細胞介素的C-端加上多肽接合鏈(如GGGGS或(GGGGS)2 )；上述治療性抗體例如對PD-1、PD-L1、CTLA4、VEGF-A、CD3、CD28專一的IgG抗體；上述免疫調節細胞介素如IL-2、TNF-α、INF-α或INF-γ。可將多肽接合鏈和多肽半抗原表現成完整重組蛋白的一部分。半抗原也可透過連接臂標記到以接合單元形式製備的細胞毒性藥物載藥束上，而後此種載藥束再被招募到腫瘤部位。此種治療策略可以提高治療劑在腫瘤部位的相對分布量，並可提升療效以及降低毒性與副作用。
對CD3或CD28專一的IgG是非常強的T細胞活化物。全身性地投予此類抗體會導致劇烈的細胞介素風暴。然而，欲活化T細胞時，若可降低所投予的抗CD3或抗CD28抗體量並使其集中在腫瘤組織，所產生的藥性就能很有效地在局部產生免疫活動與發炎反應，並可招募多種免疫細胞來對抗腫瘤細胞。因此，在本發明的較佳實施方式中，利用半抗原來標記這些抗體。之後就可以投予非常低量的經標記的抗CD3或CD28抗體。
某些腫瘤相關抗原(如CA19-9、CA125)以及癌胚抗原(CEA)會從腫瘤細胞脫落而進入血液循環中。定性與定量血清樣本中的上述抗原已是許多健康檢查中，用來初步偵測腫瘤的常規試驗。在治療後，這些試驗可以用來監控療效與腫瘤狀態。雖然血清中其他腫瘤相關抗原的偵測並非常規檢驗內容，血液循環中也可能帶有濃度不一的這些腫瘤相關抗原。
要使藥物-腫瘤標的複合藥物發揮療效的關鍵之一是要將治療劑專一地攜帶到標定的腫瘤部位，且毒性治療劑進入其他分子與組織中的量則應越低越好。亦可利用循環性腫瘤相關抗原—如CA19-9、CA125或CEA—作為本發明T-E藥物中標的元件的抗原標的，此時，本發明的方法亦可自血液中清除這些腫瘤相關抗原。進行血液透析程序時，可將對目標腫瘤相關抗原專一的抗體和樹脂複合，再將此樹脂填充於親和性管柱中，而後使患者的血漿通過親和性管柱，以清除血液中的腫瘤相關抗原；其後，再對患者施用本發明提出的對目標腫瘤相關抗原專一的藥物。
當抗體和目標細胞的細胞表面抗原結合後，有多種潛在的機制會導致目標細胞溶解。上述機制包括細胞凋亡、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、以及補體介導的細胞溶解(CMC)。這三種機制間相對的重要性取決於所標定的抗原以及與該抗原結合的抗體為何。當以Igα或Igβ作為抗體的標的，以引發B細胞溶解時，對Igα或Igβ專一的IgG抗體不會造成有效的細胞溶解，這意味著抗體無法引發所有上述三種細胞溶解機制。如上文所述，此時抗體不會將Igα或Igβ有效交聯以引發細胞凋亡。抗體也無法介導有效的ADCC與CMC機制。因此，有研究單位開發了能夠有效導致細胞凋亡的毒素-複合抗Igβ。關於本質上屬於肽聚醣或黏蛋白等腫瘤相關抗原專一的抗體，此類抗體不能引發抗體及其所攜帶的細胞毒性藥物的內化作用。
本發明亦關於一種新的治療模式，此一模式涉及依序施用經PEG修飾的結合劑與藥物-抗PEG抗體複合物。經PEG修飾的結合劑包括和PEG複合的蛋白治療劑，上述複合可改善其藥動學特性；經PEG修飾的結合劑還包括運用多臂接合物的治療劑，其可運用本發明提出的PEG連接臂。由於所標定的表面抗原密度過低、交聯程度不足、無力引發細胞凋亡或其他種種原因，經PEG修飾的結合劑可能無法有效造成標定細胞溶解，此時可利用藥物-抗PEG抗體複合物或F(ab’)2 來提升或誘發細胞溶解效應。可將多個抗PEG IgG或F(ab’)2 分子接到每一條PEG鏈上，且每一個抗PEG IgG或F(ab’)2 分子可以攜帶多個細胞毒性藥物分子。使用雙價抗PEG IgG或F(ab’)2 可以使得所標定的表面抗原和與PEG連接的結合劑經過交聯形成複合體。雙價抗PEG IgG或F(ab’)2 的結合會產生大型複合物(由標定的表面抗原加上與PEG連接的結合劑再加上藥物-二價抗PEG IgG或F(ab’)2 複合物)的聚集，且會導致目標細胞將這種複合物內化。其後，經內化的藥物會造成目標細胞的細胞溶解。此種治療策略應可有效配合以腫瘤相關抗原為標的對象的分子構建體一起使用。
此一策略能夠提升以腫瘤為標的對象的結合物的結合能力與專一性，經過抗PEG抗體結合的強化後，因而有較高且更為專一的藥物負載。於製備藥物-抗PEG IgG複合物時，可利用遺傳工程在IgG的γ重鏈C-端加入(GGGGS)2 接合鏈與一半胱胺酸殘基，並透過硫氫基與兩個含細胞毒性藥物負載的接合單元複合，每一結合單元分別帶有3到5個細胞毒性藥物分子。
本發明亦關於一種新的治療模式，此一模式涉及依序施用與PEG結合的抗體的抗原結合片段以及LPS-抗PEG抗體複合物，所述抗體為對腫瘤相關抗原(如CEA、Globo H或SSEA4)專一的抗體。使用LPS-抗PEG IgG或F(ab’)2 複合物可在標定的腫瘤部位引發強烈的免疫反應。舉例來說，當患者的癌細胞會表現Globo H或SSEA4時，先對患者施用耦接了四個scFv片段的4-臂PEG接合物，當經過一段時間之後，再給予LPS-抗PEG IgG或F(ab’)2 複合物。
於本揭示內容一些實施方式中，本發明方法可用於治療固態腫瘤。
在一些實施方式中，第一標的元件為肽類激素、生長因子或對腫瘤相關抗原專一的抗體片段；且第一效應元件為細胞毒性藥物、類鐸受體(TLR)促效劑、與放射性核種複合的螯合劑、細胞介素或對生長因子、細胞表面抗原、半抗原或細胞介素專一的抗體片段。
根據本揭示內容某些視需要而實施的實施方式，當效應元件為對半抗原專一的抗體時，所述方法更包含以下步驟：在施用本發明分子構建體之前，對所述對象施用以相同半抗原標記的免疫調節效應物。
根據一實施例，本發明方法可用以治療以下的固態腫瘤：黑色素瘤、食道癌、胃癌、腦瘤、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、乳癌、胰臟癌、結腸癌、大腸癌、大腸結腸癌、腎癌、肝細胞癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌或頭頸部鱗狀細胞癌。
根據另一實施例，腫瘤相關抗原可選自以下物質組成的群組：人類上皮生長因子受體1 (HER1)、人類上皮生長因子受體2 (HER2)、人類上皮生長因子受體3 (HER3)、人類上皮生長因子受體4 (HER4)、醣類抗原19-9 (CA 19-9)、醣類抗原125 (CA 125)、黏蛋白1 (MUC 1)、神經節苷脂GD2、神經節苷脂GD3、神經節苷脂GM2、岩藻糖基化GM1、Neu5GcGM3、黑色素瘤相關抗原(MAGE)、前列腺專一膜抗原(PSMA)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、間皮素、黏蛋白關聯Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、LewisY 、Sialyl LewisY 、LewisA 、Lewisx 、肝素結合上皮生長因子(HB-EGF)、Globo H、以及階段專一性胚胎抗原(SSEA-4)。
根據又一實施例，肽類激素是選自以下物質所組成的群組：胰泌素、胃泌素、膽囊收縮素(CCK)、胃泌素釋放肽、似升糖素多肽1 (GLP-1)、神經介素、促甲狀腺素(TSH)、腎上腺皮質激素(ACTH)、促性腺素釋素(GnRH)及體抑素。
根據又一實施例，上述生長因子是選自以下物質所組成的群組：上皮生長因子(EGF)、突變型EGF、表皮調節素、肝素結合上皮生長因子(HB-EGF)、血管內皮生長因子A (VEGF-A)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、以及肝細胞生長因子(HGF)。在一實驗例中，第一標的元件為EGF、突變型EGF、HB-EGF、VEGF-A、bFGF或HGF。在另一實驗例中，第一效應元件是對EGF、突變型EGF、VEGF-A、bFGF或HGF專一的scFv。
於一實施例中，上述細胞表面抗原是PD-1、PD-L1、CTLA-4、CD3、CD16a、CD28或CD134。
於另一實施例中，半抗原為二硝苯酚(DNP)、三硝苯酚(TNP)、丹磺醯、盤尼西林、對胺苯甲酸或具有序列編號：20所示序列的短胜肽。
在又一實驗例中，細胞介素為IL-2、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-γ、TGF-β或TNF-α。根據一實施方式，第一效應元件是選自以IL-2、IFN-α、IFN-γ或TNF-α等細胞介素為對象的非中和性scFv。
當可理解，可對腫瘤細胞發會細胞毒殺效果的細胞毒性藥物可以是：抗雌性素(anti-estrogen，如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)及甲地孕酮(megestrol))、黃體釋素促效劑(LHRH agonist，如戈舍瑞林(goscrclin)及醋酸亮丙瑞林(leuprolide))、抗雄性素(anti-androgen，如氟他胺(flutamide)及比卡魯胺(bicalutamide))、光動力治療劑(photodynamic therapies，如維替泊芬(vertoporfin)、酞菁(phthalocyanine)、光敏劑Pc4 (photosensitizer Pc4)及去甲氧基竹紅菌素(demethoxy-hypocrellin A))、氮芥(nitrogen mustard，如環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雌莫司汀(estramustine)及美法崙(melphalan))、亞硝基尿素(nitrosoureas，如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、烷基磺酸(alkylsulphonate，如白消安(busulfan)及蘇消安(treosulfan))、三氮烯(triazene，如達卡巴嗪(dacarbazine)及替莫唑胺(temozolomide))、含鉑化合物(如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)及奧沙利鉑(oxaliplatin))、長春花生物鹼(vinca alkaloid，如長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)及長春瑞濱(vinorelbine))、類紫杉醇(taxoid，如紫杉醇(paclitaxel) 及歐洲紫杉醇(docetaxeal))、表鬼臼毒素(epipodophyllin，如依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康(topotecan)、9-胺基喜樹鹹(9-aminocamptothecin)、康托替康(camptoirinotecan)、伊立替康(irinotecan)、甲磺酸(crisnatol)及絲裂黴素C (mytomycin C)、抗代謝藥物(anti-metabolite)、二氫葉酸還原酶抑制劑(DHFR inhibitor，如胺甲喋呤(methotrexate)、二氯甲胺蝶呤(dichloromethotrexate)、三甲蝶呤(trimetrexate)及依達曲沙(edatrexate))、肌苷-5'-單磷酸去氫酶抑制劑(IMP dehydrogenase inhibitor，如黴酚酸(mycophenolic acid)、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韋林(ribavirin)及EICAR))、核糖核苷酸還原酶抑制劑(ribonuclotide reductase inhibitor，如羥基尿素(hydroxyurea)及去鐵胺(deferoxamine))、尿嘧啶類似物(如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、氟尿苷(floxuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、雷替曲塞(ratitrexed)、替加氟尿嘧啶(tegafur-uracil)及卡培他濱(capecitabine))、胞嘧啶類似物(如阿糖胞苷(cytarabine，又稱ara C)、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosine arabinoside)及氟達拉濱(fludarabine))、嘌呤類似物(如巰基嘌呤(mercaptopurine)及硫鳥嘌呤(Thioguanine))、維生素D3類似物(如EB 1089、CB 1093及KH 1060)、異戊二烯抑制劑(isoprenylation inhibitor，如洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神經毒素(dopaminergic neurotoxin，如1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion))、細胞週期抑制劑(如星形孢菌素(staurosporine))、放線菌素(actinomycin，如放線菌素D)、博萊黴素(bleomycin，如博萊黴素A2、博萊黴素B2及培洛黴素(peplomycin))、蒽環類藥物(anthracycline，如柔紅黴素(daunorubicin)、阿黴素(doxorubicin)、伊達比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone))、多重抗藥性抑制劑(MDR inhibitor，如維拉帕米(verapamil))、鈣離子三磷酸腺苷酶抑制劑(Ca2+ ATPase inhibitor，如毒胡蘿蔔素(thapsigargin))、伊馬替尼(imatinib)、沙利度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，如阿西替尼(axitinib)、波舒替尼(bosutinib)、西地尼布(cediranib)、達沙替尼(dasatinib)、厄羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、來他替尼(lestaurtinib)、那替尼(neratinib)、尼洛替尼(nilotinib)、索拉非尼(sorafenib)、依維莫司(everolimus)、西羅莫司(temsirolimus)、蛋白酶抑制劑(如硼替佐米(bortezomib))、哺乳類斥消靈標的蛋白抑制劑(mTOR inhibitor，例如雷帕黴素(rapamycin)、西羅莫司(temsirolimus)、依維莫司(everolimus)、及雷帕黴素衍生物(ridaforolimus)、奧利默森(oblimersen)、吉西他濱(gemcitabine)、洋紅黴素(carminomycin)、亞葉酸鈣(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、達卡巴嗪(dacarbazine)、甲基芐肼(procarbizine)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、喜樹鹼(campathecin)、普卡黴素(plicamycin)、天門冬醯胺酶(asparaginase)、胺基蝶呤(aminopterin)、甲胺蝶呤(methopterin)、紫菜黴素(porfiromycin)、美法崙(melphalan)、異長春鹼(leurosidine)、環氧長春鹼(leurosine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、曲貝替定(trabectedin)、丙卡巴肼(procarbazine)、海綿內酯(discodermolide)、洋紅黴素(carminomycin)、胺基蝶呤(aminopterin)或六甲基三聚氰胺(hexamethyl melamine)。根據本揭示內容一具體實施方式，細胞毒性藥物為奧里斯他汀、美登木素、阿黴素、卡奇黴素或喜樹鹼。
根據某些實施方式，類鐸受體(TLR)促效劑可以是脂磷壁酸、葡聚糖、莫托立莫特、咪喹莫特、瑞西喹莫特、加德喹莫特、CpG寡聚去氧核苷酸、脂多醣、單磷醯脂A或酵母聚糖。
(iv) 骨質疏鬆症
在骨頭的細胞外基質網路中，主要的組織專一性蛋白是骨結合素，亦稱為富含半光胺酸的分泌性酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)。第I型膠原蛋白是骨基質中主要的蛋白質，但也會出現在襯接皮膚的結締組織中。
在治療骨質疏鬆症時，根據本發明所建構的T-E分子是以對骨結合素和/或第I型膠原蛋白專一的scFv作為標的元件，並以對RANKL或硬化蛋白專一的scFv作為效應元件。本發明體認到若可將抗RANKL或抗硬化蛋白抗體優勢地侷限在骨骼部位，則可降低投予劑量並可提升療效。在本揭示內容一實施方式中，多種基於「聯合接合物」構形的T-E分子帶有對骨結合素(SPARC)專一的scFv以及對第I型膠原蛋白專一的scFv以作為標的元件，並帶有對RANKL專一的scFv以作為效應元件。
根據本揭示內容某些實施方式，本發明方法可用以治療骨質疏鬆症，其中第一標的元件是對第I型膠原蛋白或骨結合素專一的scFv；且第一效應元件是對細胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL)專一的scFv。
實驗例
實驗例 1 ：合成作為多肽核的多肽 1 ( 序列編號： 17) 、多肽 2 ( 序列編號： 18) 以及多肽 3 ( 序列編號： 19) ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG3 - 反式 - 環辛烯 (TCO) 複合以作為耦合臂
利用固態多肽合成法來合成多肽1-3，並利用反相高效液相層析(HPLC)純化以得到至少95%的純度。反相HPLC使用Shimadzu Nexera-i LC-2040C 3D HPLC系統與Kromasil 100-5C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、乙腈線性梯度為10%至45%、15分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
將純化的多肽溶解於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0；含50 mM NaCl與5 mM EDTA)，最終濃度2 mM。利用1 mM三(2-羧乙基)膦(tris (2-carboxyethyl)phosphine，簡稱TCEP)使溶解的多肽還原，反應溫度25°C、時間2小時。將多肽和順丁烯二醯亞胺-PEG3 -TCO (Conju-probe Inc., San Diego, USA)以1/10的比例混合，並在pH 7.0、25°C的條件下反應24小時，以使半胱胺酸殘基的SH基和順丁烯二醯亞胺-PEG3 -TCO複合而帶有功能性連接基團TCO。利用反相HPLC來純化TCO-多肽複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 10 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。第8圖為純化TCO-多肽2的反相HPLC溶析曲線圖；圖中以箭頭標示TCO-多肽2的峰值。
以MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的三種TCO-多肽(如下所示)。由中央研究院分子生物研究所(臺灣臺北)的核心設施單位進行質譜分析。以Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF質譜分析儀(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)進行測量。
所述TCO-多肽1 (如下所示)的分子量為1,807.0道耳頓。
所述TCO-多肽2 (如下所示)的分子量為2,078.9道耳頓。
所述TCO-多肽3 (如下所示)的分子量為3,380.8道耳頓。
實驗例 2 ：合成作為多肽核的多肽 1 以及多肽 2 ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG4 - 四嗪複合以作為耦合臂
利用實驗例1所製備的多肽1與多肽2，將其溶解於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0；含50 mM NaCl與5 mM EDTA)，最終濃度2 mM。利用1 mM TCEP使溶解的多肽還原，反應溫度25°C、時間2小時。將多肽和順丁烯二醯亞胺-PEG4 -四嗪(Conju-probe Inc.)以1/5的比例混合，並在pH 7.0、4°C的條件下反應24小時，以使半胱胺酸殘基的SH基和順丁烯二醯亞胺-PEG4 -四嗪複合而帶有功能性連接基團四嗪基。利用反相HPLC來純化四嗪基-多肽複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 10 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。利用上文實施例所述的方式，以MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的兩種四嗪基-多肽。
所述四嗪基-多肽1 (如下所示)的分子量為1,912.7道耳頓。
所述四嗪基-多肽2 (如下所示)的分子量為2,185.2道耳頓。
實驗例 3 ：合成作為多肽核的多肽 1 以及多肽 2 ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG5 -DBCO 複合以作為耦合臂
利用上文實驗例所製備的多肽1與多肽2，將其溶解於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0；含50 mM NaCl與5 mM EDTA)，最終濃度2 mM。利用1 mM TCEP使溶解的多肽還原，反應溫度25°C、時間2小時。
將多肽和順丁烯二醯亞胺-PEG5 -DBCO (Conju-probe Inc.)以1/5的比例混合，並在pH 7.0、室溫下反應24小時，以使半胱胺酸殘基的SH基和順丁烯二醯亞胺-PEG5 -DBCO複合而帶有功能性連接基團DBCO基。利用反相HPLC來純化DBCO-多肽複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 10 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。利用上文實施例所述的方式，以MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的兩種DBCO-多肽。
所述DBCO-多肽1 (如下所示)的分子量為1,941.8道耳頓。
所述DBCO-多肽2 (如下所示)的分子量為2,213.9道耳頓。
實驗例 4 ：合成作為多肽中心核的多肽 4 ( 序列編號： 21) 、多肽 5 ( 序列編號： 22) 以及多肽 6 ( 序列編號： 23)
利用固態多肽合成法來合成多肽4-6，並利用反相HPLC純化以得到至少95%的純度。高炔丙基甘胺酸(GHP )與疊氮高丙胺酸(AAH )等非天然胺基酸分別帶有炔基與疊氮基。反相HPLC使用Supelco C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、乙腈線性梯度為2%至90%、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
利用MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的三種多肽。所述多肽4 (Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSK；序列編號：21)的分子量為1,317.0道耳頓；所述多肽5 (Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSKGSK；序列編號：22)的分子量為1,589.9道耳頓；而所述多肽6 (Ac-AAH GGSGGSGGSKGSGSKGSK；序列編號：23)的分子量為1,634.66道耳頓。
實驗例 5 ：合成作為多肽核的多肽 7 ( 序列編號： 24) ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG3 -TCO 或順丁烯二醯亞胺 -PEG4 - 四嗪複合以作為耦合臂
利用上文實驗例所述方法合成多肽7 (Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSKGSGSC；序列編號：24)，並使其和交聯物複合。利用MALDI-TOF來確認所合成的TCO-多肽7與四嗪基-多肽7。
所述TCO-多肽7 (如下所示)的分子量為1,736.78道耳頓。
所述四嗪基-多肽7 (如下所示)的分子量為1,820.62道耳頓。
實驗例 6 ：合成作為多肽核的多肽 8 ( 序列編號： 25) ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG3 -TCO 、順丁烯二醯亞胺 -PEG4 - 四嗪或順丁烯二醯亞胺 -PEG5 -DBCO 複合以作為耦合臂
利用固態多肽合成法來合成多肽8 (Ac-C-Xaa -K-Xaa -K-Xaa -K；其中Xaa 為具有兩個EG單元的聚乙二醇化胺基酸；序列編號：25)，並利用反相HPLC純化以得到至少95%的純度。反相HPLC使用Kromasil 100-5C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用水與0.1% TFA、乙腈線性梯度為10%至40%、12分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
利用質譜分析ESI-MS來確認所合成的多肽8。利用LTQ Orbitrap XL ETD質譜分析儀(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)並搭配標準ESI離子源，進行高解析度與高質量精度實驗。由中央研究院(臺灣臺北)基因體研究中心的核心設施單位進行質譜ESI-TOF分析。所合成的多肽樣本在981.9有較強的分子離子峰，與[M-H]- 相應，表示PEG化多肽的實際分子量為983.0道耳頓。
利用上文實驗例的方法使多肽和交聯物複合，並利用質譜分析ESI-MS來確認產物(如下所示，其中Xaa2 表示有兩個EG單元的聚乙二醇化胺基酸)。
所述TCO-多肽8 (如下所示)的分子量為1,478.87道耳頓。
所述四嗪基-多肽8 (如下所示)的分子量為1,584.92道耳頓。
本發明DBCO-多肽8 (如下所示)的分子量為1,613.8道耳頓
實驗例 7 ：合成作為多肽核的多肽 9 ( 序列編號： 26) ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和順丁烯二醯亞胺 -PEG3 -TCO 複合以作為耦合臂
利用上文實驗例所述的方法製備多肽9 (Ac-C-Xaa -K-Xaa -K-Xaa -K-Xaa -K-Xaa -K；其中Xaa 為具有六個EG單元的聚乙二醇化胺基酸；序列編號：26)。利用質譜分析ESI-MS來確認所合成的多肽9。所合成的多肽樣本在828.0有較強的分子離子峰，與[M+3H]3+ 相應，表示PEG化多肽的實際分子量為2,480.7道耳頓。
利用上文實驗例的方法使多肽和交聯物複合，並利用質譜分析ESI-MS來確認產物。所述TCO-多肽9 (如下所示)的分子量為2,975道耳頓。
實驗例 8 ：將 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和 TCO- 多肽 1 及 TCO- 多肽 2 的胺基複合以合成接合單元
將兩個PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到多肽核TCO-多肽1；並將三個PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到多肽核TCO-多肽2。交聯物NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺(琥珀醯亞胺-[(N-順丁烯二醯亞胺基-丙醯胺基)-十二乙二醇]酯；succinimidyl-[(N-maleimido-propionamido)-dodecaethyleneglycol] ester)係購自Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, USA)。根據製造商的指示進行接合；將帶有離胺酸殘基的多肽溶解於複合緩衝液(磷酸鹽緩衝液(PBS)、pH 7.5)中，濃度100 mM。在溶解的多肽中加入NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺交聯物，最終濃度1 mM (比起0.1 mM多肽溶液，莫耳數過量20倍)。使反應混合物在室溫下反應18小時。以反相HPLC純化(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽1)複合物與(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。第9圖為純化(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物的反相HPLC曲線圖；圖中以箭頭標示峰值。
利用MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽1)複合物以及(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽1)複合物 (如下所示)是一種採用多肽核的接合單元，其上接有一條帶有TCO基的耦合臂以及兩條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。MALDI-TOF質譜分析的結果顯示上述分子構建體的分子量為3,330.7道耳頓。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物 (如下所示)是一種採用多肽核的接合單元，其上接有一條帶有TCO基的耦合臂以及三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。第10圖為其MALDI-TOF質譜分析結果，圖中資料顯示上述分子構建體的分子量為4,332道耳頓((ESI-TOF) m/z (z=4): [M + 4H]+ ; calculated for C185 H313 N31 O83 S1 1083.7829; found 1083.7833), corresponding to [M+Na]+ )。
實驗例 9 ：將 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和四嗪基 - 多肽 2 以及 DBCO- 多肽 1 的胺基複合以合成接合單元
將三條PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到四嗪基-多肽2，並將兩條上述連接臂連接到DBCO-多肽1。NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺和多肽中心核中離胺酸殘基的胺基之間的複合方式，如上文實驗例所述，並利用MALDI-TOF質譜分析來確認產物。
如下所示，上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽2)複合物上接有一條帶有四嗪基的耦合臂以及三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。第11A圖為MALDI-TOF質譜分析結果，圖中顯示此構建體的分子量為4,461道耳頓。
如下所示，上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(DBCO-多肽1)複合物上接有一條帶有DBCO基的連接臂以及兩條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。第11B圖為MALDI-TOF質譜分析結果，結果顯示此構建體的分子量為3,445道耳頓。
實驗例 10 ：將 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和多肽 4 至多肽 6 的胺基複合以合成接合單元
將兩條PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到多肽4；並將三條PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到多肽5與多肽6。NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺和多肽中心核中離胺酸殘基的胺基之間的複合方式，如上文實驗例所述，並利用MALDI-TOF質譜分析來確認產物。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-多肽4複合物(如下所示)的分子量為2,817.3道耳頓；此分子構建體是以多肽核為基礎的接合單元，帶有一個炔基與兩條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-多肽5複合物(如下所示)的分子量為3,839.2道耳頓；此分子構建體是以多肽核為基礎的接合單元，帶有一個炔基與三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-多肽6複合物(如下所示)的分子量為3,811.5道耳頓；此分子構建體是以多肽核為基礎的接合單元，帶有一個疊氮基與三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
實驗例 11 ：將 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和 TCO- 多肽 7 以及四嗪基 - 多肽 7 的胺基複合以合成接合單元
將兩條PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂接到上文實驗例製備的多肽7上。NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺和多肽中心核中離胺酸殘基的胺基之間的複合方式，如上文實驗例所述，並利用MALDI-TOF質譜分析來確認產物。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽7)複合物(如下所示)的分子量為3,237.63道耳頓；此分子構建體是以多肽核為基礎的接合單元，帶有一個炔基、一條帶有TCO基的耦合臂、以及兩條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽7)複合物(如下所示)的分子量為3,342.98道耳頓；此分子構建體是以多肽核為基礎的接合單元，帶有一個炔基、一條帶有四嗪基的耦合臂、以及兩條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
實驗例 12 ：將 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和 TCO- 多肽 8 以及四嗪基 - 多肽 8 的胺基複合以合成接合單元
將三條PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到作為多肽核的TCO-多肽8與四嗪基-多肽8上。NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺和多肽中心核中離胺酸殘基的胺基之間的複合方式，如上文實驗例8所述，並利用MALDI-TOF質譜分析來確認產物。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽8)複合物(如下所示)的分子量為3,774.9道耳頓；此分子構建體是以聚乙二醇化胺基酸與離胺酸為基礎的接合單元；其上接有一條帶有TCO基的耦合臂、以及三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
上述(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽8)複合物 (如下所示)的分子量為3,856.94道耳頓，參見第12圖((ESI-TOF) m/z (z=4): [M + 4H]+ Calculated for C171 H287 N23 O71 S1 H3 Na 964.7363; Found 964.7324)；此分子構建體是以聚乙二醇化胺基酸與離胺酸為基礎的接合單元；其上接有一條帶有四嗪基的耦合臂、以及三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
實驗例 13 ：將 NHS-PEG6 - 順丁烯二醯亞胺和 TCO- 多肽 9 的胺基複合以合成接合單元
將五條PEG6 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到作為多肽核的TCO-多肽9上。NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺和多肽中心核中離胺酸殘基的胺基之間的複合方式，如上文實驗例8所述，並利用MALDI-TOF質譜分析來確認產物。
(PEG6 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽9)複合物 (如下所示)的分子量為5,543.78道耳頓，參見第13圖((ESI-TOF) m/z (z=6): [M + 6H]+ Calculated for C244 H421 N29 O101 S1 Na 924.297; Found 924.299)；此分子構建體是以聚乙二醇化胺基酸與離胺酸為基礎的接合單元；其上接有一條帶有TCO基的耦合臂、以及五條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG 連接臂。
實驗例 14 ：將 1,3,5- 三苯胺和一條 NHS-PEG12 - 炔連接臂與兩條 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺基連接臂複合以合成接合單元
1,3,5-三苯胺購自BOC Sciences (Creative Dynamics Inc., NY, USA)，而NHS-PEG12 -炔連接臂與NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺則是購自Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)。採用反應式13所述的兩步法將連接臂彼此複合。＜＜ 反應式 13 1,3,5- 三苯胺和一條 NHS-PEG12 - 炔連接臂與兩條 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺基連接臂複合所用的兩步合成法 ＞＞
在步驟(i)，將1,3,5-三苯胺溶解於接合緩衝液(磷酸鹽緩衝液(PBS)、pH 7.2)、濃度1 mM，並將NHS-PEG12 -炔交聯物以1 mM的最終濃度加入1,3,5-三苯胺溶液(以莫耳比1：1比例混合)中。其後，將4 μl的250 mM NHS-PEG12 -炔的儲備原液加入1 ml的1,3,5-三苯胺溶液中。使反應混合物在室溫下反應1小時。在步驟(ii)，將NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺交聯物以10 mM的最終濃度加入至步驟(i)的反應溶液(以莫耳比1：30比例混合)中。其後，將30 μl、250 mM的NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺儲備原液加入125毫升的反應溶液中；接著再加入845 μl接合緩衝液，使最終溶液體積達到1 ml。使反應混合物在室溫下反應2小時。
使反應混合物通過反相HPLC管柱並收集含有所述接合單元的部分，以純化反應產物並得接有一條NHS-PEG12 -炔基耦合臂以及兩條NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺基連接臂的1,3,5-三苯胺。以ESI質譜技術來分析產物，參見第14圖((ESI-TOF) m/z: [M+H]+ - calculated for C104 H180 N7 O46 2263.1955; Found 2263.1920)。在MS圖譜中，可在2264.1934、2265.1938與2266.1927觀察到三個同位素峰，分別對應於[M+H+1]+ 、[M+H+2]+ 與[M+H+3]+ 。
實驗例 15 ：將五個 DM1-SMCC 分子複合至 TCO- 多肽 9
DM1-SMCC是經過琥珀醯亞胺-4-(N-順丁烯二醯亞胺基-甲基)環己烷羧酸酯(succinimidyl-4-(N-maleimido-methyl) cyclohexan-1-carboxylate，簡稱SMCC)接合物修飾的N2 ’-脫乙醯基-N2 ’-(3-巰基-1-氧代丙基)-美登木素(N2 ’-Deacetyl-N2 ’-(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytansine，簡稱DM1)；本實驗例所用的DM1-SMCC係購自ALB Technology Inc. (Hong Kong, China)。將帶有自由胺基的TCO-多肽9溶解於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)中。在每毫升帶有NH2 基的TCO-多肽9溶液中，加入4 μl的250 mM DM1-SMCC，並使DM1-SMCC的最終濃度為1 mM，混合液中DM1-SMCC和TCO-多肽9 (0.04 mM)的莫耳比為25：1。使反應混合物在室溫下反應24小時。利用HPLC分離反應產物並將其凍乾。利用反相HPLC來純化帶有五個DM1-SMCC分子的TCO-多肽9；使用Supelco C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸，乙腈線性梯度為30%至100%、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。第15圖為純化帶有五個DM1-SMCC分子的TCO-多肽9 (亦稱為載藥束)的反相HPLC曲線圖；圖中以箭頭標示其峰值。對所合成的載藥束進行質譜分析，結果如第16圖所示，所述分子構建體的分子量為7,803道耳頓。
上述載藥束(如下所示)係由帶有一個自由TCO官能基和一組五個DM1分子(作為效應元件)的接合單元所組成。
實驗例 16 ：將 LPS 分子複合至 TCO- 多肽 1
在ÄKTA Explorer FPLC系統中，利用Superdex 200 10/300 Tricon管柱(HR, GE Healthcare)以層析法純化來自腸道沙門氏菌(Salmonella enterica sv. Minnesota )的LPS (購自Sigma，型錄編號L2137)。沖提緩衝液為50 mM HEPES (pH7.5)。將樣本以0.5 mL/min速率注入管柱進行等度沖提(eluted isocratically)，並收集成1-mL的沖提餾分。之後使用3500 MWCO膜，將含有LPS的沖提餾分在MilliQ水中於4°C下透析一晚。凍乾透析所得的LPS，以供後續使用。
在接合前，利用以下方法活化純化的LPS。將1 ml的LPS水溶液 (2 mg/ml)震盪3分鐘，並在25°C下以音波處理15分鐘。之後，加入1 ml的4.5 mM脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，簡稱NaDC)；再加入100 μl的2.5 mM EDTA溶液。在37°C下將混合物攪拌30分鐘、音波處理15分鐘，之後再於37°C下攪拌30分鐘。加入40 μl的100 mg/ml四氟硼酸1-氰-4-二甲基胺基吡啶(dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate，簡稱CDAP) (於乙腈中)。30秒後，加入40 μl的0.2M三乙胺(triethylamine，簡稱TEA)水溶液。將混和物保持在25°C下並攪拌150秒，以使得CDAP將LPS活化。
將上述LPS和丹磺醯肼反應，以引入肼基，以供後續和接合單元上的胺基反應。簡言之，將1 ml的2.0 mg/ml 丹磺醯肼(於0.1 M 硼酸鈉緩衝液中，pH 9.3)加入經CDAP活化的LPS中。在黑暗中於25°C下攪拌混合物，使其反應一晚。加入100 μl的乙醇胺使反應中止。利用3,500 MWCO透析膜在Milli-Q水中於暗室、4°C下透析24小時，以移除未反應的丹磺醯肼。利用螢光光譜分析來確認產物，測量產物在325 nm下的發射光譜。第17圖的螢光分光光度分析顯示當LPS和丹磺醯肼反應後，其最大發射波長為495 nm。
利用MALDI-TOF質譜分析來確認經純化的LPS以及經丹磺醯肼活化的LPS。經純化的LPS分子量為3,143道耳頓；經丹磺醯肼活化的LPS分子量為3,651道耳頓，顯示一個LPS分子複合了兩個丹磺醯肼分子；一個丹磺醯肼分子的分子量為265道耳頓。
將LPS分子複合到TCO-多肽1中離胺酸殘基的胺基。簡言之，將0.67莫耳經丹磺醯肼活化的LPS和0.067莫耳TCO-多肽1(於0.1 M碳酸氫鈉緩衝液中、pH 9.5)混合，在室溫下反應一晚。
所得到的載藥束(如下所示)是由帶有一個自由TCO官能基以及一組兩個LPS分子(作為效應元件)的接合單元所組成。
實驗例 17 ：將咪喹莫特分子複合至 NHS-PEG6 - 順丁烯二醯亞胺 -(TCO- 多肽 9) 複合物
將咪喹莫特分子和NHS-PEG5 -NHS (Conju-probe Inc.)以1：3.5的莫耳比混合，以使咪喹莫特分子的胺基和上述同型雙官能交聯物反應。質譜分析結果顯示和咪喹莫特接合的PEG5 -NHS的分子量為658.36道耳頓(第18圖)。
利用HPLC純化產物(即，咪喹莫特-PEG5 -NHS)，以移除多餘、未反應的交聯物。之後在100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)中混合TCO-多肽9和咪喹莫特-PEG5 -NHS，並在25°C下反應18小時。質譜分析結果顯示，帶有咪喹莫特的載藥束的分子量為5,135道耳頓。
此一載藥束(如下所示)是由帶有一個自由TCO官能基以及一組五個咪喹莫特分子(IQ，作為效應元件)的接合單元所組成
實驗例 18 ：將 DOTA-NHS 接合至 TCO- 多肽 9
N-羥基琥珀醯亞胺-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸酯(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid N-hydroxysuccinimide ester，簡稱DOTA-NHS)係購自Macrocyclics, Inc. (Dallas, USA)。利用反應式14所示的兩步驟法，將DOTA-NHS接合到TCO-多肽9。在第一步中，將TCO-多肽9溶解於接合緩衝液(磷酸延緩衝液(PBS)，含5 mM EDTA、pH 7.0)，濃度為1 mM。將反應混合物在室溫下反應一晚。在第二步中，將DOTA-NHS酯加入反應溶液中，最終濃度為100 mM (以1：100的莫耳比混合或1：20的當量比混合)。由於DOTA-NHS酯帶有TFA而呈酸性，將溶液的pH值調整為8.0，以便活化NHS酯-NH2 的接合反應。使反應混合物在室溫下反應一晚。
由第19A圖的資料可以看出，上述分子構建體的分子量為4907.685 ((ESI-TOF) m/z (z=5): [M + 3H]+ ; Calculated for C214 H38 N39 O86 S1 982.5358; Found 982.5370)。＜＜ 反應式 14 DOTA-NHS 與 TCO- 多肽 9 複合所用的兩步合成法 ＞＞
實驗例 19 ：將釔原子螯合至以 TCO- 多肽 9 為基礎的 DOTA- 複合接合單元
反應式15說明了以DOTA-(TCO-多肽9)複合物和五個Y3+ 離子螯合。在此處，將Y(NO3 )3 溶液以莫耳比1：100的比例加入至反應混合物中，並在室溫下反應2小時。利用NAP-10 Sephadex G-25管柱將來移除反應混合物中游離的DOTA-NHS與Y3+ 離子。
利用MALDI-TOF質譜分析法來分析帶有Y3+ 離子的DOTA-(TCO-多肽9)複合物。質譜分析結果顯示帶有Y3+ 離子的DOTA-(TCO-多肽9)複合物樣本的分子量為5,355道耳頓(第19B圖)。＜＜ 反應式 15 以 DOTA-(TCO- 多肽 9) 複合物螯合釔原子 ＞＞
此一載藥束(如下所示)是由帶有一個自由TCO官能基以及一組五個與Y3+ 離子螯合的DOTA基團(作為效應元件)的接合單元所組成。
實驗例 20 ：從分別產生對人類 CD79a 、 CD79b 與第 VII 型膠原蛋白專一的單株抗體的融合瘤細胞株分離 VH 以及 VL 序列以製備 scFv
利用標準融合瘤製備方法，於實驗室中製備可產生抗CD79a抗體的小鼠B細胞融合瘤24C10以及可產生抗CD79b抗體的小鼠融合瘤1F10。可產生對人類第VII型膠原蛋白專一抗體的小鼠融合瘤系細胞株LH7.2是英國鄧迪大學(University of Dundee) Irene M. Leigh教授所贈。利用SuperScript III RT-PCR系統(Invitrogen, Carlsbad, USA)進行Poly(A)+ RNA反轉錄，並合成第一股cDNA。利用Ig-primer Sets (Novagen, Madison, USA)提供的DNA引子組並根據製造商的操作說明進行PCR，進而擴增VH 與VL 的cDNA，以便決定24C10、1F10與LH7.2的可變區域之序列。決定每一株的VH 與VL 序列。
小鼠抗人類CD79a單株抗體株24C10的VH 與VL 的cDNA序列分別如序列編號：27與序列編號：28所示；小鼠抗人類CD79b株抗體株1F10的VH 與VL 的cDNA序列分別如序列編號：29與序列編號：30所示；小鼠抗人類第VII型膠原蛋白單株抗體株LH7.2的VH 與VL 的cDNA序列分別如序列編號：31與序列編號：32所示。
實驗例 21 ：製備對人類 CD79b 或第 VII 型膠原蛋白專一的 scFv
於製備抗CD79b抗體1F10的scFv (序列編號：33)以及抗人類第VII型膠原蛋白抗體LH7.2的scFv (序列編號：34)時，合成編碼VL -GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH -(GGGGS)2 -C的DNA序列。在scFv的C-端加入可撓性接合物GGGGSGGGGS以及半胱胺酸殘基，而使得之後可將經修飾的scFv連接到本發明各種接合單元的連接臂所攜帶的順丁烯二醯亞胺基。
將編碼scFv的序列置入pG1K表現匣中。將Expi293F細胞以每毫升2.0 × 106 個活細胞的密度播於Expi293F表現培養基中，並維持18至24小時後進行轉染，以確保進行轉染時細胞處於分裂狀態。進行轉染時，將帶有7.5×108 個細胞的255 ml培養基置於2-L艾氏燒瓶中，並加入ExpiFectamine™ 293轉染試劑。於轉染後，將轉染細胞在37°C下以定軌搖動器(125 rpm)培育16至18小時；之後在燒瓶中加入ExpiFectamine™ 293轉染強化劑1與強化劑2，並繼續培育6天。收集培養上清液，並使用蛋白L親和力層析法純化培養基中的scFv蛋白。第20A與20B圖分別是純化的抗CD79b抗體1F10的scFv蛋白的SDS-PAGE與ELISA分析結果。第20C圖與第20D圖分別是純化的抗第VII型膠原蛋白抗體LH7.2的scFv蛋白的SDS-PAGE與ELISA分析結果。
實驗例 22 ：利用 HEK293 過度表現系統製備曲妥珠單抗、立妥昔單抗、西妥昔單抗、尼伏魯單抗、伊匹木單抗、雷珠單抗、阿達木單抗與突變替利珠單抗的 scFv
衍生自上述抗體的scFv經過特殊設計而在C-端帶有可撓性接合物(GGGGSGGGGS)與末端的半胱胺酸殘基。半胱胺酸殘基的硫氫基可和位於各接合單元連接臂自由端的順丁烯二醯亞胺基接合。於製備曲妥珠單抗、立妥昔單抗、西妥昔單抗、尼伏魯單抗、伊匹木單抗、雷珠單抗(ranibizumab)、阿達木單抗與突變替利珠單抗(teplizumab)的scFv時，直接使用上述人源化抗體的VH 與VL 的DNA序列，而未進一步進行密碼子優化。合成編碼以下序列的的DNA序列：VL -GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH -(GGGGS)2 -C。替利珠單抗抗體分子VH 的CDR3中帶有半胱胺酸殘基，這會干擾上文所述的SH-順丁烯二醯亞胺複合。故本實驗例製備了突變的替利珠單抗，將半胱胺酸殘基取代為絲胺酸殘基。本發明各實驗例中所製備的曲妥珠單抗、立妥昔單抗、西妥昔單抗、尼伏魯單抗、伊匹木單抗、雷珠單抗、阿達木單抗與突變替利珠單抗的scFv之胺基酸序列分別如序列編號：35至42所示。
於利用哺乳類動物表現系統來製備scFv蛋白時，使用以Expi293F™細胞為基礎的過度表現系統來製備10-500 mg的scFv，以供後續實驗。各scFv的產量足供製備多種構建體，以用於活體外試驗與嚙齒類動物模型試驗。所用系統使用ExpiFectamine™ 293轉染套組(Life Technologies, Carlsbad, USA)，其包含Expi293F™細胞株、陽離子脂質系ExpiFectamine™ 293試劑、ExpiFectamine™ 293轉染強化劑1與2、以及培養基(Gibco, New York, USA)。
將編碼scFv的序列置於pG1K表現匣中。將Expi293F細胞以每毫升2.0 × 106 個活細胞的密度播於Expi293F表現培養基中，並維持18至24小時後進行轉染，以確保進行轉染時細胞處於分裂狀態。進行轉染時，將帶有7.5×108 個細胞的255 ml培養基置於2-L艾氏燒瓶中，並加入ExpiFectamine™ 293轉染試劑。於轉染後，將轉染細胞在37°C下以定軌搖動器(125 rpm)培育16至18小時；之後在燒瓶中加入ExpiFectamine™ 293轉染強化劑1與強化劑2，並繼續培育5到6天。收集培養上清液，並使用蛋白L親和力層析法純化培養基中的scFv蛋白。據經驗，從1升的培養物中可以收集到超過300 mg的阿達木單抗與曲妥珠單抗之純化scFv蛋白。 第21A圖是純化的曲妥珠單抗scFv (電泳線1)與阿達木單抗scFv (電泳線2)的SDS-PAGE (10%)分析結果；而第21B與21C圖分別是純化的曲妥珠單抗scFv與阿達木單抗scFv的ELISA分析結果。第21D圖與21E圖分別是純化的西妥昔單抗scFv的SDS-PAGE與ELISA分析結果，其中曲妥珠單抗scFv (抗HER2 scFv)作為陰性對照組。
實驗例 23 ：利用畢赤酵母表現系統製備阿達木單抗 scFv
目標scFv構建體與上文實驗例所述相同，但所用的訊息胜肽不同。
利用帶有XhoI與NotI限制位的正向引子(5’-GTATCTCTCGAGAAAAGAGATATTCAGATGACGCAATCCCC-3’；序列編號：43)與反向引子(5’-GTATCTGCGGCCGCTTAACAGGAGCCACCGCCAC-3’；序列編號：44)來合成阿達木單抗scFv的DNA序列並將其次選殖到pPICZα表現載體中，其中Kex2訊息胜肽使得阿達木單抗scFv會被分泌到細胞外。之後利用電穿孔法將表現質體轉型到畢赤酵母(Pichia pastoris )中。進行ELISA分析來測定阿達木單抗scFv的表現量，以篩選出高產量選殖株。在480個轉型株中，選出五株進行後續蛋白誘導並利用SDS-PAGE進一步檢驗。選用選殖株scFv_1-A2進行後續大規模發酵生產。
將高產量選殖株scFv_1-A2接種於100 ml的緩衝型甘油複合培養基(buffered glycerol-complex medium，簡稱BMGY，含有1%酵母抽出物、2%蛋白腖、100 mM K3 PO4 、1.34 YNB、0.4 mg/L生物素以及1%甘油，pH 6.0)中，並在30°C下以200 rpm的轉速培養24小時。第二天，將培養物更換到發酵狀態下，保持在30°C、30%溶解氧以及pH 6.0條件下。發酵24小時後，引入氮源(YE，蛋白腖)以及甲醇(0.5%，v/v)以誘發蛋白表現。收集培養上清液並進行蛋白純化。
質譜分析結果顯示scFv的分子量為27,296.28道耳頓。第22A圖是純化的阿達木單抗scFv的SDS-PAGE分析結果，而第22B圖是純化的阿達木單抗scFv的ELISA分析結果。scFv的分子量和預期相符，且酵母產生的阿達木單抗scFv和人類TNF-α的結合能力與Expi-293F產生的阿達木單抗scFv不相上下。
實驗例 24 ：製備 CCK 類似物
CCK的胜肽類似物(CGGGGSDY(SO4 H)L(N)GWL(N)DF-NH2 ；序列編號：45)是由含8個胺基酸片段的CCK(其中有三個非天然胺基酸)以及6個胺基酸殘基(CGGGGS)組成的連續N-端延伸段(末端為半胱胺酸殘基)所組成。酪胺酸殘基(Y)芳香環上的OH基經硫酸化，而L(N)是正白胺酸殘基。半胱胺酸殘基上的SH基可和根據本揭示內容的接合單元之PEG-順丁烯二醯亞胺基連接臂複合。此一胜肽類似物是由Kelowna Inc. (Taipei, Taiwan)特製。
實驗例 25 ：製備 TCO- 抗 CD3 scFv 與 DBCO- 抗 CD3 scFv
根據上文實驗例所述，合成並表現編碼序列編號：42蛋白的DNA序列。對CD3專一的scFv的VL 與VH 序列為上述突變替利珠單抗的VL 與VH 。欲將Mal-PEG3 -TCO與Mal-PEG5 -DBCO (Conju-probe, Inc.)複合時，將純化的突變替利珠單抗scFv和5 mM DTT在室溫下溫和搖晃，使其反應4小時，以還原位於C-端的半胱胺酸殘基。利用NAP-10 Sephadex G-25管柱，將含還原抗CD3 scFv的緩衝液置換為磷酸鈉緩衝液(100 mM磷酸鈉、pH7.0，含50 mM NaCl以及5 mM EDTA)。在還原反應與緩衝液置換後，使Mal-PEG3 -TCO或Mal-PEG5 -DBCO和scFv以1：1的莫耳比在室溫下反應一晚，以進行複合反應。利用去鹽管柱移除過量的交聯物，接著分析TCO-scFv複合物與DBCO-scFv複合物產物。
MALDI-TOF質譜分析結果顯示TCO-抗CD3 scFv複合物樣本的分子量為28,053道耳頓；而DBCO-抗CD3 scFv複合物樣本的分子量為28,178道耳頓。用12% SDS-PAGE以考瑪斯(Coomassie)染色來分析TCO-抗CD3 scFv複合物的純度(資料未顯示)。第23A圖與第23B圖分別顯示TCO-抗CD3 scFv複合物與DBCO-抗CD3 scFv複合物的ELISA分析結果，其中分別以抗PD1 scFv與抗CD3 scFv作為陰性對照組與陽性對照組。由ELISA結果可以看出，TCO-抗CD3 scFv複合物與DBCO-抗CD3 scFv複合物都會和CD3-Fc-融合蛋白結合。
實驗例 26 ：將三個對 CD79b 專一的 scFv 接合到帶有三條 PEG12 - 順丁烯二醯亞胺基連接臂的四嗪基 - 多肽 2 分子構建體
本實驗例的目的在於展示可將三個scFv複合到帶有三條PEG12 -順丁烯二醯亞胺基連接臂的四嗪基-多肽2分子構建體。在將其和帶有三條PEG12 -順丁烯二醯亞胺基連接臂的四嗪基-多肽2接合之前，將DTT和1F10 scFv以2：1的莫耳比混合，並在25°C、溫和搖晃下反應4小時，以使其C-端半胱胺酸保持還原狀態。之後，利用NAP-10 Sephadex G-25管柱(GE Healthcare)，將含還原1F10 scFv的緩衝液置換為順丁烯二醯亞胺-SH耦合反應緩衝液(100 mM磷酸鈉、pH 7.0，含50 mM NaCl與5 mM EDTA)。在還原反應與緩衝液置換後，使接合物和蛋白以1：4的莫耳比例混合，並在4°C下反應一晚，以使四嗪基-多肽2接上三條PEG12 -順丁烯二醯亞胺基連接臂。
實驗例 27 ：純化帶有三條 PEG12 - 順丁烯二醯亞胺基連接臂並接合了三個抗 CD79b scFv 的四嗪基 - 多肽 2 之標的接合單元
將上一實驗例的反應混合物注入粒徑篩析(size exclusion)層析管柱S75。利用粒徑篩析層析管柱S75將複合了三個對CD79b專一scFv的(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽2)複合物和未複合的scFv、未複合的(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽2)複合物以及複合了一個或兩個個對CD79b專一scFv的(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽2)複合物分開。第24A圖是所合成的標的接合單元的FPLC溶析曲線圖；此一標的接合單元是帶有一個自由四嗪基官能基以及一組三個對人類CD79b專一的scFv (作為標的元件)的接合單元。所得到的產物(即，(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽2)複合物，其帶有一個自由四嗪基官能基並接合了一組三個對人類CD79b專一的scFv)透過析出餾分而純化，第24B圖為10% SDS-PAGE分析照片，其中電泳線5至7即為純化的產物。
實驗例 28 ：帶有三條 PEG12 - 順丁烯二醯亞胺基連接臂並接合了三個抗 CD79b scFv 的四嗪基 - 多肽 2 之標的接合單元的 MALDI-TOF 質譜分析
利用MALDI-TOF質譜分析來確認標的接合單元(即，複合了三個對CD79b專一scFv的(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽2)複合物接合單元)樣本。實驗所得的分子量中位數和三個1F10 scFv與帶有三條PEG12 -順丁烯二醯亞胺基連接臂的四嗪基-多肽2複合後的理論分子量中位數相符；由第24C圖的質譜分析圖可知，上述標的接合單元的平均分子量為85,996道耳頓。下圖所示的標的接合單元是由帶有一個自由四嗪基官能基以及一組三個對人類CD79b專一的scFv (作為標的元件)的接合單元所組成。
實驗例 29 ：製備帶有三個對 HER2/neu 專一的 scFv 的四嗪基 - 多肽 2 之標的接合單元
利用上述實驗例所述的方法，將scFv複合到上文實驗例所製備的接合單元上，並進行純化與分析。第25A圖為所合成產物的SDS-PAGE分析結果，由圖中可以看出製備所得的產物純度頗高。然而，一般來說，帶有相當PEG成分的分子在SDS-PAGE上的移動速度會比相同分子量的蛋白來得慢。第25B圖的質譜分析結果顯示經純化之接合單元的分子量為86,120道耳頓。下圖所示的標的接合單元是由帶有一個自由四嗪基官能基以及一組三個對人類HER2/neu專一的scFv (作為標的元件)的接合單元所組成。
實驗例 30 ：製備帶有三個對 TNF-α 或 PD-1 專一的 scFv 的 TCO- 多肽 2 之效應接合單元
利用上述實驗例所述的方法，將scFv複合到上文實驗例所製備的接合單元上，並進行純化與分析。
第25C圖是上述效應接合單元的質譜分析結果；此一效應接合單元是由帶有一個自由TCO官能基以及一組三個對TNF-α專一的scFv (作為效應元件)的接合單元所組成(如下所示)。由第25C圖的結果可以看出，此一效應接合單元的分子量為86,134道耳頓。
第25D圖與第25E圖分別顯示另一效應接合單元的SDS-PAGE與質譜分析結果；此一效應接合單元帶有一個自由TCO官能基以及一組三個對人類PD-1專一的scFv (作為效應元件)；其結構如下圖所示。由第25E圖的結果可知，此一效應接合單元的分子量為88,431道耳頓。
實驗例 31 ：製備帶有三個 CCK 多肽分子的四嗪基 - 多肽 2 之標的接合單元
CCK多肽的製備方式如上文所述。利用上文實驗例所述的方式將多肽接合至3-臂接合物。質譜分析結果顯示，帶有三個CCK多肽之接合單元的分子量為8,801道耳頓(第26圖)。具體來說，此一標的接合單元是由帶有一個自由四嗪基官能基以及一組三個CCK多肽(作為標的元件)的接合單元所組成。
實驗例 32 ：製備帶有兩個對 CD20 專一的 scFv 的 TCO- 多肽 7 之標的接合單元
在本實施例中製備帶有兩種官能基的接合單元，此一接合單元可和兩個不同的接合單元複合。在具有三個接合單元的分子構建體中，可將此一標的接合單元作為中心接合單元，此種三個接合單元的分子構建體可包含兩個標的接合單元以及一個效應接合單元。在本案的設計中，兩個標的接合單元可透過四嗪基和TCO基之間的iEDDA反應而接合；而中心接合單元與效應接合單元則可透過炔基和疊氮基之間的CuAAC反應而接合。
利用上述實驗例所述的方法，將scFv複合到上文實驗例所製備的接合單元上，並進行純化與分析。所得到的標的接合單元(如下所示)是帶有一個自由TCO官能基、一個自由炔基以及一組兩個對人類CD20專一的scFv (作為標的元件)的接合單元。第27圖的質譜分析結果顯示此種標的接合單元的分子量是56,949道耳頓(箭頭所指處)。
實驗例 33 ：將兩個對 VEGF-A 專一的 scFv 複合到帶有一個自由 TCO 基以及兩條帶有順丁烯二醯亞胺基的 PEG 連接臂的接合單元
利用上述實驗例所述的方法，將scFv複合到上文實驗例所製備的接合單元上，並進行純化與分析。
所得到的接合單元(如下所示)是一種效應接合單元，其包括一個自由TCO官能基以及一組兩個對人類VEGF-A專一的scFv (作為效應元件)。質譜分析結果顯示，此一接合單元的分子量為59,187道耳頓(第28圖)。
實驗例 34 ：製備含三個對 CD79b 專一的 scFv ( 標的接合單元 ) 與五個 DM1 分子 ( 效應接合單元 ) 的聯合接合物分子構建體
在本實施例中，建構帶有對CD79b專一的scFv以及一個PEG-(SMCC-DM1)5 載藥束的聯合接合物分子構建體。利用與上文實驗例相似的步驟，進行TCO-四嗪間的iEDDA反應，以製備此一分子構建體。所得產物(如下所示)是帶有三個對CD79b專一的scFv與一帶有五個DM1分子的載藥束所組成的聯合接合物分子構建體。第29A圖、第29B圖以及第30圖分別顯示上述聯合接合物分子構建體的SDS-PAGE、圖譜分析(分子量為91,144道耳頓)及ELISA分析結果。箭頭#1是帶有三個抗CD79b scFv的接合單元；箭頭2是帶有三個抗CD79b scFv和一個帶有五個DM1分子的載藥束的聯合接合物分子構建體。ELISA結果顯示，所述帶有三個抗CD79b scFv的接合單元以及帶有三個抗CD79b scFv和一個帶有五個DM1分子的載藥束的聯合接合物分子構建體可專一地結合到CD79b-Fc融合蛋白。
實驗例 35 ：製備含三個對 HER2/neu 專一的 scFv ( 標的接合單元 ) 與五個 DM1 分子 ( 效應接合單元 ) 的聯合接合物分子構建體
在本實施例中，建構帶有對HER2/ne專一的scFv以及帶有五個DM1分子的載藥束的聯合接合物分子構建體(如下所示)。第31圖為此一產物的SDS-PAGE分析結果。左側為帶有三個抗HER2/neu scFv (不含載藥束)的述接合單元的SDS-PAGE圖樣，以供對照。接上帶有五個DM1分子的載藥束會使所述分子構建體的體積變大。
實驗例 36 ：製備含三個 CCK8 類似物分子 ( 標的接合單元 ) 與五個 DM1 分子 ( 效應接合單元 ) 的聯合接合物分子構建體
在本實施例中，透過上文實驗例所述的iEDDA反應，將標的接合單元(帶有三個CCK多肽類似物分子與一個自由四嗪基)和效應接合單元(即載藥束；帶有五個DM1分子與一個自由TCO基)接合在一起。所得到的聯合接合物分子構建體(如下所示)，帶有三個CCK8胜肽與一帶有五個DM1分子的載藥束。第32圖的質譜分析結果顯示所述分子構建體的分子量為16,381道耳頓。
實驗例 37 ：製備含三個 CCK8 類似物分子 ( 標的接合單元 ) 與五個 DOTA 螯合基 ( 效應接合單元 ) 的聯合接合物分子構建體
在本實施例中，透過上文實驗例所述的iEDDA反應，將標的接合單元(帶有三個CCK多肽類似物分子與一個自由四嗪基)和效應接合單元(即載藥束；帶有五個與Y+3 螯合的DOTA基與一個自由TCO基)接合在一起。所得到的聯合接合物分子構建體(如下所示)，帶有三個CCK8胜肽與一帶有五個與Y+3 螯合的DOTA基的載藥束。第33圖的質譜分析結果顯示所述分子構建體的分子量為12,654道耳頓。
實驗例 38 ：製備含三個對 HER2/neu 專一的 scFv ( 標的接合單元 ) 與三個對 CTLA-4 專一的 scFv ( 效應接合單元 ) 的聯合接合物分子構建體
在本實施例中，透過上文實驗例所述的iEDDA反應，將標的接合單元(帶有三個對HER2/neu專一的scFv與一個自由四嗪基)和效應接合單元(帶有三個對CTLA-4專一的scFv與一個自由TCO基)接合在一起。所得到的聯合接合物分子構建體(如下所示)，帶有三個對HER2/neu專一的scFv與三個對CTLA-4專一的scFv。對反應混合物進行SDS-PAGE分析，可看到大小約230 kDa的電泳帶。
實驗例 39 ：製備含三個對 CD79b 專一的 scFv ( 標的接合單元 1) 、兩個對 CD20 專一的 scFv ( 標的接合單元 2) 與五個 DM1 分子 ( 效應接合單元 ) 的聯合接合物分子構建體
在本實施例中，利用上文實驗例製備的帶有兩個對CD20專一的scFv的標的接合單元(標的接合單元2)作為中心接合單元，並藉由第一標的接合單元的四嗪基和中心接合單元的TCO基兩者間的iEDDA反應，而將中心接合單元(標的接合單元2)和第一標的單元(標的接合單元1)接合在一起。此外，中心接合單元與效應接合單元則是透過中心接合單元的炔基和效應接合單元的疊氮基兩者間的CuAAC反應而連接在一起。第34圖是在不同反應時間點，反應物與反應混合物的分析結果。電泳線1中深色的電泳帶是純化的抗CD20 scFv；電泳線2中的箭頭1是帶有兩個抗CD20 scFv、一個TCO基與一個炔基的接合單元(標的接合單元2)；電泳線3中的箭頭#2是帶有三個抗CD79b scFv與一個四嗪基的接合單元(標的接合單元1)；箭頭#3則是包含標的接合單元1與2的聯合接合物。
上述聯合接合物分子構建體(如下所示)包含三個對CD79b專一的scFv (來自第一標的接合單元)、兩個對CD20專一的scFv (來自中心或第二標的接合單元)以及五個DM1分子(來自效應接合單元)。
實驗例 40 ： LPS 透過連接臂與多肽核複合後的生物活性分析
利用HEK-blueTM 偵測套組(InvivoGen, San Diego, USA)根據製造商的說明進行TLR 4刺激細胞分析，以測試與LPS複合的接合單元中LPS的生物活性。HEK-blueTM hTLR4細胞可表現兩種人類基因—TLR4 與MD-2/CD14 共受體基因、以及分泌性胚胎鹼性磷酸酶(secreted embryonic alkaline phosphatase，簡稱SEAP )報導基因，以供監控核因子(NF)-κB活化。在和TLR4促效劑互動後，TLR4可轉導一訊號以啟動NF-κB的活化，並表現分泌性鹼性磷酸酶，接著利用偵測培養基(HEK-blueTM 偵測，用以對分泌性鹼性磷酸酶進行定性分析的培養基；InvivoGen)偵測其活化，並以分光光度計測量。
簡言之，將HEK-hTLR4細胞以2.5 × 104 細胞的密度播於96孔盤中，並保持在含選擇性抗生素(NORMOCIN™)的完全DMEM培養基中。以不同濃度(由100 μg/ml進行2-倍連續稀釋)的粗LPS、純化LPS、以丹磺醯肼修飾的LPS以及與多肽核複合的LPS來刺激細胞，反應時間18小時。利用分光光度計在620 nm的波長下測量培養基中的SEAP，以分析TLR4的活化。
第35圖的分析結果顯示LPS在經過修之前與之後的活性。將生物活性和粗LPS相近的LPS餾分純化，並進行丹磺醯肼修飾。經丹磺醯肼修飾的LPS以及與多肽核複合的LPS具有相近的部分活性。
實驗例 41 ：咪喹莫特透過連接臂與多肽核複合後的生物活性分析
利用HEK-blueTM 偵測套組(InvivoGen, San Diego, USA)根據製造商的說明進行TLR 7刺激細胞分析，以測試與咪喹莫特複合的PEG5 -NHS的生物活性。HEK-blueTM hTLR7細胞可表現兩種人類基因—TLR7 受體基因以及分泌性胚胎鹼性磷酸酶(SEAP )報導基因，以供監控核因子(NF)-κB活化。在和TLR7促效劑互動後，TLR7可轉導一訊號以啟動NF-κB的活化，並表現分泌性鹼性磷酸酶，接著利用偵測培養基(HEK-blueTM 偵測，用以對分泌性鹼性磷酸酶進行定性分析的培養基；InvivoGen)偵測其活化，並以分光光度計測量。
簡言之，將HEK-hTLR7細胞以4 × 104 細胞的密度播於96孔盤中，並保持在含選擇性抗生素(NORMOCIN™)的完全DMEM培養基中。以不同濃度(由20 μg/ml進行2-倍連續稀釋)的咪喹莫特以及與咪喹莫特複合的PEG5 -NHS來刺激細胞，反應時間18小時。利用分光光度計在620 nm的波長下測量培養基中的SEAP，以分析TLR7的活化。
第36圖的分析結果顯示咪喹莫特在和連接臂複合之前與之後的活性；結果顯示咪喹莫特分子與連接臂複合後的生物活性和未修飾的咪喹莫特相近。
實驗例 42 ：帶有三個抗 CD79b scFv 以及五個 DM1 細胞毒性分子的聯合接合物分子構建體對 Ramos 細胞的細胞毒性
將Ramos細胞(2x104 /well)播於96孔盤中，盤中含有RPMI1640培養基(含10%胎牛血清)。經過2小時後，使細胞接觸不同濃度(由20 nM進行2-倍連續稀釋)的以下成分：抗CD79scFv、帶有三個抗CD79b scFv (不含載藥束)的接合單元、帶有五個DM1分子(即，載藥束)的接合單元、以及帶有三個抗CD79b scFv以及五個DM1分子的分子構建體。在培育6小時之後，以300 g離心5分鐘，以移除培養基；加入新鮮培養基後，再將細胞培育24小時。根據製造商的操作說明，以AlamarBlue細胞存活性試劑套組(Invitrogen)進行細胞存活性分析。
第37圖顯示四種處理組別中Ramos細胞的存活性分析結果。帶有三個抗CD79b scFv以及五個DM1分子的分子構建體導致約50%的RAMOS細胞發生細胞溶解。
當可理解，上文實施方式的說明僅為例示，且本發明所屬技術領域具有通常知識者可對其進行各種修飾。上文的說明、實驗例與資料完整地說明了本發明例示性實施方式的結構與用途。雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
主要元件符號如下：
100A、200A‧‧‧接合單元
110a、210a‧‧‧中心核
120、220‧‧‧連接臂
130A、230A‧‧‧耦合臂
140‧‧‧第一標的元件
240‧‧‧第一效應元件
152‧‧‧四嗪基
154‧‧‧TCO基
156‧‧‧iEDDA化學鍵結
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，茲將所附圖式簡單說明如下。
第1A圖至第1K圖為根據本揭示內容某些實施方式的接合單元的示意圖。
第2圖為包含化合物核的接合單元的示意圖。
第3A圖至第3D圖為根據本揭示內容某些實施方式的T-E分子構建體的示意圖。
第4圖為根據本揭示內容某些實施方式，用以建構分子構建體的分子構建體庫的示意圖。
第5A圖與第5B圖為根據本揭示內容某些實施方式的分子構建體的示意圖。
第6圖為根據本揭示內容某些實施方式的分子構建體的示意圖。
第7A圖與第7B圖為根據本揭示內容多種實施方式的分子構建體的示意圖。
第8圖為以反相(reverse phase)高效液相層析 (high performance liquid chromatography，HPLC) 分析純化TCO-多肽2的溶析曲線圖；多肽2的序列如序列編號：18所示。
第9圖為以反相HPLC純化(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物的曲線圖。
第10圖為(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽2)複合物的基質輔助雷射脫附飛行時間質譜分析(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)結果。
第11A圖與11B圖分別為(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽2)複合物以及(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(DBCO-多肽2)複合物的MALDI-TOF質譜分析結果。
第12圖為(PEG12 -順丁烯二醯亞胺)-(四嗪基-多肽8)複合物的電噴灑離子化飛行時間質譜分析(electrospray ionization-time of flight mass spectrometry，ESI-TOF)結果。
第13圖為(PEG6 -順丁烯二醯亞胺)-(TCO-多肽9)複合物的ESI-TOF質譜分析結果。
第14圖是帶有一個NHS-PEG12 -炔基耦合臂和兩個NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺基連接臂的1,3,5-三苯胺的ESI-TOF質譜分析結果。
第15圖為以反相HPLC純化帶有五個DM1-SMCC分子的TCO-多肽9的曲線圖。
第16圖為帶有五個DM1-SMCC分子的TCO-多肽9的質譜分析結果。
第17圖為螢光分光光度分析結果，圖中顯示LPS和丹磺醯肼(dansyl hydrazine)反應後的最大發射波長為495 nm。
第18圖為和咪喹莫特複合的PEG5 -NHS的質譜分析結果。
第19A圖為DOTA-(TCO-多肽9)複合物的ESI-TOF質譜分析結果；第19B圖為與Y3+ -螯合的DOTA-(TCO-多肽9)複合物的質譜分析結果。
第20A圖、20B圖分別是抗CD79b抗體1F10的純化scFv蛋白的SDS-PAGE與ELISA分析結果；第20C、20D圖分別是抗第VII型膠原蛋白抗體LH7.2的純化scFv蛋白的SDS-PAGE與ELISA分析結果。
第21A圖是曲妥珠單抗(trastuzumab)及阿達木單抗(adalimumab)的純化scFv的SDS-PAGE分析結果；第21B、21C圖分別是曲妥珠單抗及阿達木單抗的純化scFv的ELISA分析結果；第21D、21E圖分別是西妥昔單抗(centuximab)的純化scFv的SDS-PAGE及ELISA分析結果。
第22A圖是阿達木單抗的純化scFv的SDS-PAGE分析結果；第22B圖是阿達木單抗的純化scFv的ELISA分析結果。
第23A、23B圖分別是TCO-抗CD3 scFv複合物以及DBCO-抗CD3 scFv複合物的ELISA分析結果。
第24A、24B及24C圖分別是根據一實施例的合成接合單元的FPLC溶析曲線圖、SDS-PAGE分析結果以及MALDI-TOF質譜分析結果，上述合成接合單元含有一個自由四嗪基官能基和一組共三個對人類CD79b專一的scFv。
第25A、25B圖分別是四嗪基-多肽2和三個對HER2/neu專一的scFv形成的複合物的SDS-PAGE與質譜分析結果；第25C圖是TCO-多肽2和三個對TNF-α專一的scFv複合物的質譜分析結果；第25D、25E圖分別是TCO-多肽2和三個對PD-1專一的scFv形成的複合物的SDS-PAGE與質譜分析結果。
第26圖是四嗪基-多肽2和三個CCK胜肽形成的複合物的質譜分析結果。
第27圖是TCO-多肽7和兩個對CD20專一的scFv形成的複合物的質譜分析結果。
第28圖是TCO-多肽1和兩個對VEGF-A專一的scFv形成的複合物的質譜分析結果。
第29A圖與29B圖分別是一分子構建體的SDS-PAGE與質譜分析結果，上述分子構建體有一標的接合單元、三個對CD79b專一的scFv和一個帶有五個DM1分子的載藥束。
第30圖是一分子構建體的ELISA分析結果，上述分子構建體具有一標的接合單元、三個對CD79b專一的scFv和一個帶有五個DM1分子的載藥束。
第31圖是一分子構建體的SDS-PAGE結果，上述分子構建體具有一標的接合單元、三個對HER2/neu專一的scFv和一個帶有五個DM1分子的載藥束。
第32圖是一分子構建體的質譜分析結果，上述分子構建體具有一標的接合單元、三個CCK8胜肽和一個帶有五個DM1分子的載藥束。
第33圖是分子構建體的質譜分析結果，上述分子構建體具有一標的接合單元、三個CCK8胜肽和一個帶有五個DOTA官能基的載藥束。
第34圖是一反應混合物的SDS-PAGE分析結果；上述反應混合物含有由四嗪基-多肽2和三個對CD79b專一的scFv組成的接合單元、由TCO-多肽7和兩個對CD20專一的scFv組成的接合單元以及帶有五個DM1的載藥束。
第35圖是LPS經丹磺醯肼修飾之前與之後的生物活性分析結果。
第36圖是咪喹莫特與PEG連接臂複合後的生物活性分析結果。
第37圖是一分子構建體的細胞毒性分析結果，上述分子構建體帶有三個對CD79b專一的scFv和一個帶有五個DM1的載藥束。
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，儘可能以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。

Claims (15)

  1. 一種中心核構建體，包含一中心核，其中： 該中心核包含(1)複數個離胺酸(lysine，K)殘基，其中每一個K殘基和其下一個K殘基間是由一填充序列所隔開，該填充序列包含甘胺酸(glycine，G)以及絲胺酸(serine，S)殘基，且該K殘基的數目為2至15；或(2)一(Xaa -K)n 序列，其中Xaa 為一聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)其具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元，且n為2至15的整數；以及 位於該中心核N-或C-端的胺基酸殘基其中之一為半胱胺酸殘基或具有疊氮基或炔基，其中當位於該中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基時，該中心核構建體包含一耦合臂，其中該耦合臂的一端透過該半胱胺酸殘基的硫氫基而與其連接，且該耦合臂的自由端有疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基(strained alkyne)。
  2. 如請求項1所述的中心核構建體，其中該耦合臂為一PEG鏈，其具有2至12個EG重複單元。
  3. 如請求項1所述的中心核構建體，其中： 具有疊氮基的該胺基酸殘基為L-疊氮高丙胺酸(azidohomoalanine、AHA)、4-疊氮-L-苯丙胺酸(4-azido-L-phenyl- alanine)、4-疊氮-D-苯丙胺酸(4-azido-D-phenylalanine)、3-疊氮-L-丙胺酸(3-azido-L-alanine)、3-疊氮-D-丙胺酸(3-azido-D-alanine)、4-疊氮-L-高丙胺酸(4-azido-L-homoalanine)、4-疊氮-D-高丙胺酸(4-azido-D-homoalanine)、5-疊氮-L-烏胺酸(5-azido-L-ornithine)、5-疊氮-D-烏胺酸(5-azido-D-ornithine)、6-疊氮-L-離胺酸(6-azido-L-lysine)、或6-疊氮-D-離胺酸(6-azido-D-lysine)；以及 具有炔基的該胺基酸殘基為L-高炔丙基甘胺酸(L-homopropargylglycine，L-HPG)、D-高炔丙基甘胺酸(D-homopropargylglycine，D-HPG)或β-高炔丙基甘胺酸(beta-homopropargyl- glycine、β-HPG)。
  4. 如請求項1所述的中心核構建體，其中： 該高應力炔基為反式-環辛烯(trans-cyclooctene，TCO)、二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化環辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二環壬炔(bicyclononyne，BCN)或二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)；以及 該四嗪基為1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪基、或其衍生物。
  5. 如請求項1所述的中心核構建體，更包含複數個第一元件，其分別連接至該中心核的該K殘基。
  6. 如請求項1所述的中心核構建體，更包含一第二元件，其係透過以下任一種方式連接： 透過銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反應或應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反應而連接於該疊氮基； 透過CuAAC反應而連接於該炔基； 透過逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反應或SPAAC反應而連接於該高應力炔基；或 透過iEDDA反應而連接於該四嗪基。
  7. 如請求項6所述的中心核構建體，其中該中心核N-或C-端的胺基酸殘基其中之一具有疊氮基或炔基，且另外一者為半胱胺酸殘基，且該耦合臂的自由端有四嗪基或高應力炔基。
  8. 如請求項6所述的中心核構建體，其中：該第一元件為對一細胞介素(cytokine)或該細胞介素的一受體專一的一第一抗體或其片段、或該細胞介素的一可溶性受體；以及該第二元件為對一組織相關細胞外基質蛋白專一的一第二抗體或其片段。
  9. 如請求項8所述的中心核構建體，其中： 該組織相關細胞外基質蛋白係選自以下物質所組成的群組：α-蛋白聚糖(α-aggrecan)、第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白、第V型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白以及第XI型膠原蛋白； 該細胞介素係選自以下物質所組成的群組：腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、介白素-17 (interleukin-17、IL-17)、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23以及B細胞活化因子(B cell activating factor，BAFF)； 該細胞介素的受體為IL-6專一受體(IL-6R)或IL-17專一受體(IL-17R)；以及 該細胞介素的可溶性受體對TNF-α或IL-1有專一性。
  10. 如請求項6所述的中心核構建體，其中： 該第一元件為對一第一細胞表面抗原專一的一第一抗體或其片段；以及 該第二元件為對一第二細胞表面抗原專一的一第二抗體或其片段。
  11. 如請求項10所述的中心核構建體，其中： 該第一細胞表面抗原係選自以下物質所組成的群組：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138以及CD319；以及 該第二細胞表面抗原為CD3或CD16a。
  12. 如請求項6所述的中心核構建體，其中：該第一元件為一肽類激素(peptide hormone)、一生長因子或對一腫瘤相關抗原專一的一第一抗體或其片段；以及該第二元件為對一細胞表面抗原專一的一第二抗體或其片段。
  13. 如請求項12所述的中心核構建體，其中： 該肽類激素為胰泌素、膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)、體抑素或促甲狀腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)； 該生長因子係選自以下物質所組成的群組：上皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、突變型EGF、表皮調節素(epiregulin)、肝素結合上皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)、血管內皮生長因子A (vascular endothelial growth factor，VEGF-A)、鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)以及肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)； 該腫瘤相關抗原係選自以下物質所組成的群組：人類上皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor，HER1)、HER2、HER3、HER4、醣類抗原19-9 (carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9)、醣類抗原125 (CA 125)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、黏蛋白1 (mucin 1，MUC 1)、神經節苷脂GD2、黑色素瘤相關抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)、前列腺專一膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)、前列腺幹細胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)、間皮素(mesothelin)、黏蛋白關聯Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、Globo H、階段專一性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)以及上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)；以及 該細胞表面抗原是CD3或CD16a。
  14. 如請求項6所述的中心核構建體，其中： 該第一元件為對細胞核因子κB受體活化因子配體(ligand of receptor activator of nuclear factor κB，RANKL)專一的第一抗體或其片段；以及 該第二元件為對第I型膠原蛋白或骨結合素(osteonectin)專一的第二抗體或其片段。
  15. 如請求項6所述的中心核構建體，其中： 該第一元件為對VEGF-A專一的抗體或其片段；以及 該第二元件為一長PEG鏈，其分子量為20,000至50,000道耳頓。
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